WO2019243159A1 - Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil - Google Patents

Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil Download PDF

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Hans-Georg Lerchen
Beatrix Stelte-Ludwig
Pascale Lejeune
Hannah JÖRIßEN
Christoph Mahlert
Simone Greven
Stephan MÄRSCH
Stefanie Hammer
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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Definitions

  • the invention relates to novel binder-drug conjugates, such as, for example, Antibody-Drug-Conjugates (ADCs) with improved properties, active metabolites of these binder-drug conjugates and their processes for the preparation. Furthermore, the present invention relates to the use of these conjugates for the treatment and / or prevention of diseases and the use of these conjugates for the production of medicaments for the treatment and / or prevention of diseases, in particular hyperproliferative and / or angiogenic diseases such as cancer diseases. Such treatments can be carried out as monotherapy or in combination with other drugs or other therapeutic measures.
  • the binder is preferably an antibody.
  • Cancers are the result of uncontrolled cell growth in a wide variety of tissues. In many cases, the new cells penetrate existing tissue (invasive growth) or they metastasize to distant organs. Cancers occur in a wide variety of organs and often have tissue-specific disease courses. Therefore, the term cancer as a generic term describes a large group of defined diseases of various organs, tissues and cell types.
  • Conjugates of binder proteins with one or more active substance molecules are known, in particular in the form of so-called “antibody drug conjugates” (ADCs), in which Chen is an internalizing, directed against a tumor-associated antigen covalently linked via a linker ("linker”) with a cytotoxic agent.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • linker a linker
  • the cytotoxic agent itself or another cytotoxically active metabolite formed therefrom is deployed within the tumor cell, where it can develop its action directly and selectively. In this way, damage to normal tissue could be kept within significantly narrower limits compared to conventional chemotherapy for cancer [see eg JM Lambert, Curr. Opin. Pharmacol.
  • W02012 / 171020 describes ADCs in which several toxophore molecules are linked to an antibody via a polymeric linker.
  • the substances SB 743921, SB 715992 (ispinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 and ARRY-520 are mentioned as possible toxophores in W02012 / 171020.
  • Kinesin spindle protein inhibitors Kinesin spindle protein (KSP, also known as Eg5, HsEg5, KNSL1 or KIL11) is a kinesin-like motor protein, which is essential for the function of the bipolar mitotic spindle.
  • KSP Kinesin spindle protein
  • Eg5 Eg5
  • HsEg5 HsEg5
  • KNSL1 KIL11
  • KSP inhibitors After the discovery of the first cell-compatible KSP inhibitor, monastrol, KSP inhibitors have established themselves as a class of new chemotherapeutic agents (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) and are the subject of a number of patent applications (for example W02006 / 044825 ; W02005 / 051922; W02006 / 060737; W003 / 060064; W003 / 040979 and WO03 / 049527). However, since KSP is only active in a short period of the mitosis phase, KSP inhibitors must be present in a sufficiently high concentration during this phase. In WO2014 / 151030 ADCs with certain KSP inhibitors are disclosed. Furthermore, from W02006 / 002236, W02007 / 021794 and W02008 / 086122 ADCs with imidazole KSP inhibitors are known which differ structurally from the KSP inhibitors of ADCs described here.
  • US Pat. No. 7,662,58l B1 discloses imidazole or benzimidazole derivatives as active substances.
  • W02004 / 100873 also describe imidazole, oxazole and diazepine derivatives as active ingredients.
  • the present invention relates to ADCs with pyrrole and pyrazole KSP inhibitors.
  • ADCs with KSP inhibitors which also contain enzymatically cleavable linkers and have a corresponding activity profile. However, it is desirable to obtain a significantly better activity profile and / or to have improved properties.
  • Legumain is a tumor-associated asparaginyl endopeptidase (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; JM Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) and was used to process prodrugs of small cytotoxic molecules as used for example by doxorubicin and etoposide derivatives (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern et al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; KM Bajjuri et al.
  • lysosomal enzymes are, for example, cathepsin or glycosidases such as, for example, ⁇ -glucuronidases, which were also used to release the active ingredients by enzymatic cleavage of prodrugs.
  • Groups that can be cleaved enzymatically in vivo are, in particular, 2-8 oligopeptide groups or glycosides.
  • Peptide cleavage sites are disclosed in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, and Bioorganic & Medicinal Chemistry Leiters 8 (1998) 3341-3346 and Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. For this include, for example, valine-alanine, valine-lysine, valine-citrulline, alanine-lysine and phenylalanine-lysine (possibly with an additional amide group).
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • enzymatically cleavable linkers are described in the prior art, but they have an action profile which is in need of improvement. So it would be a. desirable to have ADCs available that show broader efficacy on different cells. In addition, such ADCs should also have a good effectiveness, but at the same time less
  • the profile of the intracellularly released from the ADCs plays
  • the metabolites formed from ADCs are frequently substrates of Efflux pumps and / or have a high permeability through cell membranes. Both phenomena can contribute to a short residence time and thus to a suboptimal apoptotic effect in the tumor cell.
  • the present invention therefore relates to binder-active substance conjugates, in particular ADCs with a specific active substance (toxophore) -linker-antibody-
  • compositions that have a particularly interesting active profile in terms of potency and breadth.
  • the ADCs were provided with peptide linkers which can be cleaved by lysosomal tumor-associated enzymes, such as legumain, and thus release the active substance or the metabolite (toxophore).
  • Suitable antibodies are, for example, antibodies selected from the group of CXCR5 antibodies.
  • the tumor selectivity is thus determined not only by the choice of the antibody, but also by the enzymatic cleavage of the peptide derivative, for example by tumor-associated enzymes such as legumain.
  • the metabolites released from the ADCs according to the invention in the tumor cells are further distinguished by a particularly interesting property profile. They show a low efflux from the tumor cell and lead to high exposure of the active substance in tumors. A high effect is thus achieved in the tumor cell, whereas, due to the poor permeability, there is only a slight systemic cytotoxic effect, which results in a lower off-target toxicity.
  • the kinesin spindle protein inhibitors contained in the ADCs according to the invention have an amino group which is essential for the action. By modifying this amino group with peptide derivatives, the effect on the kinesin spindle protein is blocked and thus the development of a cytotoxic effect is inhibited.
  • These peptide derivatives can also be components of the linker to the antibody. However, if this peptide residue or the peptide linker can be cleaved from the active substance by tumor-associated enzymes such as Legumain, the effect can be specifically restored in the tumor tissue.
  • the special property profile of the metabolites formed in the tumor is ensured by a further modification of the kinesin spindle protein inhibitor at a position other than the amino group in the molecule, which, however, does not impair the high potency at the target.
  • the ADCs according to the invention enable a high loading of the antibody (called DAR, drug-to-antibody ratio), which surprisingly does not have a negative effect on the physicochemical and pharmacokinetic behavior of the ADCs in comparison to the non-conjugated antibody. It has now surprisingly been found that antibody-drug conjugates of the general formula (I)
  • x 3 is C
  • X3 is N
  • R 1 represents hydrogen or methyl
  • M represents the group
  • n is a number from 1 to 50, AK 2 for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment an antigen-binding fragment
  • Preferred binder-active substance conjugates of the formula (I) are those in which Xi for CH,
  • X3 is N
  • R 1 represents hydrogen or methyl
  • AK 2 for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment an antigen-binding fragment
  • X3 is N
  • R 1 represents hydrogen or methyl
  • R 2 represents methyl or isopropyl
  • AK 2 for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment an antigen-binding fragment
  • X 3 is N
  • R 1 represents methyl
  • R 2 represents methyl
  • n stands for a number from 1 to 50
  • AK 2 for a binder or a derivative thereof, preferably for one
  • Antibody or an antigen-binding fragment an antigen-binding fragment
  • R 1 represents methyl
  • R 2 represents methyl
  • AK 2 stands for an antibody or for an antigen-binding antibody fragment thereof, # stands for the binding towards the active ingredient and
  • # stands for the binding to an N atom of a lysine side chain of the antibody or of the antigen-binding antibody fragment thereof, as well as their salts, solvates and salts of these solvates.
  • Binder-drug conjugates of the formula (I) are selected according to the structure
  • AK 2 stands for an antibody, which via a N atom of a lysine
  • n 1 to 50, and their salts, solvates and salts of these solvates.
  • binder-active ingredient conjugates in which n is 1 to 20,
  • binder-active ingredient conjugates in which
  • n 1 to 8
  • binder-active substance conjugates are preferred in which
  • n 4 to 8
  • binder-active substance conjugates of the above formulas in AK 2 are preferred for a binder which specifically binds to an extracellular cancer target molecule.
  • the binder after binding to its extracellular target molecule on the target cell, the binder is internalized by the binding of the target cell.
  • the binder is an antibody or an antigen binding fragment.
  • the extracellular cancer target molecule is selected from the group consisting of the cancer target molecules CXCR5
  • the binder AK 2 is an anti-CXCR5 antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof,
  • Such binder-active substance conjugates of the formulas mentioned are preferred in AK 2 for an antibody selected from the group consisting of TPP-10063, TPP-14511, TPP-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP- 14495, or a fragment binding an antigen thereof.
  • Such binder-active substance conjugates of the formulas mentioned are particularly preferred in AK 2 for an antibody selected from the group consisting of TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP-14495, or one represents an antigen-binding fragment of these.
  • Fig. 1 Sequence listing of sequences of antibodies for binder-drug conjugates and of sequences of the target proteins.
  • the invention provides conjugates of a binder or derivative thereof with one or more drug molecules, the drug molecule being a kinesin spindle protein inhibitor (KSP inhibitor).
  • KSP inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • binders which can be used according to the invention KSP inhibitors thereof which can be used according to the invention and linkers which can be used according to the invention, which can be used in combination without restriction.
  • the binders shown as preferred or particularly preferred can be used in combination with the KSP inhibitors each shown as preferred or particularly preferred, optionally in combination with the linkers each shown as preferred or particularly preferred.
  • KSP inhibitor conjugates Biner-drug conjugates
  • KSP-inhibitor conjugates are particularly preferred, AK 2 being particularly preferred for binders or a derivative thereof (preferably for an antibody) and n for a number from 1 to 50, preferably 1 to 20, preferably 1 to 8 preferably 4 to 8.
  • AK 2 preferably stands for an antibody which is bound to the KSP inhibitor via a lysine residue.
  • binders or antibodies the binders or antibodies described as preferred in the description are preferably used.
  • binder-active ingredient conjugate is particularly preferred:
  • binder-active substance conjugates of the formulas mentioned are preferred in AK 2 for a binder which specifically binds to an extracellular cancer target molecule.
  • the binder after binding to its extracellular target molecule on the target cell, the binder is internalized by the binding of the target cell.
  • the extracellular cancer target molecule is selected from the group consisting of the cancer target molecules, in particular CXCR5.
  • the binder AK 2 is an anti-CXCR5 antibody or an antigen-binding antibody fragment thereof.
  • binder-active substance conjugates of the formulas mentioned are preferred in AK 2 for an antibody selected from the group consisting of TPP-10063, TPP-14511, TPP-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP- 14495, or a fragment binding an antigen thereof.
  • binder-active substance conjugates of the formulas mentioned are particularly preferred in AK 2 for an antibody selected from the group consisting of TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP-14495 or a represents an antigen-binding fragment of these. Accordingly, particular preference is given to those binder-active substance conjugates of the formula (I) in which
  • R 1 represents methyl
  • R 2 represents methyl
  • AK 2 for an anti-CXCR5 antibody selected from the group consisting of
  • TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP-14495 or stands for an antigen-binding antibody fragment thereof
  • # stands for the binding to an N atom of a lysine side chain of the antibody or of the antigen-binding antibody fragment thereof, as well as their salts, solvates and salts of these solvates.
  • the conjugates according to the invention are produced by first providing the low-molecular KSP inhibitor thereof with a linker. The intermediate thus obtained is then reacted with the binder (preferably antibody).
  • reaction can be illustrated as follows for an intermediate coupling to a lysine residue and the subsequent coupling with the antibody:
  • building block A The synthesis of building block A is described in WO2015 / 096982.
  • the peptide derivatives B and C were produced using classic methods of peptide chemistry.
  • Intermediates C and D were coupled using HATU in DMF in the presence of N, N-diisopropylethylamine at RT. Then both the benzyloxycarbonyl protective group and the benzyl ester were split off hydrogenolytically over 10% palladium on activated carbon.
  • Binder is understood in the broadest sense as a molecule that binds to a target molecule that is present on a specific target cell population to be addressed with the binder-active substance conjugate.
  • the term binder is to be understood in its broadest interpretation and also includes, for example, lectins, proteins that can bind certain sugar chains, or phospholipid-binding proteins.
  • Such binders include, for example, high molecular weight proteins (binding proteins), polypeptides or peptides (binding peptides), non-peptide (for example aptamers (US5,270, l63) review articles by Keefe AD., Et al., Nat. Rev. Drug Discov.
  • Binding proteins are, for example, antibodies and antibody fragments or antibody mimetics such as affibodies, adnectins, anticalins, DARPins, Avimers, nanobodies (review by Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13: 245-255; Nuttall SD et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8: 608-617).
  • Binding peptides are, for example, ligands of a ligand-receptor pair, such as
  • VEGF of the ligand-receptor pair VEGF / KDR such as transferrin of the ligand-receptor pair transferrin / transferrin receptor or cytokine / cytokine receptor, such as TNFalpha of the ligand-receptor pair TNF alpha / TNF alpha receptor.
  • the binder can be a binding protein.
  • Preferred embodiments of the binders are an antibody, an antigen-binding antibody fragment, a multispecific antibody or an antibody mimetic.
  • conjugation of organic molecules to binder and in particular antibodies is known from the literature.
  • conjugation of the toxophores to the antibody via one or more sulfur atoms of cysteine residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody is preferred.
  • a "target molecule” is broadly understood as a molecule that is present in the target cell population and can be a protein (e.g. a receptor of a growth factor) or a non-peptide molecule (e.g. a sugar or phospholipid). It is preferably a receptor or an antigen.
  • extracellular target molecule describes a target molecule bound to the cell which is located on the outside of a cell or the part of a target molecule which is located on the outside of a cell, ie a binder can bind to its intact cell to its extracellular target molecule , An extracellular target molecule can be anchored in the cell membrane or be part of the cell membrane.
  • the person skilled in the art knows methods for identifying extracellular target molecules. For Proteins can do this by determining the transmembrane domain (s) and orienting the protein in the membrane. This information is usually stored in protein databases (e.g. SwissProt).
  • cancer target molecule describes a target molecule that is present on one or more cancer cell types in comparison to non-cancer cells of the same tissue type.
  • the cancer target molecule is preferably selectively present on one or more cancer cell types in comparison to non-cancer cells of the same tissue type, wherein selectively describes an at least two-fold enrichment on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a “selective cancer target molecule”) ,
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates according to the invention.
  • the binder can be linked to the linker via a binding.
  • the binder can be linked by means of a hetero atom of the binder.
  • Heteroatoms of the binder according to the invention which can be used for the linkage are sulfur (in one embodiment via a sulfhydryl group of the binder), oxygen (according to the invention by means of a carboxyl or hydroxyl group of the binder) and nitrogen (in one embodiment via a primary or secondary amine group or amide group of the binder).
  • These heteroatoms can be present in the natural binder or can be introduced by chemical or molecular biological methods.
  • the linkage of the binder with the toxophore has only a minor influence on the binding activity of the binder to the target molecule. In a preferred embodiment, the linkage has no influence on the binding activity of the binder to the target molecule.
  • an immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule with four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • each heavy chain includes a variable domain of the heavy chain (abbreviated VH) and constant domain of the heavy chain.
  • the heavy chain constant domain can include, for example, three domains CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant domain of the light chain comprises a domain (abbreviated CL).
  • the VH and VL domains can be further divided into regions with hypervariability, also called complementarity determining regions (abbreviated CDR) and regions with less sequence variability ("framework region", abbreviated FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR frame region
  • Each VH and VL region is typically composed of three CDRs and up to four FRs.
  • An antibody can be obtained from any suitable species, for example rabbit, llama, camel, mouse, or rat.
  • the antibody is of human or murine origin.
  • An antibody can be human, humanized or chimeric, for example.
  • monoclonal antibody refers to antibodies that have been obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie individual antibodies of the population are identical except for naturally occurring mutations, which can occur in small numbers. Monoclonal antibodies recognize a single antigenic binding site with high specificity. The term monoclonal antibody does not refer to a specific manufacturing process.
  • the term "intact" antibody refers to antibodies that include both an antigen-binding domain and the constant domain of the light and heavy chain.
  • the constant domain can be a naturally occurring domain, or a variant thereof in which several amino acid positions have been changed, and can also be aglycosylated.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another polypeptide or protein that is not derived from an antibody via their amino terminus or carboxy terminus by means of a covalent bond (eg a peptide linkage).
  • Antibodies can also be modified in such a way that reactive cysteines are introduced at defined sites in order to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26 (8): 925-32).
  • “Amino acid modification” or “mutation” here means an amino acid substitution, insertion, and / or deletion in a polypeptide sequence. The preferred amino acid modification here is a substitution.
  • amino acid substitution or “substitution” is meant an exchange of an amino acid at a given position in a protein sequence with another amino acid.
  • substitution Y50W describes a variant of a parental polypeptide in which the tyrosine at position 50 is replaced by a tryptophan.
  • a "variant" of a polypeptide describes a polypeptide that has an amino acid sequence that is substantially identical to a reference polypeptide, typically a native or “parent” polypeptide.
  • the polypeptide variant can have one or more amino acid replacements, deletions, and / or insertions at specific positions in the native amino acid sequence.
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or are synthetic human antibodies.
  • a “synthetic” human antibody is an antibody that is available in part or in whole as a whole from synthetic sequences in silico that are based on the analysis of human antibody sequences.
  • a human antibody can e.g. encoded by a nucleic acid isolated from a library of antibody sequences that are of human origin. An example of such antibodies is in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • Such “human” and “synthetic” antibodies also contain aglycosylated variants, which were produced either by deglycosylation by PNGaseF or by mutation of N297 (kabat numbering) of the heavy chain to any other amino acid.
  • humanized or “chimeric” antibody describes antibodies that consist of a non-human and a human sequence part. In these antibodies, part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence components of a non-human immunoglobulin (donor). In many cases the donor is a murine immunoglobulin. In humanized antibodies, amino acids of the CDR of the recipient are replaced by amino acids of the donor. Sometimes amino acids of the framework are replaced by corresponding amino acids of the donor. In some cases, the humanized antibody contains amino acids that were neither contained in the recipient nor in the donor and that were inserted during the optimization of the antibody. In the case of chimeric antibodies, the variable Domains of donor immunoglobulin fused to the constant regions of a human antibody. Such “humanized” and “chimeric” antibodies also contain aglycosylated variants, which were either produced by deglycosylation by PNGaseF or by mutation of N297 (kabat numbering) of the heavy chain to any other amino acid.
  • complementarity determining region refers to those amino acids of a variable antibody domain that are necessary for binding to the antigen.
  • Each variable region typically has three CDR regions, which are referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region can include amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes the region of approximately amino acid positions 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain / domain (VL) and 31-35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) and 95-102 (CDR3) variable heavy chain / domain (VH) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
  • the Chotia definition includes the region of approximately amino acid positions 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable light chain (VL) and 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) and 96-101 (CDR3) of the variable heavy chain (VH) Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)).
  • a CDR can include amino acids from a CDR region defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five main classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, several of which can be broken down into further subclasses. (Isotypes), e.g. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are designated as [alpha / a], [delta / d], [epsilon /], [gamma / g] and [my / m]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • the term “functional fragment” or “antigen-binding antibody fragment” of an antibody / immunoglobulin is defined as a fragment of an antibody / immunoglobulin (eg the variable domains of an IgG) which the Antigen-binding domains of the antibody / immunoglobulin still includes.
  • the “antigen binding domain” of an antibody typically comprises one or more hypervariable regions of an antibody, for example the CDR, CDR2 and / or CDR3 region.
  • the "framework" or the "framework” region of an antibody can also play a role in binding the antibody to the antigen.
  • the framework region forms the framework for the CDRs.
  • the antigen binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acid 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably amino acids 3 to 107 of the variable light chain and 4 to 111 of the variable heavy chain, particularly preferred are the complete ones variable light and heavy chains, i.e. amino acid 1 - 109 of the VL and 1 to 113 of the VH (numbering according to W097 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” of the invention do not finally include Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linear antibodies, single-chain antibodies (single-chain Fv , abbreviated scFv); and multispecific, such as bi- and tri-specific, antibodies formed from antibody fragments CA K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Antibodies other than “multi-specific” or “multi-functional” are those with identical binding sites.
  • Multi-specific antibodies can be specific for different epitopes of an antigen or specific for epitopes of more than one antigen (see, for example, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991 , J. Immunol. 147: 60 69; U.S. Pat. Nos. 4,474,893; 4.7 14.68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601.8 19; or Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553 ).
  • An F (ab ') 2 or Fab molecule can be constructed so that the number of intermolecular disulfide interactions that take place between the Chl and the CL domains can be reduced or completely prevented.
  • Epitopic determinants are protein determinants that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor. Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or sugar side chains, or combinations thereof, and usually have specific 3-dimensional structural properties as well as specific charge properties. "Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” can be fused with another polypeptide or protein that is not derived from an antibody via their amino terminus or carboxy terminus by means of a covalent bond (eg a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified in such a way that reactive cysteines are introduced at defined sites in order to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26 (8): 925-32 ).
  • Monoclonal antibodies can be made by methods known to those of ordinary skill in the art.
  • Monoclonal antibodies can be made by methods known to those of ordinary skill in the art (Koehler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Human or humanized monoclonal antibodies can be produced by methods known to the person skilled in the art (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 or Cabilly et al US Pat. No. 4,816,567 or Boss et al US Pat. No. 4,816,397).
  • Antibodies of the invention can be obtained from recombinant antibody libraries, e.g. on the
  • Amino acid sequences of a variety of antibodies are made up of a large number of healthy volunteers. Antibodies can also be produced using known recombinant DNA technologies. The nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases.
  • An "isolated” antibody or binder was cleaned of other components of the cell. Contaminating components of a cell which can interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptide components of a cell.
  • An antibody or binder is preferred which has been purified to more than 95% by weight, based on the antibody or binder (determined, for example, by Lowry method, UV-Vis spectroscopy or by SDS capillary gel electrophoresis).
  • an antibody that has been purified to such an extent that at least 15 amino acids of the amino terminus or an internal amino acid sequence can be determined, or purified for homogeneity where the homogeneity is determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (the detection can be determined by means of Coomassie blue staining or preferably by silver staining).
  • an antibody is usually made by one or more purification steps.
  • the term “specific binding” or “binds specifically” refers to an antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule.
  • Specific binding of an antibody or binder typically describes an antibody or binder with an affinity of at least 10 7 M (as a Kd value; thus preferably those with a Kd value smaller than 10 7 M), the antibody or binder having at least two has higher affinity for the predetermined antigen / target molecule than for a non-specific antigen / target molecule (eg bovine serum albumin, or casein), which is not the predetermined antigen / target molecule or a closely related antigen / target molecule.
  • a non-specific antigen / target molecule eg bovine serum albumin, or casein
  • Specific binding of an antibody or binder does not rule out that the antibody or binder binds to several antigens / target molecules (eg orthologs from different species).
  • the antibodies preferably have an affinity of at least 10 7 M (as a Kd value; thus preferably those with smaller Kd values than 10-7 M), preferably at least 10 ⁇ M, particularly preferably in the range from 10 9 M to 10 HM on.
  • the Kd values can be e.g.
  • the antibody-drug conjugates according to the invention also have affinities in these areas.
  • the affinity is preferably not significantly influenced by the conjugation of the active substances (as a rule, the affinity is reduced less than an order of magnitude, for example, from a maximum of 10 ⁇ M to 10 7 M).
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably distinguished by a high selectivity.
  • a high selectivity is present if the antibody according to the invention has an affinity for the target protein that is at least a factor of 2, preferably a factor of 5 or particularly preferably a factor of 10 better than that of an independent other antigen, for example human serum albumin (the affinity can be determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy) ,
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive. In order to facilitate and better interpret preclinical studies, e.g. toxicological or effectiveness studies (e.g.
  • the antibody used according to the invention not only binds the human target protein, but also binds the species target protein in the species used for the studies.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive to the target protein of at least one further species in addition to the human target protein.
  • Species of the rodent, dog and non-human primate families are preferred for toxicological and efficacy studies.
  • Preferred rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, cynomolgus and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one further species selected from the group consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • Antibodies used according to the invention are particularly preferred which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive to the monkey target protein (eg cynomolgus). Preference is given to cross-reactive antibodies whose affinity for the target protein of the other non-human species does not differ by more than a factor of 50, in particular not more than a factor of ten, from the affinity for the human target protein.
  • Antibodies directed against a cancer target are particularly preferred which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive to the monkey target protein (eg cynomolgus). Preference is given to cross-reactive antibodies whose affinity for the target protein of the other non-human species does not differ by more than a factor of 50, in particular not more than a factor
  • cancer target molecule describes a target molecule which is present on one or more cancer cell types in comparison to non-cancer cells of the same tissue type.
  • the cancer target molecule is preferably selectively present on one or more cancer cell types in comparison to non-cancer cells of the same tissue type, wherein selectively describes an at least two-fold enrichment on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a “selective cancer target molecule”) ,
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates according to the invention.
  • Antibodies which are specifically directed against an antigen can be produced by the person skilled in the art using methods known to him (such as, for example, recombinant expression) or can be purchased commercially (such as, for example, from Merck KGaA, Germany).
  • Examples of known commercially available antibodies in cancer therapy are Erbitux® (cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (bevacizumab, Roche) and Herceptin® (trastuzumab, Genentech).
  • the antibody is produced recombinantly in CHO cells. All of these antibodies can also be produced as aglycosylated variants of these antibodies, either by deglycosylation by PNGase F or by mutation of N297 (Kabat numbering) of the heavy chain to any amino acid.
  • the target molecule is a selective cancer
  • the target molecule is a protein.
  • Cancer target molecules are known to the person skilled in the art.
  • cancer target molecule CXCR5 CD185; SwissProt: P32302; NCBI-Gene ID 643, NCBI reference sequence:
  • the binder after binding to its extracellular target molecule on the target cell, the binder is internalized by the binding of the target cell. This causes the binder-drug conjugate, which can be an immunoconjugate or an ADC, to be taken up by the target cell.
  • the binder is then preferably processed intracellularly, preferably lysosomally.
  • the binder is a binding protein.
  • the binder is an antibody, an antigen-binding antibody fragment, a multispecific antibody or an antibody mimetic.
  • Preferred antibody mimetics are affibodies, adnectins, anticalins, DARPins, Avimers, or nanobodies.
  • Preferred multispecific antibodies are bispecific and trispecific antibodies.
  • the binder is an antibody or an antigen-binding antibody fragment, further preferred is an isolated antibody or an isolated antigen-binding antibody fragment.
  • Preferred antigen-binding antibody fragments are Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments, diabodies, DAbs, linear antibodies and scFv.
  • Fab, diabodies and scFv are particularly preferred.
  • the binder is an antibody.
  • Monoclonal antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof are particularly preferred.
  • Human, humanized or chimeric antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof are further particularly preferred.
  • Antibodies or antigen-binding antibody fragments that bind cancer target molecules can be produced by those of ordinary skill in the art using known methods, such as chemical synthesis or recombinant expression. Binder for cancer target molecules can be purchased commercially or can be made by one of ordinary skill in the art using known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Further processes for the production of antibodies or antigen-binding antibody fragments are described in WO 2007/070538 (see page 22 “Antibodies”).
  • phage display libraries for example Morphosys HuCAL Gold
  • phage display libraries for example Morphosys HuCAL Gold
  • AK -Example 1 on page 70 AK -Example 2 on page 72.
  • Further methods for producing antibodies which use DNA libraries from B cells are described, for example, on page 26 (WO 2007/070538).
  • Methods for humanizing antibodies are on pages 30-32 of WO2007 / 070538 and in detail in Queen, et al., Pros. Natl. Acad. Be. USA 86: 10029-10033, 1989 or in WO 90/0786.
  • Suitable expression vectors for the bacterial expression of desired proteins are constructed by inserting a DNA sequence which encodes the desired protein in the functional reading frame together with suitable translation initiation and translation termination signals and with a functional promoter.
  • the vector comprises one or more phenotypically selectable markers and an origin of replication to enable maintenance of the vector and, if desired, amplification thereof within the host.
  • Suitable prokaryotic Hosts for transformation include, but are not limited to, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and various species from the genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus.
  • bacterial vectors can be based on bacteriophages, plasmids, or phagemids.
  • vectors can contain selectable markers and a bacterial origin of replication, which are derived from commercially available plasmids.
  • Many commercially available plasmids typically contain elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017).
  • pBR322 ATCC 37017
  • a number of advantageous expression vectors can be selected based on the intended use of the protein to be expressed. After transformation of a suitable host strain and growth of the host strain to an appropriate cell density, the selected promoter is de-repressed / induced by suitable means (e.g. temperature change or chemical induction) and the cells are cultivated for an additional period. The cells are usually harvested by centrifugation, if necessary physically or chemically disrupted, and the resulting crude extract is retained for further purification.
  • suitable means e.g. temperature change or chemical induction
  • another embodiment of the present invention is an expression vector comprising a nucleic acid encoding a new antibody of the present invention.
  • Antibodies of the present invention, or antigen-binding fragments thereof include naturally purified products, products derived from chemical synthesis, and products derived from recombinant technologies in prokaryotic hosts such as E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and various species from the same Genus Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus, preferably E. coli.
  • Mammalian cell expression The person skilled in the art knows how antibodies, antigen-binding fragments thereof or variants thereof can be produced with the aid of mammalian cell expression.
  • Preferred regulatory sequences for expression in mammalian cell hosts include viral elements that lead to high expression in mammalian cells, such as promoters and / or expression enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) (such as the CMV promoter / enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (as the SV40 promoter / enhancer), from the adenovirus (e.g. the adenovirus major late promoter (AdMLP)) and from the polyoma.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 Simian Virus 40
  • AdMLP adenovirus major late promoter
  • the expression of the antibodies can be constitutive or regulated (e.g. induced by adding or removing small molecule inducers such as tetracycline in combination with the Tet system).
  • the recombinant expression vectors may also include an origin of replication and selectable markers (see e.g. U.S. 4,399,216, 4,634,665 and U.S. 5,179,017).
  • Suitable selectable markers include genes which confer resistance to substances such as G418, puromycin, hygromycin, blasticidin, zeocin / bleomycin, or methotrexates, or selectable markers which lead to auxotrophy of a host cell, such as glutamine synthetase (Bebbington et al., Biotechnology (NY 1992 Feb; 10 (2): 169-75) when the vector was introduced into the cell.
  • the dihydrofolate reductase (DHFR) gene mediates resistance to methotrexate
  • the neo gene mediates resistance to G4108
  • the bsd gene from Aspergillus terreus mediates resistance to blasticidin
  • puromycin N-acetyltransferase mediates resistance to puromycin, which mediates Sh ble gene product Resistance to Zeocin
  • resistance to hygromycin is mediated by the E. coli hygromycin resistance gene (hyg or hph).
  • Selectable markers such as DHFR or Glutamine synthetase is also useful for amplification techniques related to MTX and MSX.
  • the transfection of an expression vector into a host cell can be carried out using standard techniques, including electroporation, nucleofection, calcium-phosphate precipitation, lipofection, polycation-based transfection such as polyethyleneimine (PEI) based transfection and DEAE-dextran transfection.
  • electroporation nucleofection
  • calcium-phosphate precipitation calcium-phosphate precipitation
  • lipofection lipofection
  • polycation-based transfection such as polyethyleneimine (PEI) based transfection
  • DEAE-dextran transfection DEAE-dextran transfection.
  • Suitable mammalian host cells for the expression of antibodies, antigen-binding fragments thereof, or variants thereof include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) such as CHO-Kl, CHO-S, CHO-K1SV [including DHFR-CHO cells described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Be. USA 77: 4216-4220 and Urlaub et al, Cell. 1983 Jun; 33 (2): 405-l2, used with a DHFR selectable marker as described in RJ Kaufman and PA Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621, as well as other knockout cells as described in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr; 109 (4): 1007-15), NS0 myeloma cells, COS cells, HEK293 cells, HKB11 cells, BHK21 cells, CAP cells, EB66 cells, and SP2 cells.
  • CHO-Kl Chinese Hamster Ovary
  • COS cells
  • antibodies, antigen-binding fragments thereof, or variants of these can also take place transiently or semi-stably in expression systems, such as HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-Kl, CHO-Kl SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 or CAP-T cells (e.g. how
  • the expression vector is constructed in such a way that the protein to be expressed is secreted into the cell culture medium in which the host cells grow.
  • the antibodies, the antigen-binding fragments thereof or the variants thereof can be obtained from the cell culture medium using protein purification methods known to the person skilled in the art.
  • the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the variants thereof can be obtained and purified from recombinant cell cultures using well known methods, including, for example, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, protein A chromatography, protein G chromatography, anion or Cation exchange chromatography, phospho-cellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography (HIC),
  • HPLC High performance liquid chromatography
  • Antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof, or the variants thereof include naturally purified products, products from chemical synthesis processes and products which are produced using recombinant techniques in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • Eukaryotic hosts include, for example, yeast cells, higher plant cells, insect cells and mammalian cells. Depending on the host cell chosen for recombinant expression, the expressed protein can be glycosylated or non-glycosylated.
  • the antibody is purified (1) to an extent of more than 95% by weight, for example with the Lowry method, with UV-Vis spectroscopy or with SDS capillary gel electrophoresis (for example with a Caliper LabChip GXII, GX 90 or Biorad Bioanalyzer device), and in more preferred embodiments more than 99% by weight, (2) suitable to a degree for determining at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence, or (3) for homogeneity determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions with the help of Coomassie blue or preferably silver coloring.
  • An isolated antibody is usually isolated using at least one
  • Anti-CXCR5 antibodies can be used according to the invention.
  • anti-CXCR5 antibody or “an antibody that specifically binds to CXCR5” refers to an antibody that binds the cancer target molecule CXCR5 (NCBI - reference sequence: NR 001707.1; SEQ ID NO 81), preferably with one for diagnostic and / or therapeutic affinity.
  • the antibody binds CXCR5 with a dissotation constant (K D ) of ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM.
  • an antibody and antigen-binding fragments that bind to human CXCR5 are known to the person skilled in the art, for example, as a rat antibody clone RF8B2 (ACC2153) or as human antibody 40C01 as described in WO2014 / 177652.
  • the anti-CXCR5 antibodies TPP-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 and TPP-14495 are particularly preferred.
  • Precursors (e.g. TPP-10063) of the antibodies mentioned were selected by selection for peptides and cells using phage display technology and their properties were subsequently optimized using protein engineering.
  • TRR-14511, TRR-14509, TRR-14499, TPP-14505, TPP- 14514 / GRR- 14495, TPP-10063 and 40C01 are antibodies comprising one or more of the CDR sequences given in the table above (H-CDR1, H- CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) of the heavy chain variable region (VH) or the light chain variable region (VL).
  • the antibodies comprise the indicated heavy chain variable region (VH) and / or the light chain variable region (VL).
  • the antibodies comprise the indicated heavy chain region (IgG heavy chain) and / or the indicated light chain region (IgG light chain).
  • TPP-14495 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 2, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 3 and the variable CDR3 sequence of heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 4 and a variable region of the light chain (VL) comprising the variable CDR1 sequence of the light chain (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 6 , the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 7 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 8.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 CDRI heavy chain variable sequence
  • H-CDR2 heavy variable sequence Chain H-CDR2 heavy variable sequence Chain
  • H-CDR3 variable CDR3 sequence of heavy chain
  • TPP-14499 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 12, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 13 and the variable CDR3 sequence of the heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 14 as well as a variable region of the light chain (VL) the light chain variable CDRI sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 16, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 17 and the variable CDR3- Light chain sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 18.
  • TPP-14505 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy region variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 12, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by S
  • VH comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 22, the CDR2 heavy chain variable sequence (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 23 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 24 and a light chain variable region (VL) comprising the CDRI light chain variable sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 26, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 27 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 28.
  • VL light chain variable region
  • TPP-14509 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 32, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 33 and the variable CDR3 sequence of the heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 34 as well as a variable Light chain region (VL) comprising the CDR1 light chain variable sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 36, the CDR2 light chain variable sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 37 and the CDR3 light chain variable sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 38.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 CDRI heavy chain variable sequence
  • H-CDR2 heavy variable sequence Chain H-CDR2 heavy variable sequence Chain
  • H-CDR3 sequence of the heavy chain H-CDR3
  • SEQ ID NO: 38 variable
  • VH comprising the CDR1 heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 42, the CDR2 heavy chain variable sequence (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 43 and the CDR3 heavy chain variable sequence (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 44 and a light chain variable region (VL) comprising the CDR1 light chain variable sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 46, the CDR2 light chain variable sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 47 and the CDR3 light chain variable sequence (L-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 48.
  • VL light chain variable region
  • TPP-14514 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 52, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 53 and the variable CDR3 sequence of the heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 54 as well as a variable region of the light chain (VL) the light chain variable CDRI sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 56, the light CDR2 variable sequence
  • L-CDR2 as represented by SEQ ID NO: 57
  • L-CDR3 the light chain variable CDR3 sequence
  • TPP-10063 is an anti-CXCR5 antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising the CDRI heavy chain variable sequence (H-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 62, the CDR2 heavy variable sequence Chain (H-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 63 and the variable CDR3 sequence of the heavy chain (H-CDR3) as represented by SEQ ID NO: 64 as well as a variable region of the light chain (VL) the light chain variable CDRI sequence (L-CDR1) as represented by SEQ ID NO: 66, the light chain variable CDR2 sequence (L-CDR2) as represented by SEQ ID NO: 67 and the light chain variable CDR3 sequence (L-CDR3 ), as represented by SEQ ID NO: 68.
  • VH heavy chain variable region
  • H-CDR1 CDRI heavy chain variable sequence
  • H-CDR2 CDR2 heavy variable sequence Chain
  • H-CDR3 sequence of the heavy chain H-CDR3 sequence of the heavy chain
  • TPP-14495 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 1 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 5.
  • TPP-14499 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 11 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 15.
  • TPP- 14505 is an anti CXCR5 antibodies preferably comprising a variable region of the heavy chain (VH) corresponding to SEQ ID NO: 21 and a variable region of the light chain (VL) corresponding to SEQ ID NO: 25.
  • TPP-14509 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 31 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-14511 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 41 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 45.
  • TPP-14514 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 51 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 55.
  • TPP-10063 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a variable region of the heavy chain (VH) according to SEQ ID NO: 61 and a variable region of the light chain (VL) according to SEQ ID NO: 65.
  • TPP-14495 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 9 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 10.
  • TPP-14499 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 19 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 20.
  • TPP-14505 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 29 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 30.
  • TPP-14509 is an anti-CXCR5 antibody comprising preferably a heavy region Chain corresponding to SEQ ID NO: 39 and a region of the light chain corresponding to SEQ ID NO: 40.
  • TPP-14511 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 49 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 50.
  • TPP-14514 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 59 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 60.
  • TPP-10063 is an anti-CXCR5 antibody preferably comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 69 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 70.
  • 40C01 is an anti-CXCR5 antibody as described in WO2014 / 177652 and represented herein by the sequences given in the table above (SEQ ID NO: 71-80). Isotopes, salts, solvates, isotopic variants
  • the present invention also includes all suitable isotopic variants of the compounds according to the invention.
  • An isotopic variant of a compound according to the invention is understood here to mean a compound in which at least one atom within the compound according to the invention is replaced by another atom of the same atomic number, but with a different atomic mass than the atomic mass usually or predominantly occurring in nature.
  • isotopes that can be incorporated into a compound according to the invention are those of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, chlorine, bromine and iodine, such as 2 H (deuterium), 3 H (tritium), 13 C, 14 C, 15 N, 17 0, 18 0, 32 P, 33 P, 33 S, 34 S, 35 S, 36 S, 18 F, 36 Cl, 82 Br, 123 I, 124 I, 129 I and 131 I.
  • Certain isotopic variants of a compound according to the invention can be useful, for example, for examining the mechanism of action or the distribution of active substances in the body; Due to the comparatively easy to produce and detect, compounds labeled with 3 H or 14 C isotopes are particularly suitable for this.
  • the incorporation of isotopes, such as in deuterium can lead to certain therapeutic advantages as a result of greater metabolic stability of the compound, such as an extension of the half-life in the body or a reduction in the required active dose;
  • Such modifications of the compounds according to the invention can, if appropriate, also represent a preferred embodiment of the present invention.
  • Isotopic variants of the compounds according to the invention can be prepared by the processes known to the person skilled in the art, for example according to the methods described below and the rules reproduced in the exemplary embodiments, by using corresponding isotopic modifications of the respective reagents and / or starting compounds.
  • preferred salts are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. Also included are salts that are not suitable for pharmaceutical applications themselves, but for example for Isolation or purification of the compounds of the invention can be used.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds of the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g. Salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methane sulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid and benzoic acid.
  • salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methane sulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid acetic acid, trifluoroacetic acid,
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of conventional bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth metal salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines with 1 to 16 carbon atoms, such as, by way of example and by way of preference, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, V-methylpipcridine, / V-methylmorpho 1 in, arginine, 2-ethylamine, lysine ,
  • alkali metal salts for example sodium and potassium salts
  • alkaline earth metal salts for example calcium and magnesium salts
  • solvates are those forms of the compounds according to the invention which, in the solid or liquid state, form a complex by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvate, in which coordination takes place with water. Hydrates are preferred as solvates in the context of the present invention.
  • the hyperproliferative diseases for the treatment of which the compounds according to the invention can be used include in particular the group of cancer and tumor diseases.
  • this includes in particular the following diseases, but without being limited to them: Breast carcinomas and breast tumors (breast carcinomas including ductal and lobular forms, also in situ), respiratory tumors (small-cell and non-small-cell carcinoma, bronchial carcinoma), himtum tumors (e.g.
  • adenocarcinoma pancreatic and salivary carcinomas
  • tumors of the adenocarcinoma adenocarcinoma
  • Penile, kidney, renal pelvis and hamstring tumors as well as tumors of the reproductive organs (endometrial, cervical, ovarian, vaginal, vulvar and uterine carcinomas of women as well as prostate and testicular carcinomas of men).
  • This also includes proliferative diseases of the blood, lymphatic system and spinal cord, in solid form and as circulating cells, such as leukaemias, lymphomas and myeloproliferative diseases, e.g.
  • lymphomas acute myeloid, acute lymphoblastic, chronic lymphocytic, chronic myelogenic and hairy cell leukemia, as well AIDS-correlated lymphomas, Hodgkin lymphomas, non-Hodgkin lymphomas, cutaneous T-cell lymphomas, Burkitt lymphomas and lymphomas in the central nervous system.
  • the binder or antibody-drug conjugates (ADCs) directed against CXCR5 described here can preferably be used to treat disorders expressing CXCR5, such as cancer expressing CXCR5.
  • CXCR5 cancer expressing CXCR5.
  • cancer cells show measurable amounts of CXCR5 measured at the protein (eg by means of immunoassay) or RNA level.
  • Some of these cancer tissues show an increased level of CXCR5 compared to non-carcinogenic tissue of the same type, preferably measured on the same patient.
  • the content of CXCR5 is measured before the cancer treatment is started with an antibody-drug conjugate (ADCs) according to the invention (patient stratification).
  • ADCs antibody-drug conjugate
  • the CXCR5 targeted binder drug conjugates (ADCs) can preferably be used to
  • CXCR5-expressing disorders such as treating cancer expressing CXCR5, such as tumors of the hematopoietic and lymphoid tissue or hematopoietic and lymphatic malignant tumors.
  • cancers associated with CXCR5 expression include lymphatic diseases such as Burkitt's lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL), mantle cell lymphoma (MCL), diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and Hodgkin's lymphoma.
  • lymphatic diseases such as Burkitt's lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL), mantle cell lymphoma (MCL), diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and Hodgkin's lymphoma.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • MCL mantle cell lymphoma
  • DLBCL diffuse large B cell lymphoma
  • Methods of the described invention include treating patients with a cancer expressing CXCR5, the method comprising administering an inventive antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC inventive antibody-drug conjugate
  • treatment of the aforementioned cancers by means of the compounds according to the invention includes both a treatment of the solid tumors and a treatment of metastatic or circulating lorms thereof.
  • treatment or “treat” is used conventionally in the context of this invention and means the care, care and care of a patient with the aim of combating, reducing, weakening or alleviating an illness or health deviation and improving living conditions improve that are affected by this disease, such as cancer.
  • Another object of the present invention is thus the use of the compounds according to the invention for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • the present invention furthermore relates to the use of the compounds according to the invention for the production of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • the present invention furthermore relates to the use of the compounds according to the invention in a process for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • the present invention furthermore relates to a method for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases, using an effective amount of at least one of the compounds according to the invention.
  • the compounds according to the invention can be used alone or, if required, in combination with one or more other pharmacologically active substances, as long as this combination does not lead to undesirable and unacceptable side effects.
  • the present invention therefore furthermore relates to medicaments comprising at least one of the compounds according to the invention and one or more further active compounds, in particular for the treatment and / or prevention of the aforementioned diseases.
  • the compounds of the present invention can be combined with known anti hyperproliferative, cytostatic, cytotoxic or immunotherapeutic substances for the treatment of cancer.
  • suitable combination active ingredients are: l3lI-chTNT, Abarelix, Abemaciclib, abiraterone, Acalabrutinib, aclarubicin, adalimumab, Ado-Trastuzumab Emtansine, Afatinib, Aflibercept, aldesleukin, Alectinib, Alemtuzumab, alendronic acid, alitretinoin, altretamine, amifostine, aminoglutethimide, hexyl 5-aminolevulinate, amrubicin, amsacrine , Anastrozole, ancestim, anethole dithiolethione, anetumab ravtansine, angiotensin II, antithrombin III, apalutamide, aprepit
  • binders e.g. antibodies
  • binders e.g. antibodies
  • targets OX-40, CD137 / 4-1BB, DR3, ID01 / ID02, LAG-3, CD40.
  • ADCs binder-drug conjugate according to the invention
  • the intrinsic mechanism of action of cytotoxic binder-drug conjugates involves the direct triggering of cell death of the tumor cells and thus the release of tumor antigens that can stimulate an immune response.
  • KSP inhibitor toxophore class induces markers of the so-called immunogenic cell death (ICD) in vitro.
  • ADCs binder-drug conjugates
  • Examples of therapeutic approaches to cancer immunotherapy include immunomodulatory monoclonal antibodies and low-molecular substances directed against targets from cancer immunotherapy, vaccines, CAR T cells, bi-specific T cell recruiting antibodies, oncolytic viruses, cell-based vaccination approaches ii)
  • Examples of selected Cancer immunotherapy targets suitable for immunomodulatory monoclonal antibodies include CTLA-4, PD-1 / PDL-1, OX-40, CD137, DR3, IDOL, ID02, TD02, LAG-3, TIM-3, CD40, ICOS / ICOSL, TIGIT, GITR / GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM / BTLA, CEACAM1, CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3 and TLR's.
  • ADCs binder-active substance conjugate according to the invention
  • the compounds according to the invention can also be used in combination with radiation therapy and / or a surgical intervention.
  • the compounds according to the invention can also be used in combination with radiation therapy and / or a surgical intervention.
  • the present invention further relates to medicaments which contain at least one compound according to the invention, usually together with one or more inert, non-toxic, pharmaceutically suitable auxiliaries, and to their use for the purposes mentioned above.
  • the compounds according to the invention can act systemically and / or locally. For this purpose, they can be applied in a suitable manner, such as, for example, parenterally, possibly by inhalation or as an implant or stent.
  • the compounds according to the invention can be administered in suitable administration forms.
  • Parenteral administration can be done by bypassing an absorption step (e.g. intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinally or intralumbally) or by switching on absorption (e.g. intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously or intraperitoneally).
  • Suitable forms of application for parenteral administration include: Injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions or lyophilisates. Parenteral administration, in particular intravenous administration, is preferred.
  • Exemplary synthesis routes to the exemplary embodiments are shown in the following diagrams as examples of the exemplary embodiments.
  • Xi, X 2 , X3, n and AK 2 have the meanings given in formula (I).
  • LLC-PK1 cells Lewis lung carcinoma pork kidney cell line
  • P-gp P-glycoprotein a transporter protein
  • Method 1 (LC-MSL instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC system; column: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 m 50 x 1 mm; eluent A: 1 1 water + 0.25 mL 99% formic acid, eluent B: 1 1 acetonitrile + 0.25 mL 99% formic acid; gradient: 0.0 min 90% A—> 1.2 min 5% A - 2.0 min 5% A oven: 50 ° C; flow: 0.40 mL / min; UV detection: 208 - 400 nm.
  • Method 6 (LC-MSL instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC system; column: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 m 50 x 1 mm; eluent A: 1 1 water + 0.25 mL 99% formic acid, eluent B: 1 1 acetonitrile + 0.25 mL 99% formic acid; gradient: 0.0 min 90% A—
  • Device type MS Thermo Scientific FT-MS; Device type UHPLC +: Thermo Scientific UltiMate 3000; Column: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 pm; Eluent A: 1 1 water + 0.01% formic acid; Eluent B: 1 1 acetonitrile + 0.01% formic acid; Gradient: 0.0 min 10% B 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Oven: 50 ° C; River: 0.90 mFmin; UV detection: 210 nm / Optimal Integration Path 210-300 nm.
  • the organic phase was extracted with water and then with sat. Washed NaCl solution.
  • the organic phase was dried over magnesium sulfate and the solvent evaporated in vacuo.
  • the residue was purified using silica gel (mobile phase: cyclohexane / ethyl acetate 100: 3). The solvents were evaporated in vacuo and the residue in
  • the title compound was obtained by coupling dibenzyl-D-glutamate, previously released from its p-toluenesulfonic acid salt by partitioning between ethyl acetate and 5% sodium hydrogen carbonate solution, with intermediate C61 in the presence of HATU and N, N-diisopropylethylamine and subsequent cleavage of the Teoc protective group using zinc chloride in trifluoroethanol.
  • the title compound was synthesized using classic peptide chemistry methods, starting with the HATU coupling of N - [(benzyloxy) carbonyl] -L-alanine with tert-butyl-N-methyl-L-alaninate hydrochloride salt in the presence of N, N- Diisopropylethylamine and subsequent deprotection of the carboxy group with Trifluoroacetic acid in DCM.
  • the title compound was prepared from commercially available 4-tert-butyl-L-aspartate by classic methods of peptide chemistry by coupling with N- [(benzyloxy) carbonyl] -L-alanyl-N-methyl-L-alanine (intermediate L116) in the presence of HATU, and finally by splitting off the tert-butyl ester protective group with TFA.
  • the title compound was first prepared from compound C110D by coupling with intermediate Ll 17 in the presence of HATU and N, N-diisopropylethylamine. In the next step, all protective groups were removed by hydrogenation for 1 hour over 10% palladium on activated carbon in DCM-methanol 1: 1 under normal hydrogen pressure at RT and the deprotected intermediate was then reacted with 1, 1 '- [(1, 5-dioxopentane-l, 5-diyl) bis (oxy)] dipyrrolidine-2,5-dione in the presence of N, N-diisopropylethylamine converted into the title compound.
  • the protein sequence (amino acid sequence) of the antibodies used was converted into a DNA sequence coding for the corresponding protein transferred according to methods known to the person skilled in the art and inserted into an expression vector suitable for transient mammalian cell culture (as described by Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems published by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007).
  • the antibodies for example TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514, TPP-14495 and TPP-10063, were produced in transient mammalian cell cultures as described by
  • the antibodies for example TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514, TPP-14495 and TPP 10063, were obtained from the cell culture supernatants.
  • the cell supernatants were clarified by centrifuging cells.
  • the cell supernatant was then purified by affinity chromatography on a MabSelect Sure (GE Healthcare) chromatography column.
  • the column was equillibrated in DPBS pH 7.4 (Sigma / Aldrich), the cell supernatant was applied and the column was washed with about 10 column volumes of DPBS pH 7.4 + 500 mM sodium chloride.
  • the antibodies were eluted in 50 mM sodium acetate pH 3.5 + 500 mM sodium chloride and then further purified by gel filtration chromatography on a Superdex 200 column (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4.
  • Commercially available antibodies were purified from the commercial products using standard chromatography methods (protein A chromatography, preparative gel filtration chromatography (SEC - size exclusion chromatography)).
  • the coupling reactions were usually carried out under argon.
  • AK 2 has the meaning Examples x: TPP-14495 - NH ⁇ 2
  • ⁇ 2 means the linkage with the carbonyl group
  • NH stands for the side chain amino group of a lysine residue of the antibody.
  • the reaction mixture was concentrated, for example by ultrafiltration, and then desalted and purified by means of chromatography, for example using a Sephadex® G-25. The elution took place for example with phosphate buffered saline (PBS). The solution was then sterile filtered and frozen. Alternatively, the conjugate can be lyophilized.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the binding ability of the binder to the target molecule was checked after coupling.
  • a variety of methods are known to the person skilled in the art, for example the affinity of the conjugate can be determined using ELISA technology or
  • BiAcore TM measurements can be checked.
  • the person skilled in the art can measure the conjugate concentration using common methods, for example for antibody conjugates by means of protein determination (see also Doronina et al .; Nature Biotechnol. 2003; 21: 778-784 and Polson et al., Blood 2007; 1102: 616-623) ,
  • the toxophore loading (designated in the tables as DAR, drug-to-antibody ratio) was determined as follows: The toxophore loading of the antibody (DAR) was independent of the
  • SEC-UV Linkage determined via UV absorption during size exclusion chromatography
  • 50 pL of the ADC solution were analyzed via SEC.
  • the analysis was carried out on an Agilent 1260 HPLC system with a detection at 280 nm and a detection at 260 nm.
  • the mobile phase consisted of PBS buffer (pH 7.2).
  • the drug load (DAR) was determined from this ratio as follows: Here e stands for the molar extinction coefficient of the antibody (Ab) and the drug (D). stands for the wavelength 260 nm, while 280 stands for 280 nm.
  • Preliminary concentration stands for the concentration that was only calculated using the absorption coefficient of the antibody
  • DARuv is the DAR of the respective ADC determined via SEC-UV
  • ⁇ Toxophor 280nm and ⁇ Antibody 280nm are the respective extinction coefficients of the Toxophor and the Antibody at 280 nm.
  • the DAR determination of lysine-linked ADCs was also carried out after mass spectrometric determination of the molecular weights of the individual conjugate species. This also allowed confirmation of the antibody and the coupled linker toxophore species.
  • the antibody conjugates were used in advance deglycosylated using PNGaseF, the sample acidified and after HPLC
  • Protein identification was done before coupling. In addition to determining the molecular weight after deglycosylation and / or denaturation, a tryptic digestion was carried out and, after denaturation, reduction and derivatization, the identity of the protein was confirmed using the proven tryptic peptides.
  • ADCs were disclosed in WO2015 / 096982 and in WO2016 / 096610 with various antibodies, such as cetuximab and trastuzumab, for example.
  • the precursor intermediate Fl 94 disclosed there was used for comparison purposes also implemented with the anti-CXCR5 antibodies TRR-14495, TPP-14499, TPP-14509 and TPP-14511.
  • the following ADCs were used for comparison purposes:
  • the biological activity of the compounds according to the invention can be demonstrated by the assays described below: a. C-la determination of the cytotoxic effect of the ADCs The cytototoxic effect of the ADCs is analyzed on different cell lines:
  • Rec-l human mantle cell lymphoma cells (B cell non-Hodgkin's Lymphoma) ATCC CRL-3004, standard medium: RPMI 1640 (Gibco, No. 21875-034) + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% FCS superior (Biochrom, No. S0615).) CXCR5 positive
  • HBL-1 human B cell lymphoma cells (Diffuse large B-cell lymphoma) ATT CRL-RRID (Resource Identification Initiative): CVCL 4213, first described in Abe et al. Cancer 61: 483-490 (1988), obtained from Prof. Lenz, University of Weg; Standard medium: RPMI 1640 (biochrom; # FGl2l5, stab. Glutamine) + 10% FCS (biochrom; # S04l5), cultivation analogous to Rec-l cells; CXCR5 positive
  • NCI-H292 human mucoepidermoid lung carcinoma cells, ATCC-CRL-1848, standard medium: RPMI 1640 (biochrome; # FGl2l5, stab. Glutamine) + 10% FCS (Sigma # F2442), TWEAKR-positive; EGFR-positive.
  • Oci-Ly-l human B-cell lymphoma cells (B cell non-Hodgkin's Lymphoma, assigned to germinal center B-cell like subtype), DSMZ ACC-722, standard medium: IMDM (Gibco No 31980-22) + 20% FCS superior (Biochrom, No. S0615); CXCR5 positive.
  • SU-DHL-6 human B cell lymphoma cells (B cell non-Hodgkin, described as diffuse, mixed small and large cell type; cell line) ATCC-CRL-2959, standard medium: RPMI-1640 high glucose (ATCC 30- 2001) with L-Glutamine, Hepes, sodium pyruvate + 10% FCS (FBS Gibco 10500-064 Heat inactivated, EU approved), CXCR5 positive.
  • the cells are cultivated using the standard method, such as the American Tissue Culture Collection (ATCC) or the Leibniz Institute DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganisms and cell cultures GmbH (DSMZ) specified for the respective cell lines.
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • DSMZ Leibniz Institute DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganisms and cell cultures GmbH
  • the cells were cultivated according to the standard method, using the growth media indicated under Cl.
  • the suspension cells were counted and sown in a 96-well culture plate with white soil (Perkin Elmer, NO 10775584) (in 75 pl / well, the following cell numbers per hole: Rec-l: 3000 cells / well, HBL-l and Oci- Ly-l: 6000 cells / hole) and incubated in an incubator at 37 ° C and 5% carbon dioxide.
  • the antibody-drug conjugates in 25 m ⁇ culture medium (four times concentrated) were added to the cells, so that final concentrations of the antibody-drug conjugates of 3 x 10 7 M to 3 x 10 12 M were reached on the cells (triplicates).
  • the cells were then incubated in an incubator at 37 ° C. and 5% carbon dioxide.
  • the cell vitality at the beginning of the drug treatment was determined using the Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega # G7573 and # G757l).
  • CCG Cell Titer Glow
  • IOOmI of the substrate was added per cell batch, the plates were then covered with aluminum foil, shaken for 2 minutes with the plate shaker at 180 rpm, left to stand on the laboratory bench for 8 minutes and then measured with a luminometer (Victor X2, Perkin Elmer).
  • the substrate detects the ATP content in the living cells, producing a luminescence signal, the level of which is directly proportional to the vitality of the cells.
  • the vitality in these cells was also determined using the Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay as described above. From the measured data, the IC50 of growth inhibition compared to untreated cells and at day 0 was calculated using the DRC (Dose Response Curve) analysis spreadsheet using a 4-parameter adjustment.
  • the DRC Analysis Spreadsheet is a biobook spreadsheet developed by Bayer Pharma AG and Bayer Business Services on the platform IDBS E-WorkBook Suite (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK). MTT assay
  • the cells were cultivated using the standard method, using the growth media specified under Cl.
  • the cells were detached with a solution of Accutase in PBS (Biochrom AG # L2143), pelleted, resuspended in culture medium, counted and sown in a 96-well culture plate with white soil (Costar # 3610) (NCI H292 : 2500 cells / well; in lOOpL total volume).
  • the cells were then incubated in an incubator at 37 ° C. and 5% carbon dioxide. A medium change was carried out after 48 hours.
  • the antibody-drug conjugates were then pipetted to the cells (triplicates) in 10 ml culture medium in concentrations of 10 5 M to 10 13 M before the mixture was incubated at 37 ° C. and 5% carbon dioxide in the incubator.
  • the suspension cells were counted and sown in a 96-well culture plate with white soil (Costar # 3610) (# 3610) (Rec-l: 3000 cells / well in a total volume of 100 m ⁇ ). After incubation for 6 hours in an incubator at 37 ° C. and 5% carbon dioxide, the medium was changed and the antibody-active substance conjugates or metabolites in 10 ml culture medium in concentrations of 10 5 M to 10 13 M were pipetted into the cells (triplicates) in 90 ml.
  • the batch was incubated in the incubator at 37 ° C. and 5% carbon dioxide. After 96 hours, cell proliferation was detected using the MTT assay (ATCC, Manassas, Virginia, USA, catalog No. 30-1010K). For this purpose, the MTT reagent was incubated with the cells for 4 hours before the cells were lysed overnight by adding the detergent. The dye formed was detected at 570 nm (Infinite M1000 pro, Tecan). The IC50 of growth inhibition was calculated from the measured data using the DRC (Dose Response Curve). The proliferation without test substance, but otherwise treated identically, is defined as a 100% value.
  • Table la shows the IC50 values of representative exemplary embodiments from these assays: Table la
  • the active data given relate to the exemplary embodiments described in the present experimental section with the specified drug / mAB ratios.
  • the values may differ for other drug / mAB ratios.
  • the IC50 values are mean values from several independent expressions or single values. The effect of the antibody-drug conjugates was selective versus the respective isotype control, which contained the corresponding linker and toxophore.
  • the ADCs according to the invention generally show a significantly improved cytotoxic potency compared to the corresponding reference examples.
  • the motor domain of the human kinesin spindle protein KSP / Eg5 (tebu-bio / Cytoskeleton Ine, No. 027EG01-XL) was stabilized in a concentration of 10nM with 50pg / ml taxol (Sigma No. T7191-5MG) stabilized microtubules (bovine or porcine, from tebu-bio / Cytoskeleton Ine) for 5 min at RT in l5mM PIPES, pH 6.8 (5mM MgCb and lOmM DTT, from Sigma). The freshly prepared mixture was aliquoted into a 384 MTP (Coming).
  • the ICso values are mean values from two independent experiments. The sample not treated with inhibitors served as a 100% control.
  • Table 2 summarizes the IC50 values of representative exemplary embodiments from the described assay and the corresponding cytotoxic data (MTT assay): table 2
  • the Legumain assay was performed with recombinant human enzyme.
  • the rhLegumain enzyme solution (Catalog # 2199-CY, R&D Systems) was diluted to the desired concentration in 50mM Na acetate buffer / 100mM NaCl, pEM.O and preincubated at 37 ° C for 2 hours. rhLegumain was then adjusted to a final concentration of lng / pL in 50mM MES buffer, 250mM NaCl, pH 5.0.
  • a batch was made in a microreaction vessel (0.5 ml, from Eppendorf).
  • the substrate solution was adjusted to the desired concentration (twice concentrated) with 50mM MES buffer, 250mM NaCl, pH 5.0.
  • 250 pL of the legumain solution were initially introduced and the enzyme reaction was started by adding 250 pL of the substrate solution (final concentration simply; 3 mM).
  • 50pL samples were taken at different times. This sample was taken immediately treated with 1 OOiiL ice-cold methanol to stop the enzymatic reaction and then freeze at -20 ° C. The selected times for sampling were after 0.5h, 1h, 3h and 24h. The samples were then examined using RP-HPLC analysis and LC-MS analysis. The determination of the released toxophore made it possible to determine the half-life ti / 2 of the enzymatic reaction.
  • model compounds A were prepared as substrates in the legumain assay.
  • the dye load of the antibodies examined here and the isotype control were of a comparable order of magnitude. It was tested in cell binding assays that the coupling did not lead to any change in the affinity of the antibodies.
  • the antigen to be examined is expressed by hematopoietic suspension cells, which is why the internalization was investigated in a FACS-based internalization assay.
  • the kinetic evaluation was carried out by measuring the fluorescence intensity, and the evaluation was carried out using the guavaSoft 2.6 software (Millipore). A significant and specific internalization could be detected in different cells for the target-specific antibodies described here.
  • the internalization of the antibodies TPP-14495, TPP 14499, TRR-14505, TPP-14509, TPP-14511, TPP-14514 was improved on Rec-1 and SU-DHL-6 cells compared to TPP-10063 and 40C01 ( TPP-14495 showed no improvement in SU-DHL-6).
  • the isotype controls showed no internalization.
  • Table 3 summarizes the determined fluorescence intensities (MFI) for the CXCR5-high expressing Rec-1 cell line and the moderate CXCR5 expressing SU-DHL6 cell line. Table 3
  • the cell permeability of a substance can be investigated by means of in v / Yr assay in a flux assay using Caco-2 cells [MD Troutman and DR Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. For this, the cells were cultivated on 24-hole filter plates for 15-16 days. To determine the permeation, the test substance in question was added to the cells either apically (A) or basally (B) in a HEPES buffer and incubated for 2 h. After 0 h and after 2 h, samples were taken from the cis and trans compartments.
  • the samples were separated by means of HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Germany) using reverse phase columns.
  • HPLC HPLC
  • the HPLC system was connected to a triple quadropole mass spectrometer API 4000 (AB SCIEX GmbH, Darmstadt, Germany) via a Turbo Ion Spray Interface.
  • the permeability was assessed using a P app value, which was determined using the method described by Schwab et al. published formula was calculated [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)].
  • a substance was classified as actively transported if the ratio of P app (BA) to P app (AB) (efflux ratio) was> 2 or ⁇ 0.5.
  • toxophores that are released intracellularly are the permeability from B to A [P app (BA)] and the ratio of P app (BA) to P app (A- B) (efflux ratio): the lower these Permeability is, the slower the active and passive transport processes of the substance through the monolayer of Caco-2 cells. so that the substance remains in the cell longer after intracellular release.
  • This intracellular remaining of the metabollite increases the probability of an interaction with the biochemical target (here: kinesin spindle protein, KSP / Eg5), which leads to an improved cytotoxic effect.
  • the metabolite Ml which can be formed from the binder-active substance conjugates according to the invention, shows both a significantly reduced transport from the cell and a reduced efflux ratio compared to the reference metabolite R1M, which is formed from the binder-active substance conjugates of the reference examples can be.
  • P-glycoprotein P-glycoprotein
  • Many tumor cells express transporter proteins for active substances, which is often associated with a development of resistance to cytostatics. Substances that are not substrates of such transporter proteins such as P-glycoprotein (P-gp) or BCRP could thus show an improved activity profile.
  • the substrate properties of a substance for P-gp were determined by means of a flux assay using LLC-PK1 cells that overexpress P-gp (L-MDR1 cells) [AH Schinkel et al., J. Clin , Invest. 96, 1698-1705 (1995)].
  • the LLC-PK1 or L-MDRI cells were cultivated on 96-well filter plates for 3-4 days.
  • the respective test substance was applied to the cells either apically (A) or basally (B) in a HEPES buffer either alone or in the presence of an inhibitor (such as ivermectin or verapamil) and incubated for 2 h. After 0 h and after 2 h, samples were taken from the cis and trans compartments. The samples were separated by HPLC using reverse phase columns. The HPLC system was coupled to a triple quadropole mass spectrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Germany) via a Turbo Ion Spray Interface.
  • the permeability was assessed using a P app value, which was determined using the method described by Schwab et al. published formula was calculated [D. Schwab et al., J. Med. Chern. 46, 1716-1725 (2003)].
  • a substance was classified as a P-gp substrate when the efflux ratio P app (BA) to P app (AB)> 2.
  • the efflux ratios in L-MDR1 and LLC-PK1 cells or the efflux ratio in the presence or absence of an inhibitor can be compared with one another. If these values differ by more than a factor of 2, the substance in question is a P-gp substrate.
  • the pharmacokinetic parameters of Examples 1x10063, lx- 14495, lx- 14499, lx- 14509 and 1c-14511 are determined in male Wister rats.
  • the substance to be examined is administered intravenously as a solution.
  • a silicone catheter is placed in the right jugular vein before taking the substance. The operation is carried out at least one day before the attempt under isoflurane anesthesia.
  • blood is taken from the animals over a period of up to 168 hours.
  • the samples are placed in EDTA tubes centrifuged and if necessary stored at -20 ° C until further processing.
  • the pharmacokinetic parameters of the ADCs such as clearance (CL), area under the curve (AUC) and terminal half-life (ti / 2 ) are calculated from the determined plasma concentration-time courses.
  • the compounds were quantified using a suitable ELISA (enzyme-linked immosorbent assay) method.
  • Table 5 summarizes the pharmacokinetic parameters of Examples lx-10063, lx-14495, 1c-14499, 1c-14509 and lx-14511.
  • the antibody part of the ADCs was determined by means of ligand binding assay (ELISA) as the total IgG concentration in plasma samples.
  • the sandwich ELISA format was used. This ELISA is suitable for determining the concentration of ADCs in plasma and tumor samples.
  • the ELISA plates were coated with goat anti-human IgG-Fc antibodies. After incubation with the sample, the plates were washed and incubated with a detector conjugate of anti-human-IgG (H + L) antibody of the monkey and horseradish peroxidase (HRP). After a further washing step, the HRP substrate OPD was added and the color development was monitored via the absorption at 490 nm. Standard samples with a known IgG concentration were fitted using the 4-parameter equation. Within the lower (LLOQ) and upper (ULOQ) The unknown concentrations were determined by means of interpolation.
  • Immunization studies with immunoconjugates are carried out to analyze intracellularly formed metabolites.
  • suitable tumor cells (3xl0 5 / well) are sown in 6-well plates and incubated overnight (37 ° C, 5% C0 2 ).
  • Treatment with 10 pg / rn L (66 nM) of the substance to be examined is carried out.
  • the internalization was carried out at 37 ° C and 5% CO2.
  • cell samples are taken for further analysis.
  • the supernatants (approx. 5 mL) are harvested and stored after centrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) at -80 ° C.
  • the cells are washed with PBS, detached with Accutase and the cell number is determined. After washing again, a defined cell number (2xl0 5 ) is mixed with 100 mL lysis buffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1) and with constant shaking (thermomixer, l5min, 4 ° C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat. No. 0030 108.116) After the incubation, the lysate is centrifuged (10min, 4 ° C, 12000g, eppendorf 5415R) and the supernatant is harvested, and the supernatant obtained is stored at -80 ° C. All samples are then analyzed as follows.
  • the gel reagent contains an internal standard (ISTD) in a suitable concentration (usually in the range of 20-100 pg / L). After centrifugation at 188 lg for 10 minutes, the supernatant is transferred to an autosampler vial, filled with 300 pL of a buffer matched to the eluent and shaken again and centrifuged at 188 lg for 10 min. The cell lysate and supernatant samples are finally measured on the triple-quadrupole mass spectrometer API6500 from AB SCIEX Deutschland GmbH coupled with an HPLC.
  • ISD internal standard
  • Quality controls for the validity check contain 4 and 40 pg / L.
  • the plasma and tumor concentrations of the ADC as well as potentially occurring metabolites can be measured and the pharmacokinetic parameters such as clearance (CL), area under the curve (AUC) and half-life (ti / 2 ) can be calculated become.
  • CL clearance
  • AUC area under the curve
  • ti / 2 half-life
  • the compounds in plasma, tumor, liver and kidney are measured after precipitation of the proteins with usually methanol by high-pressure liquid chromatography (HPLC) coupled to a triple quadrupole mass spectrometer (MS).
  • HPLC high-pressure liquid chromatography
  • MS triple quadrupole mass spectrometer
  • precipitation reagent usually methanol
  • the precipitation reagent contains an internal standard (ISTD) in a suitable concentration (usually in the range of 20-100 pg / L). After centrifugation at 188 lg for 10 minutes, the supernatant becomes a
  • the extraction buffer contains 50 mL tissue protein extraction reagent (Pierce, Rockford, IL), two pellet complete protease inhibitor cocktails (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) and Phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma, St. Louis, MO) in a final concentration of 1 mM.
  • tissue protein extraction reagent Pieris, IL-1
  • two pellet complete protease inhibitor cocktails Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
  • Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma, St. Louis, MO
  • the lysis and homogenization program of the Prescellys 24 Lysis and Homogenization device (www.prescellys.com). The homogenized samples are left overnight at 4 ° C.
  • 50 pL of the homogenate are transferred to an autosampler vial and filled with 150 pL of methanol including ISTD and shaken for 10 seconds and then left to stand for 5 minutes. After adding 300 pL ammonium acetate buffer (pH6.8) and shaking briefly, the sample is centrifuged at 188 lg.
  • the detection limit is between 1 and 20 pg / L depending on the sample type or tissue type.
  • the plasma and matrix samples are then measured on the triple-quadrupole mass spectrometer API4500 from AB SCIEX GmbH coupled with an HPLC. Quality controls for the validity check contain 4, 40 and 400 pg / L.
  • the effectiveness of the conjugates according to the invention was tested in vivo, for example using xenograft models.
  • the person skilled in the art knows methods in the prior art which can be used to test the effectiveness of the compounds according to the invention (see, for example, WO 2005/081711; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15; 69 (6): 2358-64).
  • a tumor cell line which expresses the target molecule of the binder was inoculated into rodents (eg mice).
  • rodents eg mice
  • an conjugate according to the invention an isotype-antibody control conjugate or a control antibody or isotonic saline solution was applied to the inoculated animals. The application was made once or more. After an incubation period of several days, the tumor size was compared in the conjugate-treated animals and the Control group determined. The conjugate-treated animals showed a smaller tumor size.
  • Human tumor cells that express the antigen for the antibody-drug conjugate are inoculated subcutaneously into the flank of immunosuppressed mice, for example NMRi Nude or SCID mice. 1-10 million cells are detached from the cell culture, centrifuged and resuspended with medium or Matrigel. The cell suspension is injected under the skin of the mouse.
  • a tumor grows within a few days. Treatment begins after the tumor has been established, approximately with a tumor size of 100 mm 3 . In order to investigate the effect on larger tumors, the treatment can also only be started with a tumor size of 200-500 mm 3 .
  • Treatment with ADCs is via the intravenous (IV) route into the tail vein of the mouse.
  • the ADC is applied with a volume of 5-10 mL / kg.
  • the treatment regimen is based on the pharmacokinetics of the antibody.
  • the conjugates according to the invention are used as standard once a week for 1-3 weeks. For a timely assessment, a schedule with a one-time treatment can also be suitable. However, the treatment can be continued or a second cycle with three treatment days can follow at a later time.
  • a group as a control group is only treated with the buffer according to the same scheme.
  • the tumor volume is regularly measured with a caliper in two dimensions (length / width).
  • the tumor volume is determined using (length x width 2 ) / 2.
  • the tumors can be removed and weighed.
  • the response rate is evaluated as an additional outcome endpoint. It corresponds to the number of mice with complete and partial tumor regressions after treatment (tumors at least 30% smaller than the size at the start of treatment on a specific day).
  • the tumor cells (eg REC-1, OCI-LY1) were inoculated subcutaneously into the flank of female SCID mice (Janvier). With a mean tumor size / group of ⁇ 280 mm 3 , treatment was carried out intravenously with the CXCR5-ADCs. After the treatment, tumor growth was followed up if necessary.

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Binder-Wirkstoff-Konjugate mit verbesserten Eigenschaften, aktive Metabolite dieser ADCs sowie deren Verfahren zur Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit CXCR5 Antikörpern und ausgewählten KSP-Inhibitoren. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Konjugate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen.

Description

Gegen CXCR5 gerichtete Binder-Wirkstoff-Konjugate mit enzymatisch spaltbaren Linkern und verbessertem Wirkungsprofil
Einleitung und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft neuartige Binder-Wirkstoff-Konjugate, wie zum Beispiel Antibody- Drug-Conjugates (ADCs), mit verbesserten Eigenschaften, aktive Metabolite dieser Binder-Wirkstoff-Konjugate sowie deren Verfahren zur Herstellung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Konjugate zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkran kungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen. Der Binder ist erfindungsgemäß vorzugsweise ein Antikörper.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.
Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radio therapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.
Konjugate von Binderproteinen mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogenannter„antibody drug conjugates“ (ADCs), in wel- chen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem cytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das cytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter cytotoxisch wirksamer Metabolit ff eigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5- 13 (2010)]. So beschreibt W02012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker an einen Antikörper geknüpft ist. Als mögliche Toxophore werden in W02012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921, SB 715992 (Ispinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt.
Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KIL11) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Lunktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibierung von KSP führt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zellgängigen KSP-Inhibitors, Monastrol, haben sich KSP- Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B. W02006/044825; W02005/051922; W02006/060737; W003/060064; W003/040979 und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase aktiv ist, müssen KSP-Inhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen. In der W02014/151030 werden ADCs mit bestimmten KSP-Inhibitoren offenbart. Weiterhin sind aus der W02006/002236, der W02007/021794 und der W02008/086122 ADCs mit Imidazol KSP-Inhibitoren bekannt, die sich strukturell von den hier beschriebenen KSP-Inhibitoren der ADCs unterscheiden.
Weiterhin sind aus der US7,662,58l Bl Imidazol- bzw. Benzimidazolderivate als Wirkstoffe bekannt.
Auch werden in der W02004/100873 Imidazol-, Oxazol und Diazepinderivate als Wirkstoffe beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ADCs mit Pyrrol und Pyrazol KSP-Inhibitoren.
In der WO2015/096982 und in der WO2016/096610 werden ADCs mit KSP-Inhibitoren offenbart, die auch enzymatisch spaltbare Linker enthalten und ein entsprechendes Wirkungsprofil aufweisen. Es ist jedoch wünschenswert, ein deutlich besseres Wirkungsprofil zu erhalten und/oder verbesserte Eigenschaften aufweisen.
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, neue Binder-Wirkstoff-Konjugate, insbesondere ADCs mit KSP-Inhibitoren und enzymatisch spaltbaren Linkem bereitzustellen, die ein verbessertes Wirkungsprofil und/oder verbesserte Eigenschaften aufweisen.
Legumain ist eine Tumor-assoziierte Asparaginyl-Endopeptidase (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) und wurde zur Prozessierung von Prodrugs von kleinen cytotoxischen Molekülen wie zum Beispiel unter anderem von Doxorubicin und Etoposid Derivaten genutzt (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern et al. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al.
ChemMedChem 2011, 6, 54).
Andere lysosomale Enzyme sind beispielsweise Cathepsin oder Glycosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen, die auch zur Freisetzung der aktiven Wirkstoffe durch enzymatische Spaltung von Prodrugs genutzt wurden. Enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere 2-8-Oligopeptidgruppen oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Leiters 8 (1998) 3341-3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin- Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).
Zusammenfassung der Erfindung
Im Stand der Technik sind verschiedene Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) mit enzymatisch spaltbaren Linkem beschrieben, die aber ein verbesserungswürdiges Wirkprofil aufweisen. So wäre es u. a. wünschenswert, ADCs zur Verfügung zu haben, die eine breitere Wirksamkeit auf verschiedenen Zellen zeigen. Darüber hinaus sollten solche ADCs auch eine gute Wirksamkeit aufweisen, bei gleichzeitig geringer
Wirkstoffkonzentration und verbesserten Eigenschaften.
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung wirksamere Verbindungen bereitzustellen, die nach Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine lang anhaltende apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sind. Hierbei spielt zum einen das Profil der aus den ADCs intrazellulär freigesetzten
Metaboliten eine entscheidende Rolle. Häufig sind die aus ADCs gebildeten Metabolite Substrate von Efflux-Pumpen und/oder weisen eine hohe Permeabilität durch Zellmembranen auf. Beide Phänomene können zu einer kurzen Verweildauer und so zu einer suboptimalen apoptotischen Wirkung in der Tumorzelle beitragen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Binder-Wirkstoff-Konjugate, insbesondere ADCs mit einer spezifischen Wirkstoff (Toxophor)-Linker- Antikörper-
Zusammensetzung, die ein besonders interessantes Wirkprofil in Bezug auf Wirkstärke und Wirkbreite aufweisen. Um die Tumorselektivität von ADCs und ihrer Metabolite weiter zu verbessern, wurden die ADCs mit Peptidlinkem versehen, die durch lysosomale Tumor-assoziierte Enzyme, wie beispielsweise Legumain gespalten werden können und somit den Wirkstoff bzw. den Metabolit (Toxophor) freisetzen.
Geeignete Antikörper sind z.B. Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe der CXCR5 Antikörper. Die Tumorselektivität wird somit aber nicht nur durch die Wahl des Antikörpers, sondern zusätzlich durch die enzymatische Spaltung des Peptidderivates, z.B. durch Tumor assoziierte Enzyme wie beispielsweise Legumain bestimmt. Die aus den erfindungsgemäßen ADCs in den Tumorzellen freigesetzten Metabolite zeichnen sich weiterhin durch ein besonders interessantes Eigenschaftsprofil aus. Sie zeigen einen geringen Efflux aus der Tumorzelle und führen zu hohen Expositionen des Wirkstoffes in Tumoren. Somit wird eine hohe Wirkung in der Tumorzelle erzielt, wohingegen bedingt durch die schlechte Permeabilität nur eine geringe systemische cytotoxische Wirkung vorliegt, was eine geringere off-Target Toxizität mit sich bringt. Die in den erfindungsgemäßen ADCs enthaltenen Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren besitzen eine für die Wirkung essentielle Aminogruppe. Durch Modifizierung dieser Aminogruppe mit Peptidderivaten wird die Wirkung gegenüber dem Kinesin- Spindelprotein blockiert und damit auch die Entfaltung einer cytotoxischen Wirkung inhibiert. Diese Peptidderivate können auch Bestandteile des Linkers zum Antikörper sein. Kann dieser Peptidrest bzw. der Peptidlinker jedoch durch Tumor-assoziierte Enzyme wie beispielweise Legumain vom Wirkstoff abgespalten werden, so lässt sich die Wirkung gezielt im Tumorgewebe wieder herstellen. Das besondere Eigenschaftsprofil der im Tumor gebildeten Metabolite wird durch eine weitere Modifizierung des Kinesin- Spindelprotein Inhibitors an einer anderen Position als der Aminogruppe im Molekül gewährleistet, die jedoch die hohe Potenz am Target nicht beeinträchtigt.
Weiterhin ermöglichen die erfindungsgemäßen ADCs eine hohe Beladung des Antikörpers (genannt DAR, Drug-to-Antibody Ratio), die sich überraschenderweise nicht negativ auf das physikochemische und pharmakokinetische Verhalten der ADCs im Vergleich zum nicht konjugierten Antikörper auswirkt. Es wurde nun überraschend gefunden, dass Antikörper-Wirkstoff-Konjugate der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000007_0001
(I), in der
Xi für N,
x2 für N und
x3 für C steht;
oder
Xi für CH oder CF,
X2 für C und
X3 für N steht;
oder
Xi für NH,
x2 für C und X3 für C steht;
oder
Xi für CH,
X2 für N und
X3 für C steht.
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)0H oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht, M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)2_8 -C(=0 )-### oder #-C(=0)- (CH2)3-C(=0 )-###, steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht, AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate, die überlegene Eigenschaften gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Konjugaten aufweisen.
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der Xi für CH,
X2 für C und
X3 für N steht;
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht, R2 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)0H oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### oder #-C(=0)- (CH2)3-C(=0 )-###, steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Fysin-Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Besonders bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der Xi für CH, X2 für C und
X3 für N steht;
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Ganz besonders bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
Xi für CH,
X2 für C und
X3 für N steht;
R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht, R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH )-NH-C(=0)-(CH2) -C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht, AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Insbesondere bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK2 für einen Antikörper oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht, # für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Ausgewählt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß der Struktur
Figure imgf000012_0001
in der
AK2 für einen Antikörper steht, der über eine N-Atom einer Lysin-
Seitenkette gebunden ist und
n 1 bis 50 ist, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Dovon bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate in denen n 1 bis 20 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Auch sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate bevorzugt, in denen
n 1 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Ferner sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate bevorzugt, in denen
n 4 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der oben genannten Formeln in der AK2 für einen Binder, der spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet, steht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle intemalisiert. Vorzugsweise ist der Binder ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen CXCR5
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist der Binder AK2 ein anti-CXCR5 Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen,
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK2 für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP- 10063, TPP-14511, TPP- 14509, TPP- 14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP-14495, oder ein für ein Antigen bindendes Fragment von diesen steht. Insbesondere bevorzugt sind solche Binder- Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK2 für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP- 14495, oder ein für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen steht. Beschreibung der Figuren
Fig. 1: Sequenzlisting von Sequenzen von Antikörpern für Binder-Wirkstoff- Konjugate und von Sequenzen der Zielproteine.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate eines Binders oder Derivats hiervon mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen bereit, wobei das Wirkstoffmolekül ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-Inhibitor) ist.
Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Binder, erfindungsgemäß verwendbare KSP-Inhibitoren hiervon sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten KSP-Inhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkem verwendet werden.
Besonders bevorzugte KSP-Inhibitor-Koniugate (Binder- Wirkstoff-Konjugate)
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden KSP-Inhibitor-Konjugate, wobei AK2 für Binder bzw. ein Derivat hiervon (vorzugsweise für einen Antikörper), und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 8, besonders bevorzugt 4 bis 8 steht. AK2; steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Lysinrest an den KSP-Inhibitor gebunden ist. Als Binder oder Antikörper werden hierbei vorzugswiese die in der Beschreibung als bevorzugt beschriebenen Binder bzw. Antikörper verwendet.
Besonders bevorzugt ist folgendes Binder-Wirkstoff-Konjugat:
Figure imgf000015_0001
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK2für einen Binder, der spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet, steht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle intemalisiert.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen, insbesondere CXCR5.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist der Binder AK2 ein anti-CXCR5 Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen.
Bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der genannten Formeln in der AK2 für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP- 10063, TPP-14511, TPP- 14509, TPP- 14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP-14495, oder ein für ein Antigen bindendes Fragment von diesen steht. Insbesondere bevorzugt sind solche Binder- Wirkstoff- Konjugate der genannten Formeln in der AK2 für einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP- 14495 oder ein für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen steht. Demgemäß besonders bevorzugt sind solche Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), in der
R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK2 für einen anti-CXCR5 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP- 14495, oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
KSP-Inhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugate
Die erfindungsgemäßen Konjugate werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP-Inhibitor hiervon mit einem Linker versehen wird. Das so erhaltene Intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt.
Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat und die anschließende Kupplung mit dem Antikörper kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:
Figure imgf000017_0001
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, R1, R2, R3 und AK2 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen und R4 steht hier für Methyl und m ist 0 oder 1.
Die Synthese des Bausteins A wird in der WO2015/096982 beschrieben. Die Peptidderivate B und C wurden nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Die Intermediate C und D wurden mittels HATU in DMF in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin bei RT gekuppelt. Anschließend wurden hydrogeno lytisch über 10% Palladium auf Aktivkohle sowohl die Benzyloxycarbonylschutzgruppe als auch die Benzylester abgespalten. Das vollständig entschützte Intermediat wurde dann mit 1,1'- [(l,5-Dioxopentan-l,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in DMF in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin bei RT zum ADC-Precursor Molekül E umgesetzt. Dieser Aktivester wurde dann wie in Kapitel B-4 beschrieben mit den entsprechenden Antikörpern gekuppelt.
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, R1, R2, R3 und AK2 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen und R4 steht hier für Methyl und n ist 1.
In analoger Verfahrensweise können auch solche Verbindungen hergestellt werden, bei denen m für 0 steht.
Binder Der Begriff„Binder“ wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches an ein Zielmolekül, das auf einer bestimmten, mit dem Binder-Wirkstoffkonjugat zu adressierenden Zielzellen-Population vorhanden ist, bindet. Der Begriff Binder ist in seiner breitesten Auslegung zu verstehen und umfasst z.B. auch Lektine, Proteine die bestimmte Zuckerketten binden können, oder Phospholipid-bindende Proteine. Solche Binder umfassen beispielsweise hochmolekulare Proteine (Bindeproteine), Polypeptide oder Peptide (Bindepeptide), nicht-peptidische (z.B. Aptamere (US5,270,l63) Übersichtsartikel von Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), oder Vitamine) und alle anderen zellbindenden Moleküle oder Substanzen. Bindeproteine sind z.B. Antikörper und Antikörperfragmente oder Antikörpermimetika wie z.B. Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (Übersichtsartikel von Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Bindepeptide sind z.B. Liganden eines Liganden-Rezeptorspaares, wie z.B.
VEGF des Liganden-Rezeptorpaares VEGF/KDR, wie Transferrin des Liganden- Rezeptorpaares Transferrin/Transferrin-Rezeptor oder Cytokine/Cytokin-Rezeptor, wie TNFalpha des Liganden-Rezeptorpaares TNF alpha/TNF alpha Rezeptor.
Der Binder kann ein Bindeprotein sein. Bevorzugte Ausführungsformen der Binder sind ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum.
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder und insbesondere Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.
Ein„Zielmolekül“ wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches in der Zielzellenpopulation vorhanden ist, und kann ein Protein (z.B. ein Rezeptor eines Wachstumsfaktors) oder ein nicht-peptidisches Molekül sein (z.B. ein Zucker oder Phospholipid). Bevorzugt ist es ein Rezeptor oder ein Antigen.
Der Begriff „extrazelluläres“ Zielmolekül beschreibt ein an die Zelle gebundenes Zielmolekül, welches sich auf der Außenseite einer Zelle befindet oder den Teil eines Zielmoleküls, welcher sich auf der Außenseite einer Zelle befindet, d.h. ein Binder kann an einer intakten Zelle an sein extrazelluläres Zielmolekül binden. Ein extrazelluläres Zielmolekül kann in der Zellmembran verankert sein oder Bestandteil der Zellmembran sein. Der Fachmann kennt Verfahren, um extrazelluläre Zielmoleküle zu identifizieren. Für Proteine kann dies über eine Bestimmung der Transmembrandomäne(n) und die Orientierung des Proteins in der Membran geschehen. Diese Angaben sind in der Regel in Proteindatenbanken (z.B. SwissProt) hinterlegt.
Der Begriff „Krebs-Zielmolekül“ beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein „selektives Krebs-Zielmolekül“). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Der Binder kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfung des Binders kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Binders, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer Ausführungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Binders), Sauerstoff (erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Binders) und Stickstoff (in einer Ausführungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgruppe des Binders). Diese Heteroatome können im natürlichen Binder vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Binders mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluss auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluss auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül.
Der Begriff “Antikörper” wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CH1, CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region“, abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region“, abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein. Der Begriff„monoklonaler“ Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren.
Der Begriff„intakter“ Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden, und kann auch aglykosyliert sein.
Der Begriff „modifizierter intakter“ Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32). Mit„Aminosäuremodifikation“ oder„Mutation“ ist hier eine Aminosäuresubstitution, - insertion, und/oder eine -deletion in einer Polypeptidsequenz gemeint. Die bevorzugte Aminosäuremodifikation ist hier eine Substitution. Mit„Aminosäuresubstitution“ oder „Substitution“ ist hier ein Austausch einer Aminosäure an einer gegebenen Position in einer Proteinsequenz durch eine andere Aminosäure gemeint. Zum Beispiel beschreibt die Substitution Y50W eine Variante eines parentalen Polypeptids, in welcher das Tyrosin an Position 50 durch ein Tryptophan ausgetauscht ist. Eine„Variante“ von einem Polypeptid beschreibt ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die substanziell identisch zu einem Referenzpolypeptid ist, typischerweise einem nativen oder „parentalen“ Polypeptid. Die Polypeptidvariante kann eine oder mehrere Aminosäureaustauche, - deletionen, und/oder -insertionen an bestimmten Positionen in der nativen Aminosäuresequenz aufweisen.
Der Begriff „humaner“ Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein„synthetischer“ humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als Ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden. Solche„humanen“ und„synthetischen“ Antikörper beinhalten auch aglykosylierte Varianten, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGaseF oder durch Mutation von N297 (kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen anderen Aminosäure hergestellt wurden.
Der Begriff „humanisierter“ oder„chimärer“ Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht-humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt. Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In manchen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefugt wurden. Bei chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert. Solche „humanisierten“ und„Chimären“ Antikörper beinhalten auch aglykosylierte Varianten, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGaseF oder durch Mutation von N297 (kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen anderen Aminosäure hergestellt wurden.
Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette / Domäne (VL) und 31 - 35 (CDR1), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette / Domäne (VH) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) und 91 -96 (CDR3) der variablen leichetn Kette (VL) und 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette (VH) Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure- Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/d], [epsilon/ ], [gamma/g] und [my/m] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt. Der Begriff„funktionales Fragment“ oder„antigen-bindendes Antikörperfragment“ eines Antikörpers/Immunoglobulins ist definiert als ein Fragment eines Antikörpers/Immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen-Bindedomänen des Antikörpers/Immunoglobulins noch umfasst. Die„Antigen- Bindedomäne“ eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework“ oder die„Gerüst“ Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen-Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 111 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 113 der VH (Nummerierung nach W097/08320).
„Funktionale Fragmente“ oder„antigen-bindende Antikörperfragmente“ der Erfindung umfassen nicht abschließend Fab, Fab’, F(ab’)2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), lineare Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als „multi-spezifische“ oder „multi- funktionale“ sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische Antikörper können spezifisch für unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab’)2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chl und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder komplett verhindert werden kann.
„Epitope“ bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3 -dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf. „Funktionale Fragmente“ oder„antigen-bindende Antikörperfragmente“ können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen- bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397).
Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; l3(l):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den
Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich.
Ein „isolierter“ Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV-Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Außerdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden). Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt. Der Begriff „spezifische Bindung“ oder „bindet spezifisch“ bezieht sich auf einen Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10 7 M (als Kd- Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als l0 7 M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nicht spezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders schließt nicht aus, dass der Antikörpers oder Binder an mehrere Antigene/Zielmoleküle bindet (z.B. Orthologe aus verschiedenen Spezies). Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens l0 7 M (als Kd- Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10-7 M), vorzugsweise von mindestens 10 ^ M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10 9 M bis l0 H M auf. Die Kd-Werte können durch z.B.
Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10 ^ M auf 10 7 M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweist als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden). Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft-Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Cynomolgus und Langschwanzmakaken. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Affen-Zielprotein (z. B. Cynomolgus) sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet. Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff „Krebs- Zielmolekül“ beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein „selektives Krebs-Zielmolekül“). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Antikörper, welche spezifisch gegen ein Antigen, wie z.B. ein Krebszell- Antigen, gerichtet sind, können vom Durchschnitts fachmann mittels ihm bekannter Verfahren hergestellt werden (wie z.B. rekombinante Expression) oder kommerziell erworben werden (wie z.B. von Merck KGaA, Deustchland). Beispiele bekannter kommerziell erhältlicher Antikörper in der Krebstherapie sind Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) und Herceptin® (Trastuzumab, Genentech). Trastuzumab ist ein rekombinanter humanisierter monokloaler Antikörper vom IgGlkappa Typ, welcher mit hoher Affinität in einem Zell-basierten Assay (Kd = 5 nM) die extrazelluläre Domäne des humanen epidermalen Wachstumsrezeptors bindet. Der Antikörper wird rekombinant in CHO-Zellen hergestellt. Alle diese Antikörper können auch als aglykosylierte Varianten dieser Antikörper hergestellt werden, entweder durch Deglycosylierung durch PNGase F oder durch Mutation von N297 (Kabat Nummerierung) der schweren Kette zu einer beliebigen Aminosäure. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein selektives Krebs-
Zielmolekül.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein Protein. Krebs-Zielmoleküle sind dem Fachmann bekannt.
In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das Krebs-Zielmolekül CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI-Gene ID 643, NCBI -Referenzsequenz:
NP 001707.1).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle intemalisiert. Dies bewirkt, dass das Binder-Wirkstoffkonjugat, welches ein Immunokonjugat oder ein ADC sein kann, von der Zielzelle aufgenommen wird. Anschließend wird der Binder vorzugsweise intrazellulär, bevorzugt lysosomal, prozessiert.
In einer Ausführungsform ist der Binder ein Bindeprotein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum.
Bevorzugte Antikörpermimetika sind Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, oder Nanobodies. Bevorzugte multispezifischer Antikörper sind bispezifische und trispezifische Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper oder ein antigen bindendes Antikörperfragment, weiter bevorzugt ist ein isolierter Antikörper oder ein isoliertes antigen-bindendes Antikörperfragment.
Bevorzugte antigen-bindende Antikörperfragmente sind Fab, Fab’, F(ab’)2 und Fv Fragmente, Diabodies, DAbs, lineare Antikörper und scFv. Besonders bevorzugt sind Fab, Diabodies und scFv.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon. Weiter besonders bevorzugt sind humane, humanisierte oder chimäre Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon.
Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten sind in der WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22 „Antibodies“). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK-Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 der W02007/070538 und im Detail in Queen, et al.,.Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033,1989 oder in der WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al, (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Wilhams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in der WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines IgGl -Antikörpers sind z.B. in der WO 2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in der WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)-Antikörpem verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.
Bakterielle Expression
Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe bakterieller Expression hergesteht werden können.
Geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Expression gewünschter Proteine werden durch Insertion einer DNA Sequenz, welche das gewünschte Protein kodiert, im funktionellen Leserahmen zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Translationsterminationssignalen und mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors und, falls erwünscht, die Amplifikation desselben innerhalb des Wirtes zu ermöglichen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation umfassen, sind aber nicht limitiert auf, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus. Bakterielle Vektoren können zum Beispiel basieren auf Bakteriophagen, Plasmiden, oder Phagemiden. Diese Vektoren können selektierbare Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, welche aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind. Viele kommerziell erhältlichen Plasmide enthalten typischerweise Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von vorteilhaften Expressionsvektoren auf Basis der beabsichtigten Verwendung des zu exprimierenden Proteins ausgewählt werden. Nach Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes zu einer angemessenen Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) de-reprimiert / induziert, und die Zellen werden für eine zusätzliche Periode kultiviert. Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, falls nötig auf physikalische Weise oder mit chemischen Mitteln aufgeschlossen, und der resultierende Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten.
Daher ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure umfasst, welche einen neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert. Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindende Fragmente von diesen beinhalten natürlich gereinigte Produkte, Produkte, die aus chemischen Synthesen stammen, und Produkte, die durch rekombinante Technologien in prokaryotischen Wirten, wie zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, bevorzugt E. coli, produziert werden.
Säugerzellexpression Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe von Säugerzellexpression hergestellt werden können.
Bevorzugte regulatorische Sequenzen zur Expression in Säugerzellwirten umfassen virale Elemente, die zu einer hohen Expression in Säugerzellen führen, wie Promotoren und/oder Expressionsverstärker, welche vom Cytomegalovirus (CMV) (wie dem CMV Promotor/Enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (wie dem SV40 Promotor/Enhancer), vom Adenovirus, (z.B. der Adenovirus major late promoter (AdMLP)) und vom Polyoma abgeleitet sind. Die Expression der Antikörper kann konstitutiv oder reguliert erfolgen (z.B. induziert durch Zugabe oder Entfernen von Kleinmolekül Induktoren wie Tetracyclin in Kombination mit dem Tet-System).
Zur weiteren Beschreibung viraler regulatorischer Elemente und Sequenzen von diesen sei verwiesen auf z.B. U.S. 5,168,062 von Stinski, U.S. 4,510,245 von Bell et al. und U.S. 4,968,615 von Schaffner et al.. Die rekombinanten Expressionsvektoren können ebenfalls einen Replikationsursprung und selektierbare Marker beinhalten (siehe z.B. U.S. 4,399,216, 4,634,665 und U.S. 5,179,017). Geeignete selektierbare Marker umfassen Gene, die Resistenz gegenüber Substanzen wie G418, Puromycin, Hygromycin, Blasticidin, Zeocin/Bleomycin, oder Methotrexate verleihen, oder selektierbare Marker, welche zur Auxotrophie einer Wirtszelle führen, wie Glutamine Synthetase (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb; 10(2): 169-75), wenn der Vektor in die Zelle eingebracht wurde.
Zum Beispiel vermittelt das Dihydrofolate-Reductase (DHFR) Gen Resistenz gegenüber Methotrexate, das neo Gen vermittelt Resistenz gegenüber G418, das bsd Gen aus Aspergillus terreus vermittelt Resistenz gegenüber Blasticidin, Puromycin N-acetyl- transferase vermittelt Resistenz gegenüber Puromycin, das Sh ble Genprodukt vermittelt Resistenz gegenüber Zeocin, und Resistenz gegenüber Hygromycin wird vermittelt durch das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hyg or hph). Selektierbare Marker wie DHFR oder Glutamine-Synthetase sind auch hilfreich für Amplifikationstechniken in Verbindung mit MTX und MSX.
Die Transfektion eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle kann mit Hilfe von Standardtechniken ausgeführt werden, unter anderem mit Elektroporation, Nucleofection, Calcium-Phosphate-Präzipitation, Lipofection, Polykation-basierter Transfektion wie Polyethlylenimine (PEI)-basierter Transfektion und DEAE-Dextran Transfection.
Geeignete Säugerwirtszellen für die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen umfassen Chinese Hamster Ovary (CHO Zellen) wie CHO-Kl, CHO-S, CHO-K1SV [inbegriffen DHFR-CHO Zellen, beschrieben in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 und Urlaub et al, Cell. 1983 Jun;33(2):405-l2, verwendet mit einem DHFR selektierbaren Marker, wie beschrieben in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, sowie andere Knockout-Zellen, wie ausgeführt in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr; 109(4): 1007- 15), NS0 myeloma Zellen, COS Zellen, HEK293 Zellen, HKB11 Zellen, BHK21 Zellen, CAP Zellen, EB66 Zellen, und SP2 Zellen.
Die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen kann auch transient oder semi-stabil in Expressionssystemen erfolgen, wie HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293- Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-Kl, CHO- Kl SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 oder CAP-T Zellen (beispielsweise wie
Durocher et ab, Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)
In einigen Ausführungsformen ist der Expressionsvektor in jener Weise konstruiert, dass das zu exprimierende Protein in das Zellkulturmedium, in welchem die Wirtszellen wachsen, sekretiert wird. Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus dem Zellkulturmedium mit Hilfe dem Fachmann bekannten Proteinreinigungsmethoden gewonnen werden.
Reinigung Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus rekombinanten Zellkulturen mit Hilfe gut bekannter Methoden gewonnen und gereinigt werden, umfassend beispielsweise Ammoniumsulfat- oder Ethanol- Präzipitation, Säureextraktion, Protein A Chromatographie, Protein G Chromatographie, Anion- oder Kationenaustauschchromatographie, Phospho-Cellulose Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC),
Affinitätschromatographie, Hydroxylapatite Chromatographie and Lectin Chromatographie. High Performance Flüssigchromatographie (“HPLC”) kann ebenfalls zur Reinigung angewendet werden. Siehe, beispielsweise, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10.
Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, welche mit Hilfe rekombinanter Techniken in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt werden. Eukaryotische Wirte umfassen beispielsweise Hefezellen, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen. Abhängig von der für die rekombinanten Expression gewählten Wirtszelle kann das exprimierte Protein glykosyliert oder nicht-glykosyliert vorliegen.
In einer bevorzugen Ausführungsform wird der Antikörper gereinigt (1) zu mehr als 95 Gew.-% gemessen beispielsweise mit der Lowry-Methode, mit UV-Vis Spektroskopie oder mit der SDS-Kapillargelelektrophorese (zum Beispiel mit einem Caliper LabChip GXII, GX 90 oder Biorad Bioanalyzer Gerät), und in mehr bevorzugten Ausführungsformen mehr als 99 Gew.-%, (2) zu einem Grade geeignet zur Bestimmung von mindestens 15 Resten der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz, oder (3) zur Homogenität bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht- reduzierenden Bedingungen mit Hilfe von Coomassie-Blau oder bevorzugt Silber-Färbung.
Gewöhnlich wird ein isolierter Antikörper mit Hilfe wenigstens eines
Proteinreinigungsschrittes gewonnen. anti-CXCR5 Antikörper
Erfindungsgemäß können anti-CXCR5 Antikörper verwendet werden.
Der Begriff „anti-CXCR5 Antikörper“ oder„ein Antikörper, der spezifisch an CXCR5 bindet“ bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CXCR5 (NCBI - Referenzsequenz: NR 001707.1; SEQ ID NO 81 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CXCR5 mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, Ein Beispiel für einen Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an humanes CXCR5 binden, sind dem Fachmann z.B. bekannt als Rattenantikörperklon RF8B2 (ACC2153) oder als humaner Antikörper 40C01 wie beschrieben in WO2014/177652.
Besonders bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-CXCR5 Antikörper TPP- 14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 und TPP-14495. Vorläufer (z.B. TPP- 10063) der genannten Antikörper wurden durch Selektion auf Peptiden und Zellen mitels Phage Display Technologie selektiert und im folgenden mitels Protein Engineering in Ihren Eigenschaften optimiert.
Bevorzugte Antikörper und Antigen-bindende Antikörperfragmente für erfindungsgemäße Binder- Wirkstoff-Konjugate
In dieser Anmeldung wird bei den Binder-Wirkstoff-Konjugaten auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-14511, TPP- 14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP- 14514 und TPP- 14495. -35-
Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper:
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TRR-14511, TRR-14509, TRR-14499, TPP-14505, TPP- 14514/GRR- 14495, TPP-10063 und 40C01 sind Antikörper umfassend eine oder mehrere der in obiger Tabelle angegebenen CDR-Sequenzen (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) der variable Region der schwere Kette (VH) oder der variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene variable Region der schwere Kette (VH) und/oder die variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene Region der schweren Kette (IgG Schwere Kette) und/oder die angegebene Region der leichten Kette (IgG Leichte Kette).
TPP- 14495 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8.
TPP- 14499 it ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDRl-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18. TPP- 14505 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere
Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDRl-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28.
TPP- 14509 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38. TPP-14511 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere
Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO:47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48.
TPP-14514 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDRl-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten
Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58.
TPP- 10063 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDRl-Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDRl-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68.
TPP- 14495 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 5.
TPP- 14499 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 15. TPP- 14505 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 25.
TPP- 14509 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend durch SEQ ID NO: 35.
TPP- 14511 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 45.
TPP- 14514 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 55.
TPP- 10063 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine variable Region der schweren Kette (VH) entsprechend SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) entsprechend SEQ ID NO: 65. TPP- 14495 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 10.
TPP- 14499 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 20.
TPP- 14505 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 30. TPP- 14509 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 40.
TPP- 14511 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 50.
TPP- 14514 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 60.
TPP- 10063 ist ein anti-CXCR5 Antikörper umfassend vorzugweise eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 70.
40C01 ist ein anti-CXCR5 Antikörper wie beschrieben in WO2014/177652 und hierin repräsentiert durch die in obiger Tabelle angegebenen angegebenen Sequenzen (SEQ ID NO: 71-80). Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfin dungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und Iod, wie 2H (Deuterium), 3H (Tritium), 13C, 14C, 15N, 170, 180, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 129I und 131I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirk mechanismus oder der Wirkstoff-Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit 3H- oder 14C-Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie bei spielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirk dosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebe nenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalin disulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyl- diisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, V-Mcthylpipcridin, /V- Methyl mo rpho 1 i n , Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Therapeutische Verwendung Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Himtumore (z.B. des Himstamms und des Hypothala mus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speise- röhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi- Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangio sarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und para- thyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Hamtrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Hamleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS- korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell- Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren Vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Die hier beschriebenen gegen CXCR5 gerichteten Binder- bzw. Antikörper- Wirkstoff- Konjugate (ADCs) können bevorzugt verwendet werden, um CXCR5 exprimierende Störungen, wie CXCR5 exprimierende Krebserkrankungen, zu behandeln. Typischerweise zeigen derartige Krebszellen messbare Mengen von CXCR5 gemessen auf Protein- (z.B. mittels Immunoassay) oder RNA-Ebene. Einige dieser Krebsgewebe zeigen einen erhöhten Spiegel an CXCR5 verglichen mit nicht-kanzerogenem Gewebe des gleichen Typs, bevorzugt gemessen am gleichen Patienten. Optional wird der Gehalt an CXCR5 gemessen, bevor die Krebsbehandlung mit einem erfindungsgemäßen Antikörper- Wirkstoff-Konjugat (ADCs) begonnen wird (Patienten- Stratifizierung). Die CXCR5 gerichteten Binder- Wirksto ff- Konjugate (ADCs) können bevorzugt verwendet werden, um
CXCR5 exprimierende Störungen, wie CXCR5 exprimierende Krebserkrankungen zu behandeln, wie Tumore des hämatopoetischen und lymphatischen Gewebes oder hämatopoetische und lymphatische bösartige Tumore. Beispiele für Krebserkrankungen, die mit einer CXCR5 -Expression verbunden sind, beinhalten lymphatische Krankheiten, wie Burkitt-Lymphom, follikuläres Lymphom, chronische lymphatische Leukämie (CLL), Mantelzelllymphom (MCL), diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom (DLBCL) und Hodgkin-Lymphom. Des weiteren kann eine erhöhte Expression von CXCR5 auch in soliden Tumoren wie Tumore der Brust, Prostata, Magen und Darm gefunden werden.
Methoden der beschriebenen Erfindung umfassen die Behandlung von Patienten mit einem CXCR5 exprimierenden Krebs, wobei die Methode die Gabe eines erfinderischen Antikörper-Wirkstoff- Konjugates (ADCs)umfasst.
Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Lormen hiervon. Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessem, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfin dungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungs- gemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Er krankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti hyperproliferativen, zytostatischen, zytotoxischen oder immuntherapeutischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt: l3lI-chTNT, Abarelix, Abemaciclib, Abirateron, Acalabrutinib, Aclarubicin, Adalimumab, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alectinib, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Anetumab ravtansine, Angiotensin II, Antithrombin III, Apalutamide, Aprepitant, Arcitumomab, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, Atezolizumab, Avelumab, Axicabtagen Ciloleucel, Axitinib, Azacitidin, Basiliximab, Belotecan, Bendamustin, Besilesomab, Belinostat, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Blinatumomab, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab vedotin, Brigatinib, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calcitonin, Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carbamazepine, Carboplatin, Carboquon, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Cobimetinib, Copanlisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daratumumab, Darbepoetin alpha, Dabrafenib, Darolutamide, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Deslorelin, Dexrazoxane, Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Dinutuximab, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Durvalumab, Eculizumab, Edrecolomab, Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutamid, Epacadostat, Epirubicin, Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Esomeprazol, Estradiol, Estramustin, Etoposid, Ethinylestradiol, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Fentanyl, Filgrastim, Fluoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitant, Fotemustin, Fulvestrant, Gadobutrol, Gadoteridol, Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB-DTPA Dinatriumsalz), Galliumnitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF), Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, I-l25-Seeds, lansoprazol, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid, Ingenolmebutat, Inotuzumab Ozogamicin, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon gamma, Iobitridol, Iobenguane (1231), Iomeprol, Ipilimumab, Irinotecan, Itraconazole, Ixabepilon, Ixazomib, Lanreotid, Lansoprazole, Lansoprazol, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lenvatinib, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamiso 1, Levonorgestrel, Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin, Lutetium Lu 177 Dotatat, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Metirosin, Midostaurin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Morphinhydrochlorid, Morphinsulfat, Mvasi, Nabilon, Nabiximols, Nafarelin, Naloxon + Pentazocin, Naltrexon, Nartograstim, Necitumumab, Nedaplatin, Nelarabin, Neratinib, Neridronsäure, Netupitant/palonosetron, Nivolumab, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid, Nimorazol, Nimotuzumab, Nimustin, Nintedanib, Niraparib, Nitracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Olaparib, Olaratumab, Omacetaxin- Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Oprelvekin, Orgotein, Orilotimod, Osimertinib, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palbociclib, Palifermin, Palladium- l03-Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab, Panobinostat, Pantoprazol, Pazopanib, Pegaspargase, PEG-Epoetin beta (Methoxy PEG- Epoetin beta), Pembrolizumab, Pegfilgrastim, Peg-interferon-alfa-2b, Pemetrexed, Pentazocin, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane, Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pralatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazole, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol, Racotumomab, Radium- 223-chlorid, Radotinib, Raloxifen, Raltitrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan, Refametinib, Regorafenib, Ribociclib, Risedronsäure, Rhenium- 186 Etidronat, Rituximab, Rogaratinib, Rolapitant, Romidepsin, Romiplostim, Romurtid, Roniciclib, Rucaparib, Samarium (l53Sm) lexidronam, Sargramostim, Sarilumab, Satumomab, Secretin, Siltuximab, Sipuleucel-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, Sonidegib, Sorafenib, Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Talimogen Laherparepvec, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin, Teceleukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]- octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin, Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanin, Tisagenlecleucel, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Trabectedin, Trametinib, Tramadol, Trastuzumab, Trastuzumab Emtansin, Treosulfan, Tretinoin, Trifluridine + Tipiracil, Trametinib, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid, Thrombopoietin, Tryptophan, Ubenimex, Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Vorozol, Yttrium-90-Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin- Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.
Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern (z.B. Antikörpern) kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targets binden können: OX-40, CD137/4-1BB, DR3, ID01/ID02, LAG-3, CD40.
Da ein nicht Zell-permeabler Toxophormetabolit eines Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) keine schädigende Wirkung auf die Zellen des adaptiven Immunsystems haben sollte, ist die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit einer Krebsimmuntherapie zur Verwendung in der Behandlung von Krebs oder Tumoren ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung. Der intrinsische Wirkmechanismus von zytotoxischen Binder-Wirkstoffkonjugaten beinhaltet die direkte Auslösung von Zelltod der Tumorzellen und somit die Freisetzung von Tumorantigenen, die eine Immunantwort stimulieren können. Zudem gibt es Hinweise, dass die KSP-Inhibitor- Toxophorklasse Marker des sogenannten immunogenen Zelltod [immunogenic cell death (ICD)] in vitro induziert. Somit stellt die Kombination der Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs-Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen, bevorzugt Antikörpern, gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie eine bevorzugte Methode zur Behandlung von Krebs oder Tumoren da. i) Beispiele therapeutischer Ansätze zur Krebs-Immuntherapie umfassen Immun-modulatorische monoklonale Antikörper und niedermolekulare Substanzen gerichtet gegen Targets aus der Krebs Immuntherapie, Vakzine, CAR T Zellen, bi-spezifische T Zell-rekrutierende Antikörper, onkolytische Viren, zellbasierte Vakzinierungsansätze ii) Beispiele ausgewählter Targets aus der Krebs Immuntherapie geeignet für Immun-modulatorische monoklonale Antikörper umfassen CTLA-4, PD-l/PDL-l, OX-40, CD137, DR3, IDOl, ID02, TD02, LAG-3, TIM-3, CD40, ICOS / ICOSL, TIGIT, GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM/BTLA, CEACAM1, CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3 und TLR’s. Die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit eine Krebsimmuntherapie könnte daher zum einen Tumoren mit schwach immunogenen Eigenschaften immunogener machen und die Wirksamkeit eine Krebsimmuntherapie verstärken und außerdem eine langanhaltende therapeutische Wirkung entfalten.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch, zytotoxisch oder immuntherapeutisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden:
• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe; • die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;
• eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.1 bis 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.3 bis 10 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größe- rer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Beispiele Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
Svnthesewege:
Exemplarisch für die Ausführungsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausführungsbeispielen dargestellt.
Schema 1: Synthese von Lysin-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarem Linker
Figure imgf000052_0001
In dem obigen Reaktionsschema haben Xi, X2, X3, n und AK2 die in der Formel (I) angegebenen Bedeutungen. a): HATU, DMF, N,N-Diisopropylethylamin, RT; b) H2, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; c) 1,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, N,N-
Diisopropylethylamin, DMF, Rühren über Nacht bei RT; d) AK2 in PBS, unter Argon 3-5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO zugeben, 60 min Rühren bei RT unter Argon, erneut 3- 5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO nachsetzen, 60 min Rühren bei RT unter Argon, dann Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD lO-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. Ggf. schließt sich bei in vivo Batches noch eine Sterilfiltration an. A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für
P-gp und MDR1)
abs. Absolut
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat
BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-Brom- 1 -ethylpyridinium-T etrafluoroborat
Boc tert. -Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
C Konzentration
ca. circa, ungefähr
CI chemische Ionisation (bei MS)
DAR drug-to-antibody ratio
D Dublett (bei NMR)
D Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
Dd Dublett von Dublett (bei NMR) DMAP 4 - N, /V-Dimcthylaminopyridin
DME 1 ,2-Dimethoxyethan
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium (standardisiertes
Nährmedium für die Zellkultur)
DMF N, N- Dimethylformamid
DMSO Dimethy lsulfo xid
D/P Dye(Fluoreszenzfarbstoff)/Protein V erhältnis
DPBS, D-PBS, Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
PBS PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537
Zusammensetzung :
O,2 g KCl
0,2 g KH2PO4 (anhyd)
8,0 g NaCl
1,15 g Na2HP04 (anhyd)
ad 1 1 mit LEO auffüllen
Dt Dublett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-Dithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC A'-(3-Dimethylaminopropyl)-A-ethylcarbodiimid-
Hydrochlorid
EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler
Wachstums faktor Rezeptor
EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ELISA Enzyme- linked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof =
Time Of Flight und q = Quadrupol)
FCS fötales Kälberserum Fmoc (9//-Fluorcn-9-ylmcthoxy)carbonyl
ges. Gesättigt
GTP Guanosin-5’-triphosphat
H Stunde(n)
HATU 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-A A N', A'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat
HBL-l Humane Tumorzelllinie
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin- 1 -ethansulfonsäure
HOAc Essigsäure
HOAt 1 -Hydro xy-7-azabenzotriazo 1
HOBt 1 -Hydro xy- 1 /7-bcnzotriazol-Hydrat
HOSu A-Hydroxysuccinimid
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
ICso halbmaximale Inhibitionskonzentration
i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.v. intravenös, Applikation in die Vene
konz. konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK1 -Zellen Lewis lung carcinoma pork kidney cell line
L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen
M Multiplett (bei NMR)
Me Methyl
MDR1 Multidrug resistence protein 1
MeCN Acetonitril
Min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazoliumbromid
NCI-H292 Humane Tumorzelllinie
NMM A-Methy lmorpho lin NMP /V-Mcthyl-2-pyrrolidinon
NMR Kemresonanzspektrometrie
NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research
Institute (NMRI)
Nude Mäuse N acktmäuse( V ersuchstiere)
NSCLC Non small cell lung cancer (Nicht-kleinzelliges
Bronchialkarzinom)
Oci-Ly-l Humane Tumorzelllinie
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/C Palladium auf Aktivkohle
P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
Quart Quartett (bei NMR)
Quint Quintett (bei NMR)
Rec-l humane Tumorzelllinie
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
S Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SCID Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten
Immundefekt (severe combined immunodeficiency)
SU-DHL6 Humane Tumorzelllinie
T Triplett (bei NMR)
TBAF T etra-n-butylammoniumfluorid
TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin
TEMPO (2,2,6,6-T etramethyl-piperidin- 1 -yl)oxyl
Teoc T rimethy lsily lethoxy carbony 1 tert. Tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF T etrahydro furan
T3P® 2,4,6-Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid
UV Ultraviolett- Spektrometrie
v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung)
Z Benzyloxycarbonyl
HPLC- und LC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MSL Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 m 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A—> 1.2 min 5% A — 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm. Methode 6 (LC-MSL
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 m 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A—> 0.5 min 97% A— » 3.2 min 5% A— » 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV- Detektion: 210 nm.
Methode 7 (LC-MSL
Instrument: Agilent MS Quad 6l50;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 m 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A — 0.3 min 90% A 1.7 min 5% A 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1,20 mL/min; UV-Detektion: 205 - 305 nm.
Methode 12 (FC-MSi:
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1.8 pm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 mFmin; UV- Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm.
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Fiteratur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Intermediat C52
( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropan- 1 -amin
Figure imgf000058_0001
10.00 g (49.01 mmol) Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt und die wässrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90.0 g Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wiederholt.
Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso 300x100; 10m, Fluss: 250 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Th.) der Verbindung Methyl- l-benzyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+.
Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl- l-benzyl-4-brom- lH-pyrro 1-2- carboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) (2,5-Difluorphenyl)boronsäure und 19.20 mL ges. Natriumcarbonat-Lösung und 1.33 g (1.63 mmol) [1,1’-Bis- (diphenylphosphino)-ferrocen]-dichlorpalladium(II):Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclo hexan/Ethylacetat 100:3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im
Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl- 1- benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrro l-2-carboxylat.
LC-MS (Methode 7): Rt = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+.
3.60 g (11.00 mmol) Methyl-l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 90.0 mL THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1.04 g (27.50 mmol)
Lithiumaluminiumhydrid (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit gesättigter Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (21.47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand 2.80 g (l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. LC-MS (Methode 7): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+.
28.21 g (94.88 mmol) l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-carbaldehyd wurden zusammen mit 23.00 g (189.77 mmol) (R)-2-Methylpropan-2-sulfmamid in 403.0 mL absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.21 mmol) Titan(IV)isopropylat versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 mL ges. NaCl-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fluss 200 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :10). LC-MS (Methode 7): Rt = 1.63 min; MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
25.00 g (62.42 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl]methylen}-2-methylpropan-2-sulfmamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1.7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 71.4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.97 min; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+. 28.00 g (61.05 mmol) (R)-N-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulfinamid wurden in 186.7 mL l,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 100x30; Lluss: 60 mL/min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): Rt = 2.10 min; MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): d [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H).
Intermediat C58
(2S)-4-[ {(1 R)- 1 -[ l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2 dimethylpropyl}
(glycoloyl) amino]-2-( {[2 (trimethylsilyl)ethoxy] carbony 1} amino)butansäure
Figure imgf000062_0001
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 8.99 g (24.5 mmol) von Intermediat L57 gelöst in 175 mL DCM hinzugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit 300 mL DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL Natriumhydrogencarbonat- Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde anschließend mittels präparativer RP- HPLC (Säule: Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Lraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 4.6 g (61 % d. Th.) Methyl-(2S)-4-({(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614 (M+H)+.
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Intermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 mL (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
2.17 g (2.64 mmol) dieses Intermediats wurden in 54 mL THE und 27 mL Wasser gelöst und mit 26 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und dann mit 1.4 mL TLA auf einen pH-Wert zwischen 3 und 4 eingestellt. Der Ansatz wurde im Vakuum aufkonzentriert. Nachdem THE weitgehend abdestilliert war wurde die wäßrige Lösung zweimal mit DCM extrahiert und anschließend im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Säule: Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Traktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand und aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. So wurden 1.1 g (63% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 656 (M-H)\
'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): d [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1H), 0.74-0.92 (m, 11H), 1.40 (m, 1H), 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1H), 3.8-4.0 (m, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7H), 7.48 (s, 1H), 7.60 (m, 1H), 12.35 (s, 1H).
Intermediat C61
N-[(2S)-4-[ {(1 R)- 1-[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glyco loyl)amino] -2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} amino)butanoyl] -beta-alanin
Figure imgf000064_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Intermediat C58 mit ß -Alaninmethylester und anschließender Esterspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Es wurden 67mg (61% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+.
Intermediat CI 10(D)
Dibenzyl-N- {(2S)-2-amino-4-[ {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamat
Figure imgf000064_0002
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Dibenzyl-D-glutamat, das zuvor durch Verteilung zwischen Ethylacetat und 5%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung aus seinem p-Toluolsulfonsäure-Salz freigesetzt wurde mit Intermediat C61 in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H]+. Intermediat L57
Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat
Figure imgf000065_0001
500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuremethylester Hydrochlorid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,5-dioxopyrrolidin-l-carboxylat wurden in 5.0 mL 1,4- Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10m, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Fösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der V erbindung (3 S)-4-Methoxy-4-oxo-3 -( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbony 1} amino) butansäure.
FC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)\
592.9 mg (3 S)-4-Methoxy-4-oxo-3 -( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmorpholin und 277.9 mg (2.04 mmol) Isobutylchlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1 ,2- Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -10 °C abgekühlt und mit 115.5 mg (3.05 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 515.9 mg (91 % d. Th.) der Verbindung Methyl-N- { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-homoserinat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+.
554.9 mg (2.00 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 1.27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit l0%iger Na2S203-Lösung, l0%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Man erhielt 565.7 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.
‘H-NMR (400 MHz, DMSO-de): d [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).
Intermediat LI 11
N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-L-asparagin
Figure imgf000066_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte nach klassischen Methoden der Peptidchemie beginnend mit der HATU-Kupplung von N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanin mit tert- Butyl-N-methyl-L-alaninat hydrochlorid Salz in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure in DCM. Anschließend erfolgte die Kupplung mit tert-Butyl-L- asparaginat in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und dann die hydrogeno lytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe in DCM/Methanol 1 :1 über l0%-igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck. Schließlich wurde das erhaltene Intermediat durch Kupplung mit 4-Pyridinessigsäure in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure in DCM in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.16 min; MS (ESIpos): m/z = 408 (M+H)+.
Intermediat LI 16
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin
Figure imgf000067_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit tert-Butyl-N-methyl-L-alaninathydrochlorid Salz in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt. LC-MS (Methode 1): Rt = 0.68 min; MS (ESIpos): m/z = 309 [M+H]+
Intermediat LI 17
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-L-asparagin -trifluoressigsäure Salz
Figure imgf000068_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 4 tert-Butyl-L- asparaginat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-alanyl-N-methyl-L-alanin (Intermediat L116) in Gegenwart von HATU, und schließlich durch Abspaltung der tert.-Butylester-Schutzgruppe mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.57 min; MS (ESIneg): m/z = 421 [M-H]
Intermediat 02
N-{5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1- {(2S)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glyco loyl)amino] - 1 - [(3 - { [( 1 R)- 1 ,3 -dicarboxypropyl] amino } -3 -oxopropyl)amino] - 1 - oxobutan-2-yl} -L-aspartamid
Figure imgf000069_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C110D zunächst durch Kupplung mit Intermediat Ll 17 in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurden alle Schutzgruppen durch l-stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM-Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 , 1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-l,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 1195 [M+H]+. B: Herstellung von Antikörper- Wirkstoff-Konjugaten
Figure imgf000069_0002
B-l. Allgemeines Verfahren zur Generierung von Antikörpern
Die Proteinsequenz (Aminosäuresequenz) der verwendeten Antikörper, zum Beispiel TPP- 14511, TRR-14509, TRR-14499, TRR-14505, TRR-14514, TPP-14495, TPP-10063 und 40C0l wurde in eine für das entsprechende Protein kodierende DNA Sequenz nach dem Fachmann bekannten Verfahren überführt und in einen für die transiente Säugerzellkultur geeigneten Expressionsvektor inseriert (wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben).
B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Antikörpern in Säugerzellen
Die Antikörper, zum Beispiel TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514 TPP-14495 und TPP-10063, wurden in transienten Säugerzellkulturen produziert, wie von
Tom et ab, Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben.
B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreinigung von Antikörpern aus Zellüberständen. Die Antikörper, zum Beispiel TRR-14511, TRR-14509, TPP-14499, TPP-14505, TPP-14514, TPP- 14495 und TPP 10063, wurden aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/ Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschließend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt. Kommerziell erhältliche Antikörper wurden mit Standard- Chromatographiemethoden aus den Handelsprodukten aufgereinigt (Protein A Chromatopgraphie, präparative Gelfiltrationschomatographie (SEC - size exclusion Chromatographie)).
B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Lysin-Seitenketten In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt:
Beispiele x: TPP-14495 TPP- 14499 TRR-14505 TRR-14509 TRR-14511 TRR-14514
TRR- 10063 40C01
Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 10 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer- Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD lO-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs inPBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösung wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-6. beschriebenen Methoden ermittelt.
In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK2 die Bedeutung Beispiele x: TPP-14495 - NH§2
TPP-14499 - NH§2
TPP-14505 - NH§2
TPP-14509 - NH§2
TPP-14511 - NH§2 TPP-14514 - NH§2
TPP- 10063 - NH§2
40C01 - NH 2 wobei
§2 die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht.
Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugate
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophylisiert werden.
B-5. Überprüfung der Antigen-Bindung des ADCs
Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder
Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen, beispielsweise für Antikörper-Konjugate mittels Proteinbestimmung (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1102:616-623).
B-6. Bestimmung des Antikörpers und der Toxophorbeladung
Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Konjugate in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung (in den Tabellen bezeichnet als DAR, drug-to- antibody ratio), wie folgt bestimmt: Die Toxophor Beladung des Antikörpers (DAR) wurde unabhängig von der
Verknüpfüngsstelle über UV-Absorption während der Size Exclusion Chromatographie (SEC) bestimmt, im Folgenden abgekürzt als SEC-UV. Hierzu wurden 50 pL der ADC- Lösung über SEC analysiert. Die Analytik wurde auf einem Agilent 1260 HPLC System mit einer Detektion bei 280 nm und einer Detektion bei 260 nm durchgeführt. Eine Superdex 200 10/300 GL Säule von GE Healthcare (Lot No: 10194037) (10 x 310 mm, 1 pm Partikelgröße) wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min unter isokratischen
Bedingungen verwendet. Die mobile Phase bestand aus PBS Puffer (pH 7.2). Für die Bestimmung der Drug Load aus dem HPLC-Chromatogramm wurde das Verhältnis R der Peakflächen des Monomerpeaks bei 260 nm und bei 280 nm bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Drug Load (DAR) wie folgt ermittelt:
Figure imgf000073_0001
Hierbei steht e für den molaren Extinktionskoefizienten des Antikörpers (Ab) und der Drug (D). steht für die Wellenlänge 260 nm, während 280 für 280 nm steht. Die
Extinktionskoeffizienten der Antikörper bei 280 nm und bei 260 nm wurden experimentell bestimmt. Der Mittelwert dieser Bestimmungen für verschiedene Antikörper wurde für die DAR Kalkulation verwendet. Auch für das KSP Toxophor wurden die molaren Extinktionskoeffizienten bei 280 nm und bei 260 nm experimentell bestimmt. Die folgenden Wellenlängen und Extinktionskoeffizienten wurden für die DAR Berechnungen verwendet:
Figure imgf000074_0001
Die Konzentration der ADCs wurde über die Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Konzentration wurde unter Verwendung des molaren Absorptionskoeffizienten des jeweiligen Antikörpers bestimmt. Um ebenfalls die Absorption des Toxophors bei 280 nm zu berücksichtigen, wurde die bei 280 nm gemessene Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung korrigiert: concentration = preliminary concentration / ( 1 +D ARuv * (□ Toxophor 280nm /□ Antibody 280nm))
Hierbei steht“preliminary concentration” für die Konzentration, die nur unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten des Antikörpers kalkuliert wurde, DARuv ist die über SEC- UV bestimmte DAR des jeweiligen ADCs, und□ Toxophor 280nm und□ Antibody 280nm sind die jeweiligen Extinktionskoeffizienten des Toxophors und des Antikörpers bei 280 nm. In einigen Fällen erfolgte die DAR Bestimmung von Lysin- verknüpften ADCs zusätzlich nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Dies ermöglichte zusätzlich die Bestätigung des Antikörpers und der gekuppelten Linker-Toxophor-Spezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-
Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/ Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.
Die Protein-Identifizierung erfolgte vor der Kupplung. Neben der Molekulargewichtsbestimmung nach Deglykosylierung und/oder Denaturierung wurde hierzu ein tryptischer Verdau durchgeführt und nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.
Ausführungsbeispiele Metabolite Beispiel Ml
N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000075_0001
Intermediat C110D wurden durch l-stündige Hydrierung über l0%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.78 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+. Die nachfolgend beispielhaft dargestellten ADCs können den bevorzugten Metaboliten Ml freisetzen, der bevorzugte pharmakologische Eigenschaften hat.
Ausführungsbeispiele ADCs
Beispiel 1
Figure imgf000076_0001
Exemplarische Vorschrift A:
Zu 2.9 mg des betreffenden Antikörpers in 0.3 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon lOEq (0.2 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 30pL DMSO zugesetzt. Nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).
Exemplarische Vorschrift B:
Zu 60 mg des betreffenden Antikörpers in 6 mL PBS Puffer (pH7.2) (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 10 Eq (4.78 mg) von Intermediat Q2 gelöst in 300pL DMSO zugesetzt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 10 mL verdünnt, über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS (pH7.2) und erneut aufkonzentriert und steril filtriert.
Figure imgf000077_0002
Zum Vergleichszwecken wurden folgende ADCs hergestellt:
Referenzbeispiel RI:
Figure imgf000077_0001
Solche ADCs wurden in der WO2015/096982 und in der WO2016/096610 mit verschiedenen Antikörpern wie beispielsweise auch Cetuximab und Trastuzumab offenbart. Zu Vergleichszwecken wurde der dort offenbarte Precursor Intermediat Fl 94 weiterhin auch mit den Anti-CXCR5 Antikörpern TRR-14495, TPP-14499, TPP-14509 und TPP-14511 umgesetzt. Folgende ADCs wurden zu Vergleichszwecken herangezogen:
Figure imgf000078_0002
Für das Referenzbeispiel Rl wurde in der WO2015/096982 der daraus gebildete Metabolit Beispiel 98 beschrieben, der hier als Referenzbeispiel R1M aufgeführt wird.
Referenzbeispiel RIM: N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxyacetamid
Figure imgf000078_0001
Die Herstellung wurde in der WO2015/096982 als Beispiel 98 beschrieben.
Die biologischen Daten zu diesen Referenzverbindungen, die in den besagten Anmeldungen offenbart bzw. mit den neuen Referenzverbindungen erhoben wurden sind in Kapitel C beschrieben. C: Bewertung der biologischen Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden: a. C-la Bestimmung der cytotoxischen Wirkung der ADCs Die Analyse der cytototoxischen Wirkung der ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
Rec-l : humane Mantelzell Lymphomzellen (B Zell non-Hodgkin's Lymphoma) ATCC CRL-3004, Standardmedium: RPMI 1640 (Gibco, No. 21875-034) + GlutaMAX I (Invitrogen 61870) + 10% FCS superior (Biochrom, No. S0615).) CXCR5-positiv
HBL-l : humane B Zell Lymphom-Zellen (Diffuse large B-cell lymphoma) ATT CRL- RRID (Resource Identification Initiative): CVCL 4213, erstmals beschrieben in Abe et al. Cancer 61 :483-490(1988), erhalten von Prof. Lenz, Universität Münster; Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FGl2l5, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S04l5), Kultivierung analog zu Rec-l Zellen; CXCR5 positiv
NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FGl2l5, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv; EGFR-positiv.
Oci-Ly-l : humane B-Zell Lymphomzellen (B Zell non-Hodgkin's Lymphoma, assigned to germinal center B-cell like Subtyp), DSMZ ACC-722, Standardmedium: IMDM (Gibco No 31980-22) + 20% FCS superior (Biochrom, No. S0615); CXCR5 positiv. SU-DHL-6: humane B Zell Lymphom-Zellen (B Zell non-Hodgkin, beschrieben als diffuse, mixed small and large cell type; cell line) ATCC-CRL- 2959, Standardmedium: RPMI-1640 High Glucose (ATCC 30-2001) with L-Glutamine, Hepes, Sodiumpyruvat + 10% FCS (FBS Gibco 10500-064 Heat inactivated, EU approved), CXCR5 positiv.
Die Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) oder des Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) für die jeweiligen Zelllinien angegeben.
CTG-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach StandardMethode, mit den unter C-l angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Suspensionszellen gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Perkin Elmer, NO 10775584) ausgesät (in 75pl/Loch, folgende Zellzahlen je Loch: Rec-l : 3000 Zellen / Loch, HBL-l und Oci-Ly-l : 6000 Zellen/Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wurden die Antikörper-Wirkstoffkonjugate in 25 mΐ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper-Wirkstoffkonjugate von 3 x 10 7 M bis 3 x 10 12 M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G757l) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz IOOmI des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikörper-Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die IC50 der Wachstumshemmung im Vergleich zu unbehandelten Zellen und zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK). MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-l angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2l43) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI H292: 2500 Zellen/well; in lOOpL Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Antikörper-Wirkstoff- Konjugate in 10m1 Kulturmedium in Konzentrationen von 10 5M bis 10 13M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Die Suspensionszellen wurden gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (#3610) (Rec-l : 3000 Zellen/well in einem Gesamtvolumen von 100 mΐ). Nach 6-stündiger Inkubation im Inkubator bei 37°C und 5% Kohlendioxid wurde das Medium gewechselt und die Antikörper Wirkstoff Konjugate oder Metabolite in 10m1 Kulturmedium in Konzentrationen von 10 5M bis 10 13M zu den Zellen (Triplikate) in 90m1 zupipettiert. Die Inkubation des Ansatzes im Inkubator erfolgte bei 37°C und 5% Kohlendioxid. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-1010K). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite M1000 pro, Fa. Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde die IC50 der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert. In der folgenden Tabelle la sind die IC50- Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesen Assays aufgeführt: Tabelle la
Figure imgf000082_0001
In der folgenden Tabelle lb sind die ICso-Werte der Referenzbeispiele aus diesen Assays aufgeführt. Tabelle lb
Figure imgf000082_0002
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Exprimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der Antikörper-Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt.
Die erfindungsgemäßen ADCs zeigen im Allgemeinen eine deutlich verbesserte zytotoxische Potenz gegenüber den korrespondierenden Referenzbeispielen.
C-lb Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eg5 durch ausgewählte Beispiele
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Ine, No. 027EG01-XL) wurde in einer Konzentration von lOnM mit 50pg/ml Taxol (Fa. Sigma No. T7191-5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Ine) für 5 min bei RT in l5mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgCb und lOmM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Coming) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 x 10-6M bis l.Ox 10-13M und ATP (finale Konzentration 500mM; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgt. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M85l5-lmg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience Al 0486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach Bestimmungen dar. Bei den ICso-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe. In der folgenden Tabelle 2 sind die IC50- Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus dem beschriebenen Assay und den korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay) zusammengefasst: Tabelle 2
Figure imgf000084_0001
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele.
C-lc Enzymatische Assays
Legumain Assay
Der Legumain Assay wurde mit rekombinatem humanem Enzym durchgeführt. Die rhLegumain Enzymlösung (Catalog # 2199-CY, R&D Systems) wurde in 50mM Na- Acetat Puffer/ lOOmM NaCl, pEM.O auf die gewünschte Konzentration verdünnt und 2h bei 37°C vorinkubiert. rhLegumain wurde dann in 50mM MES Puffer, 250mM NaCl, pH 5.0 auf eine finale Konzentration von lng/pL eingestellt. Für jede zu untersuchende Legumain-spaltbare Prodrug wurde ein Ansatz in einem Mikroreaktionsgefäße (0.5ml, Fa. Eppendorf) angesetzt. Hierzu wurde die Substratlösung mit 50mM MES Puffer, 250mM NaCl, pH 5.0 auf die gewünschte Konzentration (2-fach konzentriert) eingestellt. Für die kinetische Messung der enzymatischen Reaktion wurden zunächst 250pL der Legumainlösung vorgelegt und durch Zugabe von 250pL der Substratlösung (finale Konzentration einfach konzentriert; 3mM) wurde die Enzymreaktion gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden je 50pL Proben entnommen Diese Probe wurde sofort mit 1 OOiiL eiskaltem Methanol versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei -20°C eingefroren. Die gewählten Zeitpunkte zur Probenentnahme waren nach 0,5h, lh, 3h und 24h. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. Die Bestimmung des freigesetzten Toxophors ermöglichte die Bestimmung der Halbwertszeit ti/2 der enzymatischen Reaktion.
Als repräsentative Beispiele, um die Legumain- vermittelte Spaltung zu zeigen, wurden als Substrate im Legumain- Assay die Modellverbindungen Ahergestellt.
Referenzbeispiel Modellverbindung A N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-N-methyl-L-alanyl-N1-[(2S)-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]- 1 -(methylamino)- 1 - oxobutan-2-yl] -L-aspartamid
Figure imgf000085_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsäure (2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid wie in WO 2015096982 Al beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat Ll 11 in DMF in Gegenwart von HATU und von N,N-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 916 [M+H]+. Modellverbindung A wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen von Legumain mit einer Halbwertszeit von 0.5 h zur Zielverbindung gespalten.
Figure imgf000086_0001
C-2 Internalisierungsassay mit Suspensionszellen
Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug- Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen Antikörpern und einem Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach bis lO-fach molarem Überschuss von CypHer 5E mono NHS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8,3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DULBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung (D/P = Adye□protem:(A280-0, l 6Adye) ü dye).
Die dye load der hier untersuchten Antikörpern sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die Kupplung zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte.
Das zu untersuchende Antigen wird von hämatopoetischen Suspensionszellen exprimiert, deshalb wurde die Internalisierung in einem FACS basierten Intemalisierungsassay untersucht.
Es wurden Zellen mit verschiedenen Target Expressionslevel untersucht- Die Zellen (5xl04/well) wurden in eine 96-MTP (Greiner bio-one, CELLSTAR, 650 180, U-bottom) in 100 mΐ Gesamtvolumen ausgesät. Nach Zugabe des targetspezifischen Antikörpers in einer Endkonzentration von l0pg/ml, wurden die Ansätze bei 37°C unterschiedlich lang inkubiert (lh, 2h, 6h, Dreifachbestimmung). Die Isotyp-Kontrolle wurde unter identischen Bedingungen behandelt. Ein paraller Ansatz wurde konstant bei 4°C behandelt.und inkubiert (negative Kontrolle). Die FACS Analyse wurde mit Hilfe des Guava flow Cytometers (Millipore) durchgeführt. Die kinetische Evaluierung erfolgte über Messung der Fluoreszenzintensität, und die Auswertung wurde mit Hilfe der guavaSoft 2.6 Software (Millipore) durchgeführt. Für die hier beschriebenen targetspezifischen Antikörper konnte eine signifikante und spezifische Internalisierung in verschiedenen Zellen detektiert werden. Die Internalisierung der erfindungsgemäßen Antikörper TPP- 14495, TPP 14499, TRR-14505, TPP-14509, TPP-14511, TPP-14514 war hierbei auf Rec-l und SU-DHL-6 Zellen verbessert im Vergleich zu TPP-10063 und 40C01 (TPP-14495 zeigte bei SU-DHL- 6 keine Verbesserung). Die Isotyp-Kontrollen zeigten keine Internalisierung. In Tabelle 3 sind die ermittelten Fluoreszenzintensitäten (MFI) für die CXCR5-hoch exprimierende Rec-l Zelllinie und der moderate CXCR5 exprimierende SU-DHL6 Zellinie zusammengefaßt. Tabelle 3
Figure imgf000088_0001
C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v/Yr -Tcstung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch- Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massen- spektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) ge- koppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war. Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [Papp (B-A)] und das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A- B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. so dass die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilt. Dies intrazelluläre Verbleiben des Metabolliten erhöht die Wahrscheinlichkeit für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin- Spindelprotein, KSP / Eg5), was zu einer verbesserten zytotoxischen Wirkung führt.
In der folgenden Tabelle 4 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:
Tabelle 4
Figure imgf000089_0001
Der Metabolit Ml, der aus den erfindungsgemäßen Binder- Wirksto ff- Konjugaten gebildet werden kann, zeigt sowohl einen deutlich reduzierten Transport aus der Zelle als auch eine reduzierte Efflux-Ratio gegenüber dem Referenzmetaboliten R1M, der aus den Binder- Wirkstoff-Konjugaten der Referenzbeispiele gebildet werden kann.
C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein (P-gp) Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen. Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1) wurden mittels eines Flux- Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1- Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et al., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1- oder L-MDRl-Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) ge koppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chern. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux- Verhältnis Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDR1- und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux- Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
Die pharmakokinetischen Parameter der Beispiele 1x10063, lx- 14495, lx- 14499, lx- 14509 und 1c-14511 werden in männlichen Wister-Ratten bestimmt. Die zu untersuchende Substanz wird intravenös als Lösung appliziert. Den Ratten wird zur vereinfachten Blutabnahme vor der Substanzgabe ein Silikonkatheter in die rechte Vena jugularis gelegt. Die Operation erfolgt mindestens einen Tag vor dem Versuch unter Isofluran-Narkose. Nach Substanzgabe wird den Tieren in einem Zeitraum bis 168 Stunden Blut entnommen. Zur Plasmagewinnung werden die Proben in EDTA-Röhrchen zentrifugiert und gegebenenfalls bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C gelagert. Aus den ermittelten Plasmakonzentration-Zeit-Verläufen werden die pharmakokinetischen Kenngrößen der ADCs wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und terminale Halbwertszeit (ti/2) berechnet. Die Quantifizierung der Verbindungen erfolgte mittels einer geeigneten ELISA (Enzyme- linked Immosorbent-Assay) Methode.
In Tabelle 5 sind die pharmakokinetischen Parameter der Beispiele lx- 10063, lx- 14495, 1c-14499, 1c-14509 und lx- 14511 zusammengefasst.
Tabelle 5
Figure imgf000091_0001
In dieser orientierenden Ratten PK Studie nach i.v. Applikation wurde für alle Beispiele ein typisches IgG Profil beobachtet. Es konnten keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Beispielen festgestellt werden.
Analytik zur Quantifizierung der verwendeten ADCs Der Antikörperteil der ADCs wurde mittels Liganden-Bindungs-Assay (ELISA) als Gesamt-IgG-Konzentration in Plasmaproben bestimmt. Dabei wurde das Sandwich- ELISA-Format verwendet. Dieser ELISA ist geeignet für die Konzentrationsbestimmung der ADCs in Plasma- und Tumorproben. Die ELISA-Platten wurden mit anti-human-IgG- Fc-Antikörpem der Ziege beschichtet. Nach Inkubation mit der Probe wurden die Platten gewaschen und mit einem Detektor-Konjugat aus anti-human-IgG(H+L)-Antikörper des Affen und Meerrettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das HRP-Substrat OPD hinzugegeben und die Farbentwicklung über die Absorption bei 490 nm verfolgt. Standardproben mit bekannter IgG-Konzentration wurden mittels 4- Parameter-Gleichung gefittet. Innerhalb der unteren (LLOQ) und oberen (ULOQ) Quantifizierungsgrenzen wurden die unbekannten Konzentrationen über Interpolation ermittelt.
C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach Internalisierung in vitro
Methodenbeschreibung :
Intemalisierungsuntersuchungen mit Immunkonjugaten werden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metaboliten zu analysieren. Hierzu werden geeignete Tumorzellen (3xl05/well) in 6-well Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% C02). Es erfolgt eine Behandlung mit 10 pg/rn L (66 nM) der zu untersuchenden Substanz. Die Internalisierung wurde bei 37 °C und 5% CO2 durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) werden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst werden die Überstände (ca. 5 mL) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) bei -80 °C gelagert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wird eine definierte Zellzahl (2xl05) mit 100 mL Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1) versetzt und unter ständigem Schütteln (Thermomixer, l5min, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.116) inkubiert. Nach der Inkubation wird das Lysat zentrifugiert (lOmin, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wird bei -80 °C gelagert. Alle Proben werden anschließend wie folgt analysiert.
Zur Aufarbeitung von 50 pL Kulturüberstand/Zelllysat werden diese mit 150 pL Lällungsreagenz (Methanol) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das Lällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 pg/L). Nach dem lOminütigen Zentrifugieren bei 188 lg wird der Überstand in ein Autosampler-Vial überführt, mit 300 pL eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt und 10 min bei 188 lg zentrifugiert. Die Messung der Zelllysat- und Überstandsproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung wird Leerlysat bzw. Leerüberstand mit entsprechenden Konzentrationen (0.1 - 1000 pg/L) versetzt. Die Nachweisgrenze (LLOQ) liegt bei ca. 0.2 pg/L.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4 und 40 pg/L.
C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo
Nach i.v. Applikation von 3-30 mg/kg verschiedener ADCs können die Plasma- und Tumorkonzentrationen des ADCs sowie potentiell auftretender Metaboliten gemessen und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUC) und Halbwertszeit (ti/2) berechnet werden.
Analytik zur Quantifizierung der potentiell auftretenden Metabolite
Die Messung der Verbindungen in Plasma, Tumor, Leber und Niere erfolgt nach Fällung der Proteine mit in der Regel Methanol durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 pL Plasma werden diese mit 150 pL Fällungsreagenz (in der Regel Methanol) versetzt und für 10 sec geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 pg/ L). Nach dem lOminütigen Zentrifugieren bei 188 lg wird der Überstand in ein
Autosampler- Vial überführt, mit 300 pL eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Bei der Aufarbeitung von Tumor- oder Organmaterial wird das jeweilige Material mit der 3-20 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthält 50 mL Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL), zwei Pellets Complete-Protease- Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 mM. Je nach Gewebetyp (hart: Tumor; weich: Leber, Niere) wird das Lyse und Homogeniserungsprogramm des Prescellys 24 Lysis and Homogenization Gerätes (Bertin Technologies) ausgewählt (www.prescellys.com). Die homogenisierten Proben werden über Nacht bei 4°C stehen gelassen. 50 pL des Homogenats werden in ein Autosampler- Vial überführt und mit 150 pL Methanol inklusive ISTD aufgefüllt und 10 sec geschüttelt und darauf 5 min stehen gelassen. Nach Zugabe von 300 pL Ammoniumacetat Puffer (pH6.8) und kurzem Schütteln wird die Probe lOmin bei 188 lg zentrifugiert.
Zur Kalibrierung wird für Plasmaproben Plasma und für Gewebeproben entsprechende Leermatrix mit Konzentrationen von 0.6 - 1000 pg/L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt je nach Probentyp bzw. Gewebetyp zwischen 1 und 20 pg/L.
Die Messung der Plasma und Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API4500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH. Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4, 40 und 400 pg/L.
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/081711; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar l5;69(6):2358-64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, inokuliert. Anschließend wurde den inokulierten Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugat, ein Isotyp-Antikörper- Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.
C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper-Wirkstoffkonjugat exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nude- oder SCID-Mäuse. 1-10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt.
Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 100 mm3. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 200-500 mm3 begonnen werden.
Die Behandlung mit ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5-10 mL / kg appliziert. Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Mit den erfindungsgemäßen Konjugaten wird als Standard einmal pro Woche für 1- 3 Wochen behandelt. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig werden 10-12 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wird die Tumorvolumen regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorvolumen wird mittels (Länge x Breite2)/2 bestimmt. Der Vergleich des mittleren Tumorvolumen der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als %T/C volume angegeben. (%T/C= [mittleres Tumorvolumen behandelte Gruppe/mittleres Tumorvolumen Kontrollgruppe] xlOO.)
Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als %T/C weight angegeben. (%T/C= [mittleres Tumorgewicht behandelte Gruppe/mittleres Tumorgewicht Kontrollgruppe] xlOO.)
Die Response Rate wird als zusätzlicher Wirkungs-Endpunkt ausgewertet. Sie entspricht der Anzahl der Mäuse mit vollständigen und partiellen Tumor Regressionen nach der Behandlung (Tumoren mindestens 30% kleiner als die Größe zu Beginn der Behandlung, an einem bestimmten Tag).
C-6b. Wirksamkeit der erfindungsgemäßen CXCR5-ADCs in verschiedenen Tumormodellen
Die Tumorzellen (z.B. REC-l, OCI-LY1) wurden subkutan in die Flanke von weiblichen SCID Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer mittleren Tumorgröße/Gruppe von ~280 mm3 wurde intravenös mit den CXCR5-ADCs behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wurde das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.
Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen CXCR5-ADCs führte zu einer deutlichen und zum Teil lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontrollgruppe und dem konjugierten Isotyp-Kontroll- Antikörper. Die Tabelle 7 gibt die T/C Werte an, ermittelt über das Tumorvolumen am jeweiligen Tag des Versuchsendes gerechnet nach Behandlungsstart. Tabelle 7:
Figure imgf000097_0001
il) %T/C Volumen, Tag 11 für REC-l, Tag 13 nach Behandlung für OCI-LY1, b) Response rate, Tag 45 für REC-l, Tag 41 nach behandlung für OCI-LY-l
Alle untersuchten CXCR5-ADC’s zeigten nach einer einzigen Behandlung eine sehr hohe Wirkung mit T/C < 10% und langfristigen Tumor Regressionen in 90-100% der Mäuse.

Claims

Patentansprüche
1. Binder-Wirkstoff- Konjugate der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000099_0001
(I), in der
Xi für N,
X2 für N und
X3 für C steht;
oder
Xi für CH oder CF,
X2 für C und
X3 für N steht;
oder Xi für NH,
X2 für C und
X3 für C steht;
oder
Xi für CH,
X2 für N und
X3 für C steht,
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)0H oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)2-8 -C(=0 )-### oder
#-C(=0)- (CH2)3-C(=0 )-###, steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
2. Binder-Wirksto ff- Konjugate der allgemeinen Formel (I), gemäß Anspruch 1, in der
Xi für CH,
X2 für C und
X3 für N steht,
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-C(=0)0H oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl, Ethyl, -CH2-CH(CH3)2 oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### oder
#-C(=0)- (CH2)3-C(=0 )-###, steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
3. Binder- Wirkstoff- Konjugate der allgemeinenFormel (I), gemäß den Ansprüchen 1 und 2, in der
Xi für CH,
X2 für C und
X3 für N steht,
R1 für Wasserstoff oder Methyl steht,
R2 für Methyl oder iso-Propyl steht,
R3 für Methyl oder -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
4. Binder-Wirkstoff-Konjugate der allgemeinen Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, in der Xi für CH,
X2 für C und
X3 für N steht,
R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 50 steht,
AK2 für einen Binder bzw. ein Derivat hiervon, vorzugsweise für einen
Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des Binders steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
5. Binder- Wirkstoff- Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansrüchen 1 bis 4, in der R1 für Methyl steht, R2 für Methyl steht, R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK2 für einen Antikörper oder für ein Antigen-bindendes
Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des
Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
6. Binder-Wirkstoff-Konjugate der Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, der Struktur
Figure imgf000104_0001
in der
AK2 für einen Antikörper steht, der über eine N-Atom einer Lysin-
Seitenkette gebunden ist und
n 1 bis 50 ist, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
7. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß Anspruch 6, in denen
n 1 bis 20 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
8. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 6 und 7, in denen
n 1 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
9. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 6 bis 8, in denen
n 4 bis 8 ist,
sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
10. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, wobei
AK2 für einen anti-CXCR5 Antikörper oder ein Antigenbindendes Fragment von diesen steht.
11. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 10, wobei
AK2 für einen anti-CXCR5 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP 14511, TPP 14509, TPP 14499, TPP 14505, TPP14514 und TPP14495, oder für ein Antigen-bindendes Antikörperfragment von diesen steht.
12. Binder-Wirkstoff-Konjugate der allgemeinen Formel (I), gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 in der R1 für Methyl steht,
R2 für Methyl steht,
R3 für -CH2-C(=0)-NH2 steht,
M für die Gruppe
#-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-(CH2)3-C(=0)-### steht, n für eine Zahl von 1 bis 20 steht und
AK2 für einen anti-CXCR5 Antikörper ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus TPP 14511, TPP 14509, TPP 14499, TPP 14505,
TPP 14514 und TPP 14495, oder für ein Antigen-bindendes
Antikörperfragment von diesen steht,
# für die Bindung Richtung Wirkstoff steht und
### für die Bindung an ein N-Atom einer Lysin- Seitenkette des
Antikörpers oder des Antigen-bindenden Antikörperfragmentes von diesem steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze dieser Solvate.
13. Binder- Wirkstoff- Konjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 12, wobei AK2
(i) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8,
(ii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18,
(iii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28,
(iv) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38,
(v) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1- Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO:47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48, oder
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH; SEQ ID NO: 51) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL; SEQ ID NO:55) umfassend die variable CDRl-Sequenz der leichten Kette (L-CDR1), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
14. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei AK2 (i) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5,
(ii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15,
(iii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25,
(iv) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35,
(v) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45, oder
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
15. Binder- Wirkstoff- Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei AK2
(i) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10, (ii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20,
(iii) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30,
(iv) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch EQ ID NO: 40,
(v) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50, oder
(vi) für einen anti-CXCR5 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.
16. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Zielmolekül bindet.
17. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet.
18. Binder-Wirkstoff-Konjugate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle intemalisiert.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein Binder-Wirkstoff- Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff
20. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
21. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen
22. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren.
23. Binder-Wirkstoff-Konjugate nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren in Kombination mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs-Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie.
PCT/EP2019/065517 2018-06-18 2019-06-13 Gegen cxcr5 gerichtete binder-wirkstoff-konjugate mit enzymatisch spaltbaren linkern und verbessertem wirkungsprofil WO2019243159A1 (de)

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