CN110831977A - 新型抗人CEACAM5抗体Fab片段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供被期待对癌症的诊断、特别是大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断有用的抗人CEACAM5抗体Fab片段、以及使用包含该Fab片段的复合物的诊断手段。一种抗人CEACAM5抗体Fab片段和包含该Fab片段的复合物，所述抗人CEACAM5抗体Fab片段包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。

Description

新型抗人CEACAM5抗体Fab片段
技术领域
本发明涉及新型抗人CEACAM5抗体Fab片段。另外，本发明涉及包含该抗人CEACAM5抗体Fab片段的诊断用组合物、以及使用该Fab片段对癌症进行诊断的方法。
背景技术
CEA(Carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)或CEACAM(Carcinoembryonicantigen-related cell adhesion molecule，癌胚抗原相关细胞粘附分子)是在1965年发现的肿瘤标志物(J.Exp.Med.；1965；121:439-462、PNAS；1969；64:161-167)，到目前为止已明确了23个CEA相关分子(BioMedCentral Biology；2010；8:12-33)。其中，CEACAM5在正常组织中几乎未确认到表达，但在胎儿的消化道或大肠癌中表达(BBA；1990；1032:177-189、Mol.Pathol.；1999；52:174-178)。另外，已知CEACAM5在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌中也有表达(Diagn.Cytopathol.；1993；9:377-382、Cancer Res.；1990；50:6987-6994、Histopathology；2000；37:530-535)。
大肠癌患者与正常人相比，血中的CEACAM5的浓度增高(J.Exp.Med.；1965；121:439-462)，CEACAM5被用作肿瘤标志物。在大肠癌患者的组织学研究中，CEACAM5在90％以上的组织中高表达(British J.Cancer；2013；108:662-667)。
大肠癌的早期转移局限于肝脏，因此，若能早期发现肝转移并进行治疗，则能够降低复发率(Cell Mol.Gastroenterol.Hepatol.；2017；3:163-173)。肝转移的诊断使用CT(计算机断层扫描)、MRI(核磁共振成像)、FDG-PET(Fluorodeoxyglucose-positronemission tomography、氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描)。CT、MRI、FDG-PET的检测灵敏度分别为74.4、80.3、81.4％，就1cm以下的肿瘤而言，检测灵敏度在CT中为47.3％、在MRI中降低至60.2％(Radiology；2010；257:674-684)。也使用肝特异性造影剂MRI，对于1cm以下的肿瘤，其检测灵敏度为29～38％(Radiology；2005；237:89-98)。
为了对癌症进行诊断、治疗，使用抗癌剂或结合有金属放射性同位素的抗体。使用抗体的靶向法对肿瘤细胞的特异性高，副作用少。到目前为止已有若干种用金属放射性同位素标记的单克隆抗体被临床应用于诊断和治疗(Cancer Control；2012；19:196-203)。
另一方面，通常抗体的血中半衰期长，给药至体内后，达到提供足以将癌症可见化的信号/背景比的肿瘤/血液比需要4天～5天的长时间(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87:586-592)。另外，抗体的Fc区域会引起抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-DependentCellular Cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(Complement-DependentCytotoxicity：CDC)的药理作用(Glycoconj.J.；2013；30:227-236、Curr.Opin.Biotechnol.；2002；13:609-614)。另外，由于抗体在肝脏中代谢，因此，无论靶标如何，抗体都会高度聚集在肝脏中，但大肠癌的早期转移局限于肝脏，因此难以利用抗体对肝转移的病灶进行检测(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87:586-592)。
Fab、scFv、双抗体这样的低分子化的重组抗体片段由于组织渗透性高，因此容易到达病灶，可以期待使用大肠杆菌、酵母中的表达系统以低成本进行生产，因此可用作治疗用抗体，另一方面，其具有血中半衰期短、经肾排泄的特点，因此还报道了作为诊断剂的利用(Nat.Biotechnol.；2005；23:1126-1136)。
作为应用为诊断剂的抗人CEACAM5抗体，已知作为小鼠单克隆抗体T84.66的人源化抗体的M5A(专利文献1)。据报道，用64Cu标记的M5A在使用皮下移植有癌细胞的小鼠的试验中，为了获得良好的PET图像，需要在给药后经过22小时以上(非专利文献1)；另外，在使用肝转移的模型小鼠的试验中，向肝脏的正常组织和肝脏的病灶部位的摄取在给药后3小时时为同等程度，经过24小时后存在显著差异(非专利文献2)。
关于抗人CEACAM5抗体的片段，报道了用99mTc对小鼠单克隆抗体NP-4的Fab’进行标记而得到的CEA-Scan能够用于大肠癌的诊断(非专利文献3)。但是，CEA-Scan向病灶部位的摄取并不高于向正常肝脏中的摄取，并且肝转移的检测灵敏度低于FDG-PET(非专利文献4)。CEA-Scan在1999年被FDA批准作为大肠癌的诊断剂，但早已不再销售(非专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/086875号小册子
非专利文献
非专利文献1：Bioconjug.Chem.；2008；19:89-96
非专利文献2：PLOS ONE；2014；9(9):e106921
非专利文献3：Ann.Surg.；1997；226:621-631
非专利文献4：J.Nucl.Med.；2000；41:1657-1663
非专利文献5：Kenneth T.Cheng、“99mTc-Arcitumomab”、[online]、Update:March17,2008.、Molecular Imaging and Contrast Agent Database、[2017年5月17日检索]、互联网<URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/>
发明内容
发明所要解决的问题
一价的Fab片段的分子量为约50kDa，比分子量约150kDa的抗体小，经肾排泄，血中半衰期也短。因此，能够检测肝转移，在给药后2～32小时以内达到提供足以将癌症可见化的信号/背景比的肿瘤/血液比。由于不具有Fc区域，因此也不会引起ADCC或CDC。由于这样的特长，与抗体相比，可以期待Fab片段作为诊断剂更为有效。
但是，Fab片段因低分子化导致其结合活性大多会减弱。此外，为了将抗体用作体内诊断剂，必须用PET示踪剂或荧光染料等可检测的物质进行标记，但Fab片段存在其结合活性因使用这样的物质进行标记而减弱的课题。
本发明的课题在于提供对于检测人CEACAM5有用、并且可期待在给药后短时间(例如4小时)的期间内聚集到癌病灶的抗人CEACAM5抗体Fab片段。另外，本发明的课题在于提供可期待在给药当天就能进行诊断的包含该Fab片段的诊断用组合物和利用该诊断用组合物的诊断方法。
用于解决问题的方法
本发明人在制作对于检测人CEACAM5有用的抗人CEACAM5抗体Fab片段的制作方面反复进行了相当深入的研究，结果制作出包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人CEACAM5抗体Fab片段(实施例1)，并发现：该抗人CEACAM5抗体Fab片段对人CEACAM5的结合活性不会因标记部的结合而减弱(实施例3)；以及包含该抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物在给药4小时后在皮下移植模型和肝移植模型中聚集于人CEACAM5阳性癌细胞中，能够对人CEACAM5阳性癌细胞进行检测(实施例5和6)。即，本发明提供聚集于癌处的抗人CEACAM5抗体Fab片段和包含该抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物。
本发明包含作为医学上或产业上有用的物质、方法的下述发明。
即，在一个方式中，本发明可以如下所述。
(1)一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含重链片段和轻链，所述重链片段包含含有由序列号2的氨基酸序号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50至66的氨基酸序列构成的CDR2、以及由序列号2的氨基酸序号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区，所述轻链包含含有由序列号4的氨基酸序号24至38的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号54至60的氨基酸序列构成的CDR2、以及由序列号4的氨基酸序号93至101的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。
(2)如上述(1)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(3)如上述(2)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号2所示的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号4所示的氨基酸序列构成。
(4)如上述(3)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
(5)一种复合物，其包含标记部和上述(1)至(4)中任一项所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
(6)如上述(5)所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。
(7)如上述(6)所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体。
(8)如上述(7)所述的复合物，其中，配体为下式(A)所表示的配体：
Figure BDA0002351595970000061
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段或接头的结合。
(9)如上述(7)所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头，该配体和接头为下式(A’)所表示的基团：
Figure BDA0002351595970000062
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段的结合。
(10)如上述(9)所述的复合物，其中，抗人CEACAM5抗体Fab片段借助该Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)基的碳原子结合。
(11)如上述(7)所述的复合物，其由下式(I)所表示：
(L-X)p-Ab (I)
式中，Ab为抗人CEACAM5抗体Fab片段，
L为配体，
X为接头或键，以及
p为1～25的自然数。
(12)如上述(11)所述的复合物，其中，L为下式(A)所表示的配体：
Figure BDA0002351595970000071
式中，波状线表示与X(其中在X为键的情况下为Ab)的结合。
(13)如上述(9)或(12)中任一项所述的复合物，其由下式(II)所表示：
式中，Ab为抗人CEACAM5抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，
在此，Ab借助该Ab中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子结合。
(14)如上述(11)至(13)中任一项所述的复合物，其中，p为1～16的自然数。
(15)如上述(11)至(13)中任一项所述的复合物，其中，p为4～16的自然数。
(16)如上述(6)至(15)中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
(17)如上述(16)所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
(18)如上述(16)所述的复合物，其中，金属为89Zr。
(19)如上述(17)或(18)所述的复合物，其用作PET示踪剂。
(20)一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
(21)一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
(22)一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
(23)一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
(24)一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(25)一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(26)一种生产抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码上述(2)(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(27)一种生产抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码上述(4)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(28)一种生产包含标记部和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用上述(26)或(27)所述的方法制备抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。
(29)一种生产包含配体和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用上述(26)或(27)所述的方法制备抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段经由接头与配体共价结合或者使该Fab片段直接与配体共价结合的步骤。
(30)一种生产包含用金属放射性同位素进行了标记的标记部和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用上述(29)所述的方法生产包含配体和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的步骤、以及使金属放射性同位素与该复合物的配体配位结合的步骤。
(31)一种诊断用组合物，其包含上述(16)至(19)中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
(32)如上述(31)所述的诊断用组合物，其为疾病分期诊断剂。
(33)如上述(31)或(32)所述的诊断用组合物，其用于大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断。
(34)如上述(33)所述的诊断用组合物，其用于大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的诊断。
(35)如上述(34)所述的诊断用组合物，其中，大肠癌转移而成的癌症为转移性肝癌。
(36)上述(16)至(19)中任一项所述的复合物在生产大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断用组合物中的应用。
(37)如上述(16)至(19)中任一项所述的复合物，其用于在大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断中使用。
(38)一种大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断方法，其包括向对象给药上述(16)至(19)中任一项所述的复合物。
(39)如上述(1)至(4)中任一项所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其用于以包含标记部的复合物的形式来使用。
(40)上述(1)至(4)中任一项所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段在生产包含标记部的复合物中的应用。
(41)如上述(39)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其中，包含标记部的复合物为上述(5)至(18)中任一项所述的复合物。
(42)如上述(40)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的应用，其中，包含标记部的复合物为上述(5)至(18)中任一项所述的复合物。
发明效果
本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段对于检测人CEACAM5有用，被期待对大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症等癌症的诊断有用。
附图说明
图1A是对在右肩的皮下移植有人大肠癌细胞株LS174T细胞(人CEACAM5阳性细胞)、在左肩的皮下移植有人大肠癌细胞株HCT-15细胞(人CEACAM5阴性细胞)的小鼠给药PB009-03并在给药4小时后利用PET拍摄得到的代表性图像。由于是对伏臥位的小鼠进行拍摄，因此，右侧的圆圈表示移植有LS174T细胞的小鼠的右肩，左侧的圆圈表示移植有HCT-15细胞的小鼠的左肩。右侧的条表示肿瘤中的放射线聚集量(最大标准摄取值、MaximumStandardized Uptake Value；SUV-Max)。
图1B是示出对在右肩的皮下移植有人大肠癌细胞株LS174T细胞(人CEACAM5阳性细胞)、在左肩的皮下移植有人大肠癌细胞株HCT-15细胞(人CEACAM5阴性细胞)的小鼠给药PB009-03，在给药4小时后、24小时后和48小时后利用PET进行拍摄并进行图像分析而得到的结果的图。纵轴表示聚集于肿瘤部的PB009-03的SUV-Max值。另外，图中的误差线表示平均值±标准误差(MEAN±SEM)。
图2A是对在肝脏中移植有荧光素酶表达LS174T细胞(人CEACAM5阳性细胞)的小鼠给药PB009-03、并在给药4小时后利用PET拍摄得到的代表性图像。箭头表示移植有细胞的部分，右侧的条表示SUV-Max值。
图2B是示出对在肝脏中移植有荧光素酶表达LS174T细胞(人CEACAM5阳性细胞)的小鼠给药PB009-03，在给药4小时后和24小时后利用PET进行拍摄并进行图像分析而得到的结果的图。纵轴表示聚集于肝脏和肿瘤部的PB009-03的SUV-Max值之比(肿瘤/肝脏比)。另外，图中的误差线表示平均值±标准误差(MEAN±SEM)。
具体实施方式
以下，对本发明进行详述，但本发明并不限定于此。本说明书中，只要没有特别定义，与本发明相关地使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
本发明人在制作抗人CEACAM5抗体或其抗原结合片段的制作方面反复进行了相当有创意的研究，结果成功地制作出对检测人CEACAM5有用的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
抗体分子的基本结构在各类中是共通的，由分子量5万～7万的重链和2～3万的轻链构成。重链由通常包含约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE对应地被称为γ、μ、α、δ、ε链。此外，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别被称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链由通常包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这两种，分别被称为λ、κ链。抗体分子的基本结构的肽构成是各自相同的两条重链和两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键而结合，分子量为15万～19万。两种轻链与任一种重链均可成对。各个抗体分子总是由相同的两条轻链和相同的两条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(在μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端侧的结构域而言，即使是来自同种动物的同一类(亚类)的标品，其氨基酸序列也不是恒定的，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。比该结构域靠近C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本是恒定的，被称为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。
抗体与抗原的结合特异性取决于由重链可变区和轻链可变区构成的部分的氨基酸序列。另一方面，与补体、各种细胞的结合之类的生物学活性反映出各类Ig的恒定区的结构的差异。已知重链和轻链的可变区的可变性基本限于在任一种链中都存在的三个小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，是比较恒定的。
存在于抗体的重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间的区域被称为铰链区，该区域大量含有脯氨酸残基，并包含连接两条重链的多个链间S-S键。例如，在人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各铰链区含有构成重链间的S-S键的、分别为2个、4个、11个、2个的半胱氨酸残基。铰链区是对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白分解酶的敏感性高的区域。在用木瓜蛋白酶消化抗体的情况下，重链在铰链区的比重链间S-S键更靠N末端侧的位置被切断，分解成两个Fab片段和一个Fc片段。Fab片段由轻链与包含重链可变区、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成。Fab片段包含可变区，具有抗原结合活性。
<本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段>
本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段包括具有下述特征的Fab片段：
一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区。
作为本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区，可以选择Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等中的任意一种恒定区。在一个实施方式中，本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
作为本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区，可以选择Igλ或Igκ中的任意一种恒定区。在一个实施方式中，本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段为下述Fab片段：
包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
在细胞中表达包括Fab片段在内的抗体的情况下，已知抗体在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰的示例，可以列举重链C末端的赖氨酸的利用羧肽酶的切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸的通过焦谷氨酰化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗体中发生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.,2008；97:2426-2447)。
本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段也可以包括通过翻译后修饰生成的Fab片段。作为可通过翻译后修饰生成的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的示例，可以列举重链N末端进行了焦谷氨酰化的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本领域中公知，这种通过N末端的焦谷氨酰化进行的翻译后修饰不会对抗体的活性产生显著的影响(Anal.Biochem.；2006；348:24-39)。
在一个实施方式中，本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区。
在另一实施方式中，本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2所示的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段，所述轻链由序列号4所示的氨基酸序列构成。
本发明还包括具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：
一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含重链片段和轻链，所述重链片段包含含有由序列号2的氨基酸序号31至35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50至66的氨基酸序列构成的CDR2、以及由序列号2的氨基酸序号99至110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区，所述轻链包含含有由序列号4的氨基酸序号24至38的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号54至60的氨基酸序列构成的CDR2、以及由序列号4的氨基酸序号93至101的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。
本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与人CEACAM5结合。作为测定所得到的抗人CEACAM5抗体Fab片段对人CEACAM5的结合活性的方法，有基于表面等离子共振(SurfacePlasmon Resonance；SPR)法的分析、ELISA等方法。例如，在使用基于SPR法的分析的情况下，使用Biacore T200(通用电气医疗日本公司)，将生物素捕获试剂盒(通用电气医疗日本公司)和生物素化的人CEACAM5固相化于传感芯片上，添加连续稀释的Fab片段，由此可以测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)。
本领域技术人员可以基于本说明书中公开的、本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段和轻链的序列信息，使用本领域中公知的方法容易地制作本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段例如可以按照后述的<生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法>中记载的方法来生产，但并没有特别限定。
<本发明的复合物>
本发明的复合物为包含标记部和本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物。
“标记部”是指(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。作为某一方式，可以列举(i)配体和接头、或者包含金属的(ii)配体。作为某一方式，可以列举(iii)荧光染料和接头。作为某一方式，可以列举(i)配体和接头。“标记部”的配体可以进一步包含金属，作为某一方式，为包含金属的(i)配体和接头或者(ii)配体，作为另一方式，为(i)与金属形成了螯合络合物的配体和接头、或者(ii)与金属形成了螯合络合物的配体。
包含金属、荧光染料或非金属放射性同位素的本发明的复合物可以用于各种造影剂等，例如用于MRI造影剂、PET示踪剂、荧光标记的分子成像剂等。
本说明书中，“金属”是指顺磁性金属离子或金属放射性同位素。作为金属，只要是与各配体配位结合的金属，则没有特别限制。根据复合物的使用目的来选择公知的适当的配体与金属的组合。
顺磁性金属离子适合用于MRI造影剂。作为顺磁性金属离子的方式，可以列举Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Rh2+、Co2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Tb3+、Pm3+、Nd3+、Tm3+、Ce3+、Y3+、Ho3+、Er3+、La3+、Yb3+、Mn3+或Mn2+，但不限于这些。作为某一方式，可以列举Gd3+、Mn3+、Mn2+、Fe2+或Fe3+。作为某一方式，可以列举Mn3+或Mn2+。这种情况下，复合物中可以使用卤素等作为抗衡阴离子。另外，抗衡阴离子也可以为配体的C(＝O)O-，此外复合物也可以具有Na+等抗衡阳离子。
金属放射性同位素例如用于PET示踪剂等。作为金属放射性同位素的方式，可以列举89Zr、51Mn、52Fe、60Cu、67Ga、68Ga、72As、99mTc或111In，但不限定于这些。作为某一方式，可以列举89Zr、60Cu、67Ga、68Ga、99mTc或111In。作为某一方式，可以列举锆的放射性同位素。作为某一方式，可以列举89Zr。
“配体”是本复合物中可与金属形成螯合络合物的部分，作为某一方式，是指由螯合剂构成的基团。所构成的基团是指从螯合剂上除去质子而具有结合键的基团。
“螯合剂”是能够与金属配位结合的化合物。
作为“螯合剂”，可以列举铁载体和非铁载体。进而作为某一方式，可以列举MAG3(巯基乙酰基三甘氨酸、CAS编号：66516-09-4)及其公知的反应性衍生物。作为铁载体，可以列举异羟肟酸型、邻苯二酚型或混合配体型。作为异羟肟酸型铁载体，可以列举例如铁色素、下式：
Figure BDA0002351595970000181
所表示的去铁胺(DFO)、镰孢氨酸C、鸟氨酸菌素(ornibactin)、红酵母酸和它们的公知的反应性衍生物。作为邻苯二酚型铁载体，可以列举例如肠杆菌素、芽孢杆菌素、弧菌素和它们的公知的反应性衍生物。作为混合配体型铁载体，可以列举例如固氮菌素、脓青素、耶尔森杆菌素和它们的公知的反应性衍生物。需要说明的是，在上述铁载体的情况下，DFO可以借助其反应性官能团-NH2与接头或Fab片段反应，在DFO以外的铁载体的情况下，也可以借助羧基、羟基、氨基等反应性官能团，利用本领域技术人员通常使用的方法与接头或Fab片段反应。
作为非铁载体，可以列举DTPA(二亚乙基三胺五乙酸、CAS编号：67-43-6)、DTPA-BMA(1,7-双(甲基氨甲酰基甲基)-1,4,7-三氮杂庚烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：119895-95-3)、EOB-DTPA(乙氧基苄基DTPA、2-[[(2S)-2-[双(羧甲基)氨基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙酸)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸、CAS编号：869-52-3)、DO3A(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羟基丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸、CAS编号：120041-08-9)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、CAS编号：60239-18-1)和它们的公知的反应性衍生物。
需要说明的是，只要没有特别记载，本说明书中的化合物和复合物也包括游离体及其盐。在此，“其盐”是指根据该化合物和复合物的取代基的种类，有时会形成酸加成盐或与碱的盐，是该化合物和复合物所能形成的盐。具体而言，可以列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；与钠、钾、镁、钙、铝等无机碱、甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等有机碱的盐；与乙酰亮氨酸等各种氨基酸和氨基酸衍生物的盐；铵盐等。例如，DFO可以以去铁胺甲磺酸盐的形式存在，也可以以其他盐的形式存在。DTPA可以以钠盐的形式与游离体一起存在。
作为用于MRI造影剂的情况下的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂。
作为用于PET示踪剂的情况下的“螯合剂”的某一方式，为上述的铁载体和非铁载体螯合剂，进一步，作为某一方式，为MAG3。作为某一方式，为DFO。
作为本发明的复合物中包含的形成配体的“螯合剂”的某一方式，可以列举DFO、DTPA、DTPA-BMA、EOB-DTPA、DO3A、HP-DO3A、DOTA。作为某一方式，可以列举DFO、DTPA、DOTA。作为某一方式，可以列举DFO。
“接头”是指在抗人CEACAM5抗体Fab片段与配体之间隔出距离的基团。作为复合物中的“接头”的某一方式，可以列举下式：
(以下表示为-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)、-CH2-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-。在此，“C1-20亚烷基”为直链或支链的碳原子数1～20的亚烷基。作为C1-20亚烷基的某一方式，可以列举C1-10亚烷基、C1-2亚烷基。作为C1-20亚烷基的某一方式，可以列举亚乙基。作为某一方式，可以列举-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。作为某一方式，可以列举-C(＝O)-C2H4-C(＝O)-。作为可以用于形成接头的试剂，可以列举HO-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-OH、琥珀酸、对苯二异硫氰酸酯等。
包含荧光染料的本发明的复合物可以用作荧光标记的分子成像剂。
作为本发明的复合物中使用的荧光染料，可以使用光成像中通常使用的在近红外波长(650～1000nm)处具有极大吸收和极大发光的染料。作为荧光染料的某一方式，可以列举花青素或靛花青素化合物。作为某一方式，可以列举IRDye800CW(LI-COR公司)、Cy(Molecular Probe公司)、Alexa Fluor、BODIPY和DyLight(Thermo Fisher Scientific公司)、CF790(Biotium公司)、DY(DYOMICS GMBH公司)、HiLyte Fluor680和HiLyte Fluor750(Anaspec公司)、PULSAR650和QUASAR670(Biosearch Technologies公司)等。作为某一方式，可以列举IRDye800CW。需要说明的是，荧光染料可以借助其羧基、羟基、氨基等或者利用本领域技术人员通常使用的方法引入活化基团后与Fab片段或接头反应。作为引入有活化基团的荧光染料的某一方式，可以列举利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基进行了酯化的荧光染料。例如，上述的IRDye800CW的NHS酯在市场上销售，可以利用这些市售品。
包含非金属放射性同位素的本发明的复合物可以用作PET示踪剂。
作为本发明的复合物中使用的非金属放射性同位素，可以列举18F、11C、15O、13N。作为某一方式，可以列举18F。包含非金属放射性同位素的化合物的结合可以使用例如N-琥珀酰亚胺-4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)。
本领域技术人员可以利用公知的方法适当进行本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与标记部的结合。例如，可以使标记部与本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或氨基酸侧链的氨基)、一个以上的硫醇基(例如氨基酸侧链的硫醇基)、或者一个以上的羧基(例如C末端或氨基酸的侧链的羧基)结合。作为某一方式，本发明的复合物为标记部与本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的一个以上的氨基结合而得到的复合物。
在标记部为配体和接头的情况下，本发明的复合物也可以通过使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与接头反应、并使形成配体的螯合剂与所得到的物质反应来生产。也可以使接头与形成配体的螯合剂反应、并使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与所得到的物质反应来生产。作为反应例，可以列举使螯合剂的氨基与接头反应、并使所得到的物质与本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或赖氨酸侧链的氨基)反应。在标记部为配体的情况下，也可以使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与形成配体的螯合剂反应来生产。作为反应例，可以列举使螯合剂与本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或赖氨酸侧链的氨基)反应。本发明的复合物的生产中，可以使用向胺中添加异硫氰酸酯而合成硫脲的反应、向胺中添加羧酸而合成酰胺的反应等。该反应可以通过应用本领域技术人员公知的方法来进行。需要说明的是，作为原料，也可以使用预先将配体与接头结合而成的化合物。作为配体与接头结合而成的化合物的示例，可以列举下式所表示的p-SCN-Bn-DFO(对异硫氰基苯基氨基硫代羰基取代DFO、CAS编号：1222468-90-7)、
Figure BDA0002351595970000221
对异硫氰基苄基取代DTPA(p-SCN-Bn-DTPA、CAS编号：102650-30-6)、对异硫氰基苄基取代DOTA(p-SCN-Bn-DOTA、CAS编号：127985-74-4)、以及p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA([(R)-2-氨基-3-(4-异硫氰根合苯基)丙基]-反式-(S,S)-环己烷-1,2-二胺五乙酸、CAS编号：157380-45-5)。
例如，本发明的复合物可以以下述复合物的形式来生产，该复合物是使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的一个以上的氨基(例如N末端氨基或氨基酸的侧链的氨基)与具有异硫氰酸根基的标记部反应、借助氨基结合一个以上的标记部而得到的Fab片段。
在利用上述生产方法生产的、结合有一个以上的标记部的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段中添加金属(顺磁性金属离子或金属放射性同位素)，能够得到包含金属的本发明的复合物。
本发明的复合物为在本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段上结合一个以上的标记部而得到的复合物。本发明的复合物作为某一方式，是与1～25个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与1～23个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与1～16个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与1～11个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与1～10个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与1～9个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与4～23个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与4～16个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与4～10个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与4～9个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与3～23个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与3～16个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；作为某一方式，是与3～10个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段；进一步作为某一方式，是与3～9个标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本发明的复合物作为某一方式，是进一步包含金属、与一个以上的标记部进行了结合的抗人CEACAM5抗体Fab片段。作为本发明的复合物的某一方式，可以为所结合的标记部的数量不同的复合物的混合物。
作为一个实施方式，本发明的复合物为包含标记部和本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体的复合物。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体、该配体为下式(A)所表示的配体的复合物：
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段或接头的结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为(i)配体和接头、该配体和接头为下式(A’)所表示的基团的复合物：
Figure BDA0002351595970000242
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段的结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物是标记部为式(A’)所表示的基团、抗人CEACAM5抗体Fab片段借助该Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)基的碳原子结合的复合物。
作为某一实施方式，本发明的复合物为下式(I)所表示的复合物：
(L-X)p-Ab (I)
式中，Ab为本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段，
L为配体，
X为接头或键，
p为1～25的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数，作为某一方式，为1～16的自然数，作为某一方式，为1～11的自然数，作为某一方式，为1～10的自然数，作为某一方式，为1～9的自然数，作为某一方式，为4～23的自然数，作为某一方式，为4～16的自然数，作为某一方式，为4～10的自然数，作为某一方式，为4～9的自然数，作为某一方式，为3～23的自然数，作为某一方式，为3～16的自然数，作为某一方式，为3～10的自然数，进一步作为某一方式，为3～9的自然数。
作为某一实施方式，本发明的复合物是L为下式(A)所表示的配体的式(I)的复合物：
Figure BDA0002351595970000251
式中，波状线表示与X(其中在X为键的情况下为Ab)的结合。
作为式(I)的复合物的某一实施方式，为下式(II)所表示的复合物：
Figure BDA0002351595970000261
式中，Ab为本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，作为p的某一方式，为1～23的自然数，作为某一方式，为1～16的自然数，作为某一方式，为1～11的自然数，作为某一方式，为1～10的自然数，作为某一方式，为1～9的自然数，作为某一方式，为4～23的自然数，作为某一方式，为4～16的自然数，作为某一方式，为4～10的自然数，作为某一方式，为4～9的自然数，作为某一方式，为3～23的自然数，作为某一方式，为3～16的自然数，作为某一方式，为3～10的自然数，进一步作为某一方式，为3～9的自然数，
Ab借助该Ab中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子结合。
作为某一实施方式，本发明的复合物是式(I)的复合物且进一步包含金属的复合物。作为金属的某一方式，可以列举金属放射性同位素。作为金属放射性同位素的某一方式，可以列举89Zr。
作为某一实施方式，本发明的复合物是式(II)的复合物且进一步包含金属的复合物。作为金属的某一方式，可以列举金属放射性同位素。作为金属放射性同位素的某一方式，可以列举89Zr。
本发明的复合物中也包括作为两种以上的复合物的混合物的复合物。例如，作为包含标记部和未接受翻译后修饰的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物与包含标记部和通过上述抗人CEACAM5抗体Fab片段的翻译后修饰生成的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的混合物的复合物也包括在本发明的复合物中。
以下示出作为两种以上本发明的复合物的混合物的本发明的复合物的某些实施方式：
(1)一种复合物，其是标记部为式(A’)所表示的配体和接头、抗人CEACAM5抗体Fab片段为包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物与标记部为式(A’)所表示的配体和接头、抗人CEACAM5抗体Fab片段为包含由序列号2所示的氨基酸序列构成且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的混合物。
(2)如(1)所述的复合物，其中，进一步包含金属。
(3)一种复合物，其为进一步包含金属的(1)的复合物与不包含金属的(1)的复合物的混合物。
(4)如(2)～(3)所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
(5)如(4)所述的复合物，其中，金属放射性同位素为89Zr。
<本发明的多核苷酸>
本发明的多核苷酸中包括：包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码含有由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码含有由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码含有由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1的碱基序号1至363的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码含有由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3的碱基序号1至336的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，本发明的多核苷酸为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以基于以本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段和轻链的氨基酸序列为基础而设计的碱基序列，利用本技术领域中公知的基因合成方法进行合成。作为这样的基因合成方法，可以使用国际公开第90/07861号中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
<本发明的表达载体>
本发明的表达载体中包括：含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
优选的本发明的表达载体中包括：含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
优选的本发明的表达载体中包括：含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
本发明的表达载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中产生由本发明的多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，优选可以使用pEE6.4、pEE12.4(Lonza公司)。
本发明的表达载体可以包含以可发挥功能的方式与编码本发明的多核苷酸的重链片段和/或轻链的基因连结的启动子。作为用于在宿主细胞中表达本发明的Fab片段的启动子，在宿主细胞为埃希氏菌属菌的情况下，可以列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可以列举例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属菌中的表达用启动子，可以列举SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可以列举CMV、RSV、SV40等病毒来源的启动子、逆转录病毒的启动子、肌动蛋白启动子、EF(延伸因子、elongation factor)1α启动子、热休克启动子等。
在使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以进一步包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。另一方面，在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子。另外，这种情况下，可以包含增强子序列、编码本发明的重链片段和/或轻链的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，可以根据目的包含通常使用的选择标志物(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
<本发明的进行了转化的宿主细胞>
本发明的进行了转化的宿主细胞中包括选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(a)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(a)～(d)组成的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
(a)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为优选的本发明的进行了转化的宿主细胞，可以列举：利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为进行转化的宿主细胞，只要适合所使用的表达载体、能够利用该表达载体进行转化而表达Fab片段，则没有特别限定，可以例示本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)、哺乳动物细胞株(例如CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞)。转化本身可以利用例如磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法进行。
<生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法>
生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤。
在一个实施方式中，在生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法中培养的本发明的进行了转化的宿主细胞选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为某一方式，在生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法中培养的本发明的进行了转化的宿主细胞选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸序号1至121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码包含由序列号4的氨基酸序号1至112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为某一方式，在生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法中培养的本发明的进行了转化的宿主细胞选自由下述(a)至(c)组成的组：
(a)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
优选所使用的本发明的进行了转化的宿主细胞为利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、或者利用含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法中，进行了转化的宿主细胞可以在营养培养基中进行培养。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、豆粕、马铃薯提取液等。另外，可以根据期望含有其他营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
进行了转化的宿主细胞的培养本身利用公知的方法进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5％～约20％的胎牛血清的MEM培养基(Science；1952；122:501)、DMEM培养基(Virology；1959；8:396-397)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199:519-524)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73:1-8)等。培养基的pH优选为约6～约8，培养通常在约30℃～约40℃下进行约15小时～约336小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(PNAS；1985；82:8404-8408)等，其pH优选为约5～约8。培养通常在约20℃～约40℃下进行15～100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠杆菌(E.coli)的情况下，作为优选的培养基，可以例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet，冷泉港实验室；1972:431)等。这种情况下，培养可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在14～43℃下进行约3小时～约24小时。在宿主为芽孢杆菌(Bacillus)属菌的情况下，可以根据需要在通气、搅拌的同时通常在30～40℃下进行约16小时～约96小时。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列举例如Burkholder最小培养基(PNAS；1980；77:4505-4508)，pH优选为5～8。培养通常在约20℃～约35℃下进行约14小时～约144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
生产本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法除了包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤以外，还可以包括对表达后的抗人CEACAM5抗体Fab片段进行回收、优选分离、纯化的步骤。作为分离、纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。
<生产本发明的复合物的方法>
生产本发明的复合物的方法包括使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与标记部共价结合的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。所使用的接头、配体或荧光染料等以及连结的方法可以使用<本发明的复合物>中记载的物质和方法。
在一个实施方式中，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；以及使该Fab片段i)经由接头与配体结合、或者ii)直接与配体共价结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；使该Fab片段经由接头或直接与配体共价结合的步骤；以及使金属与该复合物的配体配位结合(即，形成螯合络合物)的步骤的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；使该Fab片段经由接头或直接与配体共价结合的步骤；以及使金属与该复合物的配体配位结合的步骤的方法。
作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；使该Fab片段经由接头或直接与配体共价结合的步骤；以及使金属放射性同位素与该复合物的配体配位结合的步骤(即，形成螯合络合物)的方法。作为某一方式，生产本发明的复合物的方法为包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤；回收所表达的该Fab片段的步骤；使该Fab片段经由接头或直接与配体共价结合的步骤；以及使金属放射性同位素与该复合物的配体配位结合的步骤的方法。
生产本发明的复合物的方法可以作为以一系列步骤的形式包括上述限定的两个以上的步骤的方法来实施，也可以作为包括上述限定的至少一个步骤的方法来实施。例如，包括使本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段与标记部结合的步骤的方法、以及包括利用金属对结合有标记部的本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段进行标记的步骤的方法也包括在生产本发明的复合物的方法中。另外，生产本发明的复合物的方法中也包括步骤的顺序不同的方法。例如，在利用金属放射性同位素对配体进行标记后使该配体与本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段共价结合的方法也包括在生产本发明的复合物的方法中。
<本发明的诊断用组合物、诊断方法>
本发明涉及包含含有荧光染料、金属或非金属放射性同位素的本发明的复合物(以下称为可检测的本发明的复合物)的诊断用组合物。可检测的本发明的复合物可以按照常规方法制剂化，作为疾病分期诊断剂(特别是癌症的诊断)来利用。疾病分期诊断剂是指能够检查病情发展到何种程度的诊断剂。例如，针对癌症，是指能够检查其分期的诊断剂。可期待能够利用本发明的诊断用组合物进行诊断的癌症选自由大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和它们转移而成的癌症组成的组。优选该癌症为大肠癌或大肠癌转移而成的癌症。更优选该癌症为大肠癌转移而成的癌症，这样的癌症包括转移性肝癌。
本发明的诊断用组合物的制剂化时的可检测的本发明的复合物的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型、或者Fab片段的结合效价等而有所不同，例如，相对于患者的每单位体重以Fab片段的质量基准计使用约0.001mg/kg至约100mg/kg即可。
作为本发明的诊断用组合物的剂型的示例，可以列举注射剂、点滴用剂等非口服剂，优选通过静脉内注射、向标靶局部的肌肉内注射、皮下注射等来给药。另外，制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。药学上可接受的载体、添加剂的种类没有特别限定，可以使用本领域技术人员公知的载体、添加剂。
另外，本发明涉及可检测的本发明的复合物在生产癌症的诊断用组合物、作为某一方式为疾病分期诊断用组合物中的应用。本发明还涉及用于在癌症的诊断中使用的、作为某一方式用于在疾病分期诊断中使用的可检测的本发明的复合物。
并且，本发明还涉及一种癌症的诊断方法，其包括在手术前或手术中向对象给药可检测的本发明的复合物。在此，“对象”是指需要接受该诊断的人或其他哺乳动物，作为某一方式，为需要接受该诊断的人。本发明的诊断方法中的可检测的本发明的复合物的有效量可以为与上述制剂化时的可检测的本发明的复合物的有效量同样的量。在本发明的诊断方法中，可检测的本发明的复合物优选通过静脉内注射等来给药。用于作为PET示踪剂使用的本发明的复合物可以在给药起1.5～48小时后、作为某一方式在2～48小时后、作为某一方式在4～24小时后、作为某一方式在4～6小时后、作为某一方式在1.5～6小时后利用PET进行拍摄。在本发明的诊断方法中，在将荧光标记的本发明的复合物用于术中诊断的情况下，该复合物例如在手术的2～48小时前、优选在4小时前给药于患者。
在另一实施方式中，本发明还涉及本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段在生产本发明的复合物中的应用。作为某一方式，本发明还涉及本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段在生产包含本发明的复合物的诊断用组合物中的应用。
整体上对本发明进行了记载，但为了得到进一步的理解，在此提供参考的特定实施例。但是，这些实施例的目的在于例示，并非对本发明进行限定。
实施例
(实施例1：抗人CEACAM5抗体Fab片段的制作)
参考文献(Protein Eng.Des.Sel.；2004；17:481-489)中记载的方法将作为小鼠来源的抗人CEACAM5抗体的T84.66人源化后，使用依照文献(Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics；2014；82:1624-1635)构建的人源化抗体的分子模型，设计出具有可期待即使结合标记部也不会使亲和性减弱的可变区的抗体。
分别在上述抗体的重链可变区基因的5’侧连接编码信号序列(ProteinEngineering；1987；1:499-505)的基因，并且在3’侧连接人Igγ1的Fab区域基因(由序列号1的碱基序号364至678的碱基序列构成)，将该重链片段基因插入到GS载体pEE6.4(Lonza公司)中。另外，分别在抗体的轻链可变区基因的5’侧连接编码信号序列的基因，并且在3’侧连接人Igκ的恒定区基因(由序列号3的碱基序号337至657的碱基序列构成)，将该轻链基因插入到GS载体pEE12.4(Lonza公司)中。利用NotI和PvuI对分别插入有抗体的重链片段和轻链的基因的上述pEE载体进行限制性酶切割，使用连接用试剂盒TAKARA连接试剂盒Ver2.1(Takara公司)进行连接，构建出插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体。
使用上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体，利用瞬时性表达和稳定表达这两种方法进行抗体表达。关于瞬时性表达，对于在Expi293表达培养基(Thermo FisherScintific公司)中培养至约300万个/mL的Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific公司)，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)转染上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体，培养5～7天。使用KappaSelect(通用电气医疗日本公司)对培养上清进行纯化，得到Fab片段。关于稳定表达，通过使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)的电穿孔法将利用PvuI形成为直链的上述插入有重链片段和轻链这两种基因的GS载体转染到CHOK1SV细胞(Lonza公司)中。在转染次日添加蛋氨酸亚砜亚胺，培养5～7天。将细胞接种到含有甲基纤维素的半固体培养基上，菌落形成后使用ClonePix FL(Molecular Devices公司)获得Fab片段的表达量多的细胞。使用Capto L(通用电气医疗日本公司)、Q Sepharose Fast Flow(通用电气医疗日本公司)和BioPro S75(YMC公司)对该细胞的培养上清进行纯化，得到Fab片段。
分别将编码所制作的抗人CEACAM5抗体Fab片段(称为PB009-01)的重链片段的碱基序列示于序列号1，将由其编码的氨基酸序列示于序列号2，将编码PB009-01的轻链的碱基序列示于序列号3，将由其编码的氨基酸序列示于序列号4。PB009-01的重链可变区由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成，重链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号2的氨基酸序号31至35、50至66、99至110的氨基酸序列构成。PB009-01的轻链可变区由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成，轻链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸序号24至38、54至60、93至101的氨基酸序列构成。
需要说明的是，可变区和CDR序列按照Kabat编号来确定(Kabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目的的蛋白质序列)、第5版、美国公共卫生局、国立卫生研究院、贝塞斯达)。
(实施例2：Fab片段复合物的生产)
作为螯合剂的DFO向Fab片段PB009-01上的结合使用p-SCN-Bn-DFO(对异硫氰基苯基氨基硫代羰基取代DFO)(Macrocyclics公司)。在利用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)制备成1mg/mL的Fab片段溶液中添加1/5量的0.1M碳酸钠溶液(pH9.0)。向其中添加p-SCN-Bn-DFO以使终浓度为1mg/mL，在37℃下反应一个半小时。反应后，使用Amicon Ultra 3K-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)对经由接头(-C(＝S)-NH-(1,4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)结合有DFO的Fab片段(称为PB009-02)进行纯化。
关于PB009-02，通过质谱分析对由DFO构成的配体的结合数进行确认。使用MassPREP Micro脱盐柱(Waters公司)对PB009-02进行脱盐，使用SYNAPT G2质谱分析仪(Waters公司)实施测定。其结果是，确认到在1个PB009-01上结合有至少3个至10个由DFO构成的配体的分子。
(实施例3：结合活性评价)
为了详细地测定PB009-02的结合活性，进行利用SPR法的分析。在本实施例中，作为比较Fab片段，使用作为T84.66的人源化抗体的M5A的Fab片段(称为M5A-Fab)。经由接头结合有DFO的M5A-Fab(称为M5A-Fab-DFO)使用实施例2中记载的方法来制作。
使用Biacore T200(通用电气医疗日本公司)进行利用SPR法的分析。在传感芯片的表面上以5μL/分钟的流速添加利用生物素捕获试剂盒S系列(通用电气医疗日本公司)和生物素标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)进行了生物素化的10μg/mL的人CEACAM5(R&DSystems公司)2分钟，将其固相化。使用HBS-EP+溶液(通用电气医疗日本公司)将PB009-01、PB009-02、M5A-Fab和M5A-Fab-DFO从400nM开始以2倍公比进行6次连续稀释，以50μL/分钟的流速分别添加100μL至流道中。利用该测定系统，使用数据分析软件(BIA Evaluation、通用电气医疗日本公司)分别计算出PB009-01、PB009-02、M5A-Fab或M5A-Fab-DFO与人CEACAM5的解离常数(KD)。其结果是，如下表所示，确认到：M5A-Fab的结合活性因DFO的结合而减弱，与此相对，PB009-01的结合活性并未因DFO的结合而减弱。
[表1]
Fab K<sub>D</sub>(M) 结合有DFO的Fab K<sub>D</sub>(M)
PB009-01 1.7E-10 PB009-02 6.1E-10
M5A-Fab 1.6E-10 M5A-Fab-DFO 9.6E-09
(实施例4：结合有DFO的Fab片段复合物的89Zr标记)
89Zr以Zr-草酸盐的形式从3D Imaging LLC公司购入。将20μL的Zr-草酸盐(2.6mCi)用2M的碳酸钠10μL进行中和后，加入5mg/mL的龙胆酸20μL。进一步，添加包含0.05％的聚山梨醇酯80的20mM的HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)110μL。添加10mg/mL的PB009-0240μL，在室温下反应30分钟后，进一步在37℃下反应30分钟。反应后，使用Amicon Ultra 10K-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)对89Zr标记的PB009-02(称为PB009-03)进行纯化。
(实施例5：复合物的皮下移植模型中的造影评价)
在免疫缺陷小鼠(NOG小鼠；Taconic Biosciences公司)的右肩的皮下移植1×106个细胞的作为人CEACAM5阳性细胞的人大肠癌细胞株LS174T细胞(ATCC(注册商标)；CL-188)，在左肩的皮下移植5×106个细胞的作为人CEACAM5阴性细胞的人大肠癌细胞株HCT-15细胞(ATCC(注册商标)；CCL-225)。本实施例以N＝3来实施。在肿瘤体积达到约300mm3后，静脉给药PB009-03(约20μg、约120μCi)。在PB009-03给药4小时后、24小时后和48小时后利用PET进行拍摄，测定肿瘤部分的SUV-Max。其结果是，如图1A所示，PB009-03在给药4小时后在作为人CEACAM5阳性细胞的LS174T细胞中聚集得比在作为人CEACAM5阴性细胞的HCT-15细胞中多。另外，如图1B所示，表明PB009-03在给药4小时后至48小时后能够检测人CEACAM5阳性的癌细胞。
(实施例6：复合物的肝移植模型中的造影评价)
在麻醉下向免疫缺陷小鼠(NSG小鼠；The Jackson Laboratory公司)的肝脏中移植1×106个细胞的荧光素酶表达LS174T细胞。本实施例以N＝6来实施。利用IVIS成像系统(PerkinElmer公司)，以荧光素酶的表达为指标确认细胞在肝脏中的植活后，静脉给药利用与实施例4同样的方法制作的PB009-03(约14μg、约100μCi)。在PB009-03给药4小时后和24小时后利用PET进行拍摄。分别测定肝脏和LS174T肿瘤(是指移植的LS174T细胞在肝脏中植活的状态)的SUV-Max，算出肿瘤的SUV-Max相对于肝脏的SUV-Max的比。其结果是，如图2A所示，表明PB009-03在给药4小时后聚集于在肝脏中植活的LS174T肿瘤中。另外，给药4小时后和24小时后的肿瘤相对于肝脏的信号比为图2B所示的值。由这些表明，PB009-03在给药4小时后和24小时后能够检测肝脏中存在的人CEACAM5阳性的癌细胞。
产业上的可利用性
本发明的抗人CEACAM5抗体Fab片段和包含该抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物被期待对选自由大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和它们转移而成的癌症组成的组中的癌症的诊断有用。
序列表自由文本
以下的序列表的数字标题<223>中记载了“人工序列(Artificial Sequence)”的说明。具体而言，序列表的序列号1和3所表示的碱基序列分别为PB009-01的重链片段和轻链的碱基序列，序列号2和4所表示的氨基酸序列分别为由序列号1和3编码的重链片段和轻链的氨基酸序列。
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社（Astellas Pharma Inc.）
<120> 新型抗人CEACAM5抗体Fab片段（Novel Anti-human CEACAM5 antibody Fabfragment）
<130> A18007A00
<150> JP 2017-133698
<151> 2017-07-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PB009-01 Fab重链的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 1
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
gac tga 678
Asp
225
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp
225
<210> 3
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码抗体轻链的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 3
gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (37)

1.一种抗人CEACAM5抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸序号1至121的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸序号1至112的氨基酸序列构成的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链；以及
(b)抗人CEACAM5抗体Fab片段，包含重链片段和轻链，所述重链片段由序列号2所示的氨基酸序列构成、且序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸，所述轻链由序列号4所示的氨基酸序列构成。
3.如权利要求2所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
4.一种复合物，其包含标记部和权利要求1至3中任一项所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
5.如权利要求4所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头、(ii)配体、(iii)荧光染料和接头、或者(iv)荧光染料。
6.如权利要求5所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头或者(ii)配体。
7.如权利要求6所述的复合物，其中，配体为下式(A)所表示的配体：
Figure FDA0002351595960000021
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段或接头的结合。
8.如权利要求6所述的复合物，其中，标记部为(i)配体和接头，该配体和接头为下式(A’)所表示的基团：
Figure FDA0002351595960000022
式中，波状线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段的结合。
9.如权利要求8所述的复合物，其中，抗人CEACAM5抗体Fab片段借助该Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)基的碳原子结合。
10.如权利要求6所述的复合物，其由下式(I)所表示：
(L-X)p-Ab (I)
式中，Ab为抗人CEACAM5抗体Fab片段，
L为配体，
X为接头或键，以及
p为1～25的自然数。
11.如权利要求10所述的复合物，其中，L为下式(A)所表示的配体：
Figure FDA0002351595960000031
式中，波状线表示与X的结合，但在X为键的情况下波状线表示与Ab的结合。
12.如权利要求8或11中任一项所述的复合物，其由下式(II)所表示：
式中，Ab为抗人CEACAM5抗体Fab片段，
p为1～25的自然数，
在此，Ab借助该Ab中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子结合。
13.如权利要求10至12中任一项所述的复合物，其中，p为1～16的自然数。
14.如权利要求10至12中任一项所述的复合物，其中，p为4～16的自然数。
15.如权利要求5至14中任一项所述的复合物，其中，进一步包含金属。
16.如权利要求15所述的复合物，其中，金属为金属放射性同位素。
17.如权利要求15所述的复合物，其中，金属为89Zr。
18.如权利要求16或17中任一项所述的复合物，其用作PET示踪剂。
19.一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
20.一种多核苷酸，其选自由下述(a)和(b)组成的组：
(a)包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；以及
(b)包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
21.一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
22.一种表达载体，其包含下述(a)和/或(b)：
(a)包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸；
(b)包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
23.一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
24.一种宿主细胞，其选自由下述(a)至(d)组成的组：
(a)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(c)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(d)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
25.一种生产抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及利用含有包含编码权利要求1(a)所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
26.一种生产抗人CEACAM5抗体Fab片段的方法，其包括对选自由下述(a)至(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤：
(a)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(b)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
(c)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及利用含有包含编码权利要求3所述的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
27.一种生产包含标记部和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用权利要求25或26所述的方法制备抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段与标记部共价结合的步骤。
28.一种生产包含配体和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用权利要求25或26所述的方法制备抗人CEACAM5抗体Fab片段的步骤、以及使该Fab片段经由接头与配体共价结合或者使该Fab片段直接与配体共价结合的步骤。
29.一种生产包含用金属放射性同位素进行了标记的标记部和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的方法，其包括利用权利要求28所述的方法生产包含配体和抗人CEACAM5抗体Fab片段的复合物的步骤、以及使金属放射性同位素与该复合物的配体配位结合的步骤。
30.一种诊断用组合物，其包含权利要求15至18中任一项所述的复合物、以及药学上可接受的载体。
31.如权利要求30所述的诊断用组合物，其为疾病分期诊断剂。
32.如权利要求30或31所述的诊断用组合物，其用于大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断。
33.如权利要求32所述的诊断用组合物，其用于大肠癌或大肠癌转移而成的癌症的诊断。
34.如权利要求33所述的诊断用组合物，其中，大肠癌转移而成的癌症为转移性肝癌。
35.权利要求15至18中任一项所述的复合物在生产大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断用组合物中的应用。
36.如权利要求15至18中任一项所述的复合物，其用于在大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断中使用。
37.一种大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或它们转移而成的癌症的诊断方法，其包括向对象给药权利要求15至18中任一项所述的复合物。
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