KR20200143527A - 항-ceacam5 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질과 결합하는 항체뿐만 아니라, 상기 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포를 개시한다. 또한, 본 발명은 성장 억제제에 접합되거나 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 암의 치료 또는 진단 목적을 위해 이용된다.

Description

항-CEACAM5 항체 및 이의 용도{ANTI-CEACAM5 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 인간 및 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) CEACAM5 단백질과 특이적으로 결합하는 항체뿐만 아니라, 상기 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포를 개시한다. 또한, 본 발명은 성장 억제제에 접합되거나 연결된 상기 항체를 포함하는 면역접합체, 및 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 본 발명은 암 치료 또는 진단 목적을 위한 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 용도를 개시한다.
암배아항원(CEA)은 세포 부착과 관련된 당단백질이다. 1965년, CEA는 임신 첫 6개월 동안 태아의 소아관에 의해 정상적으로 발현된 단백질로서 처음 확인되었고(Gold and Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965), 췌장암, 간암 및 대장암에서 발견되었다. CEA 패밀리는 면역 글로불린 수퍼패밀리에 속한다. 18개의 유전자로 이루어지는 CEA 패밀리는 암배아항원 관련 세포 부착 단백질(CEACAM) 하위 군과 임신 특이적인 당단백질 하위 군의 두 가지 하위 단백질 군으로 세분된다(Kammerer & Zimmermann, BMC Biology 2010, 8:12).
인간에서, CEACAM 하위 군은 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8의 7개 구성원으로 이루어진다. 다수의 연구 결과는 본래 확인된 CEA와 동일한 CEACAM5가 결장직장 종양세포, 위 종양세포, 폐 종양세포, 유방 종양세포, 전립선 종양세포, 난소 종양세포, 자궁경부 종양세포 및 방광 종양세포의 표면에서 높게 발현되며, 대장의 원주 상피 세포 및 술잔 세포, 위의 목점액 세포 및 식도와 자궁경부의 편평 상피세포와 같은 소수의 정상적인 상피 조직에서 약하게 발현됨을 보여주었다(Hammarstrom et al., 2002, in "Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications" Eds. Diamandis E. P. et al., AACC Press, Washington pp 375). 따라서, CEACAM5는 면역접합체와 같은, 종양 특이적인 표적화 접근법에 적합한 치료적 표적을 구성할 수 있다. 본 발명은 CEACAM5를 대상으로 한 단일 클론 항체를 제공하며, 이러한 단일 클론 항체들이 세포독성제와 접합되어, 시험관 내에서는 종양 세포를 살해하고 생체 내에서는 종양 퇴행을 유도할 수 있는, 세포독성 활성을 유도할 수 있음을 보여준다.
CEACAM 패밀리 구성원들의 세포외 도메인은 서열 상동성에 따라 A, B 및 N의 3가지 유형으로 분류된, 반복된 면역 글로불린 유사(Ig 유사) 도메인으로 이루어진다. CEACAM5는 7개의 이러한 도메인, 즉, N, A1, B1, A2, B2, A3 및 B3을 함유한다.
한 편으로 CEACAM5 A1, A2 및 A3 도메인 및 다른 한 편으로 B1, B2 및 B3 도메인은 높은 서열 상동성을 나타내는데, 인간 CEACAM5의 A 도메인들은 84 내지 87%의 쌍별 서열 유사성을 나타내고, B 도메인들은 69 내지 80%의 쌍별 서열 유사성을 나타낸다. 나아가, 그 구조에 A 및/또는 B 도메인들을 나타내는 다른 인간 CEACAM 구성원들, 즉 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8은 인간 CEACAM5와 상동성을 나타낸다. 특히, 인간 CEACAM6 단백질의 A 및 B 도메인들은 각각 인간 CEACAM5의 A1와 A3 도메인들, 및 B1 내지 B3 도메인들 중 임의의 도메인과 서열 상동성을 나타내는데, 이는 인간 CEACAM5의 A 도메인들 및 B 도메인들 중에서 관찰된 것보다 훨씬 높다.
CEA를 표적으로 한 진단용 또는 치료용 목적을 고려하여 다수의 항-CEA 항체가 생성되었다. Sharkey 등(1990, Cancer Research 50, 2823)에 의한 예에서와 같이, 관련 항원에 대한 특이성은 이 분야에서의 관심사로서 항상 언급되고 있다. 위에 언급된 상동성 때문에, 이전에 기술된 항체들 중 일부는 상이한 면역 글로불린 도메인에 존재하는 CEACAM5의 반복적인 에피토프에 대한 결합을 나타낼 수 있어, CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, 또는 CEACAM8과 같은 다른 CEACAM 구성원들에 대해서는 교차 반응성을 나타내지만, CEACAM5에 대한 특이성은 부족할 수 있다. 항-CEACAM5 항체의 특이성은 인간 CEACAM5를 발현하는 종양 세포와는 결합하지만 나머지 CEACAM 구성원들을 발현하는 일부 정상적인 조직과는 결합하지 않는 CEA를 표적으로 한 치료법의 관점에서 요구된다. CEACAM1, CEACAM6 및 CEACAM8은 인간 및 비 인간 영장류의 호중구에 의해 발현된다고 기술된 바 있는데(Ebrahimmnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), 여기서 CEACAM1, CEACAM6 및 CEACAM8이 과립구 형성을 조절하고 면역 반응에서 역할을 한다고 밝혀졌다는 점은 주목할 만하다.
제넨테크(Genentech)가 개발한 메이탄시노이드 항-CEACAM6 항체와 같은, 항-CEACAM6 항체 약물 접합체가 기술된 바 있는데(Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), 이것은 비 인간 영장류에서 CEACAM6 의존성 조혈 독성을 유도하는 것으로 나타났다. 저자들은 골수에서의 이러한 항체 약물 접합체의 축적 및 과립성 백혈구 및 그것들의 세포 전구체의 고갈 때문인 것으로 여겨지는 이러한 독성을 중요한 안전성 문제로 간주하였다. 따라서, 더욱 정확하게는, 치료적인 목적면에서, 항-CEACAM5 항체의 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 또는 CEACAM8과의 교차 반응성은 정상적인 조직에 대한 증가된 독성에 의해 이러한 화합물의 치료 지수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 특히 항체 약물 접합체(ADC)로서의 용도를 위하여 CEACAM 패밀리의 다른 분자들과 교차 반응하지 않는, 또는 표적 세포를 살해하는 결과를 가져오는 임의의 다른 작용 기작을 나타내는, 특이적으로 CEACAM5를 대상으로 한 항체를 획득하는 것은 강력한 장점이 있다.
더구나, 일부 정상적인 세포 조직에서 CEACAM5가 비록 낮은 수준이지만 발현된다고 기술되고 있으므로, 인간 CEACAM5뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이) CEACAM5와 결합할 수 있는 항-CEACAM5 항체를 개발하는 것은 중요한데, 이는 그러한 항체를 안전성 프로파일을 평가하기 위한 시노몰구스 원숭이의 전임상 독성 연구에서 용이하게 시험할 수 있기 때문이다. 치료적 항체의 효능은, 기능적 항체의 경우(Doern et al. 2009, J. Biol. Chem 284 10254) 및 작동인자 기능이 관련된 경우(Beers et al. Semin Hematol 47:107-114) 모두에 있어서, 표적에서의 에피토프의 국지화에 의존적일 수 있음이 밝혀진 바 있으므로, 인간/원숭이 교차 반응성 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 단백질의 동일한 반복된 Ig 유사 상동성 도메인의 에피토프와 결합하는 것으로 나타나야 한다.
그러한 항체들의 종 교차 반응성에 대한 필요성을 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5에 대해 특이성, 즉, 다른 필리핀 원숭이 및 인간 CEACAM 구성원들에 대해서는 교차 반응성을 나타내지 않는 성질과 결합시키는 것은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM 단백질들 사이에서의 전반적인 서열 상동성을 고려할 때 추가적인 정도의 복합성을 부가한다.
실제로, 필리핀 원숭이 CEACAM5 서열의 인간 CEACAM5 서열과의 전체적인 쌍별 정렬(AAA51967.1/GI:180223, 702개 아미노산)은 오로지 78.5%의 동일성을 나타내었다. 필리핀 원숭이 CEACAM1, CEACAM5, 및 CEACAM6 유전자들을 클로닝하고, 인간 및 필리핀 원숭이 A, B 및 N 도메인들의 전체적인 정렬을 수행하였다. 이러한 정렬 결과는 인간 및 마카크 CEACAM5에 공통적이고, 임의의 다른 패밀리 구성원과는 공유되지 않는 이상적인 에피토프를 국지화할 부위가, 만일 존재한다면, 매우 소수일 것이라고 예측하였다. 이러한 이유로 다른 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM 구성원들과는 교차 반응성을 나타내지 않으면서 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 사이에 교차 반응성을 나타내는 항체를 개발하는 것은 매우 낮은 성공 가능성을 나타낼 것이라고 예상되었다. 주목할 만한, 이전에 기술된 항-CEACAM5 항체들은 매우 소수의 예외와 함께(MT111, 아래 참조), 필리핀 원숭이 교차 반응성에 대해서는 거의 기록되지 않고 있다.
이뮤노메딕스(Immunomedics) 라베투주맙(hMN14로도 알려져 있음, Sharkey et al, 1995, Cancer Research 55, 5935)과 같은 항-인간 CEACAM5 항체들은 이미 임상 시험에 이용되고 있다. 이러한 항체는 관련된 항원과 결합하지 않는 것으로 나타났지만, 필리핀 원숭이의 CEACAM5와 교차 반응하지 않는다. 주목할 만하게도, 마이크로멧(Micromet)의 MT111 항체(메디뮨(MedImmune)의 MEDI-565 항체로도 알려져 있음)는 인간 CEACAM5 및 인간 CD3에 대한 이중특이적인 항체이다(Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641; WO 2007/071426). MT111은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CEACAM5를 인식하는 항체로부터의 단일사슬 가변 단편(scFv)과 인간 CD3를 인식하는 항체로부터의 scFv의 융합에 의해 생성되었다고 한다(Oberst 등의 포스터, AACR Annual Meeting April 2009 Denver, CO). 또한, MT111은 다른 CEACAM 패밀리 구성원과 결합하지 않는다고 보고된 바 있다(Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). MT111은 인간 CEACAM5의 A2 도메인의 입체형태적 에피토프와 결합한다. 이러한 입체형태적 에피토프는, 종양에서 전체 길이의 CEACAM5에 부수적으로 발현되는 인간 CEACAM5의 스플라이스 변이형에서 누락된다(Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). 나아가, MT111이 필리핀 원숭이 CEACAM5의 동일한 에피토프와 결합한다는 증거가 없다.
치료적 목적을 위해 최적의 특성을 나타내는, CEACAM5 표면 단백질에 대한 새로운 항체를 생산하고자 하는 시도로, 본 발명자들은 재조합 단백질로, 그리고 종양 세포로, 마우스를 면역화하였다. 본 발명자들은 유리한 프로파일을 나타내는 면역 글로불린(IgG)만을 선택하기 위하여 CEACAM 패밀리의 몇몇 재조합 단백질에 대한 ELISA 및 관련 세포주를 이용한 유동 세포계수법을 이용하여 수백 개의 하이브리도마를 스크리닝하였다. 예기치 않게도, 본 발명자들은 하이브리도마 클론들을 선택하여 원하는 특징 전부를 포함하는, 상응하는 성숙한 IgG를 생산할 수 있었다. 그것들은 높은 친화도로 인간 CEACAM5의 A3-B3 도메인과 특이적으로 결합하며, 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8 단백질들을 인식하지 않는다. 세포적 맥락에서, 이들 항체들은 종양 세포에 대해 (나노몰 범위로) 높은 친화도를 나타낸다. 더구나, 이러한 항체들은 10 이하의 원숭이/인간 친화도 비율로 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질과도 결합한다. 본 발명의 항체들은 필리핀 원숭이 CEACAM5의 A3-B3 도메인과 특이적으로 결합하며, 다른 필리핀 원숭이 CEACAM 구성원들을 인식하지 않는다.
CEACAM5의 A3-B3 도메인을 표적화함으로써, 이들 항체들은 전체 길이의 인간 CEACAM5 및 Peng 등이 확인한 그의 스플라이스 변이형(PLoS ONE 7(5): e3641) 모두와 결합하는 능력을 가지고 있으므로 증가된 종양 표적화 가능성을 나타낸다.
마지막으로, CEACAM5는 문헌에서 거의 내재화하지 않는 표면 단백질로 기술되어 있어(Schmidt et al, 2008, Cancer Immunol. Immunother. 57, 1879에서 검토됨), 항체 약물 접합체를 위한 유망한 표적이 아닐 수 있다. 선행 기술에서 보고된 바에도 불구하고, 본 발명자들은 본 발명자들이 생산한 항체들이 결합 후 CEACAM5-항체 복합체를 내재화할 수 있고, 세포독성제와 결합시킬 때 시험관 내에서 종양 세포에 대해 세포독성 활성을 유도할 수 있음을 보여주었다. 또한, 세포독성제에 결합된 동일한 항체들은 인간 원발성 대장 및 위장 종양을 가지고 있는 마우스에서 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있다.
정의
본 출원에 사용된 "CEACAM5"는 "CD66e"(분화 클러스터 66e) 또는 CEA로도 알려져 있는 "암배아항원 관련 세포 부착 단백질 5"를 가리킨다. CEACAM5는 세포 부착과 관련된 당단백질이다. CEACAM5는 특히 결장, 위, 폐 및 자궁 종양 세포의 표면 상에서 고도로 발현된다.
신호 펩티드(1~34번 위치) 및 프로펩티드(686~702번 위치)를 포함하는 전체 길이의 인간 CEACAM5의 참조 서열은 등록번호 AAA51967.1 하에 유전자 은행(GenBank) 데이터베이스로부터 이용 가능하다(SEQ ID NO:52). 백인 집단에서 같은 것을 나타내지 않는(non synonymous) SNP 다섯 개가 2%를 초과하는 빈도로 확인된 바 있는데, 그것들 중 네 개는 인간의 CECAM5(SEQ ID NO:58)의 N 도메인에 위치하고 있고(80번, 83번, 112번, 113번 위치), 마지막 것은 A2 도메인(398번 위치)에 위치하고 있다. 유전자 은행 AAA51967.1은 주요한 단상형(I80, V83, I112, I113 및 E398)을 함유한다.
본 발명자들이 클로닝한 필리핀 원숭이 CEACAM5의 세포외 도메인의 서열은 SEQ ID NO:53에 개시되어 있다.
"도메인"은 일반적으로 서열 상동성을 기초로 하여 정의된, 단백질의 임의의 부위일 수 있으며, 종종 특정한 구조적 또는 기능적 실체와 관련이 있다. CEACAM 패밀리 구성원은 Ig 유사 도메인들로 구성된다고 알려져 있다. 용어 도메인은 본 문헌에서 "N 도메인"과 같은 개별적인 Ig 유사 도메인들 또는 "A3-B3 도메인"과 같은 연속적인 도메인들의 집합을 가리키는 데에 이용된다.
인간 CEACAM5의 도메인 구성은 다음과 같다(유전자 은행 AAA51967.1 서열; SEQ ID NO:52을 기초로 함):
Figure pat00001
따라서, 인간 CEACAM5의 A3-B3 도메인은 SEQ ID NO:52의 499~685번 위치의 아미노산들로 이루어진다.
필리핀 원숭이 CEACAM5의 도메인 구성은 다음과 같다(클로닝된 세포외 도메인 서열; SEQ ID NO:53을 기초로 함):
Figure pat00002
따라서, 필리핀 원숭이 CEACAM5의 A3-B3 도메인은 SEQ ID NO:53의 465~654번 위치의 아미노산들로 이루어진다.
"부호화 서열" 또는 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 생성물을 "암호화하는" 서열은 발현 시, 그 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 생산을 가져오는 뉴클레오티드 서열로, 즉, 이러한 뉴클레오티드 서열은 그 폴리펩티드, 단백질 또는 효소를 위해 아미노산 서열을 암호화한다. 단백질의 부호화 서열은 개시 코돈(보통 ATG) 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 특이적인 단백질(예컨대, 항체)에 대한 참조는 자연적인 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드뿐만 아니라, 변이형 및 그의 기원 또는 제조 방식과는 무관한 변형된 형태를 포함할 수 있다. 자연적인 아미노산 서열이 있는 단백질은 자연으로부터 얻어진 것과 동일한 아미노산 서열이 있는 단백질이다. 그러한 자연적인 서열의 단백질은 자연으로부터 분리될 수 있거나, 일반적인 재조합 및/또는 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 자연적인 서열의 단백질은 구체적으로 자연 발생적인 절단된 형태 또는 가용성 형태, 자연 발생적인 변이형 형태(예컨대, 대안적으로 스플라이스된 형태), 자연 발생적인 대립 형질의 변이형 및 번역 후 변형을 포함하는 형태를 아우른다. 자연적인 서열의 단백질은 당화, 또는 인산화, 또는 일부 아미노산 잔기의 기타 변형과 같은 번역 후 변형을 수반하는 단백질을 포함한다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 단백질 또는 효소들 전부 또는 일부분을 포함하는 아미노산들의 특정 서열을 암호화하거나 이에 상응하는 DNA 서열을 의미하며, 예를 들어, 이러한 유전자가 발현되는 조건을 결정하는, 프로모터 서열과 같은 조절성 DNA 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 구조적 유전자가 아닌 일부 유전자들은 DNA로부터 RNA로 전사될 수 있지만, 아미노산 서열로 번역되지는 않는다. 다른 유전자들은 구조적 유전자의 조절자로서, 또는 DNA 번역의 조절자로서 기능할 수 있다. 특히, 용어 유전자는 단백질을 암호화하는 게놈 서열, 즉, 조절자, 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 위해 의도될 것일 수 있다.
"참조 서열과 적어도 85% 동일한" 서열은 그 전체 길이에, 참조 서열의 85% 이상, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열이다.
"서열 동일성"의 퍼센티지는 비교창 위에 최적으로 정렬된, 두 개의 서열들을 비교함으로써 결정될 수 있는데, 이때, 비교창의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 두 서열들의 최적 정렬에 대해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 틈)을 포함할 수 있다. 이러한 퍼센티지는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 합치된 위치의 수를 얻고, 합치된 위치의 수를 비교창에서의 전체 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센티지를 얻음으로써 계산된다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 전체적인 쌍별 정렬, 예컨대, Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 알고리즘을 이용하여 수행한다. 서열 동일성의 퍼센티지는 예를 들어, BLOSUM62 매트릭스와 함께, 프로그램 Needle 및 다음 매개변수들 gap-open=10, gap-extend=0.5을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 비슷한 화학적 성질(예컨대, 전하, 크기 및 소수성)을 나타내는 곁사슬 R이 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적인 성질을 실질적으로 바꾸지 않을 것이다. 비슷한 화학적 성질을 나타내는 곁사슬이 있는 아미노산 집합들의 예는 1) 지방족 곁사슬: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 곁사슬: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 곁사슬: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 곁사슬: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 곁사슬: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 곁사슬: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황 함유 곁사슬: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존적 아미노산 치환 집합들은 아미노산 크기를 기초로 하여 정의될 수도 있다.
"항체"는 두 개의 중쇄가 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된 자연적인 또는 통상적인 항체일 수 있다. 두 가지 유형의 경쇄, 람다(l)와 카파(k)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 다섯 가지 주요한 중쇄 부류(또는 이소형)가 있다. 각각의 쇄는 별개의 서열 도메인을 함유한다. 경쇄는 두 개의 도메인 또는 부위인 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 네 개의 도메인, 하나의 가변 도메인(VH)과 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 집합적으로 CH라 지칭됨)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 부위는 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(CH)의 불변 부위 도메인은 항체 사슬 결합, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)와의 결합과 같은, 중요한 생물학적 성질을 부여한다. Fv 단편은 면역 글로불린의 Fab 단편의 N 말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분들로 이루어진다. 이러한 항체의 특이성은 항체 결합 자리 및 항원 결정기 사이의 구조적인 상보성에 있다. 항체 결합 자리는 주로 과가변 또는 상보성 결정 부위(CDR)로부터 유래하는 잔기들로 이루어진다. 때때로, 비 과가변 또는 프레임워크 부위(FR)로부터의 잔기들은 전반적인 도메인 구조에 영향을 미치고, 따라서 결합 자리에 영향을 미친다. 따라서, 상보성 결정 부위 또는 CDR은 자연적인 면역 글로불린 결합 자리의 자연적인 Fv 부위의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열들을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L, 그리고 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로 지칭되는 각각 세 개의 CDR을 가지고 있다. 따라서, 통상적인 항체 항원 결합 자리는 중쇄 및 경쇄 V 부위의 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는, 여섯 개의 CDR을 포함한다.
"프레임워크 부위"(FR)는 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉, 단일한 종에서 상이한 면역 글로불린들 가운데 상대적으로 보존된 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 부위의 그러한 부분들을 지칭한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄들은 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 그리고 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 지칭되는 각각 네 개의 FR을 가지고 있다.
본 출원에 사용된 "인간 프레임워크 부위"는 자연 발생적인 인간 항체의 프레임워크 부위와 실질적으로 동일한 (약 85% 이상, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 프레임워크 부위이다.
본 발명의 맥락에서, 면역 글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 CDR/FR 정의는 IMGT 정의를 기초로 하여 결정된다(Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).
본 출원에 사용된 용어 "항체"는 통상적인 항체 및 이의 단편뿐만 아니라, 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 특히, 단일 도메인 항체의 가변 중쇄 및 키메라, 인간화, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 의미한다.
또한, 본 출원에 사용된 항체 또는 면역 글로불린은 더욱 최근에 기술된 바 있으며, 상보성 결정 부위가 단일 도메인 폴리펩티드의 일부분인 항체인 "단일 도메인 항체"를 포함한다. 단일 도메인 항체의 예로는 중쇄 항체, 자연적으로 경쇄가 없는 항체, 통상적인 네 개의 사슬 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체, 유전자 공학으로 제조된 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼, 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체는 경쇄가 없는 중쇄 항체로 알려져 있는 자연 발생적인 단일 도메인 항체일 수 있다. 특히, 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 단봉 낙타, 라마, 알파카 및 구아나코는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산한다. 낙타과 중쇄 항체들은 CH1 도메인도 없다.
경쇄가 없는 이러한 단일 도메인 항체들의 가변 중쇄는 당해 분야에서 "VHH" 또는 "나노바디"로 알려져 있다. 통상적인 VH 도메인과 비슷하게, VHH는 네 개의 FR과 세 개의 CDR을 함유한다. 나노바디는 통상적인 항체에 비해 장점이 있다. 나노바디는 IgG 분자들보다 약 10배 작고, 그 결과, 적절히 접힌 기능적인 나노바디는 시험관 내 발현에 의해 생산될 수 있으며, 높은 수율을 달성한다. 나아가, 나노바디는 매우 안정적이며, 단백질 가수분해효소의 작용에 대해 저항성을 나타낸다. 나노바디의 성질 및 생산은 Harmsen 및 De Haard HJ가 검토한 바 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov;77(1):13-22).
본 출원에 사용된 용어 "단일클론성 항체" 또는 "mAb"는 단일 아미노산 서열의 항체 분자를 지칭하는데, 이는 특정 항원을 대상으로 하며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 단일클론성 항체는 B 세포의 단일 클론 또는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있지만, 재조합될 수도 있다. 즉, 단백질 공학에 의해 생산될 수도 있다.
용어 "키메라 항체"는 유전자 공학에 의해 제조된 항체를 지칭하는데, 이는 가장 광범위한 의미에서, 하나의 항체로부터의 하나 이상의 부위 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 부위를 함유한다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 비 인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을, 다른 항체의, 일 구현예에서 인간 항체의, CH 도메인 및 CL 도메인과 함께 포함한다. 비 인간 동물로서, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 등과 같은 임의의 동물이 이용될 수 있다. 또한, 키메라 항체는 적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 특이성을 나타내는 다중특이적인 항체를 지칭할 수도 있다.
용어 "인간화 항체"는 전체적으로 또는 부분적으로 비 인간 기원이고, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위하여 예를 들어, VH 및 VL 도메인의 프레임워크 부위의, 특정 아미노산을 교체하도록 변형된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 도메인은 대부분의 경우 인간 CH 및 CL 도메인이다.
(통상적인) 항체의 "단편"은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디, 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체들을 포함한다. 또한, 통상적인 항체의 단편은 중쇄 항체 또는 VHH와 같은 단일 도메인 항체일 수 있다.
용어 "Fab"는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 지칭하는데, 이때, 중쇄의 N 말단쪽의 약 절반 및 전체 경쇄는 이황화 결합을 통해 함께 결합된다. 그것은 일반적으로 IgG를 단백질 가수분해효소인 파파인으로 처리함으로써 단편들 가운데에서 얻어진다.
용어 "F(ab')2"는 약 100,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 지칭하는데, 이는 힌지 부위의 이황화 결합을 통해 결합된 2개의 동일한 Fab 단편들보다 약간 더 크다. 그것은 일반적으로 IgG를 단백질 가수분해효소인 펩신으로 처리함으로써 단편들 가운데에서 얻어진다.
용어 "Fab'"은 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 지칭하는데, 이는 F(ab')2의 힌지 부위의 이황화 결합을 절단함으로써 얻어진다.
단일 사슬 Fv("scFv") 폴리펩티드는 공유적으로 연결된 VH::VL 헤테로이량체로서, 이는 일반적으로 펩티드를 암호화하는 링커에 의해 연결된 유전자들을 암호화하는 VH 및 VL을 포함하는 유전자 융합으로부터 발현된다. 본 발명의 인간 scFv 단편은 예를 들어, 유전자 재조합 기법을 이용하여, 적절한 입체구조로 유지된 CDR들을 포함한다. 2가 및 다가 항체 단편들은 1가 scFv들의 회합에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 2가의 sc(Fv)2와 같은 펩티드 링커에 의해 1가의 scFv들을 결합시킴으로써 형성될 수 있다. "dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로이량체이다. "(dsFv)2"는 펩티드 링커에 의해 결합된 두 개의 dsFv를 의미한다.
용어 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 단일 분자 내에 두 개의 항체들의 항원 결합 자리를 조합시킨 항체를 의미한다. 따라서, BsAb들은 동시에 두 개의 상이한 항원들과 결합할 수 있다. 예를 들어 EP 2 050 764 A1에 기술된 바와 같이, 결합 성질과 작동인자 기능들의 원하는 세트를 갖춘 항체 또는 항체 유도체들을 설계, 변형 및 생산하기 위하여 증가하는 빈도로 유전 공학이 이용되고 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 단일 분자 내에 둘 이상의 항체들의 항원 결합 자리를 조합시킨 항체를 의미한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원 결합 자리가 있는 작은 항체 단편들을 지칭하는데, 이러한 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬의 두 도메인들 사이에서의 짝지음을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 이러한 도메인들은 다른 사슬의 상보적인 도메인들과 짝을 이루도록 강제되어 두 개의 항원 결합 자리를 생성한다.
용어 "하이브리도마"는 비 인간 포유동물을 항원으로 면역화하여 제조된 B 세포를 마우스 등으로부터 유래된 골수종 세포와 세포 융합시킴으로써 얻어지는 세포를 의미하며, 이는 항원 특이성을 나타내는 원하는 단일클론성 항체를 생산한다.
폴리펩티드(즉, 본 발명의 항체) 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 때 "정제된" 및 "분리된"은, 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자의 실질적인 부존재 하에 지시된 분자가 존재함을 의미한다. 본 출원에 사용된 용어 "정제된"은 동일한 유형의 생물학적 거대분자가 중량을 기준으로 적어도 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 또는 98%가 존재함을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 암호화하는 "분리된" 핵산 분자는 대상 폴리펩티드를 암호화하지 않는 다른 핵산 분자들이 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다. 그러나 이러한 분자는 조성물의 기본적인 특성에 유해하게 영향을 미치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "대상자"는 설치류, 고양이, 개 및 영장류와 같은 포유동물을 의미한다. 나아가, 본 발명에 따른 대상자는 인간이다.
항체
본 발명자들은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질 모두에 대해 높은 친화도를 나타내며, 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8 단백질 및 필리핀 원숭이 CEACAM1, CEACAM6 및 CEACAM8 단백질과 유의미하게 교차 반응하지 않는 특이적인 마우스 항-CEACAM5 항체들을 생성하고, 스크리닝하고 선택하는 데에 성공하였다.
본 발명자들은 그러한 단일클론성 항체들, 소위 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 항체들의 가변 중쇄 및 경쇄의 서열을 결정하였다.
소위 "항체 MAb1"은
- 서열 EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYIYYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARPAYYGNPAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:31, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 중쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-H는 1번에서 25번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-H는 26번에서 33번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:1), FR2-H는 34번부터 50번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-H는 51번부터 58번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:2), FR3-H는 59번부터 96번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-H는 97번부터 109번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:3), FR4-H는 110번부터 120번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 중쇄의 가변 도메인 및
- 서열 DILMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:32, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 경쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-L은 1번에서 26번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-L은 27번에서 32번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:4), FR2-L은 33번에서 49번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-L은 50번에서 52번까지의 아미노산 위치를 포괄하며, FR3-L은 53번에서 88번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-L은 89번에서 98번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:6), FR4-L은 99번부터 108번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다.
소위 "항체 MAb2"는
- 서열 EVQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGITYFPDTVQGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAIYYCAAHYFGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:33, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 중쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-H는 1번에서 25번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-H는 26번에서 33번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:7), FR2-H는 34번부터 50번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-H는 51번부터 58번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:8), FR3-H는 59번부터 96번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-H는 97번부터 109번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:9), FR4-H는 110번부터 120번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 중쇄의 가변 도메인 및
- 서열 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:34, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 경쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-L은 1번에서 26번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-L은 27번에서 32번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:10), FR2-L은 33번에서 49번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-L은 50번에서 52번까지의 아미노산 위치를 포괄하며, FR3-L은 53번에서 88번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-L은 89번에서 97번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:12), FR4-L은 98번부터 107번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다.
또한, 항체 MAb2의 변이형이 CDR2-L에 K52R 치환을 도입함으로써 생성되었다. 본 출원에서 "Mab2K52R"로 지칭되는 이러한 변이형은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5에 대해 MAb2와 기본적으로 동일한 친화도를 나타낸다.
소위 "항체 MAb3"는
- 서열 EVKLVESGGGLVKPGGSLTLPCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGDTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILFLQMSSLRSEDTGMYYCARVNYYDSSFLDWWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:35, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 중쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-H는 1번에서 25번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-H는 26번에서 33번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:13), FR2-H는 34번부터 50번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-H는 51번부터 57번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:14), FR3-H는 58번부터 95번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-H는 96번부터 108번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:15), FR4-H는 109번부터 119번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 중쇄의 가변 도메인 및
- 서열 DIVMTQSQRFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:36, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 경쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-L은 1번에서 26번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-L은 27번에서 32번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:16), FR2-L은 33번에서 49번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-L은 50번에서 52번까지의 아미노산 위치를 포괄하며, FR3-L은 53번에서 88번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-L은 89번에서 98번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:18), FR4-L은 99번부터 108번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다.
소위 "항체 MAb4"는
- 서열 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAFISSYGGRTYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCAAHYFGTSGPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:37, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 중쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-H는 1번에서 25번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-H는 26번에서 33번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:19), FR2-H는 34번부터 50번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-H는 51번부터 58번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:20), FR3-H는 59번부터 96번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-H는 97번부터 109번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:21), FR4-H는 110번부터 120번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 중쇄의 가변 도메인 및
- 서열 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGIPFTFGSGTKLELK(SEQ ID NO:38, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 경쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-L은 1번에서 26번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-L은 27번에서 32번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:22), FR2-L은 33번에서 49번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-L은 50번에서 52번까지의 아미노산 위치를 포괄하며, FR3-L은 53번에서 88번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-L은 89번에서 97번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:24), FR4-L은 98번부터 107번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다.
소위 "항체 MAb5"는
- 서열 ELQLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVTYINSGGGITYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCTAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:39, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 중쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-H는 1번에서 25번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-H는 26번에서 33번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:25), FR2-H는 34번부터 50번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-H는 51번부터 58번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:26), FR3-H는 59번부터 96번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-H는 97번부터 109번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:27), FR4-H는 110번부터 120번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 중쇄의 가변 도메인 및
- 서열 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:40, CDR은 굵은 글자로 나타냄)로 이루어지는 경쇄의 가변 도메인으로, 이때, FR1-L은 1번에서 26번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR1-L은 27번에서 32번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:28), FR2-L은 33번에서 49번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR2-L은 50번에서 52번까지의 아미노산 위치를 포괄하며, FR3-L은 53번에서 88번까지의 아미노산 위치를 포괄하고, CDR3-L은 89번에서 97번까지의 아미노산 위치를 포괄하며(SEQ ID NO:30), FR4-L은 98번부터 107번까지의 아미노산 위치를 포괄하는 경쇄의 가변 도메인을 포함한다.
따라서, 본 발명은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5와 결합하는 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5의 A3-B3 도메인과 결합한다. 더욱 구체적으로는, 이러한 항체는 분리된 형태로 발현되든 또는 가용성의 세포외 도메인 또는 막 결합 전체 길이의 CEACAM5 단백질로 존재하든 간에 개의치 않고 인간 및 필리핀 원숭이 A3-B3 도메인에 결합할 수 있다.
백인 집단에서 2%를 초과하는 빈도로 어떠한 SNP도 인간 CEACAM5의 A3-B3 도메인에서 보고되지 않았으며, 이는 CEACAM5 상에서 이러한 항체들의 에피토프(들)이 집단의 일부분에서 변경될 위험을 최소화하므로, 이러한 도메인에 대한 이러한 항체들의 특이성은 유리하다.
또한, 본 발명은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인과의 결합에 대해, 소위 항체 MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, and MAb5로 이루어지는 군으로부터 선택된, 즉,
a) 서열 SEQ ID NO:31의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:32의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체;
b) 서열 SEQ ID NO:33의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:34의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체;
c) 서열 SEQ ID NO:33의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:34의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체로서, 이때, 52번 위치의 K가 R로 교체된 항체;
d) 서열 SEQ ID NO:35의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:36의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체;
e) 서열 SEQ ID NO:37의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:38의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체; 및
f) 서열 SEQ ID NO:39의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:40의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인에 대한 결합에 대해, 항체 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5로 이루어지는 군으로부터 선택된 항체(이하 "참조" 항체)의 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁하는 후보 항체의 능력은 예를 들어, 경쟁적 ELISA에 의해 용이하게 분석될 수 있는데, 이때, 항원(즉, 인간 또는 필리핀 원숭이 CEACAM5의 A3-B3 도메인 또는 A3-B3 도메인을 포함하는 인간 또는 필리핀 원숭이 CEACAM5의 단편을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드, 특히 인간 또는 필리핀 원숭이 CEACAM5의 세포 외 도메인)은 고체 지지체에 결합되고, 각각 후보 항체 및 참조 항체를 함유하는 두 가지 용액이 첨가되고, 이러한 항체들을 항원에 대한 결합을 두고 경쟁시킨다. 그런 다음, 항원에 결합된 참조 항체의 양을 측정하여, 음성 대조군(예컨대, 어떠한 항체도 함유하지 않는 용액)에 대해 측정하였을 때, 항원에 결합된 참조 항체의 양과 비교할 수 있다. 후보 항체의 존재 하에서 결합된 참조 항체의 양이 음성 대조군의 존재 하에서의 결합된 참조 항체의 양과 비교할 때 감소되었음은 후보 항체가 참조 항체와 경쟁하였음을 나타낸다. 편리하게도, 참조 항체를 (예컨대, 형광으로) 표지하여, 결합된 참조 항체의 검출을 용이하게 할 수 있다. 후보 및/또는 참조 항체의 단계별 희석액으로 반복된 측정을 수행할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 그러한 항체, 및 예를 들어, 위의 b), c), e) 및 f)에 정의된 항체와 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인에 대한 결합을 두고 경쟁하는 항체는 각각 인간 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인의 위치 109~115번의 아미노산(SEQ ID NO:76) 및 위치 131~143번의 아미노산(SEQ ID NO:77)으로 이루어지는 인간 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인의 두 부위와 결합한다. 사실, MAb2 항체에 대한 입체형태적 에피토프는 인간 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인의 109~115 및 131~143번 부위에 속하는 것으로 확인되었고, MAb2, MAb4 및 MAb5는 구조적으로 밀접하게 관련이 있어, 본 발명자들은 상기 항체들이 동일한 에피토프에 결합한다고 추정한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 표면의 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질에 대해 특이적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 CEACAM1, 인간 CEACAM6, 인간 CEACAM7, 인간 CEACAM8, 필리핀 원숭이 CEACAM1, 필리핀 원숭이 CEACAM6 및 필리핀 원숭이 CEACAM8 단백질과 결합하지 않거나, 이들과 유의미하게 교차 반응하지 않는다.
특히, 이러한 항체는 전술된 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM 단백질들의 세포외 도메인과 결합하지 않거나, 이들과 유의미하게 교차 반응하지 않는다.
인간 CEACAM1 전체 길이의 단백질은 등록번호 NP_001703.2로 유전자 은행 데이터베이스에서 이용 가능하다(SEQ ID NO:11). 인간 CEACAM1의 세포외 도메인은 SEQ ID NO:11의 35~428번 위치의 아미노산들로 이루어진다. 인간 CEACAM6 전체 길이의 단백질은 등록번호 NP_002474.3으로 유전자 은행 데이터베이스에서 이용 가능하다(SEQ ID NO:71). 인간 CEACAM6의 세포외 도메인은 SEQ ID NO:71의 35~327번 위치의 아미노산들로 이루어진다.
인간 CEACAM7 전체 길이의 단백질은 등록번호 NP_008821.1로 유전자 은행 데이터베이스에서 이용 가능하다(SEQ ID NO:72). 인간 CEACAM7의 세포외 도메인은 SEQ ID NO:72의 36~248번 위치의 아미노산들로 이루어진다.
인간 CEACAM8 전체 길이의 단백질은 등록번호 NP_001807.2로 유전자 은행 데이터베이스에서 이용 가능하다(SEQ ID NO:73). 인간 CEACAM8의 세포외 도메인은 SEQ ID NO:73의 35~332번 위치의 아미노산들로 이루어진다.
필리핀 원숭이 CEACAM1 세포외 도메인은 전체 길이 단백질의 35~428번 위치의 아미노산, 즉, SEQ ID NO:57의 1~394번 아미노산으로 이루어진다.
필리핀 원숭이 CEACAM6 세포외 도메인은 전체 길이 단백질의 35~327번 위치의 아미노산, 즉, SEQ ID NO:61의 1~293번 아미노산으로 이루어진다.
필리핀 원숭이 CEACAM8 세포외 도메인은 전체 길이 단백질의 35~332번 위치의 아미노산, 즉, SEQ ID NO:63의 1~298번 아미노산으로 이루어진다.
"친화도"는 이론상으로는 전체 항체 및 항원 사이의 평형 결합으로 정의된다. 친화도는 표면 플라즈몬 공명으로 결합 및 해리 속도를 측정하거나 면역화학분석법(ELISA, FACS)에서 EC50(또는 겉보기 KD)를 측정하는 것과 같은, 다양한 공지된 방법에 의해 실험적으로 평가될 수 있다. 이러한 분석법에서, EC50은 ELISA(효소 결합 면역 흡착 측정법)에 의한 정의된 농도의 항원 또는 FACS(형광 활성 세포 분류법)에 의한 항원을 발현하는 정의된 농도의 세포에 대한 어느 정도의 소정의 노출 시간 후의 기준선 및 최대 사이의 절반 정도의 반응을 유도하는 항체 농도이다.
항원 1(Ag1)에 대한 단일클론성 항체 결합은 항원 2(Ag2)에 대해, EC50이 두 항원 모두에 대해 비슷한 범위에 있을 때, "교차 반응적"이다. 본 출원에서, Ag1에 대한 단일클론성 항체 결합은 Ag2에 대해, Ag1에 대한 친화도에 대한 Ag2에 대한 친화도의 비율이 10 이하(예를 들어, 5, 2, 1 또는 0.5)일 때, 교차 반응적이며, 친화도는 두 항원 모두에 대해 동일한 방법으로 측정된 것이다.
Ag1과 결합하는 단일클론성 항체는 Ag2에 대해, 두 항원에 대한 친화도가 매우 상이할 때 "유의미하게 교차 반응적이지 않다". Ag2에 대한 친화도는 그 결합 반응이 너무 낮은 경우 측정 가능하지 않을 수 있다. 본 출원에서, Ag1과 결합하는 단일 클론성 항체는, 동일한 실험 설정 및 동일한 항체 농도에서의 Ag2에 대한 단일클론성 항체의 결합 반응이 동일한 단일클론성 항체의 결합 반응의 5% 미만일 때, Ag2에 대해 유의미하게 교차 반응적이지 않다. 실제에서는, 사용된 항체 농도는 EC50, 또는 Ag1으로 얻어진 포화 정체 상태에 도달하는 데 필요한 농도일 수 있다.
단일클론성 항체는 그것이 Ag2에 유의미하게 교차 반응적이지 않을 때, Ag1에 "특이적으로 결합"하거나 Ag1에 "특이적"이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 ≤10, 예를 들어, ≤5, ≤2, ≤1, 또는 ≤0.5인, 필리핀 원숭이 CEACAM5에 대한 친화도에 대한 인간 CEACAM5에 대한 친화도의 비율을 나타낸다. 따라서, 원숭이에서 관찰된 독성 프로파일이 인간에서 가능성 있는 부작용을 예상하는 것과 관련이 있을 것이므로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 원숭이에서 수행된 독성학적 연구에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 ≤10 nM, 예를 들어, ≤5 nM, ≤3 nM, ≤1 nM 또는 ≤0.1nM인, 인간 CEACAM5 또는 필리핀 원숭이 CEACAM5, 또는 둘 다에 대한 친화도를 나타내며, 예를 들어, 0.01 nM 내지 5 nM의 친화도, 또는 및 0.1 nM 내지 5 nM의 친화도, 또는 0.1 nM 또는 1 nM의 친화도를 나타낸다
인간 CEACAM5에 대한 친화도 또는 필리핀 원숭이 CEACAM5에 대한 친화도는 포획 항체로서 가용성 재조합 CEACAM5를 이용하여 ELISA에서 EC50 값으로서 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 ≤25 nM, 예를 들어 ≤20 nM, ≤10 nM, ≤5 nM, ≤3 nM 또는 1 nM인, 종양 세포주 MKN45(DSMZ, ACC 409)에 대한, 또는 환자로부터 유래되는 이종 이식 종양 세포(온코디자인 바이오테크놀로지(Oncodesign Biotechnology)로부터 이용 가능한 CR-IGR-034P, 종양 컬렉션 CReMEC)에 대한 FACS 분석법으로 결정될 수 있는, 겉보기 해리 상수(겉보기 KD)를 나타낼 수 있다. 겉보기 KD는 0.01~20 nM의 범위 내일 수 있거나, 0.1~20 nM, 0.1~10 nM, 또는 0.1~5 nM의 범위 내일 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따른 항체들은, 동결되고 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된(FFPE) 조직 박편에서 면역조직화학법에 의해 CEACAM5 발현을 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 항체들의 VH 및 VL 부위의 서열들의 정렬 결과를 도 7에 나타내었다. CRD-H 및 CDR-L 서열들의 비교는 구조적으로, MAb2, MAb4 및 MAb5가 한편으로, 그리고 MAb1 및 MAb3이 다른 한편으로 밀접하게 관련이 있으며, 상기 항체들은 아마도 동일한 에피토프와 결합함을 나타낸다. CRD-H 및 CDR-L 서열들의 비교는 또한 항체들의 두 집단 사이에서 엄격하게 보존되며, 따라서 특이성에 중요하다고 추정되는 CDR 위치들을 확인시켜 주는 반면, 다른 위치들은 치환을 뒷받침할 수 있다.
나아가, 본 발명자들은 MAb2 VH의 101~109번 위치의 잔기들(즉, CDR3-H의 잔기들) 및 MAb2 VL의 47~54번 및 88~104번 위치의 잔기들(즉, 각각 CDR2-L과 CDR3-L을 포함하는 부위들)이 인간 CEACAM5-A3B3 도메인에 대한 항체 파라토프의 일부분을 만들거나 형성함을 확인하였다.
나아가, MAb2 VL의 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96 및 97번 위치의 잔기들(즉, CDR1-L, CDR2-L and CDR3-L 내) 및 MAb2 VH의 26 내지 31, 51 내지 58, 97, 103, 104, 107 및 109번 위치의 잔기들(즉, CDR1-H 내, CDR2-H의 전부 및 CDR3-H 내)은 인간 및 시노몰구스 CEACAM5 세포외 도메인에 대한 결합에 대해 중성으로서, 단일 산 치환에 의해 확인되었다. 또한, MAb2 VL의 30번 및 92번 위치의 잔기들(즉, CDR1-L 및 CDR3-L 내)과 MAb2 VH의 98번 및 100번 위치의 잔기들(즉, CDR3-H)은 보존적 치환을 용인하는 것으로 나타났다. MAb2, MAb4 및 MAb5는 동일한 6개의 CDR 세트를 수반하거나 매우 밀접하게 관련된 것들이므로, VH 또는 VL 또는 VH와 VL 둘 다의 서열들에서 MAb4 또는 MAb5의 동일한 위치들에서의 변이형이 인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 결합 특이성 및/또는 친화도를 유지하는 변이형 항체들도 가져올 것이다.
주목할 만하게도, CDR2-H의 모든 잔기들은 인간 및 시노몰구스 CEACAM5 세포외 도메인에 대한 결합에 대해 중성으로 확인되어, 본 발명자들은 CDR2-H가 상호 작용에 참여하지 않으리라고 가정하였다. 따라서, 본 발명의 항체에서, CDR2-H는 6개 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 임의의 서열일 수 있으며, 이는 인간 항체에서 CDR2-H 서열의 일반적인 길이이다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는
a) 각각의 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6이 임의의 아미노산인 서열 X1X2X3X4X5X6YD(SEQ ID NO:83)로 이루어지는 CDR1-H; 및
6개 내지 10개의 아미노산 길이의 서열, 바람직하게는 8개의 아미노산 길이의 서열로 이루어지는 CDR2-H로서, 임의의 아미노산이 임의의 위치에 존재할 수 있는 CDR2-H; 및
각각의 X1, X4, X5, X6 및 X7이 임의의 아미노산이고, X2는 A 또는 S이고, X3은 Y, F 또는 W인 서열 X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO:84)로 이루어지는 CDR3-H; 및/또는
b) 각각의 X1, X2, X3 및 X5가 임의의 아미노산이고, X4는 Y, F 또는 W인 서열 X1X2X3X4X5Y(SEQ ID NO:85) 로 이루어지는 CDR1-L; 및
각각의 X1 및 X2가 임의의 아미노산인 서열 NX1X2로 이루어지는 CDR2-L; 및
각각의 X1, X2, X4, X5, X6 및 X7이 임의의 아미노산이고, X3는 Y, F 또는 W인 서열 X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO:86)로 이루어지는 CDR3-L을 포함한다.
일 구현예에서, 서열 X1X2X3X4X5X6YD(SEQ ID NO:83)로 이루어지는 CDR1-H에서, X1은 G, 또는 X2는 F, 또는 X3은 T, A 또는 V, 또는 X4는 F, 또는 X5는 S, 또는 X6은 S, 또는 이의 임의의 조합이다.
일 구현예에서, CDR2-H는 서열 IX1SX2GGX3T(SEQ ID NO:79)로 이루어지는데, 이때, X1은 S 또는 N(특히 S), X2는 Y 또는 G(특히 G), X3은 R 또는 I이다. 추가적인 구현예에서, X3은 I이다.
일 구현예에서, 서열 X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO:84)로 이루어지는 CDR3-H에서, X1은 A 또는 T, 또는 X4는 T 또는 S, 또는 X5는 S, 또는 X6은 F, 또는 X7은 Y, 또는 이의 임의의 조합이다.
일 구현예에서, 서열 X1X2X3X4X5Y(SEQ ID NO:85)로 이루어지는 CDR1-L에서, X1은 E, 또는 X2는 N, 또는 X3은 I, 또는 X5는 S, 또는 이의 임의의 조합이다.
일 구현예에서, CDR2-L은 서열 NX1X2로 이루어지고, 이때, X1은 A 또는 T이고, X2는 K 또는 R이다.
일 구현예에서, 서열 X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO:86)로 이루어지는 CDR3-L에서, X1은 Q, 또는 X2는 H, 또는 X4는 G, 또는 X5는 T, 또는 X6은 F, 또는 X7은 T, 또는 이의 임의의 조합이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체는
a) X1이 T, A 또는 V인 서열 GFX1FSSYD(SEQ ID NO:78)로 이루어지는 CDR1-H; 및
X1은 S 또는 N(특히 S), X2는 Y 또는 G(특히 G), X3은 R 또는 I인 서열 IX1SX2GGX3T(SEQ ID NO:79)로 이루어지는 CDR2-H; 및
X1은 A 또는 T(특히 A)이고, X2는 T 또는 S인 서열 X1AHYFGX2SGPFAY(SEQ ID NO:80)로 이루어지는 CDR3-H; 및/또는
b) 서열 ENIFSY(SEQ ID NO:10) 또는 ENIYSY(SEQ ID NO:22)로 이루어지는 CDR1-L; 및
X1은 A 또는 T이고, X2는 K 또는 R, 특히 R인 서열 NX1X2로 이루어지는 CDR2-L; 특히 NAK, NTK 및 NTR로 이루어지는 CDR2-L; 및
서열 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:12) 또는 QHHYGIPFT(SEQ ID NO:24)로 이루어지는 CDR3-L을 포함한다.
일 구현예에 따르면, CDR2-H에서, X1은 S 또는 N, X2는 G이고, X3은 I이다.
일 구현예에 따르면, CDR2-H는 ISSGGGIT(SEQ ID NO:8), ISSYGGRT(SEQ ID NO:20) 또는 INSGGGIT(SEQ ID NO:26)로 이루어진다.
일 구현예에 따르면, CDR3-H에서, X1은 A 또는 T이고, X2는 S이다.
일 구현예에 따르면, CDR3-H는 AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO:21), 또는 TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:27)로 이루어진다.
이러한 구현예들의 임의의 조합은 본 발명의 일부분을 이룬다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체는
a) X1은 R 또는 S, 특히 S이고, X2는 A 또는 D인 서열 GFTFSX1YX2(SEQ ID NO:81)로 이루어지는 CDR1-H; 및
X1은 부존재, S 또는 G(특히 G), X2는 D, Y 또는 I이고, X3은 T 또는 I인 서열 ISSGGX1X2X3(SEQ ID NO:82)으로 이루어지는 CDR2-H; 및
서열 ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO:3) 또는 ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO:15)로 이루어지는 CDR3-H; 및/또는
b) 서열 QNVGTN(SEQ ID NO:4)로 이루어지는 CDR1-L; 및
서열 SAS로 이루어지는 CDR2-L; 및
서열 QQYNSYPLYT(SEQ ID NO:6) 또는 QQYNNYPLYT(SEQ ID NO:18)으로 이루어지는 CDR3-L을 포함한다.
일 구현예에 따르면, CDR2-H는 서열 ISSGGSYI(SEQ ID NO:2) 또는 ISSGGDT(SEQ ID NO:14)로 이루어진다.
일 구현예에 따르면, CDR2-H는 서열 ISSGGSYI(SEQ ID NO:2)로 이루어지고, CDR3-H는 서열 ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO:3)으로 이루어진다.
일 구현예에 따르면, CDR2-H는 ISSGGDT(SEQ ID NO:14)로 이루어지고, CDR3-H는 서열 ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO:15)로 이루어진다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체는 소위 항-CEACAM5 항체들 MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4 및 MAb5 중 하나의 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열들을 포함한다.
따라서, 본 발명은
a) 서열 GFTFSSYA(SEQ ID NO:1) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:1과 상이한 서열의 CDR1-H; 서열 ISSGGSYI(SEQ ID NO:2) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:2와 상이한 서열의 CDR2-H; 서열 ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:3과 상이한 서열의 CDR3-H; 서열 QNVGTN(SEQ ID NO:4) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:4와 상이한 서열의 CDR1-L; 서열 SAS 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SAS와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 QQYNSYPLYT(SEQ ID NO:6) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:6과 상이한 서열의 CDR3-L; 또는
b) 서열 GFVFSSYD(SEQ ID NO:7) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:7과 상이한 서열의 CDR1-H; 서열 ISSGGGIT(SEQ ID NO:8) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:8과 상이한 서열의 CDR2-H; 서열 AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:9) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:9와 상이한 서열의 CDR3-H; 서열 ENIFSY(SEQ ID NO:10) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:10과 상이한 서열의 CDR1-L; 서열 NTK 또는 NTR 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 NTK 또는 NTR과 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:12) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:12와 상이한 서열의 CDR3-L; 또는
c) 서열 GFTFSRYA(SEQ ID NO:13) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:13과 상이한 서열의 CDR1-H; 서열 ISSGGDT(SEQ ID NO:14) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:14와 상이한 서열의 CDR2-H; 서열 ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO:15) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:15와 상이한 서열의 CDR3-H; 서열 QNVGTN(SEQ ID NO:16) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:16과 상이한 서열의 CDR1-L; 서열 SAS 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SAS와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 QQYNNYPLYT(SEQ ID NO:18) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:18과 상이한 서열의 CDR3-L; 또는
d) 서열 GFTFSSYD(SEQ ID NO:19) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:19와 상이한 서열의 CDR1-H; 서열 ISSYGGRT(SEQ ID NO:20) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:20과 상이한 서열의 CDR2-H; 서열 AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO:21) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:21과 상이한 서열의 CDR3-H; 서열 ENIYSY(SEQ ID NO:22) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:22와 상이한 서열의 CDR1-L; 서열 NAK 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 NAK와 상이한 서열의 CDR2-L 및 서열 QHHYGIPFT(SEQ ID NO:24) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:24와 상이한 서열의 CDR3-L;를 포함하는 항체 또는
e) 서열 GFAFSSYD(SEQ ID NO:25) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:25와 상이한 서열의 CDR1-H; 서열 INSGGGIT(SEQ ID NO:26) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:26과 상이한 서열의 CDR2-H; 서열 TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:27) 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:27과 상이한 서열의 CDR3-H; 서열 ENIYSY(SEQ ID NO:28) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:28과 상이한 서열의 CDR1-L; 서열 NAK 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 NAK와 상이한 서열의 CDR2-L; 및 서열 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:30) 또는 하나의 아미노산 치환에 의해 SEQ ID NO:30과 상이한 서열의 CDR3-L을 포함하는 항체에 관한 것이다.
위의 CDR 서열들 중 하나 이상에서, 하나 이상의 개별적인 아미노산이 치환에 의해, 특히 보존적 치환에 의해 변경될 수 있다. 그러한 변경은 예를 들어, 항체의 인간화와 함께, 당화 자리 또는 탈아미드화 자리를 제거하기 위한 것일 수 있다.
MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5의 VH 및 VL 부위들의 서열들의 정렬 결과를 기초로 하여, 그리고 MAb2 항체의 변이형의 단일 산 치환을 기초로 하여, 아미노산은
- CDR1-H에서: 1 내지 6번 위치 중 하나 이상에서, 예를 들어, 서열 GFVFSSYD(SEQ ID NO:7), GFTFSSYD(SEQ ID NO:19) 또는 GFAFSSYD(SEQ ID NO:25)의 CDR1-H의 3번 위치에서, 또는 서열 GFTFSSYA(SEQ ID NO:1) 또는 GFTFSRYA(SEQ ID NO:13)의 CDR1-H의 6번 위치에서; 및/또는
- CDR2-H에서, 하나 이상의 임의의 위치에서, 또는 서열 ISSGGGIT(SEQ ID NO:8), ISSYGGRT(SEQ ID NO:20) 또는 INSGGGIT(SEQ ID NO:26)의 CDR2-H의 2번, 4번 및 7번 위치들 중 하나, 둘 또는 셋에서, 또는 서열 ISSGGSYI(SEQ ID NO:2) 또는 ISSGGDT(SEQ ID NO:14)의 CDR2-H의 6번, 7번 및 8번 위치 중 하나, 둘, 또는 셋에서(여기서, 이러한 서열은 8개 아미노산 길이이다); 및/또는 위 참조
- CDR3-H에서, 1번, 7번, 8번, 11번 및 13번 위치 중 하나 이상에서, 예를 들어, 서열 AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO:21), 또는 TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:27)의 CDR3-H의 1번 및 7번 위치 중 하나 또는 둘에서, 또는 서열 ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO:3) 또는 ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO:15)의 3번, 4번, 7번, 8번, 9번, 10번, 또는 11번 위치에서; 및/또는
- CDR1-L에서, 1 내지 5번 위치 중 하나 이상에서, 특히 서열 ENIFSY(SEQ ID NO:10) 또는 ENIYSY(SEQ ID NO:28)의 CDR1-L의 1, 2, 3 및 5번 위치들 중 하나 이상에서 또는 4번 위치에서; 및/또는
- CDR2-L에서, 서열 NAK, NTK 또는 NTR의 2번 및/또는 3번 위치에서, 특히 K가 존재한다면 적어도 3번 위치에서. 그러한 경우, 예를 들어, R은 CDR2-L의 3번 위치에서 K에 대해 치환될 수 있다; 및/또는
- CDR3-L에서, 1번, 2번, 5번, 6번, 8번 및 9번 중 하나 이상에서, 예를 들어, 서열 QHHYGIPFT(SEQ ID NO:24) 또는 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:30)의 CDR3-L의 6번 위치에서, 또는 서열 QQYNSYPLYT(SEQ ID NO:6) 또는 QQYNNYPLYT(SEQ ID NO:18)의 CDR3-L의 5번 위치에서 치환될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체에서,
- 서열 AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO:21), 또는 TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:27)의 CDR3-H의 5번 위치; 및/또는
- 서열 ENIFSY(SEQ ID NO:10) 또는 ENIYSY(SEQ ID NO:28)의 CDR1-L의 6번 위치; 및/또는
- 서열 QHHYGIPFT(SEQ ID NO:24) 또는 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:30)의 CDR3-L의 3번 위치는 변경되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 서열 GFVFSSYD(SEQ ID NO:7), GFTFSSYD(SEQ ID NO:19) 또는 GFAFSSYD(SEQ ID NO:25)의 CDR1-H에서, CDR1-H의 3번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 T, A 또는 V로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 따르면, 서열 GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) or GFTFSRYA (SEQ ID NO:13)의 CDR1-H에서, CDR1-H의 6번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 R 또는 S이다.
일 구현예에 따르면, 서열 AAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY(SEQ ID NO:21), 또는 TAHYFGSSGPFAY(SEQ ID NO:27)의 CDR3-H에서, CDR3-H의 1번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 A 또는 T이고/이거나, CDR3-H의 7번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 T 또는 S이다.
일 구현예에 따르면, 서열 ARPAYYGNPAMDY(SEQ ID NO:3) 또는 ARVNYYDSSFLDW(SEQ ID NO:15)의 CDR3-H에서, CDR3-H의 3번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 V 또는 P, 4번 위치는 A 또는 N, 7번 위치는 D 또는 G, 8번 위치는 S 또는 N, 9번 위치는 S 또는 P, 10번 위치는 F 또는 A, 또는 11번 위치는 W 또는 Y이다.
일 구현예에 따르면, CDR1-L의 4번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 Y 또는 F이다.
일 구현예에 따르면, 서열 NAK, NTK 또는 NTR의 CDR2-L에서, CDR2-L의 2번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 A 또는 T이다.
일 구현예에 따르면, 서열 QQYNSYPLYT(SEQ ID NO:6) 또는 QQYNNYPLYT(SEQ ID NO:18)의 CDR3-L에서, CDR3-L의 5번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 N 또는 S이다.
일 구현예에 따르면, 서열 QHHYGIPFT(SEQ ID NO:24) 또는 QHHYGTPFT(SEQ ID NO:30)의 CDR3-L에서, CDR3-L의 6번 위치의 아미노산에 대해 치환되는 아미노산은 I 또는 T이다.
위의 구현예들의 임의의 조합은 본 발명의 일부분을 이룬다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 통상적인 단일클론성 항체와 같은 통상적인 항체, 또는 항체 단편, 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG 또는 이의 단편을 포함하거나 그것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 다섯 개의 소위 항-CEACAM5 항체들 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 중 하나의 적어도 중쇄의 가변 도메인 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 더 포함하는, 위에 정의된 항체들을 제공한다.
따라서, 본 발명의 구현예는
a) 서열 SEQ ID NO:31 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 SEQ ID NO:32의 경쇄 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 가변 도메인; 또는
b) 서열 SEQ ID NO:33 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 SEQ ID NO:34 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
c) 서열 SEQ ID NO:35 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 SEQ ID NO:36 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
d) 서열 SEQ ID NO:37 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 SEQ ID NO:38 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인; 또는
e) 서열 SEQ ID NO:39 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄의 가변 도메인 및/또는 서열 SEQ ID NO:40 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 서열은 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해, 특히 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(들) 및/또는 정준(canonical) 잔기들로의 치환(들)에 의해, 적절히, 참조 서열 SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40과는 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인의 서열은 오로지 보존적 아미노산 치환(들)에 의해 참조 서열 SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40과 상이할 수 있다.
서열 SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40과 비교할 때의 서열 변경은 프레임워크 부위 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H 중 하나 이상에 기본적으로 존재할 것이다.
그러나 하나 이상의 CDR에서의 아미노산 치환 또한 가능하다. 일 구현예에서, 경쇄의 가변 도메인의 서열은 SEQ ID NO:34의 (CDR2-L에서) 52번 위치에서 적어도 K의 R로의 치환에 의해 서열 SEQ ID NO:34와 상이할 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 각각 쥐 항체 및 쥐 항체의 단편일 수 있다.
이러한 항체는 또한 키메라 항체일 수 있고, 일 구현예에서는 쥐/인간 항체, 예컨대, 중쇄 및 경쇄의 쥐 가변 도메인 및 인간 항체로부터의 CH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 항체일 수 있다. 폴리펩티드는 이러한 항체의 단편일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는
a) 서열 SEQ ID NO:41 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 또는 SEQ ID NO:42 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(즉, 실시예 5에 기술된 바와 같이, chMAb1의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 항체; 또는,
b) 서열 SEQ ID NO:43 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 또는 SEQ ID NO:44 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄; (즉, 실시예 5에 기술된 바와 같이, chMAb2의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 항체; 또는,
c) 서열 SEQ ID NO:45 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 또는 SEQ ID NO:46 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄; (즉, 실시예 5에 기술된 바와 같이, chMAb3의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 항체; 또는,
d) 서열 SEQ ID NO:47 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 또는 SEQ ID NO:48 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄; (즉, 실시예 5에 기술된 바와 같이, chMAb4의 중쇄 및/또는 경쇄); 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 항체; 또는,
e) 서열 SEQ ID NO:49 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 또는 SEQ ID NO:50 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(즉, 실시예 5에 기술된 바와 같이, chMAb5의 중쇄 및/또는 경쇄), 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 키메라 항체 또는,
f) a), b), c), d) 또는 e)에서 정의된 키메라 항체의 단편이다.
이러한 항체는 또한 인간화 항체 또는 인간화 항체의 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 a), b), c), d), e) 또는 f)에서 위에서 정의된 키메라 항체들 중 임의의 것의 인간화로부터 기인할 수 있다.
항체 서열의 인간화를 위한 다수의 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633에 의한 리뷰 참조. 한 가지 흔히 사용되는 방법은 CDR 그래프팅, 또는 항체 재성형으로, 이는 공여체 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열들을 상이한 특이성의 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드로 그래프팅하는 것을 수반한다. CDR 그래프팅은 CDR이 그래프트된 비 인간 항체의 결합 특이성 및 친화도를 감소시킬 수 있고, 따라서 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 모항체의 결합 특이성 및 친화도를 유지하기 위하여 CDR 그래프트된 항체의 선택된 위치에 역돌연변이를 도입할 수 있다. 가능성 있는 역돌연변이를 위한 위치들의 확인은 문헌에서 및 항체 데이터베이스에서 이용 가능한 정보를 이용하여 수행할 수 있다. 역돌연변이를 위한 후보인 아미노산 잔기들은 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 것들이지만, 묻힌 잔기들 또는 낮은 정도의 표면 노출을 나타내는 잔기들은 보통은 변경되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 역돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기법은 재표면화(resurfacing)로, 여기서 비 인간 기원의 표면에 노출되지 않은 잔기들은 유지되지만, 표면 잔기들은 인간 잔기들로 변경된다. 또 다른 대안적인 기법은 "유도 선택(guided selection)"으로 알려져 있으며(Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), 쥐 항체로부터 에피토프 및 모항체의 결합 특성을 보존하는 완전 인간 항체를 도출하는 데 이용될 수 있다.
키메라 항체를 위해, 인간화는 전형적으로 가변 부위 서열들의 프레임워크 부위들의 변경을 수반한다.
CDR의 일부분인 아미노산 잔기들은 전형적으로 인간화와 관련되어 변경되지 않을 것이지만, 특정한 경우에 개별적인 CDR 아미노산 잔기들을 변경하는 것이, 예를 들어, 당화 자리, 탈아미드화 자리 또는 원치 않는 시스테인 잔기를 제거하기 위하여, 바람직할 수 있다. N 결합 당화는 올리고당 사슬을 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr의 아스파라긴 잔기에 부착시킴으로써 일어나며, 여기서 X는 Pro을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N 당화 자리의 제거는 예를 들어, 보존적 치환에 의해, Asn 또는 Ser/Thr 잔기 중 어느 하나를 상이한 잔기로 돌연변이시켜 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기들의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자들에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기들은 주로 서열 Asn-Gly, 그리고 더 적은 정도로 Asn-Ala와 같은 다른 디펩티드 서열에 존재할 때, 특히 탈아미드화에 약하다. 따라서, 그러한 탈아미드화 자리, 예를 들어, Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 전형적으로, 연루된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적인 치환에 의해, 그러한 자리를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 연루된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 CDR 서열에서의 치환 또한 본 발명에 의해 포괄되도록 의도된다.
소위 "항체 MAb2"를 예로 들면, 인간화 항체 또는 이의 단편은 가변 중쇄에 다음과 같은 돌연변이들을 포함할 수 있다: 9번 위치의 G 대신 P; 및/또는 10번 위치의 V 대신 G; 및/또는 19번 위치의 K 대신 S; 및/또는 43번 위치의 K 대신 R; 및/또는 44번 위치의 R 대신 G; 및/또는 60번 위치의 F 대신 A; 및/또는 62번 위치의 D 대신 S; 및/또는 65번 위치의 Q 대신 K; 및/또는 87번 위치의 K 대신 T; 및/또는 89번 위치의 I 대신 V; 및/또는 113번 위치의 A 대신 S; 위치들은 SEQ ID NO:33을 참조하여 제공하였다.
또한, 소위 "항체 MAb2"를 예로 들면, 인간화 항체 또는 이의 단편은 가변 경쇄에 다음과 같은 돌연변이들을 포함할 수 있다: 17번 위치의 E 대신 D; 및/또는 18번 위치의 T 대신 R; 및/또는 40번 위치의 Q 대신 P; 및/또는 45번 위치의 Q 대신 K; 및/또는 52번 위치의 K 대신 R; 및/또는 70번 위치의 Q 대신 D; 및/또는 74번 위치의 K 대신 T; 및/또는 76번 위치의 N 대신 S; 및/또는 84번 위치의 G 대신 A; 및/또는 85번 위치의 S 대신 T; 위치들은 SEQ ID NO:34를 참조하여 제공하였다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음과 같은 돌연변이들을 포함하는 중쇄를 포함하거나 이로 이루어지는 인간화 항체, 이때, 위치들은 SEQ ID NO:33을 참조하여 제공하였다:
a) 9번 위치의 G 대신 P; 그리고 10번 위치의 V 대신 G; 그리고 19번 위치의 K 대신 S; 그리고 43번 위치의 K 대신 R; 그리고 62번 위치의 D 대신 S; 그리고 65번 위치의 Q 대신 K; 그리고 87번 위치의 K 대신 T; 또는
b) 9번 위치의 G 대신 P; 그리고 10번 위치의 V 대신 G; 그리고 19번 위치의 K 대신 S; 그리고 43번 위치의 K 대신 R; 그리고 44번 위치의 R 대신 G; 그리고 60번 위치의 F 대신 A; 그리고 62번 위치의 D 대신 S; 그리고 65번 위치의 Q 대신 K; 그리고 87번 위치의 K 대신 T; 및 89번 위치의 I 대신 V; 그리고 113번 위치의 A 대신 S; 및/또는
다음과 같은 돌연변이들을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체이다. 이때, 위치들은 SEQ ID NO:34를 참조하여 제공하였다:
c) 17번 위치의 E 대신 D; 그리고 40번 위치의 Q 대신 P; 그리고 45번 위치의 Q 대신 K; 그리고 74번 위치의 K 대신 T; 그리고 76번 위치의 N 대신 S; 또는
d) 17번 위치의 E 대신 D; 그리고 18번 위치의 T 대신 R; 그리고 40번 위치의 Q 대신 P; 그리고 45번 위치의 Q 대신 K; 그리고 70번 위치의 Q 대신 D; 그리고 74번 위치의 K 대신 T; 그리고 76번 위치의 N 대신 S; 그리고 84번 위치의 G 대신 A; 그리고 85번 위치의 S 대신 T; 또는
e) 17번 위치의 E 대신 D; 그리고 18번 위치의 T 대신 R; 그리고 40번 위치의 Q 대신 P; 그리고 45번 위치의 Q 대신 K; 그리고 52번 위치의 K 대신 R; 그리고 70번 위치의 Q 대신 D; 그리고 74번 위치의 K 대신 T; 그리고 76번 위치의 N 대신 S; 그리고 84번 위치의 G 대신 A; 그리고 85번 위치의 S 대신 T.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 항체의 CDR들을 대안적인 항체 프레임워크 부위로, 더욱 구체적으로는 인간 프레임워크 부위들로 그래프팅시켜 얻어진 인간화 항체이다. MAb2를 예로 들면, MAb2K52R의 6개 CDR을 IGHV3-23 및 IGKV1D-39 유전자들로 이루어지는 인간 프레임워크로 그래프팅시켰고, VL(SEQ ID NO. 34)의 34번 및 53번 위치와 VH(SEQ ID NO. 33)의 50번 위치에 상응하는 3개의 역돌연변이들을 도입하여 그 결과 서열 SEQ ID NO:74의 중쇄의 가변 도메인 및 서열 SEQ ID NO:75의 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 얻었다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO: 74, 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄; 및/또는 서열 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO: 75 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄(MAb2의 중쇄 및 경쇄의 인간화 가변 도메인들)를 포함하거나 이로 이루어지는 인간화 항체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 SEQ ID NO:51 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:17 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄, 또는 서열 SEQ ID NO:5 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:23 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄, 또는 서열 SEQ ID NO:5 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:29 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄, 또는 서열 SEQ ID NO:51 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:55 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄, 또는 서열 SEQ ID NO:74 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:75 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체이다.
상기 인간화 항체 또는 이의 단편에서, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 인간 수령체 프레임워크 부위를 포함할 수 있다. 이러한 인간화 항체는, 인간 불변 중쇄 및 경쇄 도메인들이 존재할 경우, 이들을 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 huMAb2-3 또는 이의 변이형, 즉, 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인과 결합하는 분리된 항체로서, 이는
a) 서열 SEQ ID NO:87 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열로 이루어지는 중쇄; 또는
b) 서열 SEQ ID NO:88 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열로 이루어지는 경쇄 또는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 huMAb2-4(MAb2_VL1d VH1-IgG1) 또는 이의 변이형, 즉, 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인과 결합하는 분리된 항체로서, 이는
c) 서열 SEQ ID NO:89 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열로 이루어지는 중쇄; 및/또는
d) 서열 SEQ ID NO:90 또는 이에 대해 적어도 85% 동일한 서열로 이루어지는 경쇄를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 단일 도메인 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 단일 도메인 항체 단편은 위에 기술된 항체들의 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H를 포함하는 가변 중쇄(VHH)로 이루어질 수 있다. 이러한 항체는 또한 중쇄 항체, 즉, 경쇄가 없는 항체일 수 있으며, 이는 CH1 도메인을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다.
또한, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 낙타과의 단일 도메인 항체의 프레임워크 부위 및 선택적으로 낙타과의 단일 도메인 항체의 불변 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 및 디아바디로 이루어지는 군으로부터 선택된, 항체 단편, 예를 들어, 인간화 항체 단편일 수 있다.
또한, 이러한 항체는 항체 단편들로부터 형성된 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있으며, 적어도 하나의 항체 단편은 본 발명에 따른 항체 단편이다. 다중특이적 항체들은 예를 들어, EP 2 050 764 A1 또는 US 2005/0003403 A1에 기술된 다가 단백질 복합체이다.
본 발명에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 항체들은 (a) 소위 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 항체들 중 하나에 의해 표적화된 인간/필리핀 원숭이 CEACAM5 상의 A3-B3 에피토프 및 (b) 적어도 하나의 다른 항원에 대해 특이성을 나타낼 수 있다. 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 다른 항원은 인간 또는 필리핀 원숭이 CEACAM 패밀리 구성원이 아니고, 일 구현예에서는, 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM1, 인간 및 원숭이 CEACAM6, 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM7 및 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM8 중 적어도 하나 또는 전부가 아니다. 또 다른 구현예에 따르면, 적어도 하나의 다른 항원은 소위 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 항체들 중 하나에 의해 표적화된 상기 A3-B3 에피토프 이외의, 인간 필리핀 원숭이 CEACAM5 상의 에피토프일 수 있다.
상기 항체들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 임의의 기법에 의해 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항체들은 이하에 기술된 기법으로 생산된다. 본 발명에 따른 항체 및 이의 단편들은 분리된(예컨대, 정제된) 형태로 이용될 수 있거나, 막 또는 지질 소포체(예컨대, 리포좀)와 같은 벡터에 함유될 수 있다.
핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
본 발명의 추가적인 대상은 위에 정의된 본 발명의 항체를 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 서열에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RAN 분자로서, 이는 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적절한 벡터에 포함될 수 있다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질 전환시켜 도입시킨 서열의 발현(예컨대, 전사 및 번역)을 촉진하기 위하여 DNA 또는 RNA 서열(예컨대, 외래 유전자)이 숙주 세포로 도입될 수 있게 하는 전달 매체를 의미한다.
따라서, 본 발명의 추가적인 대상은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
그러한 벡터는 대상자에 투여 시 상기 폴리펩티드의 직접적인 발현을 유발하기 위하여 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포를 위한 발현 벡터에 이용되는 프로모터 및 인핸서의 예로는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami T. et al. 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y et al. 1987), 면역 글로불린 H의 프로모터(Mason JO et al. 1985) 및 인핸서(Gillies SD et al. 1983) 등을 포함한다.
동물 세포를 위한 발현 벡터는 인간 항체 C 부위를 암호화하는 유전자가 삽입되어 발현될 수만 있다면 임의의 것이 이용될 수 있다. 적절한 벡터의 예로는 pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등을 포함한다.
플라스미드의 다른 예로는 복제 원점을 포함하는 복제 플라스미드 또는 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 삽입 플라스미드(integrative plasmid)를 포함한다.
바이러스 벡터의 다른 예로는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 패키징 세포를 형질감염시킴으로써 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 이용한 일시적인 형질감염에 의한 것과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 기법에 의해 생산될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 그러한 복제 결함 재조합 바이러스를 생산하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어, WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 추가적인 대상은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질 전환된 세포에 관한 것이다.
용어 "형질 전환"은 "외래"(즉, 외인성) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포로 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 부호화된 단백질 또는 효소를 생산하도록 하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아들이고 발현하는 숙주 세포는 "형질 전환되었다".
본 발명의 핵산은 적절한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 항체를 생산하는 데에 이용될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은 예컨대, 벡터에 의해 전달된 외래 DNA에 의해 부호화되고 숙주 세포로 도입된 단백질의 발현을 위한, 숙주 세포 및 적절한 조건 하에서 양립 가능한 벡터를 의미한다.
흔한 발현 시스템으로는 대장균 숙주 세포와 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포와 배큘로바이러스 벡터 및 포유동물 숙주 세포와 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예로는 (세균과 같은) 원핵 세포 및 (효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등과 같은) 진핵 세포를 제한 없이 포함한다. 구체적인 예로는 대장균, 클루이베로마이세스 또는 사카로미세스 효모, 포유동물 세포주(예컨대, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)뿐만 아니라, (예컨대, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등으로부터 생산된) 초대 또는 확립된 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 또한, 예로는 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(이하 "DHFR 유전자"라 지칭함)가 결여된 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 랫트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"라 지칭함) 등을 포함한다. 일 구현예에서, YB2/0 세포가 이용되는데, 이는 이 세포에서 발현될 때 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 증진되기 때문이다.
인간화 항체의 발현을 위해, 발현 벡터는 항체 중쇄를 암호화하는 유전자 및 항체 경쇄를 암호화하는 유전자가 별도의 벡터 상에 존재하는 유형 또는 두 유전자들이 동일한 벡터에 존재하는 유형(탠덤형) 중 어느 하나일 수 있다. 인간화 항체 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 사이의 균형에 있어서는, 인간화 항체 발현 벡터는 탠덤형이다(Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3;167(1-2):271-8). 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예로는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 위에 기술된 재조합 핵산 또는 벡터를 수용성(competent) 세포로 시험관 내 또는 생체 외 도입하기, (ii) 얻어진 재조합 숙주 세포를 시험관 내 또는 생체 외 배양하기 및 (iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현 및/또는 분비하는 세포를 선택하기로 이루어지는 단계들을 포함한다.
이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체의 생산에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 생산 방법
본 발명의 항체는 제한 없이, 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기법과 같은, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법에 의해, 단독으로 또는 조합하여, 생산될 수 있다.
원하는 서열의 아미노산 서열을 앎으로써, 당업자는 폴리펩티드 생산을 위한 일반 기법에 의해, 상기 항체 또는 면역 글로불린 사슬을 용이하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 그것들은 상업적으로 이용 가능한 (미국 캘리포니아 주 포스터시티의 어플라이드 바이오시스템즈가 제조한 것과 같은) 펩티드 합성 기구를 이용하고, 제조업체의 설명서에 따라, 잘 알려져 있는 고체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 면역 글로불린 사슬은 당해 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 재조합 DNA 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들 단편들은 원하는 (폴리)펩티드를 암호화하는 DNA 서열들을 발현 벡터에 도입하고, 원하는 폴리펩티드를 발현할 적절한 진핵 또는 원핵 숙주로 그러한 벡터들을 도입한 후, DNA 발현 생성물로서 획득할 수 있으며, 그것들은 나중에 숙주로부터 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 (i) 본 발명에 따라 형질 전환된 세포를 배양하기; (ii) 상기 항체 또는 폴리펩티드를 발현시키기; 및 (iii) 발현된 항체 또는 폴리펩티드를 회수하기로 이루어지는 단계들을 포함한다.
본 발명의 항체들은 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피와 같은, 통상적인 면역 글로불린 정제 절차에 의해, 배양 배지로부터 적절하게 분리된다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간화 키메라 항체는 이전에 기술된 바와 같이 인간화 VL 및 VH 도메인들을 암호화하는 핵산 서열을 획득하고, 그것들을 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 암호화하는 유전자들이 있는 동물 세포용 발현 벡터로 삽입하여 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 발현 벡터를 동물 세포로 도입하여 부호화 서열을 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
인간 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 그것은 인간 면역 글로불린 중쇄에 속하는 임의의 부위일 수 있지만, IgG 부류의 것들이 적합하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은, IgG 부류에 속하는 하위 부류 중 임의의 하나가 이용될 수도 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL로서, 그것은 인간 면역 글로불린 경쇄에 속하는 임의의 부위일 수 있고, 카파 부류 또는 람다 부류의 것들이 이용될 수 있다.
인간화 또는 키메라 항체를 생산하는 방법은 통상적인 재조합 DNA를 수반하며, 유전자 형질감염 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(Morrison SL. et al. (1984) 및 특허 문헌 US5,202,238; 및 US5,204,244 참조).
통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 기초로 한 인간화 항체 생산방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예컨대, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985 참조). 항체는 예를 들어, 출원 WO2009/032661에 개시된 기법, CDR 그래프팅(EP 239,400; PCT 공개 WO91/09967; 미국 특허번호 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 재표면화(EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)) 및 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허번호 5,565,332)를 포함하는, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들을 이용하여 인간화될 수 있다. 그러한 항체의 제조를 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 공지되어 있다(유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 출원 WO 96/02576 참조).
본 발명의 Fab는 CEACAM5와 특이적으로 반응하는 항체를 파파인과 같은 단백질 가수분해효소로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 Fab는 항체의 Fab의 양 사슬을 암호화하는 DNA 서열들을 원핵 발현용 또는 진핵 발현용 벡터에 삽입하고, 이러한 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 CEACAM5와 특이적으로 반응하는 항체를 단백질 가수분해효소인 펩신으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 아래에 기술된 Fab'을 결합시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 Fab'은 CEACAM5와 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 디티오트레이톨과 같은 환원제로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이러한 Fab'는 항체의 Fab' 사슬을 암호화하는 DNA 서열들을 원핵 발현용 벡터 또는 진핵 발현용 벡터에 삽입하고, 이러한 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포에 도입하여 발현을 수행함으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 scFv는 이전에 기술된 CDR 또는 VH 및 VL 도메인들의 서열들을 취하여, scFv 단편을 암호화하는 DNA를 구축하고, 이러한 DNA를 원핵 또는 진핵 발현 벡터에 삽입한 다음, 이러한 발현 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 세포로 도입하여 scFv를 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 인간화 scFv 단편을 생성하기 위하여, CDR 그래프팅이라는 잘 알려져 있는 기술을 이용할 수 있는데, 이는 본 발명에 따른 상보성 결정 부위(CDR)를 선택하고, 그것들을 공지된 3차원 구조의 인간 scFv 단편 프레임워크 상에 그래프팅시키는 것을 수반한다(예컨대, W098/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494 참조).
본 발명의 항체의 변경
본 출원에 기술된 항체들의 아미노산 서열 변경(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 성질들을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 비 인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 단순히 그래프팅함으로써 인간화 항체가 생산될 때, 항원 결합 활성은 비 인간 동물로부터 유래된 본래의 항체의 항원 결합 활성과 비교할 때 감소될 수 있다고 알려져 있다. 비 인간 항체의 VH 및 VL의 몇몇 아미노산 잔기들은, CDR에서뿐만 아니라 FR에서도, 직접적으로 또는 간접적으로 항원 결합 활성과 관련이 있을 수 있다고 여겨진다. 따라서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR로부터 유래된 상이한 아미노산 잔기들로 이러한 아미노산 잔기들을 치환하면 결합 활성을 감소시킬 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 비 인간 CDR로 그래프팅된 인간 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열들 중에서 항체의 결합과 직접적으로 관련이 있는 아미노산 잔기, 또는 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 또는 항체의 3차원적 구조를 유지하는 아미노산 잔기 및 항원과의 결합과 직접적으로 관련이 있는 아미노산 잔기를 확인하려는 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 확인된 아미노산을 비 인간 동물로부터 유래된 본래의 항체의 아미노산 잔기들로 교체함으로써 증가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 쥐 항체의 여섯 개의 CDR 및 그 프레임워크로부터의 세 개의 아미노산을 인간 프레임워크에 그래프팅시켜, 서열 SEQ ID NO:74의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:75의 경쇄가 있는 인간화 항체 (MAb2_VLg5VHg2)를 얻었으며, 이는 인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 결합 특성을 유지하였다.
본 발명의 항체들의 구조 및 그것들을 암호화하는 DNA 서열들에 변화 및 변경이 이루어질 수 있으며, 또한 바람직한 특성을 나타내는 기능적인 항체 또는 폴리펩티드가 얻어질 수 있다.
폴리펩티드의 아미노산 서열들의 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 상호적인 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수친수 아미노산 지수가 단백질에 미치는 중요성은 일반적으로 당해 기술 분야에서 이해된다. 아미노산의 상대적인 소수친수 특징은 그 결과에 따른 단백질의 2차 구조에 기여하며, 결과적으로 이러한 단백질과 다른 분자들, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호 작용을 정의한다고 받아들여진다. 각각의 아미노산은 그것들의 소수성 및 전하 특성을 기초로 하여 소수친수 지수를 할당받았으며, 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
본 발명의 추가적인 대상은 또한 본 발명의 폴리펩티드들의 기능-보존적 변이형들을 포괄한다.
예를 들어, 특정 아미노산은 주목할 만한 활성의 손실 없이 단백질 구조에 있어서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호적 능력 및 속성은 그것의 생물학적 기능적 활성을 정의하므로, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열 내에서, 그리고 물론 그것의 서열을 암호화하는 DNA에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 유사한 성질을 나타내는 단백질을 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 서열들, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열들에서, 그것들의 생물학적 활성의 주목할 만한 손실 없이 다양한 변화들이 이루어질 수 있다고 예상된다.
특정 아미노산이 비슷한 소수친수 지수 또는 점수를 나타내는 다른 아미노산들로 치환될 수 있으며, 또한 비슷한 생물학적 활성을 나타내는 단백질을 초래할 수 있다는, 즉, 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 획득할 수 있다는 점은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드에서, 항원에 대한 결합의 유의미한 손실 없이 치환될 수 있는 모든 아미노산을 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 접근법과 같은 잘 확립된 기술들을 이용하는 것도 가능하다. 그러한 잔기들은 중성인 것으로 간주될 수 있는데, 그것들은 항원 결합 또는 항체의 구조 유지에 관여하지 않기 때문이다. 이러한 중성 위치들 중 하나 이상은 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 주요 특징들을 변경시키지 않고 알라닌 또는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
이것은 본 발명에서 MAb2K52R의 CDR에 행해진 알라닌 스캐닝 접근법에 의해 설명되었으며, 이는 이들 CDR 중 몇몇 위치들이 중성인 것으로 나타났음을 보여주는데, 이는 알라닌이 실제로 인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 결합에 유의미한 영향을 미치지 않고 치환될 수 있기 때문이다. 따라서, 그러한 중성 치환으로부터 얻어지는 항체 변이형들은 모항체와 기능적으로 동일하게 유지될 것으로 예상된다. 제공된 실시예 6.4에서, MAb2의 인간화 변이형에 치환이 이루어졌으나, MAb2, Mab4 또는 Mab5의 임의의 변이형으로 도입될 때에도, 동일한 변형이 생물학적 기능을 유지할 것으로 예상 가능하며, 이는 이러한 관련된 항체들이 모두 동일한 6개의 CDR 세트 또는 매우 밀접하게 관련된 것들을 수반하기 때문이다. 이러한 중성 위치들은 이러한 항체 패밀리의 VL 서열들(SEQ ID NO:34 또는 SEQ ID NO:38 또는 SEQ ID NO:40 또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:75)의 27번, 28번, 29번, 31번, 51번, 52번, 89번, 90번, 93번, 94번, 96번, 97번 잔기들 및 이러한 항체 패밀리의 VH 서열들(SEQ ID NO:33 또는 SEQ ID NO:37 또는 SEQ ID NO:39 또는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:51 또는 SEQ ID NO:74)의 26번 내지 31번, 51번 내지 58번, 97번, 103번, 104번, 107번, 109번 잔기들로 정의될 수 있다.
중성 위치들은 임의의 아미노산 치환이 Mab2, Mab4 또는 Mab5 CDR로 도입될 수 있는 위치들로서 볼 수 있다. 실제로, 알라닌 스캐닝 원칙에서, 알라닌이 선택되는데, 이 잔기는 특정한 구조적 또는 화학적 특징을 보유하지 않기 때문이다. 일반적으로, 알라닌이 단백질의 성질들을 바꾸지 않고 특정 아미노산에 대해 치환될 수 있다면, 전부는 아닐지라도 여러 다른 아미노산 치환들도 중성일 가능성이 높다고 인정되고 있다. 알라닌이 야생형 아미노산인 반대의 경우에, 특정한 치환이 중성으로 보여질 수 있다면, 다른 치환들도 중성일 가능성이 높다.
제공된 실시예 6.4에서, 알라닌 스캐닝의 맥락에서 중성인 것으로 밝혀지지 않은, Mab2, Mab4 또는 Mab5의 CDR의 네 개 위치들도 확인되었지만, 여기서 보존적 유형의 아미노산 치환은 중성 효과를 나타낸다(본 항체 패밀리의 VL 서열들의 잔기 30번과 92번 및 VH 서열들의 잔기 98번과 100번).
두 항체 사슬 서열들 중 임의의 또는 전부에서 상이한 위치들에서의 둘 이상의 중성 돌연변이는, 조합 시, 일반적으로, 모항체의 기능적인 활성을 기본적으로 유지하는 항체를 생산할 것으로도 예상된다. 이는 예를 들어, MAb2_VLg5VHg2에서 조합된 치환들 LC_T51A와 LC_T94A, VL_S31A와 VH_G54Y, 또는 VL_T53I와 VH_S53A로 설명된 바 있다.
따라서, 위에서 개략적으로 설명한 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 곁사슬 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그것들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 전술한 특징들 중 임의의 것을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌과 리신; 글루탐산과 아스파르트산; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신을 포함한다.
예컨대, 항체의 항원 의존적 세포 매개 세포 독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포 독성(CDC)을 증진시키기 위하여, 본 발명의 항체를 효과기 기능에 대하여 변경하는 것 또한 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 부위에 도입될 수 있는데, 이에 의해 이 부위에 사슬 내 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 하여 생성된 호모이량체 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 살해 및/또는 항체 의존적 세포성 세포 독성(ADCC)을 나타낼 수 있다(Caron PC. et al. 1992; and Shopes B. 1992).
본 발명의 항체의 다른 유형의 아미노산 변경은, 즉, 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 자리를 추가함으로써, 항체의 본래의 당화 패턴을 바꾸는 데에 유용할 수 있다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다) 중 어느 하나의 존재는 가능성 있는 당화 자리를 생성한다. 항체에 대한 당화 자리의 추가 또는 제거는 아미노산 서열이 위에 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록(N 결합 당화 자리) 아미노산 서열을 바꿈으로써 편리하게 달성된다.
또 다른 유형의 변경은 잠재적으로 분해 생성물 또는 항체 제제의 이질성을 초래하므로 인실리코(in silico) 또는 실험적으로, 확인된 서열들의 제거를 수반한다. 예로써, pH 및 표면 노출과 같은 인자들에 따라 아스파라긴 및 글루타민 잔기들의 탈아미드화가 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기들은 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 특히 탈아미드화에 약하고, Asn-Ala와 같은 다른 디펩티드 서열에서는 더 낮은 정도로 탈아미드화에 약하다. 따라서, 그러한 탈아미드화 자리, 특히 Asn-Gly이 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드에 존재할 때, 전형적으로 보존적 치환에 의해 이러한 자리를 제거하여 관련된 잔기들 중 하나를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 관련된 잔기들 중 하나 이상을 제거하기 위한 서열에서의 그러한 치환 또한 본 발명에 의해 포괄되도록 의도된다.
또 다른 유형의 공유적 변경은 항체에 대해 화학적으로 또는 효소적으로 글리코시드를 결합시키는 것을 수반한다. 이러한 절차는 N- 또는 O-결합 당화를 위하여 당화 능력이 있는 숙주 세포에서 항체를 생산할 것을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 결합 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프히드릴 기, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 그것들과 같은 유리 하이드록실 기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 그것들과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 WO87/05330에 기술되어 있다.
항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 항체를 트리플루오로메탄설폰산 화합물 또는 균등한 화합물에 노출시킬 것을 요구한다. 이러한 처리는 항체는 온전하게 두면서, 연결하는 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고는 대부분의 또는 모든 당들의 절단을 가져온다. 화학적 탈당화는 Sojahr H. 등(1987) 및 Edge, AS. 등(1981)에 의해 기술된 바 있다. 항체의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura, NR. 등(1987)이 기술한 바와 같이, 다양한 엔도- 및 엑소글리코시다아제를 이용하여 달성될 수 있다.
또 다른 유형의 항체의 공유적 변경은 항체를 다양한 비 단백질성 고분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 미국 특허번호 4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 연결하는 것을 포함한다.
면역접합체
본 발명은 또한 세포 독성 접합체, 또는 면역접합체, 또는 항체 약물 접합체, 또는 접합체를 포함한다. 본 출원에 사용된 모든 이러한 용어들은 동일한 의미를 나타내며 서로 교체 가능하다.
쥐 항체들 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, 및 MAb5을 SPDB 링커(N-석신이미딜 피리딜디티오부티레이트)를 통해 메이탄시노이드(DM4)에 접합시켰다. 그에 따른 항체-약물-접합체(ADC)는 MKN45 인간 위암 세포에 대해 IC50 값 ≤ 1 nM로 세포 독성 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
유사하게, 각각의 MAb1, MAb2, MAb4 및 MAb5의 키메라 형태를 기초로 하여 항체-SPDB-DM4 접합체를 제조하였다. 그에 따른 chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb3-SPDB-DM4 및 chMAb4-SPDB-DM4를 암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 두 가지 용량으로 평가하였다. 각각의 처리군과 대조군에 대해 종양 부피의 변화 및 종양 퇴화 %를 분석한 결과, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-DM4 및 chMAb5-SPDB-DM4는 적어도 분석했던 최고 농도에서 매우 활성이 있었고, chMAb2-SPDB-DM4는 분석했던 두 가지 용량 모두에서 활성을 나타냈다. 주목할 만하게도 최대 82%의 종양 퇴화 퍼센티지가 얻어졌다.
MAb2의 변이형(huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4 및 huMAb2-3-SPDB-DM4)을 이용하여 항체-SPDB-DM4 접합체도 제조하였다. MAb2의 키메라(chMAb2-SPDB-DM4) 또는 인간화 변이형을 포함하는 ADC를 MKN45 세포에 대한 세포 독성 활성에 대해 관련 없는 항체-SPDB-DM4와 비교하였다. MAb2의 모든 키메라 및 인간화 변이형들의 ADC는 IC50 값 ≤ 1 nM, 즉, 관련 없는 DM4 접합체의 측정된 세포 독성 활성보다 53배 내지 35배 낮은 IC50 값을 나타내어, 항-CEACAM5 접합체의 CEACAM5 매개성 세포 독성 활성임을 보여주었다.
huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-4-SPDB-DM4의 항종양 활성을 평가하고, 암컷 CD-1 누드 마우스에 피하 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 chMAb2-SPDB-DM4와 비교하였다. 모든 접합체들이 분석한 최고 용량(10 mg/kg)에서 매우 활성이 높았다.
huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-3-설포-SPDB-DM4의 항종양 활성을 추가로 암컷 SCID 마우스에 피하로 이식한 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 평가하였다. huMAb2-3-SPDB-DM4는 5 및 2.5 mg/kg에서 활성을 나타냈고, huMAb2-3-설포-SPDB-DM4는 5 mg/kg에서 높은 활성을 나타냈으며, 2.5 mg/kg에서 활성을 나타냈다.
huMAb2-3-SPDB-DM4의 항종양 활성을 추가로 암컷 SCID 마우스에 피하로 이식한 측정 가능한 원발성 폐 LUN-NIC-0014 종양에 대해 평가하였고, 10 및 5 mg/kg에서 활성이 매우 높은 것으로 나타났다.
각각의 DM4 접합체는 평균 2 내지 5 범위의 DM4 분자 수(또는 "약물 대 항체 비율" 또는 "DAR")를 포함하였다.
따라서, 본 발명은 세포독성제 또는 방사성 동위원소와 같은 적어도 하나의 성장 저해제에 연결된 또는 접합된, 본 발명의 항체를 포함하는 "면역접합체"에 관한 것이다.
차별 없이 이용될 수 있는 "성장 저해제" 또는 "항증식제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양 세포의 성장을 저해하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본 출원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해하거나 억제 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 용어 "세포독성제"는 화학치료제, 효소, 항생제 및 소분자 독소 또는 단편 및/또는 변이형을 포함하는, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성을 나타내는 독소와 같은 독소 및 아래에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한 것이다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 탁소이드, 일일초(vincas), DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체, 작은 약물, 토메이마이신(tomaymycin) 또는 피롤로벤조디아제핀 유도체, 크립토피신 유도체, 렙토마이신 유도체, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 유사체, 전구약물, 토포이성질화효소 II 저해제, DNA 알킬화제, 항튜불린제, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다.
본 출원에 사용된 "메이탄시노이드"는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체를 가리킨다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 저해하는 약물로서, 포유동물 세포에 독성이 매우 강하다.
적절한 메이탄시노이드의 예로는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 포함한다.
적절한 메이탄시놀 유사체의 예는 변경된 방향족 고리를 가지고 있는 것들 및 다른 위치가 변경된 것들을 포함한다. 이러한 적절한 메이탄시노이드는 미국 특허번호 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545에 개시되어 있다.
변경된 방향족 고리가 있는 메이탄시놀의 적절한 유사체들의 구체적인 예로는
(1) C-19-데클로로(미국 특허번호 4,256,746)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨);
(2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허번호 4,361,650 및 4,307,016)(스트렙토미세스 또는 액티노미세스를 이용한 탈메틸화 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및
(3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허번호 4,294,757)(염화아실을 이용한 아실화에 의해 제조됨)을 포함한다.
다른 위치에 변경이 있는 메이탄시놀의 적절한 유사체의 구체적인 예는
(1) C-9-SH(미국 특허번호 4,424,219)(메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨);
(2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허번호 4,331,598);
(3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허번호 4,450,254)(노카디아로부터 제조됨);
(4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허번호 4,364,866)(스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨);
(5) C-15-메톡시(미국 특허번호 4,313,946 및 4,315,929)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 분리됨);
(6) C-18-N-데메틸(미국 특허번호 4,362,663 및 4,322,348)(스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및
(7) 4,5-데옥시(미국 특허번호 4,371,533)(메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 세포독성 접합체는 세포독성제로서, 공식적으로 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신이라 지칭되는, 티올을 함유하는 메이탄시노이드(DM1)를 이용한다. DM1은 다음의 구조식 (I)로 표시된다:
[화학식 I]
Figure pat00003
.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포독성 접합체는 세포독성제로서, 공식적으로 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신이라 지칭되는, 티올을 함유하는 메이탄시노이드 DM4를 이용한다. DM4는 다음의 구조식 (II)로 표시된다:
[화학식 II]
Figure pat00004
.
본 발명의 추가적인 구현예에서, 황 원자를 보유하는, 탄소 원자 상에 모노- 또는 디-알킬 치환을 가지고 있는, 티올 및 이황화물을 함유하는 메이탄시노이드를 포함하는 기타 메이탄신이 이용될 수 있다. 이들은 가려진 설프하이드릴 기를 가지고 있는 아실 기가 있는 아실화된 아미노산 곁사슬을 C-3, C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시, 또는 C-20 데스메틸에 가지고 있는 메이탄시노이드를 포함하는데, 이때, 티올 기능기를 보유하는 아실 기의 탄소 원자는 하나 또는 두 개의 치환기를 가지고 있고, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 용액에 존재할 수 있는 1 내지 10개의 시약 및 임의의 응집체를 가지고 있는 선형 또는 가지형 알킬 또는 알케닐이다.
이러한 세포독성제 및 접합 방법의 예는 참조로써 포함된 출원 WO2008/010101에 추가적으로 제공된다.
용어 "방사성 동위원소"는 At211, Bi212, Er169, I131, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89 및 Lu의 방사성 동위원소들과 같은, 암을 치료하기에 적절한 방사성 동위원소를 포함하고자 한 것이다. 이러한 방사성 동위원소들은 일반적으로 주로 베타 방사선을 방출한다. 일 구현예에서, 이러한 방사성 동위원소는 알파 방출체 동위원소, 더욱 정확하게는 알파 방사선을 방출하는 토륨 227이다. 본 발명에 따른 면역접합체는 출원 WO2004/091668에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체들은 직접적으로 또는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 링커를 통해 적어도 하나의 성장 저해제에 공유적으로 부착된다.
본 출원에 사용된 "링커"는 폴리펩티드를 약물 모이어티에 공유적으로 부착시키는 공유결합 또는 원자들의 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다.
이러한 접합체들은 시험관 내 방법에 의해 제조될 수 있다. 약물 또는 전구약물을 항체에 연결하기 위하여, 연결기(linking group)가 이용된다. 적절한 연결기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이황화물 기, 티오에테르 기, 산에 불안정한 기, 빛에 불안정한 기, 펩티다아제에 불안정한 기 및 에스테라아제에 불안정한 기를 포함한다. 본 발명의 항체의 세포독성제 또는 성장 저해제와의 접합은 N-석신이미딜 피리딜디티오부티레이트(SPDB), 부탄산 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르(니트로-SPDB), 4-(피리딘-2-일디설파닐)-2-설포-부티르산(설포-SPDB), N-석신이미딜(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜 (N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), (디메틸 아디피미데이트 HCL과 같은) 이미도에스테르의 이중 기능성 유도체, (디석신이미딜 수버레이트와 같은) 활성 에스테르, (글루타르알데히드와 같은) 알데히드, (비스 (p-아지도벤조일)-헥산디아민과 같은) 비스-아지도 화합물, (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은) 비스-디아조늄 유도체, (톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같은) 디이소시아네이트 및 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은) 비스-활성 불소 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 이중 기능성 단백질 결합제를 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Vitetta 등(1987)에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소 표지된 1-이소티오시아네이토벤질 메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 핵종을 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다(WO 94/11026).
이러한 링커는 세포에서 세포독성제 또는 성장 저해제의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산에 불안정한 링커, 펩티다아제에 민감한 링커, 에스테라아제에 불안정한 링커, 빛에 불안정한 링커 또는 이황화물을 함유하는 링커(예컨대, 미국 특허번호 5,208,020 참조)가 이용될 수 있다. 이러한 링커는 일부 사례에서 더 우수한 내성을 가져올 수 있는 "절단 불가능한 링커"(예를 들어 SMCC 링커)일 수도 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 및 세포독성 또는 성장 저해성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 재조합 기법 또는 펩티드 합성법에 의해 만들어질 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나, 접합체의 원하는 성질들을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 암호화하는 부위에 의해 분리된, 접합체의 두 부분을 암호화하는 각각의 부위들을 포함할 수 있다.
전구약물(예컨대, 펩티딜 화학치료제, WO81/01145 참조)을 활성이 있는 항암제로 전환하는 전구약물 활성화 효소에 폴리펩티드를 접합시킴으로써(예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허번호 4,975,278 참조), 본 발명의 항체들은 의존성 효소 매개 전구약물 치료법(Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy)에도 이용될 수 있다. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분으로는 전구약물을 그것의 활성이 더 높은, 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소들로는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 알칼리 포스파타아제; 황산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 아릴설파타아제; 무독성 플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환하는 데 유용한 시토신 탈아미노효소; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한, 세라티아 단백질 분해효소, 서몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다아제 및 (카텝신 B 및 L과 같은) 카텝신과 같은 단백질 분해효소; D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환하는 데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제; 당화 전구약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한, O-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제와 같은 탄수화물 절단 효소; P-락탐으로 유도된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 P-락타마아제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도된 약물을 유리 약물로 전환하는 데 유용한 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제와 같은, 페니실린 아미다아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 효소들은 위에서 논의된 헤테로이중기능성 가교 시약을 이용하는 것과 같은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법들에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 공유적으로 결합될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 접합체에서, 성장 저해제는 메이탄시노이드이고, 일 구현예에서 DM1 또는 DM4이다.
상기 접합체에서, 이러한 항체는 연결기에 의해 상기 적어도 하나의 성장 저해제에 접합된다. 일 구현예에서, 상기 연결기는 SPDB, 설포-SPDB, 또는 SMCC와 같은 절단 가능한 또는 절단 불가능한 링커이다.
이러한 접합체는
i) 화학식 (III)의 항체-SPDB-DM4 접합체
[화학식 III]
Figure pat00005
;
ii) 화학식 (IV)의 항체-설포-SPDB-DM4 접합체
[화학식 IV]
Figure pat00006
; 및
iii) 화학식 (V)의 항체-SMCC-DM1 접합체
[화학식 V]
Figure pat00007
로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 구현예에서, 접합체에 포함된 항체는
i) 서열 SEQ ID NO:51의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:17의 경쇄를 포함하는 인간화 항체,
ii) 서열 SEQ ID NO:5의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 인간화 항체,
iii) 서열 SEQ ID NO:5의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:29의 경쇄를 포함하는 인간화 항체,
iv) 서열 SEQ ID NO:51의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:55의 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 이러한 접합체는 위에 정의된 화학식 (III), (IV) 또는 (V)의 접합체로서, 이때, 항체는 서열 SEQ ID NO:5의 중쇄 및 서열 SEQ ID NO:29의 경쇄를 포함하는 인간화 항체이다.
일반적으로, 이러한 접합체는
(i) 선택적으로 완충된 세포결합제(예컨대, 본 발명에 따른 항체)의 수용액을 링커 용액 및 세포독성 화합물 용액들과 접촉시키는 단계;
(ii) 그런 다음, (i) 단계에서 형성된 접합체를 반응하지 않은 세포결합제로부터 분리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다.
이러한 세포결합제의 수용액은 예컨대, 인산칼륨, 아세트산염, 시트르산염 또는 N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(Hepes 완충액)과 같은 완충액으로 완충될 수 있다. 이러한 완충액은 세포결합제의 속성에 따라 달라진다. 세포독성 화합물은 예컨대, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸아세트아미드(DMA)와 같은 유기 극성 용매 내의 용액이다.
반응 온도는 일반적으로 20 내지 40℃ 사이에 포함된다. 반응 시간은 1시간부터 24시간까지 다를 수 있다. 세포결합제와 세포독성제 사이의 반응은 굴절측정 및/또는 UV 검출기를 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 모니터링될 수 있다. 접합체 수율이 너무 낮은 경우, 반응 시간이 연장될 수 있다.
(ii) 단계의 분리를 수행하기 위하여 다수의 상이한 크로마토그래피법이 당업자에 의해 이용될 수 있다. 접합체는 예컨대, SEC, (이온 교환 크로마토그래피, IEC와 같은) 흡착 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피와 같은 혼합 지지체 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제될 수 있다. 투석 또는 정용여과에 의한 정제도 이용될 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "응집체"는 둘 이상의 세포결합제 사이에 형성될 수 있는 회합을 의미하며, 상기 세포결합제들은 접합에 의해 변경되거나 변경되지 않는다. 이러한 응집체는 용액 내의 고농도의 세포결합제, 용액의 pH, 높은 전단력, 결합된 이량체의 수 및 그것들의 소수성 특징, 온도와 같은 다수의 매개변수들의 영향 하에서 형성될 수 있다(Wang & Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311-316, 및 이에 인용된 참조문헌 참고). 이러한 매개변수들 중 일부의 상대적인 영향이 명확하게 확립되지 않았음에 주의해야 한다. 단백질 및 항체의 경우, 당업자는 Cromwell 등(2006, AAPS Jounal, 8(3): E572-E579)을 참조할 것이다. 응집체의 함유량은 SEC와 같이, 당업자에게 잘 알려져 있는 기법들로 결정될 수 있다(Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480 참조).
(i) 또는 (ii) 단계 후, 접합체를 함유하는 용액을 크로마토그래피, 한외여과 및/또는 정용여과의 추가적인 (iii) 단계를 거치도록 할 수 있다.
이러한 접합체는 수용액에서 이러한 단계들의 종료시에 회수된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 접합체는 1 내지 10 범위, 예를 들어, 2 내지 5, 특히 3 내지 4의 "약물 대 항체 비율"(또는 "DAR")을 특징으로 한다. 이는 일반적으로 메이탄시노이드 분자들을 포함하는 접합체들의 사례이다.
이러한 DAR 수는 (성장 저해제/항체 비율, 반응 시간, 용매 및 공용매가 존재한다면 공용매의 속성과 같은) 접합에 이용되는 실험 조건과 함께, 항체 및 이용되는 약물(즉, 성장 저해제)의 속성에 따라 다를 수 있다. 따라서, 항체와 성장 저해제 사이의 접촉은 상이한 약물 대 항체 비율; 선택적으로 네이키드(naked) 항체; 선택적으로 응집체에 의해 서로 상이한 여러 접합체들을 포함하는 혼합물을 초래한다. 따라서, 결정되는 DAR은 평균값이다.
DAR을 결정하는 데에 이용될 수 있는 방법은 실질적으로 정제된 접합체 용액의 λD 및 280 nm에서의 흡광도 비율을 분광학적으로 측정하는 것으로 이루어진다. 280 nm는 항체 농도와 같은 단백질 농도를 측정하는 데 일반적으로 이용되는 파장이다. 파장 λD 는 항체로부터 약물을 구분할 수 있도록 하기 위하여 즉, 당업자에게 용이하게 공지된 바와 같이 선택된다. λD 는 약물이 높은 흡광도를 나타내는 파장으로, λD 는 약물 및 항체의 흡광도 피크에서의 실질적인 중첩을 피하기 위하여 280 nm로부터 충분히 멀리 떨어져 있다. λD 는 메이탄시노이드 분자의 경우 252 nm로 선택될 수 있다. DAR 계산법은 Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science로부터 도출될 수 있다.
λD에서의 접합체에 대한 흡광도(AλD) 및 280 nm에서의 접합체에 대한 흡광도(A280)는 ("DAR(SEC)" 매개변수를 계산할 수 있게 하는) 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 단량체 피크 상에서 또는 ("DAR(UV)" 매개변수를 계산할 수 있게 하는) 전형적인 분광분석 기기를 이용하여 측정된다. 흡광도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
AλD = (cD x εDλD) + (cA x εAλD)
A280 = (cD x εD280) + (cA x εA280)
이때,
● cD 및 cA는 각각 약물 및 항체의 용액에서의 농도이다.
● εDλD 및εD280은 각각 λD 및 280 nm에서의 약물의 몰 흡광 계수이다.
● εAλD 및 εA280은 각각 λD 및 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수이다.
두 개의 미지의 물질들을 이들 두 식으로 분해할 경우, 다음의 식으로 이어진다:
cD = [(εA280 x AλD) - (εAλD x A280)] / [(εDλD x εA280) - (εAλD x εD280)]
cA = [A280 - (cD x εD280)] / εA280
그런 다음, 평균 DAR을 항체의 농도에 대한 약물의 농도의 비율로부터 계산한다: DAR = cD / cA.
약학적 조성물
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 선택적으로, 생분해 가능한 고분자와 같은 지효성 매트릭스와 조합되어 치료적 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 대상은 본 발명의 항체 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의약용의, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 면역접합체에 관한 것이다.
"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용 가능한"은 적절히, 포유동물, 특히 인간에 투여될 때, 부반응, 알레르기 반응 또는 기타 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조물을 지칭한다.
본 출원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항세균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적절한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예로는 물, 아미노산, 식염수, 인산염 완충 식염수, 완충액 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 숙신산염; 히스티딘, 아르기닌, 글리신, 프롤린, 글리실글리신과 같은 아미노산 및 유도체; 무기염 NaCl, 염화칼슘; 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올, 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨과 같은 당 또는 폴리알코올; 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188과 같은 계면활성제 등뿐만 아니라, 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에서, 조성물에 당, 폴리알코올 또는 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 포함하는 것이 바람직할 것이며, 제형은 트립타민과 같은 항산화제 및 트윈 20과 같은 안정화제도 함유할 수 있다.
약학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 투여계획은 당연히, 치료되는 병태, 병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 달려 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소용, 경구, 비경구, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 안구 내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 약학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 약학적으로 허용 가능한 용제를 함유한다. 이들은 등장성, 멸균, 식염수 용액(모노나트륨 또는 디나트륨 인산염, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 그러한 염들의 혼합물) 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가 시 주사 가능한 용액의 조성을 허용하는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있다.
이러한 약학적 조성물은 약물 조합 장치를 통해 투여될 수 있다.
투여에 이용되는 용량은 다양한 매개변수들의 함수로, 그리고 예를 들어, 이용되는 투여 방식의 함수, 관련된 병리학의 함수, 또는 대안적으로 원하는 치료 지속기간의 함수로 조정될 수 있다.
약학적 조성물을 제조하기 위하여, 본 발명의 유효량의 항체 또는 면역접합체가 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태로는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 호마유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 임기 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 분해되지 않고 전달을 위한 적절한 장치 또는 시스템으로 주사 가능해야 한다. 그것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물에, 그리고 오일에 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 면역접합체는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 (단백질의 유리 아미노 기로 형성된) 산 부가염을 포함하고, 이는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기 산 또는 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산 등과 같은 유기 산으로 형성된다. 또한, 유리 카르복실기로 형성된 염은 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 글리신, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
또한, 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는, 용매 또는 분산매일 수 있다. 예를 들어, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 레시틴과 같은 코팅제의 이용에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등의 다양한 항세균제 및 항진균제에 의해 초래될 수 있다. 여러 경우에 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 물질들, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 이용함으로써 초래될 수 있다.
멸균성의 주사 가능한 용액은 필요에 따라, 위에 열거된 임의의 기타 성분들과 함께, 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 성분을 도입한 후, 여과 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산매 및 위에서 언급된 것들로부터 필요한 기타 성분들을 함유하는 멸균 용제에 도입하여 제조된다. 멸균성의 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법으로, 이는 활성 성분의 분말에 더하여, 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분을 생산한다.
직접적인 주사를 위한 더욱 농축된, 또는 고도로 농축된 용액의 제조 또한 고려되는데, 여기서 용매로서 DMSO를 사용하는 것이 구상되어, 극도로 빠른 침투를 가져와 작은 종양 영역에 고농도의 활성 물질들을 전달한다.
제형화할 때, 용액들은 투여 제형에 적합한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 이러한 제형들은 위에 기술된 주사 가능한 용액 유형과 같이 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 등도 이용될 수 있다.
수용액으로 비경구 투여 시, 예를 들어, 이러한 용액은 필요에 따라 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성이 되도록 하여야 한다. 이러한 수용액은 특히 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균성의 수성 매질은 본 개시의 관점에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 등장성의 NaCl 용액 1 ml에 용해되거나, 피하 주입액 1000 ml에 부가되거나, 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 1035~1038쪽 및 1570~1580쪽 참조). 치료되는 대상자의 상태에 따라 투여량의 약간의 변이가 필수적으로 일어날 것이다. 투여를 책임지는 사람은 어떠한 경우에도 개별적인 대상자를 위한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 용량당 약 0.01 내지 100 밀리그램 정도를 포함하도록 치료적 혼합물 내에 제형화될 수 있다.
정맥 내 또는 근육 내 주사와 같은, 비경구 투여를 위해 제형화된 항체 또는 면역접합체 외에도, 기타 약학적으로 허용 가능한 형태는 예컨대, 경구 투여용 정제 또는 기타 고체; 경시적 방출 캡슐; 및 현재 이용되는 임의의 기타 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 리포좀 및/또는 나노 입자의 이용이 폴리펩티드의 숙주 세포로의 도입을 위해 고려된다. 리포좀 및/또는 나노 입자의 형성 및 이용은 당업자에게 공지되어 있다.
나노 캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 화합물을 포착한다. 세포간 고분자 과부하로 인한 부작용을 피하기 위하여, 이러한 (약 0.1 ㎛ 크기의) 초미세입자는 생체 내에서 분해될 수 있는 고분자를 이용하여 일반적으로 설계된다. 이러한 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노 입자, 또는 생분해성 폴리락티드 또는 폴리락티드-글리콜라이드 공중합체 나노 입자들이 본 발명에 이용하기 위하여 고려되며, 그러한 입자들은 용이하게 제조될 수 있다.
리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되며, 자발적으로 다중층의 동심상의 이중층 소포체(다중층 소포체(MLV)라고도 지칭됨)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛ 범위의 지름을 나타낸다. MLV의 초음파 처리는 핵에 수용액을 함유하는, 200 내지 500 Å 범위의 지름을 나타내는 작은 단일층 소포체(SUV)의 형성을 초래한다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 달려 있다.
치료방법 및 치료적 용도
본 발명자들은 본 발명자들이 생산했던 다섯 개의 항체들이 결합 후에 CEACAM5-항체 복합체를 내재화할 수 있음을 보여주었다. 나아가, 본 발명자들은 세포독성 메이탄시노이드(DM4)와 조합된 이러한 항체들이 시험관 내에서 인간 MKN45 종양 세포에 대해 세포독성 활성을 유도함을 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 종양 이식 후 14일차에 단일 주사로 이러한 면역접합체를 5 mg/kg 및 2.5 mg/kg의 용량으로 이용하였을 때, 환자로부터 유래된 인간 원발성 대장 종양 이종 이식편의 쥐 모델에서 이러한 면역접합체가 생체 내에서 현저한 항종양 활성을 유도함을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체, 또는 약학적 조성물은 암 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물로 치료되는 암은 CEACAM5를 발현하는 암, 특히, 동일한 조직 기원의 정상적인(즉, 비 종양성) 세포에 비해, CEACAM5를 과발현하는 암이다. 암세포에 의한 CEACAM5의 발현은 예를 들어, 다음 섹션 "진단적 용도"에서 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 항체를 이용하여, 그리고 특히, 예를 들어 실시예 8에 기술된 바와 같이, 면역조직화학적 방법에 의해, 용이하게 분석할 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 암은 대장결장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 자궁내막암, 유방암, 간암(예를 들어, 담관암종), 전립선암, 또는 피부암일 수 있다. 본 발명에 따른 마우스 항-인간 CEACAM5 항체를 이용하여 면역조직화학에 의해 인간 종양 패널을 스크리닝한 결과는 실제로 실시예 8에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 이러한 유형의 암에서 항체 염색을 보여주었다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 단독으로 또는 임의의 적절한 성장 저해제와 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이전에 기술된 바와 같이, 성장 저해제, 세포독성제, 또는 전구약물 활성화 효소와 접합되거나 결합될 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 상기 성장 저해제, 세포독성제, 또는 전구약물을, 표면에 CEACAM5를 발현하거나 과발현하는 암성 세포에 대해 표적화하는 데 유용할 수 있다.
또한, 치료적 단일클론성 항체가 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 보유하는 세포들의 고갈을 초래할 수 있음은 잘 알려져 있다. 이러한 고갈은 항체 매개 세포성 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포 용해 및 항체에 의해 표적화된 항원을 통해 제공된 신호를 통한 종양 성장의 직접적인 항종양 저해라는 적어도 세 가지의 메커니즘을 통해 매개될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 동족 항원에 결합된 항체에 보체 시스템의 첫 번째 요소가 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예컨대, Gazzano-Santoro 등(1997)에 기술된 바와 같은 CDC 분석법이 수행될 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예컨대, 자연살해(NK) 세포, 호중성 백혈구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비 항체들이 이러한 세포독성 효과기 세포들로 하여금 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합하여, 이후에 그러한 표적 세포를 살해할 수 있게 하는 세포 독성의 형태를 지칭한다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것과 같은 시험관 내 ADCC 분석법이 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상은 치료적으로 유효한 양의, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 본 출원에 사용된 용어 "치료(treating 또는 treatment)"는 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행의 저해, 또는 예방을 의미한다. 본 출원에 사용된 용어 "암 치료(treating cancer)"는 종양의 악성 세포의 성장 및/또는 상기 종양으로부터의 전이 진행의 저해를 의미한다. 또한, 그러한 치료는 종양 성장의 퇴행, 즉, 측정 가능한 종양의 크기의 감소를 초래할 수 있다. 특히, 그러한 치료는 종양 또는 전이의 완전한 퇴행을 초래한다.
본 발명에 따르면, 용어 "환자" 또는 "이를 필요로 하는 환자"는 악성 종양에 영향을 받거나 영향을 받을 가능성이 높은 인간 또는 비 인간 포유동물을 의도한 것이다. 특히, 상기 환자는 CEACAM5를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명, 예를 들어 아래에 기술된 방법에 따른 항체 또는 면역접합체에 민감하다고 결정된 환자일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 "치료적으로 유효한 양"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 이익/위험 비율로, 상기 암 질병을 치료하는 데 충분한 폴리펩티드의 양을 의미한다. 그러나 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 전체적인 1일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적으로 유효한 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 폴리펩티드의 활성; 이용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 이용된 특정 폴리펩티드의 배출 속도; 치료 지속기간; 이용된 특정 폴리펩티드와 조합하여 또는 동시에 이용된 약물; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 기술 분야의 통상적인 지식 내에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 대상은 악성 종양의 치료에 이용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
폴리펩티드, 항체, 면역접합체 또는 약학적 조성물은 악성 종양의 전이 진행을 억제하기 위하여 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 악성 종양 치료(예컨대, 애쥬반트 치료법) 및/또는 전이성 종양의 성장 감소를 위한 임의의 기타 치료적 전략과 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 이용한 치료의 효능은 생체 내에서, 예를 들어, 암의 마우스 모델에서, 그리고 예컨대, 실시예 5.3에서 정의된 바와 같은, 치료군과 대조군 사이의 종양 부피 변화, 종양 퇴행 % , 부분적인 퇴행 및/또는 완전 퇴행을 측정하여, 용이하게 분석할 수 있다.
진단적 용도
CEACAM5은 대장결장, 위, 폐, 자궁 종양 세포의 표면에서 고도로 발현되고, 대장 및 식도 상피 세포와 같은 소수의 정상적인 상피 세포에서 약하게 발현된다고 보고된 바 있다. 추가적으로, 본 발명에 따른 마우스 항-인간 CEACAM5 항체를 이용한 면역조직화학법에 의한 인간 종양 패널의 스크리닝 결과는 대장결장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 자궁내막암, 유방암, 간암(특히 담관암종), 전립선암 및 피부암에서 항체 염색을 나타냈다.
따라서, CEACAM5는 암 마커를 구성하며, 따라서 항암 치료법의 효능 또는 질병의 재발 검출의 효능을 나타내는 데에 이용될 가능성이 있다.
일 구현예에서, 치료제에 대한 환자의 민감성을 결정하고, 항암 치료법의 효능을 모니터링하거나, 치료 후 질병의 재발을 검출하기 위하여, CEACAM5를 발현하는 종양을 표적으로 하는 치료법의 맥락에서 본 발명의 항체는 분석법의 구성요소로서 이용된다. 특히, 본 발명의 동일한 항체는 치료제의 성분으로서 그리고 진단 분석법의 구성요소로서 이용된다.
따라서, 본 발명의 추가적인 대상은 대상자에서 CEACAM5 발현을 생체 내에서 검출하기 위한 용도, 또는 대상자의 생물학적 시료에서 CEACAM5 발현을 생체 외에서 검출하기 위한 용도를 위한 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다. 상기 검출은 종양 세포에서 표면 단백질 CEACAM5의 발현을 검출함으로써, 특히
a) 대상자에서 암의 존재 진단, 또는
b) CEACAM5를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 면역접합체에 대한 암 환자의 민감도 결정, 또는
c) 특히 본 발명에 따른 면역접합체를 이용한 치료법에 대하여, 항-CEACAM5 암치료법의 효능 모니터링 또는 항-CEACAM5 암치료법 후의 암 재발 검출
을 의도한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 항체는 시험관 내 또는 생체 외 용도를 위한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 이용하여, CEACAM5는 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료에서 시험관 내 또는 생체 외에서 검출될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 용도는 생체 내 용도일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 대상자에게 투여되며, 항체-세포 복합체가 검출되고/검출되거나 정량되고, 그것에 의해 상기 복합체의 검출은 암을 나타낸다.
또한, 본 발명은
(a) 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히 항체가 상기 생물학적 시료와의 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
(b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
(c) 결합된 항체의 측정된 수준, 암을 나타내는 대조군과 비교하였을 때의 결합된 항체의 증가된 수준을 비교하여 암의 존재를 검출하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 대상자에서 암의 존재를 검출하는 시험관 내 또는 생체 외 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암 환자의 CEACAM5를 표적으로 하는 치료제, 특히 본 발명에 따른 면역접합체에 대한 민감도를 시험관 내 또는 생체 외에서 결정하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은
(a) 암 환자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
(b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
(c) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하며, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 CEACAM5를 표적으로 하는 치료제에 민감한 환자를 나타낸다.
위의 방법에서, 상기 대조군은 동일한 유형의 정상적인, 비 암성, 생물학적 시료, 또는 동일한 유형의 정상적인 생물학적 시료에서 항체 결합 수준을 나타내는 것으로 결정된 참조값일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 대장결장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 자궁내막암, 유방암, 간암(특히 담관암종), 전립선암 또는 피부암과 같은, CEACAM5를 발현하는 암의 진단에 유용하다.
또한, 본 발명은
(a) 항-CEACAM5 암 치료를 받는 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
(b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
(c) 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 항-CEACAM5 암 치료법의 효능을 시험관 내 또는 생체 외에서 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 감소된 수준은 상기 항-CEACAM5 암 치료법의 효능을 나타낸다.
상기 방법에서, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 상기 항-CEACAM5 암 치료법의 비효율성을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 대조군은 분석에 제출된 생물학적 시료와 동일한 유형의 생물학적 시료이나, 항-CEACAM5 암 치료법 과정 중에, 이전에 시간에 맞춰 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료이다.
또한, 본 발명은
(a) 항-CEACAM5 암 치료를 완료한 대상자의 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와, 특히, 항체가 상기 생물학적 시료와 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉시키기;
(b) 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 수준을 측정하기;
(c) 결합된 항체의 측정된 수준을, 대조군에 결합된 항체의 수준과 비교하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 항-CEACAM5 암 치료법 후의 암 재발을 시험관 내 또는 생체 외에서 검출하는 방법에 관한 것으로, 이때, 대조군과 비교할 때, 상기 생물학적 시료에 결합된 항체의 증가된 수준은 항-CEACAM5 암 치료법 이후의 암 재발을 나타낸다.
상기 대조군은 특히 분석에 제출된 생물학적 시료와 동일한 유형의 생물학적 시료이나, 항-CEACAM5 암 치료 완료시 또는 완료 후, 이전에 시간에 맞춰 대상자로부터 얻어진 생물학적 시료이다.
상기 항-CEACAM5 암 치료법은 특히 본 발명에 따른 항체 또는 면역접합체를 이용한 치료법이다. 상기 항-CEACAM5 암 치료법은 CEACAM5를 발현하는 암, 특히 대장결장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 자궁내막암, 유방암, 간암(특히 담관암종), 전립선암 또는 피부암을 표적으로 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 형광성 분자, 방사성 분자 또는 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 표지와 같은, 검출 가능한 분자 또는 물질로 라벨링될 수 있다.
본 발명에 따른 항체와 관련하여, 본 출원에 사용된 용어 "라벨링된"은 방사성 물질 또는 형광단(예컨대, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5))과 같은 검출 가능한 물질을 폴리펩티드에 결합(즉, 물리적으로 연결)시키는 것에 의한 항체의 직접적인 라벨링뿐만 아니라, 검출 가능한 물질과의 반응성에 의한 폴리펩티드의 간접적인 라벨링을 포함하고자 한 것이다.
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 방사성 분자로 라벨링될 수 있다. 예를 들어, 방사성 분자는 I123, I124, In111, Re186, Re188, Tc99와 같은, 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 요오드-123, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은, 핵 자기 공명(NMR) 영상 촬영(자기 공명 영상 촬영(MRI)으로도 알려져 있음)을 위한 스핀 라벨로 라벨링될 수 있다.
"생물학적 시료"는 대상자로부터 얻어진 다양한 샘플 유형을 포괄하며, 진단 또는 모니터링 분석법에 이용될 수 있다. 생물학적 시료는 혈액 및 기타 생물학적 기원의 액체 시료, 생체 검사 시료 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손과 같은 고체 조직 시료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 생물학적 시료는 임상적 시료, 배양물 중의 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 시료, 특히 종양 시료를 포괄한다.
일 구현예에서, 생물학적 시료는 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 조직 시료일 수 있다. 실제로, 본 발명에 따른 항체는 조직 시료를 수집하고 보관하기 위하여 대부분의 병원에서 이용되는 포맷인 FFPE 조직에 유리하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
a) 검출 가능하게 라벨링된 본 발명에 따른 항체를 환자에 투여하기;
b) 영상화에 의해 환자에서 상기 검출 가능하게 라벨링된 항체의 국재성을 검출하기;로 이루어지는 단계들을 포함하는, 대상자에서 암의 존재를 생체 내에서 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 암의 다단화(예컨대, 방사선 영상 촬영)에 유용할 수 있다. 그것들은 단독으로 또는 다른 암 마커들과 조합하여 이용될 수 있다.
본 출원에 사용된 용어 "검출" 또는 "검출된"은 대조군을 참조하여 또는 대조군 참조 없이 (수준을 측정하는) 정성적 및/또는 정량적 검출을 포함한다.
본 발명의 내용에서, 본 출원에 사용된 용어 "진단(diagnosing)"은 다수의 수집된 데이터로부터 대상자에 영향을 미치는 병리학을 확인하기 위해 의도된, 의학적 상태의 본질을 결정하는 것을 의미한다.
상기 방법에서, 이러한 암은 CEACAM5를 발현하는 암, 특히 대장결장암, 위암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 자궁내막암, 유방암, 간암(특히 담관암종), 전립선암 또는 피부암이다.
키트
마지막으로, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 키트도 제공한다. 본 발명의 항체를 함유하는 키트는 표면 단백질 CEACAM5의 검출, 또는 치료적 분석법 또는 진단적 분석법에서 용도를 찾는다. 본 발명의 항체는 고체 지지체, 예컨대, 조직 배양 플레이트 또는 비즈(예컨대, 세파로오스 비즈)에 결합된 폴리펩티드 또는 항체를 함유할 수 있다. 시험관 내에서 표면 단백질 CEACAM5의 검출 및 정량을 위한 항체를 함유하는 키트가 예컨대, ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 제공될 수 있다. 이러한 검출에 유용한 항체는 형광 또는 방사성 라벨과 같은 라벨과 함께 제공될 수 있다.
서열의 간단한 설명
SEQ ID NO:1-4 및 6은 소위 "MAb1" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:5는 인간화 MAb2 항체의 VH 변이형 서열 VH1a을 나타낸다.
SEQ ID NO:7-10 및 12는 소위 "MAb2" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:11은 GenBank NP_001703.2로부터 이용 가능한 인간 CEACAM1 의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:13-16 및 18은 소위 "MAb3" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:17은 인간화 MAb2 항체의 VL 변이형 서열 VL1을 나타낸다.
SEQ ID NO:19-22 및 24는 소위 "MAb4" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:23은 인간화 MAb2 항체의 VL 변이형 서열 VL1a을 나타낸다.
SEQ ID NO:25-28 및 30은 소위 "MAb5" 항체의 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L 및 CDR3-L의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:29는 인간화 MAb2 항체의 VL 변이형 서열 VL1c를 나타낸다.
SEQ ID NO:31은 "MAb1" 항체의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:32는 "MAb1" 항체의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:33은 "MAb2" 항체의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:34는 "MAb2" 항체의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:35는 "MAb3" 항체의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:36은 "MAb3" 항체의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:37은 "MAb4" 항체의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:38은 "MAb4" 항체의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:39는 "MAb5" 항체의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:40은 "MAb5" 항체의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:41은 chMAb1 항체의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:42는 chMAb1 항체의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:43은 chMAb2 항체의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:44는 chMAb2 항체의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:45는 chMAb3 항체의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:46은 chMAb3 항체의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:47은 chMAb4 항체의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:48은 chMAb4 항체의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:49는 chMAb5 항체의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:50은 chMAb5 항체의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:51은 인간화 MAb2 항체의 VH 변이형 서열 VH1을 나타낸다.
SEQ ID NO:52는 등록번호 AAA51967.1로 GenBank 데이터베이스로부터 이용 가능한 전체 길이의 인간 CEACAM5의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:53은 필리핀 원숭이 CEACAM5의 세포외 도메인의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:54는 K52에서 R52로의 돌연변이를 포함하는 ("MAb2" 항체로부터 유래된) 키메라 항체의 경쇄의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:55는 인간화 MAb2 항체의 VL 변이형 서열 VL1d를 나타낸다.
SEQ ID NO:56은 hCEACAM1 세포외 도메인의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM1 (NP_001703.2)의 35-428번 위치, His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어짐).
SEQ ID NO:57은 His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어진, cCEACAM1 세포외 도메인의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:58은 hCEACAM5 세포외 도메인의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM5 (AAA51967.1)의 35-685번 위치, His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어짐).
SEQ ID NO:59는 His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어진, cCEACAM5 세포외 도메인의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:60은 hCEACAM6 세포외 도메인의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM6 (NP_002474.3)의 35-327번 위치, His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어짐).
SEQ ID NO:61은 His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어진, cCEACAM6 세포외 도메인의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:62는 hCEACAM8 세포외 도메인의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM8 (NP_001807.2)의 35-332번 위치, His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어짐).
SEQ ID NO:63은 His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어진, cCEACAM8 세포외 도메인의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:64는 hCEACAM7 세포외 도메인의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM7 (NP_008821.1)의 36-248번 위치, His-태그를 함유하는 24개의 아미노산 연장이 이어짐).
SEQ ID NO:65는 6개 아미노산 His-태그가 이어진 hCEACAM5 N-A1-B1의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM5 (AAA51967.1.)의 35-320번 위치).
SEQ ID NO:66은 6개 아미노산 His-태그가 이어진 hCEACAM5- A2-B2의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM5 (AAA51967.1.)의 321-498번 위치).
SEQ ID NO:67은 6개 아미노산 His-태그가 이어진 hCEACAM5 A3-B3의 서열을 나타낸다(전체 길이 hCEACAM5 (AAA51967.1.)의 499-685번 위치).
SEQ ID NO:68은 His-태그를 함유하는 24개 아미노산 연장이 이어진 cCEACAM5 N-A1-B1의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:69는 His-태그를 함유하는 24개 아미노산 연장이 이어진 cCEACAM5 A2-B2의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:70은 His-태그를 함유하는 24개 아미노산 연장이 이어진 cCEACAM5 A3-B3의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:71은 GenBank NP_002474.3으로부터 이용 가능한 인간 CEACAM6 전체 길이 단백질의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:72는 GenBank NP_008821.1로부터 이용 가능한 인간 CEACAM7 전체 길이 단백질의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:73은 GenBank NP_001807.2로 이용 가능한 인간 CEACAM8 전체 길이 단백질의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 74는 변이형 인간화 MAb2_VLg5VHg2의 VH 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 75는 변이형 인간화 MAb2_VLg5VHg2의 VL 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 76은 인간 CEACAM5 A3-B3의 109-115번 위치의 아미노산의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 77은 인간 CEACAM5 A3-B3의 131-143번 위치의 아미노산의 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 78은 서열 비교를 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR1-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 79는 서열 비교를 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR2-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 80은 서열 비교를 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR3-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 81은 MAb1/MAb3 항체 패밀리의 CDR1-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO: 82는 MAb1/MAb3 항체 패밀리의 CDR2-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:83은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인의 결합에서 중성으로 확인된 잔기들을 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR1-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:84는 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인의 결합에서 중성으로 확인된 잔기들을 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR3-H에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:85는 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인의 결합에서 중성으로 확인된 잔기들을 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR1-L에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:86은 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인의 결합에서 중성으로 확인된 잔기들을 기초로 한 MAb2/MAb4/MAb5 항체 패밀리의 CDR3-L에 대한 공통 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:87은 huMAb2-3(MAb2_VL1cVH1a-IgG1)의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:88은 huMAb2-3(MAb2_VL1cVH1a-IgG1)의 경쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:89는 huMAb2-4(MAb2_VL1d VH1-IgG1)의 중쇄 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO:90은 huMAb2-4(MAb2_VL1d VH1-IgG1)의 경쇄 서열을 나타낸다.
도 1: 항-CEACAM5 항체의 선택성 평가.
도 2: 인간 CEACAM5에 대한 항-CEACAM5 항체의 도메인 매핑.
도 3: 시노몰구스 CEACAM5에 대한 항-CEACAM5 항체의 도메인 매핑.
도 4: SCID 암컷 마우스에서 원발성 인간 대장 선암종 CR-IGR-034P에 대한 chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 및 chMAb2-SPDB-DM4 접합체들의 항종양 활성 평가.
도 5: SCID 암컷 마우스에서 원발성 인간 대장 선암종 CR-IGR-034P에 대한 huMAb2-3-SPDB-DM4, huMAb2-4-SPDB-DM4 및 chMAb2-SPDB-DM4 접합체들의 항종양 활성 평가.
도 6: SCID 암컷 마우스에서 원발성 인간 위장 선암종 STO-IND-006에 대한 huMAb2-3-SPDB-DM4 접합체의 항종양 활성 평가.
도 7: MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5 항체의 VH 및 VL 부위의 서열 정렬.
도 8: chMAb1-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 9: chMAb2-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 10: chMAb4-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 11: chMAb5-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 12: huMAb2-2-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 13: huMAb2-1-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 14: huMAb2-3-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 15: huMAb2-4-SPDB-DM4 접합체의 HRMS 분석.
도 16: 인간 및 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인에 대한 MAb2의 인간화 변이형의 결합 활성.
도 17: 인간 및 원숭이 CEACAM5 세포외 도메인에 대한 MAb2의 인간화 변이형의 결합의 안정성.
도 18: SCID 암컷 마우스에서 원발성 인간 폐 선암종 LUN-NIC-0014에 대한 huMAb2-3-SPDB-DM4 접합체의 항종양 활성 평가.
도 19: CD1 누드 암컷 마우스에서 원발성 인간 대장 선암종 CR-IGR-034P에 대한 huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-3-설포-SPDB-DM4 접합체들의 항종양 활성 평가.
도 20: huMAb2-3-설포SPDB-DM4의 HRMS 분석.
도 21: huMAb2-3-SMCC-DM1의 HRMS 분석.
도 22: MAb2, MAb4, MAb5, 인간화 VH1a, 인간화 VH1 및 인간화 VHg2의 중쇄 가변 도메인 정렬.
도 23: MAb2, MAb4, MAb5, 인간화 VL1, 인간화 VL1a, 인간화 VL1c, 인간화 VL1d 및 인간화 VLg5의 경쇄 가변 도메인 정렬.
실시예
본 발명을 다음의 실시예에 의해 추가로 설명하며, 이러한 실시예는 추가적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 서열 목록, 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 전체가 참조로써 본 출원에 명백히 포함된다.
실시예 1: CEACAM 단백질의 재조합 세포외 도메인의 제조
본 실시예에서는, 표 1에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 인간 배아 신장 HEK293 세포에서 각각의 cDNA의 발현을 허용하는 플라스미드로 일시적 발현에 의해 인간(h) 또는 시노몰구스 원숭이(c) 기원으로부터의 CEACAM의 세포외 단백질 도메인(ECD)을 제조하였다.
각각의 발현 플라스미드를 293펙틴(293fectinTM)(라이프 테크놀로지(Life Technologies))과 복합체를 형성하고, 현탁액에 배양된 293-F 세포(HEK293 세포로부터 유래됨)에 첨가하였다. 형질감염 8일 후, 배양물 상층액을 수집하고, 상응하는 가용성 단백질을 IMAC(GE 헬스케어(Healthcare))에 의해 정제하여 단백질 배치를 생성하였다(표 1 참조).
CEACAM 단백질의 재조합 세포외 도메인의 설명
단백질 명칭 단백질 설명 cDNA 서열 기원 서열 식별자
hCEACAM1 인간 CEACAM1 ECD (35-428) NP_001703.2 SEQ ID NO:56
cCEACAM1 필리핀 원숭이 CEACAM1 ECD (35-428) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:57
hCEACAM5 인간 CEACAM5 ECD (35-685) AAA51967.1 SEQ ID NO:58
cCEACAM5 필리핀 원숭이 CEACAM5 ECD (35-688) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:59
hCEACAM6 인간 CEACAM6 ECD (35-327) NP_002474.3 SEQ ID NO:60
cCEACAM6 필리핀 원숭이 CEACAM6 ECD (35-327) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:61
hCEACAM8 인간 CEACAM8 ECD (35-332) NP_001807.2 SEQ ID NO:62
cCEACAM8 필리핀 원숭이 CEACAM8 ECD (35-332) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:63
hCEACAM7 인간 CEACAM7 ECD (36-248) NP_008821.1 SEQ ID NO:64
hCEACAM5 NA1B1 인간 CEACAM5 N-A1-B1 도메인 (35-320) AAA51967.1 SEQ ID NO:65
hCEACAM5 A2B2 인간 CEACAM5 A2-B2 도메인 (321-498) AAA51967.1 SEQ ID NO:66
hCEACAM5 A3B3 인간 CEACAM5 A3-B3 도메인 (499-685) AAA51967.1 SEQ ID NO:67
cCEACAM5 NA1B1 필리핀 원숭이 CEACAM5 N-A1-B1 도메인 (35-320) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:68
cCEACAM5 A2B2 필리핀 원숭이 CEACAM5 A2-B2 도메인 (321-498) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:69
cCEACAM5 A3B3 필리핀 원숭이 CEACAM5 A3-B3 도메인 (499-688) 내부에서 클로닝 SEQ ID NO:70
실시예 2: 단일클론성 마우스 항-CEACAM5 항체의 생성본 실시예에서, 항CEACAM5 mAb의 생성을 가져왔던 프로토콜에 따라 마우스 면역화 이후에 단일클론성 항체를 생성하였다.
실시예 2.1: 면역화 및 하이브리도마 생성
인간 CEACAM5의 세포외 도메인, 시노몰구스 CEACAM5의 세포외 도메인 중 어느 하나와 함께, 또는 Wennerberg A.E 등(1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054) 및 Kilpatrick 등(1997. Hybridoma 16: 381389)에 기술된 인간 종양 UMC11 세포와 함께, P3X63-Ag8.653 골수종 세포를 이용하여 면역화, 융합 및 스크리닝을 수행하였다.
Kilpatrick 등(1997. Hybridoma 16: 381389)에 기술된 RIMMS 방법을 이용하여, 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스(S082342; 찰스 리버 연구소(Charles River Labs), 미국 메인 주 바 하버) 각각은 3-4일의 간격으로 14일의 과정에 걸쳐 5회의 면역 조치를 받았다. 타이터맥스(TiterMax)의 애쥬반트(타이터맥스 골드 애쥬반트; 시그마(Sigma) #T2684)에 유화시킨 항원을 마우스의 등을 따라 배출 림프절에 가까운 여섯 부위, 그리고 복부를 따라 여섯 개의 나란한 부위에 피하로 투여하였다. 마지막 주사 후 4일째에 마우스를 희생시켰다. 좌우 슬와, 표피 서혜, 액와 림프절 및 인두 림프절을 무균적으로 분리하고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다.
Wennerberg A.E 등(1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054)이 기술한 전통적인 방법을 이용하여, 6-8주령의 암컷 BALB/c 마우스(S082342; 찰스 리버 연구소, 미국 메인 주 바 하버) 각각은 41일의 과정에 걸쳐 3회의 면역 조치를 받았다. 항원을 마우스의 배쪽 자리에 복강 내 투여하였다. 마지막 주사 후 3일째에, 마우스를 희생시키고, 비장을 무균적으로 분리하고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다.
림프절 또는 비장으로부터 림프구를 방출시키고, 단일 세포 현탁액을 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 P3X63-AG8.653 골수종 세포와 융합시키기 전에 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 융합 후, 세포 혼합물을 37℃에서 16-24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그에 따른 세포 조제물을 선택적인 반고체 매질에 옮기고, 100 mm 페트리 플레이트상에 무균적으로 플레이팅하고, 37℃에서 배양하였다. 선택 개시 후 10일째에 플레이트를 대상으로 하이브리도마 성장을 조사하고, 보이는 콜로니를 집어 200 ㎕의 성장 배지를 함유하는 96웰 플레이트에 놓았다. 96웰 플레이트를 37℃에서 2-4일 동안 인큐베이터에 보관하였다.
실시예 2.2: 쥐의 항-CEACAM5 항체의 스크리닝 및 시험관 내 특성 분석
포획 항원으로서 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된) 인간 CEACAM5 단백질을 이용하는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 몇몇 인간 종양 세포(H460, MKN45, SW1463, SKMEL28 및 UMC11)를 이용하는 FACS에 의해 항-CEACAM5 IgG 생성에 대한 1차 스크리닝을 수행하였다. ELISA 분석을 위해, 플레이트를 PBS 내 0.25 ㎍/웰의 인간 CEACAM 단백질로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항-CEACAM5 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS(PBS-T)로 5회 세척하였다. 그런 다음, 호스래디쉬 퍼록시다아제(시그마; #A9044)와 접합된 토끼 항-마우스 IgG의 1:50,000 희석액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 암소에서 1시간 동안 37℃로 배양한 후, 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 가시화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다. FACS 분석을 위해, 인간 종양 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항-CEACAM5 항체를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 알렉사(Alexa)647(인비트로젠(Invitrogen); #A2135)과 접합된 염소 항-마우스 IgG를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 ㎕/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다.
항-CEACAM5 항체의 CEACAM5에 대한 특이성을 평가하기 위하여, 96웰 플레이트를 이전에 기술된 동일한 코팅 조건을 이용하여 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된) 재조합 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8 단백질로 코팅하였다. 항-CEACAM5 항체들을 플레이트에 첨가하고, 호스래디쉬 퍼록시다아제(시그마; #A9044)와 접합된 토끼 항-마우스 IgG로 검출하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 시각화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다. 도 1에 제시된 결과는 항-CEACAM5 항체가 인간 CEACAM5 v. 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8에 대해 선택적임을 보여준다.
실시예 2.3: mAb 결합 특성 분석
인간 MKN45 (DSMZ, ACC 409) 종양 세포의 표면 위에 발현된 hCEACAM5에 대한 항-CEACAM5 항체들의 겉보기 친화도를 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 결정하였다. MKN45 종양 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항-CEACAM5 항체들을 4℃에서 45분 동안 분석용 희석제에 20 ㎍/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 알렉사647(인비트로젠; #A2135)과 접합된 염소 항-마우스 IgG를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 ㎕/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. BIOST@T-BINDING 및 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 각각 겉보기 KD 및 EC50 값을 추정하였다.
MKN45 세포에 대해 얻어진 EC50 값
항체 MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
EC50 값 16 nM 3.4 nM 6.2 nM 4.9 nM 0.73 nM
인간 CEACAM5 및 시노몰구스 CEACAM5 단백질에 대한 항-CEACAM5 항체들의 도메인 매핑을 ELISA로 결정하였다. 96웰 플레이트를 이전에 기술된 동일한 코팅 조건을 이용하여 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된) CEACAM5 단백질의 재조합 인간 A1(143-237), A1-B1(143-320), A2-B2(321-498) 및 A3-B3 (499-685) 도메인으로, 그리고 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된) CEACAM5 단백질의 재조합 시노몰구스 N-A1-B1(1-320), A1-B1(143-320), A2-B2(321-498) 및 A3-B3(499-688)로 코팅하였다. 정제된 항체들을 플레이트에 첨가하고, 호스래디쉬 퍼록시다아제(시그마; #A9044)와 접합된 토끼 항-마우스 IgG를 이용하여 검출하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 시각화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다. 결과를 도 2와 도 3에 제시하였는데, 항-CEACAM5 항체들이 인간 및 시노몰구스 CEACAM5 단백질의 A3-B3 도메인에 결합함을 보여준다.개별적인 mAb들의 이소형을 제조사의 설명서(SEROTEC 참조문헌 MMT1)에 따라 마우스 IgG 이소형 분석 키트를 이용하여 결정하였다. 다섯 가지 CEACAM5에 특이적인 mAb들은 IgG1, k 이소형이었다.
실시예 3 : 쥐의 항-CEACAM5 항체의 특성 분석
실시예 3.1: 쥐의 항-CEACAM5 항체의 시험관 내 특성 분석
CEACAM5-특이적 Ab들을 발현하는 마우스 하이브리도마를 T500 플라스크에 생성하고, 7일간 성장시킨 후 조정 배지를 수집하였다. 조정 배지를 단백질-G 컬럼 사이로 통과시키고, 세척하고, 글리신/HCl 100 mM pH 2.7 완충액으로 용리시켜 CEACAM5-특이적 Ab들을 정제하였다. 멸균 여과 전에 용리액을 PBS에 대해 투석시키고, 4℃에서 보관하였다.
모든 CEACAM5-특이적 mAb들을 대상으로 ELISA에 의해 인간 및 영장류 CEACAM5 단백질과 결합하는 능력을 평가하였다. 플레이트를 인간 또는 영장류 CEACAM5 단백질로 코팅하고, 항-hCEACAM5 mAb들을 플레이트에 첨가하고, 호스래디쉬 퍼록시다아제(시그마; #A9044)와 접합된 토끼 항-마우스 IgG로 검출하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하여 항체 결합을 시각화하고, 450 nm의 파장에서 판독하였다.
영장류 CEACAM5 단백질에 대한 CEACAM5-특이적 mAb들의 결합 능력에 해당하는 EC50 값
항체 MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
EC50 (nM)
hCEACAM5		 0.53 0.14 0.36 0.08 0.40
EC50 (nM)
cCEACAM5		 1.18 0.07
 3.72 0.05 0.45
비율 c/h 2.2 0.5 10 0.6 1.1
실시예 3.2: 유동 세포계수법에 의한, 진행된 인간 원발성 대장 종양 세포 CR-IGR-034P의 겉보기 친화도 및 항체 결합 능력 진행된 인간 원발성 대장 종양 CR-IGR-034P(Julien et al., Clin Cancer Res October 1, 2012 18:5314-5328)를 마우스에서 환자 유래 이종 이식편으로부터 획득하였다. 종양 CR-IGR-034P를 IV형 콜라게나아제(인비트로젠; #17104-019) 및 데옥시리보뉴클레아제 I(인비트로젠; #18047-019)을 이용하여 4℃에서 1시간 동안 효소적으로 해리시켰다. 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하는 Viacount 애플리케이션으로 세포 생존능력을 추정하였다. 겉보기 친화도 추정을 위해, CR-IGR-034P 종양 세포를 96웰 하이 바인드 플레이트(MSD L15XB-3)에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항-CEACAM5 항체들을 4℃에서 45분 동안 분석용 희석제에 20 ㎍/ml로 시작하는 2배 계단식 희석액으로 최대 12배 희석액까지 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 알렉사647(인비트로젠; #A2135)과 접합된 염소 항-마우스 IgG 또는 알렉사488(인비트로젠; # A11013)과 접합된 염소 항-인간 IgG를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 원심분리 및 200 ㎕/웰 PBS 1% BSA를 첨가하여 세포 재현탁 후 항체 결합을 평가하고, 구아바(Guava®) 이지사이트(easyCyteTM) 8HT 유동 세포계수 시스템을 이용하여 판독하였다. BIOST@T-BINDING 및 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 이용하여 각각 겉보기 KD 및 EC50 값을 추정하였다.
제조사의 설명서에 따라 마우스 IgG 캘리브레이터 키트(바이오사이텍스(Biocytex) #7208) 또는 인간 IgG 캘리브레이터 키트(바이오사이텍스 #CP010)를 이용하여 항-CEACAM5 항체들의 항체 결합 능력을 결정하였다.
진행된 인간 원발성 대장 종양 세포 CR-IGR-034P에서 획득된 KD 및 EC50 값
항체 MAb1 MAb2 MAb3 MAb4 MAb5
KD 값 1.92 nM 0.38 nM 1.01 nM 0.16 nM 0.5 nM
EC50 값 1 nM 0.53 nM 2.8 nM 0.2 nM 1.4 nM
실시예 3.3: 쥐의 CEACAM5-특이적 항체들의 내재화 활성항-CEACAM5 항체들 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5의 내재화를 평가하기 위하여, 생존 가능한 MKN45 세포들을 10 ㎍/ml의 알렉사플루오르488로 사전 라벨링된 항-CEACAM5 항체들과 함께 37℃/5% CO2(또는 음성 대조군의 경우 얼음 상에서 4℃)에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포들의 일부분을 배양 배지로 헹구고, 이러한 세포들을 30분 동안 얼음 위에서 항-알렉사플루오르 488 항체(50 ㎍/mL)과 함께 배양함으로써 세포에 부착된, 세포외의 AF로 라벨링된 항체들을 ??칭시켰다(세포내 형광 수준). 웰의 나머지 부분은 동일한 시간 조건에서 오로지 배양 배지와 배양시켰다(총 형광 수준).
그런 다음, 세포들을 떼어내고 세척하고, MACSQUANT Vyb 분석기를 이용한 세포 유동계수 분석 전에 배양 배지에 수집하였다. 1 × 104개 세포들의 세포 관련 형광성을 측정하고, 게이티드 생존 가능 세포들의 평균 형광 강도를 정량하였다. 내재화 비율(%)을, ??칭된 세포 관련 형광성을 총 세포 관련 형광성으로 나누고 100을 곱하여 정의하였다. 데이터는 평균 ±표준 편차(SD)로 나타내었다.
MKN45 세포주에서 24시간의 항-CEACAM5 쥐 항체 내재화
항체 내재화
24시간, 37℃/5%CO2
% ± StD
MAb1 49.9 ± 5.1
MAb2 45.0 ± 5.5
MAb3 51.1 ± 3.5
MAb4 42.5 ± 6.7
MAb5 51.7 ± 3.1
다섯 가지의 CEACAM5-특이적 항체들은 세포 표면막에서 발현된 CEACAM5의 결합 후에 내재화를 거쳐, 암세포에 특이적으로 세포 독성을 나타내는 항체 면역접합체 분야에서의 용도를 뒷받침한다. 항-CEACAM5 항체들 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 및 MAb5는 24시간 배양 후 각각 49.9%, 45%, 51.1%, 42.5%, 51.7%의 MKN45 인간 암세포주에서의 내재화를 보여주었다. 실시예 3.4 : MKN45 세포주에 대한 상응하는 쥐과의 ADC의 세포 독성 활성
쥐 항체들을 시험관 내 세포 독성 활성을 정의하기 위하여 접합시켰다. 15 ml 튜브에, 실온(23℃)에서, mAb, 완충액 A /HEPES(4%), DMA(디메틸아세트아미드, 20% v/v), 그 다음 SPDB 링커 6당량을 마그네틱 교반 하에 연속적으로 도입한다. 실온에서 하룻밤 후에, 15 mM DMA 용액 내의 DM4(메이탄시노이드, 9.6당량)을 첨가하고, 5시간 동안 반응시킨다. 미정제 접합 혼합물을 수퍼덱스(Superdex) 200pg 16/60 또는 G25 26/10 컬럼(PBS-Na pH7.4 / 5% NMP) 상에서 정제하고, Amicon 15 @ 5000g로 농축시키고, Millex 0.22 ㎛로 여과시킨다.
그런 다음, 항-CEACAM5 메이탄시노이드 접합체의 효과를 세포 타이터-글로 키트(Cell Titer-Glo kit, 프로메가(Promega))를 이용하는 종양 세포 생존능으로 시험하였다. 그렇게 하기 위하여 MKN45 인간 위암 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃/5%CO2 공기에서 4시간 동안 부착되도록 하였다. 상이한 농도의 항-CEACAM5 접합체를 시딩한 세포에 첨가하였다. 그런 다음, 세포들을 동일한 공기에서 96시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포 타이터-글로 시약을 실온에서 10분 동안 웰에 첨가하고, 발광 신호를 EnVision 플레이트 계수기(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))를 이용하여 측정하였다.
CEACAM5+ MKN45 세포주에 미치는 CEACAM5-특이적 쥐 ADC들의 세포 독성 활성
항체 약물 접합체 세포 독성 활성
IC50 (nM)
MAb1-SPDB-DM4 0.89 ± 0.23
MAb2-SPDB-DM4 0.14 ± 0.01
MAb3-SPDB-DM4 0.53 ± 0.15
MAb4-SPDB-DM4 0.96 ± 0.02
MAb5-SPDB-DM4 0.24 ± 0.04
메이탄시노이드(DM4)에 접합된 항-CEACAM5 항체들 MAb1-SPDB-DM4, MAb2-SPDB-DM4, MAb3-SPDB-DM4, MAb4-SPDB-DM4 및 MAb5-SPDB-DM4는 각각 0.89, 0.14, 0.53, 0.96 및 0.24 nM의 IC50으로 시험관 내 세포 독성 활성을 보여주었다. 실시예 4 : 항-CEACAM5 mAb의 중쇄 및 경쇄의 서열 결정
mAb의 가변 도메인들의 서열을 하이브리도마로부터 회수하고, 발현 벡터로 클로닝하여 클로닝된 mAb들이 최초의 쥐 mAb들과 동일한 특성을 나타내는지를 확인하였다.
유래된 아미노산 서열들은 중쇄 및 경쇄(LC, HC)의 N 말단 서열 분석 및 질량 분광분석법(LC/MS)에 의해 하이브리도마로부터 유래된 정제된 mAb들에 대해 획득된 데이터와 일치하는 정보를 제공하였다(표 7 참조).
하이브로도마로부터의 항-CEACAM5 mAb의 질량 분광분석
질량 (Da)
클론 ID 쇄 배치로부터 LC/MS에 의한 질량 인실리코(in silico) 값
회수된 서열
MAb1 LC 23837 23836
HC (G0F) 50328 50330
MAb2i* LC 23467 23467
HC (G0F) 50288 50286
MAb3 LC 23907 23907
HC (G0F) 50372 50373
MAb4 LC 23731 23731
HC (G0F) 50370 50370
MAb5 LC 23659 23659
HC (G0F) 50329 50330
*: MAb2i는 클로닝된 하이브리도마 중 하나에 의해 생산된 항체이고, 이로부터 소위 "MAb2"가 실시예 5에서 설명된 바와 같이 VL 및 VH의 프레임워크 부위에 정준 잔기들을 도입함으로써 유도되었다. 실시예 5 : 항체 약물 접합체(ADC)(키메라)
실시예 5.1: 네이키드 키메라 mAb
가변 도메인 VH, VL의 핵산 서열들을, 각각 인간 IgG1 또는 인간 C카파 불변 도메인을 부호화하는 서열과 융합한 발현 벡터들로 클로닝하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 HEK293에 일시적 발현에 의해 키메라 mAb들의 배치를 생성하였다. 인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 친화도는 쥐 및 키메라 mAb들에 대해 유사하게 나타냈다. 표 8에서, 인간 또는 시노몰구스 CEACAM5를 이용한 ELISA에 의해 얻어진 EC50으로 친화도를 설명하였다.
쥐 하이브리도마 및 상응하는 키메라 mAb에 대하여 CEACAM5로 획득된 EC50
쥐 하이브리도마 mAb에 대해 획득된 EC50 키메라 mAb에 대해 획득된 EC50
클론 ID hCEACAM5 cCEACAM5 클론 ID hCEACAM5 cCEACAM5
MAb1 0.53 1.18 chMAb1 0.51 1.57
MAb2i 0.14 0.07 chMAb2
(로트 1)		 0.16 0.13
chMAb2
(로트 2)		 0.14 0.17
chMab2K52R 0.11 0.15
MAb3 0.36 3.72 chMAb3 미시행 미시행
MAb4 0.08 0.05 chMAb4 0.14 0.12
MAb5 0.4 0.45 chMAb5 0.18 0.13
CDR 부위에 대한 서열들을 IMBT 명명법을 이용한 단백질 서열로부터 추론하였다. 그것들은 SEQ ID NO: 1-4, 6, 7-10, 12, 13-16, 18, 19-22, 24, 25-28, 30에 해당한다.흥미롭게도, 클로닝된 하이브리도마에 의해 생산된 항체(MAb2i)에 비해, 정준 잔기들은 VL 상의 41G, 42K, 및 45Q번 위치 및 VH 상의 5Q 및 7S번 위치에서 클론 MAb2로 도입되었다.
게다가, 클론 MAb2 CEA-4의 VL 상의 52번 위치의 리신은 CDR2에 있으며, 클론 Mab2K52R에서 아르기닌에 의해 교체되었다. 클론 MAb2에 해당하는 것과 동일한 조건에서 배치가 생성되었고, 표 7에 나타난 바와 같이 인간 및 시노몰구스 CEACAM5 세포외 도메인에 대해 비슷한 친화도를 초래했다. 그것은 CDR에서의 이러한 점 돌연변이가 결합에 어떠한 영향도 미치지 않고도 만들어질 수 있음을 강조하였다.
클론 MAb2 및 클론 Mab2K52R에 대한 키메라 mAb의 LC 및 HC 서열들은 SEQ ID NO:43, 44, 54에 해당한다.
실시예 4에 기술된 바와 같이 chMAb2를 구축하였다. 그것은 인간 IgG1, Ck 이소형을 나타내는 클론 MAb2로부터 유래된 키메라 mAb이다. 서열은 SEQ ID NO:43 및 44에 해당한다. HEK293에서 일시적 발현에 이어, 단백질 An 친화도 크로마토그래피 정제에 의해 300 mg 규모로 배치를 제조하였다. 결합 데이터는 표 7 참조. 그것은 ADC 생산을 위해 사용된 네이키드 mAb였다.
실시예 5.2 : ADC의 생산 및 특성 분석
본 실시예에서, 네이키드 키메라 mAb로부터 면역접합체를 제조한 다음, 생체 내 효능을 평가하였다.
DAR 계산:
접합체는 일반적으로 항체에 공유적으로 부착된 메이탄시노이드를 1 내지 10개 분자(들)로 포함한다(소위 "약물 대 항체 비율" 또는 "DAR"). 이러한 수는 (메이탄시노이드/항체 비율, 반응 시간, 용매 및 공용매가 존재한다면 공용매의 속성과 같은) 접합에 이용되는 실험 조건과 함께, 항체 및 이용되는 메이탄시노이드의 속성에 따라 다를 수 있다. 따라서, 항체와 메이탄시노이드간의 접촉은 상이한 약물 대 항체 비율; 선택적으로 네이키드 항체; 선택적으로 응집체에 의해 서로 상이한 여러 접합체들을 포함하는 혼합물을 초래한다. 따라서, 결정되는 DAR은 평균값이다.
DAR을 결정하기 위하여 본 출원에서 이용된 방법은 실질적으로 정제된 접합체 용액의 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도 비율을 분광학적으로 측정하는 것으로 이루어진다. 특히, 상기 DAR은 항체와 메이탄시노이드(εD280 = 5,180 M-1cm-1 및 εD252 = 26,159 M-1cm-1)에 대해 각각 280 및 252 nm에서의 측정된 흡광 계수를 이용하여 분광학적으로 결정될 수 있다. 계산법은 Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science로부터 유래되며, 아래에 더욱 상세하게 기술한다:
252 nm(A252) 및 280 nm(A280)에서의 접합체에 대한 흡광도를 ("DAR(SEC)" 매개변수를 계산할 수 있게 하는) 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 단량체 피크 상에서 또는 ("DAR(UV)" 매개변수를 계산할 수 있게 하는) 전형적인 분광분석 기기를 이용하여 측정한다. 흡광도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
A252 = (CD x εD252) + (CA x εA252)
A280 = (CD x εD280) + (CA x εA280)
이때,
● cD 및 cA는 각각 메이탄시노이드 및 항체의 용액에서의 농도이다.
● εD252 및εD280은 각각 252 nm 및 280 nm에서의 메이탄시노이드의 몰 흡광 계수이다.
● εA252 및 εA280은 각각 252 nm 및 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수이다.
두 개의 미지의 물질들을 이들 두 식으로 분해할 경우, 다음의 식으로 이어진다:
cD = [(εA280 x A252) - (εA252 x A280)] / [(εD252 x εA280) - (εA252 x εD280)]
cA = [A280 - (cD x εD280)] / εA280
그런 다음, 평균 DAR을 항체의 농도에 대한 약물의 농도의 비율로부터 계산한다: DAR = cD / cA.
접합체의 탈당화 및 고분별능 질량 분광분석법(HRMS)
탈당화는 글리코시다아제에 의한 효소적 소화 기법이다. 탈당화는 500 ㎕의 접합체 + 100 ㎕의 트리스 완충액 HCl 50 mM + 10 ㎕의 글리카나아제-F 효소(동결 건조된 효소 100유닛/ 물 100 ㎕)로부터 이루어진다. 매질을 볼텍싱하고, 37℃에서 하룻밤 유지시킨다. 그러면, 탈당화된 시료는 HRMS로 분석할 준비가 된다. 워터스 Q-Tof-2 시스템 상에서 전기분무 양성 모드(ES+)로 질량 스펙트럼을 얻었다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: 칼럼: 4 ㎛ 바이오스위트(BioSuite) 250 URH SEC 4.6x300 mm (워터스); 용매: A: 포름산암모늄 25 mM + 1％ 포름산 : B: CH3CN; 칼럼 온도: 30℃; 유속 0.4 ml/분; 등용매 용리 70％ A + 30％ B (15분).
분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
- 컬럼: TSK겔(gel) G3000 SWXL 5 ㎛ 컬럼, 7.8 mm x 30 cm, 토소 바이오사이언스, 엘엘씨(TOSOH BIOSCIENCE, LLC) Part # 08541 + 가드 컬럼 TSK-GEL SWXL 7 ㎛, 40 mm x 6mm, 토소 바이오사이언스, 엘엘씨 Part # 08543
- 이동상: KCl(0.2M), KH2PO4(0.052M), K2HPO4(0.107M), iPrOH (부피로 20%)
- 분석 조건: 30분 동안 0.5 ml/분으로 등용매 용리
- 분석은 라크롬 엘리트 (Lachrom Elite) HPLC 시스템 (머크(Merck)) 상에서 L2455 DAD 분광광도계 검출기를 이용하여 수행하였다.
완충액 내용물
- 완충액 A(pH 6.5): NaCl(50 mM), 인산 칼륨 완충액(50 mM), EDTA (2mM)
- 완충액 HGS(pH 5.5): 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 5% (w/v), HCl(8 mM)
사용 약어
CV: 컬럼 부피; DAR: 약물 항체 비율; DMA: 디메틸아세트아미드; HEPES: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산; HRMS: 고분별능 질량 분광분석법; NHS: N-하이드록시석신이미드; 니트로-SPDB: 부탄산, 4-[(5-니트로-2-피리디닐)디티오]-, 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 에스테르(WO2004016801 특허에 기술된 바와 같이 제조될 수 있음); NMP: N-메틸피롤리디논; RT: 실온; SEC: 크기 배제 크로마토그래피
ADC(키메라):
chMAb1-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 148438 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 213320; ε252nm(Ab) = 73473
ε280nm(DM4) = 5180 및 ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.59 ml의 chMAb1(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.72 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.312 ml의 DMA와 0.046 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 마그네틱 교반 하에, 3.8 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.389 ml의 DMA 및 0.074 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2.5시간 후, 미정제 반응 혼합물을 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 5% NMP를 부피로 함유하는 PBS pH7.4 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이로드(HiLoad) 26/60 탈염 컬럼(수퍼덱스 200 pg; GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 5%의 NMP를 함유하는 PBS pH7.4 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 아미콘(Amicon) 울트라-15(울트라셀(Ultracel) 10 k, 밀리포어) 상에서 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 7.6 ml의 chMAb1-SPDB-DM4 접합체(c=2.19 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.38 ; DAR (SEC)= 3.34 ; RT= 17.54분 ; 단량체 순도= 99.8%.
HRMS 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
chMAb2-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147900 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 70889
ε280nm(DM4) = 5180 및 ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.8 ml의 chMAb2(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.08 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.337 ml의 DMA와 0.0433 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 마그네틱 교반 하에, 3.12 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.319 ml의 DMA 및 0.069 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 5% NMP를 부피로 함유하는 PBS pH7.4 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이로드(HiLoad) 26/60 탈염 컬럼(수퍼덱스 200 pg; GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 5%의 NMP를 함유하는 PBS pH7.4 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 아미콘 울트라-15(울트라셀(Ultracel) 10 k, 밀리포어) 상에서 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 7.5 ml의 chMAb2-SPDB-DM4 접합체(c=1.8 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 4.10 ; DAR (SEC)= 4.05 ; RT= 17.52분 ; 단량체 순도= 99.9%.
HRMS 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
chMAb4-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 148124 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 204380; ε252nm(Ab) = 73142
ε280nm(DM4) = 5180 및 ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.63 ml의 chMAb4(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.69 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.316 ml의 DMA와 0.0465 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 마그네틱 교반 하에, 3.8 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.389 ml의 DMA 및 0.074 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2시간 후, 미정제 반응 혼합물을 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 5% NMP를 부피로 함유하는 PBS pH7.4 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이로드(HiLoad) 26/60 탈염 컬럼(수퍼덱스 200 pg; GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 5%의 NMP를 함유하는 PBS pH7.4 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 아미콘 울트라-15(울트라셀(Ultracel) 10 k, 밀리포어) 상에서 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 6.5 ml의 chMAb4-SPDB-DM4 접합체(c=2.20 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.87 ; DAR (SEC)= 3.85 ; RT= 17.52분 ; 단량체 순도= 99.8%.
HRMS 분석 결과는 도 10에 나타내었다.
chMAb5-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 148040 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 207360; ε252nm(Ab) = 72288
ε280nm(DM4) = 5180 및 ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.15 ml의 chMAb5(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 6.38 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.269 ml의 DMA와 0.0453 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 마그네틱 교반 하에, 4.1 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.317 ml의 DMA 및 0.072 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 5% NMP를 부피로 함유하는 PBS pH7.4 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이로드(HiLoad) 26/60 탈염 컬럼(수퍼덱스 200 pg; GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 5%의 NMP를 함유하는 PBS pH7.4 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 아미콘 울트라-15(울트라셀(Ultracel) 10 k, 밀리포어) 상에서 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 7.5 ml의 항CEACAM5_hyb_1917CEA4_VH5Q7S_VL41G42K45Q_IgG1-SPDB-DM4 접합체(c=3.4 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.4 ; DAR (SEC)= 3.4 ; RT= 17.49분 ; 단량체 순도= 99.8%.
HRMS 분석 결과는 도 11에 나타내었다.
실시예 5.3: 생체 내 효능
암컷 SCID 마우스에 피하로 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 네 개의 키메라 접합체(chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 및 chMAb2-SPDB-DM4)를 2가지 용량에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 접합체의 용량은 mg/kg으로 나타내었다. 마우스에 종양 이식 후 14일째에 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 5 및 2.5로 투여하였다.
접합체의 항-종양 활성 평가를 위해, 동물들의 체중을 매일 측정하였고, 캘리퍼로 종양을 매주 2회 측정하였다. 최하점(군 평균)에서 20%의 체중 감량 또는 10% 이상의 약물 사망을 가져오는 투여량을 과도하게 독한 투여량으로 간주하였다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다. 종양 부피를 질량(mm3) = [길이(mm) × 너비(mm)2]/2의 식을 이용하여 계산하였다. 1차 효능 종말점은 ΔT/ΔC, 퍼센트 퇴행 중간값, 부분 퇴행 및 완전 퇴행(PR 및 CR)이다.
각각의 치료군(T)과 대조군(C)의 종양 부피의 변화는 각 종양에 대해, 소정의 관찰일의 종양 부피로부터 1차 치료 당일(단계 결정일(staging day))의 종양 부피를 감산하여 계산한다. 치료군에 대해 중간값 ΔT를 계산하고, 대조군에 대해 중간값 ΔC를 계산한다. 그런 다음, 비율 ΔT/ΔC을 계산하고, 퍼센티지로 표현한다: ΔT/ΔC = (델타 T/델타 C) x 100.
이러한 용량은 ΔT/ΔC가 40% 미만일 때 치료적으로 활성이 있고, ΔT/ΔC가 10% 미만일 때 매우 활성이 있다고 간주된다. ΔT/ΔC가 0 미만인 경우, 이러한 용량은 고도로 활성이 있다고 간주되며, 퇴행 퍼센티지를 날짜에 따라 기록하였다(Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L and Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. In: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):
종양 퇴행 %는 1차 치료 첫째 날의 종양 부피와 비교하여, 소정의 관찰 시 처리군에서의 종양 부피 감소의 %로 정의된다.
소정의 시점에서 그리고 각각의 동물에 대해, 퇴행 %가 계산된다. 그런 다음, 퇴행 % 중간값을 군에 대해 계산한다:
퇴행 % (t에서) =
Figure pat00008
부분 퇴행(PR): 퇴행은, 종양 부피가 처리 개시 시 종양 부피의 50%까지 감소하는 경우, 부분적인 것으로 정의된다.
완전 퇴행(CR): 완전 퇴행은 종양 부피 = 0 mm3일 때 달성된다(종양 부피를 기록할 수 없을 때 CR이 간주된다).
결과:
결과를 도 4 및 표 9(아래)에 나타내었다. 2.5 및 5 mg/kg의 단일 투여 스케줄 이용 시, 본 연구에서 시험한 모든 접합체는 독성을 유도하지 않았다.
chMAb1-SPDB-DM4는 각각 0 및 7%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001 및 p = 0.0170)로 5 및 2.5 mg/kg에서 매우 활성이 있었다. chMAb4-SPDB-DM4 및 chMAb5-SPDB-DM4는 각각 -5와 -7%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 5 mg/kg에서 고도로 활성이 있었으며, 각각 25 및 65%의 종양 퇴행을 나타냈다. 그것들은 각각 7 및 2%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p = 0.0152 및 p = 0.0020)로 2.5 mg/kg에서 매우 활성이 있었다. chMAb2-SPDB-DM4는 각각 -10 및 -8%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 5 및 2.5 mg/kg에서 고도로 활성이 있었으며, 종양 퇴행은 각각 82 및 39%였고, 3 및 1 CR/6이었다.
이러한 결과로부터, 모든 키메라 접합체 chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 및 chMAb2-SPDB-DM4가 치료적 ADC를 개발하는 데 이용 가능했다.
Figure pat00009
실시예 6: 항-CEACAM5_MAb2 mAb의 인간화
본 실시예에서, 쥐의 모 IgG MAb2의 인간화 변이형들을 인실리코로 설계하였다. 그 결과에 따른 mAb들을 생산하여, 키메라 IgG ch-MAb2와 유사한 특성을 제공하였다.
실시예 6.1: 4D-인간화 프로토콜
a) 분자 동역학 궤도(Molecular dynamic trajectory)를 기초를 한 인간화
쥐 MAb2 클론의 VL 및 VH 서열들을 단백질 데이터 베이스(PDB)(Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242)에 대해 비교하였다. 분자 작동 환경(Molecular Operating Environment(MOE)(v. 2011.10 - Chemical Computing Group, 캐나다 퀘벡)을 이용하여 항-CEACAM5 LC 및 HC의 상동성 모델을 구축하고자 다음의 주형을 이용하였다: 경쇄 및 중쇄 프레임워크 - 3EHB(90.9% 프레임워크 경쇄 동일성 및 90.8% 프레임워크 중쇄 동일성), L1 - 1I8M, L2 - 1F6L, L3 - 1P7K, H1 - 2QHR, H2 - 1IGT 및 H3 - 1P4B. 이후, MOE에 구현된 표준 절차를 이용하여 상동성 모델의 에너지를 최소화하였다.
이후, 쥐 MAb2의 최소화된 3D 상동성 모델의 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 일반화 보른 속용매(Generalized Born implicit solvent)에서 1.1 나노 초(ns) 동안 500K 온도로 단백질 백본에 대한 제한 하에서 수행하였다. 이러한 첫 번째 MD 실행으로부터 마지막 1 나노 초 동안 매 100 피코 초(ps)마다 10개의 다양한 입체배좌를 추출하였다. 그런 다음, 이들 다양한 입체배좌를 대상으로 단백질 백본에 대한 제한 없이, 300K 온도에서, 2.3 ns 동안 각각 MD 시뮬레이션을 수행하였다. 10회의 MD 실행 각각에 대해, MD 궤적으로부터의 매 ps마다 1개씩의 마지막 2,000 스냅샷을 참조 메도이드(medoid) 위치와 비교하여 각 쥐 MAb2 아미노산에 대해 평균 제곱근 편차(rsmd)를 계산하는 데에 이용하였다. 주어진 아미노산의 10개의 개별적인 MD 실행에 대한 평균 rmsd를 모든 MAb2 쥐 아미노산들의 전체 평균 rmsd와 비교하여, MD 중에 보이는 것처럼 아미노산이 충분히 유연한 경우, T 세포 수용체와 상호 작용할 가능성이 높으며 면역 반응의 활성화를 담당할 가능성이 높다고 간주하기로 한다. 쥐 MAb2 항체에서 CDR 및 이의 5Å 바로 인접한 것들을 제외한, 32개 아미노산이 유연한 것으로 확인되었다.
그런 다음, 분자 역동학 시뮬레이션의 20 나노 초(10 x 2 ns) 동안, 60개의 가장 유연한 쥐 MAb2 아미노산들의 운동을 49개의 인간 3D 상동성 모델(이들 각각에 대해서는 동일한 MD 시뮬레이션이 실행되었다)의 상응하는 유연한 아미노산의 운동과 비교하였다. 이러한 49개의 인간 배선 모델은 7개의 인간 경쇄(즉, vk1, vk2, vk3, vk4, v람다1, v람다2, v람다3)의 대표적인 패널을 7개의 인간 중쇄(즉, vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)의 대표적인 패널과 체계적으로 조합하여 구축되었다(Nucleic Acid Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597).
쥐 MAb2 항체의 유연한 아미노산과 비교하여, vk1-vh6 조합은 이의 유연한 아미노산의 가장 높은(72.6%) 4D 유사성을 나타냈다. 따라서, 이러한 모델을 유연한 아미노산을 초점으로 하는 MAb2 항체를 인간화하는 데 이용하였다. 쥐 MAb2와 vk1-vh6 아미노산 사이의 쌍별 아미노산 회합을 위하여, 2가지 상응하는 상동성 모델의 알파 탄소들 f의 최적 3D 중첩을 기초로 하여 두 서열들을 정렬시켰다.
b) 안정화 돌연변이
항-CEACAM5의 VL 및 VH 부위들의 안정성을 향상시키기 위하여, CDR을 제외한 경쇄 및 중쇄의 아미노산들 각각의 정준 서열에 대해, 낮은 발생 빈도를 나타내는 경쇄 및 중쇄의 아미노산들은 본래 가장 빈번하게 발견된 아미노산들로 돌연변이되도록 제안된다(ΔΔGth > 0.5 kcal/mol; Monsellier et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). LC 및 HC에 대한 공통적인 돌연변이들의 제1 목록은 가장 근접한 인간 모델에서 발견된 아미노산들로 한정되었다(즉, vk1-vh6). 이러한 돌연변이들 중 어느 것도 "버니어(Vernier)" 구역(Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499)에 위치하고 있지 않다. 항-CECAM5 MAb2 항체를 잠재적으로 안정화하기 위한 이러한 공통적인 돌연변이들을 고려하는 데에 있어서 다른 기준들이 고려된다. 이러한 기준들은 표면에서의 소수친수성의 긍정적인 변화 또는 예측된 돌연변이의 안정화를 기초로 한 분자 역학이다. 문헌 (Bedouelle, H. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593; Steipe B. J. Mol. Biol. 1994, 240, 188-192)에서 성공적이었다고 보고된 안정화 돌연변이가 고려되었다.
c) 원치 않는 서열 모티프 제거
다음의 서열 모티프를 고려하였다: Asp-Pro(산에 불안정한 결합), Asn-X-Ser/Thr(당화, X = 임의의 아미노산, 그러나 Pro), Asp-Gly/Ser/Thr(유연성 영역에서 석신이미드/이소-asp 형성), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(노출된 탈아미드화 부위), Met(노출된 영역에서의 산화). 그에 따른 인간화 서열들을 대상으로 면역 에피토프 데이터 베이스(IEDB)((PLos Biol (2005) 3(3)e91) http://www.immuneepitope.org)에 대해 서열 유사성을 블라스트하여, 어떠한 서열도 열거된 임의의 공지된 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 함유하지 않음을 확인하였다.
d) 인간화된 VH 및 VL 부위
경쇄에 대해 3개의 버전(VL1, VL1a 및 VL1c) 및 중쇄에 대해 3개의 버전(VH1, VH1a 및 VH1b)이 제안되었다. 각 인간화 MAb2 VL 및 VH 변이형에서 변경된 아미노산 잔기들의 특정 조합을 각각 표 10과 표 11에 기재하였다. 인간화 VH 및 VL 도메인의 완전한 아미노산 서열을 표 12에 기재하였다.
VL1 변이형은 항-CEACAM5 MAb2 경쇄의 비 CDR의 가장 유연한 아미노산과 vk1 인간 경쇄 서열 간의 직접적인 비교로부터 도출되는 5개의 돌연변이를 보여준다.
VL1a 변이형은 VL1으로부터 유래하며, 공통적이고(vk1 서열) 잠재적으로 안정화하는 4개의 새로운 돌연변이를 포함한다. 더구나, 이들 돌연변이 중 하나는 잠재적으로 문제가 되는 탈아미드화 자리(D17T18)를 다룬다.
VL1c 변이형은 VL1a로부터 유래하며, 52번 위치에 K 대신 하나의 돌연변이 R을 도입한다. 사실, 이 K52는 CDR L2에 위치하며, 접합 과정에 대해 "표적"이 될 수 있다.
VH1 변이형은 항-CEACAM5 중쇄의 비 CDR의 가장 유연한 아미노산과 vh6 인간 중쇄 서열 사이의 직접적인 비교로부터 유래하는 7개의 돌연변이를 포함한다.
VH1a 변이형은 VH1으로부터 유래하며, 공통적이고(vh6 서열) 잠재적으로 안정화하는 4개의 새로운 돌연변이를 포함한다.
인간화 항-CEACAM5 MAb2 항체 VL 및 VH 도메인을 다음과 같이 조합하였다: VL1과 VH1; VL1a와 VH1a; VL1c와 VH1a; VL1a와 VH1b.
항-CEACAM5 MAb2 항체의 VL 변이형의 돌연변이
마우스 MAb2 VL VL1 VL1d VL1a VL1c
E17 D D D D
T18 R R
Q40 P P P P
Q45 K K K K
K52 R R
Q70 D D
K74 T T T T
N76 S S S S
G84 A A
S85 T T
항-CEACAM5 MAb2 항체의 VH 변이형의 돌연변이
마우스 MAb2 VH VH1 VH1a
G9 P P
V10 G G
K19 S S
K43 R R
R44 G
F60 A
D62 S S
Q65 K K
N84
K87 T T
I89 V
A113 S
예시적인 인간화 항-CEACAM5 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열
VH 또는 VL 변이형 서열 SEQ ID NO.
클론 MAb2 VH1 EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFS
SYDMSWVRQTPERRLEWVAYISSGGGITYF
PSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSED
TAIYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA		 SEQ ID NO:51
클론 MAb2 VH1a EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFS
SYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYA
PSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSED
TAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS		 SEQ ID NO:5
클론 MAb2 VL1 DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIF
SYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTKTLAEGVPS
RFSGSGSGTQFSLTISSLQPEDFGSYYCQH
HYGTPFTFGSGTKLEIK		 SEQ ID NO:17
클론 MAb2 VL1a DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIF
SYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTKTLAEGVPS
RFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQH
HYGTPFTFGSGTKLEIK		 SEQ ID NO:23
클론 MAb2 VL1c DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIF
SYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPS
RFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQH
HYGTPFTFGSGTKLEIK		 SEQ ID NO:29
클론 MAb2 VL1d DIQMTQSPASLSASVGDTVTITCRASENIF
SYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPS
RFSGSGSGTQFSLTISSLQPEDFGSYYCQH
HYGTPFTFGSGTKLEIK		 SEQ ID NO:55
실시예 6.2: 인간화 항 CEACAM5 mAb의 서열인실리코 VL 및 VH 변이형의 아미노산 서열들로부터, 핵산 서열을 도출하여 Geneart로 합성하였다. 서열들을 각각 인간 IgG1 또는 인간 C카파 불변 도메인 부호화 서열들과 융합한 발현 벡터로 클로닝하였다.
실시예 6.3: 생산 및 시험관 내 특성 분석
인간화 mAb의 배치들을 HEK293에 일시적인 발현으로 생산하고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 구조 및 정체성을 SDS-PAGE 분석, 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법으로 확인하였다.
인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 친화도를 ELISA로 확인하였고, EC50을 표 13에 제공하였다.
인간 및 시노몰구스 CEACAM5에 대한 인간화 항-CEACAM5 mAb의 친화도
인간 CEACAM5 시노몰구스 CEACAM5
부호 mAb EC50 (nM) CV EC50 (nM) CV
huMAb2-1 MAb2VL1VH1-IgG1 0.22 4.7 % 0.20 7.9 %
huMAb2-2 MAb2_VL1aVH1a-IgG1 0.20 9.2 % 0.17 5.0 %
huMAb2-3 MAb2_VL1cVH1a-IgG1 0.18 11 % 0.19 4.3 %
huMAb2-4 MAb2_VL1d VH1-IgG1 0.22 4.3 % 0.17 5.0 %
chMAb2 MAb2-IgG1 0.16 9.9 % 0.17 3.0 %
인간 CEACAM5 대 인간 CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 and CEACAM8에 대한 특이성을 ELISA로 확인하였다. 그것을 인간 CEACAM5와의 전체 결합과 비교하여, 결합 퍼센티지로 보고하였다. 표 14 참조.
인간 CEACAM에 대한 인간화 항-CEACAM5 mAb의 결합 퍼센티지
hCEA
부호 mAb CAM5 CAM1 CAM6 CAM7 CAM8
huMAb2-1 MAb2_VL1VH1-IgG1 100 % 0.3 % 0.2 % 0.3 % 0.9 %
huMAb2-2 MAb2_VL1aVH1a-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 0.3 % 0.5 %
huMAb2-3 MAb2_VL1cVH1a-IgG1 100 % 0.2 % 0.3 % 0.3 % 0.6 %
huMAb2-4 MAb2_VL1d VH1-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 0.3 % 1.4 %
chMAb2 MAb2-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 0.3 % 0.6 %
에피토프 결합 도메인을 ELISA로 확인하였고, 인간화 변이형이 A3-B3 도메인을 특이적으로 인식함을 보여주었다. 그것을 표 15에 인간 CEACAM5와의 전체 결합과 비교하여 결합 퍼센티지로 보고하였다.
인간 CEACAM5 도메인에 대한 인간화 항-CEACAM5 mAb의 결합 퍼센티지
hCEACAM5
부호 mAb N-ter-A1-B1 A2-B2 A3-B3
huMAb2-1 MAb2_VL1VH1-IgG1 0.4 % 0.3 % 100 %
huMAb2-2 MAb2_VL1aVH1a-IgG1 0.4 % 0.3 % 100 %
huMAb2-3 MAb2_VL1cVH1a-IgG1 0.4 % 0.4 % 100 %
huMAb2-4 MAb2_VL1d VH1-IgG1 0.3 % 0.3 % 100 %
chMAb2 MAb2-IgG1 0.5 % 0.3 % 100 %
키메라 MAb2와 비교하여, 재조합 인간 CEACAM5(hCEACAM5) 및 시노몰구스 원숭이 CEACAM5(cCEACAM5)에 대한 인간화 항-CEACAM5_MAb2 변이형의 결합 동역학을 비아코어(BIAcore) 2000(BIAcore Inc., 미국 뉴저지 주 웁살라)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 분석법으로 결정하였다.간략하게는, CM5 비아코어 바이오센서 칩을 기기에 도킹시키고, 실온에서 1:1 NHS/EDC 70 ㎕로 활성화시켰다. 마우스 항-α인간Fc IgG1(비아코어 #BR-1008-39)(1M 아세트산염 완충액 pH5 내 50 ㎍/mL)을 모든 흐름 셀에서 활성화된 칩 상에 고정시켰다. 고정은 포화될 때까지 10 ㎕/분의 유속으로 수행하였다. 그런 다음, 칩을 70 ㎕의 에탄올아민-HCl, pH 8.5 주입으로 블로킹시키고, 3M MgCl2로 1회 세척하였다. 항-CEACAM5 mAb의 인간 CEACAM5 단백질 또는 시노몰구스 CEACAM5 단백질에 대한 결합을 측정하기 위하여, 항체들을 비아코어 전개 완충액(HBS-EP)에 1-5 ㎍/mL로 이용하였다. 항원(인간 CEACAM5 또는 시노몰구스 CEACAM5))을 1 내지 500 nM 주입하였다. 주입 단계 완료 후, 600초 동안 동일한 유속으로 비아코어 전개 완충액에서 해리를 모니터링하였다. 주입들 사이에 2 x 5 ㎕ MgCl2 3M (2 x 30s)을 이용하여 표면을 재생하였다. BIA 평가 소프트웨어를 이용하여 개별적인 센서그램을 분석하였다.
인간 및 원숭이 CEACAM5에 대한 인간화 항-CEACAM5 mAb의 결합
인간 CEACAM5 시노몰구스 CEACAM5
mAb KD (nM) KD (nM)
huMAb2-1 9.8 41.7
huMAb2-2 24.5 96.0
huMAb2-3 11.7 73.5
huMAb2-4 6.9 38.6
chMAb2 9.9 52.3
키메라 MAb2와 비교하여, 인간화 항-CEACAM5_MAb2 변이형의 시노몰구스 CEACAM5 대 시노몰구스 CEACAM1, CEACAM6 및 CEACAM8에 대한 특이성을 ELISA로 확인하였다. 그것을 CEACAM5와의 전체 결합 또는 EC50의 결합과 비교하여 결합 퍼센티지로 보고하였다. 아래 표 17 참조.
시노몰구스 CEACAM에 대한 인간화 항-CEACAM5 mAb의 결합 퍼센티지
시노몰구스 CEA
부호 mAb CAM5 CAM1 CAM6 CAM8
huMAb2-1 MAb2_VL1VH1-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 3.6 %
huMAb2-2 MAb2_VL1aVH1a-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 0.9 %
huMAb2-3 MAb2_VL1cVH1a-IgG1 100 % 0.3 % 0.4 % 1.2 %
huMAb2-4 MAb2_VL1d VH1-IgG1 100 % 0.3 % 0.3 % 3.2 %
chMAb2 MAb2-IgG1 100 % 0.2 % 0.3 % 1.2 %
실시예 6.4 : 인간 배선 프레임워크에 대한 그래프팅에 의해 얻어진 Mab2의 인간화 변이형의 특성 분석본 실시예에서, Mab2의 인간화 변이형을 CDR 그래프팅 접근법으로 획득하였다. 또한, 인간화 항체의 CDR을 대상으로 몇몇 위치들이 인간 및 필리핀 원숭이 CEACAM5에 대한 결합에 영향을 미치지 않고도 치환될 수 있음을 보여주기 위하여 알라닌 스캐닝 접근법을 수행하였다.
먼저 쥐 항체 Mab2와의 구조적인 상동성을 기초로 하여 인간 배선 프레임워크를 선택함으로써 Mab2의 인간화 버전의 서열을 생성하였다. 경쇄의 경우, 선택된 인간 프레임워크를 유전자 IGKV1D-39*01과 IGKJ2*02로 정의하고, 중쇄의 경우, 유전자 IGHV3-23*04와 IGHJ4*01로 정의한다. Mab2K52R의 여섯 개의 CDR을 이러한 인간 프레임워크에 그래프팅시켰다. 세 개의 역돌연변이를 도입하였으며, VL(SEQ ID NO. 34)의 34번 및 53번(각각 FR2-L 및 FR3-L 부위), 그리고 VH(SEQ ID NO. 33)의 50번 위치(FR2-H 부위)에 해당하고, MAb2_VLg5VHg2로 정의된 다음 서열을 생성하였다.
MAb2_VLg5VHg2의 VH 및 VL 서열
VH 또는 VL 변이형 서열 SEQ ID NO.
MAb2_VHg2
 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSYISSGGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:74
MAb2_VLg5
 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNTRTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:75
MAb2_VLg5VHg2의 몇몇 변이형을 여섯 개의 CDR의 각 아미노산의 단일 교체에 의해, 바람직하게는 알라닌에 의한 교체에 의해 얻었다. 알라닌이 MAb2_VLg5VHg2 CDR에서 이미 발견될 때, 이는 H-CDR3에서 발생하는데, 또 다른 아미노산을 치환하였다(SEQ ID NO:74의 97번 잔기의 Val, 98번 잔기의 Arg 및 108번 잔기의 Asp).VL 및 VH 변이형의 인실리코 아미노산 서열로부터, 핵산 서열을 도출하여 유전자 합성법으로 생성하였다. 이러한 서열을 각각 인간 IgG1 또는 인간 C카파 불변 도메인 부호화 서열들과 융합한 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다. 인간화 MAb2_VLg5VHg2, 이와 하나의 위치가 상이한 단일 변이형 및 제한된 수의 조합 돌연변이들을 HEK293 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산하였다. 분비된 IgG(20 내지 70 ㎍/ml)를 함유하는 세포 상층액을 인간 CEACAM5 ECD, 필리핀 원숭이 ECD 및 인간 CEACAM5의 A3-B3 도메인에 대한 결합 분석법에 이용하기 위하여 1 ㎍/ml까지 희석하였다.
이러한 변경의 영향을 평가하기 위하여, 비아코어 T200 유닛(GE 헬스케어)로 SPR 신호를 측정하여 IgG 결합을 결정하였다. 항-인간 Fc 항체들을 10,000 반응 단위(RU) 수준에 이르도록 아민 결합 키드를 통해 S 시리즈 CM5 칩에 결합시켰다. 60초의 접촉 시간 및 10 ㎕/분의 유속으로 상층액을 1 ㎍/mL로 주입하여 대략 300 내지 600 RU의 각 변이형을 포획하였다. 모든 실험은 전개 완충액으로 HBS-EP+(10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20)을 이용하여 25℃에서 수행하였다. 스크리닝 모드에서는, 인간 CEACAM5 / 시노몰구스 CEACAM5 / 인간 A3B3 도메인을 포획된 IgG 변이형 위로 1분 동안 30 ㎕/분의 유속으로 50 nM 주입하였다. 10 ㎕/분의 유속 및 30초의 접촉 시간으로 3 M MgCl2의 1 펄스 주입으로 표면을 재생시키기 전에 60초의 해리 단계를 유지하였다.
각 실험을 위해, 참조 표면을 이용하여 반응 데이터를 처리하여, 벌크 굴절률 변화 및 임의의 비 특이적인 결합에 대해 보정하였다. 블랭크 주입으로부터의 반응을 이용하여 데이터를 이중으로 표준화하였다. GE 헬스케어의 적용 정보(Application note 28-9777-72 AA)에 기술된 스크리닝 방법에 따라, 두 가지 매개변수들이 결합 특성과 관련하여 변이형들의 순위를 매긴다고 간주되었다. 먼저, 결합 활성은 이론적인 최대 측정 신호의 비율로 추정된다(Rmax의 퍼센티지, 도 16 참고). 둘째, 남아있는 신호의 퍼센티지는 해리 보고서 시점(첫 번째는 주입 종료 후 10초, 두 번째는 주입 종료 후 50초)을 이용하여 계산되고, 결합의 안정성을 반영한다(도 17).
다음 위치에서의 단일 알라닌 변이체들은 본래의 항체와 비교하여 동등한 결합 매개변수들을 나타내어, 이들 위치에서의 CDR 아미노산이 결합에 대해 중성임을 시사하였다: LC 잔기 27, 28, 29, 31, 51,52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 및 HC 잔기 26 내지 31, 51 내지 58, 97, 103, 104, 107, 109. 이러한 변이형들의 행위는 인간 및 원숭이 CEACAM5과 유사하여, 교차 반응성을 유지한다. CEACAM5의 A3-B3 도메인에 대한 결합 또한 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다. 두 개의 중성 치환의 일부 조합도 생성되었으며, LC_T51A의 LC_T94A과의 조합, LC_S31A의 HC_G54Y의 조합 또는 LC_T53I의 HC_S53A의 조합으로 설명되는 바와 같이, 바뀌지 않은 결합 매개변수를 초래하는 것으로 밝혀졌다.
역으로, 모든 다른 CDR 위치에서는, 본래의 아미노산에 대한 알라닌의 치환은 결합의 완전한 상실 또는 극적으로 변화된 결합 매개변수를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄의 101번 위치 또는 경쇄의 32번 및 91번 위치는 도 16 및 도 17에 나타낸 예이다. 제2의 변이형 세트는 일부 이러한 위치에서의 더욱 보존적인 돌연변이를 시험하는 데에 있었다. 그렇게 하여, 본 발명자들은 다음의 보존적 치환이 항원 결합에 대해 중성임을 발견하였다: MAb2_VLg5의 30번 잔기의 Phe에 대한 Tyr, MAb2_VLg5의 92번 잔기의 Tyr에 대한 Phe, MAb2_VHg2의 98번 잔기의 Ala에 대한 Ser 및 MAb2_VHg2의 100번 잔기의 Tyr에 대한 Phe(도면에 도시).
실시예 7: MAb2의 인간화 변이형 약물 접합체
실시예 7.1: 생산 및 특성 분석
huMAb2-2-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147360 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 71693
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 19.4 mg의 huMAb2-2(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.1 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.375 ml의 DMA와 0.0439 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 2시간 동안 서서히 교반한다. 과량의 0.0044 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 첨가한다. 마그네틱 교반 하에 RT에서 2시간 후, 2 ml의 PBS pH=7.5 완충액과 0.072 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 10.3 ml의 huMAb2-2-SPDB-DM4 접합체(c=1.35 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.7 ; DAR (SEC)= 3.6 ; RT= 17.29분 ; 단량체 순도= 97.9%.
HRMS 분석 결과는 도 12에 나타내었다.
huMAb2-1-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147563 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 69669
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.8 ml의 huMAb2-1(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.08 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.341 ml의 DMA와 0.0392 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(4.5 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 과량의 0.0087 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(1.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 첨가한다. 마그네틱 교반 하에 RT에서 2시간 후, 2.62 ml의 PBS pH=7.5 완충액, 0.254 ml의 DMA 및 0.076 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 1시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 9.5 ml의 huMAb2-1-SPDB-DM4 접합체(c=1.35 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 4.1 ; DAR (SEC)= 4.0 ; RT= 17.39분 ; 단량체 순도= 96.7%.
HRMS 분석 결과는 도 13에 나타내었다.
huMAb2-3-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147417 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 71451
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.8 ml의 huMAb2-3(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.09 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.336 ml의 DMA와 0.0437 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 과량의 0.0035 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(0.4 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 첨가한다. 마그네틱 교반 하에 RT에서 1시간 후, 2.60 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.248 ml의 DMA 및 0.074 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 1시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 11 ml의 huMAb2-3-SPDB-DM4 접합체(c=1.08 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.9 ; DAR (SEC)= 3.8 ; RT= 17.44분 ; 단량체 순도= 98.4%.
HRMS 분석 결과는 도 14에 나타내었다.
huMAb2-4-SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147628 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 70628
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 3.8 ml의 huMAb2-4(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.09 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.345 ml의 DMA와 0.0448 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(5 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 30초 동안 볼텍싱한 다음, RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 과량의 0.0027 ml의 니트로-SPDB 링커 용액(0.3 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 첨가한다. 마그네틱 교반 하에 RT에서 1시간 후, 2.70 ml의 PBS pH 7.5 완충액, 0.263 ml의 DMA 및 0.075 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 1시간 후, 미정제 반응 혼합물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 11 ml의 huMAb2-4-SPDB-DM4 접합체(c=1.23 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.8 ; DAR (SEC)= 3.8 ; RT= 17.53분 ; 단량체 순도= 99.3%.
HRMS 분석 결과는 도 15에 나타내었다.
실시예 7.2: 시험관 내 세포 독성
재료 및 방법:
종양 세포 생존능에 미치는 항-CEACAM5 메이탄시노이드 접합체의 영향을 실시예 3.4에 기술된 바와 같이 평가하였다.
결과:
CEACAM5-특이적 인간화 ADC가 CEACAM5+ MKN45 세포주에 미치는 세포 독성 활성
ADC 세포 독성 활성
IC50 (nM) ± StD
chMAb2-SPDB-DM4 0.24 ± 0.02
huMAb2-1-SPDB-DM4 0.18 ± 0.01
huMAb2-2-SPDB-DM4 0.23 ± 0.02
huMAb2-3-SPDB-DM4 0.16 ± 0.01
관련 없는 ADC 8.52 ± 2.07
이러한 chMAb2-SPDB-DM4, huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, 및 huMAb2-3-SPDB-DM4 접합체들과, DM4와 관계 없는 접합체는 각각 0.24, 0.18, 0.23, 0.16 및 8.52 nM의 IC50으로, 배양물 내의 MKN45 세포에 시험관 내 세포 독성 활성을 나타내었다. 항-CEACAM5 접합체들의 세포 독성 활성은 관련 없는 DM4 접합체의 측정된 활성보다 53 내지 35배 낮아, 항-CEACAM5 접합체들의 CEACAM5 매개성 세포 독성 활성을 보여주었다. 실시예 7.3: 암컷 CD-1 누드 마우스에 피하 이식된 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대한 생체 내 효능
재료 및 방법
두 가지 인간화 서열들을 접합체 huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-4-SPDB-DM4로서, 암컷 CD-1 누드 마우스에 피하 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 chMAb2-SPDB-DM4와 비교하여, 4개의 용량 수준에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 접합체의 용량은 mg/kg으로 나타내었다. 마우스에 종양 이식 후 19일째에 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5, 2.5 및 1.25로 투여하였다.
실시예 5에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과:
결과를 도 5 및 표 20(아래)에 제시하였다.
1.25, 2.5, 5 및 10 mg/kg의 단일 투여 스케줄 이용 시, 본 연구에서 시험한 모든 접합체는 독성을 유도하지 않았다.
huMAb2-4-SPDB-DM4와 chMAb2-SPDB-DM4는 -4%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001) 및 각각 21과 19%의 종양 퇴행으로 10 mg/kg에서 고도로 활성이 있었으며, 각각 12(대조군 대 p = 0.0105)와 17%(대조군 대 p = 0.0417)의 ΔT/ΔC로 5 mg/kg에서 활성이 있었으며, 각각 36 및 37%의 ΔT/ΔC(대조군 대 ns)로 2.5 mg/kg에서 미미하게 활성이 있었고, 1.25 mg/kg에서 불활성이었다. huMAb2-3-SPDB-DM4는 -6%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)와 31%의 종양 퇴행으로 10 mg/kg에서 고도로 활성이 있었으며, 4%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 5 mg/kg에서 매우 활성이 있었고, 12의 ΔT/ΔC(대조군 대 p = 0.0322)로 2.5 mg/kg으로 활성이 있었으며, 34%의 ΔT/ΔC(대조군 대 ns)로 1.25 mg/kg에서 미미하게 활성이 있었다.
이러한 결과로부터, 인간화 서열 huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-4-SPDB-DM4는 모두 치료적 ADC를 개발하는 데에 이용할 수 있었다. huMAb2-3-SPDB-DM4는 양 서열 중에 가장 좋았다.
Figure pat00010
실시예 7.4: 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 원발성 위 STO-IND-006 종양에 대한 생체 내 효능
재료 및 방법
인간화 접합체 huMAb2-3-SPDB-DM4를 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 측정 가능한 원발성 위 STO-IND-006 종양에 대해 3개의 용량 수준에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 접합체의 용량은 mg/kg으로 나타내었다. 마우스에 종양 이식 후 27일째에 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다.
실시예 5에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과:
2.5, 5 및 10 mg/kg의 단일 투여 스케줄 이용 시, huMAb2-3-SPDB-DM4는 독성을 유도하지 않았다.
도 6 및 표 21에 나타난 바와 같이, huMAb2-3-SPDB-DM4는 7%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 10 mg/kg에서 매우 활성이 있었고, 36%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p = 0.0281)로 5 mg/kg에서 활성이 있었고, 2.5 mg/kg에서 불활성이었다.
Figure pat00011
실시예 7.5: 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 원발성 폐 LUN-NIC-0014 종양에 대한 생체 내 효능
재료 및 방법
인간화 접합체 huMAb2-3-SPDB-DM4를 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 측정 가능한 원발성 폐 LUN-NIC-0014 종양에 대해 3개의 용량 수준에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 접합체의 용량은 mg/kg으로 나타내었다. 종양 이식 후 29일째에 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 10, 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다.
실시예 5에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과:
2.5, 5 및 10 mg/kg의 단일 투여 스케줄 이용 시, huMAb2-3-SPDB-DM4는 독성을 유도하지 않았다.
도 18 및 표 22에 나타난 바와 같이, huMAb2-3-SPDB-DM4는 0% 미만의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001) 및 67과 57%의 종양 퇴행으로 10 및 5mg/kg에서 각각 고도로 활성이 있었고, 12%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p = 0.0363)로 2.5 mg/kg에서 활성이 있었다.
Figure pat00012
실시예 7.6: 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대한 생체 내 효능
재료 및 방법
두 개의 상이한 링커(SPDB 및 설포-SPDB)를 통해 DM4에 접합된 인간화 huMAb2-3으로 이루어진 세 개의 접합체를 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 측정 가능한 원발성 대장 CR-IGR-034P 종양에 대해 2개의 용량 수준에서 평가하였다. 대조군은 처리하지 않은 채로 두었다. 접합체의 용량은 mg/kg으로 나타내었다. 접합체는 종양 이식 후 19일째에 정맥 내(IV) 볼러스(bolus) 주사로 5 및 2.5 mg/kg으로 투여하였다.
실시예 5에 보고된 바와 같이 독성 및 효능 평가를 수행하였다.
결과:
2.5 및 5 mg/kg의 단일 투여 스케줄 이용 시, huMAb2-3-SPDB-DM4 및 huMAb2-3-설포-SPDB-DM4는 독성을 유도하지 않았다.
도 19 및 표 23에 나타난 바와 같이, huMAb2-3-SPDB-DM4는 각각 12%와 40%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 5 및 2.5 mg/kg에서 활성이 있었고, huMAb2-3-설포-SPDB-DM4는 0% 미만의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001) 및 12%의 종양 퇴행으로 5 mg/kg에서 고도로 활성이 있었고, 11%의 ΔT/ΔC(대조군 대 p < 0.0001)로 2.5 mg/kg에서 활성이 있었다.
Figure pat00013
실시예 8 : 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 인간 및 원숭이 CEACAM5 단백질 검출 전용 면역 조직 화학(IHC) 프로토콜의 개발
재료 및 방법
조직
FFPE 조직 마이크로어레이(TMA, 표 24)를 인간(종양 및 비 종양)뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이(정상) 조직의 공급원으로서 이용하였다.
조직 공급원으로 이용된 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직 마이크로어레이
참조번호 공급자 설명
ASM221 판토믹스
(Pantomics)		 시노몰구스 원숭이, 22개 기관, 22개 시료
CyFDA US Biomax 시노몰구스 원숭이 정상 조직 마이크로어레이, 6마리의 정상 개체로부터 취한 33개 기관(99 사례)
COC1501 판토믹스 대장암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
COC1502 판토믹스 대장암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
COC1503 판토믹스 대장암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
MTU951 판토믹스 27개 해부 부위의 양성, 악성 및 전이성 엔티티를 포함하는 40개 종류의 종양
LUC1501 판토믹스 폐암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
LUC1502 판토믹스 폐암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
LUC1503 판토믹스 폐암 조직 어레이, 정상/양성(5개 사례) 및 암(70개 사례) 조직으로부터의 150개 코어
MNO961 판토믹스 항체 교차 반응성 시험에 대해 FDA 권고를 기초로 한 35개 종류의 정상 조직
MNO661 판토믹스 항체 교차 반응성 시험에 대해 FDA 권고를 기초로 한 33개 종류의 정상 조직
MNO341 판토믹스 항체 교차 반응성 시험에 대해 FDA 권고를 기초로 한 33개 종류의 정상 조직
PAC481 판토믹스 췌장암 조직 어레이는 20개 사례의 암 및 4개 사례의 정상 및 비 악성 췌장 조직을 함유한다
CC4 수퍼바이오칩스(Superbiochips) 59 사례의 폐암을 포함하는 59개 코어 어레이
A218(III) 아큐맥스(Accumax) 식도암 조직 어레이는 40 사례의 종양 및 8개 비 종양을 함유한다
A219(II) 아큐맥스 두경부암 조직 어레이는 45 사례의 종양 및 8개 비 종양을 함유한다
A213(II) 아큐맥스 난소암 조직 어레이는 43 사례의 종양 및 8개 비 종양을 함유한다
A301(IV) 아큐맥스 상응하는 정상 조직과 함께, 다양한 암 조직(30개 암 사례, 30개 비 종양 사례)
A103(V) 아큐맥스 2반복(duplicate)의 다양한 정상 조직 어레이(45개 사례)
MAN2 수퍼바이오칩스 위, 식도, 폐, 대장결장, 갑상선 및 신장의 9개 또는 10개 정상 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
MA2 수퍼바이오칩스 위암, 식도암, 폐암, 대장결장암, 갑상선암 및 신장암의 9개 또는 10개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
MBN4 수퍼바이오칩스 유방, 간, 방광, 난소, 췌장, 전립선의 9개 또는 10개 정상 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
MB4 수퍼바이오칩스 유방암, 간암, 방광암, 난소암, 췌장암, 전립선암의 9개 또는 10개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
MCN4 수퍼바이오칩스 자궁 내막, 담낭, 후두, 자궁 경부, 피부의 9개 또는 10개 정상 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
MC4 수퍼바이오칩스 자궁 내막암, 담낭암, 후두암, 자궁 경부암, 림프종암, 흑색종 암의 9개 또는 10개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
CJ1 수퍼바이오칩스 난소암 59개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
CDN3 수퍼바이오칩스 정상적인 대장 및 결장의 59개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
CCN2 수퍼바이오칩스 (CC4에 부합하는) 정상 폐의 59개 사례를 포함하는 59개 코어 어레이
BB5 수퍼바이오칩스 60개 코어, 30개의 인간의 다양한 암 종류
AA9 수퍼바이오칩스 59개 사례의 정상적인 기관을 포함하는 59개 코어 어레이
TMAhu3a 아스터랜드(Asterand) 다양한 암 조직 어레이(76개 사례)
STC1501 판토믹스 위암 조직 어레이, 위의 정상, 반응성 및 암성 조직의 75개 사례를 포함하는 150개 코어
STC1502 판토믹스 위암 조직 어레이, 위의 정상, 반응성 및 암성 조직의 75개 사례를 포함하는 150개 코어
STC1503 판토믹스 위암 조직 어레이, 위의 정상, 반응성 및 암성 조직의 75개 사례를 포함하는 150개 코어
STC481 판토믹스 위암 조직 어레이, 16개 사례, 48개 코어, 하나의 정상 조직이 각 환자로부터의 두 개의 종양 조직 코어와 짝을 이룸.
항체MAb2를 원발성 마우스 항-인간 CEACAM5 단일클론성 항체로 이용하였다. 비오틴 접합된 염소 항-마우스 IgG1(γ1 쇄 특이적)(참조번호 1070-08, 배치 L4309-X761, 서던 바이오테크(Southern Biotech), USA)를 2차 항체로 이용하였다.
면역 염색
항원 회수 절차는 95℃에서 8분 동안, 그 다음 100℃에서 28분 동안, 세포 컨디셔닝 1(CC1) 완충액과 함께 적용되었다. 엔도젠 비오틴 블로킹 단계 후, 슬라이드를 인산염 완충 식염수(PBS)에 5 ㎍/mL로 희석된 1차 항-항체와 함께 2시간 동안 24℃에서 배양하였다. 2차 항체 비오틴 접합된 염소 항-마우스를 0.5 ㎍/mL로 32분 동안 24℃에서 배양하였다. 제조업체의 권고에 따라, DABMapTM 발색 검출 키트(760-124, 베타나 메디컬 시스템즈(Ventana Medical Systems, Inc), 미국)으로부터의 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)로 면역 염색을 수행하였다. 헤마톡실린(760-2037, 베타나 메디컬 시스템즈, 미국)을 이용하여 대조염색 단계를 수행하고, 블루잉 시약을 적용하였다(760-2037, 베타나 메디컬 시스템즈, 미국). 염색된 슬라이드를 탈수시키고, 사이토실(cytoseal) XYL(8312-4, 리차드-앨런 사이언티픽(Richard-Allan Scientific), 미국)로 덮었다.
IHC 스코어링
면역 염색된 슬라이드를 스캔스코프(ScanScope) XT 시스템(아페리오 테크놀로지(Aperio Technologies), 미국 캘리포니아 주 비스타)을 이용하여 스캔하였다. 디지털화한 영상을 x20배율로 이미지스코프(ImageScope) 소프트웨어(버전 10.2.2.2319, 아페리오 테크놀로지)를 이용하여 캡쳐하였다.
염색 평가는 조직학적인 반응성 부위, 반응성 세포의 주된 유형, 염색 강도 및 세포 염색 빈도를 포함하였다. 음성 시료의 점수를 0+로 매겼다. 양성 시료들은 1+부터 4+까지의 강도 등급으로 점수화했다. 강도 범위를 약 ]0;2+[, 중 [2+;3+[ 및 강 [3+;4+]으로 설명하였다. 세포 빈도는 면역 염색된 세포들의 퍼센티지였고, 면역학자의 관찰에 의해 시료에 의한 중간값으로 추정되었다. 세포 빈도는 5개 카테고리의 비율 점수 순이었다: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) 및 5(76-100%).
종양의 경우, 전체 발현 점수를 올레드 점수(Allred score, AS)(Mohsin S, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roanh LD, et al. Progesterone receptor by immunohistochemistry and clinical outcome in breast cancer: a validation study.Mod.Pathol.2004;17:1545-1554)로 채택하였다. 이러한 AS는 강도 및 비율 점수를 더하여 0-9 범위의 총점을 얻음으로써 획득하였다. AS는 최대 전체 점수의 백분율로 보고되었고, 5개의 카테고리로 분류된다: 매우 낮음(0-25%), 약함(26-50%), 중간(51-75%) 및 높음(76-100%). 유병률은 지표에 대한 양성 사례들의 백분율로 정의되었다.
기술 통계 분석
기술 통계학은 마이크로소프트 엑셀 2003 소프트웨어로 계산되었다. 각 지표에 대해, 사례의 수, 양성 사례 수, 유병률, 강도 점수 중간값, 빈도 중간값, 올레드 점수 평균, 강도 범위, 빈도 범위 및 올레드 점수 범위가 기술되었다.
실시예 8.1: 면역 조직 화학법(IHC)에 의한 FFPE 인간 종양에서 CEACAM5 단백질 평가를 위한 항-CEACAM5 단일클론성 항체의 용도
상업적인 조직 어레이 슬라이드(FFPE 포맷)을 이용하여 대규모 패널의 인간 종양을 연구하였다. CEACAM5 단백질의 발현은 종양 세포의 막 +/- 세포질에 위치하였다(도 1c, 도 1d). 일부 막 염색은 더욱 분화된 종양에서 세포들의 정점 극에서 분극되었다. CEACAM5 단백질은
- 대장 선암종 사례의 89%(194/219, 강도 2-2.5+, 빈도 53-59%, AS 60-66%)
- 위장 선암종 사례의 49%(95/195, 강도 2.5+, 빈도 53%, AS 62%)
- 폐 선암종 사례의 41%(24/58, 강도 1.8-2+, 빈도 50-53%, AS 54-58%)
- 자궁 경부 편평 상피 암종 사례의 79%(11/14, 강도 2+, 빈도 22%, AS 46%)
- 췌장 선암종 사례의 53%(18/34, 강도 2+, 빈도 23%, AS 42%)
- 식도 편평 세포 암종 사례의 37%(23/62, 강도 2+, 빈도 16%, AS 38%)
- 난소 암종 사례의 4%(3/77, 강도 2+, 빈도 43%, AS 54%)
- 갑상선 암종 사례의 11%(2/18, 강도 1.5+, 빈도 63%, AS 56%)
- 방광 암종 사례의 25%(5/20, 강도 1.5+, 빈도 61%, AS 56%)
- 자궁 내막 선암종 사례의 7%(1/14, 강도 2+, 빈도 50%, AS 56%)
- 유방 관 암종 사례의 11%(2/18, 강도 1.5+, 빈도 53%, AS 50%)
- 담관암종 사례의 53%(2/6, 강도 1.5+, 빈도 75%, AS 50%)
- 폐 편평 세포 암종 사례의 53%(31/148, 강도 1.5+, 빈도 22%, AS 39%)
- 전립선 선암종 사례의 8%(1/13, 강도 2+, 빈도 50%, AS 44%)
- 피부 편평 암종 사례의 25%(2/8, 강도 1.5+, 빈도 23%, AS 39%)에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 8.2 : 시노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이)에서 항-CEACAM5 단일클론성 항체의 조직 교차 반응성 및 인간 발편 패턴과의 비교
인간(h) 또는 시노몰구스 원숭이(c) 기원으로부터의 CEACAM5의 세포외 단백질 도메인을 인간 배아 신장 HEK293 세포에서 CEACAM5 cDNA 플라스미드로 일시적인 발현에 의해 제조하였다(실시예 1, 표 1). 표준적인 면역학적 절차에 따라 세포 펠릿을 10% 포르말린(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국)에 16시간 동안 고정시키고, 조직 한 점으로서 파라핀에 포매시켰다.
상업적 TMA를 인간 및 원숭이 조직 공급원으로 이용하였다(표 21).
인간 및 원숭이 CEACAM5를 형질감염시킨 세포에서 면역 염색에 의해 Mab2의 교차 반응성을 나타내었다(막 및 세포질 국지화).
시노몰구스 정상 조직에서, CEACAM5 단백질 발현은 원주형 흡수성 상피 세포에서 발견되었다(2/3 양성 사례, 중간값 강도 1.5+, 평균 빈도 55%).
인간 비 종양 조직에서, CEACAM5 발현은 원주형 흡수성 상피 세포에서도 관찰되었다(62/64 양성 사례, 중간값 강도 2+, 평균 빈도 90%). 인간 조직에서, CEACAM5 발현은 식도 상피 세포, 두경부 상피 세포, 복부 위막공 상피 세포 및 자궁 경부 상피 세포에서는 더 적은 정도로 관찰되었다.
실시예 9 : 항체 약물 접합체(변이형)
항CEACAM5 huMAb2-3-설포SPDB-DM4
분석 자료:
MW(Ab) = 147417 g/mol ; MW(DM4) = 780.38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 71451
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
교반 하에, RT에서, 7.0 ml의 항CEACAM5 huMAb2-3의 용액(PBS pH = 7.4 완충액 중 C = 5.32 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 1.6 ml의 DMA와 168.4 ㎕의 (WO2009134977에 기술된) 니트로-설포SPDB 링커 용액(10 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 RT에서 3시간 동안 서서히 교반한다. 과량의 3.4 ㎕의 니트로-설포SPDB 링커 용액(2.0 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 첨가한다. 마그네틱 교반 하에 RT에서 2시간 후, 2.90 ml의 PBS pH 7.4 완충액, 0.407 ml의 DMA 및 0.322 ml의 DM4 용액(DMA 내의 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 1시간, 그리고 5℃에서 16시간 후, 미정제 반응 혼합물을 1 CV의 NaOH 1M, 2 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 2 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 19 ml의 항CEACAM5 huMAb2-3-설포SPDB-DM4 접합체(c=1.51 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 3.4 ; DAR (SEC)= 3.3 ; 단량체 순도= 99.3% ; HRMS 데이터 : 도 20 참조.
항CEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1
분석 자료:
MW(Ab) = 147417 g/mol ; MW(DM1) = 738 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 71451
ε280nm(DM1) = 5180; ε252nm(DM1) = 26159
교반 하에, RT에서, 11.3 ml의 항CEACAM5 huMAb2-3의 용액(완충액 A pH = 6.5 중 C = 3.47 mg/ml)을 용기에 넣고, 이어서 0.387 ml의 DMA와 178 ㎕의 SMCC 링커 용액(10 Eq - DMA 내의 15mM 용액)을 넣는다. 용액을 RT에서 2시간 동안 서서히 교반한다. 미정제 반응 혼합물을 2 CV의 NaOH 0.2M, 5 CV의 물 및 5 CV의 시트르산염 완충액(pH 5.5)으로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 완충액 교환한다. 접합체를 시트르산염 완충액(pH 5.5)으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다. 이러한 용액에 교반 하에서, RT에서, 0.476 ml의 DMA 및 0.124 ml의 DM1 용액(DMA 내 15 mM 용액)을 순차적으로 첨가하였다. RT에서 2시간 동안, 미정제 반응 혼합물을 2 CV의 NaOH 0.2M, 5 CV의 물 및 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액 5 CV로 사전 처리된, 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼(세파덱스 G25, GE 헬스케어) 상에서 정제한다. 접합체를 히스티딘(10 mM), 글리신(130 mM), 수크로오스 (5%), pH=5.5 완충액으로 용리시키고, 단량체 접합체 분획을 모아, 0.22 ㎛ 필터로 여과한다.
이렇게 하여, 9.5 ml의 항CEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1 접합체(c=1.73 mg/ml)가 무색의 투명한 용액으로 얻어졌다. 그런 다음, 접합체를 대상으로 최종 약물 부하 및 단량체 순도를 분석한다: DAR (UV)= 2.7 ; DAR (SEC)= 2.9 ; 단량체 순도= 99.6% ; HRMS 데이터 : 도 21 참조.
실시예 10: 질량 분광분석법과 연합된 수소-중수소 교환(HDX MS)을 이용한, MAb2_VH1aVL1c Fab와 복합된 상태의 CEACAM5-A3B3의 에피토프 및 파라토프의 특성 분석
실시예 10.1 : HDX MS의 원리
질량 분광분석법(MS)과 연합된 아미드 수소-중수소 교환(HDX)은 입체형태적 변화 또는 상호 작용에 수반된 단백질 부위들의 확인을 가능하게 한다. 이러한 기법은 더욱 구체적으로는, 중수소화 완충액에서의 배양 및 단백질 가수분해 후, 유리 형태에 비해 항체에 결합된 형태에서 중수소 도입의 감소를 보여주는 항원 부위를 확인할 수 있게 한다.
에피토프는 이러한 부위에 속하며, 이의 교환은 항체와의 결합에 의해 둔화된다. 최근 논문은 이러한 접근법을 이용하여 에피토프의 특성을 분석하기 위한 상이한 단계들을 상세히 기술하고 있다(Zhang, Q., Willison, L. N., Tripathi, P., Sathe, S. K., Roux, K. H., Emmett, M. R., Blakney, G. T., Zhang, H. M. & Marshall, A. G. (2011). Analytical Chemistry 83, 7129-7136).
실시예 10.2 : 재료
MAb2_VH1aVL1c의 가변 도메인 부호화 서열들(SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:29)을, (파파인 절단된 IgG1 유래 Fab에서 발견된) 인간 CH1 도메인의 부호화 서열들, 이어서 각각 헥사-히스티딘 태그 또는 인간 C카파 불변 도메인이 뒤따라 융합된, 포유동물 발현 벡터로 클로닝시켰다. 현탁액에서 배양시킨 HEK293-FSTM 세포에서, 두 사슬을 암호화하며 293펙틴(fectinTM)(인비트로젠)과 복합체를 형성한 두 개의 발현 플라스미드의 일시적인 형질감염에 의해, MAb2_VH1aVL1c Fab 배치를 생산하였다. 분비된 단백질을 함유하는 배양물 상층액을 형질감염 7일 후 수확하고, 원심분리하고 0.22 ㎛ 막으로 여과하였다. Fab를 PBS 내 이미다졸 경사를 이용하여 IMAC(HisTrap, GE 헬스케어) 상에서 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 그런 다음, Fab를 함유하는 분획 풀을 PBS로 평형화한 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200, GE 헬스케어)로 정제하였다.
발현 플라스미드의 일시적인 형질 감염에 의해, 플라스크에서 배양시킨 HEK293-FSTM 세포로 His-태그를 붙인 hCEACAM5-A3B3 도메인(SEQ ID NO:67)을 생산하였다. 각각의 날에 키푸넨신(트리밍 당화 과정의 저해제)을 첨가하였다. 분비된 단백질을 함유하는 배양물 상층액을 형질감염 7일 후 수확하고, 원심분리하고 0.22 ㎛ 막으로 여과하였다. EndoH를 625 u/ml까지 상층액에 첨가한 다음, 37℃에서 3시간 배양하였다. 탈당화된 hCEACAM5-A3B3을 PBS 내 이미다졸 경사를 이용하여 IMAC(HisTrap, GE 헬스케어) 상에서 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 그런 다음, 탈당화된 hCEACAM5-A3B3을 함유하는 분획 풀을, PBS로 평형화한 크기 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200, GE 헬스케어)로 정제하였다. 탈당화된 hCEACAM5-A3B3의 질량 분광분석은 두 종(22 485 및 22 278 Da)을 보여주어, 이러한 단백질이 7개 또는 8개의 N-아세틸글루코사민 잔기(GlcNAc)를 수반함을 나타내었다.
복합체를 구축하기 위하여, 두 단백질을 Fab 1몰에 대해 1.5몰의 탈당화된 hCEACAM5-A3B3 과량으로 모았다. 이러한 과량은 인산염 완충 식염수로 평형화시킨 수퍼덱스 200 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 항원과의 복합 Fab에 해당하는 분획들을 중수소 교환 연구에 이용하였다.
실시예 10.3 : 방법
수소/중수소 교환(HDX) 실험은 PAL 오토샘플러(CTC 애널리틱스(Analytics))를 이용하여 완전히 자동화하였다. 그것은 교환 개시 및 ??치, 단백질 가수분해 온도(4℃)의 조절, 중수소화 펩티드의 주입, 주입 관리 및 밸브 세척 및 질량 분광분석기 및 HPLC 펌프의 트리거링 습득을 가능하게 하였다. 펠티에(Peltier) 냉각 박스(4℃)는 두 개의 레오다인(Rheodyne) 자동화 밸브(주입용 6-포트와 세척용 10-포트), 탈염 카트리지(브루커-미크롬(Bruker-Michrom의 펩티드 마이크로 트랩) 및 HPLC 컬럼(포로셸(Poroshell) 120 EC-C18, 1x 50 mm, 2.7 μM, 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))을 포함하였다. 중수소화는 CEACAM5, mAb 또는 복합체를 D2O 내의 PBS로 5배 희석하여 개시하였다. 2M GndHCl, 0.8 M TCEP, 1M 글리신을 이용하여 역교환을 ??치하고 2분 동안 4℃에서 이황화 다리를 환원시켰다.
단백질들을 펩틴 및 네펜데신 단백질 분해효소로 소화시키고, 펩티드들을 100 ㎕/분으로 물 내 TFA 0.03%로 애질런트 테크놀로지스 HPLC 펌프를 이용하여 탈염시켰다. 그런 다음, 또 다른 애질런트 테크놀로지스 HPLC 펌프를 20분 내에 15-100% B 기울기를 이용하여 분리하였다(A: 물 내 TFA 0.03%; B: 아세토니트릴 90%, 물 내 TFA 0.03%). 전기분무-TOF 질량 분광분석기(애질런트 6210)를 이용하여 펩티드 질량을 측정하였다.
브루커(Bruker) APEX-Q FTMS(9.4 T)와 브루커 12 T SolariX를 이용하여, 탠덤 MS(MSMS)로 펩티드를 확인하였다.
데이터 분석(브루커) 소프트웨어 및 매스 헌터(Mass Hunter, 애질런트 테크놀로지스) 소프트웨어를 데이터 획득에 이용하였다. 데이터 분석 및 마스코트(Mascot, 매트릭스 사이언스(Matrix Science))를 이용하여 MSMS 데이터를 처리하였다. 매스 헌터 및 HD 조사기(HD Examiner, 시에라 애널리틱스(Sierra Analytics)) 소프트웨어를 HDX 데이터 처리에 이용하였다.
HDX 실험을 적어도 3회 반복하였다.
실시예 10.4 : 결과
펩티드 확인 및 선택
중수소화 중에 이황화 다리는 온전하게 남아서 그것들과 관련된 구조적 정보를 유지하였다. 단백질 가수분해 및 펩티드 확인을 촉진하기 위하여, 이러한 다리들을 낮은 pH 및 낮은 온도에서의 ??치 단계 후에 TCEP로 환원시켰다. CEACAM5-Fab 복합체의 소화 후 MSMS를 이용 시, 세 개의 단백질 사슬로부터 발생하는 다수의 펩티드들을 확인하는 것이 가능하였다. HDX 실험 후, 우수한 품질의 신호를 제공하는 것들만 선택하였다: 각각 CEACAM5-A3-B3 항원, MAb2_VH1aVL1c Fab 중쇄 및 MAb2_VH1aVL1c 경쇄로부터의 25, 30 및 20개 펩티드였다. 이들 펩티드는 각각 CEACAM5-A3-B3 항원, MAb2_VH1aVL1c Fab 중쇄 및 MAb2_VH1aVL1c 경쇄 서열들의 89%, 77% 및 68%를 커버한다(표 25). Fab 사슬들의 커버되지 않은 부위들은 주로 C 말단 부분들에 있다.
중수소화 펩티드로의 서열 커버 범위
펩티드 서열 커버 범위
CEACAM5-A3-B3 1-18; 1-22; 1-23; 1-19; 23-35; 36-51; 35-49; 50-70; 36-43; 44-51; 36-51; 36-49; 50-67; 37-49; 44-49; 59-67; 71-89; 93-107; 108-115; 128-143; 128-142; 143-157; 130-143; 130-142; 140-143; 163-186
MAb2_VH1aVL1c Fab 중쇄 1-6; 1-20; 1-19; 1-17; 1-18; 4-18; 5-20; 5-18; 24-29; 27-32; 27-29; 34-46; 47-68; 48-68; 50-68; 69-86; 84-93; 88-98; 92-104; 100-109; 110-115; 116-136; 111-128; 149-158; 151-158; 159-177; 162-177; 167-177; 187-206
MAb2_VH1aVL1c 경쇄 1-11; 5-11; 22-46; 47-54; 55-70; 55-71; 72-82; 87-104; 105-115; 117-132; 124-131; 127-145; 133-144; 136-145; 136-143; 136-144; 143-161; 144-151; 146-151
엔도 H 탈당화로부터 남아 있는 GlcNAc가 있는 몇몇 펩티드 내에서 잠재적인 당화 자리인 모든 8개의 아스파라긴 잔기들을 확인하였다. 특히, N114가 펩티드 108-115에서 발견되었다. (HDX에 이용되지 않은) 첫 번째 실험에서, N166은 두 가지 형태로 발견되었다(GlcNAc이 있는 형태와 없는 형태). 그것은 7개 및 8개 GlcNAc에 해당하는, 탈당화 후 CEACAM5-A3B3의 질량 스펙트럼에서 관찰된 이질성을 설명할 수 있다.에피토프 및 파라토프 확인
유리 항원, 유리 Fab 및 그것들의 복합체를 4℃에서 2분 또는 20분 동안 또는 실온(26℃)에서 20분 동안 중수소화하였다. 아미드 수소의 온도에 대한 교환 동역학을 고려하면(10℃에 대해 약 3배 교환 증가), 마지막 조건은 4℃에서 200분과 동등하다.
에피토프
CEACAM5-A3B3의 25개의 선택된 펩티드들에 대한 중수소 도입의 동역학을 항원이 유리 형태로 중수소화될 때, 그리고 항원이 Fab와 복합체로 있을 때와 비교하였다. 몇몇 펩티드들은 두 상태 사이에서 어떠한 유의미한 HDX 차이(ΔHDX)도 나타내지 않았다. 대조적으로, 그들 중 일부(108-115 및 128-143)는 유의미한 ΔHDX를 보여주었다. 두 번째 부위는 5개의 상이한 펩티드들로 커버되었다: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 및 140-143은 2분 중수소화 후 13-15 ± 2% (최대 1.6 ± 0.2 D) ΔHDX를 보여주었다.
128-142를 130-142와, 그리고 128-143을 130-143과 비교할 때, 본 발명자들은 각 경우에서 어떠한 유의미한 ΔHDX 변화도 측정하지 않았으며(2분 중수소화 후, 첫 번째 두 개의 펩티드의 경우 1.3-1.4 D, 두 번째 두 개의 펩티드의 경우 1.6), 이는 아미드 W129와 R130이 에피토프에 연루되지 않을 가능성이 높음을 의미한다. 대조적으로, 128-142를 128-143과, 그리고 130-142를 130-143과 비교할 때, 본 발명자들은 작은 ΔHDX 변화(약 0.2 D)를 측정하였으며, 이는 아미드 F143이 연루되어 있음을 의미한다. 펩티드 140-143에서의 ΔHDX(약 0.3 D)는 아미드 V141 또는 L142도 연루되어 있을 수 있음을 나타낸다. I131부터 Q140까지의 9개 아미드 내에서, 그것들 중 몇몇은 에피토프와 관련이 있다(평균적으로 공유된 약 1 ΔHDX).
중수소 도입의 이러한 차이는 이러한 에피토프가 특히 부위(아미드), 즉 서열 SGANLNL(SEQ ID NO: 76)과 INGIPQQHTQVLF(SEQ ID NO: 77)의 펩티드에 속함을 나타낸다.
파라토프
Fab 중쇄의 30개의 선택된 펩티드들에 대한 중수소 도입의 동역학을 Fab가 유리 형태로 중수소화될 때, 그리고 그것이 항원과 복합체로 있을 때와 비교하였다. 거의 모든 펩티드들이 두 상태 사이에서 어떠한 유의미한 ΔHDX도 나타내지 않았다. 오로지 하나의 펩티드(100-109)만이 200분 중수소화 후 ΔHDX: 11 ± 2%(0.7 ± 0.2 D)를 제시하였다. MAb2_VH1aVL1c Fab 중쇄의 이러한 부위(아미드) 101-109는 파라토프에 포함된다.
Fab 경쇄의 20개의 선택된 펩티드들에 대한 중수소 도입의 동역학을 Fab가 유리 형태로 중수소화될 때, 그리고 그것이 항원과 복합체로 있을 때와 비교하였다. 거의 모든 펩티드들이 두 상태 사이에서 어떠한 유의미한 ΔHDX도 나타내지 않았다. 오로지 두 펩티드(47-54 및 87-104)만이 차이를 나타냈다. 20분 중수소화 후, 그것은 각각 첫 번째 펩티드의 경우 10 ± 2 %(0.6 ± 0.2 D)였고, 두 번째 펩티드의 경우 5 ± 2 %(0.9 ± 0.2 D)였다. MAb2_VH1aVL1c 경쇄의 이러한 부위 48-54 및 88-104는 파라토프에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> ANTI-CEACAM5 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> FR2012/065 <150> EP12306444 <151> 2012-11-20 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 2 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 3 Ala Arg Pro Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 4 Gln Asn Val Gly Thr Asn 1 5 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1a of humanized MAb2 antibody <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 6 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Tyr Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 7 Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 8 Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr 1 5 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 9 Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 10 Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 1 5 <210> 11 <211> 526 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly His Leu Ser Ala Pro Leu His Arg Val Arg Val Pro Trp Gln 1 5 10 15 Gly 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