CN113301920A - 包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物 - Google Patents

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石田淳也
户谷博希
浅野亨
吉川友章
佐野赖方
菅野幸人
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Abstract

本发明提供使用了结合活性不会因为利用金属、荧光染料等进行标记而减弱的抗人MUC1抗体Fab片段的、在体内诊断药和内照射疗法中有用的包含配体、间隔物和肽接头的复合物。包含三臂DOTA、特定的间隔物、特定的肽接头和包括抗人MUC1抗体Fab片段的生物分子的复合物，其结合活性不会因为利用金属、荧光染料等进行标记而减弱，能够作为诊断用组合物和/或药物组合物使用。

Description

包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物
技术领域
本发明涉及包含抗人CEACAM5抗体Fab片段或人MUC1抗体Fab片段以及配体的复合物。另外，本发明涉及包含上述复合物的诊断用组合物和/或药物组合物、以及使用该复合物的癌症的诊断和/或治疗方法等。还涉及包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物、包含该复合物的诊断用组合物和/或药物组合物、以及使用该复合物的该生物分子相关疾病的诊断和/或治疗方法等。另外涉及包含由该配体和金属形成的络合物以及该抗人CEACAM5抗体Fab片段或该人MUC1抗体Fab片段的复合物。另外涉及包含该络合物、间隔物、肽接头和生物分子的复合物。
背景技术
CEA(Carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)或CEACAM(Carcinoembryonicantigen-related cell adhesion molecule，癌胚抗原相关细胞粘附分子)为于1965年发现的肿瘤标志物(J.Exp.Med.；1965；121：439-462、PNAS；1969；64：161-167)，到目前为止已知23个CEA相关分子(BioMed Central Biology；2010；8：12-33)。其中，CEACAM5在正常组织中几乎看不到表达，但在胎儿的消化道、大肠癌中表达(BBA；1990；1032：177-189、J.Clin.Mol.Pathol.；1999；52：174-178)。另外，已知CEACAM5在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌中也有表达(Diagn.Cytopathol.；1993；9：377-382、Cancer Res.；1990；50：6987-6994、Histopathology；2000；37：530-535)。
大肠癌患者与健康人相比，血中CEACAM5的浓度高(J.Exp.Med.；1965；121：439-462)，CEACAM5已被用作肿瘤标志物。根据大肠癌患者的组织学研究，在90％以上的组织中高表达CEACAM5(British J.Cancer；2013；108：662-667)。
大肠癌的早期转移局限于肝脏，因此，如果能够在早期发现肝转移并进行治疗，则能够降低复发率(Cell Mol.Gastroenterol.Hepatol.；2017；3：163-173)。
粘蛋白1(Mucin 1：MUC1)为在构成乳腺、气管和消化道等的上皮组织的上皮细胞的内腔侧表达的膜结合型糖蛋白(Nat.Rev.Cancer，2004 Jan；4(1)：45-60)。MUC1在乳腺癌(Mod.Pathol.，2005 Oct；18(10)：1295-304)、肺癌(Hum.Pathol.，2008 Jan；39(1)：126-36)、大肠癌(Int.J.Oncol.，2000 Jan；16(1)：55-64)、膀胱癌(PloS One，2014 Mar；9(3)：e92742)、皮肤癌(Histopathology,2000 Sep；37(3)：218-23)、甲状腺癌(J.Pathol.,2003Jul；200(3)：357-69)、胃癌(J.Pathol.,2000 Mar；190(4)：437-43)、胰腺癌(Int.J.Oncol.,2004 Jan；24(1)：107-13)、肾癌(Mod.Pathol.,2004 Feb；17(2)：180-8)、卵巢癌(Gynecol.Oncol.,2007 Jun；105(3)：695-702)和宫颈癌(Am.J.Clin.Pathol.,2004Jul；122(1)：61-9)等癌细胞中过表达，MUC1作为用于检测癌病灶的靶分子有用(Nat.Rev.Cancer,2004 Jan；4(1)：45-60、Pathol.Res.Pract.,2010 Aug15；206(8)：585-9)。
MUC1中，存在于胞外结构域的20个氨基酸的串联重复序列HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(本申请序列表的序列号19)的第9位的苏氨酸被O-糖基化。已知癌细胞中该O-糖基化不完全，以癌特异性方式发生T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)和2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr)等的O-糖基化(专利文献1、非专利文献1)。正常组织的MUC1未受到这些癌特异性的O-糖基化，因此人癌特异性MUC1作为用于治疗人的各种癌症的靶分子特别有用。作为这样的抗人癌特异性MUC1抗体，已知例如1B2抗体(专利文献1)、PankoMab抗体(非专利文献2)、5E5抗体(专利文献2)等。据报道，这些抗体中，1B2抗体与PankoMab抗体相比，对人癌特异性MUC1的特异性更高(专利文献1)。
在肝转移的诊断中，使用CT(计算机断层扫描)、MRI(核磁共振成像法)、FDG-PET(Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography，氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描)。CT、MRI、FDG-PET的检测灵敏度分别为74.4、80.3、81.4％，CT时1cm以下的肿瘤的检测灵敏度下降到47.3％，MRI时1cm以下的肿瘤的检测灵敏度则下降到60.2％(Radiology；2010；257：674-684)。虽然也使用肝特异性造影剂MRI，但其1cm以下的肿瘤的检测灵敏度为29～38％(Radiology；2005；237：89-98)。
为了对癌症进行诊断、治疗，使用抗癌剂、结合有金属放射性同位素的抗体。使用抗体的打靶对肿瘤细胞的特异性高，副作用少。到目前为止，几种用金属放射性同位素标记的单克隆抗体已被临床应用于诊断和治疗(Cancer Control；2012；19：196-203)。
另一方面，一般而言抗体的血中半衰期长，给药至体内后，达到提供足以将癌症可见化的信号的肿瘤/血液比需要4天～5天的长时间(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87：586-592)。另外，抗体的Fc区会引起抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-Dependent CellularCytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(Complement-Dependent Cytotoxicity：CDC)的药理作用(Glycoconj.J.；2013；30：227-236、Curr.Opin.Biotechnol.；2002；13：609-614)。另外，由于抗体在肝脏中进行代谢，因此无论靶标如何，抗体都会高度聚集在肝脏中，由于大肠癌的早期转移局限于肝脏，因此难以通过抗体来检测肝转移的病灶(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87：586-592)。
Fab、scFV、双抗体之类的低分子化的重组抗体片段由于组织渗透性高，因此容易到达病灶，可以期待使用大肠杆菌、酵母中的表达系统以低成本进行生产，因此可用作治疗用抗体，但另一方面，其具有血中半衰期短、经肾排泄的特征，因此还报道了作为诊断药的利用(Nat.Biotechnol.；2005；23：1126-1136)。
作为用作诊断药的抗人CEACAM5抗体，已知有小鼠单克隆抗体T84.66的人源化抗体M5A(专利文献3)。据报道，在使用皮下移植了癌细胞的小鼠的试验中，用64Cu标记的M5A需要在给药后经过22小时以上才能得到良好的PET图像(非专利文献3)，另外，在使用肝转移的模型小鼠的试验中，向肝脏的正常组织与肝脏的病灶部位的摄入在给药后3小时时为同等程度，经过24小时后有显著差异(非专利文献4)。
关于抗人CEACAM5抗体的片段，据报道将小鼠单克隆抗体的NP-4的Fab’用99mTc标记而得的CEA-Scan能够用于大肠癌的诊断(非专利文献5)。但是，CEA-Scan向病灶部位的摄入没有超过向正常肝脏的摄入，另外，肝转移的检测灵敏度低于FDG-PET(非专利文献6)。CEA-Scan虽然在1999年作为大肠癌的诊断药获得FDA批准，但是早已不再销售(非专利文献7)。
DOTA(1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)作为放射性金属的螯合剂具有临床实际效果且被广泛应用。近年来报道了使用DOTA进行金属标记而与肽、抗体结合、进行打靶的研究(非专利文献8)。
癌症治疗中，作为具有DOTA的药物，报道了特昔沙瑞肽(Satoreotidetetraxetan)(非专利文献9)处于临床I期开发中。报道了向患有血液系统肿瘤的患者给药90Y-替坦司依帕珠单抗(90Y-epratuzumab tetraxetan)(非专利文献10)。
一般而言，DOTA等螯合剂与低分子化抗体、肽结合而成的复合物会被大量摄入肾脏并被保持或聚集(非专利文献11、12)。
这样，该复合物在肾脏中的聚集会在正确的诊断、治疗中造成不便(非专利文献13)。
例如，据报道，在利用给药[111In]DOTA-利妥昔单抗Fab的复合物的小鼠的试验中，在肾脏中高度聚集(非专利文献11)。
为了避免这样在肾脏中高度聚集，首先可列举利用改造为抗体的片段例如Fab、scFV、Fab’、dsFV等的复合物的研究，其次可列举利用在螯合物与抗体之间具有在肾脏内被特异性切断的接头(也称为肽接头)的复合物的研究(非专利文献12)。
最初报道了肽接头为Gly(甘氨酸)-Lys(赖氨酸)的碘马尿酸-Gly-Lys-Fab可被肾刷状缘膜酶切断，碘马尿酸以代谢物形式包含在尿中并被排出(非专利文献14)。另外报道了肽接头为Gly-Tyr(酪氨酸)的碘马尿酸-Gly-Tys-Fab(非专利文献13)。
另一方面，报道了在代替马尿酸的有机铼络合物CpTR-COOH上结合有肽接头的Gly-Lys的[188Re]CpTR-Gly-Lys-Fab(非专利文献15)。
另外，报道了肽接头为Gly-Phe(苯丙氨酸)-Lys的99mTc-PGGFML-IT-Fab(专利文献4)。
另外，着眼于作为螯合物的NOTA，并报道了包含该NOTA和肽接头的复合物(专利文献5)。
虽然已创制出具有上述肽接头的复合物，但是根据螯合剂的种类而产生无法被该酶切断的课题，报道了通过在螯合剂与肽接头之间导入特定结构的连接部(-CH2-Ph-CO-NH-)而解决了该课题的复合物(专利文献6)。目标在于，得到具有能够配位广泛作为放射性同位素使用的铟等具有较大原子半径的原子的配体的复合物。提及了下述情况：导入了专利文献5记载的具有硫脲结构的物质作为介于螯合物与肽接头之间的间隔物，但是未被肾刷状缘膜酶分解。
基于以下发现，报道了以被溶酶体切断为目标的、肽接头为Met(甲硫氨酸)-Ile(异亮氨酸)的复合物67Ga-NOTA-Met-Ile-Fab(非专利文献16)。
报道了不具有肽接头的复合物NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv通过溶酶体切断而产生的代谢物67Ga-NOTA-Bn-Met经尿排泄(非专利文献17)，上述复合物NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv的dsFv的轻链N末端起第2位为Ile，因此设计了复合物67Ga-NOTA-Met-Ile-Her2(赫赛汀)Fab(非专利文献19)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Glycoconj.J.,2013Apr；30(3):227-36.
非专利文献2：Cancer Immunol Immunother,2006 Nov；55(11):1337-47
非专利文献3：Bioconjug.Chem.；2008；19:89-96
非专利文献4：PLOS ONE；2014；9(9):e106921
非专利文献5：Ann.Surg.；1997；226:621-631
非专利文献6：J.Nucl.Med.；2000；41:1657-1663
非专利文献7：Kenneth T.Cheng、“99mTc-Arcitumomab”、[online]、Update:March17,2008.、Molecular Imaging and Contrast Agent Database、[2017年5月17日检索]、网址＜URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/＞
非专利文献8：Bioorg.Med.Chem.；2019；27:3248-3253
非专利文献9：Clinical Trials.gov Identifier:NCT02592707
非专利文献10：Eur J Haematol.2013Dec；91(6):552-6
非专利文献11：Bioconjugate Chem.2001,12,264-270
非专利文献12：Bioconjugate Chem.2002,13,985-995
非专利文献13：Bioconjugate Chem.2013,24,291-299
非专利文献14：Cancer Res.1999,59,128-134
非专利文献15：Bioconjugate Chem.2007,18,190-198
非专利文献16：Bioconjugate Chem.2014,25,2038-2045
非专利文献17：Bioconjugate Chem.1997,8,365-369
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2010/050528号小册子
专利文献2：国际公开第WO2008/040362号小册子
专利文献3：国际公开第WO2005/086875号小册子
专利文献4：国际公开第WO2013/081091号小册子
专利文献5：国际公开第WO2017/150549号小册子
专利文献6：国际公开第WO2019/065774号小册子
专利文献7：国际公开第WO2018/092885号小册子
发明内容
发明所要解决的问题
一价的Fab片段的分子量为约50kDa，比约150kDa的抗体小，经肾排泄，血中半衰期也短。因此，在给药后2～32小时以内达到提供足以将癌症可见化的信号的肿瘤/血液比。由于不具有Fc区域，因此也不会引起ADCC或CDC。Fab片段主要经肾排泄，因此也不会妨碍肝转移的检测。由于这样的特长，与抗体相比，可以期待Fab片段作为体内诊断药更有效。
但是，由于Fab片段是抗体从二价变为一价，因此其结合活性大多减弱。此外，为了将抗体用作体内诊断药或在光免疫疗法中使用的药剂，必须用金属、荧光染料等进行标记，但是存在该抗体的结合活性因为使用这样的物质进行标记而减弱的课题。
本发明的课题在于，提供使用了结合活性不会因为利用金属、荧光染料等进行标记而减弱的抗人CEACAM5抗体Fab片段的、在体内诊断药和内照射疗法中有用的经标记化的复合物。
提供包含抗人MUC1抗体Fab片段(专利文献7)和肽接头和配体的复合物、以及包含抗人MUC1抗体Fab片段和配体的复合物。另外，本发明的另一课题提供包含上述复合物的诊断用组合物和利用该诊断用组合物的诊断方法、以及包含上述复合物的药物组合物和利用该药物组合物的治疗方法。
另外，本发明的课题在于，使聚集于肾脏的具有螯合剂和生物分子的复合物更迅速地排泄的复合物。
用于解决问题的方法
本发明人们首先制作了对人CEACAM5具有良好的亲和性的抗人CEACAM5抗体Fab片段(国际申请PCT/JP2018/025618)。进而进行了深入研究，结果制作了在该抗人CEACAM5抗体Fab片段上借助(或不借助)肽接头结合用于标记的配体而成的复合物，发现该复合物具有与抗人CEACAM5抗体Fab片段本身同等的对人CEACAM5的亲和性，即，结合活性不因为标记部与Fab片段的结合而减弱，从而完成了本发明。即，本发明提供包含抗人CEACAM5抗体Fab片段和肽接头和配体的复合物、以及包含抗人CEACAM5抗体Fab片段和特定的配体的复合物。确认了该复合物对人CEACAM5的结合活性不因为标记部与Fab片段的结合而减弱，保持了良好的对人CEACAM5的结合活性，基于这些结果，提供使用本发明的复合物的诊断手段和治疗手段。
另外，本发明人们制作了对人癌特异性MUC1具有良好的亲和性的抗人MUC1抗体Fab片段，进而进行了深入研究，结果制作了在该抗人MUC1抗体Fab片段上借助(或不借助)肽接头结合配体而成的复合物。该复合物具有与抗人MUC1抗体Fab片段本身同等的对人癌特异性MUC1的亲和性。即，本发明提供包含抗人MUC1抗体Fab片段和肽接头和配体的复合物、以及包含抗人MUC1抗体Fab片段和特定的配体的复合物。而且确认了该复合物对人癌特异性MUC1的结合活性不因为标记部的结合而减弱，保持了良好的对人癌特异性MUC1的结合活性，基于这些结果，提供使用本发明的复合物的诊断手段和治疗手段。
另外，本发明人们担心作为造影剂、抗癌症剂等药物有用的抗体等的、包含由配体和金属形成的络合物(也称为金属络合物)、间隔物、肽接头和生物分子的复合物在肾脏中聚集，因此对可更迅速地排泄的复合物进行了研究。其结果是，着眼于作为放射性金属的螯合剂具有临床实际效果且被广泛应用的DOTA(1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1,4，7，10-四乙酸)，发现包含三臂DOTA(3arm DOTA)、特定的间隔物、特定的肽接头和生物分子的复合物可在肾脏内分解并排出。
根据以上，本发明涉及以下的包含CEACAM5的Fab抗体的复合物和包含该复合物的诊断用组合物和/或药物组合物、以及使用该复合物的癌症的诊断和/或治疗方法等。另外，本发明涉及以下的包含MUC1的Fab抗体的复合物和包含该复合物的诊断用组合物和/或药物组合物、以及使用该复合物的癌症的诊断和/或治疗方法等。另外，本发明涉及从肾脏迅速排出的包含DOTA、间隔物、肽接头和生物分子的复合物、该复合物的中间体、以及使用该复合物诊断和/或治疗生物分子相关疾病的方法等。
[1]下式(I)所示的复合物。
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[式中，
Fab1为选自由下述(a)和(b)组成的组中的抗人CEACAM5抗体Fab片段，该Fab1借助该Fab1中存在的p个氨基或巯基与X结合：
(a)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；
X为肽接头或键；
S1为间隔物或键；
Y为配体；以及
p为1～25的自然数，表示与Fab1结合的基团(Y-S1-X)的数量；
其中，X为键时，S1为-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-或键，且Y为1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1，4,7,10-四乙酸(以下有时简记为DOTA)]
[2]根据上述[1]所述的复合物，其中，Fab1选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段、和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
[3]根据上述[2]所述的复合物，其中，Fab1含有包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的Fab片段(以下称为Fab2)。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的复合物，其中，X为肽接头，所述肽接头包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的由2～4个氨基酸构成的肽。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的复合物，其中，S1为：
-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-NH-(CH2)2-C(＝O)-、
-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、
-NH-(CH2)3-C(＝O)-、
-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-、
-NH-CH2-(1，4-亚苯基)-C(＝O)-、
-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、
下式(a)～(q)所示的间隔物或键，
Figure BDA0003145471430000121
上述式中，R1表示氢原子、卤素或C1-6烷基。以下同样。X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-二苯丙氨酸-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头、或
(29)键，
在此，Met表示甲硫氨酸，Ile表示异亮氨酸，Gly表示甘氨酸，Lys表示赖氨酸，Phe表示苯丙氨酸，Val表示缬氨酸，Tyr表示酪氨酸，Arg表示精氨酸，Asp表示天冬氨酸，Z1表示下式(II-I)或(II-II)所示的基团，-Lys*-Z2-表示下式(III-I)或(III-II)所示的基团，-Tyr*-CH2-表示下式(IV)所示的基团，-Lys*-C(＝S)-表示下式(V)所示的基团，-Lys*-Z3-表示下式(III-III)所示的基团，基团(A-3)、(A-4)或(A-5)如下式所示。
Figure BDA0003145471430000141
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，S1为-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、或-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-，
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、和
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-组成的组中的肽接头。
[7-1]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，S1为-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-，或者为下式，
Figure BDA0003145471430000151
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[7-2]根据上述[7-1]所述的复合物，其中，S1为-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-，或者为下式，
Figure BDA0003145471430000161
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[8]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，S1为-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-(CH2)2-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、-NH-(CH2)3-C(＝O)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、下式(a)～(q)所示的间隔物或键，
Figure BDA0003145471430000171
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-二苯丙氨酸-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[9]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，S1为-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、下式(e)～(i)或(k)所示的间隔物、或者键，
Figure BDA0003145471430000191
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[10]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，S1为选自由-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1，3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、下式(f)或(g)所示的间隔物、或键组成的组中的基团，
Figure BDA0003145471430000201
X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[11]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，X为选自由
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、和
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-组成的组中的肽接头。
[12]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，X为选自由
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、和
(28)Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[13]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其中，X为选自由
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-组成的组中的肽接头。
[14]根据上述[1]～[5]中任一项所述的复合物，其为选自由下式所示的化合物组成的组中的复合物，Fab1借助该Fab1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
Figure BDA0003145471430000211
Figure BDA0003145471430000221
[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的复合物，其中，Y为去铁胺(以下有时简记为DFO)或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(以下有时简记为DOTA)。
[16]根据上述[15]所述的复合物，其中，Y为DFO。
[17]根据上述[15]所述的复合物，其中，Y为DOTA。
[18]根据上述[17]所述的复合物，其中，Y为三臂DOTA或四臂DOTA。
[19]根据上述[18]所述的复合物，其中，Y为三臂DOTA。
[20]根据上述[18]所述的复合物，其中，Y为四臂DOTA。
[21]根据上述[15]或[17]～[20]中任一项所述的复合物，其为选自由下式所示的化合物组成的组中的复合物，Fab1借助该Fab1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
Figure BDA0003145471430000231
Figure BDA0003145471430000241
Figure BDA0003145471430000251
Figure BDA0003145471430000261
Figure BDA0003145471430000271
另外，本发明复合物可以为下述两种复合物的混合物。
Figure BDA0003145471430000281
[22]根据上述[15]或[17]～[20]中任一项所述的复合物，其为选自由下式所示的化合物组成的组中的复合物，Fab1借助该Fab1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
Figure BDA0003145471430000282
[23]根据上述[1]～[22]中任一项所述的复合物，其中，p为1～5的自然数。
[24]根据上述[1]～[20]中任一项所述的复合物，其中，在Y上配位有金属。
[25]根据上述[21]～[22]中任一项所述的复合物，其配位有金属。
[26]根据上述[24]或[25]所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
[27]根据上述[26]所述的复合物，其中，金属为89Zr。
[28]根据上述[24]或[25]所述的复合物，其中，金属为顺磁性金属离子。
[29]根据上述[28]所述的复合物，其中，金属为Gd3+。
[30]根据上述[24]～[29]中任一项所述的复合物，其为PET示踪剂。
[31]一种诊断用组合物，其包含一种以上的上述[24]～[30]中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
[32]根据上述[31]所述的诊断用组合物，其作为早期诊断药或分期诊断药使用。
[33]根据上述[31]或[32]中任一项所述的诊断用组合物，其用于表达人CEACAM5的癌症的诊断。
[34]根据上述[33]所述的诊断用组合物，其中，癌症为大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症。
[35]一种药物组合物，其包含一种以上的上述[24]～[29]中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
[36]根据上述[35]所述的药物组合物，其为用于治疗表达人CEACAM5的癌症的药物组合物。
[37]根据上述[36]所述的药物组合物，其中，癌症为大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症。
[38]上述[24]～[29]中任一项所述的一种以上在制造癌症的诊断用组合物和/或癌症的治疗用药物组合物中的应用。
[39]根据上述[24]～[30]中任一项所述的复合物，其用于癌症的诊断和/或癌症的治疗。
[40]一种癌症的诊断方法，其包括向对象给药一种以上的上述[24]～[30]中任一项所述的复合物的步骤。
[41]一种癌症的治疗方法，其包括向对象给药治疗有效量的上述[24]～[30]中任一项所述的复合物的步骤。
[42]下式(Ia)所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000301
[式中，
DOTA1：三臂DOTA，
U：键或-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(＝O)-，
Q：-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-或-NH-C(＝S)-，
X：C或N，
R1a、R1b：相同或不同，为H或C1-6烷基，
需要说明的是，R1a和R1b可以一起形成C1-6亚烷基。
p为1～25的自然数，借助Biomolecule1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
R1：H、卤素、C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
R2：C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
L2：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(＝O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(＝O)-、或-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(＝O)-，
R3：H、C1-6烷基，
R4：H、C1-6烷基，
L3：键、Arg或His，
L4：-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-、或键，
V1：下式(A-1)～(A-5)所示的基团，
Figure BDA0003145471430000311
或者，基团-L3-L4-V1-一起为下式，
Figure BDA0003145471430000321
Biomolecule1：生物分子
虚线
Figure BDA0003145471430000322
Q与环上的2个碳原子中的任意一个结合。
虚线
Figure BDA0003145471430000323
单键或双键]
[43]根据[42]所述的复合物，其中，L3、L4和V1为以下的基团。L3：键、Arg或His，
L4：-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-、或键，
V1：下式(A-1)～(A-5)中的任一者所记载的基团。
Figure BDA0003145471430000324
[44]根据[43]所述的复合物，其中，基团-L3-L4-V1-一起为下式。
Figure BDA0003145471430000325
[45]下式(Ib)所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000331
[式中，
DOTA1：三臂DOTA，
U：键或-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(＝O)-，
Q：-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、或-NH-C(＝S)-，
X：C或N，
R1a、R1b：相同或不同，为H或C1-6烷基，
需要说明的是，R1a和R1b可以一起形成C1-6亚烷基。
p为1～25的自然数，借助Biomolecule2中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
R1：H、卤素、C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
R2：C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
L2：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(＝O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(＝O)-、或-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(＝O)-，
R3：H、C1-6烷基，
R4：H、C1-6烷基，
L3：键、Arg或His，
L4：-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-、或键，
V1：下式(A-1)～(A-5)中任一项所述的基团，
Figure BDA0003145471430000341
或者，基团-L3-L4-V1-一起为下式。
Figure BDA0003145471430000342
Biomolecule2：抗体Fab片段，
虚线
Figure BDA0003145471430000343
Q与环上的2个碳原子中的任意一个结合。
虚线
Figure BDA0003145471430000344
单键或双键]
[46-1]根据上述[42]～[45]中任一项所述的复合物，其为下式(Ic)。
Figure BDA0003145471430000345
[式中，
L3：键，
L4：-NH-(CH2)2-或-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-，
Biomolecule：Biomolecule1或Biomolecule2]
[46-2]根据上述[46-1]的复合物，其中，式(Ic)中，
L3为键，
L4为-NH-(CH2)2-。
[47-1]根据上述[42]～[45]中任一项所述的复合物，其中，上述[42]～[46-2]所述的复合物如下式(Id)所示。
Figure BDA0003145471430000351
[式中，
L3：键，
L4：-NH-(CH2)2-或-NHCH((C＝O)OH)(CH2)4-，
Biomolecule：Biomolecule1或Biomolecule2]
[47-2]根据上述[47-1]的复合物，其中，式(Id)中，
L3为键，
L4为-NH-(CH2)2-。
[48]根据上述[42]～[47-2]中任一项所述的复合物，其中，V1为下式(A-3)～(A-5)中的任一者。
Figure BDA0003145471430000352
[49]根据[42]～[48]中任一项所述的复合物，其中，式(Ia)或(Ib)中的基团(B)为
Figure BDA0003145471430000361
且为选自下式(B-1)～(B-7)的组中的基团。
Figure BDA0003145471430000371
Figure BDA0003145471430000381
[50]根据[42]～[49]中任一项所述的复合物，其选自由下式所示的化合物组成的组。
Figure BDA0003145471430000382
Figure BDA0003145471430000391
Figure BDA0003145471430000401
[51-1]根据[42]～[50]中任一项所述的复合物，其中，Biomolecule1和Biomolecule2为除以下的抗体Fab片段之外的生物分子或抗体Fab片段：
选自由下述(a)和(b)组成的组中的抗人CEACAM5抗体Fab片段，
(a)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
[51-2]根据[51-1]所述的复合物，其中，Biomolecule1和Biomolecule2为除以下的抗体Fab片段之外的生物分子或抗体Fab片段：
(a)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；
(b)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；
(c)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；或
(b)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段、和包含序列号4所示的轻链的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
[52]根据[42]～[51-2]中任一项所述的复合物，其中，Biomolecule1或Biomolecule2为选自以下的(a)和(b)的组中的抗人MUC1抗体Fab片段：
选自由以下的(a)和(b)组成的组中的抗人MUC1抗体Fab片段，
(a)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[53]根据[52]所述的复合物，其中，Biomolecule1或Biomolecule2为选自以下(a)和(b)的组中的抗人MUC1抗体Fab片段：
(a)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；和
(b)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[54]根据[53]所述的复合物，其中，Biomolecule1或Biomolecule2为以下的抗人MUC1抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[55]根据上述[42]～[54]中任一项所述的复合物，其中，p为1～4的自然数。
[56]根据上述[42]～[55]中任一项所述的复合物，其中，在DOTA1上配位有金属。
[57]根据上述[56]所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
[58]根据上述[57]所述的复合物，其中，金属为89Zr。
[59]根据上述[56]所述的复合物，其中，金属为顺磁性金属离子。
[60]根据上述[59]所述的复合物，其中，金属为Gd3+。
[61]根据上述[56]～[60]中任一项所述的复合物，其为PET示踪剂。
[62]一种诊断用组合物，其包含一种以上的上述[56]～[61]中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
[63]根据上述[62]所述的诊断用组合物，其作为早期诊断药或分期诊断药使用。
[64]根据上述[62]或[63]中任一项所述的诊断用组合物，其用于Biomolecule1或Biomolecule2相关疾病的诊断。
[65]根据上述[64]所述的诊断用组合物，其中，Biomolecule1或Biomolecule2相关疾病为MUC1相关疾病。
[66]根据上述[65]所述的诊断用组合物，其用于表达MUC1的癌症的诊断。
[67]根据上述[66]所述的诊断用组合物，其中，癌症为乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。
[68]一种药物组合物，其包含一种以上的上述[56]～[60]中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
[69]根据上述[68]所述的药物组合物，其用于Biomolecule1或Biomolecule2相关疾病的诊断。
[70]根据上述[69]所述的药物组合物，其中，Biomolecule1或Biomolecule2相关疾病为MUC1相关疾病。
[71]根据上述[70]所述的药物组合物，其为用于治疗表达MUC1的癌症的药物组合物。
[72]根据上述[71]所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。
[73]上述[56]～[60]中任一项所述的一种以上在制造癌症的诊断用组合物和/或癌症的治疗用药物组合物中的应用。
[74]根据上述[56]～[60]中任一项所述的复合物，其用于癌症的诊断和/或癌症的治疗。
[75]一种癌症的诊断方法，其包括向对象给药一种以上的上述[56]～[60]中任一项所述的复合物的步骤。
[76]一种癌症的治疗方法，其包括向对象给药治疗有效量的上述[56]～[60]中任一项所述的复合物的步骤。
发明效果
本发明中记载的包含抗人CEACAM5抗体Fab片段、肽接头和配体的复合物、以及包含抗人CEACAM5抗体Fab片段和特定的配体的复合物对人CEACAM5具有优良的结合活性。因此，还包含金属的本发明的复合物可期待在癌症的诊断和/或治疗中有用。另外，本发明中记载的包含人MUC1抗体Fab片段、肽接头和配体的复合物对人MUC1具有优良的结合活性。本发明中记载的包含三臂DOTA、间隔物、肽接头和生物分子的复合物经肾脏更迅速地排泄。因此，还包含金属的本发明的复合物可期待在癌症的诊断和/或治疗中有用。
附图说明
图1示出给药包含64Cu-蛋白复合物溶液(A)的PBS溶液约3小时后得到的PET/CT图像。
图2示出给药包含64Cu-蛋白复合物溶液(B)的PBS溶液约3小时后得到的PET/CT图像。
图3示出SUV。
具体实施方式
以下，对本发明进行详述，但本发明并不限定于此。本说明书中，只要没有特别定义，与本发明相关地使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
“烷基”均表示直链或支链状的饱和烃链，表示一价基团。
“C1-6烷基”是碳原子数为1～6的烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。作为某一方式，为C1-4烷基，作为某一方式，为甲基或乙基，作为某一方式，为甲基。
“C1-6亚烷基”为上述C1-6烷基除去氢而成的二价基团。作为某一方式，为亚甲基、亚乙基、亚丙基或甲基亚甲基等。
“卤素”表示F、Cl、Br、I。
“卤代C1-6烷基”为被1个以上的卤素取代的C1-6烷基。作为某一方式，为被1～5个卤素取代的C1-6烷基，作为某一方式，为CF3。
1-1.本发明的复合物
本发明的复合物为下式(I)所示的复合物。
(Y-S1-X)p-Fab1(I)
[式中，
Fab1为抗人CEACAM5抗体Fab片段，该Fab1借助该Fab1中存在的p个氨基或巯基与X结合，
X为肽接头或键，
S1为间隔物或键，
Y为配体，以及
p为1～25的自然数，表示与Fab1结合的(Y-S1-X)的数量，
其中，X为键时，S1为-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-或键，且Y为下式所示的基团]
Figure BDA0003145471430000461
抗人CEACAM5抗体Fab片段(Fab1)
对上述式(I)中“Fab1”所示的抗人CEACAM5抗体Fab片段进行说明。
抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2～3万的轻链构成。重链由通常包含约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE对应地被称为γ、μ、α、δ、ε链。此外，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别被称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链由通常包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这两种，分别被称为λ、κ链。抗体分子的基本结构的肽构成是各自相同的两条重链和两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键而结合，分子量为15万～19万。两种轻链与任一种重链均可成对。各个抗体分子总是由相同的两条轻链和相同的两条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(在μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，其立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端的结构域而言，即使是来自同种动物的同一类(亚类)的标品，其氨基酸序列也不是恒定的，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。比该结构域靠近C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本是恒定的，被称为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。
抗体与抗原的结合特异性取决于由VH和VL构成的部分的氨基酸序列。另一方面，与补体、各种细胞的结合之类的生物学活性反映出各类Ig的恒定区的结构差异。已知重链和轻链的可变区的可变性基本限于在任一种链中都存在的三个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，是比较恒定的。
存在于抗体的重链恒定区的CH1结构域和CH2结构域之间的区域被称为铰链区，该区域大量含有脯氨酸残基，并包含连接两条重链的多个链间S-S键。例如，在人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各铰链区含有构成重链间的S-S键的、分别为2个、4个、11个、2个的半胱氨酸残基。铰链区是对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶的敏感性高的区域。在用木瓜蛋白酶消化抗体的情况下，重链在铰链区的比重链间S-S键更靠N末端侧的位置被切断，分解成两个Fab片段和一个Fc片段。Fab片段由轻链与包含重链可变区(VH)、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成。Fab片段包含可变区，具有抗原结合活性。
一个实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有以下特征的Fab片段：
含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
作为本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区，可选择Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等中的任意一种恒定区。一个实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
作为本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区，可选择Igλ或Igκ中的任意一种恒定区。一个实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
一个实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为以下的Fab2片段：
含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段(称为Fab2)。
在细胞中表达包括Fab片段在内的抗体的情况下，已知抗体在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰的例子，可列举重链C末端的赖氨酸的利用羧肽酶的切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸的通过焦谷氨酰化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗体中发生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.；2008；97：2426-2447)。
本发明的复合物中所含的抗CEACAM5抗体Fab片段也可以包含通过翻译后修饰生成的Fab片段。作为可通过翻译后修饰生成的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的例子，可列举进行了重链N末端的焦谷氨酰化的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本领域中公知，这种通过N末端的焦谷氨酰化进行的翻译后修饰不会对抗体的活性产生影响(Anal.Biochem.；2006；348：24-39)。
一个实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
某一实施方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
包含由序列号2所示的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段、和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
另一实施方式中，本发明的复合物中所含的抗CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
包含重链片段和轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段，所述重链片段含有包含由序列号2的氨基酸编号31～35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸编号50～66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸编号99～110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区，所述轻链含有包含由序列号4的氨基酸编号24～38的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号54～60的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸编号93～101的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。
本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段与人CEACAM5结合。作为测定所得到的抗人CEACAM5抗体Fab片段对人CEACAM5的结合活性的方法，有基于表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)法的分析、ELISA等方法。例如，在使用基于SPR法的分析的情况下，使用Biacore T200(通用电气医疗日本公司)，将生物素捕获试剂盒(通用电气医疗日本公司)和生物素化的人CEACAM5固相化于传感芯片上，添加连续稀释的Fab片段，由此可以测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)。
本领域技术人员可以基于本说明书中公开的、本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段和轻链的序列信息，使用本领域中公知的方法容易地制作本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段例如可以按照后述的<本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产方法>中记载的方法来生产，但并没有特别限定。
1-2.关于配体
“配体”是复合物中可与金属形成螯合络合物的部分，是指由螯合剂构成的基团。所构成的基团是指从螯合剂除去质子而具有结合键(結合手)的基团。该由螯合剂构成的基团与抗人CEACAM5抗体Fab片段直接或者借助间隔物和/或肽接头而结合。
“螯合剂”是能够与金属配位结合的化合物。作为本说明书中的“螯合剂”，可列举铁载体和非铁载体。作为铁载体，可列举异羟肟酸型、邻苯二酚型或混合配体型。作为异羟肟酸型铁载体，可列举例如铁色素、下式：
Figure BDA0003145471430000501
所示的去铁胺(DFO)、镰孢氨酸C、鸟氨酸菌素(ornibactin)、红酵母酸。作为邻苯二酚型铁载体，可列举例如肠杆菌素、芽孢杆菌素、弧菌素。作为混合配体型铁载体，可列举例如固氮菌素、脓青素、耶尔森杆菌素。需要说明的是，在上述铁载体的情况下，DFO可以借助其反应性官能团-NH2与间隔物或肽接头反应，在DFO以外的铁载体的情况下，也可以借助羧基、羟基、氨基等反应性官能团，利用本领域技术人员通常使用的方法与间隔物或肽接头反应。
作为非铁载体，可列举例如下式：
Figure BDA0003145471430000511
所示的DOTA(1，4,7,10-四氮杂环十二烷-1，4，7,10-四乙酸、CAS编号：60239-18-1)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸、CAS编号：67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-双(甲基氨甲酰基甲基)-1,4,7-三氮杂庚烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：119895-95-3)、EOB-DTPA(N-[(2S)-2-[双(羧甲基)氨基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-N-[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸、CAS编号：158599-72-5)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸、CAS编号：869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羟基丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：120041-08-9)、以及它们的公知的反应性衍生物。
DOTA可借助一个作为其反应性官能团的羧酸与间隔物或肽接头反应(以下，有时将具有如此结合的3个羧酸的DOTA记作三臂DOTA(PloS One.2019 Mar 22；14(3)：e0213397)。)。
DOTA中，作为三臂DOTA，可列举例如以下的化合物。
Figure BDA0003145471430000521
或者，作为使用下式的试剂p-SCN-Bn-DOTA而维持了4个羧酸的DOTA(以下有时记作四臂-DOTA)，也可以与间隔物或肽接头进行反应。
Figure BDA0003145471430000531
作为形成本发明的复合物中所含的配体的“螯合剂”的某一方式，可列举DFO、DOTA、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A。作为某一方式，可列举DFO、DOTA。
需要说明的是，只要没有特别记载，本说明书中的化合物和复合物也包含游离体及其盐。在此，“其盐”是指根据该化合物和复合物的取代基的种类，有时会形成酸加成盐或与碱的盐，是该化合物和复合物所能形成的盐。具体而言，可列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等无机碱、甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等有机碱的盐；与乙酰亮氨酸等各种氨基酸和氨基酸衍生物的盐；铵盐等。例如，DFO可以以去铁胺甲磺酸盐的形式存在，也可以以其他盐的形式存在。DTPA可以以DTPA钠盐的形式与游离体一起存在。
包含金属的本发明的复合物可用于各种造影剂和/或癌症的治疗剂，例如，用于MRI造影剂、PET示踪剂中使用的药剂等。
作为用于MRI造影剂时的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂。
作为用于PET示踪剂时的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂，作为某一方式，为DFO或DOTA。
本发明的复合物中，螯合剂可包含金属。本说明书中，“金属”表示顺磁性金属离子或金属放射性同位素。作为金属，只要是与各螯合剂配位结合的金属就没有特别限制。根据复合物的使用目的来选择适当的螯合剂与金属的组合。
顺磁性金属离子适合用于MRI造影剂。作为顺磁性金属离子的方式，可列举Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Rh2+、Co2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Tb3+、Pm3+、Nd3+、Tm3+、Ce3+、Y3+、Ho3+、Er3+、La3+、Yb3+、Mn3+或Mn2+，但不限于这些。作为某一方式，可列举Gd3+、Mn3+、Mn2+、Fe2+或Fe3+。作为某一方式，可列举Gd3+。作为某一方式，可列举Mn3+或Mn2+。这种情况下，复合物中可以使用卤素等作为抗衡阴离子。另外，抗衡阴离子也可以为配体的C(＝O)O-，此外复合物也可以具有Na+等抗衡阳离子。
金属放射性同位素用于PET示踪剂等。作为金属放射性同位素的某一方式，可列举89Zr、52Mn、52Fe、64Cu、67Ga、68Ga、72As、90Y、99mTc、111In或177Lu，但不限于这些。作为用于PET示踪剂、SPECT示踪剂等的金属放射性同位素的某一方式，可列举89Zr、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc或111In。作为某一方式，可列举锆(Zr)的放射同位素。作为某一方式，可列举89Zr。作为用于癌症的治疗的金属放射性同位素的某一方式，可列举90Y或177Lu。
作为本发明的复合物的某一方式，是Y为配位结合有89Zr的DFO的复合物。作为另一方式，是Y为配位结合有由90Y、67Ga、68Ga和177Lu构成的金属放射性同位素的DOTA的复合物。作为又一方式，是Y为配位结合有由Gd3+和Y3+构成的顺磁性金属离子的DOTA的复合物。作为又一方式，是Y为配位结合有Gd3+的DOTA的复合物。
1-3.肽接头或键
本发明的复合物中，配体(Y)或间隔物(S1)与Fab1可以直接结合(即，X为键)，或者也可以借助肽接头(即，X为肽接头)而结合。
本说明书中，“肽接头”为包含由2～4个氨基酸构成的肽的接头，根据期望，可以具有适合于与抗人CEACAM5抗体Fab片段结合的连接物Z1～Z3等。在此，作为肽接头所包含的肽，没有特别限定，优选为由分别选自由甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)和亮氨酸(Leu)、3-(2-萘基)丙氨酸和二苯丙氨酸组成的组中的2～4个氨基酸构成的肽，更优选为由分别选自由甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸和二苯丙氨酸组成的组中的2～4个氨基酸构成的肽。需要说明的是，只要没有特别说明，则甘氨酸以外的氨基酸残基的构型为L-体。
作为肽接头的某一方式，为包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的由2～4个氨基酸构成的肽、并可以进一步具有介于该肽接头与生物分子或抗体Fab片段之间的连接物的肽接头。据报道，具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的肽接头可被存在于肾脏中的这些酶特异性切断，因此可减少标记部向肾脏的聚集，可期待肾脏的放射线暴露、肾损伤的风险的降低。例如，Adv Drug Deliv Rev.2008 Sep；60(12)：1319-28.、Bioconjug Chem.2005 Nov-Dec；16(6)：1610-6.、和Cancer Res.1999 Jan 1；59(1)：128-34.记载了甘氨酸-赖氨酸接头可被存在于肾脏的肾刷状缘膜酶特异性切断。日本专利第6164556号公报记载了甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸接头在肾脏中可被肾刷状缘膜酶特异性切断，另外，Bioconjug Chem.2002 Sep-Oct；13(5)：985-95.记载了包含甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸序列的接头可被肾刷状缘膜酶特异性切断，另外，Bioconjug Chem.2013Feb 20；24(2)：291-9.记载了甘氨酸-酪氨酸接头可被肾刷状缘膜酶特异性切断。另外，Bioconjug Chem.2014 Nov 19；25(11)：2038-45.记载了包含甲硫氨酸-异亮氨酸序列的接头可被存在于肾脏的溶酶体酶特异性切断。作为肽接头的某一方式，为包含选自由甲硫氨酸-异亮氨酸、甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-缬氨酸-赖氨酸、甘氨酸-酪氨酸、甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸、和甘氨酸-精氨酸-赖氨酸、天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-异亮氨酸-赖氨酸、甘氨酸-酪氨酸-赖氨酸、甘氨酸-缬氨酸、甘氨酸-异亮氨酸、甲硫氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸、甘氨酸-(3-(2-萘基)丙氨酸)-赖氨酸、和甘氨酸-二苯丙氨酸-赖氨酸组成的组中的氨基酸序列的肽接头。作为某一方式，为包含选自由甲硫氨酸-异亮氨酸天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-赖氨酸、和甘氨酸-(3-(2-萘基)丙氨酸)-赖氨酸组成的组中的氨基酸序列的肽接头。
“肽接头”可任选具有适合于与抗人CEACAM5抗体Fab片段结合的连接物，在此，适合于与抗人CEACAM5抗体Fab片段结合的连接物为使肽接头部和抗人CEACAM5抗体Fab片段的氨基或巯基之间通过有机化学方式结合的基团，作为某一方式，为在末端包含来自马来酰亚胺的基团(例如下式(II-I)或(II-II)所示的基团)或来自异硫氰酸酯的基团(-NH-C(＝S)-)的基团。作为某一方式，为-NH-(CH2)2-Z1-、-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、或-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-，在此Z1如下式(II-I)或(II-II)所示。另外，有时将下式(II-I)记作-Z1(#N)-、将下式(II-II)记作-Z1(#S)-。
连接物与肽末端的氨基酸的氨基或羧基、或者与氨基酸的侧链中的氨基(例如赖氨酸)、羟基(例如酪氨酸)结合而形成肽接头。作为连接物与肽末端的氨基酸的侧链中的官能团结合而形成肽接头的例子，例如，作为与Lys一体化的连接物，可列举下式(III-I)或(III-II)所示的基团，本说明书中将这两者一并记作-Lys*-Z2-。有时将下式(III-I)记作-Lys*-Z2(#N)-、将下式(III-II)记作-Lys*-Z2(#S)-。有时将下式(III-III)记作-Lys*-Z3-。
Figure BDA0003145471430000571
另外，本说明书中，将同样具有末端氨基酸的侧链中的官能团与连接物结合而成的结构的下式(IV)所示的基团记作-Tyr*-CH2-、将下式(V)所示的基团记作-Lys*-C(＝S)-。
Figure BDA0003145471430000572
作为“X”的肽接头的某一方式，为包含连接物的肽接头。作为某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-二苯丙氨酸-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
进而，作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、和
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。
作为某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(13)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-Lys*-Z2-、
(14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(16)-Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-、
(17)-Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(19)-Gly-Tyr-Lys*-Z2-、
(20)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-、
(22)-Gly-二苯丙氨酸-Lys*-Z2-、
(23)-Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(7)-Gly-Arg-Lys*-Z2-、和
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、和
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、和
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(5)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1-、
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-、
(8)-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-和
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、和
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(4)-Met-Val-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(18)-Met-Phe-Lys*-Z2-、和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为“X”的肽接头的某一方式，为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
1-4.间隔物或键(S1)
本发明的复合物中，配体(Y)与肽接头(X)可以直接结合(即，S1为键)或借助间隔物(即，S1为间隔物)而结合。
本说明书中，S1的“间隔物”是为了使配体与肽接头或Fab1之间间隔出一定的距离、或者为了将配体与肽接头的结合而导入的基团，作为某一方式，可列举-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-(CH2)2-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、-NH-(CH2)3-C(＝O)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、下式(a)～(q)所示的间隔物等。
Figure BDA0003145471430000641
作为某一方式，S1为-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、或-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-。作为某一方式，S1为-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-(CH2)2-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、-NH-(CH2)3-C(＝O)-、-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、或上式(a)～(q)所示的间隔物。作为某一方式，S1为-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、上式(g)、(i)、(k)所示的间隔物。
作为某一方式，S1为-C(＝O)-CH2O-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、-NH-CH2-(1,4-亚苯基)-C(＝O)-、-C(＝O)-(1,3-亚苯基)-C(＝O)-，或下式。
Figure BDA0003145471430000651
作为某一方式，S1为键。
另外，本发明的Y为DOTA的复合物中，DOTA与抗人CEACAM5抗体Fab片段(Fab1)可以直接结合或借助间隔物(-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)而结合。其中，DOTA与抗人CEACAM5抗体Fab片段(Fab1)借助作为间隔物的-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-结合而成的复合物为下式(VI)所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000661
另外，本申请说明书中记载的S1间隔物包括新型间隔物、上述式(g)和(l)所示的间隔物，这些作为在DOTA上结合包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的由2～4个氨基酸构成的肽的肽接头时的间隔物尤其有用。如后述实施例4的肾脏聚集性评价试验所示，已确认将可被酶切断的肽接头与DOTA和上述式(g)所示的间隔物组合而成的复合物可减少标记部向肾的聚集性。作为某一方式，S1为上述式(g)和(l)所示的间隔物。
作为本发明的复合物的某一方式，是Y为DOTA、S1为式(g)和(l)所示的间隔物、且X为包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的由2～4个氨基酸构成的肽的肽接头的复合物。
作为某一方式，是Y为DOTA、S1为式(g)和(l)所示的间隔物、且X为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头的复合物：
(2)-Gly-Lys*-Z2-、
(3)-Gly-Phe-Lys*-Z2-、
(10)-Asp-Gly-Lys*-Z2-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、和
(21)-Gly-(3-(2-萘基)丙氨酸)-Lys*-Z2-。
作为某一方式，Y为DOTA，S1为-NH-CH2-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝O)-、上式(g)、(i)、(k)所示的间隔物，且X为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、
(12)-Met-Ile-Lys*-Z2-、
(24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-、
(25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-、
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-、
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-、和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
作为某一方式，Y为DOTA，S1为式(g)所示的间隔物，且X为选自由下述肽接头组成的组中的肽接头：
(11)-Met-Gly-Lys*-Z2-、和
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-。
本发明的复合物包括上述方式的组合。
本发明的复合物的具体方式如下所述。
式中，Fab2为含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的Fab片段。
p为1～25的自然数。Fab2借助该Fab2中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
Figure BDA0003145471430000681
Figure BDA0003145471430000691
需要说明的是，Y为DOTA、S1为式(g)和(l)所示的间隔物、且X为包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的由2～4个氨基酸构成的肽的肽接头的组合的标记部不限于与本发明的Fab1的组合，作为使用各种Fab抗体的同样的复合物中的、可期待减少肾毒性等的标记部有用，本发明也包括该标记部本身的发明。
在本发明的复合物的制造中，抗CEACAM5抗体Fab片段与配体、间隔物和/或肽接头的结合、以及配体与间隔物和/或肽接头的结合可通过公知的方法由本领域技术人员适宜地进行。
本说明书中，关于“标记部”，例如，在式(I)中，表示Fab1以外的部分，在式(Ia)或(Ib)中，“标记部”表示Biomolecule1或Biomolecule2以外的部分。为(i)配体和肽接头(Y-S1-X：其中，S1为键，X为肽接头。)、(ii)配体(Y-S1-X：其中，S1和X分别为键。)、或(iii)配体、间隔物和肽接头(Y-S1-X：其中，S1为间隔物，X为肽接头。)。作为某一方式，可列举(ii)配体。作为某一方式，可列举(i)配体和肽接头、或(iii)配体、间隔物和肽接头。在此，“标记部”的配体可以还包含金属，作为某一方式，为包含金属的(i)配体和肽接头、(ii)配体或(iii)配体、间隔物和肽接头，换言之，为(i)与金属形成了螯合络合物的配体和肽接头、(ii)与金属形成了螯合络合物的配体、或(iii)与金属形成了螯合络合物的配体、间隔物和肽接头。还存在(iv)在上述肽接头中还包含间隔物的肽接头的情况。另外，在式(Ia)或(Ib)中，表示Biomolecule1或Biomolecule2以外的部分。
1-5.标记部(Y-S1-X)相对于抗人CEACAM5抗体Fab片段(Fab1)的结合数(p)以及标记部相对于式(Ia)或(Ib)的Biomolecule1和Biomolecule2的结合数(p)
本发明的复合物是借助抗人CEACAM5抗体Fab片段(Fab1)中的1个以上氨基或巯基结合有1个以上的标记部(Y-S1-X)的复合物。另外，本发明的复合物是借助式(Ia)或(Ib)的Biomolecule1和biomolecule2中的1个以上氨基或巯基结合有1个以上标记部的复合物。本发明的复合物可以为所结合的标记部的数量彼此不同的复合物的混合物，式(I)表示Fab1上结合有1～25个标记部(Y-S1-X)的复合物中的任一者或它们的混合物。作为某一方式，本发明的复合物相对于1个Fab1包含1～25个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～23个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～15个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～11个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～9个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～7个标记部(Y-S1-X)，作为某一方式，包含1～5个标记部(Y-S1-X)，进而，作为某一方式，包含1～4个标记部(Y-S1-X)。
式(Ia)或(Ib)中，Biomolecule1和Biomolecule2表示结合有1～25个该标记部的Fab1中的任一者或它们的混合物。作为某一方式，本发明的复合物相对于1个Biomolecule1和Biomolecule2包含1～25个该标记部，作为某一方式，包含1～23个该标记部，作为某一方式，包含1～15个该标记部，作为某一方式，包含1～11个该标记部，作为某一方式，包含1～9个该标记部，作为某一方式，包含1～7个该标记部，作为某一方式，包含1～5个该标记部，进而，作为某一方式，包含1～4个该标记部。
即，表示标记部(Y-S1-X)相对于1个Fab1的结合数的“p”与表示该标记部相对于1个Biomolecule1和Biomolecule2的结合数的“p”相同或不同，作为某一方式，为1～25的自然数，作为某一方式，为1～23的自然数，作为某一方式，为1～15的自然数，作为某一方式，为1～11的自然数，作为某一方式，为1～9的自然数，作为某一方式，为1～7的自然数，作为某一方式，为1～6的自然数，作为某一方式，为1～5的自然数，作为某一方式，为1～4的自然数，进而，作为某一方式，为1～3的自然数。
2.编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸
在某一方式中，本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段由多核苷酸编码，所述多核苷酸为：包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
某一方式中，编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸为：含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号1的碱基编号1～363的碱基序列的多核苷酸。作为含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号3的碱基编号1～336的碱基序列的多核苷酸。
一个实施方式中，编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸为：包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸可以根据基于该抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段和轻链的氨基酸序列设计的碱基序列、并且利用该技术领域中公知的基因合成方法来进行合成。作为这样的基因合成方法，可使用国际公开第90/07861号记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
3.编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的表达载体
编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的表达载体包括：含有包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
作为优选的表达载体，可列举：具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、具有含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
优选的表达载体包括：含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
这些表达载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中产生由本发明的多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，可优选使用pEE6.4、pEE12.4(Lonza公司)。
另外，这些表达载体可包含以可发挥功能的方式与编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的编码重链片段和/或轻链的基因连接的启动子。作为用于在宿主细胞中表达Fab片段的启动子，在宿主细胞为埃希氏菌属菌的情况下，可列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可列举例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属菌中的表达用启动子，可列举SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可列举CMV、RSV、SV40等病毒来源的启动子、逆转录病毒的启动子、肌动蛋白启动子、EF(延伸因子，elongation factor)1α启动子、热休克启动子等。
在使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，这些表达载体可以进一步包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。另一方面，在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，表达载体可以包含起始密码子、终止密码子。另外，这种情况下，可以包含增强子序列、编码本发明的重链片段和/或轻链的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，可以根据目的包含通常使用的选择标志物(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
4.用表达载体进行了转化的宿主细胞
用表达载体进行了转化的宿主细胞包括由以下的(a)～(d)组成的组中的宿主细胞：
(a)用含有包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用含有包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)用含有包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
一个实施方式中，用表达载体进行了转化的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的、用表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用具有含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和具有含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
一个实施方式中，用表达载体进行了转化的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的、用表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
优选的用表达载体进行了转化的宿主细胞可列举：用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及，用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为用表达载体进行转化的宿主细胞，只要适合所使用的表达载体、能够利用该表达载体进行转化而表达Fab片段，则没有特别限定，可以例示本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)、哺乳动物细胞株(例如CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞)。转化本身可以利用例如磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法进行。
5.本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产方法
本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产包括下述步骤：培养上述的进行了转化的宿主细胞，使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段。
一个实施方式中，在本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产中所培养的进行了转化的宿主细胞选自由以下的(a)～(c)组成的组：
(a)用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为某一方式，在本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产中所培养的进行了转化的宿主细胞选自由以下的(a)～(c)组成的组：
(a)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和具有含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)用具有含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和用具有含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为某一方式，在本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产中所培养的进行了转化的宿主细胞选自由以下的(a)～(c)组成的组：
(a)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
优选使用的进行了转化的宿主细胞为：用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；或者，用含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产中，进行了转化的宿主细胞可以在营养培养基中进行培养。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆粕、马铃薯提取液等。另外，可以根据期望含有其他营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
进行了转化的宿主细胞的培养本身利用公知的方法进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5％～约20％的胎牛血清的MEM培养基(Science；1955；122:501.)、DMEM培养基(Virology；1959；8:396-97.)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199:519-24.)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73:1-8.)等。培养基的pH优选为约6～约8，培养通常在约30℃～约40℃下进行约15小时～约336小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可列举例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(PNAS；1985；82:8404-8.)等，其pH优选为约5～约8。培养通常在约20℃～约40℃下进行15～100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠杆菌(E.coli)的情况下，作为优选的培养基，可以例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet,冷泉港实验室；1972:431.)等。这种情况下，培养可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在14～43℃下进行约3小时～约24小时。在宿主为芽孢杆菌(Bacillus)属菌的情况下，可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在30～40℃下进行约16小时～约96小时。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可列举例如Burkholder最小培养基(PNAS；1980；77:4505-4508.)，pH优选为5～8。培养通常在约20℃～约35℃下进行约14小时～约144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
本发明的复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的生产中，除了包括对上述的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤以外，还可以包括对表达后的抗人CEACAM5抗体Fab片段进行回收、优选单离、纯化的步骤。作为单离、纯化方法，可列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。
6.生产本发明的复合物的方法
生产本发明的复合物的方法可以包括使抗人CEACAM5抗体Fab片段与标记部(Y-S1-X)共价结合的步骤。本领域技术人员可以利用公知的方法适当进行上述标记部(Y-S1-X)中的各构成要素间的结合。作为反应例，可以在使配体(Y)直接或借助间隔物(S1)与肽接头(X)结合后，使上述肽接头与抗人CEACAM5抗体Fab片段结合。另外，也可以在使抗人CEACAM5抗体Fab片段与肽接头(X)结合后，使上述肽接头与配体(Y)直接或借助间隔物(S1)而结合。需要说明的是，作为原料，也可以使用预先将配体与间隔物(S1)结合而成的化合物。
另外，生产本发明的复合物的方法可以包括：对上述进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部(Y-S1-X)共价结合的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以包括：对上述进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部(Y-S1-X)共价结合的步骤。此外，生产本发明的复合物的方法可以包括添加金属的步骤。所使用的螯合剂、肽接头、间隔物、标记部的数量、金属等可以使用本说明书所记载的物质。
生产本发明的复合物的方法可以作为以一系列步骤的形式包括上述限定的两个以上的步骤的方法来实施，也可以作为包括上述限定的至少一个步骤的方法来实施。另外，例如，包括使抗人CEACAM5抗体Fab片段与标记部(Y-S1-X)结合的步骤的方法、以及包括使金属与结合有标记部(Y-S1-X)的抗人CEACAM5抗体Fab片段配位的步骤的方法也包括在生产本发明的复合物的方法中。另外，生产本发明的复合物的方法中也包括步骤的顺序不同的方法。例如，使金属与配体配位后的标记部(Y-S1-X)与抗人CEACAM5抗体Fab片段共价结合的方法也包括在生产本发明的复合物的方法中。
另外，用本发明中记载的生物分子代替上述抗人CEACAM5抗体Fab片段也能够同样地进行生产。
7.包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物
对下式所示的本发明的包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物进行说明。
Figure BDA0003145471430000811
作为相当于间隔物的下式(S2)
Figure BDA0003145471430000821
的方式，可列举：
Figure BDA0003145471430000822
作为其它方式，可列举式S2为
Figure BDA0003145471430000823
的基团。
作为其它方式，可列举式S2为
Figure BDA0003145471430000831
的基团。
作为其它方式，可列举式S2为
Figure BDA0003145471430000832
的基团。
作为式(S2)中的基团Q的方式，可列举-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、或-NH-C(＝S)-。
作为式(S2)中的基团Q的方式，-C(＝O)-或-NH-C(＝O)-。
作为式(S2)中的基团Q的方式，可列举-NH-C(＝O)-。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L2的方式，可列举Ile、Phe、Gly。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L2的方式，可列举Ile。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L2的方式，可列举Phe。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L2的方式，可列举Gly。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L3的方式，可列举键、Arg、His。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L3的方式，可列举键。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L3的方式，可列举Arg。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L3的方式，可列举His。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L4的方式，可列举-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-、或键。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L4的方式，可列举-NH-(CH2)2-。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L4的方式，可列举-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团L4的方式，可列举键。
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-1)～(A-5)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000851
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-1)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000852
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-2)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000853
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-3)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000861
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-4)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000862
作为式(Ia)或(Ib)中的基团V1的方式，可列举下式(A-5)所示的基团。
Figure BDA0003145471430000863
式(Ia)或(Ib)中的下式(B)为由间隔物和肽接头构成的基团。
Figure BDA0003145471430000871
可列举选自下式(B-1)～(B-7)的组中的基团。
Figure BDA0003145471430000872
Figure BDA0003145471430000881
作为某一方式，可列举选自由下式的化合物组成的组且p为1～25的自然数、借助Biomolecule1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合的上述式(Ia)记载的复合物。
Figure BDA0003145471430000891
Figure BDA0003145471430000901
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000902
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000903
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000911
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000912
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000921
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000922
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
本发明的方式为下式所示的复合物。
Figure BDA0003145471430000931
[式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。]
另外，作为本发明的方式，可列举下式(Ie)和(If)。
Figure BDA0003145471430000932
本发明复合物有时存在几何异构体、互变异构体。另外，本发明化合物有时具有手性碳。本发明包括将这些异构体进行分离而得的产物、或它们的混合物。另外，标记体、即用放射性同位素或非放射性同位素置换本发明化合物中的1个以上原子而得的化合物也包括在本发明中。
作为生物分子的方式，只要是具有生理活性的生物分子，则可以为任意生物分子，可列举肽、蛋白质、激素、药物、核苷酸、寡核苷酸、核酸、多糖类等。在蛋白质的情况下，包括抗体、酶、受体和它们的片段。
作为生物分子的其它方式，可列举肽、蛋白质。
作为生物分子的其它方式，可列举蛋白质。
作为生物分子的其它方式，可列举蛋白质中的Fab片段、酶、受体、它们的片段。例如，生长抑素、PSMA配体、RGD(Arg-Gly-Asp)肽、ATSM(Diacetyl-bis(N4-methylthiosemicarbazone)，二乙酰基-双(N4-甲基硫代半卡巴腙))、211At-AITM(4-211At-astato-N-[4-(6-(isopropylamino)pyridine-4-yl)-1,3-thiazol-2-yl]-N-methylbenzamide，4-211At-astato-N-[4-(6-(异丙基氨基)吡啶-4-基)-1,3-噻唑-2-基]-N-甲基苯甲酰胺)为其示例。
作为生物分子的其它方式，可列举已上市的抗体或其Fab片段。
可列举例如纳武单抗、帕博利珠单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、达雷木单抗、地诺单抗、西妥昔单抗、伊匹单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、雷莫卢单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、埃罗妥珠单抗、阿维鲁单抗、替伊莫单抗、阿仑单抗、吉妥单抗、耐昔妥珠单抗等。
另外，作为生物分子的其它方式，可列举可以期待用于α射线治疗、β射线治疗的生物分子。
可列举例如：奥曲肽(Octreoscan)、131I-MIBG(I-131metaiodobenzylguanidine，I-131间位碘代苄胍)、211At-MABG(211At-astato-苄基胍)、曲妥珠单抗、人源化抗体A33(Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 2005 Oct；20(5)：514-23.)、Omburtamab、替妥莫单抗、CD45抗体(ClinicalTrials.gov Identifier：NCT03128034；9595；NCI-2017-00452)、替伊莫单抗、Actimab。
另外，作为生物分子的其它方式，可列举：记载于Cancer studies and molecularmedicine的HuM195,MX35-F(ab’)2单克隆抗体，小鼠9.2.27，蛋白聚糖(MCSP)抗原，CD20抗原，CD30抗原等(Cancer studies and molecular medicine(2004),1，1,1-7)。
另外，作为生物分子的其它方式，可列举CD19、GD2、VE钙粘蛋白等。
作为生物分子的某一方式，为MUC1抗体Fab片段(称为Fab3、Fab4或Fab5)，可列举国际公开WO2018/092885中记载的例子。
[1M]具体而言，该Fab3或Fab4为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的抗人MUC1抗体Fab片段，需要说明的是，将具有包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的Fab片段称为Fab3，将具有包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的Fab片段称为Fab4：
(a)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；和
(b)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[2M]作为某一方式，为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的上述[1M]所述的抗人MUC1抗体Fab片段：
(a)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；和
(b)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段、和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[3M]作为某一方式，为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的上述[1M]所述的抗人MUC1抗体Fab片段：
(a)含有包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；和
(b)含有包含由序列号14所示的氨基酸序列构成且序列号10的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段、和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[4M]作为某一方式，为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的上述[3M]所述的抗人MUC1抗体Fab片段：
(a)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；和
(b)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[5M]作为某一方式，是作为含有由序列号6所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的、上述[4M]所述的抗人MUC1抗体Fab片段。
[6M]作为某一方式，是作为含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的、上述[4M]所述的抗人MUC1抗体Fab片段。
[7M]作为国际公开WO2018/092885中记载的抗MUC1抗体Fab片段的P10-1或P10-2(称为Fab5)。
另外，本发明复合物可以由上述各种方式的组合构成。
7.诊断用组合物、诊断方法
本发明涉及含有包含金属的本发明的复合物(以下称为可检测的本发明的复合物)的诊断用组合物。本发明的诊断用组合物可以包含一种以上本发明的复合物。即，本发明的诊断用组合物可以包含一种本发明的复合物，或者也可以包含两种以上本发明的复合物的组合。可检测的本发明的复合物可以按照常规方法制剂化，作为早期诊断药或分期诊断药(特别是癌症的诊断药)来利用。
早期诊断药是指目的在于在观察不到病情、或病程的早期阶段进行诊断的诊断药。例如，在癌症中，是指在观察不到病情、或者在0期或I期的阶段使用的诊断药。
分期诊断药是指能够检查病情发展到何种程度的诊断药。例如，在癌症中，是指能够检查其分期的诊断药。
可期待能够利用本发明的诊断用组合物进行诊断的癌症为表达人CEACAM5的癌症。作为某一方式，可列举大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和它们转移而成的癌症。作为某一方式，该癌症为大肠癌或大肠癌转移而成的癌症。更优选该癌症为大肠癌转移而成的癌症，这样的癌症中包括转移性肝癌。另外，为表达人MUC1的癌症。作为某一方式，可列举乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。某一方式中，该癌症为乳腺癌或膀胱癌。
本发明的诊断用组合物的制剂化时的本发明的复合物的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型、或Fab片段或生物分子的结合效价等而有所不同，例如，相对于患者的每单位体重以Fab片段或生物分子的质量基准计使用约0.001mg/kg～约100mg/kg即可。
作为本发明的诊断用组合物的剂型的示例，可列举注射剂、点滴用剂等非口服剂，可以通过静脉内注射、向靶组织局部的肌肉内注射、皮下注射、膀胱内给药等来给药。另外，制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。药学上可接受的载体、添加剂的种类没有特别限定，可以使用本领域技术人员公知的载体、添加剂。
另外，本发明涉及可检测的本发明的复合物在制造癌症的早期诊断用组合物、分期诊断用组合物中的应用。本发明还涉及用于在癌症的早期诊断、分期诊断中使用的可检测的本发明的复合物。
另外，本发明还涉及一种癌症的诊断方法，其包括向对象给药可检测的本发明的复合物。在此，“对象”是指需要接受该诊断的人或其他哺乳动物。作为某一方式，为需要接受该诊断的人。本发明的诊断方法中的可检测的本发明的复合物的有效量可以为与上述制剂化时的本发明的复合物的有效量同样的量。在本发明的诊断方法中，可检测的本发明的复合物可列举通过向靶组织局部的肌肉内注射、皮下注射等来给药。
另一方式中，本发明还涉及抗人CEACAM5抗体Fab片段在制造包含本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段、肽接头和/或配体的复合物中的应用。作为某一方式，本发明还涉及抗人CEACAM5抗体Fab片段在制造包含本发明的复合物的诊断用组合物中的应用。
另外，作为提供包含金属放射性同位素的本发明的诊断用组合物时的方式，可以在即将使用该组合物前利用金属放射性同位素进行标记，也可以以包含金属放射性同位素的诊断用组合物的形式提供。
8.药物组合物、治疗方法
本发明中，以包含90Y或177Lu等金属放射性同位素的一种以上本发明的复合物Fab片段的质量基准计，可以使用约0.001mg/kg～约100mg/kg。
包含本发明的复合物的药物组合物可以用于癌症的治疗。可期待能够利用包含本发明的复合物的药物组合物进行治疗的癌症为表达人CEACAM5的癌症，可列举例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和它们转移而成的癌症。或者，可期待能够利用包含本发明的复合物的药物组合物进行治疗的癌症为表达人MUC1的癌症，可列举例如乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。某一方式中，该癌症为乳腺癌或膀胱癌。
本发明包括包含本发明的复合物的、用于治疗大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的药物组合物。另外，本发明包括治疗大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的复合物的步骤。另外，本发明包括诱导大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的癌细胞的细胞死亡的方法，其包括给药治疗有效量的本发明的复合物的步骤。
用于治疗癌症的药物组合物也可以用于癌症的诊断。例如，也可以将用于治疗大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的药物组合物用于该癌症的诊断。
另外，本发明包括用于大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的治疗的、本发明的复合物。进一步地，本发明包括本发明的复合物在制造用于治疗大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的药物组合物中的应用。
另一实施方式中，本发明还涉及抗人CEACAM5抗体Fab片段在制造包含本发明的复合物的药物组合物中的应用。
上述实施方式或方式也可用生物分子代替抗人CEACAM5抗体Fab片段来进行。本发明的复合物可以以与生物分子相关的疾病的诊断用组合物或药物组合物形式来提供。
整体上对本发明进行了记载，但为了得到进一步的理解，在此提供参考的特定实施例。但是，这些实施例的目的在于例示，并非对本发明进行限定。
实施例
以下的实施例以及后述表中，有时使用以下的缩写。
Gd/DOTA：用Gd进行了标记的三臂DOTA、Gd/四臂DOTA：用Gd进行了标记的四臂DOTA、MS：质谱分析、ESI+：m/z值(离子化方法ESI、在没有特别说明时为[M+H]+)、ESI-：m/z值(离子化方法ESI、在没有特别说明时为[M-H]-)、APCI/ESI+：m/z值(离子化方法APCI/ESI、APCI/ESI表示同时测定APCI和ESI。在没有特别说明时为[M+H]+)、APCI/ESI-：m/z值(离子化方法APCI/ESI、在没有特别说明时为[M+H]-)、Ex-No：复合物编号、SNo：制造例编号、Str：化学结构式、Me：甲基、Et：乙基、tBu：叔丁基、1,3-Ph：1,3-亚苯基、1,4-Ph：1,4-亚苯基、diph-Ala：二苯丙氨酸、和naph-Ala：3-(2-萘基)丙氨酸。
(实施例1：抗人CEACAM5抗体Fab片段的制作)
参考文献(Protein Eng.Des.Sel.；2004；17：481-489)中记载的方法将作为小鼠来源的抗人CEACAM5抗体的T84.66人源化后，使用依照文献(Proteins：Structure，Function,and Bioinformatics；2014；82：1624-1635)构建的人源化抗体的分子模型，设计出具有可期待即使结合标记部也不会使亲和性减弱的可变区的抗体。
分别在上述抗体的重链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(ProteinEngineering；1987；1:499-505)的基因，并且在3’侧连接人Igγ1的Fab区域基因(由序列号1的碱基编号364～678的碱基序列构成)，将该重链片段基因插入到GS载体pEE6.4(Lonza公司)中。另外，分别在抗体的轻链可变区基因的5’侧连接编码信号序列的基因，并且在3’侧连接人Igκ的恒定区基因(由序列号3的碱基编号337～657的碱基序列构成)，将该轻链基因插入到GS载体pEE12.4(Lonza公司)中。利用NotI和PvuI对分别插入有抗体的重链片段和轻链的基因的上述pEE载体进行限制性酶切割，使用连接用试剂盒TAKARA连接试剂盒Ver2.1(Takara公司)进行连接，构建出插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体。
使用上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体，利用瞬时性表达和稳定表达这两种方法进行抗体表达。关于瞬时性表达，对于在Expi293表达培养基(Thermo FisherScintific公司)中培养至约300万个/mL的Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific公司)，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)转染上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体，培养5～7天。使用KappaSelect(通用电气医疗日本公司)对培养上清进行纯化，得到Fab片段。关于稳定表达，通过使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)的电穿孔法将利用PvuI形成为直链的上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体转染到CHOK1SV细胞(Lonza公司)中。在转染次日添加蛋氨酸亚砜亚胺，培养5～7天。将细胞接种到含有甲基纤维素的半固体培养基上，菌落形成后使用ClonePix FL(Molecular Devices公司)获得Fab片段的表达量多的细胞。使用Capto L(通用电气医疗日本公司)、Q Sepharose Fast Flow(通用电气医疗日本公司)和BioPro S75(YMC公司)对该细胞的培养上清进行纯化，得到Fab片段。
分别将编码所制作的抗人CEACAM5抗体Fab片段(称为PB009-01或Fab2)的重链片段的碱基序列示于序列号1，将由其编码的氨基酸序列示于序列号2，将编码PB009-01的轻链的碱基序列示于序列号3，将由其编码的氨基酸序列示于序列号4。PB009-01的重链可变区由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成，重链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号2的氨基酸编号31～35、50～66、99～110的氨基酸序列构成。PB009-01的轻链可变区由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成，轻链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸编号24～38、54～60、93～101的氨基酸序列构成。
需要说明的是，可变区和CDR序列按照Kabat编号来确定(Kabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目的的蛋白质序列)、第5版、美国公共卫生局、国立卫生研究院、贝塞斯达)。
(实施例2：抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的制作)
本实施例公开复合物的制造实施例。本实施例中的各制造实施例中，“实施例2”中借助连字符来记载“复合物的编号”。例如，“实施例2-11”表示本实施例中的复合物11的制造实施例。另外，本实施例中的Fab2为实施例1中得到的抗人CEACAM5抗体Fab片段(PB009-01/Fab2)，“p-Fab”表示Fab2借助其p个氨基结合于p个[]或()中记载的标记部而形成复合物。需要说明的是，以下的几个实施例中记载了通过MS分析而确认的各复合物的Fab2所结合的标记部(Y-S1-X)的数量，但是该结果并不表示不包括具有除此以外的结合数的复合物。容易理解的是，有可能存在由于MS分析设备的精度的关系而未能确认其存在的结合数的复合物。另外，本实施例中的结构式中，结合有Gd的DOTA的结构式示意性地表示用Gd进行了标记的DOTA。
(实施例2-11.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001041
(i)O4-叔丁基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1.00g)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入三氟乙酸(以下简称为TFA)(3mL)，在相同温度下搅拌2小时。减压浓缩后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。向该残渣中加入N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-天冬氨酸氢O4-叔丁酯(920mg)、二氯甲烷(10mL)、二异丙基乙胺(以下简称为DIPEA)(2mL)、六氟磷酸(1-)1-(二甲基氨基)-N,N-二甲基-1-[(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)氧基]甲烷亚胺
Figure BDA0003145471430001051
(以下简称为HATU)(1.2g)，在室温下搅拌16小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，由此得到标题化合物(2.86g)。MS(ESI+)：809.5[M+Na]+
(ii)O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
向O4-叔丁基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(2.86g)的四氢呋喃(以下简称为THF)(10mL)溶液中加入吗啉(6mL)，在室温下搅拌1小时。在冰浴中冷却后，滤出所生成的固体，用甲醇洗涤残渣。将滤液减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→4％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(1.04g)。MS(ESI+)：565.5
(iii)N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
将O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(570mg)、二氯甲烷(6mL)、3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酸(305mg)、DIPEA(520μL)、HATU(575mg)的混合物在室温下搅拌43小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→80％乙酸乙酯/己烷)纯化，由此得到标题化合物(712mg)。MS(ESI+)：798.6
(iv)N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(712mg)的二氯甲烷(2mL)溶液中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌7小时。加入三乙胺、氨基硅胶，在减压下进行浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(氨基硅胶，溶剂梯度；0→2％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(495mg)。MS(ESI+)：698.4
(v)O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
将N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-O4-叔丁基-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(495mg)、N,N-二甲基甲酰胺(以下简称为DMF)(5mL)、[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1，4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酸(以下简称为DOTA-tris(t-Bu)ester)(446mg)、DIPEA(400μL)、HATU(404mg)的混合物在室温下搅拌66小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→20％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(387mg)。MS(ESI+)：1275.5[M+Na]+
(vi)O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯的合成
将O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(387mg)、10％钯负载碳(含水50％、65mg)、乙醇(4mL)的混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌5小时。使用硅藻土对该混合物进行过滤、浓缩。向残渣中加入10％钯负载碳(含水50％、650mg)、乙醇(8mL)，将该混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌20小时。使用硅藻土过滤该混合物后进行浓缩，由此得到标题化合物(336mg)。MS(ESI+)：1140.5[M+Na]+
(vii)O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯(336mg)、饱和碳酸氢钠水溶液(2.5mL)的混合物中加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯(56mg)、THF(5mL)的溶液，将该混合物在相同温度下搅拌2小时。在冰冷却下加入1M氢氧化钠水溶液(60μL)后，在室温下搅拌1小时。加入乙酸乙酯、10％柠檬酸水溶液后，分离有机层。用10％甲醇/氯仿对水层进行萃取，将收集的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→20％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(341mg)。MS(ESI+)：1198.5
(viii)N-[3-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
向O4-叔丁基-N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(341mg)的二氯甲烷(2mL)溶液中加入TFA(2mL)，在室温下搅拌5小时。减压浓缩后，将残渣用反相柱色谱(溶剂梯度；0→20％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(99.6mg)。MS(ESI+)：918.3
(ix)[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯甲酰基}-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆的合成
向N-[3-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(20.0mg)、水(2mL)、氯化钆(6mg)的混合物中加入碳酸氢钠水溶液(0.1M、800μL)，在室温下搅拌10分钟。加入碳酸氢钠水溶液(0.1M、60μL)，在室温下搅拌1小时。加入乙二胺四乙酸(以下简称为EDTA)水溶液(0.5M、300μL)，在室温下搅拌10分钟。将反应混合物用反相柱色谱(溶剂梯度；0→25％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(12.0mg)。MS(ESI-)：1071.4
(x)复合物No.11的合成
将[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯甲酰基}-L-α-天冬氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。分注其溶液40μL，加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，加入0.1M碳酸钠水溶液使pH达到6.6。
向4.45mg/mL Fab2的硼酸缓冲液(160μL)中加入此前制备的溶液，在30℃下保温2小时。加入0.05M EDTA水溶液(40μL)后，在30℃下保温10分钟。用PD-10柱进行纯化，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器(默克密理博公司)进行回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水反复洗涤7次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1073的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-12.([Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001091
(i)N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
向N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酸(1.5g)的二氯甲烷(30ml)混合液中依次加入N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯一盐酸盐(2.1g)、Et3N(2.4mL)和HATU(2.5g)，在室温下反应一晚。
将反应混合物浓缩后，用硅胶柱(溶剂梯度；10→50％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(3.16g)。MS(ESI+)：606.4[M+Na]+
(ii)N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-L-赖氨酸叔丁酯的合成
将N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(3150mg)的乙醇(60ml)、10％钯负载碳(含水50％、1000mg)的混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌4.5小时。由于有原料残留，因此对体系内进行氩气置换后对混合物进行硅藻土过滤，浓缩滤液。将残渣溶解于甲醇(60ml)，加入10％钯负载碳(含水50％、1000mg)后将混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌5小时。确认原料消失后，对体系内进行氩气置换，对混合物进行硅藻土过滤，浓缩滤液，得到标题化合物(2520mg)。MS(ESI+)：450.4
(iii)N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-L-赖氨酸叔丁酯(825mg)的饱和碳酸氢钠水溶液(6ml)悬浮液中加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯(340mg)的THF(12ml)溶液。在相同温度下搅拌2小时后，加入1M氢氧化钠水溶液(0.36ml)，在室温下搅拌1小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释后，用10％柠檬酸水溶液使其显酸性。分离有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后将滤液减压浓缩。将残渣用硅胶柱(溶剂梯度；0→8％甲醇/氯仿)纯化，得到标题化合物(743mg)。MS(ESI+)：552.4[M+Na]+
(iv)L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(325mg)的二氯甲烷(4ml)溶液中滴加TFA(2ml)。将混合物在相同温度下搅拌1小时。将混合物减压浓缩，得到标题化合物(418mg)的粗产物。MS(ESI+)：430.4
(v)N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
向L-苯丙氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐(415mg)的二氯甲烷(10ml)混合物中依次加入N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(118mg)、三乙胺(以下简称为TEA)(0.26ml)、HATU(256mg)，将混合物在室温下搅拌一晚。将混合物减压浓缩后，用硅胶柱(溶剂梯度；0→30％丙酮/氯仿)纯化，得到标题化合物(206mg)。MS(ESI+)：609.4[M+Na)+
(vi)甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐的合成
使用N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(205mg)，与上述实施例2-12(iv)同样地进行，得到标题化合物(223mg)的粗产物。MS(ESI+)：487.4
(vii)甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸单(三氟乙酸)盐的合成
向甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐(9mg)的二氯甲烷(1ml)混合物中加入TFA(1ml)，在室温下搅拌1小时。将混合物减压浓缩，得到标题化合物(8mg)的粗产物。MS(ESI+)：431.3
(viii)N-[(4-{[1,4,7,10-四(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代氨甲酰基]甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
向甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸单(三氟乙酸)盐(8mg)和2,2’,2”,2”’-{2-[(4-异硫氰酸根合苯基)甲基]-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四基}四乙酸(简称p-SCN-Bn-DOTA)(8mg)的DMF(1ml)混合物中加入DIPEA(35μL)，在室温下搅拌1.5小时。将混合物用1％TFA水溶液(约5ml)稀释，用反相柱色谱(溶剂梯度5-50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，得到标题化合物(13mg)。MS(ESI+)：982.3
(ix)氢＝[N-{[4-({1,4,7，10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-2-基-κ4N1,N4,N7,N10}甲基)苯基]硫代氨甲酰基}甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(4-)]钆酸根(1-)的合成
将N-[(4-{[1，4,7，10-四(羧甲基)-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代氨甲酰基]甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(12mg)用水(5ml)稀释，加入氯化钆(4mg)。用0.1M碳酸氢钠将混合物的pH调节到5-6，在室温下搅拌1小时。向混合物中加入0.5M EDTA水溶液(80μL)，在室温下搅拌5分钟。加入TFA(10μL)后，用反相柱色谱(溶剂梯度5-50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，得到标题化合物(5mg)。MS(ESI+)：1137.0
(x)复合物No.12的合成
使用氢＝[N-{[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基-κ4N1,N4,N7,N10}甲基)苯基]硫代氨甲酰基}甘氨酰-L-苯丙氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(4-)]钆酸根(1-)，与上述实施例2-11的步骤(x)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1136的[Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-13.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001131
(i)N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1.00g)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入TFA(3mL)，在相同温度下搅拌2小时。减压浓缩后，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。向该残渣中加入N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酸(556mg)、二氯甲烷(10mL)、DIPEA(2mL)、HATU(1.16g)，在室温下搅拌1小时。将反应溶液浓缩后，向残渣中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用1M氢氧化钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，由此得到标题化合物(1.70g)。MS(ESI+)：625.5
(ii)L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1.70g)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入TFA(4mL)，在相同温度下搅拌7小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(氨基硅胶,溶剂梯度；0→4％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(663mg)。MS(ESI+)：525.4
(iii)N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
将L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(663mg)、二氯甲烷(6mL)、3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酸(480mg)、DIPEA(700μL)、HATU(960mg)的混合物在室温下搅拌39小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→100％乙酸乙酯/己烷)纯化，由此得到标题化合物(935mg)。MS(ESI+)：758.5
(iv)N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(935mg)的二氯甲烷(2mL)溶液中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌1小时。加入Et3N、氨基硅胶，减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(氨基硅胶,溶剂梯度；0→10％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(260mg)。MS(ESI+)：658.5
(v)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
使用N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(260mg)，与上述实施例2-11的步骤(v)同样地进行，得到标题化合物(353mg)。MS(ESI-)：1210.4
(vi)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯的合成
使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(353mg)，与上述实施例2-11的步骤(vi)同样地进行，得到标题化合物(245mg)。MS(ESI+)：1078.8
(vii)N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯(245mg)，与上述实施例2-11的步骤(vii)同样地进行，得到标题化合物(139mg)。MS(ESI+)：1158.8
(viii)N-[3-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
使用N-[3-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(341mg)，与上述实施例2-11的步骤(viii)同样地进行，得到标题化合物(38.2mg)。MS(ESI+)：934.4
(ix)[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆的合成
使用N-[3-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(28mg)，与上述实施例2-11的步骤(ix)同样地进行，得到标题化合物(13.8mg)。MS(ESI+)：1089.2
(x)复合物No.13的合成
使用[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆，与上述实施例2-11的步骤(x)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1089的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-15.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001171
(i)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(400mg)的二氯甲烷(4mL)溶液中加入TFA(4mL)，在冰冷却下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩，由此得到标题化合物(642mg)。MS(ESI+)：340.4
(ii)N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向甘氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐(642mg)、二氯甲烷(6mL)的混合物中加入3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酸(228mg)、DIPEA(1.5mL)、HATU(345mg)，将该混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→4％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(489mg)。MS(ESI+)：573.4
(iii)N-[3-(17，17-二甲基-3,15-二氧代-5,8，11，16-四氧杂-2，14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酰基]甘氨酰-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(489mg)、茴香醚(280μL)、二氯甲烷(5mL)的混合物中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，加入二氯甲烷(7mL)，在冰冷却下加入2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六烷-16-酸(289mg)、DIPEA(1.5mL)、HATU(487mg)，将该混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→1％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(427mg)。MS(ESI+)：762.5
(iv)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酰基]甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(427mg)、茴香醚(200μL)、二氯甲烷(4mL)的混合物中加入TFA(1.3mL)，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，加入DMF(6mL)，在冰冷却下，加入DOTA-tris(t-Bu)ester(353mg)、DIPEA(0.96mL)、HATU(320mg)，将该混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→10％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(863mg)。MS(ESI+)：1238.9[M+Na]+
(v)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(863mg)，与上述实施例2-11的步骤(viii)同样地进行，得到标题化合物(40.0mg)。MS(ESI+)：992.5
(vi)[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆的合成
使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(40mg)，与上述实施例2-11的步骤(ix)同样地进行，得到标题化合物(15.9mg)。MS(ESI-)：1145.0
(vii)复合物No.15的合成
使用[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆，与上述实施例2-11的步骤(x)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1147的[Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-24.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)的合成)
复合物No.24的合成(经由亚氨基四氢噻吩的偶联)
向4.45mg/mL Fab2的硼酸缓冲液(160μL)中加入2mg/mL 2-亚氨基四氢噻吩(以下简称为2-IT)的0.1M硼酸缓冲液(5μL)，在37℃下保温40分钟。对于过量的2-IT，使用AmiconUltra-0.5mL离心式过滤器并用磷酸缓冲生理盐水重复洗涤3次，最后进行浓缩。
将实施例2-13(ix)中合成的[N-{3-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。向该溶液中加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，加入0.1M碳酸钠水溶液使pH达到6.0。
向包含抗体的得到的滤液中加入所制备的接头溶液，在30℃下保温2小时。加入含有EDTA的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)后，在30℃下保温10分钟。使用PD-10柱进行纯化，用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器进行回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤7次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1190的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例2-29.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1，3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001211
(i)3-(17，17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酸甲酯的合成
向2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六烷-16-酸(396mg)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入3-(氨基甲基)苯甲酸甲酯一盐酸盐(286mg)、HATU(590mg)、Et3N(900μL)，在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；2→6％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(598mg)。MS(ESI+)：455.2
(ii)3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酸的合成
向3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酸甲酯(597mg)的THF(15mL)溶液中加入1M氢氧化钠水溶液(4mL)和水(5mL)，在室温下搅拌5小时。将反应溶液用水稀释，加入10％柠檬酸后用乙酸乙酯萃取，将收集的有机层用饱和食盐水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后将滤液减压浓缩，由此得到标题化合物(662mg)。MS(ESI+)：441.1
(iii)N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(1.63g)、二氯甲烷(5mL)的混合物中加入TFA(3mL)，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩。向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酸(1.11g)、二氯甲烷(8mL)、HATU(2.12g)的混合物中加入DIPEA(5mL)，在室温下搅拌5分钟。向该反应混合物中加入此前的反应中得到的残渣的二氯甲烷(4mL)溶液，在室温下搅拌20小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→5％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(1.63g)。MS(APCI/ESI+)：571.3
(iv)N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(150mg)、二氯甲烷(2mL)的混合物中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩。向3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酸(120mg)、二氯甲烷(3mL)、HATU(150mg)的混合物中加入DIPEA(360μL)，在室温下搅拌5分钟。向该反应混合物中加入此前的反应中得到的残渣的二氯甲烷(2mL)溶液，在室温下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→5％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(113mg)。MS(ESI+)：893.4
(v)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-[3-(17,17-二甲基-3,15-二氧代-5,8,11,16-四氧杂-2,14-二氮杂十八烷-1-基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(113mg)和二氯甲烷(2mL)的混合物中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌1小时后，减压浓缩，得到粗产物。在室温下向DOTA-tris(t-Bu)ester(80mg)和HATU(80mg)和二甲基乙酰胺(以下简称为DMAc)(1mL)的混合物中加入DIPEA(0.22mL)，搅拌10分钟后，加入此前得到的粗产物的DMAc(1mL)混合物，在相同温度下搅拌2小时。将反应混合物用反相柱色谱(溶剂梯度；0→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(178mg)。MS(ESI-)：1345.8
(vi)N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐(178mg)，与上述实施例2-11的步骤(viii)同样地进行，得到标题化合物(60.0mg)。MS(APCI/ESI+)：1123.4
(vii)[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆的合成
使用N-(3-{3,15-二氧代-16-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(40mg)，与上述实施例2-11的步骤(ix)同样地进行，得到标题化合物(10.3mg)。MS(ESI+)：1278.3
(viii)复合物No.29的合成
使用[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7，10-三[(羧基-κO)甲基]-1，4,7，10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1，N4，N7，N10}-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆，与上述实施例2-11的步骤(x)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1278的[Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1，3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例2-33.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001251
(i)N-[2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(150mg)、二氯甲烷(2mL)的混合物中加入TFA(2mL)，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩。向2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羧酸(88mg)、二氯甲烷(2mL)、HATU(150mg)、DIPEA(360μL)的混合物中加入此前的反应中得到的残渣的二氯甲烷(2mL)溶液，在室温下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→6％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(231mg)。MS(APCI/ESI+)：752.2[M+Na]+
(ii)N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐的合成
使用N-[2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(231mg)，与上述实施例2-29的步骤(v)同样地进行，得到标题化合物(222mg)。MS(ESI-)：1182.7
(iii)N-(2-{[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
使用N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐(222mg)，与上述实施例2-11的步骤(viii)同样地进行，得到标题化合物(53mg)。MS(APCI/ESI+)：960.2
(iv){N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰基-κO)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)}钆的合成
使用N-(2-{[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(22mg)，与上述实施例2-11的步骤(ix)同样地进行，得到标题化合物(7.0mg)。MS(ESI+)：1115.3
(v)复合物No.33的合成
使用(iv)的化合物，与上述实施例2-11的步骤(x)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1115的[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例2-35.([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)的合成)
复合物No.35的合成
使用实施例2-29(vii)中合成的[N-{3-[3-氧代-15-(氧代-κO)-16-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十六烷-1-基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(3-)]钆，与上述实施例2-24的步骤同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1380的[Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(＝O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]的复合物。
(实施例2-40.([Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001271
(i)N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
使用N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(690mg)，与上述实施例2-33的步骤(i)同样地进行，得到标题化合物(710mg)。MS(ESI+)：726.5[M+Na]+
(ii)N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐的合成
使用N-(3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(41mg)，与上述实施例2-12(iv)同样地进行，得到标题化合物(42mg)的粗产物。MS(ESI+)：604.3
(iii)N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸单(三氟乙酸)盐的合成
向N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐(41mg)的二氯甲烷(4ml)混合物中加入TFA(2ml)，在室温下搅拌1小时。将混合物减压浓缩后，进行甲苯共沸，得到粗产物(43mg)。将其中的16mg用反相柱色谱(溶剂梯度；5→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，得到标题化合物(11mg)。MS(ESI+)：548.2
(iv)N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-四(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代氨甲酰基]氨基}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
使用N-[3-(氨基甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸单(三氟乙酸)盐(11mg)，与实施例2-12的步骤(viii)同样地进行，得到标题化合物(17mg)。MS(ESI+)：1099.5
(v)氢＝[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基-κ4N1,N4,N7,N10}甲基)苯基]硫代氨甲酰基}氨基)甲基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(4-)]钆酸根(1-)的合成
使用N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-四(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基]甲基}苯基)硫代氨甲酰基]氨基}甲基)苯甲酰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸(16mg)，与实施例2-12的步骤(ix)同样地进行，得到标题化合物(6mg)。MS(ESI+)：1254.6
(vi)复合物No.40的合成
使用氢＝[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-四[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-2-基-κ4N1，N4，N7，N10}甲基)苯基]硫代氨甲酰基}氨基)甲基]苯甲酰基}-L-甲硫氨酰甘氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸合(4-)]钆酸根(1-)，与上述实施例2-24的步骤同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1355的[Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例2-47：([Gd/DOTA]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001291
在冰冷却下，向1，4，7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7，10-四乙酸(DOTA)(16mg)和水(810μL)的混合溶液中加入1M氢氧化钠水溶液(80μL)，调整为pH 6。在冰冷却下，向得到的溶液(239μL)中加入溶解于水(117μL)的1-羟基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠(2.3mg)。之后，加入3-{[(乙基亚氨基)亚甲基]氨基}-N,N-二甲基丙烷-1-胺一盐酸盐(以下简称为EDCHCl)水溶液(8.3μL、25mg/mL)，在冰冷却下搅拌30分钟而制备N-羟基磺酰琥珀酰亚胺基DOTA溶液。Fab2添加前加入0.2M磷酸氢二钠水溶液(pH 9)(40μL)而调节为pH 7。
(i)向17.8mg/mL Fab2(60μL)的0.1M磷酸氢二钠水溶液(390μL)中加入所制备的N-羟基磺酰琥珀酰亚胺基DOTA溶液(200μL)，在4℃下保温23小时。对于过量的接头，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器用10mM磷酸缓冲液重复洗涤3次，用0.3M的乙酸铵缓冲液洗涤，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。
Figure BDA0003145471430001301
(ii)将包含(i)中制作的复合物的0.3M的乙酸铵缓冲液用同样的缓冲液稀释，使用0.25M乙酸盐缓冲液调节为pH 6.62。向该制备为2.8mg/ml的Fab2溶液中添加制备为0.057M的GdCl3水溶液(35μL)，在37℃下保温0.5小时。反应后加入0.05M EDTA(525μL)，然后使用PD-10柱进行纯化，用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器进行回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤5次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个或2个分子量542的[Gd/DOTA]的复合物的混合物。
(实施例2-48：([Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001311
(i)在使作为螯合剂的DOTA与Fab2结合时，使用p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics公司)。向用磷酸缓冲生理盐水(pH 7.4)和甘油制备为2.54mg/mL的Fab2溶液中添加0.1M碳酸钠溶液(pH 9.0)而调节为pH 8.8-9.5。向其中添加p-SCN-Bn-DOTA，在37℃下保温2小时。反应后，用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器进行回收，对复合物进行纯化。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个或2个分子量553的[四臂-DOTA-CH2-(1，4-Ph)-NH-C(＝S)]的复合物。
Figure BDA0003145471430001312
(ii)使用(i)中制作的复合物，与上述实施例2-47的步骤(ii)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量706的[Gd/四臂-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]的复合物。
(实施例2-60：([DFO-C(＝O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(＝O)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001321
(i)3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸的合成
在室温下，向(3-甲酰基苯氧基)乙酸苄酯(2.90g)、2-甲基丙烷-2-醇(60mL)和水(30mL)的混合物中加入2-甲基丁-2-酮(6mL)、磷酸二氢钠二水合物(3.35g)和亚氯酸钠(3.64g)，搅拌2小时。向反应液中加入乙酸乙酯和1M盐酸(60mL)，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤。将滤液浓缩，由此得到标题化合物(2.93g)。MS(ESI-)：285.1
(ii)N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
将N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰-L-酪氨酸叔丁酯(2.49g)溶解于丙酮(50mL)，加入溴乙酸乙酯(2.05g)、碳酸钾(2.41g)，在室温下搅拌4小时。滤去不溶物，将滤液浓缩，将得到的残渣用硅胶柱色谱(乙酸乙酯：己烷＝30：70-60：40)纯化，得到标题化合物(2.99g)。MS(ESI+)：537.4[M+Na]+
(iii)N-{3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
将N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯(2.75g)溶解于乙醇(55mL)，在氩气气氛下加入10％钯负载碳(含水50％、550mg)，在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌过夜。对体系内进行氩气置换后，滤去不溶物，将滤液浓缩，将残渣溶解于二氯甲烷(55mL)，加入3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸(1.99g)、HATU(2.84g)、Et3N(1.5mL)，在室温下搅拌1小时。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(乙酸乙酯：己烷＝30：70-70：30)纯化，得到标题化合物(3.07g)。MS(ESI-)：647.4
(iv)N-[3-(羧基甲氧基)苯甲酰基]甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
将N-{3-[2-(苄氧基)-2-氧代乙氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯(3282mg)溶解于THF(66mL)，在氩气气氛下加入10％钯负载碳(含水50％、328mg)，在氢气气氛下在室温下搅拌过夜。对反应液进行硅藻土过滤，将滤液浓缩，得到标题化合物(2.54g)。MS(ESI-)：557.4
(v)N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
向N4-{5-[乙酰基(羟基)氨基]戊基}-N1-(5-{4-[(5-氨基戊基)(羟基)氨基]-4-氧代丁酰胺}戊基)-N1-羟基丁二酰胺单甲磺酸盐(DFO.MeSO3H)(500mg)、N-[3-(羧基甲氧基)苯甲酰基]甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯(446mg)、EDC HCl(175mg)、1H-苯并三唑-1-醇(以下简称为HOBt)(123mg)中加入DMF(5mL)、Et3N(0.16mL)，在室温下搅拌过夜。向反应液中加入0.1％TFA水溶液(1ml)、TFA(0.03mL)，用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-0：100)纯化，得到标题化合物(548mg)。MS(ESI-)：1099.7
(vi)N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(羧甲基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
向N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯(500mg)中加入甲醇(5mL)和DMF(5mL)，稍加热而使其溶解，加入1M氢氧化钠水溶液(600μL)，在室温下搅拌过夜。追加1M氢氧化钠水溶液(600μL)，在室温下搅拌过夜。在冰冷却下加入TFA(90μL)，减压下馏去甲醇，将得到的溶液用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-0：100)纯化，由此得到标题化合物(315mg)。MS(ESI-)：1071.6
(vii)N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯的合成
向N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(羧甲基)-L-酪氨酸叔丁酯(269mg)、EDC HCl(58mg)、HOBt(41mg)的混合物中加入DMF(4mL)，再加入1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮一盐酸盐(44mg)、Et3N(35μL)，在室温下搅拌4小时。向反应液中加入0.1％TFA水溶液(1mL)，用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-0：100)纯化，得到原料羧酸和标题化合物的混合物(155mg、约6：4)。将其溶解于DMSO(1mL)和DMF(2mL)，加入EDC HCl(22mg)、HOBt(15mg)，在室温下搅拌5分钟后，加入1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮一盐酸盐(15.5mg)、Et3N(12μL)，在室温下搅拌1小时。向反应液中加入0.1％TFA水(1mL)，用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-10：90)纯化，由此得到标题化合物(118mg)。MS(ESI-)：1193.6
(viii)N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-酪氨酸的合成
将N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-酪氨酸叔丁酯(118mg)溶解于TFA(1.2mL)，在室温下搅拌1.5小时。将反应液浓缩，加入DMF(1.5ml)、水(0.5ml)，用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-10：90)纯化，由此得到标题化合物(82mg)。MS(ESI-)：1137.5
(ix)复合物No.60的合成
向用0.1M硼酸缓冲液制备为4.45mg/mL的Fab2溶液中加入用0.1M硼酸缓冲液制备的2-IT溶液，在37℃下保温30分钟。对于过量的2-IT，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器，用含有EDTA的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)洗涤，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤。向得到的滤液中加入溶解于DMF的N-{3-[(9,20,31-三羟基-2,10,13,21,24,32-六氧代-3,9,14,20,25,31-六氮杂三十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-O-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-酪氨酸，用0.1M硼酸缓冲液(pH8.5)稀释，在室温下保温2小时。对于过量的试剂，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器，用含有EDTA的磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)洗涤，将其重复3次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤。
接着，向得到的上清液中加入用磷酸缓冲生理盐水(pH6.0)制备为10mg/mL的2-碘乙酰胺溶液，然后在37℃下保温30分钟。对于过量的碘乙酰胺，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器，用磷酸缓冲生理盐水重复洗涤3次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，对结合有Fab2的复合物进行纯化。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1241的[DFO-C(＝O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(＝O)-Gly-Tyr*-CH2-C(＝O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]的复合物的混合物。
(实施例2-61：([DFO-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(＝O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001371
(i)N-(3-羟基苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向3-羟基苯甲酸(1.0g)和甘氨酸叔丁酯一盐酸盐(1.2g)的DMF(10mL)混合物中加入HATU(3.3g)和DIPEA(3mL)，在室温下搅拌1小时。向混合物中加入水和乙酸乙酯，进行两次分液萃取，将有机层用水和饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后将滤液减压浓缩，向得到的固体中加入乙酸乙酯，在室温下搅拌后滤取不溶物，浓缩滤液。将残渣用硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝95/5-50/50)纯化，收集作为目标物的级分，浓缩，减压干燥，得到标题化合物(1.23g)。MS(ESI+)：274.2[M+Na]+
(ii)3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸苄酯的合成
在冰冷却下向3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯(3.0g)中加入4M氯化氢/二氧杂环己烷(10mL)，然后将该混合物在室温下搅拌1小时。浓缩后用甲苯进行2次共沸干燥，然后在室温下加入甲醇(20mL)和1M氢氧化钠水溶液(13mL)，在相同温度下搅拌1.5小时。将混合物浓缩后，加入THF(10mL)、甲醇(10mL)和溴化苄(1.8mL)，在室温下搅拌3天。将混合物浓缩，将残渣用硅胶柱色谱纯化(己烷/乙酸乙酯＝95/5-0/100→氯仿/甲醇＝90/10)，得到标题化合物(2.19g)。MS(ESI+)：313.2
(iii)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酸叔丁酯的合成
加入N-(3-羟基苯甲酰基)甘氨酸叔丁酯(915mg)、3-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸苄酯(1.38g)、偶氮二羧酸二乙酯(40％甲苯溶液,约2.2M、3.4mL)、THF(20mL)，之后在室温下一点一点地加入三苯基膦(2.0g)后，在浴温60℃下搅拌过夜。加入氯化镁(1.5g)和甲苯(20mL)，在浴温60℃下加热搅拌2小时。自然冷却到室温后，通过过滤除去析出的固体，馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱纯化(硅胶；己烷/乙酸乙酯＝95/5-20/80)后，用硅胶柱色谱再次纯化(氨基硅胶；己烷/乙酸乙酯＝95/5-50/50)，得到标题化合物(1.12g)。MS(ESI+)：546.4
(iv)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酸的合成
在室温下将N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酸叔丁酯(1.11g)溶解于4M氯化氢/二氧杂环己烷(5mL)，在相同温度下搅拌2小时。将混合物浓缩，减压干燥，得到标题化合物(1.12g)。MS(ESI+)：490.3
(v)N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酸(1300mg)、N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯一盐酸盐(1.0g)的DMF(20mL)溶液中加入HATU(1.2g)和DIPEA(1.4mL)，在室温下搅拌2小时。向混合物中加入水和乙酸乙酯，进行分液萃取，将有机层用水和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后将滤液减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱纯化(氨基硅胶；己烷/乙酸乙酯＝90/10-0/100)，得到标题化合物(1.14g)。MS(ESI+)：808.5
(vi)N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲酰基]甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯的合成
在室温下，向N-{3-[(3-氧代-1-苯基-2,6,9,12-四氧杂十四烷-14-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1.12g),Et3N(20μL)和乙醇(20mL)的混合物中加入10％钯负载碳(含水50％、200mg)，在氢气气氛下在相同温度下搅拌过夜。设为开放体系，室温搅拌30分钟以上，然后对反应液进行硅藻土过滤，将滤液浓缩，得到标题化合物(825mg)。MS(ESI+)：584.5
(vii)N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲酰基]甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在室温下，向N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲酰基]甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯(350mg)、THF(3mL)和DMF(1mL)的混合物中加入2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯(150mg)和Et3N(500μL)，在浴温60℃下搅拌4天。将混合物冷却到室温后，加入TFA(300μL)和水(500μl)，进行中和。向该混合物中加入适量的水和DMF，用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-0：100)纯化。收集目标物的级分，浓缩，减压干燥，得到标题化合物(250mg)。MS(ESI+)：664.5
(viii)N-{3-[(19,30,41-三羟基-12,20,23,31,34,42-六氧代-3,6,9-三氧杂-13,19,24,30,35,41-六氮杂四十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯的合成
在冰冷却下，向N4-{5-[乙酰基(羟基)氨基]戊基}-N1-(5-{4-[(5-氨基戊基)(羟基)氨基]-4-氧代丁酰胺}戊基)-N1-羟基丁二酰胺单甲磺酸盐(DFO.MeSO3H)(240mg)、N-[3-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)苯甲酰基]甘氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(243mg)的DMF(3mL)和DMSO(1mL)的混合物中加入EDC HCl(140mg),HOBt(100mg)和DIPEA(200μL)，在室温下搅拌3小时。加入TFA(100μL)和水(500μL)，将该溶液用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-10：90)纯化，冷冻干燥，得到标题化合物(207mg)。MS(ESI+)：1228.5[M+Na]+
(ix)N-{3-[(19，30,41-三羟基-12,20,23,31,34，42-六氧代-3，6,9-三氧杂-13,19,24,30,35,41-六氮杂四十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸的合成
在室温下，向N-{3-[(19，30，41-三羟基-12,20，23，31，34，42-六氧代-3，6，9-三氧杂-13，19，24，30，35,41-六氮杂四十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸叔丁酯(202mg)中加入TFA(1mL)，在相同温度下搅拌1小时。将混合物浓缩，加入DMF(4ml)和水(500μL)，将混合物用反相柱色谱(0.1％TFA水溶液：乙腈＝95：5-10：90)纯化，冷冻干燥，得到标题化合物(137mg)。MS(ESI-)：1148.7
(x)复合物No.61的合成
使用N-{3-[(19,30，41-三羟基-12，20,23,31,34，42-六氧代-3,6，9-三氧杂-13，19，24，30，35，41-六氮杂四十三烷-1-基)氧基]苯甲酰基}甘氨酰-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-L-正亮氨酸，与上述实施例2-60的步骤(ix)同样地进行，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1252的[DFO-C(＝O)-(CH2CH2O)4-(1，3-Ph)-C(＝O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例2-18.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001411
(i)(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨基甲酸4-硝基苯酯的合成
在氮气气氛下将氯甲酸4-硝基苯酯(952mg)的二氯甲烷(10ml)溶液进行冰冷却，滴加[(4-氨基苯基)甲基]氨基甲酸叔丁酯(1000mg)和吡啶(430μL)的二氯甲烷(10mL)混合溶液后，在相同温度下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；10→100％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到粗产物。向粗产物中加入乙酸乙酯，搅拌，将固体粉碎。滤取固体，用乙酸乙酯洗涤后，减压干燥，由此得到标题化合物(861mg)。MS(ESI+)：410.3[M+Na]+
(ii)L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺单(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺(257mg)的二氯甲烷(4ml)溶液中滴加TFA(2ml)。将混合物在相同温度下搅拌1小时。将混合物减压浓缩，加入异丙醚，进行2次倾析，对沉淀出的固体进行洗涤，得到标题化合物(248mg)的粗产物。MS(ESI+)：385.3
(iii)N-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨甲酰基]-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺的合成
向(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨基甲酸4-硝基苯酯(54mg)和L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺单(三氟乙酸)盐(70mg)的二氯甲烷(5ml)混合溶液中加入TEA(59μL)，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物减压浓缩，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；2→6％甲醇/氯仿)纯化，得到标题化合物(55mg)。MS(ESI+)：633.5
(iv)N-{[4-(氨基甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺单(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨甲酰基]-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺(54mg)的二氯甲烷(4ml)溶液中滴加TFA(2ml)，在相同温度下搅拌1小时。将混合物减压浓缩，加入异丙醚，进行2次倾析，对沉淀出的固体进行洗涤，得到标题化合物(65mg)的粗产物。MS(ESI+)：555.4[M+Na]+
(v)N-{[4-({2-[4，7，10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐的合成
向N-{[4-(氨基甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺单(三氟乙酸)盐(64mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(50mg)的DMAc(2mL)混合溶液中加入HATU(66mg)、DIPEA(45μL)，在室温下搅拌2小时。向反应混合物中加入1％TFA水溶液(约4ml)和乙腈(约1ml)后，将该稀释溶液用反相柱色谱(溶剂梯度；20→100％0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(92mg)。MS(ESI+)：1109.4[M+Na]+
(vi)N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐的合成
向N-{[4-({2-[4,7，10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐(90mg)的二氯甲烷(4mL)溶液中加入TFA(4mL)，在室温下搅拌过夜。减压浓缩后，将残渣用反相柱色谱(溶剂梯度；5→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(57mg)。MS(ESI+)：919.4
(vii)[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆的合成
向N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐(22mg)、水(3mL)的混合物中加入氯化钆(8mg)，加入0.1M碳酸氢钠水溶液调节为pH5-6，在室温下搅拌1小时。向反应混合物中加入TFA(10μL)后，将该溶液用反相柱色谱(溶剂梯度；5→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(16mg)。MS(ESI-)：1072.1
(viii)复合物No.18的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。向该溶液中加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，使用0.1M碳酸钠水溶液和0.25M乙酸缓冲液调节为pH 7.3。
向4.45mg/mL Fab2的硼酸缓冲液(160μL)中加入此前制备的溶液40μL，在30℃下保温2小时。使用PD-10柱进行纯化，用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器进行回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤7次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1074的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-66.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4和/或A-5)]p-Fab2)的合成)
(i)复合物No.66的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。向该溶液中加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，使用0.1M碳酸钠水溶液调节为pH 6.5。
向4.45mg/mL Fab2的硼酸缓冲液(320μL)中加入此前制备的溶液，在30℃下保温2小时。加入0.05M的EDTA 10μL，在30℃下保温10分钟。使用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器，用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，回收溶液。
向回收的溶液中加入20mM Bis-Tris丙烷缓冲液(pH 9.5)，稀释至5倍量，负载到5mL HiTrap Q柱(GE Healthcare)，在室温下静置6小时。使用20mM Bis-Tris丙烷缓冲液(pH 9.5)和1M氯化钠水溶液洗涤柱，回收负载溶液。使用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器与磷酸缓冲生理盐水进行缓冲液交换后，将该溶液用PD-10柱纯化，用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1092的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4和/或A-5)]的复合物、结合有2个的复合物、结合有3个的复合物和结合有4个的复合物的混合物。
(实施例2-67.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)的合成)
(i)复合物No.67的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(2mg)溶解于DMSO(80μL)，加入0.1M硼酸缓冲液(80μL)后，用0.1M碳酸钠水溶液调节为pH7.3。
向4.45mg/mL Fab2的硼酸缓冲液(320μL)中加入用0.1M硼酸缓冲液制备的2mg/mL的2-IT溶液(10μL)，在37℃下保温40分钟。对于过量的2-IT，使用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器，用磷酸缓冲生理盐水洗涤，浓缩到200μL，然后加入此前制备的溶液，在30℃下保温2小时。加入0.05M的EDTA(10μL)，在30℃下保温10分钟后，用PD-10柱纯化，用AmiconUltra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。
通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1175的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-68.[Gd/DOTA-NH-CH2-(1，4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001471
(i)N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-N2-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
向N-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸(3.00g)和HATU(5.92g)的二氯甲烷(30ml)混合溶液中依次加入DIPEA(6.6mL)、(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯一盐酸盐(3.29g)，在室温下搅拌1小时。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。向残渣中加入乙酸乙酯/二氯甲烷(1：2)溶液200mL后进行浓缩而得到100mL溶液后，进行冰冷却。滤取析出的固体，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：1)溶液洗涤，得到固体。将滤液再次浓缩后，进行冰冷却，滤取析出的固体，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：1)溶液洗涤，得到固体。将得到的固体合并，减压干燥，由此得到标题化合物(4.10g)。MS(ESI+)：408.3
(ii)N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
在冰冷却下，向N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-N2-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸酰胺(2.00g)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入TFA(7.51mL)，在相同温度下搅拌1小时。减压浓缩后，向该残渣中加入N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酸(1.35g)、DIPEA(4.2mL)、二氯甲烷(20mL)和HATU(2.24g)，在室温下搅拌1小时。滤取析出的固体，用二氯甲烷和甲醇洗涤后，减压干燥，由此得到标题化合物(1.58g)。MS(ESI+)：539.4
(iii)L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
在冰冷却下，向N-(叔丁氧羰基)-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺(1.05g)的二氯甲烷(6ml)溶液中滴加TFA(3ml)。将混合物在相同温度下搅拌2小时。将混合物减压浓缩，加入二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取2次。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，由此得到标题化合物(690mg)的粗产物。MS(ESI+)：439.4
(iv)N-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨甲酰基]-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
在氩气气氛下，向4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯甲酸(395mg)、TEA(660μL)和甲苯(20mL)的混合溶液中加入叠氮磷酸二苯酯(680μL)，在室温下搅拌1小时后，在浴温100℃下搅拌2小时。将反应溶液自然冷却到室温，加入L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺(690mg)的THF(7mL)溶液，在室温下搅拌3小时。将反应溶液减压浓缩，加入碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯，将产生的固体滤出并用乙酸乙酯洗涤后，减压干燥，由此得到标题化合物(790mg)。MS(ESI+)：687.5
(v)N-{[4-(氨基甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
在冰冷却下，向N-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨甲酰基]-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺(790mg)的二氯甲烷(3ml)溶液中滴加TFA(2ml)。将混合物在相同温度下搅拌1小时。将混合物减压浓缩，加入饱和碳酸氢钠水溶液。滤取析出的固体并用水洗涤后，减压干燥，由此得到标题化合物(720mg)的粗产物。MS(ESI+)：587.6
(vi)N-{[4-({2-[4，7，10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
向N-{[4-(氨基甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺(360mg)、DOTA-tris(t-Bu)ester(386mg)、DIPEA(320μL)的DMAc(2mL)混合溶液中加入HATU(280mg)，在室温下搅拌2小时。将反应混合物用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→20％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(683mg)。MS(ESI+)：1141.9
(vii)N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-氨基乙基)-L-异亮氨酸酰胺的合成
将N-{[4-({2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1，4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺(683mg)、10％钯负载碳(含水50％、382mg)和甲醇(10mL)的混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌18小时。过滤该混合物而除去不溶物后，进行浓缩。向残渣中加入10％钯负载碳(含水50％、382mg)和甲醇(10mL)，将该混合物在氢气气氛下(1atm)在室温下搅拌2小时。过滤该混合物而除去不溶物后，浓缩，由此得到标题化合物(417mg)。MS(ESI+)：1007.7
(viii)N-{[4-({2-[4，7,10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-氨基乙基)-L-异亮氨酸酰胺五(三氟乙酸)盐的合成
将N-{[4-({2-[4，7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-氨基乙基)-L-异亮氨酸酰胺(417mg)、水(210μL)、三(丙烷-2-基)硅烷(210μL)和TFA(8mL)的混合溶液在室温下搅拌3小时。减压浓缩后，将残渣用反相柱色谱(溶剂梯度；0→33％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(255mg)。MS(ESI+)：839.7
(ix)N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4，7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-{[4-({2-[4，7,10-三(羧甲基)-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-氨基乙基)-L-异亮氨酸酰胺五(三氟乙酸)盐(255mg)的DMAc(2mL)溶液中加入TEA(200μL)，在相同温度下搅拌10分钟。向该溶液中加入1，4-二异硫氰酸根合苯(174mg)的DMAc(2mL)溶液，在相同温度下搅拌1小时。将该反应溶液用反相柱色谱(溶剂梯度；0→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(136mg)。MS(ESI+)：1031.4
(x)[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆的合成
向N-{[4-({2-[4，7，10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐(36mg)、水(1.8mL)的混合物中加入氯化钆(10mg)、0.1M碳酸氢钠水溶液(1.7mL)并调节为pH5.4，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用反相柱色谱(溶剂梯度；0→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(33.0mg)。MS(ESI-)：1184.3
(xi)复合物No.68的合成
使实施例2-68(x)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(310μL)。
向4.45mg/mL Fab2的磷酸缓冲生理盐水溶液(320μL)中加入此前制备的溶液30μL，用0.1M碳酸钠水溶液调节为约pH 9.0，在37℃下保温24小时。用PD-10柱纯化，用AmiconUltra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1187的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例2-69.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]p-Fab2)的合成)
Figure BDA0003145471430001521
(i)N-[2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯的合成
向L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(303mg)和2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羧酸(160mg)的二氯甲烷(10mL)混合溶液中加入TEA(0.24mL)和HATU(241mg)，在室温下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩后，将残渣用硅胶柱色谱(溶剂梯度；0→4％甲醇/氯仿)纯化，由此得到标题化合物(191mg)。MS(ESI+)：784.4
(ii)N-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-[2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯(190mg)的二氯甲烷(3ml)溶液中滴加TFA(1ml)。将混合物在相同温度下搅拌1小时后进行减压浓缩，由此得到标题化合物(262mg)的粗产物。MS(ESI+)：684.5
(iii)N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐的合成
向DOTA-tris(t-Bu)ester(138mg)的DMAc(1mL)溶液中加入HATU(184mg)和DIPEA(124μL)，在室温下搅拌5分钟。向该反应溶液中加入N-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯单(三氟乙酸)盐(261mg)的DMAc(1mL)溶液，在室温下搅拌2小时。将反应混合物用1％TFA水溶液(约1ml)稀释后，将该溶液用反相柱色谱(溶剂梯度；20→100％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(231mg)。MS(ESI+)：1260.7[M+Na]+
(iv)N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐的合成
将N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐(230mg)、10％钯负载碳(含水50％、300mg)、甲醇(10mL)的混合物在室温下搅拌10分钟。将该混合物过滤而除去不溶物后，对滤液进行浓缩。向其残渣中加入10％钯负载碳(含水50％、300mg)、甲醇(10mL)后，在氢气气氛下(3atm)在室温下搅拌18小时。将该混合物过滤而除去不溶物后进行浓缩，由此得到标题化合物(152mg)。MS(ESI+)：1104.5
(v)N-(2-{[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸五(三氟乙酸)盐的合成
向N-(2-{[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸叔丁酯四(三氟乙酸)盐(152mg)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入TFA(1.5mL)，在室温下搅拌4小时。减压浓缩后，将残渣用反相柱色谱(溶剂梯度；0→33％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(76mg)。MS(ESI+)：880.4
(vi)N-(2-{[4,7，10-三(羧甲基)-1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]-L-赖氨酸四(三氟乙酸)盐的合成
在冰冷却下，向N-(2-{[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-L-赖氨酸五(三氟乙酸)盐(76mg)、1,4-二异硫氰酸根合苯(50mg)的DMAc(1mL)溶液中加入TEA(60μL)，在相同温度下搅拌1小时。将该反应溶液用反相柱色谱(溶剂梯度；0→50％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(46mg)。MS(ESI-)：1070.6
(vii){N-[2-({4，7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4，N7，N10}乙酰基-κO)-1,2，3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]-L-赖氨酸合(3-)}钆的合成
向N-(2-{[4，7，10-三(羧甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基}-1，2，3,4-四氢异喹啉-5-羰基)-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]-L-赖氨酸四(三氟乙酸)盐(16mg)、水(800μL)的混合物中加入氯化钆(8mg)、0.1M碳酸氢钠水溶液(700μL)，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用反相柱色谱(溶剂梯度；0→40％乙腈/0.1％TFA水溶液)纯化，由此得到标题化合物(7.4mg)。MS(ESI-)：1225.3
(viii)复合物No.69的合成
使实施例2-69(vii)中合成的{N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰基-κO)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]-L-赖氨酸合(3-)}钆(1mg)溶解于DMSO(310μL)。
向4.45mg/mL Fab2的磷酸缓冲生理盐水溶液(320μL)中加入此前制备的溶液30μL，用0.1M碳酸钠水溶液调节为约pH 9.0，在37℃下保温24小时。用PD-10柱纯化，用AmiconUltra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.9kDa的Fab2结合有1个分子量1228的[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]的复合物、结合有2个的复合物、结合有3个的复合物、结合有4个的复合物和结合有5个的复合物的混合物。
将上述制造实施例中得到的复合物示于表1～2。
[表1]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001561
[表2]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001571
需要说明的是，上述表以及后述表15～18中，-表示键，S1栏的符号(a)～(q)分别表示下述的式(a)～(q)所示的间隔物。
Figure BDA0003145471430001581
使用与上述制造实施例同样的方法或本领域技术人员公知的方法合成表3～14的制造例编号A1～A43和B1～B4的化合物，使用这些得到了后述表15～18所示的复合物。
[表3]
Figure BDA0003145471430001591
[表4]
Figure BDA0003145471430001601
[表5]
Figure BDA0003145471430001611
[表6]
Figure BDA0003145471430001621
[表7]
Figure BDA0003145471430001631
[表8]
Figure BDA0003145471430001641
[表9]
Figure BDA0003145471430001651
[表10]
Figure BDA0003145471430001661
[表11]
Figure BDA0003145471430001671
[表12]
Figure BDA0003145471430001681
[表13]
Figure BDA0003145471430001691
[表14]
Figure BDA0003145471430001701
[表15]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001711
[表16]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001721
[表17]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001731
[表18]
(Y-S1-X)p-Fab2
Figure BDA0003145471430001741
将表15～18中记载的实施例化合物的MS分析示于下表19～23。
[表19]
Figure BDA0003145471430001751
[表20]
Figure BDA0003145471430001761
[表21]
Figure BDA0003145471430001771
[表22]
Figure BDA0003145471430001781
[表23]
Figure BDA0003145471430001791
实施例3-1：CEACAM5抗体Fab片段复合物的结合活性评价
对于实施例2中制作的各抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物进行ELISA，以评价对CEACAM5的结合活性。本试验中，作为抗原固相化液的溶剂，使用利用蒸馏水稀释至10倍而制备为10mM的磷酸缓冲液(ナカライテスク、0.1mol/L-磷酸缓冲液(pH 7.2))，作为洗涤液，使用利用蒸馏水稀释至20倍的20X PBS/Tween 20缓冲液(Thermo公司、28352)。另外，本试验中使用的牛血清白蛋白(BSA)是以合适的比例添加30％牛血清白蛋白溶液(SIGMA公司、A9576-50ML)来使用。用10mM磷酸缓冲液(pH7.2)将CEACAM5(R&D Systems公司、4128-CM-050)稀释为0.1μg/mL，以每1孔30μL添加到Nunc Maxisorp白色384平板(Nunc公司、460372)上，在4℃下将平板保温一晚而固相化。通过反离心除去CEACAM5固相化液后，添加含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液而进行封闭。之后，通过反离心除去封闭溶液，使用含有1.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液，对于上述各CEACAM5抗体Fab2片段复合物或作为对照的不具有标记部的Fab2片段(PB009-01)，将约10000ng/mL的溶液以3倍稀释进行14次连续稀释，每1孔中添加30μL，在室温下保温60分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL用含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液稀释至1000倍的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase：HRP)标记山羊抗人IgG(H+L链)抗体(MBLライフサイエンス公司、206)，在室温下保温30分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL作为底物的ECL Prime Western Blotting检测试剂(GE Healthcare公司、RPN2232)。在室温下保温15分钟后，用Envision计数器(パ一キンエルマ一公司)测定其信号值。
以重复的方式进行各抗体的试验，通过四参数Logistic曲线模型计算EC50值。将关于PB009-01的9次试验的EC50值(nM)的几何平均(Geometric mean)、标准偏差(GeometricSD factor)、95％置信区间(95％CI of geo.mean)的下限值(Lower)和上限值(Upper)示于表24。另外，将以重复的方式试验得到的各复合物的EC50值示于表25。需要说明的是，表中Ex-No表示实施例2中的复合物编号。
[表24]
PB009-01
几何平均(nM) 0.20
标准偏差 1.45
95％置信区间的下限值(nM) 0.15
95％置信区间的上限值(nM) 0.27
[表25]
Figure BDA0003145471430001811
实施例3-2：
对于实施例2中制作的各抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物进行ELISA，以评价对CEACAM5的结合活性。本试验中，作为抗原固相化液的溶剂，使用利用蒸馏水稀释至10倍而制备为10mM的磷酸缓冲液(ナカライテスク、0.1mol/L-磷酸缓冲液(pH 7.2))，作为洗涤液，使用利用蒸馏水稀释至20倍的20X PBS/Tween 20缓冲液(Thermo公司、28352)。另外，本试验中使用的牛血清白蛋白(BSA)是以合适的比例添加30％牛血清白蛋白溶液(SIGMA公司、A9576-50ML)来使用。用10mM磷酸缓冲液(pH7.2)将CEACAM5(R&D Systems公司、4128-CM-050)稀释为0.1μg/mL，以每1孔30μL添加到Nunc Maxisorp白色384平板(Nunc公司、460372)上，在4℃下将平板保温一晚而固相化。通过反离心除去CEACAM5固相化液后，添加含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液而进行封闭。之后，通过反离心除去封闭溶液，使用含有1.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液，对于上述各CEACAM5抗体Fab2片段复合物或作为对照的不具有标记部的Fab2片段(PB009-01)，将约10000ng/mL的溶液以3倍稀释进行14次连续稀释，向每1孔中添加30μL，在室温下保温60分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL用含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液稀释至1000倍的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase：HRP)标记山羊抗人IgG(H+L链)抗体(MBLライフサイエンス公司、206)，在室温下保温30分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL作为底物的ECL Prime Western Blotting检测试剂(GE Healthcare公司、RPN2232)。在室温下保温15分钟后，用Envision计数器(パーキンエルマー公司)测定其信号值。
以重复的方式进行各抗体的试验，通过四参数Logistic曲线模型计算出EC50值。将关于PB009-01的2次试验各自的EC50值(nM)示于表26。另外，将以重复的方式试验得到的各复合物的EC50值示于表27。需要说明的是，表中Ex-No表示实施例2的复合物编号。
[表26]
Figure BDA0003145471430001821
[表27]
Figure BDA0003145471430001822
实施例4-1：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(正常小鼠)
作为复合物，包括包含具有被肾刷状缘膜酶或溶酶体酶切断的氨基酸序列的肽接头作为“X”的肽接头的复合物。具有这些接头的本发明的复合物由于可在该接头部分被存在于肾脏的这些酶特异性切断，因此期待可减少标记部在肾脏中的聚集性。以下示出本发明的这样的复合物的肾脏聚集性的评价结果。
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式，从小鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。大约24小时后处死并摘出肾脏，用ICP-MS测定肾脏中的Gd量。以每组3例来实施，计算3例的平均值，以相对于总给药Gd量的百分率(％of dose/tissue(给药量的百分率/组织))形式示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量。将结果示于后述表28。表中Ex-No表示实施例2的复合物编号。另外，使用作为对照复合物的不含肽接头的上述制造实施例2-47中制造的Ex-No.47([Gd/DOTA]p-Fab)同样地进行试验，计算5次试验的几何平均(Geometric mean)、标准偏差(Geometric SD factor)、95％置信区间(95％CI of geo.mean)的下限值(Lower)和上限值(Upper)。
(结果)
将结果示于后述表29。以该对照复合物的百分率(给药量的百分率/组织)为基准，求出上述具有肽接头的各复合物的肾脏中所含的Gd量的降低比例，示于表28。如表28所示，相对于对照复合物，上述具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了39.6～82.9个百分点。
[表28]
Ex-No 给药量的百分率/组织 降低比例(％)
11 14.8 52.2
12 9.9 68.0
13 15.4 50.3
15 17.1 44.8
24 12.9 58.3
25 14.2 54.1
29 6.8 78.0
31 18.7 39.6
33 5.3 82.9
34 11.9 61.6
35 7.0 77.4
40 8.4 72.9
[表29]
Ex-No 47
几何平均(给药量的百分率/组织) 31.0
标准偏差 1.2
95％置信区间的下限值(给药量的百分率/组织) 25.3
95％置信区间的上限值(给药量的百分率/组织) 37.9
实施例4-2：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(正常小鼠)
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式，从小鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。大约24小时后处死并摘出肾脏，用ICP-MS测定肾脏中的Gd量。以每组3例来实施，计算3例的平均值，以相对于总给药Gd量的百分率(给药量的百分率/组织)形式示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量。将结果示于后述表30。表中Ex-No表示实施例2的复合物编号。另外，使用作为对照复合物的不含肽接头的上述制造实施例2中制造的Ex-No 47([Gd/DOTA]p-Fab)同样地进行试验。
(结果)
将结果示于后述表30。以该对照复合物的百分率(给药量的百分率/组织)为基准，求出上述具有肽接头的各复合物的肾脏中所含的Gd量的降低比例，示于表30。如表30所示，相对于对照复合物47，上述具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了92.15～95.38个百分点。
[表30]
肾脏残存量(正常小鼠)
Figure BDA0003145471430001851
实施例4-3：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(正常小鼠)
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式，从小鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。大约24小时后处死并摘出肾脏，用ICP-MS测定肾脏中的Gd量。以每组3例来实施，计算3例的平均值，以相对于总给药Gd量的百分率(给药量的百分率/组织)形式示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量。使用作为对照复合物的不含肽接头的上述制造实施例2中制造的Ex-No.47同样地进行试验，将关于Ex-No.47的5次试验的肾脏残存量的平均示于表31。
(结果)
以该对照复合物的百分率(给药量的百分率/组织)为基准，求出上述具有肽接头的各复合物的肾脏中所含的Gd量的降低比例(％)，示于表32。如表32所示，相对于对照复合物，上述具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了21.00～94.66个百分点。
[表31]
肾脏残存量(正常小鼠)
Figure BDA0003145471430001861
[表32]
肾脏残存量(正常小鼠)
Figure BDA0003145471430001862
实施例4-4：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(荷瘤小鼠)
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式，从荷瘤小鼠的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。作为本实施例中使用的荷瘤小鼠，使用了在给药样本之前以2.0～5.0×106个/个体向背部皮下移植人大肠癌细胞株LS174T细胞(ATCC(注册商标)；CL-188)而呈荷瘤状态的小鼠(BALB/cnu/nu)。给药样本24小时后处死并摘出肾脏以及肿瘤，使用ICP-MS测定肾脏中以及肿瘤中的Gd量。本试验以每组3例来实施，计算3例的平均值。以相对于给药Gd量的百分率(给药量的百分率/组织)形式示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量，另外以相对于总给药Gd量的百分率(％of dose/g(给药量的百分率/g))形式示出每1g肿瘤组织中所含的Gd量。将结果示于表35、36。表中Ex-No表示实施例2的复合物编号。另外，使用作为对照复合物的不含肽接头的制造实施例2-47中制造的Ex-No.47同样地进行试验。将关于Ex-No.47的2次试验的平均值示于表33、34。
(结果)
如表35、36所示，相对于对照复合物，具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了52.26～77.68个百分点。
[表33]
肾脏残存量(荷瘤小鼠)
Figure BDA0003145471430001871
[表34]
肿瘤聚集性
Figure BDA0003145471430001872
[表35]
肾脏残存量(荷瘤小鼠)
Figure BDA0003145471430001873
[表36]
肿瘤聚集量(荷瘤小鼠)
Ex-No. 给药量的百分率/g
18 10.63
24 10.50
29 4.37
33 4.53
35 6.90
(实施例5-1：抗人MUC1抗体Fab5片段复合物的制作)
本实施例公开了复合物的制造实施例。本实施例中的各制造实施例中，“实施例5”中借助连字符来记载“复合物的编号”。例如“实施例5-101”表示本实施例中的复合物101的制造实施例。另外，本实施例中的Fab5使用了国际公开WO2018/092885记载的(P10-2)。“p-Fab5”表示Fab5借助其p个氨基结合于p个[]或()中记载的标记部而形成复合物。需要说明的是，以下的几个实施例中记载了通过MS分析而确认的各复合物的Fab5所结合的标记部)的数量，但是该结果并不表示不包括具有除此以外的结合数的复合物。容易理解的是，有可能存在由于MS分析设备的精度的关系而未能确认其存在的结合数的复合物。另外，本实施例中的结构式中，结合有Gd的DOTA的结构式示意性地表示用Gd进行了标记的DOTA。
(实施例5-101.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1，4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(＃N)]p-Fab5)的合成)
(i)复合物No.101的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4，7，10-三[(羧基-κO)甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1，N4，N7，N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。向该溶液中加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，用0.25M乙酸缓冲液调节为pH6.6。
向5.2mg/mL Fab5的硼酸缓冲液(240μL)中加入此前制备的溶液80μL，在30℃下保温2小时。加入0.05M的EDTA 15μL，在30℃下保温10分钟。使用PD-10柱进行纯化，用AmiconUltra-0.5mL离心式过滤器进行回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤7次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1074的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例5-104.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4和/或A-5)]p-Fab5)的合成)
(i)复合物No.104的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(1mg)溶解于DMSO(40μL)。向该溶液中加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)，使用0.1M碳酸钠水溶液调节为pH10.2。
将此前制备的溶液全部加入到5.2mg/mL Fab5的硼酸缓冲液(240μL)中，在30℃下保温2小时。用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收，用磷酸缓冲生理盐水洗涤。
使用3mL的HEPES-NaOH缓冲液(pH＝4.5)进行两次缓冲液交换，进行浓缩，得到pH＝4.52的100μL溶液，然后将该溶液在45℃下保温30分钟。
用PD-10柱纯化，用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤3次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1092的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4和/或A-5)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例5-107.([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab5)的合成)
(i)复合物No.107的合成
使实施例2-18(vii)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(0.75mg)溶解于DMSO(40μL)，加入0.1M硼酸缓冲液(40μL)后，用0.1M碳酸钠水溶液和0.25M乙酸缓冲液调节为pH8.2。
向5.2mg/mL Fab5的硼酸缓冲液(240μL)中加入用0.1M硼酸缓冲液制备的2mg/mL的2-IT溶液(7.5μL)，在37℃下保温40分钟。对于过量的2-IT，使用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器，用磷酸缓冲生理盐水洗涤、浓缩后，加入此前制备的溶液，在30℃下保温2小时。用PD-10柱纯化，用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。
通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1175的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]的复合物、结合有2个的复合物和结合有3个的复合物的混合物。
(实施例5-112.[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5)的合成)
(i)复合物No.112的合成
使实施例2-68(x)中合成的[N-({4-[(2-{4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰胺-κO)甲基]苯基}氨甲酰基)-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺合(3-)]钆(0.46mg)溶解于DMSO(155μL)。
向用硼酸缓冲液和甘油溶液制备为5.2mg/mL的Fab5溶液(240μL)中加入0.1M碳酸钠水溶液和此前制备的溶液30μL，将pH调整为8.8，在37℃下保温2小时。用PD-10柱纯化，用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1187的[Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
(实施例5-113.([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]p-Fab5)的合成)
(i)复合物No.113的合成
使实施例2-69(vii)中合成的{N-[2-({4,7,10-三[(羧基-κO)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基-κ4N1,N4,N7,N10}乙酰基-κO)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-羰基]-L-甲硫氨酰甘氨酰-N6-[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]-L-赖氨酸合(3-)}钆(0.22mg)溶解于DMSO(72μL)。
向用硼酸缓冲液和甘油溶液制备为5.2mg/mL的Fab5溶液(240μL)中加入0.1M碳酸钠水溶液和此前制备的溶液30μL，将pH调整为9.3，在37℃下保温2小时。用PD-10柱纯化，用Amicon Ultra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1228的[Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-四氢异喹啉)]-C(＝O)-Met-Gly-Lys*-C(＝S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(＝S)]的复合物和结合有2个的复合物的混合物。
将上述制造实施例中得到的复合物的化学结构式(Str)示于表37和38。
[表37]
Figure BDA0003145471430001931
[表38]
Figure BDA0003145471430001941
通过与上述制造实施例相同的方法或本领域技术人员公知的方法合成表39的制造例编号C1、C2的化合物，使用这些或实施例2中合成的化合物得到后述表40和41所示的与Fab5的复合物。
[表39]
Figure BDA0003145471430001942
[表40]
Figure BDA0003145471430001951
[表41]
Figure BDA0003145471430001961
将记载于表40～41的上述实施例化合物的MS分析示于下表。
[表42]
Figure BDA0003145471430001971
使用与上述制造实施例同样的方法或本领域技术人员公知的方法得到表43的实施例化合物。
[表43]
Figure BDA0003145471430001981
将表43中记载的上述实施例化合物的MS分析示于下表44。
[表44]
Figure BDA0003145471430001982
进一步地，使用与上述制造实施例同样的方法或本领域技术人员公知的方法，可以得到表45～50的复合物。
[表45]
Figure BDA0003145471430001991
[表46]
Figure BDA0003145471430002001
[表47]
Figure BDA0003145471430002011
[表48]
Figure BDA0003145471430002021
[表49]
Figure BDA0003145471430002031
[表50]
Figure BDA0003145471430002032
实施例6-1：抗人MUC1抗体Fab5片段复合物的结合活性评价
对于通过实施例5的方法制作的各抗人MUC1抗体Fab5片段复合物进行ELISA，以评价对人癌特异性MUC1的结合活性。本试验中，作为洗涤液，使用利用蒸馏水稀释至20倍的20X PBS/Tween 20缓冲液(Thermo公司、28352)。另外，本试验中使用的牛血清白蛋白(BSA)是以合适的比例添加30％牛血清白蛋白溶液(SIGMA公司、A9576-50ML)来使用。将人癌特异性MUC1肽(专利文献1)以0.5μmol/L以每1孔30μL添加到Nunc Maxisorp白色384平板(Nunc公司、460372)上，在4℃下将平板保温一晚而固相化。通过反离心除去MUC1肽后，添加含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液而进行封闭。之后，通过反离心除去封闭溶液，使用含有1.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液，对于上述各抗人MUC1抗体Fab5片段复合物(Ex-No.104、108、112)，将约10000ng/mL的溶液以3倍稀释进行14次连续稀释，向每1孔中添加30μL，在室温下保温60分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL用含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液稀释至10000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗人Igκ抗体(Southern Biotechnology Associates公司)，在室温下保温30分钟。将平板用PBS/Tween20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL作为底物的ECL Prime Western Blotting检测试剂(GE Healthcare公司、RPN2232)。在室温下保温15分钟后，用Envision计数器(パーキンエルマー公司)测定其信号值。
以重复的方式进行各抗体的试验，通过四参数Logistic曲线模型计算EC50值。将关于P10-2的3次试验各自的EC50值(nM)示于表51。另外，将以重复的方式试验得到的各复合物的EC50值示于表52。
[表51]
P10-2(nM)
0.06
0.06
0.14
[表52]
Figure BDA0003145471430002051
实施例6-2：抗人MUC1抗体Fab5片段复合物的结合活性评价
对于通过实施例5的方法制作的各抗人MUC1抗体Fab5片段复合物进行ELISA，以评价对人癌特异性MUC1的结合活性。本试验中，作为洗涤液，使用利用蒸馏水稀释至20倍的20X PBS/Tween 20缓冲液(Thermo公司、28352)。另外，本试验中使用的牛血清白蛋白(BSA)是以合适的比例添加30％牛血清白蛋白溶液(SIGMA公司、A9576-50ML)来使用。将人癌特异性MUC1肽(专利文献1)以0.5μmol/L以每1孔30μL添加到Nunc Maxisorp白色384平板(Nunc公司、460372)上，在4℃下将平板保温一晚而固相化。通过反离心除去MUC1肽后，添加含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液而进行封闭。之后，通过反离心除去封闭溶液，使用含有1.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液，对于上述各抗人MUC1抗体Fab5片段复合物(Ex-No.101-113)，将约10000ng/mL的溶液以3倍稀释进行14次连续稀释，向每1孔中添加30μL，在室温下保温60分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL用含有5.0％BSA的PBS/Tween 20缓冲液稀释至10000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗人Igκ抗体(SouthernBiotechnology Associates公司)，在室温下保温30分钟。将平板用PBS/Tween 20缓冲液洗涤3次，向每1孔中添加30μL作为底物的ECL Prime Western Blotting检测试剂(GEHealthcare公司、RPN2232)。在室温下保温15分钟后，用Envision计数器(パ一キンエルマ一公司)测定其信号值。
以重复的方式进行各抗体的试验，通过四参数Logistic曲线模型计算EC50值。将关于P10-2的3次试验各自的EC50值(nM)示于表53。另外，将以重复的方式试验得到的各复合物的EC50值示于表54。
[表53]
P10-2(nM)
0.06
0.06
0.14
[表54]
Figure BDA0003145471430002061
实施例7：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(正常小鼠)
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式从小鼠(BALB/c或BALB/c nu/nu)的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。大约24小时后处死并摘出肾脏，用ICP-MS测定肾脏中的Gd量。以每组3例来实施，计算3例的平均值，以相对于总给药Gd量的百分率(给药量的百分率/组织)示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量。使用作为对照复合物的不含肽接头的上述制造实施例5中制造的Ex-No 108同样地进行试验。将关于Ex-No 108的2次试验的平均值示于表55。
(结果)
将结果示于表56。以该对照复合物的肾脏中所含的Gd量为基准，求出上述具有肽接头的各复合物的肾脏中所含的Gd量的降低比例。如表56所示，相对于对照复合物，上述具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了91.52～93.03个百分点。
[表55]
肾脏残存量(正常小鼠)
Ex-No.108
平均值(给药量的百分率/组织) 33.00
[表56]
肾脏残存量(正常小鼠)
Figure BDA0003145471430002071
实施例8：Gd标记复合物的肾脏聚集性评价试验(荷瘤小鼠)
(试验方法)
按照以蛋白质量计每只为0.02mg(100μL)的方式，从荷瘤小鼠的尾静脉给药上述实施例中制造的包含肽接头的复合物的Gd标记复合物。作为本实施例中使用的荷瘤小鼠，使用在给药样本之前以5.0×106个/个体向背部皮下移植人乳腺癌细胞株MDA-MB-468(ATCC(注册商标)；HTB-132)而呈荷瘤状态的小鼠(BALB/cnu/nu)。给药样本24小时后处死并摘出肾脏以及肿瘤，使用ICP-MS测定肾脏中以及肿瘤中的Gd量。本试验以每组3例来实施，计算3例的平均值。以相对于给药Gd量的百分率(给药量的百分率/组织)形式示出给药后的每一个肾脏中所含的Gd量，另外以相对于总给药Gd量的百分率(给药量的百分率/g)形式示出每1g肿瘤组织中所含的Gd量。将结果示于表59、60。表中Ex-No表示实施例5的复合物编号。另外，使用作为对照复合物的不含肽接头的上述制造实施例5中制造的Ex-No.108同样地进行试验。将关于Ex-No.108的2次试验的平均值示于表57、58。
(结果)
结果如表57～60所示，相对于对照复合物，上述具有肽接头的各复合物中，标记部在肾脏中的聚集性降低了88.08～90.87个百分点。
[表57]
肾脏残存量
Figure BDA0003145471430002081
[表58]
肿瘤聚集性
Figure BDA0003145471430002082
[表59]
肾脏残存量(荷瘤小鼠)
Figure BDA0003145471430002091
[表60]
肿瘤聚集量(荷瘤小鼠)
Ex-No. 给药量的百分率/g
104 1.04
112 1.27
实施例9：抗人MUC1抗体Fab5片段复合物的制作
(实施例9-115.[DOTA]p-Fab5的合成)
Figure BDA0003145471430002092
在冰冷却下，向1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)(16mg)和水(810μL)的混合溶液中加入1M氢氧化钠水溶液(80μL)而调节为pH 5.5～6。在冰冷却下，向得到的溶液(239μL)中加入溶解于水(117μL)的1-羟基-2，5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠(2.3mg)。之后，加入EDC HCl水溶液(8.3μL、25mg/mL)，在冰冷却下搅拌30分钟，制备N-羟基磺酰琥珀酰亚胺基DOTA溶液。在添加Fab5前加入0.2M磷酸氢二钠水溶液(pH 9)(40μL)而调节为pH 7。
向20.8mg/mL Fab5(90μL)的0.1M磷酸氢二钠水溶液(585μL)中加入所制备的N-羟基磺酰琥珀酰亚胺基DOTA溶液(300μL)，在4℃下保温23小时。对于过量的接头，使用AmiconUltra-15mL离心式过滤器，用10mM磷酸缓冲液重复洗涤2次，用0.3M的乙酸铵缓冲液洗涤，最后进行浓缩，然后用膜滤器进行过滤，得到复合物Ex-No.115。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量387的[DOTA]的复合物、结合有2个的复合物、结合有3个的复合物和结合有4个的复合物的混合物。
(实施例9-116.[DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5的合成
Figure BDA0003145471430002101
使实施例2-68(ix)中合成的N-{[4-({2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰胺}甲基)苯基]氨甲酰基}-L-甲硫氨酰-N1-(2-{[(4-异硫氰酸根合苯基)硫代氨甲酰基]氨基}乙基)-L-异亮氨酸酰胺四(三氟乙酸)盐(1mg)溶解于DMSO(336μL)。
向5.2mg/mL Fab5的磷酸缓冲生理盐水溶液(240μL)中加入此前制备的溶液30μL，用0.1M碳酸钠水溶液调节为约pH 8.0，在30℃下保温2小时。用PD-10柱纯化，用AmiconUltra-15mL离心式过滤器回收。将回收的溶液用磷酸缓冲生理盐水洗涤2次，最后进行浓缩，然后用膜滤器过滤，得到复合物Ex-No.116。再次进行同样的操作，将得到的复合物Ex-No.116混合。通过MS分析，确认该复合物为相对于1个分子量47.5kDa的Fab5结合有1个分子量1032的[DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(＝O)-Met-lle-NH-(CH2)2-(A-3)]的复合物、结合有2个的复合物、结合有3个的复合物和结合有4个的复合物的混合物。
实施例10：金属络合化合物的狨猴体内动态的研究
64Cu标记蛋白的制备例1
向[64Cu]CuCl2的0.05mol/L盐酸溶液10μL(19.8MBq、富士フイルム富山化学)中加入0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH 6.5)139μL并混合。进一步加入实施例9-115中制备的蛋白复合物51μL，将其在室温下保温60分钟而使其反应。将反应液加入到超滤膜(Amicon Ultra10K、Millipore)中，进一步加入50mmol/L乙酸钠缓冲液进行超滤纯化，由此得到目标64Cu-蛋白复合物溶液(A)。向得到的溶液中混合蛋白复合物140μL和PBS溶液145μL，使用针头式过滤器(Millex-GV 0.22μm、Millipore)进行过滤，由此制备含有64Cu-蛋白复合物(A)的PBS溶液(11.5MBq,19.17MBq/mg)。
64Cu标记蛋白的制备例2
向[64Cu]CuCl2的0.05mol/L盐酸溶液20μL(37.1MBq、富士フイルム富山化学)中加入0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH 6.5)285μL并进行混合。进一步加入实施例9-116中制备的蛋白复合物94.7μL，将其在室温下保温60分钟而使其反应。将反应液加入到超滤膜(AmiconUltra 10K、Millipore)中，进一步加入50mmol/L乙酸钠缓冲液进行超滤纯化，由此得到目标64Cu-蛋白复合物溶液(B)。向得到的溶液中混合蛋白复合物260μL和PBS溶液377μL，使用针头式过滤器(Millex-GV 0.22μm、Millipore)进行过滤，由此制备含有64Cu-蛋白复合物(B)的PBS溶液(31.5MBq,26.27MBq/mg)。
PET/CT摄影
将狨猴(2岁龄)用异氟烷麻醉，从尾静脉给药包含64Cu-蛋白复合物溶液(A)或(B)的PBS溶液175-185μL。给药后在麻醉下用PET/CT摄影装置(PET：Clairvivo PET、岛津制作所制，CT：Aquilion、TOSHIBA制)获得图像。
给药包含64Cu-蛋白复合物溶液(A)的PBS溶液约3小时后得到的PET/CT图像为图1。另外，给药包含64Cu-蛋白复合物溶液(B)的PBS溶液约3小时后得到的PET/CT图像为图2。图3示出SUV。SUV为每1g组织的放射能除以每1g体重的给药放射能而得的值、即SUV＝每1g组织的放射能/每1g体重的给药放射能所表示的值。需要说明的是，放射能使用了衰减校正后的值。与图1相比，图2观察到在肾脏中的聚集更少。
产业上的可利用性
本发明包括对人CEACAM5具有优良的结合活性的复合物，可期待在人CEACAM5相关的癌症的诊断和/或治疗中有用。
另外，本发明包括对MUC1具有优良的结合活性的复合物，可期待在MUC1相关的癌症的诊断和/或治疗中有用。
另外，本发明复合物、即包含三臂DOTA、特定的间隔物、特定的肽接头和生物分子的复合物可在肾脏中分解并被排出，因此可期待在生物分子相关疾病的诊断和/或治疗中有用。
序列表自由文本
以下的序列表的数字标题＜223＞中记载了代表性的“人工序列”的说明。具体而言，序列表的序列号1和3所示的碱基序列为各自的PB009-01的重链片段和轻链的碱基序列，序列号2和4所示的氨基酸序列分别为序列号1和3所编码的重链片段和轻链的氨基酸序列。另外，序列表的序列号5和9所示的碱基序列为各自的P10-1的重链片段和轻链的碱基序列，序列号6和10所示的氨基酸序列分别为序列号5和9所编码的重链片段和轻链的氨基酸序列。序列号7和9所示的碱基序列为各自的P10-2的重链片段和轻链的碱基序列，序列号8和10所示的氨基酸序列分别为序列号7和9所编码的重链片段和轻链的氨基酸序列。序列号11和15为各自的P10-1的重链可变区和轻链可变区，序列号12和16所示的氨基酸序列分别为序列号11和15所编码的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。序列号13和15为各自的P10-2的重链可变区和轻链可变区，序列号14和16所示的氨基酸序列分别为序列号13和15所编码的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社
<120> 包含配体、间隔物、肽接头和生物分子的复合物
<130> A20002A00
<150> JP 2019-000530
<151> 2019-01-07
<150> JP 2019-206560
<151> 2019-11-14
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PB009-01 Fab重链的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 1
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
gac tga 678
Asp
225
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp
225
<210> 3
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PB009-01轻链的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 3
gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链片段的DNA
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 6
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab重链片段
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-2 Fab 重链片段的DNA
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链片段
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 9
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体轻链的DNA
<400> 9
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链可变区的DNA
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-2 Fab重链可变区的DNA
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链可变区
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体轻链可变区的DNA
<400> 15
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链信号序列
<400> 17
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链信号序列
<400> 18
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1的胞外结构域的串联重复序列
<400> 19
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20

Claims (35)

1.下式(Ia)所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000011
式中，
DOTA1：三臂DOTA，
U：键或-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(＝O)-，
Q：-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-或-NH-C(＝S)-，
X：C或N，
R1a、R1b：相同或不同，为H或C1-6烷基，
需要说明的是，R1a和R1b可以一起形成C1-6亚烷基，
p：1～25的自然数，借助Biomolecule1中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合，
R1：H、卤素、C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
R2：C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
L2：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(＝O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(＝O)-或-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(＝O)-，
R3：H、C1-6烷基，
R4：H、C1-6烷基，
L3：键、Arg或His，
L4：-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-或键，
V1：下式(A-1)～(A-5)所示的基团，
Figure FDA0003145471420000021
或者，式-L3-L4-V1-一起为下式，
Figure FDA0003145471420000022
Biomolecule1：生物分子，
虚线
Figure FDA0003145471420000024
Q与环上的2个碳原子中的任意一个结合，
虚线
Figure FDA0003145471420000025
单键或双键。
2.下式(Ib)所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000023
式中，
DOTA1：三臂DOTA，
U：键或-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(＝O)-，
Q：-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-或-NH-C(＝S)-，
X：C或N，
R1a、R1b：相同或不同，为H或C1-6烷基，
需要说明的是，R1a和R1b可以一起形成C1-6亚烷基，
p：1～25的自然数，借助Biomolecule2中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合，
R1：H、卤素、C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
R2：C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
L2：Ile、Gly、Ala、Val、Phe、-NHCH(CHCH3NR3R4)C(＝O)-、-NHCH(CHCH3N3)C(＝O)-或-NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(＝O)-，
R3：H、C1-6烷基，
R4：H、C1-6烷基，
L3：键、Arg或His，
L4：-NH-(CH2)2-、-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-或键，
V1：下式(A-1)～(A-5)所示的基团，
Figure FDA0003145471420000031
或者，基团-L3-L4-V1-：一起为下式(III-I)、(III-II)或(III-III)，
Figure FDA0003145471420000032
Biomolecule2：抗体Fab片段，
虚线
Figure FDA0003145471420000044
Q与环上的2个碳原子中的任意一个结合，
虚线
Figure FDA0003145471420000045
单键或双键。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的复合物，其为下式(Ic)所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000041
式中，
L3：键，
L4：-NH-(CH2)2-或-NHCH(C(＝O)OH)(CH2)4-，
Biomolecule：Biomolecule1或Biomolecule2。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的复合物，其如下式(Id)所示，
Figure FDA0003145471420000042
式中，Biomolecule为Biomilecule1或Biomolecule2。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的复合物，其中，式(Id)中，V1为下式(A-3)～(A-5)中的任一者，
Figure FDA0003145471420000043
6.根据权利要求1～5中任一项所述的复合物，其选自由下式所示的化合物组成的组，
Figure FDA0003145471420000051
Figure FDA0003145471420000061
7.根据权利要求1～6中任一项所述的复合物，其中，
Biomolecule1和Biomolecule2为除以下的抗体Fab片段之外的生物分子或抗体Fab片段：
(a)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；
(b)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；
(c)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；或
(b)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段和包含序列号4所示的轻链的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的复合物，其中，
Biomolecule1或Biomolecule2为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的抗人MUC1抗体Fab片段，该片段借助该片段中存在的p个氨基或巯基与V1结合：
(a)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
9.根据权利要求8所述的复合物，其中，
Biomolecule1或Biomolecule2为：
(a)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
10.根据权利要求9所述的复合物，其中，
Biomolecule1或Biomolecule2为含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
11.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000081
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
12.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000082
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
13.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000091
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
14.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000092
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
15.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000101
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
16.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000102
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
17.下式所示的复合物，
Figure FDA0003145471420000111
式中，Fab5为以下的抗体Fab片段：
含有由序列号8所示的氨基酸序列构成且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，Fab5借助该Fab5中存在的p个氨基或巯基与相邻的碳原子结合。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的复合物，其中，p为1～4的自然数。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的复合物，其中，在三臂DOTA上配位有金属。
20.根据权利要求19所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
21.根据权利要求20所述的复合物，其中，金属为89Zr。
22.根据权利要求19所述的复合物，其中，金属为顺磁性金属离子。
23.根据权利要求22所述的复合物，其中，金属为Gd3+。
24.根据权利要求19～23中任一项所述的复合物，其为PET示踪剂。
25.一种诊断用组合物，其包含一种以上的权利要求19～24中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
26.根据权利要求25所述的诊断用组合物，其作为早期诊断药或分期诊断药使用。
27.根据权利要求25或26所述的诊断用组合物，其用于表达人MUC1的癌症的诊断。
28.根据权利要求27所述的诊断用组合物，其中，癌症为乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。
29.一种药物组合物，其包含一种以上的权利要求19～23中任一项所述的复合物和药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其为用于治疗表达人MUC1的癌症的药物组合物。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。
32.权利要求19～23中任一项所述的复合物在制造癌症的诊断用组合物和/或癌症的治疗用药物组合物中的应用。
33.根据权利要求19～23中任一项所述的复合物，其用于癌症的诊断和/或癌症的治疗。
34.一种癌症的诊断方法，其包括向对象给药权利要求19～23中任一项所述的复合物的步骤。
35.一种癌症的治疗方法，其包括向对象给药治疗有效量的权利要求19～23中任一项所述的复合物的步骤。
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