BR122019026701B1 - Formulações de agentes de ligação à base de igg4 estáveis, kit, e dispositivo ou recipiente pré-cheios - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas estáveis de anticorpo, incluindo formulações líquidas de produtos medicamentosos e formulações liofilizadas de produtos medicamentosos, compreendendo um agente de ligação à IgG4 e um tampão citrato, onde o pH da formulação é menor ou igual a pH 6 e ao pI do agente de ligação. As formulações podem ser usadas no tratamento de doenças intestinais crônicas ou artrite reumatoide.

Description

Referência Remissiva a Pedidos Correlatos

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório dos U.S. Série N° 61/615.539, depositado em 26 de março de 2012, que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência.

Antecedentes da Invenção

[002] O antígeno LIGHT humano é um potencial alvo da citocina que fora implicado no processo de doenças autoimunes inflamatórias crônicas. Como membro da superfamília TNF (TNFSF) de ligandos, o LIGHT também é conhecido como TNFSF14 ou CD258. O LIGHT é expresso na superfície de células T mediante ativação de maneira rigidamente regulada. No entanto, o LIGHT também está presente em níveis detectáveis constitutivamente na superfície de células dendríticas imaturas e nas células T e células exterminadoras naturais (NK) do intestino. O LIGHT medeia seus efeitos biológicos ligando três receptores da superfamília TNF, incluindo o receptor β de linfotoxina (LTβR), o mediador de entrada do vírus do herpes (HVEM), e o receptor isca 3 (DcR3). Linfócitos expressando LIGHT podem expressar sintomas semelhantes ao de IBD em seres humanos, e aumentos na expressão de LIGHT foram observados em pacientes com doença de Crohn ativa e outros distúrbios inflamatórios tais como a doença do enxerto versus hospedeiro.

[003] CXCR5, também conhecido como receptor do linfoma de Burkitt (BLR1), CD185, MDR15, e MGC117347, é um receptor acoplado à proteína G que é membro da família de receptores da quimiocina CXC. O precursor CXCR5 não processado tem 372 aminoácidos de comprimento com um peso molecular de 42 KD. O CXCR5 tem um papel na migração e localização das células B dentro de compartimentos anatômicos particulares. Camundongos nocaute carecem de nodos linfáticos periféricos, possuem poucas placas de Peyer e apresentam níveis reduzidos de células B. CXCL13, também conhecido como BLC, é um ligando para CXCR5. O CXCL13 é um quimioatraente de células B.

[004] Agentes de ligação anti-LIGHT e agentes de ligação anti- CXCR5 são cada um deles terapeuticamente relevantes, e é necessário formular cada um desses agentes de ligação em produtos medicamentosos que possam ser administrados a indivíduos, particularmente indivíduos humanos, para o tratamento de doenças inflamatórias.

[005] Para desenvolver uma formulação farmacêutica contendo um agente de ligação anti-LIGHT ou um agente de ligação anti-CXCR5 adequado para administração intravenosa ou subcutânea, o agente de ligação deve estar concentrado a cerca de 20 mg/mL ou mais, usualmente cerca de 100 a 150 mg/mL, e até mesmo a 250 mg/mL. Muitas complicações podem surgir em concentrações tão altas, incluindo um aumento na viscosidade, um desvio do pH, uma alteração da cor da solução, e a formação de partículas visíveis e subvisíveis.

[006] A formulação desses agentes de ligação pode ser ainda complicada pelo fato de que esses agentes de ligação têm uma alta tendência à agregação em concentrações tão altas.

[007] A formulação de anticorpos IgG4 é ainda mais complicada pelo fato de que anticorpos IgG4 tendem a formar meias-moléculas em concentrações elevadas em solução. No entanto, anticorpos IgG4 são de interesse terapêutico porque eles possuem função terapêutica reduzida.

Sumário da Invenção

[008] Para atender essas e outras necessidades, esta invenção oferece formulações de agentes de ligação de IgG4 altamente estáveis. Formulações de agentes de ligação de IgG4 altamente estáveis foram surpreendentemente encontradas na forma de líquidos e pósliofilizados que compreendem um agente de ligação de IgG4 e um tampão citrato, onde o pH da formulação é menor ou igual a cerca de pH 6 e ao ponto isoelétrico (pI) do agente de ligação. Essas formulações são aprimoradas em relação às formulações convencionais, que geralmente levam à dimerização do agente de ligação, tal como um anticorpo, aumentando a concentração do agente de ligação, tal como um anticorpo, na formulação. Em particular, as formulações da invenção reduzem a quantidade de subprodutos indesejados, que incluem agregados, meias-moléculas, produtos de degradação, proteínas de baixo peso molecular (LMWPs), proteínas de alto peso molecular (HMWPs), e rearranjos de isoformas ácidas, básicas e neutras do agente de ligação, tal como um anticorpo, componente na formulação.

[009] Em certos aspectos, a invenção oferece uma formulação estável compreendendo: um agente de ligação compreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc de um anticorpo IgG4; e cerca de 5 a cerca de 50 mM de citrato como um agente tamponante; onde o pH da formulação é menor ou igual a cerca de pH 6 e ao pI do agente de ligação. Em certas modalidades da invenção, o agente de ligação é um anticorpo.

[0010] Em certas modalidades da invenção, o agente de ligação ou anticorpo liga-se à linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicloproteína D do vírus do herpes pelo mediador de entrada do vírus do herpes, um receptor expresso em linfócitos (LIGHT). Em modalidades específicas da invenção, o agente de ligação ou anticorpo anti-LIGHT compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes complmentares (CDRs) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 1, 2, e 3, e a região variável de cadeia leve compreendendo CDRs compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 4, 5, e 6. Em outras modalidades específicas da invenção, o anticorpo é um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8.

[0011] Em certas modalidades da invenção, o agente de ligação ou anticorpo liga-se ao receptor da quimiocina C-X-C tipo 5 (CXCR5). Em modalidades específicas da invenção, o agente de ligação ou anticorpo anti-CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes complmentares (CDRs) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 15, 16, e 17, e a região variável de cadeia leve compreendendo CDRs compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 18, 19, e 20. Em outras modalidades específicas da invenção, o anticorpo é um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 and uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26.

[0012] Em certas modalidades da invenção, a concentração de anticorpo varia de cerca de 5 a cerca de 280 mg/mL. Em certas modalidades específicas da invenção, a concentração de anticorpo é de cerca de 150 mg/mL. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de anticorpo é de cerca de 50 mg/mL. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de anticorpo é de cerca de 20 mg/mL. Em ainda outras modalidades específicas da invenção, a concentração de anticorpo é de cerca de 100 mg/mL.

[0013] Em certas modalidades da invenção, a concentração de nitrato varia de cerca de 5 a cerca de 15 mM. Em algumas modalidades da invenção, a concentração de nitrato é de cerca de 10 mM. Em algumas modalidades da invenção, o tampão citrato é citrato de sódio di-hidratado.

[0014] Em certas modalidades da invenção, o pH da formulação varia entre cerca de pH 5 e cerca de pH 6. Em modalidades específicas da invenção, o pH da formulação é selecionado do grupo que consiste em cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,5, e cerca de pH 6,0.

[0015] Em uma certa modalidade específica da invenção, o pI do agente de ligação ou anticorpo varia de cerca de 6,8 and cerca de 7,2. Em modalidades específicas alternativas da invenção, o pI do agente de ligação ou anticorpo varia entre cerca de 7,6 e cerca de 8,4.

[0016] Em certas modalidades específicas da invenção, a formulação compreende ainda um tensoativo. Em certas modalidades específicas da invenção, a concentração de tensoativo varia entre cerca de 0,001% e cerca de 0,1% p/v. Em certas modalidades da invenção, o tensoativo é um polissorbato. Em certas modalidades específicas da invenção, o polissorbato é polissorbato 20. Em algumas modalidades específicas da invenção, a concentração de polissorbato 20 é de cerca de 0,005% p/v. Em modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de polissorbato 20 é de cerca de 0,01% p/v. Em outras modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de polissorbato 20 é de cerca de 0,02% p/v.

[0017] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um agente tonificante. Em certas modalidades específicas da invenção, a concentração de agente tonificante varia entre cerca de 0,1% e cerca de 10% p/v. Em certas modalidades específicas da invenção, o agente tonificante é um sacarídeo. Em algumas modalidades específicas da invenção, o sacarídeo é manitol. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de manitol varia entre cerca de 1% e cerca de 10% p/v. Em ainda outras modalidades específicas da invenção, a concentração de manitol é de cerca de 4%. Em modalidades específicas alternativas da invenção, o sacarídeo é sacarose. Em algumas modalidades específicas da invenção, a concentração de sacarose varia entre cerca de 1% e cerca de 10% p/v. Em algumas modalidades específicas da invenção, a concentração de sacarose é de cerca de 5% p/v. Em modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de sacarose é de cerca de 6% p/v. Em ainda outras modalidades específicas da invenção, a concentração de sacarose é de cerca de 4,5% p/v. Em outras modalidades alternativas específicas da invenção, o agente tonificante é cloreto de sódio. Em algumas modalidades específicas da invenção, a concentração de cloreto de sódio varia entre cerca de 0,01% e cerca de 1%. Em algumas modalidades específicas da invenção, a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 0,2%. Em outras modalidades específicas da invenção, o agente tonificante é uma combinação de sacarose e cloreto de sódio. Em modalidades específicas da invenção, a concentração de sacarose varia entre cerca de 1% e cerca de 10% p/v. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de cloreto de sódio varia entre cerca de 0,01% e cerca de 1%. Em modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de sacarose é de cerca de 6% p/v e a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 0,2%. Em ainda outras modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de sacarose é de cerca de 4,5% p/v e a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 0,2%.

[0018] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um aminoácido. Em certas modalidades específicas da invenção, a concentração de aminoácido varia entre cerca de 0,1% e cerca de 5% p/v. Em certas modalidades específicas da invenção, o aminoácido é prolina ou arginina. Em modalidades específicas da invenção, a concentração de prolina ou arginina varia entre cerca de 1% e cerca de 2% p/v. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de prolina é de cerca de 1,5% p/v. Em modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de arginina é de cerca de 1% p/v.

[0019] Em certas modalidades da invenção, a formulação compreende ainda um aminoácido. Em certas modalidades específicas da invenção, a concentração de aminoácido varia entre cerca de 0,1% e cerca de 5% p/v. Em certas modalidades específicas da invenção, o aminoácido é prolina ou arginina. Em modalidades específicas da invenção, a concentração de prolina ou arginina varia entre cerca de 1% e cerca de 2% p/v. Em outras modalidades específicas da invenção, a concentração de prolina é de cerca de 1,5% p/v. Em modalidades específicas alternativas da invenção, a concentração de arginina é de cerca de 1% p/v.

[0020] Em certas modalidades da invenção, a formulação é uma formulação líquida. Em outras modalidades específicas da invenção, a formulação é uma formulação liofilizada.

[0021] Em certas modalidades da invenção, a formulação é estável por pelo menos 6 meses a +5°C. Em modalidades alternativas da invenção, a formulação é estável por pelo menos 9 meses a +5°C.

[0022] Em certas modalidades da invenção, a formulação exibe uma quantidade reduzida de pelo menos um subprodutos selecionado do grupo que consiste em agregados, meias-moléculas, produtos de degradação, proteínas de baixo peso molecular, proteínas de alto peso molecular, e rearranjos de isoformas ácidas/básicas/neutras do anticorpo em relação a uma formulação anti-LIGHT de referência compreendendo um anticorpo anti-LIGHT em solução salina tamponada com fosfato a um pH 7,3 ou uma formulação anti-CXCR5 de referência compreendendo um anticorpo anti-LIGHT em solução salina tamponada com fosfato a um pH 7,3.

[0023] Em certas modalidades específicas da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo líquida e estável para administração subcutânea, a formulação compreendendo: a) cerca de 150 mg/mL de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,005% de polissorbato 20; e d) cerca de 4% de manitol; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[0024] Em outras modalidades específicas da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo líquida e estável para administração intravenosa, a formulação compreendendo: a) cerca de 50 mg/mL de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; e c) cerca de 0,01% de polissorbato 20; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[0025] Em ainda outras modalidades específicas da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo liofilizada e estável adequada para administração intravenosa, a formulação compreendendo: a) cerca de 50 mg/mL de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,01% de polissorbato 20; d) cerca de 5% de sacarose; e e) cerca de 1,5% de prolina; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[0026] Em modalidades específicas alternativas da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 20 mg/mL de um anticorpo anti-CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,02% de polissorbato 20; d) cerca de 6% de sacarose; e e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

[0027] Em outras modalidades específicas alternativas da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,01% de polissorbato 20; d) cerca de 4,5% de sacarose; e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; e f) cerca de 1% de arginina; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

[0028] Em certas modalidades da invenção, a invenção oferece um kit compreendendo um recipiente compreendendo: 1) a formulação de qualquer uma das reivindicações anteriores, e 2) uma bula ou instruções de administração e uso da formulação. Em certas modalidades da invenção, a bula compreende um ou mais dos seguintes itens: instruções de administração da formulação, instruções de uso da formulação, instruções referentes às condições de armazenamento da formulação, informações referentes ao lote e batelada da formulação e/ou kit, informações referentes à composição da formulação, informações de segurança, informações referentes a possíveis reações adversas, efeitos secundários, e/ou efeitos colaterais relacionados com a administração da formulação, ou informações referentes a possíveis indicações e/ou contraindicações da formulação.

[0029] Em certas modalidades da invenção, a invenção oferece um dispositivo pré-preenchido ou recipiente pré-preenchido, tal como uma seringa, cartucho, frasco, ampola, ou autoinjetor compreendendo a formulação da invenção. Em certas outras modalidades, a invenção oferece um kit compreendendo tal seringa, cartucho, frasco, ampola, ou autoinjetor pré-preenchido.

[0030] Em certas modalidades, a invenção oferece um método para o tratamento de uma doença do intestino inflamado compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma formação da invenção.

[0031] Em certas outras modalidades, a invenção oferece um método para o tratamento de atrite reumatoide compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma formação da invenção.

[0032] Em certas modalidades, a invenção oferece uma formulação para uso em um método de diagnóstico ou tratamento do corpo humano ou animal. Em modalidades específicas, a formulação é usada no tratamento de doenças do intestino inflamado. Em modalidades alternativas, a formulação é usada no tratamento de artrite reumatoide.

[0033] Em certas modalidades da invenção, a invenção oferece um método para a preparação de uma formulação da invenção compreendendo misturar os componentes da formulação e ajustar o pH, onde a preparação é efetuada em condições estéreis ou ed under sterile conditions ou a formulação é esterilizada depois de misturados os componentes e do ajuste do pH ou ambos.

[0034] Em certas modalidades específicas da invenção, a invenção oferece um método para a preparação de uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) apresentar um agente de ligação anti-LIGHT; b) ressuspender o agente de ligação anti-LIGHT em cerca de 5 a cerca de 50 mM de tampão citrato; e c) ajustar o pH da formulação em cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0.

Breve Descrição das Figuras

[0035] A Figura 1 é uma imagem de um gel mostrando os resultados de experimentos desnaturados de focalização isoelétrica que foram usados para determinar o ponto isoelétrico (pI) do anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8 formulado em solução salina tamponada com fosfato a um pH 7,3 a uma concentração de 5,5 mg/mL (a "formulação original", "formulação em PBS", ou "lote de referência"). Faixas 1 e 5: "IEF Calibration Kit High Range" pI 5-10,5; faixas 2 e 4: uma primeira batelada do lote de referência; faixas 3 e 4: uma segunda batelada do lote de referência. Os valores do pI estão indicados por números.

[0036] A Figura 2 é uma imagem de um gel de SDS-PAGE que comparou diferentes bateladas do lote de referência em condições redutoras e não redutoras. Faixas 1 e 10: "Biorad Precision Plus Protein Standard"; faixa 5: vazia; faixa 2: uma primeira batelada do lote de referência em condições não reduzidas; faixas 3 e 4: uma segunda batelada do lote de referência em condições não reduzidas; faixa 6: uma primeira batelada do lote de referência em condições reduzidas; faixas 7 e 8: uma segunda batelada do lote de referência em condições reduzidas; e faixa 9: controle do sistema. As dimensões estão indicadas por números nas fileiras.

[0037] A Figura 3 mostra um gráfico de ELISA que foi usado para determinar a atividade fixadora de antígeno das primeira e segunda bateladas do lote de referência.

[0038] A Figura 4 mostra um cromatograma de cromatografia por exclusão de tamanhos (SEC) da primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 4, a SEC detectou proteínas de alto peso molecular (HMWP), por exemplo, di-/oligômeros (RRT0,8) ou agregados, e proteínas de baixo peso molecular (LMWPs) ou produtos de degradação. A primeira batelada da batelada do lote de referência apresentou uma pureza de 97% de teor de monômeros.

[0039] A Figura 5 mostra um cromatograma de troca catiônica fraca para a primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 5, rearranjos de isoformas ácidas, neutras, e básicas ocorreram durante estudos de estabilidade. A primeira batelada do lote de referência teve uma distribuição de isoformas ácidas/neutras/básicas de 42,3/55,6/1,9%.

[0040] A Figura 6 mostra um termograma de calorimetria diferencial de varredura da primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 6, os três domínios do anticorpo desenrolaram a 68°C, 75°C, e 78°C.

[0041] A Figura 7 mostra um padrão de espalhamento de luz dinâmico da primeira batelada do lote de referência, que não foi filtrada. DLS foi usado para determinar o diâmetro hidrodinâmico da primeira batelada do monômero de anticorpo do lote de referência e potenciais agregados solúveis.

[0042] A Figura 8 mostra um padrão de espalhamento de luz dinâmico da primeira batelada do lote de referência, que foi filtrada. DLS foi usado para determinar o diâmetro hidrodinâmico da primeira batelada do monômero de anticorpo do lote de referência e potenciais agregados solúveis.

[0043] A Figura 9 é um fluxograma da processo de produção do produto medicamentoso para a formulação com alta concentração de anticorpo.

[0044] A Figura 10 mostra um padrão de espalhamento de luz dinâmico da formulação 14. DLS foi usado para determinar o diâmetro hidrodinâmico do monômero de anticorpo e potenciais agregados solúveis.

[0045] A Figura 11 é uma imagem de um gel mostrando os resultados da focalização isoelétrica para determinar o pI (ponto isoelétrico) do anticorpo líder para CXCR5. Faixas 1, 6: "IEF Calibration High Range pI Kit"; Faixas 2, 4: Anticorpo líder LP08031 como padrão de referência; e Faixas 3, 5: Substância medicamentosa com anticorpo líder, RSN0151.

[0046] A Figura 12 é uma imagem de um gel de SDS-PAGE que comparou diferentes bateladas da substância medicamentosa em condições redutoras e não redutoras. O gel também foi usado para determinar o peso molecular do anticorpo líder para CXCR5, e a presença de agregados.

[0047] A Figura 13 é um gráfico de ELISA que foi usado para determinar a atividade fixadora de antígeno do anticorpo líder para CXCR5 a um peptídio 28mero do antígeno CXCR5.

[0048] A Figura 14 é um cromatograma de SEC do anticorpo líder estressado para CXCR5. A SEC conseguiu detectar proteínas de alto peso molecular (HMWP), por exemplo, di-/oligômeros ou agregados e proteínas de baixo peso molecular (LMWP) ou produtos de degradação. O anticorpo líder para CXCR5 apresentou uma pureza de 99% de teor de monômeros.

[0049] A Figura 15 é um cromatograma de WCX que foi usado para determinar isoformas ácidas, neutras, e básicas do anticorpo líder para CXCR5. O anticorpo líder para CXCR5 apresentou uma distribuição de isoformas ácidas/neutras/básicas de 14/85/1%.

[0050] A Figura 16 é uma medição de DLS que foi usada para determinar o diâmetro hidrodinâmico do monômero de anticorpo e potenciais agregados solúveis.

[0051] A Figura 17 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão acetato pH 5,0 (esquerda) e pH 5,5 (direita); cada v. WFI (água para injeção) e depois de estresse térmico. Esta Figura mostra que o acetato é um sistema tampão adequado.

[0052] A Figura 18 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão histidina pH 6,0 (esquerda), pH 5,5 (middle), e pH 5,0 (direita); cada v. WFI (água para injeção) e depois de estresse térmico. Esta Figura mostra que histidina é um tampão adequado.

[0053] A Figura 19 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão TRIS pH 7,5 depois de UF/DF (esquerda) e depois de filtração (direita); cada v. WFI (água para injeção) e depois de estresse térmico. Esta Figura mostra que TRIS é um sistema tampão incompatível.

[0054] A Figura 20 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão citrato pH 6,0 depois de UF/DF e filtração.

[0055] A Figura 21 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão acetato pH 5,5 depois de UF/DF e filtração.

[0056] A Figura 22 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão succinato pH 5,0 depois de UF/DF e filtração.

[0057] A Figura 23 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão histidina pH 5,0 depois de UF/DF e filtração.

[0058] A Figura 24 é uma imagem do anticorpo líder para CXCR5 em tampão arginina pH 6,0 depois de UF/DF e filtração.

[0059] A Figura 25 é uma imagem do aspecto de soluções do anticorpo líder para CXCR5 LA_09_016 com diferentes tensoativos (sem tensoativo, polissorbato 20, polissorbato 80, Lutrol F68, Cremophor RH40, Solutol HS15, e SDS) depois de estresse mecânico (350 rpm, 2,5 h, RT).

[0060] A Figura 26 é um gráfico que mostra um aumento de dímeros em condições aceleradas, segundo analisado por SEC. Pode ser visto um aumento na formação de dímeros de até 10% depois de três meses de armazenamento em todas as quatro formulações de histidina. As formulações de acetato mostraram um aumento no teor de dímeros de até 6%. Em todas as quatro formulações de citrato, a concentração de dímeros ficou abaixo de 2%, mesmo depois de três meses a +40°C.

[0061] A Figura 27 é um gráfico mostrando um aumento de isoformas básicas em condições aceleradas, segundo analisado por WCX. Histidina é pior para a estabilidade do anticorpo líder para CXCR5 em condições aceleradas. Um leve aumento de isoformas básicas pode ser observado para todas as quatro formulações de acetato. Curiosamente, não foi possível discriminar entre as quatro formulações de citrato.

[0062] A Figura 28 é um gráfico mostrando uma diminuição de isoformas neutras em condições aceleradas, segundo analisado por WCX. Esta Figura mostra uma forte diminuição em isoformas neutras para as formulações de histidina. Uma leve diminuição foi vista em acetato. Citrato foi o menos afetado.

[0063] A Figura 29 mostra o delta pH de todas as quatro formulações (A-D) em citrato em condições aceleradas. As formulações com pH mais estabilizado são aquelas tamponadas com citrato, e especialmente as formulações B e D.

[0064] A Figura 30 mostra o delta pH de todas as quatro formulações (A-D) em tampão acetato em condições aceleradas. Em soluções tamponadas com acetato do anticorpo líder para CXCR5, o pH foi desviado para um valor mais alto.

[0065] A Figura 31 mostra o delta pH de todas as quatro formulações (A-D) em tampão histidina em condições aceleradas. Em soluções tamponadas com histidina do anticorpo líder para CXCR5, o pH diminuiu ligeiramente.

[0066] A Figura 32 é um gráfico mostrando o diâmetro hidrodinâmico de CXCR5 LA_09_027 A-D depois de 3 meses de armazenamento a 40°C. As formulações tamponadas com citrato mostraram apenas poucos agregados depois de três semanas na formulação C, e depois de seis semanas de armazenamento na formulação A. Alguns agregados também puderam ser detectados depois de três meses na formulação B. Porém, em comparação com formulações tamponadas com acetato, a quantidade foi muito pequena.

[0067] A Figura 33 é um gráfico mostrando o diâmetro hidrodinâmico de CXCR5 LA_09_028 A-D depois de 3 meses de armazenamento a 40°C. A formulação tamponada com acetato C apresentou alguns agregados <200 nm depois de três semanas. A formulação A apresentou alguns agregados depois de três meses.

[0068] A Figura 34 é um diagrama mostrando o efeito de ser aumentada a concentração do anticorpo líder para CXCR5 sobre o Z médio. O anticorpo líder para CXCR5 apresentou um aumento significativ no diâmetro hidrodinâmico (Z médio) aumentando a concentração do anticorpo.

[0069] A Figura 35 é um diagrama mostrando o efeito de diferentes stabilizantes (excipientes) sobre o Z médio a 100 mg/mL do anticorpo líder para CXCR5 depois de estresse térmico. O Z médio foi medido antes e depois de estresse térmico. O efeito estabilizante foi similar para todos os excipientes testados, mas o aumento no Z médio geralmente foi reduzido ao se usar aminoácidos como estabilizantes (arginina, lisina, ou glicina). A lisina foi excluída devido a um teor mais alto de agregados depois do estresse. A arginina apresentou um efeito melhor que o da glicina.

[0070] A Figura 36 é um diagrama mostrando o efeito de diferentes estabilizantes sobre Z médio a 100 mg/mL de anticorpo líder para CXCR5 depois de estresse mecânico. O Z médio foi medido antes e depois do estresse mecânico. A mesma redução no Z médio foi observada na presença de aminoácidos. A sacarose teve um efeito protetor melhor que o da trealose contra estresse mecânico. A arginina e aglicina tiveram um desempenho melhor em combinação com NaCl.

[0071] A Figura 37 é um conjunto de gráficos mostrando a distribuição de tamanhos de partícula, segundo medida por DLS, do anticorpo líder para CXCR5 formulado em 10 mM de tampão citrato a um pH 6 antes do estresse mecânico (A) e depois do estresse mecânico (B). Uma espécie de peso molecular mais alto foi medida por DLS depois do estresse mecânico de DS.

[0072] A Figura 38 é um conjunto de gráficos mostrando a distribuição de tamanhos de partícula, segundo medida por DLS, de formulações de um protótipo do produto medicamentoso de anticorpo líder para CXCR5 (A-D; Tabela 111) antes (A) e depois (B) do estresse mecânico.

Descrição Detalhada A. Definições

[0073] A menos definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica.

[0074] Deve-se observar que conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" também incluem a referência plural, a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto.

[0075] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 10%, tal como dentro de 5% (ou 1% ou menos) de um dado valor ou faixa.

[0076] Os termos "administrar" ou "administração" referem-se ao ato de injetar ou de alguma forma distribuir fisicamente uma substância que existe fora do corpo (por exemplo, uma formulação da invenção) em um paciente, tal como por distribuição mucosa, intradérmica, intravenosa, subcutânea, intramuscular e/ou qualquer outro método de distribuição física descrita neste relatório ou conhecida na literatura. Quando uma doença, ou um sintoma da mesma, está sendo tratada, a administração da substância ocorre tipicamente depois da manifestação da doença ou de sintomas da mesma. Quando uma doença ou seus sintomas estão sendo prevenidos, a administração da substância ocorre tipicamente antes da manifestação da doença ou de sintomas da mesma.

[0077] No contexto de um polipeptídio, o termo "análogo" refere-se a um polipeptídio que possui uma função similar ou idêntica à de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5, mas não necessariamente compreende uma sequência aminoacídica similar ou idêntica de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5, ou possui uma estrutura similar ou idêntica de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5. Um polipeptídio que tem uma sequência aminoacídica similar refere-se a um polipeptídio que satisfaz pelo menos um dos seguintes itens: (a) um polipeptídio tendo uma sequência aminoacídica que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência aminoacídica de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5 (por exemplo, SEQ ID N°: 9 ou SEQ ID N°: 14, respectivamente), um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5 já descrito neste relatório; (b) um polipeptídio codificado por uma sequência nucleotídica que hibridiza em condições rigorosas para uma sequência nucleotídica codificando um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5 (ou região VH ou VL do mesmo) já descrito neste relatório de pelo menos 5 resíduos aminoacídicos, pelo menos 10 resíduos aminoacídicos, pelo menos 15 resíduos aminoacídicos, pelo menos 20 resíduos aminoacídicos, pelo menos 25 resíduos aminoacídicos, pelo menos 40 resíduos aminoacídicos, pelo menos 50 resíduos aminoacídicos, pelo menos 60 resíduos aminoacídicos, pelo menos 70 resíduos aminoacídicos, pelo menos 80 resíduos aminoacídicos, pelo menos 90 resíduos aminoacídicos, pelo menos 100 resíduos aminoacídicos, pelo menos 125 resíduos aminoacídicos, ou pelo menos 150 resíduos aminoacídicos (vide, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); e (c) um polipeptídio codificado por uma sequência nucleotídica que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência nucleotídica encoding um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5 (ou região VH ou VL do mesmo) já descrito neste relatório. Um polipeptídio com estrutura similar a um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5 refere-se a um polipeptídio que tem uma estrutura secundária, terciária ou quaternária similar de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, um epítopo de LIGHT ou CXCR5, ou um anticorpo para LIGHT ou CXCR5. A estrutura de um polipeptídio pode ser determinada por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo, porém sem limitação, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear, e microscopia eletrônica cristalográfica.

[0078] Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências aminoacídicas de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas com o propósito de comparação de ideal (por exemplo, hiatos podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos para alinhamento ideal com a segunda sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos). Os resíduos aminoacídicos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo aminoacídico ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = número de posições sobrepostas idênticas/número total de posições X 100%). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento.

[0079] A determinação da percentagem de identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências aminoacídicas ou sequências de ácido nucleico) pode ser feita utilizando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268, modificado por Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877. Tal algoritmo foi incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. As buscas por nucleotídeos no programa BLAST podem ser efetuadas com a configuração de parâmetros do programa para nucleotídeos NBLAST, por exemplo, para escore=100, comprimento de palavra=12 para obter sequências nucleotídicas homólogas às moléculas de ácido nucleico de interesse. As buscas por proteínas no programa BLAST podem ser efetuadas com a configuração de parâmetros do programa XBLAST, por exemplo, para escore 50, comprimento de palavra=3 para obter sequências aminoacídicas homólogas a uma molécula de proteína de interesse. Para obter alinhamentos com hiatos para fins de comparação, o programa Gapped BLAST pode ser utilizado da maneira descrita em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402. Alternativamente, o PSI BLAST pode ser usado para efetuar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI Blast são utilizados, os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (vide, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) na rede mundial em ncbi dot nlm dot nih dot gov). Um outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo foi incorporado no programa ALIGN (version 2.0), que faz parte do pacote de softwares de alinhamento de sequências GCG. Quando o programa ALIGN é utilizado para comparar sequências aminoacídicas, quences, uma "Tabela de peso de resíduo PAM120" ("PAM120 weight residue table"), uma defasagem (penalty de comprimento do hiato de 12, e uma defasagem de comprimento do hiato de 4 podem ser usados.

[0080] A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando-se técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem a permissão de hiatos. No cálculo da percentagem de identidade, tipicamente somente as correspondências exatas são contadas.

[0081] Um "antagonista" ou "inibidor" refere-se a uma molécula capazz de inibir uma ou mais atividades biológicas de uma molécula alvo. Antagonistas podem interferir na ligação de receptor a um ligando e vice-versa, incapacitando ou eliminando as células ativadas por um ligando, e/ou interferindo na ativação do receptor ou ligando (por exemplo, ativação da tirosina quinase) ou transdução de sinal depois da ligação do ligando a um receptor. O antagonista pode bloquear completamente as interações receptor-ligando ou pode reduzir substancialmente essas interações. Todos esses pontos de intervenção por um antagonista devem ser considerados equivalentes para efeitos da presente invenção.

[0082] Por exemplo, um "antagonista" ou "inibidor" de LIGHT refere-se a uma molécula que é capaz de inibir ou de alguma forma diminuir uma ou mais das atividades biológicas de LIGHT, tal como em uma célula expressando LIGHT ou em uma célula expressando um ligando de LIGHT, tal como um receptor de LIGHT. Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos antagonísticos que inibem ou de alguma forma reduzem a secreção de CCL20, IL-8, e/ou de RANTES a partir de uma célula tendo um receptor de LIGHT expresso na superfície celular (por exemplo, HVEM, LTβR e/ou DcR3) quando o referido anticorpo entra em contato com a referida célula. Em algumas modalidades, um antagonista de LIGHT (por exemplo, um anticorpo antagonístico da invenção) pode, por exemplo, agir inibindo ou de alguma forma diminuindo a ativação e/ou as vias de sinalização celular da célula expressando um receptor de LIGHT, dessa forma inibindo uma atividade biológica mediada pelo LIGHT da célula em relação à atividade biológica mediada pelo LIGHT na ausência de antagonista. Em certas modalidades da invenção, os anticorpos antiLIGHT são anticorpos anti-LIGHT antagonísticos totalmente humanos, tais como anticorpos anti-LIGHT antagonísticos monoclonais totalmente humanos.

[0083] Por exemplo, um "antagonista" ou "inibidor" de CXCR5 refere-se a uma molécula capaz de inibir uma ou mais atividades biológicas, tais como sinalização, pelo CXCR5. Portanto, incluídos no escopo da invenção encontram-se antagonistas (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que se ligam ao CXCR5, CXCL13 ou outros ligandos de CXCR5, ou um complexo de CXCR5 e um ligando do mesmo, tal como CXCL13; variantes ou derivados de sequências aminoacídicas de CXCR5 ou CXCL13 que antagonizam a interação entre CXCR5 e um ligando, tal como CXCL13; CXCR5 solúvel, opcionalmente fundido a uma molécula heteróloga tal como uma região de imunoglobulina (por exemplo, uma imunoadesina); um complexo compreendendo CXCR5 em associação com um outro receptor ou molécula biológica; peptídios de sequência sintética ou nativa que se ligam ao CXCR5; e assim por diante.

[0084] Os termos "anticorpo", "imunoglobulina, ou "Ig" podem ser usados intercambiavelmente neste relatório. O termo anticorpo inclui, porém sem limitação, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, Fvs de cadeia simples (scFv) (por exemplo, incluindo monospecífico, bispecífico, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs com ligação dissulfeto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), e fragmentos fixadores de epítopos de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, domínios de ligação a antígenos ou moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um antígeno LIGHT (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo antiLIGHT) ou antígeno CXCR5 (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti- CXCR5). Os anticorpos anti-LIGHT ou anti-CXCR5 podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LIGHT são totalmente humanos, tais como anticorpos anti-LIGHT monoclonais totalmente humanos. Em certas modalidades, os anticorpos anti-LIGHT são anticorpos IgG, anticorpos IgG4 humana. Alternativamente, em algumas modalidades, os anticorpos anti-CXCR5 são humanizados, tais como anticorpos anti-CXCR5 monoclonais humanizados. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CXCR5 são anticorpos IgG, anticorpos IgG4 humanizada.

[0085] Conforme usado neste relatório, o termo "anticorpo anti LIGHT" significa um anticorpo ou polipeptídio derivado do mesmo (um derivativo) que se liga especificamente a um LIGHT humano já definido neste relatório, incluindo, porém sem limitação, moléculas que inibem ou reduzem substancialmente a ligação do LIGHT aos seus ligandos ou inibem a atividade do LIGHT.

[0086] Conforme usado neste relatório, o termo "anticorpo anti- CXCR5" significa um anticorpo ou polipeptídio derivado do mesmo (um derivativo) que se liga especificamente ao CXCR5 humano já definido neste relatório, incluindo, porém sem limitação, moléculas que inibem ou reduzem substancialmente a ligação do CXCR5 aos seus ligandos ou inibem a atividade do CXCR5.

[0087] O termo "atividade de células B" significa níveis de células B mais altos que o normal, que pode ser local, ou evidência de uma manifestação ou função biológica de uma célula B, tal como expressão de anticorpo, presença ou atividade de tirosina quinase de Bruton, expressão ou presença de CD19, expressão ou presença de fator de ativação de células B, e assim por diante.

[0088] O termo "agente de ligação" significa qualquer molécula, tal como um anticorpo, um siRNA, um ácido nucleico, um aptâmero, uma proteína, ou um composto orgânico de molécula pequena, que se liga ou que especificamente se liga ao LIGHT ou CXCR5, ou uma variante ou um fragmento da mesma.

[0089] O termo "subproduto" inclui produtos indesejados, que deprecie ou diminua a proporção de agente de ligação terapêutico/profilático, tal como um anticorpo, em uma dada formulação. Por exemplo, subprodutos típicos incluem agregados do anticorpo, fragmentos do anticorpo, por exemplo, produzidos pela degradação do anticorpo por desamidação ou hidrólise, ou misturas dos mesmos. Tipicamente, agregados são complexos que têm um peso molecular maior que o anticorpo monomérico. Produtos de degradação de anticorpo podem incluir, por exemplo, fragmentos do anticorpo, por exemplo, produzidos por desamidação ou hidrólise. Tipicamente, produtos de degradação são complexos que têm um peso molecular menor o anticorpo monomérico. No caso de um anticorpo IgG, tais produtos de degradação têm menos de cerca de 150 kD.

[0090] Os termos "composição" e "formulação" destinam-se a abranger um produto contendo os ingredientes especificados (por exemplo, um anticorpo anti-LIGHT ou um anticorpo anti-CXCR5), opcionalmente, nas quantidades especificadas, assim como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos produtos especificados, opcionalmente, nas quantidades especificadas.

[0091] Os termos "região constante" ou "domínio constante" referem-se a uma porção terminal carbóxi da cadeia leve e pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno mas exibe várias funções efetoras, tais como interação com o receptor de Fc. Os termos referem-se à porção de uma molécula de imunoglobulina tendo uma sequência aminoacídica conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação ao antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e o domínio CHL da cadeia leve.

[0092] O termo "CXCR5" refere-se à molécula de ocorrência natural conhecida encontrada em linfócitos, particularmente células B, e particularmente células B naive; a uma tal molécula isolada de tais células; a tal molécula produzida de forma recombinante usando materiais e meios conhecidos, e usando um ácido nucleico codificando um CXCR5; assim como a porção de CXCR5, tais como o domínio extracelular (EC), que conserva as características e propriedades relevantes para a prática da presente invenção, tal como a ligação ao CXCL13. Uma molécula de CXCR5 solúvel pode consistir essencialmente no domínio EC de CXCR5, que inclui, geralmente, cerca de dos sessenta primeiros aminoácidos da molécula, isto é, a porção terminal amino de CXCR5.

[0093] O CXCR5 é um receptor não promíscuo. CXCL13 é um ligando de CXCR5 e é expresso constitutivamente em células estromais, tais como células dendríticas foliculares, e tecidos linfoides. O CXCL13 atrai especificamente as células B e um pequeno subconjunto de células T chamadas células T foliculares auxiliares B, TFH. Isto não deve ser algo inesperado dadas as muitas interações entre as populações de células T e de células B no sistema imunológico. Além disso, células T ativadas induzem ou suprarregulam a expressão de CXCR5. Foi constatado que a infiltração de linfócitos em centros germinais ectópicos terciários (GCs) está bem correlacionada com severidade aumentada da doença e colapso da tolerância em certos distúrbios que se apresentam com essas estruturas semelhantes a nodos linfáticos atípicas. Usando modelos murinos in vivo, tais como camundongos CXCR5-/- e CXCL13-/-, a ausência seja do receptor ou do ligando resulta em uma estrutura fina de GC alterada devido à localização alterada de células T e B, e possivelmente interação. Esses camundongos também ficam protegidos contra o desenvolvimento de artrite severa induzida por colágeno (CIA). Como o CXCR5 é seletivamente expresso em células B maduras, que estão associadas à patogênese da RA, o bloqueio deste receptor vai modular a resposta artritogênica nos indivíduos afetados. O tratamento de artrite reumatoide com biológicos (isto é, anticorpos anti-TNFQ e anti-CD20, Rituximab) mostrou-se clinicamente eficaz; em particular, pacientes fazendo terapia direcionada para células B apresentaram melhoras de longa duração nos sinais clínicos e sintomas. A vetorização seletiva de CXCR5, que só é expresso em células B maduras e células T auxiliares B, não vai afetar o desenvolvimento de células B ou imunocomprometer o paciente. Ao contrário do Rituximab, o presente anticorpo anti-CXCR5 é um anticorpo neutralizante que não medeia a citotoxicidade celular.

[0094] Uma "doença associada a CXCR5" é uma enfermidade, distúrbio, doença, condição, anormalidade, e assim por diante, que é caracterizada ou causada por superexpressão ou níveis aumentados de CXCL13 ou outro ligando de CXCR5, níveis aumentados de células B, níveis aumentados de atividade das células B, níveis aumentados de CXCR5, ou metabolismo e atividade inadequados de CXCR5.

[0095] O termo "epítopo" refere-se a uma região localizada na superfície de um antígeno, tal como um polipeptídio LIGHT ou CXCR5, ou fragmento de polipeptídio LIGHT ou CXCR5, que é capaz de se ligar a uma ou mais regiões de ligação a antígeno de um agente de ligação, tal como um anticorpo, e que tem atividade antigênica ou imunogênica em um animal, tal como um mamífero, tal como em um ser humani, que é capaz de produzir uma resposta imunológica. Um epítopo tendo atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídio que produz uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo tendo atividade antigênica é uma porção de um polipeptídio à qual um anticorpo se liga especificamente, segundo determinado por qualquer método bastante conhecido na literatura, por exemplo, tal como um imunoensaio. Os epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Epítopos geralmente consistem em agrupos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e têm características estruturais tridimensionais, assim como características de carga específicas. Uma região de um polipeptídio que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídio ou o epítopo pode derivado de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídio. O epítopo pode ser ou não um aspecto superficial tridimensional do antígeno. Em certas modalidades, um epítopo de LIGHT ou CXCR5 é um aspecto superficial tridimensional de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5 (por exemplo, em uma forma trimérica de um polipeptídio de LIGHT). In other embodiments, um epítopo de LIGHT é um aspecto linear de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5 (por exemplo, em uma forma trimérica ou monomérica do polipeptídio LIGHT). Os anticorpos anti-LIGHT ou anti-CXCR5 podem ligar-se especificamente a um epítopo da forma monomérica (desnaturada) de LIGHT ou CXCR5, a um epítopo da forma trimérica (nativa) de LIGHT ou CXCR5, ou tanto à forma monomérica (desnaturada) quanto à forma trimérica (nativa) de LIGHT ou CXCR5. Em modalidades específicas, os anticorpos antiLIGHT ligam-se especificamente a um epítopo da forma trimérica de LIGHT mas não se ligam especificamente à forma monomérica de LIGHT.

[0096] O termo "excipientes" refere-se a substâncias inertes que são comumente usadas como diluente, veículo, preservativo, aglutinante, agente estabilizante etc. para drogas e inclui, porém sem limitação, proteínas (por exemplo, albumina sérica etc.), aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos graxos e fosfolipídios (por exemplo, alquil sulfonatos, caprilato, etc.), tensoativos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensoativo não iônico, etc.), sacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, trealose, etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol etc.). Vide, também, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa., que está aqui incorporado em sua integridade a título de referência.

[0097] No contexto de um peptídio ou polipeptídio, o termo "fragmento" refere-se a um peptídio ou polipeptídio que compreende menos que a sequência aminoacídica de comprimento integral. Tal fragmento pode resultar, por exemplo, de um truncamento no terminal amino, um truncamento no terminal carbóxi, e/ou uma deleção interna de um resíduo(s) da sequência aminoacídica. Os fragmentos podem resultar, por exemplo, de emenda de RNA alternativa ou de atividade de protease in vivo. Em certas modalidades, fragmentos de hLIGHT ou hCXCR5 incluem polipeptídios compreendendo uma sequência aminoacídica de pelo menos 5 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 10 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 15 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 20 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 25 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 40 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 50 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 60 contiguous amino residues, pelo menos 70 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 80 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 90 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos contiguous 100 resíduos aminoacídicos, pelo menos 125 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 150 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 175 resíduos aminoacídicos contíguos, pelo menos 200 resíduos aminoacídicos contíguos, ou pelo menos 250 resíduos aminoacídicos contíguos da sequência aminoacídica de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5 ou um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídio LIGHT ou CXCR5. Em uma modalidade específica, um fragmento de um polipeptídio LIGHT ou CXCR5 ou um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno LIGHT ou CXCR5 mantém pelo menos 1, pelo menos 2, ou pelo menos 3 funções do polipeptídio ou anticorpo.

[0098] Os termos "anticorpo completamente humano" ou "anticorpo humano" são usados intercambiavelmente neste relatório e referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável humana e, possivelmente, uma região constante humana. Em modalidades específicas, os termos referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável e uma região constante de origem humana. Anticorpos anti-LIGHT "totalmente humanos", em certas modalidades, também podem abranger anticorpos que ligam polipeptídios de LIGHT e são codificados por sequências de ácidos nucleicos que são variantes somáticas de ocorrência natural de uma sequência de ácidos nucleicos de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em uma modalidade específica, os anticorpos anti-LIGHT são anticorpos totalmente humanos. O termo "anticorpo completamente humano" inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes correspondentes a sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana segundo descrito por Kabat et al. (See Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Métodos de produção de anticorpos totalmente humanos são conhecidos na literatura.

[0099] A expressão "anticorpo humano recombinante" inclui anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados, ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatoriais recombinantes, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou vaca) que é transgênico e/ou transcromossômico para de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados, ou isolados por qualquer outro meio que envolva emenda de sequências gênicas de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (vide Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e portanto as sequências aminoacídicas das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências de VH e VL de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.

[00100] Um "agente de ligação de IgG4" ou um "agente de ligação compreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc de IgG4" referem-se ambos a agentes de ligação descritos neste relatório que incluem pelo menos um fragmento de IgG4 Fc. Em certas modalidades, o fragmento compreende 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 ou 220 aminoácidos da região Fc de IgG4. Em outras modalidades, o fragmento inclui 1050, 50-100, 100-150, ou 150-200 aminoácidos da região Fc de IgG4. Em outras modalidades, a porção da região Fc de IgG4 pode ter uma certa homologia com a região Fc de IgG4. Por exemplo, o agente de ligação à IgG4 pode incluir uma porção de uma proteína com mais de 50, 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de homologia com a região Fc de IgG4. Regiões Fc exemplificativas de IgG4 estão descritas em todo o relatório descritivo.

[00101] O termo "cadeia pesada", quando usado com referência a um anticorpo, refere-se a cinco tipos distintos, denominados alfa (□), delta (Δ), epsilon (ε), gama (y), e mu (μ), com base na sequência aminoacídica do domínio constante da cadeia pesada. Esses tipos distintos de cadeias pesadas são bastante conhecidos na literatura e dão lugar a cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, a saber, IgG1, IgG1, IgG3, e IgG4. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é uma cadeia pesada humana.

[00102] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a alvo de anticorpos) que contêm sequências derivadas de imunoglobulina não humana, em comparação com um anticorpo humano. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de um, e tipicamente dois, domínios variáveis, no qual todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana ou substancialmente todas as regiões FR são àquelas de sequência gabarito de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela do gabarito de imunoglobulina humana escolhido. Em geral, o objetivo é ter uma molécula de anticorpo que seja minimamente imunogênica sem um ser humano. Assim sendo, é possível que um ou mais aminoácidos em uma ou mais CDRs também possam trocados por um que seja menos imunogênico para um hospedeiro humano, sem minimizar substancialmente a função de ligação específica de uma ou mais CDRs para CXCR5 ou para CXCL13. Alternativamente, a FR pode ser não humana mas aqueles aminoácidos que são mais imunogênicos são substituídos por outros menos imunogênicos. Não obstante, enxerto de CDR, conforme discutido acima, não é a única maneira de se obter um anticorpo humanizado. Por exemplo, apenas modificar as regiões CDR pode ser insuficiente uma vez que não é raro que resíduos de esqueleto tenham um papel na determinação da estrutura tridimensional das alças de CDR e da afinidade geral do anticorpo para seu ligando. Portanto, qualquer meio pode ser praticado para que a molécula de anticorpo parental não humana seja modificada para se tranformar em uma molécula que seja menos imunogênica para um ser humano, e a identidade de sequência total com um anticorpo humano nem sempre é uma necessidade. Assim sendo, a humanização também pode ser obtida, por exemplo, pela mera substituição de apenas alguns resíduos, particularmente aqueles que ficam expostos na molécula de anticorpo e não enterrados na molécula, e por conseguinte, não necessariamente acessível para o sistema imunológico do hospedeiro. Este método é aqui ensinado para a substituição de resíduos "móveis" ou "flexíveis" na molécula de anticorpo, o objetivo sendo reduzir ou amortecer a imunogenicidade da molécula resultante sem compreender a especificidade do anticorpo para seu epítopo ou determinante. Vide, por exemplo, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 e Patente US N° 5.869.619.

[00103] Um agente de ligação "isolado" ou "purificado", tal como um anticorpo, é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte celular ou tecidual da qual o agente de ligação é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizado quimicamente. Por exemplo, a linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um anticorpo nas quais o anticorpo é separado dos componentes celulares das células das quais ele é isolado ou produzido de forma recombinante. Portanto, um anticorpo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de anticorpo tendo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína heteróloga (também denominada neste relatório "proteína contaminante"). Quando o anticorpo é produzido de forma recombinante, também é desejável que ele seja substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação de proteína. Quando o anticorpo é produzido por síntese química, em algumas modalidades ele é substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos, isto é, ele é separado dos precursores químicos ou outras substâncias químicas que estejam envolvidos na síntese da proteína. Por conseguinte, tais preparações do anticorpo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou outros compostos que não o anticorpo de interesse. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-LIGHT ou anti-CXCR5 são isolados ou purificados.

[00104] O termo "LIGHT humano", "hLIGHT" ou "polipeptídio hLIGHT" e termos similares referem-se a polipeptídios ("polipeptídios", "peptídios" e "proteínas" são usados intercambiavelmente neste relatório) compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 9 e polipeptídios relacionados, inclusive variantes SNP dos mesmos. Polipeptídios relacionados incluem variantes alélicas (por exemplo, variantes SNP); variantes de emenda; fragmentos; derivados; variantes de substituição, deleção, e inserção; polipeptídios de fusão; e homólogos interespécies, em algumas modalidades, que conservam a atividade de LIGHT e/ou são suficientes para gerar uma resposta imunológica anti-LIGHT. Também estão abrangidas formas solúveis de LIGHT que são suficientes para gerar uma resposta imunológica antiLIGHT. Como será apreciado pelos especialistas na técnica, um agente de ligação anti-LIGHT, tal como um anticorpo, pode ligar-se a um polipeptídio de LIGHT, fragmento de polipeptídio, antígeno, e/ou epítopo, já que um epítopo faz parte do antígeno maior, que faz parte do fragmento do polipeptídio maior, que, por sua vez, faz parte do polipeptídio maior. O hLIGHT pode existir em uma forma trimérica (nativa) ou monomérica (desnaturada).

[00105] O termo "CXCR5 humano", "hCXCR5" ou "polipeptídio hCXCR5" e termos similares referem-se a polipeptídios ("polipeptídios", "peptídios" e "proteínas" são usados intercambiavelmente neste relatório) compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 14 e polipeptídios relacionados, inclusive variantes SNP dos mesmos. Polipeptídios relacionados incluem variantes alélicas (por exemplo, variantes SNP); variantes de emenda; fragmentos; derivados; variantes de substituição, deleção, e inserção; polipeptídios de fusão; e homólogos interespécies, em algumas modalidades, que conservam a atividade de CXCR5 e/ou são suficientes para gerar uma resposta imunológica anti-CXCR5. Também estão abrangidas formas solúveis de CXCR5 que são suficientes para gerar uma resposta imunológica anti-CXCR5. Como será apreciado pelos especialistas na técnica, um agente de ligação anti-CXCR5, tal como um anticorpo, pode ligar-se a um polipeptídio CXCR5, fragmento de polipeptídio, antígeno, e/ou epítopo, já que um epítopo faz parte do antígeno maior, que faz parte do fragmento do polipeptídio maior, que, por sua vez, faz parte do polipeptídio maior.

[00106] O termo "numeração de Kabat", e termos similares, são reconhecidos na literatura e referem-se a um sistema de numeração de resíduos aminoacídicos que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) que outros resíduos aminoacídicos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382391, e Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Para a região variável da cadeia pesada, a região hipervariável tipicamente varia das posições de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 65 para CDR2, e posições de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para a região variável da cadeia leve, a região hipervariável tipicamente varia das posições de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 56 para CDR2, e posições de aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

[00107] O termo "cadeia leve" quando usado com referência a um anticorpo, refere-se a dois tipos distintos, chamados capa (K) ou lambda (□) com base na sequência aminoacídica dos domínios constantes. Sequências aminoacídicas de cadeia leve são bastante conhecidas na literatura. Em algumas modalidades, a cadeia leve é uma cadeia leve humana.

[00108] Os termos "controlar", "controlando", e "controle" referem- se aos efeitos benéficos dos quais um indivíduo usufrui de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura da infecção. Em certas modalidades, um indivíduo recebe uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como uma formulação da invenção) para "controlar" uma doença mediada por LIGHT (por exemplo, doença intestinal crônica, IBD, doença de Crohn, colite ulcerativa, ou GVHD) ou uma doença mediada por CXCR5 (por exemplo, artrite reumatoide), um ou mais sintomas da mesma, a fim de prevenir a evolução ou a piora da doença.

[00109] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos, e cada anticorpo monoclonal vai tipicamente reconhecer um único epítopo no antígeno. Em algumas modalidades, um "anticorpo monoclonal" é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula. O termo "monoclonal" não está limitado a qualquer método particular de fazer o anticorpo. Os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método do hibridoma conforme descrito por Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975) ou podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos. Outros métodos para a preparação de linhagens de células clonais e de anticorpos monclonais expressos por elas são conhecidos na literatura (vide, por exemplo, Chapter 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed.; Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York).

[00110] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa que é aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou que está listada na Farmacopeia Americana, Farmacopeia Europeia ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos.

[00111] Por "excipiente farmaceuticamente aceitável" entende-se qualquer substância inerte que é combinada com uma molécula ativa, tal como um anticorpo monoclonal, para preparar uma forma de dosagem agradável ou conveniente. O "excipiente farmaceuticamente aceitável" é um excipiente que não é tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e é compatível com outros princípios da formulação compreendendo o anticorpo monoclonal.

[00112] Os termos "prevenir", "prevenindo", e "prevenção" referem- se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, recorrência, manifestação ou espalhamento de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 e/ou de sintomas relacionados com as mesmas, resultante da administração de uma terapia ou da combinação de terapias apresentadas neste relatório (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como uma formulação da invenção).

[00113] O termo "agente profilático" refere-se a qualquer agente pode inibir total ou parcialmente o desenvolvimento, recorrência, manifestação ou espalhamento de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 e/ou de sintomas relacionados com as mesmas em um indivíduo. Em certas modalidades, o termo "agente profilático" refere-se a uma formulação da invenção. Em certas outras modalidades, o termo "agente profilático" refere-se a um agente que não uma formulação da invenção. Em algumas modalidades, um agente profilático é um agente que é sabidamente útil ou que fora usado ou esteja sendo atualmente usado para prevenir uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 e/ou um sintoma relacionado com a mesma, ou que impede a manifestação, desenvolvimento, evolução e/ou severidade de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 e/ou um sintoma relacionado com a mesma. Em modalidades específicas, o agente profilático é um anticorpo anti-LIGHT totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal anti-LIGHT totalmente humano, ou um anticorpo anti- CXCR5 humanizado, tal como um anticorpo monoclonal anti-CXCR5 humanizado.

[00114] O termo "antígeno LIGHT" refere-se àquela porção de um polipeptídio LIGHT à qual um agente de ligação, tal como um anticorpo, liga-se especificamente. Um antígeno LIGHT também se refere a um análogo ou derivado de um polipeptídio LIGHT ou fragmento do mesmo ao qual um agente de ligação, tal como anticorpo, liga-se especificamente. Em algumas modalidades, um antígeno LIGHT é um antígeno LIGHT monomérico ou um antígeno LIGHT trimérico. Uma região de um polipeptídio LIGHT que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídio, ou o epítopo pode ser produzido a partir de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídio. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno. Uma região localizada na superfície de um antígeno LIGHT que é capaz de produzir uma resposta imunológica é um epítopo LIGHT. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno.

[00115] O termo "antígeno CXCR5" refere-se àquela porção de um polipeptídio CXCR5 à qual um agente de ligação, tal como um, liga-se especificamente. Um antígeno CXCR5 também se refere a um análogo ou derivado de um polipeptídio CXCR5 ou fragmento do mesmo ao qual um agente de ligação, tal como um anticorpo, liga-se especificamente. Uma região de um polipeptídio CXCR5 que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídio, ou o epítopo pode ser produzido a partir de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídio. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno. Uma região localizada na superfície de um antígeno CXCR5 que é capaz de produzir uma resposta imunológica é um epítopo CXCR5. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno.

[00116] Os termos "doença mediada por LIGHT" e "distúrbio mediado por LIGHT" são usados intercambiavelmente e referem-se a qualquer doença que seja completa ou parcialmente causada pelo LIGHT, ou seja, resultado de LIGHT. Em certas modalidades, o LIGHT é expresso aberrantemente (por exemplo, altamente) na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o LIGHT pode ser aberrantemente supra-regulado em um tipo de célula particular. Em outras modalidades, sinalização celular normal, aberrante, ou excessiva é causada pela ligação de LIGHT a um ligando de LIGHT. Em certas modalidades, o ligando de LIGHT é um receptor de LIGHT (por exemplo, HVEM, LTβR, ou DCR3), por exemplo, que é expresso na superfície de uma célula, tal como uma célula epitelial colônica. Em certas modalidades, a doença mediada por LIGHT é uma doença intestinal crônica, uma doença do intestino inflamado (IBD), tal como doença de Crohn (CD) ou colite ulcerativa (UC). Em outras modalidades, a doença mediada por LIGHT é a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).

[00117] Os termos "doença mediada por CXCR5" e "distúrbio mediado por CXCR5" são usados intercambiavelmente e referem-se a qualquer doença que seja completa ou parcialmente causada pelo CXCR5, ou seja, resultado de CXCR5. Em certas modalidades, o CXCR5 é expresso aberrantemente (por exemplo, altamente) na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, o CXCR5 pode ser aberrantemente supra-regulado em um tipo de célula particular. Em outras modalidades, sinalização celular normal, aberrante, ou excessiva é causada pela ligação de CXCR5 a um ligando de CXCR5. Em certas modalidades, o CXCR5 ligando é CXCL13. Em certas modalidades, a doença mediada por CXCR5 é artrite reumatoide (RA).

[00118] O termo "sacarídeo" refere-se a uma classe de moléculas que são derivados de álcoois poli-hídricos. Os sacarídeos são comumente chamados de carboidratos e podem conter diferentes quantidades de unidades de açúcar (sacarídeo), por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, e polissacarídeos.

[00119] Os termos "liga-se especificamente" ou "ligando-se especificamente" significa ligando-se especificamente a um antígeno ou a um fragmento do mesmo e não se ligando especificamente a outros antígenos. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno pode ligar-se a outros peptídios ou polipeptídios com menos afinidade, segundo determinado, por exemplo, por radioimunoensaios (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, ou outros ensaios conhecidos na literatura. Anticorpos ou variantes ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a um antígeno podem ser reativos cruzados com antígenos relacionados. Em algumas modalidades, anticorpos ou variantes ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a um antígeno não reagem de forma cruzada com outros antígenos. Um anticorpo ou uma variante ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a um antígeno LIGHT ou CXCR5 pode ser identificado, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outras técnicas conhecidas pelos especialista na técnica. Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal ou ruído de fundo, e mais tipicamente mais de 10 vezes o fundo. Vide, por exemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York nas páginas 332-336 para uma discussão sobre especificidade de anticorpos.

[00120] Uma formulação "estável" ou "estabilizada" é aquela na qual o agente de ligação, tal como um anticorpo, na mesma conserva essencialmente sua estabilidade, identidade, e integridade físicas, e/ou estabilidade, identidade, e integridade químicas, e/ou atividade biológica durante o armazenamento. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade das proteínas encontram-se disponíveis na literatura e estão revisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada e outras condições de armazenamento por um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser determinada por pelo menos um dos métodos selecionados do grupo que consiste em inspeção visual, SDS-PAGE, IEF, HPSEC, RFFIT, e capa/lambda ELISA. Por exemplo, um anticorpo "conserva sua estabilidade física" em uma formulação farmacêutica, se ele não apresentar sinais de agregação, precipitação, e/ou desnaturação mediante exame visual da cor e/ou claridade, ou conforme medido por espalhamento de luz UV, SDS-PAGE, ou por cromatografia por exclusão de tamanho (alta pressão) (HPSEC). Em algumas modalidades, quando as formulações da invenção são usadas, 5% ou menos, tipicamente 4% ou menos, tipicamente 3% ou menos, mais tipicamente 2% ou menos, e particularmente 1% ou menos dos anticorpos formam agregados, conforme medido por HPSEC ou qualquer outro método adequado para medir a formação de agregação. Por exemplo, um anticorpo é considerado estável em uma formulação particular se o monômero de anticorpo tiver uma pureza de cerca de 90%, tipicamente cerca de 95%, em particular cerca de 98% depois de um certo período de tempo predeterminado em certas condições de armazenamento em uma formulação particular. A estabilidade química pode ser avaliada detectando-se e quantificando-se as formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver modificação de tamanho (por exemplo, recorte), que pode ser avaliada usando-se (HP)SEC, SDS-PAGE, e/ou ionização e dessorção a laser assisitida por matriz/espectrometria de massa por tempo de voo (MALDI/TOF MS), por exemplo. Outros tipos de alteração química incluem alteração de carga (por exemplo, ocorrendo como resultado de desamidação), que pode ser avaliada por cromatografia por troca iônica, por exemplo. Um anticorpo "conserva sua atividade biológica em uma formulação farmacêutica em um tempo dado, se a atividade biológica do anticorpo em um tempo dado for pelo menos cerca de 90% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada, conforme determinado em um ensaio de ligação a antígeno ou em um ensaio neutralizantes de vírus, por exemplo.

[00121] Os termos "indivíduo" e "paciente" são usados intercambiavelmente. Conforme usado neste relatório, um indivíduo é tipicamente um mamífero, tal como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, gatos, ratos etc.) ou um primata (por exemplo, macacose seresumanos, eem algumas modalidades um ser humano. Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano, tendo uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5. Em uma outra modalidade, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano, com risco de desenvolver uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5.

[00122] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de uma terapia (por exemplo, uma formulação da invenção) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a severidade e/ou a duração de uma dada doença e/ou um sintoma relacionado com a mesma. Este termo também abrange uma quantidade necessária para a redução ou melhora do avanço ou evolução de uma dada doença, redução ou melhora da recorrência, desenvolvimento ou manifestação de uma dada doença, e/ou para melhorar ou aumentar os efeitos profiláticos ou terapêuticos de uma outra terapia (por exemplo, uma terapia que não seja uma formulação da invenção). Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção varia de cerca de 0,1 mg/kg (mg de anticorpo por kg de peso do indivíduo) a cerca de 100 mg/kg. Em certas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo oferecido nesta invenção é de cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 80 mg/kg cerca de 90 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg (ou uma faixa dentro desses valores). Em algumas modalidades, "quantidade terapeuticamente eficaz" conforme usado neste relatório também se refere à quantidade de um anticorpo da invenção para obter um resultado específico (por exemplo, inibição de uma atividade biológica tipo LIGHT de uma célula, tal como inibição da secreção de CCL20, IL- 8, ou RANTES da célula; ou inibição de uma atividade biológica tipo CXCR5 de uma célula, tal como ligação a CXCL13).

[00123] O termo "agente terapêutico" refere-se a qualquer agente que pode ser usado no tratamento, controle ou melhora de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 e/ou um sintoma relacionado com a mesma. Em certas modalidades, o termo "agente terapêutico" refere-se a uma formulação da invenção. Em certas outras modalidades, o termo "agente terapêutico" refere-se a um agente que não seja uma formulação da invenção. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é um agente que é sabidamente útil, ou que tenha sido ou que esteja sendo atualmente usado para o tratamento, controle ou melhora de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 ou de um ou mais sintomas relacionados com a mesma.

[00124] O termo "terapia" refere-se a qualquer protocolo, método, e/ou agente que possa ser usado na prevenção, controle, tratamento, e/ou melhora de uma doença mediada por LIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD) ou de uma doença mediada por CXCR5 (por exemplo, artrite reumatoide). Em certas modalidades, os termos "terapias" e "terapia" referem-se a uma terapia biológica, terapia suportiva, e/ou outras terapias úteis na prevenção, controle, tratamento, e/ou melhora de uma doença mediada por LIGHT ou mediada por CXCR5 conhecidas pelo especialista na técnica, tal como equipe médica.

[00125] Os termos "tratar", "tratamento", e "tratando" referem-se a redução ou melhora da evolução, severidade, e/ou duração de uma doença mediada por LIGHT (por exemplo, chronic bowel disease, IBD, ou GVHD) ou de uma doença mediada por CXCR5 (por exemplo, artrite reumatoide) resultando da administração de uma ou mais terapias (incluindo, porém sem limitação, a administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como uma formulação da invenção). Em modalidades específicas para o LIGHT, tais termos referem-se à redução ou inibição da ligação de LIGHT a HVEM, à redução ou inibição da ligação de LIGHT a LTβR, à redução ou inibição da ligação de LIGHT a DcR3, à redução ou inibição da produção ou secreção de CCL20 a partir de uma célula expressando um receptor de LIGHT de um inidivíduo, à redução ou inibição da produção ou secreção de IL-8 a partir de uma célula expressando um receptor de LIGHT de um inidivíduo, à redução ou inibição da produção ou secreção de RANTES a partir de uma célula expressando um receptor de LIGHT de um inidivíduo, e/ou à inibição ou redução de um ou mais sintomas associados a uma doença mediada por LIGHT, tais como uma doença intestinal crônica, IBD, ou GVHD. Em modalidades específicas para CXCR5, tais termos referem-se à redução ou inibição da ligação de CXCR5 a CXCL13, e/ou à inibição ou redução de um ou mais sintomas associados a uma doença mediada por CXCR5, tal como artrite reumatoide.

[00126] Os termos "região variável" ou "domínio variável" referem- se a uma porção das cadeias leve e pesada, tipicamente cerca dos 120 a 130 aminoácidos amino-terminis na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, que diferem extensivamente em termos de sequências entre os anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. A variabilidade em sequência fica concentrada naquelas regiões chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), ao passo que as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são chamadas de regiões de esqueleto (FR). As CDRs das cadeias leve e pesada são principalmente responsáveis pela interação do anticorpo com o antígeno. A numeração das posições dos aminoácidos está de acordo com o EU Index, como em Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. ("Kabat et al."). Em algumas modalidades, a região variável é uma região variável humana.

B. Formulações e Componentes da Formulação

[00127] Como mencionado anteriormente, as formulações da invenção foram surpreendentemente encontradas na forma de líquidos e pósliofilizados que compreendem um ácido graxo à IgG4 e um tampão citrato, onde o pH da formulação tem um pH menor ou igual a cerca de pH 6 e ao ponto isoelétrico (pI) do agente de ligação. As formulações da invenção proporcionam melhoras significativas em relação às formulações de agente de ligação à IgG4 convencionais (por exemplo, formulações salinas tamponadas com fosfato (PBS), que foram subprodutos indesejados com o aumento da concentração do agente de ligação na formulação. Em particular, as formulações da invenção têm uma quantidade reduzida de agregados, meias- moléculas, produtos de degradação, proteínas de baixo peso molecular (LMWPs), proteínas de alto peso molecular (HMWPs), e rearranjos das isoformas ácidas, básicas, e neutras do agente de ligação nas formulações.

i. Agentes de ligação anti-LIGHT, e variantes e fragmentos dos mesmos

[00128] Em certas modalidades, as formulações da invenção incluem um agente de ligação anti-LIGHT. Os agentes de ligação podem ser qualquer molécula, tal como um anticorpo, um siRNA, um ácido nucleico, um aptâmero, uma proteína, ou um composto orgânico de molécula pequena, que se liga ou que se liga especificamente ao LIGHT, ou a uma variante ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo anti-LIGHT, ou uma variante do mesmo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Anticorpos anti-LIGHT ligam-se especificamente a uma proteína, fragmento de polipeptídio, ou epítopo LIGHT (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T). A molécula LIGHT pode ser de qualquer espécie. Em algumas modalidades, a molécula LIGHT é de origem humana, denominada neste relatório "hLIGHT". A hLIGHT tem a seguinte sequência aminoacídica, que é identificada como SEQ ID N°: 9: MEESVVRPSV FVVDGQTDIP FTRLGRSHRR QSCSVARVGL GLLLLLMGAG 51 LAVQGWFLLQ LHWRLGEMVT RLPDGPAGSW EQLTQERRSH EVNPAAHLTG 101 ANSSLTGSGG PLLWETQLGL AFLRGLSYHD GALVVTKAGY YYIYSKVQLG 150 GVGCPLGLAS TITHGLYKRT PRYPEELELL VSQQSPCGRA TSSSRVWWDS 200 SFLGGVVHLE AGEEVVVRVL DERLVRLRDG TRSYFGAFMV (SEQ ID N°: 9)

[00129] Em certas modalidades exemplificativas, o anticorpo antiLIGHT é um anticorpo humanizado, anticorpo totalmente humano, ou uma variante do mesmo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, anticorpos anti-LIGHT previnem a ligação de LIGHT a seus receptores e inibem a atividade biológica de LIGHT (por exemplo, a produção ou secreção mediada por LIGHT de CCL20, IL-8, ou RANTES a partir de células expressando um ligando de LIGHT, tal como um receptor de LIGHT (por exemplo, HVEM, LTβR, e/ou DcR3).

[00130] Em certas modalidades específicas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência aminoacídica de qualquer uma das regiões determinantes complmentares (CDRs) a seguir: HCDR1 - GYNWH (SEQ ID N°: 1); HCDR2 - EITHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID N°: 2); ou HCDR3 - EIAVAGTGYYGMDV (SEQ ID N°: 3).

[00131] Em outras modalidades específicas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma região variável de uma cadeia leve (VL) compreendendo a sequência aminoacídica de qualquer uma das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a seguir: LCDR1 - RASQGINSAFA (SEQ ID N°: 4); LCDR2 - DASSLES (SEQ ID N°: 5); ou LCDR3 - QQFNSYPLT (SEQ ID N°: 6).

[00132] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 1, 2, e 3.

[00133] Em uma outra modalidade específica, o anticorpo antiLIGHT compreende uma região variável de uma cadeia leve (VL) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 4, 5, e 6.

[00134] Em modalidades mais específicas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 1, 2, e 3; e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID NOs: 4, 5, e 6.

[00135] Em modalidades específicas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7: 1 QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYNWHWIRQP PGKGLEWIGE 51 ITHSGSTNYN PSLKSRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCVREIA 101 VAGTGYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFEGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG (SEQ ID N°: 7) Posições 1 a 122: região variável da cadeia pesada (VH). As CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 123 a 448: região constante IgG4 da humana (SwissProt IGHG4_HUMAN com as duas mutações S241P e L248E, de acordo com a numeração de Kabat).

[00136] Em outras modalidades específicas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8: 1 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIN SAFAWYQQKP GKAPKLLIYD 51 ASSLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ FNSYPLTFGG 101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID N°: 8) Posições 1 a 107: região variável da cadeia leve (VL). As CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 108 a 214: região constante de CK.

[00137] Em outras modalidades, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7, e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8.

[00138] Em certas modalidades, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma cadeia pesada derivada da sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10, que pode ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID N°: 11. M K H L W F F L L L V A A P R W V L S Q V Q L Q Q W G 1 ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTA GATGGGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGG • A G L L K P S E T L S L T C A V Y G G S FS G Y N W H 81 CGCTGGCCTGCTGAAGCCTTCCGAGACACTGTCCCTGACCTG CGCCGTGTACGGCGGCTCCTTCTCCGGCTACAACTGGC • W I R Q P P G K G L E W I G E I T H S G S T N Y N P 161 ACTGGATCAGGCAGCCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATC GGCGAGATCACCCACTCCGGCTCCACCAACTACAACCCT S L K S R V T I S V D T S K N Q F S L K L S S V T A A 241 AGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAG AACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCCGC • D T A VY Y C V R E I A V A G T G Y Y G M D V W G Q G -321 TGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGCGGGAGATCGCCGTGGC TGGCACCGGCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGG • T T V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S 401 GCACCACCGTGACCGTGTCCAGCGCTTCTACCAAGGGCCCTT CCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCC E S T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L- 481 GAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTC CCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCT • T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S •561 GACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTC CGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTT • S S L G T K T Y T C N V D H K P S N T K V D K R V E 641 CCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACC ACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAG S K Y G P P C P P C P A P E F E G G P S V F L F P P K- 721 TCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAG TTCGAGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAA • P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q E D P E V 801 GCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGAC CTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGG • Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T 881 TCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACG CCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTCAATTCCACC Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K 961 TACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGTAAGGTCTCCAACAA • G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P 1041 GGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAG GCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTC • S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V 1121 CTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCC TGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTG E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L 1201 GAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACA AGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT • Y S R L T V D K S R W Q E G N V F S C S V M H E A L H 1281 GTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAG GAGGGCAACGTCTTTTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGC • N H Y T Q K S L S L S L G * (SEQ ID NO: 10) 1361 ACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTG GGCTGA (SEQ ID NO: 11) Aminoácidos 1 a 19: peptídio sinal Aminoácidos 20 a 141: região variável de 124F19k2 (VH) Aminoácidos 142 até o fim: região constante de hIgG4 PE Ácidos nucleicos 1 a 57: ácidos nucleicos codificando o peptídio sinal Ácidos nucleicos 58 a 423: ácidos nucleicos codificando a região variável de 124F19k2 (VH) Ácidos nucleicos 424-até o fim: ácidos nucleicos codificando a região constante de hIgG4 PE

[00139] Em modalidades alternativas, o anticorpo anti-LIGHT compreende uma cadeia leve derivada da sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, que pode ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID N°: 13. M D M R V P A Q L L G L L L L W L P G A R C A I Q L T • ATGGACATGAGAGTGCCTGCTCAGCTGCTGGGACTGCTGCTGC TGTGGCTGCCTGGCGCTAGATGCGCCATCCAGCTGAC Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I N S A • 81 CCAGTCCCCCTCCTCTCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGT GACCATCACCTGTCGGGCCTCCCAGGGCATCAACTCCG F A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S S L E S G V 161 CCTTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCC CTAAGCTGCTGATCTACGACGCCTCCTCCCTGGAATCCGGCGTG P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T • 241 CCCTCCAGATTTTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACT TCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCAC Y Y C Q Q F N S Y P L T F G G G T K V E I K R T V A A • 321 CTACTACTGCCAGCAGTTCAACTCCTACCCTCTGACCT TCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTG P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N 401 CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E • 481 TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGA TAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y • 561 GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C * (SEQ ID N°: 12) 641 ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID N°: 13) Amino acidos 1 a 22: signal peptide Aminoácidos 23 a 129: região variável de 124F19k2 (VL) Aminoácidos 130 até o fim: região constante de hKappa Ácidos nucleicos 1 a 66: ácidos nucleicos codificando o peptídio sinal Ácidos nucleicos 67-387: ácidos nucleicos codificando a região variável de 124F19k2 (VL) Ácidos nucleicos 388-até o fim: ácidos nucleicos codificando a região constante de hKappa

[00140] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-LIGHT é um anticorpo totalmente humano. Exemplos de isótipos de anticorpo totalmente humano incluem IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIGHT é um anticorpo IgG. Existem quatro formas de IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo antiLIGHT é um anticorpo IgG4. Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti-LIGHT é um anticorpo IgG4 totalmente humano.

[00141] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LIGHT compreende ainda uma região constante, por exemplo, uma região constante de IgG humana. Em algumas modalidades, a região constante é uma região constante de IgG4 humana. Em modalidades adicionais, a região constante é uma região constante de IgG4 humana modificada.. Em outras modalidades, a região constante é uma região constante de CK humana.

[00142] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo antiLIGHT é um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8 ("o anticorpo líder para LIGHT"). Em modalidades alternativas da invenção, o anticorpo antiLIGHT é um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada variable region e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo 3 regiões determinantes complmentares (CDRs) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 1, 2, e 3, e a região variável de cadeia leve compreendendo 3 CDRs compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 4, 5, e 6. A identificação, isolamento, preparação, e caracterização de anticorpos anti-LIGHT, incluindo o anticorpo anti-LIGHT compreendendo uma sequência aminoacídica de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 7 e uma sequência aminoacídica de cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 8, foram descritos detalhadamente na Patente US N° 8.058.402, correspondente à Publicação PCT WO 2008/027338, que está aqui incorporadas a título de referência.

[00143] Certas modalidades das formulações da invenção também incluem vaintes de agente de ligação anti-LIGHT, tais como anticorpos. Especificamente, as formulações da invenção podem incluir variantes do anticorpo anti-LIGHT que é um anticorpo antiLIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8. As variantes de anticorpos anti-LIGHT podem ter propriedades físico-químicas similares com base em sua alta semelhança, e por conseguinte também estão incluídas no escopo da invenção. Variantes são definidas como anticorpos com uma sequência aminoacídica que é pelo menos 95%, pelo menos 97%, for instance pelo menos 98% ou 99% homóloga a um anticorpo anti-LIGHT, e capaz de competir pela ligação a um polipeptídio LIGHT, um fragmento de polipeptídio LIGHT, ou um epítopo LIGHT. Em algumas modalidades, as variantes vão melhorar, neutralizar, ou de alguma forma inibir a atividade biológica de LIGHT (por exemplo, a produção ou secreção mediada por LIGHT de CCL20, IL-8, ou RANTES a partir de células expressando um ligando de LIGHT, tais como um receptor de LIGHT (por exemplo, HVEM, LTβR, e/ou DcR3). A determinação de competição pela ligação ao alvo pode ser feita por métodos rotineiros conhecidos pelos especialistas na técnica. Em algumas modalidades, as variantes são anticorpos humanos, e, em algumas modalidades, são moléculas de IgG4. Em algumas modalidades, uma variante é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica em termos de sequência aminoacídica ao anticorpo líder. O termo "variante" refere-se a um anticorpo que compreende uma sequência aminoacídica que é alterada por um ou mais aminoácidos em relação às sequências aminoacídicas do anticorpo anti-LIGHT. A variante pode ter modificações conservativas de sequência, que incluem substituições, modificações, adições, e deleções de aminoácidos.

[00144] Exemplos de modificações incluem, porém sem limitação, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, e ligação a um ligando celular ou outra proteína. As modificações de aminoácidos podem ser introduzidas por técnicas tradicionais conhecidas na literatura, tais como mutagênese sítio- direcionada, clonagem molecular, mutagênese oligonucleotídeo- direcionada, e mutagênese aleatória mediada por PCR no anticorpo codificando os anticorpos. Substituições conservativas de aminoácidos incluem aquelas nas quais o resíduo aminoacídico é substituído por um resíduo aminoacídico tendo propriedades estruturais ou químicas similares. Famílias de resíduos aminoacídicos tendo cadeias laterais similares já foram definidas na literatura. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, trtiptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Ficará claro para o especialista na técnica que classificações de famílias de resíduos aminoacídicos diferentes daquela usada acima também podem ser empregadas. Além disso, uma variante pode ter substituições não conservativas de aminoácidos, por exemplo, substituição de um aminoácido por um resíduo aminoacídico tendo propriedades estruturais ou químicas diferentes. Pequenas variações similares também podem incluir deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. Uma guia determinando quais resíduos aminoacídicos podem ser substituídos, modificados, inseridos, ou deletados sem suprimir a atividade imunológica pode ser usado usando programas de computador bastante conhecidos na literatura. Algoritmos computacionais, tais como, inter alia, Gap ou Bestfit, que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica, podem ser usados para alinhar de forma ideal as sequências aminoacídicas a serem comparadas e para definir resíduos aminoacídicos similares ou idênticos. As variantes podem ter a mesma afinidade de ligação ou afinidades de ligação diferentes, seja maiores ou menores, em comparação com um anticorpo anti-LIGHT, mas ainda serem capazes de se ligar especificamente ao LIGHT, e podem ter a mesma atividade biológica, ou atividade biológica maior ou menor, que o anticorpo anti-LIGHT.

[00145] As modalidades da invenção também incluem fragmentos de ligação a antígeno dos agentes de ligação anti-LIGHT, tais como anticorpos. O termo "domínio de ligação a antígeno", "região de ligação a antígeno", "fragmento de ligação a antígeno", e termos similares referem-se àquela porção de um anticorpo que compreende os resíduos aminoacídicos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação sua especificidade e afinidade para o antígeno (por exemplo, the regiões determinantes de complementaridade (CDR)). A região de ligação a antígeno pode ser derivada de qualquer espécie animal, tal como roedores (por exemplo, coelho, rato ou hamster) e seres humanos. Em algumas modalidades, a região de ligação a antígeno será de origem humana. Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação a antígeno incluem: fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), fragmentos dAb, e unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos aminoacídicos que mimetizam a região hipervariável do anticorpo.

[00146] Em algumas modalidades da invenção, os agentes de ligação anti-LIGHT (ou uma variante dos mesmos ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos) vão melhorar, neutralizar, ou de alguma forma inibir a atividade biológica de LIGHT in vivo (por exemplo, a produção ou secreção mediada por LIGHT de CCL20, IL-8, ou RANTES a partir de uma célula expressando um receptor de LIGHT, por exemplo, HVEM, LTβR, e/ou DcR3).

[00147] Em algumas modalidades da invenção, os agentes de ligação anti-LIGHT (ou uma variante dos mesmos ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos) são agentes de ligação antagonísticos que melhoram, neutralizam, ou de alguma forma inibem a atividade biológica de LIGHT in vivo (por exemplo, a produção ou secreção mediada por LIGHT de CCL20, IL-8, ou RANTES a partir de células expressando um ligando de LIGHT, tal como um receptor de LIGHT, (por exemplo, HVEM, LTβR, e/ou DcR3).

[00148] Em algumas modalidades, o agente de ligação anti-LIGHT (ou uma variante do mesmo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo) está presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 5 mg/mL a cerca de 280 mg/mL, por exemplo, cerca de 5 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 100 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, e cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL. Por exemplo, o agente de ligação anti-LIGHTpode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 5 mg/mL, cerca de 10 mg/mL, cerca de 15 mg/mL, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 55 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 65 mg/mL, cerca de 70 mg/mL, cerca de 75 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 85 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 95 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 105 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 115 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 145 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 190 mg/mL, cerca de 205 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 135 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 165 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 195 mg/mL, cerca de 210 mg/mL, cerca de 125 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 155 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 185 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 215 cerca de 225 mg/mL, cerca de 230 cerca de 240 mg/mL, cerca de 245 cerca de 255 mg/mL, cerca de 260 cerca de 270 mg/mL, cerca de 275

[00149] Em modalidades alternativas, o agente de ligação anti- LIGHT pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 25 mg/mL, de cerca de 26 a cerca de 50 mg/mL, de cerca de 51 a cerca de 75 mg/mL, de cerca de 76 a cerca de 100 mg/mL, de cerca de 101 a cerca de 125 mg/mL, de cerca de 126 a cerca de 150 mg/mL, de cerca de 151 a cerca de 175 mg/mL, de cerca de 176 a cerca de 200 mg/mL, de cerca de 201 mg/mL a cerca de 225 mg/mL, de cerca de 226 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, de cerca de 251 a cerca de 280 mg/mL, de cerca de 5 a cerca de 10 mg/mL, de cerca de 40 a cerca de 60 mg/mL, de cerca de 75 a cerca de 85 mg/mL, ou de cerca de 140 a cerca de 160 mg/mL.

[00150] Em certas modalidades exemplificativas, o agente de ligação anti-LIGHT está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 50 mg/mL a cerca de 170 mg, cerca de 100 mg/mL a cerca de 160 mg/mL, por exemplo cerca de 150 mg/mL. Alternativamente, o agente de ligação anti-LIGHT está presente em uma quantidade de cerca de 50 mg/mL. Em uma outra modalidade exemplificativa, um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8 está presente in the formulation em uma quantidade de cerca de 150 mg/mL. ii. Agentes de ligação anti-CXCR5, e variantes e fragmentos dos mesmos

[00151] Em certas modalidades, as formulações da invenção incluem um agente de ligação anti-CXCR5. Os agentes de ligação podem ser qualquer molécula, tal como um anticorpo, um siRNA, um ácido nucleico, um aptâmero, uma proteína, ou um composto orgânico de molécula pequena, que se liga ou se liga especificamente ao CXCR5, ou uma variante ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o agente de ligação é um anticorpo anti-CXCR5, ou uma variante do mesmo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmos. Os anticorpos anti-CXCR5 ligam-se especificamente a uma proteína CXCL13 (também conhecida como BLC), um fragmento de polipeptídio, ou epítopo. A molécula CXCR5 pode ser de qualquer espécie. Em algumas modalidades, a molécula é CXCR5 é proveniente de um ser humano, neste relatório conhecida por hCXCR5". A hCXCR5 tem a sequência aminoacídica a seguir, que é identificada como SEQ ID N°: 14: TEGPLMASFK AVFVPVAYSL VFILPFAVAE GSVGWVLGTF RRLLSIHITC GTIWLVGFLL LYHVAGFLLP MLVMGWCYVG VVHRLRQAQR RPQRQKAVRV AILVTSIFFL LDTLARLKAV DNTCKLNGSL PVAITMCEFL GLAHCCLNPM LYTFAGVKFR GCTGPASLCQ LFPSWRRSSL SESENATSLT TF (SEQ ID N°: 14).

[00152] Em certas modalidades exemplificativas, o anticorpo anti- CXCR5 é um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, ou uma variante do mesmo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CXCR5 previnem a ligação de CXCR5 aos seus ligandos e inibem a atividade biológica de CXCR5 (por exemplo, a ligação de CXCR5 a CXCL13).

[00153] Em certas modalidades específicas, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência aminoacídica de qualquer uma ou mais das seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs): HCDR1 - GFSLIDYGVN (SEQ ID N°: 15); HCDR2 - VIWGDGTTY (SEQ ID N°: 16); ou HCDR3 - IVY (SEQ ID N°: 17).

[00154] Em outras modalidades específicas, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma região variável de uma cadeia leve (VL) compreendendo a sequência aminoacídica de qualquer uma das seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs): LCDR1 - RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID N°: 18); LCDR2 - RLSSLA (SEQ ID N°: 19); ou LCDR3 - MQHLEYPYT (SEQ ID N°: 20).

[00155] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 15, 16, e 17.

[00156] Em uma outra modalidade específica, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma região variável de uma cadeia leve (VL) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 18, 19, e 20.

[00157] Em modalidades maios específicas, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 15, 16, and 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 18, 19, e 20.

[00158] Em uma modalidade específica, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21: QVQLKESGPG LVAPSESLSI TCTVSGFSLI DYGVNWIRQP PGKGLEWLGV IWGDGTTYYN PSLKSRLSIS KDNSKSQVFL KVTSLTTDDT AMYYCARIVY WGQGTLVTVS A (SEQ ID N°: 21).

[00159] Em uma outra modalidade específica, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma região variável de uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22: DIVMTQAAPS VAVTPGASVS ISCRSSKSLL HSSGKTYLYW FLQRPGQSPQ LLIYRLSSLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLRI SRVEAEDVGV YYCMQHLEYP YTFGGGTKLE IK (SEQ ID N°: 22).

[00160] Em modalidades mais específicas, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22.

[00161] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 compreende ainda uma região constante, por exemplo, uma região constante de IgG humana. Em algumas modalidades, a região constante é uma região constante de IgG4 humana. Em modalidades adicionais, a região constante é região constante de IgG4 humana modificada. Em algumas modalidades, a região constante de IgG4 humana tem as seguintes modificações: S241P (mostrada abaixo na SEQ ID N°: 23 em negrito), L248E (mostrada abaixo na SEQ ID N°: 23 em negrito), e a falta de uma lisina terminal para evitar heterogeneidade. Em algumas modalidades, a região constante de IgG4 compreende a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23: ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG (SEQ ID N°: 23).

[00162] Em outras modalidades, a região constante é uma região constante de CK humano. Em algumas modalidades, a região constante de CK compreende a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24: RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID N°: 24).

[00163] Em modalidades específicas, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25: QVQLKESGPG LVAPSESLSI TCTVSGFSLI DYGVNWIRQP PGKGLEWLGV IWGDGTTYYN PSLKSRLSIS KDNSKSQVFL KVTSLTTDDT AMYYCARIVY WGQGTLVTVS AASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFEGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG (SEQ ID N°: 25). Posições 1 a 111: região variável da cadeia pesada (VH). As CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 112 a 432: região constante de IgG4 humana (SwissProt IGHG4_HUMAN, incluindo as seguintes modificações: S241P, L248E, e a falta de uma lisina terminal a fim de evitar heterogeneidade).

[00164] Em outras modalidades específicas, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26: DIVMTQAAPS VAVTPGASVS ISCRSSKSLL HSSGKTYLYW FLQRPGQSPQ LLIYRLSSLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLRI SRVEAEDVGV YYCMQHLEYP YTFGGGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC (SEQ ID N°: 26). Posições 1 a 112: região variável da cadeia leve (VL). As CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 113 a 182: região constante de CK humana.

[00165] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26.

[00166] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 compreende ainda uma sequência líder. A sequência líder, em algumas modalidades, compreende uma sequência aminoacídica de 1 a 30 aminoácidos de comprimento, tal como 25-25 aminoácidos, e tipicamente 19 aminoácidos. A cadeia pesada, a cadeia leve, ou ambas as cadeias pesada e leve compreendem uma sequência líder. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16: MGWSCIILFL VATATGVHS (SEQ ID N°: 27).

[00167] Em modalidades específicas, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma cadeia pesada derivada da sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28: ALHNHYTQKS LSLSLG (SEQ ID N°: 28). Posições 1 a 19: sequência líder Posições 20 a 130: região variável da cadeia pesada (VH). As CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 131 a 456: região constante de IgG4 humana (SwissProt IGHG4_HUMAN, incluindo as seguintes modificações: S241P, L248E, e a falta de uma lisina terminal a fim de evitar heterogeneidade).

[00168] Em outras modalidades específicas, o anticorpo anti- CXCR5 compreende uma cadeia leve derivada da sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29: MGWSCIILFL VATATGVHSD IVMTQAAPSV AVTPGASVSI SCRSSKSLLH SSGKTYLYWF LQRPGQSPQL LIYRLSSLAS GVPDRFSGSG SGTAFTLRIS RVEAEDVGVY YCMQHLEYPY TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID N°: 29). Posições 1 a 19: sequência líder Posições 20 a 131: região variável da cadeia leve (VL). The CDRs (regiões determinantes de complementaridade, de acordo com a definição de Kabat) estão sublinhadas. Posições 132 a 238: região constante de CK humana.

[00169] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28, e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29.

[00170] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti- CXCR5 é um anticorpo humanizado totalmente humano. Exemplos de isótipos de anticorpos humanizados e totalmente humanos incluem IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CXCR5 é um anticorpo IgG. Existem quatro formas de IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 é um anticorpo IgG4. Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti-CXCR5 é um anticorpo IgG4 humanizado.

[00171] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti- CXCR5 é um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26 ("anticorpo líder CXCR5"). Em modalidades alternativas da invenção, o anticorpo anti-CXCR5 é um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 15, 16, e 17, e a região variável de cadeia leve compreendendo 3 CDRs compreendendo as sequências aminoacídicas de SEQ ID N°s: 18, 19, e 20. A identificação, isolamento, preparação, e caracterização de anticorpos anti-CXCR5, incluindo o anticorpo anti-CXCR5 compreendendo uma sequência aminoacídica de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 25 e uma sequência aminoacídica de cadeia leve amino compreendendo a SEQ ID N°: 26, foram descritos detalhadamente na Publicação PCT WO 2009/032661, que está aqui incorporada a título de referência.

[00172] Certas modalidades das formulações da invenção também incluem variantes de agentes de ligação anti-CXCR5, tais como anticorpos. Especificamente, as formulações da invenção podem incluir variantes do anticorpo anti-CXCR5 que é um anticorpo anti- CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26. As variantes dos anticorpos anti-CXCR5 podem ser propriedades físico-químicas similares com base em sua grande semelhança, e por conseguinte também estão incluídas no escopo da invenção. Variantes são definidas como anticorpos com uma sequência aminoacídica que é pelo menos 95%, pelo menos 97%, por exemplo, pelo menos 98% ou 99% homóloga a um anticorpo anti-CXCR5, e capaz de competir pela ligação a um polipeptídio CXCR5, um fragmento de polipeptídio CXCR5, ou um epítopo CXCR5. Em algumas modalidades, as variantes vão melhorar, neutralizar, ou de alguma inibir a atividade biológica de CXCR5 (por exemplo, a ligação de CXCL13 a CXCR5). A determinação da competição pela ligação ao alvo pode ser feita por métodos rotineiros conhecidos conhecidos pelo especialista na técnica. Em algumas modalidades, as variantes são anticorpos humanos, e, em algumas modalidades, são moléculas de IgG4. Em algumas modalidades, a variante é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica em termos de sequência aminoacídica ao anticorpo líder. O termo "variante" refere-se a um anticorpo que compreende uma sequência aminoacídica que é alterada por um ou mais aminoácidos em relação às sequências aminoacídicas do anticorpo anti-CXCR5. A variante pode ter modificações conservativas de sequências, incluindo substituições, modificações, adições, e deleções de aminoácidos.

[00173] Exemplos de modificações incluem, porém sem limitação, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolótica, e ligação a um ligando celular ou outra proteína. As modificações de aminoácidos podem ser introduzidas por técnicas tradicionais conhecidas na literatura, tais como mutagênese sítio- direcionada, clonagem molecular, mutagênese oligonucleotídeo- direcionada, e mutagênese aleatória mediada por PCR no ácido nucleico codificando os anticorpos. Substituições conservativas de aminoácidos incluem aquelas nas quais o resíduo aminoacídico é substituído por um resíduo aminoacídico tendo propriedades estruturais ou químicas similares. Famílias de resíduos aminoacídicos tendo cadeias laterais similares já foram definidas na literatura. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Ficará claro para o especialista na técnica que classificações de famílias de resíduos aminoacídicos diferentes daquela usada acima também podem ser empregadas. Além disso, uma variante pode ter substituições não conservativas de aminoácidos, por exemplo, substituição de um aminoácido por um resíduo aminoacídico tendo propriedades estruturais ou químicas diferentes. Pequenas variações similares também podem incluir deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. Uma guia determinando quais resíduos aminoacídicos podem ser substituídos, modificados, inseridos, ou deletados sem suprimir a atividade imunológica pode ser encontrado usando programas de computador bastante conhecidos na literatura. Algoritmos computacionais, tais como, inter alia, Gap ou Bestfit, que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica, podem ser usados para alinhar de forma ideal as sequências aminoacídicas a serem comparadas e para definir resíduos aminoacídicos similares ou idênticos. As variantes podem ter a mesma afinidade de ligação ou afinidades de ligação diferentes, seja maiores ou menores, em comparação com um anticorpo anti-CXCR5, mas ainda serem capazes de se ligar especificamente ao CXCR5, e podem ter a mesma atividade biológica, ou atividade biológica maior ou menor, que o anticorpo anti-CXCR5.

[00174] As modalidades da invenção também incluem fragmentos de ligação a antígeno dos agentes de ligação anti-CXCR5, tais como anticorpos. O termo "domínio de ligação a antígeno", "região de ligação a antígeno", "fragmento de ligação a antígeno", e termos similares referem-se àquela porção de um anticorpo que compreende os resíduos aminoacídicos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação sua especificidade e afinidade para o antígeno (por exemplo, the regiões determinantes de complementaridade (CDR)). A região de ligação a antígeno pode ser derivada de qualquer espécie animal, tal como roedores (por exemplo, coelho, rato ou hamster) e seres humanos. Em algumas modalidades, a região de ligação a antígeno será de origem humana. Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação a antígeno incluem: fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), fragmentos dAb, e unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos aminoacídicos que mimetizam a região hipervariável do anticorpo.

[00175] Em algumas modalidades da invenção, os agentes de ligação anti-CXCR5 (ou uma variante dos mesmos ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos) vão melhorar, neutralizar, ou de alguma forma inibir a atividade biológica de CXCR5 in vivo (por exemplo, a ligação de CXCL13 a CXCR5).

[00176] Em algumas modalidades da invenção, os agentes de ligação anti-CXCR5 (ou uma variante dos mesmos ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos) são agentes de ligação antagonísticos que melhoram, neutralizam, ou de alguma forma inibem a atividade biológica de CXCR5 in vivo (por exemplo, a ligação de CXCL13 a CXCR5).

[00177] Em algumas modalidades, o agente de ligação anti-CXCR5 (ou uma variante do mesmo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo) está presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 5 mg/mL a cerca de 280 mg/mL, por exemplo, cerca de 5 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, cerca de 5 mg/mL a cerca de 125 mg/mL, cerca de 5 mg/mL a cerca de 75 mg/mL, cerca de 5 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, e cerca de 5 mg/mL a cerca de 25 mg/mL. Por exemplo, o agente de ligação anti-CXCR5 pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 5 mg/mL, cerca de 10 mg/mL, cerca de 15 mg/mL, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 55 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 65 mg/mL, cerca de 70 mg/mL, cerca de 75 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 85 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 95 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 105 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 115 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 125 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 135 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 145 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 155 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 165 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 175 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 185 mg/mL, cerca de 190 mg/mL, cerca de 195 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 205 mg/mL, cerca de 210 mg/mL, cerca de 215 mg/mL, cerca de 220 mg/mL, cerca de 225 mg/mL, cerca de 230 mg/mL, cerca de 235 mg/mL, cerca de 240 mg/mL, cerca de 245 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 255 mg/mL, cerca de 260 mg/mL, cerca de 265 mg/mL, cerca de 270 mg/mL, cerca de 275 mg/mL, ou cerca de 280 mg/mL.

[00178] Em modalidades alternativas, o agente de ligação anti- CXCR5 pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 25 mg/mL, de *cerca de 26 a cerca de 50 mg/mL, de cerca de 51 a cerca de 75 mg/mL, de cerca de 76 a cerca de 100 mg/mL, de cerca de 101 a cerca de 125 mg/mL, de cerca de 126 a cerca de 150 mg/mL, de cerca de 151 a cerca de 175 mg/mL, de cerca de 176 a cerca de 200 mg/mL, de cerca de 201 mg/mL a cerca de 225 mg/mL, de cerca de 226 mg/mL a cerca de 250 mg/mL, de cerca de 251 a cerca de 280 mg/mL, de cerca de 5 a cerca de 25 mg/mL, de cerca de 40 a cerca de 60 mg/mL, de cerca de 75 a cerca de 85 mg/mL, oue cerca de 90 a cerca de 110 mg/mL.

[00179] Em certas modalidades exemplificativas, o agente de ligação anti-CXCR5 está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 20 mg/mL. Alternativamente, o agente de ligação anti- CXCR5 está presente em uma quantidade de cerca de 100 mg/mL. Em uma outra modalidade exemplificativa, um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26 está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 20 mg/mL ou 100 mg/mL.

iii. Agentes tamponantes

[00180] As formulações da invenção compreendem um tampão citrato como um agente tamponante. Um agente tamponante manté um pH fisiologicamente adequado. Além disso, um agente tamponante melhora a isotonicidade e a estabilidade química da formulação. Em algumas modalidades, o tampão citrato está presente nas formulações a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 50 mM, por exemplo, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM. Por exemplo, o tampão citrato pode estar presente na formulação a uma concentração cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, cerca de 30 mM, cerca de 31 mM, cerca de 32 mM, cerca de 33 mM, cerca de 34 mM, cerca de 35 mM, cerca de 36 mM, cerca de 37 mM, cerca de 38 mM, cerca de 39 mM, cerca de 40 mM, cerca de 41 mM, cerca de 42 mM, cerca de 43 mM, cerca de 44 mM, cerca de 45 mM, cerca de 46 mM, cerca de 47 mM, cerca de 48 mM, cerca de 49 mM, e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o tampão citrato está presente na formulação a uma concentração de cerca de 7 mM a cerca de 13 mM, tal como de cerca de 9 mM a cerca de 11 mM. Em algumas modalidades, o tampão citrato está presente a uma concentração de cerca de 10 mM.

[00181] Em certas modalidades, as formulações da invenção têm um pH menor ou igual a pH 6. Em algumas modalidades, o pH das formulações varia de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Por exemplo, o pH das formulações pode ser de cerca de 5,0, cerca de 5,1, cerca de 5,2, cerca de 5,3, cerca de 5,4, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, e cerca de 6,0. Em algumas modalidades, o pH das formulações pode variar de cerca de 5,5 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 5,5 ou cerca de 6,0. O pH da formulação pode ser medido por meio conhecido pelos especialistas na técnica. Um meio para medir o pH é o uso de um medidor de pH com um microeletrodo. O pH da formulação pode ser ajustado usando-se qualquer meio conhecido na literatura. Substâncias químicas para alterar o pH das formulações são ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH).

[00182] Em certas modalidades, as formulações da invenção têm um pH menor ou igual ao ponto isoelétrico (pI) do agente de ligação, tal como um anticorpo. O ponto isoelétrico é o pH no qual uma molécula ou superfície particular não contém carga elétrica líquida. O pI de um agente de ligação anti-LIGHT ou de um agente de ligação anti-CXCR5 pode ser determinado por qualquer meio conhecido pelos especialistas na técnica. Em algumas modalidades, o pI de um anticorpo anti-LIGHT ou anti-CXCR5 é determinado por focalização isoelétrica desnaturada. Como mostrado na Figura 1, the pI of um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8 is 6,8-7,2. Como mostrado na Figura 11, o pI de um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26 é 7,6-8,4.

iv. Tensoativos

[00183] As formulações da invenção pode, opcionalmente, compreender ainda um tensoativo, que também é conhecido como agente estabilizante. Tensoativos/agentes estabilizantes são compostos químicos que interagem e estabilizam moléculas biológicas e/ou excipientes farmacêuticos em geral em uma formulação. Em certas modalidades, tensoativos podem ser usados junto com armazenamento a temperaturas mais baixas. Os tensoativos geralmente protegem o agente de ligação contra estresses induzidos pela interface ar/solução e estresses induzidos por solução/superfície, que do contrário podem resultar em agregação de proteínas. Os tensoativos podem incluir, porém sem limitação, polissorbatos, glicerina, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido succínico, ácidos fumáricos, ácidos ftálicos, e combinações dos mesmos. Os especialistas na técnica sabem que outros tensoativos, por exemplo detergentes não iônicos ou iônicos, podem ser usados contanto que eles sejam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, adequados para administração a indivíduos. O tensoativo é, em algumas modalidades, um polissorbato. Exemplos de polissorbatos incluem polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 65, e polissorbato 80.

[00184] Em modalidades exemplificativas, o tensoativo está presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (p/v). Por exemplo, o tensoativo pode estar presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 0,001% (p/v), cerca de 0,002% (p/v), cerca de 0,003% (p/v), cerca de 0,004% (p/v), cerca de 0,005% (p/v), cerca de 0,006% (p/v), cerca de 0,007% (p/v), cerca de 0,008% (p/v), cerca de 0,009% (p/v), cerca de 0,01% (p/v), cerca de 0,02% (p/v), cerca de 0,03% (p/v), cerca de 0,04% (p/v), cerca de 0,05% (p/v), cerca de 0,06% (p/v), cerca de 0,07% (p/v), cerca de 0,08% (p/v), cerca de 0,09% (p/v), e cerca de 0,1% (p/v). Em modalidades particular, o tensoativo está presente nas formulações de cerca de 0,003% a cerca de 0,05% (p/v), cerca de 0,004% a cerca de 0,025% (p/v), ou cerca de 0,005% a cerca de 0,02% (p/v), por exemplo cerca de 0,005% (p/v). Por exemplo, o polissorbato 20 pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,002% a cerca de 0,01% (p/v), cerca de 0,003% a cerca de 0,008% (p/v), e cerca de 0,004% a cerca de 0,006% (p/v), por exemplo, cerca de 0,005% (p/v). Em modalidades alternativas, o polissorbato 20 está presente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,005% a cerca de 0,05% (p/v), e cerca de 0,0075% a cerca de 0,025% (p/v), por exemplo, cerca de 0,01% (p/v). Em outras modalidades alternativas, o polissorbato 20 está presente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,005% a cerca de 0,05% (p/v), e cerca de 0,01% a cerca de 0,03% (p/v), por exemplo, cerca de 0,02% (p/v).

v. Agentes tonificantes

[00185] As formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda um agente tonificante. Tipicamente, agentes tonificantes são usados para ajustar ou manter a osmolalidade das formulações para deixá-las mais próximas da pressão osmótico dos fluidos corporais, tais como sanguem ou plasma. Os agentes tonificantes também podem manter os níveis de agente de ligação em uma formulação. Em parte, o agente tonificante contribui para preservar o nível, relação, ou proporção do agente de ligação terapeuticamente ativo presente na formulação. Conforme usado neste relatório, o termo "tonicidade" refere-se ao comportamento de componentes biológicos em um ambiente fluido ou solução. As soluções isotônicas possuem a mesma pressão osmótica que o plasma sanguíneo, e podem ser infundidas por via intravenosa em um indivíduo sem alterar a pressão do plasma sanguíneo do indivíduo. Na verdade, em certas modalidades da invenção, o agente tonificante está presente em uma quantidade suficiente para deixar a formulação adequada para infusão intravenosa. Geralmente, o agente tonificante serve como um agente de volume ou também como um agente estabilizante. Como tal, o agente tonificante pode permitir que o agente de ligação supere vários estresses, tais como congelamento e cisalhamento. Agentes tonificantes podem incluir, porém sem limitação, sacarídeos, açúcares, glicerol, sorbitol, manitol, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, e outros sais inorgânicos. Os especialistas na técnica conhecem outros agentes tonificantes que podem ser usados contanto que eles sejam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, adequados para administração a indivíduos.

[00186] Em certas modalidades, o agente tonificante está presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 0,1% a 10% (p/v). Por exemplo, o agente tonificante pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,2% (p/v), cerca de 0,3% (p/v), cerca de 0,4% (p/v), cerca de 0,5% (p/v), cerca de 0,6% (p/v), cerca de 0,7% (p/v), cerca de 0,8% (p/v), cerca de 0,9% (p/v), cerca de 1% (p/v), cerca de 2% (p/v), cerca de 3% (p/v), cerca de 4% (p/v), cerca de 4,5% (p/v), cerca de 5% (p/v), cerca de 5,5% (p/v), cerca de 6% (p/v), cerca de 7% (p/v), cerca de 8% (p/v), cerca de 9% (p/v), e cerca de 10% (p/v). Alternativamente, o agente tonificante pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8% (p/v), de cerca de 3% a cerca de 7% (p/v), e de cerca de 4% a cerca de 6% (p/v). Em outras modalidades alternativas, o agente tonificante pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 1%, de cerca de 0,1% a cerca de 0,5%, de cerca de 0,1 a cerca de 0,3%, and cerca de 0,2%.

[00187] Em certas modalidades exemplificativas, o agente tonificante é um sacarídeo. Exemplos de sacarídeos incluem glicose, sucrose (que também é conhecida como sacarose), maltose, trealose, dextrose, xilitol, frutose e manitol. Por exemplo, manitol pode estar presente em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 10% (p/v), cerca de 2% a cerca de 8% (p/v), ou cerca de 3% a cerca de 5% (p/v), por exemplo, cerca de 4% (p/v). Alternativamente, a sucrose (que também é conhecida como sacarose) pode estar presente em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 10% (p/v), cerca de 3% a cerca de 8% (p/v), ou cerca de 4% a cerca de 6% (p/v), por exemplo, cerca de 4,5, 5, 5,5, ou 6% (p/v).

[00188] Em certas outras modalidades exemplificativas, o agente tonificante é cloreto de sódio. Por exemplo, cloreto de sódio pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,2% (p/v), cerca de 0,3% (p/v), cerca de 0,4% (p/v), cerca de 0,5% (p/v), cerca de 0,6% (p/v), cerca de 0,7% (p/v), cerca de 0,8% (p/v), cerca de 0,9% (p/v), e cerca de 1% (p/v). Alternativamente, o cloreto de sódio pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 1%, de cerca de 0,1% a cerca de 0,5%, de cerca de 0,1 a cerca de 0,3%, e cerca de 0,2%.

[00189] Em ainda outras modalidades exemplificativas, as formulações podem compreender um ou mais agentes tonificantes. Por exemplo, as formulações podem compreender um ou mais dos agentes tonificantes acima nas concentrações acima. Em certas modalidades específicas, as formulações podem compreender sacarose e cloreto de sódio, onde a concentração de cada um dentre sacarose e cloreto de sódio varia entre cerca de 0,1% a cerca de 10% (p/v). Em algumas modalidades, a concentração de sacarose concentration é de cerca de 6% e a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 0,2%. Alternativamente, a concentração de sacarose é de cerca de 4,5% e a a concentração de cloreto de sódio é de cerca de 0,2%.

[00190] Em certas modalidades da invenção, a molalidade das formulações varia de cerca de 200 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg, cerca de 270 mOsm/kg a cerca de 330 mOsm/kg, cerca de 280 mOsm/kg a cerca de 320 mOsm/kg, ou cerca de 290 mOsm/kg a cerca de 310 mOsm/kg, por exemplo, cerca de 300 mOsm/kg. Em outras palavras, as formulações da invenção são, em algumas modalidades, substancialmente isotônicas, isto é, têm substancialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. A osmolalidade pode ser medida por qualquer meio conhecido pelos especialistas na técnica, tal como usando osmômetros do tipo pressão de vapor ou congelamento de gelo. A osmolalidade das formulações da invenção pode, por exemplo, ser regulada por um ou mais dos agentes tonificantes descritos neste relatório.

vi. Aminoácidos

[00191] As formulações da invenção podem, opcionalmente, compreender ainda um aminoácido. Exemplos de aminoácidos incluem, porém sem limitação, glicina, alanina, ácido aspártico, lisina, serina, tirosina, cisteína, glutamina, metionina, arginina, e prolina. Em modalidades exemplificativas, o aminoácido está presente nas formulações em uma quantidade de cerca de 0,1% to 5% (p/v). Por exemplo, o aminoácido pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,1% (p/v), cerca de 0,2% (p/v), cerca de 0,3% (p/v), cerca de 0,4% (p/v), cerca de 0,5% (p/v), cerca de 0,6% (p/v), cerca de 0,7% (p/v), cerca de 0,8% (p/v), cerca de 0,9% (p/v), cerca de 1,0% (p/v), cerca de 1,1% (p/v), cerca de 1,2% (p/v), cerca de 1,3% (p/v), cerca de 1,4% (p/v), cerca de 1,5% (p/v), cerca de 1,6% (p/v), cerca de 1,7% (p/v), cerca de 1,8% (p/v), cerca de 1,9% (p/v), cerca de 2,0% (p/v), cerca de 3% (p/v), cerca de 4% (p/v), e cerca de 5% (p/v). Alternativamente, o aminoácido está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 1,3% a cerca de 1,8% (p/v), ou cerca de 1,4% a cerca de 1,6% (p/v), por exemplo, cerca de 1,5% (p/v). Em outras modalidades alternativas, o aminoácido está presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 1,5% (p/v), ou cerca de 0,8% a cerca de 1,2% (p/v), por exemplo, cerca de 1,0% (p/v). Um aminoácido exemplificativo é prolina ou arginina. Por exemplo, a prolina pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 2%, (p/v) cerca de 1,3% a cerca de 1,8% (p/v), cerca de 1,4% a cerca de 1,6% (p/v), por exemplo, cerca de 1,5% (p/v). Alternativamente, a arginina pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 1,5% (p/v), ou cerca de 0,8% a cerca de 1,2% (p/v), por exemplo, cerca de 1,0% (p/v).

vii. Outros excipientes

[00192] Além disso, as formulações da invenção podem compreender outros excipientes que incluem, porém sem limitação, água para injeção, diluentes, agentes solubilizantes, agentes de abrandamento, tampões adicionais, sais inorgânicos ou orgânicos, antioxidantes, entre outros. Em algumas modalidades, no entanto, as formulações da invenção não compreendem outros excipientes, à exceção daqueles descritos acima. Outros carreadoores, excipientes, ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) podem ser incluídos na formulação contanto que eles não afetem adversamente as características desejadas da formulação. Em uma modalidade particular, a formulação é substancialmente livre de preservativos, embora, em modalidades alternativas, preservativos possam ser adicionados conforme necessário. Por exemplo, crioprotetores ou lioprotetores podem ser incluídos em formulações liofilizadas.

viii. Formulações líquidas ou liofilizadas

[00193] As formulações da invenção podem ser formulações líquidas ou formulações liofilizadas. Em algumas modalidades, as formulações são formulações líquidas. Em algumas modalidades, as formulações líquidas estão prontas para injeção. Alternativamente, as formulações podem ser pósliofilizados. Em algumas modalidades, os pósliofilizados estão prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes da administração.

ix. Formulações exemplificativas

[00194] Em uma modalidade exemplificativa da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo líquida e estável adequada para administração subcutânea, a formulação compreendendo: a) mais de cerca de 80 mg/ml, por exemplo, cerca de 150 mg/ml, de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,005% (p/v) de polissorbato 20; e d) cerca de 4% (p/v) de manitol; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[00195] Em certas modalidades exemplificativas, esta formulação pode ser produzida por: a) dissolução de cerca de 10 mM de citrato de sódio di- hidratado em água para injeção e ajuste do pH da solução tamponada em cerca de pH 5,5, por exemplo, usando seja ácido clorídrico ou hidróxido de sódio; b) adição de mais de cerca de 80 mg/ml, por exemplo, cerca de 150 mg/ml, de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8, cerca de 4% (p/v) de manitol, e 0,005% (p/v) de polissorbato 20 à solução tamponada da etapa a) com agitação em um vaso feito de material inerte até sua dissolução completa, e em seguida ajuste do pH da formulação resultante em cerca de pH 5,5 usando seja ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, e em seguida adição da solução tamponada da etapa a) para ajustar o peso final da formulação resultante; c) filtração da formulação da etapa b) em condições assépticas usando um filtro de membranas compatível esterilizado tendo um tamanho de poro nominal de 0,2 μM, e em seguida esterilização da formulação por filtração em condições assépticas em recipientes esterilizados feitos de material inerte usando um filtro de membranas compatível esterilizado tendo um tamanho de poro nominal de 0,2 μM; d) introdução da formulação da etapa c) em condições assépticas em frascos esterilizados que são fechados com rolhas e tampas do tipo "flip-off" com um flange; e, opcionalmente, e) inspeção dos recipientes da etapa d) quanto à presença de contaminantes grosseiros, vedação intacta, e partículas visíveis.

[00196] Em uma outra modalidade exemplificativa da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo líquida e estável adequada para administração intravenosa, a formulação compreendendo: a) cerca de 5 a cerca de 80 mg/mL, por exemplo, cerca de 50 mg/mL, de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; e c) cerca de 0,01% (p/v) de polissorbato 20; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[00197] Em uma modalidade exemplificativa alternativa da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo liofilizada e estável adequada para administração intravenosa, a formulação compreendendo: a) cerca de 5 a cerca de 80 mg/mL, por exemplo, cerca de 50 mg/mL, de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,01% (p/v) de polissorbato 20; d) cerca de 5% (p/v) sacarose; e e) cerca de 1,5% (p/v) prolina; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5.

[00198] Em uma modalidade exemplificativa da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 20 mg/mL de um anticorpo anti-CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,02% de polissorbato 20; d) cerca de 6% de sacarose; e e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

[00199] Em uma modalidade exemplificativa alternativa da invenção, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,01% de polissorbato 20; d) cerca de 4,5% de sacarose; e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; e f) cerca de 1% de arginina; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

x. Estabilidade

[00200] As formulações da invenção são estáveis a 5°C por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses ou mais, e tipicamente pelo menos cerca de 12, 18 ou 24 meses ou mais. Em modalidades exemplificativas, elas são estáveis a 5°C por pelo menos cerca de 6 meses ou mais. Em outras modalidades exemplificativas, elas são estáveis a 5°C por pelo menos cerca de 9 meses. Em outras modalidades exemplificativas, elas são estáveis a 5°C por pelo menos cerca de 1 ano ou mais, e tipicamente cerca de 2 anos.

C. Modos de Administração

[00201] Em certas modalidades da invenção, as formulações são adequadas para administração parenteral, intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutânea, ou uma combinação das mesmas. As formulações da invenção são adequadas para distribuição por um variedade de técnicas.

[00202] Em algumas modalidades da invenção, a formulação é administrada por via intravenosa. Por exemplo, é desejável que formulações contendo 80 mg/mL de agente de ligação à IgG4, tal como um anticorpo, ou menos sejam administradas por via intravenosa. Por conseguinte, as formulações são tipicamente estéreis. Métodos para deixar formulações estéreis são bastante conhecidos na literatura e incluem, por exemplo, filtração através de membranas de filtração estéreis ou autoclavagem dos ingredientes da formulação, à exceção dos anticorpos, a cerca de 120°C por cerca de 30 minutos. Por exemplo, a invenção oferece uma formulação de anticorpo líquida e estável adequada para administração intravenosa, a formulação compreendendo: a) cerca de 5 a cerca de 80 mg/mL, por exemplo, cerca de 50 mg/mL, de um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; e c) cerca de 0,01% (p/v) de polissorbato 20; onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5. Alternativamente, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 20 mg/mL de um anticorpo anti- CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,02% de polissorbato 20; d) cerca de 6% de sacarose; e e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

[00203] Em algumas modalidades da invenção, a formulação é administrada por via subcutânea. Por exemplo, é desejável que formulações contendo mais de 80 mg/mL de agente de ligação à IgG4, tal como um anticorpo, sejam administradas por via subcutânea. Em uma modalidade específica, é desejável administrar por via subcutânea aos indivíduos uma formulação de anticorpo líquida e estável compreendendo: a) cerca de 150 mg/mL de um anticorpo antiLIGHT IgG4 totalmente humano (linfotoxina-like, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,005% (p/v) de polissorbato 20; d) cerca de 4% (p/v) de manitol; e onde o pH da formulação é de cerca de pH 5,5. Alternativamente, a invenção oferece uma formulação de anticorpo estável compreendendo: a) cerca de 100 mg/mL de um anticorpo anti-CXCR5 tipo IgG4 humanizada (receptor da quimiocina C-X-C tipo 5) compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26; b) cerca de 10 mM de tampão citrato; c) cerca de 0,01% de polissorbato 20; d) cerca de 4,5% de sacarose; e) cerca de 0,2% de cloreto de sódio; e f) cerca de 1% de arginina; onde o pH da formulação é de cerca de pH 6,0.

D. Dosagens e Formas de Dosagem

[00204] As doses eficazes das formulações da invenção variam depedendo de muitos fatores diferentes que incluem o meio de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do indivíduo, se um indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Geralmente, o indivíduo é um ser humano, mas mamíferos não humanos incluindo mamíferos ransgênicos também podem ser tratados. Pode ser necessário que as dosagens de tratamento sejam tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.

[00205] As formulações da invenção podem ser administradas em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as dosagens individuais podem ser diários, semanais, quinzenais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma certa concentração plasmática do agente de ligação, tal como um anticorpo. A dosagem e a frequência vão variar dependendo da meia-vida do agente de ligação anti-LIGHT ou anti- CXCR5, tal como um anticorpo, no indivíduo. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguida por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos.

[00206] Em outras modalidades, a invenção oferece uma forma de dosagem unitária farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação da invenção para o tratamento de uma ou mais doenças em um indivíduo através da administração da forma de dosagem ao indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. O ser humano pode ser um adulto ou pode ser uma criança. O termo "forma de dosagem unitária farmacêutica" refere-se a uma unidade fisicamente distinta adequada como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados, cada unidade contendo um quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico/profilático desejado em associação com o tampão citrato e pH necessários.

[00207] A forma de dosagem unitária pode ser um recipiente compreendendo a formulação. Recipientes adequados incluem, porém sem limitação, ampolas seladas, frascos, garrafas, seringas, e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico, e podem ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Em algumas modalidades, o recipiente é um frasco. Geralmente, o recipiente deve manter a esterilidade e estabilidade da formulação.

[00208] Em modalidades específicas, as formulações são acondicionadas em frascos de 2 mL que são feitos de vidro transparente e incolor tipo I, e fechados com uma rolha (bromobutil revestido com um fluorpolímero) selada com tampas do tipo "flip-of" com flange (polipropileno). Os frascos são, em algumas modalidades, preenchidos com 1,2 mL das formulações de modo que o frasco tem um volume de transbordo de cerca de 0,2 mL por frasco, e um volume extraível de 1,0 mL. Por exemplo, isto significa que a dosagem do anticorpo anti-LIGHT (por exemplo, 150 mg/mL) estará contida em 1 mL de solução.

[00209] Em modalidades específicas, as formulações são secundariamente acondicionadas em um recipiente, tal como uma caixa de papelão, que protege os frascos contra a luz.

E. Métodos de Tratamento

[00210] Também são oferecidos nesta invenção métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por LIGHT, os métodos compreendendo administrar uma formulação da invenção a um indivíduo. A invenção refere-se ainda a uma formulação da invenção para uso em um método descrito neste relatório para tratar uma doença ou distúrbio mediado por LIGHT. Em certas modalidades, a doença mediada por LIGHT é uma doença intestinal crônica, ou uma doença do intestino inflamado (IBD), tal como doença de Crohn (CD) ou colite ulcerativa (UC). Em outras modalidades, a doença mediada por LIGHT é a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).

[00211] Também são oferecidos nesta invenção métodos para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por CXCR5, os métodos compreendendo administrar uma formulação da invenção a um indivíduo. A invenção refere-se ainda a uma formulação da invenção para uso em um método descrito neste relatório para tratar uma doença ou distúrbio mediado por CXCR-5. Em certas modalidades, o agente de ligação anti-CXCR5 é usado para redução de sinais e sintomas, inibição da evolução de um dano estrutural, indução de uma resposta clínica importante, e prevenção de incapacidade em pacientes adultos om artrite reumatoide (RA) moderadamente a severamente ativa que apresentaram resposta inadequada a uma ou mais drogas anti-reumáticas modificadoras da doença (DMARDs), tais como metotrexato (MTX), ou antagonistas de TNFD. O agente de ligação anti-CXCR5 pode ser usado em combinação com DMARDs ou com agonistas de anti-TNFD.

[00212] Em certas modalidades, as formulações da invenção podem ser administradas em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, terapias que não são as formulações da invenção que são atualmente administradas para prevenir, tratar, controlar, e/ou melhorar uma doença mediada por LIGHT ou uma doença mediada por CXCR5. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um indivíduo. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas), concomitantemene, ou depois (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo que tenha tido, tenha, ou seja suscetível a uma doença mediada por LIGHT ou uma doença mediada por CXCR5. Qualquer terapia adicional pode ser administrada em qualquer ordem com as outras terapias adicionais. Exemplos não limitativos de terapias que podem ser administradas em combinação com um anticorpo da invenção incluem agentes anti-inflamatórios aprovados listados na Farmacopeia Americana e/ou Physician's Desk Reference.

F. Kits

[00213] Certas modalidades da invenção incluem um kit compreendendo uma formulação da invenção. O kit pode compreender ainda um ou mais recipientes compreendendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e incluem outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo filtros, agulhas e seringas. Associadas aos kits podem ser encontradas instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos, que contêm informações sobre, por exemplo, as indicações, uso, dosagem, produção, administração, contraindicações, e/ou advertências referentes ao uso de tais produtos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos. O kit também pode estar associado a um rótulo que pode ser qualquer tipo de suporte de dados (por exemplo, um folheto, adesivo, chip, impresso ou código de barras) compreendendo informações. Em certas modalidades, as instruções etc. listadas acima podem estar compreendidas no rótulo. O kit pode compreender ainda um dispositivo para administração da formulação, e particularmente um dispositivo que contenha a formulação, isto é, um dispositivo pré- preenchido tal como, porém sem limitação, uma seringa pré- preenchida ou um autoinjetor pré-preenchido. O kit também pode compreender um recipiente compreendendo a formulação, isto é, um recipiente pré-preenchido, tal como um frasco, cartucho, sachê, ou ampola pré-preenchidos.

G. Combinação de diferentes modalidades

[00214] No contexto da presente invenção, qualquer uma das modalidades descritas neste relatório pode ser combinada com uma ou mais outras modalidades descritas neste relatório, a menos que explicitamente mencionado em contrário. Particularmente, qualquer um dos agentes de ligação e anticorpos descritos neste relatório e qualquer uma das formulações dos mesmos, descritas neste relatório, podem ser usados em combinação com qualquer um dos kits, dispositivos pré-preenchidos ou recipientes pré-preenchidos, ou podem ser usados nos métodos de tratamento e usos médicos descritos neste relatório em relação ao respectivo anticorpo (por exemplo, as formulações estáveis compreendendo os anticorpos anti-LIGHT ou os anticorpos anti-CXCR5 podem ser combinadas com qualquer um dos kits, recipientes ou dispositivos descritos neste relatório). Qualquer um dos agentes de ligação descritos neste relatório ligando-se especificamente a um antígeno (por exemplo, um agente de ligação ligando-se especificamente a LIGHT ou um agente de ligação ligando-se especificamente a CXCR5) também pode ser usado em qualquer um dos métodos de tratamento que estão descritos neste relatório em relação aos respectivos anticorpos (isto é, anti-LIGHT ou anti-CXCR5) e vice-versa.

EXEMPLOS

[00215] Para ajudar a ilustrar a invenção, oferecemos os exemplos que se seguem. Os exemplos não se destinam a limitar o escopo da invenção de forma alguma. Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de formulação farmacêutica, química, biologia molecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia tal como tecnologia de anticorpos, e técnicas tradicionais de preparação de polipeptídios como aquelas descritas, por exemplo, por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), volume 51, Ed.: Paul S., Humana Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), Eds.: McCafferty J. et al., Humana Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Anti-LIGHT

[00216] Um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8 ("anticorpo líder para LIGHT") foi usado nos Exemplos 1-9 para determinar as condições ideais de formulação.

MATERIAIS Batelada da substância medicamentosa

[00217] O anticorpo líder, formulado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 5,5 mg/mL e a um pH de 7,3 ("formulação original", "formulação em PBS", ou "lote de referência"), foi usado nos exemplos que se seguem.

Excipientes

[00218] A Tabela 1 mostra os excipientes que foram usados nos exemplos que se seguem, que foram escolhidos de acordo com sua aceitabilidade/adequabilidade para uso em produtos parenterais.

Tabela 1 - Excipientes usados neste estudo

MÉTODOS

[00219] Os métodos a seguir foram usados para produzir as formulações experimentais e as formulações da invenção contendo o anticorpo líder para LIGHT.

Produção e composição de tampões

[00220] Todos os tampões foram produzidos sob agitação para dissolver os respectivos excipientes. O pH foi ajustado usando HCl 0,1 M ou NaOH 0,1 M. A concentração geral de todos os tampões foi de 10 mM.

Produção e composição de soluções de estoque de excipiente

[00221] Todas as soluções de estoque foram produzidas sob agitação para dissolver os excipientes. A concentração foi dada como peso/peso (p/p).

Filtração estéril das amostras

[00222] Todas as amostras, soluções, tampões etc. foram filtrados estéreis (0,22 μm) usando uma membrana Sartopore-2. As amostras foram filtradas para dentro de garrafas ou frascos esterilizados e fechados em condições assépticas no interior de uma bancada limpa para prevenir contaminação microbiológica.

Teste de estresse mecânico

[00223] Estresse mecânico com uma velocidade de agitação de 350/minuto por 2,5 horas à temperatura ambiente foi efetuado usando- se um agitador de laboratório horizontal com uma distância de 26 mm (agitador e estufa incubadora da Bühler Company). Frascos 2R foram preenchidos com 1 mL de solução com um espaço livre de cerca de 2,5 mL. O teste de estresse mecânico foi planejado e realizado durante os primeiros estudos de pré-formulação e durante estudos relevantes para seleção do tensoativo.

Teste de estresse térmico

[00224] O estresse térmico foi usado como um teste de estresse durante todas as etapas do programa pré-formulação. As amostras foram armazenadas a +40°C seja por 24 horas ou por 7 dias, dependendo do estudo.

Métodos Analíticos no Preenchimento e Acabamento da Formulação

[00225] Os métodos analíticos a seguir foram usados no preenchimento e acabamento da formulação nos exemplos que se seguem.

Aspecto

[00226] O aspecto das soluções de anticorpo foi verificado visualmente, e adicionalmente documentado por uma fotografia tirada com uma câmera digital. pH

[00227] Todas as medições de pH foram feitas usando um medidor de pH com um microeletrodo.

Concentração usando UV

[00228] As concentrações de proteína de todas as soluções de anticorpo foram medidas contra um tampão usando um NanoDrop ND1000. As concentrações de proteína próximas ou abaixo de 5 mg/mL foram diluídas 1:3, ao passo que as concentrações de proteína mais altas próximas de 20 mg/mL foram diluídas 1:20, e a absorção foi medida a 215 nm e 280 nm.

Espalhamento de luz dinâmico (DLS)

[00229] O diâmetro hidrodinâmico da molécula foi medido usando- se espalhamento de luz laser. As amostras eram filtradas estéreis antes da análise no caso de ser observada turvação, portanto somente agregados solúveis puderam ser detectados.

Calorimetria de diferencial varredura (DSC)

[00230] Alíquotas da maioria das amostras pré-formulação foram examinadas por DSC usando um VPCapillary DSC da Microcal e exploradas no instrumento de autoclassificação a 90°C/hora com um tempo de filtro de 2 segundos. Amostras de 400 μl foram colocadas em placas de 96 poços e analisadas quanto à temperatura de desenrolamento Tm.

Osmolaridade

[00231] A osmolaridade foi medida usando um osmômetro Knaur automático.

Densidade

[00232] A densidade das formulações foi medida usando um viscosímetro de queda de esfera DMA4500 Anton Paar.

Métodos Analíticos em FF Bioanalítico

[00233] Os métodos analíticos a seguir foram usados no preenchimento e acabamento de bioanalíticos nos exemplos que se seguem.

Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)

[00234] Os agregados, assim como os produtos de degradação do anticorpo líder, foram quantificados usando cromatografia GL por exclusão de tamanho. O teste foi realizado por HPLC isocrática com uma coluna SUPERDEX 200 10/300.

SDS-PAGE, redutora e não redutora

[00235] Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usada para analisar a integridade molecular (por exemplo, meias-moléculas) e a pureza. Esta análise eletroforética foi realizada com géis em gradientes de 4 a 12% em condições redutoras e não redutoras. As proteínas foram visualizadas com coloração com Coomassie depois da separação eletroforética.

Troca catiônica fraca (WCX)

[00236] A cromatografia de troca catiônica fraca foi usada para monitorar a heterogeneidade de cargas do anticorpo. As percentagens das isoformas básicas, neutras, e ácidas foram reportadas. O teste foi realizado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) descontínua com uma coluna ProPac WCX10.

Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima com um antígeno (Antígeno- ELISA)

[00237] Antígeno-ELISA foi realizado para determinar a funcionalidade do anticorpo. As propriedades de ligação à proteína LIGHT nativa foram monitoradas em relação ao atual padrão do anticorpo. Esta potência foi potência foi relatada com a EC50 relativa.

Focalização isoelétrica (IEF)

[00238] IEF foi efetuada. O padrão isoelétrico era específico para o anticorpo líder e serviu como um teste de identificação. A degradação pôde ser vista por um padrão de cargas diferente.

Armazenamento

[00239] Todas as soluções de tampão, soluções de excipiente, e amostras foram armazenadas a 5°C (± 3°C), exceto onde mencionado em contrário.

Sumário de todas as formulações preparadas e analisadas

[00240] A Tabela 2 abaixo mostra um resumo de todas as formulações que foram preparadas e analisadas nos exemplos que seguem. Cada uma das formulações continha o anticorpo líder para LIGHT na concentração listada. Tabela 2 - Resumo de todas as formulações preparadas e analisadas

EXEMPLO 1 - Caracterização de uma formulação salina tamponada com fosfato (PBS) e desvantagens associadas à mesma

[00241] Neste exemplo, o lote de referência foi caracterizado. Como mencionado na seção Materiais acima, o lote de referência contém o anticorpo líder para LIGHT formulado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 5,5 mg/mL e a um pH de 7,3, e produzido em soluções de pesquisa Vitry (BioSCP).

[00242] Focalização isoelétrica (IEF) foi usada para determinar o ponto isoelétrico (pI) do anticorpo líder. O pI do anticorpo líder para LIGHT foi calculado teoricamente como 6,28, e em seguida foi medido por focalização isoelétrica desnaturada usando métodos tradicionais conhecidos na literatura. Como mostrado na Figura 1, as faixas principais mostram que o pI do anticorpo líder para LIGHT foi de 6,87,2.

[00243] SDS-PAGE foi usada para identificar o peso molecular do monômero de anticorpo, agregados em potencial, ou a presença de meias-moléculas. A Figura 2 mostra um gel de SDS-PAGE que comparou diferentes bateladas do lote de referência em condições redutoras e não redutoras. Um ELISA foi usado para determinar a atividade de ligação a antígeno do anticorpo líder para LIGHT. A Figura 3 mostra um gráfico de ELISA que foi usado para determinar a atividade de ligação a antígeno da primeira e segunda bateladas do lote de referência.

[00244] SEC foi usada para determinar a presença de agregados, assim como de produtos de degradação da primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 4, cromatografia por exclusão de tamanho detectou proteínas de alto peso molecular (HMWP), por exemplo, di-/oligômeros (RRT0,8) ou agregados, e proteínas de baixo peso molecular (LMWPs) ou produtos de degradação. A primeira batelada do lote de referência tinha uma pureza de 97% de teor de monômero.

[00245] WCX foi usado para monitorar a heterogeneidade de carga da primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 5, rearranjos de isoformas ácidas, neutras, e básicas ocorreram durante estudos de estabilidade. A primeira batelada do lote de referência tinha uma distribuição de isoformas ácidas/neutras/básicas de 42,3/55,6/1,9%.

[00246] DSC foi usada para analisar a temperatura de desenrolamento Tm da primeira batelada do lote de referência. Como mostrado na Figura 6, os três domínios do anticorpo desenrolaram a 68°C, 75°C, e 78°C.

[00247] DLS foi usada para determinar o diâmetro hidrodinâmico do monômero de anticorpo e potenciais agregados solúveis. Como mostrado nas Figuras 7 e 8, um diâmetro hidrodinâmico de cerca de 10 nm foi detectado, mas agregados foram vistos em PBS. No entanto, agregados não foram vistos em tampão citrato (Figura 10).

EXEMPLO 2 - Desenvovliemtno de formulações tamponadas com citrato, e vantagens associadas às mesmas

[00248] O tampão original, solução salina tamponada com fosfato (PBS) a um pH de 7,3, estava, em termos de pH, muito próximo do ponto isoelétrico (pI) do anticorpo líder (vide Exemplo 1). Além disso, a formulação original exibiu agregados; meias-moléculas; produtos de degradação; proteínas de baixo peso molecular (LMWPs); proteínas de alto peso molecular (HMWPs); e rearranjos de isoformas ácidas, básicas, e neutras do anticorpo (vide Exemplo 1). Por conseguinte, houve necessidade de uma formulação melhorada que não sofra dessas desvantagens.

[00249] Formulações do anticorpo líder para LIGHT (um anticorpo anti-LIGHT IgG4 totalmente humano compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 8) contendo 10mM de tampão citrato a um pH de 5, 5,5, e 6, com e sem polissorbato 20 foram testadas. A Tabela 3 mostra os resultados analíticos da primeira batelada do lote de referência, e as várias formulações experimentais do anticorpo líder para LIGHT formuladas em citrato, a um pH de 5,0 e 5,5 e 6,0, com e sem polissorbato 20. Agregados foram encontrados em medições de espalhamento de luz dinâmico (DLS) para o lote de referência, mas não em todas as outras formulações testadas. A Tm, conforme medida por calorimetrial diferencial de varredura (μDSC), indicou que seria possível presumir que quanto mais alto o pH, maior a estabilidade termodinâmica. Mas para formulações com alta concentração de anticorpo, era preciso escolher um pH abaixo do pI do anticorpo.

[00250] Como mostrado na Tabela 4, os dados de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) mostraram uma quantidade significativamente reduzida de proteínas de alto peso molecular (HMWPs) para o anticorpo líder para LIGHT em tampão citrato em relação ao lote de referência (tampão fosfato a um pH 7,3). Em contraste, não foi possível detectar diferenças com SDS-PAGE (Tabela 5).

[00251] Tendo em vista os melhoramentos proporcionados pela formulação de anticorpo tamponada com citrato do Exemplo 2, os componentes do tampão citrato foram otimizados para concentrações aumentadas do anticorpo líder para LIGHT. A Tabela 6 mostra os resultados analíticos da primeira batelada de formulações com alta concentração de anticorpo (cerca de 40 mg/ml): solução salina tamponada com alto teor de fosfato (PBS) a um pH de 7,3 (Formulação 2) ou citrato a um pH de 5,5 com polissorbato 20 (Formulação 4). Tabela 6 Resultados analíticos das formulações 2 e 4

[00252] Um teor ligeriamente reduzido de monômero foi observado depois de concentrar a solução de proteína em tampão citrato. Além disso, a concentração de dímeros foi reduzida e também foi possível reduzir significativamente as proteínas de alto peso molecular (HMWPs) (vide Tabela 7). Em contraste, essas impurezas e subprodutos foram aumentados aumentando-se a concentração em tampão fosfato. Não foi possível detectar diferenças com análise por SDS-PAGE (Tabela 8).

EXEMPLO 4 - Desenvolvimento de formulações de anticorpo liofilizadas

[00253] Para testar a viabilidade de liofilização, diferentes formulações experimentais liofilizadas foram produzidas e submetidas à análise da estabilidade. A concentração do anticorpo líder para LIGHT foi aumentada para 50 mg/mL.

[00254] A Tabela 9 mostra o programa de secagem por congelamento que foi usado neste exemplo. Tabela 9 - Programa de secagem por congelamento

[00255] A Tabela 10 mostra os resultados analíticos da primeira batelada do lote de referência, e as várias formulações experimentais liofilizadas do anticorpo líder para LIGHT formuladas em várias combinações de tampão citrato, sacarose, polissorbato 20, e prolina.

[00256] Como mostrado na Tabela 11, foi possível reduzir nitidamente as proteínas de alto peso molecular (HMWPs) usando tampão citrato. Nenhuma diferença no teor de dímeros foi vista durante o tempo de armazenamento a 40°C. Um aumento de proteínas de baixo peso molecular (LMWPs) depois de secagem por congelamento foi observado. Como antes, essas diferenças não puderam ser detectadas com análise por SDS-PAGE (Tabela 12).

EXEMPLO 5 - Estudo de estabilidade acelerada

[00257] Um estudo de estabilidade acelerada foi realizado com tampões citrato e histidina. A Tabela 13 mostra os resultados analíticos da primeira batelada do lote de referência, e as várias formulações experimentais do anticorpo líder para LIGHT formuladas em várias combinações de tampão citrato ou tampão histidina. Extraordinariamente, a formulação de citrato da invenção pareceu em todas as experiências ter um desempenho melhor que a histidina. Em particular, as formulações de citrato tiveram teor de monômero mais alto em relação tanto à batelada do lote de referência quanto à histidina (Tabela 13) e o teor de proteínas de baixo peso molecular (LMWPs) e de proteínas de alto peso molecular (HMWPs) também foi significativamente mais baixo (Tabela 14). Como antes, essas diferenças não puderam ser detectadas com análise por SDS- PAGE(Tabela 15).

EXEMPLO 6 - Desenvolvimento de formulação com alta concentração de anticorpo para administração subcutânea

[00258] Com base nos bons resultados das formulações tamponadas com citrato dos Exemplos 2-5, uma formulação com alta concentração (150 mg/ml) de anticorpo adequada para administração subcutânea foi desenvolvida. O desenvolvimento da formulação foi efetuado com o anticorpo líder para LIGHT com o objetivo de desenvolver uma forma de dosagem líquida com uma vida de prateleira aceitável a uma temperatura de +2 a +8°C. Estudos de estresse preliminares mostraram a formação de partículas subvisíveis e visíveis, espécies de alto peso molecular e espécies mais básicas. Por conseguinte, esses parâmetros foram monitorados durante a triagem de formulações candidatas usando avaliação visual, espalhamento de luz dinâmico, obscurecimento, cromatografia por exclusão de tamanho, eletroforese em geral de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida, e cromatografia de troca catiônica fraca. Diferentes formulações líquidas foram usadas nos ensaios de pré- formulação e formulação antes da seleção da formulação clínica. De acordo com os achados, uma formulação em 10 mM de tampão citrato com o pH ajustado em pH 5,5 (Formulação 14) foi selecionada para desenvolvimento adicional. O pH da formulação está na região de estabilidade física e química ideal da substância medicamentosa e tolerabilidade fisiológica aceitável (por exemplo, osmolaridade).

[00259] Como mostrado na Tabela 16, a Formulação 14 é uma solução para injeção e é uma solução aquosa, estéril e límpida contendo o anticorpo líder para LIGHT, citrato de sódio di-hidratado (agente tamponante), polissorbato 20 (agente estabilizante), e manitol (agente tonificante). Solução de hidróxido de sódio e ácido clorídrico foram usadas para ajustar o pH em 5,5.

[00260] Todos os excipientes eram excipientes solúveis e bem tolerados tradicionais em farmacopeias para administração parenteral e listados em Ph. Eur. e USP. Tabela 16 – Composição

a Os componentes estão listados segundo seus nomes farmacopeicos. No caso de haver mais de uma monografia, outros nomes estão dados entre colchetes, junto com o compêndio de origem. b Fazemos referência à atual edição da Farmacopeia.

EXEMPLO 7 -Processo de produção para formulação de anticorpo subcutânea

[00261] Um processo de produção compatível com GMP foi desenvolvimento para a formulação subcutânea com alta concentração de anticorpo (Formulação 14) do Exemplo 6. O processo de produção consistia nas etapas de dissolução, ajuste do pH, filtração estéril, preenchimento, e acondicionamento.

[00262] A substância medicamentosa (o anticorpo líder para LIGHT) é apresentada em uma forma líquida na formulação tampão (10 mM de tampão citrato a pH 5,5). Os excipientes eram todos solúveis em água e foram dissolvidos na porção aquosa inicial do tampão de formulação durante a produção. A solução de substância medicamentosa em massa foi ainda diluída com o mesmo tampão de formulação até atingir a concentração de 150 mg/mL de anticorpo líder para LIGHT. A solução em massa foi bem misturada para facilitar o processo de dissolução e garantir homogeneidade.

[00263] Esterilização por filtração foi efetuada (de acordo com a Ph. Eur. e USP) usando filtros retentores de bactérias tendo um tamanho de poro nominal de 0,2 μm. Um procedimento de filtração adicional antes da "esterilização por filtração" foi efetuado para garantir uma carga biológica baixa. A amostragem da carga biológica foi feita antes da etapa de pré-filtração assim como da etapa de filtração estéril.

[00264] A preparação e o preenchimento da solução esterilizada nos recipientes adequados foram feitos em condições assépticas. Esses procedimentos estavam de acordo com monografias farmacopeicas e diretrizes relacionadas, que requerem esterilização por filtração e subsequente processamento asséptico. O equipamento, que entra em contato com o produto depois da etapa de "esterilização por filtração", foi esterilizado por calor ou vapor usando um método validado (de acordo com Ph. Eur. / USP).

[00265] Os frascos foram preenchidos até cerca de 1,2 mL para garantir um volume extraível de 1,0 mL. Os frascos de 2 mL eram feitos de vidro incolor transparente tipo, e foram fechados com uma rolha (bromobutil revestido com fluorpolímero) seladas com tampas do tipo "flip-off" com um flange (polipropileno). Os materiais de acondicionamento principal satisfaziam as exigências das Ph. Eur. e USP. A adequabilidade dos materiais de acondicionamento principal foi corroborada pelos resultados dos testes de estabilidade. Não foram observadas incompatibilidades do material de acondicionamento principal. Acondicionamento secundário que proporciona proteção do produto contra luz.

[00266] A compatibilidade com seringas de aplicação foi avaliada usando 3 tamanhos de seringa e diâmetros de agulhas diferentes (entre os calibres 25 e 28)da solução de produto medicamentoso. Não foram obtidas diferenças em termos da qualidade do produto. A compatibilidade foi comprovada por um período de tempo de 8 horas.

[00267] A Formulação 14 foi feita em bateladas de 5L, cuja composição está mostrada na Tabela 17. Entretanto, o tamanho da batelada pode ser ajustado de acordo com as necessidades clínicas. Tabela 17 - Fórmula da batelada

a Os frascos foram preenchidos com um volume de 1,2 mL para garantir um volume extraível de 1,0 mL. Um tamanho de batelada de 6,0 L resulta portanto em um rendimento teórico de 5000 frascos. b Para ajuste do pH. c Este foi calculado de acordo com a densidade da solução de produto medicamentoso final (1,05705 mg/mL).

[00268] O processo de produção e controle do processo para a Formulação 14 estão mostrados no fluxograma na Figura 9. A produção da batelada incluiu as seguintes etapas:

[00269] I. Citrato de sódio di-hidratado foi dissolvido em água para injeção com agitação em um vaso feito de material inerte (por exemplo, aço inoxidável ou vidro), até sua completa dissolução. O valor do pH foi ajustado em 5,5 usando ácido clorídrico, diluído (por exemplo, ácido clorídrico 0,1 M) e/ou solução de hidróxido de sódio (por exemplo, hidróxido de sódio 0,1 M), se necessário.

[00270] II. Anticorpo líder, manitol, e polissorbato 20 foram diluídos na solução de tampão da etapa 1 com agitação em um vaso feito de material inerte (por exemplo, aço inoxidável ou vidro), até sua completa dissolução. Se necessário, o valor do pH foi ajustado em 5,5 usando ácido clorídrico, diluído (por exemplo, ácido clorídrico 1 M) ou solução de hidróxido de sódio (por exemplo, hidróxido de sódio 1 M). A solução tampão da etapa 1 (restante) foi adicionado para ajustar o peso final.

[00271] III. a) Pré-filtração:

[00272] A solução da etapa II foi filtrada em condições assépticas usando um filtro de membranas compatível esterilizado (por exemplo, poliéter sulfona ou difluoreto de polivinilideno) tendo um tamanho de poro nominal de 0,2 μm.

[00273] b) Esterilização por filtração:

[00274] A solução da etapa III.a foi esterilizada por filtração em condições assépticas para dentro de recipientes esterilizados feitos de material inerte (por exemplo, aço inoxidável ou vidro), usando um filtro de membranas compatível esterilizado (por exemplo, poliéter sulfona ou difluoreto de polivinilideno) tendo um tamanho de poro nominal de 0,2 μm.

[00275] IV. A solução da etapa III.b foi introduzida em condições assépticas em frascos esterilizados, que foram fechados com rolhas e tampas do tipo "flip-off" com um flange.

[00276] V. Os recipientes da etapa IV foram inspecionados quanto à presença de contaminantes grosseiros, vedação intacta, e partículas visíveis.

[00277] VI. Os recipientes inspecionados da etapa V foram adicionalmente acondicionados em recipientes adequados (por exemplo, caixas de papelão).

[00278] Além disso, DLS foi usada para determinar o diâmetro hidrodinâmico do monômero de anticorpo e potenciais agregados solúveis. Como mostrado na Figura 10, agregados não foram vistos em tampão citrato. Entretanto, como mostrado nas Figuras 7 e 8, agregados foram vistos em PBS. Devido à concentração mais alta de anticorpo, um aumento no Z médio para 28 nm foi observado, em relação à amostra em PBS.

EXEMPLO 8 - Perfil de estabilidade para formulação subcutânea de anticorpo

[00279] O perfil de estabilidade da batelada clínica (batelada 2) do Exemplo 7 foi avaliado em relação ao armazemaneto a longo prazo e condições de teste aceleradas de acordo com as normas ICH. Amostras foram acondicionados e armazenadas em frascos de 2 mL transparentes e incolores (vidro tipo I) fechados com rolhas (bromobutil revestido com fluorpolímero) e tampas do tipo "flip-off" com um flange (polipropileno). Os seguintes testes foram realizados durante a estabilidade: aspecto (claridade, cor), ensaio (antígeno-ELISA, UV), pureza (SEC, SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras), integridade molecular (SDS-PAGE em condições não redutoras), heterogeneidade de carga (cromatografia de troca catiônica fraca, focalização isoelétrica), pH, esterilidade, endotoxinas bacterianas, matéria particulada (partículas visíveis e subvisíveis), e integridade do fecho.

[00280] As amostras foram armazenadas nas posições invertida e vertical. Os resultados do armazenamento invertido foram apresentados como a condição mais rigorosa. Os dados de estabilidade a -20°C, +5°C e +25°C estão apresentados nas Tabelas 18-20, respectivamente. As investigações sobre as propriedades físicas, químicas, e biológicas de armazenamento em condições de armazenamento prolongado confirmaram a boa estabilidade do produto medicamentoso a 5°C (vide Tabela 19). Em condições de teste aceleradas (+25°C), apenas uma leve redução na pureza foi detectada por cromatografia por exclusão de tamanho (vide Tabela 20). Portanto, concluímos que o produto medicamentoso deve ser armazenado a uma temperatura de +2°C a +8°C protegido contra luz. Tabela 18 - Estabilidade a longo prazo a -20°C para o produto medicamentoso

EXEMPLO 9 - Desenvolvimento de formulação com concentração ultra-alta de anticorpo para administração subcutânea

[00281] Com base nos bons resultados das formulações tamponadas com citrato para concentrações de anticorpo de até 150 mg/mL no Exemplo 7, formulações com concentração de anticorpo mais alta de (até 250 mg/ml) adequadas para administração subcutânea foram desenvolvidas.

[00282] Dados preliminares mostraram que a formulação com concentrações de anticorpo acima de 150 mg/mL pode levar a viscosidades mais altas afetando o uso da formulação. Tabela 21 - Concentrações ultra-alta com a formulação 14

[00283] Como pode ser visto na Tabela 21, a viscosidade diminui com concentrações mais baixas do anticorpo, estando ainda assim em uma faixa aceitável na concentração mais alta formulada com a formulação 14. Todos os outros pareceram não afetados ou apenas levemente afetados pelas concentrações ultra-altas.

[00284] Como mostrado na Tabela 22, as concentrações de anticorpo não afetaram a estabilidade das formulações, o que foi indicado pelos dados de estabilidade idênticos em 1 mês em condições de longo prazo e estresse. Tabela 22 - Dados de estabilidade em 1 mês de formulações com altas concentrações de anticorpo líder

Estudos de pré-formulação de anti-CXCR5 (20 mg/mL)

[00285] Um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25 e uma cadeia leve compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 26 (anticorpo CXCR5 lícer") foi usado nos Exemplos 10-12 para determinar as condições ideais de formulação para uma formulação a 20 mg/mL.

[00286] O anticorpo líder é um anticorpo monoclonal humanizado (mAB) específico para CXCR5 humano, com um esqueleto de IgG4 construído geneticamente contendo 2 substituições de aminoácidos destinadas a reduzir meias-moléculas (S241P) e funções efetoras (L248E). A estrutura da proteína do anticorpo líder para CXCR5 é compreendida de duas cadeias leves capa, cada uma delas com um peso molecular de aproximadamente 24 kDa, e duas cadeias pesadas de IgG4, cada uma delas com peso molecular de aproximadamente 48 kDa ligada por meio de pontes dissulfeto. Cada cadeia leve consiste em 219 resíduos aminoacídicos, e cada cadeia pesada consiste em 437 resíduos aminoacídicos.

[00287] Os dados nos Exemplos 10-12 foram coletados durante atividades de pré-formulação para o anticorpo líder para CXCR5 e seu produto medicamentoso para administração intravenosa e subcutânea. O objetivo dos estudos de pré-formulação era proporcionar boa estabilidade para soluções tamponadas de anticorpo líder para CXCR5 com uma concentração alvo de 20 mg/mL, com ênfase especial no comportamento de agregação do anticorpo líder para CXCR5 e sua tendência para formar meias-moléculas, já que o anticorpo líder é um anticorpo da subclasse IgG4, que tem tendência à agregação e formação de partículas.

MATERIAIS Substância medicamentosa (DS)

[00288] O anticorpo líder para a batelada de CXCR5 RSN0151 foi formulado em PBS pH 7,2 com uma concentração de 5,13 mg/mL.

Excipientes

[00289] A Tabela 23 mostra os excipientes que foram usados durante os estudos de pré-formulação. Tabela 23 - Excipientes usados durante a pré-formulação

MÉTODOS

[00290] Os métodos a seguir foram usados para produzir as formulações experimentais e as formulações da invenção contendo o anticorpo líder para CXCR5.

Produção e composição de tampões

[00291] Todos os tampões foram produzidos por agitação constante até dissolver os respectivos excipientes. O pH foi ajustado usando HCl 0,1 M ou NaOH 0,1 M. A concentração geral de todos os tampões foi de 10 mM.

Produção e composição de soluções de estoque de excipiente

[00292] Todas as soluções de estoque foram produzidas por agitação constante até dissolver os excipientes. As concentrações estão dadas em peso/peso (p/p).

UF/DF - pequena escala

[00293] As experiências de UF/DF foram realizadas usando unidades Vivaspin (Sartorius Stedim, Gottingen, Alemanha) com uma membrana Hydrosart e um corte de 30 kDa para remover o tampão fosfato e substituí-lo pelos tampões apropriados e para aumentar a concentração. Essas unidades foram colocadas em uma centrífuga de laboratório comum (Multifuge 3S, Haereus, Alemanha) e centrifugadas a 2000 rpm (860 G, raio do rotor 192 mm) a +5°C.

UF/DF - grande escala

[00294] UF/ As experiências de UF/DF foram realizadas usando unidades Vivaflow (Sartorius Stedim, Gottingen, Alemanha) com uma membrana Hydrosart e um corte de 30 kDa para remover o tampão fosfato e substituí-lo pelos tampões apropriados e para aumentar a concentração. O equipamento foi colocado no interior de uma bancada limpa em condições assépticas e o processo foi efetuado à temperatura ambiente.

Filtração estéril das amostras

[00295] Todas amostras, solutions, tampões, etc. foram filtrados estéreis (0,22 μm) usando uma membrana Sartopore-2. As amostras foram filtradas para dentro de garrafas ou frascos esterilizados e fechadas em condições assépticas no interior de uma bancada limpa para prevenir contaminação microbiológica.

Teste de estresse mecânico

[00296] Estresse mecânico com uma velocidade de agitação de 350 rpm/min por 2,5 horas à temperatura ambiente foi efetuado usando um agitador de laboratório horizontal com uma distância de 26 mm (agitador e estufa incubadora da Bühler Company). Os frascos 2R foram preenchidos com 1 mL de solução com um espaço livre de cerca de 2,5 cm3.

[00297] Um teste de estresse mecânico foi planejado e realizado durante os primeiros estudos de pré-formulação. Como os resultados analíticos não mostraram informações adicionais em relação aos testes de estresse térmico, durante a seleção do tampão ou seleção do pH, este teste só foi usado durante a seleção do tensoativo.

Teste de estresse térmico

[00298] O estresse térmico foi usado como um teste de estresse acelerado durante todas as etapas do programa de pré-formulação. As amostras foram armazenadas a +40°C seja por 24 horas, 7 dias, ou 3 meses, dependendo do estudo.

Métodos analíticos no preenchimento e acabamento das formulações

[00299] Os métodos analíticos a seguir foram usados nos exemplos que se seguem.

Aspecto

[00300] O aspecto das soluções de anticorpo foi verificado visualmente e adicionalmente documentado com uma fotografia tirada com uma câmera.

pH

[00301] Todas as medições de pH foram efetuadas usando um medidor de pH com um microeletrodo.

Concentração usando UV

[00302] A concentração de proteínas de todas as soluções de anticorpo foi medida contra um tampão usando um Nanodrop ND1000. As concentrações de proteína próximas ou abaixo de 5 mg/mL foram diluídas 1:3, e as concentrações de proteína mais altas próximas de 20 mg/mL foram diluídas 1:20, antes de ser medida a absorção a 215 nm e 280 nm.

Espalhamento de luz dinâmico (DLS)

[00303] O diâmetro hidrodinâmico da molécula foi medido usando espalhamento de luz laser. As amostras foram filtradas estéreis antes da análise no caso de ser observada turvação, portanto somente agregados solúveis puderam ser detectados.

Teste da Tioflavina-T

[00304] Medições da fluorescência de algumas amostras de pré- formulação foram realizadas usando um Tecan GENios Plus, XFLOUR4. As amostras foram submetidas a estresse mecânico (4 horas a +37°C, velocidade de agitação 300 unidades/min e 26 mm de distância em um agitador e estufa incubadora da Bühler company). Os espectros de fluorescência da Tioflavina-T foram medidos à temperatura ambiente. 10 μl de solução de Tioflavina-T (10,1 mM em água ultrapura) foram adicionados a 1 ml das formulações e misturados delicadamente. A mistura foi então dispensada em um copo de Eppendorf preto em forma de V, e em seguida em uma placa de 96 poços (100 μL por poço).

[00305] O teste da Tioflavina-T foi usado no início das atividades de pré-formulação para detectar agregados insolúveis. Mas, como esses agregados podem ser vistos visualmente como uma turvação da solução, este método não foi usado em todo o programa de pré- formulação.

Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

[00306] Alíquotas das amostras de pré-formulação foram examinadas por DSC usando um VPCapillary DSC da Microcal e exploradas no instrumento de autoclassificação a 90°C/hora com um tempo de filtro de 2 segundos. Amostras de 400 μl foram colocadas em placas de 96 poços e analisadas quanto à temperatura de desenrolamento Tm.

Osmolaridade

[00307] A osmolaridade foi medida usando um osmômetro Knaur automático.

Densidade

[00308] A densidade das formulações foi medida usando um viscosímetro de queda de esfera DMA4500 Anton Paar.

Métodos analíticos em FF Bioanalítico Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)

[00309] Os oligômeros/dímeros dos anticorpos foram quantificados usando cromatografia por exclusão de tamanho. O teste foi realizado por HPLC isocrática com uma coluna SUPERDEX 200 10/300.

SDS-PAGE, redutora e não redutora

[00310] Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usada para analisar a integridade molecular (por exemplo, meias-moléculas) e o aspecto dos produtos de degradação. Esta análise eletroforética foi realizada com géis homogêneos a 15% em condições redutoras e não redutoras. As proteínas foram visualizadas com coloração com prata depois da separação eletroforética.

WCX

[00311] A cromatografia de troca catiônica fraca (WCX) foi usada para monitorar a heterogeneidade de cargas do anticorpo. As percentagens das isoformas básicas, neutras, e ácidas foram reportadas. O teste foi realizado por HPLC descontínua com uma coluna ProPac WCX10.

Antigen-ELISA

[00312] Antígeno-ELISA foi realizado para determinar a funcionalidade do anticorpo. A propriedade de ligação a um peptídio 28mero do antígeno CXCR5 foi monitorada em relação a o atual padrão do anticorpo. Esta potência foi relatada com a EC50 relativa.

Focalização isoelétrica (IEF)

[00313] IEF foi efetuada.

Storage

[00314] Todas as soluções de tampão, soluções de excipientes, e amostras foram armazenadas a +5°C, exceto onde mencionado em contrário.

RESUMO DE TODAS AS FORMULAÇÕES PREPARADAS E ANALISADAS

[00315] A Tabela 24 abaixo mostra um resumo de todas as formulações que foram preparadas e analisadas nos exemplos 10-12. Cada uma das formulações continha o anticorpo líder para CXCR5. PBS significa solução salina tamponada com fosfato. PB stands for tampão fosfato. PS significa polissorbato. LA significa o anticorpo líder para CXCR5. Tabela 24 - Resumo de todas as formulações preparadas e analisadas

Exemplo 10 - Formulação de tampão fosfato

[00316] A seguir encontra-se um panorama dos resultados da caracterização da substância medicamentosa de anticorpo líder para CXCR5 em tampão fosfato.

IEF

[00317] O pI (ponto isoelétrico) do anticorpo líder para CXCR5 foi calculado teoricamente como 7,6, e confirmado por focalização isoelétrica desnaturada (pI de 7,6- 8,4). Vide Figura 11.

SDS-PAGE

[00318] SDS-PAGE foi usada para determinar o peso molecular do monômero de anticorpo, agregados em potencial, ou a presença de meias-moléculas. A Figura 12 mostra um exemplo de um gel de SDS- PAGE para comparar diferentes bateladas da substância medicamentos em condições redutoras e não redutoras.

ELISA

[00319] A Figura 13 mostra um exemplo de um gráfico de ELISA para determinar a atividade de ligação a antígeno do anticorpo líder. SEC

[00320] Como mostrado na Figura 14, cromatografia por exclusão de tamanho detectou proteínas de alto peso molecular (HMWP), por exemplo, dioligômeros/oligômeros ou agregados e proteínas de baixo peso molecular (LMWPs) ou produtos de degradação. A batelada de anticorpo líder para CXCR5 apresentou uma pureza de 99% de teor de monômero.

WCX

[00321] Cromatografia de troca catiônica fraca para o anticorpo líder mostra na Figura 15, heterogeneidade de cargas de exposição. Durante os estudos de estabilidade, o rearranjo dos picos ácidos mudou e a percentagem de isoformas básicas aumentou. O anticorpo líder para CXCR5 teve uma distribuição de isoformas ácidas/neutras/ básicas de 14/85/1%.

Espalhamento de luz dinâmico

[00322] Como mostrado na Figura 16, DLS foi usada para determinar o diâmetro hidrodinâmico do monômero de anticorpo e potenciais agregados solúveis.

[00323] Concluindo, o anticorpo líder deve ser estável em PBS, mas a formação de agregados é fácil de ser gerada por forças de cisalhamento ou estresse luminoso.

[00324] Além disso, o pH da PBS é próximo do pI do anticorpo líder para CXCR5. Portanto, a formulação deve ser formulada pelo menos um ponto de pH abaixo do pI.

[00325] A Tabela 25 mostra 3 dos resultados de um estudo de estabilidade em três meses do anticorpo líder para CXCR5. O anticorpo líder foi armazenado a diferentes temperaturas e analisado depois de um e três meses. Tabela 25 - Resultados analíticos de um estudo de estabilidade em 3 meses da DS

[00326] Os dados do estudo de estabilidade em 3 meses com o anticorpo líder para CXCR5 tamponado em PBS indicou que não houve alterações relevantes durante armazenamento a +5°C e a - 20°C. Depois de 3 meses em condições aceleradas (+25°C), foi possível observar alterações significativas. Faixas adicionais,segundo analisadas por SDS-PAGE e por análise da mancha ocidental, mostraram um aumento de isoformas básicos e uma redução de isoformas ácidas, sugerindo produtos de degradação.

Exemplo 11 - Tampão e otimização do pH

[00327] PBS pH 7,2 mostrou agregação e degradação depois de ciclos de congelamento/descongelamento e depois de armazenamento no estado congelado. Assim sendo, foi necessário encontrar um outro tampão e uma faixa de pH melhor. Além disso, a PBS não é adequada para congelamento das soluções, já que ocorre um desvio do pH.

[00328] 30 tampões diferentes com vários sistemas de pH e tampão foram usados para a seleção da melhor faixa de pH. Essas experiências foram feitas em uma escala muito pequena, e analisadas intensamente.

Triagem do melhor tampão e seleção do pH - pequena escala (rendimento 5 mL)

[00329] Os resultados analíticos estão resumidos nas Tabelas 40, 41, 42, e 43.

[00330] Nas Figuras 17 e 18, está mostrado o aspecto de dois sistemas de tampão adequados (acetato e histidina) depois de estresse térmico. pH 5,5 em acetato e pH 5,0 em histidina foram escolhidos para avaliação adicional. A título de contraste, na Figura 19, está mostrado o aspecto de um sistema de tampão incompatível (TRIS tampão).

[00331] Os seguintes tampões foram selecionados para teste de UF/DF em grande escala: • Citrato 10 mM, pH 6 • Acetato 10 mM, pH 5,5 • Succinato 10 mM, pH 5 • Histidina 10 mM, pH 5 • Arginina 10 mM, pH 6

Triagem do melhor tampão e seleção do pH - grande escala (rendimento ~ 20 g)

[00332] Depois que foi possível selecionar os melhores tampões e pH, uma quantidade maior de anticorpo líder para CXCR5 em cada sistema de tampão foi preparada usando-se o sistema Sartorius Vivaflow. Cada batelada foi testada analiticamente e os resultados estão descritos abaixo.

Tampão citrato 10 mM, pH 6 (LA 09 016)

[00333] A etapa de UF/DF funcionou bem e uma solução apenas levemente turva foi obtida; não foram encontradas quaisquer dificuldades durante a filtração estéril. Não foi observado qualquer aumento do diâmetro hidrodinâmico, segundo analisado por DLS.

[00334] Os resultados analíticos indicaram que não houve aumento nos dímeros, e nenhuma alteração nas isoformas básicas ou ácidas em relação ao material da batelada do anticorpo líder para CXCR5. Vide Tabela 26 e Figura 20. Tabela 26 - Resultados analíticos de anticorpo líder em tampão citrato pH 6

Acetato tampão 10 mM, pH 5,5 (LA 09 017)

[00335] A etapa de UF/DF funcionou bem, mas foi obtida uma solução turva; entupimento do filtro durante filtração estéril.

[00336] Os resultados analíticos indicaram que não houve aumento nos dímeros, e nenhuma alteração nas isoformas básicas ou ácidas em relação ao material da batelada do anticorpo líder para CXCR5. Vide Tabela 27 e Figura 21. Tabela 27 - Resultados analíticos do anticorpo líder em tampão acetato pH 5,5

Succinato tampão 10 mM, pH 5 (LA 09 018)

[00337] A filtração estéril depois de UF/DF foi difícil de realizar por causa do entupimento do filtro. O rendimento de 12 g foi muito baixo.

[00338] Os resultados analíticos indicaram uma leve redução nos dímeros, e nenhuma alteração nas isoformas básicas ou ácidas em relação ao material da batelada do anticorpo líder para CXCR5. Depois de estresse mecânico, a concentração de dímeros aumentou ligeiramente, e o pico das isoformas ácidas em WCX diminuiu com o aumento das isoformas básicas. Vide Tabela 28 e Figura 22. Tabela 28 - Resultados analíticos do anticorpo líder em tampão succinato pH 5

Tampão histidina 10 mM, pH 5 (LA 09 019)

[00339] A filtração estéril depois de UF/DF foi muito difícil de realizar por causa do entupimento do filtro. O rendimento de 10,5 g foi muito baixo.

[00340] Os resultados analíticos indicaram uma leve redução nos dímeros, e nenhuma alteração nas isoformas básicas ou ácidas em relação ao material da batelada do anticorpo líder para CXCR5. Depois de estresse mecânico, a concentração de dímeros aumentou ligeiramente e o pico das isoformas ácidas em WCX diminuiu com o aumento das isoformas básicas. Vide Tabela 29 e Figura 23. Tabela 29 - Resultados analíticos de anticorpo líder em tampão histidina pH 5

Tampão arginina 10 mM, pH 6 (LA 09 020)

[00341] A filtração estéril depois de UF/DF foi muito difícil de realizar. DLS mostrou um pico apresentado ("brought peak") com um diâmetro hidrodinâmico de 21,08 nm, o que pode indicar formação de dímeros.

[00342] Os resultados analíticos indicaram um leve aumento nos dímeros de 0,29% na batelada do anticorpo líder para CXCR5 para 0,49% em arginina. Depois de estresse mecânico, 0,61% de dímeros foram encontrados e um aumento em isoformas básicas em WCX foi detectado. Vide Tabela 30 e Figura 24. Tabela 30 - Resultados analíticos do anticorpo líder em tampão arginina pH 5

[00343] Concluindo, três das cinco bateladas são compatíveis com o anticorpo líder para CXCR5 a uma concentração de 20 mg/ml: • Citrato pH 6,0 • Acetato pH 5,5 • Histidina pH 5,0

[00344] Estas bateladas foram caracterizadas de forma mais detalhada em termos de compatibilidade e estabilidade.

Exemplo 12 - Compatibilidade com excipientes

[00345] Todas as bateladas mencionadas acima foram usadas para estudos de compatibilidade com tensoativos.

[00346] Os estudos de compatibilidade foram realizados com o anticorpo líder para CXCR5 e quatro tampões selecionados. Succinato pH 5,0 e arginina pH 6,0 não foram testados com excipientes, uma vez que esses tampões não foram compatíveis com o anticorpo líder para CXCR5. Os excipientes foram classificados da seguinte maneira: • Tensoativos • Açúcares • Sais • Outros (aminoácidos, preservativos)

[00347] Estresse mecânico (velocidade do agitator 350/min, 2,5 horas, temperatura ambiente) foi aplicado para testar o efeito dos tensoativos, e estresse mecênico (+40°C, uma semana) was foi usado para testar todos os outros excipientes.

Tensoativos

[00348] Estudos de orientação sobre a seleção do tipo de tensoativos (LA_08_001) e da concentração de tensoativos (LA_09_003; 0,01%, 0,05%, e 0,1%) indicarar que uma concentração de 0,01% era suficiente para prevenir agregados visíveis. Os tensoativos a seguir não foram adequados para o anticorpo líder para CXCR5: PVP K12 e K17, uma vez que ambos mostraram turvação antes da aplicação de estresse mecânico. Adicionalmente, foi mostrado que tensoativos iônicos tais como dodecil sulfato de sódio não eram compatíveis com soluções da proteína do anticorpo líder para CXCR5.

[00349] Como um exemplo, a Figura 25 mostra o aspecto de uma solução de tampão citrato diferente e vários tensoativos depois de estresse mecânico, e em comparação com uma solução sem qualquer tensoativos. Os resultados analíticos estão reunidos nas Tabela 44 e Tabela 45.

Outros excipientes

[00350] Depois de estresse térmico de +40°C por uma semana e determinação analítica, foi possível uma seleção de excipientes compatíveis com o anticorpo líder para CXCR5 em diferentes sistemas de tampão.

[00351] Alguns excipientes não puderam ser testados em todos os quatro sistemas de tampão, já que só havia um pequeno volume de amostra disponível.

[00352] Depois de revisados todos os dados analíticos, os excipientes na Tabela 31 foram identificados como compatíveis com o anticorpo líder para CXCR5. Esses excipientes não mostraram aumento significativo nos dímeros, HMWPs ou isoformas básicas analisadas por SEC e WCX.

[00353] Todas as medições do diâmetro hidrodinâmico indicaram um pico pronunciado de monômero e a Tm dos excipientes adequados não diminuiu em relação ao anticorpo líder para CXCR5 no respectivo sistema de tampão. Todos os dados analíticos foram resumidos nas Tabelas 46, 47, 48 e 49. Tabela 31 - Compatibilidade de todos os excipientes testados nos diferentes sistemas de tampão

[00354] Concluindo, os estudos de compatibilidade com tensoativos mostram nitidamente que o polissorbato 20 é adequado para todos os tampões selecionados em combinação com o anticorpo líder para CXCR5 a 20 mg/mL. O tensoativo previne a formação de partículas durante o estresse mecânico. Praticamente todos os outros tensoativos levaram a um aumento dos HMWPs.

[00355] Os seguintes excipientes foram selecionados para formular as diferentes formulações prototípicas: NaCl, Trealose (a sacarose é mais ou menos equiparável à trealose em termos de estabilidade), e Arginina-HCl.

Estudo de estabilidade do protótipo em 3 meses

[00356] Para suportar o desenvolvimento de formulações do anticorpo líder para CXCR5, doze formulações prototípicas diferentes foram produzidas e colocadas em estabilidade em diferentes condições (-20°C, +5°C e +40°C) por três meses.

[00357] Três sistemas de tampão diferentes foram selecionados com base na triagem de tampão, pH e excipientes anteriormente descrita.

[00358] Citrato pH 6,0 (formulação número LA_09_027), acetato pH 5,5 (LA_09_028), e histidina pH 5,0 (LA_09_029) foram usados como soluções tampão 10 mM com 20 mg/mL de anticorpo líder e quatro combinações diferentes de excipientes (Tabela 32).

[00359] Esses quatro excipientes apresentaram resultados promissores depois da triagem do excipiente. NaCl foi selecionado para ajustar a osmolaridade, trealose foi escolhida para ajuste da tonicidade e para ter um açúcar para uma opção de liofilização, se necessário. Adicionalmente a trealose pode establizar o anticorpo, e arginina-HCl também foi selecionada como um estabilizante. Foi constatado que polissorbato 20 era útil para prevenir a agregação durante o estresse mecânico.

[00360] Os parágrafos a seguir mostram dados selecionados que foram compilados durante o estudo de estabilidade para selecionado o melhor sistema de tampão e os melhores excipientes para o desenvolvimento de formulações. Na Tabela 33 estão reunidos condições de armazenamento, os pontos do tempo e os métodos analíticos. Tabela 32 - Composições farmacêuticas de quatro opções de formulação diferentes

[00361] Infelizmente, os dados de estabilidade em 3 meses do anticorpo líder para CXCR5 em tampão PBS não foram equiparáveis à estabilidade do protótipo devido a diferenças nas bateladas e devido a condições aceleradas diferentes. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)

[00362] Na Figura 26, um aumento na formação de dímeros de até 10% depois de três meses de armazenamento em todas as quatro formulações de histidina pode ser nitidamente observado. As formulações de acetato mostraram um aumento do teor de dímeros de até 6%. Em todas as quatro formulações de citrato, a concentração de dímeros ficou abaixo de 2%, mesmo depois de três meses a +40°C.

Cromatografia de troca catiônica fraca (WCX)

[00363] Como a determinação de isoformas neutras, básicas, e ácidas é um bom indicador da estabilidade de diferentes formulações, esses métodos foram usados para corrigir os dados de SEC.

[00364] Na Figura 27 podemos ver mais uma vez que a histidina é pior para a estabilidade do anticorpo líder para CXCR5 em condições aceleradas. Um leve aumento de isoformas básicas pode ser observado em todas as quatro formulações de acetato, mas curiosamente para as formulações de citrato, a distinção entre as quatro formulações não foi possível aqui. Além disso, a Figura 28 mostra uma forte diminuição nas isoformas neutras para as formulações de histidina, e uma leve diminuição em acetato. Mais uma vez, o anticorpo líder para CXCR5 em citrato é o menos afetado. SDS-PAGE

[00365] Os resultados das medições de SDS-PAGE podem ser encontrados nas tabelas de resultados no apêndice. Vide Tables 37 a 61.

Temperatura de desenrolamento (Tm)

[00366] A temperatura de desenrolamento pode ser usada para prever a estabilidade de diferentes formulações e foi aqui medida com o equipamento Microcal. Quanto mais alta a Tm, mais promissoras eram as formulações. A precisão das medições da Tm foi de +/-0,4°C.

[00367] Entre as formulações de citrato e acetato, praticamente não foram observadas diferentes entre Tm em T0. Além disso, as formulações A, B, e D tiveram uma Tm ligeiramente mais alta, em relação à formulação C. Todas as formulações A, B, e D contêm trealose.

[00368] As formulações de histidina tiveram uma Tm significativamente mais baixa em todos os casos. Tabela 34 - Temperaturas de desenrolamento em TO

pH

[00369] Como o pH é de grande interesse e importância para a estabilidade de uma solução de anticorpo, o pH foi monitorado. As figuras mais adiante mostram o delta pH emtre T0, T1, T2, e T3 em condições aceleradas de armazenamento.

[00370] A maioria das formulações estabilizantes do pH são aquelas tamponadas com citrato, e especificamente as formulações B e D (Figura 29). Nas soluções tamponadas com acetato do anticorpo líder para CXCR5, o pH foi desviado para valores mais altos (Figura 30). Nas soluções tamponadas com histidina, o pH diminuiu ligeiramente (Figura 31).

DLS

[00371] O diâmetro hidrodinâmico do monômero e potenciais agregados solúveis foram medidos usando espalhamento de luz dinâmico.

[00372] Somente depois de armazenamento em condições aceleradas (+40°C), agregados solúveis < 200 nm puderam ser observados. Esses agregados ocorreram principalmente na formulação tamponada com histidina LA_09_029 A, C, D depois de 3 semanas de armazenamento.

[00373] As formulações tamponadas com citrato mostraram apenas poucos agregados (Figura 32) depois de três semanas na formulação C, e depois de seis semanas de armazenamento na formulação A. Alguns agregados também puderam ser detectados depois de três meses na formulação B. Porém, em comparação com as formulações tampinadas com acetato, a quantidade foi muito pequena.

[00374] A formulação tamponada com acetato LA_09_028 C mostrou alguns agregados < 200 nm depois de três semanas, e depois de três meses também na formulação A. Vide Figura 33.

UV

[00375] Monitorando a concentração de proteína por medições de UV, nenhuma diferença significativa entre todos os pontos do tempo, as amostras, e as formulações foi perceptível. Como o volume das amostras era muito pequeno, a concentração foi medida com um equipamento Nanodrop. Os resultados variam dentro de +/- 5%. Para informações detalhadas, vide as Tabelas 50-61.

Aspecto

[00376] Depois do período de armazenamento de três meses, todas as amostras continuavam límpidas e incolores sem qualquer turvação, mesmo em histidina. Esta observação também indica que todos os agregados medidos em DLS eram solúveis. Agregados insolúveis e subvisíveis puderam ser detectados por medição do bloqueio da luz por HIAC.

HIAC

[00377] Partículas subvisíveis foram detectadas em T0 e depois de três semanas de armazenamento a +5°C. Podemos ver nitidamente na Tabela 36 que a formação de partículas foi observada principalmente em tampão acetato. Curiosamente, a histidina mostrou bons resultados para todas as quatro diferentes formulações. Em citrato, as formulações A, B, e C também são boas. Como o nível de partículas > 10 μm e > 25 μm e os valores em todas as formulações estão muito abaixo dos limites definidos nos Ph’s. Eur. e USP, a formação de partículas não é alvo de interesse.

Osmolaridade

[00378] A quantificação dos excipientes para ajustar a osmolaridade foi feita antes da produção das amostras por cálculo, já que não havia volume de amostra disponível para guiar as experiências. Por conseguinte, a osmolaridade foi menor do que deveria ser (idealmente entre 280 e 320 mOsmol/kg) Tabela 35. Estudos adicionais para melhorar o ajuste serão feitos durante estudos de otimização das formulações. Tabela 35 - Osmolaridade em T0 para todas as formulações prototípicas.

Conclusão

[00379] Concluindo, o tampão citrato, o tampão acetato, e o tampão histidina não mostraram alterações depois de armazenamento a +5°C e -20°C, e apenas um pequeno aumento em produtos de degradação foi visto com o tampão acetato depois de 3 meses.

[00380] O armazenamento do anticorpo líder para CXCR5 em condições aceleradas levou a alterações significativas do DS. Embora pequenas alterações no tampão citrato tenham sido observadas, o tampão acetato mostrou um aumento significativo de produtos de degradação e de agregação e uma diminuição de isoformas neutras em isoformas ácidas ou básicas.

[00381] Um efeito tremendo sobre o anticorpo líder para CXCR5 foi observado em condições aceleradas (até 29,6% de proteínas de alto peso molecular e até 8,2% de di- /oligômero e até 1,3% de proteínas de baixo peso molecular). Também, cromatografia de troca catiônica revelou uma diminuição das isoformas neutras para 50%.

[00382] A concentração alvo de 20 mg/mL pôde ser obtida com todos os tampões testados, por exemplo citrato, acetato, e histidina.

[00383] A faixa de pH de um DP estável pôde ser definida como pH 5-6,5.

[00384] Duas etapas de aumento da produção (4mL fe 100 mL - 1000 mL UF/DF) com três tampões selecionados foram efetuadas com sucesso.

[00385] A redução da formação de agregados com 0,01% de polissorbato 20 em todos os tampões selecionados depois de estresse mecânico (velocidade do agitator 350 / min, 2,5 horas, temperatura ambiente) foi avaliada e confirmada analiticamente.

[00386] Foi possível observar ausência ou diminuição de HMWPs, aumentando assim a filtrabilidade (0,22μm) pela adição 0,01% de polissorbato 20.

[00387] A quantidade de dímeros/oligômeros era bastante dependente do tampão e do pH e foi analisada usando-se SEC, SDS- PAGE e DLS.

Caracterização da substância medicamentosa

[00388] A molécula de anticorpo líder para CXCR5 é muito estável em termos de degradação ou formação de meias-moléculas, mas acontece que durante as atividades de pré-formulação o anticorpo líder para CXCR5 dissolvido em PBS a um pH 7,2 não tem tendência à agregação. Por conseguinte, este tampão não é adequado para estabilidade a longo prazo. A formação de partículas visíveis e subvisíveis durante armazenamento e ciclos de congelamento/descongelamento deve ser cautelosamente monitorada durante o desenvolvimento da formulação e estudos de estabilidade.

Seleção do melhor tampão e pH

[00389] Depois da seleção do melhor tampão pH, o tampão citrato 10 mM a pH 6,0 foi identificado como sendo adequado para soluções a 20 mg/mL de anticorpo líder para CXCR5. O tampão histidina 10 mM pH 5 ou o tampão acetato 10 mM pH 5,5 serviram como opções de reserva.

Estudo de compatibilidade com excipientes

[00390] Os excipientes a seguir são recomendadoas para formulações prototípicas: • Polissorbato 20 • Trealose/sacarose • NaCl • Arginina-HCl

[00391] Os excipientes a seguir não são recomendadoas para desenvolvimento: • Álcool benzílico • Maltose • Manitol • Dextrana • Lisina-HCl

Estudo da estabilidade da formulação prototípica depois de 3 meses

[00392] Excelente estabilida do anticorpo líder para CXCR5 a 20 mg/mL em tampão citrato pH 6,0, tampão acetato pH 5,5, e tampão histidina pH 5,0 foi observada a +5°C e -20°C depois de três meses de armazenamento. Uma leve degradação a +40°C (< 5% de redução do teor de monômero) foi observada com o tampão citrato, ao passo que o tampão acetato mostrou aumentos baixos, porém significativos - e o tampão histidina mostrou grandes aumentos de produto.

[00393] Todas as formulações testadas mostraram uma diminuição significativa de formação de partículas durante armazenamento em comparação com a formulação descoberta genérica em PBS pH 7,2.

[00394] Portanto, a recomendação deste estudo de pré-formulação é usar tampão citrato 10 mM pH 6 para DS e DP de anticorpo líder para CXCR5. Uma solução tamponada filtrada estéril com o anticorpo líder para CXCR5 a 20 mg/mL e excipientes aumentadores da estabilidade deve ser viável com uma recomendação de armazenamento a +5°C em frascos.

[00395] Para ajuste da tonicidade podem ser usados trealose e NaCl e polissorbato 20 deve ser usado para prevenir a formação de agregados.

[00396] A viabilidade de experiências de UF/DF para alterar o sistema de tampão e/ou para aumentar a concentração de mAB de 5 mg/mL para 20 mg/mL pôde ser vista em diferentes escalas. Tabela 37 - Explicação da avaliação dos dados Avaliação dos dados da pré-formulação de anticorpo líder para CXCR5 Tabela 37 - Explicação da avaliação dos dados Avaliação dos dados da pré-formulação de anticorpo líder para CXCR5

Tabela 39 - Resultados dos vários testes de estresse preliminares (avaliação dos dados)

Tabela 42 - Resultados da seleção do tampão em pequena escala, T uma semana +40°C (ASD avaliação dos dados) Avaliação dos dados da pré-formulação de anticorpo líder para CXCR5

Tabela 43 - Resultados da seleção do tampão em pequena escala, depois de estresse mecânico (avaliação dos dados) Avaliação dos dados da pré-formulação de anticorpo líder para CXCR5

Tampões selecionados para testes em grande escala.

[00397] Como não foram vistas diferenças importantes depois de estresse mecânico, as amostras LA_09_09 a 15 não sofreram estresse mecânico Tabela 44 - Resultados - Avaliação dos dados de seleção dos tensoativos Avalição do anticorpo líder para CXCR5 - Dados do tensoativo

N/A, as amostras não foram testadas analiticamente, uma vez que havia um volume pequeno demais de amostra disponível. Excipientes e anticorpo líder para CXCR5 (LA_09_022) Tabela 46 - Resultados - compatibilidade do anticorpo líder com excipientes Avaliação do anticorpo líder para CXCR5 – Compatibilidade

Excipientes e (LA_09_023) tamponado com citrato Tabela 47 - Resultados - compatibilidade de anticorpo líder em tampão citrato com excipientes Avaliação do anticorpo líder para CXCR5 - Compatibilidade em tampão citrato

Excipientes e (LA_09_024) tamponado com acetato Tabela 48 - Resultados - compatibilidade com excipientes e anticorpo líder em tampão acetato Avaliação do anticorpo líder para CXCR5 - Compatibilidade em tampão acetato – data

Excipientes e (LA_09_025) tamponado com histidina Tabela 49 - Resultados — compatibilidade com excipientes e anticorpo líder em tampão histidina Avaliação do anticorpo líder para CXCR5 - Compatibilidade em tampão histidina – dados

Estudos de formulação de Anti-CXCR5 (20 mg/mL)

[00398] Os dados nos Exemplos 13-16 foram coletados durante estudos de formulação para o anticorpo líder para CXCR5 e seu produto medicamentoso para administração intravenosa e subcutânea. O objetifo dos estudos de formulação era fornecer uma solução de anticorpo líder para CXCR5 livre de partículas visuais, estável, límpida ou levemente opalescente, e incolor ou levemente amarela, para injeção para fase I.

MATERIAIS Substância medicamentosa (DS)

[00399] Duas bateladas da substância medicamentosa foram usadas para esses estudos de formulação. Uma foi formulada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e a outra foi formulada em tampão citrato. Vide Tabela 62. Tabela 62 - Bateladas disponíveis da substância medicamentosa

[00400] A Tabela 63 mostra os excipientes que foram usados durante os estudos de formulação. Tabela 63 – Excipientes

MÉTODOS Preparação de amostras

[00401] Ultrafiltração/Diafiltração foi efetuada em pequena escala usando dispositivos VivaSpin com uma membrana Hydrosart e um corte de 30kDa. Material de RSN foi concentrado de 5 mg/mL para 20 mg/mL, e o tampão fosfato (PBS) foi trocado por tampão citrato 10 mM pH 6,0, tampão acetato pH 5,5, ou tampão histidina pH 5,0. As unidades de VivaSpin foram colocadas à temperatura ambiente (RT) em uma centrífuga de laboratória comum e centrifugadas a 2000 rpm. A solução foi filtrada em um Minisart de 0,2 μm antes dos testes analíticos. Todas as amostras foram armazenadas entre +2° e +8°C, fechadas hermeticamente, e protegidas contra luz, até os testes analíticos em T0 e depois de uma semana de estresse térmico a +40°C ou depois de estresse mecânico por 2,5 horas, 300 rpm à RT (apenas para avaliação da concentração de polissorbato 20).

Métodos analíticos

[00402] As técnicas a seguir foram usadas para análise das amostras: Tabela 64 - Técnicas analíticas usadas Técnica (Companhia) Parâmetro a ser investigado

**SDS-Page será efetuada no caso de SEC mostrar resultados incomuns.

Exemplo 13 - Otimização adicional do pH

[00403] Estudos de pré-formulação identificaram o tampão citrato 10 mM a pH 6,0 como o melhor tampão com menor tendência à agregação do anticorpo líder para CXCR5. Para obter um perfil do em tampão citrato, a estabilidade escalonada dependente do pH de pH 5,0 a 7,0 foi avaliada. Devido à limitada disponibilidade da substância medicamentosa, profunda triagem do pH foi efetuada apenas com o tampão citrato 10 mM. Amostras foram coletadas em T0 e depois de uma semana de estresse térmico a +40°C. Vide Tabelas 65-69. Tabela 65 - Visão geral das amostras

[00404] Concluindo, os dados confirmam os resultados já gerados durante os estudos de pré-formulação: o aumento do pH faz com que o teor de monômero diminua e a taxa de dímeros aumente. As amostras a +40°C mostraram uma diminuição do valor de pH mais baixo em HMWs até pH 6,0 e em seguida um aumento até pH 5,0.

Exemplo 14 - Otimização do tampão adicional

[00405] Em seguida, os tampões citrato, acetato, e histidina (as back-up tampão) foram analisados a 5/10/25/50 mM nos valores de pH selecionados. Vide Tablelas 70-84. Tabela 70 - Visão geral das amostras - Tampão citrato pH 6,0

[00406] Concluindo, os dados confirmam os resultados gerados durante os estudos de pré-formulação. Com o uso de citrato como o agente tampão, o teor de monômero é ligeiramente mais alto que aquele com o tampão acetato e o tampão histidina. Com histidina, um comportamento de muita agregação é observável, mesmo em T0, levando a dificuldades na preparação de amostras analíticas. Não foi possível medir uma diferença significativa entre as concentrações de tampão testadas, de modo que todos os três tampões citrato, histidina, e acetato serão usados a uma concentração de 10 mM.

Exemplo 15 - Otimização de tensoativos adicionais

[00407] Com base nos ensaios de pré-formulação, a adição do tensoativo não iônico polissorbato 20 (0,01%) mostrou efeitos benéficos sobre a estabilidade, de forma que uma avaliação de sua concentração foi feita pela adição das seguintes concentrações de polissorbato 20 aos respectivos tampões: 0,0025%/0,005%/0,01%/0,02%. Vide Tabelas 85-94. Tabela 85 - Visão geral das amostras em tampão acetato

[00408] Concluindo, nenhuma diferença significativa nas amostras contendo tampão acetato ou citrato com várias concentrações de polissorbato foi mensurável. Para garantir a prevenção de mAb contra estresse mecânico durante um período de tempo mais longo que o testado por 150 minutos, a concentração de polissorbato foi fixada em 0,2 mg/mL. Esta quantidade também foi proposta com base nos estudos de pré-formulação.

Exemplo 16 - Otimização de isotonicidade adicional

[00409] Durante os estudos de pré-formulação, NaCl, trealose, e arginina-HCl foram identificados como aditivos para fins de isotonicidade e estabilidade. Arginina-HCl foi então abandonado por apresentar menos efeitos de estabilidade do mAb. Dependendo da concentração de tampão e o valor do pH, a quantidade isotonificante/estabilizante é adaptada para obter uma osmolalidade de pelo menos 240 mOsmol/kg de acordo com Ph.Eur.

[00410] O uso de trealose foi desafiado já que ela não é um excipiente de compêndios e é muito cara. Durante os estudos de pré- formulação, a sucrose (sacarose) provocou ligeiramente mais agregação, mas não foi acompanhada e verificada em estudos posteriores. Por conseguinte, foi desenhado um novo estudo de estabilidade em curto prazo durante quatro semanas, incluindo trealose assim como sacarose tanto em tampão citrato quanto em tampão acetato 10 mM com temperaturas de armazenamento a +5°, +25°, e +40°C. Vide Tabelas 95-103.

[00411] O ajuste fino da osmolalidade de pelo menos 240 mOsmol/kg foi feito com NaCl.

[00412] Concluindo, não foram medidas diferenças significativas entre o tampão citrato e o acetato, e nenhuma diferença nas condições aceleradas entre trealose e secarose foi visível. O tampão citrato com sacarose foi selecionados para estudos posteriores.

Determinação dos parâmetros do processo de produção de DP

[00413] A batelada de DS em tampão citrato foi usada para determinar os parâmetros do processo de produção. Estudos de pré- formulação indicaram que o DS não era suscetível à oxidação, e que era necessário proteção contra luz ou um revestimento de nitrogênio ou purga durante a produção. Equipamento de vidro tradicional assim como tubulação de silicone (SaniTech65) foram usados.

Ordem de adição

[00414] As experiências avaliando a ordem de adição dos excipientes foram limitadas devido a pequeno volume de diluição de DS.

[00415] O DS foi pesado em uma garrafa de vidro, polissorbato 20 como o primeiro excipiente, sacarose como o segundo excipiente, e NaCl como o terceiro excipiente foram acrescentados e enxaguados com tampão citrato 10 mM pH 6,0 para diluir o teor de DS até 20 mg/mL.

Velocidade e tempo de agitação

[00416] A velocidade de agitação foi fixada em 100 rpm para reduzir o estresse mecânico para o DS. Devido ao fato de que todos os excipientes eram bastante solúveis em água, o tempo de agitação foi fixado em 5 minutos.

Parâmetros de monitoramento e IPCs

[00417] Parâmetros de monitoramento tais como aspecto, turvação, densidade, e viscosidade, e IPCs tais como valor do pH e osmolalidade foram rotineiramente verificados durante a produção das amostras de acordo com Tabela 104 a seguir: Tabela 104

[00418] Nenhum problema foi observado durante a produção. Os limites para a osmolalidade foram estabelecidos com base nos dados medidos.

Processo de filtração

[00419] De acordo com os estudos de pré-formulação, poliétersulfona era uma membrana adequada para filtração estéril (Sartorius, 0,22 μm). Nenhum desvio potencial do pH depois da filtração pôde ser observado, já que a taxa e o tempo de filtração apresentaram valores padrão para filtração de uma solução aquosa. Testes quanto à integridade do filtro foram realizados como de rotina sem quaisquer problemas.

Processo de preenchimento

[00420] Equipamentos dosadores tradicionais feitos de aço inoxidável, tais como a bomba de preenchimento e a agulha de preenchimento foram investigados. Também a duração e a velocidade de preenchimento foram monitoradas. O volume extraível de DP preenchido foi determinado. Um sobre-enchimento de 0,2mL foi necessário para garantir um volume extraível de 1,5 mL.

Compatibilidade dos materiais

[00421] Todos os estudos de pré-formulação e formulação foram feitos em vidro como equipamento de produção tradicional, o que também é recomendado para o equipamento a ser usado para a produção de GMP.

Agentes de limpeza

[00422] A limpeza do equipamento de produção foi feita de acordo com os respectivos SOPs usando uma lavadora de louça com o agente de limpeza tradicional Neodisher®. Uma pré-limpeza manual com água para injeção foi antes feita como de rotina. Nenhum efeito nocivo dos agentes de limpeza foi observado.

Resumo de estudos de formulação adicionais para o anticorpo líder para CXCR5 (20 mg/mL)

[00423] Para escolha da formulação de DP de anticorpo líder para CXCR5 para a fase I, citrato 10 mM a pH 6,0 foi selecionado como o tampão em detrimento da histidina e acetato. O valor do pH da solução foi fixado em 6,0, uma vez que aumentar ou diminuir o valor do pH significa uma redução no teor de monômero. A concentração de tampão foi fixada em uma concentração média de 10 mM, embora não haja diferenças significativas entre as concentrações de 5 a 50 mM.

[00424] Polissorbato 20 foi escolhido como o tensoativo com 0,2 mg/mL (0,02%), suficiente para estabilizar o DS contra estresse mecânico.

[00425] Sucrose (sacarose) foi selecionada como o estabilizante contra estresse térmico em detrimento da trealose. A concentração de sacarose foi fixada em 60 mg/mL (6%).

[00426] NaCl foi usado como o agente isotonificante em uma concentração de 2,0 mg/mL (0,2%) para obter uma osmolalidade de DP de cerca de 300 mOsmol/kg.

ESTUDOS DE FORMULAÇÕES ANTI-CXCR5 (100 MG/ML)

[00427] Os dados nos Exemplos 17-21 foram coletados durante os estudos de formulação para o anticorpo líder para CXCR5 e seu produto medicamentoso para administração intravenosa e subcutânea. O objetivo dos estudos de formulação era proporcionar uma solução de anticorpo líder para CXCR5 livre de partículas visuais estável, límpida ou levemente opalescente, e incolor ou ligeiramente amarela para injeção para a fase I.

Métodos Preparação de amostras

[00428] UF/DF foi efetuada em pequena escala usando dispositivos VivaSpin com uma membrana Hydrosart e um corte de 30kDa. Material de RSN foi concentrado de cerca de 20 mg/mL para 100 mg/mL. Todas as soluções já estavam no tampão de formulação final (tampão citrato 10 mM a pH 6,0).

[00429] As unidades VivaSpin foram colocadas à temperatura ambiente em uma centrífuga de laboratório comum e centrifugadas a 2000 rpm. A solução foi filtrada em um Minisart de 0,2 μm antes dos testes analíticos.

[00430] Todas as amostras foram armazenadas entre +2° e +8°C, hermeticamente fechadas e protegidas contra luz, até os testes analíticos em T0 e depois de uma semana de estresse térmico a +40°C ou depois de estresse mecânico.

Métodos analíticos

[00431] As técnicas a seguir foram usados para análise das amostras: Tabela 105 Técnicas analíticas usadas

* Algumas amostras serão analisadas.

Exemplo 17 - Triagem de excipientes

[00432] Estudos de pré-formulação identificaram o tampão citrato 10 mM a pH 6,0 como o melhor tampão com menos tendência à agregação do anticorpo líder para CXCR5. Em estudos anteriores a 20 mg/mL, uma formulação contendo 10 mM de tampão citrato, 60 mg/mL (6%) de sacarose, 2 mg/mL (0,2%) de NaCl, e 0,2 mg/mL de (0,02%) Polissorbato 20 foi selecionada. Esses excipientes mais algumas alternativas foram testadas para confirmar a adequabilidade da formulação selecionada a uma concentração mais alta (100 mg/mL).

[00433] Diferentes formulações submetidas a estresse térmico a 40°C por 7 e a estresse mecânico a 100 rpm por 5 horas. Adicionalmente, a temperatura de desenrolamento para as diferentes formulações foi rastreada a 100 mg/mL usando DSC (calorimetria diferencial de varredura).

[00434] Os seguintes excipientes foram testados: Sacarose ^ 60 mg/mL Trealose ^ 60 mg/mL Arginina ^ 30 mg/mL Lisina ^ 30 mg/mL Glicina ^ 30 mg/mL

[00435] NaCl ou manitol foi acrescentado como um isotonificante. Nenhum sal foi necessário para redução da viscosidade (em torno de 2,1 cP).

[00436] Os resultados de T0 e T7 dias estão mostrados na Tabela 106.

Estresse térmico

[00437] Nenhuma das amostras apresentou turvação antes ou depois de estresse.

[00438] Lisina mostrou: um desvio do pH para 9,8, um tendência muito alta a agregar, um aumento muito grande em isoformas ácidas e básicas, e faixas de alto peso molecular em SDS-PAGE. Como resultado, ela foi excluída de considerações posteriores.

[00439] As formulações com manitol mostrou ligação ruim em um ensaio ELISA depois de estresse. Como resultado, o NaCl é o isotonificante favorito.

[00440] Sacarose mostrou uma estabilidade química ligeiramente melhor que a trealose, mas faixas adicionais foram vistas em SDS- PAGE depois de estresse (para ambas).

[00441] Arginina (especialmente na presença de NaCl) e glicina tiveram um perfil de SEC similar, mas nenhuma faixa adicional foi vista em SDS-PAGE depois de estresse.

Formação de associados de proteínas medida por espalhamento de luz dinâmico (DLS)

[00442] O anticorpo líder para CXCR5 mostrou um aumento significativo no diâmetro hidrodinâmico (Z médio) com o aumento da concentração (Figura 34). Este comportamento foi totalmente reversível com diluição. Para maior investigação deste efeito, as diferentes concentrações de anticorpo líder para CXCR5 foram medidas por ultracentrifugação analítica (AUC) e a agregação foi excluída. A conclusão do estudo de AUC foi que esse comportamento devia-se à formação de associados de proteínas.

[00443] O efeito dos excipientes listados acima sobre esse comportamento foi estudado e os resultados estão mostrados na Figura 35. O Z médio foi medido antes e depois de estresse térmico. O efeito estabilizante foi similar para todos os excipientes testados, mas o aumento no Z médio foi em geral reduzido pelo uso de aminoácidos como estabilizantes (arginina, lisina ou glicina). A lisina foi excluída devido ao teor mais alto de agregados depois de estresse. A arginina apresentou um efeito melhor que o da glicina. Ambos os aminoácidos foram considerados para o desenho final da experiência a fim de escolher a melhor combinação de excipientes.

Estresse mecânico

[00444] As formulações de lisina foram excluídas como também o foram todas as formulações contendo manitol. Os dados de SEC não mostraram efeitos do estresse sobre as amostras testadas. Vide Tabela 107. Tabela 107 Estresse mecânico

[00445] A mesma redução no Z médio foi observada na presença de aminoácidos. A sacarose teve um efeito protetor melhor que a trealose contra o estresse mecânico. A arginina e a glicina tiveram um desempenho melhor em combinação com NaCl. Vide Figura 36.

Triagem por calorimetria diferencial de varredura (DSC)

[00446] Um estudo de triagem para determinar a temperatura de desenrolamento do anticorpo líder para CXCR5 foi feito usando calorimetria diferencial de varredura (DSC). Sacarose, trealose, arginina, e glicina foram rastreadas.

[00447] Os resultados da Tm estão listados na Tabela 108. Tabela 108: Efeito de diferentes excipientes sobre os valores da Tm do anticorpo líder para CXCR5. Todas as formulações estavam em tampão citrato 10 mM em pH 6

[00448] Como base na Tm1, a sacarose e a trealose mostraram os valores mais altos. A arginina teve melhor desempenho em combinação com NaCl.

[00449] Concluindo, os dados coletados sugerem que a formulação final de anticorpo líder para CXCR5 a 100 mg/ml conteriam uma combinação de um açúcar (em algumas modalidades, sacarose) e um aminoácido (em algumas modalidades, arginina ou glicina) na presença de NaCl como o isotonificante.

Exemplo 18 - Triagem de tensoativos

[00450] Polissorbato como estabilizante foi avaliado quanto à proteção do anticorpo líder para CXCR5 tanto contra estresse térmico quanto contra estresse mecânico.

[00451] Polissorbato 20 e 80 foram testados em duas concentrações diferentes: 0,1 e 0,2 mg/ml.

Estresse térmico

[00452] DLS não mostrou qualquer efeito pela adição de polissorbato depois de estresse térmico. A formação de HMWs e fragmentos depois de 7 dias de armazenamento a 40°C foi observada em todas as amostras, conforme detectado por SEC. Nenhuma faixa adicional em SDS-PAGE foi detectada. Pequenas alterações foram vistas depois de estresse térmico, mas nenhuma diferença entre PS20 e PS80, assim como entre as 2 concentrações, foi vista (dados não mostrados).

Estresse mecânico

[00453] DLS não mostrou alterações depois de estresse mecânico. Polissorbato 20 não mostrou agregações depois de estresse mecânico. Polissorbato 80 mostrou formação de agregados depois de estresse mecânico. Nenhuma faixa adicional em SDS-PAGE (dados não mostrados) foi vista.

[00454] Concluindo, Polissorbato 20 foi o tensoativo desejado devido a sua superioridade na estabilização mecânica do anticorpo líder para CXCR5.

Exemplo 19 - Pré-seleção da formulação prototípica usando DSC

[00455] Com base nos estudos de triagem de excipientes e triagem de tensoativos, 12 combinações diferentes de excipientes foram sugeridas (vide Tabelas 109 e 110).

[00456] A temperatura de desenrolamento para todas as formulações foi determinada usando DSC e as Tms resultantes, assim como a osmolalidade para cada formulação, estão listadas nas Tabelas 109 e 110. Tabela 109: Combinações de excipientes para o estudo de pré- seleção de formulações prototípicas (arginina) usando DSC. Os valores da Tm e a osmolalidade também estão listados

Tabela 110: Combinações de excipientes para o estudo de pré- seleção de formulações prototípicas (glicina) usando DSC. Os valores da Tm e a osmolalidade também estão listados

[00457] As formulações não apresentam grandes diferenças na Tm, mas a osmolalidade variou bastante. A pré-seleção das formulações prototípicas foi feita com base na Tm e na omolalidade. Por conseguinte, em cada grupo de excipientes (arginina e glicina), foi selecionada a Tm mais alta (independente da osmolalidade). Além disso, a Tm mais alta na região isotônica também foi selecionada.

Exemplo 20 - Estudo exploratório da estabilidade dos protótipos

[00458] A seleção de protótipos acima resultou em 4 formulações prototípicas, que estão listadas na Tabela 111. Essas formulações foram testadas quanto ao estresse mecânico (100 rpm por 5 horas), 5 ciclos de congelamento/descongelamento e estresse térmico a 5, 20, e 40°C. Tabela 111: Formulações prototípicas para a formulação de anticorpo líder para CXCR5 a 100 mg/mL

Estabilidade mecânica

[00459] O anticorpo líder para CXCR5 em tampão citrato 10 mM a pH 6, sem adição de excipientes (DS formulação), também foi submetido a estresse paralelamente com as formulações prototípicas. Uma espécie de peso molecular mais alto foi medida por DLS depois de estresse mecânico do DS (Figura 37), estresse no qual não foram vistas alterações em todas as formulações testadas depois de estresse mecânico. A formação de agregados depois de estresse mecânico foi medida usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) e os resultados estão mostrados na Tabela 112. Em geral, as 4 formulações foram igualmente estáveis ao estresse mecânico à exceção da formulação A, onde mais HMWs foram encontrados por SEC depois de estresse mecânico. Vide Figura 38. Tabela 112: Resultados da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) das formulações prototípicas antes e depois de estresse Mecânico

Estabilidade ao congelamento/descongelamento

[00460] Nenhuma diferença significativa foi detectada, seja na DS ou na DP, depois de 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Por conseguinte, não deve haver problemas de instabilidade devido ao congelamento e descongelamento (dados não mostrados).

Estudos exploratórios da estabilidade dos protótipos

[00461] As formulações prototípicas foram armazenadas a -20, 5, 20, e 40°C. Elas foram analisadas no início do estudo, depois de 1 mês, depois de 3 meses, e depois de 6 meses. As formulações foram selecionadas com base nos resultados de 3 meses (Tabelas 113-115). Os resultados mostraram que a formulação B teve o melhor desempenho em termos de SEC, WCX, e subpartículas visíveis, especialmente a 40°C. Tabela 113: Resultados da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) das formulações prototípicas depois de 3 meses

[00462] Concluindo, os estudos mostraram resultados melhores para a formulação LA_10_102_B. Esta formulação tinha uma concentração de 100 mg/mL de anticorpo líder para CXCR5 em tampão citrato 10 mM a pH 6 e continha os seguintes excipientes:

Exemplo 21 - Dados de suporte de estabilidade para a formulação de 100 mg/mL

[00463] Estudos de estabilidade adicionais foram feitos com a formulação de anticorpo líder para CXCR5 a 100 mg/mL identificada no Exemplo 20. Os estudos adicionados foram feitos a -20, 5, e 25°C. Os resultados estão mostrados nas Tabelas 116-118.

Claims (16)

1. Formulação estável, caracterizada pelo fato de que compreende: um agente de ligação compreendendo uma porção de uma região Fc de um anticorpo IgG4; e de 5 a 50 mM de citrato como um agente tampão, em que o pH da formulação é igual ou inferior a ambos pH 6 e o pI de 6,8 a 7,2, e e em que o agente de ligação é diferente de um anticorpo anti-CXCR5 IgG4 humanizado (receptor de quimiocina C-X-C tipo 5).

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é um anticorpo.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação ou anticorpo se liga a tipo linfotoxina, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do vírus do herpes pelo mediador de entrada do vírus do herpes, um receptor expresso em linfócitos (LIGHT).

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação ou anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes complementares (CDRs) compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, e a região variável de cadeia leve compreendendo CDRs compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 4, 5 e 6.

5. Formulação, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação ou anticorpo é um anticorpo IgG4 anti-LIGHT totalmente humano que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

6. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 150 mg/mL de um anticorpo IgG4 anti-LIGHT totalmente humano (tipo linfotoxina, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV pelo HVEM, um receptor expresso por linfócitos T), compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) tampão citrato a 10 mM; (c) 0,005% (p/v) de polissorbato 20; e (d) 4% (p/v) de manitol, em que o pH da formulação é de pH 5,5 e em que a formulação é um líquido adequado para administração subcutânea.

7. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 50 mg/mL de um anticorpo IgG4 anti-LIGHT totalmente humano (tipo linfotoxina, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV pelo HVEM, um receptor expresso por linfócitos T), compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) tampão citrato a 10 mM; e (c) 0,01% (p/v) de polissorbato 20; em que o pH da formulação é de pH 5,5 e em que a formulação é um líquido adequado para administração intravenosa.

8. Formulação de anticorpo líquida adequada para administração intravenosa, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) 5 a 280 mg/mL de um anticorpo IgG4 anti-LIGHT totalmente humano (tipo linfotoxina, exibe expressão induzível e compete com a glicoproteína D do HSV pelo HVEM, um receptor expresso por linfócitos T), compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (b) tampão citrato a 10 mM; e (c) 0,01% (p/v) de polissorbato 20, em que o pH da formulação é igual ou inferior a pH 6 e ao pI de 6,8 a 7,2.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda 5% (p/v) de sacarose e 1,5% (p/v) de prolina.

10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação líquida.

11. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação liofilizada.

12. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a formulação exibe uma quantidade reduzida um ou mais subprodutos selecionados dentre o grupo que consiste em agregados, meias moléculas, produtos de degradação, proteínas de baixo peso molecular, proteínas de alto peso molecular, e rearranjos de isoformas ácidas/básicas/neutras do anticorpo em comparação com uma formulação anti-LIGHT de referência compreendendo um anticorpo anti-LIGHT em solução salina tamponada com fosfato a pH 7,3.

13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a formulação é estável por 6 meses a + 5° C.

14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a formulação é estável por 9 meses a + 5° C.

15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente compreendendo: (1) a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e (2) um rótulo ou instruções para a administração e uso da formulação.

16. Dispositivo pré-cheio ou recipiente pré-cheio, caracterizado pelo fato de que compreende uma seringa, um cartucho, um frasco, uma ampola, uma garrafa, um tubo de ensaio, uma cartela, uma saqueta ou um autoinjetor, compreendendo a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

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