KR20190075079A - 항 ceacam6 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 아미노산 서열 GNTFTSYVMH를 갖는 VHCDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG를 갖는 VHCDR2; 및 아미노산 서열 STARATPYFYAMDY를 갖는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 (ii) 아미노산 서열 KSSQSLLWSVNQNSYLS를 갖는 VLCDR1, 아미노산 서열 GASIRES를 갖는 VLCDR2, 및 아미노산 서열 QHNHGSFLPYT를 갖는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, CEACAM6에 결합하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 암 치료, 예방 또는 검출을 위한 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편의 사용 방법, 및 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

항 CEACAM6 항체 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 10월 10일자로 출원된 싱가포르 출원 제 10201608481W 호의 우선권의 이득을 주장하며, 상기 출원의 내용은 모든 목적을 위해 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-CEACAM6 단클론 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
암태아성 항원-관련된 세포부착 분자 6(CEACAM6)은 암태아성 항원(CEA)과에 속한다. CEACAM6은 유방, 췌장, 결장 및 비-소세포 폐 암종을 포함한 다양한 암에서 과발현되는 것으로 관찰된 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 고정된 세포 표면 당단백질이다. CEACAM6은 종양에서 발암유전자로서 작용하며 암 침투, 전이, 세포사멸 내성 및 항암제내성을 촉진하고 분화를 억제한다.
지금까지, 암 치료를 위한 항체 요법에 또는 항체-약물 접합체로서 사용될 수 있었던 항-CEACAM6 단클론 항체의 수는 매우 제한되었다. 따라서, 암 치료를 위한 항체 요법에 또는 항체-약물 접합체로서 사용될 수 있는, CEACAM6에 대한 신규의 항체를 개발할 필요가 있다.
하나의 태양에서, (i) 아미노산 서열 GNTFTSYVMH (서열번호 3)을 갖는 VHCDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG (서열번호 4)을 갖는 VHCDR2 및 아미노산 서열 STARATPYFYAMDY (서열번호 5)을 갖는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 아미노산 서열 KSSQSLLWSVNQNSYLS (서열번호 6)을 갖는 VLCDR1, 아미노산 서열 GASIRES (서열번호 7)을 갖는 VLCDR2, 및 아미노산 서열 QHNHGSFLPYT (서열번호 8)을 갖는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 태양에서, 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 치료 유효량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 암의 치료 또는 예방이 필요한 피실험자에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 피실험자에서 암을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가는 암을 가리킨다.
또 다른 태양에서, 암에 민감한 피실험자를 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가는 상기 피실험자가 암에 민감함을 가리킨다.
하나의 태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용 설명서와 함께 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 사용되는 키트(kit)를 제공한다.
정의
하기는 본 발명의 기재를 이해하는데 도움이 될 수 있는 일부의 정의들이다. 이들은 일반적인 정의로서 의도되며 결코 본 발명의 범위를 상기 용어들만으로 제한해서는 안 되고, 하기 기재의 보다 양호한 이해를 위해 제시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원 결합 단백질"이란 용어는 CEACAM6에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 구조물, 예를 들어 도메인을 지칭한다.
"항체"란 용어는 본 명세서에서 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 분자들을 지칭하는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 단클론(monoclonal), 재조합, 다클론, 키메릭, 인간화된, 이중특이성 및 이종접합체 항체; 키메릭 항원 수용체(CAR), 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 유효한 단편, 단쇄 Fv, 디아바디(diabody), 탄답스(Tandabs)™ 등을 포함한다(대안의 "항체" 포맷에 대한 요약에 대해서 문헌[Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136]을 참조하시오).
"단일 가변 도메인"이란 어구는 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 가변 도메인(예를 들어 VH, VHH, VL)을 지칭한다.
"도메인 항체" 또는 "dAb"는 항원에 결합할 수 있는 "단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주될 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 또한 다른 종들로부터의 단일 항체 가변 도메인, 예를 들어 설치류(예를 들어 WO 00/29004에 개시된 바와 같은), 수염상어 및 카멜리드 VHH dAb를 포함한다. 카멜리드 VHH는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성시키는, 카멜, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함한 종들로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 상기와 같은 VHH 도메인을 당해 분야에서 입수할 수 있는 표준 기법에 따라 인간화시킬 수 있으며, 상기와 같은 도메인은 "도메인 항체"인 것으로 간주된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 VH는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "도메인"이란 용어는 단백질의 나머지와 독립적으로 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 성질을 담당하며, 다수의 경우에 상기 단백질 및/또는 상기 도메인의 나머지의 기능 상실 없이 다른 단백질에 첨가되거나, 제거되거나 전달될 수 있다. "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 상기는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어 하나 이상의 고리가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열에 의해 대체된 도메인, 또는 절두되었거나 N- 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인뿐만 아니라, 완전 길이 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.
항원 결합 단편은 도메인과 같은 비-항체 단백질 스캐폴드상에 하나 이상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다. 상기 도메인은 도메인 항체이거나 또는 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 애피바디, 애비머, GroEl, 트랜스페린, GroES 및 피브로넥틴/애드넥틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있으며, 여기에는 천연 리간드 외에, 항원, 예를 들어 CEACAM6에의 결합을 획득하기 위해서 단백질 조작이 가해졌다.
항원 결합 단편 또는 면역학적으로 유효한 단편은 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 단편은 길이가 적어도 5, 6, 8 또는 10 아미노산이다. 한편으로 상기 단편은 길이가 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100 아미노산이다.
항원 결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체를 통해 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합하다"란 용어는 상기 항원 결합 단백질이 CEACAM6에, 다른(예를 들어 관련되지 않은) 단백질에 대한 미미한 결합으로 또는 상기 결합 없이 결합함을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 상기 항원 결합 단백질이 또한 밀접하게 관련된 분자들과 교차-반응성일 수도 있다는 사실을 배제하지 않는다. 본 명세서에 기재된 항원 결합 단백질은 CEACAM6에, 상기 단백질이 밀접하게 관련된 분자에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 50, 100 또는 1000배 더 큰 친화성으로 결합할 수 있다.
본 명세서 전체를 통해 사용되는 바와 같은 "중화시키다"란 용어는 CEACAM6의 생물 활성이 시험관내 또는 생체내에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질 부재하에서의 CEACAM6의 활성에 비해 상기 항원 결합 단백질의 존재하에서 감소됨을 의미한다. 중화는 수용체에의 CEACAM6 결합의 차단, CEACAM6이 그의 수용체 활성화를 방지함, CEACAM6 또는 그의 수용체의 하향조절, 또는 효과기 기능에 영향을 미치는 것 중 하나 이상에 기인할 수 있다. 상기 생물 활성의 감소 또는 억제는 부분적이거나 전적일 수 있다. 중화성 항원 결합 단백질은 CEACAM6의 활성을 상기 항원 결합 단백질 부재하에서의 CEACAM6 활성에 비해 적어도 20%, 30% 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 중화시킬 수 있다. 중화를 숙련가에게 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 분석을 사용하여 결정하거나 측정할 수 있다. 예를 들어, CEACAM6에 대한 항원 결합 단백질 결합을 샌드위치 ELISA에서, BIAcore™, FMAT, FORTEbio, 또는 유사한 시험관내 분석들에 의해 평가할 수 있다.
"CDR"은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 상기는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역이다. 면역글로불린의 가변 부분 중에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "CDR"은 3개 중쇄 CDR 모두, 3개 경쇄 CDR 모두, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 2개의 CDR을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로모터"란 용어는 특정 유전자의 전사를 개시시키는 DNA의 영역을 지칭하고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암성"이란 용어는 암의 이상 특징에 걸리거나 또는 상기 특징을 나타냄에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물학적 샘플" 또는 "샘플"이란 용어는 환자로부터 수득되거나, 제거되거나 또는 단리된 상기 환자로부터의 조직 또는 세포의 샘플을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "로부터 수득되거나 유래된"이란 용어는 망라되어 사용됨을 의미한다. 즉, 생물학적 샘플로부터 직접 단리된 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 샘플로부터 유래된 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하고자 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 신선한 조직, 동결 조직, 파라핀-보존된 조직 및/또는 에탄올 보존된 조직의 샘플에 사용하기에 적합하다. 상기 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 전혈 또는 그의 성분(예를 들어 혈장, 혈청), 뇨, 타액 림프, 담즙액, 객담, 눈물, 뇌척수액, 기관지폐포 세척액, 활막액, 정액, 복막 종양액, 모유 및 고름을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 핵산 샘플을 혈액, 양수 또는 구강 도말로부터 수득한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 샘플은 전혈 샘플이다.
본 명세서에서 고려되는 바와 같은 생물학적 샘플은 배양된 세포로부터 유래된 샘플, 예를 들어 배양된 세포 또는 세포 펠릿으로부터 수집된 배양 배지를 포함한 배양된 생물학적 물질을 포함한다. 상응하게, 생물학적 샘플은 완전 유기체 또는 그의 조직, 세포 또는 성분 부분의 부분집합, 또는 그의 분획 또는 일부로부터 제조된 용해물, 균질물 또는 추출물을 지칭할 수 있다. 생물학적 샘플을 또한 사용 전에, 예를 들어 하나 이상 성분의 정제, 희석, 및/또는 원심분리에 의해 변형시킬 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출성 표지" 또는 "리포터"란 용어는 핵산에 부착될 수 있는 검출성 마커 또는 리포터 분자를 지칭한다. 전형적인 표지는 형광단, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제, 금속 졸 및 콜로이드, 및 효소를 포함한다. 표지화 방법 및 다양한 목적에 유용한 표지 선택 지침이 예를 들어 문헌[Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 및 문헌[Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)]에 논의되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암에 민감한" 또는 "암에 대한 민감성"이란 용어는 피실험자의 암 발병 가능성을 지칭한다. 상기 용어는 피실험자가 100% 확실성으로 암이 발병할 것임을 가리키는 것은 아니다. 오히려, "암에 민감한"이란 용어는 피실험자가 "암에 민감하지" 않은 개인에 비해 암이 발병할 확률이 증가됨을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 제형 성분의 농도와 관련하여 "약"이란 용어는 전형적으로 서술된 값의 +/-5%, 보다 전형적으로 서술된 값의 +/-4%, 보다 전형적으로 서술된 값의 +/-3%, 보다 전형적으로 서술된 값의 +/-2%, 훨씬 더 전형적으로 서술된 값의 +/-1%, 및 훨씬 더 전형적으로 서술된 값의 +/-0.5%를 의미한다.
본 개시 전체를 통해서, 몇몇 실시태양들을 범위 포맷(format)으로 개시할 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의성 및 간략성을 위한 것이며 개시된 범위의 범위에 대한 융통성없는 제한으로서 간주해서는 안 됨은 물론이다. 상응하게, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 구체적으로 개시된 하위 범위, 예를 들어 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 상기 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
몇몇 실시태양들을 또한 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기재할 수 있다. 상기 일반적인 개시내에 있는 각각의 보다 좁은 개념 및 하위개념 그룹들이 또한 상기 개시의 부분을 형성한다. 상기는, 삭제된 물질이 본 명세서에 구체적으로 인용되든 되지 않든 관계없이, 임의의 발명의 요지를 상기 개념으로부터 제거하는 단서 조항 또는 부정적인 제한과 함께 상기 실시태양들의 일반적인 기재를 포함한다.
문맥상 달리 요구되거나 구체적으로 반박되지 않는 한, 단일의 정수, 단계 또는 요소로서 본 명세서에 인용된 본 발명의 정수, 단계 또는 요소는 상기 인용된 정수, 단계 또는 요소의 단수형 및 복수형을 모두 명백히 포함한다.
"실질적으로"란 단어는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"란 단어는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 발명을 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적합하게 실시할 수 있다. 따라서, 예를 들어 "포함하는", "내포하는", "함유하는" 등의 용어는 팽창적이고 비제한적으로 판독될 것이다. 추가로, 본 명세서에 사용되는 용어 및 표현들은 제한이 아닌 기재의 용어로서 사용되었으며, 도시되고 기재된 특징들 또는 그의 일부의 임의의 균등물의 제외와 같은 용어 및 표현을 사용하고자 하지 않지만, 다양한 변형들이 청구된 발명의 범위내에서 가능함은 인정한다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시태양 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시하였지만, 상기 중에서 구현된 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가들에 의해 실행될 수 있으며 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.
본 발명을 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기재하였다. 상기 일반적인 개시내에 있는 각각의 보다 좁은 개념 및 하위개념 그룹들이 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 상기는, 삭제된 물질이 본 명세서에 구체적으로 인용되든 되지 않든 관계없이, 임의의 발명의 요지를 상기 개념으로부터 제거하는 단서 조항 또는 부정적인 제한과 함께 본 발명의 일반적인 기재를 포함한다.
다른 실시태양들은 하기의 청구항 및 비제한적인 실시예 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 태양을 마쿠시 그룹에 의해 기재하는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위 그룹에 의해 기재됨을 알 것이다.
본 발명은 비제한적인 실시예 및 첨부 도면과 함께 고려될 때 상세한 기재를 참조하여 보다 잘 이해될 것이며, 도면에서:
도 1은 단클론 항체 패널의 면역화 및 생성의 하이브리도마 융합에 사용되는 PC-9 및 세포계(cell line)로부터 제피티니브 내성 클론의 생성을 위한 방법을 묘사하는 흐름도이다.
도 2는 A) 면역화 GR 계통, CL75, CL86 및 CL131, 및 B) 모 PC-9 및 또 다른 GR PC-9 계통상의 GR6A04의 유동 세포분석법 결합을 도시한다. 게이팅이 각각의 세포계에 대해 음성 대조용의 M=2%에서 수행되었다. 프로피디움 요오다이드 염색(FL-3)의 부재는 mAb GR 6A04 결합으로부터 본래적인 세포독성이 없음을 나타낸다.
도 3은 A) PC-9 및 유래된 제피티니브-내성 클론, B) NSCLC 계통, C) HCC827 및 유래된 제피티니브-내성 클론, D) 유방암 계통, E) 결장직장암 계통, 및 F) 정상 세포계에 대한 유동 세포분석법 선별을 도시한다.
도 4는 GR 6A04 단클론 항체 및 그의 유도체의 특성화를 도시한다. A) GR 6A04는 마우스 IgG1, κ 아이소타입의 것이다. B) CDR을 갖는 가변 중쇄 및 경쇄 번역된 서열들을 밑줄 그었다. C) GR6A04 및 IgG1 아이소타입 대조용(MG1.45)의 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에의 직접적인 접합으로 각각 GR6A04-MMAE 및 MG1.45가 수득된다(DAR:약물-항체비). 유동 세포분석법 결합은 접합 후에 영향을 받지 않는다. D) GR 6A04에 대한 인간 키메릭 단클론 항체(Hu-GR6A04). VH 및 VL 서열을 인간 불변 영역 주쇄와 함께 발현 벡터내에 클로닝하였다. Hu-GR6A04를 발현을 위해 CHO 세포내에 클로닝하였다. 쿠마씨 염색은 예상된 단백질 크기를 나타내었고 유동 세포분석법 결합은 GR6A04에 필적하였다.
도 5는 GR 6A04 항원의 특성화를 도시한다. A) 수행된 웨스턴 블럿은 55-90 kDa으로부터의 자국으로서 항원을 나타내었다. β-머캅토에탄올(환원제) 처리후 항원 자국이 감소하였다. B) GR 6A04 결합은 PNGase 민감성이다. 상기 항원에의 GR 6A04의 결합은 PNGase 처리로 없어지고(레인 3), 분자량 감소가 동반되며, 이는 상기 항원으로부터 N-글리칸의 성공적인 제거를 가리킨다. 항-액틴 결합은 상기 PNGase 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 즉, GR 6A04 결합은 항원의 N-글리코실화에 의존한다.
도 6은 A) GR 6A04에 의한 면역침전. 박스 구역이 질량 분광분석을 위해 절제되었다. B) 절제된 영역의 질량 분광분석은 컬럼 대조용 레인 중 동일한 영역에서 발견된 비특이적인 적중의 제거 후 상위 5개의 추정 항원들을 나타내었다. 상기 결과는 추정 항원들이 전체 점수를 기준으로 배열됨을 나타내었으며, 상기 점수는 총 단백질 커버리지(coverage), 및 발견된 독특한 펩티드의 수의 함수이다. 이어서 항원 동일성이 표적에 대한 상업적인 항체들에 의한 풀-다운(pull-down), 및 면역침전된 생성물과 GR 6A04, 및 이와 역의 교차-탐침에 의해 입증되었다. GRP78을 교차-IP에 의해 시험하고 GR 6A04에 대한 가능한 항원으로서 제외시켰다.
도 7은 GR 6A04에 대한 추정 항원으로서 CEACAM6의 확인을 나타낸다. A) 교차-면역침전이 상업적인 항-CEACAM6으로 수행되었다. 상업적인 항-CEACAM6, 및 GR 6A04는 모두 그의 대응물에 의한 항원 풀-다운을 인식하였다. B) CEACAM6의 siRNA 녹다운이 수행되었다. 상기 결과는 PC-9 세포에서 상기 CEACAM6 발현의 녹다운이 웨스턴 블럿 및 유동 세포분석법에서 관찰된 GR 6A04 결합의 감소를 유도함을 나타내었다.
도 8은 암 세포계에서 GR 6A04의 면역조직학을 나타낸다. A) PC-9 세포 펠릿상의 FFPE는 GR 6A04의 막 결합된 및 시토졸 국소화를 모두 나타낸다. B) 중복 코어에 걸쳐 임뮤노멤브레인(ImmunoMembrane)에 의해 채점된 FFPE 세포계 배열 배열 선별.
도 9는 종양 조직상의 GR 6A04의 면역조직학을 나타낸다. 정상 및 종양 조직의 혼합물, 다수의 장기(MNT241)를 사용하고 임뮤노멤브레인에 의해 채점된 조직 샘플(펜토믹스(Pantomics) TMA)상의 FFPE.
도 10은 종양 조직상의 GR 6A04의 면역조직학을 나타낸다. 종양 조직, 다수의 장기(MTU481) 상의 FFPE.
도 11은 종양 조직상의 GR 6A04의 면역조직학을 나타낸다. A) 종양 조직, 다수의 장기(MTU951) 상의 FFPE 및 염색된 코어들의 요약. B) 2개의 정상적인 코어; 식도 및 폐 상의 2+ 염색(거짓 양성 점수). C) 다수의 장기에서 암에 대한 전형적인 양성 채점.
도 12는 NSCLC 조직 샘플상의 GR 6A04의 면역조직학을 나타낸다. 정상과 인접한 폐 종양 TMA 상의 염색(LC 1001 2a)은 4/27 편평 및 9/18 선암종에 대한 양성 염색, 대응된 인접한 정상 조직에 대한 음성 염색을 도시한다.
도 13은 배열 LC1001 2a로부터의 코어 상들을 도시한다.
도 14는 시험된 정상 조직(MNO961)의 93/96에 대한 음성 염색을 도시한다. 비-특이적인 염색이 도관 내층(코어의 테두리) 및/또는 괴사성 조직상에서 일반적으로 발견되었다.
도 15는 GR 6A04와 상업적으로 입수할 수 있는 항-CEACAM6 항체와의 비교를 나타낸다. A) GR6A04는 튜니카마이신(N-글리코실화 억제제) 및 PNGase 절단(그러나 상업적인 항-CEACAM6(클론 9A6)은 아님)에 의해 영향을 받았다. B) mAb 결합에서 글리코실화의 역할의 차이가 또한 면역조직화학에서 특이성의 차이를 유도한다. 1개의 추가적인 코어를 갖는 세포계 배열은 양성으로 채점되었다(박스).
도 16은 결합 프로파일의 차이가 MNO961(다중-정상 TMA)(여기에서 상업적인 항-CEACAM6은 보다 많은 비-특이적 결합을 가지며, 염색 강도가 더 높다)에 대해 또한 관찰되었음을 나타낸다. 특히, 3개의 정상 폐 및 2개의 정상 비장 코어가 모두 양성으로 채점되었다.
도 17은 A549 세포의 분류를 나타낸다. A) A549 폐 선암종 세포계는 GR6A04의 이종 결합 및 15-30%의 양성 결합 꼬리를 나타내었다. B) 다이나비즈(Dynabeads) 판(Pan) Ms-IgG 비드에 이은 DNase 비드 방출을 사용한 GR6A04를 갖는 A549 세포의 분류는 P0에서 GR6A04+ 백분율의 농축을 보였으나, 후속 계대(A549 모 세포(양성 분획)로부터의 분류의 라운드 1)에서 결합의 상실이 관찰되었다. C) 수회 라운드의 분류는 안정한 차별적인 계통을 확립시켰다. D) 생성된 A549-GR6A04+ 단-세포(SC) 클론은 GR6A04 결합의 개선된 균일성을 나타내었다. E) A549-GR6A04+ 단-세포(SC) 클론들간의 형태학적 차이.
도 18은 분류된 집단들의 특성화를 나타낸다. EGFR은 A549-GR6A04+ 세포에서 하향 조절되었고 CEACAM1은 A549-GR6A04+ 세포에서 상향 조절되었다.
도 19는 A549 폐 선암종의 이종이식편 모델; A549-GR6A04+ 및 모 A549를 사용하는, GR6A04의 생체내 기능성을 나타내며, A) A549-GR6A04+ 세포는 증가된 종양발생성을 갖는다. B) 모 A549, 및 모 A549가 이종이식편에서 GR6A04+ 세포에 대해 선택된 종점에서 GR6A04 결합의 유지(20% 내지 >70%).
도 20은 GR 6A04의 항원이 순화 배지내로 침출됨을 도시한다. 배지는 5일간 배양된 세포로 순화되었으며, 기지의 부피를 멤브레인상에 중복 블럿팅하고 Hu-GR6A04로 탐침하였다. 상기 결과는 보다 높은 항원 수준이 A549 모 세포 및 GR6A04(-) 세포로부터보다는 GR 6A04(+) 세포로부터의 순화 배지 중에서 발견될 수 있음을 보였다.
도 21은 GR 6A04의 항체 약물 접합체의 특성화를 나타낸다. A) 개념 증명으로서 사용된 바와 같은 Mab-ZAP 항체 내면화 키트. GR 6A04를 독소와 결합된 항-마우스 2차 항체를 사용하여 사포린과 간접적으로 접합시켰다. B) GR 6A04를 PC-9 세포에서 내면화시켰다. 4 ℃에서 20분간 GR 6A04, 10 ㎍/㎖의 예비-배양을 수행하였다. 세포를 시점들에서 고정시키고 항-Ms 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488로 탐침하였다. 상들을 40x 촬영하였다. 상기 결과는 GR 6A04가 T=0분에서 세포 주변/막상에 고리로서(실선 화살표) 및 T=120분에서 고리(실선 화살표)로서 및 또한 세포내에(점선 화살표) 국소화됨을 도시하였다.
도 22는 GR6A04-MMAE(독소의 간접적인 접합)의 시험관내 기능성을 나타내며, 이때 용량-반응 곡선은 PC-9에 대해 EC50 @ 19.58 nM; A549-GR6A04+ 세포에 대해 EC50 @ 3.33 nM을 추정한다.
도 23은 GR 6A04의 항체 의존성 세포 세포독성을 나타낸다. 프로메아(Promea) ADCC 키트를 FcγR에 대한 루시페라제 리포터 및 양성 ADCC 대조용으로서 세툭시맵과 함께 사용하였다. PC-9에 대한 EC50: 39.6nM; A549-GR6A04+에 대한 EC50: 1.33nM.
도 24는 이종이식편 모델에서 ADC로서 GR 6A04 개념 증명을 나타낸다. 사용된 조건은 GR6A04-MMAE; MG1.45-MMAE 아이소타입 Ctrl; 완충제 Ctrl; GR6A04(접합되지 않은); Hu-GR6A04(접합되지 않은)였다. 처리 섭생은 10 ㎎/㎏(∼200 ug/마우스) 및 D0, D4 및 D8(종양 크기 >150 mm3에서 출발)에서, 3회 용량이었다. 상기 결과는 GR6A04-MMAE로 처리된 이종이식편이 ADC로서 탁월한 생체내 기능성을 입증하는 거의 없는 종양 성장을 보임을 가리켰다. 접합되지 않은 GR6A04 및 Hu-GR6A04로 처리된 이종이식편은 완충제 대조용에 비해 보다 느린 성장을 나타내었으며, 이는 ADCC 기전을 통한 약간의 생체내 종양 성장 억제를 가리켰다.
첫 번째 태양에서, (i) 아미노산 서열 GNTFTSYVMH (서열번호 3)을 갖는 VHCDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG (서열번호 4)을 갖는 VHCDR2 및 아미노산 서열 STARATPYFYAMDY (서열번호 5)을 갖는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 아미노산 서열 KSSQSLLWSVNQNSYLS (서열번호 6)을 갖는 VLCDR1, 아미노산 서열 GASIRES (서열번호 7)을 갖는 VLCDR2, 및 아미노산 서열 QHNHGSFLPYT (서열번호 8)을 갖는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 CDR 영역과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 영역을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSS를 포함한다. 한편으로, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIK를 포함한다. 한편으로, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 청구항 1 내지 6 중 어느 하나에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에서, 상기 항원 결합 단백질은 단클론, 재조합, 다클론, 키메릭, 인간화된, 이중특이성 및 이종접합체 항체; 키메릭 항원 수용체(CAR), 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 유효한 단편, 단쇄 Fv, 단쇄 항체, 힌지 영역(hinge region)이 없는 1가 항체, 미니바디(minibody), 디아바디 및 탄답스™로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 단클론 항체일 수 있다. 상기 단클론 항체는 GR 6A04일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 인간화될 수 있다. 한편으로, 상기 단클론 항체는 키메릭일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM6에 결합할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM6 상의 글리칸에 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM6 상의 N-결합된 글리칸에 결합할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 상기에 접합된 방사성동위원소 또는 세포독소를 포함할 수 있다. 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 메르탄신(DM-1), 사포린, 젬시타빈, 이리노테칸, 에토포시드, 빈블라스틴, 페메트렉시드, 도세탁셀, 패클리탁셀, 백금제(예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 비노렐빈, 카페시타빈, 미톡산트론, 익사베필론, 에리불린, 5-플루오로우라실, 트리플루리딘 및 티피라실로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포독소와 접합될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM6에 결합시 세포내로 내면화될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM6에 결합시 세포내로 내면화될 수 없다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 제피티니브 내성 폐암 세포, 비-소세포 폐암 세포, 유방암 세포 및/또는 결장직장암 세포에 선택적으로 결합할 수 있다.
또 다른 태양에서, 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물은 하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함할 수 있다.
약학 조성물 및 제제 중의 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편의 백분율은 물론 변할 수 있으며, 예를 들어 편의상 투여량 단위의 중량의 약 2% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 65%; 약 20% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 또는 약 35% 내지 약 45%의 범위일 수 있다. 치료학적으로 유용한 조성물 중의 화합물의 양은 적합한 투여량이 획득되는 바와 같은 양이다.
"생리학적으로 허용 가능한 담체"란 어휘는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 상기와 같은 매질 및 작용제들의 용도는 당해 분야에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 상기 화합물과 양립할 수 없는 한을 제외하고, 상기 치료 조성물 및 치료 및 예방 방법에서 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물을 또한 본 발명에 따른 조성물에 혼입시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서 비경구 조성물을 단위 투여형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단위 투여형"은 치료하고자 하는 개인의 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 소정량의 화합물(들)을 함유하는 각 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된다. 상기 화합물(들)을, 허용 가능한 투여량 단위 중에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 유효량으로 편리하고 유효한 투여를 위해 제형화할 수 있다. 보충적인 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우에, 상기 투여량은 상기 성분들의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참조하여 결정된다.
상기 조성물을 편의상 주사에 의해, 예를 들어 피하, 정맥내 등으로 투여할 수 있다. 상기 조성물을 또한 비경구적으로 또는 복강내로 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 화합물을 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사성 용액의 경우에, 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성을, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및/또는 항진균제의 포함에 의해 성취될 수 있다. 적합한 작용제는 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있으며, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알콜, 아스코르브산, 티메로살 등을 포함한다. 다수의 경우에, 상기 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨 및 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 생성시킬 수 있다.
멸균 주사성 용액은 상기 유사체를 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 상기 성분들의 조합과 적합한 용매 중에서 필요한 양으로 혼입시킨 다음 여과 살균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 유사체를 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다.
통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 약학 조성물은 미생물의 생육을 방지하기 위해 보존제를 함유할 수 있다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은 적합한 완충제를 추가로 포함하여 산 가수분해를 최소화할 수 있다. 적합한 완충제는 당해 분야의 숙련가들에게 주지되어 있으며, 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트, 카보네이트 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 단일 또는 수회 투여를 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 통상적인 실험에 의해 본 발명의 화합물 및/또는 조성물의 유효한 무독성 투여량 수준 및 상기 화합물 및 조성물을 적용할 수 있는 질병 및/또는 감염의 치료에 적합한 투여 패턴을 결정할 수 있을 것이다.
더욱이, 최적의 치료 과정, 예를 들어 한정된 일수 동안 하루에 제공되는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 복용 회수를 통상적인 치료 결정 시험 과정을 사용하여 확인할 수 있음은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명할 것이다.
일반적으로, 24시간당 유효 투여량은 체중 ㎏당 약 0.0001 ㎎ 내지 약 1000 ㎎; 적합하게는 체중 ㎏당 약 0.001 ㎎ 내지 약 750 ㎎; 체중 ㎏당 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎; 체중 ㎏당 약 0.1 ㎎ 내지 약 500 ㎎; 체중 ㎏당 약 0.1 ㎎ 내지 약 250 ㎎; 또는 체중 ㎏당 약 1.0 ㎎ 내지 약 250 ㎎의 범위일 수 있다. 보다 적합하게, 24시간당 유효 투여량은 체중 ㎏당 약 1.0 ㎎ 내지 약 200 ㎎; 체중 ㎏당 약 1.0 ㎎ 내지 약 100 ㎎; 체중 ㎏당 약 1.0 ㎎ 내지 약 50 ㎎; 체중 ㎏당 약 1.0 ㎎ 내지 약 25 ㎎; 체중 ㎏당 약 5.0 ㎎ 내지 약 50 ㎎; 체중 ㎏당 약 5.0 ㎎ 내지 약 20 ㎎; 또는 체중 ㎏당 약 5.0 ㎎ 내지 약 15 ㎎의 범위일 수 있다.
한편으로, 유효 투여량은 약 500 ㎎/㎡ 이하일 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 유효 투여량은 약 25 내지 약 500 ㎎/㎡, 약 25 내지 약 350 ㎎/㎡, 약 25 내지 약 300 ㎎/㎡, 약 25 내지 약 250 ㎎/㎡, 약 50 내지 약 250 ㎎/㎡, 및 약 75 내지 약 150 ㎎/㎡의 범위인 것으로 예상된다.
또 다른 태양에서, 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 암은 제피티니브 내성 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 위암, 소장암, 식도암 및 결장직장암으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 약제를 하나 이상의 추가적인 활성 약학 성분과 함께 투여할 수 있다. 한편으로, 상기 약제를 화학요법과 함께 투여할 수 있다. 상기 추가의 활성 약학 성분 또는 화학요법을 별도로, 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다.
또 다른 태양에서, 피실험자에서 암을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가는 암을 가리킨다.
또 다른 태양에서, 암에 민감한 피실험자를 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가는 상기 피실험자가 암에 민감함을 가리킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 대조용 샘플은 동일한 피실험자로부터 유래한다. 한편으로, 상기 대조용 샘플은 상이한 피실험자로부터 유래할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지를 포함할 수 있다. 상기 검출성 표지는 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지 및 방사성핵종 표지로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 검출성 표지는 비오틴, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 페록시다제, FITC, PE 및 Cy 염료로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 상기 검출성 표지를 유동 세포분석법, 조직 섹션, 면역형광, 면역세포화학 또는 면역조직화학 중에서 선택된 분석에서 검출할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용 설명서와 함께 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 사용되는 키트를 제공한다.
본 명세서에 예시적으로 기재된 발명을 적합하게는 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 실시할 수 있다. 따라서, 예를 들어 "포함하는", "내포하는", "함유하는" 등의 용어는 팽창적이고 비제한적으로 판독될 것이다. 추가로, 본 명세서에 사용되는 용어 및 표현들은 제한이 아닌 기재의 용어로서 사용되었으며, 도시되고 기재된 특징들 또는 그의 부분들의 임의의 균등물의 제외와 같은 용어 및 표현을 사용하고자 하지 않지만, 다양한 변형들이 청구된 발명의 범위내에서 가능함은 인정한다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시태양 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시하였지만, 상기 중에서 구현된 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가들에 의해 실행될 수 있으며 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.
본 발명을 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기재하였다. 상기 일반적인 개시내에 있는 각각의 보다 좁은 개념 및 하위개념 그룹들이 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 상기는, 삭제된 물질이 본 명세서에 구체적으로 인용되든 되지 않든 관계없이, 임의의 발명의 요지를 상기 개념으로부터 제거하는 단서 조항 또는 부정적인 제한과 함께 본 발명의 일반적인 기재를 포함한다.
다른 실시태양들은 하기의 청구항 및 비제한적인 실시예 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 태양을 마쿠시 그룹에 의해 기재하는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위 그룹에 의해 기재됨을 알 것이다.
실시예
본 발명의 비제한적인 실시예 및 비교 실시예를 특정한 실시예들(이들을, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다)을 참조하여 보다 상세히 추가로 기재할 것이다.
물질 및 방법
제피티니브 내성 세포계의 배양 및 생성
PC-9를 10% 소 태아 혈청(하이클론 GE 헬쓰사이언스(HyClone GE Healthscience), 남아프리카 소재)이 보충된 RPMI(인비트로젠(Invitrogen), 미국 소재)에서 배양하였다. 후천적인 제피티니브 내성을 갖는 PC-9 클론을 수득하기 위해서, PC-9 배양물을 2 nM로부터 출발하여 각각의 후속 계대에 따라 6.4 μM의 최종 농도로 점차적으로 증가되는, 증가하는 농도의 제피티니브(셀렉켐(Selleckchem), 미국 소재)에 노출시켰다. 그 후에 GR 클론, CL75, CL86 및 CL131을 6.4 μM 제피티니브에서 유지시켰다.
A549를 10% FBS 및 20 mM L-글루타민(인비트로젠, 미국 소재)이 보충된 DMEM(인비트로젠, 미국 소재)에서 배양하였다. A549는 제피티니브에 1차 내성을 가지며, >10 μM의 IC50을 갖는다.
GR mAb 패널의 생성
PC-9 GR 계통, CL75, CL86 및 CL131의 면역화를 프로인트 완전 항원보강제와 1:1 재현탁된 5E6 세포로 수행하였다. 면역화를, 1차 면역화를 위해 각각 단일 계통만을 사용하여 1 내지 3주 동안, 및 후속의 면역화를 위해 3개의 계통 모두의 혼합된 현탁액으로 4 내지 5주 동안 주당 1회 수행하였다. 5주 후에, 마우스를 죽이고, 제조사의 설명에 따라 스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies) 클로나셀(ClonaCell)™-HY 키트를 사용하여 Sp2/0 마우스 골수종 계통과의 융합을 위해 B-세포를 수집하였다. 단일 하이브리도마 클론을 96-웰에 채집하고, 배양 상등액을 유동 세포분석법에 의한 선별을 위해 수집하였다.
유동 세포분석법
세포를 트립신을 사용하여 단세포 현탁액으로서 수확하였다. 1E5 세포를 샘플당 사용하였으며, 30분 동안 100 ㎕의 mAb 배양 상등액과 배양하였다. 이어서 세포를 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 세척하고, 암실에서 4 ℃에서 15분 동안 100 ㎕의 형광 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 염소 항-마우스 항체(1:500, 다코(DAKO), 덴마크 소재)와 추가 배양하였다. 세포를 다시 세척하고 구아바(Guava)® 이지사이트(easyCyte) 8HT 벤치탑(Benchtop) 유동 세포분석계(머크 밀리포어(Merck Millipore), 미국 소재)상에서 분석을 위해 200 ㎕의 1% BSA/PBS 중에 재현탁시켰다. 세포간 결합의 심문을 위해서, 세포를 실온에서 10분 동안 4% PFA/PBS(애피메트릭스(Affymetrix), 미국 소재)로 고정시키고, PBS 중에서 세척하고, mAb 상등액/1차 항체와의 배양을 진행하기 전에 실온에서 5분 동안 0.1% 트리톤/PBS를 침투시켰다. 프로피디움 요오다이드 염색을 위해서, 상기 유동 세포분석계에 의한 분석 직전에 5분 동안 PI를 5 ug/㎖의 최종 농도로 가하였다.
웨스턴 블럿 및 면역침전
막 단백질을 막 단백질 추출 키트(바이오비젼(BioVision), 미국 소재)를 사용하여 PC-9 세포 펠릿으로부터 추출하였다. 간단히, 5E7 세포의 세포 펠릿을 1 ㎖의 균질화 완충제에 재현탁시키고 세포막을 다운스 균질화기에서 파괴하였다. 이를 에펜도르프 튜브로 옮기고 4 ℃, 700 x g에서 10분간 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 제거하였다. 상등액을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고 4 ℃에서 30분간 12,000 x g에서 원심분리시켜 상기 막을 펠릿화하였다. 상기 막을 최종적으로 프로테아제 억제제(피어스 써모사이언티픽(Pierce ThermoScientific), 미국 소재)를 함유하는 500 ㎕의 1x 세포 용해 완충제(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 소재)에 재현탁시켰다. 상기 막 단백질 용액을 4 ℃에서 5분간 15,000 x g에서 원심분리에 의해 등명화시켜 임의의 불용성 단백질을 제거하였다. 단백질을 피어스 660nM 단백질 분석 시약을 사용하여 정량분석하였다.
면역침전(IP)을 자동화된 파이넥서스(Phynexus) MEA 시스템(파이넥서스 인코포레이티드, 미국 소재)을 사용하여 수행하였다. GR6A04를 5 ul의 수지층을 함유하는 단백질 G PhyTip 컬럼상에서 포획하였다. 이어서 상기 컬럼을 PBS로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하고, PC-9 막 단백질 추출물을 도입시켜 상기 컬럼상에 포획된 GR6A04에 결합시켰다. 이어서 상기 컬럼을 용출 완충제(200 mM NaH2PO4/140 mM NaCl pH 2.5)로 저 pH에서 용출 전에 세척 완충제 II(140 mM NaCl, pH 7.4)로 세척하고 1 M 트리스-Cl pH 9.0으로 즉시 중화시켰다. 이어서 상기 IP 생성물을 웨스턴 블럿에 의해 분석을 수행하였다.
PC-9 막 단백질 추출물, 또는 IP 생성물을, SDS를 1%의 최종 농도로 함유하는 단백질 로딩 염료 중에서 변성시키고, 95 ℃에서 5분간 가열하였다. 이어서 상기 샘플을 예비-주조 구배 젤(NuPAGE 4-12% 구배 젤, 인비트로젠)에 로딩하고, MOPS 러닝 완충제(NuPAGE 인비트로젠, 미국 소재)가 흐르는 SDS-PAGE에 의해 분리시켰다. 젤 전기영동 후에, 용해된 단백질을 90분 동안 110 V의 정전압에서 DI 수 중에 20% 메탄올, 10% 트리스-글리신을 함유하는 전달 완충제 중에서 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(바이오래드(BioRad), 미국 소재) 상으로 옮겼다.
이어서 상기 멤브레인을 실온에서 30분간 PBS/0.1% 트윈-20(PBS-T) 중에서 제조된 5% 우유로 차단시켰다. 이어서 상기 멤브레인을 PBS-T 중에서 세척한 다음 4 ℃에서 2.5% 우유 중에서 2 ug/㎖로 GR6A04를 밤새 배양하였다. 후속적으로 상기 멤브레인을 PBS-T 중에서 세척한 후에, 실온에서 1시간 동안 양고추냉이 페록시다제-접합된 염소 항-마우스 2차 항체(1:10000, 다코)와 배양하였다. PBS-T에 의한 최종 세척 후에, HRP-접합된 2차 항체의 결합을 ECL 검출(GE 헬쓰케어, 스웨덴 소재)에 의해 시각화하였다.
쿠마씨 블루 염색 및 질량 분광분석
평행한 젤을 상기 IP 생성물들에 대해 실행하였으며, 상기 생성물을 실온에서 1시간 동안 10% 아세트산, 50% 메탄올 및 40% 수 중에 0.1% 쿠마씨 블루 R250을 함유하는 쿠마씨 블루 염색 용액으로 염색하였다. 이어서 상기 염색 용액을 제거하고, 10% 아세트산, 50% 메탄올 및 40% 수를 함유하는 탈-염색 용액에 의해 교체한다. 상기 탈-염색 용액을, 상기 젤의 배경이 거의 깨끗해질 때까지 새로운 용액으로 교체한다. 이어서 상기 탈-염색된 젤을 수 중에서 재수화시킨다. 이어서 상기 젤을 상기 IP 생성물의 웨스턴 블럿과 비교하여 상기 젤상의 항원 밴드의 위치를 측정한다. 이어서 상기 영역을 LC-MS 분석을 위해 절제한다.
글리코실화 연구
PNGase 절단을 제조사의 프로토콜(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 따라 수행하였다. 간단히, 20 ㎍의 PC-9 막 단백질 추출물을 먼저 95 ℃에서 10분간 1x 당단백질 변성 완충제 중에서 변성시켰다. 후속적으로, 1x G7 반응 완충제 및 10% NP-40을 가하고 37 ℃에서 1시간 동안 PNGase F와 배양하였다. 절단된 단백질을 후속적으로 상술한 바와 같이 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다.
세포 배양 중 단백질의 N-글리코실화의 억제가 또한 배양 배지 중 1 μM 튜니카마이신(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 소재)의 첨가에 의해 성취되었다. PC-9 세포를 6-웰 조직 배양 플레이스에서 1E5 세포로 시딩하고, 융합될 때까지 3일 동안 튜니카마이신 또는 DMSO가 첨가된 배양 배지 중에서 증식시켰다. 이어서 상기 세포를 유동 세포분석법 및 웨스턴 블럿팅에 의한 분석을 위해 수확하였다.
면역조직화학 염색
FFPE 조직을 함유하는 TMA 슬라이드를 먼저 60 ℃ 오븐에서 30분간 가열하여 임의의 용매를 제거하였다. 이어서 상기 슬라이드를 왁스를 제거하고 히스토클리어(Histoclear)(2x), 100% 에탄올(2x), 95% 에탄올, 70% 에탄올 중에서, 및 최종적으로 DI 수 중에서 연속적인 액침을 통해 재수화시켰다.
열-유도된 에피토프 회수를 10 mM 트리스 염기, 1 mM EDTA, 0.05% 트윈 20을 함유하는 용액 중에서 pH 9.0에서 수행하고 95 ℃에서 20분간 가열하였다. 이어서 상기 항원 회수 용액 및 슬라이드를 갖는 용기를 제거하고 추가로 20분 동안 실온으로 냉각되게 하였다. 이어서 상기 슬라이드를 DI 수 중에서 세척하였다. 이어서 내인성 페록시다제 활성을, 실온에서 30분간 PBS 중의 3% H2O2와 상기 슬라이드와의 배양에 의해 차단시켰다. 상기 슬라이드를 DI 수 중에서 세척한 다음 PBS 중의 10% 정상 염소 혈청으로 30분간 차단 단계를 수행하였다.
이어서 상기 슬라이드를 4 ℃에서 밤새 차단 용액 중에서 5 ug/㎖의 GR6A04와 배양하였다. 이어서 상기 슬라이드를 세척하고 실온에서 30분간 HRP(다코, 미국 소재)와 접합된 중합체-기재 항-마우스 2차 항체와 배양하고, 2분간 권장된 DAB 발색체 기질 용액으로 전개시키고, 길(Gill)의 헤마톡실린 용액으로 대조염색하였다.
상기 염색된 슬라이드를, 유리 커버 슬립을 올리기 전에, 50% 에탄올, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올(2x) 및 히스토클리어(2x) 중의 액침을 통해 후속적으로 탈수시켰다. 이어서 상기 슬라이드를 자이스 악시오스캔 디지털 슬라이드 스캐너(Zeiss AxioScan Digital Slide Scanner)로 영상화하였다.
A549 세포계로부터 GR6A04 결합 집단의 농축
셀렉션(CELLection)™ 판 마우스 IgG 키트(써모사이언티픽, 미국 소재)를 제조사의 설명에 따라, A549 모 폐 선암종 계통으로부터의 GR6A04- 및 GR6A04+ 하위집단의 농축에 사용하였다. 간단히, A549 세포를 트립신으로 수확하여 단-세포 용액을 수득하였다. 세포를 4 ℃에서 30분간 GR6A04와 10 ㎍/1E7 세포로 배양하였다. 이어서 상기 세포를 키트 권장에 따라 다이나비즈와 배양 전에, 300 x g에서 3분간 원심분리시켜 결합되지 않은 GR6A04를 제거하였다. 이어서 상기 세포-비드 현탁액을 자석 랙상에 적용하고, 분리되게 하였다. 상등액은 GR6A04- 집단으로서 수집된 반면, 결합된 비드 및 세포는 GR6A04+ 집단으로서 수집되었다. 상기 두 분획을 모두 세척하고 상기 자석 랙에 3회 가하였다. 상기 결합된 비드 및 세포를 최종적으로 DNase I과 배양하여 상기 다이나비즈로부터 상기 세포를 유리시켰다. 세포를 T75 조직 배양 플라스크내에 플라스크당 2.5E6 세포의 밀도로 시딩하였다.
항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 분석
ADCC 활성을 리포터 생물분석(프로메가; ADCC 리포터 바이오어세이, #G7010)을 사용하여 측정하였다. 상기 ADCC 생물분석을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히, PC-9 및 A549 세포를 96-웰 투명 바닥 검은색 조직 배양 플레이트(코닝(Corning); #3904) 중의 저 4% IgG-혈청(프로메가; #G711A) 배지에서 웰당 5,000 세포로 시딩하고, 밤새 부착 및 확산되게 하였다. Hu-GR6A04의 연속 희석물을 37 ℃, 5% CO2에서 대략 15분간 삼중 웰 중에서 배양하였다. 배양에 이어서, 조작된 효과기 세포를 상기 웰에 웰당 대략 150,000 세포로 가하였다. 6시간 후에, 바이오 글로(Bio-Glo)™ 루시페라제 분석 기질(프로메가; #G719A 및 #G720A)을 상기 웰에 가하고 인피니트(Infinite)® 200 미세플레이트 판독기(테칸(Tecan))를 사용하여 발광을 측정하였다.
증식-셀티터-글로 발광 세포 생육력(CTG) 분석
세포를 검은색 코팅된 96 웰 플레이트(그레니어 바이오 원(Grenier Bio-one), 영국 소재)에 1000-5000 세포/웰(사용되는 세포 유형에 따라)의 밀도 범위 및 90 uL/웰로 시딩하였다. 이어서 상기 플레이트를 5% CO2가 있는 가습 공기 중에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에, 10 ㎕의 mAb 또는 완충제를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 다시 5% CO2가 있는 가습 공기 중에서 37 ℃에 두었다. mAb 또는 완충제 첨가후 4일째에, 100 uL의 CTG 기질(프로메가, 미국 위스콘신주 소재)을 각 웰에 가하였다. 이어서 상기 플레이트를 암실에서 10분간 격렬히 진탕시키면서 방치하였다. 이어서 상기 샘플의 세포 생육력을 테칸(Tecan) I-콘트롤(테칸, 스위스 소재)을 사용하여 정량분석하였다.
항체 약물 접합체(ADC)
GR6A04 및 상업적인 마우스 IgG1 아이소타입 항체(바이오레전드(BioLegend)로부터 클론 MG1.45)를 각각 3.0 및 3.3의 DAR에서 MMAE 독소(모라덱(Moradec), 미국 샌디에고 소재)와 직접 접합시켰다. 상기 접합된 mAb에 대한 용량-반응 곡선을 0 내지 4.5 ㎍/㎖의 연속 희석 범위로 CTG 분석으로 확립시켰다. 상기 세포의 세포 생육력을 앞서 기재된 바와 같이 처리후 4일 째에 측정하였다.
생체내 이종이식편 모델
이종이식편 모델을 NCr 누드 마우스에서 A549-GR6A04+ 세포를 사용하여 확립시켰다. DMEM 기본 배지 중의 5E6 세포를 매트리젤(Matrigel)과 1:1 비로 혼합하고, 200 ㎕의 부피로 피하 주사하였다. 종양이 형성되어 >150 ㎣의 크기에 도달한 후, 각각 마우스 5마리씩 5개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 상기 그룹들을 하기와 같이 mAb로 처리하였다: (1) 완충제 대조용; (2) GR6A04-MMAE; (3) Hu-GR6A04; (4) GR6A04; (5) MG1.45-MMAE 아이소타입 대조용. mAb를 100 ㎕의 총 부피로 꼬리 정맥 주사를 통해 주사하였다. 적용 가능한 각각의 용량은 200 ㎍(10 ㎎/㎏과 동등함)이며, 처리를 총 3개 용량(0, 4 및 8일째)에 대해 4일마다 수행하였다. 종양 크기를 50일에 걸쳐 모니터하였다.
결과 및 논의
GR 내성 mAb 패널의 생성
GR6A04는 상피 성장 인자(EGFR)의 소분자 억제제, 제피티니브에 대해 후천적인 내성을 갖는 PC-9 폐 선암종에 대해 생성된 단클론 항체(mAb) 패널의 부분으로서 식별되었다. 제피티니브 내성(GR) PC-9 클론을, 6.4 μM의 제피티니브 농도에서 안정한 계통이 수득될 때까지 증가하는 농도의 제피티니브 중에서의 배양을 통해 생성시켰다. 상기를 상기 화합물로 치료 중인 폐암 환자에서 관찰되는 제피티니브에 대한 후천적인 내성에 대한 대용으로서 사용하였다.
3개의 제피티니브 내성 PC-9 클론(CL75, CL86 및 CL131)을 반-주기 프로토콜에서 Balb/c 마우스의 면역화에 사용하였다(도 1). 상기 마우스를 6주째에 죽이고, 상기 B-세포를 스템셀 테크놀로지스 클로나셀™-HY 키트를 사용하여 Sp2/0 마우스 골수종 세포와 융합시키고, mAb-생성 하이브리도마 클론을 수득하였다. 상기 GR 패널로부터 mAb를 유동 세포분석법에 의해 상기 면역 계통에의 결합에 대해 선별하였으며, 이 중에서 GR6A04가 상기 패널로부터의 결합 선도 후보 중 하나로 식별되었다.
유동 세포분석법에 의한 세포계상의 GR6A04 결합
GR6A04는 면역화에 사용된 3개의 PC-9 제피티니브 내성 클론에 대해 강한 반응성(>50%)을 나타내었으며, 이때 양성-결합 백분율은 오직 2차 대조용상에서 2%로 게이팅된 FL-1 채널로부터 측정되었다(도 2). 상기 FL-3 채널상의 프로피디움 요오다이드 염색은 또한 세포를 상기 mAb 단독과 배양한 경우 명백한 세포 세포독성을 보이지 않았다. GR6A04 결합을 또한 제피티니브 민감성 모 PC-9 세포계상에서, 및 상기 면역화에 사용되지 않은 또 다른 GR PC-9 클론상에서 시험하였으며, 이때 상기 두 계통 모두에 대해 유사하게 높은 결합을 갖는다. 상기 유동 세포분석법 결합 데이터를 도 3A에 요약한다.
GR6A04의 유동 세포분석법 결합을 또한, 시험된 4개의 계통 중 2개(A549 및 Calu-3)에서 부분적인 결합과 함께, 다른 NSCLC 계통에서 시험하였다. 또 다른 폐 선암종 계통, HCC827로부터의 GR 클론을 또한 증가하는 제피티니브 농도에서의 배양에 의해 수득하였다. GR6A04 결합이 이들 GR HCC827 클론 6개 중 2개에 대해 관찰되었다. 추가로, 다른 암 징후에 대한 결합이 또한 시험된 13개의 유방암 계통 중 3개 및 2개의 결장직장암 계통 중 1개에서 GR6A04 반응성을 보였다. 상이한 암 징후에 대한 GR6A04 결합을 도 3B-E에 요약한다.
중요하게, 동일한 염색 방법을 사용하여, 정상 세포의 세포 표면에 대한 GR6A04의 결합이 도 3F에 요약된 바와 같이, 섬유아세포, 내피 및 상피 세포, 및 1차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한 다양한 정상 세포계로 시험시 무시할만한(<8%) 것으로 밝혀졌다.
요약하면, GR6A04의 유동 세포분석법 결합 특성은 a) GR6A04가 유동 세포분석법을 근거로 PC-9의 세포 표면 및 그의 유도된 제피티니브-내성 클론에 결합하고, b) GR6A04가 다른 NSCLC, 유방 및 직장결장암 계통에 대해 반응성을 나타내고, c) 시험된 정상 세포계들에 대해 교차-반응성이 존재하지 않는다는 것이다.
GR6A04 mAb 및 유도체의 특성화
GR6A04 mAb의 아이소타입은 도 4A에서 피어스(Pierce)™ 고속 항체 아이소타이핑 키트에 의해 측정된 바와 같이, 마우스 IgG1 하위유형의 것으로 측정되었다. 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 아미노산 서열이 마우스 면역글로불린에 대한 축퇴 프라이머의 사용에 의해 도 4B에서와 같이 측정되었다. GR6A04를 AKTA 전위 시스템과 함께 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™ IgG-Fc(ms) 친화성 기질을 사용하여 하이브리도마 배양 상등액으로부터 정제하였다.
GR6A04의 2개의 유도체: 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)와의 항체 약물 접합체(GR6A04-MMAE), 및 인간 Ig 불변 영역 주쇄내로 클로닝된 VH 및 VL을 갖는 인간 키메릭 mAb(Hu-GR6A04)를 제조하고 특성화하였다.
GR6A04-MMAE를 3.0의 약물 대 항체비(DAR)로 MMAE와 접합시키고, 동시에 동일한 화학을 사용하여 3.3의 DAR로 상업적인 마우스 IgG1 항체(바이오레전드로부터 클론 MG1-45)와 접합시켰다(도 4C). PC-9 및 A549 세포상의 GR6A04-MMAE의 결합을 유동 세포분석법에 의해 시험하였으며, 이는 접합되지 않은 GR6A04에 필적할만한 것으로 밝혀진 반면, MG1-45-MMAE는 이들 2개의 계통에 무시할만한 결합을 갖는 것으로 측정되었다.
Hu-GR6A04를 CHO 세포에서 발현시키고, GR6A04와 동일한 시스템을 사용하여 배양 상등액으로부터 항체를 정제하였다. 정제된 Hu-GR6A04를 SDS-PAGE로부터의 쿠마씨 블루 염색으로부터 정확한 단백질 크기에 대해 조사하였으며, 이때 중쇄 및 경쇄는 환원 레인에서 각각 50 kDa 및 25 kDa, 및 완전한 IgG는 비-환원 레인에서 150 kDa의 예상된 크기를 가졌다. 유사하게, PC-9 및 A549상의 Hu-GR6A04의 결합은 도 4E에 도시된, 유동 세포분석법 시의 GR6A04에 필적할만하였다.
GR6A04는 N-글리코실화된 CEACAM6에 결합한다
PC-9 세포 용해물의 웨스턴 블럿팅을 GR6A04로 면역블럿팅하였으며, 도 5에 나타낸 비-환원 레인상에서 55 내지 90 kDa의 자국이 인식되는 것으로 밝혀졌다. 항원 결합 강도가 또한 환원 조건하에서 보다 약하였다. 추가로, N-결합된 글리칸의 제거를 위한 PNGase에 의한 세포 용해물의 처리는 또한 항원 밴드에의 GR6A04의 결합을 없앴으며, 이는 상기 항체 인식 부위에서 N-글리코실화의 중요성을 입증한다.
PC-9 세포 용해물에 대한 GR6A04에 의한 면역침전(IP)은 항원을 농축시켰으며, 이를 절제하여 질량 분광분석에 의한 식별을 위해 보냈다(도 6A). 단백질 목록을 단백질 커버리지 및 발견된 특유의 펩티드의 수를 기준으로 전체 점수에 의해 배열하고, 컬럼 대조용으로부터의 단백질 목록에 비교하였다. 상위 5개의 추정 항원을 도 6B에서 표에 나열하며 상업적인 항-CEACAM6 항체(산타 크루즈/애브캠(Santa Cruz/Abcam)으로부터 클론 9A6)와의 교차-IP(도 7A) 및 PC-9 세포 중 CEACAM6의 일시적인 siRNA 녹다운(도 7B)에 의해 확인한다.
GR6A04의 항원 표적은 CEACAM6이며, 이때 N-글리칸이 항체-항원 인식에 중요하다는 결론을 내릴 수 있다.
환자 FFPE 조직 샘플에 대한 GR6A04 결합
GR6A04가 유동 세포분석법 시 다양한 암 징후에 특이적이며 정상 세포에는 결합하지 않음을 확립시킨 후에, 본 발명자들은 포르말린 고정된 파라핀 포매된(FFPE) 조직 미세배열(TMA)상의 암 환자 조직 샘플에 대한 GR6A04의 결합 측정을 진행하였다. 상업적인 FFPE TMA를 판토믹스(Pantomics)로부터 수득하였다.
FFPE 샘플에 대한 GR6A04의 결합 조건을 FFPE 세포계 펠릿으로 최적화하였으며, 이는 pH 9 항원 검색 단계로 5 ug/㎖인 것으로 측정되었다. GR6A04는 PC-9 세포의 막과 시토졸 모두에 국소화되는 것으로 관찰되었다. 다른 암세포계에서 GR6A04의 결합 프로파일을 연장하기 위해서, 면역조직화학(IHC) 염색을 보다 넓은 범위의 암 징후를 포괄하는 FFPE 세포계 배열상에서 수행하였다. GR6A04는 위, 폐, 결장직장 및 췌장 암세포계에서 반응성인 것으로 밝혀졌다(도 8).
광범위한 장기 기원의 배열로부터 암조직 샘플을 포괄하는 다양한 FFPE TMA상의 IHC 염색을 또한 수행하였다. GR6A04 염색을 오픈 소스 소프트웨어: 임뮤노멤브레인(ImmunoMembrane)으로 채점하였다. 양성 염색된(2+ 및 3+) 조직 코어의 절대 다수에서, 결합은 세포막에 국소화되었다. 일부 비-특이적인 염색이 또한 괴사 영역에서 관찰되었다. 다중-종양 TMA상의 IHC 염색은 세포계 선별에서 관찰된 것을 지지하였으며, 이때 본 발명자들은 폐암 외에, GR6A04가 또한 비제한적으로 위장(GI) 및 유방암에 매우 반응성임을 관찰하였다(도 9 내지 11). NSCLC에 대해 집중된 배열에서, GR6A04는 상기 TMA에 나타난 편평세포암의 15%, 및 폐 선암종 코어의 50%에 대해 양성 염색하였다. 중요하게, 인접한 정상 조직은 어떠한 양성 염색도 갖지 않았으며, 이는 암조직에 대한 GR6A04 특이성을 입증한다(도 12 & 13).
또한, GR6A04를 동일한 염색 프로토콜 및 채점 시스템을 사용하여 FFPE 정상 조직에 대해 시험하였다. FDA 권장된 TMA(MNO961)(35개의 상이한 해부학적 부위를 함유한다)(도 14)를 사용하였다. 존재하는 96개의 코어 중 93개에서 GR6A04의 염색이 관찰되지 않았으나, 3개의 결장 코어 중 2개, 및 3개의 전립선 코어 중 1개는 약하게 양성이었다(2+). 확대된 상으로부터, 이들 경우의 염색은 주로 세포내 또는 괴사 영역에서였음에 유의해야 한다.
따라서, GR6A04는 환자 조직 샘플 중 광범위하게 상이한 암 징후에 대해 특이성을 나타내었으며, 정상 조직 유형상에서는 무시할만한 염색을 가졌고, 이는 유동 세포분석법 및 세포기반 선별로부터의 본 발명자들의 보다 초기의 결합 프로파일을 지지한다.
글리칸 인식 부위에 기인한 GR6A04의 증가된 특이성
상기 초기의 확인에 사용된 상업적인 항-CEACAM6 항체는 CEACAM6의 글리코실화의 변화에 민감하지 않은 것이다(즉 인식 부위는 글리칸 의존적이지 않다). 이는 도 15A에서 입증되는데, 여기에서 상기 결합 강도는 GR6A04와 달리, PNGase 및 튜니카마이신 처리 후에 변하지 않은 채로 있었다.
상기 2개의 항-CEACAM6(GR6A04 및 상업적인)을 FFPE 세포계 미세배열에서 비교시, 염색 프로파일들은 대체로 유사하였지만, 상기 상업적인 항체는 HCC827에서 하나의 추가적인 염색 코어를 가진 반면, BxPC3(췌장암 계통)는 또한 보다 강한 세포내 염색을 나타내었다(도 15B).
상기 상업적인 항-CEACAM6의 겉보기 비-특이성이 또한 정상 조직(MNO961)을 갖는 TMA에서 관찰되었으며, 이때 GR6A04의 경우의 단지 3개의 코어에 상반되게, 95개 코어 중 11개가 양성으로 염색되었다. 중요하게, 3개의 폐 정상 조직 및 2개의 비장 정상 조직이 모두 세포막상에서 염색을 나타내었다(도 16).
염색 프로파일의 차이는 CEACAM6 상의 에피토프 결합 부위의 차이, 특히 CEACAM6 상의 N-글리칸으로부터 발생하는 차이에 기인할 수 있었다. 이는 CEACAM6 단백질 단독상에서의 결합 외에, 여분의 정도의 특이성을 허용하였으며, 이는 정상 조직에 대한 감소된 비-특이적 결합을 도출한다. 이는 GR6A04가 치료법을 위해 개발되는 경우 추가된 안전성 수준을 제공하므로 중요하다.
GR6A04 + A549 하위집단의 특징
폐 선암종 세포계, A549는 단지 작은 15 내지 30% GR6A04+ 집단만을 갖는, GR6A04에 대한 이종 결합에 기인한 암에서의 글리코실화된 CEACAM6 발현의 역할을 조사하기에 양호한 생물학적 모델이다(도 17A). 셀렉톤™ 판 마우스 IgG 키트에 의한 자석 분류의 사용을 통해, GR6A04- 및 GR6A04+를 모두 농축시킬 수 있었다. GR6A04 결합의 감소가 증가하는 배양 계대수에 따라 관찰됨에 유의해야 한다. 수회 라운드의 연속적인 분류가 이를 완화시키며, GR6A04+의 경우 7 라운드의 단리 및 GR6A04- 세포의 경우 5 라운드의 단리 후에 안정한 차별적인 계통들이 수득되었고, 후속적으로 각각 A549-GR6A04+ 및 A549-GR6A04-라 지칭되었다(도 17B & C). 추가로, A549-GR6A04+ 배양물로부터, GR6A04의 강한 동종 결합을 나타내는 단세포 클론들(D5, D7 및 S4 클론)이 단리되었다. 이들은 클론들마다 상이한 세포 형태를 갖는 것으로 관찰되었다(도 17D & E). 특히, D5 클론은 둥근 형태를 갖는 치밀한 클러스터를 나타내었고, D7은 방추 모양의 세포를 나타내었고, S4는 부착 독립성 혹을 갖는 SCLC-유사 형태를 나타내었다.
EGFR 및 CEACAM1의 발현을 이들 하위집단, 및 또한 모 계통상에서의 유동 세포분석법에 의해 측정하였다. A549-GR6A04- 세포 및 모 A549 중의 이들 2개 마커의 발현은 유사하였지만, A549-GR6A04+ 세포는 훨씬 더 낮은 EGFR의 발현(MFI에서 25% 감소)을 가졌고, CEACAM1 결합의 증가가 또한 관찰되었다(도 18).
GR6A04 발현은 또한 생체내 종양형성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 누드 마우스 중의 A549 이종이식편 모델(이때 동일한 초기 세포수가 피하 주사되었다)에서, A549-GR6A04+ 세포는 A549 모 세포보다 더 큰 이종이식편을 형성시켰다(도 19A). 상기 이종이식편이 50일 연구의 끝에서 분리되었을 때, A549 모 세포로부터 수득된 이종이식편 중의 GR6A04의 백분율은 주사 시점에서 대략 20%에서부터 50일째까지 >70%로 증가됨이 또한 밝혀졌다(도 19B).
GR6A04가 폐암에 대한 혈청 생물마커로서 잠재적인 용도를 가질 수 있는지를 확립시키기 위해서, A549 하위집단으로부터의 순화 배지를 멤브레인상에 스폿팅하고 GR6A04로 면역블럿팅하였다. 상기 항원은 A549-GR6A04+ 및 A549 모 세포 배양물로부터의 순화 배지에서 검출가능하지만, A549-GR6A04- 배양물에서는 검출가능하지 않으며, 강도는 스폿팅된 배지의 부피에 비례한다(도 20). 상기 결과는 GR6A04가 환자 혈청 샘플에서 항원 정량분석에 사용될 수 있음을 보여준다.
시험관내 및 생체내 기능 분석
선행 섹션에서는 GR6A04의 특이성 및 암 생물학에서의 그의 가능한 역할을 확립시킨 반면, 본 섹션은 주로 암 치료제로서 mAb의 기능성에 초점을 둔다. 항체-약물 접합체(ADC)로서의 기능에 대한 초기 시험으로서, GR6A04를 독소와 접합된 항-마우스 항체를 사용하여 사포린(리보솜 불활성화 단백질)과 간접적으로 접합시켰다. 세포 성장은 상기 PC-9 민감성 모 계통, 및 CL75 GR 클론 모두에서 각각 43% 및 28%까지 억제되었다(도 21A). GR6A04는 또한 37 ℃에서 120분 이내에 내면화할 수 있는 것으로 관찰되었으며, 이때 상기 mAb는 0분째에 결합후 세포 주변부에 국소화되고, 120분째에 세포질(점선 화살표)내에 분포되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 세포의 일부는 120분째에 상기 mAb를 내면화하지 않았고, 상기 mAb는 여전히 표면상에 국소화되었다(실선 화살표)(도 21B).
GR6A04를 후속적으로 보다 확고한 분석을 위해 MMAE에 직접 접합시켰다(도 4C). 용량 반응 곡선을 PC-9 및 A549 결합 세포, 및 H1299 비-결합 세포에 대해 작성하였다(도 22). EC50은 PC-9 세포의 경우 19.8 nM 및 A549-GR6A04+ 세포의 경우 3.33 nM인 것으로 확립되었다. GR6A04-MMAE는 비-결합 세포, H1299 및 A549-GR6A04- 집단에 대해 세포 성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 오직 GR6A04 결합 세포에 대한 특이성만을 나타낸다.
GR6A04는 또한 인간 IgG 불변 주쇄를 갖는 키메릭 mAb로서 개발되었다(도 4D). Hu-GR6A04를 프로메가 ADCC 키트(FcγR 결합에 대한 루시페라제 리포터로서)를 사용하여 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 대해 시험하였다(도 23). PC-9 및 A549-GR6A04+에 대한 용량-반응 곡선을 작성하였으며, EC50은 각각 39.6 nM 및 1.33 nM인 것으로 확립되었다.
따라서, GR6A04는 ADCC 활성을 갖는 네이키드 인간 키메릭 mAb로서 및 MMAE와 접합된 ADC로서 2개의 폐암 세포계, PC-9(제피티니브 민감성) 및 A549(제피티니브-내성)에 대한 시험관내 기능성을 입증하였다.
최종적으로, 생체내 기능성을 피하 이종이식편 모델에서 A549-GR6A04+ 세포를 사용하여 시험하였다(도 24). 종양이 150 ㎣에 도달했을 때, 3회 용량으로 4일마다 10 ㎎/㎏의 I.V. mAb 주사로 GR6A04 및 그의 유도체에 의한 처리를 개시하였다. 상기 네이키드 mAb, Gr6A04 및 Hu-GR6A04는 모두 ADCC 기전에 기인하여, 완충제 대조용에 비해 종양 성장의 억제를 나타내었다. 중요하게, GR6A04-MMAE는 종양 크기의 억제에 대단히 유효하였으며, 45일의 연구를 통해 종양 성장이 거의 없었다(<2배). 따라서, GR6A04는 제피티니브-내성 A549 이종이식편 모델에 대해 양호한 생체내 기능성을 나타내었으며, 이는 상기 시험관내 결과와 일치한다.
SEQUENCE LISTING <110> AGENCY FOR SCIENCE, TECHNOLOGY AND RESEARCH)/SINGAPORE HEALTH SERVICES PTE LTD <120> ANTI-CEACAM6 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> IPA190512-SG <150> SG 10201608481W <151> 2016-10-10 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 1 Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys 20 25 30 Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr 35 40 45 Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 50 55 60 Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Arg 85 90 95 Ala Thr Pro Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 2 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser 20 25 30 Val Asn Gln Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Gln Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Asn Val His Val Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His 85 90 95 Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Glu Ile Lys 115 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 3 Gly Asn Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 4 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 5 Ser Thr Ala Arg Ala Thr Pro Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 6 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Val Asn Gln Asn Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 7 Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated antibody fragment <400> 8 Gln His Asn His Gly Ser Phe Leu Pro Tyr Thr 1 5 10

Claims (37)

  1. (i) 아미노산 서열 GNTFTSYVMH (서열번호 3)을 갖는 VHCDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTKYNEKFKG (서열번호 4)을 갖는 VHCDR2; 및 아미노산 서열 STARATPYFYAMDY (서열번호 5)을 갖는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 아미노산 서열 KSSQSLLWSVNQNSYLS (서열번호 6)을 갖는 VLCDR1, 아미노산 서열 GASIRES (서열번호 7)을 갖는 VLCDR2, 및 아미노산 서열 QHNHGSFLPYT (서열번호 8)을 갖는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 및 (ii)의 중쇄 및 경쇄 CDR 영역과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 영역을 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    중쇄 가변 영역이 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSS를 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    경쇄 가변 영역이 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIK를 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 단백질이 단클론(monoclonal), 재조합, 다클론, 키메릭, 인간화된, 이중특이성 및 이종접합체 항체; 키메릭 항원 수용체(CAR), 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 유효한 단편, 단쇄 Fv, 단쇄 항체, 힌지 영역(hinge region)이 없는 1가 항체, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 및 탄답스(Tandabs)TM로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    결합 단백질이 단클론 항체인 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    단클론 항체가 GR 6A04인 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    단클론 항체가 인간화되는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    단클론 항체가 키메릭인 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEACAM6에 결합하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    CEACAM6 상의 글리칸에 결합하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    CEACAM6 상의 N-결합된 글리칸에 결합하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합된 방사성동위원소 또는 세포독소를 포함하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제15항에 있어서,
    항체가 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 메르탄신(DM-1), 사포린, 젬시타빈, 이리노테칸, 에토포시드, 빈블라스틴, 페메트렉시드, 도세탁셀, 패클리탁셀, 백금제(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴), 비노렐빈, 카페시타빈, 미톡산트론, 익사베필론, 에리불린, 5-플루오로우라실, 트리플루리딘 및 티피라실로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포독소와 접합되는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEACAM6에 결합시 세포내로 내면화되는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEACAM6에 결합시 세포내로 내면화되지 않는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    제피티니브 내성 폐암 세포; 비-소세포 폐암 세포; 유방암 세포; 결장직장암 세포에 선택적으로 결합하는 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 치료 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    하나 이상의 추가의 치료 화합물을 포함하는 조성물.
  22. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제20항 또는 제21항에 청구된 바와 같은 조성물의 용도.
  23. 제22항에 있어서,
    암이 제피티니브 내성 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 위암, 소장암, 식도암 및 결장직장암으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    약제가 하나 이상의 추가의 활성 약학 성분과 함께 투여되는 용도.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    약제가 화학요법과 함께 투여되는 용도.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    하나 이상의 추가의 활성 약학 성분 또는 화학요법이 약제와 별도로, 동시에 또는 연속적으로 투여되는 용도.
  27. 피실험자에서 암을 검출하는 방법으로서, 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가가 암을 가리키는 방법.
  28. 암에 민감한 피실험자를 식별하는 방법으로서, 상기 피실험자로부터 수득된 샘플을 시험관내에서 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 상기 샘플 중의 상기 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하고; 상기 결합을 대조용 샘플 중의 결합 수준과 상관지어 상기 샘플 중의 결합 수준을 측정함을 포함하며, 상기 대조용 샘플에 비해 상기 샘플 중 결합 수준의 증가가, 상기 피실험자가 암에 민감함을 가리키는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    대조용 샘플이 동일한 피실험자로부터 유래하는 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    대조용 샘플이 상이한 피실험자로부터 유래하는 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편이 CEACAM6에 결합하는 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편이 검출성 표지를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    검출성 표지가 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지 및 방사성핵종 표지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    검출성 표지가 비오틴, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 페록시다제, FITC, PE 및 Cy 염료로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    검출성 표지가 유동 세포분석법, 조직 섹션, 면역형광, 면역세포화학 또는 면역조직화학 중에서 선택된 분석에서 검출되는 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 제피티니브 내성 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 위암, 소장암, 식도암 및 결장직장암으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  37. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편을 사용 설명서와 함께 포함하는, 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 사용되는 키트(kit).
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