TW202043288A - 包含配位子及ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段之複合體 - Google Patents

包含配位子及ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段之複合體 Download PDF

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石田淳也
戶谷博希
白石宜之
浅野亨
吉川友章
佐野頼方
土居原仁
白井宏樹
平山和徳
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Abstract

[課題]本發明之課題在於提供一種複合體，其係使用即使藉由金屬或螢光色素等進行標記，鍵結活性亦不減弱之抗人類CEACAM5抗體Fab片段，且其中包含對於體內診斷藥及放射線內用療法有用之配位子、間隔區，及胜肽連接子。 [解決手段]含有包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含特定之胺基酸序列之重鏈可變區域，且該輕鏈係含有包含特定之胺基酸序列之輕鏈可變區域之抗人類CEACAM5抗體Fab片段及配位子之複合體，或包含配位子、間隔區，及胜肽連接子之複合體，係即使藉由金屬或螢光色素等之標記，其鍵結活性亦不減弱，可作為診斷用組成物及/或醫藥組成物使用。

Description

包含配位子及ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段之複合體
本發明係關於包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段或者人類MUC1抗體Fab片段，及配位子之複合體。本發明亦關於一種包含前述複合體之診斷用組成物及/或醫藥組成物，以及，使用該複合體之癌症之診斷及/或治療方法等。此外，係關於包含配位子、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體、包含該複合體之診斷用組成物及/或醫藥組成物，以及，使用該複合體之與該生物分子相關連之疾患之診斷及/或治療方法等。又，係關於由該配位子及金屬所形成之錯合物及該抗人類CEACAM5抗體Fab片段或者包含該人類MUC1抗體Fab片段之複合體。又，關於一種包含該錯合物、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體。
CEA(Carcinoembryonic antigen)或CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule)係於1965年被發現之腫瘤指標(J.Exp.Med.；1965；121：439-462、PNAS；1969；64：161-167)，到現在為止明確已知23個CEA關連分子(BioMed Central Biology；2010；8：12-33)。其中，CEACAM5於正常組織中係幾乎不表現，然而係於胎兒之消化管或大腸癌中表現(BBA；1990；1032：177-189、J.Clin.Mol.Pathol.；1999；52：174-178)。又，已知CEACAM5係亦於乳癌、肺癌、甲狀腺癌表現(Diagn.Cytopathol.；1993；9：377-382、Cancer Res.；1990；50：6987-6994、Histopathology；2000；37：530-535)。
大腸癌患者與健康的正常人相比，其血中CEACAM5之濃度高(J.Exp.Med.；1965；121：439-462)，CEACAM5係作為腫瘤指標使用。於大腸癌患者之組織學上的探討中，在90%以上之組織中CEACAM5為高表現(British J.Cancer；2013；108：662-667)。 由於大腸癌早期之轉移係局限於肝臓，故若可在早期發現肝轉移並進行治療，則可使再發率降低(Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.；2017；3：163-173)。 黏蛋白1(Mucin 1：MUC1)係於構成乳腺、氣管及消化管等的上皮組織之上皮細胞之內腔側表現之膜鍵結型糖蛋白質(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan;4(1):45-60)。MUC1係在乳癌(Mod. Pathol., 2005 Oct;18(10):1295-304)、肺癌(Hum. Pathol., 2008 Jan;39(1):126-36)、大腸癌(Int. J. Oncol., 2000 Jan;16(1):55-64)、膀胱癌(PLoS One, 2014 Mar;9(3):e92742)、皮膚癌(Histopathology, 2000 Sep;37(3):218-23)、甲狀腺癌(J. Pathol., 2003 Jul；200(3)：357-69.)、胃癌(J. Pathol., 2000 Mar；190(4)：437-43)、胰臟癌(Int. J. Oncol., 2004 Jan；24(1)：107-13)、腎臓癌(Mod. Pathol., 2004 Feb；17(2)：180-8)、卵巢癌(Gynecol. Oncol., 2007 Jun；105(3)：695-702)及子宮頸癌(Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul；122(1)：61-9)等的癌細胞中過度地表現，MUC1作為用於檢測癌病灶之標的分子係為有用(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan；4(1)：45-60、Pathol. Res. Pract., 2010 Aug15；206(8)：585-9)。 MUC1在細胞外結構域存在之20胺基酸之串聯重複序列之HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(本案序列表之序列編號19)之第9個之蘇胺酸經O-醣基化。已知於癌細胞中此O-醣基化係不完全，T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、Tn (GalNAcα1-O-Ser/Thr)及2，3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr)等的O-醣基化係特異性地於癌中產生(專利文獻1、非專利文獻1)。正常組織的MUC1係不會接受此等的癌特異性的O-醣基化，故人類癌症特異性MUC1作為用於治療人類的各種癌之標的分子係特別有用。作為這樣的抗人類癌症特異性MUC1抗體，已知有例如1B2抗體(專利文獻1)、PankoMab抗體(非專利文獻2)、5E5抗體(專利文獻2)等。此等抗體之中，有報告指出，與PankoMab抗體相較之下，1B2抗體對於人類癌症特異性MUC1之特異性高(專利文獻1)。 肝轉移之診斷係使用CT(電腦斷層攝影)或MRI(核磁共振成像法)、FDG-PET(Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography)。CT或MRI、FDG-PET之檢測靈敏度係各自為74.4、80.3、81.4%，1cm以下之腫瘤之檢測靈敏度係降低至CT為47.3%、MRI為60.2%(Radiology；2010；257：674-684)。雖亦使用肝特異性造影劑MRI，然而在1cm以下之腫瘤中，其檢測靈敏度為29～38%(Radiology；2005；237：89-98)。
為了診斷、治療癌，係使用使抗癌劑或金屬放射性同位元素鍵結之抗體。使用抗體之標靶對於腫瘤細胞之特異性高，且副作用少。到現在為止，已有數個經金屬放射性同位元素標記之單株抗體係應用於診斷及治療之臨床應用(Cancer Control；2012；19：196-203)。 另一方面，一般而言，抗體之血中半衰期長，投予至體內後，達到提供足以將癌可視化的訊號之腫瘤對血液比需要4天～5天的長時間(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87：586-592)。此外，抗體的Fc區域係引起抗體依賴性細胞障礙(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity：ADCC)或補體依賴性細胞障礙(Complement-Dependent Cytotoxicity：CDC)之藥理作用(Glycoconj.J.；2013；30：227-236、Curr.Opin.Biotechnol.；2002；13：609-614)。此外，由於抗體係於肝臓代謝，故無論標的為何，皆高度聚集於肝臓，然而由於大腸癌早期之轉移係局限於肝臓，故係難以以抗體檢測肝轉移之病灶(Clin.Pharmacol. Ther.；2010；87：586-592)。 Fab、scFv、雙鏈抗體這樣的低分子化的重組抗體片段，由於組織浸透性高，故容易到達病灶，可以期待使用大腸桿菌或酵母中的表現系統以低成本進行生產，因此可用作治療用抗體，另一方面，其具有血中半衰期短，經腎排泄之特徴，故亦有報導其作為診斷藥之利用(Nat.Biotechnol.；2005；23：1126-1136)。
作為診斷藥而被應用之抗人類CEACAM5抗體，已知有屬於老鼠單株抗體T84.66之人類化抗體之M5A(專利文獻3)。係有報導以64 Cu標記之M5A，在使用於皮下移植了癌細胞之老鼠之試驗中，為了獲得良好的PET圖像，在投予後必須經過22小時以上(非專利文獻3)，又，使用肝轉移之模型老鼠之試驗中，向肝臓之正常組織與肝臓之病灶部位之攝入，於投予後3小時時為相同程度，而經過24小時後係具有顯著差異(非專利文獻4)。 有報導抗人類CEACAM5抗體之片段中，老鼠單株抗體的NP-4之Fab’經99m Tc標記之CEA-Scan可利用於大腸癌之診斷(非專利文獻5)。然而，CEA-Scan向病灶部位之攝入係未高於向正常的肝臓之攝入，又，肝轉移之檢測靈敏度係比FDG-PET更低(非專利文獻6)。CEA-Scan係於1999年經FDA許可作為大腸癌之診斷藥，然而已不再販售(非專利文獻7)。 DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸)係具有作為放射性金屬之螯合劑之臨床實績，且廣泛地被使用。近年有報導使用DOTA進行金屬標記，使其與胜肽或抗體鍵結，並進行標靶之研究(非專利文獻8)。 有報導於癌症治療中，作為具有DOTA之醫藥，Satoreotide tetraxetan(非專利文獻9)係為第I期開發中。有報導將90 Y-epratuzumab tetraxetan投予於具有血液系腫瘤之患者(非專利文獻10)。 一般而言，鍵結有DOTA等的螯合劑及低分子化抗體或胜肽之複合體，係於腎臓被高度地攝入、保持或聚集(非專利文獻11，12)。 如此，該複合體於腎臓之聚集，係不便於正確的診斷或治療(非專利文獻13)。
例如，有報導使用經投予[111 In]DOTA-Rituximab Fab之複合體之老鼠之試驗，係高度聚集於腎臓中(非專利文獻11)。 為了迴避這樣於腎臓高度聚集之情況，第一係舉出將抗體之片段改變為例如Fab、scFV、Fab’、dsFV等之複合體之探討，第二係舉出具有將螯合劑與抗體之間特異性地於腎臓內切斷之連接子(亦稱為胜肽連接子)之複合體的探討(非專利文獻12)。 當初，有報導胜肽連接子為屬於Gly(甘胺酸)-Lys(離胺酸)之碘馬尿酸-Gly-Lys-Fab係藉由腎刷狀緣膜酵素切斷，碘馬尿酸係作為代謝物包含於尿中排出(非專利文獻14)。又，有報導胜肽連接子為屬於Gly-Tyr(酪胺酸)之碘馬尿酸-Gly-Tys-Fab(非專利文獻13)。 另一方面，有報導取代馬尿酸，使有機錸錯合物CpTR-COOH上連結胜肽連接子之Gly-Lys[188 Re]CpTR-Gly-Lys-Fab(非專利文獻15)。 又，係有報告指出胜肽連接子係屬於Gly-Phe(苯丙胺酸)-Lys之99m Tc-PGGFML-IT-Fab(專利文獻4)。 又作為螯合劑，著眼於NOTA，且有報導包含該NOTA與胜肽連接子之複合體(專利文獻5)。 雖創作製造出具有前述胜肽連接子之複合體，然而由於螯合劑之種類的不同，而產生無法藉由該酵素切斷之課題，而有報導藉由於螯合劑與胜肽連接子之間導入特定結構之連結部(-CH2 -Ph-CO-NH-)來解決此問題之複合體(專利文獻6)。目標係獲得具有可配位廣泛用於作為放射性同位素之銦等具有比較大的原子半徑之原子之配位子之複合體。有提及作為介於螯合劑與胜肽連接子之間隔區，雖導入具有專利文獻5所記載之硫脲結構者，然而其係不進行藉由腎刷狀緣膜酵素之分解。 有報導目標為藉由溶酶體切斷之胜肽連接子為屬於Met(甲硫胺酸)-Ile(異白胺酸)之複合體67 Ga-NOTA-Met-Ile-Fab係以以下之見解為基礎(非專利文獻16)。 有報導不具有胜肽連接子之複合體NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv以溶酶體切斷產生之代謝物67 Ga-NOTA-Bn-Met係經尿排泄(非專利文獻17)、上述複合體NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv之dsFv之輕鏈N末端第2個為Ile，故設計複合體67 Ga-NOTA-Met-Ile-Her2(Herceptin)Fab(非專利文獻19)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Glycoconj. J., 2013 Apr; 30(3):227-36. [非專利文獻2]Cancer Immunol Immunother, 2006 Nov; 55(11):1337-47 [非專利文獻3]Bioconjug. Chem.；2008；19: 89-96 [非專利文獻4]PLOS ONE; 2014; 9(9: e106921 [非專利文獻5]Ann.Surg.; 1997; 226: 621-631 [非專利文獻6]J.Nucl.Med.; 2000; 41:1657-1663 [非專利文獻7]Kenneth T.Cheng, “99mTc-Arcitumomab”, [online], Update:March 17, 2008., Molecular Imaging and Contrast Agent Database、[平成29年5月17日檢索]、網際網路＜URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/＞ [非專利文獻8]Bioorg. Med. Chem.; 2019; 27:3248-3253 [非專利文獻9]Clinical Trials.gov Identifier: NCT02592707 [非專利文獻10]Eur J Haematol. 2013 Dec; 91(6): 552-6 [非專利文獻11]Bioconjugate Chem. 2001、12、264-270 [非專利文獻12]Bioconjugate Chem.2002, 13, 985-995 [非專利文獻13]Bioconjugate Chem. 2013、24、291-299 [非專利文獻14]Cancer Res. 1999，59, 128-134 [非專利文獻15]Bioconjugate Chem. 2007, 18, 190-198 [非專利文獻16]Bioconjugate Chem. 2014, 25, 2038-2045 [非專利文獻17]Bioconjugate Chem. 1997, 8, 365-369 [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第WO2010/050528號手冊 [專利文獻2]國際公開第WO2008/040362號手冊 [專利文獻3]國際公開第WO2005/086875號手冊 [專利文獻4]國際公開第WO2013/081091號手冊 [專利文獻5]國際公開第WO2017/150549號手冊 [專利文獻6]國際公開第WO2019/065774號手冊 [專利文獻7]國際公開第WO2018/092885號手冊
[發明所欲解決之課題]
一價之Fab片段之分子量約為50kDa，且比約150kDa之抗體更小，腎排泄、血中半衰期亦短。因此，在投予後2～32小時以內可達到賦與癌可視化之充分的訊號之腫瘤對血液比。由於不具有Fc區域故亦不引起ADCC或CDC。Fab片段主要是由腎排泄，故亦不妨礙肝轉移之檢測。由於這樣的特長，與抗體相比，Fab片段係更可期待作為有效之體內診斷藥。 然而Fab片段中，抗體係由二價變成一價，故其鍵結活性係大幅度減弱。此外，為了將抗體作為用於體內診斷藥或光免疫療法之藥劑來利用，係必須以金屬或螢光色素等進行標記，然而由於藉由那樣的物質進行標記，而有造成該抗體之鍵結活性減弱之課題。 本發明之課題在於提供一種對於體內診斷藥及放射線內用療法有用之經標記化之複合體，其係使用即使藉由金屬或螢光色素等進行標記，鍵結活性亦不減弱之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 係提供包含抗人類MUC1抗體Fab片段(專利文獻7)與胜肽連接子及配位子之複合體，以及包含抗人類MUC1抗體Fab片段及配位子之複合體。又，本發明之其他課題，係在於提供包含上述複合體之診斷用組成物及係用其之診斷方法，以及，提供包含上述複合體之醫藥組成物及利用其之治療方法。 又，本發明之課題在於提供一種複合體，其係使於腎臓聚集之螯合劑及具有生物分子之複合體更加快速地排泄。 [用於解決課題之手段]
本發明人等先前係製作對於人類CEACAM5具有良好的親和性之抗人類CEACAM5抗體Fab片段(國際出願PCT/JP2018/025618)。再進一步反覆進行積極探討之結果，製作在該抗人類CEACAM5抗體Fab片段上藉由用於標記之配位子及胜肽連接子(或者不藉由)鍵結之複合體，係發現該複合體係具有與抗人類CEACAM5抗體Fab片段本身同等之對於人類CEACAM5之親和性，亦即，即使藉由標記部及Fab片段之鍵結，鍵結活性亦不減弱，進而完成本發明。亦即，本發明係提供一種包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段與胜肽連接子及配位子之複合體，以及包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段及特定之配位子之複合體。該複合體係已被確認即使藉由標記部及Fab片段之鍵結，對於人類CEACAM5之鍵結活性亦不減弱，並可保持對於人類CEACAM5之良好的鍵結活性，以此等結果為基礎，亦提供一種使用本發明之複合體之診斷手段及治療手段。
又，本發明人等係製作對於人類癌症特異性MUC1具有良好的親和性之抗人類MUC1抗體Fab片段，並進一步反覆進行積極探討之結果，係製作出於該抗人類MUC1抗體Fab片段上，使配位子藉由胜肽連接子(或者不藉由)鍵結之複合體。該複合體係具有與抗人類MUC1抗體Fab片段本身同等之對於人類癌症特異性MUC1之親和性。亦即，本發明係提供一種包含抗人類MUC1抗體Fab片段與胜肽連接子及配位子之複合體，以及包含抗人類MUC1抗體Fab片段與特定之配位子之複合體。此外，該複合體係即使藉由標記部鍵結，對於人類癌症特異性MUC1之鍵結活性亦不減弱，且確認可保持對於人類癌症特異性MUC1之良好的鍵結活性，以此等結果為基礎，亦提供一種使用本發明之複合體之診斷手段及治療手段。 又，本發明人等由於作為造影劑或抗癌劑等的醫療藥品有用之抗體等的生物分子、由配位子及金屬形成之錯合物(亦稱為金屬錯合物)、包含間隔區及胜肽連接子之複合體有聚集於腎臓之疑慮，故針對更加快速地排泄之複合體進行探討。其結果，係著眼於具有作為放射性金屬之螯合劑之臨床實績，且廣泛地被使用之DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸)，係發現包含3arm DOTA、特定之間隔區、特定之胜肽連接子及生物分子之複合體係於腎臓內被分解而排出。 根據以上，本發明係關於包含以下之CEACAM5之Fab抗體之複合體及包含該複合體之診斷用組成物及/或醫藥組成物，以及，使用該複合體之癌症之診斷及/或治療方法等。又，本發明係關於包含以下之MUC1之Fab抗體之複合體及包含該複合體之診斷用組成物及/或醫藥組成物，以及，使用該複合體之癌症之診斷及/或治療方法等。又，本發明係關於一種包含由腎臓快速地排出之DOTA、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體、該複合體之中間體，以及，與使用該複合體之生物分子之疾患相關之診斷及/或治療方法等。
[1]一種由下式(I)所表示之複合體：
Figure 02_image001
[式中， Fab1 為由 (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段及輕鏈，其中，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域，及 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，且其中序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含輕鏈可變區域，且該輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列 所構成之群所選出之抗人類CEACAM5抗體Fab片段，該Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基鍵結於X上； X為胜肽連接子或鍵結； S1 為間隔區或鍵結； Y為配位子；以及、 p為1～25之自然數，係顯示鍵結於Fab1 之基(Y-S1 -X)之數量； 惟，X為鍵結時，S1 為-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-或鍵結，且，Y為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸(以下，亦簡稱為DOTA)。
[2]如上述[1]所記載之複合體，其中，Fab1 係由(a)及(b)所構成之群所選出。 (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列，及 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段，且序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列。
[3]如上述[2]所記載之複合體，其係包含Fab片段(以下稱為Fab2 )，且其中Fab1 係含有包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段及包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈。 [4]如上述[1]～[3]中之任一項所記載之複合體，X係具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之具有包含2～4個胺基酸之胜肽之胜肽連接子。
[5]如上述[1]～[4]中之任一項所記載之複合體，S1 為 -C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-(CH2 )2 -C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、 -NH-(CH2 )3 -C(=O)-、 -NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 下式(a)～(q)所表示之間隔區，或，鍵結，
Figure 02_image003
上述式中，R1 係表示氫原子、鹵素或C1-6 烷基。以下亦相同。X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (13)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-Lys＊-Z2 -、 (14)-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (15)-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (16)-Gly-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (17)-Gly-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (19)-Gly-Tyr-Lys＊-Z2 -、 (20)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 O)3 -CH2 -C(=O)- NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (22)-Gly-二苯丙胺酸-Lys＊-Z2 -、 (23)-Gly-Tyr-NH-(CH2 )5 -Z1 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子，或 (29)鍵結， 此處，Met係表示甲硫胺酸，Ile係表示異白胺酸，Gly係表示甘胺酸，Lys係表示離胺酸，Phe係表示苯丙胺酸，Val係表示纈胺酸，Tyr係表示酪胺酸，Arg係表示魚精胺酸，Asp係表示天門冬胺酸，Z1 係表示下式(II-I)或(II-II)所示之基，-Lys＊-Z2 -係表示下式(III-I)或(III-II)所示之基，-Tyr＊-CH2 -係表示下式(IV)所示之基，-Lys＊ -C(=S)-係表示下式(V)所示之基，-Lys＊-Z3 -係表示下式(III-III)所示之基，基(A-3)、(A-4)或(A-5)係如同下式。
Figure 02_image005
[6]如上述[1]至[5]中之任一項所記載之複合體，其中，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-或-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-， X為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -，及 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)- 所構成之群所選出之胜肽連接子。 [7-1]如上述[1]至[5]中之任一項所記載之複合體，其中，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-，或，下式
Figure 02_image007
X為由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [7-2]如上述[7-1]所記載之複合體，其中，S1 為-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-，或，下式
Figure 02_image009
X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [8]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-(CH2 )2 -C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 -NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、-NH-(CH2 )3 -C(=O)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、下式(a)～(q)所表示之間隔區，或，鍵結，
Figure 02_image011
X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (13)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-Lys＊-Z2 -、 (14)-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (15)-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (16)-Gly-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (17)-Gly-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (19)-Gly-Tyr-Lys＊-Z2 -、 (20)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 O)3 -CH2 -C(=O)- NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (22)-Gly-二苯丙胺酸-Lys＊-Z2 -、 (23)-Gly-Tyr-NH-(CH2 )5 -Z1 - (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
[9]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、下式(e)～(i)或者(k)所表示之間隔區，或，鍵結，
Figure 02_image013
X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [10]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為由-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、下式(f)或者(g)所表示之間隔區，或，鍵結所構成之群所選出之基，
Figure 02_image015
X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [11]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-，及 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-所構成之群所選出之胜肽連接子。 [12]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，X係由 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -，及 (28)Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [13]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其中，X係由 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 [14]如上述[1]～[5]中之任1項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出之複合體，其中Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
。
[15]如上述[1]～[14]中之任一項所記載之複合體，其中，Y為去鐵胺(以下，亦簡稱為DFO)，或1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸(以下，亦簡稱為DOTA)。 [16]如上述[15]所記載之複合體，其中，Y為DFO。 [17]如上述[15]所記載之複合體，其中，Y為DOTA。 [18]如上述[17]所記載之複合體，其中，Y為3arm DOTA或4arm DOTA。 [19]如上述[18]所記載之複合體，其中，Y為3arm DOTA。 [20]如上述[18]所記載之複合體，其中，Y為4arm DOTA。 [21]如上述[15]或[17]至[20]中之任一項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出之複合體，其中Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
、
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
Figure 02_image051
Figure 02_image053
Figure 02_image055
Figure 02_image057
Figure 02_image059
Figure 02_image061
Figure 02_image063
。
又，本發明複合體亦可為下述二個複合體之混合物。
Figure 02_image065
Figure 02_image067
[22]如上述[15]或[17]至[20]中之任1項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出之複合體，其中Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。
Figure 02_image069
[23]如上述[1]～[22]中之任一項所記載之複合體，其中，p為1～5之自然數。 [24]如上述[1]～[20]中之任一項所記載之複合體，其中，Y係配位有金屬。 [25]如上述[21]～[22]中之任1項所記載之複合體，其係配位有金屬。 [26]如上述[24]或[25]所記載之複合體，其中，金屬為金屬放射性同位元素。 [27]如上述[26]所記載之複合體，其中，金屬為89 Zr。 [28]如上述[24]或[25]所記載之複合體，其中，金屬為順磁性金屬離子。 [29]如上述[28]所記載之複合體，其中金屬為Gd3+ 。 [30]如上述[24]～[29]中之任一項所記載之複合體，其係PET示蹤劑。
[31]一種診斷用組成物，其係包含上述[24]～[30]中之任一項所記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。 [32]如上述[31]所記載之診斷用組成物，其係作為早期診斷藥，或病期診斷藥使用。 [33]如上述[31]或[32]中之任一項所記載之診斷用組成物，其係用於表現人類CEACAM5之癌症之診斷。 [34]如上述[33]所記載之診斷用組成物，其中，癌為大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等之轉移後之癌。
[35]一種醫藥組成物，其係包含上述[24]～[29]中之任一項所記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。 [36]如上述[35]所記載之醫藥組成物，其係用於治療表現人類CEACAM5之癌之醫藥組成物。 [37]如上述[36]所記載之醫藥組成物，其中，癌為大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等之轉移後之癌。 [38]如上述[24]～[29]中之任一項所記載之1種類以上之使用，其係用於癌症之診斷用組成物，及/或癌症之治療用醫藥組成物之製造。
[39]如上述[24]～[30]中之任一項所記載之複合體，其係用於癌症之診斷，及/或癌症之治療。 [40]一種癌症之診斷方法，其係包含將如上述[24]～[30]中之任一項所記載之1種類以上之複合體投予於對象。 [41]一種癌症之治療方法，其係包含將如上述[24]～[30]]中之任一項所記載之複合體之治療有效量投予於對象。 [42] 一種複合體，其係如下式(Ia)所表示：
Figure 02_image071
[式中， DOTA1 ：3arm DOTA、 U：鍵結，或，-NH(CH2 )2 O(CH2 )2 O(CH2 )2 OCH2 C(=O)- Q：-C(=O)-、-NH-C(=O)-，或，-NH-C(=S)- X：C，或N R1a 、R1b ：相同或相異氫原子，或，C1-6 烷基， 此外，R1a 及R1b 係可一起形成C1-6 伸烷基。 p為1～25之自然數，藉由Biomolecule1 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。 R1 ：H、鹵素、C1-6 烷基，或，鹵代C1-6 烷基、 R2 ：C1-6 烷基，或，鹵代C1-6 烷基， L2 ：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、 -NHCH(CHCH3 NR3 R4 )C(=O)-、-NHCH(CHCH3 N3 )C(=O)-，或，-NHCH(CHCH3 CH2 CH2 CH3 )C(=O)-、 R3 ：H、C1-6 烷基、 R4 ：H、C1-6 烷基、 L3 ：鍵結、Arg，或，His、 L4 ：-NH-(CH2 )2 -、-NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -，或，鍵結、 V1 ：下式(A-1)～(A-5)所示之基：
Figure 02_image073
或，基-L3 -L4 -V1 -係一起成為下式：
Figure 02_image075
。
Biomolecule1 ：生物分子
[化36] 虛線
Figure 02_image077
：Q係鍵結於環上的2個碳原子中之任1個。 虛線
Figure 02_image079
：單鍵，或，雙鍵]
[43]如[42]記載之複合體，L3 、L4 及V1 為以下之基。 L3 ：鍵結、Arg，或，His、 L4 ：-NH-(CH2 )2 -、-NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -，或，鍵結， V1 ：下式(A-1)至(A-5)中之任一項所記載之基：
Figure 02_image081
。
[44]如[43]記載之複合體，其中，基-L3 -L4 -V1 -係一起成為下式：
Figure 02_image083
。
[45]一種複合體，其係如下式(Ib)所表示：
Figure 02_image085
[式中， DOTA1 ：3arm DOTA， U：鍵結，或，-NH(CH2 )2 O(CH2 )2 O(CH2 )2 OCH2 C(=O)- Q：-C(=O)-、-NH-C(=O)-，或，-NH-C(=S)- X：C，或N R1a 、R1b ：相同或相異氫原子，或，C1-6 烷基 此外，R1a 及R1b 係可一起形成C1-6 伸烷基。 p為1～25之自然數，藉由Biomolecule2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。 R1 ：H、鹵素、C1-6 烷基，或，鹵代C1-6 烷基、 R2 ：C1-6 烷基，或，鹵代C1-6 烷基， L2 ：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、 -NHCH(CHCH3 NR3 R4 )C(=O)-、-NHCH(CHCH3 N3 )C(=O)-，或，-NHCH(CHCH3 CH2 CH2 CH3 )C(=O)-、 R3 ：H、C1-6 烷基、 R4 ：H、C1-6 烷基、 L3 ：鍵結、Arg，或，His、 L4 ：-NH-(CH2 )2 -、-NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -，或，鍵結、 V1 ：下式(A-1)至(A-5)中之任一項所記載之基：
Figure 02_image087
或，基-L3 -L4 -V1 -係一起成為下式：
Figure 02_image089
。
Biomolecule2 ：抗體Fab片段、
[化42] 虛線
Figure 02_image091
：Q係鍵結於環上的2個碳原子中之任1個。 虛線
Figure 02_image093
：單鍵，或，雙鍵]
[46-1] 如上述[42]至[45]中之任一項所記載之複合體，其係下式(Ic)：
Figure 02_image095
[式中， L3 ：鍵結、 L4 ：-NH-(CH2 )2 -或，-NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -、 Biomolecule：為Biomolecule1 或Biomolecule2 ]。 [46-2] 一種複合體，其係如前述[46-1]之複合體中之式(Ic)中， L3 為鍵結， L4 為-NH-(CH2 )2 -。 [47-1]如上述[42]至[46-2]所記載之複合體，下式(Id)所表示。
Figure 02_image097
[式中， L3 ：鍵結、 L4 ：-NH-(CH2 )2 -或，-NHCH((C=O)OH)(CH2 )4 -、 Biomolecule：為Biomolecule1 或Biomolecule2 ] 之上述[42]至[45]中之任一項所記載之複合體。 [47-2]一種複合體，其係前述[47-1]之複合體中之式(Id)中， L3 為鍵結， L4 為-NH-(CH2 )2 -。 [48] 如上述[42]～[47-2]中之任1項所記載之複合體，其中，V1 為下式(A-3)至(A-5)中之任一者。
Figure 02_image099
[49] 如[42]至[48]中之任一項所記載之複合體，其中，式(Ia)或(Ib)中之基(B)係
Figure 02_image101
且係由下式(B-1)至(B-7)之群所選出之基。
Figure 02_image103
Figure 02_image105
[50]如[42]～[49]中之任1項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出。
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
[51-1] 如[42]至[50]中之任1項所記載之複合體，其係於Biomolecule1 及Biomolecule2 中，排除以下之抗體Fab片段之生物分子或抗體Fab片段： 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係由(a)及(b)所構成之群所選出。 (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段及輕鏈，其中，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域，及 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，且其中序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含輕鏈可變區域，且該輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列。 [51-2] 如[51-1]所記載之複合體，其係於Biomolecule1 及Biomolecule2 中，排除以下之抗體Fab片段之生物分子或抗體Fab片段： (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段及輕鏈，其中，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域、 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，且其中序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含輕鏈可變區域，且該輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列、 (c)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列，或， (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，且序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號4所示之輕鏈。
[52]如[42]至[51-2]中之任一項所記載之複合體，其中，Biomolecule1 或Biomolecule2 係由以下之(a)及(b)之群所選出之抗人類MUC1抗體Fab片段： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段含有包含序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域，及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其係由抗人類MUC1抗體Fab片段所構成之群所選出，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，且包含序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域。 [53]如[52]所記載之複合體，其中Biomolecule1 或Biomolecule2 係由以下(a)及(b)之群所選出之抗人類MUC1抗體Fab片段： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列；及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列。
[54]如[53]所記載之複合體，其中，Biomolecule1 或Biomolecule2 係以下之抗人類MUC1抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列。 [55]如上述[42]～[54]中之任一項所記載之複合體，其中p為1～4之自然數。 [56]如上述[42]～[55]中之任一項所記載之複合體，其中DOTA1 係配位有金屬。 [57]如上述[56]所記載之複合體，其中，金屬為金屬放射性同位元素。 [58]如上述[57]所記載之複合體，其中，金屬為89 Zr。 [59]如上述[56]所記載之複合體，其中，金屬為順磁性金屬離子。 [60]如上述[59]所記載之複合體，其中，金屬為Gd3+ 。 [61]如上述[56]～[60]中之任一項所記載之複合體，其係PET示蹤劑。 [62]一種診斷用組成物，其係包含上述[56]～[61]中之任一項所記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。 [63]如上述[62]所記載之診斷用組成物，其係作為早期診斷藥，或病期診斷藥使用。 [64]如上述[62]或[63]中之任一項所記載之診斷用組成物，其係用於與Biomolecule1 或Biomolecule2 相關連之疾患之診斷。 [65]如上述[64]所記載之診斷用組成物，其中，與Biomolecule1 或Biomolecule2 相關連之疾患係與MUC1相關連之疾患。 [66]如上述[65]所記載之診斷用組成物，其係用於表現MUC1之癌症之診斷。 [67]如上述[66]所記載之診斷用組成物，其中，癌係乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、胰臟癌、腎臓癌、卵巢癌或子宮頸癌。
[68]一種醫藥組成物，其係包含如上述[56]～[60]中之任一項所記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。 [69]如上述[68]所記載之醫藥組成物，其係用於與Biomolecule1 或Biomolecule2 相關連之疾患之診斷。 [70]如上述[69]所記載之醫藥組成物，其中，與Biomolecule1 或Biomolecule2 相關連之疾患係與MUC1相關連之疾患。 [71]如上述[70]所記載之醫藥組成物，其係用於治療表現MUC1之癌之醫藥組成物。 [72]如上述[71]所記載之醫藥組成物，其中，癌係乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、胰臟癌、腎臓癌、卵巢癌或子宮頸癌。 [73]如上述[56]～[60]中之任一項所記載之1種類以上之使用，其係用於癌症之診斷用組成物，及/或癌症之治療用醫藥組成物之製造。 [74]如上述[56]～[60]中之任一項所記載之複合體，其係用於癌症之診斷，及/或癌症之治療。 [75]一種癌症之診斷方法，其係包含將如上述[56]～[60]中之任一項所記載之1種類以上之複合體投予於對象。 [76]一種癌症之治療方法，其係包含將如上述[56]～[60]中之任一項所記載之複合體之治療有效量投予於對象。 [發明之效果]
包含本發明中所記載之抗人類CEACAM5抗體Fab片段、胜肽連接子及配位子之複合體，以及，包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段及特定之配位子之複合體，係具有對於人類CEACAM5優異之鍵結活性。為此，進而包含金屬之本發明之複合體係期待對於癌症之診斷及/或治療可起作用。又，包含本發明中所記載之人類MUC1抗體Fab片段、胜肽連接子及配位子之複合體，係具有對於人類MUC1優異之鍵結活性。包含本發明中所記載之3arm DOTA、間隔區、胜肽連接子及生體分子之複合體係可自腎臓更加快速地排泄。為此，進而包含金屬之本發明之複合體係期待對於癌症之診斷及/或治療可起作用。
以下，針對本發明進行詳述，然而本發明並非受到此等所限定者。除非於本說明書中有特別定義，否則與本發明相關連而被使用之科學用語及技術用語，係具有本發明技術領域中具有通常知識者普遍理解之涵義。 所謂「烷基」，係皆意指直鏈或分枝狀之飽和烴鏈，並為一價基的意思。 所謂「C1-6 烷基」，係為碳數1～6之烷基，例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、n-己基等。作為某一態樣，係為C1-4 烷基，作為某一態樣，係為甲基或乙基，作為某一態樣，係為甲基。 所謂「C1-6 伸烷基」，係將上述C1-6 烷基之氫去除後之2價基。作為某一態樣，亞甲基、乙烯基、亞丙基或甲基亞甲基等。 「鹵素」係意指F、Cl、Br、I。 所謂「鹵代C1-6 烷基」，係指被1個以上之鹵素取代之C1-6 烷基。作為某一態樣，係為被1～5個鹵素取代之C1-6 烷基，作為某一態樣，為CF3 。
1-1.本發明之複合體 本發明之複合體係如下式(I)所表示之複合體：
Figure 02_image121
式中， Fab1 為抗人類CEACAM5抗體Fab片段，該Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基鍵結於X， X為胜肽連接子或鍵結， S1 為間隔區或鍵結， Y為配位子，以及， p為1～25之自然數，係顯示鍵結於Fab1 之(Y-S1 -X)之數量， 惟，X為鍵結時，S1 為-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-或鍵結，且，Y為下式
Figure 02_image123
所示之基]。 抗人類CEACAM5抗體Fab片段(Fab1 ) 針對前述式(I)中，「Fab1 」所表示之抗人類CEACAM5 抗體Fab片段進行說明。 抗體分子之基本結構在各類中是共通的，由分子量5萬～7萬之重鏈與2～3萬之輕鏈所構成。重鏈通常係由包含約440個胺基酸之多肽鏈所構成，各類具有特徴性結構，與IgG、IgM、IgA、IgD、IgE對應地被稱為γ、μ、α、δ、ε鏈。此外，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別被稱為γ1、γ2、γ3、γ4。輕鏈由通常包含約220個胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型與K型這2種，分別被稱為λ、κ鏈。抗體分子之基本結構之胜肽構成是各自相同的2條重鏈及2條輕鏈藉由二硫鍵(S-S鍵結)及非共價鍵而鍵結，分子量為15萬～19萬。2種輕鏈與任一種重鏈均可成對。各個抗體分子總是由相同的2條輕鏈和2條重鏈形成。 鏈內S-S鍵結在重鏈有四個(在μ、ε鏈中有五個)、在輕鏈中有二個，每100～110個胺基酸殘基形成一個環，其立體結構在各環間類似，被稱為結構單位或者結構域。對於重鏈、輕鏈中均位於N末端之結構域而言，即使是來自同種動物的同一類(亞類)的標品，其胺基酸序列也不是恆定的，稱為可變區域，各結構域係分別被稱為重鏈可變區域(VH )及輕鏈可變區域(VL )。比該結構靠近C末端側之胺基酸序列在各類或者亞類中基本是恆定的，被稱為恆定區域，各結構域係分別表示為CH 1、CH 2、CH 3或者CL 。
抗體與抗原之鍵結的特異性，係取決於由VH 及VL 所構成之部分的胺基酸序列。另一方面，與補體或各種細胞之鍵結之生物學的活性係反映出各類Ig的恆定區域的結構之差異。已知重鏈和輕鏈之可變區域之可變性幾乎受限在任一種鏈中都存在之3個小的超可變區域，將此等區域稱為互補性決定區域(CDR；從N末端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域的其餘部分被稱為框架區域(FR)，是比較恆定的。
存在於抗體之重鏈恆定區域的CH 1結構域與CH 2結構域之間的區域被稱為鉸鏈區域(Hinge area)，此區域係大量含有脯胺酸殘基，並包含連接2條重鏈複數個鏈間S-S鍵。例如，在人類之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各鉸鏈區域含有構成重鏈間的S-S鍵的，分別為2個、4個、11個、2個半胱胺酸殘基。鉸鏈區域是對木瓜酶及胃蛋白酶等的蛋白質分解酵素的感受性高的區域。在用木瓜酶消化抗體之情況下，重鏈在鉸鏈區域之比重鏈間S-S鍵更靠近N末端側的位置被切斷，分解成2個Fab片段和1個Fc片段。Fab片段由輕鏈與包含重鏈可變區域(VH )、CH 1結構域和鉸鏈區域的一部分的重鏈片段構成。Fab片段係包含可變區域，且具有抗原鍵結活性。 於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段，係具有以下之特徴之Fab片段： 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段及輕鏈，其中，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域。
作為本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域，亦可選擇Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等中的任意一個恆定區域。於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域為人類Igγ1恆定區域。 作為本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域，亦可選擇 Igλ或Igκ中的任一恆定區域。於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域為人類Igκ恆定區域。 於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段為以下之Fab2 片段： 含有包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段及包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈抗人類CEACAM5抗體Fab片段(稱為Fab2 )。 在細胞中表現包含Fab片段在內的抗體的情況下，已知抗體係在轉譯後受到修飾。作為轉譯後修飾的例子，係可舉出重鏈C末端之離胺酸之利用羧基肽酶的切斷、重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸之藉由焦麩胺醯化向焦麩胺酸之修飾、醣基化、酸化、脫醯胺化、糖化等，已知在各式各樣的抗體中，發生這樣的轉譯後修飾(J.Pharm.Sci.；2008；97：2426-2447)。 本發明之複合體中所包含之抗CEACAM5抗體Fab片段中，亦可包含藉由轉譯後修飾產生的Fab片段。作為可藉由轉譯後修飾產生之本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段的例子，可舉出進行重鏈N末端之焦麩胺醯化之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。本領域公知，這樣藉由N末端之焦麩胺醯化進行之轉譯後修飾，係不會對抗體的活性產生影響(Anal.Biochem.；2006；348：24-39)。
於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段係具有下述之特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，且其中序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含輕鏈可變區域，且該輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列。 某一實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段係具有下述之特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段，且序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列。 於其他實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗CEACAM5抗體Fab片段係具有下述之特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段： 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段以及輕鏈，該重鏈片段係包含：含有包含序列編號2之胺基酸編號31至35為止之胺基酸序列之CDR1、包含序列編號2之胺基酸編號50至66為止之胺基酸序列之CDR2，及包含序列編號2之胺基酸編號99至110為止之胺基酸序列之CDR3之重鏈可變區域，該輕鏈係包含：含有包含序列編號4之胺基酸編號24至38為止之胺基酸序列之CDR1、包含序列編號4之胺基酸編號54至60為止之胺基酸序列之CDR2，及包含序列編號4之胺基酸編號93至101為止之胺基酸序列之CDR3之輕鏈可變區域。 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段係鍵結於人類CEACAM5。作為測定所獲得之抗人類CEACAM5抗體Fab片段對於人類CEACAM5之鍵結活性之方法，有藉由表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)法之解析或ELISA等的方法。例如，使用藉由SPR法之解析之情況中，可使用Biacore T200(GE Healthcare Japan公司)，於感應晶片將Biotin CAPture Kit(GE Healthcare Japan公司)與經生物素化之人類CEACAM5進行固相化，並藉由添加連續稀釋後之Fab片段，測定鍵結速度常數(ka)、解離速度常數(kd)，及解離常數(KD )。 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段係以本說明書所揭示之本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈之序列情報為基礎，使用該領域習知的方法，可由本發明技術領域中具有通常知識者容易地製作。本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段雖未受到特別限定，然而例如，可依循後述之＜本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產方法＞所記載之方法進行生產。
1-2.關於配位子 所謂「配位子」，係指於複合體中，可於金屬形成螯合錯合物之部分，由螯合劑所構成之基的意思。所謂構成之基，係由螯合劑將質子去除，並具有鍵結鍵之基。該由螯合劑所構成之基係與抗人類CEACAM5抗體Fab片段直接，或者，藉由間隔區及/或胜肽連接子鍵結者。 所謂「螯合劑」，係指可與金屬配位鍵結之化合物。作為本說明書中之「螯合劑」，係可舉出螯鐵蛋白，與非螯鐵蛋白。作為螯鐵蛋白，可舉出羥胺酸型、兒茶酚型，或，混合配位子型。作為羥胺酸型螯鐵蛋白，例如，可舉出含鐵色素、以下式：
Figure 02_image125
表示之去鐵胺(DFO)、鐮菌胺酸C(fusarinine C)、鳥氨酸菌素(Ornibactin)、紅酵母酸(Rhodotorulic acid)。作為兒茶酚型螯鐵蛋白，可舉出例如，腸桿菌素、桿菌素(bacillibactin)、弧菌素(vibriobactin)。作為混合配位子型螯鐵蛋白，可舉出例如，固氮菌素(Azotobactin)、鐵載體(Pyoverdines)、耶爾森氏菌素(Yersiniabactin)。此外，上述螯鐵蛋白之情況中，DFO係可藉由屬於該反應性官能基之-NH2 與間隔區或胜肽連接子反應，DFO以外之螯鐵蛋白之情況中，亦可藉由羧基、羥基、胺基等的反應性官能基，以本發明技術領域中具有通常知識者通常使用之方法，與間隔區或胜肽連接子反應。 作為非螯鐵蛋白，例如，可舉出下式：
Figure 02_image127
表示之DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸、CAS編號：60239-18-1)、DTPA(二伸乙基三胺五乙酸、CAS編號：67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-雙(甲基氨基甲醯基甲基)-1,4,7-三氮雜庚烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號：119895-95-3)、EOB-DTPA(N-[(2S)-2-[雙(羧基甲基)胺基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-N-[2-[雙(羧基甲基)胺基]乙基]甘胺酸、CAS編號：158599-72-5)、TTHA(三伸乙基四胺六乙酸、CAS編號：869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羥基丙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號：120041-08-9)，及此等的習知的反應性衍生物。 DOTA係可藉由1個屬於該反應性官能基之羧酸與間隔區或胜肽連接子反應(以下，有將具有以如此之方式鍵結之3個羧酸之DOTA記載為3arm DOTA之情況(PloS One. 2019 Mar 22；14(3)：e0213397)。)。 DOTA之中，作為3arm DOTA，例如，可舉出如同以下者。
Figure 02_image129
Figure 02_image131
或者亦可作為使用下式之試藥p-SCN-Bn-DOTA維持4個羧酸之DOTA(以下，有記載為4arm-DOTA之情況)，使其與間隔區或胜肽連接子反應。
Figure 02_image133
作為形成本發明之複合體中所包含之配位子之「螯合劑」之某一態樣，可舉出DFO、DOTA、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A。作為某一態樣，可舉出DFO、DOTA。 此外，本說明書中之化合物及複合體若無特別記載，則亦包含游離體及其鹽。此處所謂「其鹽」，係指依據該化合物及複合體之取代基之種類，有形成酸加成鹽或與鹼之鹽之情況，且為該化合物及複合體可形成之鹽。具體而言，可舉出與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等之無機酸，或甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、苦杏仁酸、酒石酸、二苯甲醯酒石酸、二甲苯醯酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、天門冬胺酸、麩胺酸等的有機酸之酸加成鹽、與鈉、鉀、鎂、鈣、鋁等的無機鹼、甲基胺、乙基胺、乙醇胺、離胺酸、鳥胺酸等的有機鹼之鹽、與乙醯基白胺酸等的各種胺基酸及胺基酸衍生物之鹽或銨鹽等。例如，DFO係亦作為去鐵胺甲烷磺酸鹽存在，亦作為其他的鹽存在。DTPA亦與游離體共同作為DTPA鈉鹽存在。
包含金屬之本發明之複合體係可用於各種造影劑及/或癌症之治療劑，例如，可用於使用於MRI造影劑、PET示蹤劑之藥劑等。 作為用於MRI造影劑之情況之「螯合劑」之某一態樣，為上述之螯鐵蛋白及非螯鐵蛋白螯合劑。 作為用於PET示蹤劑之情況之「螯合劑」之某一態樣，為上述之螯鐵蛋白及非螯鐵蛋白螯合劑，作為某一態樣，為DFO或DOTA。 本發明之複合體中，螯合劑亦可包含金屬。本說明書中，「金屬」係意指順磁性金屬離子或金屬放射性同位元素。作為金屬，若為配位鍵結於各螯合劑之金屬則無特別限制。可依據複合體之用途目的，選擇適當的螯合劑與金屬之組合。
順磁性金屬離子係適宜使用於MRI造影劑。作為順磁性金屬離子之態樣，係可舉出Fe2+ 、Fe3+ 、Cu2+ 、Ni2+ 、Rh2+ 、Co2+ 、Gd3+ 、Eu3+ 、Dy3+ 、Tb3+ 、Pm3+ 、Nd3+ 、Tm3+ 、Ce3+ 、Y3+ 、Ho3+ 、Er3+ 、La3+ 、Yb3+ 、Mn3+ 或Mn2+ ，並不限定於此等。作為某一態樣，可舉出Gd3+ 、Mn3+ 、Mn2+ 、Fe2+ ，或Fe3+ 。作為某一態樣，可舉出Gd3+ 。作為某一態樣，可舉出Mn3+ 或Mn2+ 。此情況中，複合體中，作為相對陰離子，可使用鹵素等。又，相對陰離子可為配位子之C(=O)O- ，此外，複合體亦可具有Na+ 等的相對陽離子。 金屬放射性同位元素係用於PET示蹤劑等。作為金屬放射性同位元素之某一態樣，可舉出89 Zr、52 Mn、52 Fe、64 Cu、67 Ga、68 Ga、72 As、90 Y、99m Tc、111 In或177 Lu，然而並不限定於此等。作為用於PET示蹤劑或SPECT示蹤劑等之金屬放射性同位元素之某一態樣，可舉出89 Zr、64 Cu、67 Ga、68 Ga、99m Tc，或111 In。作為某一態樣，可舉出鋯(Zr)之放射同位素。作為某一態樣，可舉出89 Zr。作為用於癌症之治療之金屬放射性同位元素之某一態樣，可舉出90 Y或177 Lu。 作為本發明之複合體之某一態樣，Y為89 Zr配位鍵結之DFO之複合體。作為其他態樣，Y為包含90 Y、67 Ga、68 Ga及177 Lu之金屬放射性同位元素配位鍵結之DOTA之複合體。又，作為其他態樣，Y為包含Gd3+ 及Y3+ 之順磁性金屬離子配位鍵結之DOTA之複合體。又，作為其他態樣，Y為Gd3+ 配位鍵結之DOTA之複合體。
1-3.胜肽連接子或鍵結 本發明之複合體係配位子(Y)或間隔區(S1 )與Fab1 可直接鍵結(亦即，X為鍵結)，或者亦可藉由胜肽連接子(亦即，X為胜肽連接子)鍵結。 本說明書中，所謂「胜肽連接子」，係含有包含2～4個胺基酸之胜肽之連接子，依據要求亦可具有適於與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鍵結之連結(attachment)Z1 至Z3 等。此處，作為胜肽連接子中所包含之胜肽，係未受到特別限定，然而較佳係各自由甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、甲硫胺酸(Met)、異白胺酸(Ile)、苯丙胺酸(Phe)、纈胺酸(Val)、酪胺酸(Tyr)、魚精胺酸(Arg)、丙胺酸(Ala)、麩醯胺(Gln)、麩胺酸(Glu)、天冬醯胺(Asn)、天門冬胺酸(Asp)、組胺酸(His)及白胺酸(Leu)、3-(2-萘基)丙胺酸，及，二苯丙胺酸所構成之群所選出之2～4個胺基酸所構成之胜肽、更佳係各自由甘胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、天門冬胺酸、魚精胺酸、3-(2-萘基)丙胺酸，及，二苯丙胺酸所構成之群所選出之2～4個胺基酸所構成之胜肽。此外，除非另有說明，甘胺酸以外之胺基酸殘基之立體為L-體。
作為胜肽連接子之某一態樣，係包含具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之包含2～4個胺基酸之胜肽，進而，為可具有介於該胜肽連接子與生物分子或抗體Fab片段之間之連結(attachment)之胜肽連接子。由於具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之胜肽連接子，係藉由腎臓中存在之此等的酵素特異性地切斷，故有報導指出其於標記部之腎臓之聚集係降低，而可期待腎臓受到放射線照射或腎障礙之疑慮之降低。例如，Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep；60(12)：1319-28.、Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec；16(6)：1610-6.，及，Cancer Res. 1999 Jan 1；59(1)：128-34.中，係記載甘胺酸-離胺酸連接子係藉由腎臓中存在之腎臓刷狀緣膜酵素特異性地切斷。日本專利第6164556號公報中，係已記載甘胺酸-苯丙胺酸-離胺酸連接子係於腎臓中藉由腎臓刷狀緣膜酵素特異性地切斷，又，Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct；13(5)：985-95.中係記載包含甘胺酸-白胺酸-甘胺酸-離胺酸序列之連接子，或，Bioconjug Chem. 2013 Feb 20；24(2)：291-9.記載之甘胺酸-酪胺酸連接子係藉由腎臓刷狀緣膜酵素特異性地切斷。此外，Bioconjug Chem. 2014 Nov 19；25(11)：2038-45.中係記載包含甲硫胺酸-異白胺酸序列之連接子，係藉由腎臓中存在之溶酶體酵素特異性地切斷。作為胜肽連接子之某一態樣，為包含由甲硫胺酸-異白胺酸、甘胺酸-離胺酸、甘胺酸-苯丙胺酸-離胺酸、甲硫胺酸-纈胺酸-離胺酸、甘胺酸-酪胺酸、甘胺酸-離胺酸-離胺酸，及，甘胺酸-魚精胺酸-離胺酸、天門冬胺酸-甘胺酸-離胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-離胺酸、甲硫胺酸-異白胺酸-離胺酸、甘胺酸-酪胺酸-離胺酸、甘胺酸-纈胺酸、甘胺酸-異白胺酸、甲硫胺酸-苯丙胺酸-離胺酸、甘胺酸-(3-(2-萘基)丙胺酸)-離胺酸，及，甘胺酸-二苯丙胺酸-離胺酸所構成之群所選出之胺基酸序列之胜肽連接子。作為某一態樣，為包含由甲硫胺酸-異白胺酸天門冬胺酸-甘胺酸-離胺酸、甘胺酸-苯丙胺酸-離胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-離胺酸、甘胺酸-離胺酸，及，甘胺酸-(3-(2-萘基)丙胺酸)-離胺酸所構成之群所選出之胺基酸序列之胜肽連接子。
「胜肽連接子」係可具有適於任意地與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鍵結之連結(attachment)，此處，所謂適於與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鍵結之連結(attachment)，係使胜肽連接子部與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之胺基或硫醇基之間，以有機化學的方式鍵結之基，作為某一態樣，為於末端包含源自馬來醯亞胺之基(例如，下式(II-I)或(II-II)所表示之基)或源自異硫氰酸酯之基(-NH-C(=S)-)之基。作為某一態樣，為-NH-(CH2 )2 -Z1 -、-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-，或-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-，此處Z1 係以下式(II-I)或(II-II)表示。此外，亦有將下式(II-I)記載為-Z1 (＃N)-、將下式(II-II)記載為-Z1 (＃S)-之情況。 連結(attachment)係與胜肽末端之胺基酸之胺基或羧基，或者，與胺基酸之側鏈中之胺基(例如離胺酸)或羥基(例如酪胺酸)鍵結，形成胜肽連接子。作為連結(attachment)鍵結於胜肽末端之胺基酸之側鏈中之官能基並形成胜肽連接子之例子，例如，作為與Lys成為一體之連結(attachment)，可舉出下式(III-I)或(III-II)所表示之基，於本說明書中，係將此等2個合併記載為-Lys＊-Z2 -。且有將下式(III-I)記載為-Lys＊-Z2 (＃N)-、將下式(III-II)記載為-Lys＊-Z2 (＃S)-之情況。有將下式(III-III)記載為 -Lys＊-Z3 -之情況。
Figure 02_image135
進而，於本說明書中，同樣地，各自將具有末端胺基酸之側鏈中之官能基與連結(attachment)鍵結後之結構之下式(IV)所表示之基記載為-Tyr＊-CH2 -、將下式(V)所表示之基記載為-Lys＊-C(=S)-。
Figure 02_image137
作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，係包含連結(attachment)之胜肽連接子。作為某一態樣，係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (13)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-Lys＊-Z2 -、 (14)-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (15)-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (16)-Gly-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (17)-Gly-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (19)-Gly-Tyr-Lys＊-Z2 -、 (20)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 O)3 -CH2 -C(=O)- NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (22)-Gly-二苯丙胺酸-Lys＊-Z2 -、 (23)-Gly-Tyr-NH-(CH2 )5 -Z1 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
進一步作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-， 及 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (13)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-Lys＊-Z2 -、 (14)-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (15)-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (16)-Gly-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (17)-Gly-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (19)-Gly-Tyr-Lys＊-Z2 -、 (20)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 O)3 -CH2 -C(=O)- NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (22)-Gly-二苯丙胺酸-Lys＊-Z2 -、 (23)-Gly-Tyr-NH-(CH2 )5 -Z1 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -，及， (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-所 構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -，及 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)- 所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -及 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-，及 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為「X」之胜肽連接子之某一態樣，為由 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
1-4.間隔區或鍵結(S1 ) 本發明之複合體之配位子(Y)與胜肽連接子(X)係直接鍵結(亦即，S1 為鍵結)，或，藉由間隔區(亦即，S1 為間隔區)來鍵結。 本說明書中，S1 之「間隔區」，係用於在配位子與胜肽連接子或Fab1 之間建立一定的距離，或者，為了配位子與胜肽連接子之鍵結所導入之基，作為某一態樣，可舉出-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-(CH2 )2 -C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、-NH-(CH2 )3 -C(=O)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、下式(a)～(q)所表示之間隔區等。
Figure 02_image139
作為某一態樣，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-或 -C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-。作為某一態樣，S1 為 -NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-(CH2 )2 -C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、-NH-(CH2 )3 -C(=O)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-，或，上式(a)～(q)所表示之間隔區。作為某一態樣，S1 為-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、上式(g)、(i)、(k)所表示之間隔區。 作為某一態樣，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-，或，下式
Figure 02_image141
作為某一態樣，S1 為鍵結。 又，本發明之Y為DOTA之複合體，可為 DOTA與抗人類CEACAM5抗體Fab片段(Fab1 )直接鍵結或藉由間隔區(-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)鍵結。惟，DOTA與抗人類CEACAM5抗體Fab片段(Fab1 )藉由屬於間隔區之-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-鍵結之複合體，係為下式(VI)所表示之複合體。
Figure 02_image143
又，本案說明書所記載之S1 之間隔區中係包含新穎的間隔區、前述式(g)及(l)所表示之間隔區，此等特別係作為於DOTA上與具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之具有包含2～4個胺基酸之胜肽之胜肽連接子鍵結之場合之間隔區為有用。如同後述實施例4之腎臓聚集性評價試驗所示，在DOTA與前述式(g)所表示之間隔區以酵素切斷之胜肽連接子之組合之複合體中，係確認對於標記部之腎之聚集性降低。作為某一態樣，S1 係上述式(g)及(l)所表示之間隔區。 作為本發明之複合體之某一態樣，係一種屬於胜肽連接子之複合體，其係包含Y為DOTA，S1 為式(g)及(l)所表示之間隔區，且，X係具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之包含2～4個胺基酸之胜肽。 作為某一態樣，Y為DOTA，S1 為式(g)及(l)所表示之間隔區，且，X係屬於由 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -所構成之群所選出之胜肽連接子之複合體。 作為某一態樣，Y為DOTA，S1 為-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、上式(g)、(i)、(k)所表示之間隔區，且X為由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。 作為某一態樣，Y為DOTA，S1為式(g)所表示之間隔區，且X為由 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
本發明之複合體係包含上述態樣之組合。 本發明之複合體之具體的態樣係如同下述。 式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數。Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上。
Figure 02_image145
Figure 02_image147
Figure 02_image149
Figure 02_image151
Figure 02_image153
Figure 02_image155
Figure 02_image157
此外，Y為DOTA，S1 為式(g)及(l)所表示之間隔區，且，X係具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之具有包含2～4個胺基酸之胜肽之胜肽連接子之組合之標記部，係不限於與本發明之Fab1 之組合，使用各種Fab抗體之同樣之複合體中，作為腎毒性等的低減受到期待之標記部為有用，且本發明中亦包含該標記部本身之發明。 本發明之複合體之製造中，抗CEACAM5抗體Fab片段與配位子、間隔區及/或胜肽連接子之鍵結，及配位子與間隔區及/或胜肽連接子之鍵結，係本發明技術領域中具有通常知識者可藉由習知的手法，適宜地進行者。
本說明書中所謂「標記部」，例如於式(I)中，係意指Fab1 以外的部分，於式(Ia)或(Ib)中係意指Biomolecule1 或Biomolecule2 以外的部分。為(i)配位子及胜肽連接子(Y-S1 -X：惟，S1 為鍵結，X為胜肽連接子。)、(ii)配位子(Y-S1 -X：惟，S1 及X係各自為鍵結。)，或(iii)配位子、間隔區及胜肽連接子(Y-S1 -X：惟，S1 為間隔區，X為胜肽連接子。)。作為某一態樣，可舉出(ii)配位子。作為某一態樣，可舉出(i)配位子及胜肽連接子，或(iii)配位子、間隔區及胜肽連接子。此處，「標記部」之配位子亦可更進一步包含金屬，作為某一態樣，為包含金屬之(i)配位子及胜肽連接子、(ii)配位子，或(iii)配位子、間隔區及胜肽連接子，又，為形成(i)金屬與螯合錯合物之配位子及胜肽連接子、形成(ii)金屬與螯合錯合物之配位子，或形成(iii)金屬與螯合錯合物之配位子、間隔區及胜肽連接子。此外，為(iv)前述胜肽連接子中進一步包含間隔區之胜肽連接子之情況。此外，於式(Ia)或(Ib)中，係意指Biomolecule1 或Biomolecule2 以外的部分。
1-5.對於抗人類CEACAM5抗體Fab片段(Fab1 )之標記部(Y-S1 -X)之鍵結數(p)及對於式(Ia)或(Ib)之Biomolecule1 及Biomolecule2 之標記部之鍵結數(p) 本發明之複合體係藉由抗人類CEACAM5抗體Fab片段(Fab1 )中之1以上之胺基或硫醇基來鍵結1以上之標記部(Y-S1 -X)之複合體。又，本發明之複合體係藉由式(Ia)或(Ib)之Biomolecule1 及biomolecule2 中1個以上之胺基或硫醇基來鍵結1個以上之標記部之複合體。本發明之複合體可為鍵結之標記部之數量相異之複合體之混合物，式(I)中，係顯示在Fab1 上鍵結1～25之標記部(Y-S1 -X)之複合體中之任一者或該等之混合物。作為某一態樣，本發明之複合體係對於1個Fab1 ，包含1～25之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～23之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～15之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～11之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～9之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～7之標記部(Y-S1 -X)，作為某一態樣，係包含1～5之標記部(Y-S1 -X)，進而，作為某一態樣，係包含1～4之標記部(Y-S1 -X)。 式(Ia)或(Ib)中，Biomolecule1 及Biomolecule2 係表示1～25之該標記部所鍵結之複合體中之任一者或該等之混合物。作為某一態樣，本發明之複合體係對於1個Biomolecule1 及Biomolecule2 ，包含1～25之該標記部，作為某一態樣，包含1～23之該標記部，作為某一態樣，包含1～15之該標記部，作為某一態樣，包含1～11之該標記部，作為某一態樣，包含1～9之該標記部，作為某一態樣，包含1～7之該標記部，作為某一態樣，包含1～5之該標記部，進而，作為某一態樣，包含1～4之該標記部。 亦即，表示鍵結於1個Fab1 之標記部(Y-S1 -X)之鍵結數之「p」及表示鍵結於1個Biomolecule1 及Biomolecule2 之該標記部之鍵結數之「p」係相同或相異，作為某一態樣，為1～25之自然數，作為某一態樣，為1～23之自然數，作為某一態樣，為1～15之自然數，作為某一態樣，為1～11之自然數，作為某一態樣，為1～9之自然數，作為某一態樣，為1～7之自然數，作為某一態樣，為1～6之自然數，作為某一態樣，為1～5之自然數，作為某一態樣，為1～4之自然數，進而，作為某一態樣，為1～3之自然數。
2.編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段，於某一態樣，係藉由包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸，及包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸來編碼。 某一態樣中，編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸係含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸，或含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。 作為含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可舉出包含序列編號1之鹼基編號1至363為止之鹼基序列之聚核苷酸。作為含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可舉出包含序列編號3之鹼基編號1至336為止之鹼基序列之聚核苷酸。 於1個實施形態中，編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸係含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸，或含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。 作為含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可舉出包含序列編號1所示之鹼基序列之聚核苷酸。作為含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可舉出包含序列編號3所示之鹼基序列之聚核苷酸。 編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸，係可以該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列為基礎設計之鹼基序列為基礎，利用該技術領域習知的基因合成方法合成。作為這樣的基因合成方法，可使用國際公開第90/07861號所記載之抗體基因之合成方法等的本發明技術領域中具有通常知識者習知的各式各樣的方法。
3.編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸之表現載體 編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸之表現載體中，係包含：含有包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體、含有包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體，以及含有包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體。 作為較佳之表現載體，可舉出包含含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體、包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體，以及含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體。 較佳之表現載體係包含：包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體、包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體，以及含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體。
此等之表現載體若為可於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中產生由本發明之聚核苷酸編碼之多肽者，則未受到特別制限。作為這樣的表現載體，例如，可舉出質體載體、病毒載體(例如，腺病毒、反轉錄病毒)等，較佳係可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。 又，此等之表現載體係可包含與編碼編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之聚核苷酸之重鏈片段及/或輕鏈之基因可作用地連結之啟動子。作為用於在宿主細胞中使Fab片段表現之啟動子，在宿主細胞為埃希氏菌屬菌之情況中，例如，可舉出Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為在酵母中之表現用啟動子，例如，可舉出PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子，作為在芽孢桿菌屬菌之表現用啟動子，可舉出SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，宿主為哺乳動物細胞等的真核細胞之情況，可舉出源自CMV、RSV、SV40等的病毒之啟動子、反轉錄病毒之啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。
使用細菌、特別是大腸桿菌作為宿主細胞之情況，此等表現載體中，可進一步包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域及可複製單元。另一方面，作為宿主，使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞之情況中，表現載體可包含起始密碼子、終止密碼子。又，此情況中，亦可包含增強子序列、編碼本發明之重鏈片段及/或輕鏈之基因之5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊號序列、剪接(splicing)接合部、多腺苷酸化部位，或可複製單元等。又，依據目的，亦可包含通常使用之選擇指標(例如，四環黴素耐性基因、氨苄青黴素耐性基因、卡納黴素耐性基因、新黴素耐性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。
4.以表現載體進行轉型之宿主細胞 以表現載體進行轉型之宿主細胞中，係包含由以下之(a)～(d)所構成之群所選出之宿主細胞： (a)以含有包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以含有包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (c)以包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及含有包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (d)以含有包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及含有包含編碼抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
於1個實施形態中，以表現載體進行轉型之宿主細胞係由以下之(a)～(d)所構成之群所選出之以表現載體進行轉型之宿主細胞： (a)以包含含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (c)以含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (d)以包含含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
於1個實施形態中，以表現載體進行轉型之宿主細胞係由以下之(a)～(d)所構成之群所選出之以表現載體進行轉型之宿主細胞： (a)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (c)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (d)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
較佳之以表現載體進行轉型之宿主細胞，係可舉出以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞，以及，以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
作為以表現載體進行轉型之宿主細胞，若為適於所使用之表現載體，並藉由該表現載體進行轉型，可表現Fab片段者，則未受到特別限定，本發明之技術領域中，可例示出通常使用之天然細胞或人工地建立之細胞等各式各樣的細胞(例如，細菌(埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如，Sf9)等)、哺乳動物細胞株(例如，CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等的培養細胞)。轉型本身係可藉由例如，磷酸鈣法、電穿孔法等習知的方法來進行。 5.本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產方法 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產係包含培養上述之經轉型之宿主細胞，並使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟。
於1個實施形態中，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產中，培養之經轉型之宿主細胞係由以下之(a)～(c)所構成之群所選出： (a)以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (c)以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之以表現載體進行轉型之宿主細胞，及，含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
作為某一態樣，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產中，培養之經轉型之宿主細胞係由以下之(a)～(c)所構成之群所選出： (a)以含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以包含含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (c)以包含含有編碼含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之以表現載體進行轉型之宿主細胞，及，包含含有編碼含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
作為某一態樣，本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產中，培養之經轉型之宿主細胞係由以下之(a)～(c)所構成之群所選出： (a)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞； (b)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞；以及 (c)以包含含有編碼包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞，及，以包含含有編碼包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。
較佳係所使用之經轉型之宿主細胞為，以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞，或者，以含有包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體及包含編碼本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體進行轉型之宿主細胞。 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產中，經轉型之宿主細胞可於營養培養基中培養。營養培養基較佳係包含經轉型之宿主細胞之繁殖而言必須之碳源、無機氮源或者有機氮源。作為碳源，例如，可例示出葡萄糖、聚葡萄糖、可溶性澱粉、蔗糖等，作為無機氮源或者有機氮源，例如，可例示出銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。此外，依據要求，亦可包含其他營養素(例如，無機鹽(例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生物質(例如，四環黴素、新黴素、氨苄青黴素、卡納黴素等)等)。
經轉型之宿主細胞之培養本身，係可藉由習知的方法來進行。培養條件，例如，溫度、培養基之pH及培養時間係可適宜選擇。例如，宿主為動物細胞之情況中，作為培養基，可使用包含約5～20%之胎兒牛血清之MEM培養基(Science；1955；122：501.)、DMEM培養基(Virology；1959；8：396-97.)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199：519-24.)、199培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73：1-8.)等。培養基之pH較佳為約6～8，培養係通常在約30～40℃下進行約15～336小時，依據需要亦可進行透氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞之情況中，例如，可舉出包含胎兒牛血清之Grace’s培養基(PNAS；1985；82：8404-8.)等，其pH較佳為約5～8。培養係通常在約20～40℃下進行15～100小時，依據需要亦可進行透氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀真菌之情況，例如，含有上述營養源之液體培養基係較適當。較佳係pH為5～8之培養基。宿主為E.coli之情況中，作為較佳之培養基，可例示出LB培養基、M9培養基(Miller等、Exp.Mol.Genet,Cold Spring Harbor Laboratory；1972：431.)等。所述之場合，培養係可依據需要，一邊進行透氣、攪拌，通常在14～43℃，進行約3～24小時。宿主為Bacillus屬菌之情況中，可依據需要，一邊進行透氣、攪拌，通常係在30～40℃，進行約16～96小時。宿主為酵母之情況，作為培養基，例如，可舉出Burkholder基本培養基(PNAS；1980；77：4505-4508.)，pH較佳為5～8。培養通常約在20～35℃下進行約14～144小時，依據需要亦可進行透氣或攪拌。 本發明之複合體中所包含之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之生產中，係除了培養上述之經轉型之宿主細胞，並使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟以外，亦可包含將所表現之抗人類CEACAM5抗體Fab片段回收之步驟，較佳係包含分離、精製之步驟。作為分離、精製方法，例如，可舉出鹽析、溶劑沈澱法等的利用溶解度之方法、透析、超過濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量之差之方法、離子交換層析或羥基磷灰石層析等的利用荷電之方法、親合性層析等的利用特異性親和性之方法、逆相高速液體層析等的利用疏水性之差之方法、等電點電泳等的利用等電點之差之方法等。
6.生產本發明之複合體之方法 生產本發明之複合體之方法中，亦可包含將抗人類CEACAM5抗體Fab片段與標記部(Y-S1 -X)共價鍵結之步驟。前述標記部(Y-S1 -X)中之各構成要素間之鍵結係本發明技術領域中具有通常知識者可藉由習知的手法，適宜地進行者。作為反應例，可在將配位子(Y)直接或藉由間隔區(S1 )鍵結於胜肽連接子(X)後，使前述胜肽連接子與抗人類CEACAM5抗體Fab片段鍵結。又，亦可在將抗人類CEACAM5抗體Fab片段鍵結於胜肽連接子(X)後，將前述胜肽連接子與配位子(Y)直接或藉由間隔區(S1 )鍵結。此外，作為原料，亦可使用配位子與間隔區(S1 )預先鍵結之化合物。
生產本發明之複合體之方法，又，可包含培養上述之經轉型之宿主細胞，並使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟，及，使該Fab片段與標記部(Y-S1 -X)共價鍵結之步驟。生產本發明之複合體之方法，又，可包含培養上述之經轉型之宿主細胞，並使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟、將表現之該Fab片段回收之步驟，及，使該Fab片段與標記部(Y-S1 -X)共價鍵結之步驟。生產本發明之複合體之方法係可更進一步包含添加金屬之步驟。所使用之螯合劑、胜肽連接子、間隔區、標記部之數量、金屬等係可使用本說明書所記載者。
生產本發明之複合體之方法，係可以包含上述指定之2個以上之步驟作為一系列之步驟之方法進行實施，亦可作為包含上述指定之至少1個步驟之方法進行實施。例如，包含使抗人類CEACAM5抗體Fab片段與標記部(Y-S1 -X)鍵結之步驟之方法，及，包含在使標記部(Y-S1 -X)鍵結之抗人類CEACAM5抗體Fab片段上配位金屬之步驟之方法，亦包含於生產本發明之複合體之方法中。又，生產本發明之複合體之方法中，亦包含步驟之順序不同之方法。例如，於配位子配位金屬之標記部(Y-S1 -X)上，使其與抗人類CEACAM5抗體Fab片段共價鍵結之方法，亦包含於生產本發明之複合體之方法中。 又，以本發明所記載之生物分子代替上述抗人類CEACAM5抗體Fab片段，亦可同樣地生產。 7.包含配位子、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體 針對下式所示之本發明之包含配位子、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體進行說明。
Figure 02_image159
作為相當於間隔區之下式(S2)
Figure 02_image161
之態樣，
可舉出
Figure 02_image163
。
作為其他態樣，可舉出式S2為
Figure 02_image165
之基。
作為其他態樣，可舉出式S2為
Figure 02_image167
之基。
作為其他態樣，可舉出式S2為
Figure 02_image169
之基。
作為式(S2)中之基Q之態樣，可舉出 -C(=O)-、-NH-C(=O)-，或，-NH-C(=S)-。 作為式(S2)中之基Q之態樣，可舉出-C(=O)-，或， -NH-C(=O)-。 作為式(S2)中之基Q之態樣，可舉出-NH-C(=O)-。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L2 之態樣，可舉出Ile、Phe，Gly。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L2 之態樣，可舉出Ile。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L2 之態樣，可舉出Phe。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L2 之態樣，可舉出Gly。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L3 之態樣，可舉出鍵結、Arg、His。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L3 之態樣，可舉出鍵結。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L3 之態樣，可舉出Arg。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L3 之態樣，可舉出His。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L4 之態樣，可舉出 -NH-(CH2 )2 -、-NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -，或，鍵結。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L4 之態樣，可舉出 -NH-(CH2 )2 -。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L4 之態樣，可舉出 -NHCH(C(=O)OH)(CH2 )4 -。 作為式(Ia)或(Ib)中之基L4 之態樣，可舉出鍵結。 作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-1)～(A-5)所示之基，
Figure 02_image171
。
作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-1)所示之基。
Figure 02_image173
作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-2)所示之基。
Figure 02_image175
作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-3)所示之基。
Figure 02_image177
作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-4)所示之基。
Figure 02_image179
作為式(Ia)或(Ib)中之基V1 之態樣，可舉出下式(A-5)所示之基。
Figure 02_image181
式(Ia)或(Ib)中之下式(B)為包含間隔區及胜肽連接子之基。
Figure 02_image183
可舉出由下式(B-1)至(B-7)之群所選出之基。
Figure 02_image185
Figure 02_image187
Figure 02_image189
Figure 02_image191
Figure 02_image193
Figure 02_image195
Figure 02_image197
作為某一態樣，可舉出上述式(Ia)所記載之複合體，其係由下式之化合物所構成之群所選出之複合體，其中p為1～25之自然數，其係藉由Biomolecule1 中所具有之p個胺基或硫醇基鍵結於鄰接之碳原子上。
Figure 02_image199
Figure 02_image201
Figure 02_image203
Figure 02_image205
Figure 02_image207
本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image209
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image211
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image213
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image215
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image217
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image219
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 本發明之態樣為下式所示之複合體。
Figure 02_image221
「式中，Fab5 為以下之抗體Fab片段： 一種抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列]。 此外，作為本發明之態樣，可舉出下式(Ie)及(If)。
Figure 02_image223
Figure 02_image225
本發明複合體有存在幾何異構物或互變異構物之情況。又，本發明化合物有具有不對稱碳之情況。本發明中，係包含此等異構物之分離後之形式，或者該等之混合物。又，標籤體，亦即，本發明化合物之一個以上之原子以放射性同位元素或者非放射性同位元素取代之化合物亦包含於本發明中。 作為生物分子之態樣，係若為具有生理活性者即可，可舉出胜肽、蛋白質、荷爾蒙、藥物、核苷酸、寡核苷酸、核酸、多糖類等。蛋白質之情況中，係包含抗體、酵素、受容體及該等之碎片。 作為另一生物分子之態樣，可舉出胜肽、蛋白質。 作為另一生物分子之態樣，可舉出蛋白質。 作為另一生物分子之態樣，蛋白質之中，可舉出Fab片段、酵素、受容體、該等之碎片。例如體抑素、PSMA配體、RGD(Arg-Gly-Asp)Peptide、ATSM(Diacetyl-bis(N4-methylthiosemicarbazone))、211 At-AITM(4-211 At- astato-N-[4-(6-(isopropylamino)pyridine-4-yl)-1,3-thiazol-2-yl]-N- methylbenzamide)係屬於此。
作為另一生物分子之態樣，可舉出已上市之抗體或其之Fab片段。 例如可舉出nivolumab、pembrolizumab、bevacizumab、rituximab、pertuzumab、daratumumab、denosumab、cetuximab、ipilimumab、panitumumab、brentuximab、ramucirumab、atezolizumab、obinutuzumab、elotuzumab、avelumab、ibritumomab、alemtuzumab、gemtuzumab、necitumumab等。 又，作為另一生物分子之態樣，可舉出期待可用於阿爾法射線治療或貝他射線治療者。 例如，可舉出Octreoscan、131 I-MIBG(I-131 metaiodobenzylguanidine)、211 At-MABG(211 At-astato-benzylguanidine)、Trastuzumab 、Humanized antibody A33(Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 2005 Oct;20(5):514-23.)、Omburtamab、Tenatumomab、CD45 antibody(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03128034; 9595; NCI-2017-00452)、Ibritumomab、Actimab。 又，作為另一生物分子之態樣，可舉出Cancer studies and molecular medicine所記載之HuM195, MX35-F(ab’)2 monoclonal antibodies, Murine 9.2.27, Proteoglycan(MCSP)antigen, CD20 antigen, CD30 antigen(Cancer studies and molecular medicine(2004), 1, 1, 1-7)。 又，作為另一生物分子之態樣，可舉出CD19，GD2, VE cadherin等。
作為某一生物分子之態樣，可舉出屬於MUC1抗體Fab片段(稱為Fab3 、Fab4 或Fab5 )之國際公開WO2018/092885所記載者。 [1M]具體而言該Fab3 或Fab4 係由以下之(a)及(b)所構成之群所選出之抗人類MUC1抗體Fab片段，此外，係將具有重鏈片段且該重鏈片段含有包含序列編號12所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之Fab片段稱為Fab3 ，並將具有重鏈片段且該重鏈片段含有包含序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域之Fab片段稱為Fab4 ： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段含有包含序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域；及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號12或序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，且包含序列編號12或序列編號14之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域。 [2M]作為某一態樣，上述[1M]所記載之抗人類MUC1抗體Fab片段係由以下之(a)及(b)所構成之群所選出： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列；及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，其中重鏈片段係包含序列編號6或序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且為序列編號6或序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列。 [3M]作為某一態樣，上述[1M]所記載之抗人類MUC1抗體Fab片段係由以下之(a)及(b)所構成之群所選出： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段含有包含序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域；及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號14所示之胺基酸序列之重鏈可變區域，且包含序列編號10之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號16所示之胺基酸序列之輕鏈可變區域。
[4M]作為某一態樣，上述[3M]所記載之抗人類MUC1抗體Fab片段係由以下之(a)及(b)所構成之群所選出： (a)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列；及 (b)抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列。 [5M]作為某一態樣，如上述[4M]所記載之抗人類MUC1抗體Fab片段，其係抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段包含序列編號6所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號10所示之胺基酸序列。 [6M]作為某一態樣，如上述[4M]所記載之抗人類MUC1抗體Fab片段，其係抗人類MUC1抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係包含序列編號8所示之胺基酸序列之重鏈片段，且其中序列編號8之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈片段係包含序列編號10所示之胺基酸序列。 [7M]為國際公開WO2018/092885記載之抗MUC1抗體Fab片段之P10-1或P10-2(稱為Fab5 )。 此外，本發明複合體可由上述個別之態樣之組合所構成。
7.診斷用組成物・診斷方法 本發明係關於一種診斷用組成物，其係含有包含金屬之本發明之複合體(以下，稱為可檢測之本發明之複合體。)。本發明之診斷用組成物可為包含1種以上之本發明之複合體者。亦即，本發明之診斷用組成物可為包含1種本發明之複合體者，或亦可為包含2種類以上之本發明之複合體之組合者。可檢測之本發明之複合體係依據常規方法進行製劑化，並可作為早期診斷藥，或病期診斷藥(特別是癌症之診斷藥)來利用。 所謂早期診斷藥，係意指以未觀察到症狀，或在病期之早期階段進行診斷為目的之診斷藥。例如，係意指在癌中，未觀察到症狀，或於第0期或第1期之階段使用之診斷藥。 所謂病期診斷藥，係意指可檢查症狀係進行至何種程度之診斷藥。例如，係意指可針對癌，檢查該病期之診斷藥。 期待可藉由本發明之診斷用組成物進行診斷之癌為表現人類CEACAM5之癌。作為某一態樣，可舉出大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌及此等之轉移後之癌。作為某一態樣，該癌為大腸癌或大腸癌之轉移後之癌。更佳係該癌為大腸癌之轉移後之癌，這樣的癌中包含轉移性肝癌。又，為表現人類MUC1之癌。作為某一態樣，可舉出乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、胰臟癌、腎臓癌、卵巢癌或子宮頸癌。某一態樣係該癌為乳癌或膀胱癌。
本發明之診斷用組成物進行製劑化時，本發明之複合體之添加量雖係依據患者的症狀之程度或年齡、使用之製劑之劑型，或者Fab片段或生物分子之鍵結力價等而有所不同，然而，例如，患者的每單位體重，可使用以Fab片段或生物分子之質量基準，為0.001mg/kg至100mg/kg程度。 作為本發明之診斷用組成物之劑型的例子，可舉出注射劑、點滴用劑等的非經口劑，係可藉由靜脈內注射、對於標的組織局部之肌肉內注射、皮下注射、膀胱內投予等進行投予。又，於進行製劑化時，於藥學上可容許之範圍內，可使用適於此等劑型之載體或添加劑。藥學上容許之載體或添加劑之種類係未受到特別限定，可使用本發明技術領域中具有通常知識者習知的載體或添加劑。 本發明又關於用於癌之早期診斷用組成物、病期診斷用組成物之製造之可檢測之本發明之複合體之用途。本發明亦關於用於在癌之早期診斷、病期診斷中使用之可檢測之本發明之複合體。 此外，本發明亦關於包含將可檢測之本發明之複合體投予於對象之癌症之診斷方法。此處，所謂「對象」，係需要接受該診斷之人類或其他的哺乳動物。作為某一態樣，係需要接受該診斷之人類。本發明之診斷方法中之可檢測之本發明之複合體之有效量，可為與上述製劑化時之本發明之複合體之有效量相同的量。本發明之診斷方法中，可檢測之本發明之複合體，可舉出藉由對於標的組織局部之肌肉內注射、皮下注射等方式進行投予。 於其他態樣中，本發明亦關於一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段之用途，其係用於包含本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段、胜肽連接子及/或配位子之複合體之製造。作為某一態樣，本發明亦關於一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段之用途，其係用於包含本發明之複合體之診斷用組成物之製造。 又，作為提供包含金屬放射性同位元素之本發明之診斷用組成物時之態樣，可於即將使用該組成物之前，以金屬放射性同位元素進行標記，亦可提供作為包含金屬放射性同位元素之診斷用組成物。
8.醫藥組成物・治療方法 本發明中，可以使用以包含90 Y或177 Lu等的金屬放射性同位元素之1種類以上之本發明之複合體Fab片段之質量基準，為0.001mg/kg至100mg/kg之程度之量。 包含本發明之複合體之醫藥組成物係可用於癌症之治療。期待可藉由包含本發明之複合體之醫藥組成物進行治療之癌為表現人類CEACAM5之癌，例如，可舉出大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌及此等之轉移後之癌。或，期待可藉由包含本發明之複合體之醫藥組成物進行治療之癌為表現人類MUC1之癌，例如，可舉出乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、胰臟癌、腎臓癌、卵巢癌或子宮頸癌。某一態樣係該癌為乳癌或膀胱癌。 本發明係含有包含本發明之複合體之用於治療大腸癌或大腸癌之轉移後之癌之醫藥組成物。又，本發明中，係包含治療大腸癌或大腸癌之轉移後之癌之方法，其中包含投予本發明之複合體之治療有效量之步驟。又，本發明中，係包含誘導大腸癌或大腸癌之轉移後之癌之癌細胞的細胞死亡之方法，其係包含投予本發明之複合體之治療有效量之步驟。 用於治療癌之醫藥組成物亦可用於癌症之診斷。例如，亦可將用於治療大腸癌或大腸癌之轉移後之癌之醫藥組成物用於該癌症之診斷中。 又，本發明中，用於使用於大腸癌或大腸癌之轉移後之癌症之治療中之本發明之複合體。此外，本發明中亦包含本發明之複合體之用途，其係用於製造使用於治療大腸癌或大腸癌之轉移後之癌之醫藥組成物。 於其他實施形態中，本發明亦關於一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段之用途，其係用於包含本發明之複合體之醫藥組成物之製造。 於上述實施形態或者態樣中，係可以生物分子取代抗人類CEACAM5抗體Fab片段來進行。本發明之複合體係可提供作為與生物分子相關連之疾患之診斷用組成物或醫藥組成物。 雖已針對本發明進行總體性地記載，然而為了獲得更進一步的理解，故於此處提出作為參考之特定實施例。然而，此等之目的在於舉例說明，並非限定本發明者。 [實施例]
以下之實施例以及後述表中，有使用以下之縮寫之情況。 Gd/DOTA：經Gd標記之3arm DOTA、Gd/4arm DOTA：經Gd標記之4arm DOTA、MS：質量分析、ESI+：m/z值(離子化法ESI、除非另有說明否則為[M+H]+)、ESI-：m/z值(離子化法ESI、除非另有說明否則為[M-H]-)、APCI/ESI+：m/z值(離子化法APCI/ESI、APCI/ESI係APCI與ESI之同時測定的意思。除非另有說明否則為[M+H]+)、APCI/ESI-：m/z值(離子化法APCI/ESI、除非另有說明否則為[M+H]-)、Ex-No：複合體編號、SNo：製造例編號、Str：化學結構式、Me：甲基、Et：乙基、tBu：tert-丁基、1,3-Ph：1,3-伸苯基、1,4-Ph：1,4-伸苯基、diph-Ala：二苯丙胺酸，及，naph-Ala：3-(2-萘基)丙胺酸。
(實施例1：抗人類CEACAM5抗體Fab片段之製作) 將屬於源自老鼠之抗人類CEACAM5抗體之T84.66參考文獻(Protein Eng.Des.Sel.；2004；17：481-489)所記載之方法進行人類化後，使用以文獻(Proteins：Structure, Function, and Bioinformatics;2014;82:1624-1635)為基礎構築之人類化抗體之分子模型，設計具有即使鍵結標記部亦可期待其親和性不減弱之可變區域之抗體。 各自於前述抗體之重鏈可變區域基因之5’側連結編碼訊號序列(Protein Engineering；1987；1：499-505)之基因，然後於3’側連結人類Igγ1之Fab區域基因(包含序列編號1之鹼基編號364至678為止之鹼基序列)，並將此重鏈片段基因插入GS載體pEE6.4(Lonza公司)中。又，各自於抗體之輕鏈可變區域基因之5’側連結編碼訊號序列之基因，然而於3’側連結人類Igκ之恆定區域基因(包含序列編號3之鹼基編號337至657為止之鹼基序列)，並將此輕鏈基因插入GS載體pEE12.4(Lonza公司)中。將各自插入有抗體之重鏈片段及輕鏈之基因之前述pEE載體，以NotI與PvuI制限酶切斷，並使用接合(ligation)用套組TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara公司)進行接合，構築插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因之GS載體。
使用前述之插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因之GS載體，並以短暫性表現及持續性表現之2種類的方法進行抗體表現。關於短暫性表現，係對於在Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scintific公司)以約300萬個/mL的方式培養之Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)，將前述之插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因之GS載體使用ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific公司)進行轉染(Transfect)，並培養5～7天。將培養上清使用KappaSelect(GE Healthcare Japan公司)進行精製，獲得Fab片段。關於持續性表現，係於CHOK1SV細胞(Lonza公司)中，將以PvuI切割為直鏈之前述之插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因之GS載體使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)並藉由電穿孔法進行轉染(Transfect)。於轉染的隔天添加甲硫胺酸磺醯亞胺，並培養5～7天。於含有甲基纖維素之半固形培養基上播種細胞，並於形成群落(colony)後，使用ClonePix FL (Molecular Devices公司)取得Fab片段之表現量多之細胞。將該細胞之培養上清使用Capto L(GE Healthcare Japan公司)、Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Japan公司)，及，BioPro S75(YMC公司)進行精製，並獲得Fab片段。
將編碼所製作之抗人類CEACAM5抗體Fab片段(稱為PB009-01或Fab2 。)之重鏈片段之鹼基序列表示為序列編號1，將藉其編碼之胺基酸序列表示為序列編號2，將編碼PB009-01之輕鏈之鹼基序列表示為序列編號3，將藉其編碼之胺基酸序列表示為序列編號4。PB009-01之重鏈可變區域係包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係各自包含序列編號2之胺基酸編號31至35、50至66、99至110為止之胺基酸序列。PB009-01之輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係各自包含序列編號4之胺基酸編號24至38、54至60、93至101為止之胺基酸序列。 此外，可變區域及CDR序列係依據Kabat編號決定(Kabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda)。
(實施例2：抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體之製作) 本實施例係揭示複合體之製造實施例。本實施例中之各製造實施例中係於「實施例2」藉由連字號記載「複合體之編號」。例如，「實施例2-11」係表示本實施例中之複合體11之製造實施例。又，本實施例中之Fab2 係於實施例1所獲得之抗人類CEACAM5抗體Fab片段(PB009-01/Fab2 )，「p-Fab」係表示Fab2 係藉由該p個胺基鍵結於p個之[　]或(　)中所記載之標記部形成複合體。此外，以下之數個之實施例中，雖記載藉由MS解析確認之各複合體之Fab2 所鍵結之標記部(Y-S1 -X)之數量，然而其結果係不表示其不包含具有其他鍵結數之複合體。由於MS解析機器的精度的關係係可輕易地理解存有無法確認其存在之鍵結數之複合體存在之可能性。又，本實施例中之結構式中，Gd所鍵結之DOTA之結構式，係模式化地表示以Gd標記之DOTA。 (實施例2-11.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image227
(i)O4 -tert-丁基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(1.00g)之二氯甲烷(6mL)溶液中，於冰冷卻下添加三氟乙酸(以下略稱為TFA)(3mL)，於同溫下攪拌2小時。進行減壓濃縮後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。將合併後之有機層以飽和氯化鈉水溶液進行洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥並過濾後，進行濃縮。於此殘渣中添加N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-天門冬胺酸氫O4 -tert-丁基酯(920mg)、二氯甲烷(10mL)、二異丙基乙基胺(以下略稱為DIPEA)(2mL)、六氟磷酸(1-)1-(二甲基胺基)-N,N-二甲基-1-[(3H-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)氧基]甲烷亞胺(以下略稱為HATU)(1.2g)，並於室溫下攪拌16小時。添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。將合併後之有機層以飽和氯化鈉水溶液進行洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥，過濾後，藉由濃縮獲得標題化合物(2.86g)。MS(ESI+)；809.5[M+Na]+
(ii)O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 於O4 -tert-丁基-N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(2.86g)之四氫呋喃(以下略稱為THF)(10mL)溶液中添加嗎啉(6mL)，並於室溫下攪拌1小時。於冰浴下冷卻後，過濾生成之固體，將殘渣以甲醇進行洗淨。將濾液進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→4%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(1.04g)。MS(ESI+)；565.5 (iii)N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 將O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(570mg)、二氯甲烷(6mL)、3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}安息香酸(305mg)、DIPEA(520μL)、HATU(575mg)之混合物於室溫下攪拌43小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→80%乙酸乙酯/己烷)進行精製，獲得標題化合物(712mg)。MS(ESI+)；798.6
(iv)N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(712mg)之二氯甲烷(2mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌7小時。添加三乙基胺、胺基矽膠於減壓下濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(胺基矽膠，溶劑梯度；0→2%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(495mg)。MS(ESI+)；698.4 (v)O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 將N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-O4 -tert-丁基-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(495mg)、N,N-二甲基甲醯胺(以下略稱為DMF)(5mL)、[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙酸(以下略稱為DOTA-tris(t-Bu)ester) (446mg)、DIPEA(400μL)、HATU(404mg)之混合物於室溫下攪拌66小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→20%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(387mg)。MS(ESI+)；1275.5[M+Na]+
(vi)O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 將O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(387mg)、10%鈀碳(含水50%、65mg)、乙醇(4mL)之混合物於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌5小時。使用矽鈣石將該混合物進行過濾、濃縮。於殘渣中添加10%鈀碳(含水50%、650mg)、乙醇(8mL)，並將此混合物於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌20小時。將該混合物使用矽鈣石過濾後，藉由濃縮獲得標題化合物(336mg)。MS(ESI+)；1140.5[M+Na]+ (vii)O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 於O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-L-離胺酸 tert-丁基酯(336mg)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2.5mL)之混合物中，於冰冷卻下添加2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸甲基酯(56mg)、THF(5mL)之溶液，並將此混合物於同溫下攪拌2小時。冰冷卻下，添加1M氫氧化鈉水溶液(60μL)後，於室溫下攪拌1小時。添加乙酸乙酯、10%檸檬酸水溶液後，分離有機層。將水層以10%甲醇/氯仿進行萃取，將收集到的有機層以無水硫酸鈉進行乾燥，並進行過濾。將濾液進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→20%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(341mg)。MS(ESI+)；1198.5
(viii)N-[3-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 於O4 -tert-丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(341mg)之二氯甲烷(2mL)溶液中添加TFA(2mL)，於室溫下攪拌5小時。進行減壓濃縮後，將殘渣藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→20%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(99.6mg)。MS(ESI+)；918.3 (ix)[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯甲醯基}-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(Norleucinato)(3-)]釓之合成 於N-[3-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(20.0mg)、水(2mL)、氯化釓(6mg)之混合物中添加碳酸氫鈉水溶液(0.1M、800μL)，並於室溫攪拌10分鐘。添加碳酸氫鈉水溶液(0.1M、60μL)，並於室溫下攪拌1小時。添加伸乙基二胺四乙酸(以下略稱為EDTA)水溶液(0.5M、300μL)，並於室溫攪拌10分鐘。將反應混合物藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→25%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(12.0mg)。MS(ESI-)；1071.4
(x)複合體No.11之合成 將[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯甲醯基}-L-α-天冬胺醯甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。將該溶液40μL進行分注，並添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，以使其成為pH6.6的方式添加0.1M碳酸鈉水溶液。 於4.45mg/mL Fab2 之硼酸緩衝液(160μL)中，添加前調製之溶液，於30℃下培養2小時。添加0.05M EDTA水溶液(40μL)後，於30℃下培養10分鐘。以PD-10管柱進行精製，使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器(Merck Millipore公司)進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水重複洗淨7次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1073之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys＊ -Z2 (＃N)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例2-12.([Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)- Gly-Phe-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image229
(i)N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯丙胺酸(1.5g)之二氯甲烷(30ml)混合液中，依序添加N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯一鹽酸鹽(2.1g)、Et3 N(2.4mL)及HATU(2.5g)，於室溫下反應一晚。 將反應混合物濃縮後，以矽膠管柱(溶劑梯度；10→50%乙酸乙酯/己烷)進行精製，獲得標題化合物(3.16g)。MS(ESI+)：606.4 [M+Na]+ (ii)N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 將N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(3150mg)之乙醇(60ml)、10%鈀碳(含水50%、1000mg)之混合物，於氫環境下(1atm)於室溫攪拌4個半小時。由於係殘留原料，故將內部系統進行氬取代後，將混合物進行矽鈣石過濾，並將過濾液濃縮。將殘渣溶於甲醇(60ml)，並將添加10%鈀碳(含水50%、1000mg)之混合物，於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌5小時。確認原料消失後，將內部系統進行氬取代，並將混合物進行矽鈣石過濾，將過濾液濃縮，獲得標題化合物(2520mg)。MS(ESI+)：450.4
(iii)N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯(825mg)之飽和碳酸氫鈉水溶液(6ml)懸濁液中，於冰冷卻下添加2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸甲基酯(340mg)之THF(12ml)溶液。於同溫下，攪拌2小時後，添加1M氫氧化鈉水溶液(0.36ml)，並於室溫下攪拌1小時。將混合物以乙酸乙酯與水稀釋後，使用10%檸檬酸水溶液使其成為酸性。將有機層分離，以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水進行洗淨，並以硫酸鎂進行乾燥、過濾後，將過濾液進行減壓濃縮。將殘渣以矽膠管柱(溶劑梯度；0→8% 甲醇/氯仿)進行精製，並獲得標題化合物(743mg)。MS(ESI+)：552.4 [M+Na]+ (iv)L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(325mg)之二氯甲烷(4ml)溶液中，於冰冷卻下，將TFA(2ml)滴入。將混合物於同溫下，攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮，獲得標題化合物(418mg)之粗生成物。MS(ESI+)：430.4
(v)N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽(415mg)之二氯甲烷(10ml)混合物中，依序添加N-(tert-丁氧基羰基)甘胺酸(118mg)、三乙基胺(以下略稱為TEA)(0.26ml)、HATU(256mg)，並將混合物於室溫下攪拌一晩。將混合物進行減壓濃縮後，以矽膠管柱(溶劑梯度；0→30%丙酮/氯仿)進行精製，並獲得標題化合物(206mg)。MS(ESI+)：609.4[M+Na)+
(vi)甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽之合成 使用N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(205mg)，以與上述實施例2-12(iv)同樣的方式進行，獲得標題化合物(223mg)之粗生成物。MS(ESI+)：487.4 (vii)甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸單(三氟乙酸)鹽之合成 於甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽(9mg)之二氯甲烷(1ml)混合物中，添加TFA(1ml)，於室溫下攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮，獲得標題化合物(8mg)之粗生成物。MS(ESI+)：431.3
(viii)N-[(4-{[1,4,7,10-四(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代胺甲醯基]甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 於甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸單(三氟乙酸)鹽(8mg)與2,2’,2’’,2’’’-{2-[(4-異氰硫基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基}四乙酸(略稱為p-SCN-Bn-DOTA)(8mg)之DMF(1ml)混合物中，添加DIPEA(35μL)，並於室溫下攪拌1.5小時。將混合物以1%TFA水溶液(約5ml)進行稀釋，藉由逆相管柱層析(溶劑梯度5-50% 乙腈/0.1%TFA水溶液)精製，獲得標題化合物(13mg)。MS(ESI+)：982.3 (ix)氫=[N-{[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }甲基)苯基]硫代胺甲醯基}甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(4-)]釓酸根(1-)之合成 將N-[(4-{[1,4,7,10-四(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代胺甲醯基]甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(12mg)以水(5ml)稀釋，並添加氯化釓(4mg)。以0.1M碳酸氫鈉將混合物的pH調整為5-6，並於室溫下攪拌1小時。於混合物中添加0.5M EDTA水溶液(80μL)，並於室溫下攪拌5分鐘。添加TFA(10μL)後，藉由逆相管柱層析(溶劑梯度5-50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(5mg)。MS(ESI+)：1137.0 (x)複合體No.12之合成 使用氫=[N-{[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }甲基)苯基]硫代胺甲醯基}甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(4-)]釓酸根(1-)，以與上述實施例2-11之步驟(x)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1136之[Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys＊ -Z2 (＃N)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例2-13.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image231
(i)N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(1.00g)之二氯甲烷(6mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(3mL)，於同溫下攪拌2小時。進行減壓濃縮後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。將合併後之有機層以飽和氯化鈉水溶液進行洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥並過濾後，進行濃縮。於此殘渣中添加N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲硫胺酸(556mg)、二氯甲烷(10mL)、DIPEA(2mL)、HATU(1.16g)，並於室溫下攪拌1小時。將反應溶液濃縮後，於殘渣中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。合併後之有機層以1M氫氧化鈉水溶液及飽和氯化鈉水溶液洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥，過濾後，藉由濃縮獲得標題化合物(1.70g)。MS(ESI+)；625.5 (ii)L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(1.70g)之二氯甲烷(10mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(4mL)，於同溫下攪拌7小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(胺基矽膠，溶劑梯度；0→4%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(663mg)。MS(ESI+)；525.4
(iii)N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 將L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(663mg)、二氯甲烷(6mL)、3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}安息香酸(480mg)、DIPEA(700μL)、HATU(960mg)之混合物於室溫下攪拌39小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→100%乙酸乙酯/己烷)進行精製，獲得標題化合物(935mg)。MS(ESI+)；758.5 (iv)N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(935mg)之二氯甲烷(2mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌1小時。添加Et3 N、胺基矽膠並進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(胺基矽膠，溶劑梯度；0→10%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(260mg)。MS(ESI+)；658.5
(v)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 使用N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(260mg)，以與上述實施例2-11之步驟(v)同樣的方式進行，獲得標題化合物(353mg)。MS(ESI-)：1210.4 (vi)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸 tert-丁基酯(353mg)，以與上述實施例2-11之步驟(vi)同樣的方式進行，獲得標題化合物(245mg)。MS(ESI+)：1078.8
(vii)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸 tert-丁基酯(245mg)，以與上述實施例2-11之步驟(vii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(139mg)。MS(ESI+)：1158.8 (viii)N-[3-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(341mg)，以與上述實施例2-11之步驟(viii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(38.2mg)。MS(ESI+)：934.4 (ix)[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓之合成 使用N-[3-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(28mg)，以與上述實施例2-11之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得標題化合物(13.8mg)。MS(ESI+)：1089.2 (x)複合體No.13之合成 使用[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓，以與上述實施例2-11之步驟(x)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1089之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]之複合體、鍵結有2個之複合體，及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例2-15.([Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image233
(i)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(400mg)之二氯甲烷(4mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(4mL)，並於冰冷卻下，攪拌1小時。藉由將反應混合物進行減壓濃縮，獲得標題化合物(642mg)。MS(ESI+)；340.4 (ii)N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 於甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽(642mg)、二氯甲烷(6mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}安息香酸(228mg)、DIPEA(1.5mL)、HATU(345mg)，將此混合物於室溫下攪拌2小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→4%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(489mg)。MS(ESI+)；573.4 (iii)N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)苯甲醯基]甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(489mg)、苯甲醚(280μL)、二氯甲烷(5mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，添加二氯甲烷(7mL)，並於冰冷卻下，添加2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧雜-5-氮雜十六烷-16-酸(289mg)、DIPEA(1.5mL)、HATU(487mg)，並將此混合物於室溫下攪拌2小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→1%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(427mg)。MS(ESI+)；762.5
(iv)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)苯甲醯基]甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(427mg)、苯甲醚(200μL)、二氯甲烷(4mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(1.3mL)，並於同溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，添加DMF(6mL)，於冰冷卻下，添加DOTA-tris(t-Bu)ester(353mg)、DIPEA (0.96mL)、HATU(320mg)，並將此混合物於室溫下攪拌2小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→10%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(863mg)。MS(ESI+)：1238.9[M+Na]+ (v)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(863mg)，以與上述實施例2-11之步驟(viii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(40.0mg)。MS(ESI+)：992.5 (vi)[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓之合成 使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(40mg)，以與上述實施例2-11之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得標題化合物(15.9mg)。MS(ESI-)：1145.0 (vii)複合體No.15之合成
使用[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓，以與上述實施例2-11之步驟(x)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1147之[Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]之複合體、鍵結有2個之複合體，及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例2-24.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]p-Fab2 )之合成) 複合體No.24之合成(經由亞胺基四氫噻吩進行接合(Conjugation)) 於4.45mg/mL Fab2 之硼酸緩衝液(160μL)中添加2mg/mL 2-亞胺基四氫噻吩(以下，略稱為2-IT)之0.1M硼酸緩衝液(5μL)，並於37℃下培養40分鐘。過剩的2-IT係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器，以磷酸緩衝生理食鹽水重複洗淨3次，並於最後進行濃縮。 將實施例2-13(ix)所合成之[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。於該溶液中添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，以使其成為pH6.0的方式添加0.1M碳酸鈉水溶液。 於包含抗體之所獲得之濾液中添加調製之連接子溶液，並於30℃下培養2小時。添加含有EDTA之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)後，於30℃下培養10分鐘。使用PD-10管柱精製，並以 Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨7次並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1190之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 (實施例2-29.([Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image235
(i)3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)安息香酸甲基酯之合成 於2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧雜-5-氮雜十六烷-16-酸(396mg)之二氯甲烷(10mL)溶液中，添加3-(胺基甲基)安息香酸甲基酯一鹽酸鹽(286mg)、HATU(590mg)、Et3 N(900μL)，並於室溫下攪拌2小時。將反應混合物濃縮，並將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；2→6%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(598mg)。MS(ESI+)；455.2 (ii)3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)安息香酸之合成 於3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)安息香酸甲基酯(597mg)之THF(15mL)溶液中添加1M氫氧化鈉水溶液(4mL)及水(5mL)，並於室溫下攪拌5小時攪拌。將反應溶液以水稀釋，並添加10%檸檬酸後，以乙酸乙酯萃取，並將收集到的有機層以飽和食鹽水洗淨。將有機層藉由無水硫酸鎂進行乾燥、過濾後，將濾液藉由減壓濃縮，獲得標題化合物(662mg)。MS(ESI+)；441.1 (iii)N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(1.63g)、二氯甲烷(5mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(3mL)，並於同溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮。於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲硫胺酸(1.11g)、二氯甲烷(8mL)、HATU(2.12g)之混合物中添加DIPEA(5mL)，並於室溫下攪拌5分鐘。於此反應混合物中，添加於先前之反應中所獲得之殘渣之二氯甲烷(4mL)溶液，並於室溫下攪拌20小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→5%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(1.63g)。MS(APCI/ESI+)；571.3
(iv)N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(150mg)、二氯甲烷(2mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮。於3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)安息香酸(120mg)、二氯甲烷(3mL)、HATU(150mg)之混合物中，添加DIPEA(360μL)，並於室溫下攪拌5分鐘。於此反應混合物中，添加於先前之反應中所獲得之殘渣之二氯甲烷(2mL)溶液，並於室溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→5%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(113mg)。MS(ESI+)；893.4 (v)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽之合成 於N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧雜-2,14-二氮雜十八烷-1-基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(113mg)與二氯甲烷(2mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌1小時後，進行減壓濃縮，並獲得粗生成物。於DOTA-tris(t-Bu)ester(80mg)與HATU(80mg)及二甲基乙醯胺(以下略稱為DMAc)(1mL)之混合物中於室溫下添加DIPEA(0.22mL)，並攪拌10分鐘後，添加先前所獲得之粗生成物之DMAc(1mL)混合物，並於同溫下攪拌2小時。反應混合物係藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(178mg)。MS(ESI-)：1345.8 (vi)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽(178mg)，以與上述實施例2-11之步驟(viii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(60.0mg)。MS(APCI/ESI+)：1123.4
(vii)[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓之合成 使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(40mg)，以與上述實施例2-11之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得標題化合物(10.3mg)。MS(ESI+)：1278.3 (viii)複合體No.29之合成 使用[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓，以與上述實施例2-11之步驟(x)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1278之[Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 (實施例2-33.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image237
(i)N-[2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(150mg)、二氯甲烷(2mL)之混合物中，於冰冷卻下，添加TFA(2mL)，於同溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮。於2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羧酸(88mg)、二氯甲烷(2mL)、HATU(150mg)、DIPEA(360μL)之混合物中，添加於先前之反應中所獲得之殘渣之二氯甲烷(2mL)溶液，並於室溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→6%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(231mg)。MS(APCI/ESI+)；752.2[M+Na]+ (ii)N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽之合成 使用N-[2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(231mg)，以與上述實施例2-29之步驟(v)同樣的方式進行，獲得標題化合物(222mg)。MS(ESI-)：1182.7 (iii)N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 使用N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽(222mg)，以與上述實施例2-11之步驟(viii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(53mg)。MS(APCI/ESI+)：960.2
(iv){N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯基-κO)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基 (3-)}釓之合成 使用N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(22mg)，以與上述實施例2-11之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得標題化合物(7.0mg)。MS(ESI+)：1115.3 (v)複合體No.33之合成 使用(iv)之化合物，以與上述實施例2-11之步驟(x)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1115之[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃N)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 (實施例2-35.([Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]p-Fab2 )之合成) 複合體No.35之合成 使用實施例2-29(vii)所合成之[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }-5,8,11-三氧雜-2,14-二氮雜十六烷-1-基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(3-)]釓，以與上述實施例2-24之步驟同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1380之[Gd/DOTA-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]之複合體。 (實施例2-40.([Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH -CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image239
(i)N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯之合成 使用N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(690mg)，以與上述實施例2-33之步驟(i)同樣的方式進行，獲得標題化合物(710mg)。MS(ESI+)：726.5[M+Na]+ (ii)N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽之合成 使用N-(3-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯甲醯基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(41mg)，以與上述實施例2-12(iv)同樣的方式進行，獲得標題化合物(42mg)之粗生成物。MS(ESI+)：604.3 (iii)N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽(41mg)之二氯甲烷(4ml)混合物中，添加TFA(2ml)，並於室溫下攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮後，與甲苯共沸，獲得粗生成物(43mg)。將其中之16mg以逆相管柱層析(溶劑梯度；5→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)精製，獲得標題化合物(11mg)。MS(ESI+)：548.2 (iv)N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-四(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代胺甲醯基]胺基}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 使用N-[3-(胺基甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸單(三氟乙酸)鹽(11mg)，以與實施例2-12之步驟(viii)同樣的方式進行，獲得標題化合物(17mg)。MS(ESI+)：1099.5
(v)氫=[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }甲基)苯基]硫代胺甲醯基}胺基)甲基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(4-)]釓酸根(1-)之合成 使用N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-四(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代胺甲醯基]胺基}甲基)苯甲醯基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸(16mg)，以與實施例2-12之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得標題化合物(6mg)。MS(ESI+)：1254.6 (vi)複合體No.40之合成 使用氫=[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }甲基)苯基]硫代胺甲醯基}胺基)甲基]苯甲醯基}-L-甲二磺醯基甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺醯基(4-)]釓酸根(1-)，以與上述實施例2-24之步驟同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個分子量1355之[Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 (實施例2-47：([Gd/DOTA]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image241
於1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸(DOTA)(16mg)及水(810μL)之混合溶液中，於冰冷卻下，添加1M氫氧化鈉水溶液(80μL)調製為pH6。於所獲得之溶液(239μL)中，於冰冷卻下，添加溶解於水(117μL)之1-羥基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸鈉(2.3mg)。之後，添加3-{[(乙基亞胺基)亞甲基]胺基}-N,N-二甲基丙烷-1-胺一鹽酸鹽(以下略稱為EDC HCl)水溶液(8.3μL、25mg/mL)，於冰冷卻下攪拌30分鐘，調製N-羥基磺基琥珀醯亞胺DOTA溶液。於添加Fab2 前，添加0.2M磷酸氫二鈉水溶液(pH9)(40μL)調製成pH7。 (i)添加調製為17.8mg/mL Fab2 (60μL)之0.1M磷酸氫二鈉水溶液(390μL)之N-羥基磺基琥珀醯亞胺DOTA溶液(200μL)，於4℃培養23小時。過剩的連接子係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器以10mM磷酸緩衝液重複洗淨3次，以0.3M之乙酸銨緩衝液洗淨，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。
Figure 02_image243
(ii)將包含(i)所製作之複合體之0.3M之乙酸銨緩衝液以同樣的緩衝液進行稀釋，並使用0.25M Acetate buffer調整為pH6.62。於此調製為2.8mg/ml之Fab2 溶液中，添加調製為0.057M之GdCl3 水溶液(35μL)，並於37℃下培養0.5小時。反應後，添加0.05M EDTA(525μL)，之後使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨5次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個或鍵結有2個分子量542之[Gd/DOTA]之複合體之混合物。 (實施例2-48：([Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image245
(i)屬於螯合劑之DOTA對於Fab2 之鍵結，係使用p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics公司)。於藉由磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)及甘油調製為2.54mg/mL之Fab2 溶液中，添加0.1M碳酸鈉溶液(pH9.0)調整為pH8.8-9.5。於其中添加p-SCN-Bn-DOTA，並於37℃培養2小時。反應後，以Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器回收，並精製複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2，鍵結有1個或鍵結有2個分子量553之[4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)]之複合體。
Figure 02_image247
(ii)使用(i)所製作之複合體，與上述實施例2-47之步驟(ii)同樣地進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量706之[Gd/4arm-DOTA-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=S)]之複合體。 (實施例2-60：([DFO-C(=O)-CH2 O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]p -Fab2 )之合成)
Figure 02_image249
(i)3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]安息香酸之合成 於(3-甲醯基苯氧基)乙酸苄基酯(2.90g)、2-甲基丙烷-2-醇(60mL)及水(30mL)之混合物中，於室溫下添加2-甲基丁-2-烯(6mL)、磷酸二氫鈉二水合物(3.35g)及亞氯酸酸鈉(3.64g)，攪拌2小時。於反應液中添加乙酸乙酯及1M鹽酸(60mL)，並以乙酸乙酯進行萃取。將有機層以水及飽和氯化鈉水溶液進行洗淨，並以無水硫酸鎂乾燥，並進行過濾。藉由將濾液濃縮獲得標題化合物(2.93g)。MS(ESI-)；285.1 (ii)N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯之合成 將N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基-L-酪胺酸tert-丁基酯(2.49g)溶解於丙酮(50mL)，並添加溴乙酸乙酯(2.05g)、碳酸鉀(2.41g)，並於室溫下攪拌4小時。將不溶物濾去，並濃縮濾液，將所獲得之殘渣藉由矽膠管柱層析法(乙酸乙酯：己烷=30：70-60：40)進行精製，獲得標題化合物(2.99g)。MS(ESI+)：537.4[M+Na]+ (iii)N-{3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯之合成 將N-[(苄氧基)羰基]甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯(2.75g)溶解於乙醇(55mL)中，並於氬環境下，添加10%鈀碳(含水50%、550mg)，於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌一整夜。將內部系統進行氬取代後，將不溶物濾去，並濃縮濾液，將殘渣溶解於二氯甲烷(55mL)中，並添加3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]安息香酸(1.99g)、HATU(2.84g)、Et3 N(1.5mL)，於室溫下攪拌1小時。將反應液濃縮，藉由矽膠管柱層析法(乙酸乙酯：己烷=30：70-70：30)精製，獲得標題化合物(3.07g)。MS(ESI-)：647.4
(iv)N-[3-(羧基甲氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯之合成 將N-{3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯(3282mg)溶解於THF(66mL)中，於氬環境下添加10%鈀碳(含水50%、328mg)，並於氫環境下，於室溫下攪拌一整夜。將反應液以矽鈣石過濾，並將濾液濃縮，獲得標題化合物(2.54g)。MS(ESI-)：557.4 (v)N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸　tert-丁基酯之合成 於N4 -{5-[乙醯基(羥基)胺基]戊基}-N1 -(5-{4-[(5-胺基戊基)(羥基)胺基]-4-氧代丁醯胺}戊基)-N1 -羥基丁烷二醯胺單甲烷磺酸鹽(DFO.MeSO3 H)(500mg)、N-[3-(羧基甲氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸　tert-丁基酯(446mg)、EDC HCl(175mg)、1H-苯并三唑-1-醇(以下略稱為HOBt)(123mg)中添加DMF(5mL)、Et3 N(0.16mL)，並於室溫下攪拌一整夜。於反應液中添加0.1%TFA水溶液(1ml)、TFA(0.03mL)，並以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-0：100)進行精製，獲得標題化合物(548mg)。MS(ESI-)：1099.7 (vi)N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(羧基甲基)-L-酪胺酸tert-丁基酯之合成 於N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪胺酸　tert-丁基酯(500mg)中添加甲醇(5mL)及DMF(5mL)，加熱一會兒並使其溶解，添加1M氫氧化鈉水溶液(600μL)，於室溫下攪拌一整夜。追加1M氫氧化鈉水溶液(600μL)，並於室溫下攪拌一整夜。於冰冷卻下，添加TFA(90μL)，並於減壓下將甲醇餾去，藉由將所獲得之溶液以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-0：100)精製，獲得標題化合物(315mg)。MS(ESI-)：1071.6
(vii)N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯之合成 於N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(羧基甲基)-L-酪胺酸tert-丁基酯(269mg)、EDC HCl(58mg)、HOBt(41mg)之混合物中添加DMF(4mL)，並進一步添加1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮一鹽酸鹽(44mg)、Et3 N(35μL)，並於室溫下攪拌4小時。於反應液中添加0.1%TFA水溶液(1mL)，並藉由逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-0：100)精製，獲得原料羧酸與標題化合物之混合物(155mg、約6：4)。將其溶解於DMSO(1mL)及DMF(2mL)中，並添加EDC HCl(22mg)、HOBt(15mg)，於室溫下攪拌5分鐘後，添加1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮一鹽酸鹽(15.5mg)、Et3 N(12μL)，於室溫下攪拌1小時。於反應液中添加0.1%TFA水(1mL)，並藉由逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-10：90)精製，獲得標題化合物(118mg)。MS(ESI-)：1193.6 (viii)N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-L-酪胺酸之合成 將N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-L-酪胺酸tert-丁基酯(118mg)溶解於TFA(1.2mL)中，並於室溫下攪拌1.5小時。將反應液濃縮，並添加DMF(1.5ml)、水(0.5ml)，以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-10：90)進行精製，獲得標題化合物(82mg)。MS(ESI-)：1137.5
(ix)複合體No.60之合成 於藉由0.1M硼酸緩衝液調製為4.45mg/mL之Fab2 溶液中添加藉由0.1M硼酸緩衝液調製之2-IT溶液，於37℃下培養30分鐘。過剩的2-IT係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器，以含有EDTA之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)進行，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾。於所獲得之濾液中，添加溶解於DMF之N-{3-[(9,20,31-三羥基-2,10,13,21,24,32-六氧-3,9,14,20,25,31-六氮雜三十三烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]胺基}-2-氧代乙基)-L-酪胺酸，並以0.1M硼酸緩衝液(pH8.5)稀釋，於室溫下培養2小時。過剩的試藥係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器以含有EDTA之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)洗淨，將其重複進行3次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾。 接著，於所獲得之上清液中，添加藉由磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)調製為10mg/mL之2-碘乙醯胺溶液後，於37℃培養30分鐘。過剩的碘乙醯胺係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器以磷酸緩衝生理食鹽水重複洗淨3次、並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，精製鍵結有Fab2 之複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1241之[DFO-C(=O)-CH2 O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]之複合體之混合物。 (實施例2-61：([DFO-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]p -Fab2 )之合成)
Figure 02_image251
(i)N-(3-羥基苯甲醯基)甘胺酸tert-丁基酯之合成 在3-羥基安息香酸(1.0g)與甘胺酸tert-丁基酯一鹽酸鹽(1.2g)之DMF(10mL)混合物中，於冰冷卻下添加HATU(3.3g)及DIPEA(3mL)，於室溫下攪拌1小時。於混合物中添加水及乙酸乙酯，進行二次分液萃取，並將有機層以水及飽和氯化鈉水溶液洗淨後，以無水硫酸鎂進行乾燥、過濾後，將濾液進行減壓濃縮，並於所獲得之固體中添加乙酸乙酯，於室溫下攪拌後濾取不溶物，並將過濾液濃縮。將殘渣藉由矽膠管柱層析法(己烷/乙酸乙酯=95/5-50/50)進行精製，收集目的物之餾分並濃縮、進行減壓乾燥，獲得標題化合物(1.23g)。MS(ESI+)：274.2 [M+Na]+ (ii)3-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸 苄基酯之合成 於冰冷卻下於3-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸tert-丁基酯(3.0g)中添加4M氯化氫/二噁烷(10mL)後，將該混合物於室溫下攪拌1小時。濃縮後，以甲苯進行2次共沸乾燥後，於室溫下添加甲醇(20mL)與1M氫氧化鈉水溶液(13mL)，並於同溫下攪拌1小時半。將混合物濃縮後，添加THF(10mL)、甲醇(10mL)及溴化苄(1.8mL)，並於室溫下攪拌3天。將混合物濃縮，並將殘渣藉由矽膠管柱層析法進行精製(己烷/乙酸乙酯=95/5-0/100→氯仿/甲醇=90/10)，獲得標題化合物(2.19g)。MS(ESI+)：313.2 (iii)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺酸tert-丁基酯之合成 添加N-(3-羥基苯甲醯基)甘胺酸tert-丁基酯(915mg)、3-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸苄基酯(1.38g)、偶氮二羧酸二乙酯(40%甲苯溶液，約2.2M、3.4mL)、THF(20mL)，之後於室溫下一點一點地添加三苯基膦(2.0g)後，於水浴溫度60℃下攪拌一整夜。添加氯化鎂(1.5g)及甲苯(20mL)，並於水浴溫度60℃下加熱攪拌2小時。放冷至室溫後，將析出之固體藉由過濾去除，並將溶劑餾去。將殘渣藉由矽膠管柱層析法進行精製(矽膠；己烷/乙酸乙酯=95/5-20/80)後，藉由矽膠管柱層析法再度精製(胺基矽膠；己烷/乙酸乙酯=95/5-50/50)，獲得標題化合物(1.12g)。MS(ESI+)：546.4 (iv)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺酸之合成 於室溫下將N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺酸tert-丁基酯(1.11g)溶解於4M氯化氫/二噁烷(5mL)，並於同溫下攪拌2小時。將混合物濃縮，並進行減壓乾燥，獲得標題化合物(1.12g)。MS(ESI+)：490.3
(v)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸　tert-丁基酯之合成 於N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺酸(1300mg)、N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯一鹽酸鹽(1.0g)之DMF(20mL)溶液中，於冰冷卻下添加HATU(1.2g)及DIPEA(1.4mL)，並於室溫下攪拌2小時。於混合物中添加水及乙酸乙酯，並進行分液萃取，將有機層以水及飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鎂進行乾燥、過濾後，將濾液進行減壓濃縮。將殘渣藉由矽膠管柱層析法進行精製(胺基矽膠；己烷/乙酸乙酯=90/10-0/100)，獲得標題化合物(1.14g)。MS(ESI+)：808.5 (vi)N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-L-離胺酸 tert-丁基酯之合成 於N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧雜四癸烷-14-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(1.12g)，Et3 N(20μL)及乙醇(20mL)之混合物中，於室溫下添加10%鈀碳(含水50%、200mg)，並於氫環境下，於同溫下攪拌一整夜。使其成為開放系於室溫攪拌30分鐘以上後，將反應液以矽鈣石過濾，並將濾液濃縮，獲得標題化合物(825mg)。MS(ESI+)：584.5 (vii)N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯(350mg)、THF(3mL)及DMF(1mL)之混合物中，於室溫下添加2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-羧酸甲基酯(150mg)及Et3 N(500μL)，於水浴溫度60℃下攪拌4天。將混合物冷卻至室溫後，添加TFA(300μL)及水(500μl)進行中和。於該混合物中適量添加水及DMF，並以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-0：100)精製。收集目的物之餾分並濃縮、進行減壓乾燥，獲得標題化合物(250mg)。MS(ESI+)：664.5
(viii)N-{3-[(19,30,41-三羥基-12,20,23,31,34,42-六氧-3,6,9-三氧雜-13,19,24,30,35,41-六氮雜三四環烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯之合成 於N4 -{5-[乙醯基(羥基)胺基]戊基}-N1 -(5-{4-[(5-胺基戊基)(羥基)胺基]-4-氧代丁醯胺}戊基)-N1 -羥基丁烷二醯胺單甲烷磺酸鹽(DFO.MeSO3 H)(240mg)、N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲醯基]甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸 tert-丁基酯(243mg)之DMF(3mL)及DMSO(1mL)之混合物中，於冰冷卻下添加EDC HCl(140mg)，HOBt(100mg)及DIPEA(200μL)，於室溫下攪拌3小時。添加TFA(100μL)及水(500μL)，並將該溶液以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-10：90)進行精製，並進行凍結乾燥，獲得標題化合物(207mg)。MS(ESI+)：1228.5[M+Na]+ (ix)N-{3-[(19,30,41-三羥基-12,20,23,31,34,42-六氧-3,6,9-三氧雜-13,19,24,30,35,41-六氮雜三四環烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸之合成 於室溫下於N-{3-[(19,30,41-三羥基-12,20,23,31,34, 42-六氧-3,6,9-三氧雜-13,19,24,30,35,41-六氮雜三四環烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸tert-丁基酯(202mg)中添加TFA(1mL)，並於同溫下攪拌1小時。將混合物濃縮，並將添加有DMF(4ml)及水(500μL)之混合物以逆相管柱層析(0.1%TFA水溶液：乙腈=95：5-10：90)進行精製，並進行凍結乾燥，獲得標題化合物(137mg)。MS(ESI-)：1148.7 (x)複合體No.61之合成 使用N-{3-[(19,30,41-三羥基-12,20,23,31,34,42-六氧-3,6,9-三氧雜-13,19,24,30,35,41-六氮雜三四環烷-1-基)氧基]苯甲醯基}甘胺醯基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-L-正白胺酸，以與上述實施例2-60之步驟(ix)同樣的方式進行，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1252之[DFO-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys＊-Z2 (＃S)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 (實施例2-18.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃N)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image253
(i)(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)胺基甲酸4-硝基苯基酯之合成 於氮環境下，將氯甲酸4-硝基苯基酯(952mg)之二氯甲烷(10ml)溶液進行冰冷卻，並將[(4-胺基苯基)甲基]胺基甲酸tert-丁基酯(1000mg)及吡啶(430μL)之二氯甲烷(10mL)混合溶液滴下後，於同溫下攪拌1小時。反應將混合物進行減壓濃縮，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；10→100%乙酸乙酯/己烷)進行精製，獲得粗生成物。於粗生成物中添加乙酸乙酯，攪拌並將固體粉碎。濾取固體，並藉由乙酸乙酯洗淨後，藉由減壓乾燥，獲得標題化合物(861mg)。MS(ESI+)：410.3[M+Na]+ (ii)L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺(257mg)之二氯甲烷(4ml)溶液中，於冰冷卻下，將TFA(2ml)滴入。將混合物於同溫下，攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮，添加二異丙基醚，並進行2次傾析將將沉澱後之固體洗淨，獲得標題化合物(248mg)之粗生成物。MS(ESI+)：385.3 (iii)N-[(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)氨基甲醯基]-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺之合成 於(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)胺基甲酸4-硝基苯基酯(54mg)及L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺單(三氟乙酸)鹽(70mg)之二氯甲烷(5ml)混合溶液中，添加TEA(59μL)，並於室溫下攪拌30分鐘。反應將混合物進行減壓濃縮，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；2→6%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(55mg)。MS(ESI+)：633.5
(iv)N-{[4-(胺基甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-[(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)氨基甲醯基]-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺(54mg)之二氯甲烷(4ml)溶液中，於冰冷卻下，滴入TFA(2ml)，並於同溫下攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮，添加二異丙基醚並進行2次傾析將沉澱後之固體洗淨，獲得標題化合物(65mg)之粗生成物。MS(ESI+)：555.4[M+Na]+ (v)N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽之合成 於N-{[4-(胺基甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺單(三氟乙酸)鹽(64mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(50mg)之DMAc(2mL)混合溶液中，添加HATU (66mg)、DIPEA(45μL)，並於室溫下攪拌2小時。於反應混合物中添加1%TFA水溶液(約4ml)及乙腈(約1ml)後，將該稀釋溶液以逆相管柱層析(溶劑梯度；20→100%0.1%TFA乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(92mg)。MS(ESI+)：1109.4[M+Na]+ (vi)N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽之合成 於N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽(90mg)之二氯甲烷(4mL)溶液中添加TFA(4mL)，並於室溫下攪拌一整夜。進行減壓濃縮後，將殘渣藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；5→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(57mg)。MS(ESI+)：919.4 (vii)[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓之合成 於N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽(22mg)、水(3mL)之混合物中添加氯化釓(8mg)，並添加0.1M碳酸氫鈉水溶液，調整至pH5-6，並於室溫下攪拌1小時。於反應混合物中添加TFA(10μL)後，將該溶液藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；5→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(16mg)。MS(ESI-)：1072.1
(viii)複合體No.18之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。於該溶液中添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，使用0.1M碳酸鈉水溶液及0.25M乙酸緩衝液調整為pH7.3。 於4.45mg/mL　Fab2 之硼酸緩衝液(160μL)中添加預先調製之溶液40μL，並於30℃下培養2小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨7次並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1074之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃N)]之複合體、鍵結有2個之複合體及、鍵結有3個之複合體之混合物。
(實施例2-66.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4 and/or A-5)]p-Fab2 )之合成) (i)複合體No.66之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。於該溶液中添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至pH6.5。 於4.45mg/mL　Fab2 之硼酸緩衝液(320μL)中，添加前調製之溶液，於30℃下培養2小時。添加10μL之0.05M之EDTA，於30℃下培養10分鐘。Amicon Ultra-15mL使用離心式過濾器，以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並回收溶液。 於回收後之溶液中添加20mM Bis-Tris丙烷緩衝溶液(pH9.5)，稀釋為5倍量，使其載持於5mL HiTrap Q column(GE Healthcare)，於室溫下靜置6小時。使用20mM　Bis-Tris丙烷緩衝溶液(pH9.5)及1M氯化鈉水溶液洗淨管柱，將載持溶液回收。使用Amicon Ultra-15mL離心式過濾器向磷酸緩衝生理食鹽水與緩衝溶液進行交換後，將該溶液使用PD-10管柱進行精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1092之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4　and/or　A-5)]之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。
(實施例2-67.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]p-Fab2 )之合成) (i)複合體No.67之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(2mg)溶解於DMSO(80μL)中，並於添加0.1M硼酸緩衝液(80μL)後，使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至pH7.3。 於4.45mg/mL Fab2 之硼酸緩衝液(320μL)中添加藉由0.1M硼酸緩衝液調製之2mg/mL之2-IT溶液(10μL)，並於37℃下培養40分鐘。過剩的2-IT係使用Amicon Ultra-15mL離心式過濾器，以磷酸緩衝生理食鹽水進行洗淨，濃縮至200μL後，添加預先調整之溶液，於30℃下培養2小時。添加0.05M之EDTA(10μL)，於30℃下培養10分鐘後，使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。 該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1175之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例2-68.[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image255
(i)N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-N2 -(tert-丁氧基羰基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-異白胺酸(3.00g)及HATU(5.92g)之二氯甲烷(30ml)混合溶液中，依序添加DIPEA(6.6mL)、(2-胺基乙基)胺基甲酸苄基酯一鹽酸鹽(3.29g)，並於室溫下攪拌1小時。於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。將合併後之有機層以飽和氯化鈉水溶液進行洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥並過濾後，進行濃縮。於殘渣中添加乙酸乙酯/二氯甲烷(1：2)溶液200mL後，進行濃縮，成為100mL溶液後，進行冰冷卻。濾取析出之固體，並以乙酸乙酯/二氯甲烷(1：1)溶液進行洗淨獲得固體。將過濾液再度濃縮後，進行冰冷卻，並濾取析出之固體，以乙酸乙酯/二氯甲烷(1：1)溶液洗淨，獲得固體。將所獲得之固體合併，藉由減壓乾燥，獲得標題化合物(4.10g)。MS(ESI+)：　408.3 (ii)N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-N2 -(tert-丁氧基羰基)-L-異白胺酸醯胺(2.00g)之二氯甲烷(10mL)溶液中，於冰冷卻下，添加TFA(7.51mL)，並於同溫下攪拌1小時。進行減壓濃縮後，於此殘渣中添加N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲硫胺酸(1.35g)、DIPEA(4.2mL)、二氯甲烷(20mL)及HATU(2.24g)，並於室溫下攪拌1小時。濾取析出之固體，並以二氯甲烷及甲醇洗淨後，藉由減壓乾燥，獲得標題化合物(1.58g)。MS(ESI+)：539.4 (iii)L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於N-(tert-丁氧基羰基)-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺(1.05g)之二氯甲烷(6ml)溶液中，於冰冷卻下，滴入TFA(3ml)。將混合物於同溫下，攪拌2小時。將混合物進行減壓濃縮，二氯甲烷及添加飽和碳酸氫鈉水溶液，以二氯甲烷萃取2次。將合併後之有機層以飽和氯化鈉水溶液進行洗淨後，以無水硫酸鈉進行乾燥，過濾後，藉由濃縮獲得標題化合物(690mg)之粗生成物。MS(ESI+)：439.4
(iv)N-[(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)氨基甲醯基]-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於氬環境下，於4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}安息香酸(395mg)、TEA(660μL)及甲苯(20mL)之混合溶液中添加磷醯胺酸二苯基酯(680μL)，並於室溫下1小時攪拌後，於水浴溫度100℃下攪拌2小時。將反應溶液放冷至室溫，並添加 L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺(690mg)之THF(7mL)溶液，於室溫下攪拌3小時。將反應溶液進行減壓濃縮，並添加碳酸氫鈉水溶液及乙酸乙酯，並將生成之固體過濾，藉由乙酸乙酯洗淨後，藉由減壓乾燥，獲得標題化合物(790mg)。MS(ESI+)：687.5 (v)N-{[4-(胺基甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於N-[(4-{[(tert-丁氧基羰基)胺基]甲基}苯基)氨基甲醯基]-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺(790mg)之二氯甲烷(3ml)溶液中，於冰冷卻下，將TFA(2ml)滴入。將混合物於同溫下，攪拌1小時。將混合物進行減壓濃縮，添加飽和碳酸氫鈉水溶液。濾取析出之固體，並以水洗淨後，藉由減壓乾燥，獲得標題化合物(720mg)之粗生成物。MS(ESI+)：587.6 (vi)N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 於N-{[4-(胺基甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺(360mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(386mg)、DIPEA(320μL)之DMAc(2mL)混合溶液中添加HATU(280mg)，並於室溫下攪拌2小時。將反應混合物藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→20%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(683mg)。MS(ESI+)；1141.9
(vii)N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-胺基乙基)-L-異白胺酸醯胺之合成 將N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(苄氧基)羰基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺(683mg)、10%鈀碳(含水50%、382mg)及甲醇(10mL)之混合物於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌18小時。將該混合物進行過濾去除不溶物後，進行濃縮。於殘渣中添加10%鈀碳(含水50%、382mg)及甲醇(10mL)，並將此混合物於氫環境下(1atm)於室溫下攪拌2小時。將該混合物進行過濾去除不溶物後，藉由濃縮獲得標題化合物(417mg)。MS(ESI+)；1007.7 (viii)N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-胺基乙基)-L-異白胺酸醯胺五(三氟乙酸)鹽之合成 將N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-胺基乙基)-L-異白胺酸醯胺(417mg)、水(210μL)、三(丙烷-2-基)矽烷(210μL)及TFA(8mL)之混合溶液，於室溫下攪拌3小時。進行減壓濃縮後，將殘渣藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→33%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(255mg)。MS(ESI+)；839.7 (ix)N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽之合成 於N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-胺基乙基)-L-異白胺酸醯胺五(三氟乙酸)鹽(255mg)之DMAc(2mL)溶液中，於冰冷卻下添加TEA(200μL)，並於同溫下攪拌10分鐘。於該溶液中添加1,4-二異氰硫基苯(174mg)之DMAc(2mL)溶液，於同溫下攪拌1小時。將該反應溶液藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(136mg)。MS(ESI+)；1031.4
(x)[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓之合成 於N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽(36mg)、水(1.8mL)之混合物中添加氯化釓(10mg)、0.1M碳酸氫鈉水溶液(1.7mL)，調整至pH5.4，並於室溫下攪拌30分鐘。將反應混合物藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(33.0mg)。MS(ESI-)；1184.3 (xi)複合體No.68之合成 將實施例2-68(x)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(310μL)中。 於4.45mg/mL Fab2 之磷酸緩衝生理食鹽水溶液(320μL)中，添加預先調製之溶液30μL，並使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至約pH9.0，於37℃下培養24小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1187之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個複合體之混合物。 (實施例2-69.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2 )之合成)
Figure 02_image257
(i)N-[2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯之合成 在L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(303mg)與2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羧酸(160mg)之二氯甲烷(10mL)混合溶液中，添加TEA(0.24mL)及HATU(241mg)，並於室溫下攪拌1小時。將反應混合物進行減壓濃縮後，將殘渣藉由矽膠管柱層析法(溶劑梯度；0→4%甲醇/氯仿)進行精製，獲得標題化合物(191mg)。MS(ESI+)；784.4 (ii)N-(1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽之合成 於N-[2-(tert-丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯(190mg)之二氯甲烷(3ml)溶液中，於冰冷卻下，將TFA(1ml)滴入。將混合物於同溫下，攪拌1小時後，藉由減壓濃縮，獲得標題化合物(262mg)之粗生成物。MS(ESI+)：684.5 (iii)N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽之合成 於DOTA-tris(t-Bu)ester(138mg)之DMAc(1mL)溶液中添加HATU(184mg)及DIPEA(124μL)，於室溫下攪拌5分鐘。於該反應溶液中添加N-(1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯單(三氟乙酸)鹽(261mg)之DMAc(1mL)溶液，於室溫下攪拌2小時。將反應混合物以1% TFA水溶液(約1ml)稀釋後，將該溶液藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；20→100%乙腈/0.1%TFA水溶液)精製，獲得標題化合物(231mg)。MS(ESI+)；1260.7[M+Na]+
(iv)N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽之合成 將N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(苄氧基)羰基]-L-離胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽(230mg)、10%鈀碳(含水50%、300mg)、甲醇(10mL)之混合物於室溫攪拌10分鐘。將該混合物進行過濾，去除不溶物後，並將過濾液濃縮。於該殘渣中添加10%鈀碳(含水50%、300mg)、甲醇(10mL)，於氫環境下(3atm)於室溫攪拌18小時。將該混合物進行過濾，去除不溶物後，藉由濃縮獲得標題化合物(152mg)。MS(ESI+)；1104.5 (v)N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸五(三氟乙酸)鹽之合成 於N-(2-{[4,7,10-三(2-tert-丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸tert-丁基酯四(三氟乙酸)鹽(152mg)之二氯甲烷(1mL)溶液中添加TFA(1.5mL)，並於室溫下攪拌4小時。進行減壓濃縮後，將殘渣藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→33%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(76mg)。MS(ESI+)；880.4 (vi)N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]-L-離胺酸四(三氟乙酸)鹽之合成 於N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-L-離胺酸五(三氟乙酸)鹽(76mg)，1,4-二異氰硫基苯(50mg)之DMAc(1mL)溶液中，於冰冷卻下添加TEA(60μL)，並於同溫下攪拌1小時。藉由將該反應溶液以逆相管柱層析(溶劑梯度；0→50%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(46mg)。MS(ESI-)；1070.6 (vii){N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯基-κO)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]-L-lysinato(3-)}釓之合成 於N-(2-{[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯基}-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基)-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]-L-離胺酸四(三氟乙酸)鹽(16mg)、水(800μL)之混合物中添加氯化釓(8mg)、0.1M碳酸氫鈉水溶液(700μL)，並於室溫下攪拌30分鐘。將反應混合物藉由逆相管柱層析(溶劑梯度；0→40%乙腈/0.1%TFA水溶液)進行精製，獲得標題化合物(7.4mg)。MS(ESI-)；1225.3
(viii)複合體No.69之合成 將實施例2-69(vii)所合成之{N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯基-κO)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]-L-lysinato(3-)}釓(1mg)溶解於DMSO(310μL)中。 於4.45mg/mL Fab2 之磷酸緩衝生理食鹽水溶液(320μL)中，添加預先調製之溶液30μL，並使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至約pH9.0，於37℃下培養24小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1228之[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體、鍵結有4個之複合體及鍵結有5個之複合體之混合物。 上述製造實施例所獲得之複合體係示於表1～2。
Figure 02_image259
Figure 02_image261
此外，前述表以及後述表15～18中，-係表示鍵結，S1 欄之記號(a)～(q)係各自表示下述之式(a)～(q)所表示之間隔區。
Figure 02_image263
使用與上述製造實施例相同之方法，或本發明技術領域中具有通常知識者所習知的方法，合成表3～14之製造例編號A1～A43及B1～B4之化合物，並使用此等，獲得後述表15～18所示之複合體。
Figure 02_image265
Figure 02_image267
Figure 02_image269
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Figure 02_image279
Figure 02_image281
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Figure 02_image285
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Figure 02_image291
Figure 02_image293
Figure 02_image295
表15至18所記載之實施例化合物之MS解析係示於下表19至23。
[表19]
Ex-No MS
1 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量937之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
2 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量838之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
3 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量852之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
4 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1046之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
5 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量926之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
6 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1059之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
7 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1061之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
8 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1027之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
9 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量958之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
10 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1012之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
14 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1093之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
17 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1149之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
[表20]
Ex-No MS
18 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1074之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
19 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量988之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。
20 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量825之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
21 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量960之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。
22 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量896之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
23 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量936之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
25 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1248之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
26 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量954之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
27 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量950之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
28 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量908之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
30 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1149之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
[表21]
Ex-No MS
31 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1123之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
32 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1095之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
34 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1101之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
36 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1045之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
37 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1045之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
38 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1190之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
39 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1384之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
41 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1145之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。
42 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1107之低分子之複合體。
43 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1090之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
44 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1259之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
[表22]
Ex-No MS
45 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1296之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
46 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1296之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
49 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1203之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
50 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1280之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
51 藉由MS解析確認，係與對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1443之低分子之複合體之混合物。
52 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量984之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
53 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1148之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
54 藉由MS解析確認，係與對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1121之低分子之複合體之混合物。
55 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1187之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
56 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1153之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
57 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1079之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
58 藉由MS解析確認，係與對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1244之低分子之複合體之混合物。
[表23]
Ex-No MS
59 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1304之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
62 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1106之低分子之複合體。
63 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1253之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
64 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1076之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
65 藉由MS解析確認，係與對於1個分子量47.9kDa之Fab2 ，鍵結有1個分子量1234之低分子之複合體之混合物及鍵結有2個之複合體之混合物
實施例3-1：CEACAM5抗體Fab片段複合體之鍵結活性評價 針對實施例2所製作之各抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，為了評價對於CEACAM5之鍵結活性，係進行ELISA。本試驗中，作為抗原固相化液之溶劑，係使用以蒸餾水稀釋10倍調製為10mM之磷酸緩衝液(nacalai tesque、0.1mol/L-磷酸緩衝液(pH7.2))，作為洗淨液，係使用以蒸餾水稀釋20倍之20X PBS/Tween 20緩衝液(Thermo公司、28352)。又，本試驗中使用之牛血清白蛋白(BSA)係以使30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA公司、A9576-50ML)成為適當的比例之方式添加使用。將CEACAM5(R＆D Systems公司、4128-CM-050)藉由10mM磷酸緩衝液(pH7.2)以使成為0.1μg/mL的方式稀釋，並於Nunc Maxisorp白色384培養皿(Nunc公司、460372)之每1孔(well)添加30μL，並藉由於4℃下培養培養皿一晩進行固相化。將CEACAM5固相化液以逆離心去除後，藉由添加含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液進行阻斷(blocking)。之後，藉由逆離心去除阻斷溶液，使用含有1.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液，將上述各CEACAM5抗體Fab2 片段複合體，或者作為對照之不具有標記部之Fab2 片段(PB009-01)以10000 ng/mL程度之溶液藉由3倍稀釋進行14連續稀釋，於每1孔添加30μL，於室溫下培養60分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，將使用含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液稀釋1000倍之辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase：HRP)標記山羊抗人類IgG(H+L chain)抗體(MBL Life Science公司、206)於每1孔添加30μL，並於室溫下培養30分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，作為基質，係將ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare公司、RPN2232)於每1孔添加30μL。於室溫下培養15分鐘後，將該訊號值以Envision計數器(PerkinElmer公司)進行測定。 將各抗體之試驗重複進行，藉由4參數邏輯曲線模型算出EC50 值。關於PB009-01之9試驗之EC50 值(nM)之幾何平均(Geometric mean)、標準偏差(Geometric SD factor)、95%信賴區間(95% CI ofgeo. mean)之下限值(Lower)及上限值(Upper)係示於表24。又，重複試驗後之各複合體之EC50 值示於表25。此外，表中Ex-No係顯示實施例2中之複合體編號。
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實施例3-2： 針對實施例2所製作之各抗人類CEACAM5抗體Fab片段複合體，為了評價對於CEACAM5之鍵結活性，係進行ELISA。本試驗中，作為抗原固相化液之溶劑，係使用以蒸餾水稀釋10倍調製為10mM之磷酸緩衝液(nacalai tesque、0.1mol/L-磷酸緩衝液(pH7.2))，作為洗淨液，係使用以蒸餾水稀釋20倍之20X PBS/Tween 20緩衝液(Thermo公司、28352)。又，本試驗中使用之牛血清白蛋白(BSA)係以使30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA公司、A9576-50ML)成為適當的比例之方式添加使用。將CEACAM5(R＆D Systems公司、4128-CM-050)藉由10mM磷酸緩衝液(pH7.2)以使成為0.1μg/mL的方式稀釋，並於Nunc Maxisorp白色384培養皿(Nunc公司、460372)之每1孔添加30μL，並藉由於4℃下培養培養皿一晩進行固相化。將CEACAM5固相化液以逆離心去除後，藉由添加含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液進行阻斷。之後，藉由逆離心去除阻斷溶液，使用含有1.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液，將上述各CEACAM5抗體Fab2 片段複合體，或者作為對照之不具有標記部之Fab2 片段(PB009-01)以10000 ng/mL程度之溶液藉由3倍稀釋進行14連續稀釋，於每1孔添加30μL，於室溫下培養60分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，將使用含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液稀釋1000倍之辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase：HRP)標記山羊抗人類IgG(H+L chain)抗體(MBL Life Science公司、206)於每1孔添加30μL，並於室溫下培養30分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，作為基質，係將ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare公司、RPN2232)於每1孔添加30μL。於室溫下培養15分鐘後，將該訊號值以Envision計數器(PerkinElmer公司)進行測定。
將各抗體之試驗重複進行，藉由4參數邏輯曲線模型算出EC50 值。關於PB009-01之2試驗各自之EC50 值(nM)係示於表26。又，重複試驗後之各複合體之EC50 值係示於表27。此外，表中Ex-No係顯示實施例2中之複合體編號。
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實施例4-1：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(正常老鼠) 複合體中，作為「X」之胜肽連接子，係包含具有胜肽連接子且該胜肽連接子係具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列者。具有此等的連接子之本發明之複合體，係於該連接子部分中，藉由腎臓中存在之此等的酵素特異性地切斷，故期待於標記部之腎臓之聚集性低減。以下，顯示本發明之這樣的複合體之腎臓聚集性之評價結果。 (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式，藉由老鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)之尾靜脈進行投予。大約24小時後將其屠殺並將腎臓摘出，並使用ICP-MS測定腎臓中之Gd量。於各群皆實施3例，算出3例之平均值，將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)表示。結果係示於後述表28。表中，Ex-No係顯示實施例2之複合體編號。又，作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之前述製造實施例2-47所製造之Ex-No.47([Gd/DOTA]p-Fab)來進行同樣的試驗，算出5試驗之幾何平均(Geometric mean)、標準偏差(Geometric SD factor)、95%信賴區間(95% CI ofgeo. mean)之下限值(Lower)及上限值(Upper)。
(結果) 結果係示於後述表29。將該對照複合體之百分率(% of dose/tissue)作為基準，求取具有前述胜肽連接子之各複合體在腎臓中所包含之Gd量之降低比例，示於表28。如同表28所示，相對於對照複合體，具有前述胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低39.6～82.9%點。
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Figure 02_image307
實施例4-2：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(正常老鼠) (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式，藉由老鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)之尾靜脈進行投予。大約24小時後將其屠殺並將腎臓摘出，並使用ICP-MS測定腎臓中之Gd量。於各群皆實施3例，算出3例之平均值，將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)表示。結果係示於後述表30。表中，Ex-No係顯示實施例2之複合體編號。又，作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之前述製造實施例2所製造之Ex-No 47([Gd/DOTA]p-Fab)來進行同樣的試驗。 (結果) 結果係示於後述表30。將該對照複合體之百分率(% of dose/tissue)作為基準，求取具有前述胜肽連接子之各複合體在腎臓中所包含之Gd量之降低比例，示於表30。如同表30所示，相對於對照複合體47，具有前述胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低92.15～95.38%點。
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實施例4-3：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(正常老鼠) (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式，藉由老鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)之尾靜脈進行投予。大約24小時後將其屠殺並將腎臓摘出，並使用ICP-MS測定腎臓中之Gd量。於各群皆實施3例，算出3例之平均值，將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)表示。作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之前述製造實施例2所製造之Ex-No.47來進行同樣的試驗，關於Ex-No.47之5試驗之腎殘存量之平均係示於表31。 (結果) 將該對照複合體之百分率(% of dose/tissue)作為基準，求取具有前述胜肽連接子之各複合體在腎臓中所包含之Gd量之降低比例(%)，示於表32。如同表32所示，相對於對照複合體，具有前述胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低21.00～94.66%點。
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Figure 02_image313
實施例4-4：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(荷癌老鼠) (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式，藉由荷癌老鼠之尾靜脈進行投予。本實施例中所使用之荷癌老鼠係使用在投予檢體前，將人類大腸癌細胞株LS174T細胞(ATCC(登録商標)；CL-188)2.0～5.0×106 個/個體移植於背部皮下，成為荷癌狀態之老鼠(BALB/cnu/nu)。在投予檢體24小時後將其屠殺並將腎臓以及腫瘤摘出，將腎臓中以及腫瘤中之Gd量使用ICP-MS進行測定。本試驗係於各群皆實施3例，並算出3例之平均值。將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量，以相對於投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)表示，又，將腫瘤組織之每1g中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/g)表示。其結果示於表35、36。表中，Ex-No係顯示實施例2之複合體編號。又，作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之製造實施例2-47所製造之Ex-No.47來進行同樣的試驗，關於Ex-No.47之2試驗之平均係示於表33、34。 (結果) 如同表35、36所示，相對於對照複合體，具有胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低52.26～77.68%點。
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(實施例5-1：抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體之製作) 本實施例係揭示複合體之製造實施例。本實施例中之各製造實施例中係於「實施例5」藉由連字號記載「複合體之編號」。例如，「實施例5-101」係表示本實施例中之複合體101之製造實施例。又，本實施例中之Fab5 係使用國際公開WO2018/092885記載之(P10-2)。「p-Fab5 」係表示Fab5 係藉由該p個胺基鍵結於p個之[　]或(　)中所記載之標記部形成複合體。此外，以下之數個之實施例中，雖記載藉由MS解析確認之各複合體之Fab5 所鍵結之標記部)之數量，然而其結果係不表示其不包含具有其他鍵結數之複合體。由於MS解析機器的精度的關係係可輕易地理解存有無法確認其存在之鍵結數之複合體存在之可能性。又，本實施例中之結構式中，Gd所鍵結之DOTA之結構式，係模式化地表示以Gd標記之DOTA。
(實施例5-101.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃N)]p-Fab5 )之合成) (i)複合體No.101之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。於該溶液中添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，並使用0.25M乙酸緩衝液調整為pH6.6。 於5.2mg/mLFab5 之硼酸緩衝液(240μL)中，添加預先調製之溶液80μL，並於30℃下培養2小時。添加15μL之0.05M之EDTA，於30℃下培養10分鐘。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨7次並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1074之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃N)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
(實施例5-104.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4　and/or　A-5)]p-Fab5 )之合成) (i)複合體No.104之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(1mg)溶解於DMSO(40μL)中。於該溶液中添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)，使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至pH10.2。
於5.2mg/mLFab5 之硼酸緩衝液(240μL)中，添加所有預先調製之溶液，於30℃下培養2小時。以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收，並以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨。 使用3mL之HEPES-NaOH buffer(pH=4.5)進行2次緩衝溶液交換，並進行濃縮，成為pH=4.52之100μL溶液後，將該溶液於45℃下培養30分鐘。 使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨3次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1092之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4and/or A-5)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
(實施例5-107.([Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]p-Fab5 )之合成) (i)複合體No.107之合成 將實施例2-18(vii)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(0.75mg)溶解於DMSO(40μL)中，並添加0.1M硼酸緩衝液(40μL)後，使用0.1M碳酸鈉水溶液及0.25M乙酸緩衝液調整為pH8.2。 於5.2mg/mLFab5 之硼酸緩衝液(240μL)中添加藉由0.1M硼酸緩衝液調製之2mg/mL之2-IT溶液(7.5μL)，並於37℃下培養40分鐘。過剩的2-IT係使用Amicon Ultra-0.5mL離心式過濾器並以磷酸緩衝生理食鹽水進行洗淨、濃縮後，添加預先調整之溶液，於30℃下培養2小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。 該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1175之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 (＃S)]之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。 (實施例5-112.[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)]p-Fab5 )之合成) (i)複合體No.112之合成
將實施例2-68(x)所合成之[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯胺-κO)甲基]苯基}氨基甲醯基)-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺基(Amidato)(3-)]釓(0.46mg)溶解於DMSO(155μL)中。 於藉由硼酸緩衝液及甘油溶液調製為5.2mg/mL之Fab5 溶液(240μL)中，添加0.1M碳酸鈉水溶液及預先調製之溶液30μL，使其成為pH8.8，並於 37℃下培養2小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1187之[Gd/DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
(實施例5-113.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab5 )之合成) (i)複合體No.113之合成 將實施例2-69(vii)所合成之{N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基-κ4 N1 ,N4 ,N7 ,N10 }乙醯基-κO)-1,2,3,4-四氫化異喹啉-5-羰基]-L-甲二磺醯基甘胺醯基-N6 -[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]-L-lysinato(3-)}釓(0.22mg)溶解於DMSO(72μL)中。 於藉由硼酸緩衝液及甘油溶液調製為5.2mg/mL之Fab5 溶液(240μL)中，添加0.1M碳酸鈉水溶液及預先調製之溶液30μL，成為pH9.3，於37℃下培養2小時。使用PD-10管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體。該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1228之[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氫化異喹啉)]-C(=O)-Met-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。 上述製造實施例所獲得之複合體之化學結構式(Str)係示於表37及38。
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Figure 02_image325
使用與上述製造實施例相同之方法，或本發明技術領域中具有通常知識者所習知的方法，合成表39之製造例編號C1、C2之化合物，並使用此等，或者使用實施例2所合成之化合物，獲得後述表40及41所示之與Fab5 之複合體。
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Figure 02_image329
Figure 02_image331
表40至41所記載之上述實施例化合物之MS解析係示於下表。
[表42]
Ex-No MS
102 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1278之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
103 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1115之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
105 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1190之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
106 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1380之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
108 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量542之低分子之複合體、鍵結有2個之複合體及鍵結有3個之複合體之混合物。
109 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1216之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
110 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1201之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
111 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1391之低分子之複合體及鍵結有2個之複合體之混合物。
使用與上述製造實施例相同之方法，或本發明技術領域中具有通常知識者所習知的方法，獲得表43之實施例化合物。
Figure 02_image333
表43所記載之上述實施例化合物之MS解析係示於下表44。
[表44]
Ex-No MS
114 藉由MS解析確認，係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1059之低分子之複合體之混合物。
進而使用與上述製造實施例相同之方法，或本發明技術領域中具有通常知識者所習知的方法，可獲得表45至50之複合體。
Figure 02_image335
Figure 02_image337
Figure 02_image339
Figure 02_image341
Figure 02_image343
Figure 02_image345
實施例6-1：抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體之鍵結活性評價 針對實施例5的方法所製作之各抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體，為了評價對於人類癌症特異性MUC1之鍵結活性，係進行ELISA。本試驗中，作為洗淨液，係使用以蒸餾水稀釋20倍之20X PBS/Tween 20緩衝液(Thermo公司、28352)。又，本試驗中使用之牛血清白蛋白(BSA)係以使30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA公司、A9576-50ML)成為適當的比例之方式添加使用。將人類癌症特異性MUC1胜肽(專利文獻1)以0.5 μmol/L於Nunc Maxisorp白色384培養皿(Nunc公司、460372)之每1孔添加30μL，並藉由於4℃下培養培養皿一晩進行固相化。將MUC1胜肽以逆離心去除後，藉由添加含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液進行阻斷。之後，藉由逆離心去除阻斷溶液，使用含有1.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液，將上述各抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體(Ex-No.104、108、112)以10000 ng/mL程度之溶液藉由3倍稀釋進行14連續稀釋，於每1孔添加30μL，於室溫下培養60分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，將使用含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液稀釋10000倍之辣根過氧化物酶標記山羊抗人類Igκ抗體(Southern Biotechnology Associates公司)於每1孔添加30μL，於室溫下培養30分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，作為基質，係將ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare公司、RPN2232)於每1孔添加30μL。於室溫下培養15分鐘後，將該訊號值以Envision計數器(PerkinElmer公司)進行測定。 將各抗體之試驗重複進行，藉由4參數邏輯曲線模型算出EC50 值。將針對P10-2之3試驗各自之EC50 值(nM)示於表51。又，重複試驗後之各複合體之EC50 值示於表52。
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Figure 02_image349
實施例6-2：抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體之鍵結活性評價 針對實施例5的方法所製作之各抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體，為了評價對於人類癌症特異性MUC1之鍵結活性，係進行ELISA。本試驗中，作為洗淨液，係使用以蒸餾水稀釋20倍之20X PBS/Tween 20緩衝液(Thermo公司、28352)。又，本試驗中使用之牛血清白蛋白(BSA)係以使30% Bovine Serum Albumin solution(SIGMA公司、A9576-50ML)成為適當的比例之方式添加使用。將人類癌症特異性MUC1胜肽(專利文獻1)以0.5 μmol/L於Nunc Maxisorp白色384培養皿(Nunc公司、460372)之每1孔添加30μL，並藉由於4℃下培養培養皿一晩進行固相化。將MUC1胜肽以逆離心去除後，藉由添加含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液進行阻斷。之後，藉由逆離心去除阻斷溶液，使用含有1.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液，將上述各抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體(Ex-No.101-113)以10000 ng/mL程度之溶液藉由3倍稀釋進行14連續稀釋，於每1孔添加30μL，於室溫下培養60分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，使用含有5.0%BSA之PBS/Tween 20緩衝液稀釋10000倍之辣根過氧化物酶標記山羊抗人類Igκ抗體(Southern Biotechnology Associates公司)於每1孔添加30μL，並於室溫下培養30分鐘。將培養皿以PBS/Tween 20緩衝液洗淨3次，作為基質，係將ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare公司、RPN2232)於每1孔添加30μL。於室溫下培養15分鐘後，將該訊號值以Envision計數器(PerkinElmer公司)進行測定。 將各抗體之試驗重複進行，藉由4參數邏輯曲線模型算出EC50 值。將針對P10-2之3試驗各自之EC50 值(nM)示於表53。又，將重複試驗後之各複合體之EC50 值示於表54。
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實施例7：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(正常老鼠) (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式，藉由老鼠(BALB/c or BALB/c nu/nu)之尾靜脈進行投予。大約24小時後將其屠殺並將腎臓摘出，並使用ICP-MS測定腎臓中之Gd量。於各群皆實施3例，算出3例之平均值，將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)表示。作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之前述製造實施例5所製造之Ex-No 108 來進行同樣的試驗。針對Ex-No 108之2試驗之平均係示於表55。 (結果) 結果示於表56。將該對照複合體之腎臓中所包含之Gd量作為基準，求取具有前述胜肽連接子之各複合體在腎臓中所包含之Gd量之降低比例。如同表56所示，相對於對照複合體，具有前述胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低91.52～93.03%點。
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Figure 02_image357
實施例8：Gd標記複合體之腎臓聚集性評價試驗(荷癌老鼠) (試驗方法) 將包含前述實施例所製造之胜肽連接子之複合體之Gd標記複合體，以使每一隻之蛋白質量成為0.02mg(100μL)的方式藉由荷癌老鼠之尾靜脈進行投予。本實施例中所使用之荷癌老鼠係在投予檢體前，係將人類乳癌細胞株MDA-MB-468(ATCC(登録商標)；HTB-132)5.0×106 個/個體移植於背部皮下，成為荷癌狀態之老鼠(BALB/cnu/nu)。在投予檢體24小時後將其屠殺並將腎臓以及腫瘤摘出，將腎臓中以及腫瘤中之Gd量使用ICP-MS進行測定。本試驗係於各群皆實施3例，並算出3例之平均值。將投予後之每一個腎臓中所包含之Gd量以相對於投予Gd量之百分率(% of dose/tissue)、又，將腫瘤組織之每1g中所包含之Gd量，以相對於全投予Gd量之百分率(% of dose/g)表示。結果示於表59、60。表中，Ex-No係顯示實施例5之複合體編號。又，作為對照複合體，係使用不包含胜肽連接子之前述製造實施例5所製造之Ex-No.108來進行同樣的試驗。關於Ex-No.108之2試驗之平均係示於表57、58。 (結果) 如同表57至60所示之結果，相對於對照複合體，具有前述胜肽連接子之各複合體，於標記部之腎臓之聚集性係降低88.08～90.87%點。
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實施例9：抗人類MUC1抗體Fab5 片段複合體之製作 (實施例9-115.[DOTA]p-Fab5 之合成)
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於1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸(DOTA)(16mg)及水(810μL)之混合溶液中，於冰冷卻下，添加1M氫氧化鈉水溶液(80μL)，調製為pH5.5～6。於所獲得之溶液(239μL)中，於冰冷卻下，添加溶解於水(117μL)之1-羥基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸鈉(2.3mg)。之後，添加EDC HCl水溶液(8.3μL、25mg/mL)，於冰冷卻下攪拌30分鐘，並調製N-羥基磺基琥珀醯亞胺DOTA溶液。於添加Fab5 前，添加0.2M磷酸氫二鈉水溶液(pH9)(40μL)調製為pH7。 於20.8mg/mLFab5 (90μL)之0.1M磷酸氫二鈉水溶液(585μL)中，添加調製之N-羥基磺基琥珀醯亞胺DOTA溶液(300μL)，於4℃下培養23小時。過剩的連接子係使用Amicon Ultra-15mL離心式過濾器，以10mM磷酸緩衝液重複洗淨2次，並以0.3M之乙酸銨緩衝液洗淨，於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體Ex-No.115。該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量387之[DOTA]之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。 (實施例9-116.[DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)]p-Fab5 之合成
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將實施例2-68(ix)所合成之N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基]乙醯胺}甲基)苯基]氨基甲醯基}-L-甲二磺醯基-N1 -(2-{[(4-異氰硫基苯基)硫代胺甲醯基]胺基}乙基)-L-異白胺酸醯胺四(三氟乙酸)鹽(1mg)溶解於DMSO(336μL)中。 於5.2mg/mLFab5 之磷酸緩衝生理食鹽水溶液(240μL)中，添加預先調製之溶液30μL，並使用0.1M碳酸鈉水溶液調整至約pH8.0，於30℃下培養2小時。使用PD-10　管柱精製，並以Amicon Ultra-15mL離心式過濾器進行回收。將回收後之溶液以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨2次，並於最後進行濃縮後，以薄膜過濾器進行過濾，獲得複合體Ex-No.116。再度進行同樣的操作，混合所獲得之複合體Ex-No.116。該複合體藉由MS解析確認係對於1個分子量47.5kDa之Fab5 ，鍵結有1個分子量1032之[DOTA-NH-CH2 -(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-lle-NH-(CH2 )2 -(A-3)]之複合體、鍵結有2個之複合體、鍵結有3個之複合體及鍵結有4個之複合體之混合物。
實施例10：金屬錯合物化合物於普通狨體內動態之探討64 Cu標記蛋白之調製例1 於[64 Cu]CuCl2 之0.05mol/L鹽酸溶液10μL(19.8MBq、富士軟片富山化學)中添加0.1mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.5)139μL進行混和。進一步添加於實施例9-115所調製之蛋白複合體51μL，將其於室溫下培養60分鐘，使其反應。將反應液添加於超過濾膜(Amicon Ultra 10K、Millipore)，進一步藉由添加50 mmol/L乙酸鈉緩衝液，進行超過濾精製，獲得目的之64 Cu-蛋白複合體溶液(A)。於所獲得之溶液中混合蛋白複合體140μL與PBS溶液145μL，並藉由使用針筒過濾器(Millex-GV 0.22 μm、Millipore)進行過濾，調製含有64 Cu-蛋白複合體(A)之PBS溶液(11.5MBq，19.17MBq/mg)。64 Cu標記蛋白之調製例2 於[64 Cu]CuCl2 之0.05mol/L鹽酸溶液20μL(37.1MBq、富士軟片富山化學)中添加0.1mol/L乙酸鈉緩衝液(pH6.5)285μL進行混和。進一步添加於實施例9-116所調製之蛋白複合體94.7μL，將其於室溫下培養60分鐘，使其反應。將反應液添加於超過濾膜(Amicon Ultra 10K、Millipore)，進一步藉由添加50 mmol/L乙酸鈉緩衝液，進行超過濾精製，獲得目的之64 Cu-蛋白複合體溶液(B)。於所獲得之溶液中混合蛋白複合體260μL與PBS溶液377μL，並藉由使用針筒過濾器(Millex-GV 0.22μm、Millipore)進行過濾，調製含有64 Cu-蛋白複合體(B)之PBS溶液(31.5MBq，26.27MBq/mg)。 PET/CT攝像 將普通狨(2歲齡)以異氟烷進行麻醉，並由尾靜脈投予包含64 Cu-蛋白複合體溶液(A)或(B)之PBS溶液175-185μL。於投予後，在麻醉下，以PET/CT攝像裝置(PET：Clairvivo PET、島津製作所製、CT：Aquilion、TOSHIBA製)取得影像。 圖1為投予包含64 Cu-蛋白複合體溶液(A)之PBS溶液約3小時後所獲得之PET/CT影像。又，圖2為投予包含64 Cu-蛋白複合體溶液(B)之PBS溶液約3小時後所獲得之PET/CT影像。圖3係顯示SUV。所謂SUV，係將每1g組織之放射能除以每1g體重之投予放射能之值，亦即，SUV=每1g組織之放射能/每1g體重之投予放射能表示之值。此外，放射能係使用衰減修正後之值。觀察到與圖1相比，圖2向腎臓之聚集係較少之結果。 [產業上之可利用性]
本發明係包含具有對於人類CEACAM5具有優異的鍵結活性之複合體，係期待對於關於人類CEACAM5之癌症之診斷及/或治療可起作用。 又，本發明係包含對於MUC1具有優異的鍵結活性之複合體，係期待對於關於MUC1之癌症之診斷及/或治療可起作用。 此外，本發明複合體包含3arm DOTA、特定之間隔區、特定之胜肽連接子及生物分子之複合體由於係於腎臓內被分解而排出，故係期待對於關於生物分子之疾患之診斷及/或治療可起作用。 [序列表之非關鍵詞文字]
以下之序列表之數字標號＜223＞，係代表性地記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號1及3表示之鹼基序列係為各自之PB009-01之重鏈片段及輕鏈之鹼基序列，序列編號2及4表示之胺基酸序列係各自為藉由序列編號1及3編碼之重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列。此外，序列表之序列編號5及9表示之鹼基序列為各自之P10-1之重鏈片段及輕鏈之鹼基序列，序列編號6及10表示之胺基酸序列係各自為藉由序列編號5及9編碼之重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列。序列編號7及9表示之鹼基序列為各自之P10-2之重鏈片段及輕鏈之鹼基序列，序列編號8及10表示之胺基酸序列係各自為藉由序列編號7及9編碼之重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列。序列編號11及15為各自之P10-1之重鏈可變區域及輕鏈可變區域，序列編號12及16表示之胺基酸序列各自為藉由序列編號11及15編碼之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。序列編號13及15為各自之P10-2之重鏈可變區域及輕鏈可變區域，序列編號14及16表示之胺基酸序列各自為藉由序列編號13及15編碼之重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列。
[圖1]顯示投予包含64 Cu-蛋白複合體溶液(A)之PBS溶液約3小時後所獲得之PET/CT影像。 [圖2]顯示投予包含64 Cu-蛋白複合體溶液(B)之PBS溶液約3小時後所獲得之PET/CT影像。 [圖3]圖3係顯示SUV。
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Claims (43)

  1. 一種下式(I)所表示之複合體：
    Figure 03_image001
    [式中， Fab1 為由 (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其係包含重鏈片段及輕鏈，其中，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，該輕鏈係含有包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列之輕鏈可變區域，及 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，該重鏈片段係含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121為止之胺基酸序列之重鏈可變區域，且其中序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含輕鏈可變區域，且該輕鏈可變區域係包含序列編號4之胺基酸編號1至112為止之胺基酸序列 所構成之群所選出之抗人類CEACAM5抗體Fab片段，該Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基鍵結於X上； X為胜肽連接子或鍵結； S1 為間隔區或鍵結； Y為配位子；以及， p為1～25之自然數，係顯示鍵結於Fab1 之(Y-S1 -X)之數量； 惟，X為鍵結時，S1 為-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-或鍵結，且，Y為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸]。
  2. 如請求項1所記載之複合體，其中Fab1 係由(a)及(b)所構成之群所選出： (a)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列，及 (b)抗人類CEACAM5抗體Fab片段，其中包含重鏈片段及輕鏈，且該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段，且序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列。
  3. 如請求項2所記載之複合體，Fab1 係含有包含序列編號2所示之胺基酸序列之重鏈片段及包含序列編號4所示之胺基酸序列之輕鏈。
  4. 如請求項1～3中之任1項所記載之複合體，X係具有以腎臓刷狀緣膜酵素或溶酶體酵素切斷之胺基酸序列之具有包含2～4個胺基酸之胜肽之胜肽連接子。
  5. 如請求項1～4中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為 -C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-(CH2 )2 -C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、 -NH-(CH2 )3 -C(=O)-、 -NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 下式(a)～(q)所表示之間隔區，或，鍵結，R1 為氫原子、鹵素、C1-6 烷基，或，鹵代C1-6 烷基，
    Figure 03_image003
    X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (4)-Met-Val-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (7)-Gly-Arg-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (13)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-Lys＊-Z2 -、 (14)-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (15)-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (16)-Gly-Val-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (17)-Gly-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (18)-Met-Phe-Lys＊-Z2 -、 (19)-Gly-Tyr-Lys＊-Z2 -、 (20)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 O)3 -CH2 -C(=O)- NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -、 (22)-Gly-二苯丙胺酸-Lys＊-Z2 -、 (23)-Gly-Tyr-NH-(CH2 )5 -Z1 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-、 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -及 所構成之群所選出之胜肽連接子 或 (29)鍵結， 此處，Met係表示甲硫胺酸，Ile係表示異白胺酸，Gly係表示甘胺酸，Lys係表示離胺酸，Phe係表示苯丙胺酸，Val係表示纈胺酸，Tyr係表示酪胺酸，Arg係表示魚精胺酸，Asp係表示天門冬胺酸，Z1 係表示下式(II-I)或(II-II)所示之基，-Lys＊-Z2 -係表示下式(III-I)或(III-II)所示之基，-Tyr＊-CH2 -係表示下式(IV)所示之基，-Lys＊ -C(=S)-係表示下式(V)所示之基，-Lys＊-Z3 -係下式(III-III)所示之基，基(A-3)、(A-4)或(A-5)係如下式所示：
    Figure 03_image005
    。
  6. 如請求項1～5中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-或-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-， X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -，及 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-所 構成之群所選出之胜肽連接子。
  7. 如請求項1～5中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為-C(=O)-CH2 O-(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、 -NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-伸苯基)-C(=O)-，或，下式
    Figure 03_image007
    X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (5)-Gly-Tyr＊-CH2 -C(=O)-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (6)-Gly-Lys-Lys＊-Z2 -、 (8)-Gly-Lys＊-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
  8. 如請求項1～5中之任1項所記載之複合體，其中，S1 為-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、 -CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2 CH2 O)3 -CH2 -C(=O)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-NH-CH2 -(1,3-伸苯基)-C(=O)-、-NH-CH2 -(1,4-伸苯基)-NH-C(=O)-、下式(e)至(i)或者(k)所表示之間隔區，或，鍵結，
    Figure 03_image009
    X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (2)-Gly-Lys＊-Z2 -、 (3)-Gly-Phe-Lys＊-Z2 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (10)-Asp-Gly-Lys＊-Z2 -、 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (21)-Gly-(3-(2-萘基)丙胺酸)-Lys＊-Z2 -及 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
  9. 如請求項1～5中之任1項所記載之複合體，其中，X係由 (1)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -Z1 -、 (9)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -NH-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)- NH-C(=S)-、 (12)-Met-Ile-Lys＊-Z2 -、 (24)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-4)-、 (25)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-5)-、 (26)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(II-II)-、 (27)-Met-Ile-NH-(CH2 )2 -(A-3)-所構成之群所選出之胜肽連接子。
  10. 如請求項1～5中之任1項所記載之複合體，其中，X係由 (11)-Met-Gly-Lys＊-Z2 -，及 (28)-Met-Gly-Lys＊-Z3 -所構成之群所選出之胜肽連接子。
  11. 如請求項1～10中之任1項所記載之複合體，其中，Y為去鐵胺或1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸。
  12. 如請求項11所記載之複合體，其中，Y為去鐵胺。
  13. 如請求項11所記載之複合體，其中，Y為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸。
  14. 如請求項13所記載之複合體，其中，Y為3arm DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸)或4arm DOTA。
  15. 如請求項14所記載之複合體，其中，Y為3arm DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四醋酸)。
  16. 如請求項11或13～15中之任1項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出之複合體，其中Fab1 係藉由該Fab1 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上，
    Figure 03_image011
    Figure 03_image013
    Figure 03_image015
    Figure 03_image017
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    。
  17. 如請求項11或13～15中之任1項所記載之複合體，其係由下式所示之化合物所構成之群所選出之複合體，
    Figure 03_image025
    。
  18. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image027
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  19. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image029
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  20. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image031
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  21. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image033
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  22. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image035
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  23. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image037
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  24. 一種複合體，其係如下式所示：
    Figure 03_image039
    [式中，Fab2 係包含重鏈片段及輕鏈之Fab片段，該重鏈片段係包含序列編號2所示之胺基酸序列，該輕鏈係包含序列編號4所示之胺基酸序列； p為1～25之自然數；Fab2 係藉由該Fab2 中所具有之p個胺基或硫醇基，鍵結於鄰接之碳原子上]。
  25. 如請求項1～24中之任1項所記載之複合體，其中，p為1～5之自然數。
  26. 如請求項1～15中之任1項所記載之複合體，其中，Y係配位有金屬。
  27. 如請求項16～24中之任1項所記載之複合體，其係配位有金屬。
  28. 如請求項26或27所記載之複合體，其中，金屬為金屬放射性同位元素。
  29. 如請求項28所記載之複合體，其中，金屬為89 Zr。
  30. 如請求項26或27所記載之複合體，其中，金屬為順磁性金屬離子。
  31. 如請求項30所記載之複合體，其中，金屬為Gd3+ 。
  32. 如請求項26～31中之任1項所記載之複合體，其係PET示蹤劑。
  33. 一種診斷用組成物，其係包含請求項26～32中之任1項所記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。
  34. 如請求項33所記載之診斷用組成物，其係作為早期診斷藥，或病期診斷藥使用。
  35. 如請求項33或34所記載之診斷用組成物，其係用於表現人類CEACAM5之癌症之診斷。
  36. 如請求項35所記載之診斷用組成物，其中，癌為大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等之轉移後之癌。
  37. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項26～31記載之1種類以上之複合體，及藥學上容許之載體。
  38. 如請求項37所記載之醫藥組成物，其係用於治療表現人類CEACAM5之癌之醫藥組成物。
  39. 如請求項38所記載之醫藥組成物，其中，癌為大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等之轉移後之癌。
  40. 如請求項26～31中之任1項所記載之複合體之用途，其係用於癌症之診斷用組成物，及/或癌症之治療用醫藥組成物之製造。
  41. 如請求項26～31中之任1項所記載之複合體，其係用於癌症之診斷，及/或癌症之治療。
  42. 一種癌症之診斷方法，其係包含將如請求項26～31中之任1項所記載之複合體投予於對象。
  43. 一種癌症之治療方法，其係包含將如請求項26～31中之任1項所記載之複合體之治療有效量投予於對象。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA126388C2 (uk) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. Fab-фрагмент антитіла до muc1 людини
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
JP7360766B2 (ja) * 2018-05-17 2023-10-13 アステラス製薬株式会社 抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、ペプチドリンカー及び／又は配位子を含む複合体
EP4116306A4 (en) 2020-03-04 2024-05-29 Nihon Mediphysics Co Ltd COMPOUND AND RADIOACTIVE LABELING COMPOUND
WO2022186311A1 (ja) 2021-03-04 2022-09-09 日本メジフィジックス株式会社 化合物及び放射性標識化合物
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates
WO2024044549A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Abdera Therapeutics Inc. Vhh antibody conjugates

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US7273608B2 (en) * 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
EP2083868A2 (en) 2006-10-04 2009-08-05 Københavns Universitet Generation of a cancer-specific immune response toward muc1 and cancer specific muc1 antibodies
CA2741798A1 (en) 2008-10-28 2010-05-06 Shionogi & Co., Ltd. Anti-muc1 antibody
WO2011005322A2 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Lantheus Medical Imaging, Inc. N-alkoxyamide conjugates as imaging agents
CN102666567B (zh) * 2009-12-04 2015-08-26 免疫医疗公司 用于蛋白质、肽和其它分子的改进的f-18标记的方法和组合物
CN104039809A (zh) * 2011-10-10 2014-09-10 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
WO2013081091A1 (ja) 2011-12-01 2013-06-06 国立大学法人 千葉大学 非特異的腎集積が低減された放射性標識ポリペプチド作製用薬剤
EP3204018B1 (en) * 2014-10-07 2021-08-25 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
EP3242691A1 (en) * 2015-01-09 2017-11-15 Immunomedics, Inc. Radiosensitivity of fluorophores and use of radioprotective agents for dual-modality imaging
US10960089B2 (en) * 2016-03-01 2021-03-30 National University Corporation Chiba University Radiolabeled drug
UA126388C2 (uk) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. Fab-фрагмент антитіла до muc1 людини
US10758632B2 (en) * 2017-02-06 2020-09-01 City Of Hope NIR-conjugated tumor-specific antibodies and uses thereof
JP7207740B2 (ja) 2017-09-26 2023-01-18 国立大学法人千葉大学 放射性薬剤

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