ES2968264T3 - Anticuerpos anti-CEACAM6 y métodos de utilización - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une a CEACAM6, que comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende un VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos GNTFTSYVMH; un VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos YINPYNDGTKYNEKFKG; y un VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos STARATPYFYAMDY y (ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende un VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos KSSQSLLWSVNQNSYLS, un VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos GASIRES y un VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos QHNHGSFLPYT. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, métodos de uso de la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma para el tratamiento, prevención o detección del cáncer y un kit que comprende el antígeno. -proteína de unión, o fragmento de unión a antígeno de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CEACAM6 y métodos de utilización
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a anticuerpos. Específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-CEACAM6 y a usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
La molécula 6 de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM6, por sus siglas en inglés) pertenece a la familia del antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés). CEACAM6 es una glucoproteína de superficie celular anclada por glucosil-fosfatidil-inositol (GPI, por sus siglas en inglés) que se ha observado que está sobreexpresada en una diversidad de cánceres, incluyendo los carcinomas de mama, pancreático, colónico y pulmonar no microcítico. CEACAM6 actúa como un oncogén en tumores y estimula la invasión del cáncer, la metástasis, la resistencia a la anoikis y la quimiorresistencia, e inhibe la diferenciación.
Hasta la fecha, existe un número muy limitado de anticuerpos monoclonales anti-CEACAM6 que pueda utilizarse para el tratamiento con anticuerpos o como conjugados de anticuerpo-fármaco para el tratamiento del cáncer. El documento n.° WO 2016/150899 se refiere a anticuerpos anti-CEACAM6 y a su utilización para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos contra CEACAM6 que puedan utilizarse para el tratamiento con anticuerpos o como conjugados de anticuerpo-fármaco para el tratamiento del cáncer.
Sumario
La presente invención se describe en las reivindicaciones. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende un VHCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos GNTFTSYVMH (SEC ID n.° 3), un v Hc DR2 que presenta la secuencia de aminoácidos YINPYNDGTKYNEKFKG (SEC ID n.° 4), un VHCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos STARATPYFYAMDY (SEC ID n.° 5) y (ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende un VLCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos KSSQSLLWSVNQNSYLS (SEC ID n° 6), un V<l>C<d>R2 que presenta la secuencia de aminoácidos GASIRES (SEC ID n.° 7), y un VLCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos QHNHGSFLPYT (SEC ID n.° 8), en el que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un glicano en CEACAM6.
En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoria.
En la presente memoria se describe la utilización de un anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoria, o composición tal como se da a conocer en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoria, o una composición tal como se da a conocer en la presente memoria, para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer.
En la presente memoria se describe un método de tratamiento o prevención del cáncer que comprende administrar una proteína de unión a antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de la misma tal como se da a conocer en la presente memoria, o una composición tal como se da a conocer en la presente memoria, en un sujeto que lo necesita.
En otro aspecto, se proporciona un método para la detección del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende: poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoriain vitro;detectar la unión del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la muestra; correlacionar la unión con un nivel de unión en una muestra de control para determinar el nivel de unión en la muestra, en donde un incremento del nivel de unión en la muestra respecto a la muestra de control es indicativo de cáncer.
En otro aspecto, se proporciona un método para la identificación de un sujeto que es susceptible de sufrir cáncer, en donde el método comprende: poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoriain vitro;detectar la unión del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo en la muestra; correlacionar la unión con el nivel de unión en una muestra de control para determinar el nivel de unión en la muestra, en donde un incremento del nivel de unión en la muestra respecto a la muestra de control es indicativo de que el sujeto es susceptible de sufrir cáncer.
En un aspecto, se proporciona la utilización de un kit en el método tal como se da a conocer en la presente memoria, que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoria, junto con instrucciones de utilización. La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones. Las realizaciones y/o los ejemplos de la descripción siguiente que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención.
Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Definiciones
A continuación, se proporcionan algunas definiciones que pueden resultar útiles para comprender la descripción de la presente invención. Estas pretenden ser definiciones generales y no deben considerarse limitativas en modo alguno del alcance de la presente invención a dichos términos únicamente, aunque se presentan en aras de una mejor comprensión de la descripción siguiente.
La expresión "proteína de unión a antígeno" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros constructos de proteínas, tales como dominios, que son capaces de unirse a CEACAM6.
El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio para referirse a moléculas con un dominio de tipo inmunoglobulina e incluyen anticuerpos monoclonales, recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados; un receptor de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés), un dominio variable único, un anticuerpo de dominio, fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunitariamente eficaces, Fv de cadena sencilla, diacuerpos, Tandabs™, etc. (para un resumen de formatos alternativos de "anticuerpo", ver Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 2005, vol. 23, n.° 9, 1126-1136).
La expresión "dominio variable único" se refiere a un dominio variable de proteína de unión a antígeno (por ejemplo, V<h>, V<h h>, V<l>) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio variable diferente.
Un "anticuerpo de dominio único" o "dAb" puede considerarse equivalente a "dominio variable único", que es capaz de unirse a un antígeno. Un dominio variable único puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, aunque también incluye dominios variables de anticuerpo único de otras especies, tales como roedores (por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento n.° WO 00/29004), dAb V<h h>de tiburón nodriza y de camélido. Los V<h h>de camélido son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que se derivan de especies entre las que se incluyen el camello, la llama, la alpaca, el dromedario y el guanaco, los cuales producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente carentes de cadenas ligeras. Dichos dominios V<h h>pueden humanizarse de acuerdo con técnicas estándares disponibles, y dichos dominios se considera que son "anticuerpos de dominio único". Tal como se utiliza en la presente memoria, V<h>incluye los dominios V<h h>de camélido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "dominio" se refiere a una estructura de proteína plegada que presenta una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable único" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpo completo y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que se ha sustituido uno o más bucles por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o que comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen por lo menos la actividad de unión y especificidad del dominio de longitud completa. Un dominio puede unirse a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio variable diferente.
Un fragmento de unión a antígeno puede proporcionarse mediante la organización de uno o más CDR o andamiajes de proteína no anticuerpo, tal como un dominio. El dominio puede ser un anticuerpo de dominio único o puede ser un dominio que sea un derivado de un andamiaje seleccionado del grupo que consiste en CTLA-4, lipocalina, SpA, un aficuerpo, un avímero, GroEl, transferrina, GroES y fibronectina/adnectina, que se ha sometido a ingeniería de proteínas con el fin de obtener la unión a un antígeno, tal como CEACAM6, diferente del ligando natural.
Un fragmento de unión a antígeno o un fragmento inmunitariamente eficaz puede comprender secuencias variables parciales de cadena pesada o ligera. Los fragmentos presentan una longitud de por lo menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos. Alternativamente, los fragmentos presentan una longitud de por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 75 o por lo menos 100 aminoácidos de longitud.
La expresión "se une específicamente" tal como se utiliza a lo largo de toda la presente especificación en relación a las proteínas de unión a antígeno se refiere a que la proteína de unión a antígeno se une a CEACAM6 con un nivel de unión nulo o insignificante a otras proteínas (por ejemplo, proteínas no relacionadas). Sin embargo, la expresión no excluye el hecho de que las proteínas de unión a antígeno también pueden presentar reactividad cruzada con moléculas estrechamente relacionadas. Las proteínas de unión a antígeno indicadas en la presente memoria pueden unirse a CEACAM6 con una afinidad por lo menos 2, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces superior a la que presentan en la unión a moléculas estrechamente relacionadas.
El término "neutraliza" tal como se utiliza a lo largo de toda la presente especificación se refiere a que la actividad biológica de CEACAM6 está disminuida en la presencia de una proteína de unión a antígeno tal como se indica en la presente memoria en comparación con la actividad de CEACAM6 en la ausencia de la proteína de unión a antígeno,in vitrooin vivo.La neutralización puede deberse a uno o más factores de entre el bloqueo de la unión de CEACAM6 a su receptor, a que se impide que CEACAM6 active su receptor, la regulación negativa de CEACAM6 o su receptor, o a efectos sobre la funcionalidad como efector. La reducción o inhibición de la actividad biológica puede ser parcial o total. Una proteína de unión a antígeno neutralizador puede neutralizar la actividad de CEACAM6 en por lo menos 20 %, 30 % 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % respecto a la actividad de CEACAM6 en la ausencia de la proteína de unión a antígeno. La neutralización puede determinarse o medirse utilizando uno o más ensayos conocidos por el experto en la materia o tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, puede evaluarse la unión a CEACAM6 de la proteína de unión a antígeno en un ensayo ELISA de tipo sándwich, mediante BIAcore™, FMAT, FORTEbio o ensayosin vitrosimilares.
Los CDR se definen como secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de una proteína de unión a antígeno. Son regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Existen tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera (o regiones de CDR) en la parte variable de una inmunoglobulina. De esta manera, las "CDR" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a la totalidad de las tres CDR de cadena pesada, a la totalidad de las CDR de cadena ligera y a la totalidad de las CDR de cadenas pesada y ligera, o por lo menos dos CDR.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "promotor" pretende referirse a una región de ADN que inicia la transcripción de un gen particular.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "canceroso" se refiere a que está afectado por cáncer o que muestra anormalidades características del cáncer.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muestra biológica" o "muestra" se refiere a una muestra de tejido o células de un paciente que se ha obtenido, extraído o aislado del paciente.
La expresión "obtenido o derivado de" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que se utiliza de manera inclusiva. Es decir, pretende comprende cualquier secuencia de nucleótidos aislada directamente de una muestra biológica o cualquier secuencia de nucleótidos derivada de la muestra.
El método tal como se describe en la presente memoria resulta adecuado para la utilización en una muestra de tejido fresco, tejido congelado, tejido conservado en parafina y/o tejido conservado en etanol. La muestra puede ser una muestra biológica. Entre los ejemplos no limitativos de muestras biológicas se incluyen sangre completa o un componente de la misma (p. ej., plasma o suero), orina, saliva, linfa, líquido biliar, esputo, lágrimas, líquido cefalorraquídeo, líquido de lavado broncoalveolar, líquido sinovial, semen, líquido tumoral ascítico, leche materna y pus. En una realización, la muestra de ácido nucleico se obtiene a partir de sangre, líquido amniótico o un frotis bucal. En una realización preferente, la muestra es una muestra de sangre completa.
Una muestra biológica tal como se contempla en la presente memoria incluye materiales biológicos en cultivo, incluyendo una muestra derivada de células en cultivo, tal como medio de cultivo recogido de células en cultivo o de un pellet celular. De acuerdo con lo anterior, una muestra biológica puede referirse a un lisado, homogenado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subgrupo de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos. Una muestra biológica también podría modificarse antes de la utilización, por ejemplo, mediante purificación de uno o más componentes, dilución y/o centrifugación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "marcaje detectable" o "informador" se refiere a un marcador detectable o moléculas de informador, que pueden unirse a ácidos nucleicos. Entre los marcajes habituales se incluyen fluoróforos, isótopos radioactivos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, soluciones y coloides metálicos, y enzimas. Los métodos para el marcaje y una guía para la selección de marcajes útiles para diversos fines se analizan en, p. ej., Sambrook et al., en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y en Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "susceptible de cáncer" o "susceptibilidad al cáncer" se refieren a la probabilidad de un sujeto de desarrollar cáncer. El término no indica que un sujeto desarrollará cáncer con una certeza del 100 %. Por el contrario, la expresión "susceptible al cáncer" se refiere a una probabilidad incrementada de que un sujeto desarrolle cáncer en comparación con un individuo que no es "susceptible al cáncer".
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aproximadamente" en el contexto de concentraciones de componentes de las formulaciones normalmente significa /-5 % del valor indicado, más habitualmente /-4 % del valor indicado, más habitualmente /-3 % del valor indicado, más habitualmente, /-2 % del valor indicado, todavía más habitualmente /-1 % del valor indicado, y todavía más habitualmente /-0,5 % del valor indicado.
A lo largo de toda la presente exposición pueden darse a conocer determinadas realizaciones en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo se proporciona meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de los intervalos dados a conocer. De acuerdo con lo anterior, la descripción de un intervalo debe considerarse que ha dado a conocer específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6, debe considerarse que ha dado a conocer específicamente subintervalos tales como 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Lo anterior se aplica con independencia de la amplitud del intervalo.
Determinadas realizaciones también pueden describirse en términos amplios y genéricos en la presente memoria. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más específicas comprendidas dentro de la exposición genérica también forma parte de la exposición. Lo anterior incluye la descripción genérica de las realizaciones con una condición o limitación negativa que elimine cualquier materia del género, con independencia de si el material extraído se cite específicamente o no en la presente memoria.
A menos que el contexto requiera lo contrario o que se indique específicamente lo contrario, los números enteros, etapas o elementos de la invención citados en la presente memoria como números enteros, etapas o elementos singulares comprenden claramente tanto las formas singulares como las plurales de los números enteros, etapas o elementos citados.
El término "sustancialmente" no excluye "completamente", p. ej., una composición que esté "sustancialmente libre" de Y puede estar sustancialmente libre de Y. En caso necesario, el término "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria puede ponerse en práctica convenientemente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no dadas a conocer específicamente en la presente memoria. De esta manera, por ejemplo, los términos "comprende", "incluye", "contiene", etc., deben interpretarse en sentido amplio y sin limitación. Además, los términos y expresiones utilizados en la presente memoria se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, aunque se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. De esta manera, debe entenderse que, aunque la presente invención se ha dado a conocer específicamente mediante realizaciones preferentes y características opcionales, el experto en la materia podrá recurrir a la modificación y variación de las invenciones realizadas en las mismas y dadas a conocer en la presente memoria, y que tales modificaciones y variaciones se considera que están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
La invención se ha descrito en términos amplios y genéricos en la presente memoria. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más específicas comprendidas dentro de la exposición genérica también forma parte de la invención. Lo anterior incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier materia del género, con independencia de si el material extraído se cita específicamente o no en la presente memoria.
Otras realizaciones se encuentran comprendidas en las reivindicaciones y ejemplos no limitativos, posteriormente. Además, en donde se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos de Markush, el experto en la materia reconocerá que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor haciendo referencia a la descripción detallada, considerada conjuntamente con los ejemplos no limitativos y los dibujos adjuntos, en los que:
La fig. 1 es un diagrama de flujo que ilustra la metodología de generación de clones resistentes al gefitinib a partir de PC-9 y líneas celulares utilizadas para la inmunización y la fusión de hibridoma de generación del panel de anticuerpos monoclonales.
La fig. 2 muestra la citometría de flujo de la unión de GR6A04 en A) líneas GR de inmunización, CL75, CL86 y CL131, y B) PC-9 parental y otra línea PC-9 GR. Se llevó a cabo la clasificación con M=2 % del control negativo para cada línea celular. La ausencia de tinción con yoduro de propidio (FL-3) muestra la falta de citotoxicidad inherente por la unión de mAb de GR6A04.
La fig. 3 muestra el cribado de citometría de flujo con A) PC-9 y clones derivados resistentes al gefitinib, B) líneas NSCLC, C) clones HCC827 y derivados resistentes al gefitinib, D) líneas de cáncer de mama, E) líneas de cáncer colorrectal y F) líneas celulares normales.
La fig. 4 muestra la caracterización del anticuerpo monoclonal GR6A04 y sus derivados. A) GR6A04 es una IgG1 de ratón de isotipo<k>. B) Secuencias traducidas de cadena variable pesada y ligera con CDR subrayado. C) Conjugación directa de GR6A04 y una IgG1 de isotipo de control (MG1.45) de monometil-auristatina E (MMAE) para obtener GR6A04-MMAE y MG1.45, respectivamente (DAR:proporción fármaco-anticuerpo). La unión en la citometría de flujo no se vio afectada por la conjugación. D) Anticuerpo monoclonal quimérico humano de GR6A04 (GR6A04_hu). Las secuencias V<h>y V<l>se clonaron en un vector de expresión con un esqueleto de región constante humana. Se clonó GR6A04_hu en células CHO para la expresión. La tinción de Coomassie mostró el tamaño de proteína esperado y la unión según la citometría de flujo era comparable a GR6A04.
La fig. 5 muestra la caracterización del antígeno GR6A04. A) La transferencia Western realizada mostró el antígeno como una mancha entre 55 y 90 kDa. La borrosidad del antígeno se redujo tras el tratamiento con p-mercaptoetanol (agente reductor). B) La unión de GR6A04 es sensible a la PNGasa. La unión de GR6A04 al antígeno resultó anulada por el tratamiento de PNGasa (carril 3), acompañada de una caída del peso molecular, lo que indica la eliminación con éxito de los N-glicanos del antígeno. La unión de antiactina no resultó afectada por el tratamiento de PGNasa. En otras palabras, la unión de GR6A04 era dependiente de la N-glucosilación del antígeno.
La fig. 6 muestra A) la inmunoprecipitación con GR6A04. La zona en la caja se extrajo para la espectrometría de masas. B) Análisis de espectrometría de masas de la región extraída identificada por los 5 antígenos putativos principales tras la eliminación de los aciertos no específicos observados en la misma región en la columna Carril de control. Los resultados mostraron que los antígenos putativos se disponen según la puntuación global, que es una función de la cobertura total de la proteína y el número de péptidos únicos encontrado. A continuación, se validó la identidad de los antígenos mediante un ensayo de inmunoprecipitación (IP) con anticuerpos comerciales contra la diana y una sonda cruzada de los productos inmunoprecipitados con GR6A04 y viceversa. Se sometió a ensayo GRP78 mediante IP cruzada y se descartó como posible antígeno para GR6A04.
La fig. 7 muestra la validación de CEACAM6 como el antígeno putativo para GR6A04. A) Se llevó a cabo una inmunoprecipitación cruzada con anti-CEACAM6 comercial. Tanto el anticuerpo anti-CEACAM6 comercial como GR6A04 reconocieron el antígeno inmunoprecipitado como su contrapartida. B) Se llevó a cabo la inactivación con ARN interfiriente de molécula pequeña (ARNip) de CEACAM6. Los resultados mostraron que la inmunoprecipitación de la expresión de CEACAM6 en células PC-9 condujo a una reducción de la unión de GR6A04 observada en la transferencia Western y en la citometría de flujo.
La fig. 8 muestra la inmunohistología de GR6A04 en las líneas celulares de cáncer. A) El tratamiento de fijación en formalina e inclusión en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés) de pellets de células PC-9 mostró la localización tanto unida a membrana como citosólica de GR6A04. B) Análisis de FFPE de matriz de líneas celulares evaluado por ImmunoMembrane en muestras de punción gruesa por duplicado.
La fig. 9 muestra la inmunohistología de GR6A04 en tejido tumoral. T ratamiento de FFPE de las muestras de tejido (micromatrices de tejidos (TMA, por sus siglas en inglés) de Pantomics) utilizando una mezcla de tejidos normales y tejidos tumorales, múltiples órganos (MNT241) y evaluado por ImmunoMembrane.
La fig. 10 muestra la inmunohistología de GR6A04 en tejido tumoral. Tratamiento de FFPE de tejidos tumorales, de múltiples órganos (MTU481).
La fig. 11 muestra la inmunohistología de GR6A04 en tejido tumoral. A) FFPE de tejidos tumorales, de múltiples órganos (MTU951) y un resumen de las muestras de punción gruesa teñidas. B) Tinción 2+ de dos muestras normales: esofágica y pulmonar (puntuación falsamente positiva). La fig. 12 muestra la puntuación positiva de cánceres de múltiples órganos.
La fig. 12 muestra la inmunohistología de GR6A04 en muestras de tejido de cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés). La tinción de las TMA de tumor pulmonar con tejido contiguo normal (LC 1001 2a) mostraba tinción positiva en 4/27 escamoso y 9/18 adenocarcinoma; tinción negativa para tejido contiguo normal emparejado.
La fig. 13 muestra imágenes de muestras de punción gruesa de la matriz LC1001 2a.
La fig. 14 muestra tinción negativa para 93/96 del tejido normal sometido a ensayo (MNO961). Se observó generalmente tinción no específica en los revestimientos ductales (bordes de las muestras de punción gruesa) y/o en tejido necrótico.
La fig. 15 muestra la comparación de GR6A04 con un anticuerpo anti-CEACAM6 disponible comercialmente. A) GR6A04 resultó afectado por la tunicamicina (inhibidor de la N-glucosilación) y la digestión con PNGasa, pero no por anti-CEACAM6 comercial (clon 9A6). B) Las diferencias en el papel de la glucosilación en la unión de los mAb también condujeron a diferencias de especificidad en la inmunohistoquímica. La matriz de líneas celulares con 1 muestra de punción gruesa adicional dio una puntuación positiva (marcado con una caja).
La fig. 16 muestra que las diferencias en los perfiles de unión también se observaban para MNO961 (TMA multinormal) en donde el anticuerpo anti-CEACAM6 comercial presentaba más unión no específica, con una intensidad de tinción más alta. En particular, la totalidad de las muestras de punción gruesa, 3 de pulmón normal y 2 de bazo normal, recibió una evaluación positiva.
La fig. 17 muestra la separación de las células A549. A) La línea celular de adenocarcinoma pulmonar A549 muestra unión heterogénea de GR6A04 y una cola de unión positiva de entre 15 % y 30 %. B) La separación de las células A549 con GR6A04 utilizando microesferas Pan-Ms-IgG de Dynabeads seguido de la liberación de las microesferas con ADNasa mostró un enriquecimiento de los porcentajes de GR6A04<+>en P0, pero se observó una pérdida de unión con los pases posteriores (ronda 1 de separación de las células parentales A549 (fracción positiva). C) Múltiples rondas de separación establecieron líneas diferenciales estables. D) Los clones de células individuales (SC, por sus siglas en inglés) A549-GR6A04<+>generadas mostraron una homogeneidad mejorada de la unión de GR6A04. E) Diferencias de morfología entre los clones de células individuales (SC) A549-GR6A04<+>. La fig. 18 muestra la caracterización de las poblaciones separadas. EGFR resultó regulado negativamente en las células A549-GR6A04<+>y CEACAM1 resultó regulado positivamente en células A549-GR6A04<+>.
La fig. 19 muestra la funcionalidadin vivode GR6A04 utilizando modelos de xenoinjerto de adenocarcinoma pulmonar A549: A549-GR6A04<+>y A549 parental, A) las células A549-GR6A04<+>presentaban una tumorigenicidad incrementada. B) A549 parentales y retención de la unión de GR6A04 en el criterio de evaluación en el que se seleccionaron las A549 parentales para las células GR6A04<+>en el xenoinjerto (20 % a >70 %).
La fig. 20 muestra que el antígeno de GR6A04 se filtra hacia el medio condicionado. El medio se acondicionó durante 5 días con células en cultivo; se transfirieron volúmenes conocidos a membranas por duplicado y se sondearon con GR6A04_hu. Los resultados mostraron que podían observarse niveles de antígenos más altos en el medio condicionado d las células GR6A04(+) que en el de células A549 parentales y de células GR6A04(-). La fig. 21 muestra la caracterización del conjugado anticuerpo-fármaco de GR6A04. A) Se utilizó el kit de internalización de mAb-ZAP como prueba de concepto. Se conjugó indirectamente GR6A04 con saporina utilizando un anticuerpo secundario antirratón unido a la toxina. B) GR6A04 resultó internalizado por las células PC-9. Se llevó a cabo la preincubación de GR6A04, 10 pg/ml a 4 °C durante 20 min. Las células se fijaron en los puntos temporales y se sondearon con anti-Ms AlexaFluor 488. Las imágenes se captaron a 40x. Los resultados mostraron que GR6A04 se localizaba como un anillo (flechas de línea continua) en la periferia/membrana celular en T=0 min y como un anillo (flechas de línea continua) y también intracelularmente (flechas de línea discontinua) en T=120 min.
La fig. 22 muestra la funcionalidadin vitrode GR6A04-MMAE (conjugación directa de toxina), con curvas de dosisrespuesta que estiman la EC<50>en 19,58 nM contra PC-9; EC<50>de 3,33 nM contra las células A549-GR6A04<+>. La fig. 23 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de GR6A04. Se utilizó el kit de ADCC (por sus siglas en inglés, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) Promega con el informador luciferasa para FcYR y cetuximab como control de ADCC positivo. EC<50>para PC-9: 39,6 nM; EC<50>para A549-GR6A04<+>: 1,33 nM. La fig. 24 muestra la prueba de concepto de GR6A04 como conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) en un modelo de xenoinjerto. Las condiciones utilizadas fueron GR6A04-MMAE; control de isotipo MG1.45-MMAE; control de tampón; GR6A04 (no conjugado); GR6A04_hu (no conjugado). El régimen de tratamiento era 10 mg/kg (~200 pg/ratón) y 3 dosis, en D0, D4 y D8 (partiendo de un tamaño tumoral >150 mm<3>). Los resultados indicaron que los xenoinjertos tratados con GR6A04-MMAE mostraban poco crecimiento tumoral, lo que demuestra una excelente funcionalidadin vivocomo ADC. Los xenoinjertos tratados con GR6A04 no conjugado y GR6A04_hu mostraron un crecimiento más lento que el control de tampón, lo que indica cierta inhibición del crecimiento tumoralin vivomediante mecanismos de ADCC.
Descripción detallada de la presente invención
En un primer aspecto, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende un VHCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos GNTFTSYVMH (SEC ID n.° 3), un VHCDR2 que presenta la secuencia de aminoácidos YINPYNDGTKYNEKFKG (SEC ID n.° 4), un VHCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos STARATPYFYAMDY (SEC ID n.° 5) y (ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende un VLCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos KSSQSLLWSVNQNSYLS (SEC ID n° 6), un VLCDR2 que presenta la secuencia de aminoácidos GASIRES (SEC ID n.° 7), y un VLCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos QHNHGSFLPYT (SEC ID n.° 8), en el que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un glicano en CEACAM6.
En realizaciones descritas en la presente memoria, pero no reivindicadas, la proteína de unión a antígeno, o fragmento de unión a antígeno de la misma, puede comprender regiones CDR de cadena pesada y de cadena ligera que son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idénticas a las regiones CDR de cadena pesada y ligera de (i) y (ii).
En una realización, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYN EKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGT SVTVSS tal como se indica en la SEC ID n.° 1. Alternativamente, la región variable de cadena pesada puede comprender una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 1.
En una realización, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYG ASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEI K tal como se indica en la SEC ID n.° 2. Alternativamente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 2.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados; un receptor quimérico de antígeno (CAR); fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunológicamente eficaces, Fv de cadena sencilla, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpo univalente que no presenta una región bisagra, un minicuerpo, diacuerpos y Tandabs™. En una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal podría ser GR6A04. En una realización, el anticuerpo monoclonal puede estar humanizado. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal puede ser quimérico.
El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a CEACAM6. El anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un glicano en CEACAM6. El anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en la presente memoria puede unirse a un glicano N-ligado en CEACAM6.
En otra realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria puede comprender un isótopo radioactivo o una citotoxina conjugada con el mismo. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede conjugarse con una citotoxina seleccionada del grupo que consiste en monometil-auristatina E (MMAE), mertansina (DM-1), saporina, gemcitabina, irinotecán, etopósido, vinblastina, pemetrexed, docetaxel, paclitaxel, agentes de platino (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino), vinorelbina, capecitabina, mitoxantrona, ixabepilona, eribulina, 5-fluorouracilo, trifluridina y tipiracilo.
En una realización, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria puede internalizarse en una célula tras la unión a CEACAM6.
En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria podría no internalizarse en una célula tras la unión a CEACAM6.
En una realización, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se indica en la presente memoria, puede unirse selectivamente a una célula de cáncer pulmonar resistente a gefitinib, una célula de cáncer pulmonar no microcítico, una célula de cáncer de mama y/o una célula de cáncer colorrectal.
En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria. En una realización, la composición tal como se da a conocer en la presente memoria puede comprender uno o más compuestos terapéuticos adicionales.
El porcentaje del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se indica en la presente memoria, en composiciones farmacéuticas y preparaciones puede evidentemente modificarse y, por ejemplo, convenientemente puede estar comprendido entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 90 %, entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 80 %, entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 75 %, entre aproximadamente 15 % y aproximadamente 65 %; entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 60 %, entre aproximadamente 25 % y aproximadamente 50 %, entre aproximadamente 30 % y aproximadamente 45 %, or entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 45 %, del peso de la unidad de dosis. La cantidad de compuesto en composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtiene una dosis adecuada.
La expresión "portador fisiológicamente aceptable" pretende incluir solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocida de la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto, se encuentra contemplada la utilización del mismo en las composiciones terapéuticas y métodos de tratamiento y profilaxis. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones según la presente invención. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de las dosis.
La expresión "forma de dosis unitaria" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el individuo bajo tratamiento; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de uno o más compuestos calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. El compuesto o compuestos pueden formularse para la administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un portador farmacéuticamente aceptable adecuada en una unidad de dosis aceptable. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos complementarios, las dosis se determinan en referencia a la dosis y modo de administración habituales de dichos ingredientes.
La composición puede administrarse convenientemente mediante inyección, por ejemplo, subcutánea, intravenosa, y similar. La composición también puede administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. En una realización, el compuesto puede administrarse mediante inyección. En el caso de soluciones inyectables, el portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante la utilización de surfactantes. Puede conseguirse la prevención de la acción de microorganismos mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y/o antifúngicos. Los agentes adecuados son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, alcohol bencílico, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, puede resultar preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol y cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del análogo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes indicados anteriormente, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del análogo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de entre los indicados anteriormente.
Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, las preparaciones farmacéuticas pueden contener un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos. Preferentemente, la composición farmacéutica puede incluir, además, un tampón adecuado para minimizar la hidrólisis ácida. Los agentes tamponadores adecuados son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fosfatos, citratos, carbonatos y mezclas de los mismos.
Puede llevarse a cabo una sola administración o múltiples administraciones de las composiciones farmacéuticas según la invención. El experto en la materia podrá, mediante experimentación rutinaria, determinar los niveles de dosis eficaces y no tóxicos del compuesto y/o composición de la invención y el patrón de administración que resultará adecuado para el tratamiento de las enfermedades y/o infecciones en las que pueden aplicarse los compuestos y composiciones.
Además, resultará evidente para el experto habitual en la materia que el curso óptimo de tratamiento, tal como el número de dosis del compuesto o composición de la invención administradas cada día durante un número definido de días, puede determinarse utilizando un curso convencional de pruebas de determinación del tratamiento.
Generalmente, una dosis eficaz cada 24 horas puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,0001 mg y aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal; convenientemente, entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 750 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal; o entre aproximadamente 1,0 mg y aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal. Más convenientemente, una dosis eficaz cada 24 horas puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 1,0 mg y aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 1,0 mg y aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 1,0 mg y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 1,0 mg y aproximadamente 25 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 5,0 mg y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 5,0 mg y aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 5,0 mg y aproximadamente 15 mg por kg de peso corporal.
Alternativamente, una dosis eficaz puede ser de hasta aproximadamente 500 mg/m2. Por ejemplo, generalmente se espera que una dosis eficaz se encuentre comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 350 mg/m2, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 300 mg/m2, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 250 mg/m2, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 mg/m2, y entre aproximadamente 75 y aproximadamente 150 mg/m2.
En la presente memoria se describe la utilización de un anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se da a conocer en la presente memoria, o la composición tal como se da a conocer en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer.
En una realización, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer pulmonar resistente al gefitinib, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer del intestino delgado, cáncer esofágico y cáncer colorrectal.
En algunas realizaciones, el medicamento puede administrarse con uno o más ingredientes farmacéuticos activos adicionales. Alternativamente, el medicamento puede administrarse con quimioterapia. Los ingredientes farmacéuticos activos o quimioterapia adicionales pueden administrarse por separado, simultánea o secuencialmente.
En otro aspecto, se proporciona un método para la detección del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende: poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoriain vitro;detectar la unión del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la muestra; correlacionar la unión con el nivel de unión en una muestra de control para determinar el nivel de unión en la muestra, en donde un incremento del nivel de unión en la muestra respecto a la muestra de control es indicativo de cáncer.
En otro aspecto, se proporciona un método para la identificación de un sujeto que es susceptible de sufrir cáncer, en donde el método comprende: poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en la presente memoriain vitro;detectar la unión del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la muestra; correlacionar la unión con el nivel de unión en una muestra de control para determinar el nivel de unión en la muestra, en donde un incremento del nivel de unión en la muestra respecto a la muestra de control es indicativo de que el sujeto es susceptible de sufrir cáncer.
En una realización, la muestra de control procede del mismo sujeto. Alternativamente, la muestra de control puede proceder de un sujeto diferente.
En una realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria puede comprender un marcaje detectable. El marcaje detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje enzimático y un marcaje radionucleido.
En una realización, el marcaje detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en biotina, fosfatasa alcalina, peroxidasas de rábano picante, FITC, PE y pigmentos Cy. El marcaje detectable puede detectarse en un ensayo seleccionado de entre citometría de flujo, sección de tejido, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica o inmunohistoquímica.
En un aspecto, se proporciona la utilización de un kit en el método tal como se indica en la presente memoria, que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se indica en la presente memoria, junto con instrucciones de utilización.
Ejemplos
Se describen adicionalmente ejemplos no limitativos de la invención y ejemplos comparativos en mayor detalle en referencia a Ejemplos específicos, que no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la invención.
Materiales y métodos:
Cultivo y generación de líneas celulares resistentes al gefitinib.
Se cultivaron PC-9 en RPMI (Invitrogen, EE. UU.) complementado con suero de feto bovino al 10 % (Hyclone GE Healthscience, Sudamérica). Con el fin de obtener clones de PC-9 con resistencia adquirida a gefitinib, se expusieron cultivos de PC-9 a una concentración creciente de gefitinib (Selleckchem, EE. UU.), partiendo de 2 nM e incrementando gradualmente con cada pase siguiente hasta una concentración final de 6,4 pM. A continuación, se mantuvieron los clones de GR, CL75, CL86 y CL131 en gefitinib 6,4 pM.
Se cultivaron A549 en DMEM (Invitrogen, EE. UU.) complementado con FBS al 10 % y L-glutamina 20 mM (Invitrogen, EE. UU.). A549 presenta resistencia primaria a gefitinib, con IC<50>>10 pM.
Generación de panel de anticuerpos monoclonales (mAb) de GR.
La inmunización de las líneas de GR PC-9, CL75, CL86 y CL131, se llevó a cabo con células 5E6 resuspendidas 1:1 en adyuvante completo de Freund. La inmunización se llevó a cabo una vez a la semana para la primera inmunización en las semanas 1 a 3 con solo una única línea cada una, y una suspensión mixta de las tres líneas para las inmunizaciones posteriores en las semanas 4 y 5. Tras 5 semanas, se sacrificaron los ratones y las células B se recogieron para la fusión con líneas de mieloma de ratón Sp2/0 utilizando el kit STEMCELL Technologies ClonaCell<™>-HY de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recolectaron clones de hibridoma individuales en placas de 96 pocillos y se recogió el sobrenadante de cultivo para el cribado mediante citometría de flujo.
Citometría de flujo.
Las células se recolectaron en forma de suspensiones de células individuales utilizando tripsina. Se utilizaron células 1E5 en cada muestra y se incubaron con 100 j l de sobrenadante de cultivo de mAb durante 30 min. A continuación, se lavaron las células con albúmina de suero bovino al 1 % en PBS y se incubaron adicionalmente con 100 j l de anticuerpo de cabra antirratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:500, DAKO, Dinamarca) durante 15 min a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron nuevamente y se resuspendieron en 200 j l de BSA al 1 %/PBS para el análisis en un citómetro de flujo Guava® easyCyte 8HT Benchtop (Merck Millipore, EE. UU.). Para la interrogación de la unión intercelular, las células e fijaron con PFA al 4 %/PBS (Affymetrix, EE. UU.) a temperatura ambiente durante 10 min, se lavaron en PBS y se permeabilizaron con Triton al 0,1 %/PBS durante 5 min a temperatura ambiente antes de continuar con la incubación con sobrenadante de mAb/anticuerpo primario. Para la tinción con yoduro de propidio, se añadió PI hasta una concentración final de 5 jg/m l durante 5 min inmediatamente antes del análisis mediante citometría de flujo.
Transferencia western e inmunoprecipitación.
Las proteínas membranales se extrajeron de los pellets de células PC-9 utilizando el kit de extracción de proteínas membranales (BioVision, EE. UU.). Brevemente, se resuspendieron los pellets celulares de células 5E7 en 1 ml de tampón de homogeneización y las membranas celulares se rompieron en un homogeneizador Dounce. Lo anterior se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 700xg durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf y se centrifugó a 12.000xg durante 30 min a 4 °C para peletizar las membranas. Las membranas se resuspendieron finalmente en 500 j l de 1x tampón de lisis celulares (Cell Signaling Technology, EE. UU.) que contenía inhibidores de proteasa (Pierce ThermoScientific, EE. UU.). La solución de proteínas membranales se clarificó mediante centrifugación a 15.000xg durante 5 min a 4 °C para eliminar cualquier proteína insoluble. Las proteínas se cuantificaron utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Pierce 660nM.
Se llevó a cabo la inmunoprecipitación (IP) utilizando el sistema automatizado Phynexus MEA (Phynexus Inc., EE. UU.). Se capturó GR6A04 en columnas PhyTip de proteína G que contenían 5 j l de lecho de resina. A continuación, se lavaron las columnas con PBS para eliminar las proteínas no unidas y se introdujo el extracto de proteínas membranales de las PC-9 para unirse a GR6A04 que se había capturado en la columna. Seguidamente, las columnas se lavaron con tampón de lavado II (NaCl 140 mM, pH 7,4) antes de eluir a pH bajo con tampón de elución (NaH2PO4 200 mM/NaCl 140 mM, pH 2,5) y se neutralizó inmediatamente con Tris-Cl 1 M, pH 9,0. A continuación, el producto de IP se sometió a análisis mediante transferencia Western.
Los extractos de proteínas membranales de las PC-9 o los productos de IP se desnaturalizaron en pigmento de carga de proteína que contenía SDS a una concentración final de 1 % y se calentaron a 95 °C durante 5 min. A continuación, la muestra se cargó en gel de gradiente premoldeado (gel de gradiente al 4-12 % NuPAGE, Invitrogen) y se separó mediante SDS-PAGE pasando tampón de migración MOPS (NuPAGE, Invitrogen, EE. UU.). Tras la electroforesis en gel, las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (BioRad, EE. UU.) en un tampón de transferencia que contenía metanol al 20 %, Tris-glicina al 10 % en agua DI a voltaje constante de 110 V durante 90 min.
A continuación, las membranas se bloquearon con leche al 5 % preparada en PBS/Tween-20 al 0,1 % (PBS-T) durante 30 min a temperatura ambiente. Seguidamente, las membranas se lavaron en PBS-T seguido de la incubación durante la noche de GR6A04 a 2 jg/m l en 2,5 % de leche a 4 °C. A continuación, las membranas se lavaron en PBS-T, antes de incubar con anticuerpos secundarios de cabra antirratón conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:10000, Dako) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras un lavado final con PBS-T, se visualizó la unión de los anticuerpos secundarios conjugados con HRP mediante detección con ECL (GE Healthcare, Suecia).
Tinción de azul de Coomassie y espectrometría de masas.
Se llevó a cabo un gel paralelo para los productos de IP, que se tiñeron con solución de tinción de azul de Coomassie que contenía azul de Coomassie R250 al 0,1 % en 10 % ácido acético, 50 % metanol y 40 % agua, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se extrajo la solución de tinción y se sustituyó por la solución de destinción, que contenía 10 % ácido acético, 50 % metanol y 40 % agua. La solución de destinción se sustituyó por solución nueva, hasta que el fondo del gel estuvo prácticamente transparente. A continuación, el gel desteñido se rehidrató en agua. Seguidamente, se comparó el gel con la transferencia Western de los productos de IP a fin de determinar la posición de la banda de antígeno en el gel. A continuación, se extrajo esta región para el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL-EM).
Estudios de glucosilación.
Se llevó a cabo la digestión con PNGasa de acuerdo con el protocolo del fabricante (New England Biolabs). Brevemente, en primer lugar, se desnaturalizaron 20 jg de proteínas membranales de PC-9 en 1x tampón de desnaturalización de glucoproteínas, a 95 °C durante 10 minutos. Posteriormente, se añadió 1x tampón de reacción G7 y NP-40 al 10 % y se incubó con PNGasa F a 37 °C durante 1 hora. Las proteínas digeridas seguidamente se analizaron mediante transferencia Western tal como se ha indicado anteriormente.
La inhibición de la N-glucosilación durante el cultivo celular también se llevó a cabo mediante la adición de tunicamicina 1 |j;M (Sigma Aldrich, EE. UU.) en el medio de cultivo. Se sembraron células PC-9 a razón de 105 células en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se cultivaron en medio de cultivo con adición de tunicamicina, o DMSO durante 3 días hasta la confluencia. A continuación, se recolectaron las células para el análisis mediante citometría de flujo y transferencia Western.
Tinción de inmunohistoquímica.
Los portaobjetos de TMA que contenían tejidos de FFPE en primer lugar se calentaron en un horno a 60 °C durante 30 min para eliminar cualquier solvente. A continuación, los portaobjetos se desparafinaron y rehidrataron mediante inmersión secuencial en Histoclear (2x), etanol al 100 % (2x), etanol al 95 %, etanol al 70 % y, finalmente, agua DI.
La recuperación de epítopos inducida por calor se llevó a cabo en una solución que contenía base Tris 10 mm, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,05 % a pH 9,0 y se calentó a 95 °C durante 20 min. El recipiente con la solución de recuperación de antígeno y los portaobjetos seguidamente se extrajeron y dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente durante 20 min adicionales. A continuación, los portaobjetos se lavaron en agua DI. A continuación, la actividad endógena de peroxidasa se bloqueó mediante incubación de los portaobjetos con H<2>O<2>al 3 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron en agua DI, seguido de una etapa de bloqueo con suero de cabra normal al 10 % en PBS durante 30 min.
A continuación, los portaobjetos se incubaron con GR6A04 a 5 jg/m l en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C. Seguidamente, los portaobjetos se lavaron e incubaron con un anticuerpo secundario antirratón de base polímero conjugado con HRp (DAKO, EE. UU.) durante 30 min a temperatura ambiente y se revelaron con la solución de sustrato cromógeno DAB recomendada, durante 2 min, y se contratiñeron con solución de hematoxilina de Gill.
Los portaobjetos teñidos seguidamente se deshidrataron mediante inmersión en etanol al 50 %, etanol al 70 %, etanol al 90 %, etanol al 100 % (2x) e Histoclear (2x) antes de montar con un cubreobjetos de vidrio. A continuación, se captaron imágenes de los portaobjetos con el escáner de portaobjetos digital AxioScan de Zeiss.
Enriquecimiento en población ligante de GR6A04 de la línea celular A549.
Se utilizó el kit de IgG CELLection<™>Pan Mouse (ThermoScientific, EE. UU.) para el enriquecimiento en subpoblaciones GR6A04<->y GR6A04<+>a partir de la línea parental de adenocarcinoma pulmonar A549, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recolectaron las células A549 con tripsina para obtener una solución de células individuales. Las células se incubaron con GR6A04 a razón de 10 jg /107 células, durante 30 min a 4 °C. A continuación, se centrifugaron las células a 300xg durante 3 min para eliminar GR6A04 no unido, antes de incubarlo con las Dynabeads siguiendo las recomendaciones del kit. A continuación, la suspensión de células y microesferas se aplicó en la gradilla para separación magnética y se dejó en reposo para que se separasen. Se recogió el sobrenadante como la población GR6A04<->mientras que las microesferas y células unidas se recogieron como la población GR6A04<+>. Se lavaron ambas fracciones y se sometieron a la gradilla magnética 3 veces. Las microesferas y células unidas se incubaron finalmente con ADNasa I para liberar las células de las microesferas Dynabeads. Las células se sembraron en matraces de cultivo de tejidos T75 a una densidad de 2,5x106 células por matraz.
Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Se midió la actividad de ADCC utilizando un bioensayo de informador (Promega, ADCC Reporter Bioassay, n.° G7010). Se llevó a cabo el bioensayo de ADCC siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron células PC-9 y A549 a razón de 5.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos negras de fondo transparente de 96 pocillos (Corning, n.° 3904) en medio sérico bajo en IgG al 4 % (Promega, n.° G711A) y se dejó que se adhiriesen y multiplicasen durante la noche. Las diluciones en serie de GR6A04_hu se incubaron en pocillos por triplicado durante aproximadamente 15 min a 37 °C con 5 % de CO<2>. Tras la incubación, las células efectoras manipuladas se añadieron a los pocillos a razón de aproximadamente 150.000 células por pocillo. Tras 6 horas, se añadió sustrato de ensayo de luciferasa Bio-Glo<™>(Promega, n.° G719A y n.° G720A) a los pocillos y se midió la luminiscencia utilizando el lector de microplacas Infinite<®>200 (Tecan).
Ensayo de viabilidad celular luminiscente de proliferación CellTiter-Glo (CTG).
Se sembraron células en una placa de 96 pocillos recubierta negra (Grenier Bio-one, Reino Unido) en un rango de densidades entre 1000 y 5000 células por pocillo (según el tipo celular utilizado) y 90 j l por pocillo. A continuación, la placa se incubó durante 24 horas a 37 °C en un incubador con aire humidificado y 5 % de CO<2>. Tras 24 horas, se añadieron 10 j l de mAb o tampón a cada pocillo y placa se introdujo nuevamente a 37 °C en un incubador con aire humidificado y 5 % de CO<2>. Cuatro días después de la adición de mAb o tampón, se añadieron a cada pocillo 100 j l de sustrato de CTG (Promega, Wisconsin, EE. UU.). Seguidamente se dejó la placa en la oscuridad durante 10 minutos, bajo agitación vigorosa. A continuación, se cuantificó la viabilidad celular de las muestras utilizando un Tecan I-control (Tecan, Suiza).
Conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC).
Se conjugaron GR6A04 y un anticuerpo comercial de isotipo de IgG1 de ratón (clon MG1.45, de BioLegend) directamente con toxina M<m>AE (Moradec, San Diego, EE. UU.) a una relación fármaco-anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) de 3,0 y 3,3, respectivamente. Se estableció la curva de dosis-respuesta para los mAb conjugados con el ensayo de CTG en un rango de diluciones en serie de 0 a 4,5 pg/ml. Se midió la viabilidad celular de las células 4 días después del tratamiento, tal como se ha descrito anteriormente.
Modelo de xenoinjerto in vivo.
Se establecieron modelos de xenoinjerto utilizando células A549-GR6A04+ en ratones desnudos NCr. Se mezclaron 5x106 células en medio basal DMEM en una proporción 1:1 con Matrigel y se inyectaron por vía subcutánea en un volumen de 200 pl. Se dejó que se formasen los tumores y alcanzasen un tamaño >150 mm3 antes de aleatorizarse a 5 grupos de 5 ratones cada uno. Los grupos se trataron con mAb de la manera siguiente: (1) Control de tampón, (2) GR6A04-MMAE, (3) GR6A04_hu, (4) g R6A04, (5) control de isotipo MG1.45-MMAE. Se inyectaron mAb mediante inyección en la vena de la cola en un volumen total de 100 pl. Cada dosis, en caso de ser aplicable, era de 200 pg (equivalentes a 10 mg/kg) y el tratamiento se llevó a cabo cada 4 días para un total de 3 dosis (días 0, 4 y 8). Se realizó un seguimiento del tamaño tumoral durante 50 días.
Resultados y comentario.
Generación de panel de mAb resistentes a GR.
Se identificó GR6A04 como parte de un panel de anticuerpos monoclonales (mAb) generado contra adenocarcinoma pulmonar PC-9 con resistencia adquirida a gefitinib, un inhibidor de molécula pequeña del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés). Se generaron los clones de PC-9 resistentes a gefitinib (GR, por sus siglas en inglés) mediante cultivo en concentraciones crecientes de gefitinib hasta obtener una línea estable a una concentración de gefitinib de 6,4 pM. Lo anterior se utilizó como sustitutivo de la resistencia adquirida a gefitinib observada en pacientes de cáncer de pulmón bajo tratamiento con el compuesto.
Se utilizaron tres clones de PC-9 resistentes a gefitinib (CL75, CL86 y CL131) para la inmunización de ratones Balb/c en un protocolo semicíclico (fig. 1). Se sacrificaron los ratones en la semana 6 y se fusionaron las células B con células de mieloma de ratón Sp2/0 utilizando el kit ClonaCell™-HY de STEMCELL Technologies y se obtuvieron los clones de hibridoma productores de mAb. Los mAb de dicho panel de GR se cribó para la unión a las líneas inmunizadoras, mediante citometría de flujo, de las que se identificó GR6A04 como uno de los candidatos líderes de unión de dicho panel.
Unión de GR6A04 en líneas celulares según citometría de flujo.
GR6A04 demostró una fuerte reactividad (>50 %) con los tres clones de PC-9 resistentes a gefitinib utilizados para la inmunización, con el porcentaje de unión positivo determinado a partir del canal FL-1 seleccionado a 2 % del control de solo anticuerpo secundario (fig. 2). La tinción con yoduro de propidio en el canal FL-3 también mostró la ausencia aparente de citotoxicidad celular al incubar las células con el mAb por sí solo. También se sometió a ensayo la unión de GR6A04 en la línea celular PC-9 parental sensible a gefitinib, y en otro clon PC-9 GR no utilizado en la inmunización, con un nivel de unión similarmente elevado de ambas líneas. Estos datos de unión de citometría de flujo se resumen en la fig. 3A.
La unión en la citometría de flujo de GR6A04 también se sometió a ensayo en otras líneas de NSCLC, con unión parcial en 2 de las 4 líneas sometidas a ensayo (A549 y Calu-3). Los clones GR de otra línea de adenocarcinoma pulmonar, HCC827, también se obtuvieron mediante el cultivo en concentraciones crecientes de gefitinib. Se observó la unión de GR6A04 en 2 de 6 de dichos clones HCC827 GR. Además, la unión en otras indicaciones de cáncer también mostró reactividad con GR6A04 en 3 de 13 líneas de cáncer de mama y en 1 de 2 líneas de cáncer colorrectal sometidas a ensayo. La unión de GR6A04 en las diferentes indicaciones de cáncer se resumen en la fig. 3B-E.
Cabe destacar que, utilizando el mismo método de tinción, se encontró que la unión de GR6A04 en la superficie celular de las células normales era despreciable (<8 %) al someterla a ensayo con diversas líneas celulares normales, incluyendo fibroblastos, células endoteliales y epiteliales, y células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) primarias, tal como se resume en la fig. 3F.
En resumen, las características de unión según citometría de flujo de GR6A04 son: a) GR6A04 se une a la superficie celular de los clones de PC-9 y sus derivados resistentes a gefitinib según la citometría de flujo, b) GR6A04 muestra reactividad respecto a otras líneas de cáncer NSCLC, mamario y colorrectal, y c) no se observa reactividad cruzada con las líneas celulares normales sometidas a ensayo.
Caracterización de mAb de GR6A04 y derivados.
Se determinó que el isotipo del mAb de GR6A04 era de un subtipo IgG1 de ratón, según se determinó con el kit de isotipado rápido de anticuerpos Pierce™, en la fig. 4A. Se determinaron las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada variable (V<h>) y de la cadena ligera variable (V<l>), en la fig. 4B, mediante la utilización de cebadores degenerados para las inmunoglobulinas de ratón. Se purificó GR6A04 a partir del sobrenadante del cultivo de hibridoma utilizando la matriz de afinidad de IgG-Fc (ms) CaptureSelect™ con el sistema ÁKTA avant.
Se prepararon dos derivados de GR6A04 y se caracterizaron: un conjugado de anticuerpo-fármaco con monometilauristatina E (MMAE) (GR6A04-MMAE) y un mAb quimérico humano con V<h>y V<l>clonado en un esqueleto de región constante de Ig humana (GR6A04_hu).
Se conjugó GR6A04-MMAE con MMAE en una proporción de fármaco a anticuerpo (DAR) de 3,0 y, simultáneamente, un anticuerpo IgG1 de ratón comercial (clon MG1-45 de BioLegend) a una DAR de 3,3 utilizando la misma química (fig. 4C). La unión de GRA04-MMAE en células PC-9 y A549 se sometió a ensayo mediante citometría de flujo y se encontró que era comparable a GR6A04 no conjugado, mientras que se determinó que MG1-45-MMAE presentaba una unión despreciable en dichas dos líneas.
Se expresó GR6A04_hu en células CHO y el anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando el mismo sistema de GR6A04. Se comprobó GR6a04_hu purificado para el tamaño correcto de proteína a partir de la tinción de azul de Coomassie en SDS-PAGE con la cadena pesada y la cadena ligera en los tamaños esperados de 50 kDa y 25 kDa, respectivamente, en el carril reductor, y la IgG intacta a 150 kDa en el carril no reductor. De manera similar, la unión de GR6A04_hu en PC-9 y A549 era comparable a la de GR6A04 según la citometría de flujo, tal como se muestra en la fig. 5E.
GR6A04 se une a CEACAM6 N-glucosilado.
La transferencia Western de los lisados de células PC-9 se inmunotransfirió con GR6A04 y se encontró que reconocía un patrón entre 55 y 90 kDa en el carril no reductor, mostrado en la fig. 5. La intensidad de unión a antígeno también era más débil bajo condiciones reductoras. Además, el tratamiento del lisado celular mediante PNGasa para eliminar los glicanos N-ligados también anuló la unión de GR6A04 a la banda del antígeno, demostrando la importancia de la N-glucosilación en el sitio de reconocimiento del anticuerpo.
La inmunoprecipitación (IP) con GR6A04 contra el lisado de células PC-9 enriquecido para el antígeno se extrajo y se envió para la identificación mediante espectrometría de masas (fig. 6A). La lista de proteínas se ordenó según la puntuación global basada en la cobertura de la proteína y el número de péptidos únicos observados, y se comparó con la lista de proteínas del control de columna. Los 5 antígenos putativos principales se muestran en la tabla en la fig. 6B y se validaron mediante IP cruzada con un anticuerpo anti-CEACAM6 comercial (clon 9A6 de Santa Cruz/Abcam) (fig. 7A) e inactivación transitoria con ARNip de CEACAM6 en células PC-9 (fig. 7B).
Puede concluirse que el antígeno diana de GR6A04 es CEACAM6, de manera que el N-glicano es importante para el reconocimiento de anticuerpo-antígeno.
Unión de GR6A04 en muestras de tejido FFPE de pacientes.
Tras establecer que GR6A04 es específico de diversas indicaciones de cáncer en la citometría de flujo, y que no se une a células normales, los presentes inventores pasaron a determinar la unión de GR6A04 en muestras de tejido de pacientes de cáncer en micromatrices de tejidos (TMA) fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). Se obtuvieron TMA FFPE comerciales de Pantomics.
Las condiciones de unión de GR6A04 para las muestras FFPE se optimizó con pellets de línea celular FFPE y se determinó que era de 5 pg/ml con una etapa de recuperación de antígeno a pH 9. Se observó que GR6A04 se localizaba tanto en la membrana como en el citosol de las células PC-9. Para ampliar el perfil de unión de GR6A04 a otras líneas celulares de cáncer, se llevó a cabo inmunohistoquímica (IHQ) en unas matrices de líneas celulares FFPE que cubría un abanico más amplio de indicaciones de cáncer. Se encontró que GR6A04 era reactivo en líneas celulares de cáncer gástrico, pulmonar, colorrectal y pancreático (fig. 8).
También se llevó a cabo la tinción de IHQ de diversas TMA FFPE que cubrían muestras de tejido de cáncer de un amplio abanico de orígenes orgánicos. Se puntuó la tinción de GR6A04 con el software de código abierto: ImmunoMembrane. En una amplia mayoría de muestras de punción gruesa de tejido se observó tinción positiva (2+ y 3+); la unión se localizaba en la membrana celular. También se observó cierta tinción no específica en regiones necróticas. La tinción de IHQ en TMA multitumorales corroboró lo observado en el cribado de líneas celulares, en el que los presentes inventores observaron que, además de para el cáncer de pulmón, GR6A04 también era altamente reactivo con, aunque sin limitación, cáncer gastrointestinal (GI) y cáncer de mama (figs. 9 a 11). En una matriz centrada en NSCLC, GR6A04 mostró tinción positiva para 15 % de las muestras de punción gruesa de cáncer de células escamosas y 50 % de las de adenocarcinoma pulmonar representadas en la t Ma . Cabe destacar que el tejido normal contiguo no mostró ninguna tinción positiva, demostrando la especificidad de GR6A04 para el tejido canceroso (figs.
12 y 13).
Además, se sometió a ensayo GR6A04 contra tejidos normales FFPE utilizando el mismo protocolo de tinción y sistema de clasificación. Se utilizó una TMA recomendada por la FDA (MNO961), que contiene 35 sitios anatómicos diferentes (fig. 14). No se observó tinción de GR6A04 en 93 de las 96 muestras de punción gruesa presentes, aunque 2 de 3 muestras de colon y 1 de 3 muestras de próstata eran débilmente positivas (2+). Debe indicarse que, a partir de las imágenes ampliadas, la tinción en estos casos era principalmente intracelular o estaba presente en regiones necróticas.
Por lo tanto, GR6A04 ha demostrado especificidad hacia un amplio abanico de diferentes indicaciones de cáncer en muestras de tejidos de pacientes y presenta una tinción despreciable de los tipos de tejido normales, corroborando los perfiles de unión anteriores de los presentes inventores obtenidos mediante citometría de flujo y cribado de base celular.
Especificidad incrementada de GR6A04 debido al sitio de reconocimiento de glicano.
El anticuerpo anti-CEACAM6 comercial utilizado para la validación anterior es uno que no era sensible a los cambios en la glucosilación de CEACAM6 (es decir, el sitio de reconocimiento no es dependiente de glicanos). Lo anterior queda demostrado en la fig. 15A, en la que se muestra que las intensidades de unión se mantienen sin cambios después del tratamiento de PNGasa y tunicamicina, al contrario que GR6A04.
Al comparar los dos anticuerpos anti-CEACAM6 (GR6A04 y comercial) en una micromatriz de líneas celulares FFPE, aunque los perfiles de tinción eran en gran medida similares, el anticuerpo comercial presentaba una muestra de tinción adicional en HCC827, mientras que BxPC3 (línea de cáncer pancreático) también mostró una tinción más intensa e intracelular (fig. 15B).
Dicha aparente no especificidad del anticuerpo anti-CEACaM6 comercial también se observó en la TMA de tejidos normales (MNO961), en la que 11 de 95 muestras de punción gruesa presentaron tinción positiva, frente a solo 3 muestras con GR6A04. Cabe destacar que la totalidad de los tres tejidos pulmonares normales y 2 tejidos de bazo normales mostró tinción sobre la membrana celular (fig. 16).
Las diferencias en los perfiles de tinción podrían atribuirse a las diferencias en los sitios de unión de epítopos sobre CEACAM6, especialmente los surgidos por los N-glicanos sobre CEACAM6. Lo anterior permitió un grado adicional de especificidad además de la unión a proteína CEACAM6 solamente, lo que lleva a una unión no específica reducida en los tejidos normales. Esto es importante, ya que proporciona un nivel adicional de seguridad en el caso de que se desarrolle GR6A04 terapéuticamente.
Características de las subpoblaciones de A549 GR6A04+.
La línea celular de adenocarcinoma pulmonar A549 es un buen modelo biológico para investigar el papel de la expresión de CEACAM6 glucosilado en el cáncer debido a la unión heterogénea de GR6A04, con una población GR6A04+ pequeña, de 15-30 % (fig. 17A). Mediante la utilización de la separación magnética con el kit de IgG de ratón CELLection™ Pan, se pudieron conseguir enriquecimientos tanto para GR6A04' como para GR6A04+. Aunque debe indicarse que se observó una reducción de la unión de GR6A04 con pases crecientes en cultivo. Lo anterior puede mitigarse con múltiples rondas de separación consecutiva, y tras 7 rondas de aislamiento para células GR6A04+ y 5 rondas para células GR6A04', se obtuvieron líneas diferenciales estables, denominadas en consecuencia A549-GR6A04+ y A549-GR6A04', respectivamente (figs. 17B y C). Además, se aislaron clones de células individuales a partir de cultivos A549-GR6A04+ que mostraron una fuerte unión homogénea de GR6A04 (clones D5, D7 y S4). Se observó que estas presentaban una morfología diferente en diferentes clones (figs. 17D y E). En particular, los clones D5 mostraron agregaciones densas de morfología redonda; D7 mostró células de forma ahusada y S4 mostró una morfología de tipo SCLC con crecimiento independiente de la adhesión.
Se midió la expresión de EGFR y CEACAM1 mediante citometría de flujo en dichas subpoblaciones y también en la línea parental. Aunque la expresión de dichos dos marcadores en células A549-GR6A04- y en las A549 parenterales era similar, las células A549-GR6A04+ presentaban una expresión muy inferior de EGFR (reducción de 25 % de la intensidad media de fluorescencia, IMF) y también se observó un incremento de la unión de CEACAM1 (fig. 18).
También se encontró que la expresión de GR6A04 afectaba a la tumorigenicidadin vivo.En un modelo de xenoinjerto A549 en ratones desnudos, en el Que se inyectaron por vía subcutánea el mismo número inicial de células, las células A549-GR6A04+ formaron xenoinjertos más grandes que las células A549 parentales (fig. 19A). Al disociar el xenoinjerto el final del día 50 de estudio, también se encontró que el porcentaje de GR6A04 en los xenoinjertos obtenidos a partir de las células A549 parentales se incrementó desde aproximadamente 20 % en el punto de inyección a >70 % el día 50 (fig. 19B).
Para establecer si GR6A04 podría tener una posible aplicación como biomarcador sérico de cáncer pulmonar, se

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende un VHCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos GNTFTSYVMH (SEC ID n.° 3), un VHCDR2 que presenta la secuencia de aminoácidos YINPYNDGTKYNEKFKG (SEC ID n.° 4), un VHCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos STARATPYFYAMDY (SEC ID n.° 5) y (ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende un VLCDR1 que presenta la secuencia de aminoácidos KSSQSLLWSVNQNSYLS (s Ec ID n° 6), un VLCDR2 que presenta la secuencia de aminoácidos GASIRES (SEC ID n.° 7), y un VLCDR3 que presenta la secuencia de aminoácidos QHNHGSFLPYT (SEC ID n.° 8), en el que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un glicano en CEACAM6.
  2. 2. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en la reivindicación 1, en el que la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYN EKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGT SVTVSS tal como se indica en la SEC ID n.° 1; opcionalmente en el que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos indica en la SEC ID n.° 1, opcionalmente en el que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYG ASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEI K tal como se indica en la SEC ID n.° 2, opcionalmente en el que la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n.° 2
  3. 3. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, recombinantes, policlonales, quiméricos, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, Fv de cadena sencilla, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo univalente que carece de una región bisagra, un minicuerpo y diacuerpos, opcionalmente en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en el que el anticuerpo monoclonal es uno humanizado, opcionalmente en el que el anticuerpo monoclonal es quimérico.
  4. 4. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un isótopo radioactivo o una citotoxina conjugada con el mismo, opcionalmente en el que el anticuerpo se conjuga con una citotoxina seleccionada del grupo que consiste en monometil-auristatina E (MMAE), mertansina (DM-1), saporina, gemcitabina, irinotecán, etopósido, vinblastina, pemetrexed, docetaxel, paclitaxel, agentes de platino (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino), vinorelbina, capecitabina, mitoxantrona, ixabepilona, eribulina, 5-fluorouracilo, trifluridina y tipiracilo.
  5. 5. Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se internaliza en una célula tras la unión a CEACAM6.
  6. 6. Composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que opcionalmente comprende uno o más compuestos terapéuticos adicionales.
  7. 7. Anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o composición según se reivindica en la reivindicación 6, para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer.
  8. 8. Anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para la utilización según la reivindicación 7, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón resistente a gefitinib, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico y cáncer colorrectal, opcionalmente en el que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, debe administrarse con uno o más ingredientes farmacéuticos activos adicionales o con quimioterapia; opcionalmente en el que el ingrediente o ingredientes farmacéuticos activos o quimioterapia adicionales deben administrarse por separado, simultánea o secuencialmente con dicho anticuerpo o con un fragmento de unión a antígeno del mismo.
  9. 9. Método para la detección de cáncer en un sujeto o para la identificación de un sujeto que es susceptible de sufrir cáncer, en el que el método comprende: poner en contacto una muestra obtenida del sujeto con un anticuerpo, o con un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5in vitro;la detección de la unión del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la muestra; la correlación de la unión con el nivel de unión en una muestra de control para determinar el nivel de unión en la muestra, en donde un incremento del nivel de unión en la muestra respecto a la muestra de control es indicativo de cáncer o indica que el sujeto es susceptible de sufrir cáncer.
  10. 10. Método según la reivindicación 9, en el que la muestra de control procede del mismo sujeto o de un sujeto diferente, opcionalmente en el que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un marcaje detectable; opcionalmente en el que el marcaje detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje enzimático y un marcaje de radionucleido; opcionalmente en el que el marcaje detectable se selecciona del grupo que consiste en biotina, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, FITC, PE y pigmentos Cy; opcionalmente en el que el marcaje detectable se detecta en un ensayo seleccionado de entre citometría de flujo, sección de tejido, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica e inmunohistoquímica.
  11. 11. Método según se reivindica en la reivindicación 9 o 10, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer pulmonar resistente al gefitinib, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer del intestino delgado, cáncer esofágico y cáncer colorrectal.
  12. 12. Utilización de un kit en el método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el kit comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, junto con instrucciones de utilización.
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