ES2625742T3 - Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado que: a) se une al dominio A3-B3 de proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis; y b) no reacciona de manera cruzada significativamente con CEACAM1 humana, CEACAM6 humana, CEACAM7 humana, CEACAM8 humana, CEACAM1 de Macaca fascicularis, CEACAM6 de Macaca fascicularis, y CEACAM8 de Macaca fascicularis

Description

Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos
La presente invención describe anticuerpos que se unen específicamente a proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fasócularis, así como ácidos nucleicos aislados, vectores y células hospedantes que comprenden una secuencia que codifica dichos anticuerpos. La invenciórJ también describe inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos conjugados o unidos a un agente inhibidor del crecimiento, ya composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos o inmunoconjugados de la invención. La invención describe el uso de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención para el tratamiento de cáncer o para fines de diagnóstico
El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una glicoproteína implicada en la adhesión celular. El CEA fue por primera vez identificado en 1965 (Gold Y Freedman, J Exp Med, 121 , 439, 1965) como una proteína que se expresa normalmente en el intestino fetal durante los primeros seis meses de gestación, y se encuentra en cánceres del páncreas, hígado y colon. La familia del CEA pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La familia del CEA, que consiste en 18 genes, se subdivide en dos subgrupos de proteinas: el subgrupo de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM) y el subgrupo de glicoproteínas específicas del embarazo (Kammerer y Zimmermann, 8MC 8iology 2010, 8:12).
En los seres humanos, el subgrupo CEACAM consiste en 7 miembros: CEACAM1 , CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8. Numerosos estudios han mostrado que CEACAM5, el cual es idéntico al CEA identificado originalmente, se expresa altamente en la superficie de las células de tumor colorrectal, gástrico, de pulmón, de mama, de próstata, de ovario, de cuello uterino así como de vejiga, y se expresa débilmente en muy pocos tejidos epiteliales normales tales como células epiteliales columnares y células caliciformes en el colon, células mucosas del cuello en el estómago y células epiteliales escamosas en el esófago y cuello uterino (Hammarstrom et al, 2002, en quot;Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications· Eds. Diamandis E. P. et al., MCC Press, Washington p. 375). De este modo, el CEACAM5 puede constituir una diana terapéutica adecuada para las estrategias dirigidas especificamente de tumor, tales como inmunoconjugados. La presente invenciórJ proporciona anticuerpos monoclonales dirigidos contra CEACAM5, y muestra que éstos pueden conjugarse con un agente citotóxico para inducir una actividad citotóxica capaz de matar células tumorales in vitro y para inducir regresión tumoral in vivo
Los dominios extracelulares de los miembros de la familia de la CEACAM están compuestos por dominios repetidos similares a inmunoglobulina (similares a Ig) que se han clasificado en 3 tipos, A, 8 Y N, de acuerdo con homologías de secuencia. El CEACAM5 contiene siete de dichos dominios, concretamente N, A1, 81, A2, 82, A3 Y 83
Los dominios A1 , A2 Y A3 de CEACAM5, por una parte, y los dominios 81 , 82 Y 83, por otra parte, muestran altas homologías de secuencia, presentando los dominios A de CEACAM5 humana de 84 a 87% de similitud de secuencia por parejas, y los dominios 8 de 69 a 80%. Además, otros miembros de la CEACAM humana que presentan dominios A ylo 8 en su estructura, concretamente CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8, muestran homología con CEACAM5 humana. En particular, los dominios A y 8 de la proteína humana CEACAM6 presentan homologías de secuencia con los dominios A1 y A3, Y cualquiera de los dominios 81 a 83 de CEACAM5 humana, respectivamente, que son incluso mayores que las observadas entre los dominios A y los dominios 8 de CEACAM5 humana
Se generaron numerosos anticuerpos anti-CEA con fines de diagnóstico o terapéuticos dirigidos a CEA. La especificidad frente a antígenos relacionados siempre se ha mencionado como una preocupación en este campo, como un ejemplo lo ha hecho Sharkey et al (1990, Cancer Research 50, 2823). Debido a las homologías mencionadas anteriormente, algunos de los anticuerpos previamente descritos pueden demostrar uniórJ a epitopos repetitivos de CEACAM5 presentes en los diferentes dominios de inmunoglobulina y mostrar reactividad cruzada frente a otros miembros de CEACAM tales como CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7, o CEACAM8, careciendo de especificidad frente a CEACAM5. La especificidad del anticuerpo anti -CEACAM5 es deseada a la vista de terapias dirigidas a CEA de manera que se una a células tumorales que expresan CEACAM5 humana, pero que no se una a algunos tejidos normales que expresan los demás miembros de CEACAM. Es importante destacar que se ha descrito que CEACAM1, CEACAM6 Y CEACAM8 son expresadas por neutrófilos de primates humanos y no humanos (Ebrahimmnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao el al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), en los que han mostrado que regulan la granulopoyesis y que juegan un papel en la respuesta inmune
Se ha descrito un conjugado de fármaco de anticuerpo anti-CEACAM6, tal como el anticuerpo anti-CEACAM6 con mailansinoide desarrollado por Genenlech ((Slrickland el al, 2009 J Palhol, 218, 380), que se ha moslrado que induce toxicidad hematopoyética dependiente de CEACAM6 en primates no humanos. Esta toxicidad, atribuida a la acumulación del conjugado de fármaco y anticuerpo en la médula ósea y a la depleción de granulocitos y sus precursores celulares, se consideró por los autores como un problema de seguridad importante. Así, más precisamente, para fines terapéuticos, la reactividad cruzada de un anticuerpo anti-CEACAM5 con CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, o CEACAM8 puede disminuir el índice terapéutico del compuesto por toxicidad incrementada en los tejidos normales Asi, existe una fuerte ventaja en obtener anticuerpos dirigidos específicamente a CEACAM5 que no reaccionarían de manera cruzada con otras moléculas de la familia de la CEACAM, especialmente para uso como un conjugado de anticuerpo fármaco (ADC) o con cualquier otro modo de acción que da como resultado la muerte de la célu la diana
Además, como se describe que CEACAM5 se expresa, aunque a un nivel bajo, en algunos tejidos celulares normales, es crítico desarrollar anticuerpos anti -CEACAM5 capaces de unirse a CEACAM5 humana así como a CEACAM5 de mono macaco (Macaca fascicu/aris ), ya que dichos anticuerpos pueden ensayarse fácilmente en estudios toxicológicos preclínicos en monos macacos para evaluar su perfil de seguridad. Como se ha mostrado que la eficacia de los anticuerpos terapéuticos puede depender de la localización del epítopo en la diana, tanto en el caso de los anticuerpos funcionales (Doern et al. 2009, J. BioL Chem 2S4 10254) como en el caso en el que están implicadas funciones efectoras (Beers et al. Semin Hematol 47:107-114), tiene que mostrarse que un anticuerpo con reactividad cruzada humano/mono se une a epítopos en el mismo dominio homólogo repetido semejante a 19 de proteínas humanas y de mono macaco.
Combinando la necesidad de la reactividad cruzada en especies de dichos anticuerpos con la especificidad para CEACAM5 humana y de Macaca fascicu/aris, es decir, sin reactividad cruzada con otros miembros de CEACAM de Macaca fascicu/aris y humanos, se añade un grado adicional de complejidad, dadas las homologías de secuencia globales entre las proteínas de CEACAM humanas y de Macaca fascicu/aris .
De hecho, el alineamiento global por parejas de la secuencia de CEACAM5 de Macaca fascicularis con la secuencia de CEACAM5 humana (AAA51967,1/GI:180223, 702 aminoácidos) indicó solo un 78,5% de identidad. Los genes de CEACAM1 , CEACAM5, y CEACAM6 de Macaca fascicu/aris se clonaron, y se realizó un alineamiento global de los dominios A, B Y N humanos y de Macaca fascicu/aris. Este alineamiento predijo que hay muy pocas regiones, si hay alguna, para loca lizar un epítopo ideal que sería común a CEACAM5 humana y de macaco y no compartida por ningún otro miembro de la fam ilia. Por estas razones, se esperaba que el desarrollo de anticuerpos con reactividad cruzada entre CEACAM5 humana y de Macaca fascicu/a ris sin reactividad cruzada con otros miembros de CEACAM humanos y de Macaca fascicularis tuviera una baja probabilidad de éxito_De fOnTIa importante, los anticuerpos anti CEACAM5 descritos previamente casi nunca se documentaron para reactividad cruzada con Macaca fascicu/aris , con muy pocas excepciones (MT111 , véase más adelante)
Los anticuerpos anti-CEACAM5 humana ya se han usado en ensayos clínicos, tales como Immunomedics labetuzumab (también conocido como hMN14, Shar1lt;ey et al, 1995, Cancer Research 55, 5935). Se ha mostrado que este anticuerpo no se une a antígenos relacionados (Blumenthal et al., Cancer Research, vol. 65, nO 19, 2005, 8809-8817), pero no reacciona de manera cruzada con CEACAM5 de Macaca fascicu/aris. De fOfma importante, el anticuerpo MT111 de Micromet (también conocido como anticuerpo MEDI-565 de Medlmmune) es un anticuerpo biespecífico que se une a CEACAM5 humana y CD3 humana (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641; documento WO 2007(071426). Se afirma que MT111 se ha creado por la fusión de un fragmento variable de cadena única (scFv) a partir de un anticuerpo que reconoce CEACAM5 humana y de macaco con scFv de un ant icuerpo que reconoce CD3 humana (póster de Oberst et al., AACR Annual Meeting April 2009 Denver, COl. También se ha dado a conocer que MT111 no se une a otros miembros de la familia de la CEACAM (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). MT111 se une a un epítopo conformacional en el dominio A2 de CEACAM5 humana. Este epítopo conformacional no está presente en una variante de corte y empalme de CEACAM5 humana, que se expresa concomitantemente con CEACAM5 de longitud completa en tumores (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641 ). Además, no hay evidencia de que MT111 se una al mismo epítopo en CEACAM5 de Macaca fascicularis
En un intento de producir nuevos anticuerpos frente a la proteína de superficie CEACAM5 con características óptimas para fines terapéuticos, los inventores han inmunizado ratones con proteínas recombinantes y con células tumorales. Han cribado cientos de hibridomas usando ELlSA en varias proteínas recombinantes de la familia de la CEACAM, y citometría de Hujo con líneas celulares relevantes, con el fin de seleccionar solo inmunoglobulinas (lgG) con el perfil ventajoso. Inesperadamente, fueron capaces de seleccionar clones de hibridoma y producir 19G maduras correspondientes que comprenden todas las caracteristicas deseadas. Se unen específicamente al dominio A3-B3 de CEACAM5 humana con una alta afinidad, y no reconocen las proteínas humanas CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7 Y CEACAM8. En un contexto celular, estos anticuerpos presentan una alta afinidad por células tumorales (en el intervalo nanomolar). Además, estos anticuerpos también se unen a la proteína CEACAM5 de Macaca fascicularis con una relaciórl de afinidad monolhumana menor o igual a 10. Los anticuerpos de la invención se unen especfficamente al domínío A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularis, y no reconocen otros míembros de la famil ia de la CEACAM de Macaca fascicu/aris.
Seleccionando como diana el dominio A3-B3 de CEACAM5, estos anticuerpos tienen un potencial incrementado dirigido a tumores, ya que tienen la capacidad de unirse tanto a CEACAM5 humana de longitud completa como a su variante de corte y empalme identificada por Peng et al. (PLoS ONE 7(5): e3641 )
Finalmente, se describe en la bibliografia que CEACAM5 es una proteína de superficie con poca intemalizaciórl (revisado en Schmidt et al, 2008, Cancer Immunol. ImmullOther. 57, 1879), Y por lo tanto puede no ser una diana favorable para los conjugados de anticuerpo fármaco. A pesar de lo que se ha dado a conocer en la técnica anterior, los inventores han mostrado que los anticuerpos que han producido son capaces de intemalizar el complejo CEACAM5-anticuerpo después de la uniórl, e inducir actividad citotóxica en células tumorales in vitro cuando se combinan con un agente citotóxico. Los mismos anticuerpos combinados con un agente citotóxico también son capaces de inhibir de forma importante el crecimiento tumoral en ratones que presentan tumores humanos de coloo y estómago primarios
Oefiniciooes
5 Tal y como se usa en el presente documento, quot;CEACAM5quot; designa la quot;molécula de adhesiÓfl celular 5 relacionada con antíqeno carcinoembriooarioquot;, también conocida como ·C066equot; (Grupo de Oiferendadón 66e) o CEA. CEACAM5 es una glicoproteína implicada en la adhesión celular. CEACAM5 se expresa altamente en particular en la superficie de las células de tumor colorrectal, gastrico, de pulmón y uterino.
Una secuencia de referencia de CEACAM5 humana de longitud completa, incluyendo el péplido señal (posiciones 1
10 34) Y propéptido (posiciones 686-702), esta disponible en la base de datos GenBank con el número de registro AAA51967,1 (SEO ID NO:52). Se han identificado cinco SNP no sinónimos con una frecuencia mayor del 2% en la población caucásica, estando cuatro de ellos localizados en el dominio N (en las posiciones 80, 83, 112, 113), el último en el dominio A2 (en la posidón 398) de CECAM5 humana (SEO ID NO:58). GenBank AAA51967,1 contiene el haplotipo principal (180, V83, 1112, 1113 Y E398)
15 Una secuencia del dominio exlracelular de CEACAM5 de Macaca fascicularis, clonada por los inventores, se describe en SEO ID NO:53
Un quot;dominioquot; puede ser cualquier región de una proteína, definida generalmente sobre la base de homologías de
secuencia y relacionada frecuentemente con una entidad estructural o funciooal específica. Se sabe que los
miembros de la familia de la CEACAM estan compuestos por dominios similares a Ig. El término dominio se usa en
20 este documento para designar ya sea dominios similares a Ig individuales, tal como quot;dominio Nquot; o para grupos de dominios consecutivos, tal como quot;dominio A3-B3quot;
La organización de los dominios de CEACAM5 humana es como sigue (basado en la secuencia Gen8ank AAA51967.1, SEO ID NO:52):
Dominios de CEACAM5 humana
Posiciones en SEO ID NO:52
Dom inio N
35-142
OominioA1
143 -237
Dominio 81
238 -320
OominioA2
321 -415
Dominio 82
416 -498
DominioA3
499 -593
Dominio 83
594 -685
De acuerdo con esto, el dominio A3-83 de CEACAM5 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 499685 de SEO ID NO:52.
La organización de los dominios de CEACAM5 de Macaca fascicularis es como sigue (basado en la secuencia clonada del dominio extracelular; SEO ID NO:53):
Dom inios de CEACAM5 de Macaca fascicularis
Posiciones en SEO 10 NO:53
Dominio N A1 -B1
-1 286
Dominio A2 82
287 -464
Dominio A3-83
465 -654
De acuerdo con esto, el dominio A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularls coosiste en los am inoacidos en las posiciones 465-654 de SEO ID NO:53.
Una quot;secuencia codificantequot; o una secuencia ~que codificaquot; un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido,
proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de
ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia codificante para una proteína puede incluir un codón de inicio (habitualmente ATG) y un codón de parada
Tal y como se usa en el presente documento, las referencias a proteínas específicas (por ejemplo, anticuerpos) pueden incluir un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos nativa, así como variantes y formas modificadas independientemente de su origen o modo de preparación. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos nativa es una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos como se obtiene de la naturaleza. Dichas proteínas con secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden prepararse usando métodos estándar recombinantes ylo sintéticos. Las proteínas con secuencia nativa engloban específicamente formas naturales truncadas o solubles, formas naturales variantes (por ejemplo, formas con corte y empalme alternativo), variantes y formas alélicas naturales incluyendo modificaciones post-traduccionales. Las proteínas con secuencia nativa incluyen proteínas que portan modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación, o fosforilación, u otras modificaciones de algunos restos de aminoácidos.
El término quot;genquot; significa una secuencia de ADN que codifica, o corresponde a, una secuencia particular de aminoácidos que comprende todo o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede o no incluir secuencias de AON reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones en las que el gen se expresa. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse a partir de AON en ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción del ADN En particular, el término gen puede estar destinado para la secuencia genómica que codifica una proteína, es decir, una secuencia que comprende secuencias reguladoras, promotoras, de intrones y de exones.
Una secuencia quot;al menos 85% idéntica a una secuencia de referenciaquot; es una secuencia que tiene, en su longitud completa, 85%, o más, por ejemplo 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de referencia.
Un porcentaje de quot;identidad de secuenciaquot; puede determinarse comparando las dos secuencias, alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en el que la parte de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idéntico aparece en ambas secuencias para dar como resultado el número de posiciones concordantes, dividiendo el número de posiciones concordantes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar como resultado el pOfcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se rea liza por alineamiento por parejas global, por ejemplo usando el algoritmo de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970). El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse fácilmente por ejemplo usando el programa Needle, con la matriz BLOSUM62, y los parámetros siguientes apertura de espacio = 10, extensión de espacio =0,5.
Una quot;sustitución de am inoácidos conservativaquot; es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga, tamaño o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales con hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteina y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa también pueden definirse tomando como base el tamaño del aminoácido.
Un quot;anticuerpoquot; puede ser un anticuerpo natural o convencional en el que dos cadenas pesadas están unidas entre si por enlaces disulfuro, y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace disulfuro. E:xisten dos tipos de cadena ligera, lambda (1) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgO, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios o re9iones, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1 , CH2 y CH3, referidos colectivamente como CH). Las regiones variables tanto de la cadena ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de unión y especificidad al antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes, tales como asociaciÓn de cadenas del anticuerpo, secreciÓn, movi1idad trans-placentaria, uniÓn de complemento y unión a receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina, y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico Los sitios de combinación del anticuerpo están compuestos por restos que son principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (COR). Ocasionalmente, los restos de las regiones no hipervariables o del marco (FR) influyen en la estructura global del dominio y por lo tanto en el sitio de combinación.
Las Regiooes Determinantes de la Complementariedad o CDR se refieren por lo tanto a secuencias de aminoácidos que conjuntamente definen la afinidad de un ión y especificidad de la región Fv natu ral de un sitio de un ión de una inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L y CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y cadena ligera
quot;Regiones del Marcoquot; (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR, es decir, a aquellas porciones de las regiones variables de cadena ligera y pesada de una inmunoglobulina que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una única especie. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una cuatro FR, designadas FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, Y FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H , respectivamente .
Como se usa en el presente documento, una quot;región del marco humanaquot; es una región del marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85%, o más, por ejemplo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) a la región del marco de un anticuerpo humano que se produce de forma natural.
En el contexto de la invención, la definición CDRlFR en una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina se determina tomando como base la definición de IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgtorg)
Tal y como se usa en el presente documento, el término quot;anticuerpoquot; indica anticuerpos convencionales y fragmentos de éstos, así como anticuerpos de dominio único y fragmentos de éstos, en particular cadena pesada variable de anticuerpos de dominio único, y anticuerpos quiméricos, humanizados, biespecíficos o multiespecíficos
Tal y como se usa en el presente documento, anticuerpo o inmunoglobulina también incluye quot;anticuerpos de dominio únicoquot; que se han descubierto más recientemente y que son anticuerpos cuyas regiones determinantes de la complementa riedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos naturalmente de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, anticuerpos de dominio único preparados por ingeniería. Los anticuerpos de dominio único pueden derivar de cualquier especie, incluyendo, pero no limitado a, ratón, ser humano, camello, llama, cabra, conejo, bovino. los anticuerpos de dominio unico pueden ser anticuerpos de dominio único naturales conocidos como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. En particular, las especies Camelidae, por ejemplo camello, dromedario, llama, alpaca y guanaco, producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos también carecen del dominio CH1
La cadena pesada variable de estos anticuerpos de dominio único desprovistos de cadenas ligeras se conoce en la técnica como quot;VHHquot; o quot;nanocuerpoquot;. De manera similar a los dominios VH convencionales, los VHH cootienen cuatro FR y tres CDR Los nanocuerpos tienen ventajas sobre los anticuerpos convencionales· son aproximadamente diez veces más pequeños que las moléculas de IgG, y consecuentemente nanocuerpos funcionales plegados apropiadamente pueden producirse por expresión in vitro a la vez que se consigue un rendimiento alto. Además, los nanocuerpos son muy estables y resistentes a la acción de proteasas. Las propiedades y producción de nanocuerpos se han revisado por Harmsen y De Haard HJ (App!. Microbio!. Biotechnol 2007 Nov; 77(1):13-22).
La expresión quot;anticuerpo moooclonalquot; o quot;mAbquot;, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de anticuerpo de una única secuencia de aminoácidos, que está dirigido contra un antígeno específico, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Un anticuerpo monoclooal puede producirse por un único clan de células B o hibridoma. pero también puede ser recombinante, es decir, producido por ingeniería de proteínas
La expresión quot;anticuerpo quiméricoquot; se refiere a un anticuerpo preparado por ingeniería que, en su sentido más amplio, contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos. En una realización, un anticuerpo quimérico comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio Cl de otro anticuerpo, en una realización, un anticuerpo humano. Como el animal no humano, puede usarse cualquier animal tal como ratón, rata, hámster, conejo o similares. Un anticuerpo quimérico también puede indicar un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad por al menos dos antígenos diferentes
la expresión quot;anticuerpo humanizadoquot; se refiere a un anticuerpo que tiene un origen no humano completa o parcialmente y que se ha modificado para reemplazar determinados aminoácidos, por ejemplo en las regiones del marco de los dominios VH y VL, con el fin de evitar o minimizar una respuesta inmune en los seres humanos. Los dominios constantes de un anticuerpo humanizado son la mayor parte de las veces dominios CH y CL humanos
quot;Fragmentosquot; de anticuerpos (convencionales) comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en particular la región de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, anticuerpos bivalentes, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de un anticuerpo convencional también puede ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo de cadena pesada o VHH
El término quot;Fabquot; indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera completa están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro. Habitualmente se obtiene entre fragmentos tratando IgG con una proteasa, papaína.
El término quot;F(ab')2quot; se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que 2 fragmentos Fab idénticos unidos por un enlace disulfuro de la región bisagra. Habitualmente se obtiene entre fragmentos tratando IgG con una proteasa, pepsina.
El término quot;Fab'quot; se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente SO,OOO y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.
Un polipéptido Fv monocalenario (quot;scFvquot;) es un helerodímero VH::VL enlazado covalenlemente que habitualmente es expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador que codifica un péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye las CDR que se mantienen en una conformación apropiada, por ejemplo usando técnicas de recombinación génica. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes pueden formarse bien espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o pueden generarse acoplando scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente. quot;dsFvquot; es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. quot;(dsFv)2quot; indica dos dsFv acoplados por un enlazador peptídico
La expresión quot;anticuerpo biespecíficoquot; o quot;BsAbquot; indica un anticuerpo que combina los sitios de unión a antígeno de dos anticuerpos en una única molécula. Así, los BsAb son capaces de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. La ingeniería genética se ha usado cada vez más para diseñar, modificar y producir anticuerpos o derivados de anticuerpos con un conjunto deseado de propiedades de unión y funciones efecloras como se describe, por ejemplo, en el documento EP 2050764 A 1.
La expresión quot;anticuerpo multiespecíficoquot; indica un anticuerpo que combina los sitios de unión a antigeno de dos o más anticuerpos en una única molécula.
El término quot;anticuerpos bivalenlesquot; se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Por medio del uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.
El término quot;hibridoma~ indica una célula que se obtiene sometiendo una célula B preparada mediante la inmunización de un mamífero no humano con un antígeno a fusión celular con una célula de mieloma derivada de un ratón o semejante que produce un anticuerpo monoclonal deseado que tiene una especificidad antigénica
Por quot;purificadoquot; y quot;aisladoquot; se quiere decir, cuando se refiere a una secuencia de polipéptido (es decir, el anticuerpo de la invención) o de nucleótido, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término quot;purificadoquot;, tal y como se usa en el presente documento, significa que están presentes al menos 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, o 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula de ácido nucleico quot;aisladaquot; que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que carece sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente las características básicas de la composición.
Tal y como se usa en el presente documento, el término quot;sujetoquot; indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate Además, un sujeto de acuerdo con la invención es un ser humano.
Anticuerpos
Los inventores han tenido éxito en la generación, cribado y selección de anticuerpos anti-CEACAM5 de ratón específicos que presentan una alta afinidad por la proteína CEACAM5 tanto humana como de Macaca fascicularis y que no reaccionan de manera cruzada significativamente con las proteínas CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas, y con las proteínas CEACAM1 , CEACAM6 Y CEACAM8 de Macaca fascicularis
Los inventores han determinado la secuencia de las cadenas pesada y ligera variables de dichos anticuerpos monoclonales, los denominados anticuerpos MAb1 , MAb2, MAb3, MAb4, Y MAb5
El denominado quot;anticuerpo MAb1 quot; comprende: un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGG
SYIYYLDSVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMSSLRSEOTAMYYCARPAVYGNPAMDYWG QGTSVTVSS (SEO ID NO:31 , con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEO ID NO:1), FR2 -H abarca las posiciones de aminoácidos 34 aSO, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEO ID NO:2), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEO ID NO:3), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DILMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYOOKPGOSPKPUYSASYRYS GVPORFTGSGSGTOFTL TISNVQSEOLAEYFCQQYNSYPL YTFGGGTKLEIK (SEO ID NO:32, con las COR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1 -L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, COR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEO ID NO:4), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciooes de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos S3 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 98 (SEO ID NO:6), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 99 a 108.
El denominado ~anticuerpo MAb2quot; comprende:
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVOLOESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFVFSSYDMSWVROTPEKRLEWVAYISSGG GITYFPOlVOGRFlVSRONAKNTLYLOMNSLKSEOTAIYVCAAHYFGSSGPFAYWG OGTLVTVSA (SEO ID NO:33, con las COR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1 -H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEO ID NO:7), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, COR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEO ID NO:8), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEO ID NO:9), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
un dominio variable de cadena ligera que coosiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASVGElVTlTCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLAEG VPSRFSGSGSGTOFSLKINSLOPEDFGSYVCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEO ID NO:34, con las COR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, COR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEO ID NO:10), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, COR2-L abarca las posiciooes de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, COR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEO ID NO:12), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107
También se generó una variante del anticuerpo MAb2 introduciendo una sustitución K52R en el COR2-L. Esta variante, que se denomina en el presente documento ~Mab2K52Rquot;, tiene esencialmente la misma afinidad por CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis que MAb2
El denominado ~anticuerpo MAb3quot; comprende·
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLVESGGGLVKPGGSL TLPCAASGFTFSRYA MSWVROTPEKRLEWVASISSGG DTYYPOSVKGRFlVSRDNARNILFLOMSSLRSEOTGMYYCARVNYVDSSFLDWWG OGTILlVSS (SEO ID NO:35, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, COR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEO ID NO:13), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, COR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 57 (SEO ID NO:14), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 58 a 95, COR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 96 a 108 (SEO ID NO:15), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 109 a 119, y
un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTOSORFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYOOKPGOSPKAUYSASYRY SGVPORFTGSGSGTOFTL TISNVOSEOLAEYFCQQYNNYPL YTFGGGTKLEIK (SEO ID NO:36. con las COR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEO ID NO:16), FR2 -L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, COR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 98 (SEO ID NO:18), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 99 a 108
El denominado ~anticuerpo MAb4quot; comprende·
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVOL VESGGGL VKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVROTPEKRLEWVAFISSYG GRTYYADlVKGRFTISRONAKNTLYLOMSSLKSEDTAMFYCAAHYFGTSGPFAYWG OGTLVTVSA (SEO ID NO:37, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CoR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEO ID NO:19), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CoR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEO ID NO:20), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CoR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEO ID N 0:21), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia olOMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYOQKQGKSPQLLVYNAKILAEG VPSRFSGSGSGTOFSLK1NSLQPEoFGTYYCQHHYGIPFTFGSGTKLELK (SEO ID NO:38, con las CoR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CoR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEO ID NO:22), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CoR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CoR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEO ID NO:24), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107.
El denominado quot;anticuerpo MAb5quot; comprende:
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia ELOLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVROTPEKRLEWVTYINSGG
GITYYPolVKGRFTISRoNARNTLYLQMSSLKSEoTAIYYCTAHYFGSSGPFAYWGQ GTLVTVSA (SEO ID
NO:39, con las CoR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1 -H abarca las posiciones de
aminoácidos 1 a 25, CoR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEO ID NO:25), FR2-H abarca
las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CoR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEO ID
NO:26), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CoR3-H abarca las posiciones de
aminoácidos 97 a 109 (SEO ID N 0 :27), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia
olOMTOSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYOOKOGKSPQLL VYNAKTLTEG VPSRFSGSGSGTOFSLKINSLOPEoFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEO ID N0:40, con las CoR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CoR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEO ID NO:28), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CoR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CoR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEO ID NO:30), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107.
Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis
En una realización, el anticuerpo de la invención se une a los dominios A3-B3 de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis. Más especificamente, el anticuerpo puede unirse a los dominios A3-B3 humanos y de Macaca fascicularis indistintamente de si se expresan en forma aislada o si están presentes en un dominio extracelular soluble o proteina CEACAM5 de longitud completa anclada a membrana
La especificidad de los anticuerpos por el dominio A3-B3 de CEACAM5 humana es ventajosa, ya que no se ha dado
a conocer ningún SNP con una frecuencia mayor de 2% en la población caucásica en este dominio, lo que minimiza
el riesgo de que el epitopo o epitopos de los anticuerpos en CEACAM5 esten alterados en parte de la población
La invención también proporciona un anticuerpo que compite por la unión al dominio A3-B3 de las proteinas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos denominados MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, Y MAb5, es decir, seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:31 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:32;
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:33 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:34;
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:33 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:34 en la que K en la posición 52 se ha sustituido porR;
d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:35 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:36;
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:37 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:38; y
f) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:39 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID N0:40.
La capacidad de un anticuerpo candidato para competir por la unión al dominio A3-B3 de proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, Y MAb5 (de aquí en adelante en el presente documento, un anticuerpo quot;de referenciaquot;) puede ensayarse fácilmente, por ejemplo pOf ELlSA competitivo en el que el antígeno (es decir, el dominio A3-B3 de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis, o un polipéptido que comprende o consiste en un fragmento de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis que incluye el dominio A3-B3, en particular el dominio extracelular de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis) está unido a un soporte sólido y se añaden dos disoluciones que contienen el anticuerpo candidato y el anticuerpo de referencia, respectivamente, y se deja que los anticuerpos compitan por la unión al antígeno. La cantidad de anticuerpo de referencia unido al antigeno puede medirse entonces y se puede comparar con la cantidad de anticuerpo de referencia unido al antigeno cuando se mide frente a un control negativo (por ejemplo, una disolución que no contiene anticuerpo). Una cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del anticuerpo candidato, disminuida en comparación con la cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del control negatívo, indica que el anticuerpo candidato ha competido con el antícuerpo de referencia Convenientemente, el antícuerpo de referencia puede estar marcado (por ejemplo, fluorescentemente) para facilitar la detección del antícuerpo de referencia unido. Pueden realizarse medidas repetidas con diluciones seriadas del anticuerpo candidato y/o de referencia.
De acuerdo con una realización, dicho anticuerpo, y por ejemplo el anticuerpo que compite por la unión al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis coo un anticuerpo como se define en b), c), e) y f) anteriores, se une a dos regiones del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana que consiste en los aminoácidos en las posiciones 109-115 (SEO ID NO:76) y aminoácidos en las posiciones 131-143 (SEO ID NO:77) del dominio A3-B3 de la proteina CEACAM5 humana, respectivamente. De hecho, se ha identificado que un epítopo conformacional para el anticuerpo MAb2 pertenece a las regiones 109-115 y 131 -143 del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana, y estando MAb2, MAb4 Y MAb5 estructuralmente muy relacionados, se asume por los inventores que dichos anticuerpos se unen al mismo epitopo
De acuerdo con una rea lización , el anticuerpo de acuerdo con la invención es especifico para las proteínas de superficie CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis. En una realización, el anticuerpo de la invención no se une a, o no reacciona de manera cruzada significativamente coo las proteínas CEACAM1 humana, CEACAM6 humana, CEACAM7 humana, CEACAM8 humana, CEACAM1 de Macaca fascicularis, CEACAM6 de Macaca fascicularis y CEACAM8 de Macaca fascicularis
En particular, el anticuerpo no se une a, o no reacciona de manera cruzada significativamente con, el dominio extracelular de las proteínas CEACAM humana y de Macaca fascicularis mencionadas anteriormente
La proteína CEACAMl humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP _001703,2 (SEO ID NO:11). El dominio extracelular de CEACAM1 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-428 de SEO ID NO:11 . La proteína CEACAM6 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP_002474,3 (SEO ID NO:71). El dominio extracelular de CEACAM6 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-327 de SEO ID NO:71
La proteina CEACAM7 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP _008821,1 (SEO ID NO:72). El dominio extracelular de CEACAM7 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 36-248 de SEO ID ND:72.
La proteina CEACAM8 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP _001807 ,2 (SEO ID NO:73). El dominio extracelular de CEACAM8 humana consiste en los aminoacidos en las posiciones 35-332 de SEO ID NO:73.
El dominio extracelular de CEACAMl de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciooes 35-428 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1-394 de SEO ID NO:57
El dominio extracelular de CEACAM6 de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciooes 35-327 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1-293 de SEO ID NO:61
El dominio extracelular de CEACAM8 de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-332 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1-298 de SEO ID NO:63
La quot;afinidadquot; se define, en teoría, por la asociación en equilibrio entre el anticuerpo completo y el antígeno. Puede evaluarse experimentalmente por una variedad de métodos conocidos, tal como midiendo las velocidades de asociación y disociación con resonancia de plasmones superficiales, o midiendo la CEso (o Ko aparente) en un ensayo inmunoquimico (ELlSA, FACS). En estos ensayos, la CEso es la concentración del anticuerpo que induce una respuesta que es la mitad entre la línea base y el máximo después de algún tiempo de exposición especificado en una concentración definida de antígeno por ELlSA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o célula que expresa el antígeno por FACS (Clasificación Celular Actívada por Fluorescencia) Un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno 1 (Ag1) quot;reacciona de manera cruzadaquot; con el antígeno 2 (Ag2) cuando las CE50 están en un intervalo similar para ambos antígenos. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 reacciona de manera cruzada con Ag2 cuando la relación de la afinidad de Ag2 a la afinidad de Ag1 es igual a o menor que 10 (por ejemplo 5, 2, 1 o 0,5), midiéndose las afinidades con el mismo método para ambos antígenos
Un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 quot;no reacciona de manera cruzada significativamentequot; con Ag2 cuando las afinidades son muy diferentes para los dos antígenos. La afinidad por Ag2 puede no ser medible si la respuesta de unión es demasiado baja. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 no reacciona de manera cruzada significativamente con Ag2 cuando la respuesta de unión del anticuerpo monoclonal a Ag2 es menor que 5% de la respuesta de unión del mismo anticuerpo monoclonal a Ag1 en el mismo entorno experimental y a la misma concentración de anticuerpo. En la práctica, la concentración de anticuerpo usada puede ser la CE so o la concentración requerida para alcanzar la meseta de saturación obtenida con Ag1.
Un anticuerpo monoclonal quot;se une específicamentequot; a, o quot;es específico paraquot; Ag1 cuando no reacciona de manera cruzada significativamente con Ag2. De acuerdo con esto, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una relación de afinidad por CEACAM5 humana a la afinidad por CEACAM5 de Macaca fascicularis que es ::; 10, por ejemplo!gt; 5, !gt; 2, !gt; 1, o !gt; 0,5. Así, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse en estudios toxicológicos realizados en monos debido a que el perfil de toxicidad observado en monos sería relevante para anticipar efectos adversos potenciales en los seres humanos.
Una rea lización de la invención tiene una afinidad por CEACAM5 humana o CEACAM5 de Macaca fascicularis , o por ambas, que es::; 10 nM, por ejemplo s 5 nM, ::; 3 nM, ::; 1 nM o::; 0,1 nM, por ejemplo una afinidad de 0,01 nM a 5 nM, o/y afinidad de 0,1 nM a 5 nM, o de 0,1 nM a 1 nM.
La afinidad por CEACAM5 humana o CEACAM5 de Macaca fascicularis puede determinarse como el valor de CE50 en un ELlSA usando CEACAM5 recombinante soluble como antígeno de captura.
El anticuerpo de la invención también puede tener una constante de disociación aparente (KD aparente), como puede determinarse por análisis FACS en la línea celular tumoral MKN45 (DSMZ, ACC 409) o en células tumorales de xenoinjerto derivadas del paciente (CR-IGR-034P disponible en Oncodesign Biotechnology, colección tumoral CReMEC), que es ::; 25 nM, por ejemplo ::; 20 nM, s 10nM, s 5nM, s 3nM o s 1nM. La KD aparente puede estar en el intervalo de 0,01-20 nM, o puede estar en el intervalo de 0,1-20 nM, 0,1-10 nM, o 0,1-5 nM.
Además, se ha mostrado que los anticuerpos de acuerdo con la invención son capaces de detectar la expresión de CEACAM5 por inmunohistoquímica en secciones tisulares congeladas y fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE).
Los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5 se muestran en la Figura 7. La comparación de las secuencias de CDR-H y CDR-L indica que, estructuralmente, MAb2, MAb4 Y MAb5, por una parte, y MAb1 Y MAb3, por otra parte, están muy relacionados, uniéndose dichos anticuerpos probablemente al mismo epítopo. La comparación de las secuencias CDR-H y CDR-L identifica además posiciones de CDR que están estrictamente conservadas entre los dos grupos de anticuerpos y se asume así que son importantes para la especificidad, mientras que las demás posiciones podrían tolerar una sustitución
Los inventores han identificado además que los restos en las posiciones 101 -109 de MAb2 VH (es decir, los restos de CDR3-H) y los restos en las posiciones 47-54 y 88-104 de MAb2 VL (es decir, las regiones que incluyen CDR2-L y CDR3-L, respectivamente) forman parte, o constituyen, el paratopo de anticuerpo para el dominio A3B3 de CEACAM5 humana.
Además, los restos en las posiciones 27, 28, 29, 31, 51,52,89, 90, 93, 94, 96, Y97 de MAb2 VL (es decir, en CDR1L, CDR2-L Y CDR3-L), Y los restos en las posiciones 26 a 31, 51 a 58,97,103,104,107, Y 109 de MAb2 VH (es decir, en CDR1 -H, todos los CDR2-H y en CDR3-H) se han identificado por sustituciones de un solo aminoácido como neutros para unión a los dominios exlracelulares de CEACAMS humana y de macaco. Además, se ha mostrado que los restos en las posiciones 30 y 92 de MAb2 VL (es decir, en CDR1-L y COR3-L) , Y los restos en las posiciones 98 y 100 de MAb2 VH (es decir, en CDR3-H), toleran una sustitución conservativa. Como MAb2, MAb4 Y MAb5 portan el mismo conjunto de 6 CDR o unas muy relacionadas, se considera que las variaciones en las mismas posiciones de MAb4 o MAb5 en las secuencias VH o VL o tanto de VH y CL darán como resultado también anticuerpos variantes que mantienen la especificidad y/o afinidad de un ión por CEACAM5 humana y de macaco
De forma importante, habiéndose identificado todos los restos de CDR2-H como neutros para la unión a los dominios exlracelulares de CEACAM5 humana y de macaco, los inventores asumieron que CDR2-H podría no participar en la interacción. De acuerdo con esto, en los anticuerpos de la invención, COR2-H podría ser cualquier secuencia de 6 a 10 aminoácidos, siendo ésta la longitud normal de las secuencias de CDR2-H en los anticuerpos humanos
De acuerdo con esto, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende· a) una CDR1-H que consiste en la secuencia X,X2X:JXtXsXaYD (SEO ID NO:83), en la que cada uno de XI, X 2, Xl. Xt, Xs YXe es cualquier aminoácido; y
una CDR2-H que consiste en una secuencia con una longitud de 6 a 10 aminoácidos, preferiblemente una secuencia con una longitud de 8 aminoácidos en la que cualquier aminoácido puede estar presente en cualquier posición; y
una CDR3-H que consiste en la secuencia X1X2H~FGXtXsGPXsAX7 (SEQ ID NO:84), en la que cada uno de Xl, N , Xs, gt;lt;S, y X7 es cualquier aminoácido, X2 es A o S, y X3 es Y, F o W; y/o
b) una CDR1 -L que consiste en la secuencia X1X2~XsY (SEO ID NO:85), en la que cada uno de Xl,~, X3 y Xs es cualquier aminoácido, y x.. es Y, F o W; y
una CDR2-L que consiste en la secuencia NX,X2, en la que cada uno de Xl y X2 es cualquier aminoácido; y
una CDR3·L que cOflsiste en la secuencia X1X2HX3XiXsPXsX7 (SEO ID NO:86), en la que cada uno de XI, X2, -'lt;4 , Xs, Xe y X7 es cualquier aminoácido, X3 es Y, F o W
En una realización, en la CDR1 -H que consiste en una secuencia X1X2~XiXsXsYD (SEO ID NO:83), XI es G, o X2 es F, o)(:¡ es T, A o V, o Xi es F, o Xs es S, o Xe es S, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la COR2-H consiste en una secuencia IX,SX2GGX3T (SEO ID NO:79), en la que X, es S o N (en particular S), X2 es Y o G (en particular G), X3 es R o l. En una realización adicional )(:¡ es I
En una realización, en la COR3-H que consiste en una secuencia X,X2HX:¡FGXtXsGPXaAX7 (SEO ID NO:84), X, es A o T, o Xi es T o S, o Xs es S, o Xe es F, o X7 es Y, o cualquier combinación de los mismos
En una realización, en la COR1-L que consiste en una secuencia X,X2X:X.tXsY (SEO ID NO:85), X, es E, o X2 es N,
o XJ es 1, o Xs es S, o cualquier combinación de los mismos En una realización, la COR2-L consiste en una secuencia NX,X2, en la que X, es A o T, y X2 es K o R. En una realización, en la CDR3-L que consiste en una secuencia X,X2HX:¡)(.¡gt;lt;SPXeX7 (SEO ID NO:86), X, es Q, o X¡
es H, o Xt es G, o Xs es T, o gt;Ca es F, o X7 es T, o cualquier combinación de los mismos. De acuerdo con una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende·
a) una CDR1 -H que consiste en una secuencia GFX1FSSYO (SEO ID NO:78), en la que X, es T, A o V; y una COR2-H que consiste en una secuencia IX1SX¡GGX3T (SEO ID NO:79), en la que X, es S o N (en particular S), X2 es Y o G (en particular G), )(:¡ es Ro l; y
una COR3-H que cOflsiste en una secuencia X,AHYFGX2SGPFAY (SEO ID NO:80), en la que XI es A o T (en particular A), y X¡ es T o S , ylo
b) una COR1-Lque consiste en una secuencia ENIFSY (SEO ID NO:10) o ENIYSY (SEO ID NO:22); y una CDR2-L que cOflsiste en una secuencia NX1X2 en la que XI es A o T, y X2 es K o R, en particular R; CDR2-L que consiste en particular en NAK, NTK Y NTR; Y
una CDR3-Lque consiste en una secuencia OHHYGTPFT (SEO ID NO:12) o OHHYGIPFT (SEO ID NO:24) De acuerdo con una realización, en COR2-H, X, es S o N, X2 es G y X3 es l. De acuerdo COfl una realización, CDR2-H consiste en ISSGGGIT (SEO ID NO:8), ISSYGGRT (SEO ID NO:20) o
INSGGGIT (SEO ID NO:26) De acuerdo con una realización, en COR3-H, X, es A o T, y X¡ es S. De acuerdo con una realización, COR3-H consiste en AAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEO
ID NO:21 ), o TAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:27). Cualquier combinación de estas realizaciones forma parte de la invención Alternativamente, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende:
a) una COR1-H que consiste en una secuencia GFTFSX,YX2 (SEO ID NO:81), en la que X, es R o S, en
particular S, y X2 es A o O; y una COR2-H que cOflsiste en una secuencia ISSGGX1X2X3 (SEO ID NO:82), en la que XI está ausente, S o G (en particular G), X2 es D, Yo 1, y X3 es T o 1; y
una CDR3-H que consiste en una secuencia ARPAVYGNPAMOY (SEO ID NO:3) o ARVNVYOSSFLDW (SEO ID NO:15); y/o
b) a CDR1-L que consiste en una secuencia QNVGTN (SEO ID NO:4); y
una CDR2-L que consiste en una secuencia SAS; y
una CDR3-L que consiste en una secuencia QQYNSYPLYT (SEO ID NO:6) o QQYNNYPLYT (SEO ID NO:18)
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en una secuencia ISSGGSYI (SEO ID NO:2) o ISSGGOT (SEO ID NO:14).
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en una secuencia ISSGGSYI (SEO ID NO:2) y CDR3-H consiste en la secuencia ARPAYVGNPAMDY (SEO ID NO:3).
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en ISSGGDT (SEO ID NO:14) y CDR3-H consiste en la secuencia ARVNVYOSSFLDW (SEO ID NO:15).
De acuerdo con una rea lización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende las secuencias de CoR de las cadenas pesadas y/o ligeras de uno de los denominados anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, Y MAb5
Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo que comprende:
a) una CoR1-H de secuencia GFTFSSYA (SEO ID NO:1) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:1 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia ISSGGSYI (SEO ID NO:2) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:2 por una o más sustituciones de aminoácidos; CoR3-H de secuencia ARPAYYGNPAMOY (SEO ID NO:3) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:3 por una sustitución de aminoácidos; COR1 -L de secuencia ONVGTN (SEO ID NO:4) o una secuencia que difiere de la SEO tO NO:4 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos; y COR3-L de secuencia OOYNSYPLYT (SEO ID NO:6) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:6 por una sustitución de aminoácidos; o
b) una COR1 -H de secuencia GFVFSSYO (SEO ID NO:7) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:7 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia ISSGGGIT (SEO ID NO:8) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:8 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:9) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:9 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR1-L de secuencia ENIFSY (SEO ID NO:10) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:10 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-L de secuencia NTK o NTR o una secuencia que difiere de NTK o NTR por una sustitución de aminoácidos; y COR3 -L de secuencia OHHYGTPFT (SEO ID NO:12) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:12 por una sustitución de aminoácidos; o
e) una CoR1-H de secuencia GFTFSRYA (SEO ID NO:13) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:13 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia ISSGGoT (SEO ID NO:14) o una secuencia que difiere de la SEO ID ND:14 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR3-H de secuencia ARVNyyoSSFLDW (SEO ID NO:15) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:15 por una sustitución de aminoácidos; CoR1-L de secuencia ONVGTN (SEO ID NO:16) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:16 por una sustitución de aminoácidos; COR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos; y CoR3-L de secuencia OOYNNYPLYT (SEO ID NO:18) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:18 por una sustitución de aminoácidos; o
d) una CoR1-H de secuencia GFTFSSYo (SEO tO NO:19) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:19 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia ISSYGGRT (SEO ID NO:20) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:20 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR3-H de secuencia AAHYFGTSGPFAY (SEO ID NO:21) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:21 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR1-L de secuencia ENIYSY (SEO ID NO:22) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:22 por una sustitución de aminoácidos; COR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CoR3-L de secuencia OHHYGIPFT (SEO ID NO:24) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:24 por una sustitución de aminoácidos; o
e) un anticuerpo que comprende una CoR1-H de secuencia GFAFSSYo (SEO ID NO:25)o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:25 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia INSGGGIT (SEO ID NO:26) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:26 por una o más sustituciones de aminoácidos; CoR3-H de secuencia TAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:27) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:27 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR1 -L de secuencia ENIYSY (SEO ID NO:28) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:28 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CoR3-L de secuencia QHHYGTPFT (SEO ID NO:30) o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:30 por una sustitución de aminoácidos
Uno o más aminoácidos individuales se pueden alterar por sustitución, en particular por sustitución conservativa, en una o más de las secuencias de CoR anteriores. Dicha alteración puede pretender, por ejemplo, eliminar un sitio de glicosilación o un sitio de desamidación, en conexión con la humanización del anticuerpo
Tomando como base los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los MAb1 , MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5, Y tomando como base las sustituciones de aminoácidos únicas en una variante del anticuerpo MAb2, puede sustituirse un aminoácido·
en CoR1-H: en una o más de las posiciones 1 a 6, por ejemplo en la posición 3, de CoR1-H de secuencia GFVFSSYo (SEO ID NO:7), GFTFSSYo (SEO ID NO:19) o GFAFSSYO (SEO ID NO:25) o en la posición 6 de COR1-H de la secuencia GFTFSSYA (SEO ID NO:1) o GFTFSRYA (SEO ID NO:13); y/o
en COR2-H, en una o más de cualesquiera de las posiciones, o en una, dos o tres de las posiciones 2, 4, Y 7 de COR2-H de secuencia ISSGGGIT (SEO ID NO:8), ISSYGGRT (SEO ID NO:20) o INSGGGIT (SEO ID NO:26), o en una, dos, o tres de las posiciooes 6, 7 Y 8 (en las que la secuencia tiene una longitud de 8 aminoácidos) de COR2-H de secuencia ISSGGSYI (SEO ID NO:2) o ISSGGOT (SEO ID NO:14); y/o véase anteriormente
en CoR3-H, en una o más de las posiciones 1, 7. 8, 11 Y 13, por ejemplo en una o dos de las posiciones 1 y 7 de COR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEO ID NO:21 ), o TAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:27), o en la posición 3, 4, 7, 8, 9, 10, u 11 de secuencia ARPAYVGNPAMoy (SEO ID NO:3) o ARVNyvoSSFLoW (SEO ID NO:15); y/o
en COR1-L, en una o más de las posiciones 1 a 5, en particular en una o más de las posiciones 1, 2, 3 Y 5 o en la posición 4 de CoR1-L de secuencia ENIFSY (SEO ID NO:10) o ENIYSY (SEO ID NO:28); y/o
en COR2-L, en las posiciones 2 y/o 3 de secuencia NAK, NTK o NTR, en particular al menos en la posición 3 si K está presente. En dicho caso, R por ejemplo puede sustituirse por K en la posición 3 de COR2-L; y/o
en CoR3-L, en una o más de las posiciones 1, 2, 5, 6, 8 Y 9, por ejemplo en la posición 6 de CoR3-L de secuencia OHHYGIPFT (SEO ID NO:24) o OHHYGTPFT (SEO ID NO:30), o en la posiciÓfl 5 de COR3-L de secuencia OOYNSYPLYT (SEO ID NO:6) o OOYNNYPLYT (SEO ID NO:18)
De acuerdo con una realizaciÓfl, en los anticuerpos de la invención:
la posición 5 de CoR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEO ID NO:21 ), o TAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:27); y/o
la posición 6 de CoR1-L de secuencia ENIFSY (SEO ID NO:10) o ENIYSY (SEO ID NO:28); ylo
la posición 3 de CoR3-L de secuencia OHHYGIPFT (SEO ID NO:24) o OHHYGTPFT (SEO ID NO:30)
no está (están) modificada(s)
De acuerdo con una realización, en COR1-H de secuencia GFVFSSYO (SEO ID NO:?), GFTFSSYO (SEO ID NO:19)
o GFAFSSYo (SEO ID NO:25), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 3 de CoR1-H se selecciona del grupo que consiste en T, A o V.
De acuerdo con una realización, en COR1 -H de secuencia GFTFSSYA (SEO ID NO:1) o GFTFSRYA (SEO ID NO:13), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 6 de CoR1-H es R o S
De acuerdo con una rea lización, en COR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEO ID NO:21), o TAHYFGSSGPFAY (SEO ID NO:27), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 1 de CoR3-H es A o T, y/o el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 7 de CoR3-H esToS.
De acuerdo con una realización, en CoR3-H de secuencia ARPAYVGNPAMoy (SEO ID NO:3) o ARVNYVOSSFLOW (SEO ID NO:15), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 3 de COR3-H es V o P, en la posición 4 es A o N, en la posición 7 es O o G, en la posición 8 es S o N, en la posición 9 es S o P, en la posición 10 es F o A, o en la posición 11 es W o Y.
De acuerdo con una realización, el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 4 de CoR1-L es Y
o F.
De acuerdo con una realización, en CoR2-L de secuencia NAK, NTK o NTR, el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 2 de CoR2-L es A o T.
De acuerdo con una realización en COR3-L de secuencia OOYNSYPL YT (SEO ID NO:6) o OOYNNYPL YT (SEO ID NO:18), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 5 de CoR3-L es N o S
De acuerdo con una realización, en COR3-L de secuencia OHHYGIPFT (SEO ID NO:24) o OHHYGTPFT (SEO ID NO:30), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 6 de CoR3-L es 1 o T
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores fonna parle de la invención.
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo convencional, tal como un anticuerpo monoclonal convencional, o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecifico o mulliespecifico
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende o consiste en una IgG, o un fragmento de ésta.
La invención también proporciona anticuerpos como se ha definido anterionnente que comprenden además al menos el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de uno de los cinco denominados anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, Y MAb5
Así, una realización de la invención se refiere a un anticuerpo que comprende·
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:31 , o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:32, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:33, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:34, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:35, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:36, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
d) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:37, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:38, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:39, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID N0:40, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta. Por ejemplo, la secuencia del dominio variable de cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEO ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, según sea apropiado, en una o más sustituciones de aminoácidos, en particular en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y{o sustitución o sustituciones con restos canónicos. En una realización, la secuencia del dominio variable de cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEO ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 solo en una sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas.
Las alteraciones de la secuencia comparadas con la secuencia SEO ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 estarán presentes esencialmente en una o más de las regiones del marco, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L y/o FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
Sin embargo, también son posibles las sustituciones de aminoácidos en una o más CDR En una realización, la secuencia del dominio variable de cadena ligera puede diferir de la secuencia SEO ID NO:34 al menos por una sustitución de K a R en la posición 52 de SEO ID NO:34 (en COR2-L)
El anticuerpo de la invención y un fragmento de éste pueden ser, respectivamente, un anticuerpo murino y un fragmento de un anticuerpo murino.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico, y en una realización, un anticuerpo murinolhumano, por ejemplo un anticuerpo que comprende dominios variables murinos de cadenas pesada y ligera y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano. El polipéptido puede ser un fragmento de dicho anticuerpo.
De acuerdo con una realización, el anticuerpo de la invención es ·
a) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID N0:41 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:42 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb1 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
b) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:43 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:44, o una
secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb2 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
e) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID N0:45 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:46 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir. cadena pesada y/o ligera de chMAb3 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
d) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID N0:47 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:48 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb4 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
e) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID N0:49 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:50 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada yfo ligera de chMAb5 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
f) un fragmento del anticuerpo quimérico definido en a), b), c), d) o e)
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado. En una realización, el anticuerpo de la invención puede resultar de la humanización de cualquiera de los anticuerpos quiméricos definidos anteriormente en a), b), c), d), e) o f)
En la técnica se conocen numerosos métodos para la humanizaciÓfl de una secuencia de anticuerpo; véase, por ejemplo, la revisiÓfl por Almagro y Fransson (2008) Fronl Biosci. 13: 1619-1633. Un método usado comúnmente es el injerto de COR, o remodelado de anticuerpo, que implica el injerto de las secuencias de COR de un anticuerpo donante, generalmente un anticuerpo de ratón, en la estructura del marco de un anticuerpo humano de diferente especificidad. Como el injerto de COR puede reducir la especificidad y afinidad de unión, y de este modo la actividad biológica, de un anticuerpo no humano injertado con COR, pueden introducirse retromutaciones en posiciones seleccionadas del anticuerpo injertado con COR con el fin de retener la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo parental. La identificación de posiciones para posibles retromulaciones puede rea lizarse usando la información disponible en la bibliografía y en bases de datos de anticuerpos. Los restos de aminoácidos que son candidatos para retromutaciones son típicamente aquellos que están localizados en la superficie de una molécula de anticuerpo, mientras que los restos que están enterrados o que tienen un grado bajo de exposición en la superficie normalmente no se alterarán. Una técnica de humanización alternativa al injerto de COR y retromutación es la modificación de superficie, en la que se retienen los restos de origen no humano no expuestos en la superficie, mientras que los restos de la superficie se alteran a restos humanos. Otra técnica altemativa se conoce como quot;selección guiadaquot; (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), Y puede usarse para derivar a partir de un anticuerpo murino un anticuerpo completamente humano que conserva el epítopo y las características de unión del anticuerpo parental
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización implica típicamente la modificación de las regiones del marco de las secuencias de la región variable
Los restos de aminoácidos que forman parte de una COR no se alterarán típicamente en conexión con la humanización, aunque en determinados casos puede ser deseable alterar restos de aminoácidos individuales de COR, por ejemplo para eliminar un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación o un resto de cisteína no deseado. La glicosilación enlazada mediante N ocurre por la unión de una cadena oligosacaridica a un resto de asparagina en la secuencia del tripéptido Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La eliminación de un sitio de N-glicosilación puede conseguirse mutando bien el resto de Asn o el SerfThr a un resto diferente, por ejemplo mediante una sustitución conservativa. La desamidación de los restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como pH y exposición en la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor medida en otras secuencias de dipéptido tales como Asn -Ala. Cuando está presente dicho sitio de desamidación, por ejemplo Asn-Gly, en una secuencia de COR, puede ser deseable por lo tanto eliminar el sitio, típicamente por sustitución conservativa para eliminar uno de los restos implicados. La sustitución en una secuencia de CDR para eliminar uno de los restos implicados también se pretende que esté englobada por la presente invención
Tomando el denominado quot;anticuerpo MAb2quot; como un ejemplo, un anticuerpo humanizado o fragmento de éste puede comprender las mutaciones siguientes en la cadena pesada variable: P en lugar de G en la posición 9; y/o G en lugar de V en la posición 10; yfo S en lugar de K en la posición 19; y/o R en lugar de K en la posición 43; yfo G en lugar de R en la posición 44; y/o A en lugar de F en la posición 60; y/o S en lugar de O en la posición 62; y/o K en lugar de a en la posición 65; y/o T en lugar de K en la posición 87; yfo V en lugar de I en la posición 89; y/o S en lugar de A en la posición 113; proporcionándose las posiciones por referencia a SEO ID NO:33
Tomando aún el denominado quot;anticuerpo MAb2quot; como un ejemplo, un anticuerpo humanizado o fragmento de éste puede comprender las mutaciones siguientes en la cadena ligera variable: O en lugar de E en la posición 17; y/o R en lugar de T en la posición 18; y/o P en lugar de Q en la posición 40; yfo K en lugar de Q en la posición 45; y/o R en lugar de K en la posición 52; yfo O en lugar de Q en la posición 70 ; yfo T en lugar de K en la posición 74; y/o S en lugar de N en la posición 76; yfo A en lugar de G en la posición 84; y/o T en lugar de S en la posición 85; proporcionándose las posiciones por referencia a SEO ID NO:34
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende, o consiste en, una cadena pesada que comprende las mutaciones siguientes, proporcionándose las posiciones por referencia a SEO ID NO:33·
a) P en lugar de G en la posición 9; y G en lugar de V en la posición 10; Y S en lugar de K en la posición 19; y R en lugar de K en la posición 43; y S en lugar de O en la posición 62; y K en lugar de a en la posición 65; y T en lugar de K en la posición 87; o
b) P en lugar de G en la posición 9; y G en lugar de V en la posición 10; y S en lugar de K en la posición 19; y R en lugar de K en la posición 43; y G en lugar de R en la posición 44; y A en lugar de F en la posición 60; y S en lugar de O en la posición 62; y K en lugar de a en la posición 65; y T en lugar de K en la posición 87; y V en lugar de I en la posición 89; y S en lugar de A en la posición 113; y/o
un anticuerpo humanizado que comprende una cadena ligera que comprende las mutaciones siguientes, proporcionándose las posiciones por referencia a SEO ID NO:34:
c) O en lugar de E en la posición 17; y P en lugar de Q en la posición 40; y K en lugar de Q en la posición 45; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; o
d) O en lugar de E en la posición 17; y R en lugar de T en la posición 18; y P en lugar de a en la posición 40; y K en lugar de a en la posición 45; y O en lugar de a en la posición 70; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; y A en lugar de G en la posición 84; y T en lugar de S en la posición 85; o
e) O en lugar de E en la posición 17; y R en lugar de T en la posición 18; y P en lugar de a en la posición 40; Y K en lugar de Q en la posición 45; y R en lugar de K en la posición 52; y O en lugar de Q en la posición 70; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; y A en lugar de G en la posición 84; y T en lugar de S en la posición 85.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado obtenido injertando las COR de un anticuerpo de la invención en regiones del marco de anticuerpo altemativas, más específicamente en regiones del marco humanas. Tomando MAb2 como un ejemplo, las 6 COR de MAb2K52R se han injertado en un marco humano que consiste en los genes IGHV3-23 e IGKV10-39, y se introdujeron tres retromutaciones correspondientes a las posiciones 34 y 53 en la VL (SEO ID NO. 34) Y en la posición 50 en la VH (SEO ID NO. 33) que dan como resultado un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:74 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:75.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51, SEO ID NO:5 o SEO ID NO: 74, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; y/o una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:17, SEO ID NO:23, SEO ID NO:29, SEO ID NO:55 o SEO ID NO:75 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (dominios va riables humanizados de cadenas pesada y ligera de MAb2).
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:17 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:23 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:29 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEa ID NO:51 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:55 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEO ID NO: 74 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO: 75 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
En dicho anticuerpo humanizado o fragmento de éste, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera pueden comprender regiones del marco aceptoras humanas. El anticuerpo humanizado comprende además dominios constantes de cadena pesada y ligera humana, cuando están presentes.
En una realización, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo huMAb2-3 o una variante de éste, es decir, un anticuerpo aislado que se une al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis , y que comprende·
a) una cadena pesada que consiste en la secuencia SEO ID NO:87 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
b) una cadena ligera que consiste en la secuencia SEO ID NO:88 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta,
o una cadena pesada y una cadena ligera
En una realización, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo huMAb2-4 (MAb2_ VL 1d VH1-lgG1) o una variante de éste, es decir, un anticuerpo aislado que se une al dominio A3-B3 de las proteinas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis, y que comprende:
e) una cadena pesada que cOflsiste en la secuencia SEO ID NO:89 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; y/o
d) una cadena ligera que consiste en la secuencia SEO ID NO:90 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
El anticuerpo de acuerdo con la invención también puede ser un anticuerpo de dominio ún ico o un fragmento de éste. En una realizaci6n de la invenciÓfl, un fragmento de anticuerpo de dominio único puede consistir en una cadena pesada variable (VHH) que comprende las CDR1 -H, CDR2-H y CDR3-H de los anticuerpos como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo de cadena pesada, es decir, un anticuerpo desprovisto de cadena ligera, que puede contener o no un dominio CH1.
El anticuerpo de dominio único o un fragmento de éste también pueden comprender las regiones del marco de un anticuerpo de dominio único de camélido, y opcionalmente el dominio constante de un anticuerpo de dominio único de camélido.
El anticuerpo de acuerdo COfl la invención también puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento de anticuerpo humanizado, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, y anticuerpos bivalentes.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o multiespecifico formado a partir de fragmentos de anticuerpo, siendo al menos un fragmento de anticuerpo un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención Los anticuerpos multiespecíficos son complejos proteicos polivalentes como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 2050764 A 1 o US 2005{0003403 Al.
Los anticuerpos biespecíficos o mu ltiespecíficos de acuerdo con la invención pueden tener especificidad por (a) el epitopo A3-B3 de CEACAM5 humana/de Macaca fascicularls al que está dirigido uno de los anticuerpos denominados MAbl, MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5, Y (b) al menos otro antigeno diferente. De acuerdo con una realización, el al menos otro antígeno diferente no es un miembro de la familia de la CEACAM humana o de Macaca fascicularis, y en una realización, no es al menos uno o todos de CEACAMl humana y de Macaca fascicularis , CEACAM6 humana y de mono, CEACAM7 humana y de Macaca fascicularis, y CEACAM8 humana y de Macaca fascicularis. De acuerdo con otra realización, el al menos otro antígeno diferente puede ser un epitopo en CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis distinto de dicho epítopo A3-B3 al que está dirigido uno de los anticuerpos denominados MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5
Dichos anticuerpos pueden producirse por cualquier técnica muy conocida en la técnica. En una realización, dichos anticuerpos se producen por técnicas como se describe posteriormente en el presente documento. Los anticuerpos y fragmentos de éstos de acuerdo con la invención pueden usarse en una forma aislada (por ejemplo, purificada) o estar contenidos en un vector, tal como una membrana o vesicula lipidica (por ejemplo, un liposoma)
Acidos nucleicos, vectores y células hospedantes recombinantes
Un objeto ad icional de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que codifica un anticuerpo de la invención como se ha definido anteriormente.
Típicamente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que puede estar incluida en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector viral
Los términos quot;vectorquot;, quot;vector de clonac iónquot; y ~vector de expresiónquot; significan el vehículo por el que una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) puede introducirse en una célula hospedante, para transformar el hospedante y promover la expresión (por ejemplo, la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida
Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un vectOf que comprende un ácido nucleico de la invención.
Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para causar o dirigir la expresión de dicho polipéptido después de la administración a un sujeto. Los ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para una célula animal incluyen el promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor y potenciador LTR del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason JO et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena de inmunoglobulina H, y similares
Puede usarse cualquier vector de expresión para células animales, siempre que pueda insertarse y expresarse un gen que codifica la región C del anticuerpo humano. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990), y similares.
Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integrativos, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR, Y similares
Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, del virus del herpes y de AAV. Dichos virus recombinantes pueden producirse por técnicas conocidas en la técnica, tal como transfectando células empaquetadoras o por transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares. Los ejemplos típicos de células empaquetadoras de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes defectuosos en la replicación pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96122378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 y WO 94119478.
Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una célula que se ha transfectado, infectado o transformado mediante un ácido nucleico ylo un vector de acuerdo con la invención.
El término quot;transformaciónquot; significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN aextrañoquot; (es decir, extrínseco) en una célula hospedante, de manera que la célula hospedante expresará la secuencia o gen introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por la secuencia o gen introducido. Una célula hospedante que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha quot;transformadoquot;
Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse para producir un anticuerpo recombinante de la invención en un sistema de expresión adecuado. La expresión quot;sistema de expresiÓflquot; significa una célula hospedante y vectOf compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño portado por el vector e introducido en la célula hospedante
Los sistemas de expresión habituales incluyen células hospedantes de E coli y vectores plasmidicos, células hospedantes de insecto y vectores de baculovirus, y células hospedantes y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células hospedantes incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células de planta, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. eoli, levaduras K1uyveromyees o Saeeharomyees, líneas celulares de mamíferos (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.), así como cultivos celulares de mamíferos primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de linfoblaslos, fibroblaslos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen célula de ratón SP2fO-Ag14 (ATCC CRL1581), célula de ratón P3X63-Ag8,653 (ATCC CRL1580), célula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa (referido de aquí en adelante en el presente documento como quot;gen DHFRquot;) es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), célula de rata YB2f3HLP2.G11,16Ag,20 (ATCC CRL1662, referida de aquí en adelante en el presente documento como quot;célula YB2/0quot;), y similares. En una realización, se usa la célula YB2fO, ya que la actividad de ADCC de los anticuerpos quiméricos o humanizados se potencia cuando se expresan en esta célula.
Para la expresión de un anticuerpo humanizado, el vector de expresión puede ser de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo existan en vectores separados, o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de un anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células animales, y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células animales, el vector de expresión del anticuerpo humanizado es del tipo tándem (Shitara K et al. J Immunol Methods 1994 Ene. 3; 167(1-2):271-8). Los ejemplos de vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97110354), pEE18, Y similares.
La presente invención también se refiere a un método para producir una célula hospedante recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una célula hospedante competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedante recombinante obtenida, y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan ylo segregan dicho anticuerpo.
Dichas células hospedantes recombinantes pueden usarse para la producción de anticuerpos de la invención
Métodos para producir anticuerpos de la invención
Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, bien sola o en combinación
Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina por técnicas estándar para la producción de polipéptidos. POf ejemplo, pueden sintetizarse usando el método bien conocido de fase sólida usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante Altemativamente, los anticuerpos y cadenas de inmunoglobulina de la invención pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos pueden obtenerse como productos de la expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el (poli)péptido deseado en vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedantes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir de los cuales puede aislarse posteriormente usando técnicas muy conocidas
La invención se refiere además a un método para producir un anticuerpo de la invención, método que comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedante transformada de acuerdo con la invención; (ii) expresar dicho anticuerpo o pol ipéptido; y (iii) recuperar el anticuerpo o polipéptido expresado
Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, eleclroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad _
En una rea lización, un anticuerpo quimérico humanizado de la presente invención puede producirse obteniendo secuencias nucleicas que codifican dominios VL y VH humanizados como se ha descrito previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano insertándolos en un vector de expresión para células an imales que tiene los genes que codifican CH de anticuerpo humano y el de anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal
Como el dominio CH de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas pesadas de inmunoglobulina humana, sin embargo son adecuadas aqueltas de la clase IgG y también puede usarse una cualquiera de las subclases que pertenece a la clase IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, como la Cl de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas ligeras de inmunoglobulina humana, y pueden usarse aquellas de la clase kappa o de la clase lambda.
Los métodos para producir anticuerpos humanizados o quiméricos implican técnicas convencionales de AON recombinante y transfección génica que son muy conocidas en la técnica (véase Morrison SL. et al. (1984) y los documentos de patente US 5.202.238; y US 5.204.244).
Los métodos para producir anticuerpos humanizados basados en técnicas convencionales de AON recornbinante y transfección génica son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la técnica descrita en la solicitud W02009/032661, injerto de COR (documento EP 239.400; publicación PCT W091 f09967; Patentes U.S. nos 5.225_539; 5.530.101; Y 5.585.089), revestimiento o modificación de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA et al. (1994)), e intercambio de cadenas (patente U.S. nO 5.565.332). la tecnología general de ADN recombinante para la preparación de dichos anticuerpos también es conocida (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 Y la Solicitud de Patente Internacional WO 96f02576)
El Fab de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CEACAM5 con una proteasa, tal como papaína. También, el Fab puede producirse insertando secuencias de AON que codifican ambas cadenas del Fab del anticuerpo en un vector para la expresión procariota, o para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para expresar el Fab.
El F(ab')2 de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CEACAM5 con una proteasa, pepsina. También, el F(ab')2 puede producirse uniendo Fab' descrito anteriormente mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.
El Fab' de la presente invención puede obtenerse tratando F(ab')2 que reacciona específicamente con CEACAM5 con un agente reductor, tal como ditiotreitoJ. También, el Fab' puede producirse insertando secuencias de AON que codifican cadenas Fab' del anticuerpo en un vector para la expresión proca riota, o un vector para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para llevar a cabo su expresión
El scFv de la presente invención puede producirse tomando secuencias de las CDR o dominios VH y VL como se ha descrito previamente, construyendo un ADN que codifica un fragmento scFv, insertando el AON en un vector de expresión procariota o eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresión en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, puede usarse una tecnología muy conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de acuerdo con la invención, e injertarlas en un marco de fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (véase, por ejemplo, los documentos WO 98f45322; WO 87102671 ; US 5.859.205; US 5.585.089; US 4.816.567; EP 0173494).
Modificación de los anticuerpos de la invención
Se contemplan la o las modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado injertando simplemente solo CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión a antígeno puede reducirse en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en CDR sino también en FR, pueden estar asociados directa o indirectamente con la actividad de unión a antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos restos de aminoácidos por diferentes restos de aminoácidos derivados de FR de VH y VL del anticuerpo humano reduciria la actividad de unión. Con el fin de resolver este problema, en los anticuerpos humanos injertados con CDR no humanas, se han hecho intentos para identificar, entre las secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de anticuerpos humanos, un resto de am inoácido que está directamente asociado con la unión del anticuerpo, o que interacciona con un resto de aminoácido de una CDR, o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociado con la unión al antígeno. La actividad de unión a antígeno reducida podría incrementarse reemplazando los aminoácidos identificados por restos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano.
En una realización de la presente invención, las seis CDR de un anticuerpo murino de la invención y tres aminoácidos de su marco se injertaron en un marco humano, dando como resultado un anticuerpo humanizado (MAb2_ VLg5VHg2) que tiene una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:74 y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:75, que mantuvo las características de unión a CEACAM5 humano y de macaco.
Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, e incluso así dar como resultado un anticuerpo o polipéptido funcional con características deseables.
Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, puede considerarse el indice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos a la hora de conferir función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteina resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores, AON, anticuerpos, antigenos, y similares A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático tomando como base sus características de hidrofobia y de carga; éstos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (4,5)
Un objeto adicional de la presente invención también engloba las variantes conservativas de la función de los polipéptidos de la presente invención
Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la actividad. Como la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad funcional biológica, pueden hacerse determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica, y por supuesto en su secuencia de codificante del AON, a la vez que no obstante se obtiene una proteína con propiedades similares. Se contempla así que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de los anticuerpos de la invención, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos polipéptidos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.
Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice
o puntuación hidropática similar y aun asi dar como resultado una proteina con actividad biológica similar, es decir, aun asi obtener una proteina biológica funcionalmente equivalente. También es posible usar tecnologías bien establecidas, tales como estrategias de escaneo de alanina, para identificar, en un anticuerpo o polipéptido de la invención, todos los aminoácidos que pueden sustituirse sin pérdida significativa de unión al antígeno. Dichos restos pueden calificarse como neutros, ya que no están implicados en la unión al antígeno ni en mantener la estructura del anticuerpo. Una o más de estas posiciones neutras puede sustítuirse por alanina o por otro aminoácido sin cambiar las características principales del anticuerpo o polipéptido de la invención.
Esto se ilustró en la presente invención por una estrategia de escaneo de alanina hecho en las CDR de MAb2K52R, que muestra que varias posiciones de estas COR aparecen como neutras, ya que una alanina pudo sustituirse de hecho sin efecto significativo sobre la unión a CEACAM5 humana y de macaco. Por lo tanto se espera que las variantes de anticuerpo que resultan de dichas sustituciones neutras permanezcan funcionalmente idénticas al anticuerpo parental. En el ejemplo 6,4 proporcionado, se hicieron sustituciones en una variante humanizada de MAb2, pero es predecible que las mismas variaciones también mantendrían la función biológica cuando se introduzcan en cualquier variante de MAb2, Mab4 o Mab5, ya que estos anticuerpos relacionados portan todos el mismo conjunto de 6 CDR o unas muy relacionadas. Las posiciones neutras pueden definirse como restos 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89 , 90 , 93, 94, 96, 97 en las secuencias de VL de esta fami lia de anticuerpos (SEO ID NO:34 o SEO ID NO:38 o SEO ID N0:40 o SEO ID NO:17 o SEO ID NO:23 o SEO ID NO:29 o SEO ID NO:55 o SEO ID NO:75), y restos 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, 109 en las secuencias de VH de esta familia de anticuerpos (SEO ID NO:33 o SEO ID NO:37 o SEO ID NO:39 o SEO ID NO:5 o SEO ID NO:51 o SEO ID NO:74)
Las posiciones neutras pueden observarse como las posiciones en las que cualquier sustitución de aminoácidos podría incorporarse en las COR de Mab2, Mab4 o Mab5. De hecho, en el principio del escaneo de alanina, la alanina se elige porque este resto no porta características estructurales o químicas específicas. Se admite generalmente que si una alanina puede sustituirse por un aminoácido específico sin cambiar las propiedades de una proteína, es probable que muchas otras, si no todas las sustituciones de aminoácidos también sean neutras. En el caso opuesto en el que la alanina es el aminoácido de tipo salvaje, si puede mostrarse que una sustitución específica es neutra, es probable que otras sustituciones también serían neutras
En el ejemplo 6,4 proporcionado, también se han identificado cuatro posiciones en las CDR de Mab2, Mab4 o Mab5, que no se encontraron neutras en el contexto del escaneo de alanina, pero en las que un tipo conselVativo de sustituciones de aminoácidos tiene un efecto neutro (restos 30 y 92 en las secuencias de VL y restos 98 y 100 en las secuencias de VH de esta familia de anticuerpos).
También se espera que dos o más mutaciones neutras en diferentes posiciones en cualquiera o en las dos secuencias de cadena de los anticuerpos, cuando se combinan, dieran como resultado habitualmente un anticuerpo que mantiene esencialmente las actividades funcionales del anticuerpo parental. Esto se ha ilustrado, por ejemplo, con las sustituciones combinadas LC_T51A y LC~Tg4Aquot; VL~S31A y VH_G54Y, o VL~T531 y VH_S53A en MAb2~VLg5VHg2.
Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente, por lo tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta cualquiera de las características anteriores son muy conocidas para los expertos en la técnica, e induyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina
También puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efectora, por ejemplo para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antigeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Altemativa o adicionalmente, pueden introducirse resto(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalizacián mejorada y/o una mayor capacidad para exterminar células mediada por complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (AOCC) (Caron PC. et al. 1992; y Shopes B. 1992)
Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrÓfl de glicosilación original del anticuerpo, es decir, eliminando uno o más restos de hidratos de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilaci6n que no están presentes en el anticuerpo. La presencia de las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina, y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, crea un sitio de glicosilación potencial. La adición o supresión de sitios de glicosilación en el anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación enlazada mediante N).
otro tipo de modificación implica la eliminación de secuencias identificadas, bien in silico o experimentalmente, como que dan como resultado potencialmente productos de degradación o heterogeneidad de las preparaciones de anticuerpo. Como ejemplos, la desamidación de los restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como pH y exposición en la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor medida en otras secuencias de dipéptido tales como Asn-Ala. Cuando está presente dicho sitio de desamidación, en particular AsnGly, en un anticuerpo o polipéptido de la invenciÓfl, puede ser por lo tanto deseable eliminar el sitio, típicamente por sustitución conselVativa para eliminar uno de los restos implicados. También se pretende que dichas sustituciones en una secuencia para eliminar uno o más de los restos implicados estén englobadas por la presente invención
Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glic6sidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedante que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación enlazada mediante N o mediante O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar o azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, dichos métodos se describen en el documento WO 87105330
La eliminación de cualquier resto de hidratos de carbono presente en el anticuerpo puede realizarse química o enzimáticamente La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido triftuorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o de todos los azúcares excepto el azúcar enlazante (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras deja el anticuerpo intacto. La desglicosilación quimica se describe por Sojahr H. et al. (1987) y por Edge, AS. et al (1981). La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en anticuerpos puede conseguirse por el uso de una variedad de endo-y exoglicosidasas, como se describe por Thotakura, NR. et al. (1987).
otro tipo de modificación cava lente del anticuerpo comprende el enlace del anticuerpo a uno de una va riedad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes US nO$ 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337
Inmunoconjugados
La presente invención también incluye conjugados citotóxicos, o inmunoconjugados, o conjugados anticuerpo-fármaco, o conjugados. Tal y como se usa en el presente documento, todos estos términos tienen el mismo significado y son intercambiables
Los anticuerpos murinos, MAb1, MAb2, MAb3, MAM, Y MAb5, se han conjugado a un maitansinoide (DM4) mediante un enlazador SPDB (piridilditiobutirato de N-succinimid ilo). Se encontró que los conjugados de anticuerpofármaco (ADC) resultantes tenían actividad citotóxica en células de cáncer gástrico humano MKN45, con valores de CI5Q::; 1 nM.
De manera similar, se prepararon coojugados de anticuerpo-SPDB-DM4 tomando como base una forma quimérica de cada uno de MAb1, MAb2, MAM, Y MAb5. Los chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb3-SPDB-DM4, y chMAM-SPDB-DM4 resultantes se evaluaron a dos dosis frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. El análisis de los cambios en el volumen tumoral para cada tratado y control y el % de la regresión tumoral indicaron que chMAb2-SPDB-DM4, chMAM-SPDB-DM4, y chMAb5-SPDBDM4 eran altamente activos, al menos a la máxima dosis ensayada, y que chMAb2-SPDB-DM4 era activo a ambas dosis ensayadas. De forma importante, se obtuvieron porcentajes de regresión tumoral hasta 82%.
Los conjugados de antícuerpo-SPDB-DM4 también se prepararon usando las variantes humanizadas de MAb2 (huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, Y huMAb2-3-SPDB-DM4). ADC, que incluyen las variantes quiméricas (chMAb2-SPDB-DM4) o humanizadas de MAb2, se compararon con un anticuerpo-SPDB-DM4 irrelevante en busca de actividad citotóxica sobre células MKN45. Todas las variantes quiméricas y humanizadas de los ADC de MAb2 presentaron va lores de CI5Q S 1 nM, es decir, va lores de CI5Q 53 a 35 veces menores que la actividad citotóxica medida del conjugado de DM4 irrelevante, indicando de esta manera actividades citotóxicas mediadas por CEACAM5 de los conjugados anti-CEACAM5.
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 se evaluó y se comparó coo la de chMAb2-SPDB-DM4 frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atímicos CD-1. Todos los conjugados fueron altamente activos a la máxima dosis ensayada (10 mgfkg).
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 se evaluó adicionalmente frente a tumores de colon primarios medibles CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. huMAb2-3-SPDBDM4 fue activo a 5 y 2,5 mgfkg, huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 fue muy activo a 5 mg/kg y activo a 2,5 mgfkg.
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 se evaluó adicionalmente frente a tumores de pulmón primarios medibles LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCID, y se encontró que era muy activo a 10 y 5 mgfkg
Cada conjugado de DM4 incluyó un número medio de moléculas de DM4 (o quot;relación fármaco a anticuerpoquot; o quot;DARquot;) que variaba de 2 a 5.
De acuerdo con esto, la invención se refiere a ~inmunoconjugadosquot; que comprenden un anticuerpo de la invención enlazado o coojugado a al menos un agente inhibidor del crecimiento, tal como un agente citotóxico o un isótopo radioactivo
Un quot;agente inhibidor del crecimientoquot;, o quot;agente anti-proliferativoquot;, que puede usarse indistintamente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula tumoral, bien in vitro o In VIVO
El término quot;agente citotóxicoquot;, ta l y como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inh ibe o evita la función de las células ylo causa la destrucción de las células. Se pretende que la expresión quot;agente citotóxicoquot; incluya agentes quimioterapéuticos, enzimas, antibióticos y toxinas tales como toxinas que soo moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de éstas, y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos descritos más adelante. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un taxoide, vincas, un maitansinoide o análogo de maitansinoide tal como DM1 o DM4, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina o pirrolobenzodiazepina, un derivado de criptoficina, un derivado de leptomicina, un análogo de auristatina o dolastatina, un profármaco, inhibidores de la topoisomerasa 11, un agente alquilante de ADN, un agente anli -tubulina, un CC-1065 o análogo de CC-1065
Tal y como se usa en el presente documento, quot;maitansinoidesquot; indica maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y que son altamente tóxicos para las células de los mamíferos
Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol
Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados están descritos en las patentes U.S. nO$ 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; Y 5.846.545.
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado incluyen:
(1)
C·19·descloro (patente U.S. n() 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de ansamilocina P2);
(2)
C-20-hidroxi (o C-20--desmetilo) +f-C·19--descloro (patente U.S. nO$ 4.361 .650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o descloración utilizando LAH); y
(3)
C-20--desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +f-descloro (patente U.S. nO 4.294.757) (preparado por acilaciÓfl utilizando cloruros de acilo).
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen·
(1 ) C-9-SH (patente U.S. nO 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2SS);
(2)
C-14-alcoximetilo (desmetoxifCH20R) (patente U.S. nO 4.331 .598);
(3)
C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH20H o CH20Ac) (patente U.S nO 4.450.254) (preparado de Nocardia);
(4)
C-15-hidroxifaciloxi (patente U.S. nO 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por
Streptomyces);
(5)
C-15-metoxi (patente U.S. nO$ 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia fludiflora);
(6)
C-18-N-desmetilo (patente U.S. nO$ 4.362.663 y 4.322.348) (preparado mediante la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y
(7)
4.5--desoxi (patente U.S. nO 4.371.533) (preparado mediante la reducción de maitansinol por tricloruro de titanio/LAH)
En una realización de la invención, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), denominado formalmente W·--desacetil-W·'(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 se representa por la siguiente fórmula estructural (I):
Mea
(1).
o .# N~O
OH
Mea
En otra rea lización, los conjugados citolóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide DM4 que contiene tiol, denominado formalmente W'.desacetil-W'-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM4 se representa por la siguiente fórmula estructural (11):
I \
MeO
'quot;
(11 )
En realizaciones adicionales de la invención, se pueden utilizar otras maitansinas, incluyendo maitansinoides que contienen tiol y disulfuro que presentan una susliluciórJ con mono-o dialquilo en el átomo de carbono que lleva el átomo de azufre. Éstos incluyen un maitansinoide que tiene, en e -3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi, o C-20 desmet ilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que porta un grupo sulfhidrilo impedido, en el que el álomo de carbono del grupo acilo que porta la funcionalidad tiol tiene uno o dos sustituyenles, siendo dichos susliluyenles CH3, C2Hs, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 reactivos, y cualquier agregado que pueda estar presente en la disoluciórJ.
Los ejemplos de estos agentes citotóxicos y de los métodos de conjugación se proporcionan además en la solicitud WO 2008/010101
Se pretende que la eXfgresión quot;isóto@ radioactivoquot; incluya isótopos radioactivos adecuados para tratar cáncer, tales
Bi212 131 125 90 32 Re l86 Rel88 Sm153
como Ar 11, , Er1 9, 1, 1, y , In11 \ p , , , , Sr89, e isótopos radioactivos de Lu. Dichos
radiois6topos emiten en general principalmente radiación bela. En una realización, el isótopo radioactiva es un isótopo emisor alfa, más precisamente Torio 227 que emite radiación alfa. Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse como se describe en la solicitud WO 2004/091668
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención están unidos covalentemente, directamente o a través de un enlazador escindible o no escindible, a al menos un agente inhibidor del crecimiento.
quot;Enlazadorquot;, lal Y como se usa en el presente documento, significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un polipéptido a un resto de fármaco
Los conjugados pueden prepararse mediante métodos in vitre. Con el fin de enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo enlazador. En la técnica son bien conocidos los grupos enlazadores adecuados, e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos foto-lábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. La conjugación de un anticuerpo de la invención con agentes citotóxicos o agentes inhibidores del crecimiento puede hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, que incluyen, pero no se limitan a, piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB), éster 4-[(5-nitro-2piridinil)ditio]-2, 5-dioxo-1-pirrolid inílico del ácido bulanoico (nitro-SPDB), ácido 4-(piridin-2-ild isu Ifan il)-2 -sulfo-butirico (sulfo-SPOB), (2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (lales como adipimidato de dimetilo HCI), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos fluorados bisactivos (tales como 1,5--difluoro-2,4--dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al (1987)_ El ácido 1-isotiocianatobencil metildietilen lriaminopentaácetico marcado en carbono (MX-OTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo (documento W094/ 11026)
El enlazador puede ser un quot;enlazador escindiblequot; que facilita la liberación del agente citotóxico o agente inhibidor del crecimiento en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil a ácidos, un enlazador sensible a peptidasas, un enlazador lábil a esterasas, un enlazador fotolábil o un enlazador que contiene disulfuro (véase, por ejemplo, la patente U.S. nO 5,208,020). El enlazador también puede ser un quot;enlazador no escindiblequot; (por ejemplo, enlazador de SMCC) que podría dar lugar a una mejor tolerancia en algunos casos
Alternativamente, puede prepararse, por técnicas recombinantes o sintesis de péptidos, una proteina de fusión que comprende el anticuerpo de la invención y un polipéptido citotóxico o inhibidor del crecimiento. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en Terapia con Profármacos Dirigida por Enzimas conjugando el polipéptido a una enzima que activa un profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilico, véase el documento WO 81/01145) en un fármaco anticanceroso activo (véanse, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente U.S. nO 4.975.278). El componente enzimático del 5 inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de una manera tal que lo convierte en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfalasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir f1uorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteasas, tales 10 como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes O-aminoácido; enzimas que esciden hidratos de carbono tales como O-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; Plactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con P-Iaclamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales
15 como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivalizados en sus nitrógenos aminicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas se pueden unir covalentemente a los polipéptidos de la invención por técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente
De acuerdo con una realización, en el conjugado de la invención, el agente inhibidor del crecimiento es un 20 maitansinoide; en una realización, DM1 o DM4
En dicho conjugado, el anticuerpo se conjuga a dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento por un grupo enlazador. En una realización, dicho grupo enlazador es un enlazador escindible o no escindible, tal como SPDB, sulfo-SPDB, o SMCC.
El conjugado se puede seleccionar del grupo que consiste en:
25 i) un conjugado de anticuerpo-SPOB-OM4 de fórmula (111)
LYs--1r
Anticuerpo
(111 );
n
Ab-SPDB-DM4
ii) un conjugado de anticuerpo-sulfo-SPOB-DM4 de fórmula (IV)
5 En dicha realización, el anticuerpo incluido en el conjugado se selecciona del grupo que consiste en quot;
i) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:17,
ii) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:23,
10 ¡ii) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:29, y
iv) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:55
En una realización, el conjugado es un conjugado de fórmula (111), (IV) o (V) como se ha definido anteriormente, en el 15 que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:29
En general, el conjugado se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de:
el I O N
Ab-SulfoSPDB-DM4
y
¡ii) un conjugado de anticuerpo~SMCC-DM1 de fórmula (V)
o
I
LYs--1r
Anticuerpo
(IV);
n
H N
o
Anticuerpa
(V).
n
(i)
poner en contacto una disolución acuosa opcionalmente amortiguada de un agente de unión a células (por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invenciÓn) con disoluciones de un enlazador y un compuesto citotóxico;
(ii)
después, separar opcionalmente el conjugado que se ha formado en (i) del agente de unión a células que no ha reaccionado
La disolución acuosa del agente de unión a células puede amortiguarse con amortiguadores tales como, por ejemplo, fosfato de potasio, acetato, citrato o ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (amortiguador de Hepes). El amortiguador depende de la naturaleza del agente de unión a células. El compuesto citotóxico está en disolución en un disolvente orgánico polar, por ejemplo sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA)
La temperatura de reacción normalmente está comprendida entre 20 y 40°C. El tiempo de reacción puede variar de 1 a 24 horas. La reacción entre el agente de unión a células y el agente citotóxico se puede monitorizar mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) con un detector refractométrico yfo UV. Si el rend imiento del conjugado es demasiado bajo, se puede ampliar el tiempo de reacción .
El experto en la técnica puede usar varios métodos de cromatografía diferentes para realizar la separación de la etapa (ii): el conjugado se puede purificar por ejemplo mediante SEC, cromatografía de adsorción (tal como cromatografia de intercambio iónico, lEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografia de afinidad, cromatografía de soporte mixto tal como cromatografía de hidroxiapatita o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). TambiérJ puede usarse la purificación por diálisis o diafiltración.
Tal y como se usa en el presente documento, el término quot;agregadosquot; significa las asociaciones que se pueden formar entre dos o más agentes de unión a células, estando dichos agentes modificados o no por conjugación. Los agregados se pueden formar bajo la influencia de un gran número de parámetros, tales como una elevada concentración de agentes de unión a células en la disolución, el pH de la disolución, fuerzas de cizallamiento elevadas, el número de dímeros enlazados y su carácter hidrófobo, la temperatura (véase Wang y Gosh, 2008, J. Membrane ScL, 318: 311-316, y referencias citadas en dicho documento); nótese que la influencia relativa de algunos de estos parámetros no está claramente establecida. En el caso de proteínas y anticuerpos, el experto en la técnica se referirá a Cromwell et al. (2006, MPS Jounal, 8(3): E572-E579). El contenido de agregados se puede determinar con técnicas bien conocidas por el experto, tales como SEC (véase Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).
Después de la etapa (i) o (ii), la disolución que contiene el conjugado puede someterse a una etapa adicional (iii) de cromatografia, ultrafiltración y/o diafiltración.
El conjugado se recupera al final de estas etapas en una disolución acuosa
De acuerdo con una realización, el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza por una ~relación fármaco a anticuerpoquot; (o quot;DARquot;) que varía de 1 a 10, por ejemplo de 2 a 5, en particular de 3 a 4. Este es generalmente el caso de conjugados que incluyen moléculas de maitansinoide.
Este número DAR puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del fármaco (es decir, el agente inhibidor del crecimiento) usado, junto con las condiciones experimentales usadas para la conjugación (como la relación agente inhibidor del crecimiento/anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del codisolvente, si se usa) Así, el contacto entre el anticuerpo y el agente inhibidor del crecimiento da lugar a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre sí por diferentes relaciones fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. La DAR que se determina es así un valor medio
Un método que puede usarse para determinar la DAR consiste en medir espectrofotométricamente la relación de la absorbancia de una disolución de conjugado sustancialmente puro a AO Y a 280 nm. 280 nm es una longitud de onda usada generalmente para medir concentración de proteínas, tal como concentración de anticuerpo. La longitud de onda AD se selecciona para permitir discriminar el fármaco del anticuerpo, es decir, como ya conoce el experto, AD es una longitud de onda a la que el fármaco tiene una absorbancia alta y AO está lo suficientemente alejada de 280 nm como para evitar una superposición sustancial en los picos de absorbancia del fármaco y el anticuerpo. AO puede seleccionarse para ser 252 nm en el caso de moléculas de maitansinoide. Un método para calcular DAR puede obtenerse de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science:
Las absorbancias para el conjugado a AO (A.,.o) y a 280 nm (Azoo) se miden o bien sobre el pico monoméfico del análisis por cromatografia de exclusión de tamaños (SEC) (que permite calcular el parámetro quot;DAR(SEC)quot;) o bien usando un aparato espectrofotométrico clásico (que permite calcular el parámetro quot;DAR(UV)quot;) Las absorbancias se pueden expresar como se indica a continuación
en las que:
•
Co y CA son respectivamente las concentraciones en la disoluciÓfl del fármaco y del anticuerpo
•
CO~O y COl80 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del fármaco a }.o y 280 nm
•
Cquot;quot;o y CA280 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del anticuerpo a AO y 280 nm.
La resolución de estas dos ecuaciones con dos descOflocidos conduce a las ecuaciones siguientes:
Co = ((&A2SO X AAO) -(&MO X A280)] I [(&01.0 x&A280) -(CA.\O xCl.l280)]
CA = [A280 -(Co x t Ol80)] I t A280
La DAR promedio se calcula a partir de la relación de la concentración de fármaco a la del anticuerpo· DAR =ColCA
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas
Así, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un inmunoconjugado de la invención y un vehiculo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a un polipéptido o un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, para uso como un medicamento.
quot;Farmacéutica mentequot; o quot;farmacéutica mente aceptablequot; se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un material de relleno sólido, semi-sólido o líquido, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar no tóxico de cualquier tipo
Tal y como se usa en el presente documento, quot;vehículos farmacéuticamente aceptablesquot; incluyen todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, aminoácidos, disolución salina, disolución salina amortiguada con fosfato, amortiguador de fosfato, acetato, citrato, succinato; aminoácidos y derivados tales como histidina, arginina, glicina, prolina, glicilglicina; sales inorgánicas de NaCI, cloruro de calcio; azúcares o polialcoholes tales como dextrosa, glicerol, etanol, sacarosa, trehalosa, manitot; tensioactivos tales como Polisorbato 80, Polisorbato 20, poloxámero 188; y similares, así como combinación de éstos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición, y la formulación también puede contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizador tal como Tween 20
La forma de las composiciones farmacéuticas, la ruta de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, peso y sexo del paciente, etc
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular, y similares.
En una realización, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que SOfl farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede ser inyectada. Éstas pueden ser disoluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato de monosodio o de disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de estas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que después de la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de disolución salina fisiológica, permiten la constitución de disoluciones inyectables
La composición farmacéutica puede administrarse mediante dispositivos de combinación de fármacos.
Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de varios parámetros, y por ejemplo como una función del modo de administración usado, de la patología relevante, o altemativamente de la duraciÓfl deseada del tratam iento
Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención en un vehículo o medio acuoso farmaceuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones estériles inyectables. En todos los casos, la forma debe ser estéril e inyectable con el dispositivo o sistema apropiado para el suministro sin degradación. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe proteger frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos
Las disoluciones de los compuestos activos como una base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y sus mezclas y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos
Un polipéptido, anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorflídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, glicina, histidina, procaína, y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), sus mezclas adecuadas, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y usando tensioactivos La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenal, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con cualquiera de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehiculo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado en vacío y liofilización, que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración de éstos
También se contempla la preparación de disoluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, en las que se considera el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, administrando altas concentraciones de los agentes activos en una pequeña área tumoral.
Al formularlas, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de disoluciones inyectables descrito anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe amortiguarse adecuadamente si es necesario, y el diluyente líquido debe volverse isotónico en primer lugar con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos para los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 mi de disolución isotónica de NaCl, y añadirse a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, quot;Remington's Pharmaceutical Sciencesquot; 153 Ed ición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual
El anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede formularse en una mezcla terapéutica para comprender aproximadamente 0,01 a 100 miligramos, por dosis aproximadamente
Además del anticuerpo o inmunoconjugado formu lado para administración parenteral , tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación temporal; y cualquier otra forma usada actualmente.
En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de polipéptidos en células hospedantes. La formación y uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos para los expertos en la técnica
Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar
efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, dichas particulas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 ~m) se diseñan generalmente usando polimeros capaces de degradarse in vivo. Las nanoparticulas biodegradables de policiallOacrilato de alquilo, o las nanoparticulas biodegradables de polilactida o polilactida-co-glicolida que cumplen estos requisitos se contemplan para uso en la presente invención, y dichas partículas pueden prepararse fácilmente.
Los liposomas están formados por fosfolípidos que están dispersados en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas con bicapa multilaminares concéntricas (también denominadas vesículas multilaminares (MLV». Las MLV tienen generalmente diámetros de 25 nm a 4 f.lm . La sonicación de las MLV da como resu ltado la formación de vesiculas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A. que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes d ivalentes.
Métodos terapéuticos y usos
Los inventores han mostrado que los cinco anticuerpos que han producido son capaces de intemalizar el complejo de CEACAM5-anticuerpo después de la unión. Además, han mostrado que estos anticuerpos, combinados con un maitansinoide citotóxico (DI\I14), inducen actividad citotóxica en células tumorales humanas MKN45 in vitro. También han mostrado que estos inmunoconjugados inducen una actividad anti-tumoral importante in vivo en un modelo murino de xenoinjertos de tumor de colon primario humano derivado de un paciente, cuando se usan a una dosis de 5 mglkg y 2,5 mgfkg, con una única inyección en el día 14 después del implante del tumor.
Así, los polipéptidos, anticuerpos, inmullOconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para tratar cáncer.
El cáncer que se va a tratar con anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención es un cáncer que expresa CEACAM5, en particular que sobreexpresa CEACAM5 comparado con células normales (es decir, no tumorales) del mismo origen tisular. La expresión de CEACAM5 por las células cancerosas puede ensayarse fácilmente, por ejemplo, usando un anticuerpo de acuerdo con la invención, como se describe en la sección siguiente quot;Usos diagnósticosquot;, y en particular por un método inmunohistoquímico, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 8
En una realización, el cáncer puede ser un cáncer colOfrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de higado (por ejemplo colangiocarcinoma), de próstata o de piel. El cribado de un panel de tumores humanos por inmunohistoquímica usando un anticuerpo de ratÓfl anti-CEACAM5 humana de acuerdo con la invenciÓfl mostró de hecho tinción de anticuerpo en estos tipos de cánceres, como se describe con más detalles en el Ejemplo 8
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse solos o en combinación con cualquier agente inhibidor del crecimiento adecuado.
Los anticuerpos de la invención pueden conjugarse o enlazarse a un agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o una enzima activadora de profármaco como se ha descrito previamente. Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles de hecho para dirigir dicho agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o un profármaco a las células cancerosas que expresan o sobreexpresan CEACAM5 en su superficie
Tambien es bien conocido que los anticuerpos monoclonales terapeuticos pueden dar lugar al agotamiento de células que portan el antígeno reconocido específicamente por el anticuerpo. Este agotamiento puede estar mediado por al menos tres mecanismos: citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (AOCC), lisis dependiente de complemento, e inhibición anti-tumoral directa del crecimiento tumoral mediante señales proporcionadas mediante el antígeno al que está dirigido el anticuerpo.
quot;Citotoxicidad dependiente del complementoquot; o quot;COCO se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento a anticuerpos que están unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de COC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997)
quot;Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerposquot; o quot;ADCCquot; se refiere a una forma de citoto:xicidad en la que anticuerpos segregados unidos a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana que porta un antígeno, y posteriormente exterminar a la célula diana. Para evaluar la actividad de AOCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de AOCC in vitro, tal como el
descrito en la patente US nO 5.500.362 o 5.821 .337
Así, un objeto de la invención se refiere a un método para tratar un cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéutica mente eficaz de un polipéptido, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención
En el contexto de la invención, el término quot;tratarquot; o quot;tratamientoquot;, tal Y como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastomo o la afección a la que se aplica tal término, o uno o más síntomas de dicho trastomo o afección. Por la expresión quot;tratar cáncerquot;, tal y como se usa en el presente documento, se quiere decir la inhibición del crecimiento de células malignas de un tumor y/o la progresión de metástasis de dicho tumor. Dicho tratamiento también puede dar lugar a la regresión del crecimiento tumoral, es decir, la disminución del tamaño de un tumor medible. En particular, dicho tratamiento da lugar a la regresión completa del tumor o metástasis
De acuerdo con la invención, el término quot;pacientequot; o quot;paciente que lo necesitaquot; está destinado a un ser humano o mamífero no humano afectado o con probabilidad de estar afectado con un tumor maligno. En particular, dicho paciente puede ser un paciente que se ha determinado que es susceptible a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular a un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención, por ejemplo de acuerdo con un método como se describe más adelante aqui
Por una quot;cantidad terapéuticamente eficazquot; del polipéptido de la invención se quiere decir una cantidad suficiente del polipéptido para tratar dicha patología cancerosa, con una relación beneficiolriesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, se entenderá que el uso total diario de los polipéptidos y composiciones de la presente invención lo decidirá el médico que atiende dentro del criterio médico razonable. El nivel de dosis terapéutica mente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el trastomo que se va a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del polipéptido específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, via de administración, y tasa de excreción del polipéptido especifico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o al mismo tiempo con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica el empezar con dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se consigue el efecto deseado.
otro objeto de la invención se refiere a un polipéptido, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de un tumor maligno.
El polipéptido, anticuerpo, inmunoconjugado o composición farmacéutica puede usarse para inhibir la progresión de metástasis de un tumor maligno
Los polipéptidos de la invención pueden usarse en combinación con cualquier otra estrategia terapéutica para tratar un tumor maligno (por ejemplo, terapia adyuvante), y/o para reducir el crecimiento del tumor metastásico.
La eficacia del tratamiento con un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención puede ensayarse fácilmente in vivo, por ejemplo en un modelo de ratón de cáncer, y midiendo, por ejemplo, cambios en el volumen tumoral entre los grupos tratado y de control, % de regresión tumoral, regresión parcial ylo regresión completa como se define en el Ejemplo 5.3
Usos diagnósticos
Se ha dado a conocer que CEACAM5 se expresa altamente en la superficie de células de tumor colorrectal, gástrico, de pulmón, uterino, y se expresa débilmente en pocas células epiteliales normales tales como células epiteliales de colon y esófago. Además, el cribado de un panel de tumores humanos por inmunohistoquímica usando un anticuerpo de ratón anli-CEACAM5 humana de acuerdo con la invención mostró tindón de anticuerpo en cánceres colorreclal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, y de piel.
Por lo tanto, CEACAM5 constituye un marcador canceroso y, por lo tanto, tiene el potencial de usarse para indicar la eficacia de una terapia anti-cancerosa o detectar la recurrencia de la enfermedad.
En una realización, el anticuerpo de la invención se usa como componente de un ensayo en el contexto de una terapia dirigida a tumores que expresan CEACAM5, con el fin de determinar la susceptibilidad del paciente al agente terapéutico, monitorizar la eficacia de la terapia anti-cancerosa, o detectar la recurrencia de la enfermedad después del tratamiento. En particular, el mismo anticuerpo de la invención se usa tanto como componente del agente terapéutico como componente del ensayo de diagnóstico
Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso para detectar in vivo la expresión de CEACAM5 en un sujeto, o para uso para detectar ex vivo la expresión de CEACAM5 en la muestra biológica de un sujeto. Dicha detección puede estar destinada en particular para
a) diagnosticar la presencia de un cáncer en un sujeto, o b) determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, o
e) monitorizar la eficacia de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 o detectar la recaída de cáncer después de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, en particular para terapia con un inmunoconjugado de acuerdo con la invención;
detectando la expresión de la proteína de superficie CEACAM5 en células tumorales
En una realización, el anticuerpo está destinado para un uso in vi/ro o ex vivo. Por ejemplo, CEACAM5 puede detectarse in vitro o ex vivo en una muestra biológica obtenida de un sujeto, usando un anticuerpo de la invención. El uso de acuerdo con la invención también puede ser un uso in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invención se administra al sujeto y los complejos anticuerpo-células se detectan y/o cuantifican, con lo cual la detección de dichos complejos es indicativa de un cáncer
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en·
(a)
poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b)
medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c)
detectar la presencia de un cáncer comparando el nivel medido de anticuerpo unido con un control, siendo un nivel incrementado de anticuerpo unido comparado con el control indicativo de un cáncer.
La invención también se refiere a un método in vitro o ex vivo para determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular a un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, método que comprende las etapas que consisten en:
(a)
poner en contacto una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer con un anticuerpo de acuerdo con la invenciÓfl, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b)
medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c)
comparar el nivel medido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica con el nivel de anticuerpo unido a un control ;
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con control es indicativo de un paciente susceptible a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5
En los métodos anteriores, dicho control puede ser una muestra biológica norma l, no cancerosa, del mismo tipo, o un valor de referencia que se determina como representativo del nivel de unión del anticuerpo en una muestra biológica normal del mismo tipo.
En una realización, los anticuerpos de la invención son útiles para diagnosticar un cáncer que expresa CEACAM5, tal como un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, o de piel.
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para monitorizar la eficacia de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, que comprende las etapas que consisten en·
(a)
poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que está sometido a terapia contra el cáncer antiCEACAM5 con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b)
medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c)
comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel disminuido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de eficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5
En dicho método, un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de ineficacia de dicha terapia contra el cáncer antj-CEACAM5.
En una realización, dicho control es una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se ha obtenido del sujeto previamente en el tiempo, durante el curso de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para detectar la recidiva del cáncer después de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, que comprende las etapas que consisten enquot;
(a)
poner en contaclo una muestra biológica de un sujeto que ha completado una terapia contra el cáncer anti-CEACAMS con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo fonne complejos con dicha muestra biológica;
(b)
medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(e)
comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de recidiva del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti -CEACAM5
Dicho control es en particular una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se ha obtenido del sujeto previamente en el tiempo, durante o después de la finalización de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5
Dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 es en particular una terapia que usa un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención. Dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 está dirigida a un cáncer que expresa CEACAM5, en particular un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata,
o de piel
En una realización, los anticuerpos de la invención pueden marcarse con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualesquiera otros marcadores conocidos en la técnica que proporcionen (bien directa o indirectamente) una señal
Tal y como se usa en el presente documento, el término amarcadoquot;, respecto al anticuerpo de acuerdo con la invención, pretende englobar el marcaje directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, enlazamiento físico) de una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FIlC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5» al polipéptido, así como el marcaje indirecto del polipéptido por reactividad con una sustancia detectable.
Un anticuerpo de la invención puede marcarse con una molécula radioactiva por cualquier método conocido en la técnica. Por. ejemplo, las moléculas radioactivas incluyenaspero no están limitadas a, un átomo radioactivo para
In11 Rel86 Re1 99
estudios esclntlgráflcos. tal como 1123, 1124, \ , , Tc. Los pollpéptldos de la Invención también pueden marcarse con un marcador de espín para formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocido como formación de imágenes de resonancia magnética, MR1), tal como yodo-123, indio-111 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Una quot;muestra biológicaquot; engloba una variedad de tipos de muestra obtenidos de un sujeto, y pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. Las muestras biológicas incluyen, pero no están limitadas a, sangre u otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tal como muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivados de ésta, y la progenie de éstas. Por lo tanto, las muestras biológicas engloban muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido, en particular muestra tumoral.
En una rea lización, la muestra biológica puede ser una muestra de tejido fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). De hecho, los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden usarse ventajosamente en tejidos de FFPE que es el formato usado por la mayor parte de los hospitales para recolectar y archivar muestras de tejido.
La invenciÓfl también se refiere a un método in vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
a) administrar un anticuerpo de acuerdo con la invención marcado detectablemente a un paciente;
b) detectar la localización de dicho anticuerpo marcado detectablemente en el paciente por formación de imágenes.
Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para determinar el estadía del cáncer (por ejemplo, en formación de radioimágenes). Pueden usarse solos o en combinación con otros marcadores cancerosos.
Los términos quot;detecciónquot; o adetectadoquot;, tal y como se usan en el presente documento, incluyen la detección cualitativa yfo cuantitativa (medir los niveles) con o sin referencia a un control.
En el contexto de la invención, el término quot;diagnosticarquot;, tal y como se usa en el presente documento, significa la determinación de la naturaleza de una afección médica destinada a identificar una patología que afecta al sujeto a partir de varios datos recolectados.
En dicho método, el cáncer es un cáncer que expresa CEACAMS, en particular un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, o de piel
Kits Finalmente, la invención también proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención encuentran uso en la detección de la proteína de superficie CEACAMS, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Los kits de la invención pueden contener un polipéptido o anticuerpo acoplado a un soporte sólido, por ejemplo una placa de cultivo tisular o per1as (por ejemplo, perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen anticuerpos para la detección y cuantificación de la
proteína de superncie CEACAM5 in vitro, por ejemplo en un ELlSA o una transferencia Westem. Dicho anticuerpo útil para la detección puede proporcionarse con un marcador tal como uno fluorescente o radiomarcador. BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS SECUENCIAS
SEO ID NO:1--4, y 6 muestran las secuencias de las CDR1 H, COR2-H, COR3+H, CDR1-L y CDR3~L del denominado anticuerpo quot;MAb1 quot;.
SEO ID NO:5 muestra la secuencia de la variante de VH VH1a del anticuerpo MAb2 humanizado. SEO ID NO:7-10, y 12 muestran las secuencias de las CoR1-H, CoR2-H, CoR3-H, CoR1-L y CoR3-L del denominado anticuerpo UMAb2quot;.
SEO ID NO:11 muestra la secuencia de CEACAM1 humana según está disponible en GenBank
NP _001703 ,2 SEO ID NO:13-16, y 18 muestran las secuencias de las CoR1-H, CoR2-H, CoR3-H, CoR1-L y CoR3-L del denominado anticuerpo aMAb3quot;.
SEO ID NO:17 muestra la secuencia de la variante de VL VL 1 del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEO ID NO:19-22, y 24 muestran las secuencias de las COR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo ~MAb4" SEO ID NO:23 muestra la secuencia de la variante de VL VL 1a del anticuerpo MAb2 humanizado. SEO ID NO:25-28, y 30 muestran las secuencias de las CoR1-H, CDR2-H, COR3-H, CDR1 -L y COR3-L del
denominado anticuerpo quot;MAbSquot;. SEO ID NO:29 muestra la secuencia de la variante de VL VL 1c del anticuerpo MAb2 humanizado SEO ID NO:31 muestra la secuencia de VH del anticuerpo quot;MAb1 quot;. SEO ID NO:32 muestra la secuencia de VL del anticuerpo quot;MAb1 quot;. SEO ID NO:33 muestra la secuencia de VH del anticuerpo quot;MAb2quot;_ SEO ID NO:34 muestra la secuencia de VL del anticuerpo quot;MAb2quot;. SEO ID NO:35 muestra la secuencia de VH del anticuerpo quot;MAb3quot;_ SEO ID NO:36 muestra la secuencia de VL del anticuerpo ~MAb3" SEO ID NO:37 muestra la secuencia de VH del anticuerpo quot;MAb4quot;. SEO ID NO:38 muestra la secuencia de VL del anticuerpo quot;MAb4quot;. SEO ID NO:39 muestra la secuencia de VH del anticuerpo quot;MAb5quot;_ SEO ID NO:40 muestra la secuencia de VL del anticuerpo ~MAb5" SEO ID N0:41 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb1 . SEO ID NO:42 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb1 SEO ID NO:43 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb2. SEO ID N0:44 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb2. SEO ID N0:45 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb3
SEO ID N0:46 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb3. SEO ID N0:47 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb4. SEQ ID NO:48 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb4 SEQ ID N0:49 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAbS. SEQ ID NO:50 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb5 SEO ID NO:51 muestra la secuencia de la variante de VH VH1 del anticuerpo MAb2 humanizado SEQ ID NO:S2 muestra la secuencia de CEACAM5 humana de longitud completa según está disponible en la
base de datos GenBank con el número de registro AAA51967, 1 SEO ID NO:53 muestra la secuencia del dominio extracelular de CEACAM5 de Macaca fascicularis. SEO ID NO:54 muestra la secuencia de la cadena ligera de un anticuerpo quimérico (derivado del anticuerpo
MMAb2quot;) que comprende una mutación K52 a R52 SEQ ID NO:55 muestra la secuencia de la variante de VL VL 1d del anticuerpo MAb2 humanizado SEO ID NO:56 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM1 (posiciones 35-428 de
hCEACAM1 de longitud completa (NP_001703,2), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene
una etiqueta de His) SEO ID NO:57 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM1 , seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEO ID NO:58 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM5 (posiciones 35-685 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967,1), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His)
SEO ID NO:59 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM5, seguido de una extensión de
24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His. SEO ID NO:60 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM6 (posiciones 35-327 de hCEACAM6 de longitud completa (NP_002474,3), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His).
SEO ID NO:61 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM6, seguido de una extensión de
24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His. SEO ID NO:62 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM8 (posiciones 35-332 de hCEACAM8 de longitud completa (NP_001807,2), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEO ID NO:63 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM8, seguido de una extensión de
24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His. SEQ ID NO:64 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM7 (posiciones 36-248 de hCEACAM7 de longitud completa (NMP _008821 ,1), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His)
SEO ID NO:65 muestra la secuencia de N-A1 -B1 de hCEACAMS (posiciones 35-320 de hCEACAM5 de
longitud completa (AAA51967, 1.)), seguido de 6 a minoácidos de la etiqueta de His SEO ID NO:66 muestra la secuencia de A2-B2 de hCEACAM5 (posiciones 321-498 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967, 1.)), seguido de 6 a minoácidos de la etiqueta de His
SEO ID NO:67 muestra la secuencia de A3-B3 de hCEACAM5 (posiciones 499-685 de hCEACAM5 de
longitud completa (AAA51967,1.)), seguido de 6 aminoácidos de la etiqueta de His SEO ID NO:68 muestra la secuencia de N-A1-B1 de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His
SEO ID NO:69 muestra la secuencia de A2-B2 de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEO ID NO:70 muestra la secuencia de A3-B3 de cCEACAMS, seguido de una extensión de 24 aminoácidos
que contiene una etiqueta de His SEO ID NO:71 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM6 humana segun está disponible en GenBank NP_002474,3
SEO ID NO:72 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM7 humana según está
disponible en GenBank NP_008821 ,1 SEQ ID NO:73 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM8 humana según está disponible en GenBank NP_001807,2
SEQ ID NO:74 muestra la secuencia de VH del MAb2_VLg5VHg2 humanizado variante SEO ID NO:75 muestra la secuencia de VL del MAb2_VLgSVHg2 humanizado variante. SEQ ID NO:76 muestra la secuencia de aminoácidos en las posiciones 109-115 de A3-B3 de CEACAM5
humana.
SEO ID NO: 77 muestra la secuencia de aminoácidos en las posiciones 131-143 de A3-B3 de CEACAM5 humana SEO ID NO: 78 muestra una secuencia de consenso para CoR1-H de la familia de anticuerpos
MAb2lMAb4fMAb5 basada en comparaciones de secuencias.
SEO ID NO:79 muestra una secuencia de consenso para COR2-H de la familia de anticuerpos MAb2lMAb4fMAb5 basada en comparaciones de secuencias SEO ID NO:80 muestra una secuencia de consenso para CoR3-H de la famitia de anticuerpos
MAb2fMAb4fMAb5 basada en comparaciones de secuencias
SEO ID NO:81 muestra una secuencia de consenso para CoR1-H de la familia de anticuerpos de MAb1fMAb3 SEO ID NO:82 muestra una secuencia de consenso para COR2-H de la familia de anticuerpos de
MAb1fMAb3. SEO ID NO:83 muestra una secuencia de consenso para COR1-H de la familia de anticuerpos
MAb2lMAb4fMAb5 basada en restos identificados como neutros en la uniÓfl de los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis SEO ID NO:84 muestra una secuencia de consenso para COR3-H de la familia de anticuerpos
MAb2lMAb4fMAb5 basada en restos identificados como neutros en la uniÓfl de los dominios extracelulares de
CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis SEO ID NO:85 muestra una secuencia de consenso para CoR1-L de la famitia de anticuerpos MAb2lMAb4fMAbS basada en restos identificados como neutros en la uniÓfl de los dominios extracelulares de CEACAMS humana y de Macaca fascicularis.
SEO ID NO:86 muestra una secuencia de consenso para CoR3-L de la familia de anticuerpos MAb2fMAb4fMAbS basada en restos identificados como neutros en la unión de los dominios extracelulares de CEACAMS humana y de Macaca fascicularis.
SEO ID NO:87 muestra la secuencia de cadena pesada de huMAb2-3 (MAb2_ VL 1cVH1a-lgG1 ). SEO ID NO:88 muestra la secuencia de cadena ligera de huMAb2-3 (MAb2_VL 1cVH1a-lgG1 ). SEO ID NO:89 muestra la secuencia de cadena pesada de huMAb2-4 (MAb2_ VL1d VH1-lgG1) SEO ID NO:90 muestra la secuencia de cadena ligera de huMAb2-4 (MAb2_VL 1d VH1-lgG1 ).
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Evaluación de la selectividad de los anticuerpos anti-CEACAM5. Figura 2: Cartografiado de los dominios de los anticuerpos anti-CEACAM5 en CEACAM5 humana. Figura 3· Cartografiado de los dominios de los anticuerpos anti -CEACAM5 en CEACAM5 de mono macaco
Figura 4: Evaluación de la actividad anli-Iumoral de los conjugados chMAb4-SPOB-DM4, chMAb1-SPOBDM4, chMAb5-SPDB-DM4, y chMAb2-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano prima rio CRIGR-034P en ratones hembra SCID
Figura 5: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4, huMAb2-4-SPDBDM4 y chMAb2-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ralones hembra SeID.
Figura 6: Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado huMAb2-3-SPOB-DM4 frente a adenocarcinoma de estómago humano primario STO-IND-OD6 en ratones hembra SCID
Figura 7: Alineamientos de secuencia de las regiones VH y VL de los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 yMAb5
Figura 8: Análisis de HRMS del conjugado chMAb1-SPoB-oM4. Figura 9· Análisis de HRMS del conjugado chMAb2-SPoB-oM4 Figura 10· Análisis de HRMS del conjugado chMAb4-SPoB-oM4 Figura 11 · Análisis de HRMS del conjugado chMAb5-SPoB-oM4
Figura 12: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-2-SPoB-oM4.
Figura 13: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-1-SPoB-oM4. Figura 14: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-3-SPoB-oM4. Figura 15: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-4-SPoB-oM4 Figura 16: Actividad de unión de variantes humanizadas de MAb2 al dominio extracelular de CEACAM5
humana y de mono
Figura 17: Estabilidad de la unión de variantes humanizadas de MAb2 al dominio extracelular de CEACAM5 humana y de mono.
Figura 18: Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado huMAb2-3-SPoB-oM4 frente a adenocarcinoma de pulmón humano primario LUN -NIC-0014 en ratones hembra SClo
Figura 19: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados huMAb2-3-SPoB-oM4 y huMAb2-3sulfo-SPoB-oM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra atímicos C01 .
Figura 20· Análisis de HRMS de huMAb2-3-sulfoSPoB-oM4
Figura 21 . análisis de HRMS de huMAb2-3-SMCC-oM1 .
Figura 22: Alineamiento del dominio variable de cadena pesada de MAb2, MAb4, MAb5, VH1a humanizado, VH1 humanizado y VHg2 humanizado
Figura 23: Alineamiento del dominio variable de cadena ligera de MAb2, MAb4, MAb5, VL 1 humanizado, VL 1a humanizado, VL 1c humanizado, VL 1d humanizado y VLg5 humanizado.
EJEMPLOS La presente invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes, que no deberían constituir una limitación ad iciona l.
Ejemplo 1: Preparación de dominíos extracelulares recombínantes de proteínas CEACAM En este ejemplo, los dominios proteicos exlracelulares (ECO) de CEACAM de origen humano (h) o de mono macaco
(c) se han preparado por expresión transitoria en células de riñón embrionario humano HEK293 con plásmidos que permiten la expresión del AoNc respectivo como se muestra en la Tabla 1.
Cada plásmido de expresión formó un complejo con 293fectin™ (Life Technologies) y se añadió a células 293 -F cultivadas en suspensión (derivadas de células HEK293). Ocho dias después de la transfección, los sobrenadantes de los cultivos se recolectaron, y la proteína soluble correspondiente se purificó por IMAC (GE Heallhcare) para generar un lote de proteína (véase la Tabla 1)
Tabla 1· Descripción de los dominios extracelulares recombinantes de proteínas CEACAM
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales de ratón anti -CEACAM5
En esle ejemplo, se han generado anticuerpos monoclonales después de inmunizar ratones de acuerdo con un protocolo que dio lugar a la generación de mAb anti-CEACAM5.
Ejemplo 2.1: Inmunización y generación de hibridomas
Las inmunizaciones, fusión y cribado se realizaron usando células de mieloma P3X63-Ag8,653 con el dominio extracelular de CEACAM5 humana, el dominio extracelular de CEACAM5 de macaco o con células tumorales humanas UMC11 como se describe en Wennerberg A.E et al., 1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054 Y Kilpatrick el al. 1997. Hybridoma 16: 381389
Usando el método de RIMMS como se describe por Kilpatrick et al. (1997. Hybridoma 16: 381389), cada uno de ratones hembra BALBfc de 6-8 semanas de edad (S082342; Char1es River Labs, Bar Harbor, ME) recibió cuatro ciclos de inmunización durante una tanda de tratamiento de 14 dias a intervalos de 3-4 dias. Los antigenos emulsionados en adyuvante de Titermax (TierMax Gold Adjuvant; Sigma #T2684) se administraron subcutáneamente en seis sitios próximos a los ganglios linfáticos de drenaje, a lo largo del lomo de los ratones, yen seis sitios yuxtapuestos a lo largo del abdomen. Cuatro días después de la última inyección, se sacrificaron los ratones. Se aislaron asépticamente ganglios linfáticos inguinales, axilares y branquiales, superficiales, popliteales, bilaterales, y se lavaron con medio RPMI fresco.
Usando el método clásico como se describe por Wennerberg A.E et al. (1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054), cada uno de ratones hembra BALBfc de 6-8 semanas de edad «S082342; Charles River Labs, Bar Harbar, ME) recibió tres ciclos de inmunización durante una tanda de tratamiento de 41 días. Los antígenos se administraron intraperitonealmente en el sitio ventral de los ratones. Tres días después de la última inyección, los ratones se sacrificaron, y los bazos se aislaron aséptica mente y se lavaron con medio RPMI fresco
Se liberaron linfocitos de los ganglios linfáticos o de los bazos, y la suspensión de una sola célula se lavó dos veces con medio RPMI antes de fusionarse con células de mieloma P3X63-AG8,653 usando polietilenglicol. Después de la fusión, la mezcla celular se incubó en una incubadora a 3?OC durante 16-24 horas. La preparación de células resultante se transfirió a medio semisólido selectivo, y se colocó de manera aséptica en placas Petri de 100 mm y se incubó a 37°C. Diez dias después del inicio de la selección, las placas se examinaron para determinar el crecimiento de los hibridomas, y las colonias visibles se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos que contenian 200 ~I de medio de crecimiento. Las placas de 96 pocillos se mantuvieron en una incubadora a 370C durante 2 a 4 dias.
Ejemplo 2.2: Cribado y caracterización in vitro de anticuerpos murinos anti-CEACAM5
El cribado primario para la producciÓfl de Ig anti-CEACAM5 se realizó por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELlSA) usando proteína CEACAM5 humana (prepa rada como se describe en el Ejemplo 1) como antígeno de captura, y con FACS usando varias células tumorales humanas (H460, MKN45, SW1463, SKMEL28 Y UMC11) Para el ensayo ELlSA, las placas se revistíeron con proteína CEACAM5 humana a 0,25 Ilg/pocillo en PBS, y se añadieron 100 Illlpocillo de antícuerpos anti-CEACAM5 a la placa. La placa se incubó a 37°C durante 1 h Y se lavó cinco veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Después, se añadieron a cada pocillo 100 111 de una dilución 1:50,000 de IgG de conejo antí-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044) Después de incubar a 37°C durante 1 h en la oscu ridad, las placas se lavaron con PBS -T cinco veces. La uniÓfl del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H202 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Para el ensayo FACS, se utilizaron células tumorales humanas a 40,000 célulasfpocillo para revestir una placa de 96 pocillos High Bind (MSD L 15XB-3), y se añadieron 100 J.llfpocillo de los anticuerpos anti-CEACAM5 durante 45 mino a 4°C y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. Se añadieron 100 J.lllpocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) durante 45 mino a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 J.l1{pocillo de PBS 1% BSA, Y de leer usando el sistema de citometria de flujo Guava® easyCyte 'IN 8HT.
Para evaluar la especificidad por CEACAM5 de los anticuerpos anti -CEACAM5, se revistieron placas de 96 pocillos con proteínas recombinantes humanas CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7 Y CEACAM8 (preparadas como se describe en el Ejemplo 1) usando las mismas condiciones de revestimiento descritas previamente. Los anticuerpos anti-CEACAM5 se añadieron a las placas y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H202 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados presentados en la Figura 1 muestran que los anticuerpos anti-CEACAM5 son selectivos para CEACAM5 humana frente a CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas.
Ejemplo 2.3: Caracterización de la unión de mAb
La afinidad aparente de los anticuerpos anti -CEACAM5 por hCEACAM5 expresada en la superficie de células tumorales humanas MKN45 (DSMZ, ACC 409) se determinó pOf el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte TId 8HT Las células tumorales humanas MKN45 se utilizaron para revestir a 40,000 célulasfpocillo una placa de 96 pocillos High Bind (MSD L15XB-3), y se añadieron 100 lIt/pocillo de anticuerpos anti-CEACAM5 en diluciones seriadas de 2 veces empezando en 20 J.lgfml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min a 4°C, y se lavó tres veces coo PBS 1% BSA. Se añadieron 100 llJ/poci llo de IgG anti-rat6n de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) durante 45 mino a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 llJ/pocillo de PBS 1% BSA y de leer usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte 'IN 8HT. Los valores de KD aparente y de CESO se estimaroo usando los software BIOST@T-BINDINGyBIOST@T-SPEED, respectivamente
Tabla 2: Valores de CESO obtenidos en células MKN45
Anticue s MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
Valores de EC50 16 nM 3,4 nM 6,2nM 4,9nM 0,73 nM
El cartografiado de dominios de los anticuerpos anti-CEACAM5 contra las proteinas CEACAM5 humana y CEACAM5 de macaco se determinó por ELlSA. Se revistieron placas de 96 pocillos con los dominios recombinantes humanos A1 (143-237), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) Y A3-B3 (499-685) de la proteína CEACAM5 (preparados como se describe en el Ejemplo 1) y con los dominios recombinantes de macaco N-A1-B1 (1-320), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321 -498) Y A3-B3 (499-688) de la proteina CEACAM5 (preparados como se describe en el Ejemplo 1) usando las mismas condiciones de revestimiento descritas previamente. Los anticuerpos purificados se añadieron a las placas y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo coojugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB -H202 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados se presentan en las Figuras 2 y 3, Y muestran que los anticuerpos anti-CEACAM5 se unen al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de macaco.
Los isotipos de mAb individuales se determinaron usando un kit de isotipado de IgG de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SEROTEC ref. MMT1). Los cinco mAb específicos de CEACAM5 fueron del isotipo IgG1, k
Ejemplo 3: Caracterización de los anticuerpos murinos anti-CEACAM5
Ejemplo 3.1: Caracterización in vitro de anticuerpos murinos anti-CEACAMS
Se produjeron hibridomas de ratón que expresan Ab específicos de CEACAM5 en matraces T500, y el medio acondicionado se recolectó después de 7 días de crecimiento. Los Ab específicos de CEACAMS se pu rificaron haciendo pasar el medio acondicionado a través de una columna de Proteína G, lavándolo y se eluyéndolo con
amortiguador de glicina/HCI 100 mM pH 2,7. El eluato se dializó frente a PBS antes de filtrarlo de forma esterilil y almacenarlo a 4°C
Todos los mAb específicos de CEACAM5 se evaluaron para determinar su capacidad para unirse a la proteína CEACAM5 humana y de primate por ELlSA. Se revistieron las placas con proteína CEACAM5 humana o de primate, se añadieron mAb anti-hCEACAM5 a la placa, y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H202 y leyendo a una loogitud de onda de 450 nm
Tabla 3· Valores de CESO correspondientes a la capacidad de unión de mAb específicos de CEACAM5 a proteinas CEACAM5 de primate
Anticuerpos
MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
CESO nM hCEACAM5 CE50 (nM cCEACAM5
0,53 1,18 0,14 0,07 0,36 3,72 0,08 0,05 0,40 0,45
Relación cIh
22 05 10 06 1 1
Ejemplo 3.2: Afinidad aparente y capacidad de unión del anticuerpo de anticuerpos anti-CEACAM5 a células tumorales de colon humano primario CR-IGR-034P por citometría de flujo
El tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P (Julien et al., Clin Cancer Res October 1, 2012 18:53145328) se obtuvo de xenoinjerto derivado de paciente en ratooes. El tumor CR-IGR-034P se disoció enzimáticamente usando colagenasa tipo IV (Invitrogen; #17104-019) y desoxirribonucleasa I (Invitrogen; #18047-019) durante 1 ha 4°C. La viabilidad celular se estimó por aplicación Viacount usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte TId 8HT. Para la estimación de la afinidad aparente, las células tumorales CR-IGR-034P se utilizaron para revestir a 40,000 células/pocillo una placa de 96 pocillos High Bind (MSO L 15XB-3), y se añadieron 100 111/pocillo de anticuerpos anti-CEACAM5 en diluciones seriadas de 2 veces empezando en 20 l1g/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 mino a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. Se añadieron 100 111/pocillo de IgG anti-ratón de cabra coojugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) o IgG anti-humana de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; # A11013) durante 45 mino a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 111fpocillo de PBS 1 % BSA, y de leer usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de KO aparente y CESO se estimaroo usando los software BIOST@T-BINDINGyBIOST@T-SPEED, respectivamente
La capacidad de unión del anticuerpo de los anticuerpos anti-CEACAM5 se determinó usando el kit calibrador de IgG de ratón (Biocytex #7208) o el kit calibrador de IgG humana (Biocytex #CP010) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tabla 4: Valores de KD y de CESO obtenidos en células de tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P
Anticuerpos
MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
Valor de KO
192 nM 038 nM 101 nM 016 nM O 5nM
Valor de CE50
1 nM 0,53 nM 2,8 nM 0,2 nM 1,4 nM
Ejemplo 3.3: Actividad de internalización de los anticuerpos murinos específicos de CEACAM5
Para evaluar la internalización de los anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5, se incubaron células MKN45 viables durante 24 h a 37°C/5% de C02 (o 4°C en hielo para el control negativo) con 10 pg/ml de anticuerpos anti-CEACAM5 marcados previamente con AlexaFluor488. Después, una parte de los pocillos se enjuagó con medio de cultivo, y los anticuerpos extracelulares marcados con AF unidos a las células se paralizaron incubando las células con anticuerpo anti-AlexaFluor 488 (SO l1g/ml) en hielo durante 30 mino (nivel de fluorescencia intracelular). La otra parte de los pocillos solo se incubó con medio de cultivo en la misma condición de tiempo (nivel de fluorescencia tota l).
Las células se despegaron y se lavaroo entonces, y se recolectaron en medio de cultivo antes de análisis por citometría de flujo usando un analizador MACSQUANT Vyb. Se midió la fluorescencia asociada a las células de 1 x 104
células, y se cuantificó la intensidad fluorescente media de las células viables agrupadas. La proporción de internalización (%) se define dividiendo la fluorescencia extinguida asociada a las células entre la fluorescencia total asociada a las células multiplicado por 100. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SO)
Tabla 5: Internalización del anticuerpo murino anti-CEACAM5 a 24 h en la linea celular MKN45
Anticue o MAb1 MAb2 MAb3 MAb4
Intemalización 24h, 37OC/5%C02% + StO 49,9+ 5,1 450+ 55 51 1 + 35 42,5 ± 6,7
Anticue o Intemalización 24h 37OC/5%C02% + StO MAb5 51,7±3,1
Los cinco anticuerpos específicos de CEACAM5 experimentaron internalización después de la unión de CEACAM5
expresada en la membrana de la superficie celular, apoyando su uso en el campo de los inmunoconjugados de
anticuerpo para dirigir citotoxicidad específicamente a las células cancerosas. Los anticuerpos anti-CEACAM5
5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 Y MAb5 mostraron intemalización en la línea celular de cáncer humana MKN45 de 49,9%, 45%, 51 ,1 %, 42,5%, 51,7%, respectivamente, después de 24 horas de incubación
Ejemplo 3.4: Actividad citotóxica de los ADC murinos correspondientes en la linea celular MKN45
Los anticuerpos murinos se conjugaron con el fin de definir su actividad citotóxica in vitro. En un tubo de 15 mi, a temperatura ambiente (23OC), se introdujeron sucesivamente con agitación magnética mAb, amortiguador NHEPES
10 (4%), DMA (dimetilacetamida, 20% vlv), y después 6 equivalentes de enlazador de SPDB. Después de una noche a temperatura ambiente, se añadió oM4 (maitansinoide, 9,6 equivalentes) en disoluciÓfl de DMA 15 mM, y se hizo reaccionar 5 horas. La mezcla de conjugación bruta se purifica en columnas Superdex 200pg 16/60 o G25 26f10 (PBS-Na pH 7,4f5% de NMP), se concentró en Amicon 15 a 5000 g, Y se filtró en Millex 0,22 ~m.
El efecto de los conjugados anti-CEACAM5 con maitansinoide se ensayó entoces con respecto a la viabilidad de las
15 células tumorales usando el kit Cell Titer-Glo (Promega). Para hacer esto, se colocaron en placas de 96 pocillos células de cáncer gástrico humano MKN45 y se dejaron adhirir durante 4 horas en una atmósfera a 37quot;C/5% de C02. Se añadieron diferentes concentraciones de conjugados de anti -CEACAM5 a las células sembradas. Las células se incubaron entonces durante 96 horas en la misma atmósfera. Entonces se añadió reactivo Cell Titer-Glo a los pocillos durante 10 mino a temperatura ambiente, y la señal luminiscente se midió usando un contador de placas
20 EnVision (Per1lt;in-Elmer)
Tabla 6: Actividades citotóxicas de ADC mu rinos especificos de CEACAM5 en la línea celular CEACAM5+ MKN45
Con·u ado de anticue o fármaco MAb1 -SPDB-DM4
Actividad citotóxica Clso nM 0,89 ± 0,23
MAb2 SPoB oM4
0,14 ± 0,01
MAb3-SPoB-oM4
0,53 + 0,15
MAb4 SPoB oM4 MAb5-SPoB-oM4
096 + 002 024 +004
Los anticuerpos anti-CEACAM5 conjugados con maitansinoide (DM4), MAb1 -SPDB-DM4, MAb2-SPDB-DM4, MAb3SPDB-OM4, MAb4-SPoB-oM4 y MAb5-SPDB-DM4, mostraron actividades citotóxicas in vi/ro con una CI50 de 0,89, 25 0,14, 0,53, 0,96 Y 0,24 nM, respectivamente.
Ejemplo 4: Determinación de la secuencia de las cadenas pesadas y ligeras de los mAb anti-CEACAM5
Las secuencias de los dominios variables del mAb se recuperaron del hibridoma y se clonaron en un vector de expresión para asegurar que los mAb clonados tenían las mismas características que los mAb murinos iniciales.
Las secuencias de aminoácidos derivadas proporcionaron información de acuerdo con los datos obtenidos en mAb 30 purificados derivados del hibridoma por secuenciación N-terminal y espectrometría de masas (LCfMS) de las cadenas pesada y ligera (LC, HC) (véase la Tabla 7)
Tabla 7: Anál isis de especlrometria de masas de mAb anti-CEACAM5 de hibridoma
Masa (Da)
,
;
;
MAb1 I L'
quot;
I He (GOF:
~
He (GOF :
. MAb3
~
I ~
MAb4
;
. , poru,no~;
:: .':'A~?; ,s quot;
, , ,en 'as , , 'VL: JH~~~~':s~ee~~quot;ca en equot;, e' , ,5.
Ejemplo 5: Conjugado de anticuerpo fármaco (ADC) (quimera) 5
Ejemplo 5.1: mAb quimera desnudo
Las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables VH, VL se clonaron en vectores de expresión en fusión con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o de Ckappa humana respectivamente para generar entonces lotes de mAb quimeras por expresión transitoria en HEK293 como se describe en el Ejemplo 1 Las afinidades por CEACAM5 humana y de macaco permanecieron similares para los mAb murinos y quimeras En la Tabla 8, se ilustran las afinidades pOIquot; la CESO obtenida por ELlSA con CEACAM5 humana o de macaco.
Tabla 8: CESO obtenidas con CEACAM5 para hibridoma murino y mAb quimeras correspond ientes
CESO obtenida para los mAb de hibridomas murinos
CESO obtenida para mAb quiméricos
clan ID MAb1
hCEACAMS 0,53 cCEACAMS 1,18 clan ID chMAb1 hCEACAM5 0,51 cCEACAM5 1,57
MAb2i
0,14 0,07 chMAb2 lote 1 0,16 0,13
chMAb2 lote 2 chMab2K52R
014 011 017 O 15
MAb3 MAb4
0,36 0,08 3,72 0,05 ch MAb3 ch MAb4 No realizado 0,14 No realizado 0,12
MAbS
0,4 0,45 ch MAb5 0,18 0,13
Las secuencias para las regiones de COR se dedujeron de la secuencia de proteínas usando la nomenclatura IMGT. Corresponden a SEO ID NO: 1-4,6,7· 10, 12,13-16,18, 19-22,24,25-28,30
De forma importante, comparado con el anticuerpo producido por el hibridoma clonado (MAb2i), los restos canónicos se han introducido en et clon MAb2 en las posiciones 41G, 42K, Y450 en VL, yen las posiciones 50 y 7S en VH
Además, la lisina en la posición 52 en el VL del clon MAb2 CEA-4 localizada en la CoR2 se ha reemplazado pOIquot; arginina en el clon Mab2K52R. Se generó un lote en las mismas condiciones a las correspondientes al clan MAb2 y dio lugar a una afinidad similar por el dominio extracelular de CEACAM5 humana y de macaco como se muestra en la Tabla 7. Resaltó que esta mutación de punto en la CoR puede hacerse sin ningún impacto en la unión
Las secuencias de LC y HC del mAb quimera para el clan MAb2 y el clan Mab2K52R cOlquot;responden a SEO ID N0:43, 44, 54.
chMAb2 se construyó como se describe en el ejemplo 4. Es un mAb quimera derivado del clan MAb2 con una IgG1 humana, isotipo Ck. Las secuencias corresponden a SEO ID NO:43 y 44. Se preparó un lote a escala de 300 mg por expresión transitoria en HEK293, seguido de una purificación en cromatografía de afinidad de proteínas; véase la Tabla 7 para los datos de unión. Fue el mAb desnudo usado para la producción del AOC.
Ejemplo 5.2: Producción y caracterización de ADC
En este ejemplo, se prepararon inmunoconjugados a partir de mAb quimera desnudo Se evaluó entonces la eficacia
In VIVO
Cálculo de DAR:
Un conjugado generalmente comprende de 1 a 10 molécula(s) del maitansinoide unido covalentemente al anticuerpo (denominado, ~relación fármaco a anticuerpoquot; o ~OARquot;). Este número puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del maitansinoide usado, junto con las condiciones experimentales usadas para la conjugación (como la relación maitansinoidefanticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del codisolvente, si se usa). Así, el contacto entre el anticuerpo y el maitansinoide da lugar a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre si por diferentes relaciones de fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. El DAR que se determina es así un valor medio.
El método usado en el presente documento para determinar la DAR consiste en medir espectrofotomélricamente la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm de una disolución del conjugado purificado sustancialmente. En particular, dicha DAR puede determinarse espectrofotométricamente usando los coeficientes de extinción medidos a respectivamente 280 y 252 nm para el anticuerpo y para el maitansinoide C0280 = 5,180 M·1cm·' y C0252 = 26,159 M' 1cm'\ El método de cálculo se deriva de Antony S. Oimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science, y se describe con más detalle a continuación:
Las absorbancias para el conjugado a 252 nm (A252) y a 280 nm (A280) se miden o bien sobre el pico monomérico del análisis por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) (que permite calcular el parámetro quot;oAR(SEC)quot;) o bien usando un aparato espectrofotométrico clásico (que permite calcular el parámetro quot;DAR(UV)quot;). Las absorbancias se pueden expresar como se indica a continuación·
en las que:
•
Co y CA son respectivamente las concentraciones en la disolución del maitansinoide y del anticuerpo ~0152 y COl80 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del maitansinoide a 252 nm y 280 nm
•
~.o.151 Y C.o.180 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del anticuerpo a 252 nm y 280 nm. La resolución de estas dos ecuaciones con dos desconoddos conduce a las ecuaciones siguientes: Co = [(C.o.100X A252) -(lt;:A252 X A2/JO)] I [(lt;:0252 X C.o.1oo) -(C.o.152 X C0280)] CA = [A280 -(eo x (0200)] 1C.o.100
La DAR promedio se calcula entonces a partir de la relación de la concentración de fármaco a la del anticuerpo: DAR =CoICA. Desglicosilación y espectrometría de masas de alta resolución de los conjugados (HRMS) La desglicosilación es una técnica de digestión enzimática mediante glicosidasa. La desglicosilación se realiza a
partir de 500 ~IJ de conjugado + 100 IlJ de amortiguador Tris HCI 50 mM + 10 ~tI de enzima glucanasa-F (100 unidades de enzima liofilizadal100 III de agua). El medio se sometió a vórtice y se mantuvo una noche a 37°C. La muestra desglicosilada está entonces lista para ser analizada en HRMS. Los espectros de masas se obtuvieron en
un sistema Waters Q-Tof-2 en modo de eleclropulverización positiva (ES+). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: 4 l1m BioSuite 250 URH SEC 4,6 x 300 mm (Waters); disolventes: A: formiato de amonio 25 mM + 1% de ácido fórmico, B: CH3CN; temperatura de la columna· 30°C; caudal 0,4 mllmin.; elución isocrática 70% de A + 30% de B (15 min)
Cromatografia analítica de exclusión por tamaño (SEC) Columna: Columna TSKgel G3000 SWXL 5 l1m, 7,8 mm x 30 cm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC nO de pieza
08541 + columna de guarda TSK-GEL SWXL 7 pM, 40 mm x 6mm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC nO de pieza 08543 Fase Móvil: KCI (O ,2M), KH2P04 (0,052 M), K2HP04 (0,107 M), iPrOH (20% en volumen)
Condiciones de análisis: elución isocrática a 0,5 ml/min. durante 30 min Análisis realizado en un sistema HPLC Lachrom Elite (Merck) usando un detector espectrofotométrico con DAD L2455
Contenidos de amortiguadores Amortiguador A (pH 6,5)· NaCI (50 mM), amortiguador de fosfato de potasio (SO mM), EDTA (2 mM) Amortiguador HGS (pH 5,5)· histidina (10 mM), glidna (130 mM), sacarosa al 5% (plv), HCI (8 mM)
Abreviaturas usadas
CV: Volumen de la columna; DAR: Relación de fármaco a anticuerpo; DMA: dimetilacetamida; HEPES: ácido 4-(2hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico; HRMS· espectroscopía de masas de alta resolución; NHS· Nhidroxisuccinimida; Nitro-SPDB: éster 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-dioxo-1-pirrolidinílico del ácido butanoico (puede prepararse como se describe en la patente W02004016801 ); NMp· N-metilpirrolidinona; RT: temperatura ambiente; SEC: cromatografia de exclusión por tamaño
ADC (quimeras): chMAb 1-SPDB-DM4 Datos analíticos·
MW(Ab) = 148438 glmol; MW(DM4) =780,38 glmol t:28Onm(Ab) =213320; C252nm(Ab) = 73473 ~28Onm(DM4) =5180 Y 1:252nm(DM4) =26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,59 mi de chMAb1 (C = 5,72 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,312 mi de DMA y 0,046 mi de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y después se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitaciórJ magnética, se añadieron sucesivamente 3,8 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,389 mi de DMA Y 0,074 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2,5 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica en una columna desalad ora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel10 k, Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 ~m
Se obtienen así 7,6 mi de conjugado chMAb1-SPDB-DM4 (c = 2,19 mg/ml) como una disoluciórJ transparente incolora. El conjugado se analiza para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV)== 3,38; DAR (SEC)= 3,34; RT = 17,54 min., pureza monomérica =99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 8
chMAb2-SPDB-DM4
Datos analíticos·
MW(Ab) = 147900 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
l:28Onm (Ab) = 201400; C252nm (Ab) = 70889
t:28Onm(DM4) = 5180 Y C252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 mi de chMAb2 (e = 5,08 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,337 mi de DMA y 0,0433 mi de disolución de enlazador nitro -SPDB (5,0 eq -disolución 15 mM en DMA). La disoluciórJ se somete a vórtice durante 30 segundos, y después se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 3,12 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,319 mi de DMA y 0,069 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA)_ Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 Jlm y se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra -15 (Ultracel 10 k,
Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 Jlm.
Se obtienen así 7,5 mi de conjugado chMAb2-SPDB-DM4 (e = 1,8 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza mOllOmérica · DAR (UV) =4,10; DAR (SEC) =4,05; RT = 17,52 min., pureza monomérica =99,9%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 9
chMAb4-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 148124 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
t:28Onm 280nm(Ab) =204380; C280nm 252nm(Ab) =73142
t:28Onm 280nm(DM4) =5180 Y C280nm 252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,63 mi de chMAb4 (C = 5,69 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,316 mi de DMA y 0,0465 mi de disolución de enlazador nitro -SPDB (5,0 eq -disolución 15mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y entonces se agita lentamente a RT durante 3 hOfas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 3,8 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,389 mi de DMA y 0,074 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel10 k, Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 ~m
Se obtienen así 6,5 mi de conjugado chMAb4-SPDB-DM4 (e = 2,20 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza mOllOmérica: DAR (UV) =3,87; DAR (SEC) =3,85; RT = 17,52 min., pureza monomérica =99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 10.
chMAb5-SPDB-DM4
Datos analíticos·
MW(Ab) = 148040 g/mol; MW(DM4) =780,38 g/mol
~28Onm 280nm(Ab) =207360; (;28Onm 2S2nm(Ab) =72288
~28Onm 280nm(DM4) =5180 Y (;28Onm 2S2nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,15 mi de chMAb5 (C = 6,38 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,269 mi de DMA y 0,0453 mi de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitaciÓfl magnética, se añadieron sucesivamente 4,1 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,317 mi de DMA y 0,072 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 f.lm y se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) y se filtran en un filtro de 0,22 ~m
Se obtienen así 7,5 mi de conjugado AntiCEACAMS_hyb_1917CEA4_VH507S_VL41G42K4SQ_lgG1-SPDB-DM4 (c =3,4 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) =3,4; DAR (SEC) =3,4; RT = 17,49 min., pureza monomérica = 99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 11
Ejemplo 5.3: Eficacia ín vivo
Los cuatro conjugados quiméricos (chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAbS-SPDB-DM4 y chMAb2SPDB-OM4) se evaluaron a 2 dosis frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mglkg. Se administraron a 5 y 2,5 por una inyecciÓfl de bolo intravenosa (IV) en el dia 14 después del implante del tumor
Para la evaluación de la actividad anti -tumoral de los conjugados, los animales se pesaron diariamente, y los tumores se midieron 2 veces a la semana con un calibre. Una dosificación que producia un 20% de pérdida de peso corporal en el punto más bajo (media del grupo) o 10% o más muertes relacionadas con el fármaco se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos de los tumores. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mm3) = {longitud (mm) x anchura (mm )2V2. Los criterios primarios de valoración de la eficacia son ó.T/ó.C, mediana del porcentaje de regresión, y regresiones parcial y completa (PR y CR).
Los cambios del volumen tumoral para cada animal tratado (T) y de control (C) se calculan para cada tumor restando el volumen tumoral en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen tumoral en el día de observación especificado. El L\T mediano se calcula para el grupo tratado, y el toC mediano se calcula para el grupo de control. A continuaciórJ se calcula la relación ó.T/ó.C y se expresa como un porcentaje: ó.Tfó.C =(delta T/delta C) x
100.
La dosis se considera como terapéutica mente activa cuando L\T/L\C es menor de 40%, y muy activa cuando L\T/L\C es menor de 10%. Si L\T /L\C es menor de O, la dosis se considera como altamente activa y se data el porcentaje de regresión (Plowman J, Oykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L y Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. En: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger., 1999 p 101-125):
% de regresión tumoral se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado comparado con su volumen en el primer día del primer tratamiento
El % de regresión se calcula en un tiempo de medición específico y para cada animal. Después se calcula el % de regresión mediano para el grupo:
volumentO -volumen¡ x 100
% deregresión(a t) volumentO
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye al 50% del volumen tumoral al comienzo del tratamiento
Regresión completa (CR): La regresión completa se logra cuando el volumen tumoral = O mm3 (CR se considera cuando el volumen tumoral no se puede registrar)
5 Resultados:
Los resultados se presentan en la Figura 4 yen la Tabla 9 (más adelante), Usando un esquema de una única administración a 2,5 y 5 mglkg, ninguno de los conjugados ensayados en este estudio indujo toxicidad
chMAb1-SPDB-OM4 fue muy activo a 5 y 2,5 mglkg con una 6.Tf6.C de O y 7% (p lt; 0,0001 Y P = 0,0170 frente al control), respectivamente. chMAb4-SPOB-DM4 y chMAb5-SPDB-0M4 fueron altamente activos a 5 mglkg con
10 6.Tf6.C de -5 y -7% (p lt; 0,0001 frente al control), respectivamente, y regresión tumoral de 25 y 65%, respectivamente. Fueron muy activos a 2,5 mglkg con 6.TI6.C de 7 y 2% (p = 0,0152 Y P = 0,0020 frente al control), respectivamente. chMAb2-SPOB-DM4 fue altamente activo a 5 y 2,5 mglkg con 6.TI6.C de -10 y -8% (p lt; 0,0001 frente al control), respectivamente, regresión tumoral de 82 y 39%, respectivamente, y 3 Y 1 CRlB, respectivamente
A partir de estos resultados, todos los conjugados quiméricos chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1 -SPDB-0M4, chMAb515 SPDB-OM4 Y chMAb2-SPOB-DM4 fueron usables para desarrollar un AOC terapéutico.
Tabla 9: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados chMAb1-SPDB-DM4 , chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-OM4, y chMAb5-SPOB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra SCIO.
~
Ejemplo 6: Humanización del mAb anti-CEACAM5_MAb2
En este ejemplo, se han diseñado in silico variantes humanizadas de IgG MAb2 murino parental. Los mAb resu ltantes se produjeroo y proporcionaron características similares allgG ch-MAb2 quimérico.
Ejemplo 6.1: Protocolo de humanización 40
a) Humanización basada en trayectorias moleculares dinámicas
Las secuencias de VL y VH del clon MAb2 murino se compararon frente a la base de datos de proteínas (POB) (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). Se usaron los moldes siguientes: marco de la cadena ligera y pesada -3EHB (90,9% de identidad de cadena ligera del marco y 90,8% de identidad de cadena pesada del marco), L 1-118M, L2 -1 F6L, L3 -1 P7K, H1 -2QHR, H2 -11GT Y H3 -1 P4B para construir un modelo de homología de anti -CEACAM5 LC y HC usando Molecular Operating Environment (MOE) (v. 2011 10 -Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). Posteriormente, el modelo de homología se minimizó en energía usando los procedimientos estándar implementados en MOE.
Posteriormente, se realizó una simulación de dinámicas moleculares (MO) del modelo de homología 3D minimizado del MAb2 murino, con restricciones en la cadena principal proteica a 500 K de temperatura durante 1,1 nanosegundos (ns) en disolvente implícito de Bom generalizado. Se extrajeron 10 conformaciones diversas de este primer ciclo de MO cada 100 picosegundos (ps) para el último 1 ns. Cada una de estas diversas conformaciones se sometió entonces a una simulación de MO, sin restricciones en la cadena principal proteica y a 300 K de temperatura durante 2,3 ns. Para cada uno de los 10 ciclos de MO, las últimas 2000 imágenes, una cada ps, de la trayectoria de MO se usaron entonces para calcular, para cada aminoácido de MAb2 murino, sus desviaciones cuadráticas medias (rmsd) comparado con una posición medoide de referencia. Comparando la rmsd promedio en los 10 ciclos de MO separados de un aminoácido dado con la rmsd promedio global de todos los aminoácidos murinos de MAb2, se decide si el aminoácidos es lo suficientemente flexible, como se observa durante la MO, para considerarse que probablemente interacciona con los receptores de las células T y que es responsable de la activación de la respuesta inmune. Se identificaron 32 aminoácidos como flexibles en el anticuerpo MAb2 murino, excluyendo la COR y sus alrededores inmediatos a 5 Á.
El movimiento de los 60 aminoácidos más flexibles de MAb2 murino, durante los 20 ns (10 x 2 ns) de simulación de dinámica molecular, se comparó después con el movimiento de los aminoácidos flexibles correspondientes de 49 modelos de homologia 3D humanos, para cada uno de los cuales se realizaron las mismas simulaciones de MO. Estos 49 modelos de línea germinal humana se han construido combinando sistemáticamente un panel representativo de 7 cadenas ligeras humanas (concretamente vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) con un panel representativo de 7 cadenas pesadas humanas (concretamente vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) (Nucleic Acid Research, 2005, Vol. 33, Oatabase issue 0593-0597).
La combinación vk.1 -vh6 mostró la similitud más alta (72,6%) 40 de sus aminoácidos flexibles comparado con los aminoácidos flexibles del anticuerpo MAb2 murino; este modelo se usó por lo tanto para humanizar el anticuerpo MAb2 centrándose en los aminoácidos flexibles. Pa ra la asociación de aminoácidos por parejas entre los aminoácidos de MAb2 murino y vk.1-vh6, las 2 secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los 2 modelos de homología correspondientes
b) Mutaciones estabilizadoras
Para mejorar la estabilidad de las regiones VL y VH del anticuerpo anti-CEACAM5, se propone originalmente que los
aminoácidos de las cadenas ligera y pesada con baja frecuencia de aparición frente a sus secuencias callÓnicas respectivas, excluyendo las CoR, estén mutados en los aminoácidos encontrados más frecuentemente (MGth gt; 0,5 kcaUmol; (Monsellier et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). Una primera lista de mutaciones de consenso para la LC y para la HC se ha restringido a los aminoácidos encontrados en el modelo humano más cercano (es decir, vk1 vh6). Ninguna de estas mutaciones esté localizada en la zona quot;Vemierquot; (Foote et al., J. Mol. BioL 1992, 224, 487499). Se tienen en cuenta otros criterios para considerar estas mutaciones de consenso para estabilizar potencialmente el anticuerpo MAb2 anti-CECAM5. Estos criterios son un cambio favorable de hidropatía en la superficie, o una estabilización predicha del mutante basado en mecánicas moleculares Se consideraron las mutaciones estabilizadoras indicadas como exitosas en la bibliografía (Bedouelle, H J. Mol. BioL 2006, 362, 580593; Steipe B. J. Mol. BioL 1994, 240, 188-192).
c) Eliminación de motivos de secuencias no deseados
Se consideraron los siguientes motivos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil a ácidos), Asn-X-SerfThr (glicosilación, X = cualquier aminoácido salvo Pro), Asp-Gly/SerfThr (formación de succinimidaliso-asp en áreas flexibles), AsnGlyfHis/SerfAla/Cys (sitios de desamidación expuestos), Met (oxidación en área expuesta). Las secuencias humanizadas resultantes se analizaron por blast en busca de la similitud de secuencias frente a la base de datos Immune Epitope Data Base (IEOB) database «PLos Biol (2005) 3(3)e91) http:ftwww.immuneepitope.org) para asegurar que ninguna de las secuencias contenía ningún epítopo conocido de células B o T listado.
d) Regiones VH y VL humanizadas
Se proponen tres versiones para la cadena ligera (VL 1, VL 1a, y VL 1c) y tres versiones para la cadena pesada (VH1, VH1a y VH1 b). La combinaciórJ particular de restos de aminoácidos alterados en cada variante de VL y VH de MAb2 humanizado se muestra en la Tabla 10 y en la Tabla 11, respectivamente. Las secuencias completas de
5 aminoácidos de los dominios VH y VL humanizados se muestran en la Tabla 12
La variante VL 1 presenta 5 mutaciones que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más ftexibles no de CDR de la cadena ligera de MAb2 anti-CEACAM5 y la secuencia de cadena ligera humana de vk1 .
La variante VL1a deriva de VL1 e incluye 4 nuevas mutaciones que son de consenso (secuencia vk1) y potencialmente estabilizadoras. Además, 1 de estas mutaciones plantea un sitio de desamidación potencialmente
10 problemático (D17T18)
La variante VL1c deriva de VL1a con la introducción de 1 mutación R en lugar de K en la posición 52. De hecho, este K52 está localizado en la CDR L2 y podria ser una ~diana· para el proceso de conjugación.
La variante VH1 presenta 7 mutaciones que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más ftexibles no de CDR de la cadena pesada de anti-CEACAM5 y la secuencia de cadena pesada humana de vh6
15 La variante VH1a deriva de VH1 e incluye 4 nuevas mutaciones que son de consenso (secuencia vh6) y potencialmente estabilizadoras.
Los dominios VL y VH humanizados del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5 se combinaron como sigue VL1 y VH1 , VL1a y VH1a; VL 1c y VH1a; VL 1a y VH1 b.

Tabla 10: Mutaciones de las variantes VL del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5
VL de MAb2 de ratón
VL1 VL1 d VL1 a VL 1 c
EH
D D D D
T1B
R R
040
P P P P
045
K K K K
K52
R R
D70
D O
K74
T T T T
N76
S S S S
GB4
A A
S85
T T
Tabla 11 · Mutaciones de las variantes VH del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5
VH de MAb2 de ratón G9
VH1 p VH 1a P
V10 K19 K43
G S R G S R
R44 F60
G A
D62
S S
065 NB4
K K
KB7
T T
IB9 A113
V S

Tabla 12: Secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos anti-CEACAM5 humanizados ejemplares
Variante VH o VL
Secuencia SEO ID NO.
clon MAb2 VH 1
SYOMSWVRQTPERRLEWVAYISSGGGITYF PSTVKGRFTVSRONAKNTLYLQMNSLTSED T AIYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA SEQ ID NO:51
Variante VH o VL clan MAb2 VH 1 a
Secuencia EVQLQESGPGLVKPGGSLS LSCAASGFVFS SYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYA PSTVKGRFTVSRoNAKNTLYLQMNSLTSED TAvyyr.AAHYFGSSGPFAYW TLVTVSS SEO ID NO. SEO ID NO:5
clan MAb2 VL 1
~quot;'M. ' V quot; quot; SYLAWyQQKPGKSPKLLVYNTKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFS~T~~~LQPEDFGSYYCQH SEO ID NO:17
clan MAb2 VL 1 a
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIF SYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTKTLAEGVPS RFSGSGSGTDFSlTISSLQPEoFATYYCQH I FIK SEO ID NO:23
clan MAb2 VL 1 e
OIQMTQSPASLSASVGoRVTITCRASENIF SYLAWYOQKPGKSPKLlVYNTRTLAEGVPS R~~~SGS~;~~_SLTISSLQPEOFA TYYCQH HY TPFTF TKLEIK SEO ID NO:29
clan MAb2 VL 1d
DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIF SYLAWyQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSL TISSLQPEDFGSYYCQH HYGTPFTFGSGTKLEI K SEO ID NO:55

Ejemplo 6.2: Secuencia de mAb anti-CEACAM5 humanizado
A partir de las secuencias de aminoácidos de las variantes VL y VH in silico, se derivaron las secuencias de ácido nucleico y se sintetizaron por Geneart. Las secuencias se clonaron en vectores de expresión fusionadas con las 5 secuencias codificantes del dominio constante de 19G1 humana o de Ckappa humana, respectivamente
Ejemplo 6.3: Producción y caracterización in vitre
Se produjeron lotes de mAb humanizados por expresión transitoria en HEK293 y se purificaron por cromatografia de afinidad en proteina A. La estructura e identidad se confinnaron por análisis por SoS-PAGE, cromatografia de exclusión por lamaños y espectrometria de masas.
10 La afinidad por CEACAM5 humana yde macaco se verificó por EL ISA; las CESO se proporcionan en la Tabla 13

Tabla 13: Afinidad de mAb anl¡-CEACAMS humanizado por CEACAMS humana y de macaco
CEACAMS humana
CEACAMS de macaco
código
mAb CE50 (nM CV CESO (nM CV
huMAb2-1
MAb2Vl1VH1-1 G1 022 47% 020 79%
huMAb2-2
MAb2 Vl1aVH1a-IQG1 0,20 9,2% 0,17 5,0%
huMAb2-3
MAb2 VL1cVH1a-lgG1 018 11% 019 43%
huMAb2-4
MAb2 VL 1dVH1 -1 G1 0,22 4,3% 0,17 5,0%
ch MAb2
MAb2 I G1 O16 99% 017 30%
La especificidad por CEACAMS humana frente a CEACAM1 , CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas se verificó por EUSA. Se dio a conocer como el porcentaje de unión comparado con la unión completa con CEACAMS 15 humana; véase la Tabla 14

Tabla 14: Porcentaje de unión de mAb anti-CEACAMS humanizado a CEACAM humanas
hCEA
cód igo
mAb CAMS CAM1 CAM6 CAM7 CAMa
huMAb21
MAb2 VL WH1 I G1 100% 0,3% 0,2% 0,3% 0,9%
huMAb2-2
MAb2 VL1aVH1a-1 G1 100% 03% 03% 03% 05%
huMAb23
MAb2 VL 1cVH 1a-lgG1 100% 02% 03% 03% 06%
huMAb2-4
MAb2 Vl1d VH1-1 G1 100% 0,3% 0,3% 0,3% 1,4%
eh MAb2
MAb2-1 G1 100% 0,3% 0,3% 0,3% 0,6%
El dominio de unión al epítopo se verificó por EUSA, y se mostró que las variantes humanizadas reconocían el dominio A3-B3 especificamente. Se dio a conocer como el porcentaje de unión comparado con la unión completa 20 con CEACAM5 humana en la Tabla 15.
Las cinéticas de unión de las variantes de MAb2 anti-CEACAM5 humanizadas, comparadas con MAb2 quimérico, a CEACAM5 humana recombinante (hCEACAMS) y a CEACAM5 de mono macaco (cCEACAM5) se determinaron por 5 un ensayo de resonancia de plasmones superficiales usando un BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ)
Brevemente, un chip biosensOf de BIAcore CM5 se acopló en el instrumento y se activó con 70 ,d de NHSfEDC 1:1 a temperatura ambiente. Se inmovilizó una IgG1 de ratón anti-Fc humano (BIAcore #BR-100B-39) (50 ~gfmL en amortiguador de acetato 1 M, pH 5) en los chips activados en todas las celdas de flujo. La inmovilización se llevó a cabo a un caudal de 10 IlUmin. hasta la saturación. El chip se bloqueó entonces por inyección de 70 ~I de 10 etanolamina-HCI, pH 8,5, seguido de un lavado con MgCI2 3M. Para medir la unión de los mAb anti -CEACAM5 a la proteína CEACAM5 humana o a la proteína CEACAM5 de macaco, se usaroo los anticuerpos a 1-5 Ilgfml en amortiguador de migración de BIAcore (HBS-EP). Los antígenos (CEACAM5 humana o CEACAM5 de macaco) se inyectaron de 1 a 500 nM. Después de la fina lización de la fase de inyección, se monitorizó la disociación en un amortiguador de migración de BIAcore al mismo caudal durante 600 segundos. La superficie se regeneró entre las
15 inyecciones usando 2 x 5 IlJ MgCI2 3M (2 x 30 s). Los sensogramas individuales se ana lizaron usando el software BIAevaluation.

Tabla 16: Unión de mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAM5 humana y de mono
CEACAM5 humana
CEACAM5 de macaco
mAb
KD (nM KD nM)
huMAb2-1
9,8 41,7
huMAb2-2 huMAb2-3 huMAb2-4
245 11,7 69 960 73,5 386
eh MAb2
99 523
La especificidad de las variantes de MAb2 anti-CEACAM5 humanizadas, comparada con MAb2 quimérico, por
20 CEACAM5 de macaco frente a CEACAM1, CEACAM6 Y CEACAMB de macaco se verificó por ELlSA. Se indicó como el porcentaje de unión comparado con la un ión completa con CEACAM5 o unión a la CE so; véase la Tabla 17 a continuación
25 Ejemplo 6.4: Caracterización de variantes humanizadas de Mab2 obtenidas por injerto en marcos de linea germinal humana
En este ejemplo, se obtuvieron variantes humanizadas de Mab2 por una estrategia de injerto de CRO. Además, las
COR del anticuerpo humanizado se sometieron a una estrategia de escaneo de alanina para mostrar que varias
posiciones podían sustituirse sin afectar la unión a CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
30 La secuencia de una versión humanizada de Mab2 se generó en primer lugar in silico seleccionando marcos de línea germinal humana tomando como base la homología estructural con el anticuerpo murino Mab2. Para la cadena ligera, los marcos humanos seleccionados están definidos por los genes IGKV10-39·01 y IGKJ2·02, y para la cadena pesada, por los genes IGHV3-23·04 y IGHJ4·01 . Las seis COR de Mab2Ks2R se injertaron en estos marcos humanos. Se introdujeron tres retromutaciones, correspondientes a las posiciones 34 y 53 en la VL (SEO ID NO. 34)
35 (regiooes FR2-L y FR3-L, respectivamente) y a la posición 50 en la VH (SEO ID NO 33) (región FR2-H), que da como resultado la secuencia siguiente, definida como MAb2_ VLg5VHg2
Tabla 18: Secuencias de VH y VL de MAb2_ VLg5VHg2
Se obtuvieron varias variantes de MAb2_VLg5VHg2 por el único reemplazo de cada aminoácido de las seis CDR, preferiblemente por una alanina. Cuando la alanina ya se encontraba en las CoR de MAb2_ VLg5VHg2, lo que ocurre en H-CDR3, se sustituyó otro aminoácido (Val en el resto 97, Arg en el resto 98, y Asp en el resto 108 de SEQ ID NO:74).
A partir de las secuencias de aminoácidos de las variantes VL y VH in silico, se derivaron las secuencias de ácido nucleico y se generaron por síntesis génica. Las secuencias se donaron en un vector de expresión de mamífero fusionadas con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o de Ckappa humana respectivamente. Las variantes únicas humanizadas MAb2_VLg5VHg2, que difieren de ésta en una posición, y un número limitado de mutantes de combinación, se produjeron por la expresión transitoria en células HEK293. Los sobrenadantes celulares que contenían las IgG segregadas (20 a 70 ~gfml) se diluyeron hasta 1 ~gfml para uso en ensayos de unión a ECO de CEACAM5 humana, ECO de Macaca fascicularis y dominio A3-B3 de CEACAM5 humana
Para evaluar el impacto de estas modificaciones, la unión de IgG se detenninó midiendo las señales deSPR con una unidad Biacore T200 (GE Healthcare). Se acoplaron anticuerpos anti-Fc humano a un chip Series S CM5 mediante un kit de acoplamiento de amina para alcanzar un nivel de 10.000 unidades de respuesta (RU). Aproximadamente 300 a 600 RU de cada variante se capturaron inyectando sobrenadantes a 1 ~gfml con un tiempo de contacto de 60 segundos y un cauda l de 10 ~Ifmin. Todos los experimentos se realizaron a 25°C con HBS-EP+ (Hepes 10 mM, NaCI150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05%) como el amortiguador de migración. En un modo de cribado, se inyectó CEACAM5 humana/CEACAM5 de macaco/dominio A3B3 humano a 50 nM sobre las variantes IgG capturadas, a un caudal de 30 l1lfmin. durante 1 minuto. Se mantuvo una fase de disociación de 60 segundos antes de que la superficie se regenerara con una inyección de 1 pulso de MgCI2 3 M a un caudal de 10 ~lIminuto y un tiempo de contacto de 30 segundos
Para cada experimento, se procesaron los datos de respuesta usando una superficie de referencia, permitiendo de esta manera la corrección para cambios en el índice de refracción bruto y cualquier unión no específica. Los datos se referenciaron doblemente usando respuesta de inyecciones de blanco. De acuerdo con el método de cribado descrito en una nota de solicitud de GE Healthcare (nota de solicitud 28-9777-72 AA), se consideraron dos parámetros para clasificar las variantes con respecto a las características de unión. En primer lugar, la actividad de unión se estima por la proporción de la señal máxima teórica medida (porcentaje de Rmax, véase la Figura 16). En segundo lugar, el porcentaje de señal restante se calcula usando puntos indicados de disociación (el primero 10 segundos después del final de la inyección, y el segundo 50 segundos después del final de la inyección). y reneja la estabilidad de la uniÓfl (véase la Figura 17).
Las variantes de una sola alanina en las posiciones siguientes demostraron parámetros de unión equivalentes, comparados con el anticuerpo original, lo que sugiere que los aminoácidos de CoR en esas posiciones son neutros para la unión: restos de LC 27, 28, 29, 31, 51,52, 89, 90, 93, 94, 96, 97, Y restos HC 26 a 31, 51 a 58, 97,103,104, 107, 109. Los comportamientos de estas variantes son similares con CEACAM5 humana y de mono, manteniendo así su reactividad cruzada. También se encontró que la unión al dominio A3-B3 de CEACAM5 no resultaba afectada También se generaron algunas combinaciones de dos sustituciones neutras, y se encontró que daban como resultado parámetros de unión inalterados, como se ilustra con asociación de LC_T51A con LC_ T94A, LC_S31A con HC_G54Y, o LC_T531 con HC_S53A.
A la inversa, en todas las demás posiciones de CoR, se encontró que la sustitución del aminoácido original por alanina induce una pérdida completa de unión o alteró drásticamente los parámetros de la unión. La posición 101 de la cadena pesada o las posiciones 32 y 91 de la cadena ligera son ejemplos mostrados en las Figuras 16 y 17. Un segundo conjunto de variantes consistió en ensayar más mutaciones conservativas en algunas de dichas posiciones. Haciendo esto, encontramos que las sustituciones conservativas siguientes eran neutras para la unión al antigeno: Tyr por Phe en el resto 30 de MAb2_ VLg5, Phe por Tyr en el resto 92 del MAb2_ VLg5, Ser por Ala en el resto 98 de MAb2_ VHg2 y Phe por Tyr en el resto 100 de MAb2_ VHg2 (mostrados en las figuras)
Ejemplo 7: variantes humanizadas de conjugados de MAb2 fármaco
Ejemplo 7.1: Producción y caracterización
huMAb2-2-SPoB-0M4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147360 g/mol; MW(DM4) = 780,38 glmol
C280nm (Ab) = 201400; C280nm (Ab) = 71693
C280nm (DM4) = 5180; C280nm (DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 19,4 mg de huMAb2~2 (C = 5,1 mglml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,375 mi de DMA y 0,0439 mi de disolución de enlazador nitro~SPDB (5,0 eq ~ disolución 15 mM en DMA). La disoluciÓll se somete a vórtice durante 30 segundos y se agita lentamente a RT durante 2 horas. Se añade un volumen extra de 0,0044 mi de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq -disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2 mi de amortiguador de PBS pH =7,5 Y0,0702 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 ~m y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 ~m.
Se obtienen asi 10,3 mi de conjugado huMAb2-2-SPDB-Drv14 (c = 1,35 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,7; DAR (SEC) = 3,6; RT = 17,29 min., pureza monomérica = 97,9%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 12
huMAb2~1~SPDB~DM4
Datos analíticos·
MW(Ab) = 147563 g/mol; MW(Drv14) = 780,38 glmol
C28Onm(Ab) = 201400. C252nm(Ab) = 69669
c28Onm(DM4) = 5180; C252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 mi de una disolución de huMAb2-1 (C := 5,08 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,341 mi de DMA y 0,0392 mi de disolución de enlazador nitro~SPDB (4,5 eq ~ disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0087 mi de disolución de enlazador nitro-SPDB (1 ,0 eq • disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,62 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,254 mi de DMA y 0,076 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 f.lm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/1 O(Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CY de NaOH 1 M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 jJm.
Se obtienen asi 9,5 mi de conjugado huMAb2· 1-SPDB-DM4 (c = 1,35 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica· DAR (UY) = 4,1, DAR (SEC) = 4,0; RT = 17,39 min., pureza monomérica =96,7%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 13
huMAb2-3-SPDB-DM4
Datos analíticos·
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(Drv14) = 780,38 glmol
C28Onm(Ab) =201400; C252r1m(Ab) =71451
C28Onm(DM4) =5180; C252nm(DM4) =26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 mi de una disolución de huMAb2~3 (C = 5,09 mglml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,336 mi de DMA y 0,0437 mi de disolución de enlazador nitro~SPDB (5 eq ~ disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0035 mi de disolución de enlazador nitro -SPDS (0,4 eq • disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,60 mi
de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,248 mi de DMA y 0,074 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 Jlm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1 M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 Jlm
Se obtienen asi 11 mi de conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 (c = 1,08 mglml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para detenninar la carga fina l de fánnaco y la pureza mOllOmérica· DAR (UV) =3,9; DAR (SEC) =3,8; RT = 17,44 min., pureza monomérica =98,4%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 14.
huMAb2-4-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147628 glmol; MW(OM4) =780,38 glmol
C28Onm(Ab) =201400; f:2S2M1(Ab) =70628
C28Onm(DM4) =5180; f:252nm(DM4) =26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 mi de una disolución de huMAb2-4 (C =5,09 mgfml en amortiguador de PBS pH =7,4) en un recipiente, seguido de 0,345 mi de DMA y 0,0448 mi de disolución de enlazador nitro-SPOB (5 eq disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0027 mi de disolución de enlazador nitro-SPDB (0,3 eq disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,70 mi de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,263 mi de DMA y 0,075 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA) Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 Jlm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/1 O (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1 M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 Jlm.
Se obtienen asi 11 mi de conjugado huMAb2-4-SPDB-DM4 (c = 1,23 mglml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para detenninar la carga final de fánnaco y la pureza mOllOmérica· DAR (UV) =3,8; DAR (SEC) =3,8; RT = 17,53 min., pureza monomérica =99,3%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 15
Ejemplo 7.2: Citotoxicidad in vitro
Material y métodos
El efecto de los coojugados anti-CEACAM5 maitansinoide sobre la viabilidad de las células tumorales se evaluó como se describe en el ejemplo 3.4
Resu ltados·
Estos coojugados chMAb2-SPDB-DM4, huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, y huMAb2-3-SPDB-DM4 y el conjugado de DM4 irrelevante mostraron actividades citotóxicas in vitro en células MKN45 en cultivo con una CI50 de 0,24, 0,18, 0,23, 0,16, Y 8,52 nM, respectivamente. Las actividades citotóxicas de los conjugados anti-CEACAM5 fueron 53 a 35 veces menores que la actividad medida del coojugado de DM4 irrelevante, indicando actividades citotóxicas mediadas por CEACAM5 de los conjugados anti-CEACAM5
Ejemplo 7.3: Eficacia in vivo frente a tumores de colon primarios CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atimicos CD-1
Material y método
Dos secuencias humanizadas como conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPOB-0M4 se evaluaron a niveles de 4 dosis comparado con chMAb2-SPOB-DM4, frente a tumores de colon primario medibles CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atimicos CD-1 Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los
5 conjugados se proporcionaron en mglkg. Se administraron a 10, 5, 2,5 Y 1,25 mgfkg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 19 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
Resu ltados
Los resultados se presentan en la Figura 5 y en la Tabla 20 (más adelante).
10 Usando un esquema de una única administración a 1,25, 2,5, 5 Y 10 mglkg, ninguno de los cOfljugados ensayados en este estudio indujo toxicidad.
huMAb2-4-SPDB-DM4 y chMAb2-SPOB-0M4 fueron altamente activos a 10 mgfkg con .1Tf.1C de -4% (p lt; 0,0001 frente al control) y regresión tumoral de 21 y 19%, respectivamente; activos a 5 mgf kg con lJ.TflJ.C de 12 (p =0,0105 frente al control) y 17% (p = 0,0417 frente al control), respectivamente; y marginalmente activos a 2,5 mgfkg con
15 lJ.Tfó.C de 36 y 37% (ns frente al control), respectivamente; e inactivos a 1,25 mg/kg . huMAb2-3-SPOB-DM4 fue altamente activo a 10 mgfkg con ó.Tfó.C de -6% (p lt; 0,0001 frente al control) y regresión tumoral de 31 %; muy activo a 5 mglkg con ó.T/ó.C de 4% (p lt; 0,0001 frente al control); activo a 2,5 mglkg COfló.Tfó.C de 12 (p =0,0322 frente al control); y marginalmente activo a 1,25 mgfkg con ó.Tf6C de 34% (ns frente al control)
A partir de estos resultados, las dos secuencias humanizadas huMAb2-3-SPOB-OM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 20 fueron usa bies para desarrollar un AOC terapéutico. huMAb2-3-SPDB-DM4 fue la mejor de las dos secuencias.
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Tabla 20: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 y chMAb2-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra CD-l.
Agente
Ruta! Dosis en ml/kg Dosis en mg/kg por inyección Calendario en días Muerte por fármaco (oia) Cambio promedio de peso corporal en % por ratón en el nadir (día de nadir) t:.TIt:.C mediano en % (día) % mediano de regresión (día) Regresiones Valor de p Comentarios bioestadístico2
Parcial
Completa
chMAb2SPDBOM4
IV ( 10 ml/Kg) 10 19 016 -7,3 (0 20) -4 (032) 19 (032) 216 016 lt; 0,0001 Altamente activo
5
19 016 -4,5 (045) 12 (032) - 016 016 -0,0105 Activo
2,5
19 016 -4,2 (020) 36 (032) - 016 016 ns Marginalmente activo
1,25
19 016 -4,1 (0 20) 42 (032) - 016 016 ns Inactivo
huMAb23-SPDBOM4
IV ( 10 ml/Kg) 10 5 19 19 016 016 -4 ,3 (027) -33 020 -6 (035) 4 D38 31 (035) - 216 016 016 016 lt; 0,0001 Altamente activo lt; O 0001 Mu activo
2,5 1,25
19 19 016 016 -5,4 045 -3,0 (027) 12 0 38 34 (038) -- 016 016 016 016 0,0322 Activo ns Marginalmente activo
huMAb24-SPOBOM4
IV (10 ml/Kg) 10 5 19 19 016 016 -3,7 022 -3,2 (027) -4 032 17 (032) 21 032 - 216 016 016 016 lt; 0,0001 Mu activo 0,0417 Muy activo
2,5
19 016 -3,4 (020) 37 (032) - 016 016 ns Marginalmenle activo
1,25
19 016 -28 027) 50 (032) - 016 016 ns Inactivo
Control --19 --3,9 024 -----: formulación del fármaco: HGS (histidina 10 mM, glicina 130 mM, sacarosa al 5% v/v, Tween80 al 0,01%) pH 7,4 ; 2: valor de p: Prueba de Dunnett frente a control después de Anova de 2 vías con medidas repetidas sobre cambios transformados en rangos de volumen tumoral desde la línea base; ns: no sianificativo
Ejemplo 7.4: Eficacia in vivo frente a tumores de estómago primarios STO-INO-O06 implantados s.c. en ratones hembra selo
Material y metodo
El conjugado humanizado huMAb2-3-SPOB-DM4 se evaluó a 3 niveles de dosis frente a tumores de estómago
5 primarios medibles STO-INO-006 implantados s.c. en ratones hembra SCIO. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg _Se administraron a 10, 5 Y 2,5 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 27 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5
Resu ltados·
10 Usando un esquema de una única administración a 2,5, 5 Y 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-0M4 no indujo toxicidad.
Como se muestra en la Figura 6 y en la Tabla 21 , huMAb2-3-SPDB-DM4 fue muy activo a 10 mg/kg con llT/llC de 7% (p lt; 0,0001 frente al control); activo a 5 mgfkg con 6.TlllC de 36% (p =0,0281 frente al control); e inactivo a 2,5 mgfkg
ii:
Ejemplo 7.5: Eficacia in vivo frente a tumores de pulmón primarios LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCtO
Material y método
El conjugado humanizado huMAb2-3-SPDB-OM4 se evaluó a 3 niveles de dosis frente a tumores de pulmón
5 primarios medibles LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCIO. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mgfkg_ Se administró a 10,5 Y 2,5 mglkg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 29 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5
Resu ltados
10 Usando un esquema de una única administración a 2,5, 5 Y 10 mgfkg, huMAb2-3-SPOB-DM4 no indujo toxicidad.
Como se muestra en la Figura 18 y en la Tabla 22, huMAb2-3-SPDB-0M4 fue altamente activo a 10 y 5 mgfkg con l!.Tfl!.C inferior a 0% (p lt; 0,0001 frente al control) y regresión tumOfal de 67 y 57%, respectivamente; y activo a 2,5 mglkg con l!.T/l!.C de 12% (p =0,0363 frente al control)

Tabla 22: Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de pulmón humano primario LUN-NIC-0014 en ratones hembra SCID
Agente
Ruta! Dosis en ml/kg Dosis en mg/kg por inyección Calendario en días Muerte por fármaco (Dia) Cambio promedio de peso corporal en % por ratón en el nadir (dia de nadir) lJ.T/lJ.C mediano en % (día42)% (día % mediano de regresión (día42) Regresiones Valor de p Comentarios bioestadístico2
Parcial
Completa
huMAb2-3SPOBDM4
10 29 016 +1 7 (032) lt;O 67 516 116 lt; O0001 Muy activo
IV (10 mllko)
5 29 016 -1,1 (036) lt;O 57 416 016 lt; 0,0001 Muy activo
2,5
29 016 +0,5 (032) 12 039 - 016 016 0,0363 039) Activo
Control ---+0,1 034 ------: formulación del fármaco: HGS (histidina 10 mM, glicina 130 mM, sacarosa al 5% vlv, Tween80 al 0,01%) pH 7,4; : valor de p: Prueba de Dunnett frente a control desoués de Anova de 2 vias con medidas reoetidas sobre cambios transformados en ranoos de volumen tumoral desde la linea base.
~
Ejemplo 7.6: Eficacia in vivo frente a tumores de colon primarios CR-IGR-OJ4P implantados s.c. en ratones hembra SCtO
Material y metodo
Tres conjugados, constituidos por el huMAb2-J humanizado conjugado con el DM4 a través de dos enlazadOfes
5 diferentes (SPOS y sulto-SPOS), se evaluaroo a 2 niveles de dosis frente a tumores de oolon primario medibles CRIGR-OJ4P implantados s.c. en ratones hembra SCIO. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg . Se administraron a 5 y 2,5 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa
(IV) en el día 19 después del implante del tumor
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
10 Resultados
Usando un esquema de una única administración a 2,5 'f 5 mglkg, huMAb2-3-SPOB-DM4 y huMAb2-3-sulfo-SPDBDM4 no indujeron toxicidad
Como se muestra en la Figura 19 y en la Tabla 23, huMAb2-3-SPDB-DM4 fue activo a 5 y 2,5 mgfkg con llTlllC de 12% y 40%, respectivamente (p lt; 0,0001 frente al control); huMAb2-3-sulfo-SPOB-OM4 fue altamente activo a 5
15 mglkg con llTlllC inferior a 0% (p lt; 0,0001 frente al control) y una regresión tumoral de 12%; y activo a 2,5 mglkg con llT/llC de 1% (p lt; 0,0001 frente al control).
~
w
Ejemplo 8: Desarrollo de un protocolo de inmunohistoquímica (IHC) dedicado a la detección de proteína CEACAM5 humana y de mono en tejidos fijados con formalina y embebídos en parafina (FFPE). Materiales y métodos Tejidos 5 Se usaron micromalrices de tejido FFPE (TMA, Tabla 24) como fuente de tejidos humanos (tumorales y no tumorales) así como de mono macaco (normales) Tabla 24: Micromatrices de tejido fijado en forma lina y embebido en parafina usadas como fuentes de tejido
Referencia
Proveedor Descripción
ASM221
Pantomics Macaco, 22 órganos, 22 muestras
CyFDA
US Biomax Micromatriz de tejido normal de macaco, 33 órganos, tomados de 6 individuos normales (99 casos)
COC1501
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de colon, 150 núcleos de tejido normalfbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
COC1502
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de colon , 150 núcleos de tej ido normalfbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
COC1503
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de colon, 150 núdeos de tejido normaVbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
MTU951
Pantomics 40 tipos de tumores abarcando entidades benignas, ma lignas y metastásicas de 27 sitios anatómicos
LUC1 501
Pantomics Matriz de tej ido de cáncer de pu lmón, 150 núdeos de tejido normalfbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
LUC1 502
Pantomics Matriz de tej ido de cáncer de pu lmón, 150 núcleos de tejido normalfbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
LUC1 503
Panlomics Malriz de tej ido de cáncer de pu lmón, 150 núdeos de tejido normalfbenigno (5 casos) y canceroso (70 casos)
MN0961
Pantomics 35 tipos de tejidos normales basado en la recomendación de la FDA para ensayo de reaclividad cruzada de anticuerpos
MN0661
Pantomics 33 tipos de tejidos normales basado en la recomendación de la FDA para ensayo de reactividad cruzada de anticuerpos.
MN0341
Pantomics 33 tipos de tejidos normales basado en la recomendación de la FDA para ensayo de reactividad cruzada de anticuerpos.
PAC481
Pantomics Matriz de tejido de cáncer pancreático que contiene 20 casos de cánceres y 4 casos de tejido pancreático normal y no ma ligno
CC4
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que induye 59 casos de cáncer de pulmón
A218(11I )
Accumax Matriz de tej ido de cáncer de esófago que contiene 40 casos de tumores y 8 no neoplásicos
A219{1I )
Accumax Matriz de tejido de cáncer de cabeza y cuello que contiene 45 casos de tumores y 8 no neoplásicos
A213(1I )
Accumax Matriz de tejido de cáncer de ovario que contiene 43 casos de tumores y 8 no neoplásicos
A301 (IV)
Accumax Matriz con varios tejidos cancerosos con tejidos normales correspondientes (30 casos de cáncer, 30 casos no neoplásicos)
A103(V)
Accumax Matriz con varios tejidos normales por duplicado (45 casos)
MAN2
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos normales de estómago, esófago,
Referencia
Proveedor Descripción
pulmón , colorrectal, tiroides y riñón
MA2
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos de cánceres de estómago, de esófago, de pulmón, colorrecta l, de tiroides y de riñón
MBN4
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos IlOrmales de mama, hígado, vejiga urinaria, ova rio, páncreas, próstata
MB4
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos de cánceres de mama, de hígado, de vejiga urinaria, de ovario, de páncreas, de próstata
MCN4
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos normales de endometrio, vesícula biliar, laringe, cuello uterino, piel
MC4
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 9 o 10 casos de cánceres de endometrio, de vesícu la biliar, de laringe, de cuello uterino, linfoma o mela noma
CJ1
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 59 casos de cáncer de ovario
CDN3
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 59 casos de colon y recto normales
CCN2
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 59 casos de pu lmón normal (equivalente CC4)
BB5
Superbiochips 60 núcleos, 30 de va rios tipos de cánceres humanos
AA9
Superbiochips Matriz de 59 núcleos que incluye 59 casos de órganos normales
TMAhu3a
Astery Matriz de varios tejidos cancerosos (76 casos)
STC1501
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de estómago, 150 núcleos que incluyen 75 casos de tejidos normales, reactivos y cancerosos del estómago
STC1502
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de estómago, 150 núcleos que incluyen 75 casos de tej idos normal, reactivos y cancerosos del estómago
STC1503
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de estómago, 150 núcleos que incluyen 75 casos de tejidos normal, reactivos y cancerosos del estómago
STC481
Pantomics Matriz de tejido de cáncer de estómago, 16 casos, 48 núcleos, uno normal emparejado con dos núcleos de tejido tumoral de cada paciente
Anticuerpos
MAb2 se usó como anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-CEACAM5 humana Una IgG1 de cabra anti-ratón conjugada con biotina (específica de cadena y1) (referencia 1070-08, lote L4309-X761, Southem Biotech, USA) se 5 usó como anticuerpo secundario.
Inmunotinción
El procedimiento de recuperación del antígeno se aplicó con amortiguador Cell Conditioning 1 (CC1) a 950C durante 8 min., y después a 100°C durante 28 mino Después de una etapa de bloqueo de biotinas endógenas, los portaobjetos se incubaron con el anti-anticuerpo primario diluido en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS)
10 a 5 f.lg/ml durante 2 horas a 24°C. El anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con biotina se incubó a 24°C durante 32 minutos a 0,5 f.lg/ml. La inmunotinci6n se hizo con telrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina (DAB) del kit de detección cromogénico DABMapTM (760-124, Ventana Medical Systems, Inc, USA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se realizó una etapa de contratinci6n con hematoxilina (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA) y se aplicó reactivo azulado (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA). Los portaobjetos
15 teñidos se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos coo cytoseal XYL (8312-4, Richard-Allan SCientific, USA).
Puntuación de IHC
Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon usando el sistema ScanScope XT (Aperio Technologies, Vista, CA) Se capturaron imágenes digitalizadas usando el software ImageScope (versión 10.2.2.2319, Aperio Technologies) a un aumento de x20 La evaluación de la tinción incluyó el sitio histológico de reactividad, tipo principal de célula reactiva, intensidad de la tinción y frecuencia de la tinción celulaL Las muestras negativas se puntuaron como 0+. Las muestras positivas se puntuaron con una escala de intensidad de 1 + a 4+. Los intervalos de intensidades se describieron como débil )0;2+[, moderada [2+;3+[, y fuerte [3+;4 +]. La frecuencia celular fue el porcentaje de células inmunoteñidas, y se
5 estimó por la observación del histólogo como una mediana por muestra. La frecuencia celular se ordellÓ en 5 categorías de puntuación de proporción: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51 -75%) Y 5 (76.100%)
Para los tumores, se adaptó una puntuación de expresión global de la puntuación Allred (AS) (Mohsin S, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roanh LD, et al. Progesterone receptor by immunohistochemistry and clinical outcome in breast cancer: a validation study. Mod. Pathol. 2004; 17:1545-1 554). Esta AS se obtuvo sumando las
10 puntuaciones de intensidad y proporción para obtener una puntuación total que varía de 0-9. La AS se dio como un porcentaje de la puntuación global máxima y varió en 5 categorías: muy baja (0-25%), débil (26-50%), moderada (51·75%), y alta (76-100%). La prevalencia se definió como el porcentaje de casos positivos para la indicación.
Anál isis estadístico descriptivo
Las estadísticas descriptivas se calcularon con el software Microsoft Excel 2003. Para cada indicación se
15 describieron número de casos, número de casos positivos, prevalencia. mediana de la puntuación de intensidad, mediana de la frecuencia, media de la puntuación Allred, intervalo de intensidad, intervalo de frecuencia e intervalo de puntuación Allred
Ejemplo 8.1 : Uso de un anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5 para la evaluación de la proteína CEACAM5 en tumores humanos FFPE por inmunohistoquímica (IHC)
20 Se estudió un gran panel de tumores humanos usando portaobjetos de matrices de tejido comerciales (formato FFPE). La expresión de la proteína CEACAM5 se localizó en membrana +fcitoplasma de las células tumorales (Figura 1C, D). Parte de la tinción de membrana estaba polarizada en el polo apical de las células en los tumores más diferenciados. Se encontró que la proteína CEACAM5 se expresa en:
89% de casos de adenocarcinoma de colon (194/219, intensidad 2-2,5+, frecuencia 53-59%, AS 60-66%)
25 49% de casos de adenocarcinoma de estómago (95f195, intensidad 2,5+, frecuencia 53%, AS 62%)
41% de casos de adenocarcinoma de pulmón (24/58, intensidad 1,8-2+, frecuencia 50-53%, AS 54-58%)
79% de casos de carcinoma escamoso de cuello de útero (11/14, intensidad 2+, frecuencia 22%, AS 46%)
53% de casos de adenocarcinoma de páncreas (18/34, intensidad 2+, frecuencia 23%, AS 42%)
37% de casos de carcinoma de células escamosas de esófago (23/62, intensidad 2+, frecuencia 16%, AS 30 38%)
4% de casos de carcinoma de ovario (3fT7 , intensidad 2+, frecuencia 43%, AS 54%)
11% de casos de carcinoma de tiroides (2118 , intensidad 1,5+, frecuencia 63%, AS 56%)
25% de casos de carcinoma de vejiga (5120, intensidad 1,5+, frecuencia 61%, AS 56%)
7% de casos de adenocarcinoma de endometrio (1/1 4, intensidad 2+, frecuencia 50%, AS 56%)
35 11% de casos de carcinoma duelal de mama (2118, intensidad 1,5+, frecuencia 53%, AS 50%)
53% de casos de colangiocarcinoma (2/6, intensidad 1,5+, frecuencia 75%, AS 50%)
53% de casos de carcinoma de células escamosas de pulmón (31/148, intensidad 1,5+, frecuencia 22%, AS 39%)
8% de casos de adenocarcinoma de próstata (1113, intensidad 2+, frecuencia 50%, AS 44%)
40 25% de casos de carcinoma escamoso de la piel (218, intensidad 1,5+, frecuencia 23%, AS 39%)
Ejemplo 8.2: Reactividad cruzada en tejidos de un anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5 en mono Macaco (Macaca fascicularis) y comparación con el patrón de expresión humano
El dominio exlracelular de la proteína de CEACAM5 de origen humano (h) o de mono macaco (c) se ha preparado mediante expresión transitoria en células de riñón embrionario humano HEK293 con el plásmido de ADNc de
45 CEACAM5 (ejemplo 1, Tabla 1). Los peletes celulares se fijaron en formalina al 10% (Sigma Aldrich, USA) durante 16 horas, y se embebieron en parafina como una pieza de tejido de acuerdo con el procedimiento histológico estándar.
Se usaron TMA comerciales como fuente de tejido normal humano y de mono (Tabla 21 ).
La reactividad cruzada de Mab2 se mostró por inmunotinción en las células transfectadas tanto con CEACAM5 humana como de mono (loca lización en la membrana y el citoplasma).
En tejidos normales de macaco, la expresión de la proteína CEACAM5 se encontró en células epiteliales columnares absorbentes (2/3 casos positivos, intensidad mediana 1,5+, frecuencia media 55%).
En tejidos no tumorales humanos, la expresión de CEACAM5 también se observó en células epiteliales columnares absorbentes (62/64 casos positivos, intensidad mediana 2+, frecuencia media 90%). En los tejidos humanos, la expresión de CEACAM5 se observó en menor grado en células epiteliales del esófago, células epiteliales de cabeza y cuello, células epiteliales de la fosa gástrica del estómago, y células epiteliales del cuello uterino.
Ejemplo 9: Conjugado de anticuerpo fármaco (variante)
hu MAb 2-3-antiCEACAM5-su Ifo-SPDB-D M4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
i:28Onm(Ab) = 201 400; C252nm(Ab) = 71451
t:28Onm(DM4) = 5180; C252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 7,0 mi de una disolución de huMAb2-3 antiCEACAM5 (C = 5,32 mg/ml en amortiguador de PBS pH:: 7,4) en un recipiente, seguido de 1,6 mi de DMA y 168,4 JIJde disoluciÓfl de enlazador nitro-sulfoSPDB (descrito en el documento W02009134977) (10 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 3,4 ,ti de disolución de enlazador nitro-SPDB (2,0 eq -disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,90 mi de amortiguador de PBS pH 7,4, 0,407 mi de DMA y 0,322 mi de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, y 16 horas a 5OC, la mezcla de reacción bruta se pu rifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 fJm.
Se obtienen así 19 mi de conjugado huMAb2-3-antiCEACAM5-sulfoSPDB-DM4 (c = 1,51 mglml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,4; DAR (SEC)= 3,3; pureza monomérica = 99,8%; datos de HRMS: véase la Figura 20
huMAb2-3 antiCEACAM5-SMCC-DM1
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(DM1 ) = 738 glmol
t:28Onrn(Ab) = 201400; C252nm(Ab) = 71451
t:260nm(DM1) = 5180; f.252nrn(DM1) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 11,3 mi de una disolución de huMAb2-3 antiCEACAM5 (C = 3,47 mg/ml en amortiguador A pH = 6,5) en un recipiente, seguido de 0,387 mi de DMA y 178 fJJ de disolución de enlazador SMCC (10 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se agita lentamente a RT durante 2 horas. Se intercambia el amortiguador de la mezcla de reacción bruta en una columna desaladora HiPrep 26110 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 2 CV de NaOH 0,2M, 5 CV de agua y 5 CV de amortiguador de citrato (pH 5,5) El conjugado se eluye con amortiguador de citrato (pH 5,5), Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 Jlm. A esta disoluciÓfl se añaden sucesivamente, con agitaciórJ, a RT, 0,476 mi de DMA y 0,124 mi de disolución de DM1 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica dos veces en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 2 CV de NaOH O,2M, 5 CV de agua y 5 CV de histidina (10 mM), g licina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, Y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 JIm
Se obtienen así 9,5 mi de huMAb2-3 antiCEACAM5-SMCC-DM1 (c:: 1,73 mg/ml ) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica· DAR (UV) = 2,7; DAR (SEC) = 2,9; pureza monomérica = 99,6%; datos de HRMS: véase la Figura 21 Ejemplo 10: Caracterización del epitopo y del paratopo de A3B3 de CEACAM5 en complejo con Fab de MAb2_VH1aVl1c usando intercambio de hidrógeno-deuterio asociado con espectrometria de masas (HOX MS)
Ejemplo 10.1: Principio de HDX MS
El intercambio de hidrógeno-deuterio de amida (HoX) asociado con espectrometría de masas (MS) permite la identificación de regiones de proteinas implicadas en cambios conformacionales o interacciones. Esta técnica permite más específicamente identificar las regiones de un antígeno que muestran, después de incubación en un amortiguador deuterado y proteolisis, una disminución de la incorporación de deuterio en su forma unida a un anticuerpo comparado con su forma libre
El epítopo pertenece a estas regiones, cuyo intercambio se ralentiza por la unión al anticuerpo. Un artículo reciente describe con detalle las diferentes etapas para caracterizar epítopos usando esta estrategia (Zhang, a., Willison, l N., Tripathi, P., Sathe, S. K., Roux, K. H., Emmett, M. R, Blakney, G. T. , Zhang, H. M. Y Marshall, A. G. (2011). Analytical Chemistry 83, 7129-7136.).
Ejemplo 10.2: Materiales
Las secuencias codificantes del dominio variable de MAb2_VH1aVL 1c (SEO ID NO:5 y SEO ID NO:29) se clonaron en un vector de expresión de mamíferos en fusión con las secuencias codificantes del dominio CH1 humano (como se encuentra en los Fabs derivados de IgG1 escindida por papaína), seguido de una etiqueta de hexa-histidina, o con el dominio constante Ckappa humano, respectivamente. Se produjo un lote de Fab de MAb2_VH1aVL1c en células HEK293-FSTU cultivadas en suspensión por transfección transitoria de dos plásmidos de expresión, que codifican las dos cadenas, formando un complejo con 293fectinTU (lnvitrogen). El sobrenadante del cultivo que contiene la proteina segregada se recolectó siete días después de la transfección, se centrifugó y se filtró en una membrana de 0,22 ~m. El Fab se purificó por cromatografía de afinidad en IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando gradiente de imidazol en PBS. Después, el conjunto de fracciones que contiene el Fab se pu rificó por cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) equi librada con PBS
El dominio A3B3 hCEACAM5 etiquetado con His (SEO ID NO:67) se produjo con células HEK293-FSTU cultivadas en un matraz por transfecciórl transitoria del plásmido de expresión. Cada día se añadió kifunensina (inhibidor del proceso de recorte en la glicosilación). El sobrenadante del cultivo que contiene la proteína segregada se recolectó siete dlas después de la transfección, se centrifugó y se filtró en una membrana de 0,22 ~m. Se añadió endoH al sobrenadante hasta 625 ufml, y después se incubó 3 h a 37OC. El A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado se purificó por cromatografía de afinidad en IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando gradiente de imidazol en PBS. Después, el conjunto de fracciones que contiene el A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado se purificó por cromatografía de
exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) equilibrada con PBS. El análisis por espectrometría de masas de A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado mostró dos especies (22485 y 22278 Da), lo que indica que la proteína porta 7 u 8 restos de N-acetilglucosamina (GlcNAc).
Para construir un complejo, ambas proteínas se combinaron con un exceso de 1,5 moles de A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado por un mol de Fab. Este exceso se eliminó por cromatografía de exclusión por tamaño en superdex 200 equilibrada con disolución salina amortiguada con fosfato. Las fracciones correspondientes a Fab en complejo con el antígeno se usaron para el estudio de intercambio de deuterio.
Ejemplo 10.3: Métodos
Los experimentos de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX) se automatizaron completamente usando un automuestreador PAL (CTC Analytics). Activó el inicio y la parada del intercambio, el control de la temperatura de proteolisis (4°C), la inyección de los péptidos deuterados, la gestión de las válvulas de inyección y de lavado, y desencadenó la adquisición de las bombas del espectr6metro de masas y HPLC. Una caja enfriada por efecto Peltier (4°C) contenía dos válvulas Rheodyne automatizadas (6 puertos para inyección y 10 puertos para lavado), un cartucho de desalado (Micro Trap de péptidos de Bruker-Michrom) y una columna de HPlC (Poroshell120 EC-C18, 1 x 50 mm, 2,7 JlM de Agilent Technologies). La deuteración se inició por una dilución de 5 veces de CEACAM5, mAb o complejo con PBS en o~O. Se usó GndHCI 2M, TCEP 0,8 M, glicina 1 M para detener el retrointercambio y reducir los puentes de disulfuro durante 2 mino a 4°C.
Las proteínas se digirieron con las proteasas pepsina y nepentesina, y los péptidos se desalaron usando una bomba de HPLC de Agilent Technologies con TFA 0,03% en agua a 100 ~Ifmin. Los péptidos se separaron entonces usando otra bomba de HPLC de Agilent Technologies con un gradiente 15-100% de B en 20 mino (A: TFA 0,03% en agua; B: acetonitrilo 90%, TFA 0,03% en agua). Las masas de los péptidos se midieron usando un espectrómetro de masas TOF con electropulverización (Agilent 6210).
Los péptidos se identificaron por MS en tándem (MSMS), usando un Bruker APEX-O FTMS (9,4 T) Y un Bruker 12 T SolariX .
Los software Data Analysis (Bruker) y Mass Hunter (Agilent Technologies) se usaron para las adquisiciones de los datos_ Data Analysis y Mascot (Matrix Science) se usaron para procesar los datos de MSMS Los software Mass Hunter y HD Examiner (Sierra Analytics) se usaron para el procesamiento de los datos de HDX
Los experimentos de HOX se repitieron al menos tres veces
Ejemplo 10.4: Resultados
Identificación y selección de los péptidos
Los puentes de disulfuro permanecieron intactos durante la deuteraci6n para mantener la información estructural relacionada con ellos. Para favorecer la proteolisis y la identificación de los péptidos, los puentes se redujeron con TCEP después de la etapa de paralización a pH bajo y temperatura baja_ Usando MSMS después de la digestión del complejo CEACAM5-Fab fue posible identificar un gran número de péptidos que surgen de las tres cadenas de proteína. Después de los experimentos de HDX, solo se selecciooaron los que proporcionaron señales de buena calidad: 25, 30 Y 20 péptidos del antígeno A3-B3 de CEACAM5, cadena pesada de Fab de MAb2_VH1aVL 1c y cadena ligera de MAb2_VH1aVL1c, respectivamente_Estos péptidos abarcan 89%, 77% Y 68% de las secuencias del antígeno A3-B3 de CEACAM5, cadena pesada de Fab de MAb2_VH1aVL1c y cadena ligera de MAb2_ VH1aVL1c, respectivamente (Tabla 25)_ Las regiones no abarcadas de las cadenas de Fab están principalmente en sus partes C-terminales

Tabla 25: Cobertura de secuencia con péptidos deuterados
Péptidos
Cobertura de la secuencia
CEACAM5-A3-B3
1-18; 1-22; 1-23; 1-19; 23-35; 36-51 , 35-49; 50-70; 36-43; 44-51 , 36-51 , 36-49; 50-67; 37-49; 44-49; 59-67; 71 -89; 93-107; 108-115; 128-143; 128-142; 143-157; 130-143; 130142; 140-143; 163-186
Cadena pesada de Fab de MAb2 VH1aVL1c
1-6; 1 20; 1-19; 1 17; 1 18; 4 18; 520; 5 18; 2429; 27 32; 27 29; 34-46; 47 68; 48 68; 50-68; 69-86; 84-93; 88-98; 92-104; 100-109; 110-115; 116-136; 111 -128; 149-158; 151 -158-159-177-162-177-167-177-187-206
Cadena ligera de MAb2 VH1aVL1c
1-11 ; 511 ; 22-46; 47 54; 55 70; 5571 ; 72 82; 87-104; 1051 15; 117-132; 124 131 ; 127 145; 133-144; 136-145; 136-143; 136-144; 143-161 ; 144-151 ; 146-151
Los 8 restos de asparagina que son sitios potenciales de glicosilaciones se identificaron en varios péptidos con una GlcNAc que queda de la desglicosilación con endo H. En particular, se encontró N114 en el péptido 108-115. En los primeros experimentos (no usados para HDX), se encontró N166 en ambas formas (con y sin GlcNAc). Podría explicar la heterogeneidad observada en el espectro de masas de A3B3 de CEACAM5 después de la glicosilacién, que corresponde a 7 y 8 GlcNAc.
Identificación de epitopo y paratopo
El antígeno libre, el Fab libre y su complejo se deuteraron durante 2 mino o 20 mino a 4°C, o a 20 mino a temperatura ambiente (26°C) _ Considerando las cinéticas del intercambio de hidrógenos de amida con la temperatura (un incremento de intercambio de aproximadamente 3 veces con 10OC), la última condición es equivalente a 200 min de deuteración a 4°C
Epítopo
Las cinéticas de la incorporación de deuterio para los 25 péptidos seleccionados de A3B3 de CEACAM5 se compararon cuando el antigeno se deuteró en la forma libre y cuando estaba formando un complejo con el Fab Varios péptidos no mostraron ninguna diferencia significativa en HDX (t.HOX) entre ambos estados_ Por el contrario, algunos de ellos (108-115 y 128-143) mostraron t.HDX significativa. La segunda región estaba abarcada con 5 péptidos diferentes: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 Y 140-143, que muestran 13-15 ± 2% (hasta 1,6 ± 0,2 O) t.HDX después de 2 mino de deuteración.
Comparando 128-142 con 130-142, y 128-143 con 130-143, no medimos ningún cambio significativo en L\HDX en cada caso (1 ,3-1,4 O para los dos primeros péptidos, y 1,6 para los dos últimos, después de 2 min_de deuteraciÓn), lo que significa que las amidas W129 y R130 probablemente no estén implicadas en el epítopo_Por el cootrario, comparando 128-142 con 128-143, y 130-142 con 130-143, medimos un pequeño cambio en L\HDX (aproximadamente 0,2 O), lo que significa que la amida F143 está implicada _ El t.HDX en el péptido 140-143 (aproximadamente 0,3 O) indica que las amidas V141 o L142 también podrían estar implicadas. Dentro de las 9 amidas de 1131 a 0140, varias de ellas están implicadas en el epítopo (aproximadamente 1 L\HDX compartido en promedio)
Estas diferencias en la incorporación de deuterio indican que el epítopo pertenece en particular a regiones (amidas), es decir, péptidos de secuencias SGANLNL (SEQ ID NO: 76) y INGIPQOHTQVLF (SEO ID NO: 77).
Paratopo Las cinéticas de la incorporación de deuterio para los 30 péptidos seleccionados de la cadena pesada de Fab se
compararon cuando el Fab se deuteró en la forma libre y cuando estaba formando un complejo con el antígeno_ Casi todos los péptidos no mostraron ninguna AHDX significativa entre ambos estados. Solo un péptido (100-109) presentó una 6HDX después de 200 min _ de deuteración: 11 ± 2% (0,7 ± 0,2 D)_La región (amidas) 101-109 de
5 cadena pesada de Fab de MAb2_VH1aVL1c está implicada en el paratopo
Las cinéticas de la incorporación de deuterio para los 20 péptidos seleccionados de la cadena ligera de Fab se compararon cuando el Fab se deuteró en la forma libre y cuando estaba formando un complejo con el antígeno. Casi todos los péptidos no mostraron ninguna 6HDX significativa entre ambos estados. Solo dos péptidos (47-54 y 87104) presentaron una diferencia_Después de 20 min_de deuteración, fue 10 ± 2% (0,6 ± 0,2 D) para el primero y 5 ±
10 2% (0,9 ± 0,2 D) para el segundo, respectivamente Las regiones 48-54 y 88-104 de cadena ligera de MAb2_ VH1aVL 1c están implicadas en el paratopo.
LISTADO DE SECUENCIAS
lt;110gt; SANOFI
lt;120gt; ANTICUERPOS ANTI-CEACAM5 y USOS DE LOS MISMOS 15 lt;130gt; FR2012/065
lt;150gt; EP12306444
lt;151gt; 2012-11-20
lt;160gt; 90
lt;170gt; Patentln version 3.5
lt;210gt; 1
lt;211gt; 8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial 25 lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 1
G~y Phe Thr Phe Ser Ser Tyr A~8
1 5
30 lt;210gt; 2
lt;211gt; 8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 35 lt;223gt; CDR
lt;400gt; 2
I~e Ser Ser Gly Gly Ser Tyr I~e 1 5
lt;210gt; 3
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
5
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 3
Ala Arg Pro Al a Tyr Tyr Gl y Aso Pro Ala Mat
Asp Tyr
1 5 10
lt;210gt; 4
10
lt;211gt;6
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
15
lt;400gt; 4
Gln Asn Val Gly Th, A,n
1 5
lt;210gt; 5
lt;211gt; 120
20
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; VH1a del anticuerpo Mab2 humanizado
lt;400gt; 5
G~u Va~ G~n Leu G~n G~u Ser G~y Pro G~y Leu Va~ Lys Pro G~y G~y 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Tyr 1le Ser Ser Gly Gly Gly 1le Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Val 50 ~ 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
lt;210gt; 6
lt;211gt; 10 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 6
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Tyr Thr 1 5 10
lt;210gt; 7 lt;211gt;8
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 7
Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5
lt;210gt; 8
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 8
Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr
1 5
lt;210gt; 9
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 9
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr 1 S 10
lt;210gt; 10 lt;211gt;6
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 10
Glu Asn Ile Phe Se r Tyr
1 5
lt;210gt; 11
lt;211gt; 526
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;400gt; 11
Met Gly Hi s Leu Ser Ala Pro Leu His Arg Val l~rg Val Pro Trp G1n 1 5 10 15
G1y Leu Leu Leu Thr Al a Ser Leu Leu Thr Phe '~rp Asn Pro Pro Thr 20 25 30
Thr Ala Gln Leu Thr Thr G1u Ser Met Pro Phe nsn Val Ala Glu Gly 40 45
Lys Gl u Val Leu Leu Leu Vd His Asn Leu Pro C;ln Gln Leu Phe Gly 50 55 ~¡O
Tyr Sar Trp Tyr Lys Gly Glu Arq Val Asp Gl y J\.sn Arq Gln :11a Val 65 10 15 80
Gly Tyr Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro C;ly Pro Ala Asn Ser 85 90 95
Gly Ar9 Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu I:.eu Ile Gln Asn Val 100 105 110
Thr Gln Asn Asp Thr Gly Pha Tyr Thr Lau Gln Val Ila Lys Sar Asp 115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 J.40
Pro LyS pro Ser 1le Ser Ser Asn Asn Ser Asn 'Ira val Glu ASp LyS 145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr C;ln Asp Thr Thr Tyr 165 170 175
Leu Trp Trp Ile Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190
Leu Ser Asn Gly Aan Arq Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arq Asn 195 200 205
Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn 'Ira Val Se r Ala Asn 210 215 ~!20
Arq Ser Asp Pro Val Thr Leu Alln Val Thr Tyr (Uy Pro Allp Thr Pro 225 23U 235 240
Thr Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr Arq Pro C;ly Ala Asn Leu Ser
245 250 255
Leu Ser Cys Tyr Ala A~a Ser Asn Pro Pro A~a G~n Tyr Ser Trp Leu 260 265 270
Ile Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn 275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys His Ala Asn Asn Ser 290 295 300
Val Thr Gly Cys Asn Arq Thr Thr Va~ Lys Thr I~e Ile Va~ Thr G~u 305 310 315 320
Leu Ser Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr 325 330 335
Val Thr Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp
Thr Gly Ile Ser Ile Arg Trp Phe 355 360
Ser Glu Arg Met Lys Leu Ser Gln 370 375
Pro Val Lys Arg Glu Asp Ala Gly 385 390
345 350
Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser 365
Gly Asn Thr Thr Leu Ser Ile Asn 380
Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn 395 400
Pro Ile Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Va~ Asn Tyr 405 410 415
Asn Ala Leu Pro Gln Glu Asn Gly Leu Ser Pro Gly Ala Ile Ala Gly 420 425 430
Ile Val Ile Gly Val Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Ala Val Ala Leu
435 440 Ala Cys Phe Leu Bis Phe Gly Lys 450 455
Asp Leu Thr G~u Ris Lys Pro Ser 465 470 Ser Asn Asp Pro Pro Asn Lys Met
485 Asn Phe Glu Ala Gln Gln Pro Thr
445 Thr Gly Arq Ala Ser Asp Gln Arq 460
Va~ Ser Asn His Thr Gln Asp His 475 480
Asn Glu Val Thr Tyr Ser Thr Leu
490 495 Gln Pro Thr Ser Ala Ser Pro Ser
505 510
Leu Thr Ala Thr Glu Ile Ile Tyr Ser Glu Val Lys Lys Gln 515 520 525
lt;210gt; 12
lt;211gt;9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 12
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr 1 5
lt;210gt; 13
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 13
Gly Phe Thr Phe Ser Arq Tyr Ala
1 5
lt;210gt; 14
lt;211gt; 7
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 14
Ile Ser Ser Gly Gly Asp Thr
1 5
lt;210gt; 15
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 15
Ala Arg Val Asn 1
lt;210gt; 16 lt;211gt;6
lt;212gt; PRT
Tyr Tyr Asp Ser Ser Phe Leu Asp Trp 5 10
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 16
Gln quot;n Val Gly Thr quot;n 1 5 10
lt;210gt; 17
lt;211gt; 107
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; VL 1 del anticuerpo Mab2 humanizado
lt;400gt; 17
Asp lle Gln Met Thr Gln Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Thr Val Thr lle Thr Cys Arg ~a Ser Glu Asn lle Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
lt;210gt; 18
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 18
Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Tyr Thr
1 5 10
lt;210gt; 19
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 19
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
lt;210gt; 20 lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; f ragmento de anticuerpo
lt;400gt; 20
Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Arg Thr
1 5
lt;210gt; 21
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 21
Ala Ala His Tyr Phe Gly Thr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
lt;210gt; 22 5 lt;211gt;6
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR 10 lt;400gt; 22
Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 1 5
lt;210gt; 23
lt;211gt; 107 15 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; VL1 a del anticuerpo Mab2 humanizado
lt;400gt; 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arq Val Thr Ile Thr Cya Arq ~a Ser Glu Aan Ile Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lya Pro Gly Lya Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Le u Ala Glu Gly Val Pr o Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe ~a Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pr o Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
20 100 105
lt;210gt; 24 lt;211gt;9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 24
Gln His His Tyr Gly Ile Pro Phe Thr 1 5
lt;210gt; 25 lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
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Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5
lt;210gt; 26
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 26
Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ile Thr 1 5
lt;210gt; 27
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 27
Thr Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser G1y Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
lt;21 0gt; 28
lt;211gt; 6 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;400gt; 28
Glu Asn t1e Tyr Ser Tyr
1 5
lt;21 0gt; 29
lt;211 gt; 107
lt;212gt; PRT
15 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; VL 1c del anticuerpo Mab2 humanizado
lt;400gt; 29
Asp t~e Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu A~a Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr tle Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys G1n His His Tyr Gly Thr Pro Phe ~ 90 ~
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu G1u tle Lys 100 105
lt;210gt; 30 lt;211gt;9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220> 5 lt;223gt; CDR
lt;400gt; 30
G~n Bis Bis Tyr G~y Thr Pro Phe Thr
1 5
lt;210gt; 31 10 lt;211gt; 120
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo 15 lt;400gt;31
~~ ~~_~~~_~~Pro_~
1 5 ~O 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys A~a Ala Ser G~y Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg G~n Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Va~ 35 40 45
Ala Thr I~e Ser Ser Gly G~y Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Aep Ser Va~ 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn A~a Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Het Ser Ser Leu Arg Ser G~u Asp Thr Ala Het Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Pro Al.a Tyr Tyr G~y Asn Pro Ala Het Asp Tyr Trp Gly G~n 100 105 110
G~y Thr Ser Va~ Thr Va~ Ser Ser 115 120
20 lt;210gt;32
lt;211gt; 108
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificia l
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 32
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Aap Arq Val Ser Val Thr Cya Lya ~a Ser Gln Aan Val Gly Thr Aan 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu 11e 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser As n Val Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu ~ Glu Tyr Phe Cy8 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 5 100 105
lt;210gt; 33
lt;211gt; 120
lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 33
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe val Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val. Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr lle Ser Ser Gly Gly Gly lle Thr Tyr Phe Pro Asp Thr Val 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr A1a Ile Tyr Tyr Cya 85 90 95
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
lt;210gt; 34
lt;211gt; 107
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr lle Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lle Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys G1n Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 10 100 105
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lt;211gt;119
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 35
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Ser Leu Thr Leu Pro Cys Ala Ala 20
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr 35 40
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp 50 ~
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp 65 70
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu 85
Arg Val Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser 100
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 5 115
lt;210gt; 36
lt;211gt; 108
lt;212gt; PRT
10 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln 1 5
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys 20
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30
Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 60
Asn Ala Arg Asn Ile Leu Phe Leu 75 80
Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala 90 95
Phe Leu Asp Trp Trp Gly Gln Gly 105 110
Arg Phe Met Ser Thr Leu Glu Gly 10 15
Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 25 30
Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
Tyr Ser Ala Ser Tyr ArQ Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arq Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu ~ 90 ~
Tyr Thr Phe Gly Gly G1y Thr Lya Leu G1u I1e Lya 100 105
lt;210gt; 37
lt;211gt; 120
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 37
Glu Val Gln Leu Val. Gl.u Ser Gly Gly Gl.y Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gl.y Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
~a Phe Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Arq Thr Tyr Tyr ~a Asp Thr Val 50 55 60
Lya Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Aep Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95
~a Ala His Tyr Phe Gly Thr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 10 115 120
lt;210gt; 38
lt;211gt; 107
lt;212gt; PRT
15 lt;213gt; Artificia l
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 38
Asp r~e Gln Met Thr G~n Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Ile Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly SO 55 60
Ser G~y Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly rle Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
5 lt;210gt; 39
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lt;213gt; Artificia l
lt;220gt; 10 lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 39
Glu Leu Gln Lau Val Glu Ser Gly Gly Val Lau Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Lau Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Lau Glu Trp Val 35 40 45
Thr Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60
Lys G~y Arg Phe Thr rle Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu G~n Met Ser Ser Leu Lys Ser G1u Asp Thr ~a I~e Tyr Tyr Cys
quot;
~ ~
Thr A~a His Tyr Phe Gly Ser Ser G1y Pro Phe ~a Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
lt;210gt; 40
lt;211gt; 107 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 40
Asp I~e Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cya ArQ Ala Ser Glu Aan Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
_~ ~~_~~ r_~ ~
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Val Pr o Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 ~O
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys rle Asn Ser Leu G~n Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pr o Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 10 100 105
lt;210gt;41 lt;211gt;449
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lt;220gt;
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lt;400gt; 41
Glu Va~ Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va~ Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Lcu Lya Lcu Ser Cya A~a Ala Ser Gly Phc Thr Phc Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arq Gln Thr Pro Glu Lys Arq Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr ¡le Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu A8p Ser Val 50 55 6.
Lys Gly Arq Pha Thr 11e Sar Arq Asp Asn Ala Lys Asn Thr Lau Tyr 65 70 75 SO
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Aap Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arq Pro Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 15 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 175
17'
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro lSO 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Ly8 Val Glu Pro Ly8 Ser Cy8 Asp 210 215 220
Ly. Thr Bis Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly G1y 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Ly8 Pro Lys A8p Thr Leu Met Ile 245 250 255
Ser Arg Thr Pro GLu Val Thr Cys VaL VaL VaL Asp VaL Ser His GLu 260 265 270
ASp Pro GLu VaL Lys Phe Asn Trp Tyr VaL Asp GLy VaL GLu VaL His 275 280 285
Asn A.La Lys Thr Lys Pro Arg GLu GLu GLn Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300
VaL VaL Ser Val Leu Thr VaL Leu His GLn Asp Trp Leu Asn GLy Lys 305 3LO 3L5 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro :Ile Glu 325 330 335
Lys Thr :ILe Ser Lys Al.a Lys GLy Gln Pro Arg GLu Pro GLn VaL Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg ASp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu val Lys GLy Phe Tyr Pro Ser Asp Ile ALa val Glu Trp 3iO 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415
Lys Ser Aro Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu A~a Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly
lt;210gt; 42
lt;211gt;215 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; f ragmento de anticuerpo
lt;400gt; 42
ASp Ile LeU Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 10
1 5 10 15
Asp Arq Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 2S 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arq Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arq Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Tnr A8p Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala GLu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly GLy Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val ~a 100 105 110
Ala Pro Ser val Pne Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn phe Tyr Pro Arq Glu 130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Tnr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175
Ser Ser Thr Leu Tnr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys H18 Lys Val 180 185 190
Tyr Ala Cy8 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205
Ser Phe Asn Arq G1y Glu Cys 210 215
lt;210gt; 43
lt;211gt;449
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 43
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr 20 U 30
ASp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys J\.rg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Al. Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr :quot;he Pro Asp Thr Val SO 55 60
.'n Gly Arq Phe Thr Val 3er Arq Asp Asn Ala :Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr :l\.la I le Tyr Tyr 85 90 95
Ala Ala Bis Tyr Phe G1y Ser Ser Gl y Pro Phe :Ua Tyr Trp G1y G1n 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr :Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser (ily Gly Thr Ala Ala 130 135 .140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu ¡quot;ro Val Thr Val Serquot;, 1SO 1SS 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser G1y Val His 'rhr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Lau Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Lau Ser Ser Val Val Thr Val Pro lS0 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys :I'\.sn Val Asn His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val quot;p Lys Lys Val Glu ¡quot;ro Lys Ser Cys Asp 210 215 :220
Lys Th.o His Th.o Cys P.oo P.oo Cys P.oo Alquot;. P.oo ,:;1u Leu Lequot; G1y G1y 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys :I'\.sp Thr Leu Met I1e
245 25' 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285
Asn A~a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Gl u Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu As n Gly Ly8 305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Ly8 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro :IIa Glu 325 330 335
Lys Thr IIa Ser Lys A1a Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Ly8 Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 4()S 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val phe Ser Cys Ser Val Het His 420 425 430
G~u A~a Leu His Asn His Tyr Thr G~n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
lt;21 0gt; 44
lt;211 gt; 214 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 44
ASp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr tle Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn tle Phe Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln H~s H~s Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys ArQ Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn ASO Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Glo Trp Lys Val ASp ASO Ala Leu Glo Ser Gly ASO Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Glo Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys H~s Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr H~s Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
lt;210gt; 45
lt;211gt; 448 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 45
Glu Val Lya Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lya Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arq Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arq Gln Thr Pro Glu Lys Arq Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Ar9 Phe Thr Val Ser Ar9 Asp Asn Ala Ar9 Asn Ile Leu Phe Leu 65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cya Me 85 90
'5
Arg val Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Phe Leu Asp Trp Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ly. Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi.s Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Ly. Lys Val Glu Pro Ly. Ser Cys Asp Lys 210 215 220
Thr Hi.s Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240
Ser Val. Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Il.e Ser 245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro ArQ Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arq Val 290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Al.a Pro 1:1e Gl.u Lys 325 330 335
Thr lle Ser Lys lla Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Ala Val Glu Trp Glu 370 375 3BO
Ser Asn Gly Gl.n Pro Gl.u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val. Leu 3B5 390 395 400
ASp Ser Asp Gl.y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val. Asp Lys 41)5 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445
lt;21 0gt; 46
lt;211 gt; 215 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 46
ASp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val G1y Thr Asn 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
lt;210gt; 47
lt;211gt; 449
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Leu Val Lys Pro G1y G1y 1 5 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leo Glu Trp Val 35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Arq Thr Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60
Lys Gly Arq Phe Thr Ile Ser Arq Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala His Tyr Phe Gly Thr Ser G1y Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys G1y Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser G1y Gly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Ly. Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Al.a Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leo Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 las 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val ,quot;p Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220
Ly. Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240
Pro Ser Val. Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 1l.e 245 250 255
Ser Arg Thr Pro GLu VaL Thr Cys VaL VaL Val. Asp VaL Ser H~s GLu 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr VaL Asp Gly VaL Glu Val H~s 275 280 285
Asn A~a Lys Thr Lys Pro Ar9 GLu GLu G1n Tyr Asn Ser Thr Tyr Ar9 290 295 300
VaL Val Ser Val Leu Thr Val Leu H~s Gln Asp Trp Leu As n GLy Lys 305 310 315 320
GLu Tyr Lys Cys Lys VaL Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ILe GLu 325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Ar9 Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arq Asp GLu Leu Thr Lys As n GLn Va1 Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly phe Tyr Pro Ser Asp 1le Ala Va1 GLu Trp 3iO 375 390
GLu Ser Asn GLy G1n Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp G1y Ser phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 4()5 410 415
Lys
Ser Arq Trp G1n G1n Gly 420 Asn Val Phe 425 Ser Cys Ser va1 Met 430 His
GLu A.la Leu 435
H~s Asn His Tyr Thr Gln Lys 440 Ser Leu Ser Leu 445 Ser Pro
Gly
5
lt;210gt; 48 lt;211gt; 214 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt; lt;223gt; fragmento de anticuerpo lt;400gt; 48
ASp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr 11e Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 11e Tyr Ser Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr G1n Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys l1e Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly lle Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser G1y Thr Lys Leu Glu Leu Lys ArQ Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr G1u Gln Asp Ser Lya Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr G1u Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys G1u Val Thr His G1n G1y Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
lt;210gt; 49
lt;211gt; 449
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 49
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Thr Tyr Ile Aso Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60
Lys Gly Arq Phe Thr Ile Ser Arg Asp Aso Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys ~ ~ U
Thr Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Al. Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lya Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Ly. Asp Tyr phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 l~ l~
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Glo Thr Tyr Ile Cya Asn v.l Aso His Lys 195 200 205
Pro Ser As n Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Aap 210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Al.a Pro Gl.u Leu Leu Gl.y Gl.y 225 230 235 240
Pro Ser Val. Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ll.e 245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285
Asn A~a Lys Thr Lys Pro Arg Gl.u Gl.u Gln Tyr As n Ser Thr Tyr Arg 290 295 300
Val. Val Ser Val. Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335
Lys Thr lle Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Ly8 Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Ala Val Glu Trp 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Aso Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu A~a Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
lt;210gt; 50
lt;211gt; 214 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificia l
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo
lt;400gt; 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln G1y Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Tnr Leu Thr Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Tnr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu As p Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln H:is H:is Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys ArQ Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys v a l Gln Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Tnr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
lt;210gt; 51 5 lt;211gt; 120
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; fragmento de anticuerpo 10 lt;400gt;51
G~u Va~ G~n Leu G~n G~u Ser G~y Pro G~y Leu Va~ Lys Pro G~y G~y 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala A~a Ser G~y Phe Val Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
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~a Tyr I~e Ser Ser G~y G~y G~y I~e Thr Tyr Phe Pro Ser Thr Va~
50 55 EiO
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95
~a Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
lt;210gt; 52
lt;211gt; 702 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;400gt; 52
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15
Arl;! Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val Bis Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 EiO
Tyr Ser Trp Tyr Lys G~y G~u Arg Va~ Asp G~y :I\so Arg G~o l~e l~e 65 70 75 80
G~y Tyr Va~ lle Gly Tbr Glo Glo A1a Thr Pro '3ly Pro Ala Tyr Ser 90 95
'5
Gly Arg Glu ne lle Tyr Pro Aso Ala Ser Leu :Leu lle Glo Aso Ile 100 lOS 110
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Leu Val Aan Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140
Pro Lys Pro Ser 11e Ser Ser Aso Aso Ser Lys :lquot;ro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160
Asp Ala Val Ala phe Tbr Cys Glu Pro Glu Thr 03ln Asp Ala Tbr Tyr 165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Aso Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe :I!.sn V,' Thr Arg Aso 195 200 205
Asp Thr A1a Ser Tyr Lys Cyo Glu Thr Gln Asn ¡quot;ro Val Ser Ala Arg 210 215 .220
Arg Ser Asp Ser Val 11e Leu Aso Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240
Thr lle Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arq Ser '3ly Glu Aso Leu Aso 245 250 255
Leu Ser Cys H~s Ala Ala Ser Aso Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe 260 265 270
Val Aso Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu :Leu quot;he 11e Pro Asn 275 280 285
Ile Th., V..l ASIl ASIl Se., Gly Se., Ty., Th., Cys ,:;10 Al.. H.is ASIl Se., 290 295 .300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Tle Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320 Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu ABp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln ABn Thr 340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Ar!j1 355 360 365
Leu Gln Leu Ser ABn Asp Asn Arq Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly He Gln Asn Glu Leu Ser 385 390 395 400
Val Asp His Ser ABp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn 420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cya His Ala Ala Ser Asn pro pro Ala Gln Tyr Ser 435 440 445
Trp Leu Ila Asp Gly Asn Ile Glo Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Glo Ala Asn 465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arq Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val 485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro 500 505 510
val Glu Asp Lys Asp Ala Val Al. Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln 515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser 530 535 540
Pro Arq Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arq Thr Leu Thr Leu Phe Asn 545 550 555 560
Va~ Thr Arq Asn Asp A~a Arq Ala Tyr Va~ Cys G~y I~e G~n Asn Ser 565 570 575
Va~ Ser Ala Asn Arq Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr G~y 580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly 595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
61.0 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln Bis Thr Gln Val Leu 625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe 645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile 660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr 675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile 690 695 100
lt;21 0gt; 53
lt;211gt; 654
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;400gt; 53
Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arq Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Ala His Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe Gly Tyr Ile 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Arq Val Asp Ala Ser Arq Arq Ile Gly Ser Cys 35 40 45
Val Ile Arq Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala His Ser Gl y Arg 50 55 60
Glu Thr Ile Asp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80
Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val I l e Lys Glu Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Argo Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Tyr ne Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro I l e Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp ~,hr Thr Tyr Leu Trp 130 135 UO
Trp Val Asn Asn G1n Sar Lau Pro Val Sar Pro J\.r1jJ Lau G1u Lau
'er
145 150 155 160
Ser Asp Asn Arq Thr Leu Thr Val Phe Asn I l e Pro Arq Asn ASp Thr 165 170 175
Thr Ser Tyr Lys Cys G1u Thr G1n Asn Pro Val Ser Val Arq Arq Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Lau Asn Val Lau Tyr G1y Pro J~p Ala Pro Thr I1a 195 200 205
Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arq Ala G1y G1u ~~yr Leu Asn Leu Thr 210 215 '!20
Cys His Ala Ala Ser ASn pro Thr Ala G1n Tyr ¡Ihe Trp Phe val Asn 225 230 235 240
G1y Thr Phe G1n G1n Ser Thr G1n G1u Leu Phe l:le Pro Asn I1e Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met CyS Gln Ala Bis Asn Se' Ala Thr 260 265 270
G1y Leu Asn Arq Thr Thr val Thr Ala I1e Thr Val Tyr Ala Glu Leu 275 280 285
Pro Lys Pro Tyr I1e Thr Ser Asn Asn Ser Asn llro I1e G1u Asp Lys 290 295 300
Asp Ala Va.1 Thr Leu Thr Cys G1u Pro G1u Thr G1n Asp Thr Thr Tyr 305 310 315 320
Leu Trp Trp Va.1 Asn Asn G1n Argo Leu Ser Val Ser Ser Arq Leu Glu 325 330 335
Leu Ser Asn Asp Asn Arq Thr Leu Thr Va~ Phe nsn I~e Pro Arg Asn
340 345 350
Asp Thr Thr Phe Tyr G~u Cys G~u Thr G~n Asn Pro Va~ Ser Va~ Arg 355 360 365
Arq Ser Asp Pro Va~ Thr Leu Asn Va~ Leu Tyr G~y Pro Asp A~a Pro 370 375 ~¡80
Thr I~e Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg A~a C;~y G~u Asn Leu Asn 385 390 395 400
Leu Sar Cyli Hili A~a A~a Sar Alin Pro Ala Ala COln Tyr Pha Trp Pha 405 410 415
Val Asn Gly Thr Phe G~n Gln Ser Thr Gln Glu I:.eu Phe n. Pro Asn 420 425 430
I~e Thr Val Aso Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Aso Ser 435 440 445
A~a Thr G~y Leu Asn Ar9 Thr Thr Va~ Thr A~a I:~e Thr Va~ Tyr Va~ 450 455 ~160
G~u Leu Pro Lys Pro Tyr I~e Ser Ser Asn Aso Ser Asn Pro I~e G~u 465 470 475 480
ASp LyS Asp Ala val Thr Leu Thr Cys Glu pro val Ala Glu Asn ThT 485 490 495
Thr Tyr Leu Trp Trp Va~ Aso Asn G~n Ser Leu Ser Va~ Ser Pro Arq 500 505 510
Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arq Ile Leu 'l'hr I:.eu Leu Ser Val Thr 515 520 525
Arg Asn Asp Thr G~y Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Ser Glu Ser 530 535 S40
A~a Lys Arg Ser Asp Pro Va~ Thr Leu Asn Va~ l~hr Tyr Gly Pro Asp 545 550 555 560
Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Leu Ser Tyr J~q Ser Gly Ala Asn 565 570 575
Leu Asn Leu Ser Cys Bis Ser Asp Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser 580 585 590
Trp Leu I~e Asn G~y Thr Leu Arg 595 600
Ser Lys Ile Thr Ser Asn Asn Asn 610 615
Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn 625 630
Ser Ser Gly Asp Ser Ala Pro Gly 645
lt;210gt; 54
lt;211gt; 214
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; anticuerpo
lt;400gt; 54
G~n His Thr G~n Val Leu Phe Ile 605
Gly Ala Tyr Ala Cys Phe Val Ser 620
Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Val 635 640
Ser Ser Gly Leu Ser Ala 650
Asp I~e Gln Met Thr G~n Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 20
Leu A~a Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 35 40
Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu 50 55
10 15
Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 25 30
Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 45
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr A~a Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 10 130 135 140
Lys Va~ G~n Trp Lys Va~ Asp Asn ~a Leu G~n Ser G~y Asn Ser G~n 145 150 155 160
G1u Ser Val Thr G1u G1n Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe A8n Arg Gly Glu Cys 210
lt;210gt; 55
lt;211gt; 107 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; anticuerpo
lt;400gt; 55
Asp l1e Gln Met Thr Gln Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Thr Val Thr 11e Thr Cys ArQ ~a Ser Glu Asn 11e Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Ly8 Leu Lau Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 10 100 105
lt;210gt; 56 lt;211gt;418
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) .. (394)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM 1 humana
lt;220> 5 lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (395)..(418)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 56
Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15
VaL Leu Leu Leu vaL His Asn Leu Pro GLn GLn Leu Phe GLy Tyr Ser 20 25 30
Trp Tyr Lys GLy GLu Arg VaL Asp GLy Asn Arg GLn Ile val Gly Tyr 35 40 45
Ala I1e Gly Thr GLn GLn Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg 50 55 60
Glu Thr I le Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln U 7' 75 8'
Asn Asp Thr Gly Pne Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Tnr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 1 30 135 140
Trp I 1e As n Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asn G1y Asn Arg Tnr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175
Gly Pro Tyr GLu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Arg Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile 10
195 2DO 2D5
Ser Pro Ser Aap Thr Tyr Tyr Are;¡ Pro Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Cys Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu l1e Asn 225 230 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe l1e Pro Asn l1e Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys H18 Ala Aso Aso Ser Val Thr 260 265 270
Gly Cys Asn Arg Thr Thr Val Lys Thr 11e l1e Val Thr Glu Leu Ser 275 280 285
Pro Val Val Ala Lys Pro Gln 11e Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr
290 295 300
Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320
l1e Ser l1e Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335
Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Aso Thr Thr Leu Ser l1e Aso Pro Val 340 345 350
Lys Arg Glu Asp Al.a Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val. Phe Aso Pro I1e 355 360 365
Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro 11e Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn Ala 370 375 380
Leu Pro Gln Glu Asn Gly Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 385 390 395 400
Leu Asn Asp Ile Pne Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His His His Bis 405 410 415
His His
lt;210gt; 57
lt;211gt;418 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) .. (394)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM1 de mono macaco
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (395) ..(418) 5 lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 57
Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arg Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu 1 5 la 15
Val Leu Leu Leu Ala His Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ile Gly Tyr Asn 20 25 30
Trp His Lys Gly Glu Arg Val Asp Ala Lys Arg Leu Ile Val Ala Tyr 35 40 45
Val I~e Glu Thr Lys Gln Thr Thr Pro Gly Pro Ala His Ser Gly Arg 50 55 60
Glu Met Ile Tyr Ser ABn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln U 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Tbr Leu Gln Val Ile Lys Gly Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Tbr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
pro Asn Ile Thr Ile un Asn Ser Asn pro Val Glu Asp Lys Asp Val 115 120 125
Val Thr Phe Thr Cys Glu Ser Glu Ala Gln Asp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Ser Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asn Gl y Asn Lys Tbr Leu Thr Leu Leu Ser Val Leu Arg As n Asp Thr 165 170 175
Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala As n Arg Ser lBO lB5 190
ASp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Thr Ile
195 2DO 2D5
Ser Pro Ser Aap Thr Tyr Tyr Are;¡ Pro Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Cys Ser Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Leu l1e Asn 225 230 235 240
Glu Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe l1e Pro Asn l1e Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys H18 Ala Aso Aso Ser Val Thr 260 265 270
Gly Arg Asn Arg Thr Thr Val Lys Met 11e l1e Val Ser Glu Gln Ser 275 280 285
Leu Val Val Ala Gln Pro Gln 11e Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val Thr
290 295 300
Glu Asp Lys Asp Tyr Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr Gly 305 310 315 320
l1e Ser l1e Ser Trp Phe Phe Lys Asp Gln Ser Leu Pro Ser Ser Glu 325 330 335
Arg Met Lys Leu Ser Gln Asp Aso Ala Thr Leu Ser l1e Aso Pro Val 340 345 350
Lys Arg Glu Asp Al.a Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Val. Phe Aso Leu I1e 355 360 365
Ser Lys Asn Arg Ser Asp Pro 11e Val Leu Ile Val Asn Tyr Asn Asn 370 375 380
Arg Ala Gln Glu Asn Ile Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 385 390 395 400
Leu Asn Asp Ile Pne Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His His His Bis 405 410 415
His His
lt;210gt; 58
lt;211 gt; 675
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221 gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) .. (651)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM5 humana
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (652)..(675) 5 lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 58
Lys Leu Thr I~e G~u Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys G~u 1 5 10 15
Va~ Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gl n His Leu Phe Gly Tyr Ser 20 25 30
Trp Tyr Lys G~y G~u Arg Val Asp G~y Asn Arg Gln I~e Ile G~y Tyr 35 40 45
Va~ I~e Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser G~y Arg 50 55 60
Glu IIe Ile Tyr Pro ABn Ala Ser Leu Leu I le Gln Asn Ile I~e G~n U 70 75 80
Asn Asp Thr G~y Pne Tyr Tbr Leu His Va~ Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Tnr Gly Gln Phe Arg Va~ Tyr Pro G~u Leu Pro Lys 100 105 110
pro Ser I le Ser Ser un Asn Ser Lys pro Val Glu Asp LyS Asp Ala 115 120 125
Va~ Ala Phe Thr Cys Glu Pro G~u Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asn G~y Asn Arg Tnr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg As n Asp Thr 165 170 175
Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser lBO lB5 190
ASp Ser Val I~e Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr I~e
195 200 205
Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arq Ser G~y Glu Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220
Cyo His Ala Ala Ser ABn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn 225 230 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255
Val Asn ABn Ser Gly Ser Tyr Thr Cy8 Gln Ala His Asn Ser Asp Thr 260 265
2quot;
Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr I le Thr Val Tyr Ala Glu Pro 275 280 285
Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu
2~O 295 300
Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr 305 310 315 320
Leu Trp Trp val ASn ASn Gln Ser Leu pro val Ser pro Arg Leu Gln 325 330 335
Leu Ser Aso Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Aso
340 345 350
ASp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp 355 360 365
His Ser Asp Pro Val Ile Leu Aso Val Leu Tyr Gly Pro Asp Asp Pro 370 375 380
Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser 385 390 395 400
Leu Ser Cys H~s A1a A1a Ser Asn Pro Pro Ala G1n Tyr Ser Trp Leu
405 410 415
Ile Asp G1y ]u¡n I1e G1n Gln His Thr Gln G1u Leu Phe Ile Ser Asn '20 425 430
I1e Thr G1u Lys Asn Ser G1y Leu Tyr Thr Cys G1n Ala Asn Asn Ser 435 440 445
ALa Ser GLy His Ser Arg Thr Thr Va1 Lys Thr Ile Thr Val Ser Ala 450 455 460
GLu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu 465 470 475 480
Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr 485 490 495
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 500 505 510
Leu G~n Leu Ser Asn Gly Asn Arq Thr Leu Thr Leu phe Asn Val Thr 515 520 525
Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser 530 535 540
ALa Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp 545 550 555 560
Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 565 570 575
Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser sao 5a5 590
Trp Arq Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile 595 600 605
Ala Lys Ile Thr pro Asn Asn Aso Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser 610 615 620
Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val 625 630 635 640
Ser A~a Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser 645 650 655
Gly Leu Asn Asp 660
Ile Phe Glu Ala Gln Lys 665 Ile Glu Trp Hi8 His His 670
His His His 675
5
lt;210gt; 59 lt;211gt; 678 lt;212gt; PRT lt;213gt; Macaca fascicufaris lt;220gt; lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1 ) .. (654)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM5 de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 5 lt;222gt; (655) ..(678)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 59
Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arq Pro Phe Asn Val ~a Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15
Val Lau Leu Leu Ala H~s Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe Gly Tyr Ile 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Ala Ser Arq Arg Ile Gly Ser Cys 35 40 45
Val Ile Arq Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro ~a His Ser Gly Arq 50 55 60
Glu Th r Ile ASp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn val Thr Gln 65 70 75 80
Ser Aep Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val Ile Lys Glu Asp Leu Val 85 90 9S
A3n Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe ArQ Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Ala LeU Thr Cye Glu Pr o Glu Thr Gln ASp Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Asn Gln Ser LeU Pro Val Ser Pro Arq Leu Glu Leu Ser 145 150 155 160
Ser Asp Asn Arq Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg Asn Asp Thr 165 170 175
Thr Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln As n Pro Val Ser Val Arg Arg Se r 180 185 190
ASp Pro Va~ Thr Leu Asn Va~ Leu Tyr Gly Pro nsp Ala Pro Thr Ile
195 200 205
Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Agt;:g Ala Gly Glu 1~ygt;: Leu Asn Leu Thgt;: 210 215 220
Cys Bis Ala Ala Segt;: Asn Pro Thgt;: Ala Gln Tyr Phe Tgt;:p Phe Val Asn '25 '30 235 '40
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe ]:le Pro Asn Ile Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala Bis Asn Ser Ala Thr 260 265 270
Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val Tyr Ala Glu Leu 275 280 285
Pro Lys Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pgt;:o Ile Glu Asp Lys 290 295 300
Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Glu 'l'hr Gln Asp Thr Thr Tyr 305 310 315 320
Leu Tgt;:p Trp Val Asn Asn Gln Arg Leu Ser Val Ser Ser Arq Leu Glu 325 330 335
Leu Ser Asn ASp Asn Ar9 'l'hr Leu Thr Val Phe nsn Ile Pro Arq Asn 340 345 350
Asp Thr Thr Phe Tyr Glu Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val Arq
3~5 -quot;Hin -quot;~65
Arq Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu 'l'yr Gly Pro Asp Ala Pro 370 375 380
Thr Ile Ser Pro Leu Asn 'l'hr Pro Tyr Arq Ala Gly Glu Asn Leu Asn 385 390 395 400
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Al. Ala Gln Tyr Phe Trp Phe 405 410 415
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu ]~u Phe Ile Pro Asn 420 425 430
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Y.et Cys Gln Ala His Asn Ser 435 440 445
12.0
ALa Thr GLy Leu Asn Arg Thr Thr Val. Thr Al.a Il.e Thr Val. Tyr Val. 450 455 460
GLu Leu Pro Lys Pro Tyr Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro 1le Gl.u 465 470 475 480
Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Val Ala Glu Asn Thr 485 490 495
Thr Tyr Leu Trp Trp Val. Asn Asn Gl.n Ser Leu Ser Val. Ser Pro Arg 500 505 5l.0
Leu G~n Leu Ser Asn Gly Asn Arq Ile Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 5l.5 520 525
Arg Asn Asp Thr Gly Pro Tyr Gl.u Cys Gl.y 1l.e Gl.n Asn Ser Glu Ser 530 535 540
ALa Lys Arg Ser Asp Pro Val. Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gl.y Pro Asp 545 550 555 560
Thr Pro ll.e ll.e Ser Pro Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Ser Gl.y Al.a Asn 565 570 575
Leu Asn Leu Ser CyS His Ser Asp Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser 590 595 590
Trp Leu Ile Asn Gly Thr Leu Arq Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile 595 600 605
Ser Lys 1le Thr Ser Asn Asn Aso Gly Ala Tyr Ala Cys Phe Val Ser 610 615 620
Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser 1le Val Lys Asn 1le Ser Val 625 630 635 640
Ser Ser Gly Asp Ser Al.a Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ala Ser Gly 645 650 655
Ser G~y Ser Gly Leu Asn Asp 1le Phe Glu Ala Gln Lys 1le Glu Trp 660 665 670
His His His His His His 675
lt;210gt; 60
lt;211gt; 317 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1 ) .. (293)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM6 humana
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 5 lt;222gt; (294) ..(317)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 60
Lys Leu Thr I~e G~u Ser Thr Pro Phe Asn Va~ ~a G~u G~y Lys G~u 1 5 10 15
Va~ Leu Leu Leu ~a H~s Asn Leu Pro Gln Asn ArQ Ile Gly Tyr Ser 20 25 30
Trp Tyr Lys G~y Glu Arg Val Asp Gly Asn Ser Leu Ile Val G~y Tyr 35 40 45
Va~ Ile Gly Thr Gln G~n Ala Thr Pro G~y Pro ~a Tyr Ser G1y ArQ 50 55 60
Glu Th r Ile Tyr PrQ Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn val Thr Gln 65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Va1 85 90 95
Asn Glu Glu ~a Thr G~y Gln Phe His Val Tyr Pro G~u Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Va~ G~u Asp Lys Asp A~a 115 120 ~25
Va~ Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Val Gln Asn ~hr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Va~ Asn G~y G~n Ser Leu Pro Val Ser Pro ArQ Leu G~n Leu Ser 145 150 155 160
Asn Gly Asn Met Thr Leu Thr Leu Leu Ser Va~ Lys Arg Asn Asp A~a ~65 170 ~75
G~y Ser Tyr G1u Cys G1u I~e G1n Asn Pro A~a Ser Ala Asn Arg Ser 180 ~85 190
Asp Pro Va~ Thr Leu Asn Va~ Leu Tyr G~y Pro Asp G~y Pro Thr l~e 195 200 205
Ser Pro Ser Lys Ala Asn Tyr Aro;¡-Pro Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220
Cys His Al a Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe lle Asn 225 230 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala His Asn Ser Ala Thr 260 265 270
Gly Leu Asn Arg Thr Thr Va~ Thr Met Ile Thr Val Ser Gly Ser Ala 275 280 285
Pro Val Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe 290 295 300
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His His His His His His 305 310 315
lt;210gt; 61
lt;211gt; 317 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) .. (293) 10 lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM6 de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (294)..(317)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His 15 lt;400gt; 61
Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arg Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys G~u 1 5 10 15
val Leu Leu Leu Ala His Asn Leu Pro Gln Asn Thr Leu Gly Phe Asn 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Aro;¡-Va~ Asp Ala Lys Aro;, Leu Ile Val Ala Tyr 35 40 45
Va~ Ile Gly Thr Gln G~n Thr Thr Pro Gly Pro A~a His Ser G~y Arg SO 55 60
Glu Met I~e Tyr Ser Asn Al a Ser Leu Leu I~e Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Leu Gln Va~ Ile Lys Gly Asp Leu Val quot; R ~
Thr Glu Glu Ala Thr Gly Arg Phe Trp Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Asp Phe Thr Cys Glu Pro Asp Ile His Ser Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Asp Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arq Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asn Gly Asn Arq Thr Leu Thr Lau Lau Ser Val Ly. Arq Asn Asp Ala
Gly Ala Tyr Glu Cys Glu 180
ASp Pro va~ Ile Leu Asn 195
Ser Pro Ser Asn Ser Asn 210
Cys His Ala Ala Ser Asn 225 230
170 175
Ile Gln Asn Pro Val Ser Ala Asn Leu Ser 185 190
va~ Leu Tyr Gly pro ASp va~ Pro Thr Ile 200 205
Tyr Arg Pro Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser 215 220
Pro Thr Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Het Cys Gln Ala Tyr Asn Ser Ala Thr 260 265 270
Gly Leu Asn Arq Thr Thr Val Het Het Ile Thr Val Ser Gly Ser Ala 275 280 285
Pro Gly Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe 290 295 300
Glu Ala Gln Lys lle Glu Trp His His His His His His 305 310 315
lt;211gt; 322
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220> 5 lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1)__ (298)
lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM8 humana
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 10 lt;222gt; (299) __ (322)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 62
Gln Leu Thr 1le Glu Ala Val Pro Ser Asn Ala ~a Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15
val Leu Leu Leu val H~s Asn Leu Pro Gln Asp Pro Arq Gly Tyr Asn 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Thr Val Asp Ala Asn Arq Arq 1le 1le GLy Tyr 35 40 45
Val 1~e Ser Asn Gln Gln 1le Thr Pro Gly Pro ~a Tyr Ser Asn Arq 50 55 60
Glu Thr 1le Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Met Arq Asn Val Thr Arq 65 70 75 80
Asn Asp Thr G1y Ser Tyr Thr Leu G1n Val 1le Lys Leu Asn Leu Met
., 9' 9'
Ser Glu Glu Val Thr Gly Gln Phe Ser Val His Pro G1u Thr Pro Lys 100 105 110
Pro Ser 1le Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn G1y Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arq Leu G1n Leu Ser 145 150 155 160
Asn Gly Asn Arq Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arq Asn Asp Val 165 170 175
Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn Phe Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile 195 200 205
Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr H~s Ala Gly Val Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220
Cys H~s Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ser Gln Tyr Ser Trp Ser Val Asn 225 230 235 240
~ ~
__________ __ ,~_
245 250 255 Thr Lya Asn Ser Gly Ser Tyr Ala Cys His Thr Thr Aan Ser Ala Thr 260 265 270 Gly Arg Asn Arg Thr Thr Val Arg Met Ile Thr Val Ser Asp Ala Leu 275 280 285 Val Gln Gly Ser Ser Pro Gly Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly
290 295
Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 305 310
His His
lt;210gt; 63
lt;211gt; 322
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1)..(298)
Ile Glu Trp His His His His 315 320
10 lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM8 de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (299)..(322)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His 15 lt;400gt; 63
Gln Leu Thr Ile Glu Ala Val Pro Ser Asn Ala Ala Glu Gly Lys Glu
1 5 10 15
Val Lcu Lcu Lcu Ala H~e Aan Lcu Pro Gln Aep Pro Lcu Gly Tyr Aan 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Thr Val Asp Ala Asn Arq Arg ne Ila Gly Tyr 35 40 45
Val Ile Ala Thr Gln Val Asn l1e Ser Gly Pro Ala Asp Ser Gly Arg 50 55 60
Glu Thr Ila Tyr Pro Asn Ala Thr Leu Lau Mat Gln Asn Val Thr Arq 65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Leu Gln Val l1e Thr Leu Asn Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Val Thr Gly Gln Phe Ser Val His Pro Glu Thr Pro Lys 100 105 110
Pro Ser 11e Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Arq Asp Ala 115 120 125
Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Aso Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asp Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 170 175
Gly Pro Tyr Glu Cys Glu I1e Gln As n Pro Val Ser Val quot;quot;n Phe Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Asn Ile 195 200 205
Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr Leu Pro Gly Val Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220
Cy. Bis Ala Ala Ser Asn Pro Leu Ala Gln Tylt; Ser Trp Ser Val Asn 225 230 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln His Thr Gln Asn Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255
~a Lys Asn Ser Gl y Ser Tyr ~a Cys His Ala Thr Asn Ser Ala Thr 260 265 270
Gly His Asn Gly Thr Thr Val Arg Met Ile Thr Val Ser Asp Ala Ser 275 280 285
Val Gln Gly Ser Ser Pro Gly Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly 290 295 300
Leu Asn Aap Ile Phe Glu Ala Gln Ly s Ile Glu Trp His His His His 305 310 315 320
His His
lt;210gt; 64
lt;211gt; 237 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1 )..(213) 10 lt;223gt; dominio extracelular de CEACAM7 humana
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (21 4) .. {237)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His 15 lt;400gt; 64
Thr Asn Ile Asp Val Val Pr o Phe Asn Val Ala Gl u Gly Lys Glu Val 1 5 10 15
Leu Leu Val Val His Asn Glu Se r Gln Asn Leu Tyr Gly Tyr Asn Trp 20 25 30
Tyr Lys Gly Glu Arg Val His ~a Asn Tyr Arq Ile Ile Gly Tyr Val 35 40 45
Lys Asn Ile Ser Gln Glu Asn ~a Pro Gly Pro ~a His Asn Gl y Arg 50 55 60
Glu Th r Ile Tyr Pro Asn Gly Thr Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr His 65 70 75 80
Asn A6p Ala Gly Ile Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Glu Asn Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Val Thr Arg Gln Phe Tyr Val Phe Ser Glu Pro Pro Lya
100 lOS 110
Pro Ser rle Thr Ser Asn Asn Phe Asn Pro Val Glu Asn Lys Asp Ile 115 120 125
Val Val Leu Thr Cys Gln Pro Glu Thr Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val As n Asn Gln Ser Leu Leu Val Ser Pro Arg Leu Leu Leu Ser 145 150 155 160
Thr Asp Asn Arg Thr Leu Val Leu Leu Ser Ala Thr Lys Asn Asp Ile 165 170 175
Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Val Gly ~a Ser Arg Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Arg Tye Glu Ser Val Gln Ala Ser Ser 195 200 205
Pro Asp Leu Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe 210 215 220
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His His His His His His 225 230 235
lt;210gt; 65
lt;211gt; 292 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) (286) 10 lt;223gt; N-A1-8 1 de hCEACAM5
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (287) ..(292)
lt;223gt; etiqueta de His 15 lt;400gt; 65
Lys Leu Thr I~e G~u Ser Thr Pro Phe Asn Va~ A1a G~u G~y Lys G~u 1 5 10 15
Va1 Leu Leu Leu Va1 His Asn Leu Pro G1n His Lau Phe G1y Tyr Ser 20 25 30
Trp Tyr Lys G1y G1u Arg Va1 Asp G1y Asn Arq G1n I1e I1e G1y Tyr
35 40 45
Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg
5. D 60
Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln 65 10 15 80
Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arq Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Ser 11e Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp 130 135 140
Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser 145 150 155 160
Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr 165 110 175
Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg AIg Ser 180 185 190
Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile 195 200 205
Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser 210 215 220
Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn 225 230 235 240
Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr 245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr 260 265 270
Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala His His 275 280 285
His His His His
5 lt;210gt; 66
lt;211gt; 184
lt;212gt; PRT lt;213gt; Homosapiens
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1)..(178) 5 lt;223gt; A2-B2 de hCEACAM5
lt;220gt;
lt;221 gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (179) ..(184)
lt;223gt; etiqueta de His 10 lt;400gt; 66
Glu Pro Pro Lys Pro Pha Ila Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu 1 5 10 15
Asp Glu Asp Ala Va1 Ala Leu Thr Cya Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr 20 25 30
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Ar9 35 40 45
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 50 55 60
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser 65 70 75 80
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp 85 90 95
Asp Pro Thr Ila Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn 100 105 110
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser 115 120 125
-
_.~--_.~--~----_.~
130 135 140
Ser Asn Ile Thr Glu Lys As n Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn 145 150 155 160
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val 165 170 1,5
Ser Ala His His His His His Bis 180
15 lt;210gt; 67
lt;211gt; 193
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;220> 5 lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1)__ (187)
lt;223gt; A3-B3 de hCEACAM5
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 10 lt;222gt; (188) __ (193)
lt;223gt; etiqueta de His
lt;400gt; 67
Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu 1 5 10 15
Asp Lys A8p Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr 20 25 30
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 35 40 45
Leu G~n Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr 50 55 60
Ar9 Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser 65 70 75 80
Ala Asn Arq Ser A8p Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro A8p 85 90 U
Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 100 105 110
Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser 115 120 125
130 135 140
--
,~--~---~--~--,~
Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr ~a Cys Phe Val Ser 145 150 155 160
Asn Leu A~a Thr G~y ArQ Asn Asn Ser I~e Va~ LY8 Ser I~e Thr Va~ 165 170 175
Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala H18 H1S H18 H1S H18 180 185 190
H1S
lt;210gt; 68
lt;211gt; 310
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1) (286) 10 lt;223gt; dominio N-A1-B1 de CEACAMS de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (287)__ (310)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His 15 lt;400gt; 68
Gln Leu Thr Ile Glu Ser Arq Pro Phe Asn Val ~a Glu Gly Lys Glu 1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Ala H1S Asn Val Ser Gln Asn Leu Phe Gly Tyr Ile 20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val As p Ala Ser Arg Arg Ile Gly Ser Cys 35 40 45
Val Ile Arq Thr Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro ~a H1S Ser Gly Arq 50 55 60
Glu Thr Ile Asp Phe Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln 65 70 75 80
Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Gln Val Ile Lys Glu Asp Leu Val 85 90 95
Asn Glu Glu Ala Thr G1y Gln Phe ArQ Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys 100 105 110
Pro Tyr Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Ile Glu Asp Lys Asp Ala 115 120 125
Va~ A~a Leu Thr Cys G~u Pro G~u Thr G~n Asp Thr Thr Tyr Leu Trp ~30 135 140
Trp Va~ As n Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Glu Leu Ser 145 150 155 160
Ser Asp Asn Arg Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro Arg Asn Asp Thr 165 170 175
Thr Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Val Arg Arg Ser 180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile 195 200 205
Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr Arg Ala Gly Glu Tyr Leu Asn Leu Thr 210 215 220
Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Thr Ala Gln Tyr Phe Trp Phe Val Asn 225 230 235 240
___ == __ == __ ,~ __ .~_
245 250 255
Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Het Cys Gln Ala His Asn Ser Ala Thr 260 265 270
Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val Tyr Ala Ser Gly 275 280 285
Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 290 295 300
His His His nis nis His 305 310
lt;210gt; 69
lt;211gt; 202 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO
lt;222gt; (1)..(178) 10 lt;223gt; dominioA2-B2 de CEACAM5de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (179)..(202)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 69
Glu Leu Pro Lys Pro Tyr rle Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro rle Glu 1 5 10 15
Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Thr
20 25 30
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Arg Leu Ser Val Ser Ser Arg 35 40 45
Leu Glu Leu Ser Asn ABp Asn Arq Thr Leu Thr Val Phe Asn Ile Pro 50 55 60
Arg Asn Asp Thr Thr Phe Tyr Glu Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser 65 70 75 80
Val Arg Arq Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp 85 90 95
Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Pro Tyr ArQ Ala Gly Glu Asn 100 105 110
Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Ala Ala Gln Tyr Phe 115 120 125
Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile 1 30 135 140
Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln Ala Bis 145 150 155 160
Asn Ser Ala Thr Gly Leu Asn Arq Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr Val 165 170 n5
Tyr Val Ser G1y Ser Gly Ser G1y Leu Asn Asp rle Phe Glu Ala Gln 180 185 190
Lys Ile Glu Trp Bis His Bis His His Bis 195 200
lt;210gt; 70 5 lt;211gt; 214
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Macaca fascicularis
lt;220gt;
lt;221gt; DOMINIO 10 lt;222gt; (1) __ (190)
lt;223gt; dominio A3-B3 de CEACAM5 de mono macaco
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (191)..(214)
lt;223gt; extensión con etiqueta de His
lt;400gt; 70
Glu Leu Pro Lys Pro Tyr lle Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro lle Glu 1 5 10 15
Asp Lys Asp Ala Val Thr Leu Thr Cys Glu Pro Val Ala Glu Asn Thr 20 25 30
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg 35 40 45
Leu G~n Leu Ser Asn Gly Asn ArQ lle Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 50 55 60
Arg Asn Asp Thr Gly Pro Tyr Glu Cys Gly lle Gln Asn Ser Glu Ser U 7' 75 8'
Ala Lys Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Thr Tyr Gly Pro Asp 85 90 95
Thr Pro lle lle Ser Pro Pro Asp Leu Ser Tyr Arg Ser Gly Ala Asn 100 105 110
Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Asp Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser 115 120 125
Trp Leu lle Aso Gly Thr Leu Arg Gln His Thr Gln Val Leu phe lle 130 135 140
Ser Lys lle Thr Ser Aso Aso Asn Gly Ala Tyr Ala Cys Phe Val Ser 145 150 155 160
Asn Leu Ala Thr Gly Arg Aso Asn Ser lle Val Lys Asn lle Ser Val 165 170 1.75
Ser Ser Gly Asp Ser Ala Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ala Ser Gly 180 185 190
Ser Gly Ser Gly Leu Aso Asp lle Phe Glu Ala Gln Lys lle G1u Trp 195 200 205
5 His His His His His His 210
lt;210gt; 71
lt;211 gt; 344 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;400gt; 71
Met Gly Pro Pro Ser Ala Pro Pro Cys Arg Leu His Val Pro Trp Lys 1 5 10 15
Glu Val Leu Leu Tbr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30
Thr Ala Ly8 Leu Tbr lle Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn Leu Pro Gln Asn Arg lle Gly 50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu ArQ Val Asp Gly Asn Ser Leu lle Val 65 70 75 80
Gly Tyr Val 1le Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95
Gly Arg Glu Thr lle Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu lle Gln Asn Val 100 105 HO
Thr Gln Aan Aap Tbr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val 1le Lya Ser Asp 115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu 1 30 135 140
Pro Lys Pro Ser lle Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160
ASp Ala Val Ala Pbe Thr Cys Glu Pro Glu Val Gln Asn Thr Thr Tyr 165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arq Leu Gln 180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Met Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Lys Arq Asn 195 200 205
ASp Ala Gly Ser Tyr Glu Cys Glu lle Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn
210 220
Arg Ser A8p Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Gly Pro
225 230 235 240
Thr l1e Ser Pro Ser Lys Ala Asn Tye Arg Pr o Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His ~a Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tye Ser Trp Phe 260 265 270
I1e Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
I1e Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gln ~a His Asn Ser
290 295 300
~a Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Met I1e Thr Val Ser Gly 305 310 315 320
Ser Ala Pro Val Leu Ser Ala Val ~a Thr Val Gly I1e Thr l1e Gly 325 330 335
Val Leu Ala Arg Val Ala Leu l1e 340
lt;210gt; 72
lt;211gt; 265
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;400gt; 72
Met Gly Ser Pro Ser Ala Cys Pro Tyr Arg Val Cys l1e Pro Trp Gln 1 5 10 15
Gl y Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Leu Pro Asn
20 25 30
Ser Ala Gln Thr Asn l1e Asp Val Val Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45
Lys GLu VaL Leu Leu VaL VaL His Asn GLu Ser Gln Asn Leu Tyr Gly SO SS 60
Tyr Asn Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val His Ala Asn Tyr Arg Ile Ile 65 70 75 80
Gly Tyr Val Lys Asn Ile Ser Gln Glu Asn Ala Pro Gly Pro Ala His
85 90
Asn G~y ArQ G~u Thr Ila Tyr Pro Asn Gly Thr Leu Leu rIa Gln Asn 100 105 110
Val Thr His Asn Asp ~a Gly Phe Tyr Thr Leu Hi8 Val Ila Lys Glu 115 120 125
Asn Leu Val Asn Glu Glu Val Thr Ar~ Gln Phe Tyr Val Phe Ser Glu 130 135 HO
Pro Pro Lys Pro Ser Ile Thr Ser Asn Asn Phe A&n Pro Val Glu Asn 145 150 155 160
Lys Asp Ile Val Val Leu Thr Cys Gln Pro Glu Thr Gln Asn Thr Thr 165 170 175
Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Leu Val Ser Pro Arg Leu 180 185 190
Leu Leu Ser Thr Asp Asn Arq Thr Leu Val Leu Leu Ser Ala Thr Lys 195 200 205
Asn Asp Ile Gly Pro Tyr Glu Cy8 Glu Ile Gln Asn Pro Val Gly Ala 210 215 220
Ser Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Arg Tyr Glu Ser Val Gln 225 230 235 240
Ala Ser Ser Pro Asp Leu Ser Ala Gly Thr Ala Val Ser Ile Met Ile 245 250 255
Gly Val Leu Ala Gly Met Ala Leu Ile 260 265
lt;210gt; 73
lt;211gt; 349
5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homosapiens
lt;400gt; 73
Met Gly Pro Ile Ser Ala Pro Ser Cys Arq Trp Arq Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30
Thr Ala Gln Leu Thr Ile Glu Ala val Pro Ser ASn Ala Ala Glu Gly
35 40 45
Lya Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asp Pro Arq Gly 50 55 60
Tyr Asn Trp Tyr Lys Gly Glu Thr Val Asp Al. Asn Arg Arg Ile He 65 10 75 ao
Gly Tyr Val Ile Ser Asn Gln Gln Ile Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95
Asn Arq Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Met Arq Asn Val 100 105 110
Thr Arg Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Leu Asn 115 120 125
Leu Mat Ser Glu Glu Val Thr Gly Gln Phe Ser Val His Pro Glu Thr 130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160
Asp Ala val ~a Phe Thr Cys Glu pro Glu Thr Gln Asn Thr Thr Tyr 165 110 175
Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Lau Gln 180 185 190
LeU Ser Aso Gly Asn Arq Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arq Asn 195 200 205
Allp Val. Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Aso 210 215 220
Phe Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Tyr H~s Ala Gly Val Asn Leu Asn 245 250 255
Leu Ser Cys H~s Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ser Gln Tyr Ser Trp Ser
260 265 270
val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Tyr Thr Gln Lys Leu Phe Ila Pro Asn 275 280 285
I~e Thr Thr Lys Asn Ser G~y Ser Tyr A~a Cys H~s Thr Thr Asn Ser 290 295 300
305 3~0 3~5 320
~-~--------~---
Ala Leu Val Gln Gly Ser Ser Pro Gly Leu Ser Ala Arg Ala Thr Val 325 330 335
Ser Ile Het Ile Gly Val Leu Ala Arg Val Ala Leu Ile 340 345
lt;210gt; 74
lt;211gt; 120 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; MAb2 _ VHg2
lt;400gt; 74
G~u Va~ G~n Leu Val. Gl.u Ser G~y G~y Gl.y LeU Va~ G~n Pro G~y G~y 1 5 l.0 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys A~a A~a Ser G~y Phe Va~ Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Het Ser Trp Val. Arg G~n Ala Pro Gl.y Lys G1y Leu Gl.u Trp Va~ 35 40 45
Ser Tyr I~e Ser Ser Gl.y G~y G~y I~e Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Va~ 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Il.e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Het Asn Ser Leu Arg Ala G~u ASp Thr ~a Val. Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 10 115 120
lt;210gt; 75
lt;211gt; 107
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; MAb2_VLg5
lt;400gt; 75
Asp r~e Gln Met Thr G~n Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp ArQ Val Thr rle Thr Cys ArQ Ala Ser Glu Asn rle Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu A~a Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 1le 35 40 45
Tyr Asn Thr ArQ Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser ArQ Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G~y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr rle Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu rle Lys 100 105
5 lt;210gt; 76 lt;211gt;7
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 10 lt;223gt; restos de las posiciones 109-115 de CEACAM5-A383 humana
lt;400gt; 76
Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1 5
lt;210gt; 77 15 lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; restos de las posiciones 131 -143 de CEACAM5-A383 humana 20 lt;400gt; 77
rle Asn Gly 1le Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe 1 5 10
lt;210gt;
78
lt;210gt;
80
lt;21 1gt; 8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
5
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERlsTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (3) ..(3)
10
lt;223gt; Xaa es T, A o V
lt;400gt; 78
Gly Phe Xaa Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
lt;210gt; 79
15
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
20
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERlsTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (2) ..(2)
lt;223gt; Xaa es S o N (en particular S)
lt;220gt;
25
lt;221gt; CARACTERls TICAS DIVERSAS
lt;222gt; (4)..(4)
lt;223gt; Xaa es Yo G (en particular G)
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERlsTICAS DIVERSAS
30
lt;222gt; (7) ..(7)
lt;223gt; )(aa es Ro l (en particular 1)
lt;400gt; 79
Ile X&& Ser X&a Gly Gl y Xaa Thr
1 5
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS D1VERSAS
lt;222gt; (1) .. (1)
lt;223gt; xaa es A o T (en particular A)
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (7) .. (7)
lt;223gt; xaa es T o S (en particular S)
lt;400gt; 80
Xaa Ala His Tyr Phe Gly Xaa Ser Gly Pro Phe Ala Tyr 1 S 10
lt;210gt; 81 lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (6)..(6)
lt;223gt; Xaa es R o S, en particular S
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (8) .. (8)
lt;223gt; Xaa es A o D
lt;400gt; 81
G1y Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Xaa 1 5
lt;210gt; 82
lt;211gt;8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (6) .. (6)
lt;223gt; xaa está ausente, S o G (en particular G)
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (7) .. (7)
lt;223gt; xaa es D, Y o I
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (8)..(8)
lt;223gt; xaa es T o I (en particular T)
lt;400gt; 82
11e Ser Ser G1y G1y Xaa Xaa Xaa 1 5
lt;210gt; 83
lt;211gt; 8
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERíSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (1) .. (6)
lt;223gt; Xaa es cualquier aminoácido
lt;400gt; 83
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Asp 1 5
lt;210gt; 84
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (1) .. (1)
lt;223gt; xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (2) .. (2)
lt;223gt; xaa es A o S
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (4) ..(4)
lt;223gt; xaa es Y, F oW
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (7)..(8)
lt;223gt; Xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisT1CAS DIVERSAS lt;222gt;(11).. (11)
lt;223gt; xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (13)..(13)
lt;223gt; xaa es cualquier aminoácido
lt;400gt; 84
Xaa Xaa His Xaa Phe Gly Xaa Xaa Gly Pro Xaa Ala Xaa 1 5 10
lt;210gt; 85 lt;211gt;6
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR
lt;220gt; 5 lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (1)__ (3)
lt;223gt; xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 10 lt;222gt; (4) (4)
lt;223gt; Xaa es Y, F oW
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (5) (5)
15 lt;223gt; Xaa es cualquier aminoácido
lt;400gt; 85
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 1 ,
lt;210gt; 86 20 lt;211gt;9
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; CDR 2' lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERiSTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (1)..(2)
lt;223gt; Xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt; 30 lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (4)..(4)
lt;223gt; xaa es Y, F oW
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS 35 lt;222gt; (5)..(6)
lt;223gt; xaa es cualquier aminoácido
lt;220gt;
lt;221gt; CARACTERisTICAS DIVERSAS
lt;222gt; (8) .. (9)
lt;223gt; Xaa es cualquier aminoácido 5 lt;400gt; 86
Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 1 5
lt;210gt; 87
lt;211gt; 449 10 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; secuencia de cadena pesada de huMAb2-3
lt;400gt; 87
G~u Va~ G~n Leu G~n G~u Ser G~y Pro G~y Leu Va~ Lys Pro G~y G~y 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys A~a A~a Ser G1y Phe Va~ Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Vo1.1 Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Vo1.1 35 40 45
~01. Tyr I~e Ser Ser G~y G~y G~y I~e Thr Tyr ~01. Pro Ser Thr Va~ 50 55 60
Lya Gly Arq Phe Thr Va~ Ser Arq Aap Aan Ala Lya Aan Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser G~u Aap Thr ~a Val Tyr Tyr Cyll 85 90 95
~a A~a His Tyr Phe G~y Ser Ser G~y Pro Phe ~a Tyr Trp G~y G~n 100 105 110
G~y Thr Leu Va~ Thr Va~ Ser Ser A~a Ser Thr Lys Gly Pro Ser Va~ 115 120 125
Ph. Pro Leu ~a Pro Ser Ser Lya Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala ~a 130 135 140
Leu G~y Cys Leu Val Lys Aap Tyr Phe Pro G~u Pro Val Thr Va~ Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly ~a Leu Thr Ser Gly V'al His Thr Phe Pro Ala Val 165 'quot; quot;5
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Vo1.l Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Ser Leu G1y Thr G1n Thr Tyr I1e Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255
Ser Arq Tbr pro Glu Val Thr Cys Val Val Val ASp Val Ser Mis Glu 260 265 270
ASp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro ArQ Glu G1u Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr ArQ 290 295 300
Va1 Val Ser Va1 Lau Thr Va1 Lau His Gln Asp Trp Lau Asn G1y Lys 305 310 315 320
G1u Tyr Lys Cys Lys Va1 Ser Asn Lys Ala Leu Pro ~a Pro I1e G1u 325 330 335
LyS Thr Ile Ser LyS Ala Lys Gly G1n Pro Arq Glu Pro Gln val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Ar9 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP Ile ~a Val Glu Trp 370 375 380
G1u Ser Asn Gly G1n Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp G1y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 4~0 415
Lys Ser Arq Trp G1n Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Het His 420 425 430
G1u ~a Leu His Asn His Tyr Thr G1n Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly
5 lt;210;0. 88
lt;211gt; 214
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; secuencia de cadena ligera de huMAb2-3
lt;400gt; 88
Asp 11e Gln Met Thr Gln Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arq Va~ Thr 11e Thr Cys Arq Ala Ser Glu Aso 11e Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu ~a Trp Tyr Glo Glo Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Aso Thr Arq Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser ArQ Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr 11e Ser Ser Leu Glo Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe ~a Thr Tyr Tyr Cys Glo H1S His Tyr Gly Thr Pro Phe8' 9. ~
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala ~a 100 105 110
Pro Ser Va~ Phe 11e Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gl0 Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu ~a 130 135 140
Lys Val G10 Trp Lys Val Asp Aso ~a Leu G10 Ser G1y Aso Ser G10 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys ~a Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 5 180 185 190
~a Cys Glu Val Thr His Gln G1y Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Aso Arg Gly G1u Cys 210
lt;210gt; 89
10 lt;211gt;449
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; VH1-lgG1 de cadena pesada de Mab2
lt;400gt; 89
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Tyr Ila Ser Ser Gly Gly G1y Ile Thr Tyr Phe Pro Ser Thr Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 ,. ~
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly G1n 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly V~l His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255
Ser Aro Thr Pro G1u Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270
ASp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 28S
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arq Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arq 290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320
Glu Tyr LyS Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro ~a Pro Ile Glu 325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arq Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Aro Asp Glu Leu Thr LyS Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile ~a Val Glu Trp 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly
lt;210gt; 90
lt;211gt;214
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
5 lt;223gt; VL 1d de cadena ligera de Mab2
lt;400gt; 90
Asp Ile Gln Mat Thr Gln Ser Pro ~a Ser Leu Ser ~a Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys ArQ ~a Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45
Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Bis Tyr Gly Thr Pro Phe 85 ,. ~
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys ArQ Thr Val Ala ~a 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu As n Asn Phe Tyr Pro Arg Glu ~a 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn ~a Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
n.

Claims (32)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo aislado que:
    a) se une al dominio A3-B3 de proteinas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis ; y
    b) no reacciona de manera cruzada significativamente con CEACAM1 humana, CEACAM6 humana, CEACAM7 humana, CEACAMB humana, CEACAM1 de Macaca fascicularis, CEACAM6 de Macaca fascicularis, y CEACAM8 de Macaca fascicularis.
  2. 2. Un anticuerpo aislado segun la reivindicación 1, que compite por la unión al dominio A3-B3 de proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en·
    a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:31 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:32;
    b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:33 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:34;
    e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:33 y un
    dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:~, en la que K en la posición 52 se ha
    reemplazado por R;
    d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:35 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:36;
    e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:37 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:38; y
    f) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:39 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:40.
  3. 3. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se une al dominio A3-B3 de CEACAMS humana y de Macaca fascicularis:
    a) con una relación de afinidad por CEACAMS humana sobre la afinidad por CEACAMS de Macaca fascicularis que es ::;12; o
    b) con una afinidad por CEACAM5 humana y/o CEACAM5 de Macaca fascicularis que es ::;10 nM, o
    e) ambos a y b.
    4 El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo se une a dos regiones del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana que comprende las secuencias SEO ID NO:76 y SEO ID NO:77, respectivamente.
  4. 5. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:
    a) una CDR1-H que consiste en la secuencia X1X2~)(.¡X.Ylt;sYD (SEO ID NO:83), en la que cada uno de Xl,
    X2, ~, ~, Xs y Xe es cualquier aminoácido; y
    una COR2-H que consiste en una secuencia con una longitud de 6 a 10 aminoácidos, en la que cualquier
    aminoácido puede estar presente en cualquier posición; y
    una CoR3-H que consiste en la secuencia X1X2HJlt;JFGXtXsGPXeAX7 (SEO ID NO:84), en la que cada uno de Xl, )(.¡, Xs, Xe, y X7 es cualquier aminoácido, X2 es A o S, y X3 es Y, F o W; o b) una CDR1 -L que consiste en la secuencia X1X2X.Ylt;4XsY (SEO ID NO:85), en la que cada uno de Xl,~, ~
    y Xs es cualquier aminoácido y N es Y, F o W; y
    una COR2-L que consiste en la secuencia NX1X2, en la que cada uno de Xl y X2 es cualquier aminoácido; y
    una CoR3-L que consiste en la secuencia X1X2HX:Ylt;4XsPXeX7 (SEO ID NO:86), en la que cada uno de Xl, ~,
    -
    'lt;4 , )(S, Xe y X7 es cualquier aminoácido, X3 es Y, F o W, o e) ambos a y b. 6 Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende
    a) una CoR1-H que consiste en la secuencia GFX,FSSYo (SEO ID NO:78), en la que Xl es T, A o V; y
    una CoR2-H que consiste en la secuencia IX,SXzGGXJ T (SEO ID NO:79), en la que X, es S o N, X2 es Yo G, XJes Ro 1; y
    una CoR3-H que consiste en la secuencia X,AHYFGX2SGPFAY (SEO ID NO:80), en la que Xl es A o T, y X2 esToS;o
    b) una CoR1 -L que consiste en la secuencia ENIFSY (SEO ID NO:10) o ENIYSY (SEO ID NO:22); y
    una CoR2-L que consiste en la secuencia NX1X2, en la que X, es A o T, y X2 es K o R; y
    una CoR3-Lque consiste en la secuencia OHHYGTPFT (SEO ID NO:12) o OHHYGIPFT (SEO ID NO:24), o
    c) ambos a y b.
    7 Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende·
    a) una CoR1 -H que consiste en la secuencia GFTFSX1Y~(SEO ID N0:81), en la que Xl es Ro S, y X2 es A
    o O; y
    una CoR2-H que consiste en la secuencia ISSGGX,X2X3 (SEO ID NO:82), en la que X, está ausente, S o G, Xl es O, Yo 1, yX3es To J; y
    una CoR3-H que consiste en la secuencia ARPAYYGNPAMoy (SEO ID NO:3) o ARVNyyoSSFLoW (SEO ID NO:15); o
    b) una CoR1-L que consiste en la secuencia ONVGTN (SEO ID NO:4); y
    una CoR2-L que consiste en la secuencia SAS; y
    una CoR3-L que consiste en la secuencia OOYNSYPLYT (SEO ID NO:6) o OOYNNYPLYT (SEO ID NO:18),
    o
    e) ambos a y b.
  5. 8. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:
    a) una CoR1 -H de secuencia SEO ID NO:1 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:1 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia SEO ID NO:2 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:2 por una o más sustituciones de aminoácidos; CoR3-H de secuencia SEO ID NO:3 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:3 pOf una sustitución de aminoácidos; CoR1-L de secuencia SEO ID NO:4 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:4 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos y COR3-L de secuencia SEO ID NO:6 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:6 por una sustitución de aminoácidos; o
    b) una COR1 -H de secuencia SEO ID NO:7 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:7 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia SEO ID NO:8 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:8 por una o más sustituciones de aminoácidos; CoR3-H de secuencia SEO ID NO:9 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:9 por una o más sustituciones de aminoácidos ; CDR1-L de secuencia SEO ID NO:10
    o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:10 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-L de secuencia NTK o NTR o una secuencia que se diferencia de NTK o NTR por una sustitución de aminoácidos; y CoR3-L de secuencia SEO ID NO:12 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:12 por una sustitución de aminoácidos; o
    e) una CoR1 -H de secuencia SEO ID NO:13 o una secuencia que difiere de la SEO ID N0:13 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia SEO ID NO:14 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:14 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO:15 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:15 por una sustitución de aminoácidos; CDR1-L de secuencia SEO ID NO:16 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:16 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia SEO ID NO:18 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:18 por una sustitución de aminoácidos; o
    d) una CDR1-H de secuencia SEO ID NO:19 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:19 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-H de secuencia SEO ID NO:20 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:20 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEO ID NO:21 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:21 por una o más sustituciones de aminoácidos; COR1 -L de secuencia SEO ID NO:22 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:22 por una sustitución de aminoácidos; CoR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CoR3-L
    de secuencia SEO ID NO:24 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:24 por una sustitución de aminoácidos; o
    e) una CDR1-H de secuencia SEO ID NO:25 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:25 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia SEO ID NO:26 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:26 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEO ID NO:27 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:27 por una o más sustituciones de aminoácidos; CoRl-L de secuencia SEO ID NO:28 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:28 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CoR3-L de secuencia SEO ID NO:30 o una secuencia que difiere de la SEO ID NO:30 por una sustitución de aminoácidos
  6. 9.
    Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha sustitución de aminoácidos es una sustitución de aminoácidos conservativa
  7. 10.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende:
    a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:31 , o una secuencia al menos 85%
    idéntica a ésta, ylo un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:32, o una secuencia al
    menos 85% idéntica a ésta; o
    b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:33, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, ylo un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:34, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
    e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:35, o una secuencia al menos 85%
    idéntica a ésta, ylo un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:36, o una secuencia al
    menos 85% idéntica a ésta; o
    d) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:37, o una secuencia al menos 85%
    idéntica a ésta, ylo un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:38, o una secuencia al
    menos 85% idéntica a ésta; o
    e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEO ID NO:39, o una secuencia al menos 85%
    idéntica a ésta, ylo un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEO ID NO:40, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
    11 Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el cual es un anticuerpo quimérico o humanizado
  8. 12. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , el cual es un anticuerpo que comprende:
    a) una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:41 ylo una cadena ligera de secuencia SEO ID N0:42; o
    b) una cadena pesada de secuencia SEO ID N0:43 ylo una cadena ligera de secuencia SEO ID N0:44; o
    e) una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:45 ylo una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:46; o
    d) una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:47 ylo una cadena ligera de secuencia SEO ID N0:48; o
    e) una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:49 ylo una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:50
  9. 13. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende:
    a) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51, SEO ID NO:5, o SEO ID NO· 74; y/o
    b) un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:17, SEO ID NO:23, SEO ID NO:29, SEO ID NO:55, o SEO ID NO: 75.
  10. 14. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende ·
    a) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:51 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:17, o
    b) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:5 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:23, o
    e) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:5 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:29, o
    d) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:S1 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:55, o
    e) un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:74 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEa ID NO:75
    15 Un anticuerpo según la reivindicación 1 a 6, 8, 10, 11, 13 Y 14, que comprende:
    a) una cadena pesada que consiste en la secuencia SEO ID NO:87 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; y/o
    b) una cadena ligera que consiste en la secuencia SEO ID NO:88 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
  11. 16.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 15, el cual es un fragmento de anticuerpo
  12. 17.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, el cual es una cadena pesada variable de un anticuerpo de dominio único (VHH)
  13. 18.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el cual es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
  14. 19.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, el cual es un fragmento seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, y anticuerpos bivalentes
  15. 20.
    Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
  16. 21 . Una célula hospedante que se ha transformado por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 20.
  17. 22.
    Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciooes 1 a 19 conjugado o enlazado a al menos un agente inhibidor del crecimiento
  18. 23.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho agente inhibidor del crecimiento es un agente citotóxico o un isótopo radioactiva.
  19. 24.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 22 o 23, en el que dicho agente inhibidor del crecimiento se selecciona del grupo que coosiste en agentes quimioterapéuticos, enzimas, antibióticos y toxinas tales como toxinas que son moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas, taxoides, vincas, taxanos, maitansinoide o análogos de maitansinoides, derivados de tomaimicina o pirrolbenzodiazepina, derivados de criptoficina, derivados de leptomicina, análogos de auristatina o dolastatina, profármacos, inhibidores de la topoisomerasa 11, agentes alquilantes de ADN, agentes anti-tubulina, y CC-1065 o análogos CC-1065.
  20. 25.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho agente inhibidor del
    crecimiento es {quot;'¡·-desacetil-quot;'¡-(3-mercapto-1-Qxopropil)-maitansina) DM1 o quot;'¡·--desacelil-N}·(4-metil-4-mercaplo-1oxopentil}-maitansina (DM4).
  21. 26.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en el que el anticuerpo está unido covalentemente mediante un enlazador escindible o no escindible a al menos un agente inhibidor del crecimiento
  22. 27.
    Un inmunocoojugado de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB), ácido 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-bulírico (sulfo-SPDB), y (N-maleimidometil)ciclohexano-1--carboxilato de succinimidilo (SMCC)
  23. 28.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de una cadena pesada de secuencia SEO ID NO:5 y un dominio variable de una cadena ligera de secuencia SEO ID NO:29.
  24. 29.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia SEQ ID NO:87 o una secuencia al menos 85% idéntica a esta y una cadena ligera que consiste en la secuencia SEO ID NO:88 o una secuencia al menos 85% idéntica a esta
  25. 30.
    Un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciooes 22 a 29, en el que el inmunoconjugado se caracteriza por una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) que varia de 1 a 10
  26. 31.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo coo una cualquiera de las
    reivindicaciones 1 a 19, o un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, y un 5 vehiculo fannacéuticamente aceptable
  27. 32. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 31 , para uso para el tratamiento de cáncer
  28. 33.
    El anticuerpo, inmunoconjugado o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el 10 que el cáncer es un cáncer que expresa CEACAM5
  29. 34. El anticuerpo, inmunoconjugado o composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, en el que el cáncer es cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado, de próstata o de piel
  30. 35.
    Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso para detectar ex vivo la 15 expresión de CEACAM5 en una muestra biológica de un sujeto.
  31. 36.
    Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho anticuerpo está marcado con una molécula o sustancia detectable
  32. 37.
    Un anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 35 o 36, en el que dicho uso es para diagnosticar la presencia de un cáncer en un sujeto, determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente
    20 terapéutico dirigido a CEACAM5, o monitorizar la eficacia de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, o detectar la recidiva del cáncer después de terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
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