CN110139874A - 抗ceacam6抗体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合CEACAM6的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其包含(i)重链可变结构域,其包含具有氨基酸序列GNTFTSYVMH的VHCDR1;和具有氨基酸序列YINPYNDGTKYNEKFKG的VHCDR2;和具有氨基酸序列STARATPYFYAMDY的VHCDR3和(ii)轻链可变结构域,其包含具有氨基酸序列KSS样品QSLLWSVNQNSYLS的VLCDR1、具有氨基酸序列GASIRES的VLCDR2和具有氨基酸序列QHNHGSFLPYT的VLCDR3。本发明还涉及包含抗原结合蛋白或其抗原结合片段的组合物、使用抗原结合蛋白或其抗原结合片段用于癌症的治疗、预防或检测的方法和包含抗原结合蛋白或其抗原结合片段的试剂盒。
Description
相关申请案的交叉引用
本申请要求于2016年10月10日提交的新加坡申请号10201608481W的优先权,其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及抗体。具体地,本发明涉及抗CEACAM6单克隆抗体及其用途。
背景技术
癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)属于癌胚抗原(CEA)家族。CEACAM6是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面糖蛋白,已经观察到其在多种癌症(包括乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌)中过表达。作为肿瘤中的癌基因,CEACAM6促进癌症侵袭、转移、失巢凋亡抵抗和化学抵抗,并抑制分化。
迄今为止,数量非常有限的抗CEACAM6单克隆抗体可用于抗体疗法或用作癌症治疗的抗体-药物缀合物。因此需要开发针对CEACAM6的新抗体,其可用于抗体疗法或用作癌症治疗的抗体-药物缀合物。
发明内容
在一个方面,提供了抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其包含(i)重链可变结构域,其包含具有氨基酸序列GNTFTSYVMH(SEQ ID NO:3)的VHCDR1;具有氨基酸序列YINPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2和具有氨基酸序列STARATPYFYAMDY(SEQ IDNO:5)的VHCDR3;(ii)轻链可变结构域,其包含具有氨基酸序列KSSQSLLWSVNQNSYLS(SEQ IDNO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列GASIRES(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有该氨基酸序列QHNHGSFLPYT(SEQ ID NO:8)的VLCDR3。
另一方面,提供了组合物,其包含生理学上可接受的载体和本文所公开的治疗有效量的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
另一方面,提供了如本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段或本文所公开的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
另一方面,提供了如本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段或如本文所公开的组合物用于治疗或预防癌症。
另一方面,提供了治疗或预防癌症的方法,包括施用本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段或本文所公开的组合物至有需要的受试者。
另一方面,提供了用于检测受试者中的癌症的方法,该方法包括:使得从受试者获得的样品与本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测样品中抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将该结合与对照样品中的结合水平相关联以确定样品中的结合水平,其中相对于对照样品,样品中结合水平增加指示癌症。
另一方面,提供了鉴定易患癌症的受试者的方法,该方法包括:使得从受试者获得的样品与本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测样品中抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将该结合与对照样品中的结合水平相关联以确定样品中的结合水平,其中相对于对照样品,样品中结合水平增加指示癌症。
在一个方面,提供了用于本文所公开的方法的试剂盒,其包含本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,以及使用说明书。
定义
以下是可以有助于理解本发明的描述的一些定义。这些定义旨在作为一般性定义,决不应将本发明的范围仅仅限制在这些术语中,它们是为了更好地理解以下描述。
如本文所用的术语“抗原结合蛋白”是指抗体、抗体片段和其他蛋白质构建体(例如结构域),其能够结合CEACAM6。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用,是指具有免疫球蛋白样结构域的分子,包括单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合抗体;嵌合抗原受体(CAR)、单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双抗体、TandabsTM等(对于替代性“抗体”形式的概述,参见Holliger和Hudson,自然生物技术(Nature Biotechnology),2005,第23卷,第9期,1126-1136)。
短语“单可变结构域”是指抗原结合蛋白可变结构域(例如,VH、VHH、VL),其独立于不同的可变区或结构域与抗原或表位特异性结合。
可以认为“结构域抗体”或“dAb”与能够结合抗原的“单可变结构域”相同。单可变结构域可以是人抗体可变结构域,但也包括来自其他物种的单抗体可变结构域,比如啮齿动物(例如,如WO 00/29004中所公开的)、护士鲨和骆驼科动物VHH dAb的单抗体可变结构域。骆驼科动物VHH是免疫球蛋白单可变结构域多肽,其衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种,其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这些VHH结构域可以根据本领域可获得的标准技术进行人源化,并且这些结构域被认为是“结构域抗体”。如本文所用,VH包括骆驼科动物VHH结构域。
如本文所用,术语“结构域”是指折叠的蛋白质结构,其具有独立于其余蛋白质的三级结构。通常,结构域负责蛋白质的离散功能特性,并且在许多情况下可以被添加、去除或转移至其他蛋白质而不丧失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。“单可变结构域”是折叠的多肽结构域,其包含抗体可变结构域的序列特征。因此,它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域,例如,其中一个或多个环已被不具有抗体可变结构域特征的序列替换,或已被截短或包含N-或C-末端延伸区的抗体可变结构域替换,以及被至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段替换。结构域可独立于不同的可变区或结构域与抗原或表位结合。
可以通过在非抗体蛋白质支架如结构域上排列一个或多个CDR来提供抗原结合片段。该结构域可以是结构域抗体,或者可以是为支架衍生结构物,所述支架衍生结构物选自由以下组成的组:CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲和体、avimer、GroE1、转铁蛋白、GroES和纤连蛋白/adnectin,其已经过蛋白质工程改造以获得与除天然配体之外的抗原(如CEACAM6)的结合。
抗原结合片段或免疫有效片段可包含部分重链或轻链可变序列。片段长度至少为5、6、8或10个氨基酸。或者,片段的长度为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸。
本说明书中与抗原结合蛋白相关的术语“特异性结合”是指抗原结合蛋白与CEACAM6结合而不与或不显著与其他(例如,无关的)蛋白质结合。然而,该术语不排除抗原结合蛋白也可与密切相关的分子交叉反应的事实。本文所述的抗原结合蛋白可以与CEACAM6结合,其亲和力比与紧密相关的分子结合的亲和力至少高2、5、10、50、100或1000倍。
本说明书中使用的术语“中和”是指,在体外或体内,与在没有抗原结合蛋白的情况下的CEACAM6的活性相比,CEACAM6的生物活性在存在本文所述的抗原结合蛋白时降低。中和可能是由于以下的一种或多种原因:阻止CEACAM6与其受体结合、防止CEACAM6激活其受体、下调CEACAM6或其受体或影响效应功能。生物活性的降低或抑制可以是部分或全部的。与在不存在抗原结合蛋白的情况下CEACAM6活性相比,中和抗原结合蛋白可以将CEACAM6的活性中和至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。可以使用本领域技术人员已知的或如本文所述的一种或多种检测来确定或测量中和。例如,可以通过BIAcoreTM、FMAT、FORTEbio或类似的体外检测在双抗体夹心ELISA中评估与CEACAM6结合的抗原结合蛋白。
“CDR(CDRs)”定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列,是免疫球蛋白重链和轻链的高度可变区域。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此,如本文所用的“CDR”是指所有三个重链CDR、所有三个轻链CDR、所有重链CDR和轻链CDR,或至少两个CDR。
如本文所用,术语“启动子”意指启动特定基因转录的DNA区域。
如本文所用,术语“癌性的”涉及受癌症特征影响或表现出癌症特征异常。
如本文所用,术语“生物样品”或“样品”是指已从患者获得、移除或分离的来自患者的组织或细胞样品。
如本文所用的术语“获得或源自”意在包含性地使用。也就是说,旨在包括直接从生物样品中分离的任何核苷酸序列或源自样品的任何核苷酸序列。
如本文所述的方法适用于新鲜组织、冷冻组织、石蜡保存组织和/或乙醇保存组织的样品。样品可能是生物样品。生物样品的非限制性实例包括全血或其组分(例如血浆、血清)、尿液、唾液淋巴液、胆汁、痰液、泪液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、滑液、精液、腹水肿瘤液、乳汁和脓液。在一个实施方案中,核酸样品来自血液、羊水或口腔涂片。在优选的实施方案中,样品是全血样品。
本文所考虑的生物样品包括培养的生物材料,其包括来源于培养细胞的样品,比如从培养细胞或细胞沉淀中收集的培养基。因此,生物样品可以指从整个生物体或其组织、细胞或组成部分的亚单位或其级分或一部分制备的裂解物、匀浆或提取物。生物样品也可在使用前被修饰,例如,通过纯化一种或多种组分、稀释和/或离心。
如本文所用,术语“可检测标记物”或“报告基因”是指可与核酸连接的可检测标记物或报告基因分子。典型的标记包括荧光团、放射性同位素、配体、化学发光剂、金属溶胶和胶体以及酶。用于标记和指导选择可用于各种目的的标记的方法在例如Sambrook等人、分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、冷泉港实验室出版社(1989)和Ausubel等人、分子生物学现行方案(Current Protocols in MolecularBiology)、Greene Publishing Associates和Wiley-Intersciences(1987)中进行了讨论。
如本文所用,术语“易患癌症”或“对癌症的易感性”是指受试者患癌症的可能性。该术语并不表示受试者将100%确定地患上癌症。相反,术语“易患癌症”是指与不“易患癌症”的个体相比,受试者患癌症的概率增加。
如本文所用,在有关制剂组分浓度的上下文中,术语“约”通常表示所述值的+/-5%、更通常为所述值的+/-4%、更通常为所述值的+/-3%、更通常为所述值的+/-2%,甚至更通常为所述值的+/-1%,甚至更通常为所述值的+/-0.5%。
在整个本公开的内容中,某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解,在范围形式中的描述仅为了方便和简洁,并且不应将其理解为对所公开范围的不可改变的僵化限制。因此,应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围的各个数值。例如,应当认为对如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围,比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等,以及该范围的单个数字,例如,1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何,此均适用。
本文可以广泛地和一般地描述某些实施方案。在本公开的概括描述下的每个较窄种类和亚属分组也构成本公开的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般描述,无论本文是否具体列举了去除的材料。
除非本文另有要求或专门作出相反声明,本文所述的本发明所引用的单数形式的整数、步骤和要素明显地包括所引用的整数、步骤和要素的单数和复数形式。
词语“基本上”不排除“完全”,例如,“基本上不含”Y的组合物可以指完全不含Y。必要时,可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制条件的情况下适当实施。因此,例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等都应被广泛地理解而不受限制。另外,本文使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制,并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分,但是应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此,应该理解,尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明,但是本领域技术人员可以采用本文所公开的体现在本发明中的修改和变化,并且认为这些修改和变化在本发明的范围内。
已在本文中对本发明进行宽泛地和一般地描述。落入通用公开内容中的每个较窄重链和亚属分组中的每个也构成本公开的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般描述,无论本文是否具体列举了去除的材料。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。此外,在按照马库什(Markush)组描述本发明的特征和方面的情况下,本领域技术人员将认识到本发明也相应针对马库什组的任何单个成员或成员亚组进行了描述。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时,参考详细描述将更好地理解本发明,其中:
图1是描绘用于从PC-9产生吉非替尼抗性克隆的方法和用于免疫和产生单克隆抗体组的杂交瘤融合的细胞系的流程图。
图2示出了GR6A04在A)免疫GR细胞系、CL75、CL86和CL131、和B)亲本PC-9和另一种GR PC-9细胞系上的流式细胞术结合。对于每种细胞系,以M=2%的阴性对照进行门控。无碘化丙锭染色(FL-3)示出没有来自mAb GR 6A04结合的固有细胞毒性。
图3示出了用A)PC-9和衍生的吉非替尼抗性克隆、B)NSCLC细胞系、C)HCC827和衍生的吉非替尼抗性克隆、D)乳腺癌细胞系、E)结直肠癌细胞系和F)正常细胞系的流式细胞术筛选。
图4示出了GR6A04单克隆抗体及其衍生物的特征。A)GR6A04是小鼠IgG1、κ同种型。B)可变重链和可变轻链翻译序列,其中CDR加下划线。C)将GR6A04和IgG1同种型对照(MG1.45)直接缀合至单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)以分别获得GR6A04-MMAE和MG1.45(DAR:药物-抗体比率)。缀合后流式细胞术结合不受影响。D)针对GR6A04的人嵌合单克隆抗体(Hu-GR6A04)。将VH和VL序列克隆到具有人恒定区骨架的表达载体中。将Hu-GR6A04克隆到CHO细胞中进行表达。考马斯亮蓝染色示出预期蛋白质大小且流式细胞术结合与GR6A04相当。
图5示出了GR6A04抗原的特征。A)进行的蛋白质印迹示出抗原为55-90kDa的成片条带。用β-巯基乙醇(还原剂)处理后抗原成片条带减少。B)GR6A04结合是PNGase敏感型。用PNGase处理(泳道3)消除GR6A04与抗原的结合,伴随分子量的下降,这表明从抗原中成功去除了N-聚糖。抗肌动蛋白结合不受PNGase处理的影响。换句话说,GR6A04结合依赖于抗原的N-糖基化。
图6示出了A)用GR6A04进行免疫沉淀。切除方框区域用于质谱分析。B)在去除在柱对照泳道中的相同区域中发现的非特定匹配后,切除区域的质谱分析鉴定了前5种推定的抗原。结果表明,推定的抗原是根据总分进行排列的,总分是总蛋白覆盖率和发现的唯一肽段数的函数。然后通过使用商用抗体和带有GR6A04的免疫沉淀产物的交叉探针对靶标进行pull-down以验证抗原身份,反之亦然。通过交叉IP测试GRP78并且将其排除作为针对GR6A04的可能抗原。
图7示出了CEACAM6作为针对GR6A04的推定抗原的验证。A)用商用抗CEACAM6抗体进行交叉免疫沉淀。商用抗CEACAM6抗体和GR6A04均识别由其对应物pull-down的抗原。B)进行CEACAM6的siRNA敲低。结果示出,在蛋白质印迹和流式细胞术中观察到PC-9细胞中敲低CEACAM6表达导致GR6A04结合降低。
图8示出了癌细胞系中GR6A04的免疫组织学结果。A)对PC-9细胞沉淀物进行FFPE示出了GR6A04的膜结合和胞质定位。B)通过ImmunoMembrane在重复中心区域上对FFPE细胞系阵列筛选评分。
图9示出了肿瘤组织中GR6A04的免疫组织学结果。对组织样品(Pantomics TMA),使用正常组织和肿瘤组织、多器官的混合的FFPE(MNT241),并通过ImmunoMembrane评分。
图10示出了肿瘤组织中GR6A04的免疫组织学结果。对肿瘤组织、多器官的FFPE(MTU481)。
图11示出了肿瘤组织中GR6A04的免疫组织学结果。A)肿瘤组织、多器官的FFPE(MTU951)以及中心区域染色概貌。B)在两个正常中心区域上的2+染色;食管和肺(假阳性评分)。C)多器官中的癌症组织的代表性阳性评分。
图12示出了NSCLC组织样品中GR6A04的免疫组化结果。在周围正常(LC 1001 2a)的肺肿瘤TMA上染色示出了针对4/27鳞状和9/18腺癌的阳性染色、针对成对的相邻正常组织的阴性染色。
图13示出了来自阵列LC1001 2a的中心区域图像。
图14示出了针对93/96的测试正常组织(MNO961)的阴性染色。非特异性染色通常发现于导管膜内衬壁(中心区域边缘)和/或坏死组织上。
图15示出了GR6A04与市售抗CEACAM6抗体的比较。A)受衣霉素(N-糖基化抑制剂)和PNGase消化而非商用抗CEACAM6抗体(克隆9A6)影响的GR6A04。B)mAb结合中糖基化作用的差异也导致免疫组织化学中的特异性差异。具有1个评定为阳性的额外中心区域(加框)的细胞系阵列。
图16示出了针对MNO961(多正常TMA)也观察到结合谱的差异,其中商用抗CEACAM6抗体具有更高的非特异性结合,具有更高的染色强度。特别是,所有正常的3个肺组织和2个脾组织中心区域被评定为阳性。
图17示出了A549细胞的分选。A)A549肺腺癌细胞系示出了GR6A04的异质结合和15-30%的阳性结合尾。B)使用免疫磁珠Pan Ms-IgG磁珠以GR6A04对A549细胞进行分选,随后DNase磁珠释放,示出在P0处富集GR6A04+百分比,但随后的传代观察到结合丧失(从A549亲本细胞分选的第1轮(阳性级分))。C)多轮分选建立的稳定的差分线(differentiallines)。D)产生的A549-GR6A04+单细胞(SC)克隆示出GR6A04结合的同质性改善。E)A549-GR6A04+单细胞(SC)克隆之间的形态差异。
图18示出了分选群体的特征。EGFR在A549-GR6A04+细胞中下调,而CEACAM1在A549-GR6A04+细胞中上调。
图19示出了使用A549肺腺癌的异种移植物模型的GR6A04的体内功能性。A549-GR6A04+和A549亲本、A)A549-GR6A04+细胞致瘤性增加。B)A549亲本,并且在终点处保留GR6A04结合,其中在异种移植物中选择A549亲本用于GR6A04+细胞(20%至>70%)。
图20示出GR6A04的抗原浸入条件培养基中。用培养的细胞将培养基调理5天,将已知体积一式两次印迹到膜上并用Hu-GR6A04探测。结果显示,在来自GR6A04(+)细胞的条件培养基中可以发现比来自A549亲本细胞和GR6A04(-)细胞更高的抗原水平。
图21示出了GR6A04的抗体药物缀合物的特征。A)Mab-ZAP抗体内化试剂盒用作概念证明。使用与毒素连接的抗小鼠第二抗体将GR6A04与皂草素间接缀合。B)将GR6A04内化于PC-9细胞中。将GR6A04、10μg/mL在4℃预孵育20分钟。在时间点固定细胞并用抗MsAlexaFluor488探测。图像以40x拍摄。结果显示GR6A04在T=0分钟时在细胞周边/膜上定位为环(实线箭头)并且在T=120分钟时定位为环(实线箭头)和也定位在在细胞内(虚线箭头)。
图22示出了GR6A04-MMAE(毒素的直接缀合)的体外功能,其中剂量-反应曲线估计针对PC-9的EC50@19.58nM;针对A549-GR6A04+细胞的EC50@3.33nM。
图23示出了GR6A04的抗体依赖性细胞毒性。将Promea ADCC试剂盒与荧光素酶报告基因一起用于FcγR且西妥昔单抗作为阳性ADCC对照。针对PC-9的EC50:39.6nM;针对A549-GR6A04+的EC50:1.33nM。
图24示出了在异种移植物模型中GR6A04作为ADC的概念证明。使用的条件是GR6A04-MMAE;MG1.45-MMAE同种型Ctrl;缓冲液Ctrl;GR6A04(未缀合);Hu-GR6A04(未缀合)。治疗方案为在D0、D4和D8(从肿瘤大小>150mm3开始)按10mg/kg(~200ug/小鼠),3个剂量给药。结果表明用GR6A04-MMAE处理的异种移植物示出很少的肿瘤生长,这表明作为ADC具有优异的体内功能。与缓冲液对照相比,用未缀合GR6A04和未缀合Hu-GR6A04处理的异种移植物示出较慢的生长,这表明通过ADCC机制,一些体内肿瘤生长抑制。
具体实施方式
在第一方面,提供了抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其包含(i)重链可变结构域,其包含具有氨基酸序列GNTFTSYVMH(SEQ ID NO:3)的VHCDR1;具有氨基酸序列YINPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2和具有氨基酸序列STARATPYFYAMDY(SEQ IDNO:5)的VHCDR3;和(ii)轻链可变结构域,其包含具有氨基酸序列KSSQSLLWSVNQNSYLS(SEQID NO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列GASIRES(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有该氨基酸序列QHNHGSFLPYT(SEQ ID NO:8)的VLCDR3。
抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含与(i)和(ii)的重链CDR区和轻链CDR区约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的重链CDR区和轻链CDR区。
在一个实施方案中,重链可变区包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSS。或者,重链可变区可包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中,轻链可变区包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIK。或者,抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含轻链可变区,其包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中,如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白选自由以下组成的组:单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体;嵌合抗原受体(CAR)、单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、单链抗体、缺少铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体和TandabsTM。
在一个实施方案中,抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以是GR6A04。在一个实施方案中,单克隆抗体可以是人源化的。或者,单克隆抗体可以是嵌合的。
在一个实施方案中,抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以结合CEACAM6。在一个实施方案中,抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以与CEACAM6上的聚糖结合。如本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可结合CEACAM6上的N-连接聚糖。
在另一个实施方案中,如本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含与其缀合的放射性同位素或细胞毒素。抗原结合蛋白或其抗原结合片段可以与选自由以下组成的组的细胞毒素缀合:单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、美登素(DM-1)、皂草素、吉西他滨、伊立替康、依托泊苷、长春碱、培美曲塞、多西紫杉醇、紫杉醇、铂剂(例如,顺铂、奥沙利铂和卡铂)、长春瑞滨、卡培他滨、米托蒽醌、伊沙匹隆、艾日布林、5-氟尿嘧啶、曲氟尿苷和替吡嘧啶(tipiracil)。
在一个实施方案中,如本文所述的抗原结合蛋白或抗原结合片段可在与CEACAM6结合后内化到细胞中。
在另一个实施方案中,如本文所述的抗原结合蛋白或抗原结合片段在与CEACAM6结合后可以不内化到细胞中。
在一个实施方案中,如本文所述的抗原结合蛋白或抗原结合片段可选择性结合吉非替尼抗性肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞和/或结直肠癌细胞。
另一方面,提供了组合物,其包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的如本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一个实施方案中,如本文所公开的组合物可包含一种或多种其他治疗化合物。
当然,如本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段在药物组合物和制剂中的百分比可以变化,并且例如可以方便地在剂量单位重量的约2%至约90%、约5%至约80%、约10%至约75%、约15%至约65%、约20%至约60%、约25%至约50%、约30%至约45%、或约35%至约45%的范围变化;。治疗上有用的组合物中化合物的量使得可以获得合适的剂量。
表述“生理学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些培养基和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除非任何常规培养基或试剂与化合物不相容,否则考虑将其用于治疗组合物以及治疗和预防方法中。补充的活性化合物也可以掺入根据本发明的组合物中。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀是特别有利的。
如本文所用的“剂量单位形式”是指适合作为针对待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位;计算含有预定量化合物的每个单元以产生与所需药物载体相关联的所需治疗效果。可以配制化合物以便以有效量与合适的药学上可接受的载体以可接受的剂量单位方便有效地施用。就包含补充活性成分的组合物而言,参照所述成分的常用量和施用方式,确定其剂量。
该组合物可以通过注射方便地施用,例如皮下、静脉等。该组合物还可以通过肠胃外或腹膜内施用。在一个实施方案中,化合物可以通过注射施用。在可注射溶液的情况下,载体可以是溶剂或分散培养基,包括例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可以通过使用例如覆盖层(如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持。可以通过加入各种抗细菌剂和/或抗真菌剂来防止微生物的作用。合适的试剂是本领域技术人员所公知的,包括例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、苯甲醇、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下,可优选在组合物中包含等渗剂,例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的类似物加到带有上述列举的成份中的一个或其组合的合适溶剂中,然后通过过滤杀菌来制备。通常,分散液是通过将类似物加到含有基本分散培养基和其他上述所列举的所需要的成份的无菌媒介物中来制备。
在普通的储存和应用条件下,药物制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。优选地,药物组合物可以进一步包括合适的缓冲液以使酸水解最小化。合适的缓冲液是本领域技术人员所公知的,包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐和其混合物。
根据本发明的药物组合物可以进行单次或多次施用。本领域技术人员能够通过常规实验来确定根据本发明的化合物和/或组合物的有效的、无毒性的剂量水平以及该化合物和组合物用于治疗疾病和/或感染的合适的施用模式。
而且,对于本领域技术人员来说清楚的是,可通过使用常规的治疗测定测试来确定最佳疗程,比如在给定天数每天给予的本发明的化合物或组合物的剂量数。
通常,每24小时的有效剂量可以在每公斤体重约0.0001mg至约1000mg的范围;合适地,每公斤体重约0.001mg至约750mg;每公斤体重约0.01mg至约500mg;每公斤体重约0.1mg至约500mg;每公斤体重约0.1mg至约250mg;或每公斤体重约1.0mg至约250mg。更合适地,每24小时的有效剂量可以在每公斤体重约1.0mg至约200mg的范围;或每公斤体重约1.0mg至约100mg;或每公斤体重约1.0mg至约50mg;或每公斤体重约1.0mg至约25mg;每公斤体重约5.0mg至约50mg;每公斤体重约5.0mg至约20mg;每公斤体重约5.0mg至约15mg。
或者,有效剂量可高达约500mg/m2。例如,通常,预期有效剂量为约25mg/m2至约500mg/m2、约25mg/m2至约350mg/m2、约25mg/m2至约300mg/m2、约25mg/m2至约250mg/m2、约50mg/m2至约250mg/m2、约75mg/m2至约150mg/m2。
另一方面,提供了如本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段或本文所公开的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
在一个实施方案中,癌症可选自吉非替尼抗性肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、小肠癌、食管癌和结直肠癌组成的组。
在一些实施方案中,药物可以与一种或多种其他活性药物成分一起施用。或者,药物可以与化疗一起施用。其他活性药物成分或化疗可以分开、同时或相继施用。
另一方面,提供了鉴定受试者中的癌症的方法,该方法包括:使得从受试者获得的样品与本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测样品中抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将该结合与对照样品中的结合水平相关联以确定样品中的结合水平,其中相对于对照样品,样品中结合水平增加指示癌症。
另一方面,提供了鉴定易患癌症的受试者的方法,该方法包括:使得从受试者获得的样品与本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测样品中抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将该结合与对照样品中的结合水平相关联以确定样品中的结合水平,其中相对于对照样品,样品中的结合水平增加指示受试者易患癌症。
在一个实施方案中,对照样品来自相同的受试者。或者,对照样品可以来自不同的受试者。
在一个实施方案中,如本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段可包含可检测标记物。可检测标记物可选自由荧光标记、化学发光标记、酶标记和放射性核素标记组成的组。
在一个实施方案中,可检测标记物可选自生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、FITC、PE和Cy染料。可以在选自流式细胞术、组织切片、免疫荧光、免疫细胞化学或免疫组织化学的测定中检测可检测标记物。
在一个方面,提供了用于本文所公开的方法的试剂盒,其包含本文所公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,以及使用说明书。
本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、限制的情况下适当地实施。因此,例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等都应理解为是可扩展的和无限制的。另外,本文使用的术语和表达已用作描述而非限制的术语,并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分,但是认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此,应该理解,尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明,但是本领域技术人员可以采用本文所公开的体现在本发明中的修改和变化,并且认为这些修改和变化在本发明的范围内。
已经在本文中对本发明进行宽泛地和一般地描述。落入通用公开内容中的每个较窄重链和亚属分组中的每个也构成本公开的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般描述,无论本文是否具体列举了去除的材料。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。此外,在按照马库什组描述本发明的特征和方面的情况下,本领域技术人员将认识到本发明也相应针对马库什组的任何单个成员或成员亚组进行了描述。
实施例
通过参考具体实施例将更详细地进一步描述本发明的非限制性实施例和比较例,这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
原料和方法
培养和产生吉非替尼抗性细胞系
在添加有10%胎牛血清(HyClone GE Healthscience,South America)的RPMI(Invitrogen,USA)中培养PC-9。为了获得具有获得性吉非替尼抗性的PC-9克隆,将PC-9培养物暴露于浓度增加的吉非替尼(Selleckchem,USA),从2nM开始并随传代逐渐增加,直至最终浓度为6.4μM。然后将GR克隆、CL75、CL86和CL131维持在6.4μM吉非替尼中。
在添加有10%FBS和20mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,USA)的DMEM(Invitrogen,USA)中培养A549。A549对吉非替尼具有原始耐药性(primary resistance),IC50>10μM。
产生GR mAb组
用与弗氏完全佐剂(Fraund’s complete adjuvant)以1:1重悬的5E6细胞完成PC-9GR系、CL75、CL86和CL131的免疫。每周进行一次免疫,针对在第1-3周的第一免疫,每次只用单独的细胞系,而针对在随后第4-5周的免疫,用所有三个细胞系的混合悬浮液。5周后,处死小鼠,并且收集的B细胞用于按照制造商的说明使用干细胞技术克隆细胞TM-HY试剂盒与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系融合。将单个杂交瘤克隆挑选到96孔中,并收集培养上清液用于通过流式细胞术筛选。
流式细胞术
使用胰蛋白酶收获细胞为单细胞悬浮液。每个样品使用1E5细胞,并与100μl的mAb培养上清液一起孵育30分钟。然后用含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液洗涤细胞,并进一步与100μl的异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的山羊抗小鼠抗体(1∶500,DAKO,丹麦)在4℃在黑暗中孵育15分钟。再次洗涤细胞并重悬于200μL的1%BSA/PBS中,用于在easyCyte 8HT台式流式细胞仪(Merck Millipore,USA)上进行分析。为了查询细胞间结合,将细胞用4%的PFA/PBS(Affymetrix,USA)在室温固定10分钟、在PBS中洗涤,并在室温用0.1%的triton/PBS透化5分钟,然后与mAb上清液/第一抗体孵育。对于用碘化丙锭染色,在通过流式细胞仪分析之前,将PI加入至终浓度为5ug/mL持续5分钟。
蛋白质印迹和免疫沉淀
使用膜蛋白提取试剂盒(BioVision,USA)从PC-9细胞沉淀中提取膜蛋白。简而言之,将5E7细胞的细胞沉淀重悬于1mL的均化缓冲液中,并将细胞膜在杜恩斯匀浆器(douncehomogenizer)中破碎。将其转移到Eppendorf管中,并在4℃以700×g离心10分钟以除去细胞碎片。将上清液转移到新的Eppendorf管中,并在4℃以12,000×g离心30分钟以沉淀膜。最后将膜重悬于500μl的含有蛋白酶抑制剂(Pierce ThermoScientific,USA)的1x细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology,USA)中。通过在4℃以15,000×g离心5分钟以除去任何不溶性蛋白质,澄清膜蛋白溶液。使用Pierce 660nM蛋白质分析试剂定量蛋白质。
使用自动化Phynexus MEA系统(Phynexus Inc.,USA)进行免疫沉淀(IP)。将GR6A04捕获到含有5ul的树脂床的Protein G PhyTip柱上。然后用PBS洗涤柱以除去未结合的蛋白质,并引入PC-9膜蛋白质提取物以结合已经捕获在柱上的GR6A04。然后用洗涤缓冲液II(140mM NaCl,pH7.4)洗涤柱,随后用洗脱缓冲液(200mM NaH2PO4/140mM NaCl pH2.5)在低pH洗脱,并立即用1M的Tris-Cl pH9.0中和,然后通过蛋白质印迹分析IP产物。
PC-9膜蛋白提取物或IP产物在终浓度为1%的情况下通过含有SDS的蛋白质加样缓冲液中变性,并在95℃加热5分钟。然后将样品加样到预制的梯度凝胶(NuPAGE 4-12%梯度凝胶,Invitrogen)中,并通过SDS-PAGE运行MOPS跑胶缓冲液(NuPAGE Invitrogen,USA)分离。凝胶电泳后,将分解的蛋白质于在去离子水中含有20%的甲醇、10%的Tris-甘氨酸的转移缓冲液中在110V的恒压持续90分钟转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(BioRad,USA)上。
然后用在PBS/0.1%Tween-20(PBS-T)中制备的5%的牛奶在室温封闭膜30分钟。然后将膜在PBS-T中洗涤,接着在4℃在2.5%的牛奶中以2ug/mL的GR6A04培养过夜。随后,将膜在PBS-T中洗涤,然后在室温与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠第二抗体(1∶10000,Dako)孵育1小时。在用PBS-T最后洗涤后,通过ECL检测(GE Healthcare,Sweden)显现HRP缀合的第二抗体的结合。
考马斯亮蓝染色和质谱分析
将IP产物进行平行凝胶跑胶,用含有0.1%的考马斯亮蓝R250的10%乙酸、50%甲醇和40%水的考马斯亮蓝染色溶液在室温染色1小时。然后除去染色溶液,并用含有10%乙酸、50%甲醇和40%水的脱色溶液代替。用新鲜溶液替换脱色溶液,直到凝胶的背景几乎清晰。然后将脱色的凝胶在水中再水合。随后将凝胶与IP产物的蛋白质印迹进行比较,以确定抗原带在凝胶上的位置。然后切除该区域用于LC-MS分析。
糖基化研究
根据制造商手册(New England Biolabs)进行PNGase消化。简而言之,首先将20μg的PC-9膜蛋白提取物在1x糖蛋白变性缓冲液中于95℃变性10分钟。随后,加入1x G7反应缓冲液和10%的NP-40,并与PNGase F一起在37℃孵育1小时。随后通过如上所述的蛋白质印迹分析消化的蛋白质。
通过在培养基中加入1μM衣霉素(Sigma Aldrich,USA)也可以在细胞培养过程中抑制蛋白质的N-糖基化。将PC-9细胞接种于6孔组织培养区中的1E5细胞,并在掺有衣霉素或DMSO的培养基中生长3天直至融合。然后收获细胞用于通过流式细胞术和蛋白质印迹进行分析。
免疫组织化学染色
首先将有FFPE组织的TMA载玻片在60℃的烘箱中加热30分钟以除去任何溶剂。然后将载玻片脱蜡并通过依次浸入Histoclear(2x)、100%的乙醇(2x)、95%的乙醇、70%的乙醇、最后在去离子水中再水合。
在含有10mM的Tris碱、1mM的EDTA、0.05%的Tween 20(pH9.0)的溶液中进行热诱导表位修复,并在95℃加热20分钟。然后取出具有抗原修复溶液和载玻片的容器,并另外使其冷却至室温20分钟。然后将载玻片在去离子水中洗涤。随后通过在室温将载玻片与在PBS中的3%的H2O2孵育30分钟来阻止内源性过氧化物酶活性。将载玻片在去离子水中洗涤,然后用含有10%的正常山羊血清的PBS缓冲液进行封闭步骤30分钟。
然后将载玻片与5μg/mL的GR6A04在封闭溶液中于4℃孵育过夜。然后洗涤载玻片,并用在室温与HRP(DAKO,USA)缀合的基于聚合物的抗小鼠第二抗体孵育30分钟,并用推荐的DAB色原底物溶液显色2分钟,并用Gill’s苏木精溶液进行复染。
随后将染色的载玻片通过浸入50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇(2x)和Histoclear(2x)中脱水,然后用玻璃盖玻片封盖。随后用Zeiss AxioScan数字玻片扫描仪对载玻片成像。
从A549细胞系富集GR6A04结合群
根据制造商的说明书,CELLectionTM Pan Mouse IgG试剂盒(Thermo Scientific,USA)用于富集来自A549亲本肺腺癌细胞系的GR6A04-和GR6A04+亚群。简而言之,用胰蛋白酶收获A549细胞以获得单细胞溶液。将细胞与GR6A04以10μg/1E7细胞于4℃孵育30分钟。然后将细胞以300×g离心3分钟以除去未结合的GR6A04,随后按照试剂盒推荐将其与免疫磁珠一起孵育。然后将细胞珠悬浮液施加在磁架上,并使其分离。收集上清液作为GR6A04-群,同时收集结合的磁珠和细胞作为GR6A04+群。将两个级分洗涤并置于磁架上3次。最后将结合的磁珠和细胞与DNase I一起孵育以从免疫磁珠释放细胞。将细胞以每瓶2.5E6细胞的密度接种到T75组织培养瓶中。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定
使用报告基因生物测定法(Promega;ADCC Reporter Bioassay,#G7010)测量ADCC活性。根据制造商手册进行ADCC生物测定。简而言之,将PC-9和A549细胞以每孔5,000个细胞接种在96全黑底透培养板(Corning;#3904)中的4%低IgG-血清(Promega;#G711A)培养基中,并使其附着、扩散过夜。将连续稀释的Hu-GR6A04在37℃、5%CO2在一式三份的孔中孵育约15分钟。孵育后,将工程化的效应细胞以每孔约150,000个细胞加入孔中。6小时后,将Bio-GloTM荧光素酶检测底物(Promega;#G719A和#G720A)加入到孔中,并使用酶标仪(Tecan)测量发光。
增殖-CellTiter-Glo发光法细胞活力(CTG)测定
将细胞在每孔1000-5000个细胞(取决于所用的细胞类型)和每孔90uL的密度范围接种到黑色涂覆的96孔板(Grenier Bio-one,UK)中。然后将板在37℃在含有5%CO2的潮湿空气中孵育24小时。24小时后,向每个孔中加入10μL的mAb或缓冲液,并将板再次置于37℃的含5%CO2的潮湿空气中。加入mAb或缓冲液4天后,向每个孔中加入100uL的CTG底物(Promega,Wisconsin,USA)。然后将板在黑暗中放置10分钟,同时剧烈摇动。然后使用TecanI-control(Tecan,Switzerland)定量样品的细胞活力。
抗体药物缀合物(ADC)
将GR6A04和商用小鼠IgG1同种型抗体(来自BioLegend的Clone MG1.45)与MMAE毒素(Moradec,San Diego,USA)分别以3.0和3.3的DAR直接缀合。用CTG测定法、以0-4.5μg/ml的连续稀释范围建立缀合的mAb的剂量-反应曲线。如前所述,在处理后4天测量细胞的细胞活力。
体内异种移植物模型
使用NCr裸鼠中的A549-GR6A04+细胞建立异种移植物模型。将DMEM基础培养基中的5E6细胞与Matrigel以1:1的比例混合,并以200μl的体积皮下注射。允许肿瘤形成并达到>150mm3的大小,然后将它们随机分成5组,每组5只小鼠。如下用mAb处理所述组:(1)缓冲液对照;(2)GR6A04-MMAE;(3)Hu-GR6A04;(4)GR6A04;(5)MG1.45-MMAE同种型对照。通过尾静脉注射总体积为100μl的mAb。适用的每种剂量为200μg(相当于10mg/kg),每4天进行一次治疗,总共3个剂量(第0、4和8天)。跨50天监测肿瘤大小。
结果与讨论
生成GR抗性mAb组
GR6A04被鉴定为针对PC-9肺腺癌产生的单克隆抗体(mAb)组的一部分,其具有针对表皮生长因子(EGFR)的小分子抑制剂吉非替尼的获得性抗性。通过在增加浓度的吉非替尼中培养产生吉非替尼抗性(GR)PC-9克隆,直至在吉非替尼浓度为6.4μM时获得稳定的细胞系。其能用作在接受化合物治疗的肺癌患者中观察到的针对吉非替尼获得性抗性的替代物。
三个吉非替尼抗性PC-9克隆(CL75、CL86和CL131)在半循环方案中用于Balb/c小鼠免疫(图1)。在第6周处死小鼠,并使用干细胞技术ClonaCellTTM-HY试剂盒将B细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,并获得产生mAb的杂交瘤克隆。通过流式细胞术针对与免疫细胞系的结合筛选来自该GR组的mAb,其中GR6A04经鉴定为来自该组的结合领先候选物之一。
通过流式细胞术(检测的)GR6A04结合细胞系
GR6A04对用于免疫的三种PC-9吉非替尼抗性克隆表现出强反应性(>50%),其中阳性结合百分比由仅次级对照的门控2%的FL-1通道测定(图2)。当细胞单独与mAb一起孵育时,FL-3通道上的碘化丙啶染色也示出没有明显的细胞的细胞毒性。还在吉非替尼敏感的亲本PC-9细胞系和另一种未用于免疫的GR PC-9克隆上测试GR6A04结合,对两种细胞系均具有类似的高结合。该流式细胞术结合数据总结在图3A中。
还在其他NSCLC细胞系中测试了GR6A04的流式细胞术结合,所测试的4个细胞系中的2个细胞系(A549和Calu-3)部分结合。来自另一肺腺癌细胞系的GR克隆HCC827也通过在增加的吉非替尼浓度中培养而获得。在这些GR HCC827克隆中,6个中有2个观察到GR6A04结合。此外,在其他癌症适应症上的结合也示出在所测试的13种乳腺癌细胞系中的3种和2种结直肠癌细胞系中的1种中具有GR6A04反应性。GR6A04在不同癌症适应症上的结合总结在图3B-E中。
重要的是,使用相同的染色方法,当用各种正常细胞系(包括成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞以及原代外周血单核细胞(PBMC))进行测试时,发现GR6A04在正常细胞的细胞表面上的结合可忽略不计(<8%),总结如图3F所示。
总之,GR6A04的流式细胞术结合表征是:a)基于流式细胞术,GR6A04结合PC-9的细胞表面及其衍生的吉非替尼抗性克隆;b)GR6A04示出对其他NSCLC细胞系、乳腺癌细胞系和结直肠癌细胞系的反应性;和c)与测试的正常细胞系没有交叉反应性。
GR6A04mAb和衍生物的表征
图4A中,通过PierceTM快速抗体同种型试剂盒测定确定了GR6A04mAb的同种型是小鼠IgG1亚型。通过使用针对小鼠免疫球蛋白的简并引物,确定如图4B所示的可变重链(VH)和可变轻链(VL)氨基酸序列。使用系统、CaptureSelectTM IgG-Fc(ms)亲和基质从杂交瘤培养上清液中纯化GR6A04。
GR6A04两种衍生物的制备和表征:具有单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)(GR6A04-MMAE)的抗体药物缀合物和具有VH和VL克隆到人Ig恒定区骨架中的人嵌合mAb(Hu-GR6A04)。
GR6A04-MMAE以3.0的药物-抗体比(DAR)与MMAE缀合,同时使用相同的化学方法,与DAR为3.3的商用小鼠IgG1抗体(来自Biolegend的Clone MG1-45)缀合(图4C)。通过流式细胞术测试GR6A04-MMAE在PC-9和A549细胞上的结合,发现其与非缀合的GR6A04相当,而MG1-45-MMAE被确定为对这两种细胞系具有可忽略的结合。
Hu-GR6A04在CHO细胞中表达,并使用与GR6A04相同的系统从培养上清液中纯化抗体。从SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色检查纯化的Hu-GR6A04的正确蛋白质大小,在还原泳道中重链和轻链分别为50kDa和25kDa的预期大小,而在非还原泳道中完整IgG的大小为150kDa。类似地,通过流式细胞术,Hu-GR6A04在PC-9和A549上的结合与GR6A04相当,如图4E所示。
GR6A04与N-糖基化的CEACAM6结合
用GR6A04来免疫印迹PC-9细胞裂解物的蛋白质印迹,发现在非还原泳道上识别出55-90kDa之间的成片条带,如图5所示。在还原条件下,抗原结合强度也较弱。另外,通过PNGase处理细胞裂解物以除去N-连接的聚糖也消除了GR6A04与抗原带的结合,证明了N-糖基化在抗体识别位点中的重要性。
用GR6A04对富含抗原的PC-9细胞裂解物进行免疫沉淀(IP),将其切下送去并通过质谱法鉴定(图6A)。基于蛋白质覆盖度和发现唯一肽段数,通过总分来排列蛋白质列表,并与来自柱对照的蛋白质列表进行比较。前5个推定的抗原列于图6B的表中,并由交叉IP与商用抗CEACAM6抗体(来自Santa Cruz/Abcam的克隆9A6)(图7A)和PC-9细胞中的CEACAM6的瞬时siRNA敲低进行验证(图7B)。
可以得出结论,GR6A04的抗原靶点是CEACAM6,其中N-聚糖对于抗体-抗原识别是重要的。
GR6A04结合患者FFPE组织样品
通过流式细胞术,已经确立了GR6A04特异于各种癌症适应症,并且不与正常细胞结合,我们继续测定GR6A04在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织微阵列(TMA)上对癌症患者组织样品的结合。商用FFPE TMA来自Pantomics。
用FFPE细胞系沉淀优化GR6A04对FFPE样品的结合条件,并确定其为5ug/mL、带有一pH9抗原修复步骤。观察到GR6A04定位于PC-9细胞的膜和胞质溶胶二者。为了扩展GR6A04在其他癌细胞系中的结合谱,在覆盖更大范围的癌症适应症的FFPE细胞系阵列上进行免疫组织化学(IHC)染色。发现GR6A04在胃癌、肺癌、结直肠癌和胰腺癌细胞系中具有反应性(图8)。
还对覆盖来自各种器官源的癌组织样品的各种FFPE TMA进行IHC染色。用开源软件:ImmunoMembrane对GR6A04染色进行评分。在绝大多数染色阳性(2+和3+)的组织中心区域中,结合定位于细胞膜。在坏死区域也观察到一些非特异性染色。多肿瘤TMA上的IHC染色支持在细胞系筛选中观察到的情况,由此我们观察到除了肺癌之外,GR6A04也对胃肠(GI)和乳腺癌,但不限于胃肠(GI)和乳腺癌,具有高度反应性(图9至图11)。在针对NSCLC的聚焦阵列中,GR6A04对TMA中表示的15%的鳞状细胞癌和50%肺腺癌的中心区域染色为阳性。重要的是,相邻的正常组织没有任何阳性染色,表明GR6A04对癌组织有特异性(图12和图13)。
另外,使用相同的染色方案和评分系统针对FFPE正常组织测试GR6A04。使用FDA推荐的TMA(MNO961),其包含35个不同的解剖部位(图14)。在存在的96个中心区域中,93个中未观察到GR6A04染色,但3个结肠组织中心区域中的2个和3个前列腺组织中心区域中的1个是弱阳性(2+)。应注意,从放大的图像中,这些病例中的染色主要在细胞内或坏死区域。
因此,已经证明GR6A04对患者组织样品中的各种不同癌症适应症具有特异性,并且对正常组织类型的染色可忽略不计,支持我们早期来自于流式细胞术和基于细胞的筛选的结合谱。
由于聚糖识别位点,GR6A04的特异性增加
用于早期验证的商用抗CEACAM6抗体是对CEACAM6的糖基化变化不敏感的抗体(即识别位点不依赖于聚糖)。这在图15A中得到证实,其中与GR6A04不同的是,PNGase和衣霉素处理后结合强度保持不变。
当在FFPE细胞系微阵列中比较两种抗CEACAM6抗体(GR6A04和商用)时,虽然染色谱大致相似,但商用抗体在HCC827中具有一个额外的染色中心区域,而BxPC3(胰腺癌细胞系)也示出更强的和细胞内染色(图15B)。
商用抗CEACAM6抗体的这种明显的非特异性在具有正常组织的TMA(MNO961)中也能观察到,其中95个中心区域中的11个染色为阳性,相反GR6A04仅有3个中心区域染色为阳性。重要的是,所有三个肺正常组织和2个脾正常组织在细胞膜上示出染色(图16)。
染色谱的差异可归因于CEACAM6上表位结合位点的差异,尤其是CEACAM6上的N-聚糖引起的表位结合位点的差异。除了单独结合CEACAM6蛋白外,这还允许额外程度的特异性,这导致对正常组织的非特异性结合降低。这很重要,因为如果要开发用于疗法的GR6A04,它可以提供更高的安全性。
GR6A04+A549亚群的表征
肺腺癌细胞系A549是一种良好的生物学模型,可用于研究由于GR6A04的异源结合而糖基化的CEACAM6表达在癌症中的作用,仅有少量15-30%的GR6A04+群体(图17A)。通过使用CELLectionTM PanMouse IgG试剂盒进行磁性分选均可富集GR6A04-和GR6A04+。尽管必须注意到随着培养中传代的增加,观察到GR6A04结合的减少。多轮连续分选减轻了这一点,并且在针对GR6A04+细胞的7轮分离和针对GR6A04-细胞的5轮分离后获得稳定的差分线,并且随后分别称为A549-GR6A04+和A549-GR6A04-(Fib.17B&C)。另外,分离到来自A549-GR6A04+培养物的单细胞克隆(D5、D7和S4克隆),表明GR6A04的结合牢固、均一。观察到这些在克隆之间具有不同的细胞形态(图17D和E)。特别地,D5克隆示出具有圆形形态的致密簇,D7示出纺锤形细胞,而S4示出具有附着独立生长的SCLC样形态。
通过流式细胞术对这些亚群以及亲本系测量EGFR和CEACAM1的表达。虽然这两种标志物在A549-GR6A04-细胞和亲本A549中的表达相似,但A549-GR6A04+细胞的EGFR表达低得多(MFI降低25%),并且还观察到CEACAM1结合增加(图18)。
还发现GR6A04表达影响体内致瘤性。在裸鼠的A549异种移植物模型中,其中皮下注射相同的初始细胞数,A549-GR6A04+细胞形成比A549亲本细胞更大的异种移植物(图19A)。当在为期50天的研究结束时异种移植物解离时,还发现从A549亲本细胞获得的异种移植物中GR6A04的百分比从注射时刻的约20%增加到第50天的>70%(图19B)。
为了确定GR6A04是否可能具有作为肺癌血清生物标志物的潜在应用,将来自A549亚群的条件培养基点样在膜上并用GR6A04进行免疫印迹。在来自A549-GR6A04+和A549亲本细胞培养物的条件培养基中可检测到抗原,但在A549-GR6A04-培养物中检测不到,并且强度与点样的培养基体积成比例(图20)。结果显示GR6A04可用于患者血清样品中的抗原定量。
体外和体内功能测定
在前面几节中已经确定了GR6A04的特异性及其在癌症生物学中的可能作用,本节主要关注mAb作为癌症治疗剂的功能。作为抗体-药物缀合物(ADC)功能的早期测试,使用与毒素缀合的抗小鼠抗体将GR6A04与皂草素(核糖体失活蛋白)间接缀合。PC-9敏感亲本系和CL75GR克隆中的细胞生长分别被抑制43%和28%(图21A)。还观察到GR6A04能够在37℃在120分钟内内化,在0分钟结合后mAb定位于细胞周围,随后发现在120分钟时分布在细胞质内(虚线箭头)。然而,一定比例的细胞在120分钟时没有内化mAb,并且mAb仍然定位在表面上(实线箭头)(图21B)。
随后将GR6A04直接缀合至MMAE(图4C)以进行更稳健的测定。对PC-9和A549结合细胞和H1299非结合细胞做出剂量应答曲线(图22)。对于PC-9细胞,EC50确定为19.8nM,对于A549-GR6A04+细胞,EC50为3.33nM。GR6A04-MMAE对非结合细胞H1299和A549-GR6A04-群体的细胞生长没有影响,表现出仅对GR6A04结合细胞的特异性。
还开发GR6A04作为具有人IgG恒定骨架的嵌合mAb(图4D)。使用Promega ADCC试剂盒(其作为FcγR结合的荧光素酶报告基因)测试Hu-GR6A04的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(图23)。对PC-9和A549-GR6A04+做出剂量应答曲线,EC50分别确定为39.6nM和1.33nM。
因此,已证明作为具有ADCC活性的裸人嵌合mAb和作为与MMAE缀合的ADC,GR6A04对两种肺癌细胞系PC-9(吉非替尼敏感)和A549(吉非替尼抗性)的体外功能性。
最后,在皮下异种移植物模型中使用A549-GR6A04+细胞测试体内功能(图24)。当肿瘤达到150mm3时开始用GR6A04及其衍生物处理,以10mg/kg I.V.注射mAb,每4天注射3剂。裸mAb、Gr6A04和Hu-GR6A04都示出针对缓冲液对照的肿瘤生长的抑制,归因于ADCC机制。重要的是,GR6A04-MMAE在控制肿瘤大小方面非常有效,跨整个研究的45天肿瘤几乎未生长(<2倍)。因此,GR6A04具有良好的体内功能,具有吉非替尼抗性A549异种移植物模型,与体外结果一致。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 抗CEACAM6抗体及其使用方法
<130> 9869SG4671
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 1
Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys
20 25 30
Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr
35 40 45
Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
50 55 60
Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
65 70 75 80
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Arg
85 90 95
Ala Thr Pro Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 2
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1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser
20 25 30
Val Asn Gln Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Gln Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asn Val His Val Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His
85 90 95
Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys
115
<210> 3
<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 3
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1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 4
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 5
Ser Thr Ala Arg Ala Thr Pro Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 6
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1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
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<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 7
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<210> 8
<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 分离的抗体片段
<400> 8
Gln His Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Tyr Thr
1 5 10
Claims (37)
1.一种抗原结合蛋白或其抗原结合片段,包含(i)重链可变结构域,所述重链可变结构域包含具有氨基酸序列GNTFTSYVMH(SEQ ID NO:3)的VHCDR1;具有氨基酸序列YINPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:4)的VHCDR2;和具有氨基酸序列STARATPYFYAMDY(SEQ IDNO:5)的VHCDR3;和(ii)轻链可变结构域,其包含具有氨基酸序列KSSQSLLWSVNQNSYLS(SEQID NO:6)的VLCDR1、具有氨基酸序列GASIRES(SEQ ID NO:7)的VLCDR2和具有氨基酸序列QHNHGSFLPYT(SEQ ID NO:8)的VLCDR3。
2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,包含与(i)和(ii)的重链CDR区和轻链CDR区约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的重链CDR区和轻链CDR区。
3.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中重链可变区包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSS。
4.如权利要求3所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,包含重链可变区,所述重链可变区包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中轻链可变区包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIK。
6.如权利要求5所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,包含轻链可变区,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:2所示的所述氨基酸序列具有约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白选自由以下组成的组:单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体;嵌合抗原受体(CAR)、单可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、单链抗体、缺少铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体和TandabsTM。
8.如权利要求7所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体是GR6A04。
10.如权利要求8或9所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体是人源化的。
11.如权利要求8或9所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体是嵌合的。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与CEACAM6结合。
13.如权利要求12所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与CEACAM6上的聚糖结合。
14.如权利要求13所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段与CEACAM6上的N-连接聚糖结合。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,包含放射性同位素或与其共轭的细胞毒素。
16.如权利要求15所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗体与选自以下组成的组的细胞毒素缀合:单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、美登素(DM-1)、皂草素、吉西他滨、伊立替康、依托泊苷、长春碱、培美曲塞、多西紫杉醇、紫杉醇、铂剂(例如,顺铂、奥沙利铂和卡铂)、长春瑞滨、卡培他滨、米托蒽醌、伊沙匹隆、艾日布林、5-氟尿嘧啶、曲氟尿苷和替吡嘧啶。
17.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或抗原结合片段在与CEACAM6结合后内化到细胞中。
18.如权利要求1至16中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或抗原结合片段在与CEACAM6结合后未内化到细胞中。
19.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,其中所述抗原结合蛋白或抗原结合片段选择性结合吉非替尼抗性肺癌细胞;非小细胞肺癌细胞;乳腺癌细胞;结直肠癌细胞。
20.一种组合物,其包含生理学上可接受的载体和治疗有效量的如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
21.如权利要求20所述的组合物,其包含一种或多种其他治疗化合物。
22.如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段或如权利要求20或21所述的组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
23.如权利要求22所述的用途,其中所述癌症选自由吉非替尼抗性肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、小肠癌、食管癌和结直肠癌组成的组。
24.如权利要求22或23所述的用途,其中所述药物与一种或多种其他活性药物成分一起施用。
25.如权利要求22或23所述的用途,其中所述药物与化疗一起施用。
26.如权利要求24或25所述的用途,其中所述一种或多种其他活性药物成分或化疗与所述药物分开、同时或相继施用。
27.一种用于检测受试者中的癌症的方法,所述方法包括:使得从所述受试者获得的样品与如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测所述样本中的所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将所述结合与对照样品中的结合水平相关联以确定所述样品中的结合水平,其中相对于所述对照样品,所述样品中的所述结合水平增加指示癌症。
28.一种鉴定易患癌症的受试者的方法,所述方法包括:使得从所述受试者获得的样品与如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段体外接触;检测所述样品中的所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段的结合;将所述结合与对照样品中的结合水平相关联以确定所述样品中的结合水平,其中相对于所述对照样品,所述样品中的所述结合水平增加指示受试者易患癌症。
29.如权利要求27或28所述的方法,其中所述对照样品来自相同的受试者。
30.如权利要求27或28所述的方法,其中所述对照样品来自不同的受试者。
31.如权利要求27至30中任一项所述的方法,其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合CEACAM6。
32.如权利要求27至31中任一项所述的方法,其中所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含可检测标记物。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述可检测标记物选自由荧光标记、化学发光标记、酶标记和放射性核素标记组成的组。
34.如权利要求32或33所述的方法,其中所述可检测标记物选自由生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、FITC、PE和Cy染料组成的组。
35.如权利要求32至34中任一项所述的方法,其中在选自由流式细胞术、组织切片、免疫荧光、免疫细胞化学或免疫组织化学的测定中检测所述可检测标记物。
36.如权利要求27至35中任一项所述的方法,其中所述癌症选自由吉非替尼抗性肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、小肠癌、食管癌和结直肠癌组成的组。
37.一种用于如权利要求27至36中任一项所述的方法的试剂盒,包含如权利要求1至19中任一项所述的抗原结合蛋白或其抗原结合片段,以及使用说明书。
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