TWI795415B - 新穎的抗人類CEACAM5抗體Fab片段 - Google Patents
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Abstract
提供被期待有用於癌之診斷,特別是大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷的抗人類CEACAM5抗體Fab片段,及使用包含該Fab片段之複合體的診斷手段。 含有包含序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段,及包含序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,及包含該Fab片段之複合體。
Description
本發明係關於新穎的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。又,本發明係關於包含該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之診斷用組成物,及使用該Fab片段診斷癌之方法。
CEA(Carcinoembryonic antigen)或CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule) 為於1965年發現之腫瘤標記(J.Exp.Med.;1965;121:439-462、PNAS;1969;64:161-167),到目前為止已知有23個之CEA相關分子(BioMedCentral Biology;2010;8:12-33)。其中,CEACAM5於正常組織幾乎觀察不到表現,但於胎兒的消化道或大腸癌中有表現(BBA;1990;1032:177-189、Mol.Pathol.;1999;52:174-178)。又,已知CEACAM5於乳癌、肺癌、甲狀腺癌中亦有表現(Diagn.Cytopathol.;1993;9:377-382、Cancer Res.;1990;50:6987-6994、Histopathology;2000;37:530-535)。 大腸癌患者中,相較於健康人,血中CEACAM5之濃度高(J.Exp.Med.;1965;121:439-462),CEACAM5係使用作為腫瘤標記。大腸癌患者之組織學的探討中,於90%以上之組織有CEACAM5高表現(British J.Cancer;2013;108:662-667)。 大腸癌之早期轉移係局限於肝臟,因此若可早期發現肝轉移予以治療,則可降低復發率(Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.;2017;3:163-173)。肝轉移之診斷係使用CT(電腦斷層攝影)或MRI(核磁共振影像法)、FDG-PET (Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography)。CT或MRI、FDG-PET之檢測感度各為74.4、80.3、81.4%,於1cm以下之腫瘤,檢測感度在CT係降為47.3%、MRI係降為60.2%(Radiology;2010;257:674-684)。肝特異性造影劑MRI亦被使用,但於1cm以下之腫瘤,其檢測感度為29~38%(Radiology;2005;237:89-98)。 為了診斷、治療癌,係使用結合有抗癌劑或金屬放射性同位素的抗體。使用抗體之標靶定位對腫瘤細胞的特異性高,副作用少。至今為止有數個經金屬放射性同位素標誌的單株抗體被臨床應用於診斷及治療(Cancer Control;2012;19:196-203)。 另一方面,一般而言抗體之血中半衰期長,對體內給與後,欲使癌可見化,為達獲得充分之訊號對背景比的腫瘤對血液比,需要4日~5日之長期間(Clin. Pharmacol. Ther.;2010;87:586-592)。又,抗體之Fc區域,會引起抗體依賴性細胞毒性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity:ADCC)或補體依賴性細胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity:CDC)之藥理作用(Glycoconj.J.;2013;30:227-236、Curr.Opin.Biotechnol.;2002;13:609-614)。又,抗體係於肝臟代謝,故與標的無關地會於肝臟高度累積,但大腸癌之早期轉移局限於肝臟,因此以抗體檢測肝轉移的病灶係困難的(Clin.Pharmacol.Ther.;2010;87:586-592)。 如Fab、scFv、diabody之低分子化的重組抗體片段,由於組織滲透性高,故容易到達病灶,可期待使用以大腸菌或酵母之表現系統的低成本生產,因此利用作為治療用抗體,另一方面,具有血中半衰期短,由腎排泄之特徴,故亦被報告利用作為診斷藥(Nat.Biotechnol.;2005;23:1126-1136)。 作為診斷藥應用之抗人類CEACAM5抗體,已知有小鼠單株抗體T84.66之人類化抗體M5A(專利文獻1)。報告了經64
Cu標誌之M5A,於使用對皮下移植癌細胞的小鼠之試驗中,欲得到良好之PET影像,給與後必需經過22小時以上(非專利文獻1),又,於使用肝轉移之模式小鼠的試驗中,於給與後3小時,對肝臟之正常組織與肝臟之病灶部位的攝入係相同程度,24小時經過後係有顯著差(非專利文獻2)。 抗人類CEACAM5抗體之片段中,報告了將小鼠單株抗體之NP-4之Fab’以99m
Tc標誌之CEA-Scan,係可利用於大腸癌之診斷(非專利文獻3)。但是,CEA-Scan之對病灶部位的攝入不大於對正常肝臟之攝入,又,肝轉移之檢測感度較FDG-PET低(非專利文獻4)。CEA-Scan雖於1999年被FDA許可作為大腸癌之診斷藥,但已無販賣(非專利文獻5)。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1] 國際公開第2005/086875號小冊 [非專利文獻] [非專利文獻1] Bioconjug.Chem.;2008;19:89-96 [非專利文獻2] PLOS ONE;2014;9(9):e106921 [非專利文獻3] Ann.Surg.;1997;226:621-631 [非專利文獻4] J.Nucl.Med.;2000;41:1657-1663 [非專利文獻5] Kenneth T.Cheng、“99mTc-Arcitumomab”、[online]、Update:March 17,2008.、Molecular Imaging and Contrast Agent Database、[平成29(2017)年5月17日檢索]、網際網路<URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/>
[發明所欲解決之課題] 一價之Fab片段,分子量約50kDa,小於分子量約150kDa之抗體,由腎排泄,血中半衰期亦短。因此,可檢測肝轉移,給與後2~32小時以內會達到獲得欲使癌可見化之充分的訊號對背景比之腫瘤對血液比。因為沒有Fc區域,故亦不會引起ADCC或CDC。由於如此之特長,相較於抗體而言,Fab片段可期待作為診斷藥而言更有效。 但是,Fab片段中,多由於低分子化使其結合活性減弱。進一步地為了利用抗體作為體內診斷藥,必需以PET追蹤劑或螢光色素等之被檢測物質標誌,但Fab片段中,係有因以如此物質標誌,其結合活性減弱的課題。 本發明之課題為提供有用於檢測人類CEACAM5,且期待給與後短時間(例如4小時)之間累積於癌病灶的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。又,本發明之課題為提供期待可於給與的當日診斷之包含該Fab片段之診斷用組成物及利用其之診斷方法。 [用以解決課題之手段] 本發明者等人於有用於檢測人類CEACAM5的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之製作上重複相當的深入探討之結果,製作包含序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域,及序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域的抗人類CEACAM5抗體Fab片段(實施例1),發現該抗人類CEACAM5抗體Fab片段藉由標誌部之結合,對人類CEACAM5之結合活性不會減弱(實施例3),以及包含該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體,於給與4小時後於皮下移植模式及肝移植模式中會累積於人類CEACAM5陽性癌細胞,可檢測人類CEACAM5陽性癌細胞(實施例5及6)。亦即,本發明提供累積於癌之抗人類CEACAM5抗體Fab片段及包含該抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。 本發明為包含以下之發明作為醫學上或產業上有用之物質/方法者。 亦即,一態樣中,本發明可為如下所述。 (1)一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其包含:含有包含序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1、序列編號2之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2,及序列編號2之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域之重鏈片段,以及含有包含序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列所構成之CDR1、序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列所構成之CDR2,及序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域之輕鏈。 (2)如上述(1)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群: (a)包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之重鏈片段及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段;以及 (b)包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈可變區域之重鏈片段,及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 (3)如上述(2)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群: (a)包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段;以及 (b)包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈片段,及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 (4)如上述(3)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。 (5)一種複合體,其包含標誌部與如上述(1)至(4)中任一項之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 (6)如上述(5)之複合體,其中標誌部為(i)配位子及連結子、(ii)配位子、(iii)螢光色素及連結子,或(iv)螢光色素。 (7)如上述(6)之複合體,其中標誌部為(i)配位子及連結子,或(ii)配位子。 (8)如上述(7)之複合體,其中配位子為下式(A)表示之配位子:式中,波浪線表示對於抗人類CEACAM5抗體Fab片段或連結子之鍵結。 (9)如上述(7)之複合體,其中標誌部為(i)配位子及連結子,且該配位子及連結子為下式(A’)表示之基:式中,波浪線表示對於抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鍵結。 (10)如上述(9)之複合體,其中抗人類CEACAM5抗體Fab片段,係透過該Fab片段中之胺基,與標誌部末端之C(=S)基的碳原子鍵結。 (11)如上述(7)之複合體,其係以下式(I)表示:式中,Ab為抗人類CEACAM5抗體Fab片段, L為配位子, X為連結子或鍵結,及 p為1~25之自然數。 (12)如上述(11)之複合體,其中L為下式(A)表示之配位子:式中,波浪線表示對於X(惟,X為鍵結時係對Ab)之鍵結。 (13)如上述(9)或(12)中任一項之複合體,其係以下式(II)表示:式中,Ab為抗人類CEACAM5抗體Fab片段, p為1~25之自然數, 此處,Ab係透過該Ab中之胺基,與標誌部末端之C(=S)的碳原子鍵結。 (14)如上述(11)至(13)中任一項之複合體,其中p為1~16之自然數。 (15)如上述(11)至(13)中任一項之複合體,其中p為4~16之自然數。 (16)如上述(6)至(15)中任一項之複合體,其進一步含有金屬。 (17)如上述(16)之複合體,其中金屬為金屬放射性同位素。 (18)如上述(16)之複合體,其中金屬為89
Zr。 (19)如上述(17)或(18)之複合體,其係作為PET追蹤劑而使用。 (20)一種多核苷酸,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群: (a)包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸;及 (b)包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (21)一種多核苷酸,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群: (a)包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸;及 (b)包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (22)一種表現載體,其包含以下之(a)及/或(b): (a)包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (23)一種表現載體,其包含以下之(a)及/或(b): (a)包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸、 (b)包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 (24)一種宿主細胞,其係選自由以下之(a)至(d)所成之群: (a)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (c)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (d)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 (25)一種宿主細胞,其係選自由以下之(a)至(d)所成之群: (a)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (c)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (d)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 (26)一種生產抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,其包含培養選自由以下之(a)至(c)所成之群的宿主細胞,使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟: (a)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及上述包含編碼(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼上述(2)(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 (27)一種生產抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,其包含培養選自由以下之(a)至(c)所成之群的宿主細胞,使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟: (a)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼上述(4)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 (28)一種生產包含標誌部與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由上述(26)或(27)之方法配製抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟。 (29)一種生產包含配位子與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由上述(26)或(27)之方法配製抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與配位子,透過連結子或直接共價鍵結之步驟。 (30)一種生產包含經金屬放射性同位素標誌的標誌部與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由上述(29)之方法生產包含配位子與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之步驟,及使金屬放射性同位素配位結合於該複合體之配位子之步驟。 (31)一種診斷用組成物,其包含上述(16)至(19)中任一項之複合體及藥學上容許的承載體。 (32)如上述(31)之診斷用組成物,其係病期診斷藥。 (33)如上述(31)或(32)之診斷用組成物,其係使用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷。 (34)如上述(33)之診斷用組成物,其係使用於大腸癌或大腸癌經轉移之癌的診斷。 (35)如上述(34)之診斷用組成物,其中大腸癌經轉移之癌為轉移性肝癌。 (36)一種如上述(16)至(19)中任一項之複合體之使用,其係用於生產大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷用組成物。 (37)如上述(16)至(19)中任一項之複合體,其係使用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷。 (38)一種大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷方法,其包含對對象給與如上述(16)至(19)中任一項之複合體。 (39)如上述(1)至(4)中任一項之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其係使用作為包含標誌部之複合體。 (40)一種如上述(1)至(4)中任一項之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之使用,其係用於生產包含標誌部之複合體。 (41)如上述(39)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其中包含標誌部之複合體為如上述(5)至(18)中任一項之複合體。 (42)如上述(40)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之使用,其中包含標誌部之複合體為如上述(5)至(18)中任一項之複合體。 [發明之效果] 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,被期待有用於檢測人類CEACAM5,且有用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌等之癌的診斷。
以下詳述本發明,但本發明不限定於此等。本說明書中只要無特別定義,與本發明相關地使用的科學用語及技術用語,為具有所屬技術領域中具有通常知識者所一般性地理解的意義者。 本發明者等人於製作抗人類CEACAM5抗體或其抗原結合片段上重複相當之創意探討的結果,成功製作了有用於檢測人類CEACAM5之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 抗體分子之基本構造,係各類型共通地由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常由包含約440個之胺基酸之多胜肽鏈所構成,各類型係具有特徴性構造,對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而稱作γ、μ、α、δ、ε鏈。進一步地,於IgG係存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,分別稱為γ1、γ2、γ3、γ4。輕鏈通常由包含約220個之胺基酸之多胜肽鏈所構成,已知有L型與K型2種,各自稱作λ、κ鏈。抗體分子之基本構造的胜肽構成,係由分別相同的2條重鏈及2條輕鏈,藉由雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵結而鍵結,分子量為15萬~19萬。2種輕鏈不管與何種重鏈均可成對。個別的抗體分子,通常由相同輕鏈2條與相同重鏈2條所成。 鏈內S-S鍵,於重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)、於輕鏈有二個,每100~110個胺基酸殘基係成為一個環狀域(loop),在各環狀域間該立體構造類似,稱為構造單位或結構域(domain)。不管重鏈、輕鏈的位於N末端之結構域,均為即使來自同種動物之同一類型(次類型)的標本,其胺基酸序列亦並非一定,稱作可變區域,各結構域分別稱為重鏈可變區域(VH
)及輕鏈可變區域(VL
)。較其靠近C末端側之胺基酸序列,於各個類型或次類型係大致恆定,而稱為恆定區域,各結構域分別表記為CH1
、CH2
、CH3
或CL
。 抗體與抗原之結合的特異性,係依由重鏈可變區域及輕鏈可變區域所構成之部分的胺基酸序列所決定。另一方面,與補體或各種細胞之結合等的生物學活性,係反映各類型Ig的恆定區域之構造的差異。重鏈與輕鏈之可變區域之可變性,可知大致限定於不管於何種鏈均存在的3個小的超可變區域,此等區域稱為互補性決定區域(CDR;由N末端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域之剩餘部分稱為框架區域(FR),較為恆定。 抗體之重鏈恆定區域之CH1
結構域與CH2
結構域之間的區域稱為絞鏈(hinge)區域,該區域含有多量脯胺酸殘基,包含連接2條重鏈之複數個鏈間S-S鍵。例如,於人類之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各絞鏈區域,係各自包含構成重鏈間之S-S鍵的2個、4個、11個、2個之半胱胺酸殘基。絞鏈區域為對木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素的感受性高之區域。將抗體以木瓜蛋白酶消化時,重鏈係於較絞鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠N末端側之位置被切斷,分解為2個Fab片段與1個Fc片段。Fab片段係由輕鏈,與包含重鏈可變區域、CH1
結構域與絞鏈區域之一部分的重鏈片段所構成。Fab片段包含可變區域,具有抗原結合活性。 <本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段> 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段中,包含具有以下之特徴的Fab片段: 包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之重鏈片段及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域,可選擇Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等之任意恆定區域。於1個實施形態中,本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈恆定區域,為人類Igγ1恆定區域。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域,可選擇Igλ或Igκ之任意恆定區域。於1個實施形態中,本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈恆定區域,為人類Igκ恆定區域。 於1個實施形態中,本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,為以下之Fab片段: 包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 包含Fab片段,使抗體於細胞表現時,已知抗體於轉譯後會受到修飾。轉譯後修飾之例子,可列舉將重鏈C末端之離胺酸以羧基胜肽酶切斷、將重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺或麩胺酸以焦麩胺醯化修飾為焦麩胺酸、糖苷化、氧化、脫醯胺化、糖化等,於各種抗體中,已知如此的轉譯後修飾會產生(J. Pharm. Sci.,2008;97:2426-2447)。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段中,亦可包含藉由轉譯後修飾所產生之Fab片段。可藉由轉譯後修飾產生之本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段的例子,可列舉重鏈N末端經焦麩胺醯化之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。以如此之N末端之焦麩胺醯化所進行的轉譯後修飾,於該領域中已知對抗體之活性不造成顯著影響(Anal. Biochem.;2006;348:24-39)。 於1個實施形態中,本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,為具有下述特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段: 包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈可變區域之重鏈片段,及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 於別的實施形態中,本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,為具有下述特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段: 包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈片段,及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。 本發明中,亦包含具有以下特徴之抗人類CEACAM5抗體Fab片段: 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其包含:含有包含序列編號2之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1、序列編號2之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2,及序列編號2之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域之重鏈片段,以及含有包含序列編號4之胺基酸編號24至38之胺基酸序列所構成之CDR1、序列編號4之胺基酸編號54至60之胺基酸序列所構成之CDR2,及序列編號4之胺基酸編號93至101之胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域之輕鏈。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,係結合於人類CEACAM5。作為測定所得到的抗人類CEACAM5抗體Fab片段對人類CEACAM5之結合活性的方法,係有以表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance;SPR)法之解析或ELISA等之方法。例如,使用以SPR法進行的解析時,可藉由使用Biacore T200(GE Healthcare Japan公司),將Biotin CAPture Kit(GE Healthcare Japan公司)與經生物素化之人類CEACAM5固相化於感測晶片,並添加經階段稀釋之Fab片段,來測定結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd),及解離常數(KD
)。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,可基於本說明書揭示的本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈之序列資訊,使用該領域中週知之方法,由所屬技術領域中具有通常知識者容易地製作。本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,並無特殊限定,例如可遵照後述<生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法>之方法來生產。 <本發明之複合體> 本發明之複合體,為包含標誌部與本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。 「標誌部」係指(i)配位子及連結子、(ii)配位子、(iii)螢光色素及連結子,或(iv)螢光色素。作為一態樣,可列舉(i)配位子及連結子,或(ii)配位子。作為一態樣,可列舉(iii)螢光色素及連結子。作為一態樣,可列舉(i)配位子及連結子。「標誌部」之配位子亦可進一步含有金屬,作為一態樣,係含有金屬之(i)配位子及連結子,或含有金屬之(ii)配位子,作為別的態樣,係(i)與金屬形成螯合錯合物之配位子及連結子,或(ii)與金屬形成螯合錯合物之配位子。 含有金屬、螢光色素或非金屬放射性同位素之本發明之複合體,可用於各種造影劑等,例如可用於MRI造影劑、PET追蹤劑、經螢光標誌之分子造影劑等。 本說明書中,「金屬」意指順磁性金屬離子或金屬放射性同位素。金屬只要係配位結合於各配位子的金屬則無特殊限制。係依複合體之使用目的,選擇週知之適當的配位子與金屬之組合。 順磁性金屬離子可適合使用於MRI造影劑。順磁性金屬離子之態樣可列舉Fe2+
、Fe3+
、Cu2+
、Ni2+
、Rh2+
、Co2+
、Gd3+
、Eu3+
、Dy3+
、Tb3+
、Pm3+
、Nd3+
、Tm3+
、Ce3+
、Y3+
、Ho3+
、Er3+
、La3+
、Yb3+
、Mn3+
,或Mn2+
,但不限定於此等。作為一態樣,可列舉Gd3+
、Mn3+
、Mn2+
、Fe2+
,或Fe3+
。作為一態樣,可列舉Mn3+
或Mn2+
。此時,於複合體可使用鹵素等作為相對陰離子。又,相對陰離子可為配位子之C(=O)O-
,再者複合體亦可具有Na+
等之相對陽離子。 金屬放射性同位素例如可使用於PET追蹤劑等。金屬放射性同位素之態樣,可列舉89
Zr、51
Mn、52
Fe、60
Cu、67
Ga、68
Ga、72
As、99m
Tc,或111
In,但不限定於此等。作為一態樣,可列舉89
Zr、60
Cu、67
Ga、68
Ga、99m
Tc,或111
In。作為一態樣,可列舉鋯之放射性同位素。作為一態樣可列舉89
Zr。 「配位子」係指本複合體中,可與金屬形成螯合錯合物的部分,作為一態樣,意指由螯合劑所構成之基。所構成之基係指由螯合劑去除質子,而具有鍵結部位之基。 「螯合劑」係指可與金屬配位結合之化合物。 「螯合劑」可列舉載鐵體與非載鐵體。作為又一態樣,可列舉MAG3(巰基乙醯基-甘胺醯基-甘胺醯基-甘胺酸、CAS編號:66516-09-4),及其週知的反應性衍生物。載鐵體可列舉羥胺酸型、兒茶酚型,或混合配位子型。羥胺酸型載鐵體,例如可列舉含鐵色素、下式:表示之去鐵胺(DFO)、鐮菌胺酸C、ornibactin、紅酵母酸(rhodotorulic acid),及此等之週知的反應性衍生物。兒茶酚型載鐵體,例如可列舉腸菌素、桿菌素(bacillibactin)、弧菌素(vibriobactin),及此等之週知的反應性衍生物。混合配位子型載鐵體,例如可列舉固氮菌素(azotobactin)、螢綠素、耶爾森菌素(yersiniabactin),及此等之週知的反應性衍生物。再者,上述載鐵體的情況時,DFO可透過其反應性官能基的-NH2
與連結子或Fab片段反應,DFO以外之載鐵體的情況時,亦可透過羧基、羥基、胺基等之反應性官能基,以所屬技術領域中具有通常知識者通常使用之方法與連結子或Fab片段反應。 非載鐵體可列舉DTPA(二乙三胺五乙酸、CAS編號:67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-雙(甲基胺甲醯基甲基)-1,4,7-三氮雜庚烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號:119895-95-3)、EOB-DTPA(乙氧基苄基DTPA、2-[[(2S)-2-[雙(羧基甲基)胺基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-[2-[雙(羧基甲基)胺基]乙基]胺基]乙酸)、TTHA(三乙四胺六乙酸、CAS編號:869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號:217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羥基丙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS編號:120041-08-9)、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸、CAS編號:60239-18-1),及此等之週知的反應性衍生物。 再者,本說明書中之化合物及複合體,只要無特別記載,則亦包含游離體(free body)及其鹽。此處「其鹽」,依其化合物及複合體之取代基的種類,可能有形成酸加成鹽或與鹼之鹽的情況,其係其化合物及複合體可形成之鹽。具體而言,可列舉與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等之無機酸,或甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、苦杏仁酸、酒石酸、二苄醯基酒石酸、二甲苯甲醯基酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、天門冬胺酸、麩胺酸等之有機酸之酸加成鹽;與鈉、鉀、鎂、鈣、鋁等之無機鹼,或甲胺、乙胺、乙醇胺、離胺酸、鳥胺酸等之有機鹼之鹽;與乙醯基白胺酸等之各種胺基酸及胺基酸衍生物之鹽或銨鹽等。例如,DFO亦作為去鐵胺甲磺酸鹽存在,亦作為其他鹽而存在。DTPA,作為游離體,亦作為鈉鹽而存在。 作為用於MRI造影劑時的「螯合劑」之一態樣,係上述之載鐵體及非載鐵體螯合劑。 作為用於PET追蹤劑時的「螯合劑」之一態樣,係上述之載鐵體及非載鐵體螯合劑,進而作為一態樣,係MAG3。作為一態樣,係DFO。 作為形成本發明之複合體中所含的配位子的「螯合劑」之一態樣,可列舉DFO、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A、DOTA。作為一態樣,可列舉DFO、DTPA、DOTA。作為一態樣,可列舉DFO。 「連結子」係指於抗人類CEACAM5抗體Fab片段與配位子之間作出距離之基。作為複合體中之「連結子」之一態樣,可列舉 下式:(以下表記為-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)、 -CH2
-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-、-C(=O)-(C1-20
伸烷基)-C(=O)-。此處「C1-20
伸烷基」,係指直鏈或分支之碳數1~20之伸烷基。作為C1-20
伸烷基之一態樣,可列舉C1-10
伸烷基、C1-2
伸烷基。作為C1-20
伸烷基之一態樣,可列舉伸乙基。作為一態樣,可列舉-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-。作為一態樣,可列舉-C(=O)-C2
H4
-C(=O)-。作為可使用於形成連結子之試藥,可列舉HO-C(=O)-(C1-20
伸烷基)-C(=O)-OH、琥珀酸、對苯二異硫氰酸酯等。 含有螢光色素之本發明之複合體,可作為經螢光標誌之分子造影劑使用。 本發明之複合體所用的螢光色素,可使用在光造影通常所用的於近紅外波長(650~1000nm)具有極大吸收及極大發光之色素。作為螢光色素之一態樣,可列舉花青(cyanine)或吲哚花青(indocyanine)化合物。作為一態樣,可列舉IRDye800CW(LI-COR公司)、Cy(Molecular Probe公司)、Alexa Fluor、BODIPY,及DyLight(Thermo Fisher Scientific公司)、CF790(Biotium公司)、DY(DYOMICS GMBH公司)、HiLyte Fluor680,及HiLyte Fluor750 (Anaspec公司)、PULSAR650,及QUASAR670(Biosearch Technologies公司)等。作為一態樣,可列舉IRDye800CW。再者,螢光色素,可透過其羧基、羥基、胺基等,或以所屬技術領域中具有通常知識者通常所使用之方法導入活性化基,來與Fab片段或連結子反應。作為經導入活性化基之螢光色素之一態樣,可列舉經N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基酯化之螢光色素。例如,上述IRDye800CW之NHS酯係有市售,可利用該等。 含有非金屬放射性同位素之本發明之複合體,可作為PET追蹤劑使用。 本發明之複合體所用之非金屬放射性同位素,可列舉18
F、11
C、15
O、13
N。作為一態樣,可列舉18
F。含有非金屬放射性同位素之化合物的鍵結,例如可使用N-琥珀醯亞胺基4-[18
F]氟安息香酸([18
F]SFB)。 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與標誌部之鍵結,可藉由週知之手法,由所屬技術領域中具有通常知識者適當地進行。例如,可使標誌部鍵結於本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之1個以上之胺基(例如N末端胺基或胺基酸側鏈之胺基)、1個以上之硫醇基(例如胺基酸側鏈之硫醇基),或1個以上之羧基(例如C末端或胺基酸之側鏈之羧基)。作為一態樣,本發明之複合體,為標誌部鍵結於本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之1個以上之胺基的複合體。 當標誌部為配位子及連結子時,亦可使形成配位子之螯合劑與使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與連結子反應所得到的物質反應來生產本發明之複合體。亦可使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與使連結子與形成配位子之螯合劑反應所得到的物質反應來生產。反應例子可列舉將使螯合劑之胺基與連結子反應所得到的物質,與本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之1個以上之胺基(例如N末端胺基或離胺酸側鏈之胺基)反應。標誌部為配位子時,亦可使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與形成配位子之螯合劑反應來生產。反應例子可列舉使螯合劑與本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之1個以上之胺基(例如N末端胺基或離胺酸側鏈之胺基)反應。本發明之複合體的生產,可使用對胺添加異硫氰酸酯以合成硫脲之反應,或對胺添加羧酸以合成醯胺之反應等。該反應可藉由應用所屬技術領域中具有通常知識者所週知之方法來進行。再者,亦可使用預先使配位子與連結子鍵結的化合物,作為原料。使配位子與連結子鍵結的化合物之例子,可列舉以下之式表示之p-SCN-Bn-DFO(p-異硫氰基苯基胺基硫羰基取代DFO、CAS編號:1222468-90-7)、p-異硫氰基苄基取代DTPA(p-SCN-Bn-DTPA、CAS編號:102650-30-6)、p-異硫氰基苄基取代DOTA(p-SCN-Bn-DOTA、CAS編號:127985-74-4),及p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA([(R)-2-胺基-3-(4-異硫氰酸酯苯基)丙基]-反-(S,S)-環己烷-1,2-二胺-五乙酸、CAS編號:157380-45-5)。 例如,本發明之複合體,可使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之1個以上之胺基(例如N末端胺基或胺基酸之側鏈之胺基),與具有異硫氰酸基之標誌部反應,作為隔著胺基而鍵結有1個以上之標誌部的Fab片段之複合體來生產。 對藉由上述生產方法所生產的鍵結有1個以上之標誌部的本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段添加金屬(順磁性金屬離子或金屬放射性同位素),可得到含有金屬之本發明之複合體。 本發明之複合體,為1個以上之標誌部鍵結於本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。本發明之複合體,作為一態樣,係與1~25個標誌部鍵結、作為一態樣,係與1~23個標誌部鍵結、作為一態樣係與1~16個標誌部鍵結、作為一態樣係與1~11個標誌部鍵結、作為一態樣係與1~10個標誌部鍵結、作為一態樣係與1~9個標誌部鍵結、作為一態樣係與4~23個標誌部鍵結、作為一態樣係與4~16個標誌部鍵結、作為一態樣係與4~10個標誌部鍵結、作為一態樣係與4~9個標誌部鍵結、作為一態樣係與3~23個標誌部鍵結、作為一態樣係與3~16個標誌部鍵結、作為一態樣,係與3~10個標誌部鍵結、進而作為一態樣係與3~9個標誌部鍵結之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。本發明之複合體,作為一態樣,係進一步含有金屬的與1個以上之標誌部鍵結之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。作為本發明之複合體之一態樣,亦可為鍵結之標誌部的數目不同之複合體的混合物。 作為1個實施形態,本發明之複合體,為包含標誌部與本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。 作為一實施形態,本發明之複合體,為標誌部為(i)配位子及連結子,或(ii)配位子之複合體。 作為一實施形態,本發明之複合體,為標誌部為(i)配位子及連結子,或(ii)配位子,且該配位子為下式(A)表示之配位子的複合體:式中,波浪線表示對於抗人類CEACAM5抗體Fab片段或連結子之鍵結。 作為一實施形態,本發明之複合體,為標誌部為(i)配位子及連結子,且該配位子及連結子為下式(A’)表示之基的複合體:式中,波浪線表示對於抗人類CEACAM5抗體Fab片段之鍵結。 作為一實施形態,本發明之複合體,為標誌部為式(A’)表示之基,且抗人類CEACAM5抗體Fab片段,係透過該Fab片段中之胺基,與標誌部末端之C(=S)基的碳原子鍵結的複合體。 作為一實施形態,本發明之複合體,為下式(I)表示之複合體:式中,Ab為本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段, L為配位子, X為連結子或鍵結, p為1~25之自然數,作為p之一態樣係1~23之自然數、作為一態樣係1~16之自然數、作為一態樣係1~11之自然數、作為一態樣係1~10之自然數、作為一態樣係1~9之自然數、作為一態樣係4~23之自然數、作為一態樣係4~16之自然數、作為一態樣係4~10之自然數、作為一態樣係4~9之自然數、作為一態樣係3~23之自然數、作為一態樣係3~16之自然數、作為一態樣係3~10之自然數,進而作為一態樣係3~9之自然數。 作為一實施形態,本發明之複合體,係 L為下式(A)表示之配位子的式(I)之複合體:式中,波浪線表示對於X(惟,X為鍵結時係對Ab)之鍵結。 作為式(I)之複合體之一實施形態,為下式(II)表示之複合體:式中,Ab為本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段, p為1~25之自然數,作為p之一態樣係1~23之自然數、作為一態樣係1~16之自然數、作為一態樣係1~11之自然數、作為一態樣係1~10之自然數、作為一態樣係1~9之自然數、作為一態樣係4~23之自然數、作為一態樣係4~16之自然數、作為一態樣係4~10之自然數、作為一態樣係4~9之自然數、作為一態樣係3~23之自然數、作為一態樣係3~16之自然數、作為一態樣係3~10之自然數,進而作為一態樣係3~9之自然數,且 Ab係透過該Ab中之胺基,與標誌部末端之C(=S)的碳原子鍵結。 作為一實施形態,本發明之複合體,為式(I)之複合體,且係進一步含有金屬之複合體。作為金屬之一態樣,可列舉金屬放射性同位素。作為金屬放射性同位素之一態樣,可列舉89
Zr。 作為一實施形態,本發明之複合體,為式(II)之複合體,且係進一步含有金屬複合體。作為金屬之一態樣,可列舉金屬放射性同位素。作為金屬放射性同位素之一態樣,可列舉89
Zr。 本發明之複合體中,亦包含複數種之複合體的混合物之複合體。例如,包含標誌部與未受轉譯後修飾之本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段的複合體,及包含標誌部與藉由前述抗人類CEACAM5抗體Fab片段的轉譯後修飾所產生之本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段的複合體之混合物的複合體,亦包含於本發明之複合體中。 複數種之本發明之複合體的混合物之本發明之複合體的一實施形態如以下所示: (1)一種複合體,其係以下複合體之混合物:標誌部為式(A’)表示之配位子及連結子,且抗人類CEACAM5抗體Fab片段,為包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體;以及標誌部為式(A’)表示之配位子及連結子,且抗人類CEACAM5抗體Fab片段,為包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段且係序列編號2之胺基酸編號1之麩醯胺被修飾為焦麩胺酸之重鏈片段,及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體。 (2)如(1)之複合體,其進一步含有金屬。 (3)一種複合體,其係進一步含有金屬的如(1)之複合體及不含金屬的如(1)之複合體的混合物。 (4)如(2)~(3)之複合體,其中金屬為金屬放射性同位素。 (5)如(4)之複合體,其中金屬放射性同位素為89
Zr。 <本發明之多核苷酸> 本發明之多核苷酸,包含:包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸,及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 於1個實施形態中,本發明之多核苷酸,為包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,或包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸。 包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,例如可列舉包含序列編號1之鹼基編號1至363的鹼基序列之多核苷酸。 包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸,例如可列舉包含序列編號3之鹼基編號1至336的鹼基序列之多核苷酸。 於較佳之實施形態中,本發明之多核苷酸,為包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸,或包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。 包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸,例如可列舉包含序列編號1所示之鹼基序列的多核苷酸。 包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸,例如可列舉包含序列編號3所示之鹼基序列的多核苷酸。 本發明之多核苷酸,可基於基於本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列所設計的鹼基序列,利用於該技術領域週知之基因合成方法來合成。如此之基因合成方法,可使用國際公開第90/07861號記載的抗體基因之合成方法等之所屬技術領域中具有通常知識者週知之各種方法。 <本發明之表現載體> 本發明之表現載體,包含:含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體,以及含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。 較佳之本發明之表現載體,包含:含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體、含有包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體,以及含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體。 較佳之本發明之表現載體,包含:含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體、含有包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體,以及含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體。 本發明之表現載體,只要可於原核細胞及/或真核細胞之各種宿主細胞中產生本發明之多核苷酸所編碼的多胜肽者則無特殊限制。如此之表現載體,例如可列舉質體載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)等,較佳可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。 本發明之表現載體,可包含可發揮功能地連結於本發明之多核苷酸之編碼重鏈片段及/或輕鏈的基因之啟動子。用以於宿主細胞中表現本發明之Fab片段的啟動子,宿主細胞為大腸桿菌屬(Escherichia)菌時例如可列舉Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。於酵母中之表現用啟動子,例如可列舉PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子,於芽胞桿菌屬(Bacillus)菌中之表現用啟動子,可列舉SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又,宿主為哺乳動物細胞等之真核細胞時,可列舉CMV、RSV、SV40等之源自病毒的啟動子、反轉錄病毒之啟動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factor)1α啟動子、熱休克啟動子等。 本發明之表現載體,使用細菌、特別是大腸菌作為宿主細胞時,可進一步包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域及可複製單位。另一方面,使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主時,本發明之表現載體,可包含起始密碼子、終止密碼子。又,此時,亦可包含增強子序列、編碼本發明之重鏈片段及/或輕鏈的基因之5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊號序列、剪接(splicing)接合部、多腺苷酸化部位,或可複製單位等。又,亦可依目的包含通常所使用的選擇標記(例如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、康黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。 <本發明之經轉形之宿主細胞> 本發明之經轉形之宿主細胞,包含選自由以下之(a)~(d)所成之群的經本發明之表現載體轉形之宿主細胞。 (a)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (c)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (d)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 於1個實施形態中,本發明之經轉形之宿主細胞,為選自由以下之(a)~(d)所成之群的經本發明之表現載體轉形之宿主細胞: (a)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞; (c)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞;以及 (d)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體及含有包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。 於1個實施形態中,本發明之經轉形之宿主細胞,為選自由以下之(a)~(d)所成之群的經本發明之表現載體轉形之宿主細胞: (a)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (c)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (d)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 較佳的本發明之經轉形之宿主細胞,可列舉經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,以及經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 所轉形之宿主細胞,只要適合所使用之表現載體,可被該表現載體轉形而表現Fab片段者則無特殊限定,例示有本發明之技術領域中通常使用的天然細胞或人工建立之細胞等各種細胞(例如細菌(大腸桿菌屬菌、芽胞桿菌屬菌)、酵母(酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)等)、動物細胞或昆蟲細胞(例如Sf9)等)、哺乳動物細胞株(例如CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等之培養細胞)。轉形本身可藉由例如磷酸鈣法、電穿孔法等週知之方法進行。 <生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法> 生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟。 於1個實施形態中,生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法中所培養的本發明之經轉形之宿主細胞,係選自由以下之(a)至(c)所成之群: (a)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 作為一態樣,生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法中所培養的本發明之經轉形之宿主細胞,係選自由以下之(a)至(c)所成之群: (a)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸及包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體及含有包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼含有序列編號2之胺基酸編號1至121所示之胺基酸序列所構成之重鏈可變區域的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼含有序列編號4之胺基酸編號1至112所示之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞。 作為一態樣,生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法中所培養的本發明之經轉形之宿主細胞,係選自由以下之(a)至(c)所成之群: (a)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞; (b)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 較佳為,所使用的本發明之經轉形之宿主細胞,為經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,或經含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。 生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法中,經轉形之宿主細胞,可於營養培養基中培養。營養培養基,較佳為含有經轉形之宿主細胞生長所必要的碳源、無機氮源或有機氮源。碳源例如例示有葡萄糖、葡聚糖、可溶性澱粉、蔗糖等;無機氮源或有機氮源例如例示有銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。又,亦可依期望含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如四環黴素、新黴素、安比西林、康黴素等)等)。 經轉形之宿主細胞的培養本身,係藉由週知之方法進行。培養條件,例如溫度、培養基之pH及培養時間,係適當選擇。例如,宿主為動物細胞時,培養基可使用含有約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science;1952;122:501)、DMEM培養基(Virology;1959;8:396-397)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.;1967;199:519-524)、199培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.;1950;73:1-8)等。培養基之pH較佳為約6~8,培養通常於約30~40℃進行約15~336小時,亦可依需要進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時,例如可列舉含有胎牛血清之Grace’s培養基(PNAS;1985;82:8404-8408)等,其pH較佳為約5~8。培養通常於約20~40℃進行15~100小時,亦可依需要進行通氣或攪拌。宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀菌時,例如以含有上述營養源之液體培養基為適當。較佳為pH為5~8的培養基。宿主為E.coli時,較佳之培養基例示有LB培養基、M9培養基(Miller等、Exp.Mol.Genet,Cold Spring Harbor Laboratory;1972:431)等。此時,培養可依需要在通氣、攪拌下,通常於14~43℃進行約3~24小時。宿主為Bacillus屬菌時,可依需要在通氣、攪拌下,通常於30~40℃進行約16~96小時。宿主為酵母時,培養基例如可列舉Burkholder最小培養基(PNAS;1980;77:4505-4508),pH較期望為5~8。培養通常於約20~35℃進行約14~144小時,亦可依需要進行通氣或攪拌。 生產本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,除了培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟以外,可包含將所表現之抗人類CEACAM5抗體Fab片段回收,較佳為單離、純化之步驟。單離、純化方法,例如可列舉鹽析、溶劑沈澱法等之利用溶解度的方法;透析、超微過濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量差的方法;離子交換層析或羥基磷灰石層析等之利用電荷的方法;親和性層析等之利用特異親和性的方法;逆相高速液體層析等之利用疏水性差的方法;等電點電泳等之利用等電點差的方法等。 <生產本發明之複合體之方法> 生產本發明之複合體之方法,包含使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟。又,生產本發明之複合體之方法,亦可包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟。又,生產本發明之複合體之方法,亦可包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、將所表現之該Fab片段回收之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟。所使用的連結子、配位子,或螢光色素等,及連結之方法,可使用<本發明之複合體>中記載者。 於1個實施形態中,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟的方法。作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、將所表現之該Fab片段回收之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟的方法。 作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段i)與配位子透過連結子鍵結或ii)與配位子直接共價鍵結之步驟的方法。作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、將所表現之該Fab片段回收之步驟,及使該Fab片段i)與配位子透過連結子鍵結或ii)與配位子直接共價鍵結之步驟的方法。 作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、使該Fab片段與配位子透過連結子或直接共價鍵結之步驟,及使金屬配位結合於該複合體之配位子(亦即,形成螯合錯合物)之步驟的方法。作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、將所表現之該Fab片段回收之步驟、使該Fab片段與配位子透過連結子或直接共價鍵結之步驟,及使金屬配位結合於該複合體之配位子之步驟的方法。 作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、使該Fab片段與配位子透過連結子或直接共價鍵結之步驟,及使金屬放射性同位素配位結合於該複合體之配位子之步驟(亦即,形成螯合錯合物)的方法。作為一態樣,生產本發明之複合體之方法,為包含培養本發明之經轉形之宿主細胞,表現抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟、將所表現之該Fab片段回收之步驟、使該Fab片段與配位子透過連結子或直接共價鍵結之步驟,及使金屬放射性同位素配位結合於該複合體之配位子之步驟的方法。 生產本發明之複合體之方法,可作為包含上述特定之2個以上之步驟作為一系列步驟的方法來實施,亦可作為包含上述特定之至少1個步驟的方法來實施。例如,包含使本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段與標誌部鍵結之步驟的方法,及包含以金屬標誌鍵結有標誌部的本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟的方法,也包含於生產本發明之複合體之方法中。又,生產本發明之複合體之方法,亦包含步驟之順序不同的方法。例如,將配位子以金屬放射性同位素標誌後,使該配位子與本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段共價鍵結之方法,亦包含於生產本發明之複合體之方法中。 <本發明之診斷用組成物、診斷方法> 本發明關於一種診斷用組成物,其包含含有螢光色素、金屬或非金屬放射性同位素的本發明之複合體(以下,稱為可檢測之本發明之複合體)。可檢測之本發明之複合體,可遵照常規方法而製劑化,而利用作為病期診斷藥(特別是癌的診斷)。病期診斷藥,意指可檢查病狀進行至何種程度的診斷藥。例如就癌而言,意指可檢查其分期的診斷藥。期待可藉由本發明之診斷用組成物來診斷之癌,係選自由大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌及此等經轉移之癌所成之群。較佳為該癌係大腸癌或大腸癌經轉移之癌。更佳為該癌係大腸癌經轉移之癌,如此之癌係包含轉移性肝癌。 本發明之診斷用組成物之製劑化時的可檢測之本發明之複合體的添加量,係依患者之症狀的程度或年齡、所使用之製劑的劑型,或Fab片段之結合力價等而異,但例如以患者之每單位體重的Fab片段之質量基準計,係使用0.001mg/kg至100mg/kg左右即可。 本發明之診斷用組成物之劑型的例子,可列舉注射劑、點滴用劑等之非經口劑,較佳為藉由靜脈內注射、對標的局部之肌肉內注射、皮下注射等來給與。又,製劑化時,可於藥學上容許的範圍,使用因應此等劑型之承載體或添加劑。藥學上容許的承載體或添加劑之種類並無特殊限定,可使用所屬技術領域中具有通常知識者所週知之承載體或添加劑。 又,本發明係關於一種可檢測之本發明之複合體之使用,其係用於生產癌之診斷用組成物,作為一態樣,係用於生產病期診斷用組成物。本發明亦關於一種可檢測之本發明之複合體,其係使用於癌的診斷,作為一態樣,係使用於病期診斷。 此外,本發明亦關於一種癌之診斷方法,其包含將可檢測之本發明之複合體,於手術前或手術中對對象給與。此處,「對象」係指必需接受該診斷之人類或其他哺乳動物,作為一態樣,係必需接受該診斷之人類。本發明之診斷方法中的可檢測之本發明之複合體的有效量,亦可為與上述製劑化時的可檢測之本發明之複合體的有效量相同之量。本發明之診斷方法中,可檢測之本發明之複合體,較佳為藉由靜脈內注射等來給與。使用作為PET追蹤劑之本發明之複合體,可於給與起1.5~48小時後、作為一態樣係2~48小時後、作為一態樣係4~24小時後、作為一態樣係4~6小時後、作為一態樣係1.5~6小時後以PET攝影。本發明之診斷方法中,將經螢光標誌之本發明之複合體使用於術中診斷時,該複合體例如係於手術之2~48小時前、較佳為4小時前對患者給與。 於別的實施形態中,本發明亦關於一種本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之使用,其係用於生產本發明之複合體。作為一態樣,本發明亦關於一種本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之使用,其係用於生產包含本發明之複合體的診斷用組成物。 全面地記載了本發明,為了進一步得到理解,於此提供所參照的特定實施例。但是,此等係為例示目的者,並非限定本發明者。 [實施例] (實施例1:抗人類CEACAM5抗體Fab片段之製作) 將來自小鼠之抗人類CEACAM5抗體T84.66,參考文獻(Protein Eng.Des.Sel.;2004;17:481-489)之方法予以人類化後,使用根據文獻(Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics;2014;82:1624-1635)所構築之人類化抗體之分子模式,設計具有期待即使鍵結標誌部,親和性亦不減弱之可變區域的抗體。 於前述抗體之重鏈可變區域基因之5’側連結編碼訊號序列(Protein Engineering;1987;1:499-505)的基因,而於3’側連結人類Igγ1之Fab區域基因(序列編號1之鹼基編號364至678之鹼基序列所構成),將該重鏈片段基因插入GS載體pEE6.4(Lonza公司)。又,於抗體之輕鏈可變區域基因之5’側連結編碼訊號序列的基因,而於3’側連結人類Igκ之恆定區域基因(序列編號3之鹼基編號337至657之鹼基序列所構成),將該輕鏈基因插入GS載體pEE12.4(Lonza公司)。將分別插入有抗體之重鏈片段與輕鏈之基因的前述pEE載體以NotI與PvuI限制酵素切斷,使用接合(ligation)用套組TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara公司)進行接合,構築插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因的GS載體。 使用前述之插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因的GS載體,以暫時性(transient)表現及持續性表現之2種方法進行抗體表現。關於暫時性表現,係對以Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scintific公司)培養至約300萬個/mL的Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司),使用ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific公司)轉染前述之插入有重鏈片段與輕鏈之兩基因的GS載體,培養5~7日。將培養上清液使用KappaSelect (GE Healthcare Japan公司)純化,得到Fab片段。關於持續性表現,係將插入有以PvuI成為直鏈的前述之重鏈片段與輕鏈之兩基因的GS載體以使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)的電穿孔法對CHOK1SV細胞(Lonza公司)進行轉染。轉染翌日添加甲硫胺酸磺亞胺(methionine sulfoximine),培養5~7日。於含有甲基纖維素之半固形培養基播種細胞,於群落形成後使用ClonePix FL(Molecular Devices公司)取得Fab片段之表現量多的細胞。將該細胞之培養上清液使用Capto L(GE Healthcare Japan公司)、Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Japan公司),及BioPro S75(YMC公司)純化,得到Fab片段。 將編碼所製作之抗人類CEACAM5抗體Fab片段(稱為PB009-01)之重鏈片段的鹼基序列示於序列編號1、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號2、編碼PB009-01之輕鏈的鹼基序列示於序列編號3、被其所編碼之胺基酸序列示於序列編號4。PB009-01之重鏈可變區域,係由序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成,重鏈之CDR1、CDR2、CDR3,係分別由序列編號2之胺基酸編號31至35、50至66、99至110之胺基酸序列所構成。PB009-01之輕鏈可變區域,係由序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成,輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3,係分別由序列編號4之胺基酸編號24至38、54至60、93至101之胺基酸序列所構成。 再者,可變區域及CDR序列係遵照Kabat編號來決定(Kabat等人、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda)。 (實施例2:Fab片段複合體之生產) 螯合劑DFO對Fab片段PB009-01之鍵結,係使用p-SCN-Bn-DFO(p-異硫氰基苯基胺基硫羰基取代DFO) (Macrocyclics公司)。於以磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)配製為1mg/mL之Fab片段溶液中,添加1/5量之0.1M碳酸鈉溶液(pH9.0)。以終濃度成為1mg/mL的方式於其中添加p-SCN-Bn-DFO,於37℃反應1小時半。反應後,使用Amicon Ultra 3K-0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司),純化DFO透過連結子(-C(=S)-NH-(1,4-伸苯基)-NH-C(=S)-)而鍵結的Fab片段(稱為PB009-02)。 對於PB009-02,以質譜分析確認由DFO構成之配位子的鍵結數。將PB009-02,使用MassPREP Micro Desalting Column(Waters公司)脫鹽,使用SYNAPT G2質譜分析計(Waters公司)實施測定。其結果,確認到於1個PB009-01至少鍵結有3個至10個由DFO所構成之配位子的分子。 (實施例3:鍵結活性評估) 為了詳細測定PB009-02之鍵結活性,以SPR法進行解析。本實施例中,使用T84.66之人類化抗體M5A之Fab片段(稱為M5A-Fab)作為比較Fab片段。透過連結子鍵結有DFO之M5A-Fab(稱為M5A-Fab-DFO),係使用實施例2記載之方法製作。 使用Biacore T200(GE Healthcare Japan公司)以SPR法進行解析。於感測晶片之表面,以流速5μL/min添加經Biotin CAPture Kit、Series S(GE Healthcare Japan公司)與Biotin Labeling Kit-NH2
(同仁化學研究所)生物素化之10μg/mL之人類CEACAM5(R&DSystems公司)2分鐘並固相化。將PB009-01、PB009-02、M5A-Fab及M5A-Fab-DFO,以HBS-EP+溶液(GE Healthcare Japan公司)由400nM起以2倍公比進行6階段稀釋,以流速50μL/min,分別添加100μL於流道中。藉由該測定系統,使用數據解析軟體(BIA Evaluation、GE Healthcare Japan公司)分別計算PB009-01、PB009-02、M5A-Fab或M5A-Fab-DFO與人類CEACAM5之解離常數(KD
)。其結果,如下表所示,確認到M5A-Fab因DFO之鍵結,而結合活性減弱,相對於此,PB009-01不因DFO之鍵結而使結合活性減弱。(實施例4:鍵結有DFO之Fab片段複合體的89
Zr標誌)89
Zr係作為Zr-Oxalate由3D Imaging LLC公司購入。將20μL之Zr-Oxalate(2.6mCi)以2M之碳酸鈉10μL中和後,添加5mg/mL之龍膽酸20μL。進一步地,添加含有0.05%之聚山梨醇酯80的20mM之HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)110μL。添加40μL之10mg/mL之PB009-02,於室溫反應30分鐘後,進一步於37℃反應30分鐘。反應後,使用Amicon Ultra 10K-0.5mL離心式濾器(Merck Millipore公司),純化經89
Zr標誌之PB009-02(稱為PB009-03)。 (實施例5:複合體之於皮下移植模式的造影評估) 對免疫不全小鼠(NOG小鼠;Taconic Biosciences公司)之右肩皮下,移植人類大腸癌細胞株LS174T細胞(ATCC(註冊商標);CL-188) 1×106
個細胞,作為人類CEACAM5陽性細胞,對左肩皮下移植人類大腸癌細胞株HCT-15細胞(ATCC(註冊商標);CCL-225)5×106
個細胞,作為人類CEACAM5陰性細胞。本實施例係以N=3實施。腫瘤體積成為約300mm3
後,將PB009-03(約20μg、約120μCi)進行靜脈給與。於PB009-03給與4小時後、24小時後及48小時後以PET攝影,測定腫瘤部分之SUV-Max。其結果,如圖1A所示,PB009-03,於給與4小時後,相較於人類CEACAM5陰性細胞之HCT-15細胞,於人類CEACAM5陽性細胞之LS174T細胞顯示較多累積。又,如圖1B所示,明顯可知PB009-03於給與4小時後至48小時後,可檢測出人類CEACAM5陽性之癌細胞。 (實施例6:複合體之於肝移植模式的造影評估) 於麻醉下對免疫不全小鼠(NSG小鼠;The Jackson Laboratory公司)之肝臟移植表現螢光素酶之LS174T細胞1×106
個細胞。本實施例係以N=6實施。以IVIS imaging system(PerkinElmer公司),以螢光素酶之表現為指標,確認細胞於肝臟存活後,將以與實施例4同樣之方法製作的PB009-03(約14μg、約100μCi)進行靜脈給與。於PB009-03給與4小時後及24小時後以PET攝影。分別測定肝臟及LS174T腫瘤(指移植之LS174T細胞於肝臟存活的狀態)之SUV-Max,算出相對於肝臟之SUV-Max而言,腫瘤之SUV-Max的比。其結果,如圖2A所示,PB009-03,於給與4小時後、顯示累積於存活於肝臟之LS174T腫瘤。又,於給與4小時後及24小時後,腫瘤相對於肝臟之訊號之比係圖2B所示之值。由此等明顯可知,PB009-03於給與4小時後及24小時後,可檢測出存在於肝臟的人類CEACAM5陽性之癌細胞。 [產業上之可利用性] 本發明之抗人類CEACAM5抗體Fab片段及該包含抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體,被期待有用於選自由大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌及此等經轉移之癌所成之群的癌之診斷。 [序列表非關鍵詞文字] 以下之序列表之數字標題<223>,係記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言,序列表之序列編號1及3表示之鹼基序列,分別為PB009-01之重鏈片段及輕鏈之鹼基序列,序列編號2及4表示之胺基酸序列,分別為被序列編號1及3編碼的重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列。
[圖1A] 圖1A為對將人類大腸癌細胞株LS174T細胞(人類CEACAM5陽性細胞)移植於右肩皮下,將人類大腸癌細胞株HCT-15細胞(人類CEACAM5陰性細胞)移植至左肩皮下的小鼠給與PB009-03,給與4小時後以PET攝影之代表性的影像。由於係攝影面朝下之小鼠,因此右側之圓表示移植LS174T細胞的小鼠右肩,左側之圓表示移植HCT-15細胞的小鼠左肩。右邊的槓表示對腫瘤之放射線累積量(Maximum Standardized Uptake Value;SUV-Max)。 [圖1B] 圖1B為表示對將人類大腸癌細胞株LS174T細胞(人類CEACAM5陽性細胞)移植於右肩皮下,將人類大腸癌細胞株HCT-15細胞(人類CEACAM5陰性細胞)移植至左肩皮下的小鼠給與PB009-03,於給與4小時後、24小時後及48小時後以PET攝影,進行影像解析之結果的圖。縱軸表示累積於腫瘤部的PB009-03之SUV-Max值。又,圖中之誤差槓表示平均值±標準差(MEAN±SEM)。 [圖2A] 圖2A為對將螢光素酶表現LS174T細胞(人類CEACAM5陽性細胞)移植於肝臟的小鼠給與PB009-03,給與4小時後以PET攝影之代表性的影像。箭頭表示經移植細胞之部分,右邊的槓表示SUV-Max值。 [圖2B] 圖2B為表示對將螢光素酶表現LS174T細胞(人類CEACAM5陽性細胞)移植於肝臟的小鼠給與PB009-03,於給與4小時後及24小時後以PET攝影,進行影像解析之結果的圖。縱軸表示累積於肝臟與腫瘤部的PB009-03之SUV-Max值之比(腫瘤/肝臟比)。又,圖中之誤差槓表示平均值±標準差(MEAN±SEM)。
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<223> DNA encoding andibody light chain
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
Claims (36)
- 一種抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群:(a)包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之重鏈片段,及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段;以及(b)包含含有序列編號2之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成的重鏈可變區域且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈可變區域之重鏈片段,及含有序列編號4之胺基酸編號1至112之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。
- 如請求項1之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群:(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段;以及(b)包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段且係序列編號2之胺基酸編號1之麩胺酸被修飾為焦麩胺酸的重鏈片段,及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈的抗人類CEACAM5抗體Fab片段。
- 如請求項2之抗人類CEACAM5抗體Fab片段,其包含序列編號2所示之胺基酸序列所構成之重鏈片段及序列編號4所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
- 一種複合體,其包含標誌部與如請求項1至3中任一項之抗人類CEACAM5抗體Fab片段。
- 如請求項4之複合體,其中標誌部為(i)配位子及連結子、(ii)配位子、(iii)螢光色素及連結子,或(iv)螢光色素。
- 如請求項5之複合體,其中標誌部為(i)配位子及連結子,或(ii)配位子。
- 如請求項8之複合體,其中抗人類CEACAM5抗體Fab片段,係透過該Fab片段中之胺基,與標誌部末端之C(=S)基的碳原子鍵結。
- 如請求項6之複合體,其係以下式(I)表示:(L-X)p-Ab (I)式中,Ab為抗人類CEACAM5抗體Fab片段,L為配位子,X為連結子或鍵結,及p為1~25之自然數。
- 如請求項10或11之複合體,其中p為1~16之自然數。
- 如請求項10或11之複合體,其中p為1~10之自然數。
- 如請求項5至11中任一項之複合體,其進一步含有金屬。
- 如請求項15之複合體,其中金屬為金屬放射性同位素。
- 如請求項15之複合體,其中金屬為89Zr。
- 如請求項16之複合體,其係作為PET追蹤劑而使用。
- 一種多核苷酸,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群:(a)包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸;及(b)包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
- 一種多核苷酸,其係選自由以下之(a)及(b)所成之群:(a)包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸;及(b)包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
- 一種表現載體,其包含以下之(a)及(b):(a)包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸、(b)包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
- 一種表現載體,其包含以下之(a)及(b):(a)包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸、(b)包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其係選自由以下之(c)至(d)所成之群:(c)經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及(d)經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
- 一種宿主細胞,其係選自由以下之(c)至(d)所成之群:(c)經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及(d)經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
- 一種生產抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,其包含培養選自由以下之(a)至(c)所成之群的宿主細胞,使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟:(a)經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;(b)經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及 (c)經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼如請求項1(a)之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
- 一種生產抗人類CEACAM5抗體Fab片段之方法,其包含培養選自由以下之(a)至(c)所成之群的宿主細胞,使抗人類CEACAM5抗體Fab片段表現之步驟:(a)經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸及包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;(b)經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體及含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞;以及(c)經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞,及經含有包含編碼如請求項3之抗人類CEACAM5抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之多核苷酸的表現載體轉形之宿主細胞。
- 一種生產包含標誌部與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由如請求項25或26之方法配製抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與標誌部共價鍵結之步驟。
- 一種生產包含配位子與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由如請求項25或26之方法配製抗人類CEACAM5抗體Fab片段之步驟,及使該Fab片段與配位子,透過連結子或直接共價鍵結之步驟。
- 一種生產包含經金屬放射性同位素標誌的標誌部與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之方法,其包含藉由如請求項28之方法生產包含配位子與抗人類CEACAM5抗體Fab片段之複合體之步驟,及使金屬放射性同位素配位結合於該複合體之配位子之步驟。
- 一種診斷用組成物,其包含如請求項15至18中任一項之複合體及藥學上容許的承載體。
- 如請求項30之診斷用組成物,其係病期診斷藥。
- 如請求項30或31之診斷用組成物,其係使用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷。
- 如請求項32之診斷用組成物,其係使用於大腸癌或大腸癌經轉移之癌的診斷。
- 如請求項33之診斷用組成物,其中大腸癌經轉移之癌為轉移性肝癌。
- 一種如請求項15至18中任一項之複合體之使用,其係用於生產大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷用組成物。
- 如請求項15之複合體,其係使用於大腸癌、乳癌、肺癌、甲狀腺癌或此等經轉移之癌的診斷。
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網路文獻 Stefanie Nittka et al, "Radioimmunoimaging of Liver Metastases with PET Using a 64Cu-Labeled CEA Antibody in Transgenic Mice.", PLoS One. 2014 Sep 16;9(9): e106921. |
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