KR101667944B1 - 인간화된 항-ｃｘｃｒ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도 - Google Patents

인간화된 항-ｃｘｃｒ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하며, 예를 들어, CXCR5 기능을 억제할 수 있는 인간화된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, CXCR5 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 항체의 용도를 포함한다.

Description

인간화된 항-ＣＸＣＲ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도{Humanized anti-CXCR5 antibodies, derivatives thereof and their uses}
본 발명은 항-CXCR5 항체, 및 부적절한 CXCR5 활성 또는 대사, 또는 예를 들어, 병원체에 의한 부적당하거나 우발적인 이의 사용으로 인한 인간을 포함한 포유동물에서의 질병 또는 장애를 개선, 치료 또는 예방하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 관심이 있는 항체는 CXCL13과 같은 리간드의 CXCR5와 같은 이의 수용체에 의한 점유를 차단할 수 있다. 관심이 있는 항체 및 이의 유도체를 포함하는 예방적, 면역치료학적 및 진단적 조성물, 및 B 림프구와 같은 CXCR5+ 세포의 부적당한 대사 및/또는 활성에 의해서 야기된 인간을 포함한 포유동물에서 질병을 예방 또는 치료하는 방법에서의 그들의 용도도 또한 기술된다. 이러한 질병에는 CXCR5가 상향-조절된 류마티스성 관절염 (RA)와 같은 염증에 의해서 야기되거나, 이러한 염증을 특징으로 하는 자가면역 결핍 및 질병이 포함된다.
버킷 림프종 수용체 (BLR1), CD185, MDR15 및 MGC117347로 또한 공지되어 있는 CXCR5는 CXC 케모킨 수용체 패밀리의 구성원인 G 단백질-커플링된 수용체이다. 리간드는 CXCL13으로 또한 공지되어 있는, B 세포 화학주성인자인 BLC이다.
처리되지 않은 CXCR5 전구체는 길이가 372 아미노산이고, 42 KD의 분자량을 갖는다.
CXCR5는 특정의 해부학적 구획 내에서의 B 세포 이동 및 국재화에서 역할을 갖는다. 녹아웃 마우스는 말초 림프절이 결여되어 있으며, 더 적은 페이어 패치 (Peyer's patch)를 갖고, 감소된 B 세포 수준을 갖는다.
본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하는 신규의 인간화 및 인간 항체, 및 이의 단편 및 유도체를 제공한다. 항체의 일부 및 이의 CXCR5-결합 단편은 생체 내에서의 제조 및 사용에 걸쳐서 안정한 분자를 제공하는 쇄내 디설파이드 결합 형성을 방지하도록 변화될 수 있다. 관심이 있는 다른 항체는 FcR에 대한 결합을 최소화하도록 변화될 수 있다. 관심이 있는 일부의 CXCR5 항체는 CXCR5에 대한 결합에 대해서 CXCL13과 경쟁한다. 다른 항체는 CXCR5 활성을 감소시킨다.
본 발명은 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 이들의 상응하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하나 또는 그 이상의 CDR 부분, 또는 CDR이 수득된 모 분자의 CXCR5-결합능을 유지하는 CDR-유도된 부분을 포함하는 결합 분자를 수득하기 위한 항체의 상보성 결정 부분 (CDR) 서열을 포함한다.
관심이 있는 항체는 B 세포와 같은 CXCR5+ 세포에 대한 CXCL13, 또는 다른 리간드 결합을 방지하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 항체 서열을 수용한 세포주 및 벡터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 CXCR5 기능 및 대사와 연관된 질병 및 장애를 치료하기 위한 의약 또는 조성물의 제조를 위한 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 비정형 또는 비정상적인 CXCR5 생물학 및 기능과 연관된 장애의 치료에 있어서의 이들 항체의 용도이다.
추가의 특징 및 이점은 본 명세서에 기술되어 있으며, 이하의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정의 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 또는 시약으로 제한되지 않는데, 이는 이들은 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 변화할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들 및 모든 두문자어는 본 발명의 분야에서 기술에 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있으며, 단지 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌들은 본 명세서에서 온전히, 본 발명과 함께 및 본 발명에서 사용되어야 하는 것으로 이들 문헌에 보고된 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법을 설명하고 기술하기 위한 목적으로 참고로 포함된다. 그러나, 여기에서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 기술을 앞서는 자격이 없음을 인정하는 것으로 이해되지는 않는다.
관심이 있는 CXCR5-관련된 방법 및 생성물을 제조하고 사용하는 것을 교시하기에 앞서서, 기술자들에게 지침을 주기 위해서 몇 가지의 용어 및 문구에 대한 이하의 비-제한적인 정의를 제공한다.
"CXCR5"는 림프구, 특히 B 세포, 특히 천연 B 세포 상에서 발견되는 천연적으로 발생하는 공지의 분자; 이러한 세포로부터 분리된 이러한 분자; 공지의 물질 및 수단을 사용하고, CXCR5를 암호화하는 핵산을 사용하여 재조합적으로 제조된 이러한 분자뿐만 아니라 CXCL13 결합과 같은 본 발명의 실시에 적절한 특징 및 특성을 보유하는, 세포외 (EC) 영역과 같은 CXCR5의 일부분에 관한 것이다. 가용성 CXCR5 분자는 본질적으로, 일반적으로 대략 분자의 처음 60 개의 아미노산, 즉 CXCR5의 아미노 말단 부분을 포함하는 CXCR5의 EC 영역으로 구성될 수 있다.
CXCR5는 비-무차별 (non-promiscuous) 수용체이다. CXCL13은 CXCR5의 리간드이며, 여포성 수상돌기세포와 같은 기질세포에서, 및 림프 조직에서 구성적으로 발현된다. CXCL13은 특이적으로 B 세포 및 B 헬퍼 여포성 T 세포, TFH 라 불리는 T 세포의 작은 서브세트를 유인한다. 이것은 면역계 내에서의 T 세포 및 B 세포 집단 사이의 다수의 상호작용을 고려하면 예상 밖의 것은 아닐 수 있다. 더욱이, 활성화된 T 세포는 CXCR5 발현을 유도하거나 상향 조절한다. 림프구의 삼차 전위성 배중심 (GC) 내로의 침윤은 이러한 비정형 림프절-유사 구조에 의해서 미리 조정된 특정의 장애에서 증가된 질병 중증도 및 내성 파괴와 상당히 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. CXCR5-/- 및 CXCL13-/- 마우스와 같은 생체내 쥐 모델을 사용하여, 수용체 또는 리간드의 부재는 변화된 T 및 B 세포 국재화, 및 아마도 상호작용으로 인하여 변화된 GC 미세 구조를 제공한다. 이들 마우스는 또한, 심각한 콜라겐-유도된 관절염 (CIA)이 발생하는 것으로부터 보호된다. CXCR5는 RA의 병인론과 연관된 성숙한 B 세포 상에서 선택적으로 발현되기 때문에, 이 수용체를 차단하는 것은 병에 걸린 개체에서 관절염원성 반응을 변조시킬 것이다. 생물학적 제제 (즉, 항-TNFα 및 항-CD20 항체, 리툭시마브 (Rituximab))에 의한 류마티스성 관절염 치료는 임상적으로 효과적인 것으로 나타났으며; 특히 B 세포-지시된 치료를 받는 환자는 임상적 증상 및 징후의 장기간 지속적인 개선을 나타내었다. 성숙한 B 세포 및 B 헬퍼 T 세포 상에서만 발현되는 CXCR5의 선택적 표적화는 B 세포 발생에 영향을 미치지 않거나, 환자를 면역손상시키지 않을 것이다. 리툭시마브와는 달리, 본 발명의 항체는 세포의 세포독성을 매개하지 않는 중화성 항체이다.
"CXCR5 질병"은 CXCL13 또는 다른 CXCR5 리간드의 과발현 또는 증가된 수준, B 세포의 증가된 수준, B 세포 활성의 증가된 수준, CXCR5의 증가된 수준, 또는 CXCR5의 부적절한 대사 및 활성을 특징으로 하거나 이들에 의해서 야기되는 병, 장애, 질병, 상태, 이상 등이다.
"B 세포 활성"은 국소적일 수 있는 정상보다 더 높은 B 세포 수준, 또는 항체 발현, 브루톤 (Bruton) 타이로신 키나제 존재 또는 활성, CD19의 존재 또는 발현, B 세포 활성화 인자의 발현 또는 존재 등과 같은 B 세포의 생물학적 표현 또는 기능의 증거를 의미한다.
항체 쇄 폴리펩타이드 서열에 관한 문구 "실질적으로 동일한"은 기준 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 항체로 해석될 수 있다. 핵산 서열에 관한 당해 용어는 기준 핵산 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열로 해석될 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은 서열을 정렬하고, 필요에 따라서 갭을 도입시켜 전체 서열에 대한 최대의 동일성 퍼센트를 달성하도록 하지만, 서열 동일성의 일부분으로서 어떤 보존적 치환도 고려하지 않은 후에, 이것이 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미할 수 있다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 이용할 수 있으며, 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다.
문구 및 용어 항체 또는 항원의 "기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체" 등뿐만 아니라 이의 형태는 관심이 있는 전체-길이 항체 또는 항원과 공통적인 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 분자이다. 예를 들어, 항-CXCR5 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 CXCR5 분자에 결합할 수 있는 것, 또는 CXCL13과 같은 리간드, 또는 작동성 또는 길항성 항체가 CXCR5에 결합하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다. 예로는 scFV 분자가 있다. CXCR5에 관해서, 이의 변이체 또는 유도체는 야생형 CXCR5와 동일하지 않음에도 불구하고 야생형 CXCR5에 선택적으로 결합하는 항체를 발생시키는 면역원으로 사용될 수 있는 것과 같이, 천연적으로 존재하는 CXCR5와 동일하지 않지만, 본 발명의 목적에 따라 사용될 수 있는 분자이다.
"치환형" 변이체는 동일한 위치에서 그 대신에 삽입된 상이한 아미노산에 의해서 제거 및 대체된 천연 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는 것이다. 치환은 분자 내의 단지 하나의 아미노산이 치환된 경우인 단일형일 수 있거나, 두 개 또는 그 이상의 아미노산이 동일한 분자 내에서 치환된 경우인 다중형일 수 있다. 복수의 치환은 연속적 위치에서 있을 수 있다. 또한, 하나의 아미노산이 복수의 잔기에 의해서 대체될 수 있는데, 이 경우에 이러한 변이체는 치환 및 삽입 둘 다를 포함한다. "삽입형" 변이체는 천연 서열 내의 특정한 위치에서의 아미노산에 바로 인접하게 삽입된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 것이다. 아미노산에 바로 인접한다는 것은 아미노산의 α-카복실 또는 α-아미노 기능적 그룹에 연결된 것을 의미한다. "결실형" 변이체는 천연 아미노산 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 통상적으로, 결실형 변이체는 분자의 특정 부분에서 결실된 하나 또는 두 개의 아미노산을 가질 것이다.
용어 "항체"는 가장 광범한 의미로 사용되며, 구체적으로 모노클로날 항체 (전체 길이 모노클로날 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편, 또는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 하나 또는 그 이상의 CDR 또는 CDR-유도된 서열을 보유하는 합성 폴리펩타이드를 포함한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 일반적으로, 항체는 확정되거나 인식된 특이성을 갖는 Ig로 생각된다. 따라서, 항체는 특정의 표적에 대해서 결합 특이성을 나타내기는 하지만, 면역글로불린은 항체 및 표적 특이성이 없는 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 본 발명의 항체는 어떤 클래스 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등), 또는 어떤 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)의 것이라도 될 수 있다 (여기에서, "타입" 및 "클래스", 및 "서브타입" 및 "서브클래스"는 상호 교환하여 사용된다). 즉, 집단, 항체 및 면역글로불린의 비-인공적으로 조작된 구성원으로부터 수득된 천연 또는 야생형은 일반적으로, 두 개의 동일한 경쇄 (L) 및 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머성 당단백질이다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 영역 (VH)에 이어서 다수의 불변 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에서 가변 영역 (VL) 및 다른 말단에서 불변 영역을 갖는다. "비-인공적으로 조작된"은 외래 항원 결합 분자를 함유하거나 발현하도록 처리되지 않은 것을 의미한다. 야생형은 항원-결합 분자의 아미노산을 변화시키기 위해서 돌연변이유발, 재조합 방법의 사용 등과 같은 조작의 형태에 의해서 수득된 대립 유전자 또는 다형성, 또는 변이체 또는 유도체에 대비해서, 집단에서 발견되는 가장 우세한 대립 유전자 또는 종, 또는 비-조작된 동물로부터 수득된 항체를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "항-CXCR5 항체"는 CXCR5의 이의 리간드에 대한 결합을 억제하거나 실질적으로 감소시키거나, CXCR5 활성을 억제하는 분자를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 본 명세서에서 정의된 바와 같이 인간 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그로부터 유도된 폴리펩타이드 (유도체)를 의미한다.
항체의 가변 영역의 맥락에서 용어 "가변"은 항체들 사이에서 및 항체들 중에서 서열이 광범하게 상이하며, 이의 특정한 표적에 대한 특정한 항체의 특이적 인식 및 결합에 사용되는 적절한 분자의 특정 부분을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역에 전체적으로 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다 내에서 고가변성 부분으로 또한 공지되어 있는 상보성 결정 부분이라 불리는 3 개의 절편 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3) 내에 집중된다. 가변 영역의 더 고도로 보존된 부분은 골격구조 (FR) 부분 또는 서열로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, β-시트 구조를 연결하며, 일부의 경우에는 그 β-시트 구조의 일부분을 형성하는 루프를 형성하는 3 개의 CDR에 의해서 연결된, 주로 β-시트 입체배좌를 채택한 4 개의 FR 부분을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 부분에 의해서 종종 가깝게 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 표적 (에피토프 또는 결정인자) 결합 부위의 형성에 기여한다 [참조: Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)]. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 다른 식으로 나타내지 않는 한은 카바트 (Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 이루어진다. 하나의 CDR은 동족성 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 또는 전체-길이의 쇄 또는 항체의 일부분, 일반적으로는 표적 결합성 또는 가변적 부분이다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F( ab' )2 및 Fv 단편이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. "기능적 단편" 또는 "항-CXCR5 항체의 유사체"는 리간드에 결합하거나 시그날링을 개시하는 수용체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 기능적 단편은 일반적으로 "항체 단편"과 동의어이며, 항체에 관해서는 리간드에 결합하거나 시그날링을 개시하는 수용체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 Fv, Fab, F(ab')2 등과 같은 단편을 나타낼 수 있다. "Fv" 단편은 비-공유적 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 다이머로 구성된다 (VH-VL 다이머). 이 입체배좌에서, 각각의 가변 영역의 3 개의 CDR은 상호작용하여 온전한 항체에서와 VH-VL 다이머의 표면 상에서 표적 결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6 개의 CDR은 온전한 항체에 대한 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 영역 (또는 표적에 대해 특이적인 단지 3 개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)이라도 표적을 인식하고, 표적을 결합시키는 능력을 가질 수 있다.
"단일-쇄 Fv", "sFv" 또는 "scAb" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는데, 여기에서 이들 영역은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 추가로, VH 및 VL 영역 사이에, sFv가 표적 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 것으로 종종 유연성 분자인 폴리펩타이드 링커를 포함한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 내에서 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다. 동일한 쇄 상의 두 개의 가변 영역 사이에서 짝짓기 (pairing)가 이루어지도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 디아바디 영역은 어쩔 수 없이 또 다른 쇄의 결합 영역과 짝을 이루어서 두 개의 항원-결합 부위가 생성되도록 한다.
Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 영역 및 중쇄의 가변 및 제1 불변 영역 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 CH1 영역의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 첨가하여 항체 힌지 부분으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함시킴으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab' 단편은 F( ab' )2 펩신 분해 생성물의 힌지 시스테인에서 디설파이드 결합을 절단시킴으로써 생성될 수 있다. 항체의 추가의 효소적 및 화학적 처리는 관심이 있는 다른 기능적 단편을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉 집단을 이루는 개개 항체는 어쩌면 미량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
구체적으로 본 명세서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유도되거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스 (타입 또는 서브타입)에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메릭" 항체뿐만 아니라, CXCR5에 결합하거나 CXCR5 활성 또는 대사에 영향을 미치는 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편도 포함한다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]. 따라서, 항체의 한 클래스로부터의 CDR이 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체의 FR 내로 이식될 수 있다.
모노클로날 항체는 단일 표적 부위, 에피토프 또는 결정인자에 대해서 지시되는 매우 특이적인 것이다. 더욱이, 일반적으로 항원의 다양한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 표적 상의 단일 결정인자에 대해서 지시된다. 이들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해서 오염되지 않은 숙주 세포에 의해서 합성된다는 이점이 있고, 적절한 유전자 및 이의 쇄의 항체를 암호화하는 mRNA를 클로닝하기 위해 제공된다. 변경인자 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내며, 어떤 특정한 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 의해서 사용하기 위한 모노클로날 항체는 잘 알려진 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있거나, 폴리클로날 제제로부터 정제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 모 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et　al., Nature 256:495 (1975)]에 기술된 하이브리도마 방법에 의해서 제조될 수 있거나, 본 기술분야에서 잘 알려진 재조합 방법에 의해서 제조될 수 있다.
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 인간 항체에 비해서 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F( ab' )2 또는 항체의 다른 표적-결합 서열)이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나, 및 일반적으로는 두 개의 가변 영역의 실질적으로 모든 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 CDR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 주형 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한, 전형적으로는 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것인 면역글로불린 불변 부분 (Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 목표는 인간에게서 최소한으로 면역원성인 항체 분자를 갖는 것이다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 CDR 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 CXCR5 또는 CXCL13에 대한 하나 또는 그 이상의 CDR의 특이적 결합 기능을 실질적으로 최소화시키지 않으면서 숙주 세포에 대해서 덜 면역원성인 것으로 치환될 수도 있다. 대신으로, FR은 비-인간일 수 있지만, 가장 면역원성인 이들 아미노산은 덜 면역원성인 것으로 대체된다. 그럼에도 불구하고, 상기 언급한 바와 같은 CDR 이식은 인간화된 항체를 수득하기 위한 유일한 방법은 아니다. 예를 들어, 단지 CDR 부분을 변형시키는 것이 충분하지 않을 수도 있는데, 이는 이것이 CDR 루프의 삼차원적 구조 및 항체의 이의 리간드에 대한 전반적인 친화성을 결정하는데 있어서 일 역할을 갖는 골격구조 잔기에 대해서 드문 것이 아니기 때문이다. 따라서, 비-인간 모 항체 분자를 인간에게 덜 면역원성인 것이도록 변형시키기 위한 어떤 수단이라도 실행될 수 있으며, 인간 항체와의 전체적인 서열 동일성이 항상 필요한 것은 아니다. 따라서, 인간화는 예를 들어, 단지 몇 개의 잔기, 특히 항체 분자 내에 매립되지 않고 분자 상에 노출되어 있으며, 따라서 숙주 면역 시스템에 쉽게 접근할 수 없는 것을 단순히 치환시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에서 항체 분자 상의 "이동성" 또는 "유연성" 잔기를 치환시키는데 관하여 교시되어 있으며, 그 목표는 이의 에피토프 또는 결정인자에 대한 항체의 특이성을 포함시키지 않으면서 생성된 분자의 면역원성을 감소 또는 약화시키는 것이다 [참조: 예를 들어, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et　al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 및 미국 특허 제5,869,619호].
후천적 면역반응은 두 개의 주된 팔을 갖는다: T 림프구의 세포성 면역반응 및 항체 분비 B 림프구의 체액성 면역반응. B 세포 에피토프는 선형의 연속적 아미노산일 수 있거나, 입체배좌일 수 있다 [Protein Science (2005) 14, 246]. 이와는 대조적으로, T-세포 에피토프는 주요 조직적합성 콤플렉스 (MHC) 단백질, 또는 인간의 경우에는 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 맥락에서 제시되는 항원성 단백질로부터 절단된 짧은 선형 펩타이드이다. 에피토프 제시는 MHC-펩타이드 결합 및 T 세포 수용체 (TCR) 상호작용 둘 다에 따라 좌우된다. MHC 단백질은 매우 다형성이며, 각각은 제한된 세트의 펩타이드에 결합한다. 따라서, 숙주 내에 존재하는 MHC 대립인자의 특정한 조합은 감염 중에 인식되는 잠재적 에피토프의 범위를 제한한다.
T 세포의 두 가지 기본적 타입은 T 세포가 각각 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 의해서 제시된 에피토프를 인식할 수 있을 지 여부를 지시하는 CD8 및 CD4 단백질의 발현에 의해서 구별된다. CD4+ T 에피토프는 항원이 프로테아제에 의해서 MHC 클래스 II 단백질에 결합하는 펩타이드 단편으로 분해되는 막 결합된 소포체 내의 항원 제시 세포에 의해서 캅셀화한 후에 처리된다. 이와는 대조적으로, CD8+ T 세포는 일반적으로 세포 내에서, 면역프로테아좀에 의해 사이토졸 내에서 짧은 펩타이드로 절단되는 단백질로부터 발현되는 바이러스성 또는 자가-항원을 인식한다. 절단 후에, 펩타이드는 항원 처리와 연관된 수송체 (TAP)에 의해서 HLA I 항원 상에 부하시키기 위한 내형질 세망 내로 전좌된다. CD4+ T (헬퍼) 세포 에피토프는 단백질 항원에 대한 T 세포-의존적 면역반응을 구동시키는데 중요하다.
관심이 있는 인간화 방법은 면역 인식 중에 및 면역 인식 시에 항체의 분자 유연성의 영향을 기초로 한다. 단백질 유연성은 단백질 분자의 분자 운동과 관련된다. 단백질 유연성은 서로 상당히 상이한 입체배좌의 앙상블을 채택하는 전체 단백질, 단백질의 일부분 또는 단일 아미노산 잔기의 능력이다. 단백질 유연성에 대한 정보는 단백질 X-선 결정학 실험 [참조: 예를 들어, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732], 핵자기공명 실험 [참조: 예를 들어, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923]을 수행하거나, 또는 분자 동적 (MD: Molecular Dynamic) 시뮬레이션을 실시함으로써 수득될 수 있다. 단백질의 MD 시뮬레이션은 컴퓨터 상에서 이루어지며, 원자들 서로간의 물리적 상호작용을 계산함으로써 일정 시간에 걸친 모든 단백질 원자의 운동을 결정하도록 한다. MD 시뮬레이션의 출력물은 시뮬레이션의 기간에 걸쳐서 시험한 단백질의 궤도이다. 궤도는 시뮬레이션의 기간에 걸쳐서, 예를 들어, 매 1 피코세컨드 (ps)에 걸쳐서 주기적으로 샘플링되는, 스냅샷 (snapshot)으로 또한 불리는 단백질 입체배좌의 앙상블이다. 스냅샷의 앙상블의 분석함으로써, 단백질 아미노산 잔기의 유연성을 정량화할 수 있다. 따라서, 유연성 잔기는 잔기가 그 안에 존재하는 폴리펩타이드에 관하여 상이한 입체배좌의 앙상블을 채택하는 것이다. MD 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Brooks et al. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988)]. 앰버 (Amber) [참조: Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688], 참 (Charmm) [참조: Brooks et　al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; 및 MacKerell et al . (1998) in ' The Encyclopedia of Computational Chemistry' vol . 1:271-177, Schleyer et al ., eds. Chichester : John Wiley & Sons] 또는 임팩트 (Impact) [참조: Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900]와 같은 몇 가지 소프트웨어는 MD 시뮬레이션을 가능하게 한다.
대부분의 단백질 콤플렉스는 비교적 크고 평평한 매립된 표면을 공유하며, 결합 파트너의 유연성이 이들의 가소성에 대한 근원을 제공하여 이들이 서로에 대해서 입체배좌적으로 순응할 수 있게 하는 것으로 나타났다 [Structure (2000) 8, R137-R142]. 그것으로서, "유도 적합 (induced fit)"의 예는 단백질-단백질 계면에서 우세한 역할을 하는 것으로 나타났다. 또한, 단백질이 실제로 다양한 형상 크기 및 조성의 리간드를 결합시키며 [Protein Science (2002) 11:184-187], 입체배좌적 다양성은 상이한 파트너를 인식하는 능력의 필수적인 성분인 것으로 보인다는 것을 [Science (2003) 299, 1362-1367] 나타내는 데이터가 꾸준하게 증가하고 있다. 유연성 잔기는 단백질-단백질 파트너의 결합에 포함된다 [Structure (2006) 14, 683-693].
유연성 잔기는 기억 B 세포에 의해서 인식되고, 면역원성 반응을 유발하는 것 같은 상호작용 영역의 앙상블을 제공하는 다양한 입체배좌를 채택할 수 있다. 따라서, 항체는 변형된 항체에 의해서 표시되는 입체배좌 및 인식 영역의 앙상블이 인간 항체에 의해서 채택된 것과 가능한 한 많이 유사하도록 골격구조로부터의 다수의 잔기를 변형시킴으로써 인간화될 수 있다.
이것은 (1) 모 mAb의 상동성 모델을 조립하고, MD 시뮬레이션을 실시하고; (2) 유연성 잔기를 분석하고, 비-인간 항체 분자의 가장 유연한 잔기를 확인할 뿐만 아니라 불균일성 또는 분해반응의 근원이 될 것 같은 잔기 또는 모티프를 확인하고; (3) 모 항체와 가장 유사한 인식 영역의 앙상블을 표시하는 인간 항체를 확인하고; (4) 돌연변이될 유연성 잔기를 결정하고, 불균일성 및 분해의 근원이 될 것 같은 잔기 또는 모티프도 또한 돌연변이시키고; (5) 공지의 T 세포 또는 B 세포 에피토프의 존재에 대해서 조사함으로써 제한된 수의 잔기를 변형시켜 달성될 수 있다. 유연성 잔기는 시뮬레이션의 기간에 걸쳐 물 용매와 단백질 원자 사이의 상호작용을 설명하는 암묵적 용매 모델을 사용하여, 본 명세서에 교시된 바와 같이 MD 계산을 사용하여 찾을 수 있다.
일단 유연성 잔기의 세트가 가변 경쇄 및 중쇄 내에서 확인되면, 관심이 있는 항체의 것과 매우 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조를 확인한다. 이것은 예를 들어, 항체 인간 배선 서열의 데이터베이스와 대조하여 유연성 잔기의 세트에 대한 블라스트 (blast) 탐색을 사용하여 수행될 수 있다. 그것은 또한 부모 mAb의 동적 상태를 배선 정통 구조의 라이브러리의 동적 상태와 비교함으로써 수행될 수 있다. CDR 잔기 및 이웃하는 잔기는 항원에 대한 높은 친화성이 보존되는 것을 보장하기 위해서 탐색으로부터 배제된다.
따라서, 관심이 있는 항체의 분자 동적 궤도와 배선 항체 구조의 라이브러리의 궤도의 비교를 수행하였다. 16D7를 49 배선 구조의 라이브러리와 비교하였다. 각각의 항체의 보유된 분자 동적 궤도는 예를 들어, 약 10 개의 다양한 입체배좌가 다양한 출발점으로 사용되고, 각각의 출발점을 위해서 약 10 개의 분자 역학 시뮬레이션이 실시되는 분자 동적 컴퓨터 시뮬레이션 중의 분자 동적 계산의 앙상블이다. 인간 항체 배선의 49 개의 3D 상동성 모델이 7 개의 가장 빈번한 인간 경쇄 (vκ1, vκ2, vκ3, vκ4, vλ1, vlλ2 및 vλ3) 및 7 개의 가장 빈번한 중쇄 (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5 및 vh6)를 조직적으로 조합함으로써 조립되었다 [Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597]. 그 후, 16D7의 유연성 잔기를 관심이 있는 항체의 경우와 가장 근접한 궤도를 갖는 배선 구조의 상응하는 잔기로 변화시킨다.
그 후, 유연성 잔기를 대체시킨다. 몇 가지의 인간 잔기가 유사한 상동성을 나타내는 경우에, 선택은 또한 인간화된 항체의 용해 행동에 영향을 미칠 것 같은 잔기의 성질에 의해서 유도된다. 예를 들어, 극성 잔기가 노출된 유연성 루프 내에서 소수성 잔기보다 바람직할 것이다. 불안정성 및 불균일성의 잠재적 근원인 잔기는 또한, 비록 이들이 CDR 내에 존재하더라도 돌연변이된다. 이것은 설폭사이드 형성이 산소 래디칼로부터 유래할 것이기 때문에 노출된 메티오닌, Asp-Pro 디펩타이드의 경우와 같은 산불안정성 결합의 단백분해적 절단 [Drug Dev Res (2004) 61:137-154], 노출된 아스파라긴 잔기에 이어서 Gly, Ser, Ala, His, Asn 또는 Cys와 같은 작은 아미노산에 의해서 발견되는 탈아미드화 부위 [J Chromatog (2006) 837:35-43], 및 Asn-X-Ser/Thr 부위와 같은 N-글리코실화 부위를 포함할 것이다. 일반적으로, 노출된 메티오닌은 Leu에 의해서 치환될 수 있거나, 노출된 아스파라긴은 글루타민에 의해서, 또는 아스파르테이트에 의해서 대체될 수 있거나, 후속 서열이 변화될 수 있다. 글리코실화 부위 (Asn-X-Ser/Thr)의 경우에는, Asn 또는 Ser/Thr 잔기가 교환될 수 있다.
생성된 복합적 서열은 공지의 B 세포 또는 선형 T-세포 에피토프의 존재에 대해서 조사한다. 탐색은 예를 들어, 공공연히 이용할 수 있는 면역 에피토프 데이터 베이스 (IEDB) [PLos Biol (2005) 3(3)e91]에 의해서 수행된다. 공지의 에피토프가 복합적 서열 내에서 확인되면, 인간 서열의 또 다른 세트를 검색하여 치환시킨다.
미국 특허 제5,639,641호의 재표면화 방법과는 달리, B-세포 매개 및 T-세포 매개된 면역원성 반응 둘 다가 방법에 의한 목표가 된다. 이 방법은 또한, CDR 이식 (미국 특허 제5,530,101호)에 의해서 때때로 관찰되는 활성의 상실의 문제를 회피한다. 또한, 안정성 및 용해도 문제는 엔지니어링 및 선택 과정에서도 고려되어 낮은 면역원성, 높은 항원 친화성 및 개선된 생물물리학적 특성에 대해서 최적화된 항체를 제공한다.
항체를 재표면화하는 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내에서 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,639,641호에 기술되어 있다. 간략하면, 바람직한 방법에서는 (1) 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 풀의 위치 정렬을 발생시켜 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조 표면 노출된 위치를 수득하고 (여기에서, 모든 가변 영역에 대한 정렬 위치는 적어도 약 98% 동일하다); (2) 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 설치류 항체 (또는 이의 단편)와 같은 비-인간 항체에 대해서 규정하고; (3) 설치류 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트와 가장 근접하게 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조 표면 노출된 아미노산 서열의 세트를 확인하고; (4) 단계 (2)에서 규정된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를, 설치류 항체의 CDR의 어떤 잔기의 어떤 원자의 5Å 이내에 있는 이들 아미노산 잔기를 제외하고는, 단계 (3)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트로 치환시켜 결합 특이성을 보유하는 설치류 항체와 같은 인간화된 항체를 수득한다.
항체는 CDR 이식 [EPO 0 239 400; WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,530,101 및 5,585,089호], 베니어링 (veneering) 또는 재표면화 [EPO 0　592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973]; 및 연쇄 셔플링 (chain shuffling) [미국 특허 제5,565,332호]을 포함한 다양한 다른 기술에 의해서 인간화될 수 있다. 인간 항체는 설치류와 같은 유전자이식 동물을 사용하거나 키메릭 세포 등을 사용하는 파아지 디스플레이 방법 [참조: 미국 특허 제4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 및 5,814,318호; 및 WO　98/46645, WO 98/50433, WO　98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO　91/10741]을 포함하나 이들로만 제한되지 않는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다.
"항체 동족체" 또는 "동족체"는 본 명세서에서 교시된 바와 같이 CXCR5를 특이적으로 결합시키는 모든 분자를 나타낸다. 따라서, 항체 동족체는 변형되었든지 아니든지 천연 또는 재조합 항체, Fab 또는 Fv 분자와 같이 CXCR5를 결합시키는 것과 같은 관심이 있는 생물학적 특성을 보유하는 항체의 일부분, 단일쇄 항체, 하나 또는 그 이상의 CDR 부분을 갖는 폴리펩타이드 등을 포함한다. 동족체의 아미노산 서열은 천연적으로 존재하는 항체의 서열과 동일할 필요는 없으며, 치환체 아미노산, 삽입된 아미노산, 결실된 아미노산, 단백질 내에 정상적으로 존재하는 20 개 이외의 아미노산 등을 갖도록 변화 또는 변형되어 증진되거나 다른 유익한 특성을 갖는 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
상동성 서열을 갖는 항체는 본 발명의 CXCR5 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직하게는, 상동성은 본 발명의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과의 상동성이다. 본 명세서에서 아미노산 서열에 적용된 것으로서 "서열 상동성"은 예를 들어, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따르는 FASTA 탐색방법에 의해서 결정된 것으로서, 또 다른 아미노산 서열에 대해서 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 그 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 서열로 정의된다.
키메릭 항체는 상이한 항체, 항체의 상이한 클래스, 상이한 동물 종과 같이 상이한 공급원으로부터 유도된 항체의 상이한 부분을 갖는 것, 예를 들어, 인간 면역글로불린 불변 부분 등과 짝을 이룬 쥐 모노클로날 항체로부터 유도된 가변 영역을 갖는 항체이다. 따라서, 인간화된 항체는 키메릭 항체의 한 종류이다. 키메릭 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et　al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; 및 미국 특허 제5,807,715, 4,816,567, 및 4,816,397호].
인공적 항체에는 각각 항원-결합 또는 에피토프-결합 능력을 갖는 단일쇄 항체, scFv 단편, 키메릭 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 mru [참조: Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; 및 Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557에 의한 검토]가 포함된다. 단일쇄 Fv 단편 (scFv)에서, 항체의 VH 및 VL 영역은 유연성 펩타이드에 의해서 연결된다. 일반적으로, 링커는 약 15 개의 아미노산의 펩타이드이다. 링커가 훨씬 더 작으면, 예를 들어, 5 개의 아미노산으로 구성되면, 2가 scFv 다이머인 디아바디가 형성된다. 링커가 3 개의 아미노산 잔기 미만으로 감소되면, 각각 트리아바디 및 테트라바디라 불리는 트라이머 및 테트라머성 구조가 형성된다. 항체의 가장 작은 결합 유니트는 단일 CDR, 일반적으로는 충분한 특이적 인식 및 결합능을 갖는 중쇄의 CDR2 또는 3일 수 있지만, 본 명세서에 교시된 방법을 수행하여 결정될 수 있는 바와 같은 CDR 서열의 어떤 조합이라도 될 수 있다. 이러한 단편은 분자 인식 유니트 또는 mru라 부른다. 몇 개의 이러한 mrus는 짧은 링커 펩타이드에 의해서 서로 연결될 수 있으며, 따라서 단일 mru보다 더 큰 친화성을 갖는 인공적 결합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명의 범위 내에는 또한, 관심이 있는 항체의 기능적 등가물이 포함된다. 용어 "기능적 등가물"은 예를 들어, 상동성 서열을 갖는 항체, 항체 동족체, 키메릭 항체, 인공적 항체 및 변형된 항체를 포함하며, 여기에서 각각의 기능적 등가물을 CXCR5에 결합하거나, CXCR5 시그날링 능력 또는 기능을 억제하거나, CXCR5에 대한 CXCL13 및 다른 리간드의 결합을 억제하는 능력에 의해서 규정된다. 숙련된 전문가는 "항체 단편"이라 불리는 분자의 그룹 및 "기능적 등가물"로 불리는 그룹 내에는 중첩이 있음을 이해할 것이다. CXCR5 결합 능력을 보유하는 기능적 등가물을 생산하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 93/21319, EPO Ser. No. 239,400, WO　89/09622, EPO Ser. No. 338,745 및 EPO Ser. No. 332,424에 기술되어 있다.
본 출원의 기능적 등가물은 변형된 항체, 예를 들어, 항체에 어떤 타입의 분자를 공유적 부착시킴으로써 변형된 항체를 포함한다. 예를 들어, 변형된 항체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 탈아미드화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백분해적 절단, 세포성 리간드에 대한 연결, 독소 또는 세포독성 부위 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해서 변형된 항체를 포함한다. 공유적 부착이 항-이디오타입 반응을 생성시키는 것으로부터 면역성인 항체를 수득할 필요는 없다. 변형은 특정의 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 대사적 합성 등을 포함한 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 공지의 기술에 의해서 달성될 수 있다. 추가로, 변형된 항체는 하나 또는 그 이상의 비-전형적인 아미노산을 함유할 수 있다.
결합 친화성의 최적화를 허용하는 다수의 기술이 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 이용될 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 관심이 있는 부위에서 다양한 아미노산 잔기를 치환시키고, 이어서 동족성 항원 또는 에피토프에 대한 돌연변이체 폴리펩타이드의 결합 친화성을 스크리닝 분석하는 것을 포함한다.
일단 항체가 확인 및 분리되면, 이것은 종종 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 예를 들어, 항체의 고가변성 부분의 하나 또는 그 이상에서 변화된 변이체 항체 또는 돌연변이체 또는 뮤테인을 생성시키는데 유용하다. 대신으로, 또는 추가로, 골격구조 잔기의 하나 또는 그 이상의 변화 (예를 들어, 치환)가 항체에 도입될 수 있는데, 여기에서 이들은 CXCR5에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화성의 개선을 제공한다. 변형될 수 있는 골격구조 부분 잔기의 예로는 비-공유적으로 항원을 직접 결합시키고 [Amit et al., Science 233:747-753 (1986)]; CDR의 입체배좌와 상호작용하거나 그 입체배좌에 영향을 미치고/미치거나 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]; VL-VH 계면에 참여하는 [EP 239 400] 것이 포함된다. 특정의 구체예에서, 이러한 골격구조 부분 잔기의 하나 또는 그 이상의 변형은 동족성 항원에 대한 항체의 결합 친화성의 증진을 제공한다. 예를 들어, 약 1 내지 약 5 개의 골격구조 잔기가 본 발명의 이러한 구체예에서 변화될 수 있다. 때때로, 이것은 고가변성 부분 잔기 중의 어떤 것도 변화되지 않은 경우에 조차도 전임상 실험에서 사용하기에 적합한 항체 돌연변이체를 수득하는데 충분할 수 있다. 그러나, 통상적으로 항체 돌연변이체는 하나 또는 그 이상의 고가변성 부분 변화(들)를 포함할 수 있다. 불변 부분이 또한 변화되어 바람직하거나 더욱 바람직한 효과기 특성을 수득할 수도 있다.
변화된 고가변성 부분 잔기는 무작위적으로 변화될 수 있는데, 특히 여기에서 모 항체의 출발 결합 친화성은 무작위적으로-생산된 항체 돌연변이체가 본 명세서에 교시된 바와 같은 시험방법에서 변화된 결합에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있도록 된다.
CDR 돌연변이체와 같은 항체 돌연변이체를 수득하는 한가지 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" [Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989); 및 Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)]이다. 하나 또는 그 이상의 고가변적 부분 잔기(들)는 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)에 의해서 대체된다. 그 후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 고가변성 부분 잔기(들)는 치환의 부위에서, 또는 그 부위에 대한 추가의 또는 다른 돌연변이를 도입시킴으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시킬 위치는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 스캐닝된 잔기의 바람직한 특성에 따라서 다른 아미노산에 의한 유사한 치환이 시도될 수 있다.
변형시킬 아미노산 잔기를 확인하기 위한 더 체계적인 방법은 CXCR5를 결합시키는데 연관된 고가변성 부분 잔기 및 CXCR5 결합과의 연관성이 거의 또는 전혀 없는 이들 고가변성 부분 잔기를 확인하는 것을 포함한다. 비-결합성인 고가변성 부분 잔기의 알라닌 스캔은 CXCR5에 대한 결합을 증진시키는데 대해서 시험한 각각의 ala 돌연변이체를 사용하여 수행된다. 또 다른 구체예에서는, CXCR5를 결합시키는데 상당히 연관된 이들 잔기(들)가 변형되도록 선택된다. 변형은 잔기의 결실 또는 관심이 있는 잔기에 인접한 하나 또는 그 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 그러나, 통상적으로 변형은 또 다른 아미노산에 의한 잔기의 치환을 포함한다. 보존적 치환은 일차 치환일 수 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)의 변화를 야기한다면, 또 다른 보존적 치환을 실행하여 더 실질적인 변화가 수득되는지 여부를 결정할 수 있다.
항체 범위 및 생물학적 특성의 제시에 있어서의 훨씬 더 실질적인 변형은 그 부위에 통상적으로 존재하는 것과 특성이 상당히 더 상이한 아미노산을 선택함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 이러한 치환은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체배좌로서 치환의 영역에서의 폴리펩타이드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지시키면서 이루어질 수 있다.
예를 들어, 천연적으로 존재하는 아미노산은 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음의 그룹으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 메티오닌 (M 또는 met), 알라닌 (A 또는 ala), 발린 (V 또는 val), 류신 (L 또는 leu) 및 이소류신 (I 또는 ile);
(2) 중성, 친수성: 시스테인 (C 또는 cys), 세린 (S 또는 ser), 트레오닌 (T 또는 thr), 아스파라긴 (N 또는 asn) 및 글루타민 (Q 또는 gln);
(3) 산성: 아스파르트산 (D 또는 asp) 및 글루탐산 (E 또는 glu);
(4) 염기성: 히스티딘 (H 또는 his), 리신 (K 또는 lys) 및 아르기닌 (R 또는 arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신 (G 또는 gly) 및 프롤린 (P 또는 pro), 및
(6) 방향족: 트립토판 (W 또는 trp), 타이로신 (Y 또는 tyr) 및 페닐알라닌 (F 또는 phe).
비-보존적 치환은 아미노산을 또 다른 그룹으로부터의 아미노산으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산의 그룹 내의 또 다른 것에 의한 교환을 수반할 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화반응에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 결합 친화성을 변화시키고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리-화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것을 포함한다. 유사체는 천연적으로 존재하는 펩타이드 서열이 아닌 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (바람직하게는, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로-존재하는 서열 내에서 (바람직하게는, 분자간 접촉을 형성하는 영역(들) 외부의 폴리펩타이드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 R 그룹 또는 측쇄의 벌크 또는 입체배좌의 변화를 제외하고는 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 나타나는 나선형을 파괴하거나 모 서열을 특정화하는 이차 구조의 다른 타입을 붕괴시키는 경향이 없어야 한다) [Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991)].
통상적으로, 개선된 생물학적 특성을 갖는 항체 돌연변이체는 모 항-인간 CXCR5 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 종종 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 모 항체 서열에 관한 동일성 또는 유사성은 본 명세서에서, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입시켜 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하도록 한 후에, 모 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 상기의 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 동일한 그룹으로부터의 아미노산 잔기) 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다.
대신으로, 항체 돌연변이체는 중쇄 및 경쇄의 FR 및 CDR 부분, 또는 항-CXCR5 항체의 Fc 부분의 체계적 돌연변이에 의해서 생성될 수 있다. 항체 돌연변이체를 생성하는 또 다른 방법은 파아지 디스플레이를 사용한 친화성 성숙의 사용을 포함한다 [Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992), 및 Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)]. 박테리오파아지 외피-단백질 융합 [Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); 및 미국 특허 제5,223,409호]이 표시된 단백질 또는 펩타이드의 표현형을 이들을 암호화하는 박테리오파아지 입자의 유전자형에 연결시키는데 유용한 것으로 알려져 있다. 항체의 Fab 영역도 또한, 파아지 상에서 표시되었다 [McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991); 및 Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)].
일가 파아지 디스플레이는 단백질 변이체의 세트를 파아지 입자 상의 박테리오파아지 외피 단백질의 융합으로서 표시하는 것으로 구성된다 [Bass et al., Proteins 8:309 (1990)]. 다양한 단백질의 친화성 성숙, 또는 평형 결합 친화성의 개선은 예를 들어, 항체의 CDR 부분에 초점을 맞춤으로써 [Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); 및 Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)] 돌연변이유발, 일가 파아지 디스플레이 및 기능적 분석의 연속적 적용을 통해서 이전에 달성되었다 [Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); 및 U.S. Pat. No. 5,534,617].
서열 내의 규정된 위치에서 상이한 다수의 (예를 들어, 106 또는 그 이상) 단백질 변이체의 라이브러리는 각각 특정의 단백질 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 박테리오파아지 입자 상에서 구성될 수 있다. 고정화된 항원을 사용한 친화성 정제의 사이클 후에, 각각의 박테리오파아지 클론을 분리시키고, 표시된 단백질의 아미노산 서열을 DNA로부터 추론한다.
항체 돌연변이체의 생산 후에, 모 항체에 대비한 그 분자의 생물학적 활성은 본 명세서에 교시된 바와 같이 결정될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이것은 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 활성 또는 물리적 특성을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 항체 돌연변이체의 패널을 제조하고, 항원에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝한다. 스크린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 항체 돌연변이체는 임으로, 항체 돌연변이체(들)가 새롭거나 개선된 특성을 갖는지 여부를 확인하는 하나 또는 그 이상의 추가의 생물학적 활성 시험에 적용한다. 바람직한 구체예에서, 항체 돌연변이체는 모 항체의 결합 친화성과 유사하거나, 그보다 우수한/더 큰 결합 친화성을 가지고 CXCR5를 결합시키는 능력을 보유한다.
이렇게 선택된 항체 돌연변이체(들)는 종종 항체의 의도된 용도에 따라서 추가의 변형에 적용될 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 서열의 추가의 변화, 이종 폴리펩타이드(들)에 대한 융합 및/또는 공유적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적절한 입체배좌를 유지하는데 포함되지 않는 시스테인 잔기를 일반적으로 세린에 의해서 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고, 비정상적인 교차결합을 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인을 항체에 첨가하여 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
항체 돌연변이체의 또 다른 타입은 변화된 글리코실화 패턴을 갖는다. 이것은 항체 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 부위를 결실시키고/시키거나, 항체 내에 존재하지 않는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 항체의 글리코실화는 일반적으로, Asn에 N-연결되거나, Ser 또는 Thr에 O-연결된다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부위의 효소적 부착을 위한 통상적인 인식 서열이다. 예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈, 푸코즈 또는 크실로즈가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 결합되지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수도 있다. 원래의 항체의 서열에 대한 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환은 O-연결된 글리코실화의 가능성을 증진시킬 수 있다.
항체의 유효성을 증진시키기 위해서 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 부분에 도입시킴으로써 그 부분에서 사슬간 디설파이드 결합 형성이 가능하도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 [참조: Caron et　al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992); 및 Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993)]. 대신으로, 이중 Fc 부분을 가지며, 따라서 증진된 보체 용해 및 ADCC 가능성을 가질 수 있는 항체를 엔지니어링할 수 있다 [참조: Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989)].
항체의 공유적 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 것은 화학적 합성에 의해서, 또는 적용 가능하다면, 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해서 이루어질 수 있다. 항체의 공유적 변형의 다른 타입은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄와, 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내에 도입된다.
시스테이닐 잔기를 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민)와 반응시켜 카복실메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 수득할 수 있다. 시스테이닐 잔기는 또한, 예를 들어, 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐라-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시킴으로써 유도체화될 수도 있다.
히스티딜 잔기는 pH　5.5-7.0에서 디에틸피로카보네이트와 반응시킴으로써 유도체화될 수 있다. p-브로모펜아실 브로마이드를 또한 사용할 수 있으며, 반응은 바람직하게는 pH 6.0의 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 중에서 수행된다.
리시닐 및 α 말단 잔기를 석신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시켜 잔기의 전하를 반전시킬 수 있다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 다른 시약에는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸이소우레아 및 2,4-펜탄디온이 포함되며, 아미노산은 글리옥실레이트에 의해서 트랜스아미나제-촉매화될 수 있다.
아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌히드린과 같은 하나 또는 몇 개의 통상적인 시약과의 반응에 의해서 변형될 수 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 종종 알칼리성 반응조건을 필요로 한다. 또한, 시약은 리신뿐만 아니라 아르기닌 ε-아미노 그룹과 반응시킬 수 있다.
타이로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄에 의해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 타이로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성시킨다. 타이로실 잔기는 125I 또는 131I을 사용하여 요도드화시켜 방사선 면역검정법에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조할 수 있다.
카복실 측쇄 그룹 (아스파르틸 또는 글루타밀)은 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드와 같은 카보디이미드 (R-N=C=C-R') (여기에서, R 및 R'는 상이한 알킬 그룹일 수 있다)와의 반응에 의해서 변형될 수 있다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해서 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게, 중성 또는 염기성 조건 하에서 각각 상응하는 글루마틸 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
다른 변형에는 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세리닐 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화 [Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 모든 C-말단 카복실 그룹의 아미드화가 포함된다.
공유적 변형의 또 다른 타입은 항체에 대한 화학적 또는 효소적 커플링 글리코사이드를 포함한다. 이들 방법은 N-연결 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화 가능성을 갖는 숙주 세포 내에서의 항체의 생산을 필요로 하지 않는다. 사용된 커플링 모드에 따라서, 당(들)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카복실 그룹; (c) 시스테인의 경우와 같은 유리 설프하이드릴 그룹; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 경우와 같은 유리 하이드록실 그룹; (e) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 경우와 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
항체 상에 존재하는 모든 탄수화물 부위의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 화학적 탈글리코실화는 연결성 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 야기하면서 항체는 온전하게 두는 화합물, 트리플루오로메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 대한 항체의 노출을 필요로 할 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987); 및 Edge et　al., Anal Biochem 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 부위의 효소적 절단은 예를 들어, 문헌 [Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350(1987)]에 기술된 바와 같은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제 중의 어떤 것에 의해서나 달성될 수 있다.
항체의 공유적 변형의 또 다른 타입은 미국 특허 제4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337호에 기술된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 항체를 연결시키는 것을 포함한다.
돌연변이체 또는 뮤테인을 수득하는데 바람직한 또 다른 기술은 파이지 표시에 의한 친화성 성숙이다 [Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992); 및 Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)]. 간략하면, 몇 개의 고가변성 부분 부위 (예를 들어, 6 내지 7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환을 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체는 입자 상에 존재하는 단백질에 대한 융합물로서 파아지 입자 상에서 일가 양식으로 표시된다. 다양한 돌연변이체를 발현하는 파아지를 결합 선택의 라운드를 통해서 순환시키고, 이어서 고친화성을 표시하는 이들 돌연변이체를 분리 및 서열 분석할 수 있다.
신규의 결합 폴리펩타이드를 선택하는 방법은 구조적으로 연관된 폴리펩타이드의 라이브러리를 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 외피 단백질에 융합된, 구조적으로 연관된 폴리펩타이드의 라이브러리는 돌연변이유발에 의해서 생산되며, 입자의 표면 상에 표시된다. 그 후, 입자를 표적 분자와 접촉시키고, 표적에 대해서 최고의 친화성을 갖는 이들 입자를 더 낮은 친화성을 갖는 것으로부터 분리시킨다. 그 후, 고친화성 결합제를 적합한 박테리아성 숙주의 감염에 의해서 증폭시키고, 경쟁적 결합 단계를 반복한다. 이 방법을 바람직한 친화성의 폴리펩타이드가 수득될 때까지 반복한다.
대신으로, 다가 파아지 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; 및 Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]를 또한 사용하여 무작위 점 돌연변이 (예를 들어, 오류-경향의 DNA 폴리머라제의 사용에 의해서 생성됨)를 발현시켜 파아지 항체 단편의 라이브러리를 생성시킬 수 있으며, 그 다음에 이것을 CXCR5에 대한 친화성에 관해서 스크리닝할 수 있다 [Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896].
바람직하게는, 친화성 성숙 과정 중에 복제가능한 발현 벡터는 전사 조절요소의 엄격한 조절 하에 두고, 배양조건은 융합 단백질의 하나 이상의 카피를 표시하는 입자의 양 또는 수가 약 1% 미만이 되도록 조정한다. 또한, 바람직하게는 융합 단백질의 하나 이상의 카피를 표시하는 입자의 양은 융합 단백질의 단일 카피를 표시하는 입자의 양의 10% 미만이다. 바람직하게는, 이 양은 20% 미만이다.
기능적 등가물은 상이한 항체 쇄의 상이한 CDR을 다수의 항체로부터 유도된 골격구조 또는 복합적 FR 내에서 상호교환함으로써 생산될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CDR의 소정의 세트에 대해서 상이한 클래스의 항체는 상이한 중쇄, 예를 들어, IgG1 -4, IgM, IgA1 -2 또는 IgD의 치환에 의해서 상이한 CXCR5 항체 타입 및 이소타입을 수득할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내의 인공적 항체는 소정의 CDR의 세트를 완전히 합성인 골격구조 내에 매립시킴으로써 생산될 수 있다.
예를 들어, 적합한 골격구조 및 가변 영역 또는 관심이 있는 하나 또는 그 이상의 CDR을 갖는 Fc 부분은 감소된 효과기 기능을 갖는 IgG4 분자로부터 수득된다.
다른 구체예에서는, 관심이 있는 CXCR5-결합 분자의 특성을 증진시키기 위해서 특정의 변형이 골격구조 부분 및/또는 관심이 있는 분자의 항원-결합 부분을 갖는 분자의 Fc 부분에 대해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 일으켜서 관심이 있는 특성을 증진 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, IgG4 분자에서는 예를 들어, 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 부위에서, 예를 들어, 힌지 부분에서, 또는 효과기 기능에 영향을 미치거나 Fc 결합에 영향을 미치는 부분에서의 치환이 변형에 적합하다. IgG4 분자에서는, 카바트 넘버링을 사용하여 아미노산 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 등, 또는 이들의 조합에서의 치환이 이루어져 바람직한 특성을 수득할 수 있다. 예를 들어, 세린 241을 프롤린으로 치환시켜 분자의 3차 및 4차 구조를 안정화시킬 수 있고 [Mol Imm 30(1)105-108, 1993], 류신 248을 글루탐산으로 치환시켜 효과기 기능(들)을 약화시킬 수 있다 [J Imm 164(4)1925-1033, 2000; 및 Clin Imm 98(2)164-174, 2001].
또 다른 유익한 특성은 CXCR5를 결합시키지만, 예를 들어, B 세포를 고갈시키지 않는 항체 유도체를 수득하는 것이다. 이것은 환자에게서의 항체 생산이 손상되지 않기 때문에 유리할 수 있다. 이러한 시약에 의한 처리는 또한, B 세포가 아닌 수준에서 작용하는 특정한 적응증에 대한 제2 약물과의 병용 요법을 용이하게 한다. 이것은 예를 들어, T 세포의 수준에서 있을 수 있다.
따라서, 예를 들어, 16D7-HC1-LC3은 두 개의 치환, S241P 및 L248E을 함유하도록 처리되었다. 프롤린 및 글루탐산 잔기는 IgG4 골격구조를 갖는 관심이 있는 CXCR5-결합 분자에 안정성 및 감소된 효과기 기능과 같은 바람직한 특성을 부여한다.
본 발명의 항체 단편 및 기능적 등가물은 CXCR5에 대한 특이적 결합의 검출가능한 정도를 갖는 이들 분자를 포함한다. 결합의 검출가능한 정도는 관심이 있는 항체의 결합능의 적어도 10-100%의 범위 내의 모든 값, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 포함한다. 또한, 관심이 있는 항체의 친화성의 100% 이상인 친화성을 갖는 등가물도 포함된다.
CDR은 일반적으로, 에피토프 인식 및 항체 결합에 중요하다. 그러나, 변화는 동족성 에피토프를 인식하고, 이것을 결합시키는 항체의 능력을 저해하지 않으면서 CDR을 포함하는 잔기에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 에피토프 인식에 영향을 미치지 않지만 에피토프에 대한 항체의 결합 친화성을 증가시키는 변화가 이루어질 수 있다. 몇 가지 시험은 일차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현의 수준과 같은 이의 특성에 대한 항체의 서열 내의 다양한 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화를 도입시키는 것의 영향을 조사하였다 [Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; 및 Vaughan et　al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539].
따라서, 관심이 있는 항체의 등가물은 올리고뉴클레오타이드-매개된 부위-지시 돌연변이유발, 카세트 (cassette) 돌연변이유발, 오류-경향 PCR, DNA 셔플링 또는 이. 콜라이의 돌연변이유발 유전자-스트레인과 같은 방법을 사용하여 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내의 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 생성될 수 있다 [Vaughan et　al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; 및 Adey et al., 1996, Chap. 16, pp.　277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press]. 일차 항체의 핵산 서열을 변화시키는 방법은 개선된 친화성을 갖는 항체를 제공할 수 있다 [Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et　al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; 및 Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628].
"폴리펩타이드 선택"의 반복된 사이클을 사용하여, 예를 들어, 사이클의 다중 선택에 의해서 선택된 다중 아미노산 변화의 선택에 의해서, 더 높고 높은 친화성 결합에 대해서 선택할 수 있다. 리간드 또는 항체 폴리펩타이드 내의 아미노산의 선택의 제1 부분을 포함하는 선택의 제1 라운드 후에, 리간드의 다른 부분 또는 아미노산에서의 선택의 추가의 라운드를 수행한다. 선택의 사이클은 바람직한 친화성 특성이 달성될 때까지 반복된다.
개선된 항체는 또한, 동물 면역화, 하이브리도마 형성 및 특이적 특성을 갖는 항체에 대한 선택의 표준 기술에 의해서 제조된 개선된 특징을 갖는 항체를 포함한다.
"길항제"는 CXCR5에 의한 시그날링과 같은 표적 분자의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 분자를 나타낸다. 길항제는 리간드에 의해서 활성화된 세포를 무능력하게 하거나 사멸시키고/시키거나, 수용체 또는 리간드 활성화 (예를 들어, 타이로신 키나제 활성화) 또는 수용체에 대한 리간드 결합 후의 시그날 전달을 저해함으로써 리간드에 대한 수용체의 결합 및 그 반대를 저해할 수 있다. 길항제는 수용체-리간드 상호작용을 완전히 차단할 수 있거나, 이러한 상호작용을 상당히 감소시킬 수 있다. 길항제에 의한 이러한 모든 개입점은 본 발명의 목적에 대해서 동등한 것으로 생각되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주 내에는 CXCR5, CXCL13 또는 CXCR5의 다른 리간드, 또는 CXCR5 및 CXCL13와 같은 이의 리간드의 콤플렉스에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체); CXCR5 및 CXCL13과 같은 리간드 사이의 상호작용을 길항하는 CXCR5 또는 CXCL13의 아미노산 서열 변이체 또는 유도체; 임의로 면역글로불린 부분 (예를 들어, 이뮤노어드헤신 (immunoadhesin))과 같은 이종 분자에 융합된 가용성 CXCR5; 또 다른 수용체 또는 생물학적 분자와 회합한 CXCR5를 포함하는 콤플렉스; CXCR5에 결합하는 합성 또는 천연 서열 펩타이드 등이 포함된다.
"아고니스트"는 CXCR5의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 활성화시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 접합체, 큰 분자, 소분자를 포함한 화합물을 나타낸다. 아고니스트는 리간드에 의해서 활성화된 세포의 미토겐으로 작용하고/하거나, 수용체에 대한 리간드 결합 후의 세포 불활성화 또는 시그날 전달 억제를 저해함으로써 리간드에 대한 수용체의 결합 및 그 반대와 상호작용할 수 있다. 아고니스트에 의한 이러한 모든 개입점은 본 발명의 목적에 따라 동등한 것으로 생각되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주 내에는 CXCR5, CXCL13 또는 CXCR5의 다른 리간드, 또는 CXCR5 및 CXCL13와 같은 이의 리간드의 콤플렉스에 결합하는 아고니스트; CXCR5 및 CXCL13과 같은 리간드 사이의 상호작용을 촉진시키는 CXCR5 또는 CXCL13의 아미노산 서열 변이체 또는 유도체; 임의로 면역글로불린 부분 (예를 들어, 이뮤노어드헤신)과 같은 이종 분자에 융합된 가용성 CXCR5; 또 다른 수용체 또는 생물학적 분자와 회합한 CXCR5를 포함하는 콤플렉스; CXCR5에 결합하는 합성 또는 천연 서열 펩타이드 등이 포함된다. 아고니스트는 일반적으로, CXCR5를, 예를 들어, 시그날에 대해서 직접 활성화시키는 물질이다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 이의 자손을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인하여 DNA 함량에서와 같이 정확하게 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 원래의 세포에서 스크리닝된 것으로서 관심이 있는 동일한 기능 또는 생물학적 특성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 본 발명에서 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 디자인 선택으로 선택된 원핵성 또는 진핵성 숙주이다.
핵산에 의한 세포성 유기체, 세포 또는 세포주의 "형질전환"은 핵산이 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해서 복제가능하고, 임의로 발현되도록 표적 세포 내에 핵산을 도입시키는 것을 의미한다. 핵산에 의한 세포 또는 유기체의 "형질감염"은 어떤 암호화 서열이 실제로 발현되든지 아니든지 세포 또는 유기체에 의한 핵산, 예를 들어, 발현 벡터의 흡수를 의미한다. 용어 "형질감염된 숙주 세포" 및 "형질전환된"은 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 전형적인 원핵성 숙주 세포에는 이. 콜라이의 다양한 스트레인이 포함된다. 전형적인 진핵성 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소와 같은 포유동물 세포, 또는 인간 기원의 세포이다. 도입된 핵산 서열은 숙주 세포와 동일한 종 또는 숙주 세포와는 상이한 종으로부터 유래할 수 있거나, 일부의 외래 및 일부의 동종성 핵산을 함유하는 하이브리드 핵산 서열일 수 있다. 형질전환은 또한, 바이러스-유도된 요소에 의한 감염 또는 형질도입에 의해서 일어날 수도 있다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 이식 유전자의 발현을 위해서 적합한 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있는, 핵산, 이식 유전자, 외래 유전자 또는 관심이 있는 유전자를 함유하는 핵산 구조물, 담체를 의미한다. 이러한 조절 서열에는 예를 들어, 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 조절하기 위한 임의의 작동인자 (operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파아지 입자, 또는 단지 잠재적인 게놈성 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 무관하게 복제 및 기능할 수 있거나, 일부의 경우에는 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, 플라스미드는 벡터의 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환하여 사용된다. 그러나, 본 발명은 바이러스, 핵산을 보유하는 합성 분자, 리포좀 등과 같이 동등한 담체 기능을 제공하며, 본 기술분야에서 공지되어 있거나 공지되는 벡터의 다른 형태를 포함하고자 한다.
치료의 목적에 따른 "포유동물"은 인간, 가정용 및 농장용 동물, 비인간 영장류 및 개, 말, 고양이, 소 등과 같은 동물원, 경주용 또는 애완용 동물을 포함한 포유동물로 분류된 모든 동물을 의미한다.
관심이 있는 항체는 본 명세서에 기술되거나 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 스크리닝하거나, 시험에서 사용할 수 있다. 종종, 이러한 시험은 검출가능한, 즉 예를 들어, 표지된 시약을 필요로 한다. 본 명세서에서 사용되는 경우에 단어 "표지물"은 분자 또는 단백질, 예를 들어, 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지물은 그 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지물, 입자 또는 형광성 표지물), 효소적 표지물의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉진시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "고체상"은 본 발명의 항체와 같은 물질 또는 분자가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본 발명에 포함된 고체상의 예로는 부분적으로 또는 전체적으로 유리 (예를 들어, 조절된 공극 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로즈), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 형성된 것이 포함된다. 특정의 구체예에서, 문맥에 따라 고체상은 시험 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 경우에는 정제 칼럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 칼럼)에서 사용될 수 있다. 따라서, 고체상은 종이, 비드, 플라스틱, 칩 등일 수 있고, 니트로셀룰로즈, 아가로즈, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 실리콘 등과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있으며, 다양한 배열로 존재할 수 있다.
가용성 CXCR5 또는 세포외 (EC) 영역과 같은 이의 단편은 관심이 있는 항체를 생성시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 면역원은 천연 공급원으로부터 수득 또는 분리될 수 있거나, 재조합적으로 제조될 수 있다. CXCR5+ 세포와 같은 전체 세포, 천연 공급원으로부터 유래하는 세포 (예를 들어, B 세포, B　세포주 또는 암 세포주), 또는 CXCR5를 발현, 및 아마도 과발현하도록 재조합 기술에 의해서 형질전환된 (또는 형질감염된) 세포가 관심이 있는 항체를 제조하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 또한, CXCR5를 보유하는 막 제제 또는 CXCR5의 EC 부분에 상응하는 합성 펩타이드 또는 절단된 폴리펩타이드가 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
길이가 약 60 아미노산인 CXCR5의 EC, 또는 이의 일부분이 면역원으로 사용될 수 있다. 접합체와 같은 항체를 제조하는데 유용한 면역원의 다른 형태는 본 기술분야의 전문가에게 자명할 것이다. 따라서, CXCR5, 또는 이의 일부분은 면역원으로 사용하기 위해서 알부민 또는 KLH와 같은 담체 분자에 부착될 수 있다. 물론, CXCR5를 발현하는 세포와 더불어, 바람직한 면역원 또는 면역원의 일부분은 EC 영역이다.
본 기술분야에서 공지된 것으로서 CXCR5를 암호화하는 유전자 또는 cDNA는 플라스미드 또는 다른 발현 벡터 내에서 클로닝하고, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려지고, 예를 들어, 이하에서 보는 방법에 따라 다수의 발현 시스템 중의 어느 것에서나 발현시킬 수 있다. 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, CXCR5 단백질을 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드가 재조합 CXCR5 또는 이의 기능적 생성물을 발현시키는 작업에서 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에 의해서 바람직한 것과 같은 가능한 코돈 선택을 기초로 하여 조합을 선택함으로써 변화시킬 수 있다. 조합은 천연적으로 존재하는 CXCR5에 대해 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 적용된 것으로서 표준 3문자 유전자 암호에 따라 이루어지며, 이러한 모든 변이가 고려될 수 있다. 따라서, CXCR5-암호화 서열은 관심이 있는 아미노산을 발현하는 코돈을 함유하도록 재암호화될 수 있지만, 3문자 코돈이 인간 세포와 같은 숙주 세포의 유전자 발현 기구에 의해서 선호되는 것이다. 이들 폴리펩타이드 중의 어느 하나라도 카멜리드 (camelid)와 같은 동물, 또는 다른 시스템의 면역화에 사용되어 CXCR5에 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, CXCR5 면역원은 유익한 경우에, 일반적으로 하나 또는 그 이상의 유익한 기능을 갖는 폴리펩타이드인 융합 절편에 부착된 CXCR5를 갖는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 융합 절편은 종종, 예를 들어, 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해서 분리 및 정제되도록 허용함으로써 단백질 정제를 도와 주지만, 면역원성을 증가시키기 위해서 사용될 수도 있다. 융합 단백질은 CXCR5 폴리펩타이드의 카복실 및/또는 아미노 말단에 부착된 단백질을 암호화하는 융합 핵산 서열에 의해서 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 융합 절편에는 면역글로불린 Fc 부분, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 2가 금속 이온에 결합할 수 있는 폴리-히스티딘 절편 및 말토즈 결합 단백질이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다.
아미노산 서열 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이 방법에는 관심이 있는 분자의 미리 제조된 돌연변이체 또는 비-돌연변이체 버전의 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 [참조: 예를 들어, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)].
본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 본 발명의 단일쇄 항체 또는 본 발명의 항체 뮤테인)의 재조합 발현은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 포함한다. 일단 항체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체의 생산을 위한 벡터를 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술에 의해서 생산할 수 있다. 항체 암호화 서열 및 적절한 전사 및 해독 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터가 구성된다. 이 방법에는 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다.
발현 벡터를 통상적인 기술에 의해서 숙주 세포에 전이시킨 다음에, 형질감염된 세포를 통상적인 기술에 의해서 배양하여 본 발명의 항체 또는 단편을 생산한다. 본 발명의 한가지 관점에서는, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터를 본 명세서에 상세히 기술한 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해서 숙주 세포에서 공동-발현시킬 수 있다.
다양한 숙주/발현 벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 발현 시스템은 관심이 있는 암호화 서열이 생산되고, 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내거나, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환 또는 형질감염되면 동소에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 및 진핵성 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해서 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로 바이러스로부터 유래하는 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소를 갖는 것과 같은 벡터와 함께 한 CHO 세포와 같은 포유동물 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 [Foecking et al., Gene 45:101 (1986); 및 Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)]. 식물 및 식물 세포 배양물, 곤충 세포 등도 또한 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 관심이 있는 단백질을 제조하기 위해서 사용될 수 있다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 변조시키거나, 원하는 특이적 형식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포가 선택된다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 처리 (예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독-후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 관심이 있는 발현된 항체의 올바른 변형 및 처리가 보장되도록 선택될 수 있다. 따라서, 유전자 생성물의 일차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적절한 처리를 위한 세포성 기구를 갖는 진핵성 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, COS, 293, 3T3 또는 골수종 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 엔지니어링될 수 있다. 복제의 바이러스 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적 마커에 의해서 조절된 DNA에 의해 형질전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입시킨 후에, 엔지니어링된 세포는 강화 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 한 다음에, 선택 배지에 옮길 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선택적 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합시키고, 세포주로 확장되도록 한다. 이러한 엔지니어링된 세포주는 항체 생산에 유용할 뿐만 아니라, 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에도 유용하다.
각각 tk, hgprt 또는 aprt 세포 내의 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)], 메티오닌 설폭스이미드의 존재 하에서의 글루타메이트 신타제 선택 [Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 및 Lonza Group Ltd.의 웹사이트 및 문헌 참조] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al., Cell 22:817 (1980)] 유전자를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 저항성이 다음 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr [Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)]; 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt [Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)]; 아미노글리코사이드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo [Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)]; 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]. 본 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술의 방법을 일상적으로 적용하여 원하는 재조합체 클론을 선택할 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); 및 Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해서 증가될 수 있다 [예를 들어, 참조: Bebbington et al., in DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)]. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우에, 배양물 중에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 부분은 항체 유전자와 회합되기 때문에, 항체의 생산도 또한 증가할 것이다 [Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)].
숙주 세포는 본 발명의 두 개 또는 그 이상의 발현 벡터에 의해서 공동-형질감염될 수 있으며, 예를 들어, 여기에서 제1 벡터는 중쇄-유도된 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 벡터는 경쇄-유도된 폴리펩타이드를 암호화한다. 두 개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택적 마커를 함유할 수 있다. 대신으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다를 암호화하고, 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서는, 과잉의 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 경쇄가 배치되어야 한다 [Proudfoot, Nature 322:52 (1986); 및 Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈성 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해서 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합적으로 발현되면, 이것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 다음에 CXCR5에 대한 친화성, 및 크기-배제 크로마토그래피 등), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 그 밖의 다른 모든 표준 기술에 의해서 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 본 명세서에 기술되거나 본 기술분야에서 다른 식으로 공지된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합되어 정제를 용이하게 할 수도 있다.
이하의 실시예에 예시된 바와 같은 재조합 CXCR5 단백질을 사용하여 마우스를 면역시켜 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시켰다. 수득된 모노클로날 항체를 유익한 치료학적 가능성을 갖는 것, 예를 들어, 그에 대한 CXCR5 리간드의 결합을 방지하는 것에 대해서 선택하였다. 그 후, 선택된 항체를 변형시켜 생체내에서 증진된 안정성을 갖는 것과 같은 유익한 특성을 수득하였다.
본 발명의 항체는 본 기술분야에서 공지된 어떤 적합한 방법에 의해서나 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있지만, 인간에서의 사용을 최적화할 뿐만 아니라 항체 자체의 사용을 최적화하기 위한 항체의 변형으로 인하여 모노클로날 항체가 바람직한데, 이는 특정한 단백질의 생산 및 조작의 용이성 때문이다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 숙련된 전문가에게 공지되어 있다 [Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)].
예를 들어, 본 명세서에 예시된 바와 같은 면역원은 토끼, 마우스, 카멜리드, 랫트 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 숙주 동물에게 투여하여 CXCR5에 대해서 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 면역원의 투여는 면역화제, 및 필요에 따라, 보조제의 하나 또는 그 이상의 주사를 수반할 수 있다. 다양한 보조제는 숙주 종에 따라서 면역학적 반응을 증가시키기 위해서 사용될 수 있으며, 프로인트 보조제 (완전 및 불완전), 광유, 겔, 명반 (수산화 알루미늄), 라이소리세틴과 같은 표면 활성물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온 (polyanion), 펩타이드, 오일 에멀전, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanins; KLH), 디니트로페놀, 및 BCG (Bacille Calmette -Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 추가의 예로는 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로즈 디코리노마이콜레이트)가 포함된다. 면역화 프로토콜은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 선택된 동물 숙주 내에서 면역반응을 유발시키는 어떤 방법에 의해서나 수행될 수 있다. 따라서, 다양한 투여 경로가 디자인 선택에 따라서 다양한 시간에 걸쳐서 사용될 수 있다.
일반적으로, 면역원 (보조제가 있거나 없이)을 수회 피하 또는 복강내 주사에 의해서, 또는 근육내 또는 정맥내로 포유동물에게 주사한다. 면역원은 천연적으로 존재하는 세포, 천연적으로 존재하는 돌연변이체 세포 또는 유전적으로 엔지니어링된 세포일 수 있는, CXCR5를 생산 또는 과생산하는 세포에 의해서 생산될 수 있는 CXCR5 폴리펩타이드, 융합 단백질, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 특정의 상황에서는, CXCR5를 발현하는 전체 세포가 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 성질 (즉, 소수성 퍼센트, 친수성 퍼센트, 안정성, 순전하, 등전점 등)에 따라서, CXCR5 또는 이의 일부분은 포유동물과 같은 면역되는 동물에서 면역원성이거나 더 면역원성이 되도록 변형 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, CXCR5 또는 이의 일부분은 담체에 접합될 수 있다. 접합은 접합될 면역원 및 면역원성 단백질 둘 다에 대한 활성 화학적 기능적 그룹을 공유결합이 형성되도록 유도체화시키거나 융합-단백질 기본 방법을 통한 화학적 접합, 또는 숙련된 전문가에게 공지된 다른 방법을 포함한다. 이러한 담체 또는 면역원성 단백질의 예로는 KLH, 오브알부민, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 대두 트립신 억제제, 및 무차별적 T 헬퍼 펩타이드가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 다양한 보조제를 사용하여 상술한 바와 같이 면역학적 반응을 증가시킬 수 있다.
일단 적합한 제제가 수득되면, 친화성 크로마토그래피, 패닝 (panning), 흡수 등과 같은 공지의 분리기술에 의해서 다수의 항체로부터 특정의 항체를 분리시킬 수 있다. 이 방법으로, 각각의 항체 종이 추가의 시험, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 CDR의 아미노산 서열을 수득하기 위한 서열 결정을 위해서 수득될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는, 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975); 미국 특허 제4,376,110호; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); 및 Hammerling et　al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 기술, 예를 들어, 형질감염체 (transfectoma)를 제조 및 사용하는 재조합 DNA 방법, 또는 숙련된 전문가에 공지된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위해서 사용될 수 있는 방법의 다른 예로는 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); 및 Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)], 및 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 어떤 면역글로불린 클래스, 및 이의 어떤 서브클래스에 속하는 것일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다.
하이브리도마 모델에서는, 마우스, 인간화된 마우스, 인간 면역 시스템 유전자를 갖는 유전자 이식 마우스, 햄스터, 토끼, 랫트, 낙타 또는 어떤 다른 적절한 숙주 동물과 같은 숙주를 면역시켜 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나, 생산할 수 있는 림프구를 이끌어 낸다. 대신으로, 림프구는 시험관내에서 면역시킬 수 있다. 그 후, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)].
일반적으로, 항체-생성 하이브리도마의 제조 시에 인간 기원의 세포가 바람직하다면 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 바람직하다면, 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 불멸화된 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 또는 그 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지"), HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지하는 물질을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은 수준의 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 대해서 민감한 것이다. 이들 골수종 세포주에는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, Calif.)로부터 입수할 수 있음) 및 SP2/0, FO 또는 X63-Ag8-653 세포 (American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있음)와 같은 쥐 골수종 세포주가 있다.
인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해서 기술되었다 [Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)]. 마우스 골수종 세포주 NSO를 또한 사용할 수 있다 (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK).
또 다른 대체방법은 화학적 융합보다는 전기적 융합을 사용하여 하이브리도마를 형성시키는 것이다. 융합 대신에, B 세포를 예를 들어, 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus) 또는 또 다른 형질전환 유전자를 사용하여 불멸화시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Zurawaki et al., in Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19-33. (1980)]. 면역글로불린을 발현하는 유전자 이식 마우스 및 인간 B 림프구가 이식된 중증 복합 면역결핍성 (SCID) 마우스가 또한, 사용될 수 있다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 CXCR5에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해서 시험한다. 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해서, 또는 방사선 면역측정법 (RIA), 형광세포측정 분석법 (FACS) 또는 효소-결합된 면역흡착시험법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합시험에 의해서 결정된다. 이러한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 전문가의 기술의 범위 내의 것이다. CXCR5에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어, 스캐챠드 분석 (Scatchard analysis) [Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)]에 의해서 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론은 제한 희석방법에 의해서 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해서 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]. 적합한 배양 배지에는 예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (D-MEM) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수암으로 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해서 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 단백질 G-세파로즈, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제방법에 의해서 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리 또는 단리될 수 있다.
다양한 방법이 모노클로날 항체의 생산을 위한 기술분야에 존재하며, 따라서 본 발명은 하이브리도마에서의 이들의 유일한 생산으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵, 파아지 또는 원핵 클론으로부터 유도된 항체를 나타낸다.
본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화 또는 다른 공급원으로부터의 이러한 쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 분리되고 서열 결정된다 [Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), 및 Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)]. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내에 배치할 수 있으며, 다음에 이것을 다른 식으로는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, NS0 세포, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포 내에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. DNA는 또한, 예를 들어, 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 암호화 서열을 치환시키거나 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)], 또는 면역글로불린 암호화 서열에 비-면역글로불린 펩타이드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써 변형될 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 본 발명의 항체의 불변 영역에 대해서 치환될 수 있거나, 본 발명의 항체의 하나의 CXCR5-결합 부위의 가변 영역에 대해서 치환되어 키메릭 이가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 일가 항체일 수 있다. 일가 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합체 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, 중쇄 교차결합을 방지하기 위해서 Fc 부분의 어떤 점에서나 절단된다. 대신으로, 적절한 시스테인 잔기를 교차결합을 방지하기 위해서 결실시키거나, 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다.
특정의 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해서 생성될 수 있다. 전형적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해적 분해에 의해서 유도되었다 [참조: 예를 들어, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)]. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F( ab' ) 2 단편은 파파인 (Fab 단편을 생산함) 또는 펩신 (F( ab' ) 2 단편을 생산함)과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백분해적 절단에 의해서 생산될 수 있다. F(ab') 2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 부분 및 중쇄의 불변 부분 CH1 영역을 함유한다. 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해서 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대신으로, F(ab')2-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 화학적으로 커플링시켜 F( ab' )2 단편을 형성시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992)]. 또 다른 접근방법에 따라, F( ab' )2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리시킬 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 다른 구체예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (Fv)이다 [WO 93/16185].
인간에게서의 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출시험을 포함한 일부의 사용의 경우에는, 키메릭, 인간화 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메릭 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et　al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); 및 미국 특허 제5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397호].
인간화된 항체는 CXCR5를 결합시키는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자로부터 유도되는데, 여기에서는 이들로부터의 하나 또는 그 이상의 CDR이 인간 면역글로불린 분자로부터의 FR 부분에 삽입된다. 항체는 예를 들어, CDR 이식 [EPO 239,400; WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089호], 베니어링 (veneering) 또는 재표면화 [EPO 592,106; EPO 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); 및 Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)], 및 연쇄 셔플링 [미국 특허 제5,565,332호]을 포함한 본 기술분야에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비-인간 아미노산 잔기는 종종, 일반적으로 "수입 (import)" 가변 영역으로부터 채택되는 "수입" 잔기로 불린다. 인간화는 본질적으로, 윈터 (Winter)와 공동 연구자들의 방법 [Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et　al., Nature 332:323 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]에 따라 비-인간 CDR 또는 CDR 서열의 일부분을 인간 항체의 상응하는 서열에 대해서 치환시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이며 [미국 특허 제4,816,567호], 여기에서는 온전한 인간 가변 영역보다 실질적으로 작은 것이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해서 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 일반적으로 일부의 CDR 잔기 및 가능한 몇 개의 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터 치환된 인간 항체이다. 하나 또는 그 이상의 중쇄 영역을 포함할 수 있는 중쇄 불변 부분, 및 힌지 부분은 특정한 효과기 기능과 같은 바람직한 효과를 수득하는 어떤 클래스 또는 서브클래스로부터나 유도될 수 있다.
종종, 인간 골격구조 부분에서 골격구조 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기에 의해서 치환되어 항원 결합을 변화시키고, 아마도 개선시킬 수 있다. 골격구조 치환은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 골격구조 잔기를 확인하기 위한 CDR과 골격구조 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서의 예외적인 골격구조 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해서 확인된다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 및 Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)].
인간화된 항체는 CXCR5에 대한 높은 친화성을 보유하고, 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하거나 획득하는 것이 더 바람직하다. 따라서, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 삼차원적 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 생성물을 분석하는 방법에 의해서 제조된다. 삼차원적 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용할 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 유망한 삼차원적 입체배좌 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서의 특정 잔기의 유망한 역할의 분석, 즉 CXCR5를 결합시키는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방식으로, FR 잔기를 선택하고, 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특징이 최대화되도록 수용주 및 수입 서열로부터 조합할 수 있지만, 이것은 CXCR5 결합에 직접 및 가장 실질적으로 영향을 미치는 CDR 잔기이다. CDR 부분은 또한, CDR이 수득되는 모 항체로부터 수득된 것과는 다른 하나 또는 그 이상의 아미노산을 함유하도록 변형되어 예를 들어, 더 큰 친화성 또는 더 큰 친화력의 결합과 같은 관심이 있는 증진되거나 상이한 특성을 제공할 수 있다.
항체의 불변 부분의 특정한 부분은 모 항체에서 관찰된 것과 상이하거나 그보다 더 우수한 특성을 갖는 항체 동족체, 유도체, 단편 등을 제공하도록 조작하고, 변화시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다수의 IgG4 항체는 힌지 부분에 인접하여 쇄내 디설파이드 결합을 형성한다. 쇄내 결합은 모 이가 분자를 불안정화시켜 회합된 경쇄와 함께 중쇄를 포함하는 일가 분자를 형성할 수 있다. 이러한 분자는 재회합할 수 있지만 무작위 방식으로 이루어진다.
IgG4 분자의 힌지 부분에서 아미노산을 변형시키는 것은 쇄내 결합 형성의 가능성을 감소시킴으로써 IgG4 분자를 안정화시켜 이중특이적 분자를 형성할 가능성을 최소화시킬 수 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 변형은 치료학적 항체가 IgG4 분자인 경우에 유익할 수 있는데, 이는 증진된 안정성은 생체내에서뿐만 아니라 생산 및 제조 중에 분자가 해리하는 가능성을 최소화할 수 있기 때문이다. 일가 항체는 이가 모 분자와 동일한 유효성을 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 이가 IgG4가 환자에게 투여되면, 이가 IgG4의 백분율은 2 주일의 기간에 걸쳐서 약 30%로 쇠퇴한다. 위치 228에서의 아미노산 치환은 IgG4 안정성을 증진시킨다. 228 위치에 있는 세린은 나머지 19 아미노산 중의 하나와 같은 다른 아미노산에 의해서 대체될 수 있다. 이러한 변화는 특히 재조합 항체에 의해서 이루어질 수 있는데, 여기에서는 핵산 암호화 서열이 돌연변이되어 위치 228에서 치환 아미노산을 수득할 수 있다. 예를 들어, S는 프롤린으로 대체될 수 있다.
변형에 적합한 아미노산의 또 다른 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 및 결합된 항체의 내재화와 함께 중쇄를 함유하는 분자의 결합에 영향을 미치는 힌지의 영역 내에 있는 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산에는 IgG1 분자 내의 약 233 내지 약 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly) (서열번호 49), 약 252 내지 약 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (서열번호 50), 및 예를 들어, Lys320, Lys 322 및 Pro329를 포함하는 약 318 (Glu) 내지 약 331 (Pro)의 잔기가 포함된다.
완전한 인간 항체가 인간 환자의 치료학적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하는 상술한 파아지 디스플레이 방법을 포함하여, 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 만들어질 수 있다 [참조: 미국 특허 제4,444,887 및 4,716,111호; 및 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO　98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741]. 콜 (Cole) 등 및 보어더 (Boerder) 등의 기술도 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해서 이용할 수 있다 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); 및 Boerner et al., J　Immunol 147:86 (1991)].
인간 항체는 또한, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 특정의 인간 면역글로불린 유전자를 또한 발현하는 유전자 이식 마우스를 사용하여 생산될 수도 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 콤플렉스를 무작위적으로, 또는 상동성 재조합에 의해서 마우스 배아줄기세포 내로 도입시킬 수 있다. 대신으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도 인간 가변 영역, 불변 부분 및 다양성 부분이 마우스 배아줄기세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 그와 동시에 비-기능적이 되도록 할 수 있다. 특히, JH 부분의 동형 결실 (homozygous deletion)은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아줄기세포는 배반포 (blastocyst) 내로 확장 및 미량주입되어 키메릭 마우스를 생산한다. 그 후, 키메릭 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다 [참조: 예를 들어, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); 및 Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)].
유전자 이식 마우스를 정상적 형식으로 CXCR5, 예를 들어, 이의 EC 영역과 같은 CXCR5의 전부 또는 일부분에 의해서 면역시킨다. CXCR5에 대해 지시된 모노클로날 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 유전자 이식 마우스로부터 수득할 수 있다. 유전자 이식 마우스에 의해서 수용된 인간 면역글로불린 이식유전자는 B 세포 분화 중에 재정렬하고, 이어서 클래스 스위칭 (switching) 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 개관에 대해서는 문헌 [Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)]을 참고로 한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는데 대한 검토 및 이러한 항체를 생산하는 프로토콜에 대해서는 예를 들어, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; 및 WO 96/33735; EPO 제0 598 877호; 및 미국 특허 제5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598호를 참고로 한다. 또한, 암젠 (Amgen, Fremont, CA), 젠팜 (Genpharm, San Jose, CA) 및 메다렉스, 인코포레이티드 (Medarex, Inc., Princeton, NJ)와 같은 회사들이 상술한 것과 유사한 기술을 사용하여 CXCR5에 대해 지시된 인간 항체를 제공하는데 종사할 수 있다.
또한, 인간 mAb는 인간 말초혈액 백혈구, 비장세포 또는 골수가 이식된 마우스를 면역시킴으로써 제조될 수 있었다 (예를 들어, XTL Biopharmaceuticals (Israel)의 트리오마 (trioma) 기술). 선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도 선택 (guided selection)"으로 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근방법에서는, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어, 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도한다 [Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)].
재조합 기술을 사용하는 경우에, 항체 변이체는 세포내로, 주변세포질 공간 내로 생산될 수 있거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체 변이체가 세포내로 생산된다면, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립상 파편을 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해서 제거할 수 있다. 문헌 [Carter et　al., Bio/Technology 10:163 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 분리시키는 방법이 기술되어 있다. 간략하면, 세포 페이스트 (paste)를 나트륨 아세테이트 (pH 3.5) 및 EDTA에 노출시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해서 제거할 수 있다. 항체 변이체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로, 우선 상업적으로 이용할 수 있는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 포함시켜 단백분해를 억제할 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적인 오염물의 성장을 방지할 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화성 리간드로서 단백질 A 또는 단백질 G의 적합성은 항체 변이체 내에 존재하는 어떤 면역글로불린 Fc 영역의 종 및 이소타입에 따라 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄를 기본으로 하는 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)]. 단백질 G는 마우스 이소타입 및 인간 IgG3에 대해서 사용할 수 있다 [Guss et　al., EMBO J 5:1567 (1986)]. 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 빈번하게는 아가로즈이지만, 다른 매트릭스도 이용할 수 있다. 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로즈에 의해서 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리시간을 허용한다. 항체 변이체가 CH3 영역을 포함하는 경우에는, 베이커본드 (Bakerbond) ABXTM 수지 (JT Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 아가로즈 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 또한, 회수될 항체 또는 변이체에 따라서 이용할 수 있다.
어떤 예비적 정제단계(들) 후에, 관심이 있는 항체 또는 변이체 및 오염물질을 포함하는 혼합물을 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하여, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
추가로, 본 발명의 항체는 또한, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 기술을 사용하여 CXCR5를 "모방한" 항-이디오타입 항체를 생성시키기 위해서 이용할 수 있다 [참조: 예를 들어, Greenspan et　al., FASEB J 7:437 (1989); 및 Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)]. 예를 들어, CXCR5에 결합하고, 멀티머화 및/또는 CXCR5에 대한 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 사용하여 CXCR5 및 결합 영역을 "모방하고", 결과적으로, CXCR5 및/또는 이의 리간드에 결합하고, 이들을 중화시키는 항-이디오타입을 생성시킬 수 있다. 이러한 중화성 항-이디오타입 또는 이러한 항-이디오타입의 Fab 단편은 예를 들어, CXCL13을 중화시키기 위해서 치료 요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이중특이성 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 적어도 2 개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날의, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명에서, 결합 특이성 중의 하나는 CXCR5에 대해 지시된 것이며, 다른 것은 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유니트, 리간드, 조직-특이적 항원, 바이러스-유도된 단백질, 바이러스-암호화된 외피 단백질, 박테리아-유도된 단백질, 박테리아 표면 단백질 등과 같은 어떤 다른 항원에 대한 것일 수 있다. 따라서, 다른 특이성은 CXCL13에 대한 것일 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합체 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하며, 여기에서 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Milstein et al., Nature 305:537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인하여, 하이브리도마 (quadroma)는 10 개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이들 중에서 단지 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로, 친화성 크로마토그래피 단계에 의해서 달성된다. 유사한 방법은 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991)]에 기술되어 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 다른 방법은 예를 들어, 문헌 [Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004]에 제공된다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 영역은 면역글로불린 불변 영역 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 부분 중의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역과 이루어진다. 이것은 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 부분 (CH1)을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합물을 암호화하는 DNA 및, 경우에 따라, 면역글로불린 경쇄를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질전환시킨다. 이중특이적 항체를 생성시키는데 대한 더 상세한 사항은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986)]을 참고로 한다.
헤테로접합체 항체도 또한 본 발명에 의해서 고려된다. 헤테로접합체 항체는 두 개의 공유적으로 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역 시스템세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화시키도록 제안되었다 [미국 특허 제4,676,980호]. 항체는 교차결합제를 수반하는 것을 포함한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소 (immunotoxin)는 디설파이드 교환반응을 사용하거나, 티오에스테르 결합을 형성시킴으로써 구성될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 기술된 것이 포함된다.
또한, CXCR5에 대한 단일-영역 항체를 생성시킬 수 있다. 이 기술의 예는 카멜리다에 (Camelidae) 중쇄 Ig로부터 유도된 항체에 대해서 WO9425591에 기술되어 있을 뿐만 아니라, 파아지 라이브러리로부터 단일 영역 완전 인간 항체의 분리를 기술한 US20030130496에도 기술되어 있다.
대신으로, 단일쇄 항체의 생산을 위해서 기술된 기술 [미국 특허 제4,946,778호; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988); 및 Ward, et al., Nature 334:544 (1989)]을 단일쇄 항체를 생산하도록 순응시킬 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 브릿지에 의해 Fv 부분의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단일쇄 폴리펩타이드를 제공함으로써 형성된다. 이. 콜라이의 기능적 Fv 단편을 조립하는 기술도 또한 사용될 수 있다 [Skerra et al., Science 242:1038 (1988)].
본 발명은 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나, 화학적으로 접합된 (공유적 및 비-공유적 접합 둘 다 포함) 항체를 포함한다. 본 발명의 융합되거나 접합된 항체가 정제의 용이성을 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); 미국 특허 제5,474,981호; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992); 및 Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991)]. 마커 아미노산 서열은 특히, pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) 내에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩타이드 (서열번호 51)일 수 있으며, 특히 이들의 대부분은 상업적으로 이용할 수 있다 [Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)]. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그에는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그 [Wilson et al., Cell 37:767 (1984)] 및 "플래그 (flag)" 태그 가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
중쇄 및 경쇄 Fv 부분이 연결된 단일 펩타이드 쇄 결합 분자를 생성시킬 수도 있다. 단일쇄 항체 ("scFv") 및 이들을 구성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호에 기술되어 있다. 대신으로, Fab 는 유사한 방법에 의해서 구성 및 발현될 수 있다. 전체 및 부분적 인간 항체 모두는 전체 쥐 mAb보다 덜 면역원성일 수 있으며, 단편 및 단일쇄 항체도 또한 덜 면역원성일 수 있다.
항체 및 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌 [Clarkson et al., Nature 352:624 (1991) 및 Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991)]에는 각각 파아지 라이브러리를 사용한 쥐 및 인간 항체의 분리가 기술되어 있다. 이후의 문헌들은 연쇄 셔플링에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산 [Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)] 뿐만 아니라 매우 큰 파아지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 (combinatorial infection) 및 생체내 재조합 [Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)]을 기술하였다. 따라서, 이 기술들은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전형적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실용적인 대안이다.
항-CXCR5 항체는 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), FACS, 웨스턴 면역블럿팅 또는 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 면역화학적 기술에 의해서 시험한다. 따라서, B 세포 또는 CXCR5를 발현하는 세포를 사용하여 그에 대한 항체 결합을 공지된 기술을 사용하여 검출할 수 있거나, 재조합적으로 발현된 CXCR5 또는 이의 일부분, 예를 들어, EC 영역은 고체상에 부착시켜 디자인 선택으로 배열된 시험에서 포착 요소로 사용할 수 있다.
특정한 항체 동족체가 인간 CXCR5에 결합하는지 여부를 결정하기 위해서는 어떤 통상적인 결합 시험이라도 사용될 수 있다. 유용한 CXCR5 결합 시험에는 인간 CXCR5에 대한 항체의 결합 및 그로 인한 기능을 검출하는 FACS 분석, ELISA 시험, 방사선 면역측정법 등이 포함된다. 본 명세서에 교시된 인간 CXCR5의 전체-길이 및 가용성 형태는 이러한 시험방법에 유용하다. CXCR5, 또는 이의 가용성 단편에 대한 항체 또는 동족체의 결합은 항체 또는 동족체가 유도되는 종의 면역글로불린에 대해서 특이적인 제2 항체를 사용함으로써 편리하게 검출될 수 있다.
특정한 항체 또는 동족체가 인간 CXCR5에 대한 CXCL13 또는 다른 리간드의 결합을 상당히 차단하는지 아닌지 여부를 결정하기 위해서는, 어떤 적합한 경쟁시험이라도 사용될 수 있다. 유용한 시험방법에는 예를 들어, 인간 CXCR5에 대한 결합에 관해서 CXCL13 또는 다른 리간드와 경쟁하는 항체 또는 동족체의 능력을 정량화하는 ELISA 시험, FACS 시험, 방사선 면역측정법 등이 포함된다. 바람직하게는, 고정화된 항체 또는 동족체에 대한 표지된 인간 CXCR5의 결합을 차단하는 리간드의 능력을 측정한다.
인간 CXCR5에 결합하는 항체 또는 동족체의 능력은 인간 CXCR5+ 세포에 결합하는 이의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 특정한 항체 또는 동족체가 인간 CXCR5에 결합하는지 여부를 결정하는데 사용하기 위한 적합한 CXCR5+ 세포는 전체-길이 인간 CXCR5를 암호화하는 DNA로 형질전환되고, 세포 표면 또는 B 세포주 상에서 CXCR5를 발현하는 포유동물 조직 배양 세포이다.
CXCR5+ 세포에 대한 항체 또는 동족체의 결합은 시험할 항체 동족체가 유도된 동일한 종의 면역글로불린에 대해서 특이적인 형광-표지된 제2 항체로 세포를 염색함으로써 검출할 수 있다. 형광 활성화된 세포 분류기 (fluorescence activated cell sorter; "FACS")를 사용하여 어떤 결합이라도 검출 및 정량화할 수 있다 [참조: 예를 들어, Shapiro, Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1985)].
또한, 인간 CXCR5에 대한 CXCL13과 같은 리간드의 결합을 차단하는 항체 동족체의 능력은 과량의 리간드를 CXCR5+ 세포와 함께 예비배양하고, 결합된 리간드가 세포에 대한 항체 또는 동족체의 결합을 차단하는 정도를 정량화함으로써 결정될 수 있다. CXCR5+ 세포에 대한 항체 동족체의 결합은 시험할 항체 동족체가 유도된 동일한 종의 면역글로불린에 대해서 특이적인 형광-표지된 제2 항체를 사용한 FACS 분석에 의해서 정량화할 수 있다. 대신으로, 경쟁시험이 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 표지된 리간드 또는 항체를 사용하여 배열될 수 있다.
상기의 시험에서 사용된 CXCL13과 같은 리간드는 리간드에 대한 유전자로 형질전환된 세포에 의해서, 또는 본 명세서에 교시된 방법을 실시하여 수득하거나 상업적으로 구입한 분리된 CXCL13에 의해서 제공될 수 있다.
특정한 항체 또는 유사체가 생체내에서 순환 CXCR5+ 세포의 수를 상당히 감소시키지 않는지 여부를 결정하기 위해서, 정상적인 면역 기능을 갖는 표유동물에게 항체 또는 동족체를 투여한 후 24 시간 이내에 포유동물로부터 분리된 순환 CXCR5+ 세포의 수를 정량하고, 투여-전의 수 또는 부적절한 특이성의 이소타입-매치된 항체 또는 동족체가 본 발명의 항체 또는 동족체 대신에 투여한 대조 포유동물에서의 수와 비교한다. CXCR5 항체 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체를 투여한 동물에서 CXCR5+ 세포의 정량화는 예를 들어, 수득된 세포를 항-CXCR5 항체를 결합시키는 형광-표지된 항체뿐만 아니라 T 세포 및 B 세포에 대해서 특이적인 표지된 항체로 염색하고, 이어서 FACS 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 항체는 항체가 인식하거나 특이적으로 결합하는 CXCR5의 에피토프(들) 또는 일부분(들)에 의하여 기술되거나 명시될 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드 부분(들)은 본 명세서에 기술된 바와 같이, N-말단 및 C-말단 위치, 인접 아미노산 잔기의 크기, 입체배좌 에피토프 등에 의해서 명시될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 교차-반응성에 의해서 기술되거나 명시될 수도 있다. CXCR5 폴리펩타이드를 결합시키며, CXCR5에 대해서 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성 (본 기술분야에서 공지되고, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 항체도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체는 또한, 관심이 있는 CXCR5에 대한 결합 친화성에 의해서 기술되거나 명시될 수 있다. 항-CXCR5 항체는 약 10-7 M 미만, 약 10-6 M 미만, 또는 약 10-5 M 미만의 KD로 결합할 수 있다. 약 10-8 내지 약 10 -15　M, 약 10-8 내지 약 10-12 M, 약 10-9 내지 약 10-11　M, 또는 약 10-8 내지 약 10-10 M의 평형 해리상수 또는 KD를 갖는 것과 같은 관심이 있는 항체에서의 더 큰 친화성이 유익할 수 있다. 본 발명은 또한, 경쟁적 결합을 결정하기 위하여 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역측정법에 의해서 결정되는 것으로서, 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제한다.
본 발명은 또한, 관심이 있는 항체를 포함하는 접합체를 포함한다. 접합체는 두 개의 주된 성분인 관심이 있는 항체, 및 세포-결합제, 세포독성제 등일 수 있는 제2 성분을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "세포-결합제"는 세포 표면상의 분자를 특이적으로 인식하고, 그에 결합하는 약제를 의미한다. 따라서, 세포-결합제는 CD 항원, 바이러스 항원과 같은 병원체 항원, 분화 항원, 암 항원, 세포-특이적 항원, 조직-특이적 항원, Ig 또는 Ig-유사 분자 등일 수 있다.
한가지 구체예에서, 세포-결합제는 CXCL13, 또는 CXCR5 및 CXCL13과 같은 이의 리간드의 콤플렉스를 특이적으로 인식한다. 접합체는 접합의 효과기 기능이 세포 상에 작용하도록 하고/하거나, 접합체가 충분한 시간 동안 세포에 의해서 내재화되도록 하기 위해서 충분한 시간 동안 표적 세포와 접촉하도록 할 수 있다.
세포-결합제는 현재 공지되어 있거나, 공지될 어떤 타입의 것이라도 될 수 있으며, 펩타이드, 비-펩타이드, 사카라이드, 핵산, 리간드, 수용체 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 세포-결합제는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 세포를 결합시킬 수 있는 어떤 화합물이라도 될 수 있다. 일반적으로, 이 약제는 항체 (특히, 모노클로날 항체), 림포킨, 호르몬, 성장 인자, 비타민, 영양소-수송 분자 (예를 들어, 트랜스페린), 또는 어떤 다른 세포-결합 분자 또는 물질일 수 있다.
사용될 수 있는 세포-결합제의 다른 예로는 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체; 및 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv와 같은 항체의 단편이 포함된다 [Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); 및 Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)].
제2 성분은 또한, 세포독성제일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "세포독성제"는 세포의 기능 또는 성장을 감소시키거나 차단하고/하거나, 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 따라서, 세포독성제는 탁솔, DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드, CC-1065 또는 CC-1065 유사체, 리신, 미토마이신 C 등일 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명의 접합체의 어떤 결합제에 의한 것과 같이 세포독성제는 관심이 있는 항체에 직접적으로, 또는 절단성 또는 비-절단성 링커를 통해서 공유적으로 부착된다.
적합한 메이탄시노이드의 예로는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 포함된다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 억제하며, 포유동물 세포에 대해서 매우 독성이다.
적합한 메이탄시놀 유사체의 예로는 변형된 방향족 환을 갖는 것 및 다른 위치에서의 변형을 갖는 것이 포함된다. 이러한 적합한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545호에 기술되어 있다.
변형된 방향족 환을 갖는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 예로는 다음이 포함된다: (1) C-19-데클로로 (미국 특허 제4,256,746호) (예를 들어, 안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해서 제조됨); (2) C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 (미국 특허 제4,361,650 및 4,307,016호) (예를 들어, 스트렙토마이세스 또는 액티노마이세스를 사용한 탈메틸화 또는 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LAH)를 사용한 탈클로로화에 의해서 제조됨); 및 (3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 제4,294,757호) (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해서 제조됨).
다른 위치의 변형을 갖는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 예로는 다음이 포함된다: (1) C-9-SH (미국 특허 제4,424,219호) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해서 제조됨); (2)　C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (미국 특허 제4,331,598호); (3)　C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 제4,450,254호) (노카르디아 (Nocardia)로부터 제조됨); (4) C-15-하이드록시/아실옥시 (미국 특허 제4,364,866호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해서 제조됨); (5) C-15-메톡시 (미국 특허 제4,313,946 및 4,315,929호) (트레비아 누디플로라 (Trewia nudiflora)로부터 분리됨); (6) C-18-N-데메틸 (미국 특허 제4,362,663 및 4,322,348호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해서 제조됨); 및 (7) 4,5-데옥시 (미국 특허 제4,371,533호) (메이탄시놀의 삼염화 티타늄/LAH 환원에 의해서 제조됨).
세포독성 접합체는 시험관내 방법에 의해서 제조될 수 있다. 세포독성제, 약물 또는 프로드럭을 항체에 연결시키기 위해서는, 통상적으로 연결그룹이 사용된다. 적합한 연결그룹은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 디설파이드 그룹, 티오에테르 그룹, 산 불안정성 그룹, 광불안정성 그룹, 펩티다제 불안정성 그룹 및 에스테라제 불안정성 그룹을 포함한다. 예를 들어, 접합체는 디설파이드 교환반응을 사용하거나, 관심이 있는 항체와 약물 또는 프로드럭 사이에서 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 구성될 수 있다.
상기 검토한 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열, 본 발명의 CXCR5-결합성 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 구조물, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 기술을 제공한다.
벡터는 통상적으로 본 기술분야에서 공지된 성분들을 함유하며, 일반적으로 다음 성분들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하나 이들로 제한되지는 않는다: 시그날 서열, 복제의 기점, 하나 또는 그 이상의 마커 또는 선택 유전자, 해독을 촉진시키고/시키거나 증진시키는 서열, 인핸서 요소 등. 따라서, 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유도된 것과 같은 이러한 적합한 전사 또는 해독 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 조절 서열의 예로는 작동인자, mRNA 리보좀 결합 부위, 및/또는 이의 개시 및 종결과 같은 전사 및 해독을 조절하는 그 밖의 다른 적절한 서열이 포함된다. 뉴클레오타이드 서열은 조절 서열이 적절한 폴리펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연관되는 경우에 "작동적으로 연결"된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오타이드 서열이 그 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절한다면, 프로모터 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 항체 중쇄 서열에 작동적으로 연결된다.
또한, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 천연적으로 회합되지 않은 적절한 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열을 발현 벡터 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 시그날 펩타이드 (분비 리더)에 대한 뉴클레오타이드 서열은 항체가 주변세포질 공간에 또는 배지 내로 분비되도록, 폴리펩타이드 서열에 골격-내 융합될 수 있다. 목적하는 숙주 세포에서 기능적인 시그날 펩타이드는 적절한 항체 또는 이의 일부분의 세포외 분비를 증진시킨다. 시그날 펩타이드는 세포로부터의 항체의 분비 시에 폴리펩타이드로부터 절단될 수 있다. 이러한 분비 시그날의 예는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,698,435; 5,698,417; 및 6,204,023호에 기술된 것을 포함한다.
벡터는 플라스미드, 일본쇄 또는 이본쇄 바이러스 벡터, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 또는 DNA 파아지 벡터, 파지미드, 코스미드 또는 관심이 있는 이식유전자의 어떤 다른 담체일 수 있다. 이러한 벡터는 세포 내로 DNA 및 RNA를 도입시키는 잘 알려진 기술에 의해서, 폴리뉴클레오타이드로 세포 내에 도입될 수 있다. 벡터는 파아지 및 바이러스 벡터의 경우에 또한, 감염 및 형질도입을 위해 잘 알려진 기술에 의해서 패키지되거나 캅셀화된 바이러스로서 세포 내에 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 가능하거나 복제 결핍될 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 단지 상보성 숙주 세포 내에서만, 입자를 생산하는데 필수적인 다양한 바이러스 성분들을 보유하는 다수의 벡터를 사용하여 일어날 수 있다. 세포-부재 해독 시스템은 또한, 본 발명의 DNA 구조물로부터 유도된 RNA를 사용하여 단백질을 생산하기 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호].
본 발명의 항체는 어떤 적합한 숙주 세포로부터도 발현될 수 있다. 본 발명에서 유용한 숙주 세포의 예로는 원핵, 효모 또는 더 고등 진핵 세포가 포함되며, 미생물, 예를 들어, 관심이 있는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 세라티아, 및 시겔라뿐만 아니라, 바실리, 슈도모나스 및 스트렙토마이스세스); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스, 피치아, 액티노마이세테스, 클루이베로마이세스, 스키조사카로마이세스, 칸디다, 트리코더마, 뉴로스포라, 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라듐 및 아스퍼질러스); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 재조합 바이로스 발현 벡터 (예를 들어, 컬리플라워 모자익 (cauliflower mosaic) 바이러스, CaMV; 또는 담배 모자익 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 유도된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구조물을 수용하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293 또는 3T3 세포)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
원핵성 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 표현형 선택적 마커 유전자를 포함한다. 표현형 선택적 마커 유전자는 예를 들어, 항생제 저항성을 부여하거나, 자가영양 필요물을 공급하는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 원핵성 숙주 세포에 유용한 발현 벡터의 예로는 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) 및 벡터의 pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) 시리즈와 같은 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드로부터 유도된 것이 포함된다 [Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); 및 Schoepfer, Gene 124:83 (1993)]. 재조합 원핵성 숙주 세포 발현 벡터를 위해서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열에는 T7 [Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)], β-락타마제 (페니실리나제), 락토즈 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature 275:615 (1978); 및 Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)], 및 tac 프로모터 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)]가 포함된다.
효모 벡터는 종종, 2μ 효모 플라스미드로부터 유래하는 것과 같은 복제 서열의 기점, 자가 복제 서열 (ARS), 프로모터 부분, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열 및 선택적 마커 유전자를 함유할 수 있다. 효모 벡터를 위한 적합한 프로모터 서열에는 특히, 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)], 또는 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 다른 해당 효소 [Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)]에 대한 프로모터가 포함된다. 효모 발현에 사용하기 위한 그 밖의 다른 적합한 벡터 및 프로모터는 문헌 [Fleer et al., Gene 107:285 (1991)]에 더 기술되어 있다. 효모에 대해 적합한 다른 프로모터 및 벡터 및 효모 형질전환 프로토콜은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 효모 형질전환 프로토콜은 잘 알려져 있다. 이러한 프로토콜 중의 하나는 선택 배지 내에서 Trp+ 형질전환체를 선택하는 것으로 문헌 [Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)]에 기술되어 있다.
척추동물 배양물이든, 또는 무척추동물 배양물이든 이들로부터 유도된 어떤 진핵성 세포 배양물이라도 작업가능하다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다 [Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp.　277-9, Plenum Publishing (1986); 및 Maeda et al., Nature 315:592 (1985)]. 예를 들어, 바큘로바이러스 시스템이 이종 단백질이 생산을 위해서 사용될 수 있다. 곤충 시스템에서는, 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) 핵다각체병 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 바이러스는 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 암호화 서열은 AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에서 클로닝될 수 있다. 확인된 다른 숙주에는 아에데스 (Aedes), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)가 포함된다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 스트레인, 예를 들어, AcNPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 스트레인을 공공연히 이용할 수 있다. 더구나, 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물도 또한, 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 숙주로 이용될 수 있다.
비록, 예를 들어, 독특한 인자, 피더 (feeder) 세포 등을 갖는 전문화된 배지를 필요로 하는 까다로운 세포주가 존재하지만, 척추동물 세포, 및 배양 (조직 배양) 중에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 과정일 수 있다 [참조: Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973)]. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장주; 어린 햄스터 신장 세포; 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub et　al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포; 인간 자궁경부암 세포 (예를 들어, HeLa); 개 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 마우스 유선종양; 및 NS0 세포이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위해서 벡터로 형질전환시키고, 성장 인자, 비타민, 무기물 등뿐만 아니라 사용된 세포 및 벡터에 적절한 유도체를 함유하는 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다. 통상적으로 사용된 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 (Simian) 바이러스 40 (SV40) 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유도된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 포유동물 숙주 세포 내에서 구조적 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전적 요소, 예를 들어, SV40 기점, 조기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플리스 및 폴리아데닐화 부위를 제공할 수 있다. 바이러스 조기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 두 가지가 복제의 바이러스 기점을 또한 함유할 수 있는 단편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 수득되기 때문이다. 포유동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터의 예는 상업적으로 이용할 수 있다.
햄스 (Ham's) F10, 최소 필수배지 (MEM), RPMI-1640 및 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM)와 같은 상업적으로 이용할 수 있는 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) 및 Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980); 미국 특허 제4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; 또는 6,048,728호]에 기술된 어떤 배지라도 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떤 것이라도 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피성장인자), 염류 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘과 같은 염화물; 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 원소 (통상적으로, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기화합물로 정의됨) 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 그 밖의 다른 어떤 필요한 보충물이라도 디자인 선택에 따라 적절한 농도로 포함될 수 있다. 세포에 적절하며, 이식 유전자의 원하는 발현을 가능하게 하는 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
관심이 있는 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서라도 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지되면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립한 다음에 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et　al., Bio/Techniques 17:242 (1994)]에 기술된 바와 같음), 접합된 올리고뉴클레오타이드를 예를 들어, PCR에 의해서 증폭시킬 수 있다.
대신으로, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이것을 발현하는 세포의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정의 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 면역글로불린을 암호화하는 핵산은 본 발명의 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같은 항체-생산 세포에 대해서 특이적인 것일 수 있는 라이브러리와 같은 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 적합한 프라이머가 PCR 증폭을 위해서 배열될 수 있다. 그 후, PCR에 의해서 생성된 증폭된 핵산은 본 기술분야에서 잘 알려진 어떤 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노사 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오타이드 서열은 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하도록, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생하도록 뉴클레오타이드 서열을 조작하기 위하여 본 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 부위 지시된 돌연변이유발, PCR 등 [참조: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)]을 사용하여 본 명세서에 기술된 관심이 있는 등가물을 수득하도록 조작할 수 있다.
중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 검사하여 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 서열 고가변성의 부분을 결정하기 위한 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열에 대한 비교에 의해서 CDR의 서열을 확인할 수 있다. 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 하나 또는 그 이상의 CDR을 골격구조 부분 내에, 예를 들어, 인간 골격구조 부분 내에 삽입하여 상술한 바와 같이 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있다. 골격구조 부분 및 하나 또는 그 이상의 CDR의 조합에 의해서 생성된 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드는 CXCR5, 또는 적어도 이의 ED 영역을 특이적으로 결합시키는 항체를 암호화한다. 예를 들어, 이러한 방법을 사용하여 쇄내 디설파이드 결합에 참여하는 하나 또는 그 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만들어 하나 또는 그 이상의 쇄내 디설파이드 결합이 결여된 항체 분자를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내의 CXCR5, 및 따라서, CXCR5를 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 한가지 구체예에서는, 본 발명의 항-CXCR5 항체를 사용하여 조직 내 또는 조직으로부터 유도된 세포 내의 CXCR5의 존재 및 수준을 결정한다. 조직 또는 생검에서의 CXCR5의 수준은 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 면역측정법에서 결정될 수 있다. 조직 또는 이의 생검은 동결되거나 고정될 수 있다. 동일하거나 다른 방법을 사용하여 CXCR5의 수준, 세포성 국재화, mRNA 수준, 이의 돌연변이 등과 같은 CXCR5의 다른 특성을 결정할 수 있다.
상술한 방법을 사용하여 예를 들어, 암을 갖는 것으로 공지되거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 암을 진단할 수 있으며, 여기에서는 상기 환자에서 측정된 CXCR5의 수준을 정상적인 대조 대상체의 수준 또는 표준값과 비교한다. 관심이 있는 시험을 또한 사용하여 분화된 림프 조직의 발생과 함께 B 세포 침윤 및 농축을 특징으로 하는 관절염 또는 다른 자가면역 질환을 진단할 수 있다.
본 발명은 추가로, 탐색 또는 진단적 용도로 사용하기 위하여 표지된 모노클로날 항체, 인간화된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 일부의 구체예에서, 표지물은 방사성 표지물, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
상기 표지된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 암, 관절염, 자가면역 질환 또는 다른 CXCR5 질병을 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, 대상체의 신체 내에서 표지물의 분포를 측정하거나 모니터링하는 진단 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 친화성 정제화제로 사용될 수 있다. 이 방법에서는, 항체를 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 덱스트란 또는 아가로즈 수지 또는 필터 종이와 같은 고체상 위에 고정화시킬 수 있다. 고정화된 항체를 정제할 CXCR5를 함유하는 샘플 또는 이들을 보유하는 세포와 접촉시키고, 그 후에 지지체를 관심이 있는 고정화된 항체에 결합된, 정제할 CXCR5 또는 세포를 제외한 샘플 내의 모든 물질을 실질적으로 제거할 수 있는 적합한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체를 관심이 있는 항체로부터 CXCR5 또는 세포를 유리시킬 수 있는 글리신 완충액, pH 5.0과 같은 또 다른 적합한 용매로 세척한다.
진단적 용도를 위해서는, 관심이 있는 항체를 일반적으로 검출가능한 부위로 표지할 수 있다. 일반적으로 다음의 카테고리로 그룹화될 수 있는 다수의 표지물이 이용될 수 있다: (a) 36S, 14C, 125I, 3H 및 131I과 같은 방사성 동위원소 (항체는 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, vol. 12, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991)]에 기술된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다); (b) 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드와 같은 형광 표지물 (형광 표지물은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, supra]에 기술된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있으며, 여기에서 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다); 및 (c) 다양한 효소 기질 표지물이 이용될 수 있다 (미국 특허 제4,275,149호는 개관을 제공한다) (효소는 일반적으로, 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화를 촉진시키는데, 예를 들어, 효소는 분광광도적으로 측정할 수 있는 기질에서의 색상 변화를 촉진시킬 수 있거나, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다). 예를 들어, 발광측정기 (luminometer)를 사용하여 형광의 변화를 정량하는 기술은 공지되어 있거나, 표지물은 형광 수용기에 에너지를 제공한다. 효소 표지물의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어, 유리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 항체에 효소를 접합하는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981)]에 기술되어 있다.
이러한 표지물이 사용되는 경우에는, 다음과 같은 적합한 기질이 이용될 수 있다: i) 호스래디쉬 퍼옥시다제의 경우에는 기질로서 하이드로겐 퍼옥시다제를 사용 (여기에서, 하이드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다); (ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)의 경우에는 발색성 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트를 사용; 및 (iii)　β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)의 경우에는 발색성 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 같은 형광성 기질.
그 밖의 다른 효소-기질 조합은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 이용할 수 있다. 일반적인 개관에 대해서는 미국 특허 제4,275,149 및 4,318,980호를 참고로 한다.
때때로, 표지물은 항체와 간접적으로 접합된다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있으며, 상기 언급된 리포터 중의 어떤 것이라도 아비딘과 접합될 수 있거나 반대로 될 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 따라서 표지물은 간접적 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대신으로, 표지물의 간접적 접합을 달성하기 위해서는 항체를 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합시키고, 상기 언급된 다양한 형태의 표지물 또는 리포터 중의 하나를 항-디곡신 항체와 접합시킨다. 따라서, 표지물과 항체 또는 뮤테인의 간접적 접합은 제2 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 표지될 필요는 없으며, 이의 존재는 제2 항체의 또 다른 형태인 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 경쟁적 결합시험, 직접 및 간접 샌드위치 시험, 및 면역침강시험과 같은 공지된 어떤 시험방법에서나 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987)].
경쟁적 결합시험은 제한된 양의 항체와 결합하는데 대해서 시험 샘플과 경쟁하는 표지된 표준물의 능력을 근거로 한다. 시험 샘플 내의 항원의 양은 항체에 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양의 측정을 용이하게 하기 위해서, 항체는 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 불용성화시킨다. 그 결과로, 항체에 결합된 표준물 및 시험 샘플은 비결합된 채로 남아 있는 표준물 및 시험 샘플로부터 편리하게 분리시킬 수 있다.
샌드위치 시험은 각각 검출된 표적의 상이한 면역원성 부분, 결정인자 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 시험에서는, 분석할 시험 샘플을 고체 지지체 상에 직접 또는 간접적으로 고정화된 제1 항체에 의해서 결합시키고, 그 후에 직접 또는 간접적으로 표지된 제2 항체를 결합된 시험 샘플에 결합시킴으로써 불용성 3-부분 콤플렉스를 형성시킨다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호]. 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 부위로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 시험), 검출가능한 부위로 표지된 항-면역글로불린 항체 또는 다른 적합한 결합쌍의 구성원 (예를 들어, 항체/항원, 수용체/리간드, 효소/기질)을 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 시험). 예를 들어, 샌드위치 시험의 한가지 타입은 ELISA 시험이며, 이 경우에 검출가능한 부위는 효소이다.
면역조직화학의 경우에, 세포 또는 조직 샘플은 신선하거나 동결시킬 수 있거나, 파라핀 내에 포매시키고, 예를 들어, 포르말린과 같은 보존제로 고정시킬 수 있다.
항체는 또한 생체내 진단시험을 위해서 사용될 수도 있다. 일반적으로, CXCR5를 발현하는 부위가 면역신토그래피 (immunoscintography)를 사용하여 국재화될 수 있도록 항체 돌연변이체를 방사성핵종 (예를 들어, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지한다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 표지되거나 세포독성인 접합체와 같은 항체, 이의 단편, 동족체, 이의 유도체 등, 및 특정한 세포 타입을 사멸시키기 위해서 항체, 접합체를 사용하는데 대한 설명서 등을 포함하는 키트를 포함한다. 설명서는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 항체, 접합체 등을 사용하는 지침을 포함할 수 있다. 항체는 액체 형태, 또는 일반적으로 동결건조된 고체로 존재할 수 있다. 키트는 완충제, 재구성용 용액, 및 목적하는 용도를 위한 그 밖의 다른 필요한 성분들과 같은 적합한 다른 시약을 함유할 수 있다. 치료학적 용도 또는 진단적 시험을 수행하기 위한 것과 같은 이의 사용을 위한 설명서와 함께 예정된 양의 시약들의 패키지된 조합이 계획된다. 항체가 효소와 같은 것에 의해서 표지되는 경우에, 키트는 효소에 의해서 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 사용자 유연성, 공간의 경제성, 시약의 경제성 등을 제공하는 시약의 용액의 농축물을 제공하도록 변화될 수 있다. 시약은 용해시키면 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함한, 통상적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 항체는 포유동물을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 한가지 구체예에서, 관심이 있는 항체 또는 등가물은 예를 들어, 전임상 데이터를 수득할 목적으로 비인간 포유동물에게 투여된다. 치료되는 비인간 포유동물의 예로는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 시험이 수행된 그 밖의 다른 포유동물이 포함된다. 이러한 포유동물은 항체에 의해서 치료될 질병에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 관심이 있는 항체의 독성을 시험하기 위해서 사용될 수 있다. 이들 구체예의 각각에서는, 용량 증가식 시험이 포유동물에서 수행될 수 있다.
항체에 접합된 치료학적 부위와 같은 제2 성분이 있거나 없이, 단독으로 또는 세포독성 인자(들)와 함께 투여된 항체는 치료학적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체를 CXCR5-매개된 질병, 장애 또는 상태를 치료하기 위하여 동물, 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 항체-기본 치료법에 관한 것이다. 동물 또는 대상체는 특정한 장애, 예를 들어, CXCR5와 관련된 장애를 갖는 것으로 진단된 포유동물과 같은, 특정한 치료가 필요한 포유동물일 수 있다. CXCR5에 대해 지시된 항체는 예를 들어, 관절염, 염증성 질병, 일반적으로 이식 거부반응, 암 및 자가면역 장애의 예방 또는 치료에 유용하다. 예를 들어, 치료학적으로 허용되는 용량의 본 발명의 항-CXCR5 항체, 또는 다수의 본 발명의 항체 또는 이의 등가물의 칵테일을, 또는 다양한 공급원의 다른 항체와의 조합하여 투여함으로써 질병 증상은 치료된 포유동물, 특히 인간에게서 개선되거나 방지될 수 있다.
본 발명의 치료학적 화합물은 본 발명의 항체 (본 명세서에 기술된 바와 같은 이의 단편, 유사체, 등가물 및 유도체를 포함) 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 (이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함) 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체를 사용하여 본 명세서에 기술된 질병, 장애 또는 상태 중의 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) CXCR5의 이상 발현 및/또는 활성과 연관된 질병, 장애 또는 상태를 치료, 억제 또는 예방할 수 있다. CXCR5의 이상 발현 및/또는 활성과 연관된 질병, 장애 또는 상태의 치료 및/또는 예방은 이들 질병, 장애 또는 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화시키는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체는 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 조성물로 제공될 수 있다. 용어 "생리적으로 허용되는", "약제학적으로 허용되는" 등은 동물 및 또는 특히, 인간에게서 사용하도록 연방 또는 주정부의 관리기관에 의해서 승인되거나, 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
항-CXCR5 항체는 어떤 적합한 방식으로나 포유동물에게 투여될 수 있다. 도입의 방법에는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 경막외, 흡입 및 경구 경로, 및 면역억제 치료를 위해서 필요한 경우에, 병소내 투여가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 비경구적 주입에는 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여가 포함된다. 항체 또는 조성물은 어떤 편리한 경로에 의해서나, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 (bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 라이닝 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 정막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성 약제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료학적 항체 또는 조성물은 심실내 및 초내 주사를 포함한 어떤 적합한 경로에 의해서 중추신경계에 도입시키는 것이 바람직할 수 있으며; 심실내 주사는 예를 들어, 옴마야 저장소 (Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해서 촉진될 수 있다. 또한, 항체는 적합하게는 펄스 주입 (pulse infusion)에 의해서, 특히 항체의 감소식 용량으로 투여된다. 바람직하게는, 투약은 부분적으로 투여가 단기 또는 만성적 주사인지 여부에 따라 주사에 의해서, 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해서 이루어진다.
예를 들어, 리포좀, 미립자, 마이크로캅셀 내의 캅셀화 [참조: Langer, Science 249:1527 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer; Lopez-Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989); 및 Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327] 및 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포; 수용체-매개된 세포내이입 [참조: 예를 들어, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)]; 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부분으로서 핵산의 구성을 포함한 다양한 다른 전달 시스템은 공지되어 있으며, 발명의 항체를 투여하기 위해서 사용될 수 있다.
활성성분은 또한, 예를 들어, 코아서베이션 (coascervation) 기술에 의해서, 또는 계면 중합반응에 의해서 제조된 마이크로캅셀 내에, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캅셀 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캅셀 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캅셀) 내에, 또는 마크로에멀전 내에 포착될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)]에 기술되어 있다.
폐내 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 갖는 제제의 사용에 의해서 사용될 수 있다. 항체는 또한, 건조 분말 조성물의 형태로 환자의 폐 내로 투여될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,514,496호].
특정의 구체예에서, 본 발명의 치료학적 항체 또는 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이것은 예를 들어, 주사에 의해, 카테터를 이용하여, 좌제를 이용하여, 또는 이식물 (여기에서, 상기 이식물은 시알라스틱 (sialastic) 막 또는 섬유와 같은 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질로 된 것이다)을 이용하여 국소 주입, 국부 도포함으로써 (이들로 제한되지는 않는다) 달성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 투여할 때, 단백질이 흡수 또는 흡착하지 않는 물질을 사용하는데 주의를 기울여야 한다.
또 다른 구체예에서, 항체는 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한가지 구체예에서는, 펌프가 사용될 수 있다 [참조: Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); 및 Saudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)]. 또 다른 구체예에서는, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 [참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); 또한, Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); 및 Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)]. 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템은 치료학적 표적의 부근에 배치될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 항체의 치료학적 제제는 저장을 위해서, 바람직한 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 본 기술분야에서 일반적으로 사용되는 임의의 "약제학적으로 허용되는" 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제, 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제 및 그 밖의 다른 잡다한 첨가제와 혼합시킴으로써 동결건조된 제제 또는 수용액으로 제조될 수 있다 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (1980)]. 이러한 첨가제는 일반적으로, 사용되는 투약량 및 농도에서 수용주에게 비독성이며, 따라서 부형제, 희석제, 담체 등은 약제학적으로 허용된다.
"분리된" 또는 "정제된" 항체는 단백질이 유도되는 세포 또는 조직 공급원 또는 배지로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염성 단백질이 실질적으로 존재하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 것이다. 언어 "세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는"은 폴리펩타이드/단백질이 이들이 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포성 성분들로부터 분리된 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 오염성 단백질을 갖는 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생산되는 경우에, 이것은 또한, 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않으며, 즉 배양 배지가 단백질 제제의 용적의 약 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만으로 존재한다. 항체가 화학적 합성에 의해서 생산되는 경우에, 이것은 바람직하게는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질 및 시약이 존재하지 않는데, 즉 관심이 있는 항체는 단백질의 합성에 포함된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 항체의 제제는 관심이 있는 항체 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만으로 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체는 분리되거나 정제된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 문구 "낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준의 응집"은 예를 들어, 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해서 측정된 것으로서, 단백질 중량을 기준으로 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 및 종종 0.5% 이하의 응집을 함유하는 샘플을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준의 단편화"는 예를 들어, HPSEC에 의해서 측정된 것으로서 단일 피크 내에, 또는 예를 들어, 환원된 모세관 겔 전기영동 (rCGE)에 의한 두 개 (2)의 피크 (중쇄 및 경쇄) 내에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 내지 그 이상의 총 단백질을 함유하고, 각각 총 단백질의 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상, 1% 이상 또는 0.5% 이상을 갖는 다른 단일 피크를 함유하지 않는 샘플을 나타낸다. 여기에서 사용된 rCGE는 항체 또는 항체-타입 또는 유도된 분자에서 디설파이드 결합을 환원시키기에 충분한 환원 조건 하에서의 모세관 겔 전기영동을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, CXCR5 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 액체 제제에 관한 용어 "안정성" 및 "안정한"은 소정의 제조, 제제, 수송 및 및 저장 조건 하에서 열 및 화학적 전개, 응집, 분해 및 단편화에 대한 제제 내의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 저항성을 의미한다. 본 발명의 "안정한" 제제는 소정의 제조, 제제, 수송 및 저장 조건 하에서 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 내지 그 이상의 생물학적 활성을 보유한다. 상기 항체 제제의 안정성은 rCGE, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 HPSEC를 포함한 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 기준물과 비교한 응집, 분해 또는 단편화의 정도에 의해서 평가될 수 있다.
용어 "담체"는 치료학적 제제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 생리학적 담체는 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에는 물이 적합한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한, 액체 담체로서, 특히 주사용 용액을 위해서 사용될 수도 있다. 적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 필요한 경우에, 또한 미량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 환제, 캅셀제, 분말, 서방출 제제, 데포제 (depot) 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드와 같은 전형적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 의해서 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태인 유효량의 항체를 함유할 수 있다. 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 제제는 투여의 모드에 적합하도록 구성될 수 있다.
완충제는 생리학적 조건에 근접한 범위로 pH를 유지시키는 것을 도와준다. 완충제는 바람직하게는 약 2　mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제에는 유기 및 무기산 둘 다, 및 이의 염, 예를 들어, 시트레이트 완충제 (예를 들어, 모노나트륨 시트레이트-디나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제 (예를 들어, 석신산-모노나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-디나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제 (예를 들어, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예를 들어, 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-디나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제 (예를 들어, 글루콘산-나트륨 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제 (예를 들어, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제 (예를 들어, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제 (예를 들어, 아세트산-나트륨 아세테이트 완충제 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)가 포함된다. 포스페이트 완충제, 카보네이트 완충제, 히스티딘 완충제, 트리스와 같은 트리메틸아민 염, HEPES 및 그 밖의 다른 공지된 완충제가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해서 첨가될 수 있으며, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 보존제에는 페놀, 벤질 알콜, m-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올 및 3-펜탄올이 포함된다.
등장화제는 본 발명의 액체 조성물의 생리학적 등장성을 보장하기 위해서 존재하며, 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 또는 더 고급 당알콜, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 다가 알코올은 다른 성분의 상대적 양을 고려하여, 중량 기준으로 약 0.1% 내지 약 25%, 바람직하게는 1% 내지 5%의 양으로 존재할 수 있다.
안정화제는 벌크화제부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 것을 도와주는 첨가제까지의 기능적 범위를 가질 수 있는 광범한 카테고리의 부형제를 의미한다. 대표적인 안정화제는 다가 당알콜; 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산, 이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함한 락토즈, 트레할로즈, 스타키오즈, 아라비톨, 에리트리톨, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등과 같은 유기 당류 또는 당알콜; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트와 같은 황-함유 환원제; 저분자량 폴리펩타이드 (즉, <10 잔기); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 사카라이드, 크실로즈, 만노즈, 프럭토즈, 글루코즈와 같은 모노사카라이드; 락토즈, 말토즈 및 슈크로즈와 같은 디사카라이드; 라피노즈와 같은 트리사카라이드; 덱스트란과 같은 폴리사카라이드 등일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 부당 0.1 내지 10,000 w/w의 범위로 존재한다.
추가의 잡다한 부형제에는 벌크화제 (예를 들어, 전분), 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌 또는 비타민 E) 및 공용매가 포함된다.
본 발명에서 제제는 또한, 치료할 특정의 적응증에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 역으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합물 내에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 나타내며, 즉 반대되는 용해도 경향의 그룹, 일반적으로는 유용성 탄화수소 쇄 및 수용성 이온성 그룹으로 구성된다. 계면활성제는 표면-활성 부위의 전하에 따라서 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 종종 다양한 약제학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제에 대해 습윤, 유화, 가용화 및 분산제로 사용된다.
비이온성 계면활성제 또는 세제 (또한, "습윤제"로도 공지됨)는 치료제의 가용화를 돕기 위해서뿐만 아니라 교반-유도된 응집으로부터 치료학적 단백질을 보호하기 위해서 (이것은 또한, 제제가 단백질의 변성을 야기함이 없이 전단 표면 응력에 노출될 수 있도록 한다) 첨가될 수 있다. 적합한 비이온성 계면활성제에는 폴리소르베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 (Pluronic® 폴리올 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (트윈 (TWEEN)-20®, 트윈-80® 등)이 포함된다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07　mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "무기 염"은 산 수소 또는 산의 전부 또는 일부를 금속 또는 금속과 유사하게 작용하는 그룹으로 대체시킴으로써 제공되는, 탄소를 함유하지 않는 모든 화합물을 나타내며, 종종 약제학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제에서 장성 조정용 화합물로 사용된다. 가장 통상적인 무기 염은 NaCl, KCl, NaH2PO4 등이다.
본 발명은 약 5.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.5 내지 6.5, 또는 약 5.8 내지 약 6.2, 또는 약 6.0 범위의 pH를 갖는, 항-CXCR5-결합 화합물 또는 이의 단편의 액체 제제를 제공한다.
본 발명은 약 60일, 약 120일, 약 180일, 약 1 년, 약 2 년 또는 그 이상 동안과 같은 저장을 목적으로 약 -20℃ 내지 약 5℃와 같은, 의사의 진료실 또는 실험실에 있는 상업용 냉장고 및 냉동고 내에서 확인되는 온도에서 안정성을 갖는 액체 제제를 포함하며, 여기에서 상기 안정성은 예를 들어, 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해서 평가된다. 본 발명의 액체 제제는 또한, 예를 들어, 사용 전에 적어도 수 시간, 예를 들어 1시간, 2시간 또는 약 3시간 동안 실온에서 HSPEC에 의해 평가되는 안정성을 나타낸다.
용어 "소분자" 및 유사 용어들은 펩타이드, 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 몰당 약 10,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 (즉, 헤테로유기 및/또는 가노금속 (ganometallic) 화합물, 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 그 밖의 다른 약제학적으로 허용되는 형태를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
따라서, 예를 들어, 암의 경우에 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 통상적인 화학요법제 (파클리탁셀, 카보플라틴, 시스플라틴 및 독소루비신), 항-EGFR 제 (제피티니브, 에를로티니브 및 세툭시마브), 항-혈관형성제 (베바시주마브 및 수니티니브) 뿐만 아니라 인터페론 α 및 탈리도마이드와 같은 면역조절제를 포함하는 다른 타입의 암 치료제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 류마티스성 관절염 (RA)과 같은 류마티스성 질병의 경우에는 관심이 있는 CXCR-결합 분자를 포함하는 병용 요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 CXCR5 항체는 예를 들어, 메토트렉세이트, 및 레플루노마이드와 같은 피리딘 합성 억제제를 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 질병 변형 항류마티스 약물과 같은 소분자와 함께 투약될 수 있다 [Mader & Keystone, J Rheum 34 Supp(16-24) 2007, Gaffo et　al., Am J Health Syst Pharm 63:2451-2465, 2006].
관심이 있는 다양한 형태의 CXCR5-결합 분자는 비-B 세포-고갈성이기 때문에, 이 분자는 작용의 중첩성 기전을 갖는 다른 약물과 조합하여 추가의 상가적 또는 상승적 종말점을 수득할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제2 약물은 사이토킨의 수준에서, T 세포축에서 등으로 작용하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "치료제" 및 "치료제들"은 이상 CXCR5 및/또는 CXCL13 이상 활성과 연관된 질병, 장애, 병 등의 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 모든 약제(들)을 나타낸다. 이것은 비정상적인 B 세포 수준 또는 B 세포 활성으로 나타날 수 있다. 또한, 이상 CXCR5 및/도는 CXCL13 대사 및 활성과 연관된 장애 등을 치료하는데 약물학적 효과를 갖는 공지된 화합물도 포함된다.
또한, 본 발명의 항체는 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사성 뉴클레오타이드 또는 독소와 같은 다양한 효과기 분자에 접합될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Pat. No. 5,314,995; 및 EPO 396,387]. 항체 또는 이의 단편은 세포독소 (예를 들어, 세포증식억제 또는 살세포성 약제), 치료제 또는 방사성 금속 이온 (예를 들어, α 방출제, 예를 들어, 213Bi)과 같은 치료학적 부위에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 모든 약제가 포함된다. 이의 예로는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제에는 항대사산물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 및 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파마이드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신, 다우노마이신 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신, 액티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
항체에 이러한 치료학적 부위를 접합하는 기술은 잘 알려져 있다 [참조: 예를 들어, Arnon et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., in Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson et al., eds., p. 623-53, Marcel Dekker (1987); Thorpe, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., eds., p. 475-506 (1985); Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., p. 303-16, Academic Press (1985); 및 Thorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982)]. 대신으로, 항체는 제2 항체에 접합되어 이기능성 항체와 같은 항체 헤테로접합체를 형성할 수도 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호].
본 발명의 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해서 사용될 수 있으며, 치료제 또는 약물 부위는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 이해되지는 않는다. 예를 들어, 약물 부위는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질에는 예를 들어, 아부린, 리신 A, 슈도모나스 내독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 조직 플라즈미노겐 활성화제 또는 세포소멸제, 예를 들어, TNF-α, TNF-β, AIM I [WO 97/33899], AIM II [WO 97/34911], Fas 리간드 [Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)], VEGF [WO 99/23105]와 같은 단백질; 혈전제; 항-혈관형성제, 예를 들어, 앤지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 예를 들어, 림포킨, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-6 (IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (GCSF) 또는 다른 성장인자와 같은 생물학적 반응 변형제가 포함될 수 있다.
생체내 투여하기 위하여 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 액체 제제는 0.2㎛ 또는 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 멸균될 수 있다.
서방출 제제가 제조될 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예로는 성형체, 예를 들어, 필름 또는 매트릭스의 형태인, 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함된다. 서방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 [미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 (예를 들어, 락트산-글리콜산 공중합체로 구성된 주사용 마이크로구체) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하는 반면에, 특정의 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 합리적인 전략은 포함된 기전에 따라 안정화를 위해서 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 발견된다면, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제, 아미노산 치환을 사용하고, 특정의 중합체 매트릭스 조성을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
항체 또는 이의 변이체 조성물은 적합한 의료 관례에 부합하는 방식으로 제제화하고, 조제하고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들에는 치료할 특정의 장애, 치료될 특정의 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제 전달의 부위, 투여의 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 전문가에게 공지된 그 밖의 다른 인자들이 포함된다. 투여될 항체 또는 변이체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려사항에 의해서 결정되며, CXCR5 질병, 상태 또는 장애를 예방, 개선 또는 치료하는데 필요한 최소량일 수 있다.
항체 또는 이의 변이체는 임의로, 해당 장애를 예방 또는 치료하기 위해서 현재 사용되는 하나 또는 그 이상의 약제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입 및 상기 언급된 다른 인자들에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일한 투약형으로, 상기에서 사용된 것과 같은 투여 경로에 의해서, 또는 이전에 사용된 투약량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "유효량"은 CXCR5 질병의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키거나, 이의 하나 또는 그 이상의 증상을 개선시키거나, CXCR5 질병의 전진을 방지하거나, CXCR5 질병의 퇴화를 야기하기에 충분하거나, CXCR5 질병 또는 이의 하나 또는 그 이상의 증상의 발달, 재발, 발병 또는 진행의 예방을 제공하거나, CXCR5 질병을 치료하는데 유용한 또 다른 치료법 (예를 들어, 또 다른 치료제)의 예방적 및/또는 치료학적 효과(들)를 증진 또는 개선시키는데 충분한 치료법 (예를 들어, 예방 또는 치료제)의 양을 나타낸다. 예를 들어, 관심이 있는 치료는 기준선 또는 정상적인 수준을 기초로 하여, 상승된 B 세포 수준을 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 치료 또는 예방제의 유효량은 관절염 또는 이식 거부반응과 같은 CXCR5 질병의 증상을 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%까지 감소시킨다. 또한, 본 명세서에서는 동등한 것으로 용어 "치료학적 유효량"이 사용된다.
특정한 장애 또는 상태의 치료에 사용하기에 효과적일 수 있는 치료학적 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 단편의 양은 장애 또는 상태의 성질에 따라 좌우될 수 있으며, 표준 임상적 기술에 의해서 결정될 수 있다. 가능한 경우에, 본 발명의 용량-반응 곡선 및 약제학적 조성물은 일차로 시험관내에서 유도될 수 있다. 적합한 동물 모델 시스템을 이용할 수 있다면, 다시 용량-반응 곡선을 수득하고 사용하여 본 기술분야에서 공지된 적합한 인간 투약 실시방법을 추정할 수 있다. 그러나, 본 기술분야의 통상적인 지식을 기준으로 하여, 염증성 효과의 감소를 촉진시키는데 효과적인 약제학적 조성물은 예를 들어, 약 5 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 약 10 내지 20　ng/ml 사이의 국소적 치료제 농도를 제공할 수 있다. 본 발명의 추가의 특정한 구체예에서, B 세포-의존적 자가면역 증상 또는 이식 거부반응에 책임이 있는 세포의 성장 및 생존을 개선시키는데 효과적인 약제학적 조성물은 약 10 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 국소적 치료제 농도를 제공할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 치료학적 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 단편의 수용액은 피하 주사에 의해서 투여될 수 있다. 각각의 용량은 체중 킬로그램당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg, 더욱 바람직하게는 체중 킬로그램당 약 3 mg 내지 약 30 mg의 범위일 수 있다. 투약량은 본 기술분야에서 공지된 약제학적 방법을 실행하여 특정한 질병, 환자 집단, 투여의 모드 등에 대해서 경험적으로 확인될 수 있다.
피하 투여를 위한 투약 스케줄은 질병의 타입, 질병의 중증도 및 치료제에 대한 대상체의 감수성을 포함한 다수의 임상적 인자들에 따라서 1 주일에 한번 내지 매일로 달라질 수 있다.
본 발명은 정제된 항체의 분획을, 예를 들어, 적절한 분자량 (mw) 컷오프 (예를 들어, 이의 F( ab' )2 단편에 대해서 30 KD 컷오프; 및 Fab 단편에 대해서 10 KD 컷오프)를 갖는 반투과성 막을 사용하여 약 15 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 250　mg/ml, 약 300 mg/ml 또는 그 이상의 최종 농도로 농축시키고, 농축된 항체 분획을 임의로, 동일한 막을 사용하여 제제 완충제 내로 정용여과하는 것을 포함하여, 항체 또는 이의 CXCR5-결합 단편의 액체 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체내에서 개선된 반감기를 갖는, 관심이 있는 생성물의 KD 안정성과 같은 안정한 액체 제제를 포함한다. 따라서, 관심이 있는 항체는 대상체, 바람직하게는 인간에게서, 3일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상, 또는 그 이상의 개선된 반감기를 갖는다.
생체내에서 항체의 혈청 순환을 지연시키기 위해서는, 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 불활성 중합체 분자는 다기능성 링커가 있거나 없이, 항체의 N-말단 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해서, 또는 리신 잔기 상에 존재하는 ε 아미노 그룹에 의해서 항체에 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 최소 상실을 제공하는 선형 또는 분지된 중합체 유도체화가 사용될 수 있다. 접합의 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해서 면밀하게 모니터링하여 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제에 의해서, 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역측정법에 의해서, 결합 활성에 대해서뿐만 아니라 생체내 효능에 대해서도 시험할 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 영역, 또는 이의 FcR 결합 단편 (예를 들어, Fe 또는 힌지 Fe 영역 단편)에 도입시킴으로써 생성될 수도 있다 [참조: 예를 들어, WO 98/23289; WO 97/34631; 및 미국 특허 제6,277,375호].
추가로, 항체는 알부민에 대해 접합되어 생체내에서 더 안정한 항체를 제조하거나, 생체내에서 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 이 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, WO 93/15199, WO　93/15200 및 WO 01/77137; 및 EPO 413, 622]. 항체는 또한, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백분해적 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해서 변형될 수도 있다.
한가지 구체예에서, 조성물은 일상적인 절차에 따라서 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로 제제화된다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요에 따라서, 조성물은 또한, 가용화제, 및 주사의 부위에서 통증을 완화시키기 위한 리도카인 또는 다른 "카인" 마취제와 같은 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로, 또는 함께 혼합시켜 단위 투약형으로, 예를 들어, 활성 약제의 양을 나타내는 앰플 또는 새시 (sachet)와 같은, 밀봉된 용기 내의 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 제공된다. 조성물이 주입에 의해서 투여되는 경우에, 이것은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우에는, 주사하기 전에 성분들을 혼합시킬 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이, 예를 들어, 키트 내에 제공될 수 있다.
본 발명은 또한, 관심이 있는 생성물의 양을 나타내는 앰플 또는 새시와 같은 밀봉된 용기 내에 포장된 본 발명의 액체 제제를 제공한다. 본 발명의 액체 제제는 항체 또는 항체 단편의 양 및 농도를 나타내는 밀봉된 용기 내에 있을 수 있다. 본 발명의 액체 제제는 적어도 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40　mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100　mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml의 CXCR5 항체를 갖는 밀봉된 용기 내에서, 예를 들어, 1 ml, 2　ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9　ml, 10 ml, 15 ml 또는 20 ml의 양으로 공급될 수 있다.
상술한 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 CXCR5 장애 또는 질병을 진단, 예방 또는 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트 (sterile access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하용 주사바늘에 의해서 뚫을 수 있는 스톱퍼 (stopper)를 갖는 바이알일 수 있다). 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 조성물이 선택된 상태를 치료하기 위해서 사용되는 것을 나타낸다. 제품은 추가로, 포스페이트-완충된 식염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이것은 추가로, 완충제, 희석제, 필터, 주사바늘, 시린지 및 사용에 대한 설명을 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 소비자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 항체 또는 이의 기능적 유도체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산은 유전자 요법을 이용하여, CXCR5의 이상 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 장애를 치료, 억제 또는 예방하기 위하여 투여된다. 유전자 요법은 발현되거나 발현가능한 관심이 있는 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 치료법을 나타낸다. 본 발명의 구체예에서, 핵산은 치료학적 효과를 매개하는 표적 숙주 세포 내에서 그에 의해, 암호화된 단백질을 생산한다. 이용할 수 있는 유전자 요법을 위한 어떤 방법이라도 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
유전자 요법의 방법에 대한 일반적인 검토는 문헌 [Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488 (1993); Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991); Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993); Mulligan, Science 260:926 (1993); Morgan et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993); 및 May, TIBTECH 11:155 (1993)]을 참고로 한다.
한가지 관점에서, 화합물은 항체 또는 이의 기능적 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 적합한 숙주 내에서 항체 또는 단편 또는 키메릭 단백질 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 발현하는 발현 벡터의 일부분이다. 특히, 이러한 핵산 서열은 항체 암호화 부분에 작동적으로 연결된 프로모터 (여기에서 상기 프로모터는 유도성 또는 구성적이며, 임의로 조직-특이적이다) 뿐만 아니라 다른 조절 서열을 갖는다.
또 다른 특정한 구체예에서, 항체 암호화 서열 및 어떤 다른 바람직한 서열의 옆에 게놈 내의 원하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진시키는 부위가 존재하는 핵산 분자를 사용함으로써 항체-암호화 핵산의 염색체내 발현을 제공한다 [Koller, et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435 (1989)]. 특정의 구체예에서, 발현된 항체 분자는 단일쇄 항체이며; 대신으로, 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다, 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 통합을 위한 대체 방법은 특정의 핵산 서열, 아연 핑거 (zinc finger) 등을 인식하는 특정의 전사 인자를 사용하는 것을 포함한다.
환자에게 핵산을 전달하는 것은 직접적 (이 경우에는, 환자가 핵산 또는 핵산-보유 벡터에 직접 노출된다)이거나, 간접적 (이 경우에는, 세포를 시험관내에서 우선 핵산으로 형질전환시킨 다음에 환자에게 이식한다)일 수 있다.
한가지 구체예에서, 핵산 서열은 직접 생체내에 투여되고, 암호화된 생성물을 생산하도록 발현된다. 이것은 본 기술분야에서 공지된 다수의 방법 중의 어느 것에 의해서나, 예를 들어, 적절한 핵산 발현 벡터의 일부분으로서 항체 암호화 서열을 구성하고, 벡터가 세포내에 있도록, 예를 들어, 불완전 또는 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용하여 감염시키거나 [참조: 미국 특허 제4,980,286호], 네이키드 (naked) DNA를 직접 주입하거나, 친수성 핵산을 결합시키며 세포와 융합하는 능력을 가짐으로써 일반적으로 막과 결합하기 위한 소수성 부분을 함유하는 양친매성 화합물을 포함하고, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅한 합성 조성물과 같은 비-바이러스성 벡터 또는 리포좀, 미립자 또는 마이크로캅셀 내의 캅셀화를 사용한 미립자 충돌 (예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 사용하거나, 벡터를 핵을 도입시키는 것으로 공지된 펩타이드에 대한 결합에 투여하거나, 벡터를 수용체-매개된 세포내이입이 일어나기 쉬운 리간드에 대한 결합에 투여하는 [참조: 예를 들어, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)] (이것은 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 타입을 표적화하기 위해서 사용될 수 있다) 등에 의해서 이것을 투여하여 이루어질 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 리간드가 융합원성 바이러스 펩타이드를 포함하여 엔도좀을 붕괴시켜 핵산이 라이소좀성 분해를 회피하도록 하는 핵산-리간드 콤플렉스가 형성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화함으로써 생체내에서 세포-특이적 흡수 및 발현에 대해 표적화될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188 및 WO 93/20221].
벡터에 관해서는, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터가 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 패키징하고, 숙주 세포 DNA 내로 통합시키기 위한 성분을 함유한다. 유전자 요법에서 사용하기 위한 항체를 암호화하는 핵산 서열을 환자에 대한 유전자의 전달을 용이하게 하는 하나 또는 그 이상의 벡터 내에 클로닝시킨다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 이식 유전자를 조혈성 줄기세포에 전달할 수 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스 벡터의 사용을 설명하는 문헌은 다음과 같다: Clowes et al., J Clin Invest 93:644 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467 (1994); Salmons et al., Human Gene Therapy 4:129 (1993); 및 Grossman et al., Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993).
아데노바이러스가 또한, 본 발명에서 사용될 수 있다. 아데노바이러스-기본 전달 시스템에 대한 표적은 예를 들어, 간, 중추신경계, 내피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 초기의 레트로바이러스 벡터에 비해서 이점인 비-분열 세포를 감염시킨다. 문헌 [Kozarsky et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993)]은 아데노바이러스-기본 유전자 요법의 개관을 나타내었다. 문헌 [Bout et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994)]은 유전자를 레수스 원숭이 (rhesus monkey)의 호흡기 상피에 전이시키기 위한 아데노바이러스 벡터의 사용을 설명하였다. 유전자 요법에서 아데노바이러스의 사용에 관한 다른 예는 문헌 [Rosenfeld et al., Science 252:431 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143 (1992); Mastrangeli et al., J Clin Invest 91:225 (1993); WO94/12649; 및 Wang et al., Gene Therapy 2:775 (1995)]에서 볼 수 있다.
아데노-연관된 바이러스 (AAV)도 또한, 유전자 요법에서 사용될 수 있다 [Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993); 및 미국 특허 제5,436,146; 6,632,670; 및 6,642,051호].
유전자 요법에 대한 또 다른 접근방법은 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 인산 칼슘-매개된 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해서 조직 배양물 내의 세포에 대해 유전자를 전이시키는 것을 포함한다. 통상적으로, 전이방법에는 세포에 대한 선택적 마커의 전이가 포함된다. 그 후, 세포는 전이된 유전자를 흡수하고, 이를 발현하는 세포를 분리시키기 위하여 선택한다. 그 후, 이들 세포를 환자에게 전달한다.
따라서, 핵산은 생성된 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공, 미량주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파아지 벡터에 의한 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전이, 마이크로셀 (microcell)-매개된 유전자 전이, 구형질 (spheroplast) 융합 등을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 본 기술분야에서 공지된 방법 중의 어느 것에 의해서나 수행될 수 있다. 세포 내로 외래 유전자를 도입시키기 위한 다수의 기술이 본 기술분야에서 공지되어 있으며 [참조: 예를 들어, Loeffler et al., Meth Enzymol 217:599 (1993); Cohen et al., Meth Enzymol 217:618 (1993); 및 Cline Pharm Ther 29:69 (1985)], 본 발명에 따라 사용될 수 있지만, 단 수용주 세포의 필수적인 발육적 및 생리학적 기능은 붕괴되지 않아야 한다. 이 기술은 핵산이 유전성 세포에 의해서 발현되고, 세포 자손에 의해서 유전되고 발현되도록 세포에 대한 핵산의 안정한 전이를 제공하여야 한다.
생성된 재조합 세포는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 환자에게 전달될 수 있다. 재조합 혈액 세포 (예를 들어, 조혈성 줄기 또는 조상 세포)는 바람직하게는, 정맥내로 투여된다. 사용을 위해서 생각되는 세포의 양은 원하는 효과, 환자의 상태 등에 따라 좌우되며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 결정될 수 있다.
핵산이 유전자 요법을 목적으로 도입될 수 있는 세포는 어떤 바람직하고, 이용가능한 세포 타입이라도 포함하며, 상피세포, 내피세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육세포, 간세포, T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구 및 과립구와 같은 혈액 세포; 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간 등으로부터 수득된 것과 같은 다양한 줄기 또는 조상 세포, 특히 조혈성 줄기 또는 조상 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
한가지 구체예에서, 유전자 요법을 위해서 사용된 세포는 환자에게 자가 유래성이다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열은 이식 유전자가 세포 또는 이의 자손에 의해서 발현되도록 세포 내에 도입시킨 다음에, 재조합 세포를 치료학적 효과를 위해서 생체내에 투여한다. 특정의 구체예에서는, 줄기 또는 조상 세포가 사용된다. 시험관내에서 분리 및 유지될 수 있는 어떤 줄기 및/또는 조상 세포라도 본 발명의 구체예에 따라 잠재적으로 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 94/08598; Stemple et　al., Cell 71:973 (1992); Rheinwald Meth Cell Bio 21A:229 (1980); 및 Pittelkow et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)]. CXCR5는 예를 들어, B 세포 상에서 발현하기 때문에, 혈액 세포 및 골수 세포가 적합한 숙주 세포이다. 그러나, 줄기세포 숙주의 사용에 관한 본 발명의 범위는 관심이 있는 이식 유전자를 배아 및 배아줄기세포에 투여함으로써 유전자 이식 유기체를 제조하기 위하여 이식 유전자를 제조 및 사용하는 것은 예상하지 못하였다.
본 발명은 대상체에게 예를 들어, 본 발명의 액체 제제의 유효량을 투여함으로써 CXCR5 질병 또는 이의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료, 예방 및 개선시키는 방법을 제공한다. 대상체는 바람직하게는 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 등) 및 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 및 인간)와 같은 포유동물이다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
CXCR5는 또한, 췌장암, 결장암 및 방광암뿐만 아니라 T 세포 백혈병 [Qinping et　al., Oncogene 24:573-584, 2005], 및 B 세포 백혈병 [Burkel et al., Blood, Jul 2007; doi:10.1182/blood-2007-05-089409]과 같은 특정의 암 세포 상에서 발현되며, CXCR5의 자극은 암세포의 증식과 상관관계가 있다 [Meijer et al., Canc Res 66:9576-9582, 2006].
따라서, 관심이 있는 항체 또는 이의 유도체는 CXCR5를 발현하는 암세포의 증식을 조절하기 위해서 사용될 수 있으며, 여기에서 암은 본 명세서에 교시된 바와 같은 진단적 시험에 의해서 CXCR5 발현의 존재를 결정함으로써 확인된다. 관심이 있는 항체는 악성 세포의 침윤을 감소시키고, 세포소멸에 대한 저항성을 감소시키고, 증식을 최소화할 수 있다. 그 후, 이러한 환자에게 본 명세서에서 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 유도체의 암세포 증식 억제량을 투여한다.
자가면역 질환은 루푸스 [Ishikawa et al., J Exp Med 193:1393-1402, 2001] 및 쇼그렌 (Sjoren's) 증후군 [Salomonsson et al., Scan J Imm 55:336-342, 2002; 및 Barone et al., Arth Rheum 52(6)1773-1784, 2005]과 같이 CXCL13의 이상 및/또는 높은 발현, 또는 중증근무력증 [Sims et al., J Imm 167:1935-1944, 2001; Saito et al., J Neuroimm 55:336-342, 2005; 및 Tackenberg et al., Eur J Imm 37:849-863, 2007]에서와 같이 CXCR5의 높은 발현과 연관된다. 따라서, 관심이 있는 항체는 CXCL13 또는 CXCR5 리간드의 높은 수준 또는 높은 활성의 영향을 최소화하기 위해서 사용된다. B 세포의 높은 수준, CXCR5의 높은 수준, 또는 CXCL13 또는 다른 CXCR5 리간드의 높은 수준을 특징으로 하는 자가면역 질환에서는, 관심이 있는 항체의 B 세포 활성 억제량이 본 명세서에 교시된 바와 같이 투여된다.
이상 CXCR5 발현은 다발성 경화증에서 관찰된다 [Brain 129(Pt 1)200-211, 2006].
결장염에서, CXCR5는 GALT 형성 및 기능에 역할을 갖는다 [Carlsen et al., Gut, 2002, 51(3)364-367]. 전위성 배중심을 함유하는 궤양성 결장염 병소에서 B 세포의 장점막 고유층 내로의 CXCR5-매개된 이동 및 침윤, 및 일반적으로 점막 침윤 [M azzucchelli et al., J Clin Invest, 1999, 104(10)R49-R54], 및 이의 발현은 관심이 있는 항체에 의해서 억제된다.
B 세포 고갈은 특정의 환경 하에, 류마티스성 관절염과 같은 특정의 적응증에서 증상을 개선시키는데 치료학적 이점이 있을 수 있다 [Oligino & Dalrymple, Arth Res Ther 5(Suppl 4)S7-S11, 2003]. CXCR5는 류마티스성 관절염에 걸리지 않은 개체로부터의 조직에 비해, 관절염 환자의 활액 조직 내에서 높은 수준으로 발현된다 [Schmutz et al., Arth Res Ther 7:R217-R229, 2005]. 따라서, 특정한 형태의 본 발명의 항체 및 이의 유도체는 B 세포 집단을 고갈시킬 수 있으며, 관절 내에서 B 세포의 침윤 및 상호작용을 방지할 수 있다. 따라서, 치료는 관심이 있는 항체의 B　세포 수준 감소량을 관절염으로 진단된 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 병에 걸린 관절에 국소적으로 투여될 수 있다.
전위성 림프구 신생 (ectopic lymphoid neogenesis)은 건선 관절염 [Canete et al., Ann Rheum Dis, Jan 12, 2007, doi:10:1136/ard.2006.062042], 일반적으로, 만성 염증성 질병 [Aloisi & Pujol-Borrell, Nat Rev Imm 6:205-217, 2006], 및 만성 [Baddoura et al., Am J Trans 5:510-516, 2005] 및 급성 [DiCarlo et al., Am J Trans 7:201-210, 2007] 둘 다인 이식 거부반응을 포함한 몇 가지의 상태에서 관찰된다. CXCL13 및 CXCR5는 심장 이식 시에 존재하였으며 [DiCarlo et al., supra]; CXCL13은 건선 관절염에 존재하였다 [Canete et al., supra]. CXCL13 및/또는 CXCR5의 존재는 정상적인 절에서 나타나는 것과 같이, B 세포 및 T 세포 영역을 갖는 전위성 림프 소절의 발생과 연관된다. 동종항원의 B 세포 항원 제시는 또한, 급성 심장 동종 이식 모델과 연관되었다 [Noorchashm et　al., J Imm 177:7715-7722, 2006].
따라서, 관심이 있는 항체를 사용하여 염증 및 이식 거부반응을 약화시킬 수 있다. 그래서, 환자에게 B 세포 활성 억제량의 항체를 투여하여 염증을 약화시키고, 전위성 배중심 발생을 최소화시키고, 이식에 대한 B 세포 동원을 최소화하고, 이식술 전 후에 B 세포 동종항원 제시를 최소화시킨다.
본원 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하며, CXCR5 기능을 억제할 수 있는 인간화된 항체를 제공하며, 또한 상기 항체는 CXCR5 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 이제 숙련된 전문가를 위해서, 일부의 구체예를 도시하고, 본 발명을 실행할 수 있는 이하의 비-제한적 실시예에 의해 예시될 수 있다.
실시예
실시예 1: 면역원의 생성
항-CXCR5 모노클로날 항체는 DNA 암호화 전체-길이 인간 CXCR5에 의해서 형질전환된 CHO 세포에 대해서 야기되었으며, 세포 표면상에서 발현되었다 ("r-CXCR5-CHO cells"). 세포를 형질전환시키기 위해서 사용된 CXCR5 서열은 NM 001716.2, NC000011.8 또는 NM001716과 같은 데이터 베이스로부터 수득될 수 있으며, 적합한 세포 공급원으로부터 합성되거나 분리될 수 있다.
CXCR5 개방 판독 골격 (open reading frame)을 pCDNA3.1neo_DEST와 같은 발현 벡터 내에 배치한 다음에, 300-19 세포 (Immunogen)에 형질감염시켰다.
또한, 아미노산 서열 MNYPTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNTSLVENHLC (서열번호 1)을 갖는 CXCR5 EC 영역을 C 말단 시스테인에 의해서 KLH에 접합시키고, 면역원으로 사용하였다. CXCR5를 발현하는 세포 또는CXCR5 EC 영역을 IP로 투여하였다 (임의로 프로인트 완전 보조제와 같은 100 ㎕의 보조제와 임의로 혼합시킨, 0.2 ml 내의 5 x 106 세포 또는 100　㎕의 완충액 중의 50　㎍의 펩타이드). 항원 주사는, 다양한 공지된 방법 중의 어떤 것, 예를 들어, FACS에 의해서 분리될 수 있는 CXCR5+ 세포, 및 예를 들어, 양성 대조군으로서 상업적으로 이용할 수 있는 MAB190 (R & D Systems)을 사용하는 FACS 또는 ELISA를 사용하여 높은 역가의 CXCR5 항체가 혈청에서 검출될 때까지 매 2 주일마다 반복하였다.
CXCR5를 발현하는 세포를 10% 투석된 소태자혈청 (FBS) (Invitrogen)이 보충된 RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 5% CO2 하에 37℃로 유지시켰다. 세포는, 상기 배양 배지를 5　mM EDTA가 보충된 포스페이트-완충된 (Ca/Mg-부재) 식염수 (CMF-PBS)로 치환시키고, 세포를 이 완충액 중에서 수확함으로써 주사를 위해서 준비하였다. 수확된 세포를 약 5 분 동안 500 x g로 원심분리하여 펠릿화하고, 펠릿을 CMF-PBS에 재현탁시키고 앞서와 같이 원심분리시킴으로써 한번 세척하고, 계수하고, 세포 펠릿을 CMF-PBS에 재현탁시킴으로써 주사에 적절한 용적 (예를 들어, 0.2 ml 내에 5 x 106 세포)으로 조정하였다.
언급한 바와 같이, CXCR5 발현은 예를 들어, 상업적으로 이용할 수 있는 CXCR5 항체, 예를 들어 MAB190 (R & D), 클론 RF8B2 및 2G8 (2G8은 랫트 항-마우스 CXCR5 항체이며, 반면에 구입하는 다른 항체는 항-인간 CXCR5 항체이다) (BD), 및 2C1 (Abnova)뿐만 아니라, 본 기술분야에서 공지된 방법을 실시하여 만들어진 hCXCR5에 대해 지시된 다양한 폴리클로날 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해서 모니터링하였다.
플라스미드 구성을 용이하게 하고, CXCR5의 발현을 증진시키기 위해서, CXCR5 핵산 암호화 서열의 처음 135 염기쌍을 포함하는 리더 펩타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 생성시켰다. 올리고뉴클레오타이드는 GC 함량을 저하시키기 위한 동요성 (wobble) 암호화 위치에서의 약간의 변화를 함유하였다. 모든 뉴클레오타이드 서열 변화는 침묵성이었으며, 즉 어떤 아미노산 서열 변화도 야기하지 않았다. 올리고뉴클레오타이드를 함께 어니일링한 후에, 엔지니어링된 리더 펩타이드 암호화 서열을 PCR-SOE에 의해서 암호화 서열의 나머지에 연결시켰다 [Ho et al., Gene 77:51 (1989); 및 Horton et al., BioTechniques 8:528 (1990)].
CXCR5의 발현은 면역원으로 사용하기 전에 검증되었다. 세포를 10% FBS, 0.2 mM의 글루타민 및 1 x 비-필수 아미노산 용액을 함유하는 RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에서 배양하고, 이어서 T75 플라스크 내에 웰당 약 3-5　x 105 세포로 접종하고, 약 24-48 시간 동안 성장시켰다.
형질전환되거나 형질감염된 세포를, CXCR5 발현 플라스미드를 보유하지 않는 세포가 항생제 선택에 의해서 제거될 때까지 약 2 주일 동안 배양하였다. 안정한 세포주의 세포를 용해시키고, 단백질을 수득하고, 웨스턴 블럿 분석에 적용할 수 있다.
안정하거나 일시적으로 형질감염된 세포를 FACS 분석과 같은 CXCR5의 세포 표면 발현을 검출하기 위한 방법을 사용하여 CXCR5의 발현에 대해서 시험하였다. 대신으로, 세포를 용해시키고, 단백질을 예를 들어, 웨스턴 블럿 분석에 의해서 시험할 수 있다. 배양 접시로부터 수확한 형질감염된 세포를 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)로 한번 세척하고, 탈이온수에 재현탁시키고, 등용적의 2 x 단백질 샘플 부하 완충액 (BioRad, Hercules, CA)과 혼합시킨 다음에, 약 100℃에서 10 분 동안 가열하였다. 막 단백질은 등용적의 2 x 단백질 샘플 부하 완충액과 혼합된 조건화 배지를 사용하여 분석하고, 100℃에서 10 분 동안 가열하였다. 샘플을 4-12% 구배 SDS-PAGE를 사용하여 분리시켰다. 단백질을 겔로부터, 단백질을 전이시키기 전에 PBST (0.05% TWEEN-20®을 함유하는 PBS) 중의 5% 탈지 분유로 적어도 1 시간 동안 차단시킨 니트로셀룰로즈 막 (BioRad, Hercules, CA)에 전이시켰다.
CXCR5는 막을 차단 완충액 중의 CXCR5-특이적 일차 항체와 함께 실온에서 진탕하면서 적어도 1 시간 동안 배양함으로써 검출하였다. 막을 적어도 3 회 세척하고, 차단 완충액 중의 리포터-접합된 이차 항체를 막에 첨가하고, 실온에서 진탕하면서 적어도 1 시간 동안 배양하였다. 막을 PBST 중에서 3 회 세척하고, 예를 들어, 화학발광성 기질로 전개시켰다.
실시예 2: 항- CXCR5 mAB 의 생성
약 4-6 주령의 A/J 또는 BALB/cJ 마우스 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME)를 CXCR5-형질감염 세포 또는 EC 펩타이드로 면역시켰다. 마우스의 한 그룹을 보조제 (CFA)와 혼합된 KLH-접합된 펩타이드의 1:1 에멀젼에 의해 제0일에 복강내로 초회자극하고, IFC (불완전 프로인트 보조제)를 함유하는 펩타이드 및/또는 보조제가 없는 PBS 중의 세포로 제20일에 ip로 추가자극하고, 마지막으로 IFC 중에서 혼합된 KLH-펩타이드 및/또는 보조제가 없는 PBS 중의 세포에 의해서 제44일에 정맥내로 추가자극하였다. 또 다른 그룹의 마우스는 제0일에 ip로 초회자극하고, 제15, 39, 53 및 67일에 ip로 추가자극하고, 마지막으로 제81일에 정맥내로 추가자극하였다 (모든 주사는 보조제가 없는 PBS 중의 세포에 의한다). 양 그룹의 마우스에 대해서, 각각의 주사는 약 200 ㎕의 용적 중에 약 3 x106 내지 2 x 107 세포를 함유하였다. 대신으로, 펩타이드 및/또는 세포 면역화는, 예를 들어, FACS 분석 또는 ELISA에 의해서 확인되는 바와 같이 바람직한 항-CXCR5 역가가 수득될 때까지 매 2 주일마다 한번씩, 3-6 회 수행하였다.
마지막 주사한 지 3일 후에, 마우스를 임의로, 혈청 내의 항-CXCR5 항체 역가에 대해서 시험하고, 희생시키고, 비장을 적출하여 페트리 접시 내의 약 10 ml의 무-혈청 DMEM (Gibco) 내에 배치하였다. 비장세포를 핀셋을 사용하여 캅셀 밖에서 찢어서 가르고, 37℃에서 10 ml의 무-혈청 IMDM (Cellgro, Herndon, VA) 중에서 2 회 세척하였다. 비장 세포 현탁액을 15 ml의 원뿔형 바닥 튜브에 옮기고, 약 2-5 분 동안 파편이 침강하도록 하였다. 비장세포를 함유하는 상등액을 새로운 15 ml 원뿔형 바닥 튜브에 옮기고, 융합이 일어날 때까지 IMDM으로 3 회 더 세척하였다. 마우스로부터의 비장 세포를 모을 수 있다.
임의로, 대조 비장 피더 (feeder) 세포의 5 ml 단일 세포 현탁액을 본질적으로 면역된 비장 세포에 대해서 상술한 바와 같이 비면역된 마우스로부터 제조하고, 필요할 때까지 배양기 (37℃, 5% CO2) 내에 배치하였다.
면역된 비장 세포에 대한 융합 파트너는 P3X63-AG8.653 또는 SP2/0 (ATCC, Manassas, VA)와 같은 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘 (HAT)-민감성, 비-분비성 골수종 세포주 또는 FO_B 림프아세포 (ATCC, CRL-1646)일 수 있다. 융합시키기 전에, 림프양 세포는 세포가 융합일에 대수증식기에 있는 것을 보장하는 IMDM/10% FBS (37℃, 7% CO2) 내에서 유지시켰다. 대체 선택 기전은 일반적으로 융합 후 1일에 첨가되는 아자세린을 사용하는 것을 기반으로 한다.
사용된 융합 프로토콜은 문헌 [Lerner, Yale J Biol Med, 1981, 54(5)387-402, 및 Gefter et al., Somatic Cell Genet, 1977, 3(2)231-236]에 기술된 프로토콜의 하이브리드이다. 융합시키기 전에, 모은 비장 세포를 무-혈청 IMDM으로 3 회 세척하고, 계수하였다. 또한, 융합시키기 직전에, 대수기의 골수종 세포를 무-혈청 IMDM으로 3 회 세척하고, 계수하였다. 림프양 세포를 무-혈청 IMDM 내에 1 x 107 세포/ml로 재현탁시켰다. 각각의 융합을 위해서, 1-1.5 x 108 비장 세포를 50 ml 원뿔형 바닥 폴리프로필렌 튜브 내에서 1-3 x 107 골수종 세포와 혼합시키고, 세포를 무-혈청 IMDM으로 1 회 세척하였다. 비장 세포 대 골수종 세포의 비는 5:1이었다. 튜브를 500 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 상등액을 흡인한 후에, 펠릿을 튜브의 바닥을 태핑 (tapping)함으로써 온화하게 재현탁시켰다. 그 후, 튜브를 37℃ 물의 비이커 내에 배치하였다. 모든 후속 융합 단계는 이 비이커 내에서 수행되었다.
그 다음에, 튜브를 부드럽게 흔들어 주면서 37℃로 예열된 1 ml의 폴리에틸렌 글리콜 1500 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 약 1 분의 기간에 걸쳐서 각각의 세포 펠릿에 서서히 첨가하였다. 세포를 약 1 분 동안 PEG 내에서 배양하고, 이어서 각각의 펠릿에 30 초의 기간에 걸쳐서 1 ml의 무-혈청 IMDM을 적가한 다음, 각각의 펠릿에 다음 1 분에 걸쳐서 9 ml의 무-혈청 IMDM을 첨가하였다. 두 개의 튜브를 모두 실온에서 10 분 동안, 500 x g으로 원심분리시키고, 상등액을 흡인하였다. 세포 펠릿을 100 ml의 여과된 완전 하이브리도마 생산 배지 (10% FBS (SeraCare, Millford, MA), 0.2 mM의 L-글루타민, 1x 비-필수 아미노산 용액, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.01% pen-strep (Invitrogen) 및 1X HT 보충제 (Invitrogen)와 혼합된 500 ml IMDM (Cellgro)) 내에 재현탁시켰다.
각각 100 ml 세포 현탁액을 10 개의 96-웰 편평-바닥 미량역가 플레이트 내에 약 100 ㎕/웰의 용적으로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃., 7% CO2의 배양기 내에 유지시켰다. 융합-후 제2일에, 융합된 세포에 웰당 100 ㎕로 IMDM 중의 5.7 μM 아자세린을 첨가함으로써 세포를 선택하였다. 상등액은 일차 스크리닝을 위해서 일반적으로 융합-후 제10-14일에 클론을 함유하는 웰로부터 배출시켰다. 융합 효율은 75-99%였다 (960 개의 가능한 웰중에서 720-950 개가 스크리닝된 클론을 발생시켰다).
일차 스크린은 인간 CXCR5에 결합하는 항체를 검출하도록 디자인된 방사선 면역측정법 (RIA)일 수 있다. RIA를 수행하기 위해서, PBS 중의 친화성-정제된 염소 항-마우스 IgG (Fc 단편-특이적) (Cappell, Cochranville, PA)를 96-웰 PVC 미량역가 플레이트에 첨가하고 (50　㎕/웰), 4℃에서 밤새 배양하였다. 염소 항-마우스 IgG를 플레이트로부터 제거하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 100 ㎕/웰의 5% FCS/PBS로 차단시켰다. 차단 용액을 제거한 후에, 순수한 하이브리도마 배양 상등액을 웰에 첨가하고 (50　㎕/웰), 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈-20으로 3 회 세척하였다. 다음으로, PBS/5% FCS 중의 50 ㎕ 125I-CXCR5 (약 20,000 cpm)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 웰을 PBS/0.05% 트윈-20으로 3 회 세척하였다. 세척 완충액을 모두 털어버린 후에, 플레이트를 절단하여 웰을 분리시키고, 감마 계수기로 분석하였다. 배양 상등액 대신에 5% FCS/PBS가 첨가된 웰은 배경 웰로 작용하였다.
정제된 CXCR5를 실질적으로 볼턴-헌터 시약 (Bolton-Hunter reagent; New England Nuclear, Boston, MA)의 공급자에 의해서 기술된 바와 같은 볼턴-헌터 방법에 따라 125I로 표지하였다. 125I-CXCR5의 품질은, 표지 과정이 상업적으로 이용할 수 있는 CXCR5 항체 (R & D or Becton Dickinson, Mountain View, CA)에 의해서 인식된 에피토프를 파괴하지 않았음을 확인함으로써 모니터링한다.
상등액 샘플이 RIA에서 배경보다 약 10배 이상 표지된다면, 클론은 일차 스크리닝에 대해서 양성인 것으로 판단된다. 양성 클론을 확보하고, 확장시키고, 동결상태로 저장하였다.
일차 하이브리도마 스크린은 항체가 천연적인 CXCR5 에피토프를 인식하였는지 여부를 결정하도록 디자인되었다. 이것은 형광 표지된 염소 항-마우스 이차 항체와의 결합을 가시화하는, 모노클로날 항체로 염색된 CXCR5+ 세포 상에 표시된 세포 표면 CXCR5의 FACS 분석에 의해서 수행되었다. 상등액 샘플이 FACS 분석에서 배경보다 약 10배 이상 표지되었다면, 클론은 일차 스크리닝에 대해서 양성인 것으로 판단되었다. 또한, 항체에 의해서 결합된 CXCR5 에피토프를 국재화시키기 위해서 CXCR5 항체와의 경쟁 시험을 수행하였다. 양성 클론을 선택하고, 확장시키고, 동결상태로 저장하였다.
실시예 3: 항- CXCR5 mAB 에 대한 세포-기본 결합시험
세포-기본 결합시험을 사용하여 항-CXCR5 mAb를 특정화하였다. 예를 들어, hCXCR5/HEK293과 같은 상술한 CXCR5-발현 형질감염 세포가 사용될 수 있다. 전체-길이 인간 CXCR5 개방 판독 골격을 벡터, 예를 들어, pCDNA3.1neo DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내에 클로닝하였다. CXCR5-암호화 부분은 주형으로서 인간 뇌 및 간 RNA (Ambion, Inc., Austin, TX)를 사용하여 RT-PCR에 의해서 합성하였다. 최종 플라스미드 구조물인 CXCR5/CDNA3.1neo는 전체-길이 CXCR5 단백질을 발현하였다. CXCR5를 발현하는 안정한 세포주는 표준 및 상업적으로 이용할 수 있는 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 키트를 사용하여 CXCR5/pCDNA3.1neo 플라스미드 구조물을 CHO 또는 HEK293 세포 (ATCC No. CRL-1573)에 형질감염시킴으로써 생성되었다. 형질감염 후에, 세포를 밤새 DMEM 중에서 배양한 다음에, 200 ㎍/ml 네오마이신을 함유하는 배지 내에 재접종하고, 12-14일 동안 배양하였다. 분리된 단일 콜로니를 채취하고, 충분한 클로날 세포가 증폭될 때까지 별도의 웰에서 성장시켰다. 네오마이신에 대해서 저항성이며, 높은 수준의 CXCR5 단백질을 발현하는 안정한 클론을 폴리클로날 항-CXCR5 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는 통상적으로 생성된 폴리클로날 항체를 사용한 FACS 분석에 의해서 확인하였다.
천연적으로 CXCR5를 발현하는 인간 HS 술탄 (Sultan) 세포 (ATCC No. CRL-1484)를 또한, FACS 분석에 의해 CXCR5 발현에 대해서 확인하였다. HS 술탄 세포는 10% 송아지 태자혈청, 0.2 mM의 글루타민 및 0.1% pen/strep 용액 (100 ㎍/ml 페니실린 및 10 ㎍/ml 스트렙토마이신)을 함유하는 RPMI 1640 내에서 성장시켰다.
세포-기본 항체-결합은 제조자에 의헤서 제공된 프로토콜에 따라 FMAT™ (형광 마크로-공초점 고속 스크리닝 (fluorescence macro-confocal high-throughput screening)) 8100 HTS 또는 8200 세포 검출 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 평가될 수 있다. 천연적으로 CXCR5를 발현하거나 CXCR5 발현 구조물에 의해서 안정적으로 형질감염된 세포주를 96-웰 플레이트에 접종한다. 대신으로, 일시적으로 형질감염된 293T 또는 CHO 세포를 96-웰 플레이트에 접종한다. 세포는 웰당 5,000-30,000 세포의 밀도로 접종한다. 20-24 시간 후에, 항-CXCR5 mAb 및 FMAT-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체를 함께 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 밤새 배양한다.
세포-기본 항체-결합은 또한 CXCR5를 발현하는 안정한 HEK293/CXCR5 세포주를 사용하여 FACS에 의해서 평가되었다. 세포를 PBS 중에서 항-CXCR5 mAb와 함께 배양하였다. 3 회 세척한 후에, 세포를 형광성 분자-접합된 이차 항체 (BD Sciences, Palo Alto, CA)와 함께 배양하였다.
결과는 몇 개의 mAb가, 어떤 것이든 재조합 플라스미드 구조물로부터 발현된 CXCR5에 결합하는 것을 나타내었다. 예를 들어, 클론 11D6, 14C9, 19H5, H28, 54G6, G7, 56H6, 79B7 및 16D7뿐만 아니라 후자의 항체의 인간화된 변이체, 16D7, 16D7-HC1-LC3, 16D7-HC1-LC2, 16D7-HC1-LC1 및 16D7-HC2-LC1, 음성 대조군 IL13 항체, CA13, 양성 대조군, MAB190, 2C1 및 RF8B2, IgG1, IgG2a 및 IgG2b에 대한 3 개의 마우스 이소타입 대조군, 및 랫트 IgG2b 이소타입 대조군 (RF8B2에 부합됨)을 CXCR5를 발현하도록 형질감염된 HEK293 세포에 대한 결합에 관해서 시험하였다. 2C1 및 MAB190 양성 대조 항체는 CXCR5 세포에 결합한다. RF8B2는 중간 결합 수준으로 나타났다. 음성 대조 항체는 단지 배경 결합을 나타내었다. CA13을 제외한 모든 항체는 모항체 16D7, 및 79B7와 유사한 결합 프로필 및 적정 역학 (titration kinetics)으로 hCXCR5/HEK293 세포에 결합하였다.
CXCR5/neo 플라스미드를 함유하는, 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포는 상술한 바와 같이 면역형광법으로 염색하고, 형광 현미경검사에 의해서 관찰하였다. 세포-기본 FMAT 및 FACS 분석으로 mAb는 실제로, 재조합 플라스미드 구조물로부터, 또는 배양 세포 내에서 천연적인 단백질로 발현된 CXCR5에 결합하는 것을 확인한다. 양성 결합 시그날은 배경 결합 및 다른 음성 하이브리도마 클론보다 상당히 더 큰 FMAT 시그날 판독치를 기준으로 하여 결정된다 (p > 0.01).
16D7, 14C9, 19H5, H28, 54G6, G7, 56H6 및 79B7과 같은, 생성된 CXCR5 mAb는 EC 영역에 결합하고, 세포 상의 CXCR5에 대한 CXCL13의 결합을 차단한다.
실시예 4: 비아코어 ( BIACORE ) 친화성 분석
인간 및 마우스로부터의 CXCR5의 N-말단 EC 부분 (아미노산 1-59)을 말단 비오틴 태그를 갖도록 합성하고, 펩타이드를 비아코어 칩 상에 고정화시킨 다음 칩 상에서 펩타이드와 항체 상호작용의 반응속도를 결정하는 정방향 형식 (forward format) 비아코어 시험에서 사용하였다. 합성 펩타이드는 약 20 응답 유니트 (response unit; RU)로 비아코어 칩 상에 고정화시켰다. 그 후, mAb를 제조자의 추천 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 따라, 반응속도 측정을 위해서 칩에 노출시켰다.
마우스 항-hCXCR5 mAb 클론인 16D7는 2.16-12 M의 계산된 KD를 가졌으며; 마우스/인간 IgG4 키메릭 16D7 (인간 IgG4 Fc 상에 이식된 16D7 VH 및 VL 부분, 이의 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 임의로 클로닝, 말단의 증폭, 부분의 질량의 확인 및 일부분의 클로닝과 같은 표준 방법을 사용하여 코돈 최적화된다)은 1.41-12 M의 KD를 가졌고; 16D7의 다양한 인간화된 변이체 (여기에서, 변이체의 구조 및 이의 중쇄 및 경쇄의 유도는 특정의 중쇄에 대해서는 용어 "HC_"로, IgG4 골격 상에 이식된 특정의 경쇄에 대해서는 "LC_"로 표시되며, 여기에서 쇄의 조성은 이하에 나타낸다)의 경우에 16D7-HC1-LC1은 3.11-12 M의 KD를 가졌고; 16D7-HC1-LC2는 1.41-12 M의 KD를 가졌으며; 16D7-HC2-LC1은 2.40-12 M의 KD를 가졌고; 16D7-HC1-LC3은 1.21-12　M의 KD를 가졌으며; 16D7-HC3-LC4는 4.92-12 M의 KD를 가졌고; 16D7-HC3-LC5는 1.84-10　M의 KD를 가졌으며; 16D7-HC1-LC6은 9.17-11 M의 KD를 가졌다.
인간 IgG4 불변 부분 영역을 가지며, 힌지 부분에서 두 개의 아미노산 치환을 함유하는 인간화 및 키메릭 16D7, 16D7 인간화된 변이체의 한 형태로 S241P 및 L248E 치환 (공지된 방법 및 시약을 실시하여 도입된 치환, 카바트 넘버링 사용)을 보유하는 16D7-HC1-LC3을 전-고정화된 마우스 항-인간 IgG Fc 항체에 의해서 비아코어 칩 상에 포착시킨 다음에, 칩 상의 mAb와 비-태깅된 인간 CXCR5 N-말단 펩타이드 (아미노산 1-59) 상호작용의 반응속도를 결정하는 역방향 시험형식 비아코어 시험에서 사용하였다. 인간 IgG4 불변 부분 영역을 가지며, 힌지 부분에서 두 개의 아미노산 치환을 함유하는 인간화 및 키메릭 16D7에 대한 KD는 1.13 ± 0.08-11 M인 것으로 결정되었다. 분석물로서, 칩 표면상에 고정화된 비오티닐화 인간 펩타이드, 및 SAR113244를 사용한 정방향 시험에 의해서 결정된 KD 값은 역방향 시험을 사용하여 수득한 값과 일치하였다.
실시예 5: 항- CXCR5 mAb 결합 활성의 웨스턴 블럿 분석
웨스턴 블럿은 변성 조건 하에서 CXCR5에 대한 항-CXCR5 mAb 결합 활성뿐만 아니라 인간 세포주에서 CXCR5 및 다른 CXCR5-관련된 단백질의 발현 수준을 평가하기 위해서 수행되었다. 단백질 샘플은 제조자의 지침에 따라 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약 키트 (Pierce, Rockland, IL, Cat # 78501)를 사용하여 안정하게 형질감염된 세포로부터 제조하였으며, 등용적의 2 x 단백질 샘플 부하 완충액을 첨가한 후에 70oC에서 10 분 동안 가열하였다. 모든 샘플은 4-12% 구배 SDS-PAGE 겔 내에서 전기영동하여 분리시켰다. 단백질을 겔로부터 PVDF 막에 전이시키고, 항-CXCR5 mAb를 일차 검출 항체로서 웨스턴 블럿 막에 적용하였다. 알렉사 (Alexa)　680-접합된 이차 항체가 검출을 위해서 사용되었으며, 막은 오딧세이 적외선 영상화 시스템 (Odyssey Infrared Imaging system; Li-cor, Lincoln, Nebraska)을 사용하거나, 전기화학발광 (ECL)을 사용하여 스캐닝하였다. 인간 CXCR5에 대한 양성 대조 항체를 본 명세서에 교시된 바와 같이 생성시켰다.
실시예 6: CXCR5 내재화를 모니터링하기 위한 FACS 시험
연막 (buffy coat) 세포는 건강한 지원자로부터 수득하였다 (Gulf Coast Blood Center, Houston, TX). 인간 말초 단핵세포 (PBMC)는 표준 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 구배 방법에 의해서 분리시킨다. PBMC를 96-웰 플레이트 내에서 4℃로 배양한다 (0.5 x 106 세포/웰). 각각의 웰은 모노클로날 항체 (10　㎍/ml)의 존재/부재 하에서 10% FBS가 보충된 0.2 ml의 RPMI 1640을 함유한다. 30 분 후에, 배지를 항생제가 없고 10% FBS가 보충된 신선한 냉 RPMI 1640으로 대체한다. 세포를 5% CO2를 함유하는 37℃의 가습 조직 배양 챔버로 전이시켰다. 모노클로날 항체-처리된 세포는 세포를 37℃로 옮긴 직후, 2 시간 후, 또는 24 시간 후에 수확한다. 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 1% BSA를 함유하는 냉 PBS (PBSB) 중에서 30 분 동안 배양한다. 그 후, 세포를 PE-접합된 항-인간 CXCR5 (BD Biosciences)로 염색한다. 30 분 후에, 세포를 PBSB로 3 회 세척하고, 밤새 1% 파라포름알데히드 용액 중에 고정시킨다. 다음 날, CXCR5의 존재는 BD FACSCalibur™ 시스템 유동 세포분석기 (BD Biosciences, San Jose, CA)로 분석한다.
실시예 7: FLIPR 시험
세포내 칼슘의 변화는 9000 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 배양함으로써 측정되었다. 세포는 인간 CXCR5로 안정하게 형질감염된 RBL-2H3 세포주였다. 그 후, 세포를 세척한 다음에, 2.5　mM 프로베네시드를 함유하는 완충액 중의 2 mM fluo-4/AM (Molecular Probes)으로 부하시켰다. 세포를 CXCR5 mAb에 노출시킨 다음에 시험 완충액으로 세척하였다. 세포를 10 nM CXCL13 (R　& D)에 노출시켰다. 세포내 Ca+2의 변화는 384-B FLIPR 장치 (Molecular Devices)를 사용하여 기록하였다. 상업적으로 이용할 수 있는 항-인간 CXCR5 mAb, 및 마우스 IgG1 및 IgG2b가 대조군으로 사용되었다.
이하에서 논의하는 바와 같이, 키메릭 16D7 (hIgG4 키메라), 16D7-HC1-LC1, 16D7-HC1-LC2, 16D7-HC2-LC1, 16D7-HC1-LC3, 16D7-HC3-LC4, 16D7-HC3-LC5 및 16D7-HC1-LC6과 같은 mAb 16D7의 몇 가지 인간화된 변형체가 구성되었고, 이들은 칼슘 유입에 의해서 입증되는 바와 같은 생물학적 활성에 대해서 시험하였다.
음성 대조군 CA13과는 별도로 인간화된 항체는 CXCR5를 안정적으로 발현하는 형질감염 세포 상에서의 모 16D7 항체의 경우와 동등한 시그날 중화 활성을 나타내었다.
실시예 8: 화학주성 시험
CXCR5+ HS 술탄 세포 (ATCC CRL1484)를 100 nM CXCL13 (R & D) 또는 CTX 완충액 (페놀 레드가 없고, 1% FBS, 0.5% BSA 및 1　nM Na 피루베이트를 함유하는 RPMI)의 존재 하에서 0.5　x　106　세포/웰로 트랜스웰 (transwell) 플레이트 (Millipore)의 상부 챔버에 첨가하고, 하부 챔버로 이동하는 세포를 산정하였다. 두 개의 챔버를 조립하고, 2 시간 동안 배양하였다. 비색 시약 (colorimetric reagent) (Promega)을 첨가하고 OD490에서 판독한 후에 하부 챔버 내의 세포를 계수하였다.
CXCR5 특이적 이동은 이동한 세포의 총 수와 자발적으로 이동한 세포의 수 사이의 차이로 결정되었다. 항-CXCR5를 시험하는 경우에, 세포는 상부 챔버에 첨가하기 전에 항체와 함께 30분 동안 배양한다. 항체 억제의 정도는 항체의 부재 하에서의 이동량에 대한 항체의 존재 하에서의 특이적 이동의 비이다. 이 비에 100%를 곱하여 억제율 %를 제공할 수 있다.
실시예 7의 항체는 또한, 화학주성을 중화시키는 능력에 관해서 모 16D7 항체와 비교하였다. 음성 대조 mAb CA13을 제외한 모든 인간화된 항체는 16D7 및 79B7, 14C9, 19H5, H28, 54G6, G7, 56H6의 경우와 동등한 프로필로 화학주성을 중화시켰다. R&D MAB190은 중간 활성을 가졌으며, 반면에 H28 및 애브노바 (Abnova) 항체 2C1은 리간드-유도된 세포 이동을 완전히 중화시키지 않았다.
실시예 9: 일차 인간 B 세포 반응성 시험
인간 PBMC는 애컵신 칼럼 (Accuspin columns; Sigma)을 사용하여 전체 혈액으로부터 분리시켰다. 그 후, PBMC를 BD 염색 완충액 (Becton Dickinson) 내에 2000만 세포/ml로 재현탁시켰다. 1 mg의 마우스 항-인간 CXCR5 모노클로날 항체를 50 ml PBMC에 첨가하고, 4oC에서 20 분 동안 결합하도록 하였다. 세포를 BD 염색 완충액으로 2 회 세척하였다. 50 ml의 이차 항체인 1/100 희석된 염소-항-마우스 IgG-PE F( ab' ) (Beckman Coulter)를 PBMC-항체 칵테일에 첨가하고, 4oC에서 20 분 동안 결합하도록 하였다. 세포를 BD 염색 완충액으로 3 회 세척하였다. 1/50 희석도로 마우스 항-인간 CD20-FITC (BD) 및 CD4-APC (BD)를 함유하는 칵테일을 각각 세포에 첨가한 다음에, 이것을 4oC에서 20 분 동안 배양하여 B/T 세포 특이성을 평가하였다. 세포를 BD 염색 완충액으로 3 회 세척하고, 250 ml의 BD 염색 완충액에 재현탁시키고, FAC스타 플러스 (FACStar Plus) 상에서 FACS 분석에 적용하였다. 마우스 항-인간 CXCR5 항체 (R&D; mAb190)가 양성 대조군으로 사용된다. 적정 곡선은 인간화된 항체에 대해서 생성되었으며, 평균 형광강도 (MFI)를 농도에 대비하여 도시하였다.
실시예 7의 인간화된 항체를 인간 PMBC에 대한 결합에 관하여 시험하였다.
음성 대조군 CA13를 제외한 항체는 결합하며, 인간 B 세포 상에서 동일한 적정 프로필을 갖는다. 음성 대조군 CA13은 단지 배경 결합을 나타내었다. BD 클론 RF8B2는 인간 PBMC에 불충분하게 결합한다.
실시예 10: 시노몰구스 B 세포 반응성 시험
시노몰구스 (cyno) 원숭이 전체 혈액은 바이오리클라메이션, 인코포레이티드 (Bioreclamation, Inc., Hicksville, NY)으로부터 수득하였다. 혈액은 원심분리-후 BD 세포 제제 튜브 (BD Cell Preparation Tubes; CPT) 내에서 수송되었다. 혈장층 내에 함유된 cyno PBMC를 CPT 튜브로부터 50　ml 튜브로 분리시키고, 구배 겔층은 동요하지 않게 두었다. 튜브를 5 ml PBS로 세척하여 모든 세포를 완전히 추출하고, 세척액을 새로운 50 ml 튜브에 첨가하였다. cyno PBMC를 4℃에서 10 분 동안 1200　RPM으로 원심분리시켰다. 펠릿을 1 ml BD FACS 염색 완충액 (BD)에 재현탁시켰다. 시험당 100만 세포를 사용하였다. 1 ㎍의 마우스 항-인간 CXCR5 모노클로날 항체 (정제됨)를 50　ml PBMC에 첨가하고, 4oC에서 20 분 동안 결합하도록 두었다. 세포를 BD 염색 완충액으로 2 회 세척하였다. 50 ㎕의 이차 항체인, 1/100으로 희석된 염소 항-마우스 IgG-PE F( ab' ) (Beckman Coulter)를 세포에 첨가하고, 4oC에서 20 분 동안 결합하도록 두었다. 세포를 BD 염색 완충액으로 3 회 세척하였다. 각각 1/20 희석도로 마우스 항-인간 CD20-FITC (BD) 및 CD4-APC (BD)를 함유하는 칵테일을 세포에 첨가하고, B/T 세포 특이성을 평가하기 위해서 4oC에서 20 분 동안 배양하였다. 세포를 BD 염색 완충액으로 3 회 세척하고, 250 ml BD 염색 완충액에 재현탁시키고, FAC스타 플러스 상에서의 FACS 분석에 적용하였다. 상업적인 마우스 항-인간 CXCR5 mAb (R&D; MAB190)가 양성 대조군으로 사용되었다.
인간 CXCR5에 대해 반응성인 본 발명의 마우스 모노클로날 11D6을 IgG 이소타입 대조군과 비교하였다. 16D7의 인간화된 변형체 및 상업적으로 이용할 수 있는 MAB190는 시노몰구스 CXCR5에 대한 반응성에 관해서 시험하였다. 79B7도 또한 시험하였다.
CD20 및 CXCR5에 대해서 양성인 세포는 MAB190 및 11D6에 의해서 발견되었다. 다른 한편으로, 16D7 및 이의 인간화된 변이체뿐만 아니라 G7 및 BD RF8B2 및 애브노바 2C1은 시노몰구스 B 세포에 결합하지 않았다. 14C9, 19H5, H28, 54G6, 56H6 및 79B7은 또한 시노몰구스 B 세포에 결합하였다.
본 발명의 CXCR5 항체를 사용하여 말초 혈액 세포를 시험하였다. B 세포는 CXCR5를 발현하였으며, 적어도 하나의 실험에서 약 10%의 말초 T 세포는 CXCR5를 발현하는 것으로 확인되었다.
실시예 11: 항- CXCR5 mAB 의 서열 결정
마우스 모노클로날 항체는 상업적으로 이용할 수 있는 이소타입화 키트를 사용하여 이소타입화하였다. 16D7 및 다른 항-CXCR5 mAb의 가변 서열을 서열 결정하였다. 총 RNA는, 키트 프로토콜에 따라 퀴아겐 퀴안이지 미니프레프 키트 (Qiagen Qianeasy miniprep kit)를 사용하여 하이브리도마의 약 500만 세포로부터 분리하였다. 제1 스트랜드 cDNA는 인비트로겐 슈퍼스크립트 키트 (Invitrogen Superscript kit; Cat 11904-018)를 사용하여 합성하였으며, 키트 프로토콜은 다음과 같았다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역은 우선, 문헌 [Wang et al. J Immunol Methods. 233:167-77, 2000]에 기술된 방법을 기본으로 다음의 변성 PCR 프라이머 및 Taq 폴리머라제 (Roche)를 사용하여 증폭시켰다.
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여기에서, R은 A 또는 G이며; N은 A, G, T 또는 C이고; M은 A 또는 C이며; W는 A 또는 T이고; S는 G 또는 C이며; Y는 C 또는 T이다.
PCR 생성물을 인비트로겐 TOPO TA 클로닝® 키트 (Cat #: 45-0641)를 사용하여 pCR4-TOPO® 내로 클로닝하고, T3 및 T7 프라이머를 사용하여 서열 결정하였다. 그 후, 서열을 진뱅크 데이터 베이스에 대해서 블라스트하여 완전한 가변 영역의 클로닝을 위한 리더 서열을 추론하였다. 블라스트 결과를 기초로 하여, 다음의 프라이머 [Chardes et al., FEBS Letters 452:386-394, 1999]가 Pfx 폴리머라제 (Invitrogen)를 사용한 PCR 증폭의 제2 라운드를 위해서 선택되었다.
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PCR 생성물을, 인비트로겐 제로 블런트 (Zero Blunt® TOPO® PCR 클로닝 키트 (Cat 45-0245)를 사용하여 pCR-Blunt　II®-TOPO® 내에 클로닝하고, T7 프라이머를 사용하여 서열 결정하였다.
일단 경쇄 및 중쇄가 서열 결정되면, 예를 들어, 인간 숙주 세포 내에서의 발현을 최적화하기 위해서 핵산을 재암호화할 수 있다.
실시예 12: 형질감염체
NS0-eu 세포를 1 x 106 세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 세포를 지수 성장기에서 유지시키고, 배지는 형질감염 전날 교환한다. 형질감염일에 40 x 106 세포를 세척한다. 그 후, 10　㎍의 경쇄 DNA와 같은 선형 핵산, 및 10 ㎍의, 예를 들어, 선형 중쇄 DNA를 세포 현탁액에 첨가하고 (총 DNA 용적은 50 ㎕ 미만이어야 한다), 배양물을 얼음 위에서 15 분 동안 배양한다. DNA 및 세포 혼합물을 냉각된 큐벳 (0.4 cm)에 옮기고, 전기 펄스 (750 V 및 25 μF)를 적용한다. 큐벳을 전기 펄스를 가한 직후에 얼음 위에 놓고, 얼음 위에서 10-15 분 동안 유지시킨다. 세포를 수집하고, 플레이팅한다. 세포를 5% CO2 배양기 내에서 12-16일 동안, 또는 콜로니가 나타날 때까지 배양한다. 세포 배양약 중에서 성장한 세포 콜로니 또는 세포의 상등액을 ELISA에 의해서 시험하고, 양성 형질감염체를 새로운 배지 내에 클로닝한다. 양성 형질감염체를 더 스크리닝하기 위해서, 적정 ELISA 또는 비아코어 시험을 수행한다. 확장된 형질감염체를 진탕 플라스크 내에 유지시키고, 항체 또는 이의 유도체를 상등액으로부터 수집한다.
실시예 13: 생체내 시험
인간 RA에 대한 잘 확립된 모델인 콜라겐-유도된 관절염 (CIA)을 사용하여 TNFα에 대한 항체 [Williams et al., PNAS 1992, 89:9784-9788]뿐만 아니라 CTLA-4와 TNFα의 융합 단백질 [Webb et al., Eur J Immunol. 1996, 26:2320-2328; 및 Wooley et al., J Immunol. 1993, 151:6602-6607]의 효능을 입증하였다. 랫트 항-마우스 CXCR5 모노클로날 항체인 클론 1038을, DBA/1J 마우스를 면역시키고, 병아리 콜라겐 타입 II로 추가자극한 CIA의 마우스 모델에서 프로파일링하였다. 질병 중증도 (이것은 팔 팽윤/염증을 측정함으로써 시각적으로 스코어를 매겼다)는 1 주일에 2 회 모니터링하는 한편, 시험 종료시에 수집된 관절을 염증, 파누스 (pannus), 연골 파괴 및 골 침식의 변화에 대해서 평가하였다. 예방적 투약 요법으로 투여하는 경우에, 클론 1038은 이소타입-치료된 CIA 마우스에 비해서 질병 중증도 및 관절 병리학 둘 다를 상당히 감소시켰다 (반복 측정 ANOVA, p<0.05).
생체내 화학주성에서 16D7-HC1-LC3의 효능을 평가하기 위한 급성 마우스 모델이 사용되었다. 간략하면, B 세포, T 세포 및 호중구와 같은 면역세포 상에서 huCXCR5를 선택적으로 발현하는 C57/Bl6 마우스 (8-16 주령)는 CD11a 프로모터를 사용한 전형적 유전자 이식방법에 의해서 생성시켰다. 생체내 화학주성 모델은 호중구-유도된 모델이다. 20 ㎍의 huCXCL13 리간드 (R&D)를 복강내 투여하면, huCXCR5 수용체를 발현하는 마우스 호중구는 huCXCL13 구배에 대한 반응으로 복강내로 이동하였다. huCXCL13의 복강내 투여 후 80 분에 복강 세척액을 사용하여 세포를 회수하고, 형광세포분석을 사용하여 huCXCL13 주입에 대한 반응으로 복강 내로 특이적으로 이동한 복막 관류액의 2 ml 샘플 내의 huCXCR5-발현 호중구의 수를 정량하였다. 호중구는 Ly6G, CD19 및 CD11b와 같은 표현형 마커에 의해서 확인되었다. huCXCL13을 주입하기 24 시간 전에 인간화된 항-hCXCR5, 16D7-HC1LC3을 두 가지 상이한 용량 (7.5　㎍ 또는 15 ㎍)으로 피하 투여하는 것은 이소타입-처리된 대조군과 비교할 때, huCXCL13에 대한 반응으로 huCXCR5-발현 호중구가 복강으로 이동하는 것을 감소시키는 효과를 나타내었으며, 여기에서 두 개의 CXCR5 항체 처리된 샘플은 호중구의 이소타입 음성 대조 수준에 비해 본질적으로 호중구의 통계학적으로 상이한 수준을 나타내지 않았다. 1.5　㎍에서 인간화된 CXCR5 항체는 시험한 더 고용량의 CXCR5 항체에 비해, 낮은 수준의 호중구 이동 억제를 나타내었다.
실시예 14: 재표면화
쥐 16D7 클론의 재표면화는 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:969, 및 미국 특허 제5,639,641호]에 기술된 단계에 따라 수행되었다.
16D7의 VL 및 VH 서열은 단백질 데이터 뱅크 [Nucleic Acids Research, 28:235-242 (2000)]에 대해서 블라스트하였으며 (누구라도 생물학적 마크로분자의 3D 좌표를 함유하는 인터넷 상의 단백질 데이터 뱅크 (PDB)에 접근할 수 있다), 16D7의 경우와 가장 유사한 10 개의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 검색하였다. 서열을 확인하기 위해서 PDB 확인 암호를 사용한다.
가변 경쇄에 가장 유사한 10 개의 동족체는 1MJU [J Mol Biol 332:423-435, 2003], 1AE6 [Proteins 29:161-171, 1997], 1QYG [Pozharski et al., "Carving a Binding Site: Structural Study of an Anti-Cocaine Antibody" in "Complex with Three Cocaine Analogs"), 1UZG [J Virol 79:1223, 2005], 1UB5 [Beuscher et al., "Structure and Dynamics of Blue Fluorescent Antibody 19G2 at Blue and Violet Fluorescent Temperatures"), 1RUR [Proc Natl Acad Sci USA 110:2247-2252, 2004], 1FPT [Nat Struct Biol 2:232-243, 1995], 1QFU [Nat Struct Biol 6:530-534, 1999], 1NAK [Virology 315:159-173 , 2003] 및 1CGS [J Mol Biol 236:247-274, 1994] (불필요한 서열은 제거하였다)였으며, 가변 중쇄에 가장 유사한 10 개의 동족체는 1FNS [Nat Struct Biol 7:881-884, 2000], 1OAK [Nat Struct Biol 5:189-194, 1998], 1VFB [Proc Natl Acad Sci 91:1089-1093, 1994], 1CIC [Nature 348:254-257, 1990], 1GIG [Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50:768-777, 1994], 1T4K [J Mol Biol 343:1269-1280, 2004], 1A7P [Marks et al.], 1FE8 [J Biol Chem 276:9985-9991, 2001], 1DL7 [J Exp Med 191:2101-2112, 2000] 및 1YY8 [Cancer Cell 7:301-311, 2005]이었다. 경쇄 및 중쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 각각 1MJU 및 1FNS였다. 이들 두 개의 서열을 사용하여 가변 영역의 상동성 모델을 구성하였으며, 이어서 이것을 MOE 슈트 (Chemical Computing Group, Quebec, CA)에서 구현된 것과 같은 CHARMM22 힘의 장 [J Comput Chem (1983) 4, 187; J Comput Chem (1986) 7, 591]에 의해 원자 배좌 위치의 접합체 구배를 최소화시킴으로써 에너지-최소화시켰다. 모델을 사용하여 CDR 부분 및 골격구조 잔기의 위치를 정하였다. 각각의 항체 가변 영역에 대한 10 개의 가장 유사한 동족체의 각각의 가변 영역 잔기의 용매 접근성은 사이티직 프로토콜 (Scitegic protocol) (Hill & Lewicki (2006) Statistics: Methods and Applications, Statsoft, Tulsa, OK)에서 제공된 바와 같은 엑셀 스프레드시트 (Excel spreadsheet)에서 계산하고, 평균을 구하였다. 30%보다 큰 평균 접근성을 갖는 위치를 표면 잔기로 간주하였다. 25% 내지 30%의 평균 접근성을 갖는 위치는 CDR 루프에 대한 근접성에 따라 더 검토되었다.
쥐 16D7 가변 영역의 표면 위치를 인간 항체 서열에서의 상응하는 위치와 비교하였다. 25%보다 큰 접근성 표면적을 나타내며, 용매 노출된 잔기를 측면에 둔 몇 개의 잔기와 함께, 단지 30%보다 큰 접근성 표면적을 나타낸 잔기들 만이 탐색을 위해서 유지되었다. 모든 면역글로불린 서열 내의 약간의 보존된 잔기를 포함시켜 탐색의 수렴도를 개선시켰다. 단지 배선 서열만이 적중 (hits)의 분석을 위해서 유지되었다. CDR의 5.0Å 이내에 있는 위치에 대해서 특별히 고려하여, 가장 동일한 표면 잔기를 갖는 인간 항체 가변 영역 표면이 쥐 16D7 항체 가변 영역 표면 잔기를 대체시키도록 선택되었다.
서열 중의 어떤 것도 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB, Immune Epitope Database and Analysis Resource web site; PLoS Biol. 2005;3(3):e91)에 열거된 어떤 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 함유하지 않는다.
쥐 16D7 가변 영역의 원래 서열은 다음과 같다:
경쇄 (CDR은 밑줄로 표시한다):
Figure 112014089213800-pat00009
중쇄 (CDR은 밑줄로 표시한다)
Figure 112014089213800-pat00010
경쇄의 탐색을 위해서 유지된 표면 잔기의 셋트는 D1, V3, A7, P9, P15, R16, E17, S18, P45, G46, Q47, D65, R79, R82, E86, K108, E110 및 K112를 포함하였다.
경쇄에 대한 조회는 상기 정의된 표면 잔기의 셋트, 및 BLAST 프로토콜의 수렴성을 위해서 포함된 보존된 아미노산 C23, W40, Q43, Y91, C93, F103, G104, G106 및 T107을 함유한다. 모든 다른 아미노산은 20 개의 천연적인 아미노산 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. BLAST 탐색은 IMGT (International Immunogenetics Information Systems website, Molec Immunol, 2004, 40:647-659)에 의해서 컴파일된 인간 배선 항체 서열 데이터베이스에 대해서 수행되었다. 최상의 스코어링 매치 (scoring match)는 경쇄 LC4가 유도된 X72482 (단백질_id=CAA51150.1)인 것으로 확인되었다. LC5 및 LC6은 VL4 (VL은 가변 경쇄를 의미한다)의 두 개의 변이체이며, 이것은 경쇄 내의 잠재적인 문제가 있는 다음의 잔기를 다루도록 제안하였다: Leu로 돌연변이될 1 개의 노출된 메티오닌 (M51) (LC5 & LC6), 및 아스파라긴 N53이 세린 잔기로 변화되는 1 개의 잠재적 탈아미드화 부위 (LC6). 전체적으로, 모 쥐 16D7 클론과 비교할 때 4 내지 6 개의 돌연변이를 함유하는 3 개의 변형체가 가변 경쇄에 대해서 제안된다. 상응하는 돌연변이는 이하의 표 1에 제시한다. 순차적 및 카바트 넘버링이 제시된다.
가변 중쇄에 대해서 유지된 표면 잔기의 세트는 Q1, Q3, K5, S7, P9, L11, S15, Q16, S20, P41, G42, K43, S61, A62, K64, S65, R70, S74, Q75, Q86, T87, D88, Q103, L106, A111, A112 및 K113 (순차적 넘버링)을 포함하였다. 탐색의 수렴성을 위한 BLAST 조회에 포함된 불변 아미노산은 다음과 같았다: C22, W36, I37, Q39, D89, Y93, C95, W101, G102, G104 및 T105. BLAST 탐색은 IMGT에 의해서 컴파일된 인간 배선 항체 서열 데이터베이스에 대해서 수행되었다. 중쇄에 대한 한가지 변형체 (HC3)가 유지되었다. 표면 잔기의 세트에 대해서 최상의 스코어링 매치를 나타낸 AF062266 (단백질_id=AAC18304.1) 및 AY393082 (단백질_id=AAS86018.1)의 두 개의 VH 영역은 동등한 유사성 스코어를 나타내며, 동일한 표면 잔기를 표시한다. 따라서, 단지 10 개의 돌연변이를 갖는 중쇄에 대한 단일 서열만이 유지되었다. 상이한 표면 잔기를 갖는 더 낮은 스코어의 서열은 이들이 감소된 잠재적 용해도를 시사하는 더 극성인 잔기를 갖기 때문에 유지되지 않았다.
Figure 112014089213800-pat00011
경쇄에 대해서 3 개의 변형체가 제안된다 (LC4, LC5 및 LC6). 가변 쇄의 재표면화를 통해서 도입된 각각의 돌연변이는 소문자로 나타내고 밑줄을 쳤으며, CDR은 밑줄을 쳤다. 가변 영역의 재표면화된 서열은 이하에 열거하며, 불변 영역 (IgG4)은 포함되지 않는다.
Figure 112014089213800-pat00012
중쇄 (VH3) (VH는 가변 중쇄를 의미한다)에 대해서는 한가지 변형체가 제안되었다. 가변 쇄의 재표면화를 통해서 도입된 돌연변이는 소문자로 나타내고 밑줄을 쳤으며, CDR은 밑줄을 쳤다. 불변 영역 서열은 포함되지 않는다.
Figure 112014089213800-pat00013
뉴클레오타이드 서열을 OE-PCR에 의해서 생성시키고, 에피좀성 발현 벡터 pXL4214 [Durocher et al., NAR, 2002, 30(2), E9]의 NheI/HindIII 부위에 클로닝하였다. 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해서 최적화된 코돈이다. VL은 IGKC (AAH93097)에 융합시켰다. VH는 C-말단 Lys (IGHG4△K)를 결여한 IGHG4 (AAH25985)에 융합시켰다. 서열은 이중 스트랜드 서열 결정에 의해서 증명되었다.
LC4 :
Figure 112014089213800-pat00014
LC5 :
Figure 112014089213800-pat00015
LC6 :
Figure 112014089213800-pat00016
HC3 :
Figure 112014089213800-pat00017

실시예 15: 인간화
16D7의 VL 및 VH 서열을 블라스트하였으며, 가변 경쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 동등한 유사성 스코어를 갖는 1MH5, 1MJJ 및 1MJU이다 [J Mol Biol 332:423-435, 2003]. 1MJU는 1.22Å 해상도까지 도달하는 것으로 측정된 결정 구조의 높은 정밀성으로 인하여 주형으로 유지되었다. 중쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 1FNS [Nat Struct Biol 7:881-884, 2000]인 것으로 확인되었다. 구조물 1MJU 및 1FNS를 사용하여 가변 영역의 상동성 모델을 구성하였으며, 이어서 이것을 표준 절차를 사용하여 에너지 최소화시켰다. 이어서, 16D7의 3D 상동성 모델의 분자 동적 (MD) 계산은 제네랄라이즈드 본 임플리시트 용매 (Generalized Born implicit solvent) 중에서 1.7 나노세컨드 동안 수행하였다 [참조: Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499].
MD는 298.15°K에서 가우스 분포로부터 속도의 초기화에 의해서 시작하며, 이어서 300 ps의 평형화 기간이 이어진다. MD 중에, 모든 결합은 SHAKE 알고리즘 [참조: Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209]을 사용하여 속박되며, 시간 단계는 1 펨토세컨드 (femtosecond; fs)였으며, 버렛 통합 알고리즘 (Verlet integration algorithm)을 기초로 한 시뮬레이션은 298.15°K에서의 캐노니칼 (canonical) NVT (입자의 수, 용적 및 온도) 앙상블로 실시되었다. 생산 기간 중에, 1,700 스냅샷 (snapshot)을 1 ps마다 1개씩 저장하였다. 쥐 항체의 1,700 개의 형태는 그에 대해서 가장 유연한 잔기를 확인하기 위한 다음의 분석이 수행되는 앙상블을 구성한다. MOE 분자 모델링 환경 (Molecular Operating Environment (MOE), Chemical Computing Group, Quebec, Canada)에서 이용할 수 있는 SVL (Scientific Vector Language)을 사용하여 이하의 분석을 암호화하였다. 우선, 각각의 스냅샷 N을 그 이전의 것인 스냅샷 N-1 상에 최적으로 중첩시켜 MD 모델링 및 계산 중에 나타나는 전반적인 회전 및 및 해독 운동을 조절하였다. 중첩은 두 개의 스냅샷으로부터의 상응하는 원자의 모든 쌍 사이에서 RMSD (Root Mean Square Distance)를 최소화시킴으로써 수득되었다. 단지 항체 골격의 중원자 (heavy atom)만이 중첩시키는데 고려되었다. 동일한 중첩방법을 사용하여 각각의 스냅샷을 메도이드 (medoid) 스냅샷 위에 중첩시켰다. 메도이드 스냅샷은 모든 입체배좌의 평균 좌표 중에서 가장 밀집한 데카르트 좌표 (Cartesian coordinate)를 갖는 항체 입체배좌이다.
항체 잔기 i 각각에 대해서, 입체배좌 j와 메도이드 기준 입체배좌 k의 중원자 사이의 RMSD를 계산하였다. RMSD는 하기 수학식을 갖는다:
Figure 112014089213800-pat00018
(여기에서, dlk는 잔기 j의 중원자 l와 메도이드 기준 입체배좌 k의 이의 대응물 사이의 유클리드 (Euclidean) 간격으로 정의되며, 옹스트롬 (Å)으로 표현된다). 중원자 l의 페어와이즈 회합 (pairwise association)에 대해서는, 아미노산 Asp, Leu, Val, Glu, Arg, Phe 및 Tyr에 대한 측쇄 중원자의 대칭성이 또한 고려되었다. 기준 입체배좌 k는 잔기에 따라 달라지며, 시험한 잔기 i의 모든 입체배좌의 평균 좌표까지의 가장 가까운 유클리드 간격을 갖는 메도이드 입체배좌 k에 상응한다. 그래서, 각각의 잔기 i에 대해서 MD의 과정에서 잔기 i의 좌표의 변동을 반영하는 1,700 RMSD 값의 분포가 수득되었다. 시험한 항체의 모든 잔기의 모든 RMSD 값을 합하여서 모든 RMSD의 전체 분포를 수득하였다. 그 후, 모든 RMSD의 전체 분포를 기준 분포로 사용하였다. 잔기 i가 매우 유연성이 있다면, 통계학적 시험을 수행하여 잔기 i의 관찰된 평균 RMSD, mi가 모든 잔기에 대한 전체 평균 RMSD, mg보다 상당히 더 큰지 여부를 결정하였다. 샘플은 예를 들어, 클론 16D7의 분석의 경우에는 1,700으로 크기 때문에, "관찰된 mi는 전체 mg보다 더 낮다"는 귀무가설 (null-hypothesis) H0을 갖는 원-테일드 (one-tailed) Z-시험 [참조: Dorofeev & Grant, "Statistics for real-life sample surveys. Non-simple-random samples and weighted data" 2006. Cambridge University Press]을 사용하여 다음 수학식에 따라 통계치 Zi을 계산하였다:
Figure 112014089213800-pat00019
(여기에서, mi은 잔기 i의 RMSD 분포로부터 계산된 평균 RMSD이며, mg는 전체 RMSD 분포로부터 계산된 평균 RMSD이고, sdi는 잔기 i의 RMSD 분포로부터 계산된 표준 편차이며, n은 샘플 크기이고, 즉 16D7 클론의 분석을 위해서는 n=1,700이다). 그 후, 계산된 Zi를 표준 정상 분포의 누적확률과 비교하여 대체 가설, 즉 "관찰된 mi은 전체 mg보다 크다"는 가설의 유의성의 99.9% 수준을 산정하였다. 이것은 Zi ≥ 3.08에 해당하였다. 유연성 스코어로 간주될 수 있는 Zi 통계치는 분자량이나 항체 잔기의 중원자의 수와 상관관계가 없다 (16D7 항-CXCR5 모델 MD를 분석하는 경우에, 각각 r2=0.014 및 0.0009).
경쇄에 대한 유연성 잔기의 세트는 다음의 잔기 (순차적 넘버링) D1, T14, P15, R16, E17, Q47, D65, S72 R79, R82, E86, K108, E110 및 K112를 포함하며; 중쇄의 경우에는 다음의 잔기를 포함한다: Q1, V2, Q3, L11, S15, Q16, S61, A62, K64, S65, R70, D72, Q75, K81, M82, N83, Q86, Q103, S110, A111, A112 및 K113. 16D7의 유연성 부분을 임뮤노제네틱스 데이터베이스 웹사이트 (ImMunoGeneTics Database website)의 2005년 9월 버전에서 인간 항체 서열의 상응하는 위치와 비교하였다.
상당히 높은 유연성 스코어를 나타내는 이들 잔기 및 유연성 잔기의 3D 구조를 보존하는 몇 개의 측면 잔기 (flanking residue)가 탐색을 위해서 유지되었다.
CDR의 5.0Å 내에 있는 위치를 특별히 고려하여 가장 동일한 유연성 잔기를 갖는 인간 항체 가변 영역을 선택하여 쥐 16D7 항체 가변 영역 유연성 잔기를 대체시켰다. 생성된 인간화된 서열을, 합리적인 추정이 이루어졌다는 확신을 제공하는 유니프로트케이비 (UniProtKB)/스위스프로트 (SwissProt) 데이터베이스에서 서열 유사성에 대해서 블라스트하였다. 모든 서열은 다수의 인간 항체에 대해서 높은 정도의 유사성을 나타내었다. 또한, 어떤 서열도 IEDB 데이터베이스에 열거된 어떤 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프도 함유하지 않는다.
경쇄 (LC1, LC2 및 LC3)에 대한 IEDB에서의 최상의 서열 매치는 CDR2를 포함하지만, IEDB 데이터베이스 내에서의 BLAST 탐색으로부터 수득한 56% 서열 동일성으로 예시되는 것과 같은 상당한 잔기 차이를 갖는 KPGQPPRLLIYDASNRATGIPA (서열번호 25)였다.
중쇄 (HC1 및 HC2)에 대한 IEDB에서의 최상의 매치는 CDR3의 시작점 앞에 위치하는 TDDTAMYYCARI (서열번호 26)였다. 이 서열은 펩타이드 SEDSALYYCARD (서열번호 27)와 61% 서열 동일성을 나타내어 이것이 잠재적 인간 T 세포 에피토프일 것 같지는 않게 만든다 [J Exp Med (1995) 181, 1540].
쥐 16D7 가변 영역의 원래의 서열은 다음과 같다:
경쇄 (CDR은 밑줄을 쳤다):
Figure 112014089213800-pat00020
중쇄 (CDR은 밑줄을 쳤다):
Figure 112014089213800-pat00021
중쇄에 대한 두 개의 변형체 (HC1 및 HC2) 및 경쇄에 대한 3 개의 변형체 (LC1, LC2 및 LC3)가 제시되었다. 중쇄의 두 가지 변형체는 모두 각각, AF262096/AAF79987 및 AB063657/BAC01285.1로부터 유도된다. 두 개의 서열은 동등한 유사성 스코어를 나타내지만, 돌연변이 잔기의 세트는 비교적 상이한 것으로 보이고 상이한 물리-화학적 특성을 나타내기 때문에 유지되었다. LC1 서열은 BAC01682/AB064054.1로부터 유도되며, 여기에는 돌연변이될 단지 두 개의 잔기가 있다. LC2 및 LC3은 경쇄 내의 잠재적인 문제가 있는 다음의 잔기를 다루도록 제안된 LC1의 변형체이다: Leu (변형체 3 및 4)로 돌연변이된 노출된 메티오닌 (M51) 및 아스파라긴 N53이 세린 잔기로 변화되는 1 개의 잠재적 탈아미드화 부위 (변형체 4). 모든 조합이 유지되지는 않았지만, 4 개는 다루어질 주요 위치의 대부분을 포함한다. 카바트 넘버링이 사용된다.
Figure 112014089213800-pat00022
가변 쇄의 인간화를 통해서 도입된 돌연변이는 소문자로 나타내고 밑줄을 쳤으며, CDR은 밑줄을 쳤다. 불변 영역은 포함되지 않는다.
Figure 112014089213800-pat00023
키메릭 구조물의 서열은 다음과 같다:
키메릭 LC 서열
Figure 112014089213800-pat00024
키메릭 HC 서열
Figure 112014089213800-pat00025
인간화된 VL 서열
LC1 :
Figure 112014089213800-pat00026
LC2 :
Figure 112014089213800-pat00027
LC3 :
Figure 112014089213800-pat00028
인간화된 VH 서열
HC1 :
Figure 112014089213800-pat00029
HC2 :
Figure 112014089213800-pat00030

실시예 16: 분자 동적 궤도를 기초로 한 인간화
16D7의 VL 및 VH 서열은 단백질 데이터 베이스 (PDB) [Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28 :235-242]에서 블라스트하였으며, 가변 경쇄에 대한 가장 유사한 동족체는 동등한 유사성 스코어를 갖는 1MH5, 1MJJ 및 1MJU이다 [J Mol Biol 332:423-435, 2003]. 1MJU는 1.22Å 해상도로 측정된 결정 구조의 높은 정밀성으로 인하여 주형으로 유지되었다. 중쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 1FNS [Nat Struct Biol 7:881-884, 2000]인 것으로 확인되었다. 구조물 1MJU 및 1FNS를 사용하여 가변 영역의 상동성 모델을 구성하였으며, 이어서 이것을 표준 절차를 사용하여 에너지 최소화시켰다.
이어서, 16D7의 3D 상동성 모델의 분자 동적 (MD) 시뮬레이션은 제네랄라이즈드 본 임플리시트 용매 중에서 1.1 나노세컨드 (ns) 동안 수행하였다 [참조: Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499]. MD 시뮬레이션은 500 K에서 가우스 분포로부터 속도의 초기화에 의해서 시작하며, 이어서 200 피코세컨드 (ps)의 평형화 기간이 이어진다. MD 시뮬레이션 중에, 모든 결합은 SHAKE 알고리즘 [참조: Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209]을 사용하여 속박되며, 시간 단계는 1 펨토세컨드 (fs)였으며, 버렛 통합 알고리즘을 기초로 한 시뮬레이션은 500 K의 온도에서의 캐노니칼 NVT (입자의 수, 용적 및 온도) 앙상블로 실시되었다. 이 시뮬레이션은 골격구조 원자에 적용된 조화 속박 (harmonic constraint)에 의해서 이루어진다. 이러한 일차 시뮬레이션의 마지막 1 ns 중에 매 100 ps마다 1 개씩, 10 개의 다양한 입체배좌가 추출된다.
그 후, 이들 10 개의 다양한 입체배좌를 10 개의 다양한 출발점으로 사용하여 제네랄라이즈드 본 임플리시트 용매 중에서 2.3 ns 동안 300 K 온도에서 골격구조에 대한 속박이 없이 10 개의 분자 동적 시뮬레이션을 실시한다. 각각의 MD 시뮬레이션은 298.15 K에서 가우스 분포로부터 속도의 초기화에 의해서 시작하며, 이어서 300 ps의 평형화 기간이 이어진다. 모든 결합은 SHAKE 알고리즘 [참조: Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209]을 사용하여 속박되며, 시간 단계는 1 fs였으며, 버렛 통합 알고리즘을 기초로 한 시뮬레이션은 298.15 K의 온도에서의 캐노니칼 NVT (입자의 수, 용적 및 온도) 앙상블로 실시되었다. 생산 기간 중에, 2,000 스냅샷을 1 ps마다 1개씩 저장하였다. MOE 분자 모델링 환경 (Molecular Operating Environment (MOE), Chemical Computing Group, Quebec, Canada)에서 이용할 수 있는 SVL (Scientific Vector Language)을 사용하여 이하의 처리-후 프로토콜을 암호화하였다.
우선, 각각의 스냅샷 N을 그 이전의 것인 스냅샷 N-1 상에 최적으로 중첩시켜 MD 모델링 및 계산 중에 나타나는 전반적인 회전 및 및 해독 운동은 버렸다. 중첩은 두 개의 스냅샷으로부터의 상응하는 원자의 모든 쌍 사이에서 RMSD (Root Mean Square Distance)를 최소화시킴으로써 수득되었다. 단지 항체 골격의 중원자만이 중첩시키는데 고려되었다. 동일한 중첩방법을 사용하여 각각의 스냅샷을 메도이드 스냅샷 위에 중첩시켰다. 메도이드 스냅샷은 모든 입체배좌의 평균 좌표 중에서 가장 밀집한 데카르트 좌표를 갖는 항체 입체배좌이다. 10 개의 MD 시뮬레이션의 각각에 대해, 마지막 2,000 개의 입체배좌를 사용하여 아미노산의 메도이드 입체배좌에 관한 원자 위치의 편차를 쥐 항체의 각각의 아미노산에 대하여 정량화한다. 항체 잔기 i 각각에 대해서, 입체배좌 j와 메도이드 기준 입체배좌 k의 중원자 사이의 RMSD를 계산하였다. RMSD는 하기 수학식을 갖는다:
Figure 112014089213800-pat00031
(여기에서, dlk는 잔기 j의 중원자 l과 메도이드 기준 입체배좌 k의 이의 대응물 사이의 유클리드 간격으로 정의되며, 옹스트롬 (Å)으로 표현된다). 중원자 l의 페어와이즈 회합에 대해서는, 아미노산 Asp, Leu, Val, Glu, Arg, Phe 및 Tyr에 대한 측쇄 중원자의 대칭성이 또한 고려되었다. 기준 입체배좌 k는 잔기에 따라 달라지며, 시험한 잔기 i의 모든 입체배좌의 평균 좌표까지의 가장 가까운 유클리드 간격을 갖는 메도이드 입체배좌 k에 상응한다.
인간화 돌연변이는 어떤 인간 항체 배선이 그들의 가장 유연한 아미노산의 관점에서 쥐 항체와 가장 유사한 지를 결정함으로써 발견된다. 이렇게 하기 위하여, 분자 동적 시뮬레이션의 20 ns (10 x 2　ns) 중의 쥐 항체의 60 개의 가장 유연한 아미노산의 운동을 인간 항체 배선의 49 개의 상동성 모델 (이들 각각에 대해서 10 개의 분자 동적 시뮬레이션이 동일한 프로토콜을 사용하여 실시되었다)의 상응하는 아미노산의 운동과 비교한다. 인간 항체 배선의 49 개의 3D 상동성 모델은 7 개의 가장 빈번한 인간 경쇄 (vκ1, vκ2, vκ3, vκ4, vλ1, vλ2, vλ3) 및 7 개의 가장 빈번한 중쇄 (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)를 체계적으로 결합시킴으로써 구성되었다 [Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597].
60 개의 가장 유연한 아미노산은 CDR 및 이의 바로 인접한 부분에 있는 모든 아미노산. 즉 3D 상동성 모델에서 나타나는 바와 같이 CDR 아미노산의 α 탄소까지 5Å 미만의 간격에 있는 α 탄소를 갖는 아미노산을 배제한다.
유연성은, 10 개의 분자 동적 시뮬레이션에 걸쳐서 평균한, 이미 정의된 바와 같은 소정의 아미노산 (i)의 이의 메도이드 입체배좌에 대한 RMSD (Fi)를 동일한 10 개의 분자 동적 시뮬레이션에 걸쳐서 평균한 쥐 항체의 모든 아미노산의 RMSD (Fm)와 비교함으로써 정량화된다. Zi = (Fi - Fm)/Fm으로 정의된 유연성 스코어 Zi가 0.15 이상인 경우에, 아미노산은 잠재적으로 T-세포 수용체와 상호작용하며, 면역반응을 유발하기에 충분히 유연한 것으로 생각된다.
이러한 분자 동적 평균적 유연성 평가 프로토콜을 사용하여, 23 개의 아미노산이 CDR 부분 및 그에 바로 인접한 부분을 제외한 쥐 16D7 항체의 가변 영역에서 유연한 것으로 간주되었다.
경쇄에 대한 유연성 잔기의 세트는 다음의 잔기 (순차적 넘버링) R16, E17, R44, G46, Q47, S48, R79, R82, E84, E86, 및 E110을 포함하며; 중쇄에 대해서는 다음의 잔기를 포함한다: K5, P41, G42, K43, K64, R70, D72, N73, S74, Q75, Q86, 및 Q103.
49 개의 인간 배선 상동성 모델에 대한 쥐 항체의 4차원적 유사성은 독특한 3차원적 큐빅 그리드 (cubic grid)에 의해, 10 개의 분자 동적 시뮬레이션의 모든 피코세컨드 스냅샷을 사용하여 60 개의 유연성 아미노산의 특정 원자의 위치를 샘플링함으로써 정량화된다. 이 그리드는 1Å 해상도를 갖는다. 3차원적 그리드는 445740 개의 점으로 만들어지며, 항체 8FAB를 기초로 한 인간 항체 결정학적 모델의 3차원적 구조를 사용하여 초기화되었다 [Biochem 30:3739-3748, 1991]. 또한, 8FAB 모델을 사용하여 3차원적 그리드에서 샘플링된 항체의 모든 피코세컨드 스냅샷 입체배좌를 배치시킨다. 이를 목적으로, 항체의 분자 동적의 메도이드 입체배좌를 8FAB 모델 상에 중첩시킨다. 이 중첩은 2 개의 모델의 관성 모멘트를 정렬하고, 이어서 두 개의 모델의 α 탄소 사이의 스칼라 간격 (scalar distance)을 최소화시키는 것으로 구성된다. 분자 동적 시뮬레이션의 나머지 모든 입체배좌는 동일한 방법을 사용하여 메도이드 입체배좌 상에 중첩시킨다.
비교되는 항체의 쌍에 대해서 두 가지 유사성 (정전기적 유사성 및 친유성 유사성)을 제공하는 두 가지 타입의 샘플링을 수행한다. 그 후, 이들 두 가지 유사성을 더하여 총 유사성을 수득한다. 정전기적 샘플링은 아미노산 측쇄의 모든 원자를 고려한다. 그리드의 한 점에서의 값 x는 앰버99 (Amber99) 힘의 장 [Cieplak et al.; J. Comp. Chem. 2001, 22　:1048-1057]에 기술된 바와 같이 원자 부분 전하에 의해서 가중된 3차원적 가우스 함수 f(x)를 적용함으로써 수득된다. f(x) 함수는 하기 수학식을 사용하여 3 개의 데카르트 좌표 축에 적용된다:
Figure 112014089213800-pat00032
(여기에서, x 및 u는 각각 그리드 점 및 샘플링된 아미노산 원자의 데카르트 좌표이며, s　= r/1.6 (r = 원자의 공유원자가 반경)이다). 샘플링은 아미노산의 모든 입체배좌에 대해서 반복하며, 수득된 결과는 3차원적 그리드의 모든 점에서 평균한다. 친유성 샘플링은 아미노산 측쇄의 친유성 원자만을 고려한다. 그리드의 한 점에서의 값은 가중이 없이 동일한 가우스 함수 f(x)에 의해서 계산한다. 결과적으로, 비교되는 두 개의 항체의 분자 동적 시뮬레이션으로부터의 피코세컨드 스냅샷 입체배좌의 두 개의 앙상블은 동일한 3 차원적 그리드에 의해서 샘플링된다. 항체 a와 항체 b 사이의 정전기적 유사성 (sim-elec)은 다음의 수학식에 의해서 계산될 수 있다:
Figure 112014089213800-pat00033
친유성 유사성은 전술한 바와 같은 친유성 샘플링에 의해서 생성된 데이터에 적용된 동일한 수학식에 의해서 계산된다.
인간 배선 모델 vλ2-vh4는 쥐 항체 16D7의 60 개의 가장 유연한 아미노산에 관하여 이의 60 개의 가장 유연한 아미노산의 최고의 4차원적 유사성 (총 유사성 = 50%)을 나타낸다. 따라서, 인간 배선 모델 vλ2-vh4를 사용하여 쥐 항체 16D7 유연성 잔기를 대체시켰다. 사전에, 두 개의 서열의 아미노산을 상응하는 3D 상동성 모델의 α 탄소의 최적 중첩에 따라 정렬하였다. 원치 않는 모티프는 상기 단락 41에 전술한 바와 같이, 블라스트 탐색을 사용하여 생성된 인간화된 서열에서 탐색하였다. 또한, 공지의 B-세포 또는 T-세포 에피토프는 상기 단락 44에 기술된 바와 같이, IEDB 데이터베이스를 사용하여 생성된 인간화된 서열에서 탐색하였다.
IEDB에서 경쇄 (LC7)에 대한 최상의 서열 매치는 CDR2를 포함하는 PGKAPQLLIYRMSNL (서열번호 52)이었다. 이 서열은 HLA-DRB1 0404*에 대한 결합을 나타내지만, 인간에게서 면역원성인 것으로 입증되지 않은 펩타이드 PGKAPKLLIYAASSL (서열번호 53)과 73% 서열 동일성을 나타낸다 [J Immunol (1995) 155, 5655].
IEDB에서 중쇄 (HC4 및 HC5)에 대한 최상의 매치는 CDR1을 포함하지만 IEDB 데이터베이스 내에서의 BLAST 탐색으로부터 수득된 40% 서열 동일성에 의해서 예시되는 바와 같은 상당한 잔기 차이를 갖는 SLIDYGVNWIRQPPG (서열번호 54)였다.
중쇄에 대한 두 개의 변형체 (HC4 및 HC5) 및 경쇄에 대한 한 개의 변형체 (LC7)가 수득되었다. 중쇄의 두 개의 변형체는 모두 인간 배선 모델 vλ2-vh4로부터 유도된다. HC5는 잠재적인 문제가 있는 다음의 잔기를 다루기 위한 추가의 돌연변이를 갖는 HC4의 변형체이다: 아스파라긴 N60이 프롤린 잔기로 변화되는 1 개의 잠재적 탈아미드화 부위.
가변 쇄의 인간화를 통해서 도입된 돌연변이는 소문자로 쓰고 밑줄을 쳤으며, CDR은 밑줄을 쳤다. 불변 영역은 포함되지 않는다.
Figure 112014089213800-pat00034
Figure 112014089213800-pat00035

실시예 17: 약력학
시험은 적합한 수의 동물 (예를 들어, 시험에서 4; 단일 투약에 대해서 2 및 반복 투약에 대해서 2, 1 주일에 5 회 투약), 즉 체중이 2.0 내지 5.4 kg이고 연령이 2 내지 7 세 범위인 건강한 목적-사육된 수컷 시노몰구스 원숭이를 사용하여 수행되었다. 동물은 두 개의 처리 그룹으로 분배할 수 있으며, 한 그룹에게는 대조 IgG4 항체를 투여하고, 다른 한 그룹에게는 인간화된 16D7을 투여한다. 각각의 그룹 내의 원숭이에게는 단일 정맥내 볼루스 용량, 예를 들어, 2-3 mL/kg의 투약 용적으로 2.5-10 mg/kg, 또는 1 주일에 5 회 용량을 i.v.로 투여한다. 혈액 샘플은 각각의 용량 투여 후 다양한 시점에 수집하고, 혈장으로 처리된다. 혈장 샘플을 ELISA를 사용하여 총 IgG4 및 CXCR5 mAb의 농도에 대해서 분석한다.
실시예 18: 비교시험
본 발명의 항체의 일부를 병행 실험에서 상업적으로 이용할 수 있는 항체와 비교하였다. 알앤드디 시스템스 (R & D Systems)로부터 이용할 수 있는 MAB190은 마우스 mAb이다. RF82B는 BD로부터 이용할 수 있는 랫트 항-인간 CXCR5이다. 클론 2C1은 애브노바 (Abnova)로부터 이용할 수 있는 GST 태그를 갖는 마우스 mAb이다. 본 명세서에 기술된 다양한 인간화된 항체는 본 기술분야에서 공지된 시약 및 방법을 사용하여 이소타입화하였다. 예를 들어, 본 명세서에 교시된 것은 κ 경쇄를 가지며, 대부분은 IgG1인 한편, 46C9, 68D3 및 H28 IgG2a이다. 항체의 대부분은 CXCR5의 아미노 말단에 결합하며, 몇 가지의 항체는 동일한 에피토프 또는 부분에 대한 결합에 관해서 서로 경쟁한다.
BD 항체는 인간 PBMC에 불충분하게 결합한다.
항체는 일반적으로 시노몰구스 세포에 결합하지 않았지만, 본 발명의 14C9, 19H5, H28, 54G6, 56H6 및 79B7는 결합하였다.
16D7은 상업적인 항체보다 더 큰 친화성, 적어도 10배의 친화성이 있는 것으로 확인되었으며, 다른 항체보다 100배 더 우수한 오프율을 갖는다.
실시예 19: 스케일-증대
각각의 모노클로날 항체 변이체는 293펙틴 (293fectin™ (Invitrogen)과 콤플렉스화된 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 두 개의 발현 플라스미드의 일시적 형질감염에 의해 현탁-배양된 HEK293 FS™ 세포에서 생산되었다. 분비된 단백질은 형질감염-후 8일에 수확하고, 원심분리하였다. 단백질은 칼럼으로부터 25 mM 시트레이트 pH 3, 0.15 M NaCl 완충액에 의해서 용출시킨 후에 단백질 A (ProSepvA, Millipore) 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 모노클로날 항체는 PBS 중에서 제제화하고, 0.22 ㎛ 여과하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 각각의 배취는 환원 및 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE (Nupage Bistris/ MES-SDS 10%)에 의해서 분석하여 각각의 서브유니트 및 모노머의 순도 및 분자량을 결정하였다. 각각의 단백질 로트는 또한, 겔 여과 (Tricorn 10/300 GL Superdex 200)에 의해서 분석하여 모노머의 균질성 및 고분자량 종의 존재를 결정하였다.
240 mL 배양물로부터, 총 30 내지 40 mg의 8 개의 16D7 변이체 모노클로날 항체를 이용할 수 있었으며, 이들은 후속 시험관내 및 생체내 시험에 적절한 품질을 가졌다.
본 기술분야에서 숙련된 전문가는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정한 구체예의 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
<110> Sanofi-Aventis <120> Humanized anti-CXCR5 antibodies, derivatives thereof and their uses <130> 190809-14330601 <150> US 60/968,792 <151> 2007-08-29 <160> 57 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Tyr Pro Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu 1 5 10 15 Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Thr Ser Leu Val Glu 20 25 30 Asn His Leu Cys 35 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (18) <223> a, c, g or t <400> 2 cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc 32 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (18) <223> a, c, g or t <400> 3 cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a 31 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ccaagctgtg tcctrtcc 18 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 cgacaagtcg actagccctt gaccaggcat cc 32 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 wtctctrgag tcagtggg 18 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 cgactagtcg actggtggga agatggatac ag 32 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Arg 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 17 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 18 <211> 731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60 cacagcgaca tcgtgatgac ccagagcgcc ctcagcgtgg ccgtgacccc cggcgagagc 120 gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180 tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg catgagcaac 240 ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300 aagatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360 tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420 tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480 tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540 ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600 tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660 tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720 tgctgaagct t 731 <210> 19 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60 cacagccagg tgcagctgaa ggagagcggc cccggcctgg tggcccccag ccagagcctg 120 agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180 cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240 tacaacagcg ccctgaagag ccgcctgagc atccgcaagg acaacagcca gagccaggtg 300 ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360 gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcgccg ccagcaccaa gggcccttcc 420 gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480 ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540 tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600 gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660 aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720 tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780 aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val 20 25 30 Thr Pro Gly Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 85 90 95 Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 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ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60 cacagcgagg tgcagctgaa ggagagcggc cccggcctgg tggcccccgg cggcagcctg 120 agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180 cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240 tacaacgccc ccctgaaggg ccgcctgagc atcagcaagg acaacagcaa gagccaggtg 300 ttcctgcaga tgaacagcct gaagaccgac gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360 gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg ccagcaccaa gggcccttcc 420 gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480 ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540 tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600 gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660 aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720 tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780 aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 840 caggaggacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900 aagaccaagc ctcgggagga gcagttcaat tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc 960 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gaatacaagt gtaaggtctc caacaagggc 1020 ctgccctcct ccatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag 1080 gtgtacaccc tgcctcctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1140 ctggtgaagg gcttctaccc ttccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagcct 1200 gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260 tccaggctga ccgtggacaa gtcccggtgg caggagggca acgtcttttc ctgctccgtg 1320 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc tctgggctga 1380 agctt 1385 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Met Ile Ser Arg Thr 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6x His tag <400> 51 His His His His His His 1 5 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ser Leu Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly 1 5 10 15 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln His Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 56 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 100 105 110 Lys <210> 57 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala 100 105 110 Lys

Claims (8)

  1. (a) 비-인간 항체의 가변 영역에 대해 상동성인 인간 가변 영역을 확인하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 확인된 인간 가변 영역을 사용하여, 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 상동 모델을 만들고, 분자 동적 시뮬레이션 (molecular dynamic simulation)을 수행하여 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 분자 동적 궤도 (molecular dynamic trajectory)를 수득하는 단계;
    (c) 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 상기 분자 동적 궤도를 분석하고, 하기 수학식 I 또는 수학식 II에 따라 아미노산 유연성 스코어를 측정하여 상기 비-인간 항체의 가변 영역 중의 유연한 아미노산 및 상기 유연한 잔기의 측면에 있는 아미노산을 확인하는 단계,
    수학식 I
    Figure 112016031071474-pat00036


    수학식 II
    Zi = (Fi - Fm)/Fm

    상기 수학식 I에서, mi은 잔기 i의 RMSD (Root Mean Square Distance: 평균 제곱근 거리) 분포로부터 계산된 평균 RMSD이며, mglobal은 전체 RMSD 분포로부터 계산된 평균 RMSD이고, sdi는 잔기 i의 RMSD 분포로부터 계산된 표준 편차이며, n은 샘플 크기이고,
    상기 수학식 II에서, Fi는 주어진 아미노산의 RMSD이고, Fm은 모든 쥐(murine) 아미노산의 RMSD이다;
    (d) 인간 항체 배선 (germ line)의 상동 모델을 만들고, 분자 동적 시뮬레이션을 수행하여 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도를 수득하는 단계;
    (e) 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도를 분석하고, 아미노산 유연성 스코어를 측정하여 상기 인간 항체 배선의 가변 영역 중의 유연한 아미노산 및 상기 유연한 잔기의 측면에 있는 아미노산을 확인하는 단계;
    (f) 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 상기 분자 동적 궤도에 가장 유사한 분자 동적 궤도를 나타내는 인간 항체 배선의 인간 가변 영역을 확인하고, 상기 (c) 및 (e) 단계의 가장 유연한 아미노산의 유연성 스코어를 비교하고 유연성 스코어의 유사성을 확인함으로써 인간화 돌연변이를 확인하는 단계;
    (g) 상기 단계 (c)의 확인된 아미노산을 상기 단계 (f)의 확인된 아미노산으로 대체하여 인간화된 가변 영역을 생성하는 단계;
    (h) 인간화된 가변 영역 분자 동적 궤도를 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도와 비교함으로써, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 인간 항체와 유사한 지를 확인하는 단계;
    (i) 상기 단계 (g)의 상기 인간화된 가변 영역을 인간 서열과 연결하여, 인간화된 항체 또는 이의 단편을 수득하는 단계
    를 포함하여, 인간화된 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (g)가 상보성 결정 영역으로부터 5Å 초과인 아미노산을 대체시키지 않음을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간화된 가변 영역 서열을 인간 항체 서열의 수집물 중의 서열과 비교함으로써, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 인간 항체와 유사한 지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 포함하지 않는 방법.
  5. (a) 비-인간 CXCR5 항체의 가변 영역에 대해 상동성인 인간 가변 영역을 확인하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 확인된 인간 가변 영역을 사용하여, 상기 비-인간 CXCR5 항체의 가변 영역의 상동 모델을 만들고, 분자 동적 시뮬레이션 (molecular dynamic simulation)을 수행하여 비-인간 항체의 가변 영역의 분자 동적 궤도 (molecular dynamic trajectory)를 수득하는 단계;
    (c) 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 상기 분자 동적 궤도를 분석하고, 하기 수학식 I 또는 수학식 II에 따라 아미노산 유연성 스코어를 측정하여 상기 비-인간 항체의 가변 영역 중의 유연한 아미노산 및 상기 유연한 잔기의 측면에 있는 아미노산을 확인하는 단계,
    수학식 I
    Figure 112016031071474-pat00037


    수학식 II
    Zi = (Fi - Fm)/Fm

    상기 수학식 I에서, mi은 잔기 i의 RMSD (Root Mean Square Distance: 평균 제곱근 거리) 분포로부터 계산된 평균 RMSD이며, mglobal은 전체 RMSD 분포로부터 계산된 평균 RMSD이고, sdi는 잔기 i의 RMSD 분포로부터 계산된 표준 편차이며, n은 샘플 크기이고,
    상기 수학식 II에서, Fi는 주어진 아미노산의 RMSD이고, Fm은 모든 쥐(murine) 아미노산의 RMSD이다;
    (d) 인간 항체 배선 (germ line)의 상동 모델을 만들고, 분자 동적 시뮬레이션을 수행하여 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도를 수득하는 단계;
    (e) 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도를 분석하고, 아미노산 유연성 스코어를 측정하여 상기 인간 항체 배선의 가변 영역 중의 유연한 아미노산 및 상기 유연한 잔기의 측면에 있는 아미노산을 확인하는 단계;
    (f) 상기 비-인간 항체의 가변 영역의 상기 분자 동적 궤도에 가장 유사한 분자 동적 궤도를 나타내는 인간 항체 배선의 인간 가변 영역을 확인하고, 상기 (c) 및 (e) 단계의 가장 유연한 아미노산의 유연성 스코어를 비교하고 유연성 스코어의 유사성을 확인함으로써 인간화 돌연변이를 확인하는 단계;
    (g) 상기 단계 (c)의 확인된 아미노산을 상기 단계 (f)의 확인된 아미노산으로 대체하여 인간화된 가변 영역을 생성하는 단계;
    (h) 인간화된 가변 영역 분자 동적 궤도를 인간 항체 배선의 가변 영역의 분자 동적 궤도와 비교함으로써, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 인간 항체와 유사한 지를 확인하는 단계;
    (i) 상기 단계 (g)의 상기 인간화된 가변 영역을 인간 서열과 연결하여, 인간 CXCR5의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 수득하는 단계
    를 포함하여, 인간 CXCR5의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (g)가 상보성 결정 영역으로부터 5Å 초과인 아미노산을 대체시키지 않음을 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 인간화된 가변 영역 서열을 인간 항체 서열의 수집물 중의 서열과 비교함으로써, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 인간 항체와 유사한 지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단계 (g)의 인간화된 가변 영역이 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 포함하지 않는 방법.
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