ES2827180T3 - Formulaciones de anticuerpos estables - Google Patents

Abstract

Una formulación, caracterizada porque comprende un regulador de pH de ácido acético, un regulador de pH de ácido glutámico o un regulador de pH de ácido succínico con un pH de entre 4.5-5.5, por lo menos un excipiente que comprende un azúcar o un poliol, y una cantidad efectiva de un anticuerpo terapéutico que tiene actividad de unión específica al receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR), en donde el anticuerpo terapéutico conserva al menos aproximadamente 80% de estabilidad durante hasta dos meses en solución, y en donde el anticuerpo humano es panitumumab.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de anticuerpos estables

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a medicinas para el tratamiento de enfermedades, y más específicamente a formulaciones consistentemente estables para moléculas terapéuticas.

Con la llegada de la tecnología de ADN recombinante, los terapéuticos a base de proteínas se han vuelto continuamente y cada vez más comunes en el repertorio de fármacos disponibles para practicantes médicos para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades desde cáncer hasta enfermedades autoinmunitarias. Junto con los avances científicos y técnicos que han ocurrido en la producción de proteínas recombinantes, otra razón para el éxito de terapéuticos de proteínas es su alta especificidad hacia objetivos y su capacidad para exhibir perfiles de seguridad superiores cuando se comparan con terapéuticos de molécula pequeña. La capacidad de emplear moléculas biológicas como farmacéuticos en el tratamiento de enfermedades ha mejorado significativamente el cuidado médico y calidad de vida durante el pasado cuarto de siglo.

Las proteínas que se sabe exhiben varias acciones farmacológicas in vivo son ahora capaces de ser producidas en grandes cantidades para varias aplicaciones farmacéuticas. La estabilidad a largo plazo de una proteína terapéutica es un criterio particularmente benéfico para tratamientos seguros, consistentes y eficaces. La pérdida de funcionalidad del terapéutico dentro de una preparación reducirá su concentración efectiva para una administración dada. En forma similar, modificaciones no deseadas de un terapéutico pueden afectar la actividad y/o la seguridad de una preparación, llevando a pérdida de eficacia y riesgo de efectos secundarios adversos.

Las proteínas son moléculas complejas con estructuras primarias, secundarias, terciarias y en algunos casos cuaternarias definidas, todas las cuales juegan un papel en impartir una función biológica específica. La complejidad estructural de los farmacéuticos biológicos tales como proteínas los hacen susceptibles a varios procesos que resultan en inestabilidad estructural y funcional, así como pérdida de seguridad. Con respecto a estos procesos de inestabilidad o vías de degradación, una proteína puede sufrir una variedad de reacciones o modificaciones covalentes y no covalentes en solución. Por ejemplo, las vías de degradación de proteínas pueden ser clasificadas generalmente en dos categorías principales: (i) vías de degradación física o no covalente y (ii) vías de degradación química o covalente.

Los fármacos de proteínas son susceptibles a procesos de degradación física de agregación irreversible. La agregación de proteínas es de particular interés en la producción de polipéptidos toda vez que comúnmente da como resultado bioactividad reducida que afecta la potencia del fármaco, y también puede desarrollar serias reacciones inmunológicas o antigénicas en los pacientes. La degradación química de un terapéutico de proteínas, incluyendo la degradación de la estructura química mediante, por ejemplo, modificación química, también ha estado implicada en incrementar su potencial inmunogénico. Así, las formulaciones de proteínas estables requieren que las vías de degradación del fármaco tanto físicas como químicas sean minimizadas.

Las proteínas pueden degradarse, por ejemplo, por medio de procesos físicos tales como adsorción interfacial y agregación. La adsorción puede impactar significativamente la potencia y estabilidad de un fármaco de proteínas. Puede causar una pérdida apreciable en la potencia de formas de dosis de baja concentración. Una segunda consecuencia es que la adsorción mediada por desdoblamiento en las interfases comúnmente puede ser una etapa de inicio para una agregación irreversible en solución. A este respecto, las proteínas tienden a adsorberse en las interfases líquido-sólido, líquido-aire y líquido-líquido. Una exposición suficiente del núcleo de una proteína a una superficie hidrófoba puede dar como resultado la adsorción como una consecuencia de agitación, temperatura o tensiones inducidas por pH. Además, las proteínas también son sensibles a, por ejemplo, pH, fuerza iónica, tensión térmica, esfuerzo cortante y tensiones interfaciales, todas las cuales pueden llevar a agregación y dar como resultado inestabilidad. Otra consecuencia de la agregación es la formación de partículas, una consideración importante en farmacéuticos de proteínas líquidos y liofilizados.

Las proteínas también son sujetas a una variedad de reacciones de modificación y/o degradación química tales como desamidación, isomerización, hidrólisis, enrollamiento de disulfuro, beta-eliminación, oxidación y formación de aductos. Los mecanismos de degradación hidrolíticos principales incluyen hidrólisis de enlaces péptidos, desamidación de asparagina y glutamina, isomerización de ácido aspártico y la ciclización de ácido glutámico que lleva a ácido piro-glutámico. Una característica común de las vías de degradación hidrolítica es que una variable de formulación significativa, con respecto a las velocidades de las reacciones, es el pH de la solución.

Por ejemplo, la hidrólisis de enlaces péptidos puede ser catalizada por ácidos o bases. La desamidación de asparagina y glutamina también son catalizadas por ácidos debajo de un pH de aproximadamente 4. La desamidación de asparagina a pH neutro ocurre a través de un intermediario de succinimidilo que es catalizado por bases. La isomerización y racemización de residuos de ácido aspártico puede ser rápida a un pH ligeramente ácido a neutro (pH 4-8). Además de los efectos de pH generalizados, las sales reguladoras de pH y otros excipientes pueden afectar las velocidades de las reacciones hidrolíticas.

Otros ejemplos de vías de degradación incluyen reacciones de beta-eliminación, las cuales ocurren bajo condiciones de pH alcalino y llevan a racemización o pérdida de parte de la cadena lateral para ciertos aminoácidos. Las oxidaciones de residuos de metionina, cisteína, histidina, tirosina y triptófano son vías de degradación covalentes ejemplares para las proteínas.

Debido al número y diversidad de diferentes reacciones que pueden dar como resultado la inestabilidad de las proteínas, la composición de los componentes en una formulación puede afectar significativamente el grado de degradación de proteínas y, como consecuencia, la seguridad y eficacia del terapéutico. La formulación de un polipéptido también puede afectar la facilidad y frecuencia de administración y dolor después de inyección. Por ejemplo, las reacciones inmunogénicas no sólo han sido atribuidas a agregados de proteínas sino también a agregados mixtos de la proteína terapéutica con un componente inactivo contenido en la formulación (Schellekens, H., Nat. Rev. Drug Discov. 1:457-62(2002); Hesmeling, et al., Pharm. Res. 22:1997-2006 (2005)).

Sin embargo, a pesar de los avances hechos en la utilización de proteínas en tratamientos terapéuticos y del conocimiento del proceso de inestabilidad que pueden sufrir, sigue habiendo una necesidad por desarrollar formulaciones con características de estabilidad a largo plazo incrementadas. Una formulación que conserve estabilidad a largo plazo bajo una variedad de condiciones proporcionaría un medio efectivo para suministrar una cantidad eficaz y segura del polipéptido. La retención de estabilidad a largo plazo en una formulación también reduciría los costos de producción y tratamiento. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de estas formulaciones consistentemente estables y de esta manera proporcionar resultados clínicos más efectivos.

Así, existe la necesidad de formulaciones que conserven estabilidad a largo plazo bajo una variedad de condiciones de fabricación y almacenamiento diferentes. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también.

El documento WO 2004/039826 A1 describe anticuerpos anti-IL6.

El documento US 2004/191243 A1 describe formulaciones de anticuerpos estabilizados.

El documento WO 03/039485 A2 describe formulaciones farmacéuticas líquidas estables que comprenden altas concentraciones de anticuerpos.

El documento WO 2006/096461 A2 comprende composiciones de anticuerpos anti-M-CSF.

El documento WO 2006/107854 A2 describe agentes de unión específicos para el receptor del factor de crecimiento anti-epidermal.

El documento US 2007/145862 A1 describe inhibidores de la dimerización de HER, tales como pertuzumab.

El documento WO 02/096457 A2 describe formulaciones de anticuerpos líquidas estables.

Breve descripción de la invención

La invención proporciona una formulación que comprende un regulador de pH de ácido acético, un regulador de pH de ácido glutámico o un regulador de pH de ácido succínico con un pH de entre 4.5-5.5, al menos un excipiente que comprende un azúcar o un poliol, y una cantidad efectiva de un anticuerpo terapéutico que tiene actividad de unión específica al receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR), en donde el anticuerpo terapéutico conserva al menos aproximadamente 80% de estabilidad durante hasta dos meses en solución, y en donde el anticuerpo humano es panitumumab. El regulador de pH puede incluir una sal sodio de acetato, glutamato o succinato y el azúcar o poliol puede incluir glicerol, sucrosa, trehalosa o sorbitol.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la apariencia visual de un anticuerpo formulado a varios pH’s de 5.0 a 7.5.

La figura 2 muestra los resultados de SE-HPLC para la estabilidad de pH de una formulación de anticuerpo almacenada a 37°C durante hasta 2 meses. Los conjuntos de histogramas para cada pH medido corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 1 semana (1w); 2 semanas (2w); 1 mes (1m) y 2 meses (2m). Para cada punto de tiempo, los valores de pH correspondieron a 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 y 7.5.

La figura 3 muestra los resultados de cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo formulado a diferentes pH’s después de su almacenamiento a 37°C durante hasta 2 meses. Las condiciones de almacenamiento correspondieron a no almacenamiento (0, diamantes); 1 semana (1w, cuadrados); 2 semanas (2w, triángulos); 1 mes (1 m, X) y 2 meses (2m, asteriscos).

La figura 4 muestra los conteos de partículas de un anticuerpo formulado a varios pH’s después de vortexear durante 15 minutos a 4°C. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado correspondieron de izquierda a derecha a 5 qm (5); 7.5 qm (7.5); 10 qm (10); 20 qm (20) y 25 qm (25).

La figura 5 muestra los resultados de cromatografía de exclusión por tamaño de un anticuerpo formulado en diferentes formulaciones después de su almacenamiento a 37°C durante hasta 4 meses. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 2 semanas (2w); 1 mes (1 m); 2 meses (2m); 3 meses (3m) y 4 meses (4m).

La figura 6 muestra la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo formulado en diferentes formulaciones después de su almacenamiento a 29°C durante hasta 6 meses. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 2 semanas (2w); 1 mes (1 m); 2 meses (2m); 3 meses (3m) y 6 meses (6m).

La figura 7 muestra un conteo de partículas subvisibles por HIAC de diferentes formulaciones de anticuerpo después de su almacenamiento a 4°C durante 6 meses. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado corresponden de izquierda a derecha a 2 qm (2); 5 qm (5); 7.5 qm (7.5); 10 qm (10); 20 qm (20) y 25 qm (25).

La figura 8 muestra las mediciones por cromatografía de intercambio de tamaño (SEC)-HPLC de contenido de monómeros de anticuerpo que resulta de varias formulaciones que contienen diferentes excipientes. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 2 semanas (2w); 1 mes (1m); 2 meses (2m); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 1 año (1y).

La figura 9 muestra mediciones de partículas subvisibles por HIAC de más de 10 qm de diferentes formulaciones de anticuerpo almacenadas a 4°C durante 1 año. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado corresponden de izquierda a derecha a 10 qm (10); 20 qm (20), y 25 qm (25).

La figura 10 muestra las mediciones por SE-HPLC del contenido de monómeros de anticuerpo después de almacenamiento a -30°C durante hasta 3 meses en varias formulaciones que tienen un pH que varía de 5.0 a 7.0 y que contienen diferentes excipientes. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 5 veces de congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (C5); 6 semanas (6w) y 3 meses (3m).

La figura 11 muestra las mediciones por SE-HPLC del contenido de monómeros de anticuerpo después de almacenamiento a -30°C durante hasta 1 año en regulador de pH ya sea de acetato o fosfato en varias formulaciones que tenían un pH que variaba de 5.0 a 6.0 y que contenían diferentes estabilizadores. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 5 veces de congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (C5); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 12 meses (12m).

La figura 12 muestra las mediciones por SE-HPLC del contenido de monómeros de anticuerpo de diferentes formulaciones después de almacenamiento a -30°C durante hasta 1 año en recipientes ya sea de acero inoxidable o polipropileno. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (0); 5 veces de congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (C5); 1 mes (1m); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 12 meses (12m).

La figura 13 muestra el efecto de congelación/descongelación y almacenamiento a -30°C en la formación de partículas de diferentes formulaciones de anticuerpo. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a periodos de almacenamiento de no almacenamiento (t=0); 5 veces de congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (t=c5); 1 mes (t=1m) y 3 meses (t=3m).

Descripción detallada de la invención

Esta invención está dirigida a una formulación que exhibe capacidad estabilizadora óptima del anticuerpo humano panitumumab. La formulación contiene un sistema regulador de pH de acetato, glutamato o succinato que es particularmente útil a intervalos de pH de entre 4.5-5.5. Panitumumab solubilizado o incluido en una formulación de la invención exhiben estabilidad durante largos periodos de tiempo, permitiendo la administración de cantidades seguras y efectivas de panitumumab.

La invención incluye panitumumab en una formulación que tiene un sistema regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico. El componente de ácido débil del sistema regulador de pH es suministrado por una forma de sal acetato, glutamato o succinato para regular el pH de la formulación y está presente a una concentración de entre alrededor de 1-100 mM. El sistema regulador de pH de la invención mantiene estabilidad de polipéptidos entre un intervalo de pH de alrededor de 4.5-5.5, más particularmente entre alrededor de 4.8-5.3. En esta modalidad específica, el panitumumab formulado también puede contener excipientes tales como glicerol, sucrosa o trehalosa. Una formulación de la invención es una solución acuosa que exhibe un pH de aproximadamente 5.0 y mantiene capacidad de regulación de pH en presencia de panitumumab. Otra formulación de la invención es una solución que exhibe un pH de alrededor de 5.0, mantiene capacidad de regulación de pH en presencia de panitumumab de al menos aproximadamente 12-18 meses a temperaturas debajo del congelamiento y reduce la agregación y/o formación de partículas inducida por congelación-descongelación.

Según se usa en la presente, el término “biofarmacéutico” intenta significar una macromolécula o biopolímero tal como un polipéptido, ácido nucleico, carbohidrato o lípido, o bloque de construcción del mismo, que esté destinado para usarse como un farmacéutico. Una “formulación biofarmacéutica” se refiere a un medio farmacéuticamente aceptable que es compatible con un biofarmacéutico y es seguro y no tóxico cuando se administra a humanos. Según se usa en la presente, el término “anticuerpo” intenta significar un producto polipéptido de células B dentro de la clase inmunoglobulina de polipéptidos que está compuesto de cadenas pesada y ligera y es capaz de unirse con un objetivo o antígeno molecular específico. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que es el producto de un clon de una sola célula o hibridoma. El término también intenta referirse a un anticuerpo producido mediante métodos recombinantes a partir de genes de inmunoglobulina que codifican para la cadena pesada y ligera para producir una especie de inmunoglobulina molecular individual. Las secuencias de aminoácidos para anticuerpos dentro de una preparación de anticuerpos monoclonales son sustancialmente homogéneas y la actividad de unión de los anticuerpos dentro de esta preparación exhibe sustancialmente la misma actividad de unión a antígenos. Como se describe más abajo, las características de anticuerpos y anticuerpos monoclonales se conocen bien en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo el uso de metodologías de hibridomas, recombinantes, de despliegue de fagos y de bibliotecas de anticuerpos combinatorias, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridomas incluyendo aquellas conocidas en la técnica y mostradas, por ejemplo, en Harlow y Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, Elsevier, N.Y. (1981); Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), y Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., W.H. Freeman and Co., Publishers, Nueva York, pp. 103-20 (1991). Ejemplos de métodos conocidos para producir anticuerpos monoclonales mediante métodos recombinantes, de despliegue de fagos y de bibliotecas de anticuerpos combinatorias, incluyendo bibliotecas derivadas de animales inmunizados y naives, pueden encontrarse descritos en Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., citado arriba. El término “anticuerpo monoclonal” según se usa en la presente no está limitado a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridomas. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al método mediante el cual se produce. Según se usa en la presente, el término “fragmento funcional” cuando se usa en presencia de un anticuerpo intenta significar una porción de un anticuerpo que aún conserva alguna o toda su actividad de unión a antígeno específica. Estos fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, fragmentos funcionales de anticuerpos tales como Fd, Fv, Fab, F(ab’), F(ab)2, F(ab’)2, Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. Otros fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos de las cadenas pesada (H) o ligera (L), polipéptidos de la región de la cadena pesada variable (V^h) y de la cadena ligera variable (V^l), polipéptidos de región de determinación de complementariedad (CDR), anticuerpos de un solo dominio y polipéptidos que contengan al menos una porción de una inmunoglobulina que sea suficiente para retener su actividad de unión específica. Estos fragmentos de unión de anticuerpos pueden encontrarse descritos, por ejemplo, en Harlow y Lane, citado arriba; Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., CellBiophysics, 22:189-224 (1993); Plückthun y Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, segunda edición, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990).

Con respecto a anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, varias formas, alteraciones y modificaciones son bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden incluir cualquiera de estas diferentes formas, alteraciones y modificaciones de anticuerpos monoclonales. Ejemplos de estas diferentes formas terminus según se conocen en la técnica se explican a continuación.

Un fragmento Fab se refiere a un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^l y C^h1; un fragmento F(ab’)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de pivote; un fragmento Fd consiste en los dominios V^h y C^h1 ; un fragmento Fv consiste de los dominios V^l y V^h de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 34:544-546, (1989)) consiste en un dominio V^h.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina que ocurre naturalmente tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena individual o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.

Un anticuerpo de cadena individual (scFv) se refiere a un anticuerpo en el cual una región V^l y V^h es unida por medio de un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácido) para formar una cadena de polipéptidos continua en la que el enlazador sea lo suficientemente largo como para permitir que la cadena de proteínas se doble sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:5879-83 (1988)). Diacuerpos se refiere a anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptidos, en donde cada cadena de polipéptidos comprende dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto como para permitir el apareo entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo entonces que cada dominio se aparee con un dominio complementario en otra cadena de polipéptidos (véase, por ejemplo, Holliger et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A.

90:6444-48 (1993) y Poljak et ai., Structure 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas de polipéptidos de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo que resulte de su apareo tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Cadenas de polipéptidos que tengan diferentes secuencias pueden usarse para hacer un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. En forma similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas de polipéptidos, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, los cuales pueden ser iguales o diferentes.

Una CDR se refiere a una región que contiene una de las tres asas hipervariables (H1, H2 ó H3) dentro de la región no estructural de la estructura de de lámina b V^h de la inmunoglobulina (Ig o anticuerpo), o una región que contiene una de tres asas hipervariables (L1, L2 o L3) dentro de la región no estructural de la estructura de lámina b V^l del anticuerpo. En consecuencia, las CDRs son secuencias de región variable intercaladas dentro de las secuencias de región estructural. Las regiones de CDR se conocen bien por los expertos en la técnica y han sido definidas, por ejemplo, por Kabat como las regiones de mayor hipervariabilidad dentro de los dominios variables (V) de anticuerpos (Kabat et al., J. Bioi. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Las secuencias de la región CDR también han sido definidas estructuralmente por Chothia como aquellos residuos que no son parte de la estructura de lámina b conservada, y de esta manera son capaces de adaptarse a diferentes conformaciones (Chothia y Lesk, J. Moi. Bioi. 196:901-917 (1987)). Ambas tecnologías se reconocen bien en la técnica. Las posiciones de CDRs dentro de un dominio variable de anticuerpo canónico han sido determinadas por la comparación de numerosas estructuras (Al-Lazikani et al., J. Moi. Bioi., 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Debido a que el número de residuos dentro de un asa varía en diferentes anticuerpos, los residuos de asa adicionales en relación a las posiciones canónicas se numeran convencionalmente con, a, b, c y así sucesivamente hasta cerca del número de residuo en el esquema de numeración de dominios variables canónicos (Al-Lazikani et al., citado arriba (1997)). Esta nomenclatura similarmente se conoce bien por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, las CDRs definidas de acuerdo con las designaciones ya sea de Kabat (hipervariables) o Chothia (estructurales), se muestran en la siguiente tabla:

Tabla: Definiciones de CDR

Kabat1 Chothia2 Ubicación del Asa

CDR1 31-35 26-32 enlazando las hebras B y C

CDR2 50-65 53-55 enlazando las hebras C’ y C!

CDR3 95-102 96-101 enlazando las hebras F y G

CDR1 24-34 26-32 enlazando las hebras B y C

CDR2 50-56 50-52 enlazando las hebras C’ y C

CDR3 89-97 91-96 enlazando las hebras F y G

numeración de los residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., citado arriba

2 La numeración de los residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., citado arriba

Un anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En un ejemplo específico, una o más de las CDRs se derivan de un anticuerpo donador no humano que tiene una actividad específica para EGFR y la estructura de la región variable se deriva de un anticuerpo receptor humano. En otro ejemplo específico, todas las CDRs se derivan de un anticuerpo donador no humano que tiene actividad específica para EGFR y la estructura de la región variable se deriva de un anticuerpo receptor humano. En otro ejemplo específico adicional, las CDRs de más de un anticuerpo específico para EGFR no humano se mezclan e igualan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede incluir una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo específico para EGFR no humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo específico para EGFR no humano y las CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo específico para EGFR. Además, las regiones estructurales pueden derivarse de uno de los mismos o de uno o más anticuerpos humanos diferentes o de un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos quiméricos pueden producirse cuando tanto los anticuerpos donadores como receptores sean humanos.

Un anticuerpo humanizado o anticuerpo injertado tiene una secuencia que difiere de una secuencia de un anticuerpo de una especie no humana por una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácido, por lo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmune, y/o induzca una respuesta inmune menos severa, en comparación con el anticuerpo de una especie no humana, cuando se administre a un sujeto humano. En un ejemplo específico, ciertos aminoácidos en los dominios estructural y constante de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie no humana se cambian para producir el anticuerpo humanizado. En otro ejemplo específico, los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan a los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de cómo elaborar anticuerpos humanizados pueden encontrarse en las patentes de E.U.A. Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293. Los anticuerpos humanizados incluyen también anticuerpos producidos usando métodos de reconstrucción superficial de anticuerpos y similares.

Un anticuerpo humano se refiere a anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, un anticuerpo completamente humano incluye un anticuerpo en donde todos los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos pueden prepararse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo específico de un anticuerpo humano es panitumumab, el cual es la materia del anticuerpo anti-EGFR humano descrito en la patente de E.U.A. No. 6,235,883. Panitumumab también se conoce en la técnica como Vectibix™ (Amgen, Thousand Oaks, California) y es útil para tratar condiciones patológicas tales como cáncer colorrectal metastático, por ejemplo.

Una o más CDRs también pueden incorporarse en una molécula ya sea de manera covalente o no covalente para hacerla una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDRs como parte de una cadena de polipéptidos más larga, puede enlazar covalentemente las CDRs a otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar las CDRs en forma no covalente. Las CDRs permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno de interés particular.

Un anticuerpo neutralizante o un anticuerpo inhibidor cuando se usa en referencia a un anticuerpo formulado de la invención se refiere a un anticuerpo que inhibe la unión de receptor a ligando. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo inhibidor se refiere a un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de EGFR a EGF cuando un exceso del anticuerpo específico de EGFR reduce la cantidad de EGF unido a EGFR. La inhibición de la unión puede ocurrir en al menos 10%, particularmente por lo menos aproximadamente 20%. En varios ejemplos específicos, el anticuerpo monoclonal puede reducir la cantidad de EGF unido a EGFR, por ejemplo, en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% y 99.9%. La reducción de unión puede medirse por cualquier medio conocido por alguien de capacidad ordinaria en la técnica, por ejemplo, como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro.

Un anticuerpo “antagonista” se refiere a un anticuerpo que inhibe una respuesta de actividad de su antígeno. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo antagonista se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad de EGFR cuando se añade una célula, tejido u organismo que expresa EGFR. La disminución en actividad puede ser de al menos aproximadamente 5%, particularmente de al menos alrededor de 10%, muy particularmente al menos alrededor de 15% o más, en comparación con el nivel de actividad de EGFR en presencia de EGF solo. En varios ejemplos específicos, los anticuerpos monoclonales específicos de EGFR de la invención pueden inhibir la actividad de EGFR en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.

Un anticuerpo agonista se refiere a un anticuerpo que activa una respuesta de actividad de su antígeno. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo agonista se refiere a un anticuerpo que activa EGFR en al menos aproximadamente 5%, particularmente en al menos alrededor de 10%, más particularmente en al menos alrededor de 15% cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa EGFR, en donde “100% de activación” es el nivel de activación logrado bajo condiciones fisiológicas por la misma cantidad molar de EGF. En varios ejemplos específicos, los anticuerpos monoclonales específicos de EGFR de la invención pueden activar la actividad de EGFR en al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750% o 1000%.

Un epítopo se refiere a una parte de una molécula, por ejemplo, una porción de un polipéptido, que se une específicamente a uno o más anticuerpos dentro del sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Los determinantes epitópicos pueden incluir regiones continuas o no continuas de la molécula que se unan a un anticuerpo. Los determinantes epitópicos también pueden incluir agrupamientos de moléculas en superficie químicamente activos tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

Según se usa en la presente, el término “específica” cuando se usa en referencia a la actividad de unión de un anticuerpo monoclonal, intenta significar que el anticuerpo monoclonal referenciado exhibe unión preferencial para su antígeno en comparación con otros antígenos similares. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, la actividad de unión específica intenta significar que el anticuerpo monoclonal EGFR referenciado exhibe unión preferencial para EGFR en comparación con otros receptores relacionados con factor de crecimiento epidérmico. La unión preferencial incluye un anticuerpo monoclonal de la invención que exhibe unión detectable a EGFR mientras que exhibe muy poca o ninguna unión detectable a otro receptor de factor de crecimiento relacionado.

Según se usa en la presente, el término “receptor del factor de crecimiento epidérmico” o “EGFR” intenta significar el receptor de la técnica que puede encontrarse expresado sobre la superficie de células epidérmicas y el cual se une a factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o factor de crecimiento por factor alfa (TGFa). Este receptor se conoce bien en la técnica y puede encontrarse descrito en, por ejemplo, Yarden, Y., y Sliwkowski, M. X., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 127-37 (2001), y Mendelsohn, J. y Baselga, J., J. Clin Oncol 21, 2787-99 (2003). EGFR también es el antígeno para el anticuerpo humano panitumumab, el cual es la materia de la patente de E.U.A. No. 6,235,883.

Según se usa en la presente, el término “ácido acético” intenta significar un ácido que tiene la fórmula CH³COOH. El ácido acético tiene un punto de fusión de 16.7°C y un punto de ebullición de 118.0°C.

Según se usa en la presente, el término “ácido glutámico” intenta significar un aminoácido ácido que tiene la fórmula C⁵H⁹NO⁴. El término incluye las formas tanto L como D del aminoácido.

Según se usa en la presente, el término “ácido succínico” intenta significar un ácido dicarboxílico que tiene la fórmula C⁴H⁶O⁴. El ácido succínico tiene un punto de fusión de 185°C y un punto de ebullición de 235°C.

Un regulador de pH de “ácido acético” o “de acetato”, un regulador de pH de “ácido glutámico” o “de glutamato” o un regulador de pH de “ácido succínico” o “de succinato” según se usan los términos en la presente intentan referirse a un regulador de pH que contiene ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico en equilibrio con su base conjugada respectiva. Cada uno de estos reguladores de pH puede proporcionar capacidad de regulación de pH óptima en la región de su pK^a, en donde capacidad de regulación de pH se refiere a una resistencia a cambios en pH cuando se altera al añadir ya sea un ácido o base a la solución. La pK^a de ácido acético es de 4.75. La pK^a de la cadena lateral de ácido glutámico es de 4.07 en tanto que la pK^a de ácido succínico es de 4.19 y 5.57 para sus dos porciones de ácido carboxílico. La forma de ácido acético de un regulador de pH de ácido acético de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido acético, ión de acetato y/o formas de sal de ácido acético que incluyan acetato. En forma similar, la forma de ácido glutámico de regulador de pH de ácido glutámico de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido glutámico, ión de glutamato y/o formas de sal de ácido glutámico que incluyan glutamato. Además, la forma de ácido succínico de un regulador de pH de ácido succínico de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido succínico, ión de succinato y/o formas de sal de ácido succínico que incluyan succinato. Las sales ejemplares que pueden incluirse en el regulador de pH de la invención incluyen, por ejemplo, sal sodio, potasio, calcio, amino orgánico o magnesio. El ácido acético, reguladores de pH de ácido acético, ácido glutámico, reguladores de pH de ácido glutámico, ácido succínico y reguladores de pH de ácido succínico se conocen bien por los expertos en la técnica.

Según se usa en la presente, el término “excipiente” intenta significar una sustancia terapéuticamente inactiva. Los excipientes pueden incluirse en una formulación para una amplia variedad de propósitos incluyendo, por ejemplo, como un diluyente, vehículo, regulador de pH, estabilizador, agente de tonicidad, agente de volumen, agente tensioactivo, crioprotector, lioprotector, antioxidante, fuente de iones metálicos, agente quelante y/o conservador. Los excipientes incluyen, por ejemplo, polioles tales como sorbitol o manitol; azúcares tales como sucrosa, lactosa o dextrosa; polímeros tales como polietilenglicol; sales tales como NaCl, KCl o fosfato de calcio, aminoácidos tales como glicina, metionina o ácido glutámico, agentes tensioactivos, iones metálicos, sales reguladoras de pH tales como propionato, acetato o succinato, conservadores y polipéptidos tales como albúmina de suero humana, así como solución salina y agua. Los excipientes particularmente útiles de la invención incluyen azúcares incluyendo alcoholes de azúcar, azúcares reductores, azúcares no reductores y ácidos de azúcar. Los excipientes se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Wang W., Int. J. Pharm. 185:129-88 (1999) y Wang W., Int. J. Pharm. 203:1-60 (2000).

Brevemente, los alcoholes de azúcar, también conocidos como polioles, alcoholes polihídricos o polialcoholes, son formas hidrogenadas de carbohidratos que tienen un grupo carbonilo reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario. Los polioles pueden usarse como excipientes de estabilización y/o agentes de isotonicidad en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas. Los polioles pueden proteger a los polipéptidos tanto contra las vías de degradación físicas como químicas. Los co-solventes que se excluyen preferentemente incrementan la tensión superficial efectiva del solvente en la interfaz de la proteína con lo cual las conformaciones estructurales más energéticamente favorables son aquellas con las áreas superficiales más pequeñas. Ejemplos específicos de alcoholes de azúcar incluyen sorbitol, glicerol, manitol, xilitol, maltitol, lactitol, eritritol y treitol.

Los azúcares reductores incluyen, por ejemplo, azúcares con un grupo cetona o aldehído y contienen un grupo hemiacetal reactivo, el cual permite que el azúcar actúe como un agente reductor. Ejemplos específicos de azúcares reductores incluyen fructosa, glucosa, gliceraldehído, lactosa, arabinosa, manosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y maltosa.

Los azúcares no reductores contienen un carbono anomérico que es un acetal y que no es sustancialmente reactivo con aminoácidos o polipéptidos para iniciar una reacción de Maillard. Los azúcares que reducen la solución de Fehling o reactivo de Tollen también se conocen como azúcares reductores. Ejemplos específicos de azúcares no reductores incluyen sucrosa, trehalosa, sorbosa, sucralosa, melezitosa y rafinosa.

Los ácidos de azúcar incluyen, por ejemplo, ácidos sacáricos, gluconato y otros polihidroxi azúcares y sales de los mismos.

Los excipientes reguladores de pH mantienen el pH de las formulaciones líquidas a través de la vida útil del producto y conservan el pH de las formulaciones liofilizadas durante el proceso de liofilización y luego de su reconstitución, por ejemplo.

Los agentes de tonicidad y/o estabilizadores incluidos en formulaciones líquidas pueden usarse, por ejemplo, para proporcionar isotonicidad, hipotonicidad o hipertonicidad a una formulación de tal manera que sea adecuada para administración. Estos excipientes también se pueden usar, por ejemplo, para facilitar el mantenimiento de la estructura de un polipéptido y/o para minimizar interacciones proteína-proteína electrostáticas en solución. Ejemplos específicos de agentes de tonicidad y/o estabilizadores incluyen polioles, sales y/o aminoácidos. Los agentes de tonicidad y/o estabilizadores incluidos en formulaciones liofilizadas pueden usarse, por ejemplo, como un crioprotector para proteger a los polipéptidos de tensiones por congelación o como un lioprotector para estabilizar polipéptidos en el estado liofilizado. Ejemplos específicos de estos crio- y lioprotectores incluyen polioles, azúcares y polímeros.

Los agentes de volumen son útiles en formulaciones liofilizadas para, por ejemplo, incrementar la elegancia del producto y para impedir el estallamiento. Los agentes de volumen proporcionan resistencia estructural a la torta lio e incluyen, por ejemplo, manitol y glicina.

Los antioxidantes son útiles en formulaciones líquidas para controlar la oxidación de proteínas y también pueden usarse en formulaciones liofilizadas para retardar reacciones de oxidación.

Los iones metálicos pueden incluirse en una formulación líquida, por ejemplo, como un co-factor y cationes divalentes tales como zinc y magnesio pueden utilizarse en formulaciones en suspensión. Agentes quelantes incluidos en las formulaciones líquidas pueden usarse, por ejemplo, para inhibir reacciones catalizadas por iones metálicos. Con respecto a formulaciones liofilizadas, los iones metálicos también pueden incluirse, por ejemplo, como un co-factor. Aunque los agentes quelantes generalmente se omiten de las formulaciones liofilizadas, también se pueden incluir según se desee para reducir reacciones catalíticas durante el proceso de liofilización y después de su reconstitución.

Los conservadores incluidos en formulaciones líquidas y/o liofilizadas pueden usarse, por ejemplo, para proteger contra crecimiento microbiano y son particularmente benéficos en formulaciones de varias dosis. En formulaciones liofilizadas, los conservadores se incluyen generalmente en el diluyente de reconstitución. Alcohol bencílico es un ejemplo específico de un conservador útil en una formulación de la invención.

Según se usa en la presente, el término “agente tensioactivo” intenta significar una sustancia que funciona para reducir la tensión superficial de un líquido en el cual se disuelva. Los agentes tensioactivos pueden ser incluidos en una formulación para una variedad de propósitos incluyendo, por ejemplo, para prevenir o controlar agregación, formación de partículas y/o adsorción superficial en formulaciones líquidas o para prevenir o controlar estos fenómenos durante el proceso de liofilización y/o reconstitución en formulaciones liofilizadas. Los agentes tensioactivos incluyen, por ejemplo, compuestos orgánicos anfifáticos que exhiben solubilidad parcial en solventes tanto orgánicos como soluciones acuosas. Las características generales de los agentes tensioactivos incluyen su capacidad para reducir la tensión superficial del agua, reducir la tensión interfacial entre aceite y agua y también formar micelas. Los agentes tensioactivos de la invención incluyen agentes tensioactivos no iónicos y iónicos. Los agentes tensioactivos se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Randolph T. W. y Jones L. S., Surfactant-protein interactions. Pharm Biotechnol. 13:159-75 (2002).

Brevemente, los agentes tensioactivos no iónicos incluyen, por ejemplo, óxido de alquilpoli(etileno), alquilpoliglucósidos tales como octilglucósido y decilmaltósido, alcoholes de azúcar tales como alcohol cetílico y alcohol oleílico, cocamida MEA, cocamida DEA y cocamida TEA. Ejemplos específicos de agentes tensioactivos no iónicos incluyen los polisorbatos incluyendo, por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 28, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85 y similares; los poloxámeros incluyendo, por ejemplo, poloxámero 188, también conocido como poloxalcol u óxido de poli(etileno)-óxido de poli(propileno), poloxámero 407 o polietilen-polipropilenglicol y similares, y polietilenglicol (PEG). Polisorbato 20 es sinónimo de TWEEN 20, monolaurato de sorbitan y monolaurato de polioxietilensorbitan.

Los agentes tensioactivos iónicos incluyen, por ejemplo, agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos y zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, agentes tensioactivos a base de sulfonato o a base de carboxilato tales como jabones, sales de ácido graso, dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio y otras sales de alquilsulfato. Los agentes tensioactivos catiónicos incluyen, por ejemplo, agentes tensioactivos a base de amonio cuaternario tales como bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB), otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetil piridinio, sebo amina polietoxilada (POEA) y cloruro de benzalconio. Los agentes tensioactivos zwitteriónicos o anfotéricos incluyen, por ejemplo, dodecil betaína, óxido de dodecil dimetilamina, cocamidopropil betaína y coco anfo glicinato.

Según se usa en la presente, el término “terapéutico” cuando se usa en referencia a un polipéptido según se divulga en la presente, incluyendo panitumumab de la invención, intenta significar que el polipéptido está destinado para usarse en la cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades en un humano u otro animal. En consecuencia, un polipéptido terapéutico es un tipo específico de farmacéutico y puede incluir un solo polipéptido o dos o más subunidades de polipéptidos. Un polipéptido terapéutico incluye un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional del mismo, un pepticuerpo o fragmento funcional del mismo, factores de crecimiento, citocinas, moléculas de señalización celular y hormonas. Se conocen bien en la técnica una amplia variedad de polipéptidos terapéuticos, todos los cuales están incluidos dentro del significado del término según se usa en la presente. Los polipéptidos terapéuticos ejemplares que pueden usarse en una formulación de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos tales como panitumumab de la invención (Vectibix™) y Epratuzumab® (Emab) así como fragmentos funcionales contra una amplia variedad de antígenos, interleucinas, G-CSF, GM-CSF, cinasas, TNF y ligandos de TNFR, ciclinas y eritropoyetina.

Según se usa en la presente, el término “cantidad efectiva” cuando se usa en referencia a una macromolécula terapéutica tal como un polipéptido terapéutico intenta significar una cantidad de la molécula terapéutica suficiente para reducir al menos un síntoma asociado con una enfermedad o condición fisiológica seleccionada.

Una formulación de la invención exhibe propiedades óptimas para administración, almacenamiento y manipulación de panitumumab. La manipulación incluye, por ejemplo, liofilización, reconstitución, dilución, titulación y similares. El componente regulador de pH de una formulación de la invención es eficiente de preparar y se puede combinar fácilmente con panitumumab usando cualquiera de una variedad de métodos bien conocidos en la técnica, evitando en etapas preparatorias y/o intermedias problemáticas y algunas veces tardadas. Además, los componentes reguladores de pH acuosos de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico son compatibles con una amplia variedad de excipientes y agentes tensioactivos que facilitan la estabilidad de panitumumab. Estos y otros atributos de una formulación de la invención descrita en la presente permiten que se preparen formulaciones estables de panitumumab y que se mantengan durante periodos que excedan 12-18 meses o más.

La estabilidad de una formulación de la invención, incluyendo una formulación líquida de la invención, se refiere a la retención de la estructura y/o función de panitumumab dentro de una formulación. Panitumumab en una formulación de la invención exhibirá atributos tales como resistencia a cambio o deterioro que afecten la estabilidad o función y por lo tanto mantengan las características funcionales consistentes con el tiempo. En consecuencia, las formulaciones de la invención exhibirán, por ejemplo, confiabilidad y seguridad con respecto a actividad por unidades de volumen o actividad.

En una modalidad, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye, por ejemplo, la retención de la estabilidad física y/o química. La estabilidad del polipéptido puede evaluarse mediante, por ejemplo, la determinación de si el polipéptido ha sido sujeto a una vía de degradación física y/o degradación química tales como aquellas descritas previamente, incluyendo la modificación química de su estructura. La retención en la estabilidad de un polipéptido en una formulación de la invención incluye, por ejemplo, retención de estabilidad física o química de entre aproximadamente 80-100%, 85-99%, 90-98%, 92-96% ó 94-95% en comparación con la estabilidad del polipéptido en un punto de tiempo inicial. En consecuencia, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye una retención de estabilidad de más de 99.5%, al menos alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% u 80% en comparación con la estabilidad de panitumumab en un punto de tiempo inicial.

En una modalidad más, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye, por ejemplo, retención de actividad. La actividad del polipéptido puede evaluarse usando, por ejemplo, un ensayo in vitro, in vivo y/o in situ que indique la función del polipéptido. La retención de la estabilidad de panitumumab en una formulación de la invención incluye, por ejemplo, retención de actividad de entre aproximadamente 50-100% o más, dependiendo de la variabilidad del ensayo. Por ejemplo, la retención en la estabilidad puede incluir una retención de actividad de entre aproximadamente 60-90% ó 70-80% en comparación con la actividad de panitumumab en un punto de tiempo inicial. En consecuencia, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye retención de actividad de por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% y puede incluir mediciones de actividad de más de 100%, tales como 105%, 110%, 115%, 120%, 125% ó 150% o más en comparación con la actividad de panitumumab en un punto de tiempo inicial. Generalmente, un punto de tiempo inicial se selecciona para que sea el tiempo en el que panitumumab se prepare primero en una formulación de la invención o se examine primero para calidad (es decir, cumpla con las especificaciones de liberación). Un punto de tiempo inicial también puede incluir el tiempo en el cual panitumumab sea reformulado en una formulación de la invención. La reformulación puede ser, por ejemplo, a una concentración más alta, concentración más baja o a la misma concentración de una preparación inicial.

Una formulación de la invención puede prepararse para ser isotónica con una solución o fluido de referencia (es decir, suero sanguíneo). Una solución isotónica tiene una cantidad sustancialmente similar de soluto disuelta en ésta en comparación con las cosas alrededor de éste por lo que es osmóticamente estable. A menos que se compare expresamente con una solución o fluido específico, isotónico o isotonicidad se usan en forma ejemplar en la presente en referencia a suero sanguíneo humano (por ejemplo, 300 mOsmol/kg). Por lo tanto, una formulación isotónica de la invención contendrá una concentración sustancialmente similar de solutos o exhibirá presión osmótica sustancialmente similar a la de la sangre humana. En general, una solución isotónica contiene aproximadamente la misma concentración de solutos que la solución salina normal para humanos y muchos otros mamíferos, la cual es de aproximadamente 0.9 por ciento en peso (0.009 g/ml) de sal en solución acuosa (por ejemplo, 0.009 g/ml de NaCl). Las formulaciones de la invención también pueden incluir preparaciones de solución hipotónicas e hipertónicas.

Una formulación puede prepararse en cualquiera de una variedad de formas bien conocidas en la técnica para producir un componente regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico que tenga un pH deseado, al menos un excipiente y una cantidad efectiva de panitumumab. A este respecto, la capacidad de regulación de pH de una formulación de la invención es suministrada por los ácidos débiles ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico, los cuales exhiben fuerte capacidad reguladora de pH a un intervalo de pH que está dentro de alrededor de una unidad de pH de sus pK^as respectivas. El ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico tienen pK^as que son óptimas para varias moléculas biológicas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos tales como panitumumab.

El componente ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico puede suministrarse al sistema de regulación de pH en una variedad de diferentes formas de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico. Por ejemplo, el componente ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico puede suministrarse como su ácido, sal ácida o cualquier otra forma que esté disponible o que pueda producirse usando síntesis química. Las formas de sal ácida de estos ácidos -acetato, glutamato o succinato - son particularmente útiles para producir un sistema de regulación de pH de una formulación debido a que están disponibles comercialmente en forma altamente purificada. Las sales acetato, glutamato y succinato incluyen, por ejemplo, aquellas descritas previamente así como otras conocidas en la técnica. Una forma altamente purificada de un componente de formulación se refiere a un nivel de pureza grado farmacéutico, el cual es suficientemente puro para administrarse a un humano de tal manera que está libre de contaminantes para que sea seguro y no tóxico.

Los reguladores de pH de ácido acético, ácido glutámico y ácido succínico se conocen bien por los expertos en la técnica. Una formulación de la invención contendrá una concentración de, por ejemplo, un ácido o sal ácida de la invención que tenga suficiente capacidad de regulación de pH como para mantener un pH seleccionado de una formulación a una temperatura seleccionada. Las concentraciones útiles de ácido o sal (es decir, ácido acético o acetato, ácido glutámico o glutamato o ácido succínico o succinato) incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1­ 150 mM y tan altas como de 200 mM o más. Por ejemplo, en algunos casos, podría ser deseable incluir hasta 1 M de ácido o sal ácida para producir una formulación hipertónica de la invención. Estas soluciones hipertónicas pueden diluirse para producir una formulación isotónica antes de usarse si se desea. A manera de ejemplificación, las concentraciones útiles de regulador de pH de ácido o sal de ácido de la invención incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1-200 mM, 5-175 mM, 10-150 mM, 15-125 mM, 20-100 mM, 25-80 mM, 30-75 mM, 35-70 mM, 40­ 65 mM y 45-60 mM. Otras concentraciones útiles de ácido o sal de ácido incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1-50 mM, 2-30 mM, 3-20 mM, 4-10 mM y 5-8 mM. En consecuencia, una concentración de ácido o sal de ácido de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 mM o más también son útiles. Todos los valores anteriores y debajo de estas concentraciones ejemplares también pueden usarse en una formulación. Por lo tanto, una formulación de la invención puede tener un ácido o sal de ácido en una cantidad de menos de 1 mM o más de 20 mM incluyendo, por ejemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 mM o más de ácido o sal de ácido. Varias formulaciones son ejemplificadas en los siguientes ejemplos mostrados en las figuras 1-13.

Como se describió anteriormente, la pK^a del regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico en una formulación de la invención es particularmente adecuado para usarse con polipéptidos debido a que tienen una fuerte capacidad de regulación de pH de alrededor de pH de 4.5-7, lo cual puede ser óptimo para el mantenimiento de la estabilidad del polipéptido. Un componente regulador de pH de una formulación de la invención puede prepararse para exhibir cualquier capacidad de regulación de pH efectiva dentro de un intervalo de pH de entre alrededor de 4.5 a 7.0. Los intervalos de pH ejemplares de un regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico y/o la formulación final pueden incluir intervalos de pH de entre alrededor de 3.5-6.5, entre alrededor de 4.0-6.0, entre alrededor de 4.5-5.5, entre aproximadamente 4.8-5.2 o alrededor de 5.0. En consecuencia, un regulador de pH y/o la formulación final pueden prepararse para tener un pH de alrededor de 3.0 o menos, aproximadamente 3.5, 4.0, 4.5, 4.8, 5.0, 5.2, 5.5, 6.0, 6.5 o alrededor de 7.0 o más. Todos los valores de pH arriba, debajo y entre estos valores ejemplares también pueden usarse en un regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico y/o la formulación final. Por lo tanto, por ejemplo, un componente regulador de pH y/o la formulación final de la invención se pueden preparar para tener un pH de entre 4.5-5.5 y todos los valores dentro de estos intervalos.

Un componente regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico de una formulación de la invención puede incluir uno o más excipientes. Como se describió anteriormente, un papel de un excipiente incluido es proporcionar estabilización de polipéptidos contra tensiones que puedan ocurrir durante la fabricación, transportación y almacenamiento. Para lograr este papel, al menos un excipiente puede funcionar como un regulador de pH, estabilizador, agente de tonicidad, agente de volumen, agente tensioactivo, crioprotector, lioprotector, anti­ oxidante, fuente de iones metálicos, agente quelante y/o conservador. Además, por lo menos un excipiente también puede funcionar como un diluyente y/o vehículo o se puede emplear para reducir la viscosidad en formulaciones de alta concentración para de esta manera hacer posible su suministro y/o incrementar la conveniencia para el paciente.

De manera similar, al menos un excipiente puede conferir además más de una de las funciones anteriores a una formulación de la invención. Como alternativa, dos o más excipientes pueden incluirse en una formulación de la invención para llevar a cabo más de una de las funciones anteriores u otras. Por ejemplo, un excipiente puede incluirse como un componente en una formulación de la invención para cambiar, ajustar u optimizar la osmolaridad de la formulación, actuando de esta manera como un tonificador. De manera similar, un agente de tonicidad y un agente tensioactivo pueden ambos ser incluidos en una formulación de la invención tanto para ajustar la osmolaridad como para controlar la agregación. Los excipientes, su uso, formulación y características se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Wang W., Int. J. Pharm. 185:129-88 (1999) y Wang W., Int. J. Pharm. 203:1-60 (2000).

En general, los excipientes pueden seleccionarse con base en los mecanismos mediante los cuales se estabilicen proteínas contra varios estreses químicos y físicos. Según se describe en la presente, ciertos excipientes son benéficos para incluirse de tal manera que alivien los efectos de una tensión específica o para regular una susceptibilidad particular de un polipéptido específico. Otros excipientes son benéficos para incluir ya que tienen efectos más generales en las estabilidades físicas y covalentes de proteínas. Los excipientes particularmente útiles incluyen aquellos química y funcionalmente inocuos o compatibles con soluciones reguladoras de pH acuosas y polipéptidos para de esta manera optimizar las propiedades de estabilidad de una formulación. Varios de estos excipientes se describen en la presente como excipientes ejemplares que exhiben compatibilidad química con las formulaciones acuosas de la invención y compatibilidad funcional con el polipéptido incluido en estas formulaciones. Los expertos en la técnica entenderán que las enseñanzas y guía provistas en la presente con respecto a los excipientes ejemplificados son igualmente aplicados al uso de una amplia gama de otros excipientes bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, los excipientes óptimos seleccionados para incrementar o conferir estabilidad de un polipéptido dentro de una formulación incluyen aquellos que están sustancialmente libres de reaccionar con grupos funcionales en el polipéptido. A este respecto, azúcares tanto reductores como no reductores pueden usarse como un excipiente en una formulación de la invención. Sin embargo, debido a que los azúcares reductores contienen un grupo hemiacetal pueden reaccionar y formar aductos u otras modificaciones con grupos amino en cadenas laterales de aminoácidos de polipéptidos (es decir, glicosilación). De manera similar, excipientes tales como citrato, succinato succinato o histidina también pueden formar aductos con cadenas laterales de aminoácidos. Dadas las enseñanzas y guía provistas en la presente, los expertos en la técnica sabrán que una retención mayor de estabilidad para un polipéptido dado puede lograrse al seleccionar un azúcar no reductor sobre un azúcar reductor o sobre otros excipientes reactivos con aminoácidos tales como aquellos ejemplificados arriba.

Los excipientes óptimos también se seleccionan para incrementar o proporcionar estabilización con referencia a un modo de administración para una formulación acuosa de la invención. Por ejemplo, las rutas parenterales de administración intravenosa (IV), subcutánea (SC) o intramuscular (IM) pueden ser más seguras y eficaces cuando todos los componentes de la formulación mantengan estabilidad física y química durante la fabricación, almacenamiento y administración. Los expertos en la técnica sabrán emplear uno o más excipientes que mantengan la estabilidad máxima de la forma activa de un polipéptido dada, por ejemplo, una condición de fabricación o almacenamiento particular o un modo de administración particular. Los excipientes ejemplificados en la presente para usarse en una formulación exhiben éstas y otras características.

La cantidad o concentración de excipiente que se usará en una formulación de la invención variará dependiendo de, por ejemplo, la cantidad de panitumumab incluida en la formulación, la cantidad de otros excipientes incluidos en la formulación deseada, si un diluyente se desea o se requiere, la cantidad o volumen de otros componentes de la formulación, el número total de componentes dentro de una formulación, la actividad específica del polipéptido y la tonicidad u osmolaridad que se desee lograr. Ejemplos específicos de concentraciones de excipientes se ejemplifican más abajo. Además, diferentes tipos de excipientes pueden combinarse en una sola formulación. En consecuencia, una formulación de la invención puede contener un solo excipiente, dos, tres o cuatro o más tipos diferentes de excipientes. Combinaciones de excipientes pueden ser particularmente útiles en conjunto con una formulación que contenga dos o más polipéptidos diferentes. Los excipientes pueden exhibir propiedades químicas similares o diferentes.

Dadas las enseñanzas y guía provistas en la presente, los expertos en la técnica sabrán qué cantidad o intervalo de excipientes pueden incluirse en una formulación particular para lograr una formulación de la invención que promueva la retención en estabilidad de panitumumab. Por ejemplo, la cantidad y tipo de una sal que se incluirá en una formulación de la invención se puede seleccionar con base en la osmolaridad deseada (es decir, isotónica, hipotónica e hipertónica) de la solución final así como las cantidades y osmolaridad de otros componentes que se incluirán en la formulación. En forma similar, mediante ejemplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de este excipiente dependerá de su osmolaridad. La inclusión de aproximadamente 5% de sorbitol puede lograr isotonicidad mientras que alrededor de 9% de un excipiente de sucrosa se requiere para lograr isotonicidad. La selección de la cantidad o intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que pueden incluirse dentro de una formulación de la invención se ha ejemplificado anteriormente por referencia a sales, polioles y azúcares. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que en las consideraciones descritas en la presente y ejemplificadas más por referencia a excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes incluyendo, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, agentes tensioactivos, estabilizadores, agentes de volumen, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, agentes quelantes y/o conservadores.

Los excipientes pueden incluirse en una formulación de la invención a intervalos de concentración generalmente de entre alrededor de 1-40% (p/v), entre alrededor de 5-35% (p/v), entre aproximadamente 10-30% (p/v), entre alrededor de 15-25% (p/v) o aproximadamente 20% (p/v). Concentraciones tan altas como aproximadamente 45% (p/v), 50% (p/v) más de 50% (p/v) en ciertos casos también se pueden emplear en las formulaciones de la invención. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable incluir concentraciones de hasta 60% (p/v) ó 75% (p/v) para producir una formulación hipertónica de la invención. Estas soluciones hipertónicas pueden diluirse para producir una formulación isotónica antes de usarse si se desea. Otros intervalos de concentración útiles incluyen entre alrededor de 1-20%, particularmente entre aproximadamente 2-18% (p/v), más particularmente entre alrededor de 4-16% (p/v), todavía más particularmente entre alrededor de 6-14% (p/v) o entre aproximadamente 8-12% (p)v) o alrededor de 10% (p/v). Las concentraciones y/o cantidades de excipientes de menos de, mayores que o entre estos intervalos también se pueden usar en una formulación de la invención. Por ejemplo, uno o más excipientes pueden ser incluidos en una formulación que constituya menos de aproximadamente 1% (p/v). En forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más excipientes de más de alrededor de 40% (p/v). En consecuencia, puede producirse una formulación de la invención que contenga esencialmente cualquier concentración deseada o cantidad de uno o más excipientes incluyendo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20% (p/v) o más. Abajo se proporciona un ejemplo para una formulación de un polipéptido que tiene alrededor de 10.0% de excipiente.

Varios excipientes útiles en una formulación de la invención han sido descritos previamente. En las formulaciones específicas descritas en el ejemplo, los excipientes ejemplificados incluyen glicerol, sucrosa, trehalosa y/o sorbitol, el cual se emplea como un estabilizador. Otro excipiente ejemplificado en las formulaciones descritas en el ejemplo es polisorbato 80, el cual se emplea en formulaciones líquidas en comparación con formulaciones a granel para almacenamiento. Otros excipientes útiles ya sea en una formulación líquida o liofilizada de la invención incluyen, por ejemplo, fucosa, celobiosa, maltotriosa, melibiosa, octulosa, ribosa, xilitol, arginina, histidina, glicina, alanina, metionina, ácido glutámico, lisina, imidazol, glicilglicina, manosilglicerato, Triton X-100, Pluoronic F-127, celulosa, ciclodextrina, dextrano (10, 40 y/o 70 kD), polidextrosa, maltodextrina, ficoll, gelatina, hidroxipropilmeticelulosa, fosfato de sodio, fosfato de potasio, ZnCl2, zinc, óxido de zinc, citrato de sodio, citrato trisódico, trometamina, cobre, fibronectina, heparina, albúmina de suero humana, protamina, glicerina, glicerol, EDTA, metacresol, alcohol bencílico y fenol. Los excipientes tales como éstos, así como otros conocidos en la técnica pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Wang W., citado arriba (1999) y Wang W., citado anteriormente, (2000).

Un componente regulador de pH de una formulación de la invención también puede incluir uno o más agentes tensioactivos como un excipiente. Como se describió previamente, un papel de los agentes tensioactivos en una formulación de la invención es prevenir o minimizar la agregación y/o adsorción tal como la degradación inducida en superficie. A concentraciones suficientes, generalmente alrededor de la concentración micelar crítica del agente tensioactivo, una capa superficial de moléculas tensioactivas sirve para prevenir que las moléculas de proteína se adsorban en la interfaz. De esta manera, la degradación inducida en superficie es minimizada. Los agentes tensioactivos, su uso, formulación y características para formulaciones se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Randolph y Jones, citado arriba, (2002).

Los agentes tensioactivos óptimos para incluirse en una formulación de la invención pueden seleccionarse, por ejemplo, para incrementar o promover retención en estabilidad de panitumumab al prevenir o reducir agregación y/o adsorción. Por ejemplo, ésteres de ácido graso de sorbitan tales como los polisorbatos son agentes tensioactivos que exhiben una amplia gama de características hidrófilas y emulsionantes. Se pueden usar individualmente o en combinación con otros agentes tensioactivos para cumplir una amplia gama de necesidades de estabilización. Estas características son particularmente adecuadas para usarse con polipéptidos toda vez que pueden ser diseñadas para cubrir la amplia gama de características hidrófobas e hidrófilas de los polipéptidos. Las consideraciones para seleccionar un agente tensioactivo incluyen aquellas previamente mencionadas con referencia a excipientes en general, así como el carácter hidrófobo o concentración micelar crítica del agente tensioactivo. Los agentes tensioactivos ejemplificados en la presente, así como muchos otros bien conocidos en la técnica se pueden usar en una formulación de la invención.

Los intervalos de concentración de agente tensioactivo para una formulación de la invención incluyen aquellos descritos previamente con referencia a excipientes en general con concentraciones particularmente útiles siendo de menos de aproximadamente 1% (p/v). A este respecto, las concentraciones de agente tensioactivo generalmente pueden usarse a intervalos de entre aproximadamente 0.001-0.10% (p/v), particularmente entre alrededor de 0.002-0.05% (p/v), más particularmente entre alrededor de 0.003-0.01% (p/v), todavía más particularmente entre alrededor de 0.004-0.008% (p/v) o entre aproximadamente 0.005-0.006% (p/v). Las concentraciones y/o cantidades de agente tensioactivo de menos de, mayores que o entre estos intervalos también se pueden usar en una formulación de la invención. Por ejemplo, uno o más agentes tensioactivos pueden incluirse en una formulación que constituyen menos de aproximadamente 0.001% (p/v). En forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más agentes tensioactivos de más de aproximadamente 0.10% (p/v). En consecuencia, puede producirse una formulación de la invención que contenga esencialmente cualquier concentración deseada o cantidad de uno o más agentes tensioactivos incluyendo, por ejemplo, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.010, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 ó 0.10% (p/v) o más.

Varios agentes tensioactivos útiles como un excipiente en una formulación de la invención han sido descritos previamente. Otros agentes tensioactivos útiles en una formulación ya sea líquida o liofilizada de la invención incluyen, por ejemplo, ésteres de azúcar tales como ésteres de ácido láurico (C12), ácido palmítico (C16), ácido esteárico (C18), éteres cetoestearílicos de macrogol, éteres laurílicos de macrogol, éter oleílico de macrogol, oleato de macrogol, estearato de macrogol, ricinoleato de macrogol glicerol, hidroxiestearato de macrogol glicerol; alquil poliglucósidos tales como octal glucósido y decil maltósido; alcoholes grasos tales como alcohol cetílico y alcohol oleílico, y cocamidas tales como cocamida MEA, DEA, TEA, otros agentes tensioactivos no iónicos y otros agentes tensioactivos iónicos.

Por lo tanto, la invención proporciona una formulación que incluye una solución acuosa que tiene entre aproximadamente 1-100 mM de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico con un pH de entre 4.5-5.5, un poliol o azúcar entre alrededor de 1 -20%, polisorbato 80 entre alrededor de 0.001 -0.010% y una cantidad efectiva de panitumumab, en donde panitumumab conserva al menos 80% de estabilidad durante hasta dos meses en solución. La formulación de la invención también puede incluir alrededor de 10 mM de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico que tenga un pH de aproximadamente 5.0, aproximadamente 2.6% de glicerol y alrededor de 0.004% de polisorbato 80. Varios otros componentes de formulación, combinaciones de componentes y concentraciones de los mismos se pueden incluir también en una formulación de la invención.

Se divulga además una formulación que tiene un polipéptido terapéutico como el componente de polipéptido de la formulación. El polipéptido terapéutico incluye un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo, un pepticuerpo, una hormona, un factor de crecimiento o una molécula de señalización celular. En una modalidad específica divulgada, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otra modalidad específica divulgada, el anticuerpo es específico para EGFR. En el caso de la presente invención, el anticuerpo es panitumumab.

También se incluye dentro de una formulación según se divulga en la presente una amplia variedad de moléculas terapéuticas. Una molécula terapéutica según se divulga incluye, por ejemplo, una macromolécula o biopolímero tal como un polipéptido, ácido nucleico, lípido, carbohidrato empleado como un ingrediente farmacéutico activo o bloque de construcción del mismo, que se puede usar en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una condición patológica o como un componente de una medicación. Por ejemplo, las formulaciones según se divulgan son aplicables a, y facilitan la retención en estabilidad para, polipéptidos, glicopolipéptidos, péptidoglicanos, ADN tal como ADN genómico, ADNc y similares, ARN tal como ARNm, ARNi, SNRPS, y similares, carbohidratos contemplados como un ingrediente farmacéutico activo los cuales pueden incluir monosacáridos, polisacáridos, azúcares N-enlazados, azúcares O-enlazados, leptinas y similares, lípidos tales como fosfolípidos, glicolípidos, ácidos grasos, poliaminas, isoprenoides, aminoácidos, nucleótidos, neurotransmisores y co-factores, así como muchas otras macromoléculas, biopolímeros y bloques de construcción de los mismos, endógenos para sistemas fisiológicos de mamíferos, incluyendo humanos. Estos y otros biofarmacéuticos se conocen bien por los expertos en la técnica y pueden incluirse en una formulación según se divulga para usarse en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una condición patológica o como un componente de una medicación.

Dadas las enseñanzas y guía provistas en la presente, los expertos en la técnica entenderán que una formulación según se divulga es igualmente aplicable a todos los tipos de moléculas terapéuticas, incluyendo aquellas ejemplificadas arriba, así como otras bien conocidas en la técnica. Dadas las enseñanzas y guía provistas en la presente, los expertos en la técnica también entenderán que la selección de, por ejemplo, tipos y/o cantidades de uno o más excipientes, agentes tensioactivos y/o componentes opcionales se puede hacer con base en la compatibilidad química y funcional con la molécula terapéutica que se formulará y/o el modo de administración, así como otros factores químicos, funcionales, fisiológicos y/o médicos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, comos se describió previamente, los azúcares no reductores exhiben propiedades excipientes favorables cuando se usan con terapéuticos de polipéptidos en comparación con azúcares reductores. En consecuencia, las formulaciones según se divulgan se ejemplifican más abajo con referencia a terapéuticos de polipéptidos. Sin embargo, la gama de aplicabilidad, propiedades químicas y físicas, consideraciones y metodología aplicadas a terapéuticos de polipéptidos son similarmente aplicables a moléculas terapéuticas que no son terapéuticos de polipéptidos.

Los tipos ejemplares de polipéptidos aplicables para usarse en una formulación según se divulga incluyen todos los tipos de polipéptidos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, la superfamilia de inmunoglobulinas de polipéptidos, factores de crecimiento, citocinas, moléculas de señalización celular y hormonas. Los polipéptidos ejemplares aplicables para usarse en una formulación de la invención incluyen todos los polipéptidos terapéuticos incluyendo, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, interleucinas, G-CSF, GM-CSF, cinasas, TNF y ligandos de TNFR incluyendo Fhm, ciclinas, eritropoyetina, factores de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento nervioso regulado en desarrollo VGF, factores neurotróficos, factor neurotrófico NNT-1, receptor de Eph, ligandos de receptor de Eph; receptor tipo Eph, ligandos del receptor tipo Eph, inhibidores de proteínas de apoptosis (IAP), proteína específica Thy-1, ligando Hek (hek-L), receptor de Elk y ligandos del receptor de Elk, STATs, inhibidor de colagenasa, osteoprotegerina (OPG), APRIL/G70, AGP-3/BLYS, BCMA, TACI, Her-2/neu, polipéptidos de apolipoproteínas, integrinas, inhibidor tisular de metaloproteinasas, receptor de complemento C3b/C4b, proteína de unión a SHC, polipéptidos DKR, polipéptidos de matriz extracelular, anticuerpos contra los polipéptidos terapéuticos anteriores y fragmentos funcionales de anticuerpo de los mismos, anticuerpos contra receptores para los polipéptidos terapéuticos anteriores y fragmentos funcionales de anticuerpo de los mismos, fragmentos de polipéptidos funcionales de los mismos, polipéptidos de fusión, polipéptidos quiméricos y similares.

Ejemplos específicos de farmacéuticos disponibles comercialmente aplicables para usarse en una formulación según se divulga incluyen, por ejemplo, ENBREL (Etanercept; una proteína de fusión dimérica expresada por CHO ((Amgen, Inc.)); EPOGEN (Epoetina alfa; una glicoproteína expresada por células de mamífero (Amgen, Inc.)); INFERGEN® (Interferón alfacon-1; una proteína recombinante expresada en E. coli (Amgen, Inc.)); KINERET® (anakinra; una forma no glucosilada y recombinante expresada en E. coli del antagonista del receptor de interleucina-1 humana (IL-1 Ra) (Amgen, Inc.)); ARANESP (darbepoetina alfa; una proteína estimuladora de eritropoyesis humana recombinante expresada por CHO (Amgen, Inc.)); NEULASTA (pegfilgrastim; un conjugado covalente de metionilo humano recombinante G-CSF y 20kD PEG (Amgen, Inc.)); NEUPOGEN (Filgrastim; un factor estimulador de colonia de granulocitos humano expresado en E. coli (G-CSF) (Amgen, Inc.)) y STEMGEN (Ancestim, factor de células madre; una proteína humana recombinante expresada en E. coli (Amgen, Inc.)). Estos y otros farmacéuticos disponibles comercialmente pueden ser, por ejemplo, reformulados en una formulación según se divulga en el momento de producción, antes de usarse y/o antes de almacenamiento a corto o largo plazo.

Ejemplos específicos de anticuerpos, en particular de anticuerpos específicos contra EGFR aplicables para usarse como un anticuerpo terapéutico en una formulación según se divulga incluyen, por ejemplo, panitumumab (Amgen, Inc.) según la presente invención; cetuximab (Erbitux™; Imclone Systems, Ciudad de Nueva York); IMC-11F8 (Imclone Systems); Humax-EGFR (Genmab, Copenhagen, Dinamarca); matuzumab (EMD-7200; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y nimotuzumab (TheraCIM hR3; YM Biosciences, Mississauga, Ontario, Canadá). Todos los anticuerpos anteriores se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, panitumumab está disponible comercialmente de Amgen y es la materia del anticuerpo anti-EGFR humano descrito en la patente de E.U.A. No. 6,235,883, IMC-11F8 es la materia de la patente de E.U.A. No. 7,060,808 y Humax-EGFR es la materia de las publicaciones de patente de E.U.A. 20030091561 y 20030194403.

A manera de ilustración adicional de la gama de aplicabilidad de moléculas terapéuticas de una formulación según se divulga, más abajo se describen tipos ejemplares de anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, que se pueden emplear como un polipéptido terapéutico en una formulación de la invención. Como se describió previamente, las propiedades químicas y físicas, consideraciones de formulación y metodología aplicables a los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, son similarmente aplicables a biofarmacéuticos que incluyan otros biofarmacéuticos de polipéptidos.

Los anticuerpos monoclonales específicos de objetivo para usarse como un polipéptido según se divulga, o fragmentos funcionales de los mismos, se pueden producir en cualquiera de las diferentes formas de anticuerpo y/o pueden alterarse o modificarse en cualquiera de las diferentes formas como se describió previamente conservando al mismo tiempo su actividad de unión objetivo específica. Cualquiera de estas formas de anticuerpo, alteraciones o modificaciones, incluyendo combinaciones de las mismas, de un anticuerpo monoclonal específico objetivo, o fragmento funcional del mismo, se incluye dentro de la divulgación como un polipéptido. Cualquiera de estas diferentes formas de anticuerpo, alteraciones o modificaciones de un anticuerpo monoclonal específico de objetivo para usarse como un polipéptido de la invención, o un fragmento funcional del mismo, se pueden usar similarmente en los métodos, composiciones y/o artículos de fabricación de la divulgación como los descritos en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales específicos de objetivo de la invención, o fragmentos funcionales de los mismos, incluyen anticuerpos injertados específicos de objetivo, humanizados, Fd, Fv, Fab, F(ab)2, scFv y anticuerpos monoclonales de pepticuerpos así como todas las demás formas, alteraciones y/o modificaciones descritas anteriormente, e incluyendo otras formas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los métodos para producir hibridomas y tamizar para anticuerpos monoclonales específicos de objetivo usando tecnología de hibridomas son de rutina y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con una molécula objetivo tal como un polipéptido y una vez que se detecte una respuesta inmune, por ejemplo, anticuerpos específicos para la molécula objetivo se detectan en el suero del ratón, se coseche el bazo del ratón y se aíslen los esplenocitos. Los esplenocitos son después fusionados mediante métodos bien conocidos a cualquiera célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible de la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante dilución limitada. Los clones de hibridoma son después ensayados mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse a una molécula objetivo. Fluido de ascites, el cual contiene generalmente altos niveles de anticuerpos, puede generarse de inmunizar ratones con clones de hibridoma positivos.

Además, la expresión recombinante en huéspedes procarióticos o eucarióticos puede usarse para generar anticuerpos monoclonales específicos de objetivo. Se puede utilizar expresión recombinante para producir especies de anticuerpos monoclonales específicos de objetivo individuales, o fragmentos funcionales de los mismos. Como alternativa, puede utilizarse expresión recombinante para producir diversas bibliotecas de combinaciones de cadenas pesada y ligera, o cadena pesada variable y ligera variable, y luego tamizarse para un anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional del mismo, que exhiba actividad de unión específica a la molécula objetivo. Por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras, dominios de las cadenas pesadas y ligeras variables o fragmentos funcionales de los mismos, pueden ser co-expresados de ácidos nucleicos que codifiquen para anticuerpos monoclonales específicos de objetivo usando métodos bien conocidos en la técnica para producir especies de anticuerpos monoclonales específicas. Se pueden producir bibliotecas usando métodos bien conocidos en la técnica a partir de poblaciones co-expresadas de ácidos nucleicos que codifiquen para cadenas pesadas y ligeras, dominios de las cadenas pesada y ligera variables o fragmentos funcionales de los mismos, y tamizarse mediante unión de afinidad a la molécula objetivo para la identificación de anticuerpos monoclonales específicos de objetivo. Estos métodos pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Guíele, C.A.K. Borrebaeck, ed., citado arriba; Huse et al., Science 246: 1275-81 (1989); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 88:7978-82 (1991); Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 88:4363-66 (1991); Plückthun y Skerra, citado arriba; Felici et al., J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991); Lerner et al., Science 258:1313-14 (1992) y en la patente de E.U.A. No. 5,427,908.

La clonación de ácidos nucleicos de codificación puede lograrse usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En forma similar, la clonación de los repertorios de cadenas pesadas y/o ligeras de ácido nucleico de codificación, incluyendo ácidos nucleicos de codificación VH y/o VL también se puede lograr mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, clonación de expresión, tamizado de hibridación con una sonda complementaria, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un par complementario de cebadores o reacción en cadena de la ligasa (LCR) usando un cebador complementario, PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) y similares. Estos métodos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001) y Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

Los ácidos nucleicos de codificación también pueden obtenerse de cualquiera de varias bases de datos públicas incluyendo bases de datos de genomas enteros tales como aquellas operadas por el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Un método particularmente útil para aislar ya sea un solo ácido nucleico de codificación o un repertorio de ácidos nucleicos de codificación para cadenas pesadas y/o ligeras, o fragmentos funcionales de los mismos, puede lograrse sin el conocimiento específico de la porción de región de codificación ya que están disponibles cebadores o pueden diseñarse fácilmente usando porciones conservadas de proporciones variables de anticuerpos o de región constante. Por ejemplo, un repertorio de ácidos nucleicos de codificación puede clonarse usando una pluralidad de cebadores degenerados para estas regiones junto con PCR. Estos métodos se conocen bien en la técnica y pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Huse et al., citado arriba y Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., citado arriba. Cualquiera de los métodos anteriores así como otros conocidos en la técnica, incluyendo combinaciones de los mismos, se pueden usar para generar un anticuerpo monoclonal específico de objetivo para usarse como un polipéptido de la invención.

Por lo tanto, la divulgación proporciona una formulación que tiene un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo como un polipéptido terapéutico. El polipéptido terapéutico puede incluir un anticuerpo monoclonal, Fd, Fv, Fab, F(ab’), F(ab)2, F(ab’)2, Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos o pepticuerpos.

Las concentraciones de un polipéptido que se incluirá en una formulación de la divulgación y la invención variarán, por ejemplo, dependiendo de la actividad del polipéptido, la indicación que se tratará, el modo de administración, el régimen de tratamiento y si la formulación está diseñada para almacenamiento a largo plazo en forma ya sea líquida o liofilizada. Los expertos en la técnica sabrán qué concentraciones usar dadas estas consideraciones bien conocidas y el estado de la técnica en la ciencia farmacéutica. Por ejemplo, existen más de 80 polipéptidos aprobados para uso terapéutico en los Estados Unidos para una amplia variedad de indicaciones médicas, modos de administración y regímenes de tratamiento. Estos polipéptidos aprobados son ejemplares de la gama de concentraciones de polipéptidos que se pueden usar en una formulación de la invención.

Generalmente, un polipéptido que incluya, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, en el caso de la invención panitumumab, será incluido en una formulación de la invención a una concentración de entre aproximadamente 1­ 200 mg/ml, alrededor de 10-200 mg/ml, aproximadamente 20-180 mg/ml, particularmente entre alrededor de 30-160 mg/ml, más particularmente entre 40-120 mg/ml, todavía más particularmente entre alrededor de 50-100 mg/ml o aproximadamente 60-80 mg/ml. Las concentraciones y/o cantidades de polipéptidos menores que, mayores que o entre estos intervalos también se pueden usar en una formulación de la invención. Por ejemplo, uno o más polipéptidos pueden ser incluidos en una formulación que constituyan menos de aproximadamente 1.0 mg/ml. En forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más polipéptidos mayor que aproximadamente 200 mg/ml, particularmente cuando se formule para almacenamiento. En consecuencia, una formulación de la invención puede producirse que contenga esencialmente cualquier concentración o cantidad deseada de uno o más polipéptidos incluyendo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ó 200 mg/ml o más. En los siguientes ejemplos se ejemplifica una formulación para un polipéptido terapéutico que tiene una concentración de aproximadamente 10 mg/ml.

Una formulación de la invención también puede incluir combinaciones de polipéptidos en la formulación. Por ejemplo, una formulación de la invención puede incluir un solo polipéptido para el tratamiento de una o más condiciones. Una formulación de la invención también puede incluir dos o más polipéptidos diferentes. El uso de varios polipéptidos en una formulación de la invención puede estar dirigido a, por ejemplo, las mismas o diferentes indicaciones. De manera similar, se pueden usar varios polipéptidos en una formulación de la invención para tratar, por ejemplo, tanto una condición patológica como uno o más efectos secundarios causados por el tratamiento primario. También se pueden incluir varios polipéptidos en una formulación de la invención para lograr diferentes propósitos médicos incluyendo, por ejemplo, tratamiento y monitoreo simultáneo de la progresión de la condición patológica. Varias terapias concurrentes tales como aquellas ejemplificadas arriba, así como otras combinaciones bien conocidas en la técnica son particularmente útiles para cooperación del paciente debido a que una sola formulación puede ser suficiente para algunos o todos los tratamientos y/o diagnósticos sugeridos. Los expertos en la técnica conocerán los polipéptidos que pueden ser mezclados para una amplia gama de terapias de combinación. En forma similar, una formulación de la invención también se puede usar con farmacéuticos de molécula pequeña y combinaciones de uno o más polipéptidos junto con uno o más farmacéuticos de molécula pequeña. Por lo tanto, la invención proporciona una formulación de la invención que contiene 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o más polipéptidos diferentes, así como para uno o más polipéptidos combinados con uno o más farmacéuticos de molécula pequeña.

Una formulación de la invención también puede incluir uno o más conservadores y/o aditivos bien conocidos en la técnica. En forma similar, una formulación de la invención puede formularse además en cualquiera de varias formulaciones de suministro conocidas. Por ejemplo, una formulación de la invención puede incluir agentes lubricantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservadores tales como metil- y propilhidroxibenzoatos, agentes edulcorantes y agentes saborizantes. Estos componentes opcionales, sus características químicas y funcionales se conocen bien en la técnica. De manera similar se conocen bien en la técnica las formulaciones que facilitan una liberación rápida, prolongada o retrasada del polipéptido después de su administración. Una formulación de la invención puede producirse para incluir éstas y otros componentes de formulación bien conocidos en la técnica.

Una formulación de la invención también se puede producir, por ejemplo, en estados que no sean un líquido acuoso. Por ejemplo, las formulaciones que contienen regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico de la invención pueden prepararse, por ejemplo, como una formulación liofilizada.

Una vez que una formulación de la invención se prepara como se describe en la presente, la estabilidad del uno o más polipéptidos contenidos dentro de la formulación se puede evaluar usando métodos bien conocidos en la técnica. Varios de estos métodos se ejemplifican más abajo en los ejemplos e incluyen cromatografía de exclusión de tamaño y conteo de partículas. Cualquiera de una variedad de ensayos funcionales incluyendo, por ejemplo, actividad de unión, otra actividad bioquímica y/o actividad fisiológica pueden evaluarse en dos o más puntos de tiempo diferentes para determinar la estabilidad del polipéptido en la formulación de pH regulado de la invención.

Una formulación de la invención será, en general, preparada de acuerdo con estándares farmacéuticos y usando reactivos grado farmacéutico. En forma similar, una formulación de la invención será, en general, preparada usando reactivos estériles en un ambiente de fabricación estéril o se esterilizarán después de la preparación. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse usando procedimientos bien conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, al incorporar uno o más polipéptidos en la cantidad requerida en un regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico o excipiente de la invención con una o una combinación de componentes de formulación descritos en la presente seguidos por microfiltración por esterilización. En la modalidad específica de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos particularmente útiles de preparación incluyen, por ejemplo, secado al vacío y secado por congelación (liofilización) como se describió previamente. Estos métodos de secado producirán un polvo del uno o más polipéptidos junto con cualquier componente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente de los mismos.

Los regímenes de administración y dosificación pueden ajustarse para proporcionar una cantidad efectiva para una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser particularmente útil para formular una formulación de la inyección para inyección intravenosa, parenteral o subcutánea en una forma de dosis única para la facilidad de administración y uniformidad de dosis en la administración de una cantidad efectiva de uno o más polipéptidos. Dosificación unitaria se refiere a una cantidad físicamente individual de un farmacéutico adecuado como dosis unitarias para los sujetos que serán tratados; cada unidad contiene una unidad predeterminada de polipéptido activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado.

Para una ejemplificación adicional, una cantidad efectiva de un polipéptido tal como un anticuerpo terapéutico, particularmente panitumumab, se puede administrar, por ejemplo, más de una vez, a intervalos programados durante un periodo de tiempo. En ciertas modalidades, un anticuerpo terapéutico se administra durante un periodo de por lo menos un mes o más incluyendo, por ejemplo, uno, dos o tres meses o más. Para tratar condiciones crónicas, tratamiento a largo plazo prolongado es generalmente más efectivo. Periodos de administración más cortos pueden ser suficientes cuando se trata en condiciones agudas incluyendo, por ejemplo, de una a seis semanas. En general, un anticuerpo terapéutico u otro polipéptido se administra hasta que el paciente manifieste un grado médicamente relevante de mejora sobre la línea de base para el indicador o indicadores seleccionados.

Dependiendo del polipéptido seleccionado y de la indicación que se tratará, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para causar una reducción en al menos un síntoma de la condición patológica seleccionada de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55% o 60% o más, en relación a sujetos no tratados. La capacidad de una formulación para reducir o inhibir un síntoma puede evaluarse, por ejemplo, en un sistema de modelo de animal predictivo de la eficacia para la condición seleccionada en un humano. Como alternativa, la capacidad de una formulación para reducir o inhibir un síntoma puede evaluarse, por ejemplo, al examinar una función o actividad in vitro de la formulación que indique actividad terapéutica in vivo.

Los niveles de dosis reales de uno o más polipéptidos en una formulación de la invención pueden variarse de tal manera que se obtenga una cantidad del polipéptido activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, formulación y modo de administración, sin que sea tóxica para el paciente. Alguien de capacidad en la técnica sería capaz de terminar cantidades administradas con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y el polipéptido y/o ruta de administración seleccionado. El nivel de dosificación seleccionado puede depender, por ejemplo, de una variedad de factores farmacocinéticas incluyendo la actividad del polipéptido empleado, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, seco, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que esté siendo tratado, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Las modalidades particulares de la presente invención incluyen administrar un polipéptido terapéutico tal como un anticuerpo, o fragmento funcional del mismo, en una formulación de la invención a una dosis de aproximadamente 1 ng de anticuerpo por kg de peso del sujeto al día (1 ng/kg/día) a aproximadamente 1 mg/kg/día, más particularmente alrededor de 500 ng/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y todavía más particularmente alrededor de 5 pg/kg/día a aproximadamente 2 mg/kg/día, a un sujeto.

Un médico o veterinario que tenga capacidad en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la formulación farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario puede iniciar dosis de una formulación de la invención a niveles más bajos que aquellos requeridos para lograr de esta manera el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una formulación de la invención será aquella cantidad de polipéptido que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Esta cantidad efectiva dependerá generalmente de los factores descritos previamente. Es particularmente útil que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Si se desea, la dosis diaria efectiva para lograr una cantidad efectiva de una formulación se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas por separado a intervalos adecuados a lo largo del día, opcionalmente, en cantidades de dosificación unitaria.

Una formulación de la invención se puede administrar, por ejemplo, con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad particularmente útil, una formulación de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ó 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: patente de E.U.A. No. 4,487,603, la cual describe una bomba de micro-infusión implantable para suministrar medicamento a una velocidad controlada; patente de E.U.A. No. 4,486,194, la cual describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente de E.U.A. No. 4,447,233, la cual describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una velocidad de infusión precisa; patente de E.U.A. No. 4,447,224, la cual describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro de fármaco continuo; patente de E.U.A. No. 4,439,196 la cual describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de varias cámaras y patente de E.U.A. No. 4,475,196, la cual describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Muchos otros de estos implantes, sistemas de suministro y módulos se conocen por los expertos en la técnica.

En ciertas modalidades específicas, panitumumab para usarse en una formulación de la invención puede formularse además para facilitar la distribución selectiva in vivo. Por ejemplo, la barrera hemoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para facilitar el cruce de la BBB si se desea, una formulación puede incluir además, por ejemplo, liposomas para encapsulación de uno o más polipéptidos. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,522,811; 5,374,548 y 5,399,331. Los liposomas pueden contener además una o más porciones que sean transportadas selectivamente a células u órganos específicos, incrementando así el suministro dirigido de un polipéptido seleccionado (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Las porciones de dirección ejemplares incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,416,016 a Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180) o receptor de proteína A tensioactiva (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.

1233:134).

Por lo tanto, la divulgación proporciona además un método para preparar una formulación. El método incluye combinar una solución acuosa que tenga un regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico u ácido succínico con un pH de alrededor de 4.5 a aproximadamente 7.0 y un excipiente seleccionado de un azúcar o poliol con una cantidad efectiva de un polipéptido terapéutico que incluya, por ejemplo, un anticuerpo específico contra EGFR. El anticuerpo específico de EGFR puede ser, por ejemplo, panitumumab. Uno o más de los componentes de la formulación descrita en la presente puede combinarse con una o más cantidades efectivas de un polipéptido para producir una amplia gama de formulaciones de la invención.

Se divulga además un recipiente que contiene una formulación que incluye una solución acuosa que tiene entre aproximadamente 1-10 mM de regulador de pH de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico con un pH de aproximadamente 4.5 a alrededor de 7.0, glicerol o sorbitol entre alrededor de 1-10%, polisorbato 80 entre alrededor de 0.001-0.010% y una cantidad efectiva de un anticuerpo terapéutico, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo específico para EGFR o panitumumab. Brevemente, con respecto a las composiciones, los kits y/o medicamentos según se divulgan en la presente, las cantidades efectivas combinadas de uno o más polipéptidos dentro de una formulación de la invención pueden incluirse dentro de un solo medio recipiente o medio contenedor, o incluirse dentro de diferentes recipientes o medios contenedores. Pueden incluirse opcionalmente componentes de formación de imágenes y el envase también puede incluir instrucciones escritas o accesibles por Internet para usar la formulación. Un recipiente o medio contenedor incluye, por ejemplo, un vial, botella, jeringa o cualquiera de una variedad de formatos bien conocidos en la técnica para envase de varios despachadores.

Se entiende que modificaciones que no afecten sustancialmente la actividad de las diferentes modalidades de esta invención también están incluidas dentro de la definición de la invención provista en la presente. En consecuencia, los siguientes ejemplos intentan ilustrar pero no limitar la presente invención.

Ejemplo 1

Caracterización de la estabilidad del polipéptido en soluciones de pH regulado

Este ejemplo describe la caracterización de varias formulaciones en la estabilidad de panitumumab. Se describe también la caracterización de varias formulaciones en la estabilidad a largo plazo de preparaciones globales de panitumumab.

Una variedad de condiciones de formulación que estabilizan el anticuerpo monoclonal IgG2 panitumumab se describen a continuación. Estas condiciones de formulación incluyen aquellas aplicables para la administración del polipéptido terapéutico así como para el almacenamiento, mantenimiento y/o preparación de lotes del polipéptido terapéutico. Las condiciones de formulación de la invención ejemplificadas abajo confieren estabilidad de panitumumab particularmente útil contra agregación, degradación química y formación de partículas. Estas condiciones mostraron ser particularmente efectivas para prevenir la formación de partículas lo cual permite la eliminación de cualquier necesidad de filtro en línea para administración intravenosa.

Brevemente, se encontró que panitumumab era estable a un pH que varía de alrededor de 5.0 a 7.0. La estabilidad óptima se observó a un pH de 5.0 con respecto a agregación y formación de partículas. Formulaciones con un pH de 5.0 también fueron la solución líquida más clara (es decir, más transparente), indicando menos agregación. Los sistemas reguladores de pH particularmente útiles incluyeron ácido acético, ácido L-glutámico y ácido succínico. Los tres de estos sistemas reguladores de pH funcionaron bien a un pH de cerca de alrededor de 5.0 (por ejemplo, aproximadamente 4.8 a alrededor de 5.2). Entre estos sistemas reguladores de pH, se observó que el ácido L-glutámico era igualmente efectivo o mejor que el ácido acético para estabilidad de panitumumab. Los excipientes particularmente útiles para panitumumab incluyeron glicerol, sucrosa, trehalosa y sorbitol. Todos mostraron propiedades de estabilización efectivas con respecto a agregación y/o formación de partículas. Los excipientes óptimos incluyeron glicerol y sucrosa.

Los resultados mostrados a continuación muestran una variedad de formulaciones que mantienen, aumentan u optimizan la estabilidad de panitumumab. En ciertas formulaciones específicas, particularmente formulaciones líquidas útiles para panitumumab incluyeron ácido acético 10 mM, 2.6% de glicerol, 0.004% de polisorbato 80 a pH 5.0 y ácido L-glutámico 10 mM, 2.6% de glicerol, 0.004% de polisorbato 80 a pH 5.0. En otras formulaciones específicas, las formulaciones a largo plazo particularmente útiles para, por ejemplo, almacenamiento congelado, mantenimiento y/o preparación de lotes tales como preparación de sustancia global, incluyeron ácido acético 10 mM, 2.6% de glicerol a pH 5.0 y ácido L-glutámico 10 mM, 2.6% de glicerol a pH 5.0 cuando la formulación de panitumumab se mantiene a -30°C o menos. Glicerol, sucrosa y trehalosa se encontró que eran particularmente útiles como excipientes que protegieron al panitumumab contra la agregación inducida por congelacióndescongelación y formación de partículas.

Los estudios descritos en la presente estuvieron dirigidos a la caracterización y selección de formulaciones que incrementan la retención en la estabilidad de panitumumab. Con base en un análisis preliminar, se seleccionaron tres sistemas reguladores de pH para caracterizar formulaciones líquidas y congeladas estables para panitumumab. Estos sistemas reguladores de pH fueron ácido acético, ácido glutámico y ácido succínico. La caracterización de las formulaciones derivadas de estos sistemas reguladores de pH se ejemplifica a continuación.

Una caracterización inicial fue la apariencia visual de panitumumab en varias formulaciones reguladoras de pH de ácido acético. Brevemente, las siete formulaciones listadas a continuación fueron evaluadas a diferentes valores de pH.

1. pH 5.0: 20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.0

2. pH 5.5: 20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.5

3. pH 6.0:20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.0.

4. pH 6.5: 20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.5

5. pH 7.0: 20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.0

6. pH 7.5: 20 mg/ml de panitumumab, 5 mM de acetato, 5 mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.5

7. A58N: 20 mg/ml de panitumumab, 50 mM de acetato, 100 mM de NaCl, pH 5.8 (control)

La figura 1 muestra la apariencia visual de panitumumab formulado a valores de pH que varían de 5.0 a 7.5. Los resultados indican que la solución de proteínas es más clara y más transparente a valores de pH más bajos. En comparación, las formulaciones se hicieron más turbias a valores de pH más altos.

Estudios de estabilidad acelerada fueron llevados a cabo para caracterizar la estabilidad a panitumumab bajo diferentes condiciones de pH. Brevemente, estudios de estabilidad acelerada fueron llevados a cabo a un pH particular y a, por ejemplo, 37°C en viales de vidrio. Las muestras se dializaron en las formulaciones respetivas a ser probadas y se filtraron estérilmente en recipientes estériles. Aproximadamente cantidades de 2 mL de cada muestra formulada se colocaron en viales de vidrio de 3 mL estériles en una cabina estéril y se taparon. Las muestras designadas para congelación se pusieron en tubos Eppendorf de polipropileno estériles. Todos los viales fueron etiquetados y sujetados seguidos por su colocación en cajas especificadas para almacenamiento a condiciones de -80°C, 2-8°C y 37°C. Se removieron muestras y se analizaron en puntos de tiempo designados. Se usó cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) como uno de los métodos analíticos. Una columna doble TosoHaas G3000SWx1 se usó para llevar a cabo el análisis usando una fase móvil que consistía en fosfato 100 mM (pH 7), NaCl 150 mM.

Diferentes formas de las muestras pudieron ser evaluadas y separadas cuantitativamente con base en su volumen hidrodinámico. Los resultados ejemplares se ilustran en la figura 2 y muestran el porcentaje de monómero de panitumumab almacenado a 37°C durante hasta 2 meses. Pérdidas de monómero más altas se observaron a condiciones de pH más altas. Las formulaciones ejemplificadas en la figura 2 en cada punto de tiempo fueron:

1. EGF_20pH 5.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.0 2. EGF_20pH 5.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato,

5% de sorbitol, pH 5.5 3. EGF_20pH 6.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.0 4. EGF_20pH 6.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.5 5. EGF_20pH 7.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.0 6. EGF_20pH 7.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.5 7. EGF_20pH A58N: 20mg/ml de panitumumab, 50mM de acetato, 100 mM de NaCl, pH 5.8 (control)

Los cambios en la variación de carga de la solución de proteínas también se determinaron mediante cromatografía de intercambio catiónico (CEX) para las muestras almacenadas arriba durante hasta 2 meses. Brevemente, panitumumab fue evaluado usando procedimientos de intercambio catiónico conocidos en la técnica. Este método separó isoformas de lisina C-terminal predominantes con base en las diferencias en carga superficial de proteína usando una gradiente de sal lineal a pH 6.2 y una columna de intercambio catiónico débil Dionex (WCX-10; Sunnyvale, CA) y también la modificación ácida de algunos aminoácidos representados por desamidación.

Los datos de CEX para las siete formulaciones mostradas abajo tienen diferentes condiciones de pH y se almacenaron durante hasta 2 meses a 37°C y se presentan en la figura 3. El resultado muestra que el porcentaje de variantes ácidas (representado por pico 0, que indica productos de desamidación) es mínimo a pH ácido (5.0 y 5.5). 1. EGF_20pH 5.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.0 2. EGF_20pH 5.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.5 3. EGF_20pH 6.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.0 4. EGF_20pH 6.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.5 5. EGF_20pH 7.0: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.0 6. EGF_20pH 7.5: 20mg/ml de panitumumab, 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.5 7. EGF_20pH A58N: 20mg/ml de panitumumab, 50mM de acetato, 100 mM de NaCl, pH 5.8 (control)

Otra característica que se refiere a anticuerpos monoclonales y otros polipéptidos es la ocurrencia de partículas insolubles subvisibles. En este contexto, una partícula de polipéptido se refiere a, por ejemplo, un fragmento o agregado del polipéptido y puede ser soluble y/o insoluble. Además, las partículas pueden estar formadas de materia que sea extraña (es decir, fragmentos de vidrio, pelusa, piezas pequeñas de tapones de hule) y no necesariamente estar compuestas del polipéptido. Los agregados/partículas solubles pueden evaluarse usando métodos tales como SEC, por ejemplo. Las partículas que son insolubles pueden evaluarse usando métodos tañes como conteo de partículas líquidas o enfoque de oscurecimiento de luz tal como HIAC, por ejemplo. Las partículas gruesas se clasifican generalmente como partículas que tienen tamaños de más de 1.0 pm y aquellas consideradas partículas finas son de un tamaño más pequeño. Usando el sistema láser LD-400 con el instrumento HIAC (Ginebra, Suiza), tamaños de partícula de entre 2 y 400 pm pueden ser medidos.

La formación de partículas insolubles fue evaluada para siete formulaciones ejemplares evaluando diferentes condiciones de pH usando conteo de partículas líquidas. Para referencia, estas formulaciones son como se indican en la figura 4 fueron:

1. pH 5.0: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.0

2. pH 5.5: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 5.5

3. pH 6.0: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.0

4. pH 6.5: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 6.5

5. pH 7.0: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.0

6. pH 7.5: 20mg/ml de panitumumab en 5mM de acetato, 5mM de fosfato, 5% de sorbitol, pH 7.5

7. pH A58N: 20mg/ml de panitumumab en 50mM de acetato, 100 mM de NaCl, pH 5.8 (control)

El instrumento contador de partículas HIAC estaba equipado con un software PharmSpec versión 1.4, requerido para medir las partículas de 10 pm y 25 pm presentes en una muestra de Emab dada. Los métodos empleados siguieron procedimientos que cumplen con los requerimientos de USP para la evaluación y calidad de partículas. Agua filtrada (0.22 micras) fue extraída a través de un tubo de acero inoxidable usando volúmenes de 1.0 mL y se enjuagó aproximadamente 10 veces entre las mediciones de muestras. Un estándar de tamaño de partícula de 10 pm líquidas Duke scientific EZY-CAL se usó para verificar la calibración adecuada del instrumento. Ambas mediciones de muestra y estándares se tomaron con un volumen de 0.2 mL, se extrajeron 4 veces, descartando la primera ejecución y promediando las últimas dos o tres. Las muestras fueron extraídas de sus viales originales, con una ligera revoltura dada a cada muestra antes de la medición para asegurar una mezcla uniforme de la solución. El estándar se agitó vigorosamente antes de la medición.

Los resultados de los conteos de partículas HIAC de panitumumab formulado a varios pHs después del vortexeo durante 15 minutos a 4°C se muestran en la figura 4. Partículas que variaban de 5 pm a 25 pm en tamaño fueron contadas. Los resultados muestran que todas las muestras formuladas a pH de 5.0 a 7.0 exhibieron conteos de partículas más bajos que aquellas formuladas a pH 7.5. Los conteos de partículas formulados en el regulador de pH que contiene cloruro de sodio (A58N) fueron significativamente más altos que aquellos formulados en los reguladores de pH de sorbitol.

Con base en los resultados ejemplares anteriores, un pH de 5.0 se seleccionó para la caracterización de formulaciones adicionales como se describe abajo.

Se empleó cromatografía de exclusión de tamaño como se describió arriba para evaluar la estabilidad de panitumumab formulado en regulador de pH de ácido acético, regulador de pH de ácido succínico o regulador de pH de ácido glutámico después de almacenamiento a 37°C durante hasta 4 meses. Las formulaciones mostradas abajo son las siguientes:

1. A_2.6% de glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10mM de ácido acético, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

2. Succ_2.6% de glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10mM de ácido succínico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

3. Gluta_2.6Glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10 mM de ácido L-glutámico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

Los resultados de este estudio se muestran en la figura 5. Brevemente, el contenido de monómeros similar se observó para todos los sistemas de regulación de pH. Las formulaciones que contenían ácido succínico revelaron un contenido de monómeros ligeramente más bajo y la formulación que contenía ácido glutámico mantuvo la mayoría de cantidad exhibida de monómero después de 4 meses de almacenamiento a 37°C.

La estabilidad de las formulaciones de panitumumab y sea en ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico también se evaluó durante periodos de tiempo más largos y para diferentes temperaturas como se describe abajo. Brevemente, cromatografía de intercambio catiónico como se describió previamente se empleó para evaluar la estabilidad de panitumumab en estos sistemas reguladores de pH después de una incubación a 29°C durante hasta 6 meses. Como se muestra en la figura 6, las formulaciones incluyeron:

1. A_2.6% de glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10mM de ácido acético, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

2. Succ_2.6% de glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10mM de ácido succínico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

3. Gluta_2.6Glicerol_pH5_T80: 20 mg/mL de panitumumab en 10 mM de ácido L-glutámico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0. 00 4. de Tween 80.

El resultado mostrado en la figura 6 indica que el porcentaje de variantes ácidas (representado por pico 0, el cual indica productos de desamidación) es comparable en todas las formulaciones. La formación de variantes mínima se observó usando un sistema regulador de pH de ácido glutámico.

La formación de partículas de panitumumab ya sea en ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico también se evaluó usando el análisis de partículas HIAC como el descrito previamente. Brevemente, se formuló panitumumab como se muestra abajo y se incubó a 4°C durante 6 meses.

1. Ace2.6glicerolT80H5.0: 20 mg/mL panitumumab en 10 mM de ácido acético, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

2. Succ2.6glicerolT80pH5.0: 20 mg/mL de panitumumab en 10 mM de ácido succínico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

3. Gluta2.6glicerolT80pH5.0: 20 mg/mL de panitumumab en 10 mM de ácido L-glutámico, 2.6% de glicerol, pH 5.0, 0.004% de Tween 80.

Los resultados se muestran en la figura 7 e indican conteos de partículas aceptables en todas las formulaciones. Según se juzga por los lineamientos de la USP, hubieron muy pocas partículas de >10 gm y >25 gm, aunque se observó que los conteos de partículas de >2 gm en tamaño en el regulador de pH de acetato eran más altos que aquellos en los reguladores de pH ya sea de glutamato o succinato.

La figura 8 muestra el contenido de monómeros medido por SEC HPLC de varias formulaciones isotónicas que contenían diferentes excipientes. Se llevó a cabo SEC HPLC como se describió previamente. Los diferentes excipientes caracterizados incluyeron sorbitol (S), glicerol (GLY), arginina (ARG), sucrosa (SUC) y polisorbato 80 (T80). Las formulaciones completas se muestran abajo para muestras almacenadas durante hasta 2 años a 4°C. Los resultados indican que panitumumab es estable en sorbitol, glicerol, sucrosa y polisorbato 80. Se observó menos estabilidad para arginina.

A5S 10 mM NaAcetato 5% de sorbitol pH 5.0 20 mg/mL

A5ST 10 mM NaAcetato 5% de sorbitol pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

GLY5 10 mM NaAcetato 2.6% de glicerol pH 5.0 20 mg/mL

GLY5T 10 mM NaAcetato 2.6% de glicerol pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

ARG5 10 mM NaAcetato 2.5% de arginina pH 5.0 20 mg/mL

ARG5T 10 mM NaAcetato 2.5% de arginina pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

SUC5 10 mM NaAcetato 9.3% de sucrosa pH 5.0 20 mg/mL

SUC5T 10 mM NaAcetato 9.3% de sucrosa pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

A58N 50 mM NaAcetato 100 mM de NaCl pH 5.8 20 mg/mL

A58NT 50 mM NaAcetato 100 mM de NaCl pH 5.8 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

La figura 9 muestra mediciones de conteo de partículas para los excipientes diferentes anteriores para tamaños de partícula >10 gm usando el método HIAC como el descrito previamente. Las formulaciones y claves para la figura 9 se proporcionan abajo. Los resultados indican que panitumumab es estable en una variedad de formulaciones que contienen sorbitol, glicerol, sucrosa y sal ya sea en presencia o ausencia de polisorbato cuando se almacenan durante 1 año a 4°C.

A5S 10 mM NaAcetato 5% de sorbitol pH 5.0 20 mg/mL

A5ST80 10 mM NaAcetato 5% de sorbitol pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

2.6GLY5 10 mM NaAcetato 2.6% de glicerol pH 5.0 20 mg/mL

2.6GLY5T80 10 mM NaAcetato 2.6% de glicerol pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

ARG5 10 mM NaAcetato 2.5% de arginina pH 5.0 20 mg/mL

ARG5T 10 mM NaAcetato 2.5% de arginina pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

SUC5 10 mM NaAcetato 9.3% de sucrosa pH 5.0 20 mg/mL

SUC5T 10 mM NaAcetato 9.3% de sucrosa pH 5.0 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

A58N 50 mM NaAcetato 100 mM de NaCl pH 5.8 20 mg/mL

A58NT 50 mM NaAcetato 100 mM de NaCl pH 5.8 0.004% de Tween-80 20 mg/mL

Además de las formulaciones anteriores, un número de componentes y formulaciones adicionales fueron caracterizados para estabilidad de panitumumab bajo condiciones de almacenamiento a largo plazo y con respecto a ciclos de congelación-descongelación. Estas caracterizaciones se describen a continuación. Todos los métodos de ensayo se llevaron a cabo como se describió previamente.

Brevemente, la figura 10 muestra el porcentaje de monómeros de panitumumab analizado mediante SE-HPLC en varias formulaciones a un pH que variaba de 5.0 a 7.0. Diferentes excipientes fueron incluidos como se muestra abajo para cada formulación. Las muestras de panitumumab fueron almacenadas durante hasta 3 meses a -30°C. Estas formulaciones se estudiaron en relación al desarrollo de una formulación congelada o sustancia de fármaco congelada o una solución de sustancia global.

1. EGF_p5glicerol2.6: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 2.6% de glicerol, pH 5.0

2. EGF_p5glicerol10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 10% de glicerol, pH 5.0

3. EGF_p5suc9.3: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 9.3% de sucrosa, pH 5.0

4. EGF_p5suc20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 20% de sucrosa, pH 5.0

5. EGF_p5tre9.3: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 9.3% de trehalosa, pH 5.0

6. EGF_p5tre20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 20% de trehalosa, pH 5.0

7. EGF_p5arg2.5: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 2.5% de arginina, pH 5.0

8. EGF_p5arg10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de acetato, 10% de arginina, pH 5.0

9. EGF_p6glicerol2.6: 40 mg/mL de panitmumab en 10 mM de fosfato de potasio, 2.6% de glicerol, pH 6.0

10. EGF_p6glicerol10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 10% de glicerol, pH 6.0

11. EGF_p6suc9.3: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 9.3% de sucrosa, pH 6.0

12. EGF_p6suc20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 20% de sucrosa, pH 6.0

13. EGF_p6tre9.3: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 9.3% de trehalosa, pH 6.0

14. EGF_p6tre20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 20% de trehalosa, pH 6.0

15. EGF_p6arg2.5: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 2.5% de arginina, pH 6.0

16. EGF_p6arg10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 10% de arginina, pH 6.0

17. EGF_p7glicerol2.6: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 2.6% de glicerol, pH 7.0

18. EGF_p7glicerol10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 10% de glicerol, pH 7.0

19. EGF_p7suc9.3: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 9.3% de sucrosa, pH 7.0

20. EGF_p7suc20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 20% de sucrosa, pH 7.0

21. EGF_p7tre9.3: 40 mg/mL panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 9.3% de trehalosa, pH 7.0

22. EGF_p7tre20: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 20% de trehalosa, pH 7.0

23. EGF_p7arg2.5: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 2.5% de arginina, pH 7.0

24. EGF_p7arg10: 40 mg/mL de panitumumab en 10 mM de fosfato de potasio, 10% de arginina, pH 7.0

25. EGF_A58N: 50 mM de acetato, 100 mM de cloruro de sodio, pH 5.8 (control)

26. EGF_A5S: 10 mM de acetato, 5% de sorbitol, pH 5.0 (control)

26. EGF_H58Suc: 50 mM de histidina, 1% de sucrosa, pH 5.8 (control)

La figura 11 muestra el monómero porcentual de panitumumab analizado mediante SE-HPLC como una función del pH (5 a 6) y una variedad de estabilizadores en regulador de pH ya sea de acetato o fosfato. Los resultados indican que cuando panitumumab se almacena a -30°C durante hasta un año el contenido de monómero no cambia significativamente. Las siguientes formulaciones fueron caracterizadas:

1. EGF_p5gly2.6: 10 mM de acetato, 2.6% de glicerol, pH 5.0

2. EGF_p5gly10: 10 mM de acetato, 10% de glicerol, pH 5.0

3. EGF_p5suc9: 10 mM de acetato, 9.3% de sucrosa, pH 5.0

4. EGF_p5suc20: 10 mM de acetato, 20% de sucrosa, pH 5.0

5. EGF_p5arg2.5: 10 mM de acetato, 2.5% de arginina, pH 5.0

6. EGF_p5A5S: 10 mM de acetato, 5% de sorbitol, pH 5.0

7. EGF_p55gly2.6: 10 mM de acetato, 2.6% de glicerol, pH 5.5

8. EGF_p55gly10: 10 mM de acetato, 10% de glicerol, pH 5.5

9. EGF_p55suc9.3: 10 mM de acetato, 9.3% de sucrosa, pH 5.5

10. EGF_p55suc20: 10 mM de acetato, 20% de sucrosa, pH 5.5

11. EGF_p55arg2.5: 10 mM de acetato, 2.5% de arginina, pH 5.5

12. EGF_p55A5S: 10 mM de acetato, 5% de sorbitol, pH 5.5

13. EGF_p6gli2.6: 10 mM de fosfato de potasio, 2.6% de glicerol, pH 6.0

14. EGF_p6gli10: 10mM de fosfato de potasio, 10% de glicerol, pH 6.0

15. EGF_p6suc9.3: 10 mM de fosfato de potasio, 9.3% de sucrosa, pH 6.0

16. EGF_p6suc20: 10 mM de fosfato de potasio, 20% de sucrosa, pH 6.0

17. EGF_p6arg2.5: 10 mM de fosfato de potasio, 2.5% de arginina, pH 6.0

18. EGF_p6A5S: 10 mM de fosfato de potasio, 5% de sorbitol, pH 6.0

La figura 12 muestra el porcentaje de monómeros de panitumumab analizado mediante SE-HPLC. Para esta caracterización, se incluyó panitumumab a 40 mg/mL y se almacenó a -30°C durante hasta un año en las diferentes formulaciones listadas y mostradas a continuación.

Nombre Regulador de pH Excipientes pH

A5G2.6 10 mM Na acetato 2.6% de glicerol 5.0

S5G2.6 10 mM de ácido succínico 2.6% de glicerol 5.0

G5G2.6 10mM de ácido glutámico 2.6% de glicerol 5.0

G2.6 Sin agente regulador de pH 2.6% de glicerol ~5.8

A57G2.6 10mM de acetato 2.6% de glicerol 5.7 A58N 50 mM de Na Acetato 100 mM de NaCl 5.8

Los resultados indican que el almacenamiento a -30°C durante más de 12 meses no dio como resultado ninguna diferencia significativa entre ninguna de las formulaciones anteriores. En este estudio, el efecto de almacenamiento en recipientes de acero inoxidable (S) también se comparó con almacenamiento en botellas de polipropileno (P) como se muestra en la figura 12. No se pudo determinar ninguna diferencia observable entre estos dos recipientes. La figura 13 muestra el efecto de ciclos de congelación-descongelación y almacenamiento a -30°C en la formación de partículas de panitumumab. Las formulaciones caracterizadas se muestran abajo. Los resultados indican números de partícula aceptables para cada una de las formulaciones estudiadas.

Nombre Regulador de pH Excipientes

A5G2.6 10 mM Na acetato 2.6% de glicerol 5.0

S5G2.6 10 mM de ácido succínico 2.6% de glicerol 5.0

G5G2.6 10mM de ácido glutámico 2.6% de glicerol 5.0

G2.6 Sin agente regulador de pH 2.6% de glicerol ~5.8

A57G2.6 10mM de acetato 2.6% de glicerol 5.7

A58N 50 mM de Acetato de sodio 100 mM de NaCl 5.8

A lo largo de esta solicitud se han mencionado varias publicaciones dentro de paréntesis.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación, caracterizada porque comprende un regulador de pH de ácido acético, un regulador de pH de ácido glutámico o un regulador de pH de ácido succínico con un pH de entre 4.5-5.5, por lo menos un excipiente que comprende un azúcar o un poliol, y una cantidad efectiva de un anticuerpo terapéutico que tiene actividad de unión específica al receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR), en donde el anticuerpo terapéutico conserva al menos aproximadamente 80% de estabilidad durante hasta dos meses en solución, y en donde el anticuerpo humano es panitumumab.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el regulador de pH comprende una sal sodio de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico.

3. La formulación de la reivindicación 1, en donde dicho ácido o sal de ácido acético, dicho ácido o sal de ácido glutámico o dicho ácido o sal de ácido succínico se encuentra a una concentración de 1-50 mM.

4. La formulación de la reivindicación 3, en donde dicho ácido o sal de ácido acético, dicho ácido o sal de ácido glutámico o dicho ácido o sal de ácido succínico se encuentra a una concentración de 5-10 mM.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pH es de 4.8-5.2.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el azúcar o poliol es glicerol, sucrosa, trehalosa o sorbitol.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el glicerol, sucrosa, trehalosa o sorbitol está en una concentración de 1-20%.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el glicerol está en una concentración de 2.6%.

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la sucrosa está en una concentración de 9.3% o 20%.

10. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la trehalosa está en una concentración de 9.3% o 20%.

11. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el sorbitol está en una concentración de 5%.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un agente tensioactivo.

13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente tensioactivo comprende un polisorbato.

14. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente tensioactivo está en una concentración de 0.001-0.10% (p/v).

15. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un segundo excipiente.

16. La formulación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el segundo excipiente se selecciona del grupo que consiste en un regulador de pH, estabilizador, agente de tonicidad, agente de volumen, agente tensioactivo, crioprotector, lioprotector, antioxidante, ión metálico, agente quelante y conservador.

17. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo terapéutico está en una concentración de 10-200 mg/ml.

18. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo terapéutico está en una concentración de 20 mg/ml.

19. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende 10 mM de regulador de pH de ácido glutámico que tiene un pH de 4.8-5.2, por lo menos un excipiente que comprende alrededor de 2.6% de glicerol y una cantidad efectiva de panitumumab, en donde el panitumumab conserva al menos aproximadamente 80% de estabilidad durante hasta dos meses en solución.

20. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende además 0.004% de polisorbato 80.