CN109952375B - 新型抗人MUC1抗体Fab片段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供被期待对癌症的诊断和/或治疗、特别是乳腺癌或膀胱癌的诊断和/或治疗有用的抗人MUC1抗体Fab片段、以及使用包含该Fab片段的复合物的诊断手段和/或治疗手段。一种抗人MUC1抗体Fab片段和包含该Fab片段的复合物，所述抗人MUC1抗体Fab片段包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。

Description

新型抗人MUC1抗体Fab片段
技术领域
本发明涉及新型抗人MUC1抗体Fab片段。另外，本发明涉及包含该抗人MUC1抗体Fab片段的诊断用和/或治疗用组合物、以及使用该Fab片段诊断和/或治疗癌症的方法。
背景技术
粘蛋白1(Mucin1：MUC1)是在构成乳腺、气管和消化道等的上皮组织的上皮细胞的内腔侧表达的膜结合型糖蛋白(Nat.Rev.Cancer,2004 Jan；4(1):45-60.)。MUC1在乳腺癌(Mod.Pathol.,2005 Oct；18(10):1295-304.)、肺癌(Hum.Pathol.,2008 Jan；39(1):126-36.)、大肠癌(Int.J.Oncol.,2000 Jan；16(1):55-64.)、膀胱癌(PLoS One,2014 Mar；9(3):e92742.)、皮肤癌(Histopathology,2000 Sep；37(3):218-23.)、甲状腺癌(J.Pathol.,2003 Jul；200(3):357-69.)、胃癌(J.Pathol.,2000 Mar；190(4):437-43.)、胰腺癌(Int.J.Oncol.,2004 Jan；24(1):107-13.)、肾癌(Mod.Pathol.,2004 Feb；17(2):180-8.)、卵巢癌(Gynecol.Oncol.,2007 Jun；105(3):695-702.)和宫颈癌(Am.J.Clin.Pathol.,2004 Jul；122(1):61-9.)等的癌细胞中过表达，MUC1作为用于检测癌症病灶的靶分子是有用的(Nat.Rev.Cancer,2004 Jan；4(1):45-60.、Pathol.Res.Pract.,2010 Aug15；206(8):585-9.)。
MUC1中，存在于细胞外结构域的20个氨基酸的串联重复序列HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(序列号15)的第9位的苏氨酸被O-糖基化。已知在癌细胞中，该O-糖基化不完全，以癌症特异性方式发生T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)和2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr)等O-糖基化(专利文献1、非专利文献1)。正常组织的MUC1不接受这些癌症特异性O-糖基化，因此，人癌症特异性MUC1作为用于治疗人体内的各种癌症的靶分子特别有用。
作为这样的抗人癌症特异性MUC1抗体，已知例如1B2抗体(专利文献1)、PankoMab抗体(非专利文献2)、5E5抗体(专利文献2)等。据报道，这些抗体中，与PankoMab抗体相比，1B2抗体对人癌症特异性MUC1的特异性高(专利文献1)。另外，据报道，1B2抗体的解离常数为3.7×10-10M(专利文献1)，5E5抗体的解离常数为1.7×10-9M(非专利文献1)。
另一方面，对癌症病灶的可见化也有很大需求。首先，有早期发现癌症病灶的需求。在目前的X射线成像或超声、计算机断层成像(Computed Tomography：CT)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging：MRI)、正电子发射断层成像(Positron EmissionTomography：PET)、单光子发射计算机断层成像(Single Photon Emission ComputedTomography：SPECT)等诊断方式中，无法以良好的灵敏度检测出微小癌。若能检测出微小癌，则在原发癌的情况下可以通过手术或放射线疗法治愈，即使是转移癌，通过早期的药物介入也能够延长寿命、治愈。其次，有鉴别癌症病灶与良性病变的需求。在目前的诊断方式中，将良性病变误诊为癌症病灶的情况很多。若能鉴别癌症病灶与良性病变，则能够减少不必要的活检。此外，对手术中的癌症病灶的可见化有需求。目前，在以乳腺癌和膀胱癌、皮肤癌为代表的癌症的手术中，由于无法准确地掌握癌症病灶的位置和扩散程度，因此无法将癌症病灶完全切除，存在在遗留有癌细胞的状态下结束手术的危险。此外，有掌握癌症病灶的确切位置的需求。即使由于血中的肿瘤标志物的升高而怀疑术后的复发和转移，由于以目前的诊断方式无法将微小的转移癌可见化，因此不清楚是否真正发生了转移、或者转移到了哪个器官，无法进行最佳治疗的选择。因此，使用与人癌症特异性MUC1特异性结合的抗体作为体内诊断剂、利用荧光成像和γ射线成像(PET、SPECT)等分子成像技术将癌症病灶可见化也是有用的。但是，迄今为止尚未已知使用抗人癌症特异性MUC1抗体作为体内诊断剂的示例。
另外，对于使抗体与癌症治疗药结合而成的抗体药物有需求。抗体药物从能够将癌症治疗剂特异性地递送到癌症病灶这一点考虑作为副作用少的癌症治疗方法受到期待，已报道了使用结合有放射性同位素的抗体的放射免疫疗法(鹤尾隆著、“癌症的分子靶向治疗”南山堂出版、2008年9月15日发行、332～336页、J.Nucl.Med.,2016 Jul；57(7):1105-11.、Nucl.Med.Biol.,2010 Nov；37(8):949-55.)、使用结合有IRDye700DX的抗体的光免疫疗法(Nat.Med.,2011 Dec；17(12):1685-91.)等。IRDye700DX是也能用于诊断的近红外荧光染料，据报道，使其与针对表达在癌细胞膜上的抗原的抗体结合，特异性地聚集在癌组织中后，照射近红外光，由此能够利用IRDye700DX所产生的光毒性效果以癌症特异性的方式诱导细胞死亡(Nat.Med.,2011 Dec；17(12):1685-91.)。但是，到目前为止，尚未已知临床应用使抗人癌症特异性MUC1抗体与癌症治疗药结合而成的抗体药物的示例。
通常抗体的血中半衰期长，给药至体内后，达到提供足以将癌症可见化的信号/背景比的肿瘤/血液比需要4天～5天的长时间(Clin.Pharmacol.Ther.,2010 May；87(5):586-92.)。另外，抗体的Fc区域会引起抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-DependentCellular Cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(Complement-DependentCytotoxicity：CDC)的药理作用(非专利文献1、Curr.Opin.Biotechnol.,2002 Dec；13(6):609-14.)。另外，无论靶标如何，抗体都会高度聚集在肝脏中，但乳腺癌等的癌细胞多向肝脏转移，在对由远隔转移所致的全身的癌症病灶进行诊断时会妨碍肝转移的检测(Clin.Pharmacol.Ther.,2010 May；87(5):586-92.)。
例如，Fab、scFV、双抗体、微型抗体这样的低分子化的重组抗体片段由于组织渗透性高，因此容易到达病灶，可以期待使用大肠杆菌、酵母中的表达系统以低成本进行制造，因此可用作治疗用抗体，但另一方面，其具有血中半衰期短、经肾排泄的特征，因此还报道了作为诊断剂的应用(Nat.Biotechnol.,2005 Sep；23(9):1126-36.)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/050528
专利文献2：WO2008/040362
非专利文献
非专利文献1：Glycoconj.J.,2013 Apr；30(3):227-36.
非专利文献2：Cancer Immunol Immunother,2006 Nov；55(11):1337-47.
发明内容
发明所要解决的问题
一价的Fab片段的分子量为约50kDa，比约150kDa的抗体小，经肾排泄，血中半衰期也短。因此，在给药后2～32小时以内达到提供足以将癌症可见化的信号/背景比的肿瘤/血液比。由于不具有Fc区域，因此也不会引起ADCC或CDC。Fab片段主要经肾排泄，因此也不会妨碍肝转移的检测。由于这样的特长，与抗体相比，可以期待Fab片段作为体内诊断剂更有效。
但是，由于Fab片段从二价变为一价，因此其结合活性大多减弱。此外，为了将抗体用作体内诊断剂或在光免疫疗法中使用的药剂，必须用荧光染料或造影剂等可检测的物质进行标记，但是存在其结合活性通过使用这样的物质进行标记而减弱的课题。
本发明的课题在于提供具有优良的结合活性、并且可期待在给药后一定时间(例如24小时)的期间内聚集到癌症病灶的抗人MUC1抗体Fab片段。另外，本发明的课题在于提供包含该Fab片段的诊断用组合物和利用该诊断用组合物的诊断方法、以及提供包含该Fab片段的治疗用组合物和利用该治疗用组合物的治疗方法。
用于解决问题的方法
本发明人在制作对人癌症特异性MUC1具有优良的结合活性的抗人MUC1抗体Fab片段方面反复进行了相当深入的研究，结果，制作出包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人MUC1抗体Fab片段(实施例1)，并发现：该抗人MUC1抗体Fab片段对人癌症特异性MUC1具有优良的结合活性(实施例3)；对人癌症特异性MUC1的结合活性不会通过荧光标记化和螯合剂标记化而减弱(实施例5和实施例7)；以及包含该抗人MUC1抗体Fab片段的复合物对癌症的诊断有用(实施例8、实施例12和实施例13)；在皮下荷瘤模型中显示出抗肿瘤效果(实施例15)。
结果，提供使用上述抗人MUC1抗体Fab片段和包含该抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的诊断手段和治疗手段。
本发明包含作为医学上或产业上有用的物质、方法的下述发明。
即，在一个方式中，本发明可以如下所述。
[1]一种抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号8或序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[2]如上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号2或序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
[3]如上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[4]如上述[3]所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
[5]如上述[4]所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[6]如上述[4]所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段以及由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[7]一种复合物，其包含一个以上的标记部和上述[1]至[6]中任一项所述的抗人MUC1抗体Fab片段。
[8]如上述[7]所述的复合物，标记部为(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。
[9]如上述[8]所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体。
[10]如上述[9]所述的复合物，其中，配体为下式(A)所表示的配体：
Figure BDA0002060862510000071
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
[11]如上述[10]所述的复合物，其中，标记部为下式(A’)所表示的配体和接头：
Figure BDA0002060862510000072
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合。
[12]如上述[11]所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝S)基的碳原子结合。
[13]一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[12]所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[6]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[12]所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
[14]如上述[9]至[13]中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
[15]如上述[14]所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
[16]如上述[15]所述的复合物，其中，金属为89Zr。
[17]如上述[13]所述的复合物，其中，进一步包含89Zr。
[18]如上述[8]所述的复合物，其中，标记部为(i)荧光染料和接头或者(ii)荧光染料。
[19]如上述[18]所述的复合物，其中，荧光染料为选自由下式(B)和下式(C)组成的组的荧光染料：
Figure BDA0002060862510000081
Figure BDA0002060862510000091
式(B)和(C)中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
[20]如上述[19]所述的复合物，其中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合，该抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
[21]如上述[20]所述的复合物，其中，标记部为式(B)所表示的荧光染料。
[22]一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[21]所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[6]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[21]所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
[23]如上述[20]所述的复合物，其中，标记部为式(C)所表示的荧光染料。
[24]一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[23]所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为上述[6]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的上述[23]所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
[25]一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
[26]一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
[27]一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
[28]一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
[29]一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[30]一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[31]一种生产抗人MUC1抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码上述[1]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[32]一种生产抗人MUC1抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码上述[5]所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[33]一种生产包含标记部和抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用上述[31]或[32]所述的方法生产抗人MUC1抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。
[34]如上述[33]所述的生产复合物的方法，其中，使Fab片段与标记部共价结合的步骤是使该Fab片段i)经由接头与配体结合或者ii)直接与配体共价结合的步骤。
[35]如上述[34]所述的生产复合物的方法，其中，进一步包括用金属放射性同位素对该复合物的配体进行标记的步骤。
[36]如上述[33]所述的生产复合物的方法，其中，使Fab片段与标记部共价结合的步骤是使该Fab片段i)经由接头与荧光染料结合或者ii)直接与荧光染料共价结合的步骤。
[37]一种诊断用组合物，其包含一种以上的上述[7]至[24]中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
[38]如上述[37]所述的诊断用组合物，其中，复合物为上述[17]、[22]和[24]中任一项所述的复合物。
[39]如上述[38]所述的诊断用组合物，其中，复合物为上述[17]所述的复合物。
[40]如上述[38]所述的诊断用组合物，其中，复合物为上述[22]所述的复合物。
[41]如上述[38]所述的诊断用组合物，其中，复合物为上述[24]所述的复合物。
[42]如上述[37]至[41]中任一项所述的诊断用组合物，其用于表达人MUC1的癌症的诊断。
[43]如上述[42]所述的诊断用组合物，其中，癌症为乳腺癌或膀胱癌。
[44]一种药物组合物，其包含一种以上的上述[7]至[24]中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
[45]如上述[44]所述的药物组合物，其中，复合物为上述[17]、[22]和[24]中任一项所述的复合物。
[46]如上述[45]所述的药物组合物，其中，复合物为上述[24]所述的复合物。
[47]如上述[44]至[46]中任一项所述的药物组合物，其为用于治疗表达人MUC1的癌症的药物组合物。
[48]如上述[47]所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌或膀胱癌。
[49]上述[7]至[24]中任一项所述的复合物在制造乳腺癌或膀胱癌的诊断用组合物和/或用于治疗乳腺癌或膀胱癌的药物组合物中的应用。
[50]如上述[7]至[24]中任一项所述的复合物，其用于在乳腺癌或膀胱癌的诊断和/或治疗中使用。
[51]一种乳腺癌或膀胱癌的诊断方法，其包括：在手术前或手术中向对象给药上述[7]至[24]中任一项所述的复合物的步骤。
[52]一种乳腺癌或膀胱癌的治疗方法，其包括：给药治疗有效量的上述[7]至[24]中任一项所述的复合物的步骤。
发明效果
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段对人癌症特异性MUC1具有优良的结合活性，可期待对乳腺癌等癌症的诊断和/或治疗有用。
附图说明
图1是示出P10-1 Fab、P10-2 Fab和作为比较例的1B2 Fab对人癌症特异性MUC1的结合活性的图和表。
图2是示出P10-1 Fab染料、P10-2 Fab染料和作为比较例的1B2Fab染料对人癌症特异性MUC1的结合活性的图和表。
图3是示出P10-2 Fab DFO和P10-2 Fab对人癌症特异性MUC1的结合活性的图和表。
图4是示出P10-2 Fab对表达人癌症特异性MUC1的乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞(也称为MM-468细胞)和膀胱癌细胞株647-V细胞的结合活性的图。横轴示出P10-2 Fab的浓度(Log(mg/mL))，纵轴示出发光量(Luminescense)。
图5A是对皮下荷瘤模型静脉给药3mg/kg的P10-2 Fab染料，在给药6小时后利用通常的相机(左)和近红外荧光相机(中央、右)拍摄的代表性照片。
图5B是对肿瘤部分(肿瘤(Tumor))和肿瘤周围的正常部分(背景(Background))的荧光亮度比(肿瘤/背景比)进行定量化的图，示出平均值+标准误差。横轴示出P10-2 Fab染料的给药量和给药后的时间。
图6是示出对移植了MM-468细胞的小鼠给药P10-2 Fab IR700，在给药2小时后使动物安乐死，摘除肿瘤，用IVIS SPECTRUM进行拍摄，测定肿瘤部分的发光量的结果的图。纵轴示出发光量。
图7是示出使P10-2 Fab IR700与MM-468细胞、647-V细胞或作为比较例的CHO-K1细胞反应后，进行光照射，测定细胞毒性的结果的图。各图的横轴的上段示出P10-2 FabIR700的浓度、下段示出光照射量。纵轴为发光量，示出平均值+标准误差。
图8是示出使用移植了MM-468细胞的裸小鼠测定P10-2 Fab IR700给药时在有无光照射(0J或200J)下产生的抗肿瘤效果的结果的图。横轴示出将肿瘤体积达到300mm3的那天作为第1天时的天数(天)。纵轴为肿瘤体积(体积(mm3))，示出平均值+标准误差。
具体实施方式
以下，对本发明进行详述，但本发明并不限定于此。本说明书中，只要没有特别定义，与本发明相关地使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
本发明人在制作抗人癌症特异性MUC1抗体或其抗原结合片段方面反复进行了相当有创意的研究，结果成功地制作出对癌症特异性MUC1具有强结合能力的抗人MUC1抗体Fab片段。
抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2～3万的轻链构成。重链由通常包含约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE对应地被称为γ、μ、α、δ、ε链。此外，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别被称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链由通常包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这两种，分别被称为λ、κ链。抗体分子的基本结构的肽构成是各自相同的两条重链和两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键而结合，分子量为15万～19万。两种轻链与任一种重链均可成对。各个抗体分子总是由相同的两条轻链和相同的两条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(在μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，其立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端的结构域而言，即使是来自同种动物的同一类(亚类)的标品，其氨基酸序列也不是恒定的，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)。比该结构域靠近C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本是恒定的，被称为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。
抗体与抗原的结合特异性取决于由重链可变区和轻链可变区构成的部分的氨基酸序列。另一方面，与补体、各种细胞的结合之类的生物学活性反映出各类Ig的恒定区的结构的差异。已知重链和轻链的可变区的可变性基本限于在任一种链中都存在的三个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，是比较恒定的。
存在于抗体的重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间的区域被称为铰链区，该区域大量含有脯氨酸残基，并包含连接两条重链的多个链间S-S键。例如，在人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各铰链区含有构成重链间的S-S键的、分别为2个、4个、11个、2个的半胱氨酸残基。铰链区是对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白分解酶的敏感性高的区域。在用木瓜蛋白酶消化抗体的情况下，重链在铰链区的比重链间S-S键更靠N末端侧的位置被切断，分解成两个Fab片段和一个Fc片段。Fab片段由轻链与包含重链可变区、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成。Fab片段包含可变区，具有抗原结合活性。
<本发明的抗人MUC1抗体Fab片段>
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的Fab片段：
一种抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
作为本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链恒定区，可以选择Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等中的任意一种恒定区。在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
作为本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链恒定区，可以选择Igλ或Igκ中的任意一种恒定区。在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为下述Fab片段：
包含由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
在细胞中表达包括Fab片段在内的抗体的情况下，已知抗体在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰的示例，可以列举重链C末端的赖氨酸的利用羧肽酶的切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸的通过焦谷氨酰化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗体中发生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.,2008；97:2426-47.)。
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段也可以包含通过翻译后修饰生成的Fab片段。作为可通过翻译后修饰生成的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的示例，可以列举进行了重链N末端的焦谷氨酰化的抗人MUC1抗体Fab片段。本领域中公知，这种通过N末端的焦谷氨酰化进行的翻译后修饰不会对抗体的活性产生影响(Anal.Biochem.,2006；348:24-39)。
在一个实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：
一种抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号8或序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
在某一实施方式中，本发明的抗人MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：
一种抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
在另一实施方式中，本发明的抗MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：
一种抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号2或序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
在某一实施方式中，本发明的抗MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：
一种抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与人癌症特异性MUC1结合。癌症特异性MUC1表达在乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌等癌症中。作为测定所得到的抗人MUC1抗体Fab片段对人癌症特异性MUC1的结合活性的方法，有ELISA、FACS等方法。例如，在使用ELISA的情况下，将人癌症特异性MUC1阳性细胞(例如T-47D细胞)固定化到ELISA板上，向其中添加Fab片段进行反应后，使利用辣根过氧化物酶等标记的抗Igκ抗体等反应后，通过使用检测其活性的试剂(例如，在辣根过氧化物酶标记的情况下为化学发光辣根过氧化物酶底物)等进行活性测定，鉴定二次抗体的结合。
本领域技术人员可以基于本说明书中公开的、本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段和轻链的序列信息，使用本领域中公知的方法容易地制作本发明的抗人MUC1抗体Fab片段。本发明的抗人MUC1抗体Fab片段例如可以按照后述的<生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法>中记载的方法来制造，但并没有特别限定。
<本发明的复合物>
本发明的复合物为包含标记部和本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物。
“标记部”是指(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。作为某一方式，可以列举(i)配体和接头、或者(ii)配体。作为某一方式，可以列举(i)荧光染料和接头、或者(ii)荧光染料。“标记部”的配体可以进一步包含金属，作为某一方式，为包含金属的(i)配体和接头或者(ii)配体，换言之，为(i)与金属形成了螯合络合物的配体和接头、或者(ii)与金属形成了螯合络合物的配体。
包含金属或荧光染料的本发明的复合物可以用于各种造影剂和/或癌症的治疗剂，例如用于MRI造影剂、PET示踪剂、荧光标记的分子成像剂、光免疫疗法中使用的药剂等。
在本说明书中，“金属”是指顺磁性金属离子或金属放射性同位素。
顺磁性金属离子适合用于MRI造影剂。作为顺磁性金属离子的方式，可以列举Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Rh2+、Co2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Tb3+、Pm3+、Nd3+、Tm3+、Ce3+、Y3+、Ho3+、Er3+、La3+、Yb3+、Mn3+或Mn2+，但不限于这些。作为某一方式，可以列举Gd3+、Mn3+、Mn2+、Fe2+或Fe3+。作为某一方式，可以列举Mn3+或Mn2+。这种情况下，复合物中可以使用卤素等作为抗衡阴离子。另外，抗衡阴离子也可以为配体的C(＝O)O-，此外复合物也可以具有Na+等抗衡阳离子。
金属放射性同位素例如用于PET示踪剂等。作为某一方式，可以列举89Zr、51Mn、52Fe、60Cu、67Ga、68Ga、72As、99mTc或111In，但不限于这些。作为某一方式，可以列举89Zr、60Cu、67Ga、68Ga、99mTc或111In。作为某一方式，可以列举锆的放射同位素。作为某一方式，可以列举89Zr。
“配体”是复合物中可与金属形成螯合络合物的部分，是指由螯合剂构成的基团。所构成的基团是指从螯合剂上除去质子而具有结合键(結合手)的基团。
“螯合剂”是能够与金属配位结合的化合物。
作为“螯合剂”，可以列举铁载体和非铁载体。作为铁载体，可以列举异羟肟酸型、邻苯二酚型或混合配体型。作为异羟肟酸型铁载体，可以列举例如铁色素、下式：
Figure BDA0002060862510000211
所表示的去铁胺(DFO)、镰孢氨酸C、鸟氨酸菌素(ornibactin)、红酵母酸。作为邻苯二酚型铁载体，可以列举例如肠杆菌素、芽孢杆菌素、弧菌素。作为混合配体型铁载体，可以列举例如固氮菌素、脓青素、耶尔森杆菌素。需要说明的是，在上述铁载体的情况下，DFO可以借助其反应性官能团-NH2与接头或Fab片段反应，在DFO以外的铁载体的情况下，也可以借助羧基、羟基、氨基等反应性官能团，利用本领域技术人员通常使用的方法与接头或Fab片段反应。
作为非铁载体，可以列举DTPA(二亚乙基三胺五乙酸、CAS编号：67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-双(甲基氨甲酰基甲基)-1,4,7-三氮杂庚烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：119895-95-3)、EOB-DTPA(结合有乙氧基苄基的DTPA、CAS编号：158599-72-5)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸、CAS编号：869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羟基丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：120041-08-9)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、CAS编号：60239-18-1)、以及它们的公知的反应性衍生物。
需要说明的是，只要没有特别记载，本说明书中的化合物和复合物也包含游离体及其盐。在此，“其盐”是指根据该化合物和复合物的取代基的种类，有时会形成酸加成盐或与碱的盐，是该化合物和复合物所能形成的盐。具体而言，可以列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等无机碱、甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等有机碱的盐；与乙酰亮氨酸等各种氨基酸和氨基酸衍生物的盐；铵盐等。例如，DFO可以以去铁胺甲磺酸盐的形式存在，也可以以其他盐的形式存在。DTPA可以以钠盐的形式与游离体一起存在。
作为用于MRI造影剂的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂。
作为用于PET示踪剂的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂，进一步，作为某一方式，为MAG3(巯基-乙酰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、CAS编号：66516-09-4)。作为某一方式，为DFO。
作为本发明的复合物中包含的形成配体的“螯合剂”的某一方式，可以列举DFO、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A、DOTA。作为某一方式，可以列举DFO、DTPA、DOTA。作为某一方式，可以列举DFO。
“接头”是指在抗人MUC1抗体Fab片段与配体之间隔出距离的基团。作为复合物中的“接头”的某一方式，可以列举下式：
Figure BDA0002060862510000221
(以下表示为-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-。在此，“C1-20亚烷基”为直链或支链的碳原子数1～20的亚烷基。作为C1-20亚烷基的某一方式，可以列举C1-10亚烷基、C1-2亚烷基。作为C1-20亚烷基的某一方式，可以列举亚乙基。作为某一方式，可以列举-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。作为某一方式，可以列举-C(＝O)-C2H4-C(＝O)-。作为可用作接头的试剂，可以列举HO-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-OH、琥珀酸、对二NCS-苯(对二异硫氰基苯)等。
包含荧光染料的本发明的复合物可以用作荧光标记的分子成像剂、光免疫疗法中使用的药剂、或者荧光标记的分子成像剂和光免疫疗法中使用的药剂。
作为本发明的复合物中使用的荧光染料，可以使用光成像中通常使用的在近红外波长(650～1000nm)处具有极大吸收和极大发光的染料。作为荧光染料的某一方式，可以列举花青素或靛花青素化合物。作为某一方式，可以列举IRDye800CW和IRDye700DX(LI-CORBiosciences公司)、Cy(Molecular Probe公司)、Alexa Fluor、BODIPY和DyLight(ThermoFisher Scientific公司)、CF790(Biotium公司)、DY(DYOMICS GMBH公司)、HiLyteFluor680和HiLyte Fluor750(Anaspec公司)、PULSAR650和QUASAR670(BiosearchTechnologies公司)等。作为某一方式，可以列举下式所表示的IRDye800CW
Figure BDA0002060862510000231
和下式所表示的IRDye700DX。
Figure BDA0002060862510000241
需要说明的是，荧光染料可以借助其羧基、羟基、氨基等或者利用本领域技术人员通常使用的方法引入活化基团后与Fab片段或接头反应。作为引入有活化基团的荧光染料的某一方式，可以列举利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基进行了酯化的荧光染料。例如，上述的IRDye800CW和IRDye700DX的NHS酯在市场上销售，可以利用这些市售品。
本领域技术人员可以利用公知的方法适当进行本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与标记部的结合。例如，可以使标记部与本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或氨基酸侧链的氨基)、一个以上的硫醇基(例如氨基酸侧链的硫醇基)、或者一个以上的羧基(例如C末端或氨基酸的侧链的羧基)结合。作为某一方式，本发明的复合物为标记部与本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的一个以上的氨基结合而得到的复合物。
在标记部为配体和接头的情况下，本发明的复合物也可以通过使本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与接头反应、并使螯合剂与所得到的物质反应而制造。也可以使接头与螯合剂反应、并使本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与所得到的物质反应而制造。作为反应例，也可以使螯合剂的氨基与接头反应、并使所得到的物质与本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或赖氨酸侧链的氨基)反应。复合物的制造中，可以使用向胺中添加异硫氰酸酯而合成硫脲的反应、添加胺和羧酸而合成酰胺的反应等。反应可以通过应用本领域技术人员公知的方法来进行。需要说明的是，作为原料，也可以使用预先将螯合剂与接头结合而成的化合物。作为螯合剂与接头结合而成的化合物的示例，可以列举下式所表示的p-SCN-Bn-DFO(结合有对异硫氰基苯基氨基硫代羰基的DFO、CAS编号：1222468-90-7)、
Figure BDA0002060862510000251
结合有对异硫氰基苄基的DTPA(p-NCS-Bn-DTPA、CAS编号：102650-30-6)、结合有对异硫氰基苄基的DOTA(p-NCS-Bn-DOTA、CAS编号：127985-74-4)、以及p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA([(R)-2-氨基-3-(4-异硫氰根合苯基)丙基]-反式-(S,S)-环己烷-1,2-二胺五乙酸、CAS编号：157380-45-5)。
在利用上述制造方法制造的、结合有一个以上的标记部的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段中添加金属(顺磁性金属离子或金属放射性同位素)，能够得到包含金属的本发明的复合物。
另外，本发明的复合物也可以制造下述复合物，该复合物是使Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或氨基酸的侧链的氨基)与具有被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的羧基或异硫氰酸根基的标记部反应、借助氨基结合一个以上的标记部而得到的Fab片段。
本发明的复合物为包含一个以上的标记部和本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物。作为某一方式，为与1～27个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～23个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～15个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～11个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～9个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～7个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；作为某一方式，为与1～5个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段；进一步，作为某一方式，为与1～4个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。作为某一方式，为进一步包含金属的、与一个以上的标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
作为一个实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料的复合物。
作为本发明的复合物的某些实施方式，可以列举下述复合物：
(1)一种复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(2)如(1)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(3)一种复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(4)如(2)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为含有由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(5)如(1)至(4)中任一项所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头、或者(ii)配体。
(6)如(1)至(4)中任一项所述的复合物，其中，配体为由选自由DFO、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A和DOTA组成的组中的螯合剂构成的基团，接头为选自由-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-和-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-组成的组中的接头。
(7)如(6)所述的复合物，其中，配体为由选自由DFO、DTPA和DOTA组成的组中的螯合剂构成的基团。
(8)如(6)所述的复合物，其中，配体为由DFO构成的基团，接头为-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。
(9)如(5)至(8)中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
(10)如(9)所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
(11)如(10)所述的复合物，其中，金属为89Zr。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体的复合物。
作为某一实施方式，本发明的复合物是配体为下式(A)所表示的配体的复合物：
Figure BDA0002060862510000271
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
作为配体为式(A)所表示的配体的本发明的复合物的某一实施方式，是标记部为下式(A’)所表示的配体和接头的复合物：
Figure BDA0002060862510000281
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合，抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝S)基的碳原子结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体、且进一步包含金属的复合物。作为金属的某一方式，可以列举金属放射性同位素。作为金属放射性同位素的某一方式，可以列举89Zr。
另外，作为另一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)荧光染料和接头或者(ii)荧光染料的复合物。
作为在标记部中包含荧光染料的本发明的复合物的某一实施方式，是荧光染料为选自由下式(B)和下式(C)组成的组中的荧光染料的复合物：
Figure BDA0002060862510000291
式(B)和(C)中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
作为标记部为式(B)所表示的荧光染料的本发明的复合物的某一实施方式，为下述复合物：式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合，该抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
作为标记部为式(C)所表示的荧光染料的本发明的复合物的某一实施方式，为下述复合物：式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合，该抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
以下示出本发明的复合物的另外的某些实施方式：
(1)一种复合物，其中，标记部为式(A’)所表示的配体和接头，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(2)如(1)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(3)一种复合物，其中，标记部为式(A’)所表示的配体和接头，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(4)如(3)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为含有由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(5)如(2)或(4)所述的复合物，其为与1～11个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
(6)如(2)或(4)所述的复合物，其为与1～4个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
(7)如(1)至(6)中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
(8)如(7)所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
(9)如(8)所述的复合物，其中，金属为89Zr。
(10)一种复合物，其中，标记部为式(B)或式(C)所表示的荧光染料，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(11)如(10)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(12)一种复合物，其中，标记部为式(B)或式(C)所表示的荧光染料，抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(13)如(12)所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
(14)如(10)至(13)中任一项所述的复合物，其中，标记部为式(C)所表示的荧光染料。
(15)如(14)所述的复合物，其为与1～11个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
(16)如(15)所述的复合物，其为与1～5个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
(17)如(10)至(13)中任一项所述的复合物，其中，标记部为式(B)所表示的荧光染料。
(18)如(17)所述的复合物，其为与1～11个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
(19)如(18)所述的复合物，其为与1～5个标记部进行了结合的抗人MUC1抗体Fab片段。
作为另一实施方式，本发明的复合物为下式(I)所表示的复合物：
(L-X)p-Ab (I)
式中，Ab表示抗人MUC1抗体Fab片段，
L表示(i)配体或者(ii)荧光染料，
X表示接头或键，
p为1～27的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数；作为某一方式，为1～15的自然数；作为某一方式，为1～11的自然数；作为某一方式，为1～9的自然数；作为某一方式，为1～7的自然数；作为某一方式，为1～5的自然数；进一步，作为某一方式，为1～4的自然数。
作为某一实施方式，本发明的复合物是作为式(I)的复合物、且进一步包含金属的复合物。作为金属的某一方式，可以列举金属放射性同位素。作为金属放射性同位素的某一方式，可以列举89Zr。
作为式(I)的复合物的某一实施方式，可以列举标记部为式(A’)所表示的配体和接头的本发明的复合物，作为该复合物的某一实施方式，为下式(II)所表示的复合物：
Figure BDA0002060862510000321
式中，Ab表示抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～27的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数；作为某一方式，为1～15的自然数；作为某一方式，为1～11的自然数；作为某一方式，为1～9的自然数；作为某一方式，为1～7的自然数；作为某一方式，为1～5的自然数；进一步，作为某一方式，为1～4的自然数，
Ab借助其氨基与标记部末端C(＝S)基的碳原子结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物为作为式(II)的复合物、且进一步包含金属的复合物。作为金属的某一方式，可以列举金属放射性同位素。作为金属放射性同位素的某一方式，可以列举89Zr。
作为式(I)的复合物的某一实施方式，可以列举标记部为式(B)所表示的荧光染料的本发明的复合物，作为该复合物的某一实施方式，为下式(III)所表示的复合物：
Figure BDA0002060862510000331
式中，Ab表示抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～27的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数；作为某一方式，为1～15的自然数；作为某一方式，为1～11的自然数；作为某一方式，为1～9的自然数；作为某一方式，为1～7的自然数；作为某一方式，为1～5的自然数；进一步，作为某一方式，为1～4的自然数，
Ab借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
作为式(I)的复合物的某一实施方式，可以列举标记部为式(C)所表示的荧光染料的本发明的复合物，作为该复合物的某一实施方式，为下式(IV)所表示的复合物：
Figure BDA0002060862510000341
式中，Ab表示抗人MUC1抗体Fab片段，
p为1～27的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数；作为某一方式，为1～15的自然数；作为某一方式，为1～11的自然数；作为某一方式，为1～9的自然数；作为某一方式，为1～7的自然数；作为某一方式，为1～5的自然数；进一步，作为某一方式，为1～4的自然数，
Ab借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物为利用可检测的分子进行了标记的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段。利用可检测的分子进行了标记的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段是指本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与可检测的分子直接或经由适当的接头以共价结合的方式连结而成的物质。本说明书中，可检测的分子是指本技术领域中公知的成像诊断技术中可检测的所有部分。例如，在成像诊断技术为荧光成像的情况下，可检测的分子为荧光染料。在成像诊断技术为PET的情况下，可检测的分子为可利用PET进行成像的化合物，作为某一方式，可以列举包含利用放射性核种进行了标记的配体的化合物、或利用非金属放射性核种进行了标记的糖残基。作为包含利用放射性核种进行了标记的配体的化合物的某一方式，可以列举与金属放射性同位素形成了螯合络合物的配体。在成像诊断技术为MRI的情况下，可检测的分子为可利用MRI技术进行检测的化合物，作为某一方式，可以列举包含具有顺磁性金属离子的进行了标记的配体的化合物。作为包含具有顺磁性金属离子的进行了标记的配体的化合物的某一方式，可以列举与顺磁性金属离子形成了螯合络合物的配体。
在利用可检测的分子进行了标记的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段中，在以可检测的分子的含义使用的情况下，将可利用PET进行成像的化合物称为PET示踪剂，将可利用MRI技术进行检测的化合物称为MRI造影剂。
作为利用可检测的分子进行了标记的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的某一实施方式，可以列举下述的抗人MUC1抗体Fab片段。
(1)一种抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为荧光染料、PET示踪剂或MRI造影剂。
(2)如(1)所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为荧光染料。
(3)如(2)所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为式(B)所表示的荧光染料。
(4)如(2)所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为式(C)所表示的荧光染料。
(5)如(1)所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为PET示踪剂或MRI造影剂。
(6)一种抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子为包含式(A)所表示的配体和顺磁性金属离子的MRI造影剂、或者为包含该配体和金属放射性同位素的PET示踪剂。
(7)如(6)所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其中，可检测的分子和接头为包含式(A’)所表示的配体和接头以及顺磁性金属离子的MRI造影剂、或者为包含该配体和接头以及金属放射性同位素的PET示踪剂。
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与可检测的分子的连结可以利用上述的方法。
本发明的复合物也包含作为两种以上本发明的复合物的混合物的复合物。例如，作为包含标记部和未接受翻译后修饰的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物、与包含标记部和通过上述抗人MUC1抗体Fab片段的翻译后修饰生成的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的混合物的复合物也包含在本发明的复合物中。
以下示出作为两种以上本发明的复合物的混合物的本发明的复合物的某一实施方式：
(1)一种复合物，其是标记部为式(A’)所表示的配体和接头、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物与标记部为式(A’)所表示的配体和接头、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的混合物。
(2)如(1)所述的复合物，其中，进一步包含金属。
(3)如(2)所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
(4)如(3)所述的复合物，其中，金属为89Zr。
(5)一种复合物，其是标记部为式(B)所表示的荧光染料、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物与标记部为式(B)所表示的荧光染料、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的混合物。
(6)一种复合物，其是标记部为式(C)所表示的荧光染料、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物与标记部为式(C)所表示的荧光染料、抗人MUC1抗体Fab片段为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的混合物。
<本发明的多核苷酸>
本发明的多核苷酸包括：包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码含有由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号7所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码含有由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号9所示的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码含有由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码含有由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号5所示的碱基序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以基于以本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段和轻链的氨基酸序列为基础而设计的碱基序列，利用本技术领域中公知的基因合成方法进行合成。作为这样的基因合成方法，可以使用国际公开第90/07861号中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
<本发明的表达载体>
本发明的表达载体包括：含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
优选的本发明的表达载体包括：含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
本发明的表达载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中产生由本发明的多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，优选可以使用pEE6.4、pEE12.4(Lonza公司)。
本发明的表达载体可以包含以可发挥功能的方式与编码本发明的多核苷酸的重链片段和/或轻链的基因连结的启动子。作为用于在宿主细胞中表达本发明的Fab片段的启动子，在宿主细胞为埃希氏菌属菌的情况下，可以列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可以列举例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属菌中的表达用启动子，可以列举SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可以列举CMV、RSV、SV40等病毒来源的启动子、逆转录病毒的启动子、肌动蛋白启动子、EF(延伸因子，elongation factor)1α启动子、热休克启动子等。
在使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以进一步包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。另一方面，在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子。另外，这种情况下，可以包含增强子序列、编码本发明的重链片段和/或轻链的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，可以根据目的包含通常使用的选择标志物(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
<本发明的进行了转化的宿主细胞>
本发明的进行了转化的宿主细胞包括选自由下述(a)至(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为进行转化的宿主细胞，只要适合所使用的表达载体、能够利用该表达载体进行转化而表达Fab片段，则没有特别限定，可以例示本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)、哺乳动物细胞株(例如CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞)。转化本身可以利用例如磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法进行。
<生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法>
生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤。
在一个实施方式中，在生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法中培养的本发明的进行了转化的宿主细胞选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明记载的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明记载的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为某一方式，在生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法中培养的本发明的进行了转化的宿主细胞选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
优选所使用的本发明的进行了转化的宿主细胞为利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、或者利用含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法中，进行了转化的宿主细胞可以在营养培养基中进行培养。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆粕、马铃薯提取液等。另外，可以根据期望含有其他营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
进行了转化的宿主细胞的培养本身利用公知的方法进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5％～约20％的胎牛血清的MEM培养基(Science；1952；122:501)、DMEM培养基(Virology；1959；8:396-97.)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199:519-24.)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73:1-8)等。培养基的pH优选为约6～约8，培养通常在约30℃～约40℃下进行约15小时～约336小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(PNAS；1985；82:8404-8.)等，其pH优选为约5～约8。培养通常在约20℃～约40℃下进行15～100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠杆菌(E.coli)的情况下，作为优选的培养基，可以例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet,冷泉港实验室；1972:431)等。这种情况下，培养可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在14～43℃下进行约3小时～约24小时。在宿主为芽孢杆菌(Bacillus)属菌的情况下，可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在30～40℃下进行约16小时～约96小时。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列举例如Burkholder最小培养基(PNAS；1980；77:4505-8.)，pH优选为5～8。培养通常在约20℃～约35℃下进行约14小时～约144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
生产本发明的抗人MUC1抗体Fab片段的方法除了包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤以外，还可以包括对表达后的抗人MUC1抗体Fab片段进行回收、优选分离、纯化的步骤。作为分离、纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。
<生产本发明的复合物的方法>
生产本发明的复合物的方法包括使本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与标记部共价结合的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。此外，生产本发明的复合物的方法可以包括添加金属的步骤。所使用的接头、螯合剂、金属或荧光染料等以及连结的方法可以使用<本发明的复合物>中记载的物质和方法。
在一个实施方式中，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤；以及利用金属对该复合物的配体进行标记(即，形成螯合络合物)的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤；以及利用金属对该复合物的配体进行标记的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤；以及利用金属放射性同位素对该复合物的配体进行标记(即，形成螯合络合物)的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤；以及利用金属放射性同位素对该复合物的配体进行标记的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与荧光染料结合、或者ii)直接与荧光染料共价结合的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与荧光染料结合、或者ii)直接与荧光染料共价结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；以及利用可检测的分子对该Fab片段进行标记的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及利用可检测的分子对该Fab片段进行标记的步骤的方法。
生产本发明的复合物的方法可以作为以一系列步骤的形式包括上述限定的两个以上的步骤的方法来实施，也可以作为包括上述限定的至少一个步骤的方法来实施。例如，包括使本发明的抗人MUC1抗体Fab片段与标记部结合的步骤的方法、以及包括利用金属对结合有标记部的本发明的抗人MUC1抗体Fab片段进行标记的步骤的方法也包含在生产本发明的复合物的方法中。另外，生产本发明的复合物的方法中也包含步骤的顺序不同的方法。例如，在螯合剂上标记金属后使该螯合剂与本发明的抗人MUC1抗体Fab片段共价结合的方法也包含在生产本发明的复合物的方法中。
<诊断用组合物、诊断方法>
本发明涉及包含含有金属或荧光染料的本发明的复合物(以下称为可检测的本发明的复合物)的诊断用组合物。本发明的诊断用组合物可以包含一种以上本发明的复合物。即，本发明的诊断用组合物可以包含一种本发明的复合物，或者也可以包含两种以上本发明的复合物的组合。可检测的本发明的复合物可以按照常规方法制剂化，作为早期诊断剂、病程诊断剂或术中诊断剂(特别是癌症的诊断剂)来利用。术中诊断剂是指在外科手术、内窥镜手术等手术中能够确定病变部、对其性质进行检查的诊断剂。在使用本发明的诊断用组合物作为术中诊断剂的情况下，该诊断用组合物例如在手术2～32小时前、作为某一方式在6～24小时前、作为另一方式在2小时前给药于患者。
早期诊断剂是指目的在于在观察不到病情、或病程的早期阶段进行诊断的诊断剂。例如，在癌症中，是指在观察不到病情、或者在0期或I期的阶段使用的诊断剂。
病程诊断剂是指能够检查病情发展到何种程度的诊断剂。例如，在癌症中，是指能够检查其分期的诊断剂。
可期待能够利用本发明的诊断用组合物进行诊断的癌症为表达人MUC1的癌症。作为某一方式，可以列举乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。优选该癌症为乳腺癌或膀胱癌。
本发明的诊断用组合物的制剂化时的本发明的复合物的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型、或者Fab片段的结合效价等而有所不同，例如，相对于患者的每单位体重以Fab片段的质量基准计使用约0.001mg/kg至约100mg/kg即可。
作为本发明的诊断用组合物的剂型的示例，可以列举注射剂、点滴用剂等非口服剂，可以通过静脉内注射、向靶组织局部的肌肉内注射、皮下注射、膀胱内给药等来给药。另外，制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。药学上可接受的载体、添加剂的种类没有特别限定，可以使用本领域技术人员公知的载体、添加剂。
另外，本发明涉及可检测的本发明的复合物在制造癌症的早期诊断用组合物、病程诊断用组合物或术中诊断用组合物中的应用。本发明还涉及用于在癌症的早期诊断、病程诊断或术中诊断中使用的可检测的本发明的复合物。
另外，本发明还涉及一种癌症的诊断方法，其包括在手术前或手术中向对象给药可检测的本发明的复合物。在此，“对象”是指需要接受该诊断的人或其他哺乳动物，作为某一方式，为需要接受该诊断的人。本发明的诊断方法中的可检测的本发明的复合物的有效量为与上述制剂化时的本发明的复合物的有效量同样的量。在本发明的诊断方法中，可检测的本发明的复合物优选通过向靶组织局部的肌肉内注射、皮下注射等来给药。在本发明的诊断方法中，在手术前给药本发明的复合物的情况下，该复合物例如在手术的2～48小时前、作为某一方式在6～24小时前、作为另一方式在2小时前给药于患者。
在另一实施方式中，本发明还涉及本发明的抗人MUC1抗体Fab片段在制造本发明的复合物中的应用。作为某一方式，本发明还涉及本发明的抗人MUC1抗体Fab片段在制造包含本发明的复合物的诊断用组合物中的应用。
另外，作为提供包含金属放射性同位素的本发明的诊断用组合物时的方式，可以在即将使用前利用金属放射性同位素进行标记，也可以以包含金属放射性同位素的诊断用组合物的形式提供。
<治疗用组合物、治疗方法>
本发明中包含一种药物组合物，其包含一种以上的本发明的复合物和药学上可接受的赋形剂。即，本发明的治疗用组合物可以包含一种本发明的复合物，或者也可以包含两种以上本发明的复合物的组合。本发明的复合物可以使用本领域中通常使用的赋形剂、即药剂用赋形剂或药剂用载体等，利用通常使用的方法用于药物组合物的制备。作为这些药物组合物的剂型的示例，可以列举例如注射剂、点滴用剂等非口服剂，可以通过静脉内给药、皮下给药、膀胱内给药等来给药。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。
上述制剂化时的本发明的复合物的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型、或者Fab片段的结合效价等而有所不同，例如，相对于患者的每单位体重以Fab片段的质量基准计可以使用约0.001mg/kg至约100mg/kg。
包含本发明的复合物的药物组合物能够用于癌症的治疗。可期待能够利用包含本发明的复合物的药物组合物进行治疗的癌症为表达人MUC1的癌症，可以列举例如乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌。
作为某一方式，包含本发明的复合物的药物组合物为包含含有荧光染料的复合物的药物组合物，能够应用于光免疫疗法而用于癌症的治疗。光免疫疗法是使包含荧光染料的复合物特异性地聚集在癌组织中后，照射对该复合物中所含的荧光染料进行激发的波长的光，通过由该荧光染料所产生的光毒性效果以癌症特异性的方式诱导细胞死亡的方法。在将包含荧光染料的本发明的复合物用于光免疫疗法的情况下，所照射的光的波长可以为近红外波长(650～1000nm)。
本发明中包含一种用于治疗乳腺癌或膀胱癌的药物组合物，其包含本发明的复合物。另外，本发明中包含一种治疗乳腺癌或膀胱癌的方法，其包括给药治疗有效量的本发明的复合物的步骤，在该步骤的基础上，可以还包括照射近红外波长(650～1000nm、例如660～740nm、例如680nm)的光的步骤。作为某一方式，照射光的线量至少为1J/cm2、作为某一方式至少为10J/cm2、作为某一方式至少为100J/cm2、作为某一方式为1～500J/cm2、作为某一方式为50～200J/cm2。在某一实施方式中，在给药本发明的复合物后，也可以多次实施照射。另外，本发明中包含一种诱导乳腺癌或膀胱癌的癌细胞的细胞死亡的方法，其包括给药治疗有效量的本发明的复合物的步骤。
用于治疗癌症的药物组合物也可以用于癌症的诊断。例如，也可以将用于治疗乳腺癌或膀胱癌的药物组合物也用于该癌症的诊断。
另外，本发明中包含用于在乳腺癌或膀胱癌的治疗中使用的本发明的复合物。此外，本发明中包含本发明的复合物在制造用于治疗乳腺癌或膀胱癌的药物组合物中的应用。
在另一实施方式中，本发明还涉及本发明的抗人MUC1抗体Fab片段在制造包含本发明的复合物的药物组合物中的应用。
整体上对本发明进行了记载，但为了得到进一步的理解，在此提供参考的特定实施例。但是，这些实施例的目的在于例示，并非对本发明进行限定。
实施例
(实施例1：抗人MUC1抗体Fab片段的制作)
制作称为P10-1 Fab和P10-2 Fab的两种抗人MUC1抗体Fab片段。
具体而言，关于P10-1 Fab和P10-2 Fab的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，参考文献(Front Biosci.,2008 Jan 1；13:1619-33)中记载的方法将作为小鼠来源的抗人癌症特异性MUC1抗体的1B2抗体人源化后，使用依照文献(Proteins,2014 Aug；82(8):1624-35)构建的人源化抗体的分子模型，设计出可期待亲和性提高、并且即使结合标记部也不会使亲和性减弱的序列。
分别在P10-1 Fab和P10-2 Fab的各重链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(序列号13))的基因，并且在3’侧连接人Igγ1的恒定区基因(由序列号1和3的碱基序号355至669的碱基序列构成)而形成重链片段基因，制作插入有该重链片段基因的GS载体pEE6.4(Lonza公司)。在此，为了以Fab片段的形式进行表达，在重链恒定区基因中，在基于由Kabat等提出的EU索引的第221位的Asp(对应于后述序列号2和4的氨基酸序列中的第222位的Asp)的密码子后插入终止密码子。另外，分别在P10-1 Fab和P10-2Fab共通的轻链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(序列号14))的基因，并且在3’侧连接人κ链的恒定区基因(由序列号5的碱基序号340至660的碱基序列构成)而形成轻链基因，制作插入有该轻链基因的GS载体pEE12.4(Lonza公司)。
利用瞬时性表达的方法进行Fab片段的表达。对于在Expi293表达培养基(ThermoFisher Scientific公司)中培养至约250万个/mL的Expi293F细胞(Thermo FisherScientific公司)，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)将上述重链片段和轻链的GS载体进行转染，培养8天。使其表达后，使用KappaSelect(GEHealthcare公司)对培养上清进行纯化，得到各Fab片段。
将P10-1 Fab的重链片段的碱基序列示于序列号1，将由其编码的氨基酸序列示于序列号2。将P10-1 Fab的重链可变区的碱基序列示于序列号7，将由其编码的氨基酸序列示于序列号8。
将P10-2 Fab的重链片段的碱基序列示于序列号3，将由其编码的氨基酸序列示于序列号4。将P10-2 Fab的重链可变区的碱基序列示于序列号9，将由其编码的氨基酸序列示于序列号10。
P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链是共通的，将其碱基序列示于序列号5，将由其编码的氨基酸序列示于序列号6。将P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链可变区的碱基序列示于序列号11，将由其编码的氨基酸序列示于序列号12。
(实施例2：Fab片段的氨基酸修饰分析)
对纯化的P10-2 Fab的氨基酸修饰进行分析，结果暗示，在大部分纯化抗体中，重链N末端的谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸。
(实施例3：Fab片段的结合活性评价)
对于利用上述方法表达的P10-1 Fab和P10-2 Fab，利用细胞ELISA法与嵌合1B2抗体Fab片段(以下有时表示为1B2 Fab。在1B2抗体(专利文献1)的VH结构域和VL结构域(序列信息引用自专利文献1)上分别连结人IgG1的CH1结构域、κ链的CL结构域而制作。为了便于连结CH1结构域和CL结构域，VH结构域的基于由Kabat等提出的EU索引的第113位的丙氨酸残基被置换成丝氨酸残基、VL结构域的基于由Kabat等提出的EU索引的第109位的丙氨酸残基被置换成苏氨酸残基。)进行对人癌症特异性MUC1的结合活性的比较。即，将表达人癌症特异性MUC1的乳腺癌细胞株T-47D细胞(可由ATCC购入；HTB-133)以每孔0.75×104个细胞接种到用I型胶原蛋白包被的96孔ELISA板中，培养一晚后，将细胞用福尔马林固定化，使上述P10-1 Fab、P10-2 Fab或1B2 Fab与其反应后，使辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase：HRP)标记山羊抗人Igκ抗体(Southern Biotechnology Associates公司)作为二次抗体进行反应，添加ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂(GE Healthcare公司)使其发光，考察其发光度。其结果是，如图1所示，确认到P10-1 Fab和P10-2 Fab具有1B2 Fab的约10倍以上的对人癌症特异性MUC1的结合活性。
(实施例4：Fab片段的荧光标记化)
接着，本发明人对上述的P10-1 Fab、P10-2 Fab和1B2 Fab进行荧光染料的导入。
具体而言，在利用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)调节至约1mg/mL的Fab片段溶液中添加1/10量的1M磷酸氢二钾溶液(pH9)，调整pH至8.5。向其中添加IRDye800CW NHS酯(LI-CORBiosciences公司)使终浓度为310.8μg/mL，在室温下避光搅拌2小时。由于IRDye800CW NHS酯具有N-羟基琥珀酰亚胺基，因此迅速与Fab片段的Lys反应。利用Amicon Ultra 3K-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)将其回收，纯化出荧光标记化的Fab片段。将该导入有荧光染料的P10-1 Fab、P10-2 Fab和1B2 Fab称为P10-1 Fab染料、P10-2 Fab染料和1B2Fab染料。
(实施例5：荧光标记化Fab片段的结合活性评价)
对于利用上述方法标记的P10-1 Fab染料和P10-2 Fab染料，利用细胞ELISA法与1B2 Fab染料进行对人癌症特异性MUC1的结合活性的比较。即，将表达人癌症特异性MUC1的乳腺癌细胞株T-47D细胞以每孔0.75×104个细胞接种到用I型胶原蛋白包被的96孔ELISA板中，培养一晚后，将细胞用福尔马林固定化，使上述P10-1 Fab染料、P10-2 Fab染料或1B2Fab染料与其反应后，使HRP标记山羊抗人Igκ抗体(Southern Biotechnology Associates公司)作为二次抗体进行反应，添加ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂(GE Healthcare公司)使其发光，考察其发光度。其结果是，如图2所示，确认到1B2 Fab染料的结合活性通过标记而减弱，与此相对，P10-1 Fab染料和P10-2 Fab染料的结合活性不会通过标记而减弱。
(实施例6：Fab片段的螯合剂标记化)
接着，本发明人对上述P10-2 Fab进行螯合剂的导入。
具体而言，在利用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)调节至12.5mg/mL的Fab片段溶液中添加100mM碳酸钠溶液使其达到10mM，调整pH至9.0。向其中添加p-SCN-Bn-去铁胺(Macrocyclics公司)使终浓度为1mM，在37℃下反应2小时。由于p-SCN-Bn-去铁胺具有异硫氰酸酯基，因此迅速与Fab片段的Lys反应。利用Amicon Ultra 10K-0.5mL离心式过滤器将其回收，纯化出螯合剂标记化的Fab片段。将该螯合剂标记化的P10-2 Fab称为P10-2 FabDFO。
(实施例7：螯合剂标记化Fab片段的结合活性评价)
对于利用上述方法标记的P10-2 Fab DFO，利用细胞ELISA法与P10-2 Fab进行对人癌症特异性MUC1的结合活性的比较。即，将表达人癌症特异性MUC1的T-47D细胞以0.75×104个细胞接种到用I型胶原蛋白包被的96孔ELISA板中，培养一晚后，将细胞用福尔马林固定化，使上述P10-2 Fab DFO或P10-2 Fab与其反应后，使HRP标记山羊抗人Igκ抗体(Southern Biotechnology Associates公司)作为二次抗体进行反应，添加ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂(GE Healthcare公司)使其发光，考察其发光度。其结果是，如图3所示，确认到P10-2 Fab DFO与P10-2 Fab的结合活性同等，P10-2 Fab的结合活性不会通过螯合剂标记而减弱。
(实施例8：人膀胱癌组织样品中的P10-2的反应性)
为了研究人膀胱癌中的P10-2 Fab的反应性，利用使用人膀胱癌组织阵列(USBiomax公司BC12011b)的免疫染色法进行了研究。若使用P10-2 Fab作为一次抗体，则作为二次抗体使用的抗人抗体会与人组织交叉，因此制作小鼠嵌合P10-2IgG(在P10-2 Fab的VH结构域和VL结构域上分别融合小鼠IgG2a的CH1～3结构域和小鼠κ链的CL结构域而得到的抗体)作为一次抗体使用。将人膀胱癌组织阵列样品在3％的过氧化氢溶液中反应5分钟后，用pH7.4的磷酸缓冲生理盐水清洗。然后，使小鼠嵌合P10-2IgG(0.25μg/mL)反应后，使One-Step Polymer-HRP抗体(Biogenex公司)作为二次抗体进行反应，添加Super SensitiveDAB(Biogenex公司)使其显色。关于对癌组织的染色的阳性反应的判定，设定为±：极轻度的阳性、+：阳性、++：中等度的阳性、+++：高度的阳性，将癌组织不明确的一例排除在外。其结果是，±为11例、+为24例、++为17例、+++为5例，所研究的59例中57例确认为阳性反应(阳性率97％)。
(实施例9：螯合剂标记化Fab片段的89Zr标记化)
89Zr使用以溶解在1M草酸水溶液中的89Zr-草酸盐(冈山大学)的形式制造的89Zr。将20μL的89Zr-草酸盐(21.4MBq)用10μL的2M碳酸钠水溶液中和后，添加溶解在250mM乙酸钠水溶液中的5mg/mL龙胆酸溶液70μL。进一步，添加含有0.1％聚山梨醇酯80和20％甘油的500mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)水溶液200μL。在该含有89Zr的溶液中添加9.5mg/mL的P10-2 Fab DFO 100μL，在室温下反应30分钟。使用Amicon Ultra 10K-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)对所得到的反应混合物进行纯化，进一步用膜过滤器(Millex-GV 0.22μm13mm；Merck Millipore公司)过滤，由此得到目标P10-2 Fab DFO的89Zr标记体(16.1MBq)。将该89Zr标记的P10-2 Fab DFO称为P10-2 Fab DFO 89Zr。使用高效液相色谱(20AD系列；岛津制作所)对所得到的P10-2 Fab DFO 89Zr溶液进行分析，比较P10-2Fab DFO的保留时间(UV：10.192分钟)和P10-2 Fab DFO 89Zr的保留时间(UV：10.178分钟、RI：10.515分钟)，各自的保留时间同等，由此确认P10-2 Fab DFO被89Zr进行了标记。HPLC分析在下述条件下实施。柱：BioSep SEC s3000 300×7.8mm(Phenomenex公司)、柱温：室温、UV检测器波长：280nm、流动相：磷酸缓冲液(Gibco公司、10010-023)、流速：1mL/分钟
(实施例10：IRDye700DX向Fab片段上的附加)
IRDye700DX向P10-2 Fab上的附加使用IRDye700DX NHS酯(LI-COR Biosciences公司)。
具体而言，在利用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)调节至1mg/mL的P10-2 Fab溶液中添加1/10量的1M磷酸氢二钾溶液(pH9)。向其中添加IRDye700DX NHS酯使终浓度为154μg/mL，在室温下搅拌2小时。反应后，使用Amicon Ultra 10K-15mL离心式过滤器(MerckMillipore公司)进行回收，纯化出附加有IRDye700DX的P10-2 Fab。将这样附加有IRDye700DX的P10-2 Fab称为P10-2 Fab IR700。
(实施例11：Fab片段对乳腺癌细胞株和膀胱癌细胞株的结合活性评价)
对人乳腺癌和膀胱癌中的P10-2 Fab的结合活性进行了研究。
具体而言，将表达人癌症特异性MUC1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞(可由ATCC购入；HTB-132、以下称为MM-468细胞)和人膀胱癌细胞株647-V细胞(可由DSMZ购入；ACC 414)以每孔1×104个细胞接种到96孔板中，培养一晚后，使上述P10-2 Fab以0.0000003-0.001mg/mL的浓度进行反应，然后使辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase：HRP)标记山羊抗人IgG抗体(Medical&Biological Laboratories公司)作为二次抗体进行反应，添加ECL Prime蛋白免疫印迹检测试剂(GE Healthcare公司)使其发光，考察其发光度。其结果是，如图4所示表明，P10-2 Fab对人乳腺癌细胞株MM-468细胞和人膀胱癌细胞株647-V细胞具有结合活性。
(实施例12：皮下荷瘤模型中的荧光标记化Fab片段的造影评价)
在免疫缺陷小鼠(SCID小鼠；日本查尔斯河公司)的右背部的皮下移植3×106个细胞的人乳腺癌细胞株MM-468细胞作为人癌症特异性MUC1阳性细胞。在移植后约一个月，挑选出形成了肿瘤的小鼠，将溶解在磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中的P10-2 Fab染料以0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg的用量进行静脉给药(0.1mg/kg给药组以N＝2实施、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg给药组以N＝3实施)。在P10-2Fab染料给药6小时后和24小时后，利用普通的相机和近红外荧光相机(Fluobeam(800nm滤光片)；Fluoptics公司)进行拍摄，测定利用红外荧光相机拍摄的图的肿瘤部分(肿瘤(Tumor))和肿瘤周围的正常部分(背景(Background))的荧光亮度。其结果是，如图5A所示表明，P10-2 Fab染料在给药6小时后聚集在人癌症特异性MUC1阳性MM-468肿瘤部位，在荧光图像中可清楚地辨认。另外，如图5B所示表明，在0.1～3mg/kg的范围内，肿瘤部位荧光亮度/正常部位荧光亮度比以P10-2 Fab染料给药用量依赖的方式升高。此外还表明，其效果在给药24小时后也得以持续。由这些结果表明，P10-2 Fab染料在给药6小时后至24小时后能够对人MUC1阳性的癌细胞进行检测。
(实施例13：利用IRDye700DX附加Fab片段的肿瘤的检测)
在免疫缺陷小鼠(裸小鼠；日本查尔斯河公司)的右背部的皮下移植5×106个细胞的MM-468细胞。本试验以N＝2实施。移植40天后，静脉给药P10-2 Fab IR700(3mg/kg)或溶剂(磷酸缓冲生理盐水)。在P10-2 Fab IR700给药2小时后使动物安乐死，摘除肿瘤，利用IVIS SPECTRUM(Perkin Elmer公司)在675nm的波长下激发，以740nm的波长进行检测，测定肿瘤部分的发光量。其结果是，如图6所示表明，P10-2 Fab IR700在给药2小时后聚集在MM-468细胞中。
(实施例14：IRDye700DX附加Fab片段的细胞毒性评价)
为了研究P10-2 Fab IR700在癌症治疗中的应用，利用光免疫疗法对细胞毒性进行评价。
具体而言，将人乳腺癌细胞株MM-468细胞、人膀胱癌细胞株647-V细胞或作为比较例的CHO-K1细胞(可由ATCC购入；CCL-61)以每孔5×103个细胞接种到384孔白色板中，培养一晚后，使P10-2 Fab IR700以0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL或1μg/mL进行反应，然后以达到0～30J/cm2的方式照射波长680nm的光。光照射后，培养一晩，添加CellTiter-Glo(Promega公司)使其发光，测定发光量，由此测定细胞的活细胞数。需要说明的是，本试验在各条件下分别以各3孔进行实施。其结果是，如图7所示表明，P10-2 Fab IR700通过光照射而呈人癌症特异性MUC1的表达特异性地显示出细胞毒性。
(实施例15：IRDye700DX附加Fab片段的抗肿瘤活性评价)
在免疫缺陷小鼠(裸小鼠；日本查尔斯河公司)的右背部的皮下移植5×106个细胞的MM-468细胞。本试验以N＝4实施。在肿瘤体积达到300mm3后，在第1天、第5天、第8天、第12天和第15天静脉给药P10-2 Fab IR700(0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg)。对溶剂组同样给药磷酸缓冲生理盐水。在药物给药的第二天以达到0J/cm2或200J/cm2的方式照射波长680nm的光，随日期推移测定肿瘤体积。其结果是，如图8所示表明，P10-2 Fab IR700以给药量和光照射依赖的方式显示出抗肿瘤效果。
产业上的可利用性
本发明的抗人MUC1抗体Fab片段被期待对乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或宫颈癌等癌症的诊断和/或治疗有用。
序列表自由文本
序列号1：编码P10-1 Fab重链片段的DNA的碱基序列
序列号2：P10-1 Fab重链片段的氨基酸序列
序列号3：编码P10-2 Fab重链片段的DNA的碱基序列
序列号4：P10-2 Fab重链片段的氨基酸序列
序列号5：编码抗体轻链的DNA的碱基序列
序列号6：抗体轻链的氨基酸序列
序列号7：编码P10-1 Fab重链可变区的DNA的碱基序列
序列号8：P10-1 Fab重链可变区的氨基酸序列
序列号9：编码P10-2 Fab重链可变区的DNA的碱基序列
序列号10：P10-2 Fab重链可变区的氨基酸序列
序列号11：编码抗体轻链可变区的DNA的碱基序列
序列号12：抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号13：重链信号序列
序列号14：轻链信号序列
序列号15：MUC1的胞外结构域的串联重复序列。
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社（Astellas Pharma Inc.）
<120> 新型抗人MUC1抗体Fab片段（NOVEL ANTI-HUMAN MUC1 ANTIBODY FABFRAGMENT）
<130> A17011A00
<150> JP2016-224811
<151> 2016-11-18
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链片段的DNA
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
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<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab重链片段
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 3
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-2 Fab重链片段的DNA
<400> 3
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
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tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 4
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链片段
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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210 215 220
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<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体轻链的DNA
<400> 5
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atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 6
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链可变区的DNA
<400> 7
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tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
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ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
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<212> PRT
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
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Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链可变区
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> 编码抗体轻链可变区的DNA
<400> 11
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链可变区
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
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20 25 30
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 13
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<212> PRT
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<220>
<223> 重链信号序列
<400> 13
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1 5 10 15
Val His Ser
<210> 14
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<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链信号序列
<400> 14
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1的胞外结构域的串联重复序列
<400> 15
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20

Claims (50)

1.一种抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号8或序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号8或序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号2或序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号2或序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
3.如权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号10所示的氨基酸序列构成、且序列号10的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
4.如权利要求3所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段，包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人MUC1抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号6所示的氨基酸序列构成。
5.如权利要求4所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
6.如权利要求4所述的抗人MUC1抗体Fab片段，其为包含由序列号4所示的氨基酸序列构成、且序列号4的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段以及由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
7.一种复合物，其包含一个以上的标记部和权利要求1至6中任一项所述的抗人MUC1抗体Fab片段。
8.如权利要求7所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。
9.如权利要求8所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体。
10.如权利要求9所述的复合物，其中，配体为下式(A)所表示的配体：
Figure FDA0003809008650000031
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
11.如权利要求10所述的复合物，其中，标记部为下式(A’)所表示的配体和接头：
Figure FDA0003809008650000032
式中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合。
12.如权利要求11所述的复合物，其中，抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝S)基的碳原子结合。
13.一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求12所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求6所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求12所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
14.如权利要求9至13中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
15.如权利要求14所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
16.如权利要求15所述的复合物，其中，金属为89Zr。
17.如权利要求13所述的复合物，其中，进一步包含89Zr。
18.如权利要求8所述的复合物，其中，标记部为(i)荧光染料和接头或者(ii)荧光染料。
19.如权利要求18所述的复合物，其中，荧光染料为选自由下式(B)和下式(C)组成的组的荧光染料：
Figure FDA0003809008650000041
Figure FDA0003809008650000051
式(B)和(C)中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段或接头的结合。
20.如权利要求19所述的复合物，其中，波状线表示与抗人MUC1抗体Fab片段的结合，所述抗人MUC1抗体Fab片段借助其氨基与标记部末端C(＝O)基的碳原子结合。
21.如权利要求20所述的复合物，其中，标记部为式(B)所表示的荧光染料。
22.一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求21所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求6所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求21所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
23.如权利要求20所述的复合物，其中，标记部为式(C)所表示的荧光染料。
24.一种复合物，其选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求23所述的复合物；
(b)抗人MUC1抗体Fab片段为权利要求6所述的抗人MUC1抗体Fab片段的权利要求23所述的复合物；以及
(c)作为上述(a)和上述(b)的混合物的复合物。
25.一种多核苷酸，其包含下述(a)和(b)：
(a)包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
26.一种多核苷酸，其包含下述(a)和(b)：
(a)包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
27.一种表达载体，其包含下述(a)和(b)：
(a)包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
28.一种表达载体，其包含下述(a)和(b)：
(a)包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(b)利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
30.一种宿主细胞，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(b)利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
31.一种生产抗人MUC1抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码权利要求1所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
32.一种生产抗人MUC1抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人MUC1抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码权利要求5所述的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
33.一种生产包含标记部和抗人MUC1抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用权利要求31或32所述的方法生产抗人MUC1抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。
34.如权利要求33所述的生产复合物的方法，其中，使Fab片段与标记部共价结合的步骤是使该Fab片段i)经由接头与配体结合或者ii)直接与配体共价结合的步骤。
35.如权利要求34所述的生产复合物的方法，其中，进一步包括用金属放射性同位素对该复合物的配体进行标记的步骤。
36.如权利要求33所述的生产复合物的方法，其中，使Fab片段与标记部共价结合的步骤是使该Fab片段i)经由接头与荧光染料结合或者ii)直接与荧光染料共价结合的步骤。
37.一种诊断用组合物，其包含一种以上的权利要求7至权利要求24中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
38.如权利要求37所述的诊断用组合物，其中，复合物为权利要求17、22和24中任一项所述的复合物。
39.如权利要求38所述的诊断用组合物，其中，复合物为权利要求17所述的复合物。
40.如权利要求38所述的诊断用组合物，其中，复合物为权利要求22所述的复合物。
41.如权利要求38所述的诊断用组合物，其中，复合物为权利要求24所述的复合物。
42.如权利要求37至41中任一项所述的诊断用组合物，其用于表达人MUC1的癌症的诊断。
43.如权利要求42所述的诊断用组合物，其中，癌症为乳腺癌或膀胱癌。
44.一种药物组合物，其包含一种以上的权利要求7至权利要求24中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中，复合物为权利要求17、22和24中任一项所述的复合物。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其中，复合物为权利要求24所述的复合物。
47.如权利要求44至46中任一项所述的药物组合物，其为用于治疗表达人MUC1的癌症的药物组合物。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌或膀胱癌。
49.权利要求7至24中任一项所述的复合物在制造乳腺癌或膀胱癌的诊断用组合物和/或用于治疗乳腺癌或膀胱癌的药物组合物中的应用。
50.如权利要求7至24中任一项所述的复合物，其用于在乳腺癌或膀胱癌的诊断和/或治疗中使用。
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