CN102482701A - I类抗-cea抗体及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用人源化、嵌合或人I类抗-CEA抗体或其片段的组合物和方法，所述人源化、嵌合或人I类抗-CEA抗体或其片段优选地包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。I类抗-CEA抗体或片段对治疗疾病(例如癌症)是有用的，其中病变细胞表达CEACAM5和/或CEACAM6抗原。I类抗-CEA抗体或片段还用于干扰特异性进程例如癌细胞的转移、侵袭和/或附着，或用于增强癌细胞对细胞毒素剂的敏感性，且对患有癌症的受试者的存活具有有益的作用。

Description

I类抗-CEA抗体及其使用
发明背景
相关申请
本发明依据35U.S.C.119(e)要求2009年9月16日提交的美国临时专利申请No.61/242,872的权益，其全部文本以引用方式并入本文。
序列表
本发明包含已通过EFS-Web提交的序列表并且在此以引用方式整体并入。将创建于2010年7月9日的所述ASC II拷贝命名为IMM322WO.txt，并且其大小为17,746字节。
发明领域
本发明涉及用于治疗表达CEACAM 5(癌胚抗原，“CEA”)和/或CEACAM6(NCA-90)的癌症的组合物和方法，所述癌症例如甲状腺髓样癌(MTC)、结肠直肠癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌、造血癌(hematopoieticcancer)、白血病和其它表达CEACAM5和/或CEACAM6的癌症。所述方法包括施用优选地与至少一种其它治疗剂组合的靶向CEACAM5和CEACAM6的I类抗-CEA抗体或片段，所述其它治疗剂例如为另一种抗体、化疗剂、放射性试剂、反义寡核苷酸、免疫调节剂、免疫偶联物或其组合物。所述I类抗-CEAMAb可以在施用所述治疗剂之前、同时或之后施用。在优选实施方案中，所述I类抗-CEA抗体是包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)的嵌合、人源化或人单克隆抗体(MAb)。更优选地，嵌合、人源化或人I类抗-CEA MAb保留了亲本鼠I类抗-CEA MAb的结合亲和力特征和特异性，但具有更多人抗体的抗原和效应物性质。
相关领域
CEA(CEACAM5)是通常在若干上皮癌中表达的癌胚抗原，更通常地CEA不仅在结肠还在乳腺、肺脏、胰腺、甲状腺(髓质型)和卵巢中产生(Goldenberg等人，J.Natl.Cancer Inst.57：11-22，1976；Shively等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2：355-399，1985)。人CEA基因家族由属于CEACAM亚群的7个已知基因构成。这些亚群成员主要与细胞膜有关并且在正常组织和癌组织中显示出复杂的表达模式。CEACAM5基因，也称为CD66e，编码CEA蛋白(Beauchemin等人，Exp Cell Res 252：243，1999)。CEACAM5在1965首次被描述为胃肠癌胚抗原(Gold等人，J Exp Med 122：467-481，1965)，但现在已知其在大多数癌(包括胃肠道癌、呼吸系统癌和生殖泌尿系统癌及乳腺癌)中过表达(Goldenberg等人，J Natl Cancer Inst.57：11-22，1976；Shively和Beatty，Crit Rev Oncol Hematol 2：355-99，1985)。
CEACAM6(也称为CD66c或NCA-90)是与CEACAM5共享一些(但非全部)抗原决定簇的非特异性交叉反应的糖蛋白抗原(Kuroki等人，Biochem Biophys Res Comm 182：501-06，1992)。CEACAM6在来自各种器官的粒细胞和上皮细胞上表达，并且与正常粘膜以及许多人癌症相比在增生性结肠息肉和腺瘤的增殖细胞中具有更广泛的表达区(Scholzel等人，Am J Pathol 157：1051-52，2000；Kuroki等人，Anticancer Res 19：5599-5606，1999)。在患有肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和肝细胞癌的患者中发现CEACAM6的相对高血清水平。CEACAM6的量与CEACAM5表达的量无关(Kuroki等人，AnticancerRes 19：5599-5606，1999)。
CEACAM6在结肠直肠癌中的表达与细胞分化负相关(Ilantzis等人，Neoplasia 4：151-63，2002)并且是与较高的复发风险相关的独立的预测因子(Jantscheff等人，J Clin Oncol 21：3638-46，2003)。CEACAM5和CEACAM6在细胞附着、侵袭和转移中起作用。已显示CEACAM5参与亲同种抗原的相互作用(CEA与CEA结合)和亲异种抗原的相互作用(CEA与非CEA分子结合)(Bechimol等人，Cell57：327-34，1989；Oikawa等人，Biochem Biophys Res Comm 164：39-45，1989)，某种程度表明其为参与癌侵袭和转移的细胞间附着分子(Thomas等人，Cancer Lett 92：59-66，1995)。这些反应被抗-CEACAM5抗体的Fab′片段完全抑制(Oikawa等人，Biochem Biophys Res Comm164：39-45，1989)。CEACAM6还展现出与CEA家族的其它成员同型结合及与整联蛋白受体的异型相互作用(Stanners和Fuks，于Cell  Adhesion and Communication by the CEA Family(Stanners编)Vol.5，第57-72页，Harwood Academic Publ.，Amsterdam，1998)。靶向CEACAM6的N-结构域的抗体干扰细胞-细胞间相互作用(Yamanka等人，Biochem Biophys Res Comm 219：842-47，1996)。许多乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系表达CEACAM6并且抗-CEACAM6抗体抑制体外迁移、侵袭及抗原阳性细胞的附着(Blumenthal等人，Cancer Res 65：8809-17，2005)。
根据抗-CEA抗体与抗原而非CEA的交叉反应性，抗-CEA抗体分为不同的类别。抗-CEA抗体分类由Primus和Goldenberg在美国专利No.4,818,709(以引用方式并入本文，从US 4,818,709的第3栏第5行至第26栏第49行)中描述。抗-CEA抗体的分类由它们与CEA、胎粪抗原(MA)和非特异性交叉反应抗原(NCA)的结合所决定。I类抗-CEA抗体与所有三种抗原结合。II类抗体与MA和CEA结合，但不与NCA结合。III类抗体仅与CEA结合(U.S.4,818,709)。已知抗-CEA抗体每一类的实例，例如MN-3、MN-15和NP-1(I类)；MN-2、NP-2和NP-3(II类)；及MN-14和NP-4(III类)(U.S.4,818,709；Blumenthal等人，BMC Cancer 7：2(2007))。
还已鉴定多种抗-CEA抗体的表位结合位点。MN-15抗体与CEA的A1B1结构域结合，MN-3抗体与CEA的N-端结构域结合并且MN-14抗体与CEA的A3B3(CD66e)结构域结合(Blumenthal等人，BMC Cancer 7：2(2007))。表位结合位点和抗-CEA抗体的类之间不存在直接关联。例如，MN-3和MN-15都是I类抗-CEA抗体，其与NCA、MA和CEA反应，但分别与CEA的N-端和A1B1结构域结合。Primus和Goldenberg(U.S.4,818,709)报道了不同的抗-CEA抗体之间的交叉阻断活性的复杂模式，其中NP-1(I类)和NP-2(II类)交叉阻断彼此与CEA的结合，但不阻断与NP-3(II类)的结合。然而，根据定义I类抗-CEA抗体与CEACAM5和CEACAM6结合，而III类抗-CEA抗体仅与CEACAM5结合。
已表明抗-CEA抗体用于多种癌症的治疗性治疗。例如，局限于甲状腺的甲状腺髓样癌(MTC)通常通过全甲状腺切除术和中央淋巴结切割来治疗。然而，疾病在大约50％的这些患者中复发。此外，患有不可切除疾病或远处转移的患者的预测不容乐观，少于30％的所述患者存活10年(Rossi等人，Amer.J.Surgery，139：554(1980)；Samaan等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，67：801(1988)；Schroder等人，Cancer，61：806(1988))。这些患者几乎没有治疗选择(Principles and Practice ofOncology，DeVita，Hellman和Rosenberg(编)，New York：JB LippincottCo.，pp.1333-1435(1989)；Cancer等人，Current Problems Surgery，22：1(1985))。已报道当III类抗-CEA抗体MN-14与促凋亡剂(例如DTIC、CPT-11和5-氟尿嘧啶)联合使用时，对治疗动物异种移植模型系统中的人甲状腺髓样癌是有效的(美国专利申请No.10/680,734，其实施例部分以引用方式并入本文)。据报道III类抗-CEA抗体使癌细胞对用化疗剂的治疗致敏并且据报道与单独使用抗体或化疗剂相比，抗体与化疗剂的组合对肿瘤具有协同效应(USSN 10/680,734)。已提出将不同类的抗-CEA抗体(例如MN-3、MN-14和MN-15)用于治疗多种肿瘤。
仍存在提供治疗表达CEA的癌症的更有效的方法的需要。本发明利用I类抗-CEAMAb提供用于有效抗癌治疗的组合物和方法，所述I类抗-CEA MAb例如为包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的嵌合、人源化或人抗体，所述嵌合、人源化或人抗体能够与CEACAM5和CEACAM6结合。优选地，I类抗-CEA MAb是人源化的，并且与治疗剂(特别是化疗剂)组合使用用来以最低的毒性产生对表达CEACAM5或CEACAM6的癌症的有效的治疗性治疗。I类抗体和治疗剂的分开使用提供增强的结果、多样性及灵活性以适应单独的治疗方法。
发明概述
在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一种嵌合、人源化或人I类抗-CEA MAb或其抗原-结合片段的组合物。当利用I类抗-CEA抗体的抗体片段时，所述片段可选自由F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、scFv片段和单域抗体(VHH)组成的组。优选地，I类抗-CEA MAb是包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的嵌合、人源化或人单克隆抗体或其片段。更优选地，嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体的可变区序列与人IgG1或IgG4恒定区序列附接。
在替代实施方案中，嵌合、人源化或人I类抗-CEAMAb或其抗原-结合片段可用具有轻链CDR及重链CDR的单克隆抗体阻断或竞争与CEACAM5和/或CEACAM6结合，所述轻链CDR包含具有氨基酸序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)的CDR1、具有氨基酸序列GTSTLAS(SEQ ID NO：2)的CDR2和具有氨基酸序列QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)的CDR3，所述重链CDR包含具有氨基酸序列DYYMS(SEQ ID NO：4)的CDR1、具有氨基酸序列FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)的CDR2和具有氨基酸序列DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的CDR3。通过多种已知的结合测定中的任一种可进行这种竞争性结合或阻断研究，如图1和图4及它们对应的实施例中所示例。
随着以下更详细地讨论，熟练的技术人员应意识到嵌合抗体保留亲本鼠抗体的框架区(FR)序列，而人源化和人抗体将通常具有人抗体FR序列。优选地，人源化I类抗-CEAMAb包含人KOL抗体的重链FR序列和人REI抗体的轻链FR序列。然而，在适当的情况下，某些鼠FR氨基酸残基可取代对应的人FR氨基酸残基。在优选实施方案中，取代的鼠FR残基可包括选自SEQ ID NO：10的重链氨基酸残基28、29、30、48和49及SEQ ID NO：9的轻链氨基酸残基21、47和60中的一个或多个氨基酸残基。在更优选地实施方案中，人源化I类抗-CEA MAb包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的可变区序列，而嵌合I类抗-CEAMAb包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的可变区序列。
在各种实施方案中，I类抗-CEA抗体将与CEA、MA和NCA结合并且还将与人粒细胞结合。I类抗-CEA MAb与CEACAM5和CEACAM6结合。在I类抗-CEA MAb或其片段是嵌合、人源化或人的情况下，抗体将优选地保留亲本鼠I类抗-CEAMAb的结合特异性。
在某些实施方案中，I类抗-CEAMAb可与至少一种治疗剂和/或诊断剂偶联以形成免疫偶联物。这种免疫偶联物用于向表达CEACAM5或CEACAM6的癌细胞递送治疗剂和/或诊断剂和/或用于癌症的治疗或诊断。在替代实施方案中，I类抗-CEA MAb可作为“裸”(未偶联)的抗体施用。裸抗体或免疫偶联物可在另一种抗癌治疗剂之前、同时或之后施用。
其它实施方案涉及诊断或治疗癌症的方法，所述方法包括给受试者施用I类抗-CEA抗体或其片段。出于诊断目的，抗体可与至少一种诊断剂偶联。使标记的抗体与表达CEA的细胞结合后，可将结合的抗体的分布成像或以其它方式确定。对于表达CEA的肿瘤的治疗，可使I类抗-CEA抗体与至少一种治疗剂偶联并且将免疫偶联物给患者施用。
在替代实施方案中，I类抗-CEA抗体可以是双特异性或多特异性抗体的一部分。这种抗体可含有肿瘤相关抗原(例如CEA)的至少一个结合位点和与可靶向构建体附接的半抗原的至少一个其它结合位点。这种双特异性或多特异性抗体用于癌症诊断或者治疗的预靶向方法，如以下更详细地描述。在使用预靶向的情况下，可给受试者施用双特异性或多特异性抗体并且使其定位于表达CEACAM5或CEACAM6的肿瘤。任选地添加澄清剂以提高未结合的抗体从循环中的清除率。在使未结合的抗体足以从循环中清除的时间后，可给受试者施用与治疗剂和/或诊断剂偶联的可靶向构建体以与定位于肿瘤部位的抗体结合。使用I类抗-CEA抗体递送诊断剂可作为内窥镜检查、血管内或手术中程序的一部分来进行。
在各种实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、激素、酶、反义寡核苷酸或其组合物，任选地在药学上可接受的媒介物中配制。优选地，治疗剂是选自药物或毒素的细胞毒素剂。预期药物可具有选自由抗有丝分裂剂、烷化剂、抗代谢剂、抗血管生成剂、细胞凋亡剂、生物碱、COX-2和抗生素剂及其组合组成的组的药物性质。优选地，药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、经取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、奥沙利铂、阿霉素及它们的类似物。示例性的寡核苷酸可包括siRNA或RNAi分子。治疗性寡核苷酸的许多实例是本领域已知的并且任何这种已知的实例可与受试者I类抗-CEA抗体或其片段附接。
当治疗剂是微生物、植物或动物毒素时，毒素可选自由以下组成的组：篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞外毒素和假单胞内毒素。
在另一实施方案中，在单独施用治疗有效量的I类抗-CEA单克隆抗体或其片段或施用I类抗-CEA单克隆抗体和至少一种治疗剂之前施用免疫调节剂。免疫调节剂可选自由以下组成的组：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素及其组合。优选地，淋巴毒素是肿瘤坏死因子(TNF)，造血因子是白介素(IL)，集落刺激因子是粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))，干扰素是干扰素-α、-β或-γ，并且干细胞生长因子命名为″S1因子″。
细胞因子中所包括的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、试剂盒-配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物和天然序列细胞因子的生物活性等价物的蛋白质。在暴露于导致髓样毒性或造血毒性的细胞毒素剂之前、同时或之后施用细胞因子，描述于美国专利No.5,120,525中，其实施例部分以引用方式并入本文。
在某些优选实施方案中，治疗剂是具有20至10,000keV的能量的放射性核素。优选地，放射性核素选自由以下组成的组：111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。
本发明的方法还可包含同时或相继给受试者施用治疗有效量的第二人源化、嵌合、人或鼠单克隆抗体或其片段。第二MAb可与选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原(TAA)结合：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白(tenascin)、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。类似地，该方法可包含同时或相继给受试者施用治疗有效量的选自由I类或II类或III类抗-CEA单克隆抗体或其片段组成的组的第二人源化、嵌合或人单克隆抗体或其片段。在第二抗体或片段与I类抗-CEA抗体同时施用的情况下，它可作为单独的分子或可选择地作为具有I类抗-CEA抗体的双特异性或多特异性抗体构建体的一部分施用。
第二MAb可选自本领域已知的多种抗癌抗体的任一种，包括但不限于hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,151,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.7,074,403)、hMu-9(美国专利No.7,387,772)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)和hR1(美国专利申请No.12/722,645，2010年3月12日提交)，每个引用的专利或申请的实施例部分以引用方式并入本文。第二MAb还可以选自本领域已知的任何抗半抗原抗体，包括但不限于h679(美国专利No.7,429,381)和734(美国专利No.7,405,320)或h734(美国专利No.7,405,320)，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
在各种实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其它抗体构建体可作为融合蛋白或通过使用停靠和锁定(DNL)技术来产生，如以下更详细地描述。已报道用于产生和使用DNL构建体的组合物和方法(参见，例如，美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400及美国专利申请No.12/418,877、12/544,476、12/731,781、12/752,649和12/754,740，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文)。DNL复合物通过选择的效应物与锚定域(AD)或二聚化和停靠域(DDD)肽序列附接来形成。当DDD序列自发地二聚化并与AD序列结合时，形成DNL复合物。几乎任何效应物部分可与DDD或AD序列附接，所述DDD或AD序列包括抗体或抗体片段、肽、蛋白质、酶、毒素、治疗剂、诊断剂、免疫调节剂、聚合物例如聚乙二醇(PEG)、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素及任何其它类型的分子或复合物。在优选实施方案中，DNL复合物可包括包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的抗体或其片段。在其它优选实施方案中，DNL复合物还可包含细胞因子或聚乙二醇部分。这些实施方案是非限定性的并且熟练的技术人员应意识到所要求保护的DNL复合物可包含与几乎任何其它效应物部分附接的I类抗-CEA抗体部分。
附图简述
图1图解了嵌合MN-15(cMN-15)与亲本鼠MN-15抗体的示例性的比较的CEA结合曲线。
图2示出了人KOL抗体(SEQ ID NO：38)、鼠MN-15抗体(SEQ IDNO：10)和人源化MN-15抗体(hMN-15)(SEQ ID NO：8)的重链可变区序列的比较。CDR序列置于方框中并且通过在鼠MN-15序列中加下划线标示人KOL和鼠MN-15FR序列之间的不同。通过在hMN-15序列中加下划线标示hMN-15序列中保留的鼠FR氨基酸。
图3示出了人REI抗体(SEQ ID NO：39)、鼠MN-15抗体(SEQ IDNO：9)和人源化MN-15抗体(hMN-15)(SEQ ID NO：7)的轻链可变区序列的比较。CDR序列置于方框中并且通过在鼠MN-15序列中加下划线标示人REI和鼠MN-15FR序列之间的不同。通过在hMN-15序列中加下划线标示hMN-15序列中保留的鼠FR氨基酸。
图4图解了人源化MN-15(hMN-15)与亲本鼠MN-15抗体的示例性的比较的CEA结合曲线。
图5示出了CEACAM5(左侧)和CEACAM 6(右侧)的结构域的结构示意图。CEACAM5和CEACAM6上由MN-15、MN-3和MN-14抗体识别的表位如所示。
图6示出了体外内皮细胞附着测定的结果。在不存在或存在MN-15Fab’、MN-3Fab’或Ag8Fab’对照的情况下，具有不同量的表达的CEACAM5和CEACAM6的多种肿瘤细胞与HUVEC细胞的附着百分比。将细胞用1μCi/mL的3H-胸苷标记并且添加到HUVEC培养物并且在37℃孵育30分钟。将样品用PBS洗涤3次以去除未附着细胞。将附着肿瘤细胞用0.1N NaOH溶解并且在β-闪烁计数器中测量放射性。测定附着的cpm/添加的总cpm(附着潜力)。提交典型研究的结果。使用的细胞系包括BT-20(CEACAM5+/CEACAM6+)、MCF-7(CEACAM5-/CEACAM6+)、HT-29(CEACAM5-/CEACAM6+)、Moser(CEACAM5+/CEACAM6-)、MCA38cea(CEACAM5+/CEACAM6-)和MCA38(CEACAM5-/CEACAM6-)。MN-15和MN-3诱导对4个细胞系附着的49％至58％的抑制(对于MCF-7、HT-29和BT-20上的MN-3Fab′，P＜0.01；对于三个相同细胞系上的MN-15，P＜0.02；及对于与内皮细胞附着的Moser上的两种Fab，P＜0.05)。
图7图解了示例性的体内微转移研究。上图，用非特异性抗体(A)、MN-14抗-CEACAM5(B)及MN-15抗-CEACAM6(C)染色的GW-39肿瘤部分的免疫组织化学并且以100x拍照。下图，植入30μL的GW-39人结肠癌细胞的10％悬浮液的裸鼠的存活率。给小鼠植入MN-3-、MN-15-或hMN-14-Fab′(10μg/mL)预孵育30分钟的细胞。细胞植入后1天小鼠还接受单次100μg剂量的相同Fab′。
优选实施方案的详细描述
本发明提供给患有癌症的受试者施用嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其片段的治疗方法。所述方法用于治疗表达CEACAM5(CEA)和/或CEACAM6的癌症，因为I类抗-CEA抗体与两种抗原都结合。抗体可作为裸(未偶联)抗体或作为与一种或多种治疗剂附接的免疫偶联物施用。裸抗体可在一种或多种其它抗癌治疗剂之前、同时或之后施用。
所述方法对治疗多种癌症是有用的，所述癌症包括但不限于甲状腺髓样癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、子宫癌和卵巢癌，及甚至不以非常高的水平表达CEACAM5或CEACAM6的癌症。例如，考虑治疗用于以至少100ng/g组织的水平表达CEA的癌症。
如本文所使用，短语″I类抗-CEA″抗体或抗体片段是指与CEA抗原(或CD66e)结合并且还与正常的交叉反应抗原(NCA)、胎粪抗原(MA)、粒细胞和CD66a-d结合的抗体或片段(参见，Primus等人，美国专利No.4,818,709，其以引用方式并入本文)。在优选实施方案中，I类抗-CEA抗体是具有轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ IDNO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)的人源化、嵌合或人抗体。
通过裸露的I类抗-CEA抗体杀死肿瘤细胞的机理还未确切知道并且其可能涉及若干机理。据推测单独的裸抗体或与治疗剂的组合可通过阻断它们各自的抗原的生物活性或通过刺激天然免疫功能例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体介导的裂解来影响肿瘤生长。另外，单独的或与治疗剂组合的裸抗体可通过抑制细胞生长和细胞周期进程、诱导细胞凋亡、抑制血管生成、抑制转移活性和/或影响肿瘤细胞附着来治疗和控制癌症。实际上，与原发癌相比，抗-CEA抗体或其片段可更有效地治疗转移瘤，因为转移瘤可对肿瘤细胞附着的拮抗剂更易感。本治疗方法提供这样的治疗计划，该治疗计划可通过调整抗体和一种或多种不同的治疗剂以提供有效的治疗方案而被优化，从而给个体患者提供最大抗肿瘤活性。
在某些替代实施方案中，优选的裸露的鼠、嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体可以是仅包含CEACAM5或CEACAM6的一个结合位点的单价构建体。例如，可利用包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的Fab、Fab′或scFv抗体片段。可使用以下详细描述的技术将这种单价构建体与聚合物(例如PEG)偶联以延长其血清半衰期。另一可选的单价抗体片段可含有人IgG4恒定区和铰链区。在某些实施方案中，可通过用丝氨酸残基替代半胱氨酸残基来改变天然的IgG4序列，如McDonagh等人在(2006，Protein EngDes Sel 19：299-307)中所描述。在其它替代实施方案中，单价抗体片段可由DNL技术构建，也在以下详细描述。
定义
如本文所使用，术语“a”、“an”和“the”可以指单数或复数，除非在上下文中以其它方式明确指出仅是单数含义。
如本文所述的抗体是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成)的免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、scFv(单链Fv)等。与结构无关，抗体片段与由完整抗体识别的相同抗原结合。术语″抗体片段″包括由可变区组成的分离的片段(例如由重链和轻链、重组单链的可变区组成的″Fv″片段)、其中轻链和重链的可变区由肽连接子(″scFv蛋白″)连接的重组单链多肽分子及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。可以不同的方式构建Fv片段以产生多价和/或多特异性结合形式。对于前一种多价体来说，它们与多于一个针对CEA表位的结合位点反应，然而多于一个表位(CEA的表位或甚至针对CEA和不同抗原的表位)与多特异性形式结合。
裸抗体通常是不与治疗剂偶联的完整抗体。这是因为抗体分子的Fc部分提供效应物或免疫功能，例如补体结合和ADCC(抗体依赖的细胞毒性)。然而，对于抗体的治疗功能Fc部分可能是非必需的，但是其它机理例如细胞凋亡、抗血管生成、抗转移活性、抗附着活性例如抑制异型或同型附着和干扰信号转导途径可发挥作用并且干扰疾病进展。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体及其片段，包括鼠抗体以及某些重组抗体，例如嵌合、人源化或人抗体及其片段。如本文所定义，″裸露的″与″未偶联的″同义并且是指未与任何治疗剂连接或偶联。
嵌合抗体是含有抗体重链和轻链的可变域的重组蛋白，包括源自一个物种(优选地啮齿动物抗体)的抗体的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定域则源自人抗体。
人源化抗体将来自一个物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变域转移至人重链和轻链的可变域的重组蛋白。抗体分子的恒定域源自人抗体。
人抗体是从已被″工程化″以响应于抗原攻击而产生特异性人抗体的转基因小鼠获得的抗体。这此技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源重链和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对人抗原特异性的人抗体，并且所述小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7：13(1994)；Lonberg等人，Nature 368：856(1994)及Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)所描述。全人抗体还可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有所述技术是本领域已知的。参见例如，McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)中关于从未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因谱系(gene repertoires)在体外产生人抗体及其片段。在此技术中，将抗体可变域基因框内克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能性质的选择也导致对编码展示那些性质的抗体的基因的选择。这样，噬菌体模拟B细胞的一些性质。可以多种方式进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体还可通过体外活化的B细胞生成。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275，其以引用方式整体并入本文。
治疗剂是与抗体或抗体片段分开、同时或相继施用并且对治疗疾病有用的分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、免疫偶联物、药物、酶、细胞毒素剂、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂或染料、放射性同位素或放射性核素、反义寡核苷酸或其组合。
如本文所使用，术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中一种或多种相同或不同的天然抗体、单链抗体或抗体片段部分以相同或不同的特异性连接。I类抗-CEA融合蛋白包含至少一个CEA结合位点。优选地，I类抗-CEA融合蛋白包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。融合蛋白的价态显示融合蛋白具有的针对抗原或表位的结合臂或位点的总数，即单价的、二价的、三价的或多价的。抗体融合蛋白的多价是指它可利用与抗原结合的多种相互作用，因而提高与抗原或不同抗原结合的亲和力。特异性显示抗体融合蛋白能够结合多少不同类型的抗原或表位，即单特异性的、双特异性的、三特异性的、多特异性的。使用这些定义，天然抗体例如IgG是二价的因为它具有两个结合臂，但为单特异性的因为它与一种类型的抗原或表位结合。在某些实施方案中，融合蛋白可包含与不同的效应物蛋白或肽例如细胞因子、激素、生长因子、结合蛋白、结合肽或其它效应物连接的一种或多种抗体或其片段。示例性的融合蛋白可包含与如下详细地讨论的AD或DDD肽附接的抗体或其片段。
免疫调节剂是当存在时改变、抑制或刺激身体免疫系统的治疗剂。通常地，使用免疫调节剂以起到使刺激免疫细胞(例如巨噬细胞、B-细胞和/或T-细胞)增殖或在免疫级联反应中活化的作用。如本文所述的免疫调节剂的实例是细胞因子，其为与特异性抗原接触后由一种细胞群(例如，致敏T-淋巴细胞)释放的并且其作为细胞之间的细胞间介质起作用的大约5-20kDa的可溶性的小蛋白质。作为熟练的技术人员应理解，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、白介素和若干相关的信号转导分子(例如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素)。趋化因子是细胞因子的亚群。某些白介素和干扰素是刺激T细胞或其它免疫细胞增殖细胞因子的实例。
包括嵌合、人源化和人抗体的单克隆抗体的制备
针对特异性抗原的单克隆抗体(MAb)可由本领域技术人员已知的方法获得。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，及Coligan等人(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，VOL.1，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)[以下称为″Coligan″]。简言之，单克隆抗体可通过以下获得：给小鼠注射包含抗原的组合物，通过去除血清样品来检验抗体产物的存在，去除脾脏以获得B-淋巴细胞，使B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤，克隆杂交瘤，选择生成针对抗原的抗体的阳性克隆，培养生成针对抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
MAb可通过多种完善的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这种分离技术包括使用蛋白-A琼脂糖的亲和色谱法、体积排除色谱法和离子交换色谱法。参见，例如，Coligan于第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，″Purification of ImmunoglobulinG(IgG)″，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，VOL.10，第79-104页(Humana Press，Inc.1992)中。
针对肽骨架的MAb由Ab产生的熟知方法生成。例如，注射弗罗因德完全佐剂中的免疫原，例如(肽)N-KLH，其中KLH是钥孔傶血蓝蛋白，并且N＝1-30，接着将悬浮于弗氏不完全佐剂中的相同免疫原两次后续注射到免疫活性动物中。最终给予动物静脉推注抗原，接着三天后收获脾脏细胞。然后将收获的脾脏细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合并且使用直接结合ELISA来分析所得克隆的培养物上清液的抗肽反应性。可通过使用初始免疫原的肽片段来分析生成的MAb的良好特异性。使用自动化肽合成器可易于制备这些片段。为了产生MAb，分离酶缺陷型杂交瘤使能够选择融合的细胞系。这种技术还可用于产生针对一种或多种螯合部分或其它半抗原部分(例如In(III)-DTPA螯合物)的抗体。针对In(III)-二-DTPA的单克隆小鼠抗体是已知的(Barbet的美国专利No.5,256,395)。
用于产生抗体的另一方法是通过在转基因牲畜的奶中产生。参见，例如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63：141-147，1998；美国专利5,827,690，两者皆以引用方式整体并入本文。制备分别含有编码配对的免疫球蛋白重链和轻链的DNA片段的两种DNA构建体。将DNA片段克隆到含有优先在乳房上皮细胞中表达的启动子序列的表达载体中。实例包括但不限于，来自兔、牛和绵羊酪蛋白基因、牛α-乳球蛋白基因、绵羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸蛋白基因的启动子。优选地，插入的片段在来自乳房特异性基因的同源基因组序列3′端的侧面。这提供了聚腺苷酸化位点和稳定转录物的序列。将表达盒共注射到哺乳动物受精卵的原核中，然后将其植入受体雌性的子宫内并且使之妊娠。出生后，通过DNA印迹分析来筛选出现两种转基因的后代。为了出现抗体，两种重链和轻链基因必须在相同细胞中同时表达。使用本领域已知的标准免疫学方法分析来自转基因雌性的奶的抗体或抗体片段的存在和功能性。抗体可使用本领域已知的标准方法从奶中纯化。
开始产生针对免疫原的抗体后，可从杂交瘤细胞克隆单克隆抗体的可变基因，测序并且随后通过重组技术制备。用于克隆鼠免疫球蛋白可变域的一般技术例如由Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA86：3833(1989)的出版物所描述。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化是本领域技术人员所熟知的。嵌合抗体是含有包括源自动物的一个物种(例如啮齿动物抗体)的CDR的可变域然而抗体分子的其它部分(即恒定域)源自人抗体的重组蛋白。源自人源化和嵌合单克隆抗体的抗体组分的使用缓解了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员所熟知的。举例来说，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)描述了他们如何通过将编码鼠LL2单克隆抗体(抗CD22抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与各自人κ和IgG1恒定区结构域组合产生LL2嵌合体。
嵌合单克隆抗体(MAb)可通过用一种或多种不同的人FR替代嵌合MAb的可变域中的鼠FR的序列来人源化。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，为了恢复鼠抗体的初始亲和力可能需要另外的修饰。这可通过用鼠对应物替代FR区的一种或多种人残基以获得与其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见，例如，Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)及Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。
另外，已知嵌合抗-CEA展示出与其鼠相应部分相当的结合亲和力，人源化抗-CEA MAb的原始形式的任何设计缺陷(如果有)可通过嵌合抗-CEA的轻链和重链与人源化形式混合和匹配来鉴定。优选地，人源化抗-CEA抗体包含轻链可变区CDR序列和重链可变区CDR序列，所述轻链可变区CDR序列具有氨基酸序列SASSRVSYIH(SEQ IDNO：1)的CDR1、具有氨基酸序列GTSTLAS(SEQ ID NO：2)的CDR2和具有氨基酸序列QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)的CDR3，所述重链可变区CDR序列具有氨基酸序列DYYMS(SEQ ID NO：4)的CDR1、具有氨基酸序列FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)的CDR2和具有氨基酸序列DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的CDR3。更优选地，人源化抗-CEA抗体包含人REI抗体的轻链FR序列和人KOL抗体的重链FR序列。更优选地，人源化抗-CEA抗体包含选自SEQ IDNO：10的重链氨基酸残基28、29、30、48和49和SEQ ID NO：9的轻链氨基酸残基21、47和60的一种或多种鼠FR氨基酸残基。
可选择地，来自2种或更多种不同的人抗体的框架序列的组合可用于VH和VKFR序列。人源化MAb的产生例如由Jones等人，Nature321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat′lAcad Sci.USA89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)及Singer等人，J.Immun.150：2844(1993)所描述。此外，人源化、嵌合和人MAb与特异性表位的亲和力可通过CDR的突变来增加，使得较低剂量的抗体可与突变之前较低亲和力MAb的较高剂量一样有效。参见例如，WO0029584A1。
在另一实施方案中，I类抗-CEA单克隆抗体是人抗体。人抗-CEAMAb或另一种人抗体可从转基因非人动物获得。参见，例如，Mendez等人，Nature Genetics，15：146-156(1997)及美国专利No.5,633,425。例如，可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠回收人抗体。通过灭活内源免疫球蛋白基因且引入人免疫球蛋白基因座使小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂并且包含共同占据人基因组的几乎0.2％的大量离散片段。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体谱系，重链和轻链基因座的大部分必须引入到小鼠基因组中。这通过分步方法实现，开始是在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)。因为每个插入片段的大小为大约1Mb，所以YAC构建体需要免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。通过使含有酵母球状体的YAC与小鼠胚胎干细胞融合将两种YAC(一种含有重链基因座且一种含有轻链基因座)分别引入小鼠中。然后将胚胎干细胞克隆微注射到小鼠胚泡中。所得的嵌合雄性就其通过它们的种系转运YAC的能力进行筛选且与鼠抗体产生缺陷的小鼠繁殖。培育两种转基因品系，一种含有人重链基因座且另一种含有人轻链基因座，从而建立响应于免疫而产生人抗体的后代。
还可经微细胞-介导的染色体转移(MMCT)将未重排的人免疫球蛋白基因引入小鼠胚胎干细胞。参见，例如，Tomizuka等人，NatureGenetics，16：133(1997)。在此方法中含有人染色体的微细胞与小鼠胚胎干细胞融合。转移的染色体被稳定地保留，并且成熟嵌合体展示出适当的组织-特异性表达。
作为替代，人抗体片段可从组合免疫球蛋白文库分离。参见，例如，Barbas等人，METHODS：A Companion to Methods in Enzymology2：119(1991)及Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12：433(1994)。许多与由B-细胞永生化生成单克隆抗体相关的困难可通过使用噬菌体展示在大肠杆菌中工程化和表达抗体片段来克服。为了确保高亲和力的回收，单克隆抗体组合免疫球蛋白文库必须含有大的谱系大小。典型方案是使用逆转录酶利用从免疫小鼠的淋巴细胞或脾脏细胞获得的mRNA来合成cDNA。通过PCR分别扩增重链和轻链基因并且连接到噬菌体克隆载体中。产生两种不同的文库，一种含有重链基因且一种含有轻链基因。从每种文库分离噬菌体DNA，并且将重链和轻链序列连接到一起并包装以形成组合文库。每个噬菌体含有重链和轻链cDNA的随机配对并且感染大肠杆菌后指导感染细胞中抗体链的表达。为了鉴定识别所关注抗原的抗体，涂布噬菌体文库，且将空斑中存在的抗体分子转移至过滤器。将过滤器用放射性活性标记的抗原孵育然后洗涤以去除过量的未结合配体。放射自显影图上的放射性活性斑鉴定出含有结合抗原的抗体的空斑。例如，从STRATAGENE克隆系统(La Jolla，CA)可获得对产生人免疫球蛋白噬菌体文库有用的克隆和表达载体。
在一个实施方案中，如Hansen等人，Cancer，71：3478(1993)；Hansen等人，美国专利No.5,874,540；Primus等人，美国专利No.4,818,709及Shively等人，美国专利No.5,081,235中所描述产生抗体，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
抗体片段的产生
某些实施方案涉及优选地包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的I类抗-CEA抗体的片段的使用。与亲本抗体识别相同表位的抗体片段可由已知的技术生成。例如，抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过编码片段的DNA在大肠杆菌中的表达来制备。抗体片段是抗体的抗原结合部分，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等，并且可通过常规方法或通过基因工程技术由整个抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。
例如，可通过用胃蛋白酶酶切抗体以提供标示为F(ab′)2的100Kd片段来产生抗体片段。可使用巯基还原剂和任选的由切割二硫键产生的巯基的阻断基团进一步切割这种片段以产生50Kd的Fab′单价片段。可选择地，使用木瓜蛋白酶的酶切直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法例如由Goldenberg，美国专利No.4,036,945和4,331,647及其中含有的参考文献所描述。此外，参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)；Edelman等人于METHODS IN ENZYMOLOGY VOL.I，第422页(Academic Press 1967)及Coligan于第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
其它切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或还可使用其它酶、化学或基因技术，只要片段与由完整抗体识别的抗原结合。
例如，Fv片段包含VH和VL链的缔合。这种缔合可以是如Inbar等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.69：2659(1972)中所述的非共价缔合。可选择地，可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学制品例如戊二醛交联。参见，例如，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)。优选地，例如Fv片段包含由肽连接子连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备。将结构基因插入随后引入宿主细胞例如大肠杆菌的表达载体中。重组的宿主细胞合成连接肽桥接两个V结构域的单条多肽链。用于产生scFv的方法例如由Whitlow等人，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，2：97(1991)中所描述。还参见Bird等人，Science 242：423(1988)，Ladner等人，美国专利No.4,946,778；Pack等人，Bio Technology 11：1271(1993)及Sandhu，同上。
抗体片段的另一形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR是与结合抗体的表位在结构上互补的抗体的可变区部分，并且比可变区的其余部分更加易变。因此，有时将CDR称为高变区。可变区包含3个CDR。CDR肽可通过构建编码所关注抗体的CDR的基因来获得。这种基因例如通过使用聚合酶链式反应以合成来自抗体产生细胞的RNA的可变区来制备。参见，例如，Larrick等人，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：106(1991)；Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies″，在MONOCLONALANTIBODIES，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编)，第166-179页(Cambridge University Press 1995)中；及Ward等人，″Genetic Manipulation and Expression of Antibodies″，在MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS，Birch等(编)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)中。
其它抗体片段例如单域抗体片段是本领域已知的并且可用于所要求保护的构建体中。可通过标准免疫技术例如从骆驼、羊驼或美洲驼获得单域抗体(VHH)。(参见，例如，Muyldermans等人，TIBS26：230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281：161-75，2003；Maass等人，J Immunol Methods 324：13-25，2007)。VHH可具有潜在的抗原-结合能力并且可与常规VH-VL对无法进入的新型表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG含有约50％骆驼科的仅有重链的IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。羊驼可用已知的抗原(例如TNF-α)免疫，且可分离出结合且中和靶抗原的VHH(Maass等人，2007)。已鉴定出扩增几乎所有的羊驼VHH编码序列的PCR引物，并且该PCR引物可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，该羊驼VHH噬菌体展示文库通过本领域熟知的标准生物淘筛技术可用于抗体片段分离(Maass等人，2007)。
用于治疗的人源化、嵌合和人抗-CEA抗体
各种实施方案涉及使用鼠、嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体及其片段治疗疾病状态(例如癌症)的组合物和方法。优选地，I类抗-CEA抗体或其片段包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ IDNO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)。抗体可用于治疗表达CEACAM5和/或CEACAM6的任何癌症。示例性的表达CEACAM5或CEACAM6的癌症包括但不限于甲状腺髓样癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、造血癌、白血病和卵巢癌。
组合物
本文所要求保护的组合物可包含至少一种I类抗-CEA单克隆抗体(MAb)或其片段。在某些实施方案中，使用的组合物或方法还可包括可与I类抗-CEA抗体偶联或不偶联的至少一种治疗剂。在包含多于一种抗体或抗体片段例如第二种I类抗-CEA抗体的组合物中，第二抗体是非-阻断性的(即，不阻断第一I类抗-CEA抗体或抗体片段与其靶抗原的结合)。
在一个实施方案中，I类抗-CEA单克隆抗体或其片段是人源化的、人的或嵌合的，其中人源化的、人的或嵌合的MAb大体上保留鼠I类抗-CEAMAb的I类抗-CEA结合特异性。在优选实施方案中，I类抗-CEA单克隆抗体或其片段包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。
在优选实施方案中，I类抗-CEA单克隆抗体或其片段是包含人抗体FR和恒定区序列(优选地具有来自人REI和KOL抗体的FR序列)的人源化抗体。框架区(FR)优选地包含从对应的鼠单克隆抗体的FR取代的至少一种氨基酸。更优选地，人源化抗体或其片段包含选自由SEQ ID NO：10的重链氨基酸残基28、29、30、48和49及SEQID NO：9的轻链氨基酸残基21、47和60组成的组的至少一种氨基酸。优选的人源化抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的可变区序列。
另一实施方案是包含嵌合I类抗-CEA单克隆抗体或其片段的组合物，所述组合物任选地含有可以偶联或未偶联的至少一种治疗剂。优选地，嵌合抗体或其片段包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。更优选地，嵌合抗体包含SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10的可变区序列。
本文还描述了包含裸鼠、人源化、嵌合或人I类抗CEA抗体或其片段的组合物。组合物可任选地包含治疗剂，例如第二裸露的或偶联的抗CEA抗体或其抗体片段。在使用第二抗-CEA抗体的情况下，它是非阻断性的，即不阻断第一I类抗-CEA抗体或其片段的结合。换句话说，两种抗-CEA抗体或其片段彼此不阻断，使得两种抗体或其片段与CEA(CD66e)结合。
在其它实施方案中，所要求保护的组合物和方法可包含结合CEACAM5或CEACAM6的与I类抗-CEA抗体相同的表位的抗体或片段，所述I类抗-CEA抗体轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)。例如可通过本领域熟知的竞争性结合测定来确定表位结合的证据。另外，可使用其它抗-CEA抗体(例如II类或III类抗-CEA抗体)以裸露的或偶联的形式与I类抗-CEA抗体组合。例如，一种或多种嵌合或人源化的II类或III类抗-CEA抗体或其片段可与I类抗-CEA抗体或其片段组合。
许多出版物公开了识别CEA和CEA基因家族的不同的成员的MAb，例如Thompson等人，J.Clin.Lab.Anal.5：344(1991)；Kuroki等人，J.Biol.Chem.266：11810(1991)；Nagel等人，Eur.J.Biochem.214：27(1993)；Skubitz等人，J.Immunol.155：5382(1995)；Skubitz等人，J.Leukoc.Biol.60：106(1996)；及Chen等人，Proc.Natl.Acad Sci.93：14851(1996)。
第二抗体或抗体片段可以是未偶联(裸露)的或与至少一种治疗剂(免疫偶联物)偶联的。免疫偶联物可通过将治疗剂与抗体组分间接偶联来制备。一般技术在Shih等人，Int.J.Cancer，41：832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer，46：1101(1990)；及Shih等人，美国专利No.5,057,313中描述。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一种游离胺功能并且负载有多种药物、毒素、螯合剂、硼附加物或其它治疗剂的载体聚合物反应。这种反应产生初始的希夫碱(亚胺)键合，其可通过还原成仲胺而稳定化以形成最终偶联物。然而，如以下讨论的许多制备免疫偶联物的方法是本领域已知的并且可使用任何这种已知的方法。
还考虑包括人源化、嵌合、鼠或人I类抗-CEA抗体或其片段及与不同肿瘤相关抗原(TAA)结合的第二抗体或片段的组合物和使用方法。在一个实施方案中，第二抗体或其片段与选自由以下组成的组的TAA结合：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
方法
本文还描述了用于治疗癌症的方法。示例性的癌症包括表达CEACAM5和/或CEACAM6的甲状腺髓样癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、子宫癌、造血癌、白血病及多种肺癌、头颈部癌、子宫内膜癌、膀胱癌和肝癌。存在于这些类型癌症中CEA水平比甲状腺髓性癌中的低，但是必要的是CEACAM5和/或CEACAM6水平足够高使得I类抗-CEA治疗提供有效的治疗。正常的结肠粘膜具有约100-500ng/g但是以约5mcg/g组织的水平表达CEA的癌症适于用本文所述的方法治疗。
例如，本文涵盖用于治疗癌症的方法，所述方法包括给受试者同时或相继施用任选地在药学上可接受的媒介物中配制的治疗有效量的I类抗-CEA单克隆抗体或其片段和至少一种治疗剂。优选地，I类抗-CEA单克隆抗体或其片段是嵌合、鼠、人源化或人抗体，其中I类抗-CEAMAb大体上保留亲本鼠MAb的I类抗-CEA结合特异性。更优选地，I类抗-CEA抗体包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。优选地，治疗剂是细胞毒素剂，更优选地烷化剂，并且更优选地达卡巴嗪(DTIC)。但在另一实施方案中，治疗剂可以不是DTIC。也可使用其它类型的抗癌细胞抑制剂和细胞毒素剂(例如5-氟尿嘧啶、CPT-11和奥沙利铂)与这些抗体的组合，尤其是在结肠直肠癌的治疗中。在其它癌症类型中，已知有效的抗癌药还是与本文提出的抗体疗法组合的良好候选物。
本文还涵盖用于治疗表达CEACAM5和/或CEACAM6的癌症的方法，所述方法包括给受试者同时或相继施用任选地在药学上可接受的媒介物中配制的治疗有效量的第一I类抗-CEA单克隆抗体或其片段和至少一种治疗剂，以及裸露的或偶联的第二人源化、嵌合、人或鼠单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，第二抗体或其片段与选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原结合：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。在另一实施方案中，第二抗体或其片段可以是非-阻断性的不同的I类抗-CEA抗体或其片段。可选择地，第二抗体或其片段可以是II类或III类抗-CEA抗体或片段。抗体及其片段可与彼此或治疗剂同时或相继施用。
如本文所述的裸露的I类抗-CEA抗体可极大提高癌细胞对一种或多种治疗剂的化疗敏感性。例如，用如裸露的I类抗-CEA抗体治疗结肠癌细胞，所述裸露的I类抗-CEA抗体包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID  NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)，如本文所述，在治疗剂之前或与治疗剂(例如DTIC、CPT-11、5’-氟尿嘧啶(5-FU)或奥沙利铂)同时，提高细胞对治疗剂(例如细胞毒素药)的应答。此外，通过在施用裸抗体或施用裸抗体和至少一种治疗剂之前施用本文所述的免疫调节剂可进一步增强使用单独的裸露的I类抗-CEA抗体或与治疗剂组合的治疗的这些治疗性方法。
多模式疗法包括具有I类抗-CEA抗体或其片段及治疗剂的免疫疗法，补充有施用未偶联或偶联的抗体、未偶联或偶联的融合蛋白或其片段。例如，包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ IDNO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)的未偶联的人源化、嵌合、鼠或人I类抗-CEA MAb或其片段可与另一种裸露的人源化、鼠、嵌合或人I类抗-CEA抗体(例如针对CEA上不同表位的抗体)或与放射性同位素、化疗剂、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素或激素拮抗剂、金属、毒素、反义寡核苷酸(例如抗bcl-2)或其组合偶联的人源化、嵌合、鼠或人I类抗-CEA抗体免疫偶联物组合。
优选地，使用的治疗剂是在标准癌症化疗中使用的药物，例如卵巢癌中使用的紫杉烷或铂类药物，结肠直肠癌中使用的氟尿嘧啶、CPT-11和奥沙利铂(oxaloplatin)药物，胰腺和其它癌症中使用的吉西他滨，或乳腺癌中使用的紫杉烷衍生物。COX-2抑制剂代表另一类试剂，其与典型的细胞毒素剂组合在癌症化疗中显示活性，并且可以相同的方式使用，但另外与单独抗CEA抗体组合或与其它抗TAA抗体组合。任选地，这些药物可与放射性标记的抗体(具有其它抗TAA抗体的抗-CEA抗体偶联物或放射性免疫偶联物)组合使用。
在优选实施方案中，裸露的I类抗-CEA抗体或其片段与达卡巴嗪(DTIC)、阿霉素、环磷酰胺或长春新碱或这些的任何组合相继(之前或之后)或同时施用。例如，DTIC和环磷酰胺可与裸露的I类抗-CEA抗体或其片段相继或同时施用。类似地，5-氟尿嘧啶与单独的或与伊立替康(CPT-11)或奥沙利铂组合的亚叶酸组合是用于治疗结肠直肠癌的方案。对本领域的技术人员所熟知的其它适合的组合化学治疗方案，例如单独使用奥沙利铂或与这些其它药物组合。因此，使用这些化疗剂和裸露的I类抗-CEA抗体或其片段中的任一种的组合疗法可用于治疗癌症。在甲状腺髓样癌中，可优选其它化疗剂，例如一种烷化剂(例如，DTIC)，以及吉西他滨和其它最新型的细胞毒素药。化疗药物和裸露的I类抗-CEA抗体或其片段可以任何顺序施用或一起施用。在优选的多模式疗法中，化疗药物和裸露的I类抗-CEA抗体或其片段在偶联或未偶联的抗-CEA抗体、融合蛋白或其片段之前、之后施用，或与偶联或未偶联的抗-CEA抗体、融合蛋白或其片段共施用。优选地，I类抗-CEA抗体或其片段是人源化抗体或其片段。
多模式治疗的优选治疗时间表是施用hMN-15和DTIC 3天，并且在第7、14、21天仅施用hMN-15，随后每21天施用一次，治疗持续时间12个月。hMN-15的剂量是每次输注0.5-15mg/kg体重，更优选地2-8mg/kg，并且进一步更优选地每次输注3-5mg/kg，并且DTIC的剂量如目前临床上应用的优选剂量，但是也可给予使用的最大优选剂量的2/3或更少，由此减少药物相关的不良反应。可给予重复的药物循环，例如每1-6个月，与连续裸抗体疗法一起，或与放射性标记的抗体、药物-偶联的抗体以及包含某些细胞因子(例如G-CSF和/或GM-CSF)的不同时间表一起，调整每种剂量使得治疗组合不提高对患者的毒性。细胞因子生长因子(例如G-CSF)的应用，可使施用甚至更高剂量的骨髓抑制剂(例如放射性标记的抗体或细胞毒素药)成为可能，并且可对患者单独地调整这些时间表和剂量，取决于他们的疾病状态和先前的疗法、骨髓状态和对另外的细胞毒疗法的耐受性。在优选实施方案中，以每次注射每次剂量100-600毫克蛋白质的剂量施用I类抗-CEA抗体或其片段。更优选地，以每次剂量每次注射300-400毫克蛋白的剂量施用I类抗-CEA抗体或其片段，优选具有重复剂量。优选的抗体时间表是每周输注一次或甚至更低频率，例如每隔一周一次或甚至每3周一次，取决于许多因素，所述因素包括疾病的程度和患者血液中循环的CEA的量。
双特异性和多特异性抗体
在各种实施方案中，包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的I类抗-CEA抗体可并入双特异性或多特异性抗体。双特异性抗体在许多生物医学应用中是有用的。例如，用包含至少一个肿瘤相关抗原的结合位点(TAA)(例如CEACAM 5和/或CEACAM6)以及至少一个与治疗剂或诊断剂偶联的可靶向构建体的结合位点的双特异性抗体预靶向方法也是本领域所熟知的(参见，例如，美国专利No.7,300,644、7,138,103、7,074,405、7,052,872、6,962,702、6,458,933，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文)。在其它实施方案中，包含靶向两个不同的TAA的结合部分或相同TAA的不同表位的双特异性抗体可以具有治疗性用途。
可利用包含任何已知的抗TAA抗体的抗原-结合可变区序列的双特异性抗体，包括但不限于hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,151,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.7,074,403)、hMu-9(美国专利No.7,387,772)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)和hR1(美国专利申请No.12/722,645，提交于2010年3月12日)，每个引用专利或申请的实施例部分以引用方式并入本文。
使用的其它抗体可从多种已知的来源商购获得。例如，分泌杂交瘤细胞系的多种抗体从美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC，Manassas，VA)获得。大量针对多种疾病靶标(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏于ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可获得以在所要求保护的方法和组合物中使用。参见，例如，美国专利No.7,312,318、7,282,567、7,151,164、7,074,403、7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7,037,498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6,994,976、6,994,852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、6,783,758、6,770,450、6,767,711、6,764,688、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,653,104、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、6,576,745、6,572；856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,276、6,395,274、6,387,350、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459、6,331,175、6,306,393、6,254,868、6,187,287、6,183,744、6,129,914、6,120,767、6,096,289、6,077,499、5,922,302、5,874,540、5,814,440、5,798,229、5,789,554、5,776,456、5,736,119、5,716,595、5,677,136、5,587,459、5,443,953、5,525,338，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文。这些抗体仅为示例性的并且多种其它抗体和它们的杂交瘤是本领域已知的。熟练的技术人员应意识到针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤可通过对ATCC、NCBI和/或USPTO数据库简单搜索针对所关注的与选定疾病相关的抗体来获得。可使用本领域熟知的标准技术将克隆的抗体的抗原结合结构域扩增、删除、连接到表达载体、转染到适合的宿主细胞中并且用于蛋白产生。
产生双特异性或多特异性抗体的许多方法已知的，例如在美国专利No.7,405,320中所公开，其实施例部分以引用方式并入本文。双特异性抗体可通过四体杂交瘤(quadroma)方法产生，其涉及两种不同的杂交瘤的融合，每种所述杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature，1983；305：537-540)。
另一种用于产生双特异性抗体的方法使用异型双功能交联剂以化学束缚两种不同的单克隆抗体(Staerz等人，Nature.1985；314：628-631；Perez等人Nature.1985；316：354-356)。还可通过将两种亲本单克隆抗体中的每一种还原为各自的半分子，然后混合且使得再次氧化以获得混合结构来产生双特异性抗体(Staerz和Bevan.ProcNatl Acad Sci U S A.1986；83：1453-1457)。另一替代方法涉及使用合适的连接子化学交联两种或三种分别纯化的Fab’片段(参见，例如，欧洲专利申请0453082)。
其它方法包括通过将不同的可选择标记经逆转录病毒衍生的穿梭载体基因转化到各自的随后融合的亲本杂交瘤(DeMonte等人ProcNatl Acad Sci U S A.1990，87：2941-2945)或用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来提高生成杂交-杂交瘤的效率。
同源VH和VL结构域可与合适的组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽连接子连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。产生scFv的方法公开于在美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,132,405中，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文。使肽连接子的长度减至少于12个氨基酸残基来防止相同链上VH和VL结构域的配对并且迫使VH和VL结构域与其它链上的互补结构域配对，导致功能性多聚体的形成。与3至12个氨基酸残基的连接子连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。在0至2个氨基酸残基的连接体情况下，优选三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)，但低聚反应的确切模式除了取决于连接子长度之外，似乎还取决于组合物以及V-结构域(VH-连接子-VL或VL-连接子-VH)的定向。
在低产量、纯化的必要性、低稳定性或技术的劳动密集性方面，这些用于产生多特异性或双特异性抗体的技术展现出多种困难。最近，已利用称为“停靠和锁定”(DNL)的技术以产生几乎任何所需抗体、抗体片段和其它效应物分子的组合(参见，例如，美国专利No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400及美国专利申请No.12/418,877、12/544,476、12/731,781、12/752,649和12/754,740，每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文)。
停靠和锁定(DNL)
在优选实施方案中，可使用停靠和锁定技术来产生双特异性或多特异性抗体或其它构建体。DNL方法利用cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)之间存在的特异性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264。Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。在1968年首次从兔骨骼肌中分离到PKA，所述PKA在深入研究的通过第二信使cAMP与R亚基的结合而触发的信号转导途径之一中起核心作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚基而保持灭活形式的两个催化亚基组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且每个类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。R亚基已仅作为稳定的二聚体被分离并且已显示该二聚化结构域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚基的结合导致用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，其经其与AKAP停靠通过PKA的区室化来对选择的底物定向(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从1984年第一个AKAP(微管相关蛋白-2)被表征以后(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，已经在酵母到人的范围的物种中鉴定出定位于多种亚细胞位点(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网)的多于50个具有不同结构的AKAP(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA的AKAP的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个体AKAP间相当多样化，其中据报道R II二聚体的结合亲和力在2至90nM的范围内(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP将仅与二聚R亚基结合。对于人R II α，AD与由23个氨基末端残基形成的疏水表面结合(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因而人R IIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域两者都位于在本文称为DDD的相同的N-端44个氨基酸序列中(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人，EMBO J.2001；20：1651)。
我们已研发了利用人R IIα的DDD和AKAP的AD作为将任何两个实体停靠到非共价复合物中的良好连接子组件对(以下称为A和B)的平台技术，所述非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入战略位置处的DDD和AD以促进二硫键的形成而被进一步锁定于稳定束缚的结构。“停靠和锁定”方法的一般方法学如下。实体A通过连接DDD序列与A的前体来构建，产生以下称为a的第一组分。因为DDD序列可能影响二聚体的自发形成，因而A可能由a2构成。实体B通过连接AD序列和B的前体来构建，产生以下称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚体基序将产生与b中含有的AD序列结合的停靠位点，因而促使a2和b易于缔合以形成由a2b构成的二元三聚复合物。随后经二硫键共价保护两个实体的反应使这种结合事件不可逆，因为初始结合相互作用应该使置于DDD和AD上的反应巯基变得接近以特异性连接位点，该反应基于有效局部浓度的原理而非常有效地发生(Chimura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)。使用连接子、接头组件和前体的多种组合，可产生和使用不同的化学计量法的多种DNL构建体，包括但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体DNL构建体。
通过附接远离两个前体的官能团的DDD和AD，预计此类位点特异性连接还维持两个前体的初始活性。这种方法本质上是组合式并且可潜在地应用于位点特异性和共价地连接具有广泛活性的各种物质(包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和其它效应物部分)。在以下实施方案中描述了利用融合蛋白构建AD和DDD偶联效应物的方法，几乎任何蛋白或肽可并入DNL构建体。然而，该技术是非限定性的并且可利用其它偶联方法。
已知多种用于制备融合蛋白的方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码所关注的融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将这种双链核酸插入到用于融合蛋白产生的表达载体中(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)。在此类优选实施方案，AD和/或DDD部分可与效应物蛋白或肽的N-端或C-末端中的任一端附接。然而，熟练的技术人员应意识到AD或DDD部分与效应物部分的附接位点可变化，取决于效应物部分的化学性质和参与其生理活性的效应物部分的一部分。可使用本领域已知的技术进行多种效应物部分的位点特异性附接，例如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。
预靶向
双特异性或多特异性抗体可应用于预靶向技术。预靶向是最初为了解决直接靶向抗体的缓慢血液清除率而研发的多步骤方法，其有助于对正常组织(例如骨髓)的不期望的毒性。利用预靶向，放射性核素或其它治疗剂与数分钟内从血液清除的小递送分子(可靶向构建体或可靶向偶联物)附接。首先施用具有针对可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体，使得游离的抗体从循环中清除且然后施用可靶向构建体。
预靶向方法是本领域熟知的，例如，如Goodwin等人，美国专利No.4,863,713；Goodwin等人，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich等人，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr等人，J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov等人，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等人，J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等人，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter等人，Int.J.Cancer 48：167，1991；Paganelli等人，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等人，Nucl.Med.Commun.12：211，1991；美国专利No.5,256,395；Stickney等人，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等人，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利No.6,077,499、7,011,812、7,300,644、7,074,405、6,962,702、7,387,772、7,052,872、7,138,103、6,090,381和6,472,511中所描述。
在受试者中治疗或诊断疾病或病症的预靶向方法可通过以下步骤提供：(1)给受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地给受试者施用清除组合物，并使得组合物从循环中清除抗体；及(3)给受试者施用可靶向构建体，所述可靶向构建体含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。可通过施用与可靶向构建体偶联的酶，然后通过施用由酶转化为活性形式的前药将该技术还用于抗体依赖性酶前药疗法(ADEPT)。
治疗剂和诊断剂
在某些实施方案中，本文所述的抗体、抗体片段或融合蛋白可作为“裸”抗体、片段或融合蛋白单独施用。在替代实施方案中，抗体、片段或融合蛋白可在至少一种其它治疗剂之前、同时或之后施用。在其它替代实施方案中，抗体、片段或融合蛋白可与至少一种治疗剂和/或诊断剂共价或非共价附接以形成免疫偶联物。
诊断剂优选地选自由放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏剂组成的组。这种诊断剂是熟知的并且可使用任何这种已知的诊断剂。诊断剂的非限定性实例可包括放射性核素例如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它γ-、β-或正电子-发射极。使用的顺磁离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包含脂质体，例如充气脂质体。不透射线的诊断剂可选自钡化合物、镓化合物和铊化合物。多种荧光标记是本领域已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白(phycoerytherin)、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)和荧胺。使用的化学发光标记物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
治疗剂优选地选自由以下组成的组：放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、促凋亡剂、光敏性治疗剂、细胞毒素剂(可以是化疗剂或毒素)及其组合。使用的药物可具有选自由抗有丝分裂剂、抗激酶、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂及其组合物组成的组的药物性质。
示例性的使用的药物包括但不限于，5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecan)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、表叶毒素(epidophyllotoxin)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基尿素、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲(nitrosurea)、光辉霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链唑霉素、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺(temazolomide)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱及长春花生物碱。
使用的毒素可包括篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如豹蛙酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞外毒素和假单胞内毒素。
使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、促血小板生成素及其组合。尤其有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、-β或-γ，及干细胞生长因子例如命名为″S1因子″的干细胞生长因子。包括于细胞因子中的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、试剂盒-配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素和LT。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。
使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-B和IP-10。
对治疗病变组织有用的放射性同位素包括但不限于：111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选地具有在20至6,000keV范围内的衰变能量，优选地对于Auger发射体在60至200keV范围内，对于β发射体在100-2,500keV范围内及对于α发射体在4,000-6,000keV范围内。有用的发射β颗粒的核素的最大衰变能量优选地为20-5,000keV，更优选地为100-4,000keV，并且更优选地为500-2,500keV。还优选的是随着发射Auger的颗粒大体上衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的发射β颗粒的核素的衰变能量优选地＜1,000keV，更优选地＜100keV，并且更优选地＜70keV。还优选的是随着α-颗粒的生成而大体上衰变的放射性核素。这种放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的发射α-颗粒的放射性核素的衰变能量优选地为2,000-10,000keV，更优选地为3,000-8,000keV，并且更优选地为4,000-7,000keV。使用的另外的潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。一些有用的诊断核素可包括124I、123I、131I、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可包括光敏剂或染料。荧光组合物例如荧光染料、及其它色素原或染料例如对可见光敏感的卟啉已被用于通过将适当的光导向损伤来检测和治疗病变。在疗法中，这已称为光辐射、光疗法或光动力学疗法。参见Jori等人(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OFTUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van denBergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，已将单克隆抗体与光活化的染料偶联以实现光疗法。参见Mew等人，J.Immunol.(1983)，130：1473；idem.，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。
皮质类固醇激素可提高其它化疗剂的效力，因而它们经常用于组合治疗。强的松和地塞米松是皮质类固醇激素的实例。
在某些实施方案中，可以使用抗血管生成剂，例如血管抑素、baculostatin、血管能抑制素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应素、2-甲氧雌二醇(methoxyoestradiol)、增殖蛋白-相关蛋白、羧胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他、聚磷酸戊糖、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
其它有用的治疗剂包含寡核苷酸，尤其是优选地直接针对B-细胞恶性肿瘤(例如bcl-2)的癌基因和癌基因产物的反义寡核苷酸。优选的反义寡核苷酸包括称为siRNA或RNAi的反义寡核苷酸。
免疫偶联物
本文所述的抗体、抗体片段或抗体融合蛋白中的任一种可与一种或多种治疗剂或诊断剂偶联。治疗剂不必是相同的但可以是不同的，例如药物和放射性同位素。例如，131I可并入抗体或融合蛋白的酪氨酸及与赖氨酸残基的ε氨基附接的药物。治疗剂和诊断剂还可与例如还原的SH基和/或碳水化合物的侧链附接。许多用于制备治疗剂或诊断剂的共价或非共价偶联物与抗体或融合蛋白的方法是本领域已知的，并且可利用任何此类已知方法。
治疗剂或诊断剂可附接至经二硫键形成而还原的抗体组分的铰链区处。可选择地，此类试剂可使用异型双功能交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)附接。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这种偶联的一般技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等人“Modification ofAntibodies by Chemical Methods”，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)中；Price，“Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies”，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)中。可选择地，治疗剂或诊断剂可经抗体的Fc区中的碳水化合物部分偶联。碳水化合物基团可用于提高与巯基结合的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
经抗体的碳水化合物部分将肽与抗体组分偶联的方法是本领域的技术人员熟知的。参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41：832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)及Shih等人，美国专利No.5,057,313，其以引用方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一种游离胺功能的载体聚合物反应。这种反应产生初始的希夫碱(亚胺)键合，其可通过还原成仲胺而稳定化以形成最终偶联物。
如果用作免疫偶联物的抗体组分的抗体是抗体片段，则Fc区可以不存在。然而，将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区是可能的。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，美国专利No.5,443,953(1995)，Leung等人，美国专利No.6,254,868，每个均以引用方式并入本文。工程化的碳水化合物部分用于附接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，螯合剂可与抗体、抗体片段或融合蛋白或可靶向构建体附接且可用于螯合治疗剂或诊断剂(例如放射性核素)。示例性的螯合剂包括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。偶联的方法和使用螯合剂与金属附接或其它配体与蛋白附接是本领域熟知的(参见，例如，美国专利No.7,563,433，其实施例部分以引用方式并入本文)。
在某些实施方案中，放射性活性金属或顺磁离子可通过与具有长尾巴的试剂反应而与蛋白质或肽附接，所述具有长尾巴的试剂可附接用于结合离子的多种螯合基团。这种尾巴可以是聚合物(例如聚赖氨酸、多糖)或具有可与螯合基团例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)及对此目的有用的已知类似基团结合的侧基的其它衍生的或可衍生的链。
螯合物可直接与抗体或肽连接，例如如美国专利4,824,659中所公开，其以引用方式并入本文。尤其有用的金属-螯合物的组合包括与在60至4,000keV一般能量范围内的用于放射性成像的诊断同位素(例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br)一起使用的2-苯甲基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与对MRI有用的非-放射性活性金属(例如锰、铁和钆)复合时，发生相同的螯合。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA与多种金属和放射性金属(更具体地分别与镓、钇和铜的放射性核素)一起使用。通过根据所关注的金属调整环的大小可使这种金属-螯合物复合物非常稳定。包括其它环形螯合物例如用于稳定结合核素(例如包括用于RAIT的223Ra)所关注的大环聚醚。
最近，已公开了在PET扫描技术中使用的18F-标记方法，例如通过F-18与金属或其它原子例如铝反应。18F-Al偶联物可与螯合基团例如DOTA、NOTA或NETA复合，所述螯合基团直接与抗体附接或在预靶向方法中用于标记可靶向构建体。这种F-18标记技术公开于美国专利No.7,563,433，其实施例部分以引用方式并入本文。
药学上可接受的媒介物
包含待递送给受试者的鼠、人源化、嵌合或人I类抗-CEA MAb的组合物可包含一种或多种药学上可接受的媒介物、一种或多种另外的成分或这些的一些组合。I类抗-CEA抗体及其片段可根据制备药学上有用的组合物的已知方法来配制。无菌磷酸酯-缓冲生理盐水是药学上可接受的媒介物的一个实例。其它可接受的媒介物是本领域所熟知的。参见，例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，及Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。
可配制I类抗-CEA抗体或其片段用于静脉内施用，所述静脉内施用通过例如推注注射或连续输注进行。注射用制剂可与添加的防腐剂在单位剂量形式(例如安瓿)中或在多剂量容器中存在。组合物可采用例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可以呈粉末形式，其在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水复原。
可利用另外的药学方法以控制治疗剂和/或抗体或其片段的作用持续时间。控释制剂可通过使用聚合物复合或吸附抗体来制备。例如，生物相容的聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物的基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。Sherwood等人，Bio/Technology10：1446(1992)。来自这种基质的抗体或其片段的释放速率取决于免疫偶联物或抗体的分子量、基质内抗体的量和分散颗粒的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型在Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)及Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版中描述。
还可将I类抗-CEA抗体或其片段皮下施用或通过其它胃肠外途径施用给哺乳动物。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注施用。一般来说，对于人施用的抗体或其片段的剂量将根据例如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和既往医疗史的因素而变化。通常地，需要以单次静脉内输注形式给受者提供在约0.5mg/kg至20mg/kg范围内的抗体或其片段的剂量，尽管可根据情况施用更低或更高的剂量。根据需要可重复这种剂量，例如，每月一次，持续4-10个月，优选地每隔一周一次，持续16周，并且更优选地，每周一次，持续8周。还可以更低的频率给予，例如每隔一周一次，持续数月，或者更频繁地和/或在更长的时间内给予。可在适当调整剂量和方案下，通过多种胃肠外途径给予剂量。
为了治疗目的，与未治疗的对照相比，给哺乳动物以减小肿瘤大小的治疗有效量施用I类抗-CEA抗体或其片段。优选地，I类抗CEA抗体或其片段是人源化抗体或其片段。本发明合适的受试者通常是人，尽管还涵盖非人哺乳动物或动物受试者。如果施用的量是生理上显著的，则该抗体制剂以″治疗有效量″施用。如果试剂的存在导致受者哺乳动物生理上可检测的变化，则该试剂是生理上显著的。
具体地，如果抗体制剂的存在引发抗肿瘤应答，则抗体制剂是生理上显著的。生理上显著的影响可以在受者哺乳动物中引发体液和/或细胞免疫应答。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适用于治疗或诊断患者中病变组织的组分的试剂盒。示例性的试剂盒可包含如本文所述的至少一种抗体、抗体片段或融合蛋白。如果含有施用组分的组合物不配制成经消化道递送(例如通过口腔递送)，则可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。应用于例如胃肠外递送的一种类型的装置是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，可以含有抗体的无菌、液体制剂或冻干制品的预充式注射器或自动注射笔的形式提供I类抗-CEA抗体或其片段(例如，Kivitz等人，Clin.Ther.2006，28：1619-29)。
试剂盒组分可包装到一起或分装到两个或更多个容器中。在一些实施方案，容器可以是含有适于复原的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有适于复原和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于药袋、盘、盒、管或类似容器。可将试剂盒组分包装并且在容器内保持无菌。可包括的另一组分是指导人使用试剂盒的说明。
表达载体
其它实施方案可涉及包含编码的抗体、抗体片段、融合蛋白或双特异性抗体的核酸的DNA序列。可编码和表达的示例性序列包括I类抗-CEA MAb或其片段、包含至少一种I类抗-CEA抗体或其片段的融合蛋白、包含至少一种第一抗体或片段和至少一种第二抗体或片段的融合蛋白。第一和第二抗体可包含I类抗-CEA抗体和/或针对肿瘤或B-细胞相关抗原例如B7、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM6、ED-B纤连蛋白、IL-2、IL-6、IL-25、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MIF、NCA-66、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、T101、TAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、VEGFR、EGFR、PlGF、ILGF、Flt-3、生腱蛋白、补体因子C5、癌基因产物、Kras、cMET、bcl-2和/或可靶向构建体的半抗原的抗体。在优选实施方案中，I类抗体、抗体片段、融合蛋白或双特异性抗体包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可包含可与嵌合、人源化或人可变区序列附接的编码人免疫球蛋白轻链和重链恒定区以及铰链区的序列。载体可另外地含有在选择的宿主细胞、免疫球蛋白增强子及信号或前导序列中表达MAb的启动子。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地在同种异型位置中的氨基酸的至少一种变化为不同IgG1同种异型中发现的氨基酸，并且其中基于EU计数系统，EU的重链的氨基酸253可任选地被替代为丙氨酸。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。
还包括表达抗体或其片段或融合蛋白的方法。熟练的技术人员应意识到基因工程化表达构建体并且插入宿主细胞以表达工程化蛋白的方法是本领域熟知的并且为例行实验的问题。例如在美国专利No.7,531,327、7,537,930和7,608,425中已描述了宿主细胞和克隆的抗体或片段的表达方法，其每个专利的实施例部分均以引用方式并入本文。
用于构建抗-CEA抗体的一般技术
I类抗-CEA抗体的Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序(例如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选)来获得。尤其，来自表达鼠I类抗-CEA MAb的细胞的I类抗-CEA MAb的V基因可通过PCR扩增和DNA测序来鉴定。为了证实它们的可靠性，可如Orlandi等人所描述在细胞培养物中作为嵌合Ab表达克隆的VL和VH基因(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：3833(1989))。然后如Leung等人所描述可基于V基因序列来设计和构建人源化I类抗-CEAMAb(Mol.Immunol.，32：1413(1995))。
cDNA可通过一般分子克隆技术从产生鼠I类抗-CEA MAb的任何已知的杂交瘤细胞系或转染的细胞系来制备(Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人，1989)或由Leung等人所描述的扩展的引物组(BioTechniques，15：286(1993))来扩增。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或与由Leung等人所描述的鼠IgG的恒定区退火的引物(Hybridoma，13：469(1994))来扩增。
含有10μl第一链cDNA产物、10μl 10X PCR缓冲液[500mMKCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2和0.01％(w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、250μM每种dNTP、200nM引物和5个单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)的PCR反应混合物可经历30个循环的PCR。每个PCR循环优选地由以下组成：在94℃变性1min，在50℃退火1.5min并且在72℃聚合1.5min。扩增的Vκ和VH片段可在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，CA)上纯化。人源化的V基因可通过如由Leung等人所描述的长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建(Mol.Immunol.，32：1413(1995))。
Vκ的PCR产物可被亚克隆到含有Ig启动子、信号肽序列和方便的限制性位点的分期载体中(例如基于pBR327的分期载体，VKpBR)以促进VκPCR产物的框内连接。VH的PCR产物可被亚克隆到类似的分期载体(例如基于pBluescript的VHpBS)内。含有各自PCR产物的单独克隆可通过例如Sanger等人的方法来测序(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977))。
含有Vκ和VH序列的表达盒连同启动子和信号肽序列可通过双限制性消化为HindIII-BamHI片段分别从VKpBR和VHpBS中切除。Vκ和VH表达盒可分别连接到合适的表达载体例如pKh和pG1g中(Leung等人，Hybridoma，13：469(1994))。表达载体可共转染到合适的细胞例如骨髓瘤Sp2/0-Ag14(ATCC，VA)内，选择潮霉素抗性的克隆及通过例如ELISA检测监测上清液中嵌合、人源化或人I类抗-CEAMAb的产生。可选择地，Vκ和VH表达盒可被组装到分别切除成XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段的经修饰的分期载体(VKpBR2和VHpBS2)中，并且被亚克隆到单表达载体例如pdHL2，如由Gilles等人所描述(J.Immunol.Methods 125：191(1989)并且也在Losman等人，Cancer，80：2660(1997)中示出)。有用的另一载体是GS载体，如Barnes等人，Cytotechnology 32：109-123(2000)中所描述。其它合适的哺乳动物表达系统在Werner等人，Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II)，Nr.8，870-880(1998)中描述。
可如下通过ELISA进行分泌抗体的克隆的共转染和分析。约10μg VKpKh(轻链表达载体)和20μg VHpG1g(重链表达载体)可用于根据Co等人，J.Immunol.，148：1149(1992)通过电穿孔(BioRad，Richmond，CA)转染5×106个SP2/0骨髓瘤细胞。转染之后，细胞可在37℃，5％CO2下生长于96-孔微量滴定板中完全HSFM培养基(LifeTechnologies，Inc.，Grand Island，NY)中。通过以500单位/ml潮霉素的终浓度添加潮霉素选择培养基(Calbiochem，San Diego，CA)两天后开始选择过程。通常在电穿孔后2-3周出现克隆。然后可扩增培养物用于进一步分析。对嵌合、人源化或人重链的分泌呈阳性的转染瘤克隆可通过ELISA检测来鉴定。
抗体可从如下的细胞培养基中分离。使转染瘤培养物适应无血清培养基。为了产生嵌合抗体，使用HSFM使细胞在滚瓶中生长为500ml培养物。将培养物离心并且将上清液通过0.2μ膜过滤。使经过滤的培养基以1ml/min的流速通过蛋白A柱(1×3cm)。然后用约10倍柱体积的PBS洗涤树脂并且用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.5)将蛋白A-结合的抗体从柱上洗脱。将1.0ml的组分收集于含有10μl 3M Tris(pH 8.6)的管中，并且由在280/260nm的吸光度来确定蛋白浓度。将峰组分汇集，针对PBS透析，并且例如用Centricon30(Amicon，Beverly，MA)浓缩抗体。通过ELISA来确定抗体浓度并且使用PBS将其浓度调整至约1mg/ml。0.01％(w/v)的叠氮化钠便于作为防腐剂加入样品。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，但决不不限于以下实施例。
实施例1.MN-15和其它抗-CEA抗体的产生和表征
在1983年，Primus等人描述了第一组MAb(NP-1、NP-2、NP-3和NP-4)，其定义了NCA-交叉反应、MA-交叉反应和CEA分子上的CEA-特异性表位(Primus等人，Cancer Res 1983，43：686-92)。NP-1与NCA(正常的交叉反应抗原)、MA(胎粪抗原)和CEA(癌胚抗原)反应，并且在离子强度降低的液体溶液中显示提高的对CEA的亲和力，这是与未吸附的山羊抗-CEA血清和从山羊抗-CEA血清纯化的经亲和纯化的NCA交叉反应抗体共享的性质(Primus等人，1983)。CEA上的″离子-敏感性″决定簇首先由Hansen等人使用未吸附的抗-CEA多克隆血清描述(Clin Res 1971，19：143)，并且随后由Haskell等人使用MAb描述(Cancer Res 1983，43：3857-64)。NP-2和NP-3与MA和CEA反应但不与NCA反应，然而NP-4仅与CEA反应(Primus等人，1983)。NP-2与NP-3不同，因为NP-2与CEA的结合被NP-1阻断，然而NP-1不阻断NP-3与CEA的结合。与NCA、MA和CEA反应的MAb命名为I类MAb；与MA和CEA反应但不与NCA反应的MAb命名为II类MAb；并且对CEA有特异性且不与NCA和MA反应的MAb命名为III类MAb(参见，例如，美国专利No.4,818,709，其实施例部分以引用方式并入本文)。本实施例描述了第二代抗-CEA抗体(包括MN-15I类抗-CEAMAb)的产生和表征。
免疫和杂交瘤产生和筛选
用于产生MN-15和其它第二代抗-CEA抗体的免疫原是源自GW-39人结肠腺癌异种移植物的部分纯化的CEA制剂(Hansen等人，1993，Cancer 71：3478-85)。肿瘤生长于金仓鼠的后腿肌肉，将其切除、冷冻并贮存于-20℃。如前所述对肿瘤进行均质化、用高氯酸提取和通过超滤浓缩经透析的提取物(Newman等人，Cancer Res 1974，34：2125-530)。通过用调整至0.05M NaH2PO4的生理盐水透析来平衡经浓缩的提取物，并且在5.0X 90.0cm G-200SEPHADEX凝胶柱上进行色谱。收集无效峰，用生理盐水通过透析平衡并且冷冻于-20℃直至使用。用免疫MEDICS
Figure BDA0000140501800000522
NP-1/NP-3和NP-1/NP-4酶免疫测定(EIA)(Immunomedics，Inc.，Morris Plains，NJ)测定提取物中CEA的浓度。
使用以下方案免疫20-g BALB/c雌性小鼠(Harlan，Madison，WI)，抗-CEA MAb的第二代MN系列源自20-g BALB/c雌性小鼠。首先用7.5μg完全弗罗因德佐剂中的CEA皮下免疫小鼠，然后在第3天皮下推注7.5μg不完全弗罗因德佐剂中的CEA并且在第6天和第9天静脉内推注7.5μg在生理盐水中的CEA。在第20天，静脉内给予第一只小鼠50μg在生理盐水中的CEA；在第23天杀死一只动物，制备脾细胞悬浮液，并且使用聚乙二醇使该细胞与鼠骨髓瘤细胞P2/O-Ag 14融合，然后在含有8-氮鸟嘌呤的培养基中培养。
通过在0.01M和0.10M醋酸铵缓冲液中进行ROCHE 125I-CEA放射性免疫测定(RIA)对杂交瘤上清液筛选CEA反应抗体。将阳性克隆续代克隆。通过全血间接荧光流式细胞仪分析来测定CEA-反应的MAb的粒细胞反应性(Sharkey等人，Cancer Res.，1990，50：2823-31)。选择具有与NP-2和NP-3的性质类似的性质的命名为MN-2和MN-6的两种MAb用于另外的研发。第三MAb、MN-3与粒细胞反应，但与NP-1和NP-2不同，不显示CEA结合的离子敏感性；其也被选择用于研发。
如上所述对用于第二融合的小鼠在第1、3、6和9天进行免疫。在第278天静脉内给予65μg在生理盐水中的CEA并且在第404天给予在90μg生理盐水中的CEA。在第407天杀死。融合和筛选方案与用于第一只小鼠的相同。第二融合产生具有与NP-4的性质一致的性质的一种克隆(MN-14)，所述性质为其不与粒细胞反应，仅与ROCHE
Figure BDA0000140501800000531
CEA RIA中的125I-CEA的30-40％结合，并且在RIA中不显示CEA结合的离子敏感性。产生具有与NP-1、MN-15的性质相同的性质的粒细胞反应抗体的第二克隆也源自此融合。
MAb-IgG纯化/表征
在4℃下通过蛋白A和离子-交换柱色谱法从CD2F1小鼠(CharlesRiver Laboratories，Wilmington，MA)中产生的腹水液纯化MAb。所有的MAb都是具有κ轻链的IgG1同种型，如通过双凝胶扩散所测定。
酶免疫分析
这些研究中所使用的三明治EIA的试剂、制剂、标准和测定方案已在别处描述(Hansen等人，Clin Chem 1989，35：146-51)。在用NP-1涂布的微孔中进行所有分析，除了一个实验用MN-15涂布微孔之外。以顺序模式进行所有分析，首先加入CEA，孵育，洗涤孔并且加入MAb-辣根过氧化物酶探针。第二次孵育后，通过洗掉未结合的探针、加入底物(邻苯二胺/过氧化氢)、加入酸以停止反应及通过在490nm读取吸光度对彩色产物定量来测定与CEA结合的探针的量。辣根过氧化物酶与MAb NP-4、MN-3、MN-6和MN-14偶联，如前对NP-3所描述(Hansen等人，Clin Chem 1989，35：146-51)。稀释所有的偶联物以与先前用NP-3-辣根过氧化物酶探针建立的剂量-反应曲线匹配。用NP-4、MN-3、MN-6和MN-14制备的探针都给出GW-39CEA标准物的线性剂量-反应曲线。
MA标准物
将胎粪在10体积去离子水中匀化并且使混合物以40,000X g离心30分钟。将上清液从沉淀中轻轻倒出并且贮存于-20℃。通过用NP-1/NP-3EIA分析来测定MA标准物中MA与CEA的量(以ng/ml计)。用NP-1/NP-4分析来测定MA标准物中CEA的量(以ng/ml计)并且发现其为用NP-1/NP-3EIA测定的总MA/CEA活性的15％。
阻断研究
在与关于定量CEA所述的相同的条件下进行阻断研究。为了评估酶探针结合的阻断，通过使用25ng/ml CEA标准物将微孔装载CEA。将未标记MAb加入MAb-酶偶联物，并且如关于用NP-3探针定量CEA所述，完成EIA分析。
组织反应性
使用研发的与ORTHO SPECTRUM
Figure BDA0000140501800000541
I11流式细胞仪(OrthoDiagnostic Systems，Inc.，Raritan，NJ)一起使用的全血染色方法，通过活细胞间接免疫荧光法测定与血淋巴细胞的免疫反应性。通过在冷冻部分和从包埋于Paraplast-II中的组织切除的5-μm部分上进行免疫组织学检查来测定Mab的组织反应性。如前所述用20μg/ml的MAb浓度在冷冻部分上进行间接免疫荧光法(Pawlak-Byczkowska等人，Cancer Res 1989，49：4568-77)。根据制造商建议的方案使用10μg/ml的MAb浓度用亲和素-生物素辣根过氧化物酶复合物方法进行部分的免疫过氧化物酶染色(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。
动物研究
对于放射性定位的研究，给予4-5周雌性无胸腺小鼠(nu/nu；Harlan，Indianapolis，IN)皮下注射0.2ml由无胸腺小鼠中连续增殖的肿瘤制备的GW-39的10％悬浮液。2周后，给予小鼠静脉内注射大约1μg 131I-标记的NP-4或MN-14。7和14天后杀死动物；去除器官并如先前所述测定器官中的放射性(Sharkey等人，Cancer Res 1990，50：828s-34s)。
结果
MAb MN-3和MN-6与MA反应，然而MN-14无法检测MA。用NP-1-涂布的装载25ng/ml CEA的微孔滴定所有的MAb-辣根过氧化物酶探针以获得0.6-0.8的吸光度。用MN-15涂布的微孔产生的结果与来自用NP-1涂布的微孔的结果相同。将CEA和MA标准物作为编码样本呈送到商业实验室进行各自的商业分析。据预期ROCHE
Figure BDA0000140501800000551
CEA EIA可能对CEA具有特异性，因为ROCHE
Figure BDA0000140501800000552
分析使用MAb T86.44，一种与CEA反应但不与MA反应的MAb(Neumaier等人，J Immunol 1985，135：3604-09)。HYBRITECH
Figure BDA0000140501800000553
和ABBOTT商业CEAEIA显示与MA的交叉反应性(未示出)。
如通过将增加量的CEA加入固定量的Mab并且通过高压液相色谱上浆凝胶分析测定游离抗体和结合抗体所测定，放射性碘标记的MN-14对CEA的亲和力是NP-4的10倍。这项研究中使用100ng/ml放射性活性抗体以测定输注1μg抗体后近似于血液中存在的抗体的血清浓度的Mab的亲和力。需要1至2μg/ml CEA以复合50％NP-4，其中MN-14的50％复合由大约0.2μg/ml CEA获得(结果未示出)。
发现NP-4和MN-14的正常组织反应性是相同的，两者均不与血粒细胞、脾脏、正常的肝脏及所有其它正常的组织反应(结肠除外)(未示出)。用两种Mab对正常结肠的染色位于上皮细胞的糖萼上(未示出)。来自10个不同患者结肠直肠癌部分和1个患者肺癌部分的染色显示与两种MAb相同的染色模式，但用MN-14持续观察到更强的染色(未示出)。
确定在冷冻部分和通过常规组织方法(固定于甲醛溶液且包埋于Paraplast)制备的部分上进行的用MN-2和MN-3对脾脏部分免疫过氧化物酶染色的结果。与MN-3(脾脏部分)反应的粒细胞抗原在固定于甲醛溶液且包埋于Paraplast的部分中染色，然而在固定于甲醛溶液并包埋于Paraplast的部分中粒细胞中未检测出与MN-2反应的抗原(未示出)。相比之下，在固定于甲醛溶液和包埋于Paraplast中的结肠癌部分存在MN-2强烈染色的CEA(未示出)。MN-2染色的模式与使用MN-3和MN-14观察到的类似。尽管阻断研究不能证明两种MAb与相同的表位反应，但阻断未提供与单独表位具有反应性的证据。
为了评估由MN-14对NP-4的交叉阻断，用25μg CEA利用如上所述的试剂孵育NP-1涂布的微孔。然后洗涤微孔并且加入具有和不具有50μg/ml MN-14的NP-4-辣根过氧化物酶探针。孵育后，轻轻倒出孔中的上清液，洗涤孔，并且完成分析。大于50％的NP-4探针的结合被抑制。在类似的实验条件下显示未阻断NP-3探针的结合。用以上对NP-4使用的相同方案来评估NP-3探针结合的阻断。MN-3和MN-6阻断NP-3探针对CEA的结合。
NP-1和MN-15似乎具有类似的性质，显示出高粒细胞反应性、与离子敏感CEA决定簇的表位的结合及当涂布在微孔(未示出)上时迅速有效地将CEA从溶液捕获。NP-2和MN-2与离子-敏感决定簇结合但与NP-1不同之处在于与血粒细胞具有更低的反应性并且与被在组织学检查中使用的常规组织方法破坏的粒细胞抗原反应(未示出)。MN-3与粒细胞强烈反应但不与离子-敏感决定簇反应(未示出)。它还与结合NP-1的CEA反应，然而NP-2显示出由NP-1产生的交叉阻断(未示出)。NP-3、MN-6、NP-4和MN-14不与粒细胞或离子敏感决定簇反应(未示出)。NP-3和MN-6与MA反应，然而NP-4和MN-14不与MA反应(未示出)。
已进行了若干肿瘤定位研究以比较放射性碘标记的NP-4与MN-14的功效，其中在两项研究中显示出对MN-14优异的靶向且在第三项研究中显示出等效地靶向(未示出)。在每个时间点对20只动物注射抗体中的每一种。如所观察，与NP-4相比较，在注射后7天和14天MN-14提供显著提高的肿瘤摄取(分别P＜0.02和P＜0.001)。正常器官或血液中两种抗体的摄取无显著不同(未示出)。
讨论
MN-14符合III类抗-CEAMab的所有标准，不通过EIA与MA反应且不染色正常组织(正常结肠除外)。这项研究为与MA的反应性缺乏是对选择III类抗-CEA MAb唯一的最有用的参数这一建议提供了支持。可在CEA MAb的分类中误导单独的阻断实验，如根据由International Workshop出版的关于与CEA反应的MAb的表位反应性的广泛的数据而明显(Hammarstrom等人，Cancer Res 1989，49：4852-58)。尽管阻断实验将许多III类MAb置于Gold组1(T84.66、II-16、II-7、II-10)，但与MA强烈反应且与NCA微弱反应的CEA66交叉阻断III类MAb，II-16的CEA结合。同样置于Gold组1中的MAb B7.8.5阻断II-16的结合但与NCA反应。因而，基于MAb与CEA结合的交叉阻断而构建的Gold组1含有I类、II类和III类MAb。
当用放射性碘标记的MAb测定时MN-14的亲和力比NP-4的大大约10倍且在相同的分析条件下测定游离的与抗原-结合的抗体。在这项研究中针对NP-4测定的亲和力比之前报道的用125I-CEA代替放射性标记的NP-4的显著地低(Primus等人，1983)。MN-14，与NP-4和T86.44一样，结合少于50％放射性碘标记的CEA。就T86.44而言，已将125I的低结合归因于T86.44反应表位被放射性破坏。如果放射性导致NP-4-反应表位破坏，则未标记的CEA将更有效地置换NP-4，导致亲和常数错误地提高。出于这个原因，我们选择通过使用放射性碘标记的抗体直接结合而不是通过竞争阻断125I-CEA与抗体结合的方法来比较NP-4与MN-14的亲和力。
这项研究还证实了Bormer等人(Clin Chem 1991，37：1736-39)的发现，在商业ROCHE
Figure BDA0000140501800000571
CEAEIA中用作探针的T84.66MAb不与MA反应，然而商业ABBOTT
Figure BDA0000140501800000572
和HYBRITECHCEAEIA使用同样地与MA和CEA反应的MAb。在具有人结肠癌异种移植物的无胸腺小鼠的实验中已证明，与NP-4相比较，针对MN-14的靶向得以持续地提高(未示出)。然而针对NP-4靶向的结果在实验之间是高度可变的；并且如本文呈现的数据所证实的，已经不可能得出优异的靶向是否由提高的结合或抗体在肿瘤中更长的滞留所引起的结论。
已通过临床放射性闪烁扫描术研究评估了4种MN MAb。MN-3强靶向于骨髓粒细胞且对潜伏感染和炎症的放射性免疫检测研究。在含有CEA的癌症的放射性免疫检测中MN-2和MN-6显示出类似的缺乏，如对NP-2和NP-3所观察。131I-MN-2靶向骨髓，并且131I-MN-6附着于正常结肠的管腔中(未公开的结果)。在I期临床研究中用131I-MN-14通过放射性免疫检测以检测含有CEA的肿瘤证实优异的特异性和敏感性，且这项研究的结果已被描述(Sharkey等人，Cancer1993，71：2082-96)。
结论
已生成一组第二代抗癌胚抗原(抗-CEA)单克隆抗体(MAb)，且与用于区分CEA与胎粪抗原(MA)的第一组MAb比较特异性。
4种MAb具有与第一代NP MAb组类似的特异性。MN-15与它的第一代等价物NP-1一样，与正常的交叉反应抗原(NCA)、MA和CEA反应。MN-15和NP-1与粒细胞强烈反应。MN-2具有与II类NP-2类似的性质，与MA和CEA反应，通过NP-1交叉阻断与CEA结合，并且与粒细胞具有低反应性。NP-2和MN-2均染色冷冻组织部分中的粒细胞但对固定于甲醛溶液及包埋于Paraplast的部分中的粒细胞显示极低染色。MN-14显示与III类抗-CEA-特异性MAb NP-4类似的性质，不与NCA和MA反应。与NP-4相比较，MN-14在人结肠瘤异种移植模型中显示显著优异的肿瘤靶向且对结肠癌的冷冻部分始终较强染色。1/5的MAb、MN-3具有不同于MAb的NP系列的独特性质，与粒细胞强烈反应但未显示由MN-15和NP-1展示的CEA的液相离子-敏感性结合。
实施例2.嵌合和人源化MN-15抗体的产生
为了制备嵌合MN-15抗体，将鼠MN-15可变区序列与人IgG1恒定区序列附接，如Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)中所描述。用于构建嵌合MN-15(cMN-15)的鼠MN-15VK(SEQ ID NO：9)和MN-15VH(SEQ ID NO：10)的序列如图2和图3中所示。图1示出了鼠MN-15与嵌合MN-15竞争辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠MN-15的竞争性结合研究的结果。图1显示了cMN-15构建体具有几乎与亲本鼠MN-15抗体相同的CEA的亲和力，其具有纳摩尔范围内的解离常数。如预期的那样，与CEA而不是MN-15(A1B1)的不同表位结合的MN-3(氨基末端)和MN-14(A3-B3)抗体不竞争与HRP-标记的鼠MN-15结合。
为了人源化MN-15抗体，基于与其鼠对应物的序列同源性选择人可变FR。发现与人KOL VH和REI VK FR具有最大同源性。将编码鼠MN-15CDR的寡核苷酸分别移植到这些重链和轻链可变区结构域上。MN-15CDR序列包括轻链CDR1(SASSRVSYIH，SEQ IDNO：1)、CDR2(GTSTLAS，SEQ ID NO：2)和CDR3(QQWSYNPPT，SEQID NO：3)及重链可变CDR1(DYYMS，SEQ ID NO：4)、CDR2(FIANKANGHTTDYSPSVKG，SEQ ID NO：5)和CDR3(DMGIRWNFDV，SEQ ID NO：6)。根据Orlandi等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86：3833(1989)，将人源化可变区基因沿人IgG1恒定区基因的一侧克隆到表达载体中。
使某些鼠FR氨基酸残基取代到KOL和REI FR区序列中。尤其通过标准突变技术使鼠MN-15抗体的重链氨基酸残基28、29、30、48和49及轻链氨基酸残基21、47和60取代到人FR序列中(Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版(1989))。所得的hMN-15VK(SEQ ID NO：7)和VH(SEQ ID NO：8)氨基酸序列如图2和图3中所示。通过在hMN-15序列中加下划线标示保留在hMN-15序列中的鼠MN-15FR区氨基酸。将CDR序列加粗和加框。
图4示出了鼠、嵌合和人源化MN-15与HRP-标记的鼠MN-15竞争的结合亲和力的比较。如图4中所示，cMN-15和hMN-15构建体对具有亲本鼠MN-15抗体的CEA具有几乎相同的结合亲和力，其中解离常数在纳摩尔范围内。
可通过电穿孔将表达载体DNA转染到SP2/0内。选择和分析分泌多种形式的嵌合或人源化MN-15的转染瘤。对于大规模生产，使细胞系生长于16升搅拌的罐生物反应器系统(Sulzer-Chemtech，Woodbury，NY)中。经0.2μm切向流微量过滤空心纤维单元从生物反应器连续收获培养基。将过滤的收获物连续收集至50升储存器内，贮存于4℃，将培养基流从所述储存器泵送至蛋白-A柱以从产物流收集抗体。通过第二次流过蛋白-A柱且最终流过Q-Sepharose(Pharmacia，Inc.，Piscatway，NJ)来纯化收获的抗体。最终产物的纯度通过SDS-PAGE、免疫电泳、HPLC和免疫反应性来评估。
实施例3.通过靶向CEACAM6(NCA-90)和CEACAM5(CEA)的抗体抑制附着、侵袭和转移
概述
CEACAM5和CEACAM6在许多癌症中过表达并且与附着和侵袭相关。在体外迁移、侵袭和附着分析中使用一组人胰腺癌、乳腺癌和结肠癌细胞系及在体内GW-39人结肠微转移瘤模型中来评估靶向这些抗原上不同表位(由CEACAM5和CEACAM6共享的NH2-末端[MN-3]和A1B1结构域[MN-15]及限制于CEACAM5的A3B3结构域[MN-14])的3种单克隆抗体的作用。MN-3Fab′和MN-15Fab′两者都有效抑制细胞迁移。MN-15Fab′治疗抑制侵袭，降低细胞经细胞外基质(ECM)渗透。MN-3Fab′还减少侵袭但不及5个细胞系中的4个的MN-15Fab′有效。所有的3种单克隆抗体将Fab肿瘤细胞与内皮细胞附着降低至49％至58％。MN-15Fab′但不是MN-3或MN-14Fab诱导6个细胞系中的3个与ECM蛋白、纤连蛋白的附着降低，但与玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原-I和胶原-IV的附着未受影响。体内研究表明用植入GW-39人结肠癌细胞的小鼠的MN-3Fab′或MN-15Fab′治疗提高它们的存活率(分别地，P＜0.025且P＜0.01)。这些研究表明靶向CEACAM5或CEACAM6的抗体Fab影响体外细胞迁移、细胞侵袭及细胞附着，并且MN-15和MN-3Fab具有体内抗转移作用，导致提高具有转移瘤的小鼠的存活率。因而，阻断CEACAM5/CEACAM6的N和A1B1结构域可阻止转移过程。
背景
转移性疾病的根除对实现大多数癌症患者的存活是至关重要的。转移过程由一系列连续步骤组成，包括细胞外基质(ECM)的侵袭、外渗至血管内、运输到循环中、附着到新组织中的内皮细胞、经血管壁外渗及响应于新位点处的器官特异性因子而进行的迁移和增殖(Fidler，Cancer Res 1990，50：6130-8)。本实施例涉及阻止转移的基于抗体的治疗方法的研发。
癌胚抗原(CEA、CEACAM5和CD66e)在许多癌症上表达(Goldenberg等人，J Natl Cancer Inst 1976，57：11-22；Gold&Goldenberg，McGill J Med 1997，3：46-66；Hammarstrom，Semin CancerBiol 1999，9：67-81)并且已参与恶性肿瘤，特别是增强的转移瘤(Yoshioka等人，Jpn J Cancer Res 1998，89：177-85；Hashino等人，Clin Exp Metastasis 1994，12：324-28)。CEACAM5作为化学引诱物和作为附着分子发挥功能(Kim等人，Int J Cancer 1999，82：880-85)，并且已报道在一些实验性肿瘤中提高转移潜力(Minami等人，CancerRes 2001，61：2732-5)。已显示CEACAM5参与在细胞表面的对面处的逆平行CEACAM5分子的N结构域之间的亲同种结合(CEACAM5与CEACAM5)和亲异种结合(CEACAM5与非-CEACAM5分子结合)。核糖酶介导的CEACAM5表达的抑制减少裸鼠尾静脉注射模型中的转移瘤(Wirth等人，Clin Exp Metastasis 2002，19：155-60)，然而抗-CEACAM5的完整Mab、MN-14还延缓由于人结肠直肠癌模型中转移瘤引起的死亡(Blumenthal等人，Cancer Immuno Immunother 2005，54：315-27)并且减缓TT人甲状腺髓样癌异种移植物的生长(Stein&Goldenberg，Mol Cancer Ther 2005，3：1559-64)。
非特异性交叉反应抗原(NCA-90、CEACAM6和CD66c)是也在许多人癌症中表达的CEA家族的成员(Kuroki等人，Anticancer Res1999，19：5599-606)。肿瘤中的CEACAM6与细胞分化负相关(Ilantzis等人，Neoplasia 2002，4：151-63)并且为与结肠直肠癌复发的较高风险相关的独立预测因子(Jantscheff等人，J Clin Oncol 2003，21：3638-46)。CEACAM6还是与细胞附着相关的重要蛋白质；它在嗜中性粒细胞上的表达参与与细胞因子活化的内皮细胞的附着(Kuijpers等人，J Cell Biol 1992，118：457-66)。这种分子展示与CEA家族其它成员及与整联蛋白受体的同型和异型相互作用。靶向N结构域的抗体干扰细胞间相互作用(Yamanka等人，Biochem Biophys ResCommun 1996，219：842-7)。正常细胞通常在与ECM不存在附着相互作用的情况下进行细胞凋亡，这种现象称为″失巢凋亡″(Frisch等人，J Cell Biol 1994，124：616-26)。对失巢凋亡的抵抗(肿瘤细胞的特征)，促进肿瘤形成和转移。CEACAM5和CEACAM6都抑制失巢凋亡且CEACAM6表达的调节改变癌细胞的恶性表型(Duxbury等人，Oncogene 2004)。通过小干扰RNA沉默CEACAM6基因来增强细胞失巢凋亡，响应于不依赖贴壁的条件而增加半胱天冬酶活化，下调Akt细胞存活途径及抑制体内转移瘤(Duxbury等人，Cancer Res 2004，64：3987-93)。这种膜蛋白的表达还经c-src-依赖性机制与增加的侵袭力相关(Duxbury等人，Br J Cancer 2004，91：1384-90)。因而，CEACAM6可代表控制恶性肿瘤和/或转移瘤的治疗靶标。
已表征CEACAM5和CEACAM6上的抗原位点，并且已生成识别特异性表位的抗体的组(Audette等人，Mol Immunol 1987，24：1177-86；Bjerner等人，Tumour Biol 2002，23：249-62)。通过定点缺失和点突变已鉴定细胞间同型附着所需的N区中的3个亚结构域(Taheri等人，J Biol Chem 2000，275：26935-43)。已研发这些区域的结合肽试图阻断附着(Taheri等人，J Biol Chem 2003，278：14632-9)。阻断细胞聚集所需的肽浓度是1mg/mL或为完整抗体的25倍摩尔浓度，尽管预测肽越小渗透越高。这种无效剂量要求可能由于小肽的不稳定性或由于它的低亲和力造成的。我们推定使用单价抗体片段将是对靶向这些结构域更有效的方法，因为与对应的肽相比Mab的稳定性可能会更高且亲和力更高。我们的研究主要涉及所关注的抗体的单价片段，而非完整IgG，因为Fab的单个结合臂将防止肿瘤细胞复合，其可能与二价IgG发生。此外，这允许我们研究CEA/NCA-90-靶向的抗体在没有Fc区的潜在效应细胞诱导活性下的功效。我们已评估一组肿瘤细胞系上CEACAM5和CEACAM6的表达并且已确定靶向CEACAM5和CEACAM6不同表位的若干抗体影响肿瘤细胞体外迁移、侵袭和细胞附着的能力。我们还已评估了这些抗体Fab在控制转移瘤和具有表达CEACAM5/CEACAM6的人结肠癌的小鼠的存活率中的治疗潜力。
材料和方法
抗体产生-MN-15与A1B1结构域结合(Gold组4)且MN-3与CEACAM5和CEACAM6上发现的N结构域结合(Gold组5)，而MN-14与仅在CEACAM5上发现的A3B3结构域结合(Gold组3)(图5)。将MN-3和MN-15用作鼠Mab，然而MN-14以其人源化形式(hMN-14或拉贝珠单抗)被包括(Sharkey等人，Cancer Res 1995，55：5935-45)。
细胞培养-所有细胞系保持在具有补充有10％胎牛血清(FBS)及100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素、4mmol/L谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的RPMI 1640的单层培养物中且在37℃、95％空气和5％CO2下生长。使用1％胰蛋白酶收获细胞并且通过血细胞计数器计数。成活力通过台盼蓝拒染法测定。
CEACAM5和CEACAM6表达-从培养物中收获细胞且等分到含有2mL具有0.2％叠氮化钠和1％合适的阻断血清的杜尔贝科PBS的FACSCANTM管内。用10μg/mL在PBS(+NaN3+1％阻断血清)中的hMN-14抗-CEACAM5在冰上孵育细胞1小时，沉淀(1,440rpm×5分钟)并将上清液轻轻倒出。然后将一些管用10μg/mL鼠MN-15IgG或MN-3IgG(以测定CEACAM6表达)在冰上孵育1小时且沉淀。一旦MN-14与CEACAM5结合，则无论MN-15还是MN-3都不与CEACAM5结合，使得在存在MN-14的情况下仅CEACAM6通过MN-15或MN-3检测。加入与FITC(用于CEACAM5测定的FITC-山羊-抗人和用于CEACAM6测定的FITC-山羊-抗小鼠)偶联的第二抗体(1∶500PBS+NaN3+1％阻断血清中的第二抗体)在冰上在黑暗中保持30分钟。沉淀细胞，用2mL冰冷的PBS+NaN3洗涤两次，并重悬浮于1.5％低聚甲醛。在流式细胞仪上读取荧光。记录阳性细胞的百分比和平均通道荧光(MCF)。使用与hMN-14类似的方法通过免疫组织化学测定GW-39肿瘤异种移植物上CEACAM5和CEACAM6的表达，接着测定生物素化的GAH以检测CEACAM5且与hMN-14预孵育，接着测定mMN-15或mMN-3和生物素化的GAM第二抗体以检测石蜡部分上的CEACAM6。
自发迁移分析-将玻璃盖玻片置于100×15mm皮氏培养皿中且UV灭菌过夜。将来自80％至90％汇合的单细胞层制备癌细胞的悬浮液(2-4×105个细胞/mL)。将细胞涂布于每个盖玻片上且孵育2至5天以达到70％至80％汇合。通过无菌黄色吸管尖端在表面划过产生两条对角线的无细胞路径(″损伤″)。冲洗单细胞层若干次以去除漂浮的细胞且在不存在或存在抗体IgG或Fab′(10μg/mL)的情况下重新加入4mL新鲜培养基且在37℃孵育。18至24小时后，去除培养基并且将盖玻片用1mL Wright-Giemsa染色1分钟。用蒸馏水洗掉染剂，风干，且用Cytoseal 60固定在载玻片上。通过计数迁移到10个代表区域中损伤区的细胞的数量来评估损伤空间的再增殖。对迁移区拍照用于存档。
内皮细胞附着分析-人脐静脉内皮细胞(HUVEC；Cambrex，SanDiego，CA.)在具有5％CO2的湿润空气中在37℃在EGM培养基中于胶原涂布的皿中生长。传代2至5代，分析24小时前将细胞在96-孔板中以4×104个细胞/孔的密度涂布。分析前4小时加入白介素-1β(IL-1β，1ng/mL)。在研究开始时，去除具有IL-1β的培养基且加入具有1％牛血清白蛋白(BSA)的新鲜DMEM且孵育30分钟。加入不具有抗体或具有10μg/mL MN-15Fab′、MN-3Fab′或Ag8Fab′的新鲜培养基。将用3H-胸苷(100μL/孔，使用1.0μCi/mL)预先标记过夜的肿瘤细胞(1×106个细胞/mL)加入HUVEC培养物且在37℃在具有20％FBS的培养基中旋转孵育30分钟。用PBS洗涤样品3次以去除未附着细胞。用0.1N NaOH溶解附着的细胞且在β闪烁计数器中测量放射性。测定附着的cpm/加入的总cpm(附着潜力)。
与细胞外基质蛋白附着的分析-使用来自CHEMICON
Figure BDA0000140501800000651
的CYTOMATRIXTM筛选试剂盒(试剂盒#ECM205，Temecula，CA)进行分析。试剂盒含有具有涂布有纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原-I或胶原-IV的条带的96-孔板。亚汇合细胞培养物用于这些研究。将细胞(1×106个细胞/mL)接种于涂布的基质上且在37℃在CO2孵育箱内在含有Ca2+/Mg2+(200μL/孔)的PBS中孵育1小时。将附着细胞固定且染色。洗涤板以去除未附着的细胞且用100μL/孔MTS(CellTiter Aq 96，PROMEGAMadison，WI)在室温染色5分钟。以PBS洗涤3次去除过量的染剂。每个孔加入增溶缓冲液[100μL 0.1mol/LNaH2PO4(pH 4.5)和50％乙醇的50∶50混合物]。使用吸光度读数(A540 nm-A570nm)测定相对附着。
基于胶原的侵袭分析-使用CHEMICON
Figure BDA0000140501800000653
试剂盒(#ECM551，MILLIPOREBillerica，MA)进行分析。肿瘤细胞为80％汇合且在使用分析前血清-饥饿18至24小时。用5mL 2mmol/LEDTA/PBS/100-mm皿来收获细胞且在37℃孵育5至15分钟。将细胞收集到10至20mL淬灭培养基(含有5％BSA的无血清DMEM)中以灭活来自收获缓冲液的胰蛋白酶/EDTA。使细胞沉淀，重悬浮于淬灭培养基(1×106个细胞/mL)中，且将合适的抗体Fab加入到单独的细胞等份中。如下测定细胞侵袭潜力。在37℃在5％CO2孵育箱中孵育期72小时后测量基线侵袭和在存在化学引诱物(10％FBS)的情况下的侵袭。侵袭室的胶原-涂布的聚碳酸酯膜插入物的底部在室温置于400μL细胞染剂中20分钟并且洗涤。提取染料且转移至96-孔微量滴定板用于比色测量(A560nm)。
体内治疗研究-雌性无胸腺裸鼠(6至8周龄)从TACONIC
Figure BDA0000140501800000661
(Germantown，NY)购买。使用我们的CEACAM5+/CEACAM6+GW-39肺内微转移模型(GW-39iv)进行治疗研究(Sharkey等人，J Natl Cancer Inst 1991，83：627-32；Blumenthal等人，Cancer Res 1992，52：6036-44)。GW-39人结肠癌已从1966起保持为连续移植印戒细胞癌细胞系(Goldenberg等人，Transplantation1966，4：760-4)。使用在裸鼠中生长的Stock s.c.GW肿瘤制备10％细胞悬浮液。将细胞(30μL)静脉注射到5至6周龄雌性裸鼠的尾静脉内。这导致～50至100个肿瘤结节在肺脏中发育且中位存活时间7至9周。植入前用抗体体外(10μg/mL)预先治疗细胞，且然后在植入后1天给予小鼠一次另外的剂量(100μg/小鼠，静脉内)。每周监测体重且记录动物存活率。由Kaplan-Meier估计的存活曲线分析结果，并且用存活曲线的对数级比较来测定显著性。还测定每个治疗组的中位存活时间。所有研究使用10只小鼠/治疗组。
结果
细胞系中CEACAM5和CEACAM6的表达-一组31至33种常用的实体瘤细胞系中的CEACAM5和CEACAM6表达的流式细胞仪分析表明29种中的仅6种(20.7％)表达显著量的CEACAM5，然而30种细胞系中的16种(53.3％)对CEACAM6呈阳性(表1)。两种癌细胞系为CEACAM5+/CEACAM6-(Moser和LNCAP)，4种癌细胞系为CEACAM5+/CEACAM6+，且12种癌细胞系为CEACAM5-/CEANCAM6+。CEACAM6+细胞系包括10种乳腺癌中的7种、4种卵巢癌中的1种、4种结肠癌中的3种、4种胰腺癌中的3种、6种前列腺癌中的1种及4种非小细胞肺癌细胞系中的2种。许多这些肿瘤细胞系具有＞95％的表达CEACAM6抗原的细胞，且在一些情况下，表达非常高(对于ZR75-30，MCF则为641，对于BXPC3则为702且对于CaPAN-1则为476)。相比之下，大多数表达阳性CEACAM5的细胞系具有＜60％的表达抗原的细胞，MCF＜120。
表1.对每种组织型分析的组织核心的数量
Figure BDA0000140501800000671
抗-CEACAM5和抗-CEACAM6抗体对细胞迁移的作用-使用损伤-愈合分析，我们在一组细胞系中评估体外细胞迁移活性。LS174T和HT-29细胞显示最强的迁移活性，然而ZR75-30、MCF-7和BXPC3细胞显示极小的迁移活性(结果未示出)。与不相关抗体相比较，MN-3和MN-15完整IgG和Fab′都减少两种细胞系中的迁移。在HT-29中，对于MN-3IgG和Fab′，迁移细胞的数量/区域分别从14.9±9.1降至6.1±0.9和3.7±1.6个细胞，且对于MN-15IgG和Fab′，分别降至5.5±1.8和5.4±0.8(对于MAb治疗与未治疗细胞的所有比较，P＜0.01；对于每个臂，n＝10)。在LS174T研究中，未治疗的细胞具有38.8±10.9个迁移细胞/区域，然而用MN-3IgG或Fab′治疗的细胞分别具有21.4±5.2和18.1±1.6个迁移细胞(与未治疗的相比，P＜0.001)，且用MN-15IgG或Fab′治疗的细胞分别具有20.3±0.1和21.6±1.2个迁移细胞(与未治疗的相比，P＜0.001)。因而，阻断具有完整IgG或单价Fab的CEACAM6的N或A1B1结构域抑制体外迁移。
MN-15和MN-3对肿瘤细胞与内皮细胞附着的作用-因为已知CEACAM5和CEACAM6均具有附着作用，我们评估了阻断这些抗原是否降低与内皮细胞的附着(图6)。在CEACAM5-/CEACAM6-MCA38鼠结肠癌细胞系中，无论靶向N结构域的MN-3Fab′还是靶向CEACAM6的A1B1结构域的MN-15Fab′对肿瘤细胞-内皮细胞附着无作用(未示出)。相比之下，两种抗体使内皮细胞与MCA38cea(人CEA转染的细胞系)的结合从11.68±0.77％降至6.42±2.1％(MN-3)和5.53±1.15％(MN-15)，这对两种Fab来说是显著的(P＜0.05)(图6)。两种抗体在4种其它细胞系中诱导49％至58％附着抑制(对于MCF-7、HT-29和BT-20上的MN-3Fab′，P＜0.01；对于3个相同细胞系上的MN-15，P＜0.02；且与内皮细胞附着的Moser上的两种Fab，P＜0.05，图6)。同种型-匹配的不相关抗体Fab′(Ag8)和MN-14抗-CEAFab′都不影响肿瘤细胞-内皮细胞附着。抗附着作用的大小似乎与表达的CEACAM5或CEACAM6的量严格相关，因为MN-15Fab′导致HT-29细胞(48％)中的附着与表达更多CEACAM6的MCF-7细胞(41％)相比有较大降低。
抗-CEACAM5和抗-CEACAM6抗体对肿瘤细胞与细胞外基质蛋 白附着的作用-除了与内皮细胞结合的肿瘤细胞之外，这些细胞还可结合ECM蛋白。肿瘤细胞与ECM蛋白结合的程度在不同的细胞系之间变化。MCF-7与5种蛋白中的4种良好地结合(A560nm＞1.1)(除层粘连蛋白外(A560nm＝0.2±0.04))，然而ZR75-30与所评估的所有5种ECM蛋白弱附着(A560nm＜0.45)。MDA-468与胶原-I和胶原-IV相当良好地结合(分别A560nm＝1.25±0.07和0.97±0.03)但与纤连蛋白、玻连蛋白或层粘连蛋白结合不太好。在CaPAN-1观察到相反模式(对于纤连蛋白A560nm＝1.78±0.21，对于玻连蛋白为0.88±0.11，对于层粘连蛋白为1.14±0.09，对于胶原-I为0.07±0.00，且对于胶原-IV为0.13±0.08)。任何抗体(IgG或Fab′)都不调节与玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原-I或胶原-IV的附着(结果未示出)。然而，MN-15IgG将MCF-7、MDA-468和CaPAN-1与纤连蛋白的附着分别降低了29％(P＜0.01)、51％(P＜0.001)和47％(P＜0.02)，而不影响ZR75-30、BXPC3或Moser与纤连蛋白的结合。这3种MAb-无应答细胞系中的两种具有与纤连蛋白的最低基线附着。
MN-3、MN-15和MN-14Fab对肿瘤细胞侵袭的作用-响应于作为化学引诱物的FBS的特异性侵袭为在不存在FBS的情况下(未示出)的1.9倍(LS174T)至7.4倍(BXPC3)。MN-15Fab′比MN-3Fab′更有效地减少5种表达CEACAM5、CEACAM6或两种抗原的细胞系中体外肿瘤细胞侵袭。MN-14抗-CEA(CEACAM5)在大多数细胞系中对肿瘤细胞侵袭没有作用。MDA-231不表达抗原，且不通过MN-3或MN-15IgG或Fab′降低其侵袭。对于5种抗原阳性细胞系，给定抗体的完整IgG和单价Fab′均同样地有效。例如，MN-15Fab′将LS174T、MCF-7、ZR75-30、BXPC3和CaPAN-1细胞的细胞侵袭分别减少30％(P＜0.02)、77％(P＜0.01)、49％(P＜0.01)、44％(P＜0.01)和73％(P＜0.002)。MN-3Fab′对相同5种细胞系的作用分别减少3％(P＝NS)、47％(P＜0.01)、59％(P＜0.01)、0％(P＝NS)和55％(P＜0.05)的侵袭。因而，CEACAM6的A1B1结构域似乎是比肿瘤细胞侵袭进程的N结构域更重要的靶标。
MN-3、MN-15和MN-14Fab′对具有GW-39肺内结肠微转移瘤 的小鼠的存活的作用-GW-39表达CEACAM5和CEACAM6两者，如免疫组织化学所示(图7，上图)。基于体外结果表明抗-CEACAM6抗体具有有限的抗增殖作用，但显示显著的抗侵袭和抗附着性质，我们在静脉内注射30μL细胞前用抗体片段中的每一种(10μg/mL)预先治疗GW-39肿瘤细胞悬浮液15分钟，然后在移植后当天给予100μg抗体。这种设计模拟连续暴露于在任何时间可用的抗体的作用，来自原发瘤的细胞可开始转移性级联反应。图7中出现的结果说明了MN-15和MN-3Fab延长了这些小鼠的中位存活时间(分别为＞77天和77天；与未治疗的细胞相比P＜0.001)，然而hMN-14Fab′(49天)不显著地影响存活(对于未治疗的小鼠为42天)。尽管研究持续到小鼠接近死亡，而不是在治疗后限定的时间处死它们且计数肺结节的数量，但中位存活时间应该与肺转移性疾病的数量相关。在这项研究中关于hMN-14Fab′的结果与我们对此转移性模型中对于hMN-14F(ab)2的报道类似(Blumenthal等人，Cancer Immuno Immunother 2005，54：315-27)，表明靶向A3B3结构域不影响此模型中的中位存活，然而当各自的Fab是给定的时，靶向由CEACAM5和CEACAM6共享的N和A1B1结构域影响转移瘤和宿主的存活。
讨论
免疫疗法的长期目标是诱导针对肿瘤相关抗原的抗肿瘤应答。直接干扰信号转导机理的抗体已显示临床益处，例如针对HER-2/neu、表皮生长因子受体和CD20的细胞外结构域的那些(Weiner&Adams，Oncogene 2000，19：6144-51；Alas等人，Cancer Res 2001，61：5137-44)。本文呈现的研究表明不是通过免疫效应物或直接细胞抑制剂机理进行直接治疗，针对CEACAM6的MAb抑制迁移、侵袭和附着，由此限制转移。我们的大多数研究使用单价Fab′形式以避免来自MAb的Fc区的效应细胞功能且集中于涉及转移过程的机理。
CEACAM5在包括胃肠癌、呼吸系统癌和生殖泌尿系统癌及乳腺癌的大多数癌中过表达。我们的结果显示另一CEA家族成员CEACAM6可以是实体瘤抗转移性治疗的良好(如果不是更好)的靶标。我们已表明，与CEACAM5相比CEACAM6在更大百分比的实体瘤细胞系中表达，并且许多这些细胞系的高MCF表明更多的抗-CEACAM6MAb可递送至这些肿瘤细胞。因而，MN-15和MN-3MAb对表达CEACAM6或CEACAM5的肿瘤是有用的，因为它们靶向由两种抗原共享的表位。因此这些MAb可能优于只靶向CEACAM5的MAb(如MN-14)或仅对CEACAM6特异性且不与CEACAM5交叉反应的MAb。我们的数据与之前的报道一致，显示在大量肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌患者的血清中CEACAM6的水平相对高(Kuroki等人，Anticancer Res 1999，19：5599-606)。有趣的是，一些患者为CEACAM5-/CEACAM6+，这进一步表明CEACAM6可能是有用的独立靶标。
已知CEACAM6在中性粒细胞的表面上表达，因而调节与活化的内皮细胞上的内皮细胞-白细胞附着分子-1的附着(Kuijpers等人，JCell Biol 1992，118：457-66)。我们已显示针对CEACAM6上的不同表位(N和A1B1结构域)的MAb影响与内皮细胞的细胞附着。还有证据表明CEACAM5经活化Kupffer细胞及刺激IL-1β、肿瘤坏死因子-α和IL-6产生可影响与内皮细胞的细胞附着(Gangopadhyay等人ClinExp Metastasis 1998，16：703-12)。然后这些细胞因子诱导内皮细胞上细胞间附着分子的表达，因而提高肿瘤细胞与内皮的附着。我们的结果已显示，MN-3和MN-15Fab比MN-14Fab′在降低CEACAM5+/CEACAM6+肿瘤细胞与内皮细胞的附着方面更具活性。因而，N和A1B1结构域而不是A3B3结构域均参与肿瘤细胞与内皮细胞的附着。
肿瘤细胞可与其它肿瘤细胞、与内皮细胞以及与ECM蛋白附着。我们已发现，与一组这些蛋白附着的量在细胞系之间变化且与肿瘤的类型(例如乳腺癌和胰腺癌)或与表达的CEACAM5或CEACAM6的量无关。肿瘤细胞与ECM蛋白的相互作用对迁移和侵袭并且因而对转移而言是重要的。例如，肿瘤细胞与纤连蛋白的相互作用通过α5β1整联蛋白参与骨髓基质内的继发瘤的发育(Van derVelde-Zimmermann等人，Exp Cell Res 1997，230：111-20)。阻断与纤连蛋白抑制的转移瘤的肝素-结合结构域的多肽片段的附着(Matsumoto等人，Jpn J Cancer Res 1991，82：1130-8)。用肽阻断肿瘤细胞-层粘连蛋白附着已获得类似的结果(Islam等人，Surgery 1993，113：676-82)。意外的是，仅MN-15(A1B1结构域)能够降低与所测试的6种肿瘤细胞系中的3种中的纤连蛋白的附着。在这组细胞系中的纤连蛋白附着的抑制百分比与未治疗的细胞样品中附着的量无关。靶向N或A3B3结构域的MAb不影响与纤连蛋白的细胞附着。在一篇Duxbury等人(J Biol Chem 2004，279：23176-82)的报道中，MAb-介导的CEACAM6交联导致ECM附着增加。然而，靶向的表位与在此研究的表位不同。
肿瘤细胞活性迁移是肿瘤细胞侵袭和转移的前提。增强侵袭的附着分子也促进迁移进程(Hazan等人，J Cell Biol 2000，148：779-90)。已报道CEACAM6的过表达促进胰腺癌的细胞侵袭(Duxbury等人，Oncogene 2004，23：465-73)。抑制转移瘤的试剂通常影响包括迁移、附着和侵袭的若干步骤。因为我们的数据表明CEACAM6在附着和侵袭中发挥作用，同样评估这些MAb阻止迁移的能力是重要的。我们已显示在具有强迁移倾向的细胞系中，对CEACAM5和/或CEACAM6的MAb阻断(MN-3＞MN-15)减少迁移细胞的数量。在我们的体外分析中，包括与ECM的附着和迁移步骤的细胞侵袭的进程，被MN-15Fab′＞MN-3Fab′所抑制，表明CEACAM6的A1B1结构域对于此步骤更加重要但N结构域也发挥重要作用。
与我们之前报道的MN-14抗-CEA IgG的结果相比较(Blumenthal等人，Cancer Immunol Immunother 2005，54：315-27)，MN-15或MN-3MAb治疗的显著优势之一是靶向表达CEACAM6、CEACAM5或两者的肿瘤的能力，然而MN-14仅可用于CEACAM5+肿瘤。如表1中所示，许多实体瘤细胞系表达CEACAM6但不表达CEACAM5或与CEACAM5相比表达更多的CEACAM6。这些肿瘤类型是使用CEACAM6MAb的转移瘤定向的MAb治疗的候选物。
基于体内实验的重要考虑因素是当细胞首次进入循环时MAb的可用性。如果转移进程开始之前使细胞暴露于MAb则MN-15Fab′和MN-3Fab′显示治疗功效。然而，如果在癌细胞已存在于脉管系统且已开始在肺中接种之后递送MAb，那么单独的MAb无疗效(数据未示出)。因此，在某些优选实施方案中，抗-CEACAM5/CEACAM6Mab将持续有用，可能利用植入泵，以维持循环中所需的水平。
总的来说，抗转移及MAb对附着、侵袭和迁移的抑制应该是相对无毒、不受药物抗性问题所限制且易于使用其它标准和/或实验性治疗方法作为佐剂应用的技术。因为CEACAM6也在正常肺、脾脏和粒细胞中表达(Grunert等人，Int J Cancer 1995，63：349-55)，所以抗-CEACAM6MAb对正常组织的作用是治疗用途的一个考虑因素。在一篇报道中，靶向CEACAM6的免疫毒素疗法在具有肿瘤的裸鼠模型中有效(Duxbury等人，Biochem Biophys Res Commun 2004，317：837-43)，但此模型在正常组织上不表达CEACAM6。
总的来说，我们已显示抗-CEACAM6/CEACAM5MAb片段没有效应细胞功能且靶向这些抗原的N和A1B1结构域阻断迁移、与内皮细胞和ECM的附着，及侵袭，并且还提高具有人结肠癌的肺内微转移瘤的小鼠的中位存活。这些结果表明针对CEACAM5和CEACAM6的抗体(例如MN-15)可在人癌症疗法中是有效的。
实施例4.CEACAM5和CEACAM6在原发癌和转移癌中的表达模式
概述
许多乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌细胞系表达CEACAM6(NCA-90)和CEACAM5(癌胚抗原，CEA)，并且针对两者的抗体可影响肿瘤细胞在体外和体内的生长。在此，我们将两种抗原作为在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌(包括患者匹配的正常原发瘤及转移性乳腺癌和结肠癌样本)中组织学表型的函数进行比较。
用分别靶向CEACAM6的A1B1-和N-结构域的MN-15和MN-3抗体和靶向CEACAM5的A3B3结构域的MN-14抗体。通过使用组织微阵列的免疫组织化学(IHC)测定抗原表达。使用亲和素-生物素-二氨基联苯胺染色进行IHC。记录对每种组织型的平均评分±SD(0＝阴性/8＝最高)。
对于所有肿瘤，表达的CEACAM6的量比CEACAM5的量大，并且反映肿瘤组织型。在乳腺肿瘤中，CEACAM6在乳头瘤中最高，乳头瘤＞浸润性导管瘤＞小叶瘤＞叶状瘤；在胰腺瘤中，中分化的肿瘤＞高分化的肿瘤＞低分化的肿瘤；粘液性卵巢腺癌具有比浆液性卵巢腺癌高几乎3倍的CEACAM6；肺腺癌＞鳞癌；且结肠癌的肝转移瘤＞原发瘤＝淋巴结转移瘤＞正常的肠。然而，前列腺癌和正常组织中的CEACAM6表达类似。肝中发现的转移性结肠瘤中CEACAM6的量比许多原发结肠瘤中CEACAM6的量高。相比之下，来自乳腺瘤、结肠瘤或肺肿瘤的淋巴结转移瘤的CEACAM6免疫染色与原发瘤类似。
CEACAM6表达在许多实体瘤中提高，但作为组织型的函数变化。基于以前的工作显示出CEACAM6在肿瘤细胞迁移、侵袭和附着及远处转移瘤的形成中发挥作用(Blumenthal等人，Cancer Res 65：8809-8817，2005)，它可能对基于抗体的治疗是重要的靶标。
背景
人癌胚抗原(CEA)家族具有属于CEACAM亚群的7个基因。这些亚群的成员主要与细胞膜相关且在正常组织和癌组织中显示复杂的表达模式。CEACAM5基因，也称为CD66e，编码蛋白质、CEA(Beauchemin等人，Exp Cell Res.1999，252：243-249)。CEACAM5首先在1965年作为胃肠癌胚抗原被描述(Gold&Freedman，J Exp Med.1965，122：467-481)，但现在已知在大多数癌(包括胃肠道癌、呼吸系统癌和生殖泌尿系统癌及乳腺癌)中过表达(Goldenberg等人，J NatlCancer Inst.1976，57：11-22；Shively等人，Crit Rev Oncol Hematol.1985，2：355-399；Hammarstrom，Semin Cancer Biol.1999，9：67-81)。CEACAM6(也称为CD66c或NCA-90)是与CEACAM5分享一些抗原决定簇的非特异性交叉反应的糖蛋白抗原(Kuroki等人，BiochemBiophys Res Comm.1992，182：501-506)。CEACAM6还在来自多种器官的粒细胞和上皮细胞上表达，并且与正常粘膜(Scholzel等人，Am JPathol.2000，157：1051-1052)以及许多人癌症(Kuroki等人，AnticancerRes.1999，19：5599-5606；Hinoda等人J Gastroenterol.1997，32：200-205)相比在增生性结肠息肉和腺瘤的增殖细胞中具有更广的表达区。患有肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌及肝细胞癌的患者中发现CEACAM6的相对高的血清水平。CEACAM6的量与表达的CEACAM5的量无关(Kuroki等人，Anticancer Res.1999，19：5599-5606)。
CEACAM6在结肠直肠癌中的表达与细胞分化负相关(Ilantzis等人，Neoplasia.2002，4：151-163)且为与较高的复发风险相关的独立预测因子(Jantscheff等人，J Clin Oncol.2003，21：3638-3646)。CEACAM5和CEACAM6均在细胞附着、侵袭和转移中发挥作用，如在实施例3中所讨论。本研究使用组织微阵列分析以比较CEACAM5和CEACAM6在实体瘤的不同组织型中的相对表达，并且比较相同患者中原发位点和匹配的转移瘤之间的表达。
方法
抗体-如上所述，MN-15与A1B1-结构域结合且MN-3与在CEACAM5和CEACAM6上发现的N-结构域结合。MN-14与仅在CEACAM5上发现的A3B3结构域结合。这些抗体对它们的靶抗原具有类似的亲和力(Hansen等人，Cancer.1993，71：3478-3485)。将MN-3和MN-15用作鼠Mab，而MN-14以其人源化形式hMN-14(labetuzumab)被包括。
组织微阵列-ACCUMAXTM组织阵列来自ISU ABXIS
Figure BDA0000140501800000751
(Seoul，Korea)。使用以下阵列：乳腺A202(II)、具有匹配的肝转移瘤的结肠A203(II)、肺A206、胰腺A207、前列腺A208及卵巢A213。匹配原发瘤和淋巴结转移瘤的另外的乳腺BR1001、结肠直肠C0991及肺LC810阵列从US Biomax，Inc.(Rockville，MD)购买。所有的阵列由每个载玻片上的两份不同组织型的癌症组织核心和4个非肿瘤对应样品组成。存在45个乳腺癌样本、40个肺癌样本、26个胰腺癌样本、40个前列腺癌样本及45个卵巢癌样本。良好地代表了一些组织型(例如，30个浸润性导管型乳腺肿瘤)，而其它仅具有3-6个核心/组织型。转移瘤阵列由以下匹配情况组成：18个正常结肠、原发结肠癌和肝转移瘤，38个乳腺和淋巴结转移瘤，33个结肠和淋巴结转移瘤及37个肺和淋巴结转移瘤。
免疫组织化学-将载玻片在二甲苯中脱蜡、再水化和用新鲜的0.3％过氧化氢的甲醇溶液处理15min。在1×磷酸酯-缓冲生理盐水(PBS，pH 7.4)中洗涤后，在室温(RT)将载玻片在恒湿箱中用正常血清阻断20min。用1X PBS冲洗掉过量的血清且在RT将载玻片在恒湿箱中用25-50μl一抗(10μg/ml)孵育45min。对于CEACAM5染色，一抗为鼠mMN-14IgG。对于CEACAM6染色，将载玻片首先用人源化hMN-14IgG阻断且然后用一抗(鼠mMN-15或mMN-3IgG)孵育。洗掉过量的一抗且在RT将部分在恒湿箱中用生物素化的山羊-抗小鼠覆盖30min。然后将载玻片用甲醇中的0.3％H2O2浸泡且加入25μl亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物。将载玻片在RT孵育45min，在1X PBS中洗涤，且用100μl 3，3′-二氨基联苯胺盐酸盐溶液(0.1M醋酸钠缓冲液中的100mg/ml二氨基联苯胺，pH 6.0，具有0.01％(v/v)H2O2)覆盖15min。将载玻片通过浸入自来水洗涤两次且在苏木精中快速浸入4次进行复染(经WHATMAN
Figure BDA0000140501800000761
#4滤纸过滤)。将载玻片冲洗、风干且用1-2滴cytoseal和玻璃盖玻片固定。使用Kawai的方法对每个组织核心的染色计算从0至8的半定量评分(Kawai等人，Clin Cancer Res.2005，11：5084-5089)。估计阳性细胞数量/列(file)且指定编号：0＝无，1＝1/100细胞，2＝1/100至1/10细胞，3＝1/10至1/3细胞，4＝1/3至2/3细胞及5＝＞2/3细胞。然后在0＝无，1＝弱，2＝中及3＝强时测定染色强度。然后将第一评分和第二评分加在一起，产生对于任何组织核心的最大化染色评分8。两位独立的不知情的调查者进行IHC分析且两次读数的结果强一致。结果记录为每个组的平均±标准偏差。通过变量的单因素分析及使用双尾F检验和95％置信界限来评估给定的组织型的CEACM5和CEACAM6之间或每种抗原的组织型之间的评分比较。在k等于实验组的数量时，使用零假设Ho：μ1＝μ2＝1/4μ/k。双尾检验考虑到从群体均数向高或低的方向(两端)偏离的任何一组中的极端值。F值是组中的这种差异可能仅仅偶然发生的概率的量度。
结果
实体瘤中的表达作为组织型的函数-对于评估的所有肿瘤核心，CEACAM6的量比CEACAM5的高。然而，表达均质性和染色强度在组织的组织型之间和相同组织学类型内的样品之间变化。我们评估了45个乳腺肿瘤核心：30个浸润性导管瘤、8个乳头瘤、4个小叶癌及3个叶状瘤。对于所有组织型，CEACAM6水平比CEACAM5水平高(P＜0.001)。发现CEACAM6的表达在乳头瘤中最高，乳头瘤(6.0±2.1)＞浸润性导管瘤(5.1±2.5)＞小叶癌(4.0±0.8)＞叶状瘤(2.0±1.0)。乳头和小叶乳腺癌之间的差异在P＜0.01水平上具有显著性。最高的CEACAM5表达发现于乳头瘤样品(1.4±1.4)，但并非与浸润性导管瘤或小叶癌样品统计学上不同。叶状乳腺癌为间质瘤，通常为良性，且因此应该不表达CEACAM5或CEACAM6。
在6种不同的肺癌中评估CEACAM5和CEACAM6表达：5种各自为高分化、中分化和低分化的腺癌，5种各自为高分化、中分化和低分化的鳞癌，3种各自为大细胞癌和细支气管肺泡癌及2种各自为大细胞神经内分泌癌和小细胞癌。其中，腺癌比鳞癌表达更多的CEACAM6(P＜0.001)。发现CEACAM6表达在中分化的腺癌中最高，中分化的腺癌(7.8±0.4)＞高分化的腺癌(7.3±1.1)＝细支气管肺泡癌(7.2±0.8)＞低分化的腺癌(6.8±1.0)＞小细胞癌(5.5±0.7)＞高分化的鳞癌(5.2±1.0)＞中分化的鳞癌(4.9±1.1)。大细胞癌(4.5±0.9)和低分化的鳞癌(3.8±1.3)中的CEACAM6水平与非肿瘤肺组织(P＝NS)的CEACAM6水平类似，表明抗-CEACAM6抗体将对肺癌的这些组织型无效。最高表达的CEACAM5是在小细胞肺癌样本中(5.5±0.7)，接着是大细胞神经内分泌癌(4.75±3.18)。大细胞癌是CEA阴性的且所有腺癌和浆液性肿瘤的评分≤2.60。
胰腺癌已经是关于CEACAM6表达研究最广泛的肿瘤。我们评估胰腺癌中的CEACAM5和CEACAM6作为肿瘤细胞分化的函数。研究了1个高分化的、3个高-中分化的、13个中分化的、2个中-低分化的及7个低分化的肿瘤核心。发现胰腺瘤中的CEACAM6表达在中分化的腺癌中最高，中分化的腺癌(7.5±0.7)＞中-低分化的腺癌(5.9±1.9)＝高-中分化的腺癌(5.8±1.8)＞低分化的腺癌(5.1±2.5)＞高分化的(4.0±0.0)腺癌(亚型之间P＝NS)。非肿瘤胰腺CEACAM6表达为2.25±0.5。高-中分化、中分化及中-低分化腺癌显著高于非肿瘤胰腺(P＜0.001)。CEACAM6表达与疾病阶段无关。具有高表达(8)和低表达(3-4)的样品可发现于阶段IA-IB、II A-II B和IV中。对所有组织型，CEACAM5表达比CEACAM6低；最高表达发现于中分化的肿瘤(4.0±1.4)中且最低表达发现于中-低分化的肿瘤(0.92±1.92)和低分化的肿瘤(1.4±1.5)。仅中分化的和高-中分化的肿瘤比非肿瘤组织表达显著更多的CEACAM5(分别P＜0.002及P＜0.005)。
将18个阶段-II、15个阶段-III和4个阶段-IV前列腺肿瘤核心的CEACAM5和CEACAM6染色。4至9的Gleason评分代表阶段-II中的样品，并且6至10的Gleason评分发现于阶段-III样本中。所有阶段-IV样品是Gleason 9-10。表达与任何阶段中的样品的Gleason评分无关。CEACAM6的类似表达发现于阶段-II、阶段-III和阶段-IV的前列腺癌(3.3-3.8)，并且与非肿瘤前列腺组织没有显著不同(P＝NS)。对于前列腺癌的所有阶段，CEACAM5表达持续低于0.9且不超过非肿瘤前列腺组织中的表达水平(0.5±1.0；P＝NS)。
研究了9种卵巢癌类型：5种各自为浆液性腺癌、粘液性腺癌、透明细胞癌和移行细胞癌；4种各自为子宫内膜样腺癌和布伦纳瘤(Brenner tumor)；并且3种各自为卵黄囊肿瘤、粒层细胞瘤和无性细胞瘤。卵巢癌中CEACAM6的量在粘液性腺癌中最高，粘液性腺癌(5.6±1.7)＞移行细胞瘤(3.8±1.6)＞子宫内膜样瘤(3.6±2.8)＞透明细胞瘤(3.4±1.8)＞卵黄囊瘤(2.5±0.5)。粘液性瘤CEACAM6表达显著高于移行细胞瘤及子宫内膜样瘤(P＜0.02)、透明细胞瘤(P＜0.01)及卵黄囊瘤(P＜0.005)。较低水平发现于浆液性腺癌(1.8±1.3)＞布伦纳瘤(1.3±1.4)＝无性细胞瘤(1.3±1.5)＞粒层细胞瘤(0.7±1.2)。正常卵巢样品对CEACAM6为阴性。因而，所有的肿瘤组织型与非肿瘤卵巢相比表达显著更多的CEACAM6。最高的CEACAM5表达也发现于粘液性腺癌类型中(1.6±1.5)。CEACAM5的表达在所有其它卵巢样品中的评分低于0.6，并且非肿瘤卵巢评分为0.5±1.0。粘液性CEACAM5水平显著高于所有其它组织型(与子宫内膜样瘤和布伦纳瘤相比P＜0.002，并且与浆液性肿瘤、透明细胞瘤、移行细胞瘤和卵黄囊瘤相比P＜0.001)。
与非肿瘤结肠(3.0±0.0；P＜0.002)相比，更大数量的CEACAM6发现于结肠腺癌(6.2±1.4)且CEACAM6表达超过CEACAM5表达(3.4±0.5；P＜0.001)。
CEACAM6表达与转移性级联反应中的关键步骤细胞附着相关。我们已经在前面表明针对CEACAM6表达的抗体可阻断附着。因此，我们评估CEACAM6表达在匹配的原发性结肠和转移性肝位点之间是否类似或不同。在匹配情况的半数(N＝6)下，在肝转移瘤中的CEACAM6表达比在原发性结肠瘤中的更高，并且在其余的6种情况下，原发性和转移性肝位点之间的数量相当。
与CEACAM6在许多来自结肠癌的二级肝位点中的表达较高相比，在原发瘤和淋巴结转移瘤之间无CEACAM6表达模式。对于乳腺样品，淋巴结位点在7对中具有较高的CEACAM6表达，在6对中具有较低的CEACAM6表达，并且在25对中无差异。对于肺样品，淋巴结位点在10对中具有较高的CEACAM6表达，在11对中具有较低的CEACAM6表达，并且在16对中无差异。对于结肠样品，淋巴结位点在7对中具有较高的CEACAM6表达，在10对中具有较低的CEACAM6表达，在11对中无差异。
讨论
CEACAM5和CEACAM6是在细胞附着和肿瘤细胞化疗敏感性中起重要调节作用的两种肿瘤相关抗原(Glinsky，Cancer MetastasisRev.1998，17：177-186；Kraus等人，Oncogene.2002，21：8683-8695；Zhou等人，Cancer Res.1993，53：3817-3822)。CEACAM6过表达独立地预示总存活率较差以及无疾病存活率较差，然而CEACAM5并不与这些结果显著相关(Jantscheff等人，Vol.37.Eur J Cancer，2001，37：S290)。
研究已显示CEACAM5影响多组癌症相关基因(尤其是细胞循环和细胞凋亡基因)的表达，保护结肠瘤细胞免受多种细胞凋亡刺激，例如用5-氟尿嘧啶的治疗(Soeth等人，Clin Cancer Res.2001，7：2022-2030)。因此，CEACAM5表达可以是癌细胞克服诱导细胞凋亡的疗法的手段。Ordonez等人已报道，当丧失与细胞外基质的锚定时CEACAM5和CEACAM6的表达在抑制细胞的细胞凋亡中发挥作用，该进程称为失巢凋亡(Ordonez等人，Cancer Res.2000，60：3419-3424)。提高的CEACAM6表达与对药物如吉西他滨的敏感性降低相关(Duxbury等人，Cancer Res.2004，64：3987-3993)。因此，靶向CEACAM5和/或CEACAM6可以是调节癌细胞化疗敏感性和细胞凋亡的新方法。已报道针对CEACAM6的siRNA降低失巢凋亡的抗性且提高异种移植肿瘤的半胱天冬酶介导的细胞凋亡(Duxbury等人，Oncogene.2004，23：465-473)。CEACAM6的抗体定点靶向可在临床上提供RNA干扰沉默的可行替代以促进对表达CEACAM6的那些肿瘤中化疗剂的应答。
为了确定哪种实体瘤和组织学类型将最适合CEACAM5和CEACAM6的抗体阻断，我们使用组织微阵列分析研究了这些抗原的表达。迄今为止，在文献中胰腺癌和结肠癌已经是CEACAM6表达的焦点(Duxbury等人，Ann Surg.2005，241：491-496；Kodera等人，.BrJ Cancer.1993，68：130-136)。在此，我们已进一步探究了CEACAM6在一组实体瘤：乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌(除了扩展到胰腺瘤和结肠瘤之外)中的表达，且使用组织微阵列以进一步定义以CEACAM6+作为所有六种实体瘤类别中组织学类型的函数的肿瘤。我们的结果显示表达强烈取决于肿瘤的组织型。在一些亚型中的抗原表达比正常组织中高2-4倍，而在其它组织中，表达与非肿瘤组织类似。
大多数实体瘤中与CEACAM5相比CEACAM6表达更高并且差异表达作为组织型的函数的证明是给患者说明抗-CEACAM6疗法的重要观察结果。该分析是迈向解释CEACAM6作为多种实体瘤中的肿瘤靶标的重要性的步骤，该实体瘤扩展了关于胰腺癌报道的许多重要研究(Duxbury等人，J Biol Chem.2004，279：23176-23182；Duxbury等人，Cancer Res.2004，64：3987-3993；Duxbury等人，Biochem BiophysRes Comm.2004，317：837-843；Duxbury等人，Ann Surg.2005，241：491-496)。还揭示表达水平作为肿瘤组织型的函数而变化。
我们还已经解决了在相同患者中在原发瘤和在匹配的转移瘤中CEACAM6的表达模式。我们的结果显示在半数临床样本中，肝转移瘤比原发结肠直肠肿瘤具有更高的CEACAM6表达，表明在这些患者中，阻断由CEACAM6表达引起的附着和侵袭可影响肿瘤细胞转移的能力，正如我们已通过实验实际上所显示的那样(Goldenberg等人，J Natl Cancer Inst.1976，57：11-22)。然而，淋巴结转移瘤中的CEACAM6表达与原发乳腺、结肠或肺肿瘤样品中抗原的量类似。恶性肿瘤侵袭淋巴管和转移到局部淋巴结的机制似乎通过VEGF-C和VEGF-D诱导的淋巴生成(Detmar&Hirakawa，J Exp Med.2002，196：713-718)及趋化因子梯度来调节。定向运动与肿瘤细胞上的趋化因子受体表达相关(Nathanson，Cancer.2003，98：413-423)，但不涉及CEACAM家族的成员。相比之下，CEACAM6在迁移、侵袭和附着中发挥重要作用(Duxbury等人，Oncogene.2004，23：465-473)，为转移性扩散到二级组织位点而非淋巴结中的重要步骤。已提出干扰细胞-基质与细胞-细胞附着的抗附着分子作为潜在的癌症疗法，这基于它们干扰运动、附着和转移进程的能力(Blumenthal等人，Cancer Res.2005，65：8809-8817；Glinsky，Cancer Metastasis Rev.1998，17：177-186；Kerbel等人，Bulletin de I′institut Pasteur.1995，92：248-256)。
我们已报道了人源化抗-CEA(CEACAM5)抗体hMN-14可增强常用于结肠直肠癌疗法的两种细胞毒素药(氟尿嘧啶和CPT-11)在裸鼠中增殖的皮下和转移性人结肠瘤细胞中的治疗作用(Blumenthal等人，Cancer Immuno Immunother.2004，54：315-27)。在另一高表达CEA的人甲状腺髓样癌异种移植物中，我们还已表明MN-14抗-CEA IgG可抑制肿瘤细胞生长且也提高达卡巴嗪(一种在该癌症类型中具有活性的药物)的作用(Stein等人，Mol Cancer Ther.2004，2：1559-1564)。一种解释可涉及在抗体阻断附着(Zhou等人，Cancer Res.1993，53：3817-3822)及由此化疗增敏肿瘤细胞中的作用。
在一系列研究中，Duxbury和同事已表明通过siRNA沉默CEACAM6来：(a)促进细胞失巢凋亡，(b)响应于依赖贴壁的条件而提高半胱天冬酶活性，(c)下调Akt细胞存活途径，(d)抑制体内转移及(e)增强吉西他滨诱导的化疗敏感性(Duxbury等人，Cancer Res.2004，64：3987-3993；Duxbury等人，Oncogene.2004，23：465-473；Duxbury等人，Biochem Biophys Res Comm.2004，317：133-141；Duxbury等人，Ann Surg.2005，241：491-496)。因而，除了CEACAM5之外，CEACAM6也可以是有用的治疗靶标。阻断CEACAM6-介导的同型和/或异型附着可具有抗转移性和化疗增敏作用。在正在进行的临床前疗法研究中，我们检验单独的或与标准化疗剂组合的未偶联的抗-CEACAM6抗体在结肠、乳腺和肺转移瘤模型中的疗效。替代方法是开发抗-CEACAM6免疫偶联物作为针对CEACAM6+肿瘤的治疗剂(Duxbury等人Biochem Biophys Res Comm.2004，317：837-843)。用抗-CEACAM6抗体、接着用二级皂草素-偶联的免疫球蛋白(IgG)的体外靶向，经半胱天冬酶-介导的细胞凋亡诱导显著的细胞毒性。在体内裸鼠异种移植模型中，这种间接免疫毒素方法显著地抑制胰腺腺癌肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡。
结论
基于表达水平，在所研究的实体瘤中CEACAM6可以是对基于抗体的抗转移和化疗增敏疗法比CEACAM5更有希望的靶标。此外，CEACAM6可以是在选择实体瘤亚型中靶向的有用抗原。在结肠癌中，CEACAM6可在远处转移瘤的发育中发挥重要作用。
实施例5：用hMN-15和CPT-11治疗之前用免疫调节剂的预先治疗对肿瘤细胞化疗敏感性的体内作用
评估hMN-15与CPT-11组合治疗的作用，在具有表达更高CEA水平的GW-39肿瘤(由于用干扰素-γ(IFNγ)预先治疗GW-39stock肿瘤(10％GW-39细胞悬浮液))的小鼠中一起开始。涉及干扰素-γ增强裸CEA抗体(hMN-15)的抗肿瘤作用的实验如下进行。
GW-39人结肠癌在每天两次连续4天接受100,000单位IFN-γ的小鼠中皮下生长。对具有GW-39肿瘤的对照小鼠不给予IFN。给实验小鼠静脉注射来自两种小鼠(即进行IFN治疗或不进行IFN治疗)(分为两组，每组8只)中的任一种的GW-39(w/v)的5％悬浮液。4只中的每一只接受来自IFN-治疗的小鼠的肿瘤且4只接受来自未治疗的小鼠的肿瘤。然后8只小鼠的一组接受hMN-15(100μg/天×14天且然后此后每周两次直至实验结束)，另一组以160μg/天×5天接受CPT-11(＝最大耐受剂量的20％)，第三组接受相同剂量的组合的抗体+药物，并且第四组不接受任何治疗。测量动物体重且每周测定存活率。此外，小鼠中用IFN治疗的此后植入的stock肿瘤样品也进行免疫组织学程序以评估来自用IFN-γ治疗的小鼠的肿瘤中CEA表达的提高，并且这也通过用不显示CEA染色的不相关的IgG(例如Ag8)的免疫组织学分析处理悬浮液来控制。
观察到IFNγ预先治疗提供GW-39肿瘤中CEA的表达。与单独治疗剂中的每一种的作用的总和相比，裸hMN-15与CPT-11的组合更有效地减缓肿瘤生长和提高存活率。这种作用比用IFNγ预先治疗的肿瘤中的作用更明显。
实施例6.用抗-CEA抗体和GM-CSF治疗乙状结肠癌
JR是62岁的男人，其对用5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸减少在去除其乙状结肠癌时发现的向肝的转移的化疗无效。他的癌胚抗原(CEA)的血浆滴度呈现为34ng/mL，且肝的计算机断层扫描术显示了右叶中测量为直径2至4cm的若干小病变。其它放射学研究似乎是正常的。每周进行使用人源化抗-CEA IgG(hMN-15)单克隆抗体的免疫疗法，以300mg/m2的静脉内剂量输注2小时，持续4周。hMN-15治疗前1周，患者接受2次200μg/m2GM-CSF皮下注射，相隔3天，且在4周hMN-15治疗期间每周连续两次。这4周后，以相同剂量隔周给予hMN-15和GM-CSF，持续另外的3个月，但GM-CSF剂量的增加至250μg/m2。每次施用人源化抗-CEA抗体前，给予患者苯海拉明(50mg口服)和对乙酰氨基酚(500mg口服)。
此时，患者再次登场，对肝转移瘤进行CT测量且对身体的其它部分进行多种放射性扫描。还取血以进行化学分析及测定他的血液的CEA滴度。注意到无肝脏以外的疾病区域，但是肝脏中可测量肿瘤的直径的总数似乎减少了40％，并且患者的血液CEA滴度降至18ng/mL，因而表明治疗反应。
另外再施用2个月使用hMN-15和GM-CSF的免疫疗法，每隔一周给予一次，对于hMN-15以200mg/m2且对于GM-CSF以250μg/m2，并且再次登场显示肝肿瘤的直径的总数的另外的减少且CEA滴度降至10ng/mL。因为测量肿瘤减少为超出预治疗基线＞65％，所以认为治疗已提供部分反应。此后，使剂量频率稍减，每个月一次持续接下来的六个月，并且所有的研究显示疾病无变化。然后给患者施用另外的10个月，并且保持部分缓解，且对治疗无不良反应，并且通常无任何疾病的症状。
实施例7.转移性结肠癌的组合免疫疗法和化疗
ST是切除原发瘤后存在结肠癌的肝和肺转移的52岁的女人。将她置于基于Gramont时间表的组合的化疗和免疫疗法方案(deGramont等人，J Clin Oncol.2000，18：2938-47)，但使用增加的人源化抗-CEA单克隆抗体IgG1(hMN-15)。输注抗体之前，她接受口服50mg苯海拉明和口服500mg对乙酰氨基酚。她接受甲酰四氢叶酸的2小时输注(200mg/m2/天)接着是5-氟尿嘧啶推注(400mg/m2/天)及5-氟尿嘧啶的22小时连续输注(600mg/m2/天)，每2周一次连续2天，与250mL右旋糖5％中的85mg/m2奥沙利铂的2小时输注一起，同时在第1天施用亚叶酸(FOLFOX4时间表)。患者还接受用5-羟色胺-3-受体拮抗剂进行的抗呕吐预防。该2周化疗周期之前1周，以200mg/m2的剂量输注hMN-15单克隆抗-CEA抗体2hr，并且重复2周化疗周期的每周，并且此后以另一化疗周期每周一次，持续接下来的1个月。此外，在第二个化疗周期开始每周皮下施用G-CSF一次，剂量为5μg/kg/天，并且以此剂量持续用hMN-15抗体的免疫疗法期间，持续接下来的3个月。
持续施用hMN-15抗体和非格司亭进行总计5个循环的化疗。之后，以相同剂量给予hMN-15和非格司亭疗法，每隔一周一次，持续接下来的3个月，不进行化疗。患者2个月后登场，并且与先前疗法进行的测量相比，通过肝和肺中测量的＞80％疾病的计算机断层扫描术测量显示她的肝和肺转移减少。还显示她的血液CEA滴度从预治疗水平的63ng/mL降至9ng/mL。她在接下来的6个月继续接受治疗，并且她的疾病似乎稳定，没有发现新的病变且肝脏和肺脏中存留的疾病没有增加。患者主要的毒性是由咽喉感觉迟钝组成的周围神经病变。患者还在化疗周期期间经历腹泻、粘膜炎、恶心和呕吐，但这些并不过度。当仅施用免疫疗法时她没有经历任何不良反应，并且能够返回全职活动而不受任何显著的限制。
实施例8.hMN-15预先治疗对CPT-11功效的作用
在SUM1315乳腺癌模型中检测CPT-11治疗之前3天给予的用裸hMN-15CEA Mab预治疗的作用(Kuperwasser等人，Cancer Res.2005，65：6130-38)。比较单独的CPT-11、单独的hMN-15及hMN-15+CPT-11的组合疗法(其中CPT-11之前3天施用hMN-15)。剂量如实施例5中所示。单独的hMN-15使在这些条件下中位存活时间增加了21％。单独的CPT 11使存活率增加了76％。相比之下，在CPT-11之前3天施用hMN-15的组合疗法产生超过单独施用CPT-11的另外58％的中位存活时间增加。用hMN-15预治疗显著延长人乳腺癌的转移模型中具有低肿瘤负荷的动物的存活率。hMN-15抗体与CPT-11疗法的协同效应是令人惊讶的。
实施例9.施用时间表对hMN-15与CPT-11协同作用的作用
对人结肠癌模型中裸hMN-15CEAMab和CPT-11的多种施用时间表进行比较。CPT-11之前3天给予hMN-15是最有效。剂量如实施例5所示。当顺序颠倒时(hMN-15之前3天给予CPT-11)或当将两者同时一起给予时，70天的中位存活时间比未治疗对照组(35天)增加，但仍少于CPT-11之前3天用hMN-15预治疗的105天的中位存活时间。
实施例10.I类抗-CEA抗体和甲状腺髓样癌疗法
TT，人甲状腺髓样细胞系，购于美国典型培养物保藏中心。将细胞在补充有10％胎牛血清、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)及L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中生长成单层。用胰蛋白酶、0.2％EDTA分离后对细胞进行常规传代。
通过皮下注射在组织培养物中增殖的2×108个洗涤的TT细胞，该肿瘤在6-8周龄的雌性nu/nu小鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)中增殖。经侧尾静脉将抗体静脉注射到具有肿瘤的动物中。通过每周使用测径器测量肿瘤的长度、宽度和深度来监测肿瘤大小。肿瘤体积计算为三个测量值的乘积。
为了研究是否裸hMN-15可增加DTIC的功效，给具有TT的裸鼠DTIC(75μg/剂量)与未标记MAb的疗程组合。皮下注射TT细胞后2天开始以75μg/剂量连续3天施用DTIC作为一个疗程。在DTIC的第一剂量之前3天开始hMN-15MAb治疗，前两周中以100μg/剂量/天持续5天，然后每周两次。由MAb治疗或单独化疗的这些时间表引起肿瘤生长的显著延缓。意外地，DTIC的75-μg剂量与hMN-15的这个时间表的组合比任一单独治疗更有效。在第7周，与75μg仅DTIC组中的1/10及未治疗和仅MAb组中的0/10相比，75μg DTIC+MAb组中的8/10小鼠不具有可触知的肿瘤。第7周的平均肿瘤体积为0.018+0.039cm3(75μg DTIC+hMN-15)、0.284+0.197cm3(75μgDTIC)、0.899+0.545cm3(hMN-15)和1.578+0.959cm3(未治疗的)。
实施例11.用于预靶向的DNL构建体的制备
DNL技术可用于以多种形式制备包含几乎任何抗体或其片段或其它效应物部分(例如细胞因子)的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选实施方案，IgG抗体或Fab抗体片段可作为含有DDD或AD序列的融合蛋白产生。可通过组合第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白形成双特异性抗体。可选择地，可制备组合IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白的构建体。为了预靶向的目的，含有针对与待治疗的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原的结合位点的抗体或片段，可与结合可靶向构建体上的半抗原的第二抗体或片段组合。在示例性的实施方案中，靶向肿瘤的抗体或片段是包含6个MN-15CDR序列的嵌合、人源化或人MN-15抗体，而半抗原结合部分可以是抗HSG或抗DTPA抗体。给受试者施用双特异性抗体(DNL构建体)，使得循环抗体从血液中清除且定位于靶组织，并且可靶向构建体与加入的至少一种治疗剂和/或诊断剂附接并且与定位的抗体结合。
独立的转基因细胞系可形成各自的Fab或IgG融合蛋白。一旦产生，如果所需就可纯化组件，或将组件维持于细胞培养上清液中。产生后，任何DDD2-融合蛋白组件可与任何AD-融合蛋白组件组合以生成双特异性DNL构建体。对于不同类型的构建体，可利用不同的AD或DDD序列。
DDD1：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREA
RA(SEQ ID NO：11)
DDD2：CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLRE
ARA(SEQ ID NO：12)
AD1：QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：13)
AD2：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：14)
质粒载体pdHL2已用于产生许多抗体和基于抗体的构建体。(参见，Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6)。双顺反子哺乳动物的表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。载体序列与许多不同的IgG-pdHL2构建体大部分相同，其中仅在可变域(VH和VL)序列中存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化为Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了生成Fab-DDD表达载体，用编码铰链区的前4个残基、14个残基的Gly-Ser连接子和人R IIα的前44个残基(称为DDD1，SEQ ID NO：11)的序列替代重链的铰链区、CH2和CH3结构域的编码序列。为了生成Fab-AD表达载体，用编码铰链区的前4个残基、15个残基的Gly-Ser连接子和17个残基的称为AKAP-IS的合成AD(称为AD1，SEQ ID NO：13)的序列替代IgG的铰链区、CH2和CH3结构域的序列，所述合成AD使用生物信息学和肽阵列技术生成且显示以非常高的亲和力(0.4nM)结合R IIα二聚体。参见Alto等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。
设计两种穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板通过PCR扩增CH1结构域。左端PCR引物由CH1结构域的上游(5’)端和Sac II限制性核酸内切酶位点组成，其为CH1编码序列的5’。右端引物由编码铰链区(PKSC)的前4个残基及随后编码4个甘氨酸和1个丝氨酸的序列组成，其中最后的两个密码子(GS)包含Bam HI限制性位点。将410bp PCR扩增引物克隆到pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)内且筛选在T7(5’)方向插入的克隆。
(G4S)2DDD1的构建体(G4S)2如SEQ ID NO：15所公开)
由Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成命名为(G4S)2DDD1的双链寡核苷酸((G4S)2如SEQ ID NO：15所公开)以编码连接肽的11个残基之后的DDD1的氨基酸序列，其中前两个密码子包含BamHI限制性位点。将终止密码子和EagI限制性位点附加到3’端。编码的多肽序列显示如下。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEY
FTRLREARA(SEQ ID NO：16)
合成命名为R II A1-44上端和R II A1-44下端的在它们的3’端处有30个碱基对重叠的两个寡核苷酸(Sigma Genosys)且组合以包含174bp DDD1序列的中央154个碱基对。使寡核苷酸退火且使用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链。将扩增引物克隆到pGemT且筛选在T7(5’)方向插入的克隆。
(G4S)2-AD1的构建体(G4S)2如SEQ ID NO：15所公开)
合成命名为(G4S)2-AD1((G4S)2如SEQ ID NO：15所公开)的双链寡核苷酸(Sigma Genosys)以编码在连接肽的11个残基之后的AD1的氨基酸序列，其中前两个密码子包含BamHI限制性位点。将终止密码子和EagI限制性位点附加至3’端。经编码的多肽序列显示如下。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：17)
合成和退火编码上述肽序列的命名为AKAP-IS上端和AKAP-IS下端的两种互补重叠寡核苷酸。通过PCR扩增双链。将扩增引物克隆到pGemT载体中且筛选在T7(5’)方向插入的克隆。
连接DDD1与CH1
将编码DDD1序列的190bp片段用BamHI和NotI限制酶从pGemT切除且然后连接到CH1-pGemT中的相同位点以生成穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
连接AD1与CH1
将含有AD1序列的110bp片段用BamHI和NotI从pGemT切除且然后连接到CH1-pGemT中的相同位点以生成穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体
以这种分子设计可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过从pdHL2去除Sac II/EagI限制性片段(CH1-CH3)且将其用从各自pGemT穿梭载体中切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的Sac II/EagI片段替代来用上述构建体之一替代整个重链恒定域。
h679-Fd-AD1-pdHL2的构建
h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生具有经由14个氨基酸残基构成的柔性Gly/Ser肽间隔子与Fd的CH1结构域的羧基末端偶联的AD1的h679Fab的表达载体。通过用使用Sac II和EagI从CH1-AD1-SV3穿梭载体切除的CH1-AD1片段替代Sac II/EagI片段将含有h679可变域的基于pdHL2的载体转化为h679-Fd-AD1-pdHL2。
C-DDD1-Fd-hMN-15-pdHL2的构建
C-DDD1-Fd-hMN-15-pdHL2是用于产生包含融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-15的两个拷贝的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1经柔性肽间隔子与hMN-15Fab在CH1的羧基末端处连接。通过用Sac II和EagI限制性核酸内切酶消化以去除CH1-CH3结构域和插入用Sac II和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除的CH1-DDD1片段来将用于产生hMN-15IgG的质粒载体hMN15-pdHL2转化为C-DDD1-Fd-hMN-15-pdHL2。
已利用相同技术以产生多种已知抗体(例如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20及若干其它)的Fab表达质粒。通常，抗体可变区的编码序列出现在pdHL2表达载体中且转化表达载体用于产生如上所述的AD-或DDD-融合蛋白。可以大约2个DDD-融合蛋白/1个AD-融合蛋白的比率组合包含任何这种抗体的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以生成包含第一抗体的2个Fab片段和第二抗体的1个Fab片段的三聚DNL构建体。
C-DDD2-Fd-hMN-15-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-15-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-15的表达载体，其具有经14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子附加到hMN-15的Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠域序列。分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用连接到一起的hMN-15Fab的两个相同拷贝构成。
将表达载体如下工程化。合成制备包含连接肽(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO：18)的一部分和DDD2的残基1-13(SEQ ID NO：12)的编码序列的两种重叠、互补的寡核苷酸。使寡核苷酸退火且用T4PNK磷酸化，产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的5′和3′端处突出。
将双链DNA与通过用BamHI和PstI消化而制备的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接，以生成穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。用Sac II和EagI从CH1-DDD2-pGemT切除507bp片段且与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN15-pdHL2连接。将最终的表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-15-pdHL2。已利用类似的技术以生成许多不同的人源化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。
H679-Fd-AD2-pdHL2
设计h679-Fab-AD2以作为B与作为A的C-DDD2-Fab-hMN-15配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生具有经14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子附加到CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定域序列(SEQ ID NO：14)的h679-Fab-AD2的表达载体。AD2具有一个在AD1的锚定域序列之前的半胱氨酸残基和在AD1的锚定域序列之后的另一半胱氨酸残基。
将表达载体如下工程化。合成制备包含AD2的编码序列和连接子序列的一部分的两个重叠、互补的寡核苷酸(AD2上端和AD2下端)。使寡核苷酸退火且用T4PNK磷酸化，产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的5′和3′端处的突出。
将双链DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化而制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT内，以生成穿梭载体CH1-AD2-pGemT。含有用Sac II和EagI限制酶从穿梭载体切除的CH1和AD2编码序列的429个碱基对片段且连接到通过用那些相同的酶消化而制备的h679-pdHL2载体中。最终的表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。
三聚MN-15-679构建体的生成
通过使C-DDD2-Fab-hMN-15与h679-Fab-AD2反应来获得三聚DNL构建体。如下生成具有＞90％产量的DNL三聚体的试验批次。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-15(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4∶1摩尔比混合。总蛋白浓度为在含有1mM EDTA的PBS中的1.5mg/ml。后续步骤涉及TCEP还原、HIC色谱法、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱法。迅速加入5mM TCEP导致与所预期的157kDa蛋白质的二级结构一致的a2b复合物的形成。通过IMP 291亲和色谱法将三聚DNL构建体纯化至接近均质。IMP 291是含有与679Fab结合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等人，2005，Clin Cancer Res11：7122s-29s)。SE-HPLC分析IMP 291未结合的组分显示从产物中去除a4、a2和游离的κ链。结合研究表明并入hMN-15抗体的三聚DNL构建体以与亲本MN-15和679抗体类似的亲和力与CEA和HSG结合。
TF10双特异性抗体的产生
使用类似方案来生成包含C-DDD2-Fab-hPAM4的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝的三聚TF10DNL构建体。TF10中靶向癌症的抗体组分源自hPAM4，一种已作为放射性标记的Mab被详细研究的人源化抗胰腺癌粘蛋白(例如，Gold等人，Clin.Cancer Res.13：7380-7387，2007)。半抗原-结合组分源自h679，一种上述讨论的人源化抗组胺基-琥珀酰-甘氨酸(HSG)Mab。如上所述，使用公开的用于产生(抗CEA)2x抗HSG bsAb方法来产生TF10双特异性([hPAM4]2×h679)抗体。TF10构建体具有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
两种融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立表达。组合组织培养上清液，产生超过两倍摩尔的hPAM4-DDD。将反应混合物使用1mM还原型谷胱甘肽在温和还原条件下在室温孵育24小时。还原后，使用2mM氧化型谷胱甘肽通过温和氧化完成DNL反应。使用与h679Fab高度特异性结合的IMP291-affigel树脂通过亲和色谱法分离TF10。
hMN-15-Fd-AD2-pdHL2
对于某些DNL构建体，优选地使用hMN-15-Fab-AD2融合蛋白，其具有经14个氨基酸残基Gly/Ser肽连接子附加到CH1结构域的羧基末端的AD2(SEQ ID NO：14)的锚定域序列。可利用hMN-15-Fab-AD2构建体，例如，以制备包含较低数量的hMN-15亚基和较高数量的其它效应物部分亚基(例如毒素、细胞因子、药物或另一抗体或抗体片段)的DNL构建体。
如上所述工程化表达载体用于h679-Fab-AD2融合蛋白。合成制备包含AD2的编码序列和部分连接子序列的两种重叠、互补的寡核苷酸(AD2上端和AD2下端)。使寡核苷酸退火和用T4PNK磷酸化，在与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA的连接的相容的5′和3′端处产生突出。
双链DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化而制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT内，以生成穿梭载体CH1-AD2-pGemT。用Sac II和EagI限制酶从穿梭载体切除含有CH1和AD2编码序列的429个碱基对片段且连接到通过用那些相同酶消化而制备的hMN-15-pdHL2载体中。最终表达载体是hMN-15-Fd-AD2-pdHL2。
实施例12.利用用hMN-15-679DNL构建体和111In-标记的肽的预靶向来成像
以下研究证实使用具有标记的靶向肽和并入hMN-15的双特异性抗体的预靶向技术在体内成像的可行性。如前面实施例所述，制备包含C-DDD2-Fab-hMN-15的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝的hMN-15-679DNL构建体。利用用hMN-15-679DNL构建体和111In-IMP-288肽的预靶向对具有0.2至0.3g人结肠癌异种移植物的裸鼠成像。结果显示使用bsMAb预靶向方法在动物模型中清楚地描绘的肿瘤。实验动物接受不同剂量的与给定肽的摩尔数为10∶1或20∶1摩尔比的hMN-15-679DNL构建体，并且第二天给予它们111In-标记的diHSG肽(IMP 288)。对照动物仅接受111In-IMP-288(无预靶向)。注射标记的肽后3h成像且显示在用两种剂量的DNL构建体预靶向的动物中0.2-0.3g肿瘤的清楚定位，且仅给予111In-肽的动物中无定位。
实施例13.聚乙二醇化的DNL构建体
在某些实施方案中，可优选地制备包含抗体或免疫偶联物的聚乙二醇化形式的构建体，例如提高抗体或免疫偶联物部分的血清半衰期。这种聚乙二醇化的构建体可通过DNL技术制备。
在优选的方法中，将待聚乙二醇化的效应物部分(例如hMN-15Fab)与DDD序列连接以生成DDD组件。选择的分子大小的PEG试剂用互补的AD序列衍生化，且所得的PEG-AD组件与DDD组件组合以产生由经DDD和AD之间形成的二硫键与hMN-15Fab的两个拷贝或其它效应物部分在特异性位点束缚的单个PEG组成的聚乙二醇化偶联物。PEG试剂可在具有甲氧基的一端加帽(m-PEG)，可以是直链或支链的，且可包含以下官能团之一：丙醛、丁醛、邻吡啶基硫酯(OPTE)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、噻唑烷-2-硫酮、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、马来酰亚胺或邻二硫吡啶(OPPS)。可能是关注对象的用于聚乙二醇化的效应物部分是酶、细胞因子、趋化因子、生长因子、肽、适体、血红蛋白、抗体和抗体片段。所述方法不受限制且使用公开的方法和组合物可使多种试剂聚乙二醇化。可从商业来源例如NEKTAR
Figure BDA0000140501800000951
Therapeutics(Huntsville，AL)获得多种大小的PEG和与多种反应部分衍生的PEG。
PEG-AD2组件的生成
IMP350：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-NH2(SEQ IDNO：19)
在肽合成器上使用Fmoc方法学用SieberAmide树脂以0.1mmol规模制备并入AD2的序列IMP350。从C-末端开始使用以下保护氨基酸：Fmoc-Cys(t-buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Obut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(but)-OH、Fmoc-Glu(Obut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。使肽从树脂上切割且通过反相(RP)-HPLC纯化。
PEG20-IMP350的合成
将IMP350(0.0104g)与7mL 1M Tris缓冲液(pH 7.81)中的0.1022g mPEG-OPTE(20kDa，NEKTAR
Figure BDA0000140501800000961
THERAPEUTICS)混合。然后加入1mL乙腈以溶解一些悬浮的物质。将反应物在室温搅拌下3h且然后将0.0549g半胱氨酸和0.0527g TCEP一起加入。搅拌反应混合物1.5h且然后在用20％甲醇的水溶液平衡的PD-10脱盐柱上纯化。将样品洗提、冷冻和冻干以获得0.0924g粗PEG20-IMP350(通过MALDIMH+23508)。
IMP362(PEG20-IMP360)的合成
IMP360：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)G-EDANS(SEQID NO：20)MH+2660
在肽合成器上使用Fmoc方法学用Fmoc-Gly-EDANS树脂以0.1mmol规模合成并入AD2序列的IMP 360。使用0.23g Fmoc-Gly-OH、0.29g HATU、26μL DIEA、7.5mL DMF和0.57g EDANS树脂(NOVABIOCHEM
Figure BDA0000140501800000962
)手动地向树脂加入Fmoc-Gly-OH。将试剂混合且加入树脂。将反应物在室温混合2.5hr且用DMF和IPA洗涤树脂以去除过量的试剂。从C-末端开始使用以下保护氨基酸：Fmoc-Cys(t-buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Obut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(but)-OH、Fmoc-Glu(Obut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。将肽从树脂上切割且通过RP-HPLC纯化。
关于IMP362的合成，将IMP360(0.0115g)与7mL 1M tris缓冲液(pH 7.81)中的0.1272g mPEG-OPTE(20kDa，NEKTAR
Figure BDA0000140501800000971
THERAPEUTICS)混合。然后加入乙腈(1mL)以溶解一些悬浮的物质。将反应物在室温下搅拌4h且然后将0.0431g半胱氨酸与0.0410gTCEP一起加入。将反应混合物搅拌1h且在用20％甲醇的水溶液平衡的PD-10脱盐柱上纯化。将样品洗提、冷冻和冻干以获得0.1471g粗IMP362(MH+23713)。
IMP413(PEG30-IMP360)的合成
对于IMP 413的合成，将IMP 360(0.0103g)与7mL 1M tris缓冲液(pH 7.81)中的0.1601g mPEG-OPTE(30kDa，NEKTAR
Figure BDA0000140501800000972
THERAPEUTICS)混合。然后加入乙腈(1mL)以溶解一些悬浮的物质。将反应物在室温搅拌4.5h且然后将0.0473g半胱氨酸与0.0423gTCEP一起加入。将反应混合物搅拌2h，接着透析两天。将透析物质冷冻和冻干以获得0.1552g粗IMP413(MH+34499)。
IMP421的合成
IMP421Ac-C-PEG3-C(S-tBu)GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(S-tBu)G-NH2(SEQ ID NO：21)
通过将以下氨基酸按以下顺序添加到树脂来在NOVASYN
Figure BDA0000140501800000981
TGR树脂(487.6mg，0.112mmol)上制备肽IMP421、MH+2891：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(t-buthio)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Obut)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(but)-OH、Fmoc-Glu(Obut)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(t-buthio)-OH、Fmoc-NH-PEG3-COOH、Fmoc-Cys(Trt)-OH。N-端氨基酸作为乙酰基衍生物来保护。然后使肽从树脂上切割并且通过RP-HPLC纯化以产生32.7mg白色固体。
IMP457的合成
通过标准化学含义合成并入AD2序列的IMP 421(SEQ IDNO：21)。向1mL乙腈中15.2mg(5.26μmol)IMP 421(F.W.2890.50)和274.5mg(6.86μmol)mPEG2-MAL-40K的溶液加入7mL 1M Tris pH7.8并使其在室温反应3h。用49.4mg L-半胱氨酸淬灭过量的mPEG2-MAL-40K，接着用59.1mg TCEP将S-S-tBu去保护1小时。使用两个3-12mL容量10K SLIDE-A-LYZER
Figure BDA0000140501800000982
透析盒(透析到每个盒4ml)使反应混合物在2-8℃透析过夜到5L 5mM醋酸铵(pH 5.0)。第二天制备5mM醋酸铵(pH 5.0)的另外三个5L缓冲液变化，每次透析持续至少
Figure BDA0000140501800000983
将纯化产物(19.4mL)转化至两个20mL闪烁管内，冷冻并冻干以产生246.7mg白色固体。MALDI-TOF给出mPEG2-MAL-40K 42,982和IMP-457 45,500的结果。
实施例14.通过DNL生成聚乙二醇化的hMN-15
制备具有与20kDa PEG偶联的hMN-15Fab的两个拷贝的DNL结构。通过将10倍摩尔过量的经还原且冻干的IMP362加入250mM咪唑、0.02％Tween 20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mMNaH2PO4(pH 7.5)中的hMN-15Fab-DDD2进行DNL反应。在室温在黑暗中6h后，于4℃在黑暗中使反应混合物对CM上样缓冲液(150mM NaCl，20mM NaAc，pH 4.5)透析。将溶液负载到1mL用CM上样缓冲液预平衡的Hi-Trap CM-FF柱(AMERSHAM
Figure BDA0000140501800000991
)上。样品负载后，用CM上样缓冲液洗涤柱至基线，接着用15mL 0.25M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗涤。用12.5mL 0.5M NaCl、20mM NaAc(pH4.5)洗提聚乙二醇化的hMN-15。
通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析偶联过程。在非还原条件下，考马斯亮蓝-染色的凝胶显示反应混合物中主要条带的出现，所述主要条带在未结合的或0.25M NaCl洗涤馏分中不存在，但在0.5MNaCl馏分中明显。用于检测IMP362上EDANS标记的荧光成像，显示条带含有IMP362并且反应混合物和未结合馏分中存在过量的IMP362。DNL反应导致位点特异性和IMP362与hMN-15Fab的二聚体的共价偶联。在破坏二硫键的还原条件下，DNL结构的组分被分解。经计算的(hMN-15Fab)2-PEG构建体的MW与通过MALDI TOF测定的MW匹配。总的来说，通过阳离子交换色谱法纯化后DNL反应产生＞90％纯度的接近定量产量的均质产物。
通过将10倍摩尔过量的经还原且冻干的IMP457加入250mM咪唑、0.02％Tween 20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM NaH2PO4(pH7.5)中的hMN-15Fab-DDD2进行另一DNL反应。在室温60h后，向反应混合物加入1mM氧化型谷胱甘肽，然后保持另外的2h。用CM上样缓冲液(150mM NaCl、20mM NaAc(pH 4.5))将混合物以1∶20稀释且用醋酸滴定至pH 4.5。将溶液负载到用CM上样缓冲液预平衡的1mL Hi-Trap CM-FF柱(AMERSHAM
Figure BDA0000140501800000992
)上。样品负载后，用CM上样缓冲液洗涤柱至基线，接着用15mL 0.25M NaCl、20mM NaAc(pH4.5)洗涤。用20mL 0.5M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗提聚乙二醇化的产物。将DNL构建体浓缩至2mL且渗滤至0.4M PBS(pH 7.4)中。通过SDS-PAGE测定最终的聚乙二醇化的hMN-15Fab2构建体为大约90％纯度。
使用IMP413而非IMP362，如紧接的上面所述制备具有与30kDaPEG偶联的hMN-15Fab的两个拷贝的DNL构建体。如上所述纯化聚乙二醇化的hMN-15Fab2DNL构建体且获得大约90％纯度。聚乙二醇化的DNL构建体可用于如上所述hMN-15的非-聚乙二醇化形式的治疗方法。观察到hMN-15Fab2的聚乙二醇化延长hMN-15部分的血清半衰期，如所预期的那样。
实施例15.基于干扰素(IFN)-α2b DDD组件的生成
通过PCR扩增IFN-α2b的cDNA序列，产生包含以下特征的序列，其中XbaI和BamHI为限制性位点，针对IFN-α2b的信号肽是天然的，并且6His为六聚组氨酸标记(SEQ ID NO：37)：XbaI---信号肽---IFNα2b---6His---BamHI(″6His″公开为SEQ ID NO：37)。所得的分泌性蛋白由在其C-末端与由SEQ ID NO：22组成的多肽融合的IFN-α2b组成。
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPP
DLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)
使用全长人IFNα2b cDNA克隆(INVITROGEN
Figure BDA0000140501800001001
Ultimate ORF人克隆cat#HORF01克隆ID IOH35221)作为模板且使用以下寡核苷酸作为引物完成PCR扩增：
IFNA2 XbaI左端
5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG-3’(SEQ ID NO：23)
IFNA2 BamHI右端
5’GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3’(SEQ ID NO：24)
将PCR扩增引物克隆到PGEMT
Figure BDA0000140501800001011
载体(PROMEGA
Figure BDA0000140501800001012
)中。通过消化用XbaI和Bam HI限制性核酸内切酶来制备用于与IFN-α2b连接的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。IFN-α2b扩增引物用XbaI和Bam HI从PGEMT
Figure BDA0000140501800001013
切除且连接到DDD2-pdHL2载体中以生成表达载体IFN-α2b-DDD2-pdHL2。
通过用SalI酶消化使IFN-α2b-DDD2-pdHL2线性化且通过电穿孔稳定转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞中(参见，例如，美国专利7,537,930，其实施例部分以引用方式并入本文)。通过ELISA发现两种克隆具有可检测的IFN-α2b水平。命名为95的两种克隆之一，适合在无血清培养基中生长而无产量的实质降低。随后将克隆用0.1至0.8μM的渐增的甲氨蝶呤(MTX)浓度扩增5周。在此阶段，通过有限稀释将其亚克隆且扩展最高生成的亚克隆(95-5)。使用商业rIFN-α2b(CHEMICON
Figure BDA0000140501800001014
IF007，Lot 06008039084)作为标准物估计生长于摇瓶中的95-5的产量为2.5mg/L。
将克隆95-5扩展到含有总计20L具有0.8μM MTX的无血清杂交瘤SFM的34个滚瓶中且使其达到终端培养。通过离心使上清液澄清且过滤(0.2μM)。将滤液渗滤至1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5MNaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5))中且浓缩至310mL中，为通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)纯化做准备。将浓缩物负载到30mLNi-NTA柱上，所述Ni-NTA柱用500mL 1X结合缓冲液中的0.02％Tween 20洗涤且然后用290mL 30mM咪唑、0.02％Tween 20、0.5MNaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5.)洗涤。用110mL 250mM咪唑、0.02％Tween 20、150mMNaCl、50mMNaH2PO4(pH 7.5)洗提产物。纯化约6mg的IFNα2b-DDD2。
在还原条件下通过SDS-PAGE评估IFN-α2b-DDD2的纯度(未示出)。IFN-α2b-DDD2为染色最重的带且占总蛋白质的大约50％(未示出)。使产物解析为Mr为～26kDa的二重峰，其与经计算的IFN-α2b-DDD2-SP(26kDa)的MW一致。存在一种Mr为34kDa的主要污染物和许多微弱的污染带(未示出)。
实施例16.通过DNL生成hMN-15Fab-(IFN-α2b)2
C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的产生
已将pdHL2哺乳动物表达载体用于介导许多重组IgG的表达。产生质粒穿梭载体以促进任何IgG-pdHL2载体转化为C-H-AD2-IgG-pdHL2载体。使用pdHL2载体作为模板及寡核苷酸FcBgl II左端和Fc Bam-EcoRI右端作为引物来扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因。
Fc Bgl II左端
5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：25)
Fc Bam-EcoRI右端
5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQID NO：26)
将扩增引物克隆到PGEMTPCR克隆载体中。将Fc插入片段从PGEMT
Figure BDA0000140501800001022
切除且与AD2-pdHL2载体连接以生成穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。
hMN-15IgG-AD2的生成
为了将任何IgG-pdHL2表达载体转化为C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体，将861bp BsrGI/NdeI限制性片段从前者切除且用从Fc-AD2-pdHL2载体切除的952bp BsrGI/NdeI限制性片段替代。BsrGI在CH3结构域中切割且NdeI在表达盒的下游(3’)切割。这种方法用于生成hMN-15IgG-AD2蛋白。
hMN-15IgG-(IFN-α2b)2构建体的生成
通过将经还原且冻干的hMN-15IgG-AD2加入到250mM咪唑、0.02％Tween 20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM NaH2PO4(pH 7.5)中的IFN-α2b-DDD2进行DNL反应。于室温在黑暗中6h后，将反应混合物在4℃在黑暗中对CM上样缓冲液(150mM NaCl，20mMNaAc，pH 4.5)透析。将溶液负载到1mL用CM上样缓冲液预平衡的Hi-Trap CM-FF柱(AMERSHAM
Figure BDA0000140501800001031
)上。样品负载后，用CM上样缓冲液洗涤柱至基线，接着用15mL 0.25M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗涤。用12.5mL 0.5M NaCl、20mM NaAc(pH 4.5)洗提产物。DNL反应导致hMN-15IgG与IFN-α2b的二聚体位点特异性和共价偶联。IgG和IFN-α2b部分保留DNL构建体中它们各自的生理活性。这种技术可用于使任何细胞因子或其它生理上活性的蛋白质或肽与hMN-15附接以靶向地递送至表达CEA抗原的结肠癌或其它癌症。
实施例17.DNL双特异性抗体构建体的制备
例如，在美国专利No.7,521,056中描述了制备双特异性DNL抗体构建体的方法，其方法部分以引用方式并入本文。
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生包含融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的两个拷贝的稳定二聚体的表达载体，其中经柔性肽间隔子DDD1在CH1的羧基末端处与hMN-14Fab连接。已用于产生hMN-14IgG的质粒载体hMN14(I)-pdHL2，通过用Sac II和EagI限制性核酸内切酶消化以去除CH1-CH3结构域以及插入用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体中切除的CH1-DDD1片段来转化为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2的产生
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有经14个氨基酸残基Gly/Ser肽连接子附加到Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠域序列。分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用结合在一起的hMN-14Fab的两个相同拷贝构成。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2载体通过电穿孔转染到Sp/EEE骨髓瘤细胞内。双顺反子表达载体指导组合以形成C-DDD2-Fab-hMN14的hMN-14κ轻链和C-DDD2-Fd-hMN-14的合成和分泌。经DDD2部分发生二聚化，产生由每个DDD2中半胱氨酸残基提供的两个活性巯基。电穿孔后，将细胞涂布于96-孔组织培养皿中且用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。
通过使用涂布有WI2(hMN-14抗Id)的微孔板的ELISA并且用山羊抗人Fab-HRP检测筛选克隆的蛋白表达。最高生成的克隆具有大约100mg/L的初始产量。通过蛋白L亲和色谱法从1.8升滚瓶培养物中纯化总计为200mg的C-DDD2-hMN-14。
三聚hMN-14-hMN-15双特异性DNL构建体的生成
如实施例12中所述制备hMN-15-Fab-AD2。如上所述制备hMN-14-Fab-DDD2。两种融合蛋白(hMN-14-Fab-DDD2和hMN-15-Fab-AD2)在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立表达。将组织培养上清液组合，产生两倍摩尔过量的hMN-14-Fab-DDD2。将反应混合物使用1mM还原型谷胱甘肽在温和还原条件下在室温孵育24小时。还原后，使用2mM氧化型谷胱甘肽通过温和氧化完成DNL反应。使用针对hMN-14的抗独特型抗体通过亲和色谱法分离三聚双特异性DNL构建体。复合物保留hMN-14和hMN-15抗体的结合亲和力。
三聚hPAM4--hMN-15双特异性DNL构建体的生成
如在实施例11中所述制备hMN-15-Fab-AD2和hPAM4-Fab-DDD2。两种融合蛋白(hPAM4-Fab-DDD2和hMN-15-Fab-AD2)在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达。将组织培养上清液组合，产生两倍摩尔过量的hPAM4-Fab-DDD2。将反应混合物使用1mM还原型谷胱甘肽在温和还原条件下在室温孵育24小时。还原后，使用2mM氧化型谷胱甘肽通过温和氧化完成DNL反应。使用针对hMN-15的抗独特型抗体通过亲和色谱法分离三聚双特异性DNL构建体。复合物保留hPAM4和hMN-15抗体的结合亲和力。
熟练的技术人员应意识到三聚Fab构建体可使用已在表达载体中克隆的几乎任何抗体、使用合适的限制性核酸内切酶及标准分子克隆技术来制备。因而，可通过DNL制备hMN-15与任何其它抗体或抗体片段的组合。
实施例18.用于预靶向和18F标记的靶向肽的产生
在某些实施方案中，通过新技术来制备18F-标记的蛋白质或肽且用于诊断和/或成像研究，例如PET成像。用于18F标记的新技术涉及制备与螯合部分(例如DOTA、NOTA或NETA或其衍生物)螯合的18F-金属复合物，优选地18F-铝复合物。螯合部分可与使用本领域熟知的偶联技术的蛋白质、肽或任何其它分子附接。在某些优选实施方案中，18F-Al复合物首先在溶液中形成且然后与已经与蛋白质或肽偶联的螯合部分附接。然而，在替代实施方案中可将铝首先与螯合部分附接且之后加入18F。
肽合成
使用Fmoc方案通过固相肽合成来合成肽。通过使用Fmoc/Aloc保护基向二氨基氨基酸的侧链加入基团以允许差别的去保护。通过Dangles等人(J.Org.Chem.1987，52：4984-4993)的方法去除Aloc基团，除了将哌啶以1∶1的比率加入使用的醋酸之外。如McBride等人(美国专利No.7,405,320，其实施例部分以引用方式并入本文)中所述制备不对称四叔丁基DTPA。
三叔丁基DOTA、对称四叔丁基DTPA、ITC-苯甲基DTPA、p-SCN-Bn-NOTA和TACN从MACROCYCLICS
Figure BDA0000140501800001061
(Dallas，TX)获得。DiBocTACN、NODA-GA(tBu)3和NO2AtBu从CheMatech(Dijon，France)购买。Aloc/Fmoc赖氨酸和Dap(二氨基丙酸衍生物(也称为Dpr))从CREOSALUS
Figure BDA0000140501800001062
(Louisville，KY)或BACHEM
Figure BDA0000140501800001063
(Torrance，CA)获得。Sieber Amide树脂从NOVABIOCHEM
Figure BDA0000140501800001064
(San Diego，CA)获得。其余的Fmoc氨基酸从CREOSALUS
Figure BDA0000140501800001065
BACHEM
Figure BDA0000140501800001066
PEPTECH
Figure BDA0000140501800001067
(Burlington，MA)、EMD BIOSCIENCES
Figure BDA0000140501800001068
(San Diego，CA)、CHEM IMPEX
Figure BDA0000140501800001069
(Wood Dale，IL)或NOVABIOCHEM
Figure BDA00001405018000010610
获得。六水合氯化铝从SIGMA-ALDRICH(Milwaukee，WI)购买。其余的溶剂和试剂从FISHER SCIENTIFIC
Figure BDA00001405018000010612
(Pittsburgh，PA)或SIGMA-ALDRICH
Figure BDA00001405018000010613
(Milwaukee，WI)购买。18F 由IBAMOLECULAR
Figure BDA00001405018000010614
(Somerset，NJ)提供。
IMP 272的18F-标记
被制备且经18F-标记的第一肽是IMP 272：
DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512
如所述合成IMP 272(McBride等人，美国专利No.7,534,431，其实施例部分以引用方式并入本文)。
醋酸盐缓冲溶液-将1.509g醋酸稀释于～160mL水中且通过加入1MNaOH调整pH然后稀释至250mL以制备0.1M溶液，pH 4.03。
醋酸铝缓冲溶液-通过将0.1028g AlCl3六水合物溶解于42.6mLDI水中制备铝的溶液。4mL等份铝溶液与16mL 0.1M NaOAc溶液在pH 4混合以提供2mM Al储备溶液。
IMP 272醋酸盐缓冲溶液-将肽(0.0011g，7.28×10-7mol IMP 272)溶解于364μL 0.1M pH 4醋酸盐缓冲溶液中以获得2mM肽的储备溶液。
IMP 272的F-18标记-将3μL等份的铝储备溶液置于REACTI-VIALTTM中且与50μL 18F(如所接受)和3μL IMP 272溶液混合。将溶液在加热器中于110℃加热15min且通过反相HPLC分析。HPLC分析(未示出)显示93％18F游离且7％与肽结合。向反应中加入另外的10μL IMP 272溶液且将其再次加热且通过反相HPLC分析(未示出)。HPLC迹线显示8％18F在空隙容积且92％活性物与肽附接。将肽溶液的剩余物在室温用150μL PBS孵育～1hr且然后通过反相HPLC检测。HPLC(未示出)显示58％18F未结合且42％仍与肽附接。数据表明当与磷酸酯混合时18F-Al-DTPA复合物可能不稳定。
通过将标记的肽溶液应用于1cc(30mg)WATERS
Figure BDA0000140501800001071
HLB柱(Part#186001879)且用300μL水洗涤以去除未结合的F-18来纯化标记的肽。通过用2×100μL 1∶1EtOH/H2O洗涤柱来洗提肽。将纯化的肽在水中在25℃孵育且通过反相HPLC分析(未示出)。HPLC分析显示18F-标记的IMP 272在水中不稳定。在水中孵育40min后约17％的18F从肽中释放，而83％保持(未示出)。
将肽(16μL 2mM IMP 272，48μg)用18F标记且通过体积排阻HPLC分析肽与抗体的结合。体积排阻HPLC显示肽结合hMN-14×679但未与不相关双特异性抗体hMN-14×734结合(未示出)。
用其它金属标记IMP 27218F
将～3μL等份的金属储备溶液(6×10-9mol)置于聚丙烯锥形瓶且与75μL 18F(如所接受)混合，在室温孵育～2min且然后与0.1M NaOAcpH 4缓冲液中的20μL 2mM(4×10-8mol)IMP 272溶液混合。将溶液在加热器中在100℃加热15min且通过反相HPLC分析。用铟(24％)、镓(36％)、锆(15％)、镥(37％)和钇(2％)标记IMP 272(未示出)。这些结果证明18F金属标记技术并不限于铝配体，但还可利用其它金属。可利用具有不同金属配体的不同螯合部分以优化F-18-金属偶联物的结合。
血清-稳定的18F-标记的肽IMP 449的产生和使用
通过所示顺序将以下氨基酸加至树脂以制备所需的肽而在Sieber Amide树脂上制备肽IMP 448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1009：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH(Aloc被切割)、Fmoc-D-Tyr(but)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH(Aloc被切割)、Fmoc-D-Ala-OH(最后的Fmoc被切割)。然后将肽从树脂上切割且通过HPLC纯化以产生IMP 448，然后将所述IMP 448与ITC-苯甲基NOTA偶联。将0.0757g(7.5×10-5mol)肽IMP 448与0.0509g(9.09×10-5mol)ITC苯甲基NOTA混合且溶解于1mL水中。然后将无水碳酸钾(0.2171g)缓慢加入搅拌的肽/NOTA溶液。加入所有的碳酸盐后反应溶液为pH 10.6。使得反应物在室温搅拌过夜。14hr后用1M HCl将反应小心地淬灭且通过HPLC纯化以获得48mg IMP 449。
IMP 449的18F标记
将肽IMP 449(0.002g，1.37×10-6mol)溶解于686μL(2mM肽溶液)0.1M NaOAc pH 4.02中。将3微升在pH 4醋酸盐缓冲液中的2mMAl溶液与15μL 1.3mCi 18F混合。然后将溶液与20μL 2mM IMP 449溶液混合且在105℃加热15min。反相HPLC分析显示35％(tR～10min)活性物与肽附接且65％活性物在柱的空隙容积被洗提(3.1min，未示出)，这表明大多数活性物与肽不相关。将粗标记的混合物(5μL)与汇集的人血清混合且在37℃孵育。15min后去除一等份且通过HPLC分析。HPLC显示9.8％活性物仍与肽附接(从35％下降)。1hr后去除另一等份且通过HPLC分析。HPLC显示7.6％活性物仍与肽附接(从35％下降)，其基本上与15min迹线相同(数据未示出)。
高剂量18F标记
用纯化的IMP 449的进一步研究证明18F-标记的肽在人血清中在37℃高度稳定(91％，未示出)至少1小时且在人血清中在37℃部分稳定(76％，未示出)至少4小时。进行另外的研究，其中在存在抗坏血酸作为稳定剂的情况下制备IMP 449。在那些研究中(未示出)，显示在37℃4hr后血清中金属-18F-肽复合物不可检测的分解。发现注射18F-标记的肽30min后小鼠尿含有与肽结合的18F(未示出)。这些结果证明在用于18F成像研究的近似体内条件下本文公开的18F-标记的肽展示充分稳定性。
对于不存在抗坏血酸的情况下的研究，将～400μL水中的18F～21mCi与9μL在0.1M pH 4NaOAc中的2mM AlCl3混合。加入60μL肽IMP 449(0.01M，在0.5NaOH pH 4.13中的6×10-7mol)且将溶液加热至110℃保持15min。然后通过将反应溶液置于1cc WATERS
Figure BDA0000140501800001091
HLB柱的筒中且用水洗提以去除未结合的18F接着用1∶1EtOH/H2O洗提18F-标记的肽来将粗标记的肽纯化。使粗反应溶液通过柱流进废物瓶且用3×1mL馏分的水(18.97mCi)洗涤柱。然后将HLB柱置于新瓶且用2×200μL 1∶1EtOH/H2O洗提以收集标记的肽(1.83mCi)。完成所有洗提后柱保留0.1mCi的活性。将等份的纯化的18F-标记的肽(20μL)与200μL汇集的人血清混合且在37℃加热。通过反相HPLC分析等份。结果显示在37℃在人血清中孵育0时间、1小时(91％标记的肽)、2小时(77％标记的肽)和4小时(76％标记的肽)时18F-标记的纯化的IMP 449的相对稳定性(未示出)。还观察到18F-标记的IMP 449在TFA溶液中稳定，其偶尔在反相HPLC色谱期间使用。对本文所述的示例性的18F-标记的分子观察TFA中的稳定性和人血清中的稳定性之间似乎存在一般相关性。这些结果证明根据本文公开的方法产生的18F-标记的肽在人血清中显示充分的稳定性以成功地用于体内标记和成像研究，例如使用PET扫描以检测标记的细胞或组织。最终，因为IMP 449肽含有对放射性裂解敏感的硫脲键合，所以通过RP-HPLC观察到若干产物。然而，当将抗坏血酸加至反应混合物时，生成的副产物显著减少。
实施例19.利用用MN-15-679DNL构建体和18F-标记的肽的预靶向的体内研究
如下制备18F-标记的IMP 449。将～0.5mL中的18F 54.7mCi与3μL在0.1M NaOAc pH 4缓冲液中的2mM Al混合。3min后加入10μL在0.5M pH 4NaOAc缓冲液中的0.05M IMP 449且在96℃加热器中将反应加热15min。用注射器去除反应的内容物。然后通过HPLC在C18柱上纯化粗标记的肽。流速为3mL/min。缓冲液A是0.1％TFA的水溶液且缓冲液B是具有0.1％TFA的90％乙腈的水溶液。在15min内梯度从100％A变为75/25A∶B。在首先洗提的标记的肽和未标记的肽之间的保留时间(tR)上存在约1min差异。以0.5min(mL)馏分收集HPLC洗脱液。标记的肽具有6至9min之间的tR，这取决于使用的柱。通过将所关注的馏分在水中稀释两倍且将溶液置于1ccWATERS
Figure BDA0000140501800001101
HLB柱的筒中来进一步处理HPLC纯化的肽样品。用3×1mL水洗提筒以去除乙腈和TFA接着用400μL 1∶1EtOH/H2O以洗提18F-标记的肽。纯化的[Al18F]IMP 449洗提为分析型HPLC C18柱上的单峰(未示出)。
将具有GW-39异种移植物的雌性无胸腺小鼠(nu/nu)用于体内研究。将3只小鼠用hMN-15-679DNL构建体(162μg)、接着18h后用[Al18F]IMP 449注射。hMN-15-679DNL构建体是用于肿瘤成像研究的人源化双特异性抗体，与CEA肿瘤抗原二价结合且与HSG单价结合。1只小鼠用单独的肽注射。在肽注射后1h对所有的小鼠进行尸体剖检。直接计数组织。平均分布的比较显示位于肿瘤中的18F-标记的肽比在存在靶向肿瘤双特异性抗体的情况下任何正常组织中的大体上更高的水平。结果证明与含有抗体构建体(例如hMN-15-679DNL构建体)的hMN-15联合使用的18F标记的肽，提供18F标记的合适靶标以进行体内成像(例如PET成像分析)。
实施例20.AD和DDD序列变异体
在某些优选实施方案中，并入DNL复合物的AD和DDD序列包含如上所述的AD2(SEQ ID NO：14)和DDD2(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列。然而，在替代实施方案中，AD和/或DDD部分的序列变异体可用于构建细胞因子-MAb DNL复合物。AD和DDD结构域的结构-功能关系已经为调查的对象。(参见，例如，Burns-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001，J Biol Chem276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem J 396：297-306；Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408)。
例如，Kinderman等人(2006)检测了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并且得出结论：人DDD序列含有许多对二聚体形成或AKAP结合重要且在以下SEQ ID NO：11中加下划线的保守氨基酸残基(参见Kinderman等人，2006的图1)。熟练的技术人员应意识到在设计DDD序列的序列变异体时，应期望避免改变任何加下划线的残基，然而可以对二聚化和AKAP结合不太重要的残基进行保守氨基酸取代。
来自蛋白激酶A的人DDD序列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：11)
Alto等人(2003)进行了多种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学分析以设计称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(NO：13)，对DDD的结合常数为0.4nM。将AKAP-IS序列设计为与PKA结合的AKAP的肽拮抗剂。其中取代倾向于降低与DDD的结合的AKAP-IS序列中的残基在以下SEQ ID NO：13中加下划线。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：13)
类似地，Gold(2006)利用晶体学和肽筛选以研发SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：27)，展示出对PKA的RII同种型的选择性比RI同种型高5个数量级。加下划线的残基标示氨基酸取代相对于AKAP-IS序列的位置，其提高与R II α的DDD部分的结合。在此序列中，将N-端Q残基编号为残基数4且C-末端A残基为残基数20。进行取代可影响R II α的亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些替代实施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-IS AD部分序列以制备细胞因子-MAb DNL构建体。可取代AKAP-IS AD序列的其它替代序列在SEQ ID NO：28-30中所示。将相对于AKAP-IS序列的取代加下划线。预期关于在SEQ ID NO：14中所示的AKAP-IS序列，AD部分还可包括另外的N-端残基半胱氨酸和甘氨酸及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：27)
替代AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：28)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：29)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：30)
Stokka等人(2006)还研发了与PKA结合的AKAP的竞争肽，在SEQ ID NO：31-33中示出。肽拮抗剂称为Ht31(SEQ ID NO：31)、RIAD(SEQ ID NO：32)和PV-38(SEQ ID NO：33)。Ht-31肽展示了对PKA的R II同种型更高的亲和力，而RIAD和PV-38显示对RI更高的亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：31)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：32)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：33)
Hundsrucker等人(2006)还研发了与PKA结合的AKAP的其它竞争肽，与PKA的R II形式的DDD的结合常数低至0.4nM。Hundsrucker等人在表1中提供了多种AKAP拮抗肽的序列(以引用方式并入本文)。参照AKAP IS序列(SEQ ID NO：13)通过加下划线在以下标示不同的AKAP蛋白的AD结构域内高度保守的残基。残基与Alto等人(2003)所观察的相同，具有添加的C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，以引用方式并入本文)。对R II DDD序列具有尤其高的亲和力的肽拮抗剂的序列在SEQ ID NO：34-36中示出。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：13)
AKAP7δ-wt-pep
PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：34)
AKAP7δ-L304T-pep
PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：35)
AKAP7δ-L308D-pep
PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：36)
Carr等人(2001)检测了来自人和非人蛋白的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度及鉴定了不同DDD部分内似乎具有最高度保守性的DDD序列中的残基。参照SEQ ID NO：11的人PKAR II αDDD序列通过加下划线在以下标示这些残基。将尤其保守的残基进一步通过斜体标示。所述残基与Kinderman等人(2006)建议对与AKAP蛋白结合重要的残基重叠但不相同。
SHIQ
Figure BDA0000140501800001141
P
Figure BDA0000140501800001142
TE
Figure BDA0000140501800001143
QY
Figure BDA0000140501800001145
V
Figure BDA0000140501800001146
Q
Figure BDA0000140501800001147
P
Figure BDA0000140501800001148
VE
Figure BDA0000140501800001149
VE
Figure BDA00001405018000011410
TR
Figure BDA00001405018000011411
REA
Figure BDA00001405018000011412
A(SEQ ID NO：11)
熟练的技术人员应意识到一般来说，来自不同蛋白质的DDD和AD序列中高度保守的那些氨基酸残基可能是在进行氨基酸取代时优选保持不变的残基，而高度保守性较低的残基可能更易于变化以产生本文所述的AD和/或DDD序列的序列变异体。
熟练的技术人员应意识到可利用DNL构建体的抗体部分或连接子部分中的这些和其它氨基酸取代以增强所得的DNL构建体的治疗性质和/或药代动力学性质。
实施例21.通过间接流式分析细胞仪测试MN-3和MN-15与CEA、NCA-90和NCA-95的反应性
通过Becton-Dickinson FACSCAN
Figure BDA00001405018000011413
的流式细胞仪测试抗体的反应性。生物素化的第二抗体针对小鼠IgG并且通过链霉亲和素/藻红蛋白偶联物来检测。用以1/50稀释1mg/ml储备液的抗体进行测试。
测试抗体MN-3和MN-15对用编码CEA(HeLa-CEA2)、NCA-90(HeLa-KNC6/S44)和NCA-95(HeLa-CGM6/1)的cDNA转染的HeLa细胞的识别。作为阴性对照，使用用质粒pSV2-Neo(对照HeLa细胞，HeLa-NeoA)转染的HeLa细胞。除了抗体MN-3和MN-15之外，还包括3个对照抗体：
与CEA和NCA-95交叉反应，但不与NCA-90反应的MAb 47
与CEA反应的MAb A
与NCA-90反应的MAb NA
由间接荧光流式细胞仪分析的结果显示MN-3结合NCA-90并且也结合CEA，但不结合NCA-95(未示出)。相比之下，MN-15与所有的3个抗原CEA、NCA-90和NCA-95结合(未示出)。测试组中包括的对照抗体显示预期的交叉反应性，如由文献所预测(Berling等人，Cancer Res 1990，50：6534-39)。
Figure IDA0000140501860000011
Figure IDA0000140501860000021
Figure IDA0000140501860000031
Figure IDA0000140501860000041
Figure IDA0000140501860000051
Figure IDA0000140501860000061
Figure IDA0000140501860000071
Figure IDA0000140501860000081
Figure IDA0000140501860000091
Figure IDA0000140501860000101
Figure IDA0000140501860000111
Figure IDA0000140501860000121
Figure IDA0000140501860000131
Figure IDA0000140501860000141
Figure IDA0000140501860000161
Figure IDA0000140501860000181
Figure IDA0000140501860000191

Claims (66)

1.一种组合物，其包括包含轻链可变区CDR(互补决定区)序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及重链可变区CDR序列DYYMS(SEQID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQ ID NO：6)的嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其抗原-结合片段。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其片段与CEACAM5、CEACAM6和粒细胞结合。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中给患有癌症的受试者施用所述I类抗-CEA抗体或其片段使所述癌症对治疗剂敏感。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段包含人抗体IgG1恒定区的序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段是嵌合抗体或其片段。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述嵌合I类抗-CEA抗体或其片段包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的所述可变区氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中I类抗-CEA抗体或其片段是人源化抗体或其片段。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述人源化I类抗-CEA抗体或其片段包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的所述氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述人源化I类抗-CEA抗体或其片段包含人REI抗体的所述轻链FR序列和人KOL抗体的所述重链FR序列。
11.根据权利要求8所述的组合物，其中所述人源化抗体或其片段的所述轻链和重链可变区的所述框架区包含选自SEQ ID NO：10的所述重链氨基酸残基28、29、30、48和49及SEQ ID NO：9的所述轻链氨基酸残基21、47和60的至少一种氨基酸取代。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体片段选自由F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和scFv组成的组。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中I类抗-CEA抗体或其片段是裸抗体或其片段。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸和激素。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述细胞毒素剂是药物或毒素。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述药物具有选自由抗有丝分裂、烷基化、抗代谢、抗血管生成、细胞凋亡、生物碱、COX-2抑制剂和抗生素剂组成的组的药物性质。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、经取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、奥沙利铂和阿霉素。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基尿素、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、马法兰、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、光辉霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链唑霉素、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
20.根据权利要求16所述的组合物，其中所述毒素选自由以下组成的组：篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞外毒素和假单胞内毒素。
21.根据权利要求15所述的组合物，其中所述寡核苷酸选自由RNAi和siRNA组成的组。
22.根据权利要求15所述的组合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、255Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb。
23.根据权利要求15所述的组合物，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和命名为″S1因子″的干细胞生长因子。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述趋化因子选自由RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-B和IP-10组成的组。
26.权利要求13所述的组合物，其中所述诊断剂选自由以下组成的组：放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂和光敏剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述顺磁离子选自由以下组成的组：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。
29.根据权利要求26所述的组合物，其中所述荧光标记选自由以下组成的组：Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5，6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红。
30.根据权利要求14所述的组合物，其还包含一种或多种治疗剂。
31.根据权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其抗原-结合片段是单价的。
32.一种双特异性或多特异性抗体，其包含根据权利要求1所述的第一嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其抗原-结合片段及第二抗体或其抗原-结合片段。
33.根据权利要求32所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述双特异性或多特异性抗体是融合蛋白。
34.根据权利要求32所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述第二抗体或其片段与肿瘤相关抗原(TAA)或可靶向构建体上的半抗原结合。
35.根据权利要求34所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述TAA选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
36.根据权利要求32所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述第二抗体选自由以下组成的组：hPAM4、hA20、hA19、hIMMU31、hLL1、hLL2、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-3、hR1、h679和734。
37.根据权利要求32所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述抗体与至少一种治疗剂和/或诊断剂附接。
38.根据权利要求32所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述第二抗体或其片段与可靶向构建体结合。
39.根据权利要求38所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述可靶向构建体与至少一种治疗剂和/或诊断剂附接。
40.一种递送诊断剂和/或治疗剂的方法，其包括给受试者施用嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其片段，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段包含所述轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ IDNO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及所述重链可变区CDR  序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段与至少一种治疗剂和/或诊断剂偶联。
41.一种治疗疾病的方法，其包括给受试者施用嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其片段，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段包含所述轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：1)、GTSTLAS(SEQ ID NO：2)和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：3)及所述重链可变区CDR  序列DYYMS(SEQ ID NO：4)、FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：5)和DMGIRWNFDV(SEQID NO：6)。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段是裸抗体或其片段。
43.根据权利要求42所述的方法，其还包括给所述受试者施用至少一种治疗剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：裸抗体、抗体片段、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸和激素。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述I类抗-CEA抗体或其片段与至少一种治疗剂偶联。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸和激素。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述细胞毒素剂是药物或毒素。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述药物具有选自由抗有丝分裂、烷基化、抗代谢、抗血管生成、细胞凋亡、生物碱、COX-2和抗生素剂组成的组的药物性质。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、经取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、奥沙利铂和阿霉素。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、昙花毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸酯、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基尿素、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、马法兰、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、光辉霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链唑霉素、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述毒素选自由以下组成的组：篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞外毒素和假单胞内毒素。
52.根据权利要求46所述的方法，其中所述寡核苷酸选自由RNAi和siRNA组成的组。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、125I、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、255Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb。
54.根据权利要求46所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和命名为″S1因子″的干细胞生长因子。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。
56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述趋化因子选自由RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10组成的组。
57.根据权利要求41所述的方法，其中所述嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或片段是还包含与可靶向构建体结合的第二抗体或其片段的双特异性抗体的一部分，并且所述方法还包括给所述受试者施用可靶向构建体，其中所述可靶向构建体与至少一种治疗剂偶联。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸和激素。
59.根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：甲状腺髓样癌(MTC)、结肠直肠癌、肝细胞癌、肝癌、胃癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈部癌、膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌、造血癌、白血病和黑素瘤。
60.一种融合蛋白，其包括包含根据权利要求1所述的嵌合、人源化或人I类抗-CEA抗体或其片段。
61.根据权利要求60所述的融合蛋白，其还包含DDD(二聚化和停靠域)部分或AD(锚定域)部分，其中所述DDD部分具有来自蛋白激酶A的二聚化和停靠域的肽序列且所述AD部分具有来自AKAP(A-激酶锚定蛋白)的锚定域的肽序列。
62.根据权利要求61所述的融合蛋白，其中所述DDD部分作为选自由DDD1(SEQ ID NO：11)和DDD2(SEQ ID NO：12)组成的组的氨基酸序列。
63.根据权利要求61所述的融合蛋白，其中所述AD部分作为选自由AD1(SEQ ID NO：13)和AD2(SEQ ID NO：14)组成的组的氨基酸序列。
64.根据权利要求61所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是停靠和锁定(DNL)复合物的一部分。
65.根据权利要求60所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与至少一种诊断剂或治疗剂附接。
66.根据权利要求64所述的融合蛋白，其中所述DNL复合物还包含选自由抗体、抗原-结合抗体片段、细胞因子、毒素和siRNA组成的组的效应物部分。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104918958A (zh) * 2012-11-20 2015-09-16 赛诺菲 抗ceacam5抗体及其用途
WO2017025033A1 (zh) * 2015-08-10 2017-02-16 中山大学 用于治疗cea阳性表达肿瘤的双特异纳米抗体
CN107743495A (zh) * 2015-03-23 2018-02-27 拜耳制药股份公司 抗ceacam6抗体及其用途
CN108341876A (zh) * 2017-01-22 2018-07-31 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108440668A (zh) * 2017-02-16 2018-08-24 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 Fgf21与igf-1的融合蛋白及其应用
CN110139874A (zh) * 2016-10-10 2019-08-16 新加坡保健服务集团有限公司 抗ceacam6抗体及其使用方法
CN110698559A (zh) * 2015-12-24 2020-01-17 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN110713539A (zh) * 2019-09-23 2020-01-21 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途
CN110831977A (zh) * 2017-07-07 2020-02-21 安斯泰来制药株式会社 新型抗人CEACAM5抗体Fab片段
WO2020244526A1 (zh) * 2019-06-04 2020-12-10 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN112557662A (zh) * 2021-02-22 2021-03-26 北京瀚梅生物科技有限公司 一种结直肠癌检测试剂盒
CN112839683A (zh) * 2018-10-10 2021-05-25 安斯泰来制药株式会社 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
WO2023041065A1 (zh) * 2021-09-17 2023-03-23 优迈生物科技(连云港)有限公司 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用
US11679166B2 (en) 2016-11-18 2023-06-20 Astellas Pharma Inc. Anti-human MUC1 antibody Fab fragment
CN116731165A (zh) * 2023-03-23 2023-09-12 北京巴瑞医疗器械有限公司 一种抗血清素抗体及其应用
WO2023198019A1 (zh) * 2022-04-12 2023-10-19 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种抗ceacam5和ceacam6抗体及其应用

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7527787B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
CA2501616C (en) * 2002-10-08 2015-05-12 Immunomedics, Inc. Antibody therapy
US20100226884A1 (en) * 2009-01-20 2010-09-09 Immunomedics, Inc. Novel Class of Monospecific and Bispecific Humanized Antibodies that Target the Insulin-like Growth Factor Type I Receptor (IGF-1R)
US9862770B2 (en) * 2005-10-19 2018-01-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting IGF-1R show potent toxicity against solid tumors
US9272029B2 (en) 2009-03-26 2016-03-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Interferon lambada-antibody complexes
CA2774260C (en) * 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
US9464136B2 (en) 2010-08-20 2016-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Antibody-based constructs directed against tyrosine kinase receptors
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
AU2011336470B8 (en) 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
WO2012097313A2 (en) 2011-01-14 2012-07-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
CN103842383B (zh) 2011-05-16 2017-11-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
EP2537933A1 (en) 2011-06-24 2012-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines
CN102911248B (zh) * 2011-08-05 2014-12-10 上海原子科兴药业有限公司 合成1，4-二取代三唑结构的188Re(CO)3标记化合物的方法
EP2806887A4 (en) * 2012-01-26 2015-11-04 Ibc Pharmaceuticals Inc OBJECT TO INTERFERON LAMBDA WITH ANTIBODIES FOR GAINING ANTITUMOR AND ANTIVIRAL EFFECTS
EP2708556B1 (en) 2012-09-12 2018-11-07 Samsung Electronics Co., Ltd Pharmaceutical composition for the use in a combination therapy for prevention or treatment of c-met or angiogenesis factor induced diseases
HUE045435T2 (hu) 2012-10-12 2019-12-30 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinek és konjugátumaik
JP6392770B2 (ja) 2012-12-03 2018-09-19 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ４７抗体およびその使用方法
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US10329350B2 (en) 2012-12-26 2019-06-25 Industrial Technology Research Institute Method for producing a multivalent fab fragment with collagen-like peptide
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
AU2014240083C1 (en) 2013-03-15 2019-10-24 Celgene Corporation Modified T lymphocytes
CA2909576C (en) 2013-04-19 2023-07-18 Cytune Pharma Cytokine derived treatment with reduced vascular leak syndrome
US9717715B2 (en) 2013-11-15 2017-08-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of combination therapy using an anti-C-Met antibody
US9349535B2 (en) 2013-12-17 2016-05-24 Metastable Materials, Inc. Method and apparatus for manufacturing isotropic magnetic nanocolloids by pulsed laser ablation
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
CN113549153A (zh) 2014-05-29 2021-10-26 宏观基因有限公司 三特异性结合分子和其使用方法
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN106999517A (zh) 2014-10-07 2017-08-01 免疫医疗公司 抗体‑药物缀合物的新辅助剂用途
CA2973978A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of cancer with anti-lap monoclonal antibodies
WO2016210108A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
SI3316885T1 (sl) 2015-07-01 2021-09-30 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati protitelo-SN-38 z linkerjem CL2A
GB201514875D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Receptor
CR20180318A (es) 2015-12-14 2018-09-19 Macrogenics Inc Moléculas biespecíficas que tienen inmunorreactividad con pd-1 y ctla-4, y métodos de uso de las mismas
SG10201601719RA (en) 2016-03-04 2017-10-30 Agency Science Tech & Res Anti-LAG-3 Antibodies
EP3430058A4 (en) 2016-03-15 2019-10-23 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
SG10201913326UA (en) 2016-06-07 2020-02-27 Macrogenics Inc Combination therapy
CN109862919A (zh) 2016-10-11 2019-06-07 免疫医疗有限公司 抗体-药物缀合物联合免疫介导的治疗剂
CA3041284A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Celgene Corporation Cereblon-based heterodimerizable chimeric antigen receptors
US11459394B2 (en) 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
EP3398967A1 (en) 2017-05-04 2018-11-07 B Cell Design Antibodies against carcinoembryonic antigen for cancer therapy and diagnosis
EP3648786A4 (en) 2017-07-03 2021-12-15 Torque Therapeutics, Inc. FUSION MOLECULES TARGETING IMMUNE REGULATORY CELLS AND THEIR USES
CA3067247A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides that bind complement component c5 or serum albumin and fusion proteins thereof
WO2019075090A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Tilos Therapeutics, Inc. ANTI-LAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
RU2020122822A (ru) 2017-12-12 2022-01-13 Макродженикс, Инк. Биспецифичные связывающие cd16 молекулы и их применение при лечении заболеваний
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
JP2021524449A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 分子アジュバント
US20210221908A1 (en) 2018-06-03 2021-07-22 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
GB201811410D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd OX40 Binding molecules
GB201811415D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-Mesothelin Anti bodies
MX2021003184A (es) 2018-09-26 2021-08-11 Ascendis Pharma As Hidrogeles de acido hialuronico degradables.
JP2022504839A (ja) 2018-10-10 2022-01-13 ティロス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 抗ｌａｐ抗体変異体及びその使用
CN110132937A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 福建师范大学 一种dna链作为信号开关检测重金属离子的制备方法
CN110327074A (zh) * 2019-08-02 2019-10-15 无锡海斯凯尔医学技术有限公司 肝脏评价方法、装置、设备及计算机可读存储介质
GB201911187D0 (en) 2019-08-05 2019-09-18 Autolus Ltd Receptor
CN114786776A (zh) 2019-09-18 2022-07-22 拉姆卡普生物阿尔法股份公司 针对ceacam5和cd3的双特异性抗体
WO2021059075A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Janssen Biotech, Inc. Anti-ceacam antibodies and uses thereof
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
BR112023001733A2 (pt) * 2020-09-04 2023-03-28 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-ceacam5 e conjugados e usos dos mesmos
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
EP4055055B1 (en) 2020-12-18 2023-11-22 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2023016488A1 (zh) 2021-08-13 2023-02-16 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种基于微管抑制剂的抗体偶联药物
CN117881431A (zh) 2021-08-24 2024-04-12 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种由可断裂连接子偶联的抗体偶联药物
GB202115329D0 (en) 2021-10-25 2021-12-08 Autolus Ltd Chimeric cytokine receptor
CN114560944B (zh) * 2022-03-30 2022-08-09 北京科跃中楷生物技术有限公司 胶体金颗粒标记的抗体及其应用
CN114409789B (zh) * 2022-03-30 2022-06-07 北京科跃中楷生物技术有限公司 一种胶体金颗粒标记方法及检测试剂盒
WO2023242351A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Lamkap Bio Beta Ag Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
US20240124607A1 (en) 2022-08-10 2024-04-18 Merck Sharp & Dohme Llc Proteins binding nkg2d, cd16, and ceacam5

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1878562A (zh) * 2002-10-08 2006-12-13 免疫医疗公司 抗体治疗
WO2007071426A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Micromet Ag Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US672015A (en) 1900-10-05 1901-04-16 Alfred Schlatter Automatic switch for groups of transformers.
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4818709A (en) 1983-01-21 1989-04-04 Primus Frederick J CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay
US4824659A (en) 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US5525338A (en) 1992-08-21 1996-06-11 Immunomedics, Inc. Detection and therapy of lesions with biotin/avidin conjugates
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US6861511B1 (en) 1986-06-04 2005-03-01 Bayer Corporation Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US6511665B1 (en) 1987-11-25 2003-01-28 Immunex Corporation Antibodies to interleukin-1 receptors
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
DE3909799A1 (de) 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
US6432402B1 (en) 1989-05-25 2002-08-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti-idiotypic antibody which induces an immune response against a glycosphingolipid and use thereof
DE69028684T2 (de) 1989-06-02 1997-05-22 Univ Johns Hopkins Med Gegen die beta-kette des leukozyten-adhäsions-rezeptors gerichtete monoklonale antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5081235A (en) 1989-07-26 1992-01-14 City Of Hope Chimeric anti-cea antibody
US7041293B1 (en) 1990-04-03 2006-05-09 Genentech, Inc. HIV env antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6764681B2 (en) 1991-10-07 2004-07-20 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
US5854416A (en) 1991-11-14 1998-12-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Streptococcus pneumoniae 37-KDA surface adhesin a protein and nucleic acids coding therefor
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
WO1993015405A1 (en) 1992-01-29 1993-08-05 Sci-Clone, Inc. Carcinoma associated antigen (sk1) monoclonal antibodies against sk1, methods of producing these antibodies and use therfor
CA2131692A1 (en) 1992-03-09 1993-09-16 Sybille Muller An anti-idiotypic antibody and its use in diagnosis and therapy in hiv-related disease
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5578704A (en) 1992-04-03 1996-11-26 Genentech, Inc. Antibody to osteoclast alphavbeta3 ntegrin
EP0643583B1 (en) 1992-05-06 2000-07-26 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular and endoscopic tumor and lesion detection and therapy
US6096289A (en) 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
WO1993023556A1 (en) 1992-05-08 1993-11-25 Genentech, Inc. Antibodies to leukemia inhibitory factor
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
WO1994026297A1 (en) 1993-05-17 1994-11-24 Immunomedics, Inc. Improved detection and therapy of lesions with biotin/avidin-metal chelating protein conjugates
DE69434812D1 (de) 1993-05-28 2006-09-14 Scripps Research Inst Methoden für inhibition der cd14-abhängigen zellaktivierung
US6084067A (en) 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
WO1995007102A1 (en) 1993-09-09 1995-03-16 Duke University A method of promoting cellular function
WO1995014040A1 (en) 1993-11-19 1995-05-26 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6432404B1 (en) 1993-12-23 2002-08-13 Icos Corporation Methods of inhibiting locomotor damage following spinal cord injury with α D-specific antibodies
US5922572A (en) 1994-01-25 1999-07-13 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding haemopoietic maturation factor
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US6100389A (en) 1995-04-21 2000-08-08 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding a human chemotactic protein
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
ATE306930T1 (de) 1994-08-12 2005-11-15 Immunomedics Inc Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US6458349B1 (en) 1995-06-02 2002-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine β-4 polypeptides
US6174995B1 (en) 1994-08-23 2001-01-16 Haodong Li Human chemokines, CKβ4 and CKβ10/MCP-4
US6709653B1 (en) 1994-09-16 2004-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies specific for human inositol monophosphatase H1
US5874540A (en) * 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
US6538121B1 (en) 1994-11-01 2003-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-1 β converting enzyme like apoptosis protease-3 and 4
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US6521227B1 (en) 1999-11-18 2003-02-18 Peter L. Hudson Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US6537764B1 (en) 1995-01-19 2003-03-25 Children's Medical Center Corporation Method of identifying inhibitors of C—C chemokine receptor 3
US5786204A (en) 1995-01-20 1998-07-28 Human Genome Sciences, Inc. Human prostatic specific reductase
US6312691B1 (en) 1996-01-26 2001-11-06 Jeffrey L. Browning Lymphotoxin-α/β complexes and anti-lympotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents
US6949244B1 (en) 1995-12-20 2005-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Murine monoclonal anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof
US5783404A (en) 1995-04-13 1998-07-21 Amgen Inc. Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5773252A (en) 1995-06-05 1998-06-30 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor 15
US5773292A (en) 1995-06-05 1998-06-30 Cornell University Antibodies binding portions, and probes recognizing an antigen of prostate epithelial cells but not antigens circulating in the blood
US6605441B1 (en) 1995-06-05 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against fibroblast growth factor 11
WO1996040875A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Methods for obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells and antibodies for use therein
US6340459B1 (en) 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5945309A (en) 1996-03-19 1999-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Cytostatin III nucleic acids encoding
WO1997034632A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Immunomedics, Inc. Glycosylated humanized b-cell specific antibodies
FR2746398B1 (fr) 1996-03-21 1998-04-30 Bio Merieux Anticorps specifique de staphylococcus aureaus, et utilisations
US6174992B1 (en) 1997-03-21 2001-01-16 Human Genome Sciences, Inc. Human endometrial specific steroid-binding factor I, II and III
US6962981B1 (en) 1996-03-25 2005-11-08 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US6110463A (en) 1996-03-29 2000-08-29 North Carolina State University Anti-Cryptosporidium parvum preparations
US6066617A (en) 1996-04-03 2000-05-23 Human Genome Sciences, Inc. Human cystatin F
US7011812B1 (en) 1996-05-03 2006-03-14 Immunomedics, Inc. Targeted combination immunotherapy of cancer and infectious diseases
AU717020B2 (en) 1996-05-03 2000-03-16 Immunomedics Inc. Targeted combination immunotherapy of cancer
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
DE69735547T2 (de) 1996-09-03 2007-03-08 Kaneka Corp. Verfahren zur induzierung von immunsupprimierten zellen und vorrichtung zu deren kultivierung
US6479247B1 (en) 1996-10-09 2002-11-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Dendritic cell-specific antibodies
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6528625B1 (en) 1996-10-28 2003-03-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibodies and kits comprising same
AU7180398A (en) 1996-11-13 1998-06-03 Morphogenesis, Inc. Antibody MG1 recognizing a small subset of human hematopoietic cells
US6455040B1 (en) 1997-01-14 2002-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptor 5
US6605699B1 (en) 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
AU6241698A (en) 1997-01-21 1998-08-07 Human Genome Sciences, Inc. Tace-like and matrilysin-like polypeptides
US6342363B1 (en) 1997-01-28 2002-01-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4 nucleic acids and methods
DE69840723D1 (de) 1997-02-11 2009-05-20 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikörper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
CA2282410A1 (en) 1997-03-03 1998-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies to human cd6
US6951924B2 (en) 1997-03-14 2005-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against secreted protein HTEBYII
US6919433B2 (en) 1997-03-14 2005-07-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to protein HPMBQ91
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
ATE302217T1 (de) 1997-05-02 2005-09-15 Us Gov Health & Human Serv Immuntoxine, die ein onc protein enthalten, gegen bösartige zellen
US6284474B1 (en) 1998-04-23 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Detection and diagnosis of conditions associated with lung injury
US6372217B1 (en) 1997-06-03 2002-04-16 Regents Of The University Of Minnesota Methods for the treatment of CD7+ viral infection with TXU-7-PAP
US6545130B2 (en) 1997-06-04 2003-04-08 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Monoclonal antibodies to mycobacterium tuberculosis and a modified ELISA assay
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
US6342220B1 (en) * 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
ATE393222T1 (de) 1997-09-18 2008-05-15 Genentech Inc Dcr3 polypeptid, ein tnfr homolog
US6689607B2 (en) 1997-10-21 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US6355244B1 (en) 1997-11-17 2002-03-12 University Of Kentucky Research Foundation Methods and compositions for the treatment of psoriasis
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
US6562618B1 (en) 1997-12-25 2003-05-13 Japan Tobacco, Inc. Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US6861227B2 (en) 1998-03-19 2005-03-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to cytokine receptor common gamma chain like
US6200765B1 (en) 1998-05-04 2001-03-13 Pacific Northwest Cancer Foundation Non-invasive methods to detect prostate cancer
AU742626B2 (en) 1998-05-20 2002-01-10 Immunomedics Inc. Therapeutics using a bispecific anti-HLA class II invariant chain X anti-pathogen antibody
JP2002518347A (ja) 1998-06-15 2002-06-25 アルタレックス コーポレイション 前立腺癌治療のための免疫療法組成物および方法
US6528269B1 (en) 1998-06-22 2003-03-04 Case Western Reserve University Immunological agents specific for prion protein (PRP)
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
ATE460946T1 (de) 1998-06-22 2010-04-15 Immunomedics Inc Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7405320B2 (en) 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7052872B1 (en) 1999-06-22 2006-05-30 Immunomedics, Inc. Bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US6312689B1 (en) 1998-07-23 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6572856B1 (en) 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
JP2002528140A (ja) 1998-11-05 2002-09-03 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ ヒトｐａｎ−ｈｃｖヒトモノクローナル抗体
DK1135498T3 (da) 1998-11-18 2008-05-26 Genentech Inc Antistofvarianter med höjere bindingsaffinitet end forældreantistoffer
KR20010081089A (ko) 1998-12-21 2001-08-25 에드워드 에이. 맥더모 2세, 로이드 제이. 오울드 절단된 ｖｅｇｆ-ｄ에 대한 항체 및 그것의 이용
AU3128000A (en) 1998-12-23 2000-07-31 Human Genome Sciences, Inc. Peptidoglycan recognition proteins
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6488930B1 (en) 1999-01-15 2002-12-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR4 antibodies and methods of use therefor
WO2000064946A2 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US7527787B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7534866B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US7074403B1 (en) 1999-06-09 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
US7550143B2 (en) * 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US20020002270A1 (en) 1999-06-16 2002-01-03 Raymond P. Zinkowski Purified antigen for alzheimer's disease, and methods of obtaining and using same
AU5625500A (en) 1999-06-18 2001-01-09 Emory University Huntington disease cellular model: stably transfected pc12 cells expressing mutant huntingtin
US6964854B1 (en) 1999-07-13 2005-11-15 Science & Technology Corporation Compositions and methods useful for the diagnosis and treatment of heparin induced thrombocytopenia/thrombosis
US6693176B1 (en) 1999-07-23 2004-02-17 University Of Massachusetts Antitumor antibodies, proteins, and uses thereof
US6376654B1 (en) 1999-08-13 2002-04-23 Molecular Discoveries, Llc Myeloma cell and ovarian cancer cell surface glycoproteins, antibodies thereto, and uses thereof
US6716966B1 (en) 1999-08-18 2004-04-06 Altarex Corp. Therapeutic binding agents against MUC-1 antigen and methods for their use
AU7089600A (en) 1999-08-30 2001-03-26 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Monoclonal antibodies and vaccines against epitopes on the ebola virus glycoprotein
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20030031670A1 (en) 1999-11-08 2003-02-13 Jack R. Wands Diagnosis and treatment of malignant neoplasms
US6835370B2 (en) 1999-11-08 2004-12-28 Rhode Island Hospital Diagnosis and treatment of malignant neoplasms
US6994852B1 (en) 1999-11-12 2006-02-07 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Inhibition of angiogenesis by antibodies against high molecular weight kininogen domain 5
US6994976B1 (en) 1999-11-19 2006-02-07 Tittle Thomas V Tr3-specific binding agents and methods for their use
US6319675B1 (en) 1999-11-24 2001-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting and/or identifying agents which bind and/or modulate function of “bonzo” chemokine receptor
US6835549B2 (en) 2000-02-24 2004-12-28 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Immunoassay method for the diagnosis of gastric intestinal metaplasia associated with gastric carcinoma
US6998468B2 (en) 2000-03-23 2006-02-14 Tanox, Inc. Anti-C2/C2a inhibitors of complement activation
EP1294398A2 (en) 2000-05-11 2003-03-26 Altarex Corp. Therapeutic method and composition utilizing antigen-antibody complexation and presentation by dendritic cells
WO2001094413A2 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Bristol-Myers Squibb Company B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation
AU2001278129A1 (en) 2000-07-31 2002-02-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specific binding agents for kshv vil-6 that neutralize a biological activity
DK1309627T3 (da) * 2000-08-08 2009-12-21 Immunomedics Inc Immunoterapi for kronisk myelocytisk leukæmi med nögent anti-NCA-90-antistof
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
US6989241B2 (en) 2000-10-02 2006-01-24 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for rapid detection of human activated protein C and highly specific monoclonal antibody therefor
EP2281840A3 (en) 2000-10-10 2012-05-23 Genentech, Inc. Inhibition of complement C5 activation for the treatment and prevention of delayed xenograft or acute vascular rejection
GB0029360D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Univ Nottingham Humanised antibodies and uses thereof
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
US6743898B2 (en) 2001-03-15 2004-06-01 Ochsner Clinic Foundation Monoclonal antibodies that suppress B cell growth and/or differentiation
US6824778B2 (en) 2001-04-23 2004-11-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Prophylactic and therapeutic monoclonal antibodies
AU2002303832A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. P.aeruginosa mucoid exopolysaccharide specific binding peptides
US7049060B2 (en) 2001-11-05 2006-05-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV anti-core monoclonal antibodies
CA2476166C (en) 2002-02-14 2011-11-15 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US7282567B2 (en) 2002-06-14 2007-10-16 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody hPAM4
DE60325184D1 (de) 2002-03-01 2009-01-22 Immunomedics Inc Rs7 antikörper
EP2865688A1 (en) 2002-03-01 2015-04-29 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
US7563433B2 (en) 2007-01-11 2009-07-21 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
EP1546203B1 (en) 2002-08-01 2012-06-20 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US7541440B2 (en) * 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
CA2501616C (en) * 2002-10-08 2015-05-12 Immunomedics, Inc. Antibody therapy
EP1551876B1 (en) * 2002-10-16 2011-03-16 Purdue Pharma L.P. Antibodies that bind cell-associated ca 125/0722p and methods of use thereof
DE60332957D1 (de) * 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
US6875580B2 (en) 2003-01-28 2005-04-05 Schering Corporation Antibodies specific for plasmacytoid dendritic cells
CA2514277C (en) 2003-01-31 2015-01-20 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for administering therapeutic and diagnostic agents
US7109304B2 (en) 2003-07-31 2006-09-19 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD19 antibodies
WO2006107617A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US7537930B2 (en) 2004-07-23 2009-05-26 Immunomedics, Inc. Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7531327B2 (en) 2004-07-23 2009-05-12 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7608425B2 (en) 2004-07-23 2009-10-27 Immunomedics, Inc. Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium
JP2008520186A (ja) * 2004-10-01 2008-06-19 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 哺乳類ｅａｇ１イオンチャネルタンパク質に対する新規の抗体
EP3332808B1 (en) 2005-03-03 2020-09-09 Immunomedics Inc. Humanized l243 antibodies
WO2007098283A2 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Biogen Idec Ma Inc. Use of antagonists of maif receptor complex molecules and neurotrophic factors for treatment of neurological diseases and disorders
NZ590330A (en) * 2008-07-21 2012-08-31 Immunomedics Inc Structural variants of anti-cd20 antibodies for improved therapeutic characteristics
CA2774260C (en) * 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
US8877202B2 (en) * 2013-02-07 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Pro-drug form (P2PDOX) of the highly potent 2-pyrrolinodoxorubicin conjugated to antibodies for targeted therapy of cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1878562A (zh) * 2002-10-08 2006-12-13 免疫医疗公司 抗体治疗
WO2007071426A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-28 Micromet Ag Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104918958B (zh) * 2012-11-20 2019-12-10 赛诺菲 抗ceacam5抗体及其用途
CN104918958A (zh) * 2012-11-20 2015-09-16 赛诺菲 抗ceacam5抗体及其用途
US11773164B2 (en) 2015-03-23 2023-10-03 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Anti-CEACAM6 antibodies and uses thereof
CN107743495A (zh) * 2015-03-23 2018-02-27 拜耳制药股份公司 抗ceacam6抗体及其用途
US11866495B2 (en) 2015-03-23 2024-01-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Anti-CEACAM6 antibodies and uses thereof
WO2017025033A1 (zh) * 2015-08-10 2017-02-16 中山大学 用于治疗cea阳性表达肿瘤的双特异纳米抗体
CN110698559A (zh) * 2015-12-24 2020-01-17 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN110698559B (zh) * 2015-12-24 2021-11-26 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN110139874A (zh) * 2016-10-10 2019-08-16 新加坡保健服务集团有限公司 抗ceacam6抗体及其使用方法
CN110139874B (zh) * 2016-10-10 2023-04-14 新加坡保健服务集团有限公司 抗ceacam6抗体及其使用方法
US11679166B2 (en) 2016-11-18 2023-06-20 Astellas Pharma Inc. Anti-human MUC1 antibody Fab fragment
CN108341876A (zh) * 2017-01-22 2018-07-31 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108440668A (zh) * 2017-02-16 2018-08-24 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 Fgf21与igf-1的融合蛋白及其应用
CN110831977B (zh) * 2017-07-07 2023-06-09 安斯泰来制药株式会社 新型抗人CEACAM5抗体Fab片段
CN110831977A (zh) * 2017-07-07 2020-02-21 安斯泰来制药株式会社 新型抗人CEACAM5抗体Fab片段
TWI795415B (zh) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
US11667724B2 (en) 2017-07-07 2023-06-06 Astellas Pharma Inc. Anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment
CN112839683A (zh) * 2018-10-10 2021-05-25 安斯泰来制药株式会社 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
CN112839683B (zh) * 2018-10-10 2023-11-14 安斯泰来制药株式会社 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
CN113906052A (zh) * 2019-06-04 2022-01-07 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN113906052B (zh) * 2019-06-04 2024-02-13 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2020244526A1 (zh) * 2019-06-04 2020-12-10 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN110713539A (zh) * 2019-09-23 2020-01-21 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗癌胚抗原的抗体及其制备方法和用途
CN112557662A (zh) * 2021-02-22 2021-03-26 北京瀚梅生物科技有限公司 一种结直肠癌检测试剂盒
CN112557662B (zh) * 2021-02-22 2021-07-06 和卓生物科技（上海）有限公司 一种结直肠癌检测试剂盒
WO2023041065A1 (zh) * 2021-09-17 2023-03-23 优迈生物科技(连云港)有限公司 一种靶向人ceacam5/6的抗体、制备方法和应用
WO2023198019A1 (zh) * 2022-04-12 2023-10-19 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种抗ceacam5和ceacam6抗体及其应用
CN116731165A (zh) * 2023-03-23 2023-09-12 北京巴瑞医疗器械有限公司 一种抗血清素抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2774260C (en) 2018-10-09
US20150343087A1 (en) 2015-12-03
US8470994B2 (en) 2013-06-25
US9371393B2 (en) 2016-06-21
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US8945554B2 (en) 2015-02-03
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US8603479B1 (en) 2013-12-10
US20110064653A1 (en) 2011-03-17
US8287865B2 (en) 2012-10-16
US20140308278A1 (en) 2014-10-16
US20130034492A1 (en) 2013-02-07
EP3009455A1 (en) 2016-04-20
EP2478110A1 (en) 2012-07-25
US20130344071A1 (en) 2013-12-26
US20140079629A1 (en) 2014-03-20
EP2478110A4 (en) 2013-11-27
CN102482701B (zh) 2015-05-13
EP2478110B1 (en) 2016-01-06
CA2774260A1 (en) 2011-03-24
US9139657B2 (en) 2015-09-22

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