UA115789C2 - Композиція антитіла до cd105 та її застосування - Google Patents

Композиція антитіла до cd105 та її застосування Download PDF

Info

Publication number
UA115789C2
UA115789C2 UAA201501709A UAA201501709A UA115789C2 UA 115789 C2 UA115789 C2 UA 115789C2 UA A201501709 A UAA201501709 A UA A201501709A UA A201501709 A UAA201501709 A UA A201501709A UA 115789 C2 UA115789 C2 UA 115789C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibodies
antibody
cells
composition
cancer
Prior art date
Application number
UAA201501709A
Other languages
English (en)
Inventor
С'юзанн Бенедікт
Марк Корнелл Меннінґ
Браян М. Мерфі
Шарон Ріал
Чарлз Тейер
Original Assignee
Трейкон Фармасутікалз, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Трейкон Фармасутікалз, Інк. filed Critical Трейкон Фармасутікалз, Інк.
Publication of UA115789C2 publication Critical patent/UA115789C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Abstract

Винахід стосується композиції, що містить від приблизно 25 до приблизно 100 мг/мл антитіла до CD105, від 10 до 20 мМ буферного агента, до приблизно 240 мМ поліолу та рН від приблизно 4,0 до приблизно 5,5; де буферним агентом є ацетат, гістидин або фосфат, де поліол є цукром, і де композиція підтримує стабільність та ефективність антитіла до CD105. Також винахід стосується заздалегідь наповненого шприца, придатного для внутрішньовенного або інтравітреального введення, що включає дану композицію, та застосування композиції у формуванні лікарського засобу для лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом.

Description

Комплезиції зиумтів та їх застосування
Модель регулювання зигіогенезу з даепоматою СНО (ноги яке ТОВ ї ТО і і
ТО ТЕ.
А с . Ко їм її т Ге
Ж 7 чі з ї : Н
Б. Ж ; Ж и ке в ПК дише ше чин шйсю т
Ве НЕ прерії «віг. 2
І0О001) Ця заявка містить перелік послідовностей, який був представлений у форматі АЗСІЇ з допомогою програмного додатку ЕЕ5-Умеб та є включеним сюди у вигляді посилання в повному обсязі. Зазначена копія АЗСІЇ, створена 4 вересня 2013 р., отримала назву 35882-714.601 5І ЩІ та має розмір 22121 байт.
Ї0002| Рак є другою головною причиною смерті людини після серцево-судинних захворювань, та кожен рік мільйони людей вмирають від цієї хвороби. Тільки у Сполучених
Штатах кожного року рак викликає смерть значно більш, ніж півмільйона осіб разом з появою приблизно 1,4 мільйонів нових встановлених випадків цього захворювання. У той час, як кількість смертельних випадків від серцево-судинних захворювань значно скорочується, кількість смертей від раку звичайно зростає, та у багатьох країнах рак вже є головною причиною смерті.
І0О003) Крім того, загальний досвід навіть тих хворих на рак, якім спочатку вдалося вижити після первинної стадії захворювання, показав, що їх життя різко змінилося. Багато хворих на рак відчувають сильні побоювання, обумовлені усвідомленням можливості повторення хвороби або невдалого лікування. Також багато хворих на рак після лікування відчувають значне фізичне виснаження. (0004) Взагалі кажучи, основною проблемою у лікуванні найбільш смертоносних видів раку є відсутність ефективної та нетоксичної системної терапії. Рак є складним захворюванням, що характеризується наявністю генетичних мутацій, які призводять до неконтрольованого росту клітин. Ракові клітини є присутніми у всіх організмах, та в нормальних умовах їх надмірний ріст жорстко регулюється різними фізіологічними факторами. (0005) Ангіогенез є фізіологічним процесом, при якому з вже існуючих судин розвиваються нові кровоносні судини. Припускають, що ангіогенез відіграє важливу роль у розвитку як нормальних, так і патологічних процесів. Наприклад, ангіогенні процеси є залученими до розвитку судинних систем тваринних органів та тканин. 0006) У разі виникнення деяких патологічних станів стимулювання ангіогенезу є засобом забезпечення належного постачання крові та поживних речовин до клітин всередині ураженої тканини. Багато з цих патологічних станів охоплюють проліферацію та/або регулювання аберантних клітин. Солідні види раку та ексудативна дегенерація жовтої плями залежать від задіяння нового кровопостачання для подовження росту, а також утворення метастазу.
ІЇ0007| Заявленим винаходом створені нові композиції анти-СО105 антитіл, попередньо заповнені шприці, які містять ці композиції та застосування цих композицій у лікуванні пов'язаних з ангіогенезом розладів. Заявленим винаходом створені композиції, які можуть бути застосовані для внутрішньовенного або внутрішньоочного введення, наприклад, для лікування пов'язаних з СО105 онкологічних захворювань та офтальмологічних станів. 0008) У одному аспекті передбачено композицію, яка містить приблизно 1-150 мг/мл анти-
СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту, до приблизно 100 мМ буферизуючого агента, до приблизно 1 М поліолу, та має рН у межах приблизно 4,0-7,5. 0009) У одному аспекті, композиція в процесі отримання є стійкою речовиною, яку можна піддати перевірці з допомогою загальноприйнятних засобів. Щодо стійкості композиції протягом часу, то принаймні 9595 анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту може знаходитися у вигляді мономерів протягом принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-8"С, як було виміряно шляхом ексклюзійної хроматографії (ЗЕС). У деяких втіленнях буферизуючим агентом такої композиції є гістидин або фосфатно-сольовий буфер. Також щодо стійкості композиції протягом часу слід зазначити, що принаймні 9095 анти-
СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту може знаходитися у вигляді мономерів протягом принаймні приблизно б-місячного зберігання при температурі приблизно 25"С, як було виміряно ексклюзійної хроматографії (ЕС). У деяких втіленнях буферизуючим агентом таких композицій є ацетат. 00101) Крім того, анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент виявляє приблизно 50-15095 зв'язування в результаті СО105 ІФА перевірки на зв'язувальну властивість після зберігання при температурі приблизно 2-8"С протягом принаймні 12 місяців.. 00111) Середня ізоелектрична точка (рі) анти-СО105 антитіла може дорівнювати приблизно 8.7-9.2 після принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-87С, як було визначено, шляхом наприклад, капілярного електрофорезу-ізоелектричного фокусування.
І0012| Будь-якому фахівцю буде зрозуміло, що анти-СО105 антитіло або його антиген- зв'язуючий фрагмент може зберігати стійкість протягом принаймні приблизно 12 місяців, принаймні приблизно 18 місяців, принаймні приблизно 24 місяців, принаймні приблизно 30 місяців, принаймні приблизно 36 місяців або більше. бо 0013) Композиція може містити принаймні 9595 анти-СО105 антитіл у вигляді мономерів, як було виміряно шляхом 5ЕС під час циклів заморожування-відтавання цієї речовини.
Альтернативним чином або додатково композиція може містити принаймні 9595 анти-СО105 антитіл у вигляді мономерів, як було виміряно шляхом 5ЕС при їх струшуванні. (0014) Анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент може містити будь-яку послідовність, яка має СОК-ділянки, здатні до зв'язування з СЮО105. У одному необмеженому втіленні анти-СО1О5 антитіло містить легколанцюгову змінну ділянку (Мі), яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮ Мо: 1; легколанцюгову сталу ділянку (Сі), яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕО ІЮО Ме: 2; важколанцюгову змінну ділянку (Мн), яка має амінокислотну послідовність, позначену як БЗЕО ІЮ Мо: 3; та сталу ділянку (Ес), яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Ме: 4 (Див., наприклад, Фіг. 1). 0015) У іншому необмеженому втіленні анти-СО105 антитіло містить ділянку Мі СОК'І, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕ ІО Мо: 5; ділянку Мі СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕ ІО Мо: б; ділянку Мі СОКЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕБО ІО Мо: 7; ділянку Мн СОКІ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕБО ІО Мо: 8; ділянку Мн СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮО Мо: 9; та ділянку Мн СОКЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як БЕО ІЮО Мо: 10.
ІО016| Виділені гуманізовані, деімунізовані анти-СО105 антитіла можуть містити важколанцюгову змінну ділянку, як має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮО Мо: 11 та легколанцюгову змінну ділянку, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮ
Мо: 12. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих важких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності «ЕО ІЮ МоМо: 13, 14, 15 та 16. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих легких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності
ЗЕО ІЮО МоМо: 17, 18, 19, 20, 21, 22, та 23. Ці послідовності наведені нижче у Прикладі 17.
І0017| Композиція може містити приблизно 1-150 мг/мл анти-СО105 антитіл або їх антиген- зв'язуючих фрагментів або будь-яку їх кількість, включаючи, але без обмеження приблизно 2 мг/мл, приблизно 5 мг/мл, приблизно 7.5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно
Ко) 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 95 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 105 мг/мл, приблизно 110 мг/мл, приблизно 115 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 125 мг/мл, приблизно 130 мг/мл, приблизно 135 мг/мл, приблизно 140 мг/мл, приблизно 145 мг/мл, приблизно 150 мг/мл або більше. 0018) У одному втіленні композиція містить приблизно 25 мг/мл анти-СО105 антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів. 0019) У іншому втіленні композиція містить приблизно 50 мг/мл анти-СО105 антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів. 00201 У іншому втіленні композиція містить приблизно 100 мг/мл анти-СО105 антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів
ІЇ0021| Композиції, подібні описаним тут можуть містити буферизуючий агент, як-то, наприклад, гістидин, ацетат, цитрат або фосфат. У одному втіленні композиція містить приблизно 5 мМ, приблизно 7.5 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 12.5 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 17.5 мМ, 20 мМ, приблизно 22.5 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 50 мМ, приблизно 55 мМ, приблизно 60
ММ, приблизно 65 мМ, приблизно 70 мМ, приблизно 75 мМ, приблизно 80 мМ, приблизно 85 мМ, приблизно 90 мМ, приблизно 95 мМ або приблизно 100 мМ гістидину, ацетату, цитрату або фосфату. (0022) Композиції можуть бути отримані для будь-якого відомого для антитіл типу введення, які охоплюють, але без обмеження, ін'єкцію у склоподібне тіло та внутрішньовенне введення. 0023) Створені тут композиції можуть додатково містити прийнятний носій або наповнювач, включаючи будь-який носій або наповнювач, який є фармацевтично прийнятним носієм або наповнювачем та який є прийнятним для введення пацієнту. 0024) У одному втіленні передбачена тут композиція є ізотонічною. Термін "ізотонічний" означає, що інтересуюча композиція має по суті такий саме осмотичний тиск, як і людська кров.
Головним чином ізотонічні композиції мають осмотичний тиск приблизно 250-350 міліосмолей (мОсм). Ізотонічність можна виміряти з застосуванням газопарових або кріоскопічних осмометрів. Наприклад. у іншому втіленні, передбачена там композиція є гіпертонічною. Якщо "Іізотонічна" композиція є такою, що має по суті такий саме осмотичний тиск, як і людська кров, 60 то, відповідно, термін "гіпертонічна" застосовують для описання композиції, осмотичний тиск якого перевищує осмотичний тиск людської крові. (0025) Передбачена тут композиція може містити поліол з концентрацією, меншою, ніж 1 М.
Наприклад, композиція може містити поліол з концентрацією приблизно 50 мМ, приблизно 75
ММ, приблизно 100 мМ, приблизно 150 мМ, приблизно 200 мМ, приблизно 225 мМ, приблизно 240 мМ, приблизно 250 мМ, приблизно 300 мМ, приблизно 350 мМ, приблизно 400 мМ, приблизно 450 мМ, приблизно 500 мМ, приблизно 550 мМ, приблизно 600 мМ, приблизно 650
ММ, приблизно 700 мМ, приблизно 750 мМ, приблизно 800 мМ, приблизно 850 мМ, приблизно 900 мМ, приблизно 950 мМ, приблизно 1 М або яка дорівнює будь-якому цілому числу у цих межах. У одному втіленні ізотонічну композицію отримують з сіллю з концентрацією приблизно 100-175 мМ, наприклад, композицію, яка містить менш, ніж 300 мМ поліолу отримують у ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 130 мМ. 0026) У одному аспекті, поліол для застосування у передбачених тут композиціях може бути цукром, як-то, наприклад, невідновлювальним цукром. Типові приклади невідновлювальних цукрів охоплюють, але без обмеження, трегалозу та цукрозу. Наприклад, композиція може містити приблизно 200 мМ - 300 мМ трегалози або цукрози. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ трегалози або цукрози.
І0027| Альтернативним чином, цукор може бути сорбітом у кількості (з концентрацією) приблизно 200-300 мМ. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ сорбіту.
І0028| Додатковими необмеженими прикладами передбаченої тут композиції є будь-які з композицій 1-39 у Таблиці 1.
І0029| Передбачена тут композиція може мати рН приблизно 4,0-7,5. У одному втіленні передбачена тут композиція може мати рН приблизно 4.5, приблизно 5.0, приблизно 5.5, приблизно 6.0, приблизно 6.5 або приблизно 7.0.
І00ОЗ30) У одному втіленні створені тут композиції не містять поверхнево-активну речовину, але вибірково, у деяких випадках, поверхнево-активна речовина може бути включеною до складу композицій. Необмежені приклади поверхнево-активних речовин охоплюють полісорбат 20, полісорбат 80 та Ріпгопіст Е68.
ІЇ0031| Також винаходом передбачено попередньо наповнений шприц, прийнятний для внутрішньовенного введення або введення у скловидне тіло, який містить описану тут
Зо композицію. Такі попередньо наповнені шприці можуть бути запакованими та обладнаними маркуванням для застосування у лікуванні пов'язаного з ангіогенезом стану, як-то будь-якого з описаних тут станів. Також пакування можуть містити інструкції по зберіганню та застосуванню.
Також передбачено пакування, яке містить один або декілька попередньо заповнених шприців, прийнятних для внутрішньовенного введення або до введення у скловидне тіло, що містять композиція за будь-яким з попередніх пунктів.
ІЇ0032| Одне втілення цієї заявки передбачає застосування будь-якої з описаних тут композицій для отримання лікарського препарату для лікування описаних тут розладів. Лікарські препарати можуть бути отримані у залежності від фізичних характеристик пацієнта/суб'єкта, який потребує лікування та можуть бути отримані у вигляді однієї або декількох композицій.
Лікарські препарати можуть бути запакованими у прийнятне пакування з відповідним маркуванням для розподілу у клініки та лікарні, яке містить вказівки по лікуванню розладу у суб'єкта. Лікарські препарати можуть бути запакованими у вигляді однієї або декількох одиниць.
Також пакування може містити інструкції по дозуванню та застосуванню описаних тут композицій.
ІЇ0033| Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом у пацієнта (суб'єкта), який потребує такого лікування, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції. Такі композиції можуть бути введені пацієнту або внутрішньовенно або шляхом введення у скловидне тіло. 0034) Описані тут захворювання, пов'язані з ангіогенезом можуть бути, наприклад, раком або метастазами. У одному втіленні рак є твердою пухлиною. Прийнятні для лікування види раку охоплюють, наприклад, пухлини на основі епітеліальної тканини.
Необмежені прийнятні для лікування приклади захворювань на рак охоплюють, але без обмеження, рак легенів, гінекологічні злоякісні хвороби, меланому, рак молочної залози, рак підшлункової залози, рак яєчника, рак матки, рак товстої кишки, рак передміхурової залози, рак нирок, рак голови, рак підшлункової залози, рак печінки (гепатоцелюлярний рак), рак шиї, рак нирок (нирково-клітинний рак), саркому, мієлому та лімфому. Композиції для лікування раку або метастазів можуть бути введені пацієнту внутрішньовенно.
І0035| Альтернативним чином, описане тут пов'язане з ангіогенезом захворювання може бути, наприклад, офтальмологічним станом. Офтальмологічні стани охоплюють, але без 60 обмеження, вікову макулодистрофію, діабетичну ретинопатію, макулярний набряк та/або хоріоїдальну неоваскуляризацією Вікова макулодистрофія може сухою та вологою. Композиції для лікування офтальмологічного стану можуть бути введені пацієнту у скловидне тіло. 0036) З допомогою таких способів композицію можна вводити пацієнтові один або більше разів. Наприклад, композицію можуть вводити раз на день, раз на тиждень, раз на місяць, раз на два місяці, раз на два місяці, раз на три місяці, раз на чотири місяці, через кожні 5 місяців або раз на 6 місяців. Схеми лікування можуть бути збільшені або зменшені в разі необхідності в залежності від реакції пацієнта на лікування.
І0037| У одному аспекті композицію вводять аж до усунення однієї або декількох ознак або симптомів пов'язаного з ангіогенезом захворювання.
І0038)| Щодо офтальмологічних станів, то одна або більше ознак або симптомів таких станів може охоплювати, але без обмеження, пов'язане з очної хворобою скорочення кровоносних судин, пригнічення проліферації ендотеліальних клітин, чіткі ознаки або симптоми кровотечі, лікування помутніння зору, забезпечення затримки втрати зору, поліпшення зору, підвищення гостроти зору, зменшення макулярного набряку та/або запобігання витоку кровоносних судин.
І0039| Відносно раку або метастазів слід зазначити, що лікування може привести до покращення стану пацієнта та його результати можна оцінити шляхом визначення появи одного або декількох наступних факторів, як-то зниження клітинної проліферації, зниження кількості клітин, збільшення апоптозу або зниження виживання принаймні частини клітин, уражених клітинним проліферативним розладом.
ІЇ0040| Лікування може привести до часткового або до повного усунення пухлин або метастазів та/(або до подовження строку життя пацієнта.
ІЇ0041| У одному втіленні після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції тривалість або суворість однієї або декількох ознак або симптомів скорочується приблизно на 296, приблизно на 595, приблизно на 1095, приблизно на 1595, приблизно на 2095, приблизно на 2595, приблизно на 3095, приблизно на 3595, приблизно на 4095, приблизно на 4595, приблизно на 5095, приблизно на 5595, приблизно на 6095, приблизно на 6595, приблизно на 7095, приблизно на 7595, приблизно на 8095, приблизно на 9095, приблизно на 9595 або приблизно на 10096.
І0042| У іншому втіленні після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції тривалість або суворість однієї або декількох ознак або симптомів скорочується приблизно у 2 рази, приблизно у 5 разів, приблизно у 10 разів, приблизно у 15 разів, приблизно у 20 разів, приблизно у 25 разів, приблизно у 30 разів, приблизно у 35 разів, приблизно у 40 разів, приблизно у 45 разів, приблизно у 50 разів, приблизно у 55 разів, приблизно у 60 разів, приблизно у 65 разів, приблизно у 70 разів, приблизно у 75 разів, приблизно у 80 разів, приблизно у 90 разів, приблизно у 95 разів, приблизно у 100 разів або більше.
І0043| Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування офтальмологічного стану у пацієнта, який того потребує, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого одна або декілька ознак або симптомів зазначеного офтальмологічного стану покращуються шляхом лікування. Введення композиції також може бути здійснено у скловидне тіло. (0044) Також заявленим винаходом передбачено спосіб запобігання або лікування раку або метастазів у суб'єкта, який цього потребує, який полягає у введенні пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого виникає покращення однієї або декількох ознак або симптомів вказаного раку або метастазів. Введення композиції може бути внутрішньовенним. 00451 У передбачених тут способах призначений для лікування суб'єкт може бути людиною або твариною. Створені тут композиції можуть бути введені один або багато разів залежно від стану здоров'я пацієнта, розвитку захворювання або стану та від ефективності лікування.
Відповідні узгодження в ході терапії та лікування можуть бути здійснені впродовж курсу лікування (наприклад, шляхом змінення дозування антитіл у композиції).
І0046| Заявленим винаходом передбачено спосіб моніторингу ефективності одного або кількох з будь-яких передбачених тут способів. Рівні розчинного СО105 корелюють з виживанням пацієнтів, хворих на рак та можуть піддані моніторингу перед та протягом терапії, отже вони можуть бути свідченням того, що терапевтичний режим є ефективним для лікування пацієнта. Процедури, описані тут, можуть включати в себе один або більше додаткових етапів лікування.
Включення шляхом посилання. (00471) Всі зазначені у цій заявці публікації, патенти та патентні заявки включені сюди у вигляді посилання в такій саме мірі, як якщо б кожна окрема публікація, патент або заявка на патент була 6 конкретно та індивідуально зазначена включеною шляхом посилання. (516)
Стислий опис фігур. (0048) Нові ознаки втілень докладно наведені у доданій Формулі Винаходу. Краще розуміння особливостей та переваг цих втілень може бути отримано шляхом посилання на подальший докладний опис, який містить ілюстративні втілення, у яких застосовано принципи втілень та доданими кресленнями, у яких: 00491 У Фіг. 1А-) наведені зразкові амінокислотні послідовності описаного тут анти-СО0105 антитіла (ТКС105). У Фіг. 1А наведено послідовність типового змінного легкого (МІ) ланцюга анти-СО105 антитіла (ЗЕО ІЮО Мо: 1); у Фіг. 18 наведено послідовність типового сталого легкого ланцюга (СІ) анти-СО105 антитіла (5ЕО ІЮ Мо: 2); у Фіг. 1С наведено послідовність типового змінного важкого (МН) ланцюга анти-СО105 антитіла (ЗЕО ІЮ Мо: 3); та у Фіг. 10 наведено послідовність типового сталого гамма-1 важкого ланцюга анти-СО105 антитіла (5ЕО ІО Ме: 4). У
Фіг. 1Е-С, відповідно, наведені СОК 1, 2 та З типового змінного легкого (МІ) ланцюга. У Фіг. 1Н-
У, відповідно, наведені СОК 1, 2 та З типового змінного важкого (УН) ланцюга.
ІОО5ОІ У Фіг. 2 наведено діаграму шляху сигналування ТОЕ-В/"АСКЬ. Шлях ТОЕ-Д/АЇ К5 (А) веде до пригнічення клітинної проліферації. Шлях ТОЕ-ДВ/АЇКІ (В) викликає проліферацію ендотеліальних клітин та потребує наявності СО105 (ендогліну) для сигналування АЇКІ1.
Пунктирними лініями позначені неактивні або заблоковані шляхи. Напівжирна стрілка вказує на стимулювання шляху сигналування.
ЇОО51| Слід розуміти, що застосована у цьому документі термінологія наведена з метою опису лише певних втілень та не призначена для обмеження. Крім того, слід розуміти, що у практичному втіленні цих винаходів можуть бути застосовані численні способи та матеріали, які є подібними до описаних тут. 00521) У відповідності з цією заявкою також можуть бути застосовані способи звичайної клітинної біології, молекулярної біології, мікробіології та застосування рекомбінантних ДНК, як повністю описано у цій галузі.
І0053| Як застосовано у цій заявці та у доданій Формулі Винаходу, одиничні значення можуть охоплювати також посилання на множину, якщо тільки у контексті ясно не зазначено іншого. Отже, наприклад, посилання на "спосіб" охоплює один або декілька способів та/або етапів описаного тут типу та/або які стануть очевидними для фахівців в даній галузі після
Зо читання цієї заявки. (0054) Анти-СО105 антитіла можуть бути застосовані для лікування або запобігання різних форм розладів, пов'язаних з ангіогенезом. Тут описані способи лікування різних форм раку, твердих пухлин, метастазів тощо шляхом введення описаних тут композицій. 0055) Як тут застосовано, термін "антитіло" має відношення до імуноглобуліну (Ід), який є природним або частково або повністю має синтетичне походження. Термін також охоплює будь- який поліпептид або білок, який має зв'язувальний домен, який є антиген-зв'язуючим доменом або є гомологічним цьому домену. Термін також охоплює "антиген-зв'язувальні фрагменти" та інші взаємозамінні терміни для позначення подібних зв'язувальних фрагментів, як-то описані нижче.
ІЇ0О56| Нативні антитіла та нативні імуноглобуліни звичайно є гетеротетрамерними глікобілками розміром приблизно у 150,000 Да, які складаються з двох ідентичних легких (І) ланцюгів та двох ідентичних важких (Н) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг звичайно є приєднаним до важкого ланцюга з допомогою одного ковалентного дисульфідного зв'язку, тоді як число дисульфідних зв'язків варіює серед важких ланцюгів різних ізотипів імуноглобуліну. Кожен важкий та легкий ланцюг також має регулярно розташовані всередині дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має на одному кінці змінний домен ("Ун' або "МН"), за яким знаходиться кілька сталих доменів ("Сн або "СН"). Кожен легкий ланцюг має на одному кінці змінний домен (Мі" або "МІУ та сталий домен (Сі" або "СІ У на іншому кінці, сталий домен легкого ланцюга є вирівняним з першим сталим доменом важкого ланцюга та змінний домен легкого ланцюга є вирівняним зі змінним доменом важкого ланцюга. Вважається, що окремі амінокислотні залишки утворюють поверхню поділу між легко- та важколанцюговим змінними доменами.
ІЇ0057| Як тут застосовано, терміни "синтетичний полінуклеотид, "синтетичний ген" або «синтетичний поліпептид, означають, що відповідна полінуклеотидна послідовність або її частина або амінокислотна послідовність або її частина є отриманою з послідовності, розробленої або синтезованої де помо або зміненою порівняно до еквівалентної послідовності природного походження. Синтетичні полінуклеотиди (антитіла або антиген-зв'язуючі фрагменти) або синтетичні гени можуть бути отримані з допомогою відомих у цій галузі способів, включаючи, але без обмеження, хімічний синтез нуклеїнових кислот або амінокислотних послідовностей. Синтетичні гени звичайно відрізняються від генів природного походження на 60 амінокислотному або на полінуклеотидному рівні (або на обох рівнях) та, як правило,
розташовані у контексті синтетичних послідовностей, контролюючих експресію. У порівнянні з природним геном, полінуклеотидні послідовності синтетичного гена не обов'язково кодують білки з різними амінокислотами. Наприклад, вони можуть також містити синтетичні полінуклеотидні послідовності, які включають різні кодони, але кодують ту ж саме амінокислоту (тобто нуклеотидні змінення, які являють собою "мовчазні "мутації на амінокислотному рівні). 0058) Щодо антитіл, то термін "змінний домен" має відношення до змінних доменів антитіл, які є залученими у зв'язуванні та мають відношення до специфічності кожного окремого антитіла до свого окремого антигену. Однак, мінливість є нерівномірно розподіленою по довжині змінних доменів антитіл, а скоріше, вона є сконцентрованою у трьох сегментах, які мають назву гіперзмінних ділянок (також відомі як СОК) в обох змінних доменах легкого та важкого ланцюга.
Набагато більш консервативні частини змінних доменів отримали назву "каркасних ділянок" або "ЕК." Кожен зі змінних доменів немодифікованих важкого та легкого ланцюгів містить чотири ЕК (ЕКТ1, ЕК2, ЕКЗ та БЕМК4), в основному приймаючих бета-листову конфігурацію, яка перемежається з трьома СОК, які утворюють петлі, що з'єднують та, у деяких випадках, складають частину бета-листової структури. СОК у кожному ланцюзі утримуються разом в безпосередній близькості від ЕК та, разом з СОК з іншого ланцюга, сприяють утворенню антиген-зв'язуючої ділянки антитіла (див. Кабаї еї аіІ., 5едиепсевз ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї!
Іп'єге5і (Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору"), Бій Ед. Рибіїс Неакй Зегмісе,
Маїогпаї Іпзійшез ої Неаци, Веїпезаа, Ма. (1991), раде5 647-669).
ІЇ0059| Застосовані тут терміни "гіперзмінна ділянка" та "СОК'" мають відношення до амінокислотних залишків антитіл, відповідних за зв'язування з антигеном. СОЖК містять амінокислотні залишки з трьох послідовностей ділянок, які комплементарно зв'язуються з антигеном та відомі під назвами СОКІ, СОК2, та СОКЗ для кожного з Мн та Мі ланцюгів.
Звичайно ділянки СОК у змінному домені легкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 24-34 (СОВІ 1), 50-56 (СОКІ2) та 89-97 (СОКІ 3) та ділянки СОК у змінному домені важкого ланцюга звичайно приблизно відповідають залишкам 31-35 (СОВНІ), 50-65 (СОКНЗ) та 95-102 (СОКНУЗ) (згідно з КаБбаї єї аІ., Зедиепсе5 ої Ргоївїп5 ої Іттипоїіодіса! Іпіеге5і (Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору"), Бій Ей. Рибіїс Неакй бегмісе, Маїйопаї! Іпбійшев ої
Неакнй, Веїйпезаа, ма. (1991)). Зрозуміло, що ділянки СОК різних антитіл можуть містити вставки,
Зо отже нумерація амінокислот може відрізнятися. Система нумерації Кабаї враховує ці вставки з допомогою схеми нумерації, у якій застосовано букви, прикріплені до певних залишків (наприклад, 27А, 278, 27С, 270, 27Е, та 27Е у СОВІ 1 легкого ланцюга) для відображення будь- яких вставок у нумераціях між різними антитілами. Альтернативним чином, згідно до системи нумерації від Споїпіа апа І евзкК, У. Мої. Віої., 196: 901-917 (1987), звичайно ділянки СОК у змінному домені легксого ланцюга приблизно відповідають залишкам 26-32 (СОВІ1), 50-52 (СОКІ2) та 91-96 (СОКІЗ3) та ділянки СОК у змінному домені важкого ланцюга звичайно приблизно відповідають залишкам 26-32 (СОАВНТІ), 53-55 (СОКНЗ) та 96-101 (СОВНЗ).
ІЇ0О60| Як тут застосовано, "каркасна ділянка" або "РК" має відношення до каркасних амінокислотних залишків, які утворюють частину антиген-зв'язуючої кишені або щілини та амінокислотні залишки у петельній ділянці або можуть або не можуть контактувати з антигеном.
Звичайно каркасні ділянки містять ділянки, які розташовані між СОК. У змінному домені легкого ланцюга, ЕК-ділянки звичайно приблизно відповідають залишкам 0-23 (ЕВІ 1), 35-49 (ЕВІ 2), 57- 88 (ЕКІ 3) та 98-109 та у змінному домені важкого ланцюга ЕВ-ділянки звичайно приблизно відповідають залишкам 0-30 (ЕВНІ), 36-49 (ЕВНг), 66-94 (ЕКНЗ) та 103-133 (згідно з Кабаї еї аї.,
Зедиепсев5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіеге5і ("Послідовності білків, цікавих з імунологічної точки зору"), Бій Ей. Рибіїс Неайй Зегмісе, Майопаї! Іпзійшщевз ої Неанй, ВеїШПезаа, ма. (1991)). Як обговорювалося вище щодо нумерації Караї для легкого ланцюга, система нумерації Кабаї також подібним чином враховує вставки для важкого ланцюга (наприклад, З5А, 358 СОБЕНІ у важкому ланцюзі). Альтернативним чином, згідно до системи нумерації від Споївпіа апа І! езвк, 9.
Мої. ВіоІ., 196: 901-917 (1987), звичайно ЕК-ділянки у змінному домені легкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 0-25 (ЕВІ 1), 33-49 (ЕВІ 2) 53-90 (ЕРНІ 3), та 97-109 (ЕКІ 4) та звичайно ЕК-ділянки у змінному домені важкого ланцюга приблизно відповідають залишкам 0- 25 (ЕВНІ), 33-52 (ЕНН), 56-95 (ЕКНЗ), та 102-113 (ЕВНА).
ІОО61| Сталі домени (Бс) антитіл безпосередньо не залучені до зв'язування антитіл з антигеном, але вони часто демонструють різні ефекторні функції, як-то участь антитіл у залежній від антитіл клітинній токсичності шляхом взаємодії з, наприклад Ес-рецепторами (ЕСВ). Ес-домени також можуть збільшувати біодоступність антитіл у кровотоці після введення пацієнту. Заміщення мишачого Ес-домену Ес-доменом людини може також зменшити побічні
НАМА-реакції. 60 0062) У залежності від амінокислотної послідовності сталого домену своїх важких ланцюгів,
імуноглобуліни можуть бути розподілені на різні класи. Існує 5 головних класів імуноглобулінів:
ІЧА, дО, І9Е, Ідс, та ІДМ та деякі з них також додатково можуть бути розділені на підкласи (підтипи), наприклад, Іде, Ід2, дез, Ідс4, ІдДА1, та ІдДА2. Сталі домени важкого ланцюга (Ес), які відносяться до різних класів імуноглобулінів отримали, відповідно, назви с, б, є, у та дн.
Субодиничні структури та тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів є добре відомими.
ІЇ0063| Беручи за основу амінокислотні послідовності їх сталих доменів, "легкі ланцюги" антитіл будь-яких видів хребетних тварин можна віднести до одного із двох чітко відокремлених типів, які отримали назву каппа або ("к") та лямбда або (777).
І0064| Терміни "антиген-зв'язувальна частка антитіла," "антиген-зв'язуючий фрагмент," «"антиген-зв'язуючий домен," "фрагмент антитіла" або "функціональний фрагмент антитіла" тут застосовані взаємозамінне для позначення одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном. Необмежені приклади фрагментів антитіла, які охоплюються цими термінами охоплюють, але без обмеження, (і) фрагмент Раб, моновалентний фрагмент, який складається з доменів Мі, Мн, Сі та Сні; (ії) фрагмент К(аб)г, бівалентний фрагмент, який містить два фрагменти Раб, приєднані через дисульфідний місток до шарнірної ділянки; (ії) фрагмент Еа, який складається з доменів Мн та
Сні; (м) фрагмент Ем, який містить домени Мі та Мн у складі одного"плеча" антитіла, (м) фрагмент ЯАБ (Умага еї аї., (1989) Маїшге 341:544 546), який містить домен Мн; та (м) виділений
СОК. Додатково це визначення охоплює "половинні" антитіла, які містять одиничний важкий та одиничний легкий ланцюги та інші форми антитіл з одиничними ланцюгами, як-то діатіла.
ІЇ0065| Функціональні групи "Р(аб)»2" та "Бар" можуть бути отримані шляхом обробки імуноглобулінів протеазою, як-то пепсином та папаїном та містять фрагменти антитіл, отримані шляхом розщеплення імуноглобуліну поруч з дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів. Наприклад, папаїн розщеплює Ідс перед дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів з отриманням двох гомологічних фрагментів антитіла, у яких легкий ланцюг, що складається з Мі та Сі (легколанцюгова стала ділянка), та фрагмент важкого ланцюга, що складається з Мн та ділянки Снуї (у!) у сталій ділянці важкого ланцюга) є з'єднаними у С- кінцевих ділянках дисульфидним зв'язком.
Кожен з цих двох гомологічних фрагментів антитіла має назву ЕРар'. Пепсин розщеплює Ідс за дисульфідними зв'язками, розташованими між шарнірними ділянками у кожному з двох важких ланцюгів з отриманням фрагменту антитіла, трохи довшого, ніж фрагмент, у якому два зазначених вище фрагмента Рар'є з'єднаними у шарнірній ділянці. Цей фрагмент антитіла отримав назву Е(аб)». 0066) Фрагмент Раб також містить сталий домен легкого ланцюга та перший сталий домен (Сні) важкого ланцюга. Фрагменти Рар' відрізняються від фрагментів Раб додаванням кількох залишків на С-кінці домену Сні важкого ланцюга, включаючи один або декілька цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. Фрагмент Раб, у якому цистеїновий залишок(залишки) сталих доменів несуть вільну тіолову групу має у цьому документі назву Бар'-5Н.
І0067| Фрагменти антитіл Е(аб)2 спочатку були отримані у вигляді пар фрагментів Раб", які мають між ними шарнірні цистеїни. Також відомі інші хімічні поєднання фрагментів антитіл. "Рм' є фрагментом антитіла, який містить повний сайт впізнавання антигену та антиген- зв'язуючий сайт. Ця ділянка складається з димеру одного важкого ланцюга та одного змінного домену легкого ланцюга, щільно поєднаних нековалентним або ковалентним шляхом (дисульфідно зв'язаний Ем5 було описано у науковій літературі, див. Кейег еї аї. (1996) Маїиге
Віотесппоіоду 14:1239-1245). Він знаходиться у такій конфігурації, що три СОК кожного змінного домену взаємодіють для визначення антиген-зв'язуючого сайту на поверхні димеру Мн-Мі.
Сукупним чином, комбінація одного або декількох СОК з кожного Мн та Мі ланцюга наділяє антитіло антиген-зв'язуючою специфічністю. Наприклад, має бути зрозуміло, що у разі перенесення ланцюгів Мн та Мі реципієнта або їх антиген-зв'язуючих фрагментів однієї наявності СОКНЗ та СОМКІ З може бути достатньо для надання антитілу антиген-зв'язуючої специфічності та ці комбінації СОК можуть бути перевірені на зв'язування, спорідненість тощо з застосуванням будь-якого з описаних тут способів. Навіть одиничний змінний домен (або половина фрагменту Ем, яка містить тільки три специфічні для антигену СОК-ділянки) має здатність до впізнавання та зв'язування антигену, хоча скоріше він має нижчу спорідненість, ніж при поєднанні з другим змінним доменом. Крім того, хоча два домени фрагменту Ем (Мі та Мн) кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані з застосуванням рекомбінантних технологій через синтетичний лінкер, що дозволяє тримати їх у вигляді єдиного білкового 60 ланцюга, у якому ділянки Мі та Мн спаровуються з утворенням моновалентних молекул
(відомих, як одиничний ланцюг Ем (зсЕм); Віга еї аІ. (1988) 5сівпсе 242:423-426; Нивіоп еї аї. (1988) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 85:5879-5883; та О5роигп еї аї. (1998) Маї. Віоїесппої. 16:778).
Такі молекули 5сЕм також охоплюються терміном "антиген-зв'язуюча частина" антитіл. Для отримання векторів експресії, що кодують повні молекули Ід (наприклад, Ідс) або інших ізотопів, до Ес-ділянки КДНК або геномних послідовностей можуть бути приєднані будь-які послідовності
Мн- та Мі-специфічних 5сЕм. Послідовності Мн та Мі також можуть бути застосовані для отримання Раб, Ем або інших фрагментів дб з допомогою або хімії білків або способів рекомбінантної ДНК. (0068) "Одноланцюгові Ру" або "5Еу" фрагменти антитіл містять домени Мн та Мі антитіл, які знаходяться у одиничному поліпептидному ланцюзі. У деяких втіленнях поліпептид Ем додатково містить поліпептидний лінкер між доменами Мн та Мі, який дозволяє 5Ем утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. Огляд різних 5Ем, див., наприклад, у книзі Ріискійип
А. Те РПагтасоїоду ої Мопосіопа! Апіібодіе5 ("Фармакологія моноклональних антитіл"), Мої. 113, Возеприга апа Мооге еадв5. Зргіпдеї-Мепад, Мем ХОоїКк, рр. 269-315 (1994).
ІЇ0069| Термін "АМІМЕК"М" має відношення до класу терапевтичних білків людського походження, які не мають відношення до антитіл та фрагментів антитіл та складаються з декількох модулярних та багаторазових зв'язуючих доменів, позначених як А-домени (також позначених, як модуль класу А, повтор комплементарного типу або ІІ -рецепторний домен класу А). Також їх можна отримати з зовнішньоклітинних рецепторних доменів людини з допомогою фаг-дисплею або перемішування екзонів іп мійго (бімегптап еї аї., 2005, Маї.
Віоїесппої. 23:1493-1494; 5іїмегтап еї аї!., 2006, Маї. Віоїесппої. 24:220). Отримані білки можуть містити багато незалежних зв'язуючих доменів, які можуть демонструвати спорідненість (у деяких випадках, субнаномолярну) та специфічність, яка є підвищеною у порівнянні з білками, що зв'язують одиничний епітоп. Див., наприклад, патентні заявки США И.5. Раїепі Арріїсайоп
Рибі. МоМо. 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 та 2005/0089932, 2005/0048512, та 2004/0175756, кожну з яких повністю включено сюди шляхом посилання.
І0070| Кожен з відомих 217 А-доменів людини містить х35 амінокислот (4 кДа); та ці домени відокремлені лінкерами, які в середньому займають 5 амінокислот у довжину. Нативні
А-домени швидко та ефективно згортаються у однорідну та стійку структуру, яка насамперед є
Зо опосередкованою через зв'язування кальцію та утворення дисульфідних зв'язків. Ця загальна структура вимагає наявності консервативної скелетної характерної послідовності довжиною лише у 12 амінокислот. Кінцевим результатом є одиничний білковий ланцюг, який містить багато доменів, кожен з яких демонструє окрему функцію. Кожен домен білків незалежно зв'язується та енергетичні внески кожного домену є адитивними. Ці білки отримали назву авимерів (АМІМЕК "м" через авидність мультимерів.
І0071|) Термін "діатіла" має відношення до маленьких Фрагментів антитіл з двома антиген- зв'язуючими сайтами, які містять важколанцюговий змінний домен (УН), приєднаний до змінного домену легкого ланцюга (МІ) у складі того ж саме поліпептидного ланцюга (МН-М|). з допомогою лінкера, який є занадто коротким, щоб дозволити спарювання двох доменів на одному ланцюзі, внаслідок чого домени змушені спаровуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга та створювати два антиген-зв'язуючих сайти. Діатіла більш докладно описані у, наприклад, ЕР 404,097; МО 93/11161; та Ноїїїпдег еї а!., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90:6444 6448 (1993).
І0072| Антиген-зв'язуючі поліпептиди також містять важколанцюгові димери, як-то, наприклад, антитіла верблюдових та акул. Антитіла верблюдових та акул містять гомодимерну пару двох ланцюгів М-подібних та С-подібних доменів (та ніколи не мають легких ланцюгів).
Ділянка Мн важколанцюгового димеру дб верблюдових не може утворювати гідрофобні взаємодії з легким ланцюгом, оскільки ділянка важкого ланцюга, яка звичайно контактує з легким ланцюгом у них замінена гідрофільними амінокислотними залишками. Домени Мн важколанцюгового димеру (ДО отримали назву доменів Мнн. ІД-МАК акул містить гомодимер одного змінного домену (який отримав назву "домен М-МАКУ) та п'ять С-подібних сталих доменів (домени С-МАК). Різноманітність набору антитіл у верблюдових обумовлена наявністю СОК 1, 2 та З у ділянках Мн або Мнн. СОКЗ у ділянці Мнн верблюдових відрізняється відносно великою довжиною, яка сягає у середньому 16 амінокислот (МиуЇдегтапз еї аї., 1994, Ргоївїп Епдіпеегіпа 7(9): 1129) на відміну від ділянок СОКЗ антитіл багатьох інших видів, наприклад, СОКЗ мишачого домену Мн (довжиною у 9 амінокислот). Бібліотеки змінних ділянок антитіл тварин родини верблюдових, які зберігають свою різноманітність іп мімо можуть бути отримані, наприклад, з допомогою способів, наведених у патентній заявці США Ш.5. Раїепі Арріїсайоп 5ег.
Мо. 20050037421. 0073) "Химерні" форми антитіл іншого, окрім людини походження (наприклад, мишачих) бо охоплюють химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з Ід-імуноглобулінів тваринного походження. Здебільшого химерні антитіла є мишачими антитілами, у яких принаймні частка сталої ділянки імуноглобуліну (Ес), звичайно людського імуноглобуліну є вставленою замість мишачої Ес-ділянки. Більш детально див. допез еї аї., Майшге 321: 522-525 (1986); Веісптапп еї а!., Майте 332: 323-329 (1988); апа Ргевіа, Сшт. Ор. 5ігисі. Віо!., 2: 593-596 (1992). (0074) Як тут застосовано, термін "моноклональне антитіло" має відношення до антитіл, отриманих з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла у складі популяції є ідентичними, виключаючи можливі мутації, які трапляються в природі, що можуть бути присутніми у незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, оскільки вони спрямовані до одиничного антигенного сайту. Крім того, на відміну до композицій традиційних (поліклональних) антитіл, які можуть містити різні антитіла безпосередньо до різних сайтів зв'язування (епітопів), кожне моноклональне антитіло є спрямованим лише до одиничного сайту зв'язування антигена. Визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, отриманого з практично гомогенної популяції антитіл та не повинно бути тлумачено так, як вимагає отримання антитіла будь-яким певним способом. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути отримані з допомогою гібридомного способу, який першим описали Копіег еї аїЇ., Маїшге 256:495 (1975) або можуть бути отримані шляхом застосування технологій рекомбінантних ДНК (див., наприклад, Патент США ЦШ.5. Раї. Мо. 4,816,567). У деяких втіленнях моноклональні антитіла можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл з допомогою способів, описаних, наприклад, у Сіаскхоп еї аї., Маїшге 352:624-628 (1991) та Магк5 еї аї., 9. Мої. Віої. 222:581-597 (1991).
І0075| Антитіла можуть бути виділені та очищені з культурального супернатанту або згаданого вище асциту шляхом осадження насиченим сульфатом амонію, шляхом еуглобулінового висолювання, з допомогою способу з застосуванням капроевої кислоти, каприлової кислоти, іонообмінної хроматографії (ОЕАЕ або РЕ52) або афінної хроматографії з застосуванням анти-Ід колонки або колонки з білком А, о або Ї, як більш детально описано нижче. 0076) При конструюванні імуноглобулінової молекули, її змінні ділянки або частини можуть бути злиті, зв'язані або іншим чином приєднані до однієї або до декількох її сталих ділянок або частин для отримання будь-якого з описаних тут антитіл.. Це може бути досягнуто з допомогою різних відомих у цій галузі способів, в тому числі, але без обмеження, способів молекулярного клонування або прямого синтезу нуклеїнових кислот, які кодують молекули.
І0077| Як тут застосовано, термін "імунореактивний" має відношення до зв'язуючих агентів, антитіл або їх фрагментів, які є специфічними до послідовності амінокислотних залишків ("сайт зв'язування" або "епітоп"), навіть якщо вони є перехресно-реактивними до інших пептидів/білків та які є нетоксичними у кількостях, у яких їх отримують для введення людині. Термін "зв'язування" має відношення до безпосереднього з'єднання двох молекул з допомогою, наприклад, взаємодій, опосередкованих ковалентним, електростатичним, гідрофобним, іонним та/або водневим зв'язком у фізіологічних умовах та включаючи такі взаємодії, як сольові та водні містки та будь-які інші звичайні засоби зв'язування. Термін "переважно зв'язує" означає, що зв'язуючий агент зв'язується з сайтом зв'язування з більшою спорідненістю, ніж він зв'язується зі сторонніми амінокислотними послідовностями. Спорідненість може бути принаймні у 1 рази більшою, принаймні у 2 рази більшою, принаймні у З рази більшою, принаймні у 4 рази більшою, принаймні у 5 разів більшою, принаймні у б разів більшою, принаймні у 7 разів більшою, принаймні у 8 разів більшою, принаймні у 9 разів більшою, у 10 разів більшою, принаймні у 20 разів більшою, принаймні у 30 разів більшою, принаймні у 40 разів більшою, принаймні у 50 разів більшою, принаймні у 60 разів більшою, принаймні у 70 разів більшою, принаймні у 80 разів більшою, принаймні у 90 разів більшою, принаймні у 100 разів більшою або принаймні у 1000 разів більшою, ніж спорідненість зв'язуючого агенту до сторонніх амінокислотних послідовностей. Терміни "імунореактивний" та "переважно зв'язує" тут застосовано взаємозамінне. 0078) Як тут застосовано, термін "спорідненість" має відношення до константи рівноваги для оборотного зв'язування двох агентів та є вираженою у вигляді Ка. Спорідненість зв'язувального білка до ліганда, як-то спорідненість антитіла для епітопу може дорівнювати, приблизно 100-0.1 наномолей (нМ), приблизно 100 нМ - 1 пікомоль (ПМ) або приблизно 100 пМ - 1 фемтомоль (фМ). Як тут застосовано, термін "авидністьї має відношення до стійкості комплексу двох або більше агентів до дисоціації після розведення. Виявлені спорідненості можуть бути визначені з допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) або будь-якого іншого способу, відомого будь-якому фахівцю у цей галузі. Значення авидностей можуть бути 60 визначені з допомогою, наприклад, аналізу Скетчарда або будь-якого іншого способу, відомого будь-якому фахівцю у цей галузі.
І0079| "Епітоп' має відношення до частини антигену або іншої макромолекули, здатної утворювати зв'язувальну взаємодію зі змінною ділянкою зв'язувальної кишені антитіла. Такі зв'язувальні взаємодії можуть проявлятися у вигляді міжмолекулярного контакту з одним або декількома амінокислотними залишками однієї або декількох СОК-ділянок. Зв'язування антигену може охоплювати, наприклад, СОКЗ або пару СОКЗ або, у деяких випадках може охоплювати взаємодії, до яких залучено до шести СОК-ділянок ланцюгів Мн та Мі. Епітоп може бути лінійною пептидною послідовністю (тобто бути "безперервним") або може складатися з несуміжних амінокислотних послідовностей (тобто бути "конформаційним' або "переривчастим"). Антитіло може впізнавати одну або декілька амінокислотних послідовностей; отже епітоп можна визначити у вигляді більш, ніж однієї окремої амінокислотної послідовності.
Епітопи, які впізнають антитіла можуть бути визначені з допомогою відомих фахівцям у цей галузі способів пептидного картування та аналізу послідовності. Зв'язувальні взаємодії проявляються у вигляді міжмолекулярних контактів з одним або декількома амінокислотними залишками СОМ. ТКС105 є мишачим антитілом, яке має таку ж саме амінокислотну послідовність, як і мишаче антитіло, описане, як Х4-2Е1 або 5Мбі| у патентах США (05 раїепі
МоМо 5,928,641; 6,200,566; 6,190,660; та 7,097,836). Попередньо були визначені епітопи, яких впізнають антитіла У4-2Е1 та 5Мб), отже й антитіло ТКС105..
І0О80І Термін "специфічно" має відношення до ситуації, в якій антитіло не демонструє будь- якого значного зв'язування з іншими молекулами, крім антигену, що містить епітоп якого впізнає антитіло. Термін також застосовують, наприклад, тоді, коли антиген - зв'язуючий домен є специфічним для окремого епітопу, який є у складі кількох антигенів та у такому разі антитіло буде здатним зв'язуватися з різними антигенами, що несуть цей епітоп. Терміни "переважно зв'язується" або "специфічно зв'язується" означає, що антитіло зв'язується з епітопом зі збільшеною спорідненістю, ніж воно зв'язується зі сторонніми амінокислотними послідовностями та, за умови перехресної реактивності до інших поліпептидів, які містять цей епітоп, воно є нетоксичним у кількостях, у яких ці антитіла отримують для введення людині. У одному аспекті, така спорідненість є принаймні у 1 раз більшою, принаймні у 2 рази більшою, принаймні у З рази більшою, принаймні у 4 рази більшою, принаймні у 5 разів більшою,
Зо принаймні у б разів більшою, принаймні у 7 разів більшою, принаймні у 8 разів більшою, принаймні у 9 разів більшою, у 10 разів більшою, принаймні у 20 разів більшою, принаймні у 30 разів більшою, принаймні у 40 разів більшою, принаймні у 50 разів більшою, принаймні у 60 разів більшою, принаймні у 70 разів більшою, принаймні у 80 разів більшою, принаймні у 90 разів більшою, принаймні у 100 разів білошою або принаймні у 1000 разів більшою, ніж спорідненість антитіл до сторонніх амінокислотних послідовностей. Терміни "їімунореактивний" "зв'язується, "переважно зв'язується та "специфічно зв'язується" тут застосовано взаємозамінне. Термін "зв'язування" має відношення до безпосереднього з'єднання двох молекул з допомогою, наприклад, взаємодій, опосередкованих ковалентним, електростатичним, гідрофобним, іонним та/або водневим зв'язком у фізіологічних умовах та включаючи такі взаємодії, як-то сольові та водні містки та будь-які інші звичайні засоби зв'язування.
І0081)| "Виділений" (застосовано взаємозамінне з "суттєво чистим") при застосуванні до поліпептидів означає поліпептид або його частину, який в силу свого походження або в результаті маніпуляції: (ї) існує у клітині-хазяїні у вигляді продукту експресії частини вектора експресії або (ії) є приєднаним до білка або до іншої хімічної функціональної групи, іншої, ніж та, до якої він є приєднаним у природі; або (іїї) не зустрічається у природі, як-то, наприклад, білок, який було отримано шляхом хімічних маніпуляцій, як--о шляхом прикріплення або додавання до білка принаймні однієї гідрофобної функціональної групи таким чином, що отриманий білок знаходиться у формі, яка не існує у природі. Під "виділеним" також мається на увазі білок, який є: (ї) хімічно синтезованим; або (ії) є продуктом експресії у клітині-хазяїні та є очищеним від асоційованих з ним та забруднюючих білків. Звичайно цей термін має відношення до поліпептиду, відокремленому від з інших білків та нуклеїнових кислот, з якими він зустрічається в природі. Звичайно поліпептид є також відокремленим від інших речовин, як-то антитіл або для його очищення застосовують гелеві матриці (поліакриламідний гель). (0082) Як тут застосовано, терміни "пригнічуючий ангіогенез," "пригнічення ангіогенезу" або "анти-ангіогенетичний" стосуються пригнічення розвитку судин та призначені означати такі, що впливають на зменшення ступеня, кількості або швидкості неоваскуляризації. Зменшення ступеня, кількості або швидкості проліферації ендотеліальних клітин або їх міграції у тканині є специфічним прикладом пригнічення ангіогенезу. 0083) Термін "композиція, яка пригнічує ангіогенез" має відношення до композиції, яка бо пригнічує опосередковані ангіогенезом процеси, як-то міграцію, проліферацію ендотеліальних клітин, утворення судинної трубки та згодом веде до пригнічення утворення нових кровоносних судин з вже існуючих, отже впливає на ангіогенез-залежні стани.
І0084| Як тут застосовано, термін "ангіогенез-залежний стан' означає стан, при якому процес ангіогенезу або васкулогенезу підтримує або посилює патологічний стан або корисно впливає на нормальні фізіологічні процеси. Таким чином, лікування ангіогенез-залежного стану, при якому ангіогенез сприяє патологічному стану може призвести до послаблення захворювання, тоді як лікування ангіогенез-залежного стану, при якому ангіогенез корисно впливає на нормальні фізіологічні процеси може призвести, наприклад, до покращення нормального процесу. (0085) Ангіогенез є утворенням нових кровоносних судин з попередньо існуючих капілярів або з пост-капілялрних венул. Васкулогенез є утворенням нових кровоносних судин, які виникають з ангіобластів, які є попередниками ендотеліальних клітин. Обидва процеси призводять до утворення нових кровоносних судин та охоплюються значенням терміну ангіогенез-залежних станів. Як тут застосовано, термін "ангіогенез" стосується утворення судин де помо, як-то судин, що виникають в результаті васкулогенезу, а також судин, що виникають шляхом розгалуження та проростання існуючих судин, капілярів та венул. Також до ангіогенезу може бути залучено АЇК! сигналування та пов'язане з ним фосфорилювання та/або сигналування Зтаа 1/5/8. Також відомо про залучення СО105 до шляху сигналування АЇ КІ1 та таким чином це також включено до значення ангіогенезу.
І0086| Клітинні популяції СО1057, які викликають пухлини були знайдені у ниркових карциномах людини. Клітини СО105- містять характерні стовбурові пухлинні клітини, які раніше були описані, як ракові стовбурові клітини, наявні у інших видів пухлин.
Спостережені клітини СО105-, які були клоногенними, здатними до експресії стовбурових клітинних маркерів та позбавленими диференціативних маркерів, були здатними перетворюватися іп міїго у епітеліальні та ендотеліальні типи клітин та утворювати іп мімо здатні до серійного перевивання пухлини. Незважаючи на те, що ці пухлини були отримані з клонів, які мають експресію мезенхимальних маркерів, вони, як і початкові пухлини, були епітеліальними карциномами та відрізнялися підтриманням пухлиногенної популяції клітин СО105- та наявністю непухлиногенної диференційованої популяції клітин СО105-.
Зо І0087| "Викликання імунної відповіді хазяїна" означає, що пацієнт відчуває полегшення або зменшення ознак або симптомів хвороби та, зокрема, охоплює, без обмеження, збільшення строку виживання. 0088) Як тут застосовано, терміни "проліферативний розлад" та "проліферативний стан" означають будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або небажаною проліферацією. Терміни "клітинний проліферативний розлад" та "клітинний проліферативний стан' означають будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або небажаною клітинною проліферацією, а також охоплюють стани, які відрізняються аномальною або небажаною клітинною проліферацією або клітинним виживанням (наприклад, завдяки дефектному апоптозу), стани, які відрізняються дефектним або аномальним або недостатнім апоптозом, а також стани, які відрізняються аномальним або небажаним або непотрібним клітинним виживанням. Термін "розлад диференціації" означає будь-який патологічний або непатологічний фізіологічний стан, який відрізняється аномальною або недостатньою диференціацією.
І0089| Проліферативні розлади або розлади диференціації, які піддаються лікуванню включають захворювання, доброякісні та неопластичні стани, які відрізняються аномальними або небажаними кількістями клітин, ростом клітин або виживанням клітин. Отже, такі розлади або стани можуть являти собою хворобливий стан та охоплюють всі типи ракових пухлин або онкогенних процесів, метастатичних тканин або злоякісно трансформованих клітин, тканин або органів. 00901 Клітини, які мають проліферативний розлад або розлад диференціації можуть бути скупчені у клітинну масу або бути розсіяними. "Нетверда пухлина" має відношення до новоутворень кровотворної системи, як-то лімфоми, мієломи та лейкози або неоплазії, яких не помітно неозброєним оком в природі, оскільки вони зазвичай не утворюють твердої маси.
Окремі приклади лейкемій охоплюють, наприклад, гостру та хронічну лімфобластну, мієлобластну та множинну мієлому.
І0091| Термін "тверда пухлина" має відношення до новоутворень або метастазів, які звичайно скупчуються разом з утворенням маси. Такі розлади охоплюють новоутворення або онкологічні захворювання, як-то рак, саркому, меланому, метастатичні розлади або гемопоетичні пухлинні розлади, які можуть вплинути на практично будь-яку клітину або тип бо тканини. Метастатична пухлина може виникнути з безлічі типів первинних пухлин, у тому числі,
але без обмеження, лімфоїдних пухлин, пухлин молочної залози, легень, щитовидної залози, голови та шиї, головного мозку, шлунково-кишкового тракту (рота, стравоходу, шлунка, тонкої кишки, товстої кишки, прямої кишки), сечостатевого тракту (матки, яєчників, шийки матки, сечового міхура, яєчок, статевого члена, передміхурової залози), нирок, підшлункової залози, печінки, кісток, м'язів, шкіри тощо. (0092) Карциноми є злоякісними новоутвореннями епітеліальних або ендокринних тканин та охоплюють карциноми дихальної системи, шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи, яєчок, молочної залози, передміхурової залози, ендокринної системи та меланоми. Тирові карциноми охоплюють карциноми, які виникають у шийці матки, легенях, передміхуровій залозі, молочній залозі, ділянках голови та шиї, товстому кишечнику, печінці та яєчниках. Цей термін також охоплює, наприклад, карциносаркоми, як-то новоутворення, які містять злоякісні пухлини, що складаються з карциноматозних та саркоматозних тканин. Аденокарцинома охоплює карциному залозистої тканини або карциному, в якій пухлина утворює залозоподібну структуру. 0093) Злоякісними тканинами. які підлягають лікуванню є, наприклад, ендотеліальні тканини або трансформовані клітини, в яких відбувається експресія аномального рівня СО105. Як тут застосовано, термін ""трансформовані клітини" відноситься до клітин, які спонтанно переходять до стану необмеженого зростання, тобто вони набувають здатність до росту через необмежену кількість поділів у культурі. Трансформовані клітини можуть бути охарактеризовані, як неопластичні, анапластічні та/або гіперпластичні, а також по відношенню до їх втрати контролю над ростом. Для цілей заявленого винаходу терміни ""рансформований фенотип злоякісних клітин ссавців" та "трансформований фенотип" призначені для охоплення, але без обмеження, будь-яких з наступних фенотипічних ознак, пов'язаних з клітинною трансформацією клітин ссавців: іморталізацію, морфологічну або ростову трансформацію та здатність викликати пухлини, як виявлено шляхом подовженого росту у клітинній культурі, росту у напівтвердому середовищі або онкогенного росту у імуно-некомпетентних або сингенних тваринах.
І0094| Термін "антиген пухлинної клітини" визначено тут, як антиген, який є присутнім у пухлинній клітині або у рідинах організму у підвищених, порівняно до неспоріднених пухлинних клітин, нормальних клітин або рідин здорового організму кількостях. Присутність антигену може бути перевірена з допомогою будь-якого з численних аналізів, відомих фахівцям у цей галузі, які
Ко) охоплюють, без обмеження, негативний та/або позитивний відбір з антитілами, як-то ІФА-аналіз,
Вестерн-блот аналіз або радіоіїмунний аналіз.
І0095| Терміни "апоптоз" або "запрограмована загибель клітин' має відношення до фізіологічного процесу, з допомогою якого здійснюється усунення небажаних або неприйнятних клітин під час розвитку та інших нормальних біологічних процесів. Апоптоз є режимом загибелі клітин, що відбувається у нормальних фізіологічних умовах та клітина є активним учасником своєї власній загибелі ("клітинне самогубство"). Це найбільш часто зустрічається в ході нормального обігу клітин та тканинного гомеостазу, ембріогенезу, індукції та підтримання імунної толерантності, розвитку нервової системи та залежної від ендокринної системи атрофії тканин. Клітини на стадії апоптозу демонструють характерні морфологічні та біохімічні особливості, які охоплюють агрегацію хроматину, нуклеарне та цитоплазматичне ущільнення, розділення цитоплазми та ядра на мембранозв'язані везикули (апоптичні тільця), які містять рибосоми, морфологічно інтактні мітохондрії та ядерний матеріал. Іп мімо ці апоптичні тільця швидко впізнають та піддають фагоцитозу макрофаги, дендритні клітини або прилеглі епітеліальні клітини. Завдяки цьому ефективному механізму усунення апоптотичних клітин в природних умовах не виникає жодної запальної реакції. В умовах іп міго апоптотичні органи, а також позосталі клітинні фрагменти зрештою набухають та потім розчиняються. Цей кінцевий етап загибелі клітин іп міго отримав назву "вторинного некрозу." Апоптоз може бути виміряно з допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі, як--о шляхом фрагментації ДНК, дії анексину М, шляхом активації каспаз, вивільнення цитохрому с тощо. Клітини, які були індуковані для загибелі тут мають назву "апоптичних клітин." 0096) "Агент, який викликає апоптоз", як тут визначено, спричинює апоптоз/програмовану загибель клітин та охоплює, наприклад, анти-СЮО105 антитіла, анти-МЕСЕ антитіла, випромінювання, хіміотерапевтичні агенти або рецепторні лігуючі агенти, з допомогою яких клітини, наприклад, пухлинні або ендотеліальні клітини зазнають запрограмованої загибелі.
Типові агенти, які викликають апоптоз більш детально описані нижче.
І0097| Апоптоз можна перевірити з застосуванням стандартного аналізу апоптозу з композиціяом анексин М. У цьому аналізі клітини МІН'"ОМСАК-З підрощують у б-луночних планшетах (МОМС) та піддають дії випромінювання або обробляють антагоністом (або у поєднанні з іншими протипухлинними ліками) протягом 4-48 год., після чого промивають та бо фарбують реактивом анексин М-РІТС (ВО-РПпаптіпдеп) протягом години. Потім клітини досліджують шляхом проточної цитометрії (проточний цитометр Весіоп-бісКіп5оп, програмне забезпечення СейОие5з), дофарбовують йодистим пропідієм та знову досліджують у проточному цитометрі.
Способи виготовлення та експресії антитіл 0098) Химерні імуноглобуліни конструюють шляхом генної інженерії. Більшість попередньо описаних химерних імуноглобулінів містить МН- та МІ/- ділянки мишачих моноклональних антитіл та Сі- та ЕРсо-ділянки антитіл людини. Ес-ділянки можуть бути застосовані з будь-яким з описаних тут ізотипів. Як тут описано, химери також можуть задовольняти критеріям, з допомогою яких з метою підвищення спорідненості антитіл змінюють обмежену кількість амінокислот каркасної ділянки змінної ділянки легкого ланцюга та/або змінної ділянки важкого ланцюга.
Ї0099| Химерні антитіла звичайно мають деякі потенційні переваги над мишачими антитілами стосовно застосування у терапії людини. Через те, що ефекторна частина таких антитіл є людською, вважається, що вона краще взаємодіє з іншими частинами імунної системи людини (наприклад, більш ефективно руйнує клітини-мішені шляхом комплемент-залежної цитотоксичності (СОС) або залежної від антитіл клітинної цитотоксичності (АОСС)). Крім того, імунна система людини не повинна впізнавати сталу ділянку химерного антитіла, як чужорідну, отже відповідь організму проти таких введених шляхом ін'єкції антитіл повинна бути в загальному випадку меншою, ніж проти повністю чужорідних мишачих антитіл. Нарешті, відомо, що мишачі антитіла у порівнянні з людськими мають більш короткий період напівжиття у кровотоці людини, отже можливо, що химерні антитіла можуть мати період напівжиття, який буде більш подібний до періоду напівжиття людських антитіл природного походження, що дозволить застосовувати менші дози та менш часто їх вводити.
ІЇ00100| Якщо бажаною є підвищена спорідненість антитіл, то залишки всередині їх СОК- ділянок можуть бути додатково заміщені іншими амінокислотами зі звичайним заміщенням не більш, ніж чотирьох амінокислотних залишків у складі СОЕК та ще більш звичайним заміщенням не більш, ніж двох залишків у складі СОМ за виключенням важколанцюгових СОК2, у яких може бути заміщено до 10 залишків. Змінення спорідненості можуть виміряні шляхом загальноприйнятних способів, як-то описаних тут (наприклад, Віасоге).
Зо 00101) Антитіла можуть бути побудовані та отримані з застосуванням відомих у цій галузі загальноприйнятних способів. Крім того, антитіла рекомбінантного походження можна часто отримувати у великих кількостях, особливо у разі застосування векторів з високим рівнем експресії. 00102) Антитіла для ветеринарних цілей можуть бути синтезовані для внутрішньовенного введення тварині (як--то примат, корова, кінь, свиня тощо) з застосуванням Рс-ділянок тваринного походження. 00103) Для змінення нуклеотидів, що кодують амінокислотні послідовності з застосуванням рекомбінантних способів у сайтах рестрикції ендонуклеаз з застосуванням рекомбінантних способів може бути застосовані створені та включені у цю заявку добре відомі у цей галузі способи. 00104) Для експресії передбачено відповідну систему експресії, як-то 55-систему (І оп7а) з застосуванням гена глютамін-синтази у якості селективного маркера. Стисло кажучи, трансфекцію здійснюють у клітинах СНО шляхом електропорації (250 В) з застосуванням о5- системи (І оп7а) та гена глютамін-синтази у якості селективного маркера. Клітини СНО дикого типу підрощують у середовищі ОМЕМ (Зідта), яке містить 1095 діалізовану телячу ембріональну сироватку (БС5) з 2 мМ глютаміном. Потім клітини СНО (6бх107 клітин) трансфікують 300 мкг лінеаризованої ДНК шляхом електропорації. Після електропорації клітини ресуспендують у середовищі ОМЕМ з глютаміном, наносять у 36 х 96-луночних планшетів (50 мкл/лунку) та інкубують їх при 37"С. у 595 СО». Наступного дня до лунок додають селективне середовище ОМЕМ без глютаміну (150 мкл/лунку). Через приблизно три тижні колонії досліджують шляхом ІФА-аналізу (див. нижче) з застосуванням нерелевантних антитіл в якості негативного контролю. Всі колонії, які продукують 220 мкг/мл переносять у 24-луночнії планшети та потім у двох копіях у флакони Т25. 00105) Для отримання високих рівнів продукту широко застосовують систему експресії у ссавцях, в якій застосовано процедуру ампліфікації гена, передбачену у клітинах яєчників китайського хом'яка, дефектних по дигідрофолатредуктазі (анпіт-. Ця система побудована на основі гена дигідрофолатредуктази апі", який кодує фермент ДГФР, що каталізує перетворення дигідрофолату на тетрагідрофолат. Для досягнення високої продуктивності апіт- клітини СНО трансфікують з вектором експресії, який містить функціональний ген ДГФР разом з 60 геном, який кодує бажаний білок. У цьому разі бажаний білок є важким та/або легким ланцюгом рекомбінантного антитіла.
І00106)| Шляхом підвищення кількості конкурентного пригнічувача ДГФР метотрексату (МТУ), у рекомбінантних клітинах розвивається стійкість за рахунок ампліфікації гена ат. У стандартних випадках застосована одиниця ампліфікації є набагато довшою, ніж розмір гена ані та в результаті відбувається спільна ампліфікація важкого ланцюга антитіла.
Ї00107| Коли бажано отримати великомасштабне виробництво білка, як-то ланцюга антитіла, то приймаються до уваги як рівень експресії, так і стійкість застосованих клітин. У культурі з тривалим строком життя популяції рекомбінантних клітин СНО втрачають гомогенність з точки зору їх специфічної продуктивності антитіл протягом ампліфікації, навіть якщо вони походять з одного батьківського клону. 00108) У цій заявці передбачено виділений полінуклеотид (нуклеїнову кислоту), який кодує антитіло або її частину, як описано тут, вектори, які містять такі полінуклеотиди та клітини-хазяї та системи експресії для транскрипції та трансляції таких полінуклеотидів у поліпептиди. 00109) У цій заявці також передбачено конструкції у вигляді плазмід, векторів, касет для транскрипції або експресії, які містять принаймні один полінуклеотид, як зазначено вище. 00110) У цій заявці також передбачено рекомбінантну клітину-хазяїна, яка містить одну або декілька конструкцій, як зазначено вище. Нуклеїнова кислота, яка кодує будь-яке описане тут антитіло утворює аспект цієї заявки, як і спосіб отримання антитіл, який полягає у досягненні експресії білка, закодованого у зазначеній нуклеїновій кислоті. Ця експресія може бути зручно досягнута шляхом культивування у відповідних умовах рекомбінантних клітин-хазяїв, які містять нуклеїнову кислоту. Після отримання шляхом експресії, антитіла або їх частини можуть бути виділені та/або очищені з застосуванням будь-якого прийнятного способу та потім застосовані у разі необхідності. 00111) Специфічні антитіла (або їх частини), які кодуються молекулами нуклеїнової кислоти та вектори з зазначеним тут вмістом можуть бути надані виділеними та/або очищеними, наприклад, з їх природного оточення у суттєво чистій або гомогенній формі. У випадку нуклеїнових кислот, вони є вільними або суттєво вільними від нуклеїнових кислот або генів, які мають інше походження, ніж послідовність, яка кодує поліпептид з потрібною функцією.
Послідовності нуклеїнових кислот можуть містити ДНК або РНК та можуть бути повністю або
Зо частково синтетичними. Способи очищення є добре відомими у цій галузі. 00112) Системи для клонування та експресії поліпептиду у багатьох різних клітинах-хазяях є добре відомими. Прийнятні клітини-хазяї охоплюють клітини бактерій, ссавців, дріжджів та бакуловірусні системи. Відомі у цій галузі прийнятні для експресії гетерологічного поліпептиду клітинні лінії ссавців охоплюють, але без обмеження, клітини яєчників китайського хом'ячка, клітини Нега, клітини нирок новонародженого хом'яка, клітини мишачої мієломи М5О та багато інших клітинних ліній.
ІЇ00113)| Широке розмаїття одноклітинних клітин-хазяїв також є корисним для експресії послідовностей ДНК. Ці хазяї охоплюють добре відомих про- та еукаріотів, як-то штами Е. соїї,
Рзейдотопах, Васійи5, еігеріотусев, грибів, як-то дріжджів та клітини тварин, як-то клітини
СНО, УвВ/20, М50, 5Р2/0О, ВІЛ, В-М/ та І-М, клітини нирок африканської зеленої мавпи (наприклад, клітини СО51, СО57, В5С1, В5С40, та ВМТ10), клітини комах (наприклад, 519), та людські та рослинні клітини у культурі тканин. 00114) Експресія антитіл або їх частин у клітинах прокаріот, як-то Е. соїї є добре відомою у цій галузі. Відповідний огляд, див., наприклад, у РійсКкіІйип, А. Віо/Гесппоїоду 9: 545-551 (1991).
І00115| Експресія у культурі еукаріотичних клітин також доступна фахівцям в якості опції для отримання описаних тут антитіл. Сучасний огляд див., наприклад, у статтях Кай, М.Е. (1993) Си. Оріпіоп Віотесн. 4: 573-576; Ти! У.У. еї аіІ. (1995) Ст. Оріпіоп Віоїесп 6: 553-560, кожна з яких є повністю включеною сюди шляхом посилання.
ІЇ00116| Можуть бути вибрані або побудовані прийнятні вектори, які містять відповідні регуляторні послідовності, включаючи промоторні послідовності, термінаторні послідовності, послідовності поліаденілування, підсилюючі послідовності, маркерні гени та інші послідовності у разі необхідності. Вектори, відповідно, можуть бути плазмідами або вірусними векторами, наприклад, на основі фагів або фагмід. Більш детально див., наприклад, книгу МоіІесшіаг
СіІопіпд: а І арогаїогу Мапича! (Лабораторний підручник по молекулярному клонуванню"): 2п4 еайоп, затргоок еї аї!., 1989, Соїд брііпд Нагбог І арогаюгу Ргез55. Багато відомих способів та протоколів, присвячених маніпуляціям з нуклеїновою кислотою, наприклад, присвячених отриманню конструкцій на основі нуклеїнових кислот, мутагенезу, сиквенсу, введенню ДНК у клітини, генній експресії та аналізу білків детально описано у книзі Зпогі Ргоїосої5 іп МоіІесшаг
Віоїоду (Короткі протоколи у молекулярній біології), Зесопа Еайіоп, А!,5ибеї еї аї. ед5., дойп бо Уміеу 8 5оп5, 1992. Способи, наведені у вищезгаданих книгах є добре відомими у цій галузі та повністю включені сюди шляхом посилання.
І00117| Отже, додатковим аспектом передбачено клітину-хазяїна, яка містить нуклеїнову кислоту, як зазначено тут. У іншому додатковому аспекті передбачено спосіб, який полягає у введенні такої нуклеїнової кислоти клітині-хазяїну. Для такого введення може бути застосовано будь-який прийнятний спосіб. Для еукаріотичних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансфекції з фосфатом кальцію, трансфекції з ОЕАЕ-декстраном, електропорації, трансфекції, опосередкованої ліпосомами та у трансдукції з застосуванням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу коров'ячої віспи або бакуловірусів для клітин комах. Для бактеріальних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансформації з хлоридом кальцію, електропорації та трансфекції з застосуванням бактеріофагів.
ЇО0118| Після введення може бути викликана або дозволена експресія продукту з нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом культивування клітини-хазяїна в умовах, прийнятних для експресії гена.
Ї00119| У одному втіленні нуклеїнова кислота є вбудованою у геном (наприклад, у хромосому) клітини-хазяїна. Сприяння подібній інтеграції може бути здійснено шляхом включення послідовності, яка сприяє рекомбінації з геномом у відповідності зі стандартними способами. При необхідності максимізування експресії може бути запущено підсилення Ід. 00120) Також у цій заявці передбачено спосіб, який полягає у застосуванні зазначеної вище конструкції у системі експресії з метою досягнення експресії антитіл (або їх частин) як зазначено вище.
І00121| Ця заявка також стосується виділених нуклеїнових кислот, як-то рекомбінантних молекул ДНК або клонованих генів або їх вироджених варіантів, мутантів, аналогів або фрагментів, які кодують антитіло, що зв'язується з СЮО105. 00122) У додатковому втіленні повнорозмірна послідовність ДНК рекомбінантної молекули
ДНК або клонованого гена антитіла або його описаної тут частини може бути функціонально приєднаною до послідовності, яка контролює експресію та може бути введена відповідному хазяїну. Винахід відповідно охоплює також одноклітинних хазяїв, трансформованих клонованим геном або рекомбінантною молекулою ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує Мн, Мі, Сі. та/або Ес-ділянку антитіла.
Зо 00123) Іншою особливістю є експресія описаних тут послідовностей ДНК. Як добре відомо у цій галузі, експресія послідовностей ДНК може бути викликана шляхом їх функціонального приєднання до послідовності, яка контролює експресію у прийнятному векторі експресії та застосування цього вектора експресії для трансформації відповідного одноклітинного хазяїна.
І00124| Зрозуміло, що таке оперативне приєднання послідовності ДНК до послідовності, яка контролює експресію у разі, якщо вона сама вже не є частиною зазначеної послідовності ДНК, полягає у забезпеченні розташування ініціюючого кодону АТО, у належній рамці зчитування перед послідовністю ДНК. 00125) Полінуклеотиди та вектори можуть бути надані у виділеній та/або а очищеній формі (наприклад, вільній або суттєво вільній від полінуклеотидів іншого походження, ніж полінуклеотид, який кодує поліпептид з бажаною функцією). Як тут застосовано, "суттєво чистий, та "суттєво вільний" відносяться до розчину або до суспензії, яка містить менш ніж, наприклад, приблизно 2095 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 1095 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 595 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 495 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 3956 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 295 або ще менше стороннього матеріалу, як-то приблизно 195 або ще менше стороннього матеріалу.
І00126| Для експресії послідовності ДНК заявленого винаходу може бути застосовано широкий вибір комбінацій хазяїн/вектор експресії. Корисні вектори експресії, наприклад, можуть складатися з сегментів послідовності хромосомної, нехромосомної та синтетичної ДНК.
БО Прийнятні вектори охоплюють, але без обмеження, похідні 5М40 та відомих бактеріальних плазмід, наприклад, плазмід Е. соїї ЕІ, Ре1, Рбг322, Ртбро та їх похідних, таких плазмід, як КРА; фагову ДНК, наприклад, численні похідні фага Х, наприклад, ММУ989 та іншу фагову ДНК, наприклад, М13 та ниткоподібну одноланцюгову фагову ДНК; плазмід дріжджів, як-то плазміду 2ми або її похідні; вектори, корисні для застосування у еукаріотичних клітинах, як-то вектори, корисні для застосування у клітинах комах або ссавців; вектори, отримані з комбінацій плазмідної та фагової ДНК, як-то плазміди, які були змінені для застосування фагової ДНК або інших послідовностей, що контролюють експресію тощо .
І00127| Також заявленим винаходом передбачено рекомбінантну клітину-хазяїна, що містить одну або декілька полінуклеотидних конструкцій. Полинуклеотид, що кодує антитіло, як це бо передбачено в даному документі, утворює аспект цієї заявки, так само як і спосіб отримання антитіла, який полягає у досягненні експресії одного або декількох полінуклеотидів, якої може бути досягнуто, наприклад, шляхом культивування у відповідних умовах рекомбінантних клітин- хазяїв, які містять полінуклеотид, після чого бажане антитіло може бути виділено та/або очищено з застосуванням будь-якого прийнятного способу з наступним застосуванням у разі необхідності. 00128) Для експресії послідовностей ДНК у цих векторах можуть бути застосовані будь-які з широкого спектру послідовностей, які контролюють експресію функціонально приєднаної до них послідовності ДНК. Такі корисні послідовності що контролюють експресію охоплюють, наприклад, ранній або пізній промотори 5М40, СММУ, коров'ячої віспи, поліоми або аденовірусу, системи Пас, ігр, ТАС, ТКС, ІТК, головну операторну та промоторну ділянки фагу Х, контрольні ділянки білка оболонки їЯ4, промотор 3-фосфогліцераткинази або інших гликолитических ферментів, промотори кислої фосфатази (наприклад, Рпо5), промотори дріжджових факторів альфа-парування та інші послідовності, відомі своєю здатністю контролювати експресію генів прокаріотичних або еукаріотичних клітин або їх вірусів та різні їх комбінації.
І00129| Слід розуміти, що не всі вектори, послідовності, що контролюють експресію та хазяї будуть функціонувати однаково добре при експресії послідовності ДНК. Не всі хазяї будуть функціонувати однаково добре з однією і тією ж системою експресії. Тим не менш, фахівець у цій галузі зможе вибрати відповідні вектори, послідовності, що контролюють експресію та хазяїв без зайвого експериментування для досягнення бажаної експресії та без відходу від суті та обсягу цієї заявки. Наприклад, при виборі вектора також повинен розглядатися хазяїн, оскільки вектор повинен функціонувати в ньому. Також можуть бути розглянуті такі фактори, як кількість копій вектора, здатність контролювати це число копій та експресію будь-яких інших білків, що кодуються вектором, як-то антибіотичних маркерів. 00130) Цією заявкою також створені, як описано тут в іншому місці, конструкції у вигляді плазмід, векторів, касет для транскрипції або експресії, які містять принаймні один полинуклеотид, як описано вище. Прийнятні вектори, які можна вибрати або побудувати, містять відповідні регуляторні послідовності, промоторні послідовності, термінаторні послідовності, послідовності поліаденілування, підсилюючі послідовності, маркерні гени та інші послідовності у разі необхідності. Вектори відповідно можуть бути плазмідами або вірусними векторами, наприклад, на основі фагів або фагмід. Більш детально див., наприклад, книгу
Моїесшіаг Сіопіпд: а | аброгайгу Мапиа! ("Лабораторний підручник по молекулярному клонуванню"): 2па4 ейайіоп, затбгоок еї аї., 1989, Соїа 5ргіпд Нагброг ІГарогафгу Ргез55. Багато відомих способів та протоколів, присвячених маніпуляціям з нуклеїновою кислотою, наприклад присвячених отриманню конструкцій на основі нуклеїнових кислот, мутагенезу, сиквенсу, введенню ДНК у клітини, генній експресії та аналізу білків детально описано у книзі Зпогі
Ргоїосої5 іп МоїІесшціаг Віоїоду (Короткі протоколи у молекулярному клонуванні"), Зесопа Еайіоп,
А!йзибеї еї аї. ед5., Уопп Умієу 5 Зоп5, 1992. Способи, наведені у вищезгаданих книгах є добре відомими у цій галузі та повністю включені сюди шляхом посилання. 00131) При виборі послідовності, яка контролює експресію, як правило, будуть розглянуті різні фактори, які, наприклад, охоплюють відносну силу системи, її керованість та її сумісність з певною послідовністю ДНК або з геном, експресію якого досліджують, особливо відносно потенційних вторинних структур. Прийнятні одноклітинні хазяї будуть обрані шляхом розгляду, наприклад, їх сумісності з обраним вектором, їх секретивним характеристикам, їх здатності до належного згортання білків, їх ферментативним критеріям, а також ступеня токсичності для хазяїна продукту, який кодується послідовністю ДНК, експресію якої треба отримати та легкості очищення продуктів експресії.
І00132| Додатковим аспектом передбачено клітину-хазяїна, що містить один або декілька полінуклеотидів, як зазначено в цьому документі. Іншим додатковим аспектом передбачено спосіб введення клітині-хазяїну такого одного або декількох полінуклеотидів з допомогою будь- якого прийнятного способу. Для еукаріотичної клітини подібні прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансфекції з фосфатом кальцію, трансфекції з ОЕАЕ-декстраном, електропорації, трансфекції, опосередкованої ліпосомами та у трансдукції з застосуванням ретровірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу коров'ячої віспи або бакуловірусів для клітин комах. Для бактеріальних клітин прийнятні способи можуть, наприклад, полягати у трансформації з хлоридом кальцію, електропорації та трансфекції з застосуванням бактеріофагів. 00133) Після введення може бути викликано або дозволено проведення експресії з одного або декількох полінуклеотидів, наприклад шляхом культивування клітин-хазяїв в прийнятних для експресі одного або декількох поліпептидів з одного або декількох полінуклеотидів. Для бо цього можуть бути застосовані індуцибельні системи та викликання експресії може бути здійснено шляхом додавання активатора. 00134) У одному втіленні полінуклеотиди можуть бути приєднані до геному (наприклад, хромосоми) клітини-хазяїна. Для сприяння цієї інтеграції з геномом з допомогою стандартних способів можуть бути приєднані послідовності, які сприяють рекомбінації з геномом та у іншому втіленні нуклеїнову кислоту підтримують у складі епісомального вектора у клітині-хазяїні.
ІЇ00135| Створені тут способи охоплюють застосування зазначеної вище конструкції у системі експресії з метою експресії певного поліпептиду. 00136) З урахуванням цих та інших факторів, фахівець цій галузі зможе сконструювати різні комбінації векторів/послідовностей, що контролюють експресію/хазяїв, з допомогою яких можна здійснити експресію послідовностей ДНК, прийнятну для ферментації або для великомасштабної культури тваринних клітин.
І00137| Окрім клонування або швидше, ніж шляхом клонування, полінуклеотид, який кодує антитіло або його частину може бути отримано рекомбінантним/синтетичним шляхом.
Полинуклеотид може бути сконструйовано з застосуванням відповідних кодонів та загалом будь-хто може вибрати бажані кодони для призначеного хазяїна при застосуванні відповідної послідовності для експресії. Повний полинуклеотид може бути зібрано з перекриваються олігонуклеотидів, отриманих з допомогою стандартних способів та зібраних у повну кодуючу послідовність. Див., наприклад, Едде, Майшге, 292:756 (1981); Матрваїг еї аї., Зсіепсе, 223:1299 (1984); дау є! аї., 9. Віої. Снет., 259:6311 (1984). 00138) Одночасне застосування нуклеїнових кислот, які кодують антитіла (або їх частини) та замін у вибраних положеннях амінокислот може бути здійснено з допомогою різних способів, відомих фахівцям у цій галузі, включаючи, наприклад, рекомбінантні технології та хімічний синтез.
Анти-СО105 антитіла
І00139| Ендоглін (СО0О105) експресується на клітинній поверхні у вигляді гомодимерного трансмембранного білка у 180 кДА. Зовнішній домен зв'язує ТОБЕ-ДР1 та -3 ізоформи з високою спорідненістю (50 нМ) та трансмембранний та внутрішньоклітинний домени СО105 мають 7195 схожість послідовності до бетаглікану. Ген СО105 людини, розташований на хромосомі 9434 було визначено з допомогою флуоресцентної гібридізації іп 5йи. Було виявлено, що його
Зо кодуюча ділянка містить 14 екзонів та описані дві різні ізоформи (І. та 5) СО105 зі здатністю до зв'язування ТОБЕ-Д. На відміну від ізоформи 5-СО105, яка складається з 600 амінокислотних залишків з 14 амінокислотними залишками у цитоплазматичному хвості, ізоформа І-С0105 складається з 633 амінокислотних залишків 3 47 амінокислотними залишками у цитоплазматичному хвості, однак 1-СО105 є домінуючою формою. СО105 постійно фосфорилюється у ендотеліальних клітинах, головним чином по сериновим та треоніновим залишкам та це фосфорилювання відбуівається завдяки постійній активності ТОЕ-ДР ВІЇ всередині клітини. Зв'язування ТОЕ-В з СО105 веде до пригнічення фосфорилювання, подібного до спостереженої дії пригнічувачів протеїнкінази С. Амінокислотна послідовність СО105 людини містить трипептид КОЮ (аргінін-гліцин-аспарагінова кислота), розташований у оголеній ділянці позаклітинного домену. Пептид КСО є ключовою структурою розпізнавання, знайденою у білках позаклітинної матриці, як-то фибронектин, вітронектин, фактор фон Віллебранда (ФВ), колаген першого типу та фібриноген та її впізнають інтегрини клітинної поверхні. Адгезія інтегрину є залученою до гемостазу, тромбозу, ангіогенезу та запалення, тобто до процесів, у яких ендотелій відіграє важливу роль. (ий еї а!., РЕАБЗЕВ У., 17:984-992 (2003)).
І(00140| СО105 є членом родини рецепторів ТОЕ-р, експресія яких відбувається шляхом проліферації ендотеліальних клітин, для якої потрібна присутність нормальних кількостей
СОр105. Експресія СО105 підвищується через клітинну гіпоксію завдяки продукуванню фактора індукції гіпоксії 1-о; (НІБ-1-о) та захищає гіпоксичні клітини від апоптозу. Деякі функції СО105 є пов'язаними з сигналуванням ТОЕ-Д. Сигналування ТОЕ-Д відбувається через гетеродимерні рецептори, які складаються з серинових кіназ, рецептора І (КІ) та рецептора І! (КІЇ),.
Зв'язування ТОБ-Др з зовнішніми доменами рецептора викриває активність цитоплазматичної кінази КІІ, яка фосфорилює ТОЕ-Др КІ, який потім може взаємодіяти з низовими сигнальними факторами, як-то білки Зтай. СО105 утворює частину рецепторного комплексу ТОЕ-Д та також може бути незалежно присутнім на клітинній поверхні. У багатьох клітинах іп міго СО105 пригнічує сигналування ТОБ-рД. 001411) СО105 також зв'язує інші фактори росту, активин А та кісткові морфогенетичні білки (ВМР) -10, -9, -7 та -2. Зв'язування ТОБ-ВД або іншого з лігандів фактора росту до СО105 потребує наявності принаймні рецептора КІЇ та сам по собі він не спроможний до зв'язування лігандів. Об'єднання СО105 з рецепторами не змінює їх власної спорідненості до ліганду. В бо результаті об'єднання цитоплазматичний домен СО105 фосфорилюється кіназами ТОаЕ-В КІ та такг-р КІ з наступною дисоціацією кінази ТОЕ-Д КІ (але не ТОБЕ-Д КІЇ) від рецепторного комплексу.
І00142| Експресія СО105 пригнічує рівні фосфорилювання ТОЕ-р КІЇІ, але підвищує рівні фосфорилювання ТОЕ-р КІ, що веде до підвищеного фосфорилювання тільки тай 2, але не
Ззтай 3. Оскільки 5тайдй 2 може взаємодіяти з різними факторами транскрипції, спільними активаторами та супресорами, фосфорильований 5ітпай 2 може виступати в якості інтегратора кількох сигналів для модулювання транскрипції генів. Отже, СО105 знижує функції ТОБ-рД шляхом взаємодії з ТОБЕ-Д КІ та ТОБ-р КІІ та змінює фосфорилювання білків Зтай низового рівня.
І00143| Дія СО105 полягає у зниженні сигналування численних кіназних рецепторних комплексів надродини ТОЕ-Д, включаючи рецептори ТОБЕ-Д (ТОаБ-РЕ), рецептороподібні кінази активіну (АГК) та рецептори активіну. За відсутністю СО105 активування рецепторів ТОЕ-р веде до фосфорилювання білків ЗМАЮ (ЗМАО 2 та 3), які пригнічують ріст ендотеліальних клітин.
Однак, активування СО105 з допомогою ТОБ-В змінює фосфорилювання білка ЗМАЮ (включаючи фосфорилювання ЗМАЮ 1, 5 та 8). Кінцевим результатом є інкубування росту ендотеліальних клітин через активування рецептора ТОБЕ-В (див. Фіг. 2). Не дивно, що запобігання активування СО105 шляхом дії анти-СО105 антитіл або антисенсового олігонуклеотиду діє з ТОЕ-р синергічним чином, пригнічуючи ріст ендотеліальних клітин. 00144) Промотор СО105 має 2.6 кб. у довжину, але не містить відрізків ініціації транскрипції
ТАТА або СААТ. Проте він містить дві ділянки, багаті С-парами, консенсусні характерні послідовності для Зр1, еї5, ЗАТА, АР-2, МОЕ-Д, та Май, а також елементи відповіді ТОЕ-р. Тим не менше, СО105 має відносно обмежений розподіл у клітинах. Основний рівень транскрипції, як видається, вимагає наявності сайту еї5 у положенні -68 та сайтів 5р11, але вважається, що до відносного обмеження експресії, наприклад для ендотеліальних клітин, залучені численні регуляторні ділянки, зокрема одна у положенні -1294 - -932 та друга, яка розташована дуже близько до сайту ініціації транскрипції. СО105 активується з допомогою ТОЕ-ДВД та, як було показано, потребує наявності сайту Зрі у положенні -37 - -29, а також участі одного або декількох розташованих поруч нижче ЗВЕ сайтів зв'язування тав З та/або 4 (які активуються шляхом сигналування ТОБЕ-ДВ). Гіпоксія є спільною рисою ішемічних тканин та пухлин та
Зо потужним стимулятором для експресії гена СО105 у судинних ендотеліальних клітинах (ЕС).
Таку дію можна підсилити у поєднанні з ТОЕ-В1. Активування СО105 може виконувати самозахисну роль у ЕС-клітинах в умовах гипоксичного стресу.
І00145| Судинні ЕС-клітини є головним джерелом СО105. Інші типи клітин, включаючи судинних гладком'язові клітини, фібробласти, макрофаги, лейкозні клітини пре-В та мієломоноцитарного походження та еритроїдні попередники здатні до експресії СО105 у меншій кількості.
І00146| СО105 є залученим до ангіогенезу. Антисенсові експерименти демонструють, що пригнічення експресії СО105 у клітинах НОМЕС веде до помітного пригнічення ангіогенезу іп мійго у комбінації з ТОЕ-Д1, що вказує на те, що СО105 є проангіогенним компонентом ендотеліальних клітин. Додаткове свідоцтво важливої ролі СО105 у ангіогенезі було отримано шляхом експериментів з мишами, які мали заблокований ген СО105. Такі миші мали численні судинні та серцеві дефекти, які призводили до смерті тварин на ранній ембріональній стадії.
Важкі судинні порушення, які спостерігали у цих мишах вказують на те, що СО105 є необхідним для утворення кровоносних судин у позаембріональній судинній системі, що додатково підтверджує безпосередню роль СО105 у ангіогенезі.
І00147| СО105, який також має назву ендогліну або едд-1 є гомодимерним мембранним глікобілююм першого типу, який має високі рівні експресії у проліферуючих судинних ендотеліальних клітинах. Отже, СО105 головним чином є пов'язаним з проліферацією маркером для ендотеліальних клітин, які проходять стадію активного ангіогенезу. Однак може існувати обмежена експресія СО105 через судинний ендотелій нормальних тканин. Відомо, що СО105 людини специфічно зв'язує трансформуючий фактор росту-р (ТаБ-Р), та визначена амінокислотна послідовність СО105 має сильну гомологію до р-глюкану, який є типом рецептора ТОБ-рД. (00148) Застосування СО105 було орієнтовано на способи зменшення пухлинної судинної системи на основі застосування антитіл, оскільки СО105 є пов'язаним з проліферацією антигеном у ендотеліальних та лейкозних клітинах. Його експресія активується у пов'язаному з пухлинами судинному ендотелії та СО105 є необхідним для ангіогенезу. Ангіогенез, який полягає у утворенні нових капілярних кровоносних судин веде до неоваскуляризації а також підтримує існуючу судинну систему. Він є комплексним процесом, який охоплює серії послідовних кроків, включаючи ендотеліальну клітинно-опосередковану деградацію судинної базальної мембрани та міжтканевих матриць, міграцію ендотеліальних клітин, проліферацію ендотеліальних клітин та утворення цими клітинами капілярних петель.
І00149| СО105 можна знайти на клітинах, які складають та підтримують існуючу судинну систему, а також клітинах, які сприяють ріст та стають частиною нової судинної системи. Ці антитіла можуть зв'язувати СО105 та тим самим пригнічувати ангіогенез, пригнічувати існуючу судинну систему або підтримку існуючої судинної системи та/або пригнічувати розповсюдження малих судин. Додатково до їх застосування для очищення СО105, ці антитіла є корисними для очищення, визначення та для діагностичних та терапевтичних цілей. Створені тут антитіла можуть бути застосовані для отримання лікарських засобів для лікування різних станів та захворювань, у способах лікування зазначених станів та захворювань та їх визначення або діагностики. Як тут застосовано, ангіогенез охоплює ріст та/"або розвиток нових кровоносних судин (який також має назву неоваскуляризації), розповсюдження дрібних судин, надмірний або тривалий судинний ріст та підтримку існуючої судинної системи. Ангіогенні стани та захворювання стосуються таких захворювань та станів, які мають відношення до, спричинені або пов'язані з ангіогенезом. Необмежені приклади таких захворювань охоплюють, наприклад, різні форми раку (початкові пухлини та метастази) До СО105 були отримані мишачі моноклональні антитіла (тАбБ), які знижують активність СО105 та таким чином пригнічують ангіогенез та/або пригнічують розповсюдження малих кровоносних судин. Ці мишачі антитіла описані у патентах США (Ш.5. раїепі5 5,928,641, 6,200,566, 6,190,660 та 7,097,836), кожен з яких повністю включено сюди шляхом посилання. Крім того була підтверджена ефективність кількості цих антитіл ех мімо та іп мімо та моноклональні антитіла, які зв'язують СО105 становлять інтерес у якості сполук для зниження кількості СО105. Проте терапевтичне застосування мишачих антитіл є недоцільним, оскільки їх введення має ряд обмежень, включаючи їх імуногенність у вигляді, наприклад, анти-мишачих антитіл людини (НАМА).
ІЇО0150| Були також описані деякі антитіла до СО105, зокрема моноклональні антитіла (тАБ") до СО105. МАБ 5М6 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей глікобілюовими сумішами клітинних мембран клітин лейкемії людини (Нагша апа б5еоп, 1986, Ргос. Маї). Асад. осі. 83:7898-7902). 5Мб6 є мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає СО105 людини. МАБ
Зо 44054 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей цільною клітинною суспензією клітин рге-В лейкемії людини (Соцдоз апа І еїапе, 1988, 9. Іттипої. 141:1925-1933; 1990, У). ВіоЇ. Спет. 265:8361-8364). 44654 є також мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає СО105 людини.
МАБ М.)7/18 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації щурів запальною мишачою шкірою (се апа Виїснег, 1994, 5ирга). МуО7/18 також є мишачим моноклональним антитілом, яке впізнає
СО105 людини. отАр Тес-11 є антитілом, отриманим внаслідок імунізації мишей ендотеліальними клітинами з пупочної вени людини (Виггом/5 еї аї., 1995, Сіп. Сапсег Кев. 171623-1634). Тес-141 є мишачим моноклональним антитілом з обмеженою реактивністю до
СО105 людини. Також описані химерні антитіла, які зв'язують СО105, які демонструють зменшену імуногенність при зберіганні та/або покращену специфічність. Додатковим чином, для розв'язання проблем, пов'язаних з мишачими антитілами, тут також описані химерні антитіла, які зв'язують СО105 та зменшують та/або пригнічують ангіогенез та демонструють зменшену імуногенність при зберіганні та/"або покращену специфічність. Ці анти-СО105 антитіла є корисними для діагностики та лікування різних станів та захворювань, а також для очищення та визначення СО105. Антитіла до СО105 є важливими елементами для розвитку терапії для лікування різних захворювань та станів, які призводять до ангіогенезу або які знаходяться під його впливом або виникають через ангіогенез.
Ї0О0151| Заявленим винаходом створено антитіла, які зв'язуються з СО105, а також антитіла, (або їх антиген-зв'язуючі фрагменти), які зв'язуються з СО105 та пригнічують (частково або повністю) або стримують розвиток/лікують (частково або повністю) ангіогенез/неоваскуляризацію, розповсюдження малих судин, пригнічення клітинної проліферації або пригнічення пухлинного росту. Аналогічним чином, пригнічення або зв'язування СО105 також охоплює пригнічення функції СО105 (наприклад, сигналування, зв'язування, активування тощо). У іншому втіленні антитіло пригнічує ангіогенез шляхом зв'язування з СЮО105. Винаходом також створені клітинні лінії, які можуть бути застосовані для отримання антитіл, способи отримання клітинних ліній, способи отримання експресії та очищення антитіл.
І00152| Можна визнати, що отримані з застосуванням описаних тут способів антитіла, які специфічно зв'язують СО105 можуть бути перевірені з допомогою передбачених тут або відомих у цій галузі аналізів на здатність до зв'язування СО105 з застосуванням стандартних 60 способів, як-то, але без обмеження, ІФА. Спорідненість описаних тут антитіл також може бути визначена з застосуванням стандартних способів, як-то, але без обмеження, Віасоге або поверхневий плазмонний резонанс.
І00153)| Заявленим винаходом створені антитіла, які зв'язують СО105, а також створені антитіла, які зв'язують СО105 та пригнічують ангіогенез.
ІЇ00154| Заявленим винаходом створено антитіло, яке містить змінну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮО Мо: 1, сталу ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕ ІЮО Мо: 2, змінну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕ ІЮО Мо: З та сталу ділянку (Ес) гамма 1 (уї), яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕО ІО Мо: 4., позначену, як ЗЕО ІО Мо: З; та сталу ділянку (Ес), яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕО ІО Мо: 4. 00155) У іншому необмеженому втіленні анти-СО105 антитіло містить ділянку Мі СОКІ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 5; Мі СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕ ІО Мо: 6; Мі СОКЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 7; Мн СОКІ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮ
Мо: 8; Мн СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮО Мо: 9; та Мн СОВЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ХЕО ІЮО Мо: 10. 00156) У іншому необмеженому втіленні виділене гуманізоване, деімунізоване антитіло до
СО105 може містити змінну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ЕО ІО Мо: 11 та змінну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 12. Інші необмежені приклади гуманізованих- деімунізованих важких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності ЗЕО ІЮ МоМо: 13, 14, 15 та 16. Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих легких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності ЗЕО ІЮ МоМое: 17, 18, 19, 20, 21, 22 та 23.
Послідовності наведені нижче у Прикладі 17. 00157) У іншому аспекті, заявленим винаходом створено антитіло, здатне конкурувати з описаним тут анти-СО105 антитілом в умовах, у яких зв'язування з СО105 принаймні 590 антитіл, які мають послідовності Мн та Мі. блокується шляхом конкуренції з таким антитілом, як доведено шляхом ІФА аналізу.
Зо 00158) Також тут створено нейтралізуючі антитіла, які зв'язуються з СО105 та зменшують його активність. Нейтралізуючі антитіла можуть, наприклад, пригнічувати ангіогенез шляхом зв'язування з СО105. 001591) Описані тут антитіла є корисними у визначенні або у діагностичних застосуваннях, як більш детально описано нижче. Описані тут антитіла є корисними для зв'язування з СЮО105, яке, в свою чергу, може пригнічувати ангіогенез, як описано тут. 00160) Описані тут антитіла можуть додатково містити терапевтичні функціональні групи для застосування з терапевтичною метою. 00161) Описані тут антитіла також можуть бути застосовані у якості імунокон'югатів. Як тут застосовано для цілей цієї заявки та Формули Винаходу, імунокон'югати мають відношення до кон'югатів, які містять анти-СО105 антитіла або їх фрагменти за заявленим винаходом та принаймні одну терапевтичну мітку. Терапевтичні мітки містять протипухлинні агенти та пригнічувачі ангіогенезу. Такі протипухлинні агенти відомі у цій галузі та охоплюють, але без обмеження, токсини, лікарські препарати, ферменти, цитокіни, радіонукліди, фотодинамічні агенти та інгібітори ангіогенезу. Токсини, охоплюють, але без обмеження, А - ланцюг рицину, мутантні екзотоксини Рзейдотопавх, дифтерійний анатоксин, стрептонігрин, боаміцин, сапорин, гелонін та антивірусний білок лаконосу американського. Лікарські препарати охоплюють даунорубіцин, метотрексат та каліхеаміцин. Радіонукліди охоплюють радіометали. Цитокіни охоплюють, але без обмеження, трансформуючий фактор росту (ТОБ)-Д, інтерлейкіни, інтерферони та фактори некрозу пухлин. Фотодинамічні агенти охоплюють, але без обмеження, порфірини та їх похідні Також передбачено застосування добре відомих додаткових терапевтичних міток. Способи отримання комплексів моноклональних антитіл до СЮО105 або їх фрагментів з принаймні одним протипухлинним агентом добре відомі фахівцям у цей галузі (тобто кон'югатів антитіл, розглянутих у СПейе еї аї!., 1994, Рпаптасої. Тег. 63:209-34). Такі способи можуть полягати у застосуванні одного з декількох прийнятних гетеробіфункціональних реагентів, застосованих для з'єднання або зв'язування молекул. Далі тут надано опис додаткових радіонуклідів разом з додатковими способами зв'язування молекул, як-то терапевтичних та діагностичних міток.
І00162| Антитіла можуть бути змінені з різною метою з допомогою відомих у цій галузі способів, як-то, наприклад, шляхом додавання поліетиленгліколю (ПЕГ). Модифікація з бо допомогою ПЕГ (ПЕГілування) може привести до одно- або до багатократного підвищення часу обігу, підвищеної розчинності, підвищеної стійкості до протеолізу, зниженої антигенності та імуногенності, підвищеної біодоступності, зменшеної токсичності, покращення стійкості та до більш легкого отримання композиції. (огляд див. у Егапсібє еї аї., Іп(егпайопа! дошигпаї ої
Нетаїйо!іоду 68:1-18, 1998). 00163) Рс-частини антитіл можуть бути змінені для підвищення часу напівжиття у кровообігу після введення пацієнту. Змінення можуть бути визначені з застосуванням стандартних засобів у цій галузі, як-то, наприклад, засоби, описані у патенті США Ш.5. Раїепі Мо. 7,217,798, повністю включеним сюди у якості посилання.
І00164| Також відомі інші способи підвищення часу напівжиття злитих білків на основі антитіл у кровообігу, як-то, наприклад, способи, описані у патентах США ЦШ.5. Раїепі МоМо. 7,091,321 та 6,737,056, кожен з яких є також повністю включеним сюди у якості посилання.
Додатково можуть бути отримані антитіла або досягнута експресія антитіл, які не будуть містити фукозу на їх складних цукрових ланцюгах з приєднаним М-глікозидом. Відомо, що усунення такої фукози підвищує ефекторні функції антитіл та антиген-зв'язуючих фрагментів, в том числі, але без обмеження, залежну від антитіл клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮСС) та комплемент-залежну цитотоксичність (СОС). Аналогічним чином, антитіла, які можуть зв'язувати
СО105 можуть бути прикріплені за їх С-кінець до частини або до повного важкого ланцюга імуноглобуліну, отриманого від антитіла будь-якого ізотипу, наприклад, Ідс, ІдА, ІДЧЗЕ, ІдО та ЗМ та від будь-якого з підкласів ізотипів, особливо Ід, Ідсе26, Ідог2а, Ідсез та Ідс4. 00165) Крім того, описані тут антитіла можуть також бути змінені таким чином, щоб вони набули здатність перетинати гематоенцефалічний бар'єр. Таке змінення антитіл, описаних вище дозволяє лікувати захворювання мозку, як--о мультиформну гліобластому (ВМ).
Зразкові модифікації, які дозволяють білкам, як-то антитілам, перетинати гематоенцефалічний бар'єр описані у патенті США 5 Раїепі Рибіїсайоп 20070082380, повністю включеному сюди у якості посилання. 00166) Було показано, що глікозилування імуноглобулінів значно впливає на їх ефекторні функції, структурну стійкість та швидкість їх виділення клітинами, які їх продукують (Геаїйегбатом еї аї., Мої. Іттипої. 22:407 (1985)). Відповідні за ці властивості вуглеводні групи звичайно є прикріпленими до сталих (С) ділянок антитіл. Наприклад, глікозилування дос по
Зо аспарагіну 297 у Сн 2 домені є необхідним для набуття максимального потенціалу антитіл Їдс у активуванні класичного шляху комплемент-залежного цитолізу (Тао апа Моїгтізоп, «). Іттипо). 143:2595 (1989)). Глікозилування ДМ по аспарагіну 402 у Сн З домені є необхідним для належної збірки та цитолітичної активності антитіл (МигаоКа апа 5пиїЇтап, у. Іттипої. 142:695 (1989)). Усунення сайтів глікозилування у положеннях 162 та 419 у доменах Сн 1 та Сн З антитіл
ІДА веде до внутрішньоклітинної деградації та принаймні до 9090 пригнічення секреції (Тауїюг апа умаїї, Мої. Сеїї. Вісі. 8:4197 (1988)). Додатково можуть бути отримані антитіла або досягнута експресія антитіл, які не будуть містити фукозу на їх складних цукрових ланцюгах з приєднаним
М-глікозидом. Відомо, що усунення такої фукози підвищує ефекторні функції антитіл та антиген- зв'язуючих фрагментів, в том числі, але без обмеження, залежну від антитіл клітинно- опосередковану цитотоксичність (АОСС) та комплемент-залежну цитотоксичність (СОС). Ці «дефукозиловані" антитіла можуть бути отримані з допомогою різних систем з застосуванням відомих у цій галузі способів молекулярного клонування, до яких залучені, але без обмеження, трансгенні тварини, трансгенні рослини або клітинні лінії, змінені шляхом генетично-інженерних способів таким чином, що вони більше не містять ферментів та біохімічних шляхів, необхідних для включення фукози у складні цукрові ланцюги з приєднаним М-глікозидом (також відомі під назвою тварин, рослин та клітин з фукозилтрансферазним «нокаутом»). Необмежені приклади клітин, з яких можна створити клітини з фукозилтрансферазним "нокаутом'охоплюють клітини
СНО, 5Р2/О, М50 та УВ2/0.
І00167| Також дослідники спостерігали глікозилування імуноглобулінів у змінній (М) ділянці. ох та Носой повідомили, що приблизно 2095 антитіл людини є гліколізованими у М-ділянці (Ргос.
Майн. Асай. сі. ОБА 66:975 (1970)). Вважається, що глікозилування М-домену виникає через випадкову наявність сигналу М-приєднаного глікозилування Азп-Хаа-5ег/ТПг у послідовності М- ділянки та не доведено, що воно відіграє роль у функціонуванні імуноглобуліну.
ЇО0168| Глікозилування у залишку змінного домену каркасної ділянки може змінити зв'язувальну взаємодію антитіла з антигеном. Заявленим винаходом створені критерії, з допомогою яких обмежену кількість амінокислот у складі каркасної ділянки або СОК-ділянок ланцюга імуноглобуліну можна буде вибрати для мутації (наприклад, шляхом заміщення, усунення або додавання залишків) з метою підвищення спорідненості антитіл.
І00169| Спорідненість до зв'язування антигену може, звичайно, бути зменшена шляхом 60 введення однієї або декількох мутацій у М-ділянку каркасної ділянки, звичайно у ділянки,
прилеглі до одного або до кількох СОК та/або у одну або у декілька каркасних ділянок.
Звичайно такі мутації передбачають введення заміщень консервативних амінокислот, які або руйнують або створюють послідовності сайту глікозилування, але суттєво не зачіпають гідрофобні структурні властивості поліпептиду та при цьому звичайно уникають мутацій, пов'язаних з введенням пролінового залишку. Глікозилування антитіл додатково описано у патенті США Мо. 6 350 861, вміст якого, який стосується глікозилування включений сюди у якості посилання.
ІЇ00170| Можуть також бути отримані антитіла, призначені для короткострокової або для довгострокової доставки. 00171) Антитіла, які зв'язуються з СЮО1О5 також можуть бути застосовані для очищення
СО105 та/або для визначення рівнів СЮО105 у зразку або у організмі пацієнті для визначення або для діагностики захворювання або розладу, пов'язаного з СЮО105, як більш детально описано нижче.
І00172| Отримані з застосуванням таких способів антитіла, які зв'язують СЮО105 можуть бути перевірені на одну або на декілька їх властивостей, як-то спорідненість зв'язування, авидність та нейтралізуючі можливості. Корисні антитіла можуть бути застосовані для введення пацієнту для запобігання, пригнічення, стримування або лікування стану, захворювання або розладу, пов'язаного з ангіогенезом.
Ї00173| Антитіла можна оцінити відносно однієї або декількох притаманних їм характеристик, як-то спорідненість зв'язування, авидність та швидкості асоціації та дисоціації. У одному аспекті антитіла можна оцінити на їх здатність до нейтралізовування активності СО105 або МЕСЕ. Вимірювання спорідненості зв'язування авидності та швидкостей асоціації та дисоціації може бути здійснено з застосуванням відомих у цій галузі способів, як-то, але без обмеження, імуноферментний аналіз (ІФА), аналіз Скетчарда, аналіз з допомогою системи
Віасоге (поверхневий плазмонний резонанс) тощо, а також з допомогою інших загальноприйнятних відомих фахівцям у цій галузі способів аналізу.
І00174| Вимірювання зв'язування антитіл з СО105 та/або здатності антитіл, наприклад, пригнічувати ангіогенез може бути визначено з застосуванням, наприклад, імуноферментного аналізу (ІФА), аналізу конкурентного зв'язування, аналізу ЕГІБРОТ або будь-якого іншого
Зо корисного відомого у цій галузі аналізу. Ці аналізи є загальноприйнятними та відомими пересічним фахівцям у цій галузі. 00175) У одному необмеженому втіленні для вимірювання зв'язувальної здатності певних антитіл, які зв'язуються з СЮО105 може бути застосовано ІФА-аналіз. 00176) Аналізи, як-то ІФА, також можуть бути застосовані для визначення антитіл, які демонструють підвищену специфічність до СО105 у порівнянні з іншими антитілами. Аналізи, як-то ІФА, також можуть бути застосовані для визначення антитіл, які зв'язуються з епітопами через один або декілька поліпептидів та через один або декілька видів СО105 або МЕСБЕ. Аналіз специфічності може бути проведено шляхом здійснення паралельних ІФА-аналізів, в яких досліджуване антитіло одночасно перевіряють у різних камерах для аналізу на здатність до зв'язування одного або кількох епітопів з різними видами поліпептиду, який містить епітопи
СО105 для визначення антитіл, які зв'язуються з СО105. Іншим відомим фахівцям у цій галузі способом вимірювання виявленої спорідненості зв'язування є спосіб поверхневого плазмонного резонансу (аналіз здійснюють з допомогою системи ВІАСОКЕ 2000) (І Шебіайд, еї аї., сіІусо. 9. 2000, 17:323-329). Стандартні вимірювання та традиційні способи аналізу зв'язування описані у
Неег!вєу, В. Р., Епаостг. Нез. 2002, 28:217-229. (00177) Антитіла, які специфічно зв'язуються з СЮО105 також можуть бути досліджені на їх здатність до лікування різних захворювань та станів, пов'язаних з ангіогенезом у зв'язку з різними формами раку (наприклад, первинними пухлинами, рецидивними пухлинами та метастазами). Для перевірки цих ефектів може бути застосовано будь-якій прийнятний та відомий будь-якому фахівцю у цій галузі аналіз та деякі подібні способи описані тут. У одному прикладі, описані тут антитіла досліджують на їх здатність до зв'язування СО105. У іншому прикладі, константи спорідненості для описаних тут антитіл визначають шляхом поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК). У іншому прикладі, описані тут антитіла досліджують на їх вплив на пригнічення ангіогенезу.
ЇО0О178| Крім активного інгредієнта створені тут композиції (анти-СО105 антитіла або їх фрагменти) можуть додатково містити фармацевтично прийнятний наповнювач, носій, буфер, стабілізатор, поверхнево-активну речовину або інші добре відомі фахівцям у цій галузі матеріали. Такі матеріали повинні бути нетоксичними та не впливати на ефективність активного інгредієнта (інгредієнтів). Точна природа носія або іншого матеріалу буде залежати від шляху
Гс10) введення.
І00179| Заявленим винаходом створені нові композиції анти-СО105 антитіл, попередньо заповнені шприці, які містять композиції та застосування таких композицій, корисних у лікуванні розладів, пов'язаних з ангіогенезом. Цією заявкою також створені композиції, які можуть бути застосовані для внутрішньовенного або внутрішньоочного введення, наприклад, для лікування пов'язаних з СЮО105 захворювань на рак та офтальмологічних станів. Описані тут зв'язування, спорідненість, авидність та активність антитіл або їх антиген-зв'язуючих фрагментів до СО105 тут можуть бути оцінені з допомогою відомих у цей способів, включаючи, але не без обмеження, описані вище та нижче у Прикладах способи аналізу.
ІЇ00180| У одному аспекті, заявленим винаходом передбачено композицію, яка містить приблизно 1-150 мг/мл анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента, до 100
ММ буферизуючого агента, до 1 М поліолу та має рнН, який дорівнює приблизно 4,0-7,5. 00181) У одному аспекті, композиція є стійкою після отримання, що може бути перевірено у відповідності зі стандартними засобами. Безпечне застосування композицій, які містять білки та поводження з ними створюють значні труднощі для фармацевтичних рецептур. Білки володіють унікальними хімічними та фізичними властивостями, які мають проблеми, пов'язані зі стійкістю, тобто існують різні шляхи деградації білків, в тому числі як хімічна, так і фізична нестійкість.
Хімічна нестійкість охоплює дезамінування, агрегацію, усічення пептидного каркасу та окислення залишків метіоніну. Фізична нестійкість охоплює багато явищ, у тому числі, наприклад, агрегацію. 00182) "Стійка" композиція є такою, у якої білок у його складі суттєво зберігає свою фізичну та/або хімічну стійкість та/або біологічну активність протягом зберігання. Різні аналітичні способи вимірювання стійкості білка є прийнятними у цій галузі та огляд їх можна знайти, наприклад, у книгах Реріїде апа Ргоївіп Огид Оеїїмегу (Доставка ліків на основі пептидів та білків"), 247-301, Міпсепі І єе Ейа., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем Могк, М.У., Рибв. (1991) апа допев, А.
Аду. Огид Оеїїмегу Кеум. ("Розширений огляд доставки ліків") 10: 29-90 (1993). Стійкість може бути виміряна при вибраній температурі та у вибраному періоді часу. Переважним чином, композиція є стійкою при кімнатній температурі (приблизно 3072) або при 407"С протягом принаймні 1 місяця та/або стійкою при температурі приблизно 2-8"С протягом принаймні 1 року або принаймні 2 років. Крім того, композиція може бути стійкою після заморожування (наприклад, до -80"С) та відтавання. 00183) Білок "зберігає свою фізичну стійкість" у складі фармацевтичної композиції, якщо він не демонструє ознак агрегації, осаджування та/або денатурації під час візуальної перевірки кольору та/або прозорості або як було виміряно шляхом розсіювання УФ-випромінювання або шляхом ексклюзійної хроматографії (ЕС). Способи визначення таких вимірювань відомі у цій галузі та більш детально описані нижче. 00184) Білок "зберігає свою хімічну стійкість" у композиції, якщо хімічна стійкість у даний момент часу є такою, що білок, як вважають, як і раніше зберігає свою біологічну активність, як визначено нижче. Хімічну стійкість можна оцінити шляхом виявлення та кількісного аналізу хімічно змінених форм білка. Хімічна зміна може охоплювати змінення розміру (наприклад, усічення), які можуть бути оцінені з допомогою, наприклад, ексклюзійної хроматографії, електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (50О5-РАСЕ) та/або матрично-активованої лазерної десорбції/онізації/мас-спектрометрії з часом прольоту (МАГОІ/ТОБ М5), Інші типи хімічних змінень охоплюють змінення заряду (наприклад, що виникають внаслідок дезамідування), які можуть бути оцінені, наприклад, з допомогою іонообмінної хроматографії або капілярного електрофорезу та ізоелектричного фокусування (СІЕЄ).
Ї00185| Антитіло "зберігає свою біологічну активність" у композиції, якщо біологічна активність антитіл у даний момент часу дорівнює, наприклад, приблизно 50-15095 (у межах похибки аналізу) від біологічної активності, яку спостерігали при отриманні композиції, як визначено, наприклад, шляхом аналізу зв'язування антигену. Інші аналізи "біологічної активності" для антитіл висвітлені нижче. 00186) Щодо стійкості композиції протягом часу, то принаймні 9595 анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагменту може бути присутніми у вигляді мономерів після принаймні приблизно 12-місячного зберігання при температурі приблизно 2-8"С, як було виміряно шляхом ексклюзійної хроматографії (ЗЕС). Також тут передбачено застосування додаткових визнаних у цей галузі способів оцінки стійкості охоплюючи, але без обмеження, способи, описані у
Прикладах.
І00187| Додатково анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент може демонструвати приблизно 50-15095 зв'язування при вимірюванні шляхом ІФА-аналізу бо зв'язування СО105 після їх зберігання з температурою приблизно 2-8 "С протягом принаймні приблизно 12 місяців. 00188) Середня ізоелектрична точка (рі) анти-СО105 антитіла після його зберігання з температурою приблизно 2-8 "С протягом принаймні приблизно 12 місяців може дорівнювати приблизно 8.8-9.2, як було виміряно шляхом, наприклад, капілярного електрофорезу та ізоелектричного фокусування. 00189) Зрозуміло, що анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент може зберігати стійкість протягом принаймні приблизно 12 місяців, принаймні приблизно 18 місяців, принаймні приблизно 24 місяців, принаймні приблизно 30 місяців, принаймні приблизно 36 місяців або ще більше.
І00190| Композиція може містити принаймні 9595 анти-СО105 антитіла у вигляді мономеру, як було виміряно шляхом 5ЕС після циклів заморожування та відтавання композиції.
Альтернативним або додатковим чином композиція може містити принаймні 9595 анти-СО105 антитіла у вигляді мономеру, як було виміряно шляхом 5ЕсС зі струшуванням композиції. (00191) Анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент може містити будь-яку послідовність, СОК-ділянки у складі якої є здатними до зв'язування з СО105. У одному необмеженому втіленні анти-СО105 антитілом є ТКС105, яке містить змінну ділянку легкого ланцюга (М), що має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Ме: 1; сталу ділянку легкого ланцюга (СІ), яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮО Мо: 2; змінну ділянку важкого ланцюга (УН), яка має амінокислотну послідовність, позначену як ХЕО ІЮ Мо: 3; та сталу ділянку (Ес), яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 4. 00192) У іншому необмеженому втіленні анти-СО105 антитіло містить ділянку М СОКТ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ХЕО ІО Мо: 5; М СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 6; МІ СОКЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІО Мо: 7; МН СОКТ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ЗЕО ІЮ
Мо: 8; МН СОК2, яка має амінокислотну послідовність, позначену як зЕО ІЮ Мо: 9; та МН СОКЗ, яка має амінокислотну послідовність, позначену як 5ХЕО ІЮО Мо: 10. 00193) Композиція може містити приблизно 1-150 мг/мл анти-СО105 антитіл або їх антиген- зв'язуючих фрагментів або будь-яку їх кількість (включаючи, але без обмеження, приблизно 2 мг/мл, приблизно 5 мг/мл, приблизно 7.5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, 20 мг/мл, приблизно 25
Ко) мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 65 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 75 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 85 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 95 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 105 мг/мл, приблизно 110 мг/мл, приблизно 115 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 125 мг/мл, приблизно 130 мг/мл, приблизно 135 мг/мл, приблизно 140 мг/мл, приблизно 145 мг/мл, приблизно 150 мг/мл або більше або вона може дорівнювати будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. Як тут застосовано відносно до концентрацій антитіла, термін "приблизно" означає х 295 вказаного значення. 00194) У одному втіленні композиція містить приблизно 25 мг/мл анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента. У іншому втіленні композиція містить приблизно 50 мг/мл анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента. У іншому втіленні композиція містить приблизно 100 мг/мл анти-СО105 антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента. 00195) Як тут описано, композиції можуть містити буферизуючий агент, як-то, наприклад, гістидин, ацетат, цитрат або фосфат. Буферизуючі агенти можуть бути включені у кількості приблизно 5-100 мМ. У одному втіленні композиція містить приблизно 5 мМ, приблизно 7.5 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 12.5 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 17.5 мМ, приблизно 20 мМ, приблизно 22.5 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 50 мМ, приблизно 55 мМ, приблизно 60 мМ, приблизно 65 мМ, приблизно 70 мМ, приблизно 75 мМ, приблизно 80 мМ, приблизно 85 мМ, приблизно 90 мМ, приблизно 95 мМ або приблизно 100 мМ гістидину, ацетату, цитрату або фосфату або ця концентрація може дорівнювати будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. Як тут застосовано відносно до концентрацій буферу, термін "приблизно" означає ж 295 вказаного значення.
Ї00196| Композиції можуть бути отримані для будь-якого відомого для антитіл типу введення, включаючи, але без обмеження, введення у скловидне тіло та внутрішньовенне введення.
Ї00197| Створені тут композиції можуть додатково містити прийнятний носій або наповнювач, включаючи будь-який носій або наповнювач, який є фармацевтично прийнятним та прийнятним для введення пацієнту. бо ІЇ00198| У одному втіленні передбачена тут композиція є ізотонічною. Типові ізотонічні композиції охоплюють, але без обмеження, композиції з осмотичним тиском приблизно у 250- 350 мОсм. У іншому втіленні передбачена тут композиція є гіпертонічною. Типові гіпертонічні композиції охоплюють, але без обмеження, композиції з осмотичним тиском приблизно у 351- 1000 моОсм. 00199) До описаної тут композиції також можуть бути додані поліоли з концентрацією до 1
М. Наприклад композиція може містити поліол з концентрацією приблизно 50 мМ, приблизно 75
ММ, приблизно 100 мМ, приблизно 150 мМ, приблизно 200 мМ, приблизно 225 мМ, приблизно 240 мМ, приблизно 250 мМ, приблизно 300 мМ, приблизно 350 мМ, приблизно 400 мМ, приблизно 450 мМ, приблизно 500 мМ, приблизно 550 мМ, приблизно 600 мМ, приблизно 650
ММ, приблизно 700 мМ, приблизно 750 мМ, приблизно 800 мМ, приблизно 850 мМ, приблизно 900 мМ, приблизно 950 мМ, приблизно 1 М або з концентрацією, яка дорівнює будь-якому цілому числу, яке існує між цими значеннями. У одному втіленні передбачена тут композиція містить поліол у кількості, меншій, ніж 300 мМ та композицію отримують в ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 100 мМ - 175 мМ. Наприклад, композицію, яка містить поліол у кількості, меншій, ніж 300 мМ отримують в ізотонічному стані з сіллю з концентрацією приблизно 130 мМ. Як тут застосовано відносно до концентрацій поліолу, термін "приблизно" означає х 295 вказаної кількості. У одному аспекті, поліол для застосування у передбачених тут композиціях може бути цукром, як-то, наприклад, невідновлюючим цукром. Типові приклади невідновлюючих цукрів охоплюють, але без обмеження, трегалозу та цукрозу. наприклад, композиція може містити приблизно 200 мМ - 300 мМ трегалози або цукрози. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ трегалози або цукрози. Альтернативним чином, цукор може бути сорбітом у кількості (концентрації) приблизно 200 мМ - 300 мМ. У одному втіленні композиція може містити приблизно 240 мМ сорбіту.
І00200| Додаткові необмежені приклади передбаченої тут композиції є будь-якими з композицій 1-39, наведених у Таблиці 1.
Таблиця 1
Композиція Фосфат ІГістидиніІ Цитрат | Ацетат масі | Трегалоза й й г | 7| 20 | 0 | о | о | 130| 0 | 0 | 25 а |6| 20 | 0 | о | о | 130 | 0 | 0 | 25
Роз | 6| 0 | го | о | о | 130 | 0 | 0 | 25
Я | 5| 0 | го | о | о | 130 | 0 | 0 | 25
Б |6| 0 | 0 | го | о | 130 | 0 | 0 | 25
Роб | 5| 0 | 0 | го | о | 130 | 0 | 0 | 25 о | 4| 0 | 0 | о | го | 130 | 0 | 0 | 25
РОЇ | 5| 0 | 0 | о | го | 130 | 0 | 0 | 25
Ро |5| 0 | го | 0 | о | о | 240 | 0 | 25 по |5| 0 | 0 | 20 | о | о | 240 | 0 | 25 й 5 0 ЇЇ 0 | 0 | го | о | 240 | 0 | 25 па | 6| 10 | 0 | 0 | о | о | 240 | 0 | 25
З |6| 0 | ло | 0 | о | о | 240 | 0 | 25 4 | 6| 10 | 0 | о | о | 80 | 120 | 0 | 25 5 |6| 0 | ло | о | о | 80 | 120 | 0 | 25 мб |7| 20 | 0 | о | о | л130| 0 | 0 | 25 ям7 |6| 20 | 0 | о | о | 130 | 0 | 0 | 25 м |6| 0 | го | о | о | 130 | 0 | 0 | 25 ле |5| 0 | 20 | о | о | 130| 0 | 0 | 25 го | 6| 0 | 0 | го | о | 130 | 0 | 0 | 25 1 |51| 0 | 0 | го | о | лї30| 0 | 0 | 25 2 |4| 0 | 0 | о | го | 130 | 0 | о | 25 23 | 5| 0 | 0 | о | 20 | 130 | 0 | 0 | 25 24 | 5| 0 | го | 0 | о | о | 240 | 0 | 25 25 | 5| 0 | 0 | го | о | о | 240 | 0 | 25 б | 5| 0 | 0 | о | го | 0 | 240 | 0 | 25 27 | 6| 10 | 0 | о | о | о | 240 | 0 | 25 гг | 6| 0 | ло | 0 | о | о | 240 | о | 50
Таблиця 1 о, (мМ) (мМ) (ММ) (ММ) (мМ) (ММ) 29 | 6| 10 | 0 | о | о | 80 | 120 | 0 | 50 ьо |6| 0 | 10 | о | о | 80 | 120 | 0 | 50 1 |7| 17 | 0 | 0 | о |7145| 0 | 0 | 5 32 | 7| 17 | 0 | о | о | 7145| 0 | 0 | 7 33 |55| 0 | го | 0 | о | о | 240 | 0 | 25 34 |55| 0 | го | 0 | 0 | о | 0 | 240 | 25 35 |4| 0 | 0 | о | го | 0 | 0 | 20 | 25 36 |55| 0 | го | 0 | о | о | 240 | 0 | 50 37 |4| 0 | 0 | о | го | о | 240 | 0 | 50 38 |55| 0 | го | 0 | о | о | 240 | 0 | 00 і вггьзьаа |4| 0 | 0 | о | го | 0 | 240 | о | оо
Фосфат. - фосфатно-сольовий буфер;
І00201| Передбачена тут композиція може мати рН приблизно 4,0-7,5. У одному втіленні передбачена тут композиція може мати рН приблизно 4,5, приблизно 5,0, приблизно 5,5, приблизно 6,0, приблизно 6,5 або приблизно 7,0. Як тут застосовано по відношенню до рн, термін "приблизно" стосується значень рН х 0.05, 0,1 або 0 2. 002021) Зрозуміло, що композиції, які містять антитіла або антиген-зв'язуючі фрагменти, визначені з допомогою описаних тут способів можуть бути підготовлені для зберігання шляхом змішування білка, який має бажаний ступінь чистоти з вибірковими фізіологічно прийнятними носіями, наповнювачами та/або стабілізаторами у вигляді водних розчинів (Кетіподоп'є
Рпагтасецшіїса! Зсієпсез 1610 едйіоп, Озої, А. Еа. (1980)). (00203) Прийнятні носії є фізіологічно прийнятними для введення пацієнту та зберігають терапевтичні властивості сполук, з якими/у які їх вводять. Прийнятні носії та їх композиції звичайно описані у, наприклад, Кетіпдіоп' рпагтасеціїса! Зсіепсез (181 Еайоп, єд. А. Сеппаго,
Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА 1990). Одним зі зразкових носіїв є фізіологічний сольовий розчин. Фраза "фармацевтично прийнятний носій", як тут застосовано, означає прийнятний матеріал, композицію або засіб доставки, як-то рідкий або твердий наповнювач, розріджувач, допоміжну речовину та/або розчинник, залучений до перенесення або до транспортування сполук суб'єкта з розташованого на одному органі або частині тіла місця введення до іншого органу або частини тіла. Кожен носій повинен бути прийнятним у сенсі сумісності з іншими інгредієнтами композиції та нешкідливим для суб'єкта, якому його вводять. Прийнятний носій не повинен змінювати специфічну активність сполук суб'єкту. (00204) У одному аспекті створені фармацевтично прийнятні або фізіологічно прийнятні та сумісні з введенням композиції, які містять розчинники (водні або неводні), розчини, емульсії, дисперсні середовища, оболонки, ізотонічні агенти та агенти, які сприяють абсорбції або затримують її. Отже, композиції або препарати є композиціями, прийнятними для терапевтичного та/або діагностичного застосування у суб'єкті. Композиції та препарати містять певну кількість описаної тут сполуки та фармацевтично або фізіологічно прийнятного носія.
Зо 00205) Композиції можуть бути отримані таким чином, щоб бути сумісними з певним шляхом введення (тобто системним або місцевим). Отже, композиції містять прийнятні для введення різними шляхами носії, розріджувачі або наповнювачі. (00206) Композиції можуть бути введені, наприклад, шляхом ін'єкції, включаючи, але без обмеження, підшкірне введення, введення у скловидне тіло, внутрішньошкірне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або внутрішньом'язове ін'єкційне введення. Також до складу композиції можуть бути включені ізотоничні агенти, як-то цукри, багатоатомні спирти, як-то як маніт та сорбіт, а також хлорид натрію. Отримані розчини можуть бути упаковані для застосування як є або у ліофілізованому вигляді та у цьому разі така ліофілізована композиція потім перед введенням може бути об'єднаною зі стерильним розчином. Для внутрішньовенної ін'єкції або ін'єкції у місце ураження активний інгредієнт може знаходитися у формі парентерально прийнятного водного розчину, який є апірогенним та має прийнятний рН, ізотонічність та стійкість. Будь-які кваліфіковані фахівці у цій галузі цілком здатні отримати відповідні розчини з застосуванням, наприклад, прийнятних для ін'єкції изотонічних носіїв, як-то хлорид натрію, розчин Рингера або лактований розчин Рингера. У разі необхідності ці розчини також можуть містити консерванти, стабілізатори, буфери, антіоксиданти та/або інші домішки. Стерильні прийнятні для ін'єкційного введення розчини можуть бути отримані шляхом поєднання активного інгредієнта у потрібній кількості у прийнятному розчиннику з одним з перелічених вище інгредієнтів або з комбінацією таких інгредієнтів з наступною стерилізацією шляхом фільтрування.
І00207| У одному втіленні описана тут композиція не містить поверхнево-активних речовин.
У іншому втіленні описана тут композиція вибірково містить поверхнево-активні речовини, як-то, наприклад, полісорбат 20 або 80, ТУУЕЕМ-, РІ ЮВОМІС? Еб68 або поліетиленгліколь (ПЕГ). (00208) Якщо композиції розглядають для застосування у складі лікарських композицій або у будь-яких з описаних тут способів, то передбачається, що вони можуть бути суттєво апірогенними та при введенні пацієнтуу/людині вони не будуть викликати запальних або небажаних алергічних реакцій. Перевірка композицій на пірогени та отримання суттєво апірогенних композицій є добре відомими для пересічних фахівців у цей галузі процедурами та вони можуть бути здійснені з застосуванням наявних у продажу наборів.
І00209| Фраза "фармацевтично прийнятний" має відношення до молекулярних об'єктів та композицій, які є фізіологічно толерантними та звичайно при введені суб'єкту не спричинюють алергічних або подібних несприятливих реакцій, як-то розлад шлунку, запаморочення тощо. (00210) Термін "одиниця дози" при застосуванні по відношенню до терапевтичної композиції має відношення до фізично різних одиниць, прийнятних у якості унітарного дозування для суб'єктів, де кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активного матеріалу, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту у поєднанні з потрібним розріджувачем; тобто носієм або засобом доставки.
І00211| Композиції можна вводити сумісним з лікарським способом та в терапевтично ефективній кількості. Кількість, яку треба вводити залежить від суб'єкта, який підлягає лікуванню, здатності імунної системи суб'єкта застосовувати активний інгредієнт та від ступеня бажаної зв'язувальної здатності. Точні необхідні для введення кількості активного інгредієнта залежать від розсуду лікаря та є індивідуальними для кожної людини. Прийнятні схеми первісного введення та бустерних доз також варіюють, але є типізованими у вигляді початкового введення з наступними повторними дозами з одним або кількома годинними інтервалами з наступною ін'єкцією або іншим типом введення. Крім того, також розглядаються
Зо безперервні внутрішньовенні вливання, достатні для підтримки концентрації в крові. 00212) Одним втіленням передбачено застосування описаної тут композиції для отримання лікарського засобу для лікування описаного тут розладу або стану. Лікарські засоби можуть бути сформульовані на основі фізичних характеристик пацієнта/суб'єкта, який потребує лікування та можуть бути отримані у вигляді одного або кількох композицій у залежності від стадії стану, захворювання або розладу. Лікарські засоби можуть бути запакованими у прийнятне пакування з відповідним маркуванням для розподілення по лікарням та клінікам з показаннями по лікуванню суб'єкту, який має описане тут захворювання. Лікарські засоби можуть бути запакованими у вигляді однієї або кількох одиниць.
Ї00213| Також заявленим винаходом передбачено попередньо наповнений шприц, прийнятний для внутрішньовенного введення або введення у скловидне тіло, який містить описаний тут композиція. Такі попередньо заповнені шприці також можуть бути запаковані та помічені маркуванням для застосування у лікуванні пов'язаного з ангіогенезом стану, як-то будь-який з описаних тут станів. Додатково пакування цих композицій може містити інструкції по зберіганню та застосуванню. Заявленим винаходом передбачено пакування, яке містить один або декілька попередньо заповнених шприців, прийнятних для внутрішньовенного введення або введення у скловидне введення, що містять композиція за будь-яким з попередніх пунктів.
Також заявленим винаходом передбачено отримання лікарського засобу, який містить описану тут композицію для лікування стану, пов'язаного з ангіогенезом, як-то будь-якого з описаних тут станів.
Способи лікування.
І00214| Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування суб'єкта (людини або іншої живої істоти) шляхом введення суб'єкту композиції антитіл, які переважним чином зв'язуються з
СО0105. Також створені способи запобігання або лікування одного або декількох захворювань або розладів, пов'язаних з ангіогенезом/неоваскуляризацією, надмірною васкуляризацією, ростом пухлин, розповсюдженням пухлинних клітин або розвитком малих судин, який полягає у веденні композиції, що містить анти-СО105 антитіло або його антиген-зв'язуючий фрагмент, тим самим забезпечуючи запобігання, лікування, пом'якшення або послаблення перебігу або тяжкості захворювання.
І00215| Ефективної відповіді за заявленим винаходом досягають, коли суб'єкт відчуває 60 затримку або часткове або повне полегшення або зменшення ознак або симптомів хвороби та вона специфічно охоплює, без обмеження, подовження періоду виживання. Очікуваний період виживання без випадків прогресування захворювання може бути виміряним у вигляді місяців або років у залежності від прогностичних факторів, які охоплюють кількість рецидивів захворювання, стадію захворювання та інші фактори. Пролонговане виживання охоплює, без обмеження, час, який сягає принаймні 1 місяць, приблизно принаймні 2 місяці, приблизно принаймні З місяці, приблизно принаймні 4 місяці, приблизно принаймні 6 місяців, приблизно принаймні 1 рік, приблизно принаймні 2 роки, приблизно принаймні З роки, приблизно принаймні 4 роки, приблизно принаймні 5 років тощо або будь-який інтервал між ними. Загальне виживання або виживання без випадків прогресування захворювання може бути також виміряно строком від місяців до років. Альтернативним чином, ефективною відповіддю може бути така, при якої ознаки або симптоми суб'єкта або маса злоякісних пухлин залишаються незмінними та не погіршуються. Додатково показання до лікування більш детально описані нижче. (00216) Композиції описаних тут антитіл можуть бути застосовані у якості нетерапевтичних агентів (наприклад, у якості агентів афінної очистки). Звичайно, у одному такому втіленні інтересуючий білок з допомогою стандартних відомих у цій галузі способів імобілізують на твердому носії, як-то смола бЗерпадехФб або фільтрувальний папір та такий імобілізований білок контактує зі зразком, що містить інтересуючу речовину (або її фрагмент) для його очищення, після чого підтримуючий носій промивають прийнятним розчинником, який усуває суттєво весь сторонній матеріал у зразку за виключенням білка-мішені, який є зв'язаним з імобілізованим антитілом. Зрештою підтримуючий носій промивають іншим прийнятним розчинником, як-то гліциновим буфером, рН 5.0, який вивільнює цільовий білок. Додатково, крім очищення, композиції можуть бути застосовані для визначення, діагностики та терапії пов'язаних з СЮО105 захворювань та розладів.
І00217| Визначений тут термін "контактування" означає засоби залучення композиції, як тут передбачено, до фізичної близькості з клітиною, органом, тканиною або рідиною, як тут описано. Контактування охоплює системні або місцеві введення будь-якої з передбачених тут композицій та також охоплює, але без обмеження, процедури та способи іп міїго, іп мімо та/або ех мімо. "Комбінування" та "контактування" тут застосовані взаємозамінне та покликані бути визначені таким саме чином. Для застосувань іп мімо контактування може відбуватися,
Зо наприклад, шляхом введення композиції пацієнту будь-як прийнятним способом. Композиції з фармацевтично прийнятними наповнювачами та носіями більш детально описані вище. (00218) Як тут застосовано, "запобігання" має відношення до профілактики, запобігання перебігу ознак або симптомів, запобігання прогресування захворювання або розладу, пов'язаного з ангіогенезом або розладу, який корелює з активністю СО105. У одному необмеженому втіленні пацієнтам з діагнозом першої стадії раку може бути введено описану тут композицію, тим самим запобігаючи розвитку другої стадії раку. У ще іншому втіленні описана тут композиція може бути введеною пацієнту, який не має симптомів, але є тест-позитивним на один з біомаркерів раку, тим самим запобігаючи розвитку цієї хвороби. Як тут застосовано, терміни "пригнічення" та "лікування" тут застосовують взаємозамінне та вони означають, наприклад, затримку розвитку ознак або симптомів, пролонгування виживання, часткове або повне покращення ознак або симптомів та часткове або повне усунення пухлин або метастазів.
І00219| "Суб'єкт" або "пацієнт" (наприклад, ссавець, як-то людина або тварина, яка не є людиною, як-то примати, гризуни, корови, коні, свині, вівці, верблюди, лами тощо.) може бути ссавцем, який демонструє один або декілька клінічних проявів та/або ознак або симптомів описаного тут захворювання або розладу. У певних випадках суб'єкт може бути безсимптомним та все-таки мати клінічні прояви захворювання або розладу. Антитіло може бути кон'юговано до терапевтично функціональної групи або бути злитим білком, який містить терапевтично функціональну групу. Також антитіло може бути кон'юговано до прийнятної для визначення функціональної групи або бути злитим білком, який містить прийнятну для визначення функціональну групу. У одному втіленні антитіло може бути кон'юговано як до терапевтичної функціональної групи, так і до прийнятної для визначення функціональної групи. Антитіло може бути кон'юговано до афінної мітки або рекомбінантним чином побудовано разом з нею (наприклад, з міткою очистки). Афінні мітки є стандартними у цій галузі. (00220) Створені тут антитіла або їх фрагменти є такими, що вони можуть бути кон'юговані або приєднані до терапевтичної функціональної групи та/або здатної до візуалізації або прийнятної для визначення функціональної групи та/або до афінної мітки. Способи кон'югації або зв'язування поліпептидів є добре відомі у цій галузі. Асоціації (зв'язування) між сполуками та мітками охоплює будь-які відомі у цій галузі засоби, як-то, але без обмеження, ковалентні та не ковалентні взаємодії, хімічну кон'югацію, а також рекомбінантні способи. бо І00221| Застосований тут термін "ангіогенез"' охоплює всі аспекти підтримки та розвитку кровоносних судин. Отже, ангіогенез охоплює утворення нових капілярних кровоносних судин (або де помо або з попередньо існуючих судин), яке веде до неоваскуляризації, а також підтримання та контроль існуючої судинної системи та малих кровоносних судин. Ангіогенез є комплексним процесом, який полягає у серії послідовних кроків, включаючи ендотеліальну клітинно-опосередковану деградацію судинної базальної мембрани та інтерстиціальних матриць, міграцію ендотеліальних клітин, проліферацію ендотеліальних клітини та утворення ендотеліальними клітинами капілярних петель. Ангіогенез також охоплює ріст та/або розвиток нових кровоносних судин (також позначених, як неоваскуляризація), розповсюдження малих судин, надлишковий або подовжений ріст судин та підтримання існуючої судинної системи. (00222) Застосований тут термін "захворювання, пов'язане з ангіогенезом" означає певні патологічні процеси у людини з аномальною пролонгацією ангіогенезу. Також цей термін охоплює ангіогенезні стани та захворювання, як-то захворювання та стани, які мають відношення до ангіогенезу, викликані ангіогенезом або пов'язані з ангіогенезом. Необмежені приклади таких захворювань охоплюють різні форми раку та метастазів, дегенерацію жовтої плями та хороїдальну неоваскуляризацію. Описані тут антитіла можуть бути застосовані для лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом шляхом зв'язування СО105 та пригнічення ангіогенезу. (00223) Застосований тут термін "анти-ангіогенна терапія" означає терапію, спрямовану до клітин та/або судинної системи, в якій відбувається експресія СО105 (підвищені рівні експресії у проліферативній судинній системі порівняно до судинної системи у стані спокою); та додатково охоплює терапію, яка є спрямованою проти ангіогенезу (тобто проти утворення нових капілярних кровоносних судин, яке веде до неоваскуляризації), терапію, яка є спрямованою проти існуючої судинної системи та/або надмірної васкуляризації або росту кровоносних судин, терапії, яка спрямована проти розповсюдження малих судин та терапії, яка спрямована до захворювання або стану (наприклад, судинно-спрямована терапія). Зразкові захворювання або стани, створені межами винаходу охоплюють, але без обмеження, різні форми раку та метастазів. (00224) Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом у пацієнта (суб'єкта), який потребує такого лікування, який полягає у введенні
Зо зазначеному пацієнту описаної тут композиції. Такі композиції можуть бути введені пацієнту шляхом введення у скловидне тіло або внутрішньовенно. (00225) Описані тут захворювання, пов'язані з ангіогенезом можуть бути, наприклад, раком або метастазами. У одному втіленні рак є твердою пухлиною. Захворювання на рак, які підлягають лікуванню охоплюють, наприклад, пухлини на основі епітеліальної тканини.
Необмежені приклади захворювань на рак, які підлягають лікуванню зазначеними композиціями охоплюють, але без обмеження, рак легенів, гінекологічні злоякісні новоутворення, меланому, рак молочної залози, підшлункової залози, рак яєчників, рак матки, колоректальний рак, рак передміхурової залози, рак нирки, рак голови, рак підшлункової залози, рак печінки (гепатоцеллюлярний рак), раку матки, рак шиї, рак нирки (рак ниркових клітин), саркому, мієлому та лейкози. Сполуки для лікування раку або метастазів можуть бути введені пацієнту внутрішньовенно. (00226) Альтернативним чином, описане тут пов'язане з ангіогенезом захворювання може бути, наприклад, офтальмологічним станом. Офтальмологічні стани охоплюють, але без обмеження, вікову макулодистрофію, діабетичну ретинопатію, макулярний набряк та/або хоріоїдальну неоваскуляризацією. Вікова макулодистрофія (ВМД) може бути сухою та вологою.
Композиції для лікування офтальмологічного стану можуть бути введені пацієнту шляхом введення у скловидне тіло.
І00227| З допомогою таких способів композиція може бути введена пацієнту один або кілька разів. Наприклад, композиція може бути введена пацієнту раз на добу, раз на тиждень, раз на місяць, раз на два місяці, раз на кожні два місяці, раз на кожні три місяці, раз на кожні чотири місяці, раз на кожні 5 місяців або раз на кожні 6 місяців. Якщо це потрібно, то схеми лікування можуть бути підсилені або полегшені у залежності від відповіді пацієнта на лікування. (00228) У одному аспекті композицію вводять до зменшення однієї або декілька ознак або симптомів захворювання, пов'язаного з ангіогенезом.
І00229| Щодо офтальмологічних станів, то одна або декілька ознак або симптомів можуть охоплювати, але без обмеження, скорочення кровоносних судин, пригнічення проліферації ендотеліальних клітин, пов'язаної з офтальмологічним захворюванням, усунення ознак або симптомів кровотечі, лікування замутненого зору, досягнення затримки втрати зору, покращення зору та/або запобігання витоку крізь кровоносні судини. бо 002301) Відносно раку або метастазів, то лікування може привести до покращення стану пацієнта та може бути оцінено шляхом визначення наявності одного або кількох наступних факторів, як-то зменшення клітинної проліферації, зменшення кількостей клітин, підвищення апоптозу або зниження виживання принаймні частини клітин, що містить клітинний проліферативний розлад.
І00231| Лікування може привести до часткового або загального усунення пухлин або метастазів та/або до пролонгації виживання пацієнта. 00232) У одному втіленні тяжкість або тривалість перебігу однієї або кількох ознак або симптомів після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції зменшується приблизно на 295, приблизно на 595, приблизно на 1095, приблизно на 1595, приблизно на 2095, приблизно на 2595, приблизно на 3095, приблизно на 3595, приблизно на 4095, приблизно на 4595, приблизно на 5095, приблизно на 5595, приблизно на 6095, приблизно на 6595, приблизно на 7095, приблизно на 7595, приблизно на 8095, приблизно на 9095, приблизно на 9595 або приблизно на 10095. 00233) У одному втіленні тяжкість або тривалість перебігу однієї або кількох ознак або симптомів після введення пацієнту однієї або декількох доз композиції зменшується приблизно у 2 рази, приблизно у 5 разів, приблизно у 10 разів, приблизно у 15 разів, приблизно у 20 разів, приблизно у 25 разів, приблизно у 30 разів, приблизно у 35 разів, приблизно у 40 разів, приблизно у 45 разів, приблизно у 50 разів, приблизно у 55 разів, приблизно у 60 разів, приблизно у 65 разів, приблизно у 70 разів, приблизно у 75 разів, приблизно у 80 разів, приблизно у 90 разів, приблизно у 95 разів, приблизно у 100 разів або ще більше.
ІЇ00234| Заявленим винаходом передбачено спосіб лікування офтальмологічного стану у пацієнта, який того потребує, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого одна або декілька ознак або симптомів зазначеного офтальмологічного стану покращується шляхом лікування. Введення композиції може бути введенням у скловидне тіло.
І00235| Також заявленим винаходом передбачено спосіб запобігання або лікування раку або метастазів у суб'єкта, який цього потребує, який полягає у введенні зазначеному пацієнту описаної тут композиції, в результаті чого покращується одна або декілька ознак або симптомів зазначеного раку або метастазів. Введення композиції може бути внутрішньовенним.
Зо І00236| Терміни "рецидив, "загострення" або "рецидивний" мають відношення до повернення раку або іншої хвороби після клінічного визначення її зникнення. Діагностику віддалених метастазів або місцевого рецидиву можна також вважати рецидивом.
І00237| Термін "підтримуюча терапія" має відношення до запланованого повторного лікування, яке здійснюють для того, щоб допомогти підтримати попередньо досягнуті лікувальні ефекти. Підтримуючу терапію часто здійснюють для того, щоб допомогти зберегти рак на стадії ремісії або для подовження відповіді на специфічну терапію незалежно від прогресування захворювання. (00238) Термін "виживання без прогресування хвороби" у онкології стосується тривалості часу протягом та після лікування, під час якого не відбувається розвитку раку. Виживання без прогресування хвороби охоплює строк, за який пацієнти отримали повну або часткову відповідь, а також строк, за який пацієнти набули стабілізації стану захворювання.
ІЇ00239| У одному аспекті заявленим винаходом передбачено спосіб запобігання або лікування раку або метастазів у суб'єкта шляхом введення будь-якої передбаченої тут композиції пацієнту, який страждає від раку або метастазів. Такий пацієнт може мати симптоматичний перебіг хвороби або бути безсимптомним.
І00240| У деяких випадках, введення композиції подовжує життя пацієнта, підданого лікуванню, зменшує об'єм пухлин, усуває пухлини, зменшує клітинну проліферацію, підвищує апоптоз пухлинних клітин або їх комбінації. (00241) Якщо це потрібно, способи можуть додатково полягати у хірургічному усуненні раку та/або у введенні додаткового протиракового агенту або у запровадженні відповідного лікування. Протиракові засоби надані тут у іншому місці. (00242) У одному аспекті виникає покращення ознак або симптомів пацієнта, який страждає на рак. Таке покращення може проявлятися у вигляді, наприклад, зменшення болю, зменшення розміру пухлин, усунення пухлин, запобігання збільшення розміру пухлин або розвитку захворювання, запобігання утворення метастазів або пригнічення росту метастазів або у вигляді комбінацій цих ознак. 00243) У одному аспекті, введення описаної тут композиції зменшує або усуває потребу у хірургічній операції або у лікуванні з одним або декількома додатковими протираковими агентами або способами лікування. бо (00244) Композиції, які містять анти-СО105 антитіла можуть бути введені послідовно або
Зо одночасно з композицією, яка містить анти-МЕСЕ антитіла (або їх антиген-зв'язуючі фрагменти).
Такі введення охоплюють, але без обмеження, введення з приблизним 12-тижневим інтервалом, введення з приблизним 8-тижневим інтервалом, введення з приблизним 4- тижневим інтервалом, введення з приблизним 3-тижневим інтервалом, введення з приблизним 2--тижневим інтервалом, введення з приблизним 1-тижневим інтервалом, введення з приблизним 24-годинним інтервалом, введення з приблизним 12-годинним інтервалом, введення з приблизним 6б-годинним інтервалом, введення з приблизним 3-годинним інтервалом, введення з приблизним 1-годинним інтервалом, введення з приблизним 30-хвилинним інтервалом, введення в той же день, в той же час або їх комбінації. Слід також розуміти, що коли передбачено застосування багатьох доз композиції заявленого винаходу та/або комбінованої терапевтичної функціональної групи, то кожну з доз можна буде емпірично визначити з застосуванням відомих доз та концентрацій на основі віку,росту, ваги, стану здоров'я та інших фізичних характеристик суб'єкта з застосуванням стандартів наявних у продажу продуктів. (00245) Композиції можуть бути введені пацієнту у терапевтично ефективній кількості, яка є ефективною для отримання певного бажаного терапевтичного ефекту шляхом пригнічення захворювання або розладу з розумним співвідношенням користі до ризику, яке можна застосувати до будь-якого способу лікування. Для введення пацієнту-людині зазначених композицій, ці композиції можуть бути отримані з застосуванням відомих фахівцям у цій галузі способів. Терапевтично ефективна кількість є кількістю, яка дозволяє досягти принаймні часткового бажаного терапевтичного або профілактичного ефекту у органі або тканині. Кількість анти-СО105 антитіл або анти-МЕСЕ антитіл, необхідних для запобігання та/або терапевтичного лікування захворювання або розладу не є суттєво фіксованою. Кількість введених антитіл може змінюватися з типом та екстенсивністю захворювання та розмірами ураженого цим захворюванням або розладом ссавця. Описані тут антитіла вводять пацієнту у комбінації, як описано вище. Введення у комбінації може мати відношення до введення у вигляді одиничної композиції або окремих композицій.
І00246| Під "введенням" тут мається на увазі надання пацієнту одного або кількох композицій таким чином, що веде до проникнення композиції у організм пацієнта. Таке введення
Ко) може бути здійснено будь-яким шляхом, включаючи, без обмеження, місцеве, регіональне або системне введення підшкірним, внутрішньошкірним, внутрішньовенним, внутрішньоартеріальним, внутрішньочеревним, внутрішньом'язовим шляхом або може бути введенням у скловидне тіло (наприклад, шляхом ін'єкції).
І00247| Актуальні рівні дозування активних інгредієнтів у композиціях можна варіювати таким чином, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка буде ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для певного пацієнта, композиції та способу введення без токсичного впливу на цього пацієнта. Обраний рівень дозування буде залежати від безлічі факторів, які охоплюють активність певної застосованої сполуки, спосіб введення, час введення, швидкість екскреції певної застосованої сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки та/або матеріали, які застосовують в комбінації з певним композиціями, вік, стать, вагу, загальний стан здоров'я та попередню історію хвороби пацієнта, який підлягає лікуванню та від подібних факторів, добре відомих в медичній галузі. 00248) Додатково, доза(дози) антитіл може бути введена двічі на тиждень, щотижнево, кожні 2 тижні, кожні З тижні кожні 4 тижні, кожні б тижнів, кожні 8 тижнів, кожні 12 тижнів, кожні 24 тижні або з будь-якими зазначеними тут тижневими комбінаціями. Також створені цикли дозування, як-то, наприклад, введення антитіл раз або два рази на тиждень протягом 2, 3, 4, 5 або 6 тижнів з наступними 1, 2, 3, 4, 5 або 6 тижнями без терапії. Альтернативним чином, в залежності від відповіді суб'єкта на терапію, час циклу між лікуваннями може дорівнювати 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 місяців. Також винаходом створені додаткові цикли дозування, які охоплюють, наприклад, різні комбінації доз та описані тут тижневі цикли. (002491 Лікар або ветеринар може легко визначити та призначити ефективну кількість (ЕЮО5О) потрібної композиції. Лікар або ветеринар, наприклад, може починати з доз, застосованих у композиції з рівнями, які є нижчими, ніж це потрібно з метою досягнення бажаного терапевтичного ефекту та послідовно підвищувати дозування до досягнення бажаного ефекту.
Альтернативним чином, доза може залишатися постійною.
ІЇ00250| Композиції можуть бути введені пацієнту будь-яким прийнятним шляхом, як-то описано вище. Незалежно від обраного шляху введення, сполуки даного винаходу, які можуть бути застосовані у прийнятній гідратованій формі, та/або композиції отримують у вигляді прийнятних лікарських форм, таких як описано нижче або іншими стандартними способами, бо відомими у цій галузі.
(00251) Для отримання ряду дозувань для застосування до людини можуть бути застосовані результати аналізів клітинної культури та/або досліджень з тваринами. Дозування у цьому діапазоні може змінюватися у залежності від застосованої лікарської форми та застосованого шляху введення. Терапевтично ефективну дозу для будь-якої сполуки можна спочатку дослідити з допомогою аналізів з застосуванням клітинних культур. Для досягнення концентрації циркулювання у плазмі крові, яка включає величину ІСзо (тобто концентрацію досліджуваної сполуки, яка досягає напівмаксимального пригнічення), як визначено у клітинній культурі, можна отримати відповідні дози з допомогою тваринних моделей. Рівні сполуки у плазмі крові можуть бути виміряні, наприклад, шляхом ВЕРХ-хроматографії. Таку інформацію можна застосувати для більше точного визначення корисних доз для людини. Композиції, які містять комбінації сполук також можуть бути досліджені з застосуванням будь-якого з цих способів. (002521) У одному втіленні винаходом передбачено пригнічення ангіогенезу у тканині. Ступінь ангіогенезу у тканині та, отже, ступінь досягнутого пригнічення можна оцінити з допомогою різних способів, як-то описаних тут. (00253) Унікальна специфічність антитіл, які впізнають (наприклад, переважно зв'язують)
СО105 або МЕСЕ та пригнічують ангіогенез передбачає їх діагностичні та терапевтичні застосування у захворюваннях, які відрізняються наявністю ангіогенезу, (неоваскуляризації), дилатацією малих судин, надлишковою васкуляризацією, проліферацією пухлинних клітин та/або пухлинним ростом. Антитіла можуть бути введені суб'єкту, який страждає від різних форм раку (первинні пухлини та метастази). (00254) Зрозуміло, що, крім введення описаних тут композицій тут передбачено, що суб'єкт може також отримувати лікування одним або декількома додатковими пригнічувачами ангіогенезу. (00255) Термін "пригнічувач ангіогенезу застосований тут для цілей цієї специфікації та
Формули Винаходу означає сполуку або молекулу, як-то, але без обмеження, пептиди, білки, ферменти, полісахариди, олігонуклеотиди, ДНК, РНК, рекомбінантні вектори та лікарські засоби, які діють, щоб пригнічувати ангіогенез.
Пригнічувачі ангіогенезу є відомими у цій галузі та всі типи цих сполук створені заявленим
Зо винаходом. Необмежені приклади таких сполук та молекул охоплюють природні та синтетичні біомолекули, як-то паклітаксел, О-(хлорацетил-карбоміл) фумагілол ("ТМР-470" або "АСОМ 1470"), тромбоспондин-1, тромбоспондин-2, ангіостатин, інгібітор ангіогенезу, отриманий з хондроцитів людини ("ПСНІАМР"), інгібітор ангіогенезу, отриманий з хрящів, тромбоцитарний фактор-4, гро-бета, людський інтерферон-індукований білок 10 людини ("ІР10"), інтерлейкін-12,
Ко 318220, трициклодекан-9-іл ксантат ("0609"), ірсогландин, 8,9-дигідрокси-7 метил-бензо (бі хінолізину бромід ("ЗРА 1734"), медроксипрогестерон, поєднання гепарину та кортизону, інгібітори глюкозидази, генистеїн, талідомід, діаміно-антрахінон, гербіміцін, урсолову та олеанолову кислоту. Необмежені приклади антитіл охоплюють антитіла, спрямовані до таких молекул, як МЕСЕ, рецептор МЕСЕ або різні епітопи СО105. Крім того, також відомі та створені тут малі молекулярні пригнічувачі рецептора МЕСЕ. Необмежені приклади пригнічувачів рецепторів МЕСЕ охоплюють композиції ранібізумаб, афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб, пегаптаніб та пазопаніб.
І00256| Різні комбінації цих пригнічувачів рецепторів МЕСЕ можна застосовувати з композиціями, описаними тут. В одному втіленні комбінації можуть призвести до застосування менших доз для описаних тут антитіл або для зв'язування антигену. Такі змінення дозування можуть виникати в результаті синергічних ефектів комбінацій антитіл.
Рак
І00257| СО105 є пов'язаним з пухлинним ангіогенезом та, порівняно з нормальними тканинами, сильно активується у ендотелії різних пухлинних тканин, отже він знаходиться у активованому стані у великому діапазоні клітин пухлинного ендотелію. Крім того, експресія
СО105 у клітинах пухлинного ендотелію є більш сильнішою, ніж у відповідних нормальних тканинах. Таким чином, пригнічення ангіогенезу анти-СО105 антитілами демонструє можливість лікування ракових пухлин. Описані тут композиції можуть бути застосовані для лікування ракових пухлин та метастазів. Також ці композиції можуть бути застосовані для отримання медичних засобів для лікування ракових пухлин та метастазів.
І00258| Однією з цілей протипухлинної терапії є МЕСЕ, оскільки експресія цієї сполуки активується у ряді твердих пухлин. МЕСЕ є головним регулятором ангіогенезу, росту нових судин з судин, які вже існують. Цей процес має фундаментальне значення для росту твердих пухлин, який спирається на утворенні нових кровоносних судин. Деякі низькомолекулярні бо терапевтичні агенти здатні поцілювати у рецептор судинного ендотеліального фактора росту
(СУЕСРК") та таке спрямовування малих молекул терапевтично може привести до протиракових ефектів. Спрямовані до рецептора МЕСЕ агенти небезпосередньо блокують пухлинний ріст шляхом пригнічення утворення нових судин. Пригнічення МЕСЕ-індукованого ангіогенезу може надати протипухлинного або посиленого протипухлинного ефекту без значного пригнічення
МЕСЕ-стимулювання макрофагів, остеокластів або хондрокластів.
І00259| Термін "пухлина" застосовано тут по відношенню до ракових тканин, у яких відбувається експресія СО105 та/або МЕСЕ (порівняно до експресії у нормальних тканинах такого ж типу). Пухлини можуть охоплювати тверді та напівтверді пухлини. Необмежені приклади пухлин охоплюють людські лейкози, включаючи гострий лімфобластний лейкоз іншого, ніж Т-клітинного типу (не-Т) (АСУ), мієло-моноцитарний лейкоз; та тверді та напівтверді пухлини у людини, з їх оточуючою судинною системою, в якій відбувається експресія СО105 на середньому - високому рівні (порівняно до експресії у нормальних тканинах такого ж типу) включаючи, у тому числі, ангіосаркому, рак молочної залози, рак шлунка, рак товстої кишки, лімфому Ходжкіна, лімфому, мультиформну гліобластому (ВМ), рак легенів, меланому, мієлому, остеосаркому, рак яєчників, пухлину привушної залози, рак глотки, рак передміхурової залози, гепатоцелюлярну карциному, рак нирки та рак ректосигмовидного відділу ободочної кишки.
І00260| Ракова тканина підлягає лікуванню, якщо, наприклад, у ендотеліальній тканині спостерігається експресія аномального рівня СО105 та/або МЕСБЕ. 00261) За відсутністю неоваскуляризації пухлинної тканини ця тканина не отримує потрібні живильні речовини, уповільнює в рості, припиняє додаткове зростання, регресує та в кінцевому рахунку стає некротичною, що веде до загибелі пухлини. У цій роботі створені способи пригнічення новоутворених кровоносних судин пухлини шляхом пригнічення пухлинного ангіогенезу пухлини. Так само тут створені способи пригнічення пухлинного росту.
І00262| Ці способи також особливо ефективні проти утворення метастазів, тому що їх утворення потребує васкуляризації первинної пухлини таким чином, щоб метастатичні ракові клітини могли вийти з первинної пухлини та їх впровадження у іншому місці організму також потребує утворення нових судин для підтримання метастатичного росту. 002631) Слід розуміти, що "суб'єкт, який страждає від раку/метастазів" за винаходом може
Зо бути здатним до експресії мутантного білка (пов'язаного з пухлиною антигену) або мутантного гена та не бути симптоматичним для захворювання. У одному необмеженому прикладі раку товстої кишки (пов'язаного з мутантним білком К-Кав) суб'єкт з мутантним білком К-Ка5 у деяких клітинах товстої кишки є суб'єктом, який підлягає лікуванню, хоча у цього суб'єкту можуть ще й не проявлятися симптоми раку товстої кишки. "Ознаки або симптоми хвороби", являють собою клінічно визнані прояви або ознаки захворювання. (00264) Під "лікуванням" суб'єкта, який страждає від пухлин або метастазів мається на увазі, що після означеного лікування ознаки або симптоми суб'єкта частково покращилися, повністю покращилися або залишилися у статичному стані. Пацієнт, який підлягає лікуванню може демонструвати часткове або повне полегшення пухлинного навантаження. Лікування також призначено охоплювати профілактику, терапію та лікування. У одному необмеженому прикладі вважається, що суб'єкт, який страждає від дуже метастатичного раку (наприклад, раку молочної залози) отримує лікування, якщо нові метастази не виникають або кількість метастазів зменшується у порівнянні з суб'єктом, який не отримав лікування. У іншому необмеженому прикладі вважається, що суб'єкт отримує лікування, якщо його тверді ракові пухлини або стають меншого розміру або не збільшуються у розмірі у порівнянні з суб'єктом, який не отримав лікування. У іншому необмеженому прикладі, кількість ракових клітин у суб'єкта, який отримав лікування або не збільшується або є зменшеною порівняно з кількістю ракових клітин у суб'єкта, який не отримав лікування. Покращення може бути визначено, наприклад, у вигляді зменшеної клітинної проліферації, зменшення кількості клітин, підвищення апоптозу та/або підвищення виживання підданого лікуванню суб'єкта.
І00265| Лікування може привести до часткового або до повного усунення пухлин або метастазів та/"або до подовження строку виживання пацієнта. (00266) У одному втіленні тяжкість або тривалість однієї або декількох ознак або симптомів після введення однієї або декількох доз композиції пацієнту зменшується приблизно на 295, приблизно на 595, приблизно на 1095, приблизно на 1595, приблизно на 2095, приблизно на 2595, приблизно на 3095, приблизно на 3595, приблизно на 4095, приблизно на 4595, приблизно на 5095, приблизно на 5595, приблизно на 6095, приблизно на 6595, приблизно на 7095, приблизно на 7595, приблизно на 8095, приблизно на 9095, приблизно на 9595 або приблизно на 10095.
І00267| У іншому втіленні тяжкість або тривалість однієї або декількох ознак або симптомів бо після введення однієї або декількох доз композиції пацієнту зменшується приблизно у 2 рази,
приблизно у 5 разів, приблизно у 10 разів, приблизно у 15 разів, приблизно у 20 разів, приблизно у 25 разів, приблизно у 30 разів, приблизно у 35 разів, приблизно у 40 разів, приблизно у 45 разів, приблизно у 50 разів, приблизно у 55 разів, приблизно у 60 разів, приблизно у 65 разів, приблизно у 70 разів, приблизно у 75 разів, приблизно у 80 разів, приблизно у 90 разів, приблизно у 95 разів, приблизно у 100 разів або ще більше. (00268) Пухлини або рак, які підлягають лікуванню описаними тут способами охоплюють, але без обмеження, рак легенів, гінекологічні злоякісні захворювання, меланому, рак молочної залоза, раку мозку (наприклад, мультиформну гліобластому (СВМ) або гліому), рак підшлункової залози, рак яєчників, рак матки, колоректальний рак, рак передміхурової залоза, рак нирки, рак голови, рак печінки (гепатоцелюлярний рак), рак шиї, рак ниркових клітин, рак статевого члена, рак шлунка, рак щитоподібної залози, рак січового міхура, саркому, карциному, мієлому та лімфому. У одному втіленні пухлина, що підлягає лікуванню є твердою або напівтвердою пухлиною. У іншому втіленні пухлина, що підлягає лікуванню є первинною пухлиною. У іншому втіленні пухлина, що підлягає лікуванню є метастатичною пухлиною. У одному втіленні пухлина або рак, що підлягає лікуванню має епітеліальне походження. У іншому втіленні рак, що підлягає лікуванню є мієломою. У іншому втіленні рак, що підлягає лікуванню є раком яєчників. У іншому втіленні рак, що підлягає лікуванню є раком нирки/ренальним раком. У іншому втіленні рак, який підлягає лікуванню є гепатоклітинним раком/ раком печінки.
І00269| Сполуки можуть бути, якщо це потрібно, введені у комбінації з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, які охоплюють, але без обмеження, адріаміцин, циклофосфан, паклітаксел, пеметрексед, темозоломід, оксалиплатин, цетуксимаб, панітумумаб, сорафеніб, сунітиніб, гефітиніб, ерлотиніб, 5-фторурацил, іринотекан, топотекан, лейковорин, бортезуміб, леналідомід, талідомід, капецитабин, доцетаксел та багато інших стандартних описаних тут протиракових терапевтичних засобів. Як тут застосовано, "випромінювання" має відношення до, наприклад, мікрохвильового, ультрафіолетового (УФ), інфрачервоного (ІЧ) або альфа-, бета- або гамма-випромінювання. Випромінювання може бути "зосередженим" або місцево доставленим з застосуванням стандартних способів його націлювання на місце розташування однієї або декількох пухлин без дії на цілий організм. Зрозуміло, що перелік
Зо перелічених нижче терапевтичних режимів представляє звичайні способи лікування, але заявлений винахід охоплює інші відомі терапевтичні режими, які певним чином тут не розкриті.
І00270| У одному втіленні рак є раком яєчників та одним або декількома додатковими способами терапії є хірургія, хіміотерапія (наприклад, застосування доксорубіцину, доксорубіцин-НСІ ліпосом, гемцитабіну, хіміотерапевтичних засобів на основі платини, як-то цисплатину, карбоплатину та оксаліплатину), застосування мелфалану, пригнічувачів топоїзомерази !, як-то топотекану та іринотекану, терапія на основі таксанів, гормонів, променева терапія, гіпотермія всього організму, застосування похідних ізофлавонів, цитотоксичних макролідів, як-то епотилонів, пригнічувачів ангіогенезу, як-то бевацизумаб, пригнічувачів сигнальної трансдукції, як-то трастузумаб, застосування генної терапії, терапії з допомогою / РНК-інтерференції, імунотерапії застосування моноклональних антитіл, застосування пригнічувачів кінази, подібних до фосфатидилінозитолу, як-то рапаміцину, або будь-які їх комбінації. За рахунок синергетичного ефекту від спільного застосування терапевтичних засобів, комбінована терапія з описаними тут антитілами та терапевтичними засобами для лікування раку яєчників може також забезпечити застосування більш низьких доз або полегшення терапії або обох цих компонентів лікування. 00271) У одному втіленні рак є ренальним раком/раком нирки та одним або декількома видами його додаткового терапевтичного лікування є хірургія, хіміотерапія та застосування пазопанібу, альфа-інтерферону або 1-2. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕСЕ. Необмежені приклади таких пригнічувачів охоплюють описані вище сполуки, афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб та пазопаніб. За рахунок синергетичного ефекту від спільного застосування терапевтичних засобів, комбінована терапія з описаними тут антитілами та терапевтичними засобами для раку нирки може також забезпечити застосування більш низьких доз або полегшення терапії або обох цих компонентів лікування.
І00272| У одному втіленні рак є мієломою та одним або декількома додатковими терапевтичними засобами лікування цієї недуги є хірургія, променева терапія та застосування композицій бортезоміб, леналідомід або талідомід. Дозування будь-яких цих засобів відомі у цій галузі та можуть бути, відповідно, відрегульовані у комбінаційній терапії.
І00273| У одному втіленні рак є раком передміхурової залози та одним або декількома додатковими терапевтичними засобами лікування цієї недуги є хірургія, променева терапія бо (наприклад, зовнішнє опромінення або брахітерапія), антигормональна терапія (пригнічення андрогену, у тому числі з абіратероном), застосування пригнічувачів білка теплового шоку 90 (НБРОО), хіміотерапія (наприклад, застосування композицій доцетаксел, естрамустин, хіміотерапія на основі сполук, які містять платину, як-то цисплатин, карбоплатин, сатраплатин та оксаліплатин), застосування преднізону або преднізолону, ліків, які знижують рівень холестерину, як-то статинів, застосування агоністів рилізинг-фактор лютеїнізуючого гормону (НКН), терапія з допомогою РНК-інтерференції, застосування засобів терапії на основі дендритних клітин, застосування генетично змінених цілих пухлинних, здатних виробляти гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ЗМ-С5Е) (також відомий, як
СМАХ) або будь-які їх комбінації. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕСЕ. Необмежені приклади пригнічувачів рецептора МЕСЕ охоплюють афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб та пазопаніб.
І00274| У одному втіленні рак є раком легенів та одним або декількома додатковими способами терапевтичного лікування є хірургія, променева терапія (наприклад, грудна променева терапія, променева терапія з зарядженими частинками), застосування композиції урацил-тегафур, хіміотерапія на основі сполук, які містять платину, (як-то цисплатин, карбоплатин, оксаліплатин тощо), застосування композицій вінорельбін, ерлотиніб, гефітиніб, антитіл до рецептора епідермального фактора росту (наприклад, цетуксимаб), низькомолекулярних пригнічувачів тирозинкіназ, безпосередніх пригнічувачів білків, залучених до клітинної проліферації раку легенів, пригнічувачів кіназ Аврора, термотерапія, викликана дією лазера, терапія з допомогою РНК-інтерференції, застосування генетично змінених цілих пухлинних клітин, здатних виробляти гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ЗМ-С5Е) (також відомий, як МАХ) або будь-які їх комбінації. Додаткові засоби терапевтичного лікування охоплюють застосування препаратів паклітаксел або пеметрексед. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕСЕ. Необмежені приклади пригнічувачів рецептора МЕСЕ охоплюють афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб та пазопаніб. Дозування будь-яких цих засобів відомі у цій галузі та можуть бути, відповідно, відрегульовані у комбінаційній терапії..
І00275| У одному втіленні рак є раком молочної залози та одним або декількома додатковими способами терапевтичного лікування є хірургія, застосування моноклональних
Зо антитіл (наприклад, антитіл Нег-2, герцептину), ад'ювантна хіміотерапія, як-то хіміотерапія з одиничним агентом або комбінаційна хіміотерапія (наприклад, поліхіміотерапія на основі антрацикліну та таксану) або застосування трастузумабу спрямованої дії з або без ендокринної маніпуляції з або без постмастектомічної променевої терапії, вінорельбіну), застосування препаратів адриамицин, циклофосфан, капецитабин, доцетаксел, вибіркових модуляторів рецептора естрогену, як-то тамоксифен та ралоксифен, алостеричних модуляторів рецептора естрогену, як-то трилостан, випромінювання (наприклад, інтерстиціальна брахітерапія, застосування пристрою Матітозіе, тривимірного конформаційного зовнішнього випромінювання та інтраопераційної променевої терапії), застосування пригнічувачів ароматази, які пригнічують синтез у всьому організмі (наприклад, анастрозол, екземестан та летрозол), терапія з допомогою РНК-інтерференції, застосування внутрішньовенних аналогів рапаміцину, які є імуносупресивними та анти-проліферативними, як-то темсиролімус або будь- які їх комбінації. Огляд способів отримання тривимірних моделей раку молочної залози у культурі тканин іп міго описані у роботі Кіт еї а!., Вгеахі Сапсег Кезеагсі Тгтеаїтепі 85(3): 281-91 (2004). Інші моделі перевірки раку іп мімо та іп міго відомі фахівцям та можуть бути застосовані для перевірки описаних тут антитіл. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕС. Необмежені приклади пригнічувачів рецептора МЕСЕ охоплюють афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб та пазопаніб. Дозування будь-яких цих засобів відомі у цій галузі та можуть бути, відповідно, відрегульовані у комбінаційній терапії. (00276) У одному втіленні рак є раком товстої кишки та одним або декількома додатковими способами терапевтичного лікування цієї хвороби є хірургія, променева терапія та хіміотерапія (наприклад, застосування 5-фторурацилу, левамізолю, лейковорину або семустидину (метил-
ССМу)), застосування М-(2-(диметиламіно)етилі| акридин-4-карбоксаміду та інших пов'язаних з карбоксамідом протиракових ліків; застосування пригнічувачів не-топоізомерази ЇЇ, іринотекану, ліпосомального топотекану, таксанового класу протиракових агентів (наприклад, паклітаксел або доцетаксел), сполук класу ксантенон - оцтової кислоти (наприклад, 5,6-диметилантенон-4- оцтової кислоти, РМАА), ламінарину, аналогів сайт-селективного ЦАМФ (наприклад, 8- хлораденозин-3,5'-диклофосфату), застосування піраноїндолових пригнічувачів Сох-2, карбазольних пригнічувачів Сох-2, тетрагідрокарбазольних пригнічувачів Сох-2, інденових пригнічувачів Сох-2, локалізованих пригнічувачів М5АЇІЮ5 (наприклад, антранілових кислот, бо аспірину (5-ацетилсаліцилової кислоти), азодисаліцилату натрію, карбогетероциклічних кислот,
карпрофену, хлорамбуцилу, диклофенаку, фенбуфену, фенклофенаку, фенопрофену, флуфенамової кислоти, флурбіпрофену, флупрофену, фуросеміду, ауротіомалату натрію, ібупрофену, індометацину, індопрофену, кетопрофену, лоназолаку, локсопрофену, меклофенамової кислоти, мефанамової кислоти, мелфалану, напроксену, пенициламину, фенілоцтових кислот, пропріонових кислот, саліцилових кислот, салазосульфопіридину, суліндаку, толметину, пиразолону, бутазону, пропазону, нестероїдних протизапальних композицій, мелоксикаму, оксикаму, піроксикаму, фелдену, пироксикам-бета-ціклодекстрану, теноксикаму, етодолаку та оксапрозину), пригнічувачів НЕК-2/пеи, терапія з допомогою РНК- інтерференції, 5М-С5Е, застосування моноклональних антитіл (наприклад, анти-Нег-2/пеи антитіл, анти-СЕА антитіл, АЗЗ (НВ 8779), 100-210 (НВ 11764) та 100-310 (НВ 11028)), цетуксимабу, панітумумабу, гормональна терапія, застосування піримідинамінів, похідних камптотецину (наприклад, СРТ-11), фолінової кислоти (ГА), гемцитабіну, Ага-С, хіміотерапія на основі сполук, які містять платину, як-то цисплатин, карбоплатин та оксаліплатин, застосування пригнічувачів специфічної до циклічного гуанозинмоно фосфату фосфодіестерази або будь- яких їх комбінацій. У одному втіленні додаткове терапевтичне лікування полягає у застосуванні комбінації 5-фторурацилу, лейковорину та оксаліплатину (БОЇ РОХ). У одному втіленні додаткове терапевтичне лікування полягає у застосуванні комбінації 5-фторурацилу, лейковорину та іринотекаїну (ІБ). У одному втіленні додатковим агентом є цетуксимаб. У одному втіленні додатковим агентом є панітумумаб. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕСЕ. Необмежені приклади пригнічувачів рецептора МЕСЕ охоплюють афліберцепт, сунітиніб, сорафеніб, акситиніб та пазопаніб. Дозування будь-яких цих засобів відомі у цій галузі та можуть бути, відповідно, відрегульовані у комбінаційній терапії.
І00277| У одному втіленні рак є раком підшлункової залози та одним або декількома додатковими способами терапевтичного лікування цієї хвороби є застосування комбінації лікувальних процедур, як-то хірургії, променевої терапії, застосування 5-фторурацилу та променевої терапії, системної терапії, стентування, застосування гемцитабіну, гемцитабіну та променевої терапії, цетуксимабу, ерлотинібу, поєднання хіміотерапії з променевою терапією або будь-які їх комбінації. У іншому втіленні додатковим агентом є пригнічувач рецептора МЕСБЕ.
Необмежені приклади пригнічувачів рецептора МЕСЕ охоплюють афліберцепт, сунітиніб,
Зо сорафеніб, акситиніб та пазопаніб. (00278) Оцінка стану пацієнтів може бути проведена, беручи до уваги ознаки або симптоми захворювання протягом одного або кількох різних моментів часу, включаючи моменти часу до, під час та після проведення курсів лікування. Лікування може привести до поліпшення стану суб'єкта та можуть бути оцінено шляхом визначення наявності одного або кількох наступних факторів, як-то зменшення розмірів пухлин, зниження проліферації клітин, зменшення кількості клітин, зниження неоваскуляризації, збільшення апоптозу, або зниження виживання принаймні частини клітин, які містять клітинний проліферативний розлад. Один або декілька з цих випадків можуть у певному разі призвести до часткового або повного усунення та/або до подовження строку життя пацієнта. Крім того, для лікування термінальній стадії раку, лікування може призвести до зупинки розвитку захворювання, поліпшення якості життя та/або подовження виживання.
І00279| При послідовному введенні композицій, композиція, яка містить описані тут анти-
СО105 антитіла може, наприклад, бути введеною перед та/або після застосування анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів).
І00280| При одночасному введенні композицій, композиція, яка містить описані тут анти-
СО105 антитіла може, наприклад, бути введеною у те ж саме місце, що й композиція, яка містить анти-МЕСЕ антитіла або у інше місце. 00281) У іншому втіленні передбачено композиції (лікарські композиції ), які містять анти-
СО105 антитіла та анти-МЕОЕ антитіла (або їх антиген-зв'язуючі фрагменти), здатні до пригнічення однієї або декількох біологічних активних властивостей, відповідно, білків СО105 та
МЕСРЕ, як-то мітогенної активності, клітинної проліферації, пухлинного росту, неоваскуляризації або ангіогенної активності... (002821) Зрозуміло, що схеми лікування можуть полягати у одному або у кількох введеннях кожної описаної тут композиції, які можуть бути введені у вигляді одиничної дози або багатьох доз. Введення окремих композицій може бути здійснено або однаковим шляхом або різними шляхами. (00283) У одному втіленні композицію вводять кожні 1-3 тижні протягом 6-12 циклів або до появи змінення стану пухлин. Спосіб може додатково полягати у введенні композиції кожен 1-12 тижнів протягом часу, який може сягати до 2 років. У іншому необмеженому прикладі, 60 одночасне введення анти-СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) здійснюють у перший тиждень з наступним додатковим введенням композиції у 1, 2, З або 4 тиждень, при цьому зазначене одночасне введення повторюють протягом 6-12 циклів або до появи змінення стану пухлин шляхом введення композиції кожен 1-12 тижнів протягом часу, який може сягати до 2 років. (00284) У одному необмеженому прикладі способу лікування раку у пацієнта, спосіб полягає у хірургічному видаленні раку та у введенні анти-СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) через 1-3 тижні протягом 12 місяців або до появи змінення стану пухлин з наступним одночасним введенням анти-СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) з дозою у 1-12 тиждень. Це одночасне введення анти-
С0105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) можна додатково повторювати кожні 1-3 тижні (до 6 циклів). Вибірково спосіб додатково полягає у введенні анти-
СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) кожен 1-12 тижнів протягом часу, який може сягати до 2 років. Зрозуміло, що схеми лікування можуть бути поєднані з передбаченими тут способами моніторингу для визначення потрібності у введенні додаткових доз анти-СО10О5 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів). (00285) Комбінаційна терапія може надавати синергетичного та/або сприятливого ефекту або може дозволити застосування знижених доз комбінації для забезпечення більшого запасу безпеки. Винаходом передбачені схеми лікування, які посилюють профілактичний або терапевтичний ефект анти-СО105 та анти-МЕСЕ антитіла (або їх антиген-зв'язуючих фрагментів) для запобігання, контролю, лікування або усунення раку або інших захворювань. (00286) У одному втіленні суб'єкту вводять додатковий терапевтичний лікувальний засіб, як- то, наприклад, пригнічувач ангіогенезу (як тут описано). Композицію, яка містить такий додатковий терапевтичний засіб може бути введена у комбінації (або послідовно або одночасно) з іншими описаними тут композиціями.
І00287| У одному передбаченому тут необмеженому способі лікування раку, додаткове терапевтичне лікування полягає у хірургічному видаленні раку, застосуванні випромінювання, одного або кількох хіміотерапевтичних агентів або їх комбінацій та у одночасному введенні описаних тут однієї або декількох композицій. У одному аспекті, введення композиції може бути,
Зо наприклад, 20-хвилинним внутрішньовенним вливанням.
Стан очей у випадку ангіогенезу. (00288) У одному аспекті заявленим винаходом передбачено спосіб лікування діабетичної ретинопатії, макулярної дегенерації, хоріоїдальної неоваскуляризації, макулярного набряку або неоваскулярній глаукоми, який полягає у введенні пацієнту терапевтично ефективної кількісті одного або декількох передбачених тут композицій.
І00289| Макулярною дегенерацією (ВМД) є втрата фоторецепторів у центральній частині сітківки, яка має назву макули та відповідає за високу гостроту зору. Дегенерація макули пов'язана з аномальним накопичуванням компонентів позаклітинної матриці та інших клітинних уламків у мембрані між пігментним епітелієм сітківки та судинною оболонкою ока. Цей матеріал клітинних уламків має назву друзів. Друзи спостерігають під час обстеження очного дна.
Нормальні очі можуть мати вільні від друз макули, незважаючи на достатню кількість друз у периферії сітківки. Наявність м'яких друз у макулі за відсутності будь-якої втрати макулярного зору вважається раннім етапом ВМД. Дегенерація жовтої плями характеризується хоріоїдальною неоваскуляризацією (ХНВ), тобто розвитком аномальних кровоносних судин під шаром пігментного епітелію (КРЕ) сітківки ока. Ці судини прориваються крізь мембрану Бруха, порушуючи пігментований епітелій сітківки, кровоточать та в кінцевому рахунку призводять до макулярного рубцювання, яке призводить до тяжкої втрати центрального зору (дископодібне рубцювання). (002901 Хороїдальна неоваскуляризація (ХНВ) звичайно виникає при макулярній дегенерації на додачу до інших очних розладів та є пов'язаною з проліферацією хороїдальних ендотеліальних клітин, надлишковим утворенням позаклітинного матриксу та утворенням фіброваскулярної субретинальної мембрани. Клітинна проліферація пігментного епітелію сітківки та утворення ангіогенних факторів імовірно спричинює хороїдальну неоваскуляризацію.
І00291| Діабетична ретинопатія (ДР) є очним розладом, який відрізняється надмірним ангіогенезом, який розвивається при діабеті завдяки потовщенню капілярних базальних мембран та втраті контакту між перицитами та ендотеліальними клітинами капілярів. Втрата перицитів підвищує витоку капілярів та веде до порушення гематоретинального бар'єру.
Діабетична ретинопатія є результатом мікросудинних змінень сітківки. Спричинена гіперглікемією загибель перицитів та потовщення базальної мембрани веде до слабкості бо судинних стінок. Ці пошкодження впливають на утворення гематоретинального бар'єру,
змінюючи його, а також роблять кровоносні судини сітківки більш проникними. Малі кровоносні судини, як-то малі кровоносні судини ока є особливо уразливими до поганого контролю цукру (глюкози крові) у крові. Надмірне накопичування глюкози та/або фруктози пошкоджує крихітні кровоносні судини сітківки. Макулярний набряк також може розвиватися, коли виникає витік рідини та ліпідів на макули з пошкоджених кровоносних судин. Ці рідини роблять макулу набряклою, що розмиває бачення. Це пошкодження також веде до втрати кисню в сітківці. (00292) При розвитку захворювання, втрата кисню в сітківці стимулює ангіогенез вздовж сітківки та у прозорому гелеподібному скловидному тілі, яке знаходиться всередині ока. Без своєчасного лікування, ці нові кровоносні судини можуть кровоточити, затьмарювати бачення та знищувати сітківку. Фіброваскулярна проліферація також може викликати тракційне відшарування сітківки. Нові кровоносні судини можуть рости до кута передньої камери ока та викликати неоваскулярну глаукому.
І00293| Проліферативна вітреоретинопатія є пов'язаною з клітинною проліферацією, яка зачіпає клітинні та фіброзні мембрани всередині мембран склоподібного тіла та на поверхні сітківки. Для цього очного розладу є характерною проліферація та міграція клітин епітелію пігменту сітківки. Мембрани, пов'язані з проліферативною вітреоретинопатією містять компоненти позаклітинного матриксу, як-то колаген типу І, ІЇ та ІМ та фібронектин та поступово стають фіброзними.. (00294) Вікова макулярна дегенерація (ВМД) та діабетична ретинопатія - це дві головні хвороби, які викликають сліпоту у розвинутому світі. Алфіберцепт, ранібізумаб та пегаптаніб мають покращені можливості лікування, які є прийнятними для пацієнтів з ВМД. Ранібізумаб є
Еаб, та алфіберцепт є злитим білком та обидві ці сполуки зв'язують судинний ендотеліальний фактор росту (МЕСЕ) та на сьогоднішній день демонструють найбільш вражаючі результати при лікуванні ВМД. Однак, тільки менша частина пацієнтів, які пройшли лікування відчувають значне покращення гостроти зору. Анти-ангіогенна терапія, яка зосереджена на іншій, ніж МЕСБЕ, мішені, може подолати деякі обмеження, пов'язані з агентами, спрямованими до метаболічного шляху МЕСЕ.
І00295| Описані тут анти-СО105 антитіла можуть бути застосовані для лікування або запобігання макулярної дегенерації, хороїдальної неоваскуляризації, діабетичної ретинопатії
Зо або проліферативної вітроретинопатії. Тут також описані способи лікування або запобігання макулярної дегенерації, хороїдальної неоваскуляризації, діабетичної ретинопатії, макулярного набряку або проліферативної вітроретинопатії шляхом введення описаних тут антитіл. Описані тут анти-СО105 антитіла також можуть скорочувати кровоносні судини, пригнічувати пов'язану з офтальмологічним захворюванням проліферацію ендотеліальних клітин, усувати ознаки або симптоми кровотечі, лікувати замутнений зір, зупиняти розвиток втрати зору, покращувати зір та/або запобігати витоку кровоносних судин. Описані тут анти-СО105 антитіла також можуть бути застосовані для отримання лікарських композицій для лікування макулярної дегенерації, хороїдальної неоваскуляризації, діабетичної ретинопатії макулярного набряку або проліферативної вітроретинопатії.
І00296| Крім того, описані тут анти-СО105 антитіла також можуть бути застосовані у поєднанні з відомими видами терапевтичного лікування та/або зі сполуками для лікування макулярної дегенерації, хороїдальної неоваскуляризації, діабетичної ретинопатії, макулярного набряку або проліферативної вітроретинопатії. Приклади таких сполук охоплюють, але без обмеження, ранібізумаб, афліберцепт та пегаптаніб. Крім описаних тут способів введення, анти-
СО105 антитіла може бути застосовані шляхом введення у скловидне тіло. Необмежені приклади способів введення у скловидне тіло охоплюють введення у скловидне тіло шляхом ін'єкції та застосування інтравітреальних імплантів.
І00297| Полегшення та чутливість до лікування у пацієнтів можуть бути відповідно досліджені. Лікування охоплює, але без обмеження, заходи, спрямовані до зменшення макулярного набряку, зниження обсягу хороїдальної неоваскуляризації та підвищення гостроти зору. Вимірювання ознак або симптомів є відомою у цій галузі процедурою та додатково описано у прикладах нижче. (00298) У відповідності з наведеними тут втіленнями, описані тут композиції можуть бути введені окремо або у комбінації з одним або декількома додатковими активними або неактивними агентами. При застосуванні комбінацій може бути застосовано одночасне або послідовне введення анти-СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл (їх антиген-зв'язуючих фрагментів).
Способи функціонального аналізу. 00299) Описані тут композиції можуть бути різним чином оцінені шляхом аналізів іп міїго, їп бо мімо та ех мімо. Для моніторингу таких ефектів може бути застосовано будь-який відомий фахівцям у цей галузі прийнятний аналіз. Деякі такі способи описані нижче.
Аналіз сигналування та функції СО105 . 00300) СО105 (ендоглін) є членом родини рецепторів ТОЕ-Д, експресія якого відбувається у ендотеліальних клітинах під час їх проліферації, яка потребує наявності нормальних рівнів цього білка. Сильна експресія СО105 відбувається у ангіогенній судинній системі твердих пухлин та цей білок є залученим до ангіогенезу/судинного розвитку, а також є рецептором допоміжного трансформуючого фактору росту ВД (ТаБ-Д) СО105 є гомодимерним глікобілком клітинної мембрани, експресія якого відбувається у лейкозних та ендотеліальних клітинах. Були описані дві ізоформи СО105, І -ендоглін (170 кДа) та 5-ендоглін (160 кДа), які відрізняються амінокислотною послідовністю їх цитоплазматичних хвостів. (00301) Експресія СО105 підвищується шляхом клітинної гіпоксії за рахунок продукування індукованого гіпоксією фактора-1-о; (НІБ-1-о0) та захищає гіпоксичні клітини від апоптозу. Дія
СОр105 спрямована на зменшення сигналування численних кіназних рецепторних комплексів надродини ТОЕ-Д, включаючи рецептори ТОЕ-р (ТаЕ-ВЕ), активін-рецептороподібні кінази (А К) та рецептори активину. У відсутність СО105 активування рецепторів ТОЕ-ВД веде до фосфорилювання білків 5МА0, які пригнічують ріст ендотеліальних клітин. Однак активування
СО105 шляхом ТОБЕ-Д зменшує фосфорилювання білка ЗМАЮ. Кінцевим результатом є вивільнення ростових пригнічувальних ефектів від активування рецептора ТОБ-ВД у ендотеліальних клітинах.
І00302| Запобігання активування СО105 з допомогою анти-СО105 антитіла синергетично впливає разом з ТОЕ-р на пригнічення росту ендотеліальних клітин. У ендотеліальних клітинах
Тар-рД може стимулювати два окремих шляхи сигналування рецептора типу І/5МАЮО з протилежними ефектами. Шлях сигналування ТОЕ-В/АГК5 (А) веде до пригнічення клітинної проліферації та міграції клітин, тоді як шлях ТОЕ-В/АЇКІТ (В) викликає проліферацію ендотеліальних клітин та міграцію. СО105, який є допоміжним рецептором ТОЕ-Д має високий рівень експресії протягом ангіогенезу та є необхідним для сигналування АЇКТ1. У відсутність
СО105, сигналування ТОЕ-В/АЇК5О є переважаючим та підтримує ендотелій у стані спокою.
Високий рівень експресії СО105 стимулює шлях АЇКІ!1 та небезпосередньо пригнічує сигналування АГК»5, сприяючи таким чином стану активування ангіогенезу.
Зо 00303) У одному необмеженому втіленні антитіло може бути оцінено відносно пригнічення ангіогенезу та проліферації ендотеліальних клітин. Зв'язування анти-СО105 антитіл з НОМЕС не запобігає подальшому зв'язуванню ТОЕ-Дй з НОМЕС. Отже, безпосереднє пригнічення росту ендотеліальних клітин з допомогою анти-СО105 антитіл являє собою один з основних механізмів, з допомогою яких спостерігаються анти-ангіогенні та пухлинно-супресивні ефекти іп мімо. У іншому втіленні антитіло може бути оцінено відносно блокування ангіогенезу шляхом запобігання фосфорилювання та/або сигналування бітай1/5/8. СО105 приймає участь у сприянні ангіогенезу шляхом сигналування ТОЕ-р/АЇ КІ, яке в свою чергу викликає зменшення та/або зупинення фосфорилювання білків 5таай2/3. У іншому втіленні антитіло може бути оцінено відносно блокування ангіогенезу шляхом посилення фосфорилювання та/або сигналування 5тай2/3. (00304) Способи та технічні прийоми оцінки блокуючої або пригнічуючої дії передбачених тут антитіл на шлях сигналування ТОЕ-Д/АЇІ КІ та/або фосфорилювання Зтаай1/5 є (без обмеження) відомими молекулярними способами. У якості прикладу, для визначення пригнічуючого та/або стимулюючого ефекту описаних тут анти-СО105 антитіл на шляхи ТОЕ-Д/АЇК5 або ТОЕ-р/АЇ КІ може бути застосовано Вестерн-блотинг з антитілами, специфічними до будь-яких білків шляхів такг-р/(АГК5 або ТОБЕ-Д/АЇ КІТ. Так само, для оцінки пригнічуючого та/або стимулюючого ефекту описаних тут антитіл може бути застосовано визначення мРНК або регулювання мРНК для білків, залучених до шляхів ТОЕ-ДВ/АЇ К5 або ТОЕ-Д/АІ КІ. Додаткові способи оцінки клітинного сигналування для шляхів ТОЕ-ДР/АІ К5 або ТОЕ-Д/АГ КІ відомі у цій галузі та є передбаченими тут. 00305) Активність описаних тут анти-СО105 антитіл може бути оціненою з застосуванням відомих у цій галузі способів аналізу, наприклад, шляхом аналізу зв'язування, як-то різні види
ІФА, конкурентний ІФА, поверхневий плазмонний резонанс та дослідження дії на клітини НОМЕС (більш детально описане нижче).
Застосування мишей ЗСІО/голих мишей.
ЇООЗОб6|Ї Один спосіб дослідження пухлинного росту полягає у наступному застосуванні мишей 5СІЮ. Спочатку субконфлюентні клітини людської меланоми М21 збирають, промивають та ресуспендують у стерильному буфері РВ5 (20х105 клітин на мл.), після чого 100 мкл суспензії клітин (2х106) людської меланоми М21 підшкірно вводять мишам 5СІЮ шляхом ін'єкції. Через три дні після ін'єкції пухлинних клітин, мишей або не піддають лікуванню або вводять один або декілька контрольних або досліджуваних композицій внутрішньовенним або внутрішньочеревинним шляхом (наприклад, 100 мкг/мишу) та таке введення триває щоденно протягом 24 днів. Розмір пухлин вимірюють з допомогою штангенциркулів та об'єм обчислюють з застосуванням формули М - (І хУМг)/2, де М є об'ємом, І. є довжиною та М/ є шириною.
Ї00307| Один спосіб дослідження пухлинного росту полягає у наступному застосуванні голих мишей. Пухлинні клітини МОА-МВ-435 (0.4х105 клітинил мишу) у 50 мкл РВ5 ортотопічно імплантують у жирову тканину молочної залози голих мишей жіночої статі 5-6 тижневого віку.
Коли пухлини досягнуть середнього об'єму приблизно 50-80 мм3, мишей розподіляють випадковим чином (принаймні 10 на групу) та двічі на тиждень тваринам внутрішньовенно або внутрішньочеревинно вводять один або кілька типів антитіл, кількість (концентрація) яких дорівнює 1 мкг (0.05 мг/кг) на дозу, 10 мкг (0.5 мг/кг), 100 мкг (5 мг/кг) або 200 мкг (10 мг/кг) або контрольні антитіла (100 мкг) у 100 мкл РВ5 або засіб доставки (100 мкл РВ5) та у деяких випадках також здійснюють дослідження необробленої групи тварин. Розмір пухлин вимірюють з допомогою штангенциркулів та об'єм обчислюють з застосуванням формули М - (ІхМуг)/2, де
М є об'ємом, ГІ. є довжиною, та М/ є шириною.
Застосування сингенних мишачих моделей ВАЇ В/с.
І00308| Альтернативним чином, для оцінки пухлинного росту та його пригнічення з допомогою антитіл також можуть бути застосовані сингенні мишачі моделі ВА В/с. Опис застосування цих моделей також наведено, наприклад, у роботі Т5цііе еї аї., Іпі. У. Опсоіоду, 29: 1087-1094 (2006).
Миша 003091 У іншому аналізі вимірюють ангіогенез у химерної (миша/людина) мишачій моделі та цей аналіз отримав назву аналізу химерних мишей. Аналіз було докладно описано іншими дослідниками разом з додатковим описом вимірювання ангіогенезу, неоваскуляризації та регресії пухлинних тканин. Див. чУап, еї аї. (1993) 9. Сііп. Іпмев5і. 91:986-996.
І00310| Аналіз химерних мишей є корисною моделлю аналізу для дослідження ангіогенезу іп мімо, оскільки трансплантати пересадженої шкіри гістологічно дуже нагадують шкіру нормальної людини та неоваскуляризація цілої тканини відбувається, коли існуючі кровоносні судини
Зо людини ростуть зі щепленої людської шкіри до людської пухлинної тканини на поверхні прищепленої людської шкіри. Походження неоваскуляризації у людському трансплантаті може бути продемонстровано з допомогою імуногістохімічного фарбування новонаявленої судинної системи маркерами, специфічними до ендотеліальних клітин людини.
ІЇ00311| Аналіз химерних мишей демонструє регресію неоваскуляризаці на основі як кількості, так і ступеня регресії росту нових судин. Крім того, можна легко контролювати вплив на ріст будь-якої тканини, пересадженої на прищеплену шкіру, як-то пухлинної тканини.
Нарешті, аналіз є корисним, оскільки існує внутрішній контроль токсичності у тест-системі.
Химерних мишей можна піддати дії будь-якого досліджуваного реагенту отже здоров'я такої миші є показником токсичності. Також у описаних тут способах можна застосувати й інші описані тут та відомі у цій галузі тваринні моделі.
Застосування аналізу кролячого ока. 00312) Іншими способом вимірювання ангіогенезу є застосування моделі кролячого ока іп мімо, який позначено тут, як аналіз кролячого ока. Аналіз кролячого ока більш детально було описано іншими дослідниками та його застосовують для вимірювання ангіогенезу та неоваскуляризації у присутності ангіогенних пригнічувачів, як показано на прикладі у роботі р'Атайо еї аї. (1994) Ргос. Маї!. Асайд. 5сі. ОБА, 91(9): 4082-4085. 00313) Аналіз кролячого ока є визнаною моделлю аналізу ангіогенезу іп мімо, оскільки процес неоваскуляризації на прикладі кролячих кровоносних судин, які ростуть з краю рогівки у рогівку легко спостерігається візуально завдяки природній прозорій рогівці ока. Крім того, у такій моделі можна легко контролювати ступінь та кількість стимулювання або пригнічення неоваскуляризації або регресію неоваскуляризації протягом часу.. 00314) Зрештою кролів можна піддати дії будь-якого досліджуваного реагенту, отже їх стан здоров'я є показником токсичності цього реагенту. 00315) Стисло кажучи, були здійснені аналізи хоріоналантоїсной мембрани курчат (САМ) та дії досліджуваних сполук на судинну систему, яка розвивалася записували через 48 год. після імплантації гранул з 0.595 карбоксиметилцелюлози, які містили одну або декілька контрольних або досліджуваних сполук. Неоваскуляризацію рогівки викликали шляхом імплантування гранули з полі(гідроксіетилметакрилату) (Нуагоп; Іпіепегоп Зсіепсе5, Мем/ Вгип5улісК, МУ), яка містила 650 нг сильнодіючого ангіогенного білка основного фактора росту фібробластів (БЕСБЕ), бо зв'язаного з сукральфатом (алюмінієва сіль сульфату цукрози; Вики Меадаіййес, Сорепнадеп).
Додавання сукральфату до гранул захищає БЕСЕ від руйнування та забезпечує його повільне вивільнення, утворюючи таким чином стійкий агресивний ангіогенез, який є більш вираженим, ніж ангіогенез, індукований одним лише БЕСЕ/Нуагоп. Вивільнення БЕСЕ з гранул, які містять сукральфат/Нудгоп може бути визначено іп мйго протягом строку до 4 діб після утворення гранул порівняно з лише однією добою для гранул, які містили тільки полімер Нуагоп. Гранули отримували шляхом змішування 110 мкл фізіологічного розчину, який містив 12 мкг рекомбінантного БЕСЕ (ТаКкеда, ОзакКа) з 40 мг сукральфату та цю суспензію додавали до 80 мкл 1295 (вага/об'єм) полімеру Нуагоп у етанолі. Аліквоти (10 мкл) цій суміші потім наносили піпеткою на тефлонові кілочки та давали просохнути з отриманням приблизно 17 гранул. 00316) Гранули імплантували у рогівкові мікрокишені у кожне око попередньо підданого дії анестезії новозеландського білого кроля жіночої статі на відстані 2 мм від краю рогівки з наступним однократним місцевим нанесенням еритроміцинової мазі на поверхню рогівки.
Проведена у наступні дні гістологічна перевірка показала наявність прогресивного росту кровоносних судин у рогівці в напрямку гранули та дуже рідко спостерігалися запальні клітини.
Ця ангіогенна відповідь не змінилася через сильне імунне пригнічення разом з опроміненням всього організму та гранули, у складі яких був тільки сукральфат не викликали ангіогенезу.
Поява нових судин головним чином була викликана дією рЕСЕ, а не запаленням. Піддослідних тварин годували щоденно, починаючи від другої доби після імплантації шляхом промивання шлунка однією або кількома сполуками, суспендованими у 0.595 карбоксиметилцелюлозі або лише засобом доставки. Імуносупресовані тварини отримали повний курс опромінення організму з дозою у 6 Гр. протягом 6 хв. безпосередньо перед імплантацією гранул. Ця доза випромінювання призвела до появи помітної лейкопенії з »8095 зменшенням кількості лейкоцитів на другу добу та до 29095 зменшення на третю добу, що узгоджується з попередніми повідомленнями.
І00317| Тварин щодня перевіряв з допомогою щілинної лампи сліпою перевіркою той же самий фахівець з рогівки (фахівець з науково-медичної інформації). Площу неоваскуляризації рогівки визначали шляхом вимірювання з допомогою шкали оптичного приладу довжини судинної сітки (І) від лімба (краю рогівки) та кількості астрономічних годин (С) залученого лімба.
Для визначення площі сегмента кругової зони була застосована наступна формула: С/12 х
Зо 3.1416 (і - (і - І, де г - 6 мм, тобто виміряний радіус рогівки кроля. В результаті була виміряна рівномірна смуга неоваскуляризації, яка була прилеглою до гранули. Таким чином може бути оцінено повне пригнічення неоваскуляризації.
Аналізи ангіогенезу у мишей з застосуванням пробки з препарату Маїгідеї|.
І00318| Для підтвердження дії композиції на ангіогенез може бути застосовано аналіз ангіогенезу у мишей з допомогою пробок з препарату Маїгіде!. Різні фактори росту (наприклад,
ІСЕ-1, БЕСЕ або УЕСРБЕ) (250 пд) та гепарин (0.0025 одиниць на мл.) перемішують зі зменшеним фактором росту з матрицею МаїгідеїЇ, як попередньо було описано у роботі Мопіезапо, еї аї.,..
Клітин Віої. 1983, 97:1648-1652; біеїапззоп, вї аї., У. Віої. Спет. 2000, 276:8135-8141. Описані тут композиції або контрольні антитіла можуть бути включені до складу препаратів Маїгідеї! з застосуванням однієї або кількох груп тварин з дозуваннями. У контрольних експериментах
МаїгідеІ отримують у відсутність факторів росту. Мишам вводять шляхом підшкірної ін'єкції по 0.5 мл препарату МаїгідеІ! з наступним інкубаційним тижневим періодом. Після завершення інкубаційного періоду мишей піддають розтину та хірургічним шляхом вилучають полімеризовані пробки з препарату МаїгідеІ. Ангіогенез всередині цих пробок досліджують шляхом кількісному аналізу з допомогою двох загальноприйнятних способів, як-то способу імуногістохімічного аналізу та аналізу вмісту гемоглобіну (ЕигеТепрегдег, еї аї., І апсеї. 2002, 3:298-302; Мо!ретї, вї аіІ., Сапсег Сеї! 2002, 2(6):473-83; та зи, еїгаі., Рак Ке5. 2003, 63:3585-3592).
Для імуногістохімічного аналізу, пробки з препарату Маїгіде! занурюють у середовище ОСТ та швидко заморожують з отриманням 4 мкм зрізів. Заморожені зрізи фіксують у суміші метанол/ацетон (1:1) та потім фарбують спрямованими до СОЗ31 поліклональними антитілами.
Кількісний аналіз ангіогенезу здійснюють шляхом підрахунку мікросудинної щільності у мікроскопічному полі з великим збільшенням 20 (200Х).
І00319| Вміст гемоглобіну може бути обчислено, як описано у роботах попередніх дослідників (5сппарег, еї аї., У. СеїЇ Рпузіо!. 1993, 256:235-246; Мопіезапо, еї аї., 9. Клітин Віої. 1983, 97:11648-1652; Біеїапв5оп, еї аї., у. Віої. Спет. 2000, 276:8135-8141; апа сідії, еї аї., 9.
Ітітипої. 1986, 100:1154-1164). Імпланти з препарату МаїгідеІ швидко заморожують у сухому льоді та ліофілізують протягом ночі. Підсушені імпланти ресуспендують протягом години у 0.4 мл 1.095 сапоніну (СаїІріоспет) та піддають руйнуванню шляхом інтенсивного переливання з допомогою піпетки. Для усунення будь-яких частинок, отримані композиції центрифугують бо протягом 15 хв. при 14000 д, після чого безпосередньо у супернатанті визначають концентрацію гемоглобіну шляхом вимірювання поглинання при 405 нм, порівнюючи його зі стандартною концентрацією очищеного гемоглобіну.
Способи аналізу міграції клітин.
І0ОоЗ2о)
Способи аналізу міграції клітин описані у науковій літературі, див., наприклад, спосіб, зазначений у роботі Вгооквб, єї аї., у. Сііп. Іпмеві 1997, 99:1390-1398 та інші відомі фахівцям у цій галузі способи вимірювання міграції клітині. У одному такому способі, мембрани з камер системи ТгапзугеіЇ покривають субстратом (у цьому випадку, це - СО105 та/або МЕСРБЕ), потім ці камери промивають та неспецифічне сайт - зв'язування блокують бичачим сиворотковим альбуміном (ВЗА). Пухлинні клітини з субконфлюентних культур збирають, промивають та ресуспендують у міграційному буфері у присутності або з відсутністю досліджуваних антитіл.
Потім пухлинним клітинам дозволяють мігрувати до нижньої частини покритих мембран системи
ТгапвмуєїЇ, позосталі на верхній частині мембрани клітини відокремлюють та клітини, які мігрують до нижньої частини фарбують кристалічним фіолетовим барвником. Кількісний аналіз клітинної міграції здійснюють шляхом безпосереднього підрахунку клітин у мікроскопічному полі.
Способи аналізу клітинної проліферації. (00321) Аналіз клітинної проліферації може бути здійснено з допомогою способів, відомих фахівцям у цій галузі. Як тут описано, субконфлюентні ендотеліальні клітини людини (НОМЕС) можуть бути ресуспендованими у буфері для проліферації, який містить малу кількість (5.095) сироватки у присутності або у відсутність СМ (25 мкл) з клітин ЕСМ або ЕСМІ, після чого їм дозволяють розвиватися протягом 24 год. Клітинну проліферацію можна кількісно обчислити шляхом вимірювання активності мітохондріальної дегідрогенази з допомогою наявного у продажу набору МУ5Т-1 (Спетісоп). Також, як тут описано, кількісний аналіз проліферації можна здійснити шляхом вимірювання включення УЗН з допомогою стандартних способів. (пе еї аї., пі. у. Сапсег, 108: 251-257 (2004)).
І00322| Також у цій галузі відомі та передбачені тут інші способи оцінки клітинної проліферації, додатково необмежені приклади яких більш детально описані у розділі прикладів.
Способи викликання СОС, АОС та опсонізації. (003231) Різні види терапії спрямовані на збільшення природної імунної відповіді організму на
Зо трансформовані клітини. Традиційні ефекторні способи охоплюють комплемент-залежний цитоліз ("СОС"), залежну від антитіл клітинну цитотоксичність (АЮСС") та фагоцитоз (очищення шляхом дії ретикулоендотеліальної системи після покриття клітини-мішені імуноглобуліном).
Відомо, що у присутності антитіл деякі ефекторні клітини, як-то лімфоїдні клітини, які мають зв'язані з поверхнею рецептори для Ес-ділянок антитіл, опосередковують реакцію проти клітин- мішеней, яка має назву залежної від антитіл клітинної цитотоксичності САЮСС"). З допомогою
АОС ці ефекторні клітини проявляють цитолітичну активність проти таких клітин-мішеней. (00324) У стані іп міго спостерігають два типи реакцій АОСС. У класичних реакціях АОСС ефекторні клітини приєднуються до покритих антитілами клітин-мішеней та згодом викликають їх цитоліз (А. Н. сгеепбего еї аї., "Спагасієгісііс5 ОЇ Те Епесіог Сеїї5 Медіайпуд Цитотоксичнігу
Адаїнпбзі Апібоду-Соаїєй Тагде( Се, (Характеристики опосередкованої ефекторними клітинами цитотоксичності, спрямованої до покритих антитілами клітин-мішеней") Іттипоїіоду, 21, р. 719 (1975)). Це приєднання ефекторної клітини до клітини-мішені веде до взаємодії Ес- ділянки антитіла, яке покриває клітину-мішень та Ес-рецептора ефекторної клітини. Одним з недоліків цього типу реакції АОСС є те, що її дії можуть заважати циркулюючі комплекси типу "антиген-антитіло", часто пов'язані з різними захворюваннями, які конкурують з антитілами, що зв'язуються з клітинами-мішенями за Ес-рецептори ефекторних клітин (І. С. М. Мас! еппап, "Сотрешіоп Рог Кесеріог5 Рог Іттиподіобиїйп Оп Сушїохіс Гутрпосуїге5," (Конкурування за рецептори імуноглобуліну на цитотоксичних лімфоцитах") Сіїп. Ехр. Іттипої., 10, р. 275 (1972)).
Через ці недоліки класичної реакції АОСС може бути застосовано другий тип цієї реакції - спрямована до антитіл реакція АОСС, в якій специфічне до мішені антитіло спочатку прикріплюється до ефекторної клітини та отриманий комплекс потім "спрямовується" антитілом до свого специфічного антигену на поверхні клітини-мішені. Переважним чином спрямованій до антитіл реакції АОСС не може заважати наявність циркулюючих у системі хазяїна комплексів типу "антиген-антитіло. Взаємодія між антитілами та ефекторними клітинами за рахунок прикріплення Ес-ділянки до Ес-рецептора звичайно є слабкою та у певних випадках антитіла не залишаються зв'язаними з ефекторними клітинами протягом часу, достатнього для забезпечення лізису клітин-мішеней. У зв'язку з цією потенційною проблемою, процес прикріплення з ефекторними клітинами здійснюють з застосуванням попередньої обробки поліетиленгліколем та сумішшю фталатних масел ((9У. ГЕ. дУопе5 апа 0. М. зедаї, "79. Іттипої., бо 125, рр. 926-33 (1980)). Застосовність цього способу для лікування іп мімо, однак, може бути принижено через токсичні дії для організму будь-яких залишків поліетиленгліколю та фталатних масел, спрямованих до антитіло-ефекторного клітинного комплексу.
І00325| Альтернативним чином також запропоновано спосіб посилення спрямованої до антитіл реакції АОСС шляхом ад'ювантної хіміотерапії з цитотоксичними ліками (І. К. МаскКау еї аІ., Сапсег Іттипої!. ІттипоїНег., 16, рр. 98-100 (1983)). Аналітичні способи перевірки для АОСС є добре відомими у цій галузі (Див., наприклад, патент США 5 Раїепі Мо. 5,756,097).
І00326| Відповідним чином, у зазначених втіленнях передбачені антитіла, які можуть зв'язуватися з клітинами, які відіграють певну роль у неоваскуляризації або ангіогенезі, які можуть посилювати фагоцитоз та загибель та тим самим підвищити захист у природних умовах.
Також запропоновані інші антитіла та їх функціональні фрагменти, які вступають у імунну реакцію, специфічно зв'язуються з, або переважно зв'язуються з сайтом зв'язування або епітопом, до якого такі антитіла можуть зв'язуватися та які мають таку ж саме дію.
І00327| Антитіло також може бути опсонічним або демонструвати опсонічну активність для клітин, які відіграють певну роль у неоваскуляризації або ангіогенезі (наприклад, ендотеліальних клітин). Як зрозуміло фахівцям, "опсонічна активність" має відношення до здатності опсоніну (звичайно або антитіла або сироваткового фактора СЗ3Б) зв'язуватися з антигеном або клітинним рецептором для сприяння прикріплення антигену або клітинного рецептора до фагоциту, тим самим підсилюючи фагоцитоз. Деякі клітини стають надзвичайно привабливими для фагоцитів, як-то нейтрофілів та макрофагів, коли вони є покритими опсонічними антитілами та їх швидкість виведення з кровотоку разюче підвищується. Опсонічна активність може бути виміряна будь-яким стандартним способом, як описано, наприклад, у патенті США Мо. 6,610,293. (00328) У іншому необмеженому втіленні у пацієнта, який має неоваскулярний розлад або залежний від ангіогенезу розлад спостерігається розповсюдження антигенів/пептидів (наприклад, СО105) від ангіогенезу. Ці антигени/пептиди можуть бути "антигенами, пов'язаними з пухлинами". Таким пацієнтам можуть бути соматично введені антитіла до антигену/пептиду (наприклад, СЮО105) та можна застосувати будь-який з описаних тут шляхів для викликання
СОС, АОСС, опсонізації або будь-якої іншої форми клітинно-опосередкованого знищення.
Додаткові аналізи.
Зо 00329) Для перевірки дії описаних тут композицій також можуть бути застосовані інші відомі у цій галузі способи аналізу, наприклад, описані у прикладах нижче.
Приклади.
І00330| Ця заявка може бути краще зрозумілою з посиланням на наступні необмежені приклади, які наведені в якості зразкових варіантів її втілення. Наступні приклади наведені для більш докладної ілюстрації зразкових втілень та жодним чином не повинні бути витлумачені у якості обмеження широкого обсягу винаходу. У той час, як деякі втілення цієї заявки були показані та описані тут, буде очевидно, що такі втілення надані тільки у якості прикладу. Також можуть мати місце численні варіації, зміни та заміни та слід розуміти, що різні альтернативи втілень, описаних в даному документі можуть бути застосовані у практичному втіленні описаних тут способів.
Приклад 1: Зразкові схеми дозувань для введення.
ІЇ00331| Описані тут оптимальні схеми дозувань для введення антитіл та їх антиген- зв'язуючих фрагментів можуть бути визначені з застосуванням відомих у цей галузі способів та описаним вище шляхом. 00332) У одному необмеженому втіленні описані тут антитіла можуть бути введені суб'єкту протягом різних періодів часу. Доза(дози) антитіла або його антиген-зв'язуючого фрагмента може бути введена двічі на тиждень, щотижнево, кожні 2 тижні, кожні З тижнів, кожні 4 тижня, кожні б тижнів, кожні 8 тижнів, кожні 12 тижнів або може бути застосована будь-яка комбінація тижнів. Також передбачені певні цикли дозування, як-то, наприклад, введення антитіл раз або два рази на тиждень протягом 4 тижнів з наступним двотижневим періодом без терапії. Також тут передбачені додаткові цикли дозування, які охоплюють, наприклад, різні комбінації доз та описані тут тижневі цикли.
Приклад 2: Аналіз ВіАсоге (поверхневий плазмонний резонанс: (ЗРК)).
І00333| Спорідненість антитіл може бути оцінена з застосуванням, наприклад, аналізу
ВІАсоге з допомогою стандартних протоколів. Стисло кажучи, антитіло до гістидинової мітки приєднується до чипу ВіАсоге для захоплення міченого гістидином рекомбінантного білка людини СО105, який, в свою чергу, застосовують для вимірювання зв'язування анти-СО105 антитіла. 5РК-аналіз здійснюють мінімум з двома партіями композиції від чипу з додатковими аналітичними партіями (8 партій). В ході проведення цього аналізу досліджують наступні (516) параметри:
(а) Приєднання анти-гістидинового антитіла до чипів СМ5. (00334) Антитіло до гістидинової мітки приєднують до чипу ВІАсоге СМ5 шляхом стандартної амінної хімії з застосуванням ЕОС/МНЗ5 зв'язування (ЕС - З-диметил амінопропіл)карбодиїмід;
МНЗ5 - М-гідроксісукцінімід). Умови реакції (концентрація та рН) можуть бути оптимізовані. (5) Зв'язування людського СО105 та відновлення біосенсорного чипу.
ЇОО0335| Були перевірені умови зв'язування людського СО105 та відновлення чипу з застосуванням різних буферів (на основі попереднього досвіду) для елюювання зв'язаних антитіл. Одразу після розробки потенційного способу відновлення були здійснені вимірювання зв'язувальної здатності та фону поверхні одиничного чипу, які тривали протягом принаймні 25 циклів. Метою досліджень є отримання середнього підвищення фону, яке б становило « 10 КО (резонансних одиниць) на цикл та зменшення зв'язувальної здатності, яке б становило « 1 95 на цикл. (с) Зв'язування людського СЮО10О5.
І00336| Дозозалежний ефект людського СО105 вимірюють з метою визначення прийнятної концентрації для досягнення максимального зв'язування. (4) Зв'язування анти-СО105 антитіла.
І00337| Дозозалежний ефект анти-СО105 антитіла вимірюють з метою визначення прийнятного діапазону для експериментів по кінетичному або рівноважному зв'язуванню (який може включати в себе порівняння відносних кінетичних констант Ка та Ка або або порівняння відносної активності з допомогою способу паралельних ліній). (є) Експерименти попередньої перевірки.
І00338| Експерименти по зв'язуванню у вибраних умовах повторюють принаймні тричі з застосуванням різних чипів, різних клітин потоку та у різних умовах з метою отримання попередньої інформації про точність та вірність вимірювань. Всі експерименти ВіАсоге проводять при температурі 252 С у рухливому буфері НВЗ-ЕР.
Приклад 3: ІФА-аналіз зв'язування анти-СО105 антитіла. 00339) Для оцінки зв'язування анти-СО105 антитіл з СЮО105. може бути застосовано ІФА аналіз. Стисло кажучи, ІФА здійснюють у відповідності з наступними етапами: 1. На планшет наносять МАВУО811-01 (моноклональні анти-СО105 антитіла) з концентрацією
Зо у 1500 нг/мл у РВ5, 100 мкл/лунку. Планшет заклеюють з допомогою приладу для заклеювання планшетів та інкубують протягом ночі (16-24 год.) при 4"С. 2. Планшет промивають 2Х 200 мкл РВЗ (без Туееп). 3. Планшет промивають ЗХ РВ5, який містить Тмеєп (РВ5-Т). 4. Додають СО105 у РВ5-Т з 0.195 ВБА (100 мкл/лунку; 100 нг/мл) та інкубують 60 хв. при кімнатній температурі. 5. Планшет промивають ЗХ РВ5З-Т. 5. У досліджувані лунки додають 100 мкл/лунку анти-СО105 антитіл з концентрацією 20, 10, 4,2, 1, 0.5 та 0.2 нг/мл (розведені у РВ5З-Т з 0.195 В5А) та планшет інкубують 60 хв. при кімнатній температурі До лунок негативного контролю додають 100 мкл/лунку ізотипічно подібних контрольних антитіл. 7. Планшет промивають ЗХ РВ5З-Т. 8. У всі лунки додають козячі антитіла до людського імуноглобуліну дос, кон'юговані з пероксидазою хріну (100 мкл/лунку, розведені 1:10000 у РВ5-Т з 0,195 ВБ5А); інкубування триває 30-60 хв. при кімнатній температурі. 9. Планшет промивають 5Х РВ5-Т. 10. Додають розчин субстрату ТМВ (100 мкл/лунку) та планшет інкубують у непокритому стані у темному місці протягом 15 хв.. 11. Реакцію зупиняють шляхом додавання 100 мкл/лунку стоп-розчину ТМВ. 00340) Зразки досліджують тричі та оптичну густину вимірюють з побудовою стандартної кривої та визначення константи зв'язування. Статистичний аналіз проводять з застосуванням 1- тесту Стьюдента або іншого стандартного тесту. (003411) Зрозуміло, що подібну схему також можна застосувати для перевірки зв'язування антитіл з МЕСЕ.
Приклад 4: Авидність антитіла та кількість доступних епітопів у клітинах з експресією СО105.
І00342| Авидність антитіла та кількість доступних епітопів у клітинах з експресією СО105 може бути оцінена з допомогою аналізів графіка Скетчарда з застосуванням стандартних умов. 00343) Стисло кажучи, були здійснені аналізи прямого зв'язування мічених радіоактивною міткою анти-СОТ1ТО5 антитіл з лейкозними клітинами КМ-3 з експресією СО105 та субконфлюентними проліферуючими клітинами НОМЕС з застосуванням графіка Скетчарда. бо Очищені анти-СО105 антитіла індивідуальним чином помітили радіоактивною міткою (7251) з застосуванням способу Іодо-Сеп та згідно зі стандартними способами, які відомі фахівцям у цій галузі. Мічені радіоактивною міткою анти-СО105 антитіла відповідно досліджували на кількість атомів йоду (в середньому) на молекулу ДО. Експерименти по титруванню проводили з застосуванням фіксованої кількості (0.1 мкг) кожного міченого "25| моноклонального антитіла та дворазових серійних приростів клітина КМ-3 з експресією СО105 або клітин НОМЕС для визначення антиген-зв'язуючої активності. Аналіз результатів зв'язування з застосуванням графіка Скетчарда проводили у відповідності з відомими способами. З допомогою цього аналізу було обчислено константу рівноваги та середнє максимальне число зв'язаних моноклональних антитіл на клітину.
Приклад 5: Вестерн-блот аналіз блокуючої активності. (00344) Здатність анти-СО105 антитіл блокувати стимульоване білююм СО105 активування клітин, у яких відбувається експресія цього білка може бути досліджена шляхом Вестерн-блот аналізу для визначення фосфорилювання білків, залучених до шляху сигналування СО105.
І00345| Вестерн-блот аналіз було здійснено для визначення фосфорильованих білків
Зтай1/5/8 або Зтаад?2 у відповідності з відомими способами проведення цього аналізу. Антитіла
РбБтаді та Рбтайд2 специфічно впізнають фосфорильований білок Зтай1/5 або фосфорильований білок Зтад2 у нетрансфікованих ендотеліальних клітинах. Для визначення молекул у зразках були застосовані перші антитіла до 5тай1, Зтад2, Зтадй5, 191 (Запіа Сги?) та СО105. Визначення було здійснено шляхом підсиленої хемолюмінесценції (ЕС).
Приклад 6: Пригнічення росту клітин НОМЕС та аналіз включення ЗН-тимідину. (00346) Кількість аналізів була прийнятною для оцінки пригнічення клітинного росту.
І00347| У одному прикладі клітини НОМЕС культивували у флаконах з площиною поверхні 75 см: (РаїІсоп, Весіоп-бісКіпзоп, Егапкіїп І акев5, МУ) у інкубаторі з СОг та температурою 37"С у субконфлюєнтних умовах. Відокремлення клітин здійснювали шляхом 15-хвилинного інкубування у збалансованому сольовому розчині Хенкса з 15 мМ ЕОТА у 25 мМ буфері НЕРЕЗ5, рН 7.3 при температурі 37"С. Після подвійного промивання крижаним РВБ, клітини ресуспендували у ростовому середовищі ендотеліальних клітин з концентрацією у 25,000 клітин/мл. 00348) У додаткових експериментах, ендотеліальні клітини пупкової вени людини (НОМЕС)
Зо суспендували та культивували у вільному від ембріональної телячої сироватки (ЕВ5) та екстрактів бичачого мозку ростовому середовищі ендотеліальних клітин. Аліквоту (200 мкл) клітинної суспензії посіяли у кожну лунку 96-луночного культурального планшету та. клітини культивували у інкубаторі з СО» та температурою 37"С протягом ночі, після нього до них додали (у трьох примірниках) анти-СО105 антитіла, анти-МЕСЕ антитіла, комбінацію анти-СО105 антитіл та анти-МЕСЕ антитіл та контроль (дО або ТОЕ-рР1). Культуральні планшети зберігали у інкубаторі протягом 72 год.. з заміщенням (кожні 24 години) свіжого середовища та антитіл або контролів. Потім до кожної лунки додали ЗН-тимідин (1 мкК) та планшети інкубували ще протягом 20 год. Далі клітини промили РВЗ та обробили розчином трипсин-ЕОТА (0.059505 трипсин, 0.53 мМ ЕОТА; 100 мкл/лунку) з наступним 15-хвилинним інкубуванням при 37"С. Збір клітин здійснювали на фільтрах зі скловолокна (УМайас Ргіпіей РійегтаїА) з застосуванням автоматичного колектору клітин Нагмехіеєг 96 (ТОМТЕС, НВМДеп, СТ) та ЗН-радіоактивність визначали з допомогою лічильника Тгйих 1540 МісгоВеїа Гідціай ЗсіпіШаєноп апа Гитіпезсепсе
Сошцпіег (У/аІас, Тижи, Ріпіапа).
Приклад 7: Аналіз пригнічення клітинної міграції.
І00349| Вимірювання міграції (хемокінезу) у якості показника клітинної проліферації та активування здійснювали з застосуванням камери Бойдена. 00350) Стисло кажучи, оцінку клітинної міграції проводили наступним чином: нуклеопорний фільтр Созіаг (з порами у 8 мм) покрили фібронектином та інкубували при 4"С протягом ночі.
Камеру промили фосфатно-сольовим буфером (РВ5) та нижню камеру наповнили середовищем ЮМЕМ з сироваткою або без неї та з білюм ТОЕ-В3 або без нього. Клітини трипсинізували та суспендували з кінцевою концентрацією у 50,000 клітин/умл у середовищі
ОМЕМ з присутністю контрольних антитіл, анти-СО105 антитіл, анти-МЕСЕ антитіл або їх комбінацій, після чого до верхній камери додали аліквоту (150 мкл) клітинної суспензії та камеру інкубували при 37"С. Через 16 год. клітини промили та верхню поверхню протерли для видалення клітин, які не мігрували. Потім мембрани зафіксували у метанолі, промили водою, піддали фарбуванню та підрахували кількість клітин, присутніх на нижній поверхні.
Приклад 8: Аналіз АОСОС.
ІЇ00351| Описані тут антитіла можуть бути оцінені щодо їх здатності генерувати І1І-2- активовані природні кілерні (МК) клітини та викликати АОСС з застосуванням, наприклад, (516) наступних процедур:
Виділення клітин МК та отримання клітин МК, активованих ІІ -2.
І00352| Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК; РВМС) виділили та залишили відпочивати на 24 год. при 4"С у розчині КЕРМІ з 1095 ЕВ5. Потім ці клітини помістили у розчин
ЕРМІ з 295 ЕВ5 (повний об'єм - 50 мл) та 10 мл клітинної суспензії нанесли у чашку Петрі.
Клітини МКПК інкубували протягом 2 год. при 37"С та зібрали неприкріплені клітини. Клітини МК культивували у кількості 8х106/ мл з 1000 од./мл 1-2 протягом 48 год. з наступним 5-8 денним нормальним культивуванням перед проведенням аналізу.
Аналізи природної цитотоксичності та АОСОС. 00353) Клітини МК вилучили з культури (відскрібанням) та зібрали у 50 мл конічній пробірці.
Потім клітини один раз промили середовищем КРМІ (повний склад) та піддали 10-хвилинному центрифугуванню при 1200 об/хв. Потім клітини МК ресуспендували у 5 мл середовища КРМІ (повний склад) та підрахували. Перед проведення аналізу, кількість клітин МК нормалізували до співвідношення ефектор:мішень, як 10:11. Нормалізовані клітини МК нанесли на планшети, до призначених лунок додали 10 мкл анти-СО105 антитіл та планшети нкубували 30 хв. при 37"С.
Контрольні зразки містили необроблені або оброблені контрольними антитілами клітинні популяції.
І00354| Інтересуючі клітини-мішені зібрали (клітини НОМЕС), промили, піддали 10- хвилинному центрифугуванню при 1200 об/хв. та ресуспендували у 5 мл середовища КЕРМІ (повний склад). Потім клітини-мішені знову промили та ресуспендували у безсироватковому середовищі КРМІ до кінцевої концентрації у 1х105 клітин /мл. Потім ці клітини помітили кальцеїном-АМ з кінцевою концентрацією 5 мкг/мл та інкубували протягом години 1 при 37"С, після чого їх двічі промили середовищем КРМІ (повний склад). Далі клітини-мішені ресуспендували та додали до лунок з клітинами МК. Комбінацію клітин-мішеней та клітин МК потім інкубували при 37"С протягом 4 год. Після інкубування планшети піддали 5-хвилинному центрифугуванню при 1200 об/хв. та клітини промили та ресуспендували у ОРВБ.
Флуоресценцію зчитували з застосуванням співвідношення емісії/збудження у 450/530 нм та емісія була показником опосередкованої антитілами загибелі клітин.
Приклад. 9: Оцінка стійкості композицій ТКС105 (анти-СО105 антитіл).
ІЇ00355| Винахідники визначили композиції, які забезпечують адекватну стійкість при концентраціях ТКС105, вищих, ніж 5 мг/мл. Початкові дослідження показали, що можна досягти концентрації ТЕС105 у принаймні 25 мг/мл без будь-яких очевидних обмежень розчинності, отже у якості початкової концентрації ТКС105 для скринінгових досліджень була вибрана концентрація у 25 мг/мл. Протягом курсу цих досліджень була проведена оцінка композицій з концентраціями ТЕС105, які перевищували 50 мг/мл. Додатково також було проведено оцінку композицій з концентраціями ТКС105 у 7 мг/мл та 100 мг/мл.
Процедури.
Спектроскопія з ультрафіолетовим (УФ) поглинанням. (00356) УФ-спектроскопію застосовували для визначення концентрації білка у зразках різної стійкості. Було визначено, що поглинання нефасованої речовини при довжині хвилі у 280 нм (7,0 мг/мл), яке дорівнювало 1,13 при застосуванні довжини пробігу клітини у 1 мм, веде до появи коефіцієнту екстинції у 1,61 мл/мг.-см. Це значення було застосовано для всіх обчислень у цьому проекті. Додаткові вимірювання також було проведено із застосуванням 0,0096 см клітини, що більш пасує до зразків високої концентрації.
Інкубування термостійких зразків ТЕС105.
Ї00357| Кожну термостійку композицію було пропущено через фільтр МШех (0.22 мкм) з прикріпленим шприцом І цег ІосК, після чого його аліквоти помістили у флакони для ліофілізації об'ємом 1 мл та кожен флакон герметично закрили пробкою з бутилкаучуку з наступним обжиманням алюмінієвою кришкою. Зразки помістили при вказаній температурі до кліматичних камер та потім вони були вилучені після зазначеного періоду інкубування, який сягав протягом декількох тижнів.
Заморожування-відтавання та струшування ТКС105. (00358) Зразки для заморожування-відтавання (Р/Т) заморозили на 25 хв. та потім піддали відтаванню 0 або З або 5 разів протягом 25 хв. Всі операції заморожування здійснювали при температурі -80"С. Зразки після відтавання перевіряли на повне відтавання перед новим заморожуванням. Кожен зразок для заморожування-відтавання містив 100 мкл розчину та його зберігали у 0.5 мл мікропробірках (Еррепдогі). Кожен зразок містив 0.195 Еб68, 0.005956 Тмееп 80 або не містив поверхнево-активних речовин.
Ї00О359| Зразки для досліджень струшування отримали у кількостях 350 мл на колбу та помітили ті з них, що були призначені для струшування та для нерухомого стану. Всі зразки бо перенесли у холодну кімнату з температурою 4"С. Зразки, помічені призначеними для струшування розмістили на круговій качалці зі швидкістю хитання у 150 об/хв. Зразки, помічені призначеними для стану спокою розташували на полиці поблизу кругової качалці. Кожен зразок містив 0.195 68, 0.005956 Ту'ееп 80 або не містив поверхнево-активних речовин. Зразки інкубували протягом 24 год. у зазначених умовах.
Ексклюзійна хроматографія (5ЕС). 00360) Була отримана рухлива фаза, яка містила 0.2 М моноосновний фосфат натрію, рн якої довели до 7.0 з застосуванням 1.0 М Маон. Для всіх хроматографічних операцій була застосована колонка Т5К Се! 53000 РМ/ХІ (7.8 мм х 30 см, частинки Ж РОО47-02РМ(7 мкм)) зі швидкістю потоку 1 мл/хв. та довжиною хвилі визначення у 280 нм. Об'єм ін'єкції дорівнював 2 мкл для зразків з концентрацією 25 мг/мл та 1 мкл для зразків з концентрацією 50 мг/мл. Перед нанесенням кожного зразка (дослідження кожного зразка повторювали тричі) колонку кілька раз промивали буфером та ці хроматограми були, відповідно, відняті. Об'єднання піків було проведено з допомогою програмного забезпечення Спготеїеоп 6.08.
Капілярне ізоелектричне фокусування (СЕР).
І00361| Аналіз шляхом капілярного ізоелектричного фокусування (сІЕЕ) проводили, як описано у РА 800 ріи5 Арріїсайоп Сціде рибіїзпеа Бу ВесКтап Сошег. Більш детальний опис можна знайти у Маск еї аї!. (ЕІесігорпогевзів 2009, 30 (23), 4049-4058). Всі аналізи здійснювали з застосуванням системи для капілярного електрофорезу ВесКтап Сошег Р/АСЕМ МО (ВесКтап СошпПМег, Іпс.; Вгеа, СА) при температурі навколишнього середовища з повною довжиною нейтрального капіляру, яка дорівнювала 30 см (ефективна - 20 см) (внутрішній діаметр - 50 мкм). Нейтральний капіляр було отримано шляхом імобілізації полі(акриламіду) до капілярної стінки з застосуванням способу, описаного у Сао еї аї. (Апа!Ї Спет 2004, 76 (24), 7179-7186). Всі зразки для СІЕЕ-аналізу були отримані шляхом змішування інтересуючого білка з концентрацією 0.25 мг/мл з сумішшю гелю шигеа-СсІЕЕ від ЗМ, який містив амфоліт, катодний стабілізатор, анодний стабілізатор та маркери для ізоелектричної точки (рі). Зразки вводили у капіляр під тиском 0, 655 бар протягом 4.1 хв., після чого їх зосереджували протягом 15 хв. між анолітом та католітом з застосуванням напруги у 25 кВ. Після цього протягом 30 хв. відбувалася хімічна мобілізація речовини при 30 кВ між анолітом та хімічним мобілізатором. Маркери рі та інтересуючий білок визначали під час етапу мобілізації при довжині поглинання у 280 нм. рі
Зо білка обчислювали з допомогою отриманого рівняння регресії рі у порівнянні з моментом першого піку, отриманим при застосуванні рі - стандартів.
Результати та обговорення.
Дослідження 1.
І00362| Зразки ТКС105 були успішно піддані концентруванню до концентрацій, які перевищували 5 мг/мл. В результаті цього, дослідження 1 проводили з застосуванням концентрації білка у 25 мг/мл. Зразки зберігали протягом двох тижнів при температурі 40"С. 16 композицій були отримані з зосередженням на впливі рН та буферної композиції (Таблиця 2).
Основним аналітичним способом, застосованим для оцінки стійкості цих зразків була ексклюзійна хроматографія (5ЕС). Після зберігання протягом двох тижнів при 40"С при застосуванні БЕС спостерігали дуже маленький заряд як для мономерного вмісту, так і для агрегатів з високою молекулярною масою (Таблиця 3). Всі композиції зберегли більш, ніж 9995 мономерів після зберігання.
Таблиця 2
Склад композиції ТКС105, оцінку якої проводили у дослідженнях 1 в |! 7| 20 | 0 | 0 ЇЇ 0 | 7130 | 0 02 |6| 20 | 0 | 0 | 0 | 130 | 0
РОЗ |6| 0 | 20 | 0 | 0 | 130 | 0
РМ |51| 0 | 20 | 0 | 0 | 130 | 0 5 |6| 0 | 0 | 20 | 0 | 130 | 0
Роб | 5 0 | 0 | 20 | 0 | 130 | 0 07 |4| 0 | 0 | 0 | 20 | 130 | 0
ОЇ | 51 0 | 0 | 0 | 20 | 130 | о в |51| 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 20 по |5| 0 | 0 | 20 | 0 | о | 240
Таблиця 2
Склад композиції ТКС105, оцінку якої проводили у дослідженнях 1 й 151 0 | 0 1 0 ЇЇ 20 | 0 | 20 ма |6| 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 яз 6 0 | т | 0 | 0 | 0 | 20 4 |6| 10 | 0 | 0 | 0 | 80 | 20 |Ї6| 0 | 0 | 0 | 0 | 80 | 20
Таблиця З
Підсумкові результати досліджень рівнів мономерів та агрегатів, виміряні шляхом 5ЕС для композицій з досліджень 1 у початкову точку часу та через два тижні (12) ення и (п рення о композиції | рн й й й . агрегатів мономерів два тижні через два тижні 02 | 6 | 2 щ079 2 | 9970 | бе | 99
РОЗ | 6 | що079 2 | 9978 | 04 | 9982 «(
ОБ | 6 | щ о079 | 9978 | 028 (| 9
ОО | 5 | щоб | 9981 | 009 2 4 | .юЮюЙ9990 2 южКВЖ 2 | 6| ющо079 2 | 9978 | 053 | 9945
З | 6| щ бе | 9976 | 05 | 9981 4 | 6| щбго | 9976 | 045 | 9952 5 | 6| щбеї | 99579 | беї | 9977 00363) Було відмічено, що ТКС105 був дуже стійким.
Дослідження 2. 5 І00364| Після отримання результатів дослідження 1 було розроблено план досліджень 2. У цих дослідженнях рН змінювали у діапазоні від 4.0 до 5.5 з оцінкою ацетату, гістидину та цитрату. У якості модифікаторів/стабілізаторів для цих досліджень були вибрані сорбіт та трегалоза. Зрештою, окрім композицій з концентрацією 25 мг/мл, також були перевірені три композиції з концентрацією 50 мг/мл.
Таблиця 4
Склад композиції ТКС105, оцінку якої проводили у дослідженнях 2
Р | 55 | 25 | 0 | 0 | 2г0о | 0 | 0
Ра | 45 | 25 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0
РОЗ | 55 | 25 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0
РЯ | 55 | 25 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0
РОБ | 245 | 25 | 0 | 0 | 70 | 0 | 0
Роб | 40 | 25 | 0 | 0 | ло | 0 | 0
РО | 55 | 25 | 20 | 0 | 0 | 20 | о
РО | 55 | 25 | 20 | 0 | 0 | 0 | 240
Р | 40 | 25 | 0 | 0 | 20 | 20 | 0
Таблиця 4
Склад композиції ТКС105, оцінку якої проводили у дослідженнях 2 мо | 40 | 25 | 0 | 0 | 20 | 0 | 240 1 | 55 | 25 | 0 | 10 | 0 | 20 | о 2 | 55 | 25 | 0 | 10 | 0 | 0 | 240
З | 55 | 25 | 10 | 0 | 0 | 20 | 0 4 | 55 | 25 | 10 | 0 | 0 | 0 | 240
Б |40| 50 | 0 | 0 | то | 0 | 0 мб | 50 | 50 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 м | 55 | 50 | 20 | 0 | 0 | 20 | о 00365) Враховуючи стійкість композицій ТКС105, ці зразки зберігали протягом чотирьох тижнів при 40"С з метою спробувати більш докладніше відрізнити композиції. Головним засобом перевірки була 5ЕС-хроматографія.
Таблиця 5
Підсумкові результати досліджень рівнів мономерів та агрегатів, виміряні шляхом 5ЕС для композицій з досліджень 1 у початкову точку часу та через чотири тижні - о до агрегатів Фо мономерів ую агрегатів мономерів : й тижні тижні (00366) Подібно до спостереженого у дослідженнях 1, вміст мономерів майже всіх мономерів у наведених вище композиціях перевищував 99,595 навіть після місяця зберігання при температурі 40"С (Таблиця 5). Схоже, що один зразок (Е16) показав підвищений рівень агрегації, однак цей зразок не було піддано повторній перевірці, щоб переконатися в тому, що це був дійсно вірний результат. Схоже на те, що показники рн 4 у ацетаті та рН 5.5 у гістидині забезпечують адекватну та прийнятну для порівняння стійкість. Через проблеми з цитратом та подразнення, його було вилучено з подальшого розгляду...
І00367| Ці зразки також піддали аналізу з застосуванням капілярного ізоелектричного фокусування (СІЕЕ). Спочатку були здійснені обчислення загального центру сіІЕБ- електроферограми. Ці значення можуть вважатися середніми значеннями рі зразка (Таблиця 6).
Таблиця 6
Середнє значення рі для композицій ТКС з досліджень 2 у початкову точку часу та через чотири тижні ш Початкове . (00368) Загальним чином, мале змінення значення рі для будь-якої композиції свідчить про те, що деамідування, тобто гідроліз аспарагіну бічних ланцюгів, який веде до утворення заряджених аспарагінових продуктів є відносно низьким (Таблиця 6). Отже, схоже, що ці композиції ТКС105 є фізично стійкими (тобто мають низький рівень агрегації або взагалі її не мають) та хімічно стійкими (тобто не розпадаються на фрагменти та мають низький рівень деамінування або взагалі його не мають).
І00369| Іншим питанням було виявити, чи будуть ці композиції з підвищеною концентрацією демонструвати неприйнятний рівень в'язкості, що тим самим обмежить їх клінічне застосування.
Таблиця 7
Динамічна в'язкість ТЕС105 у ацетатному та гістидиновому буфері при концентраціях у 25 та -50 мг/мл (003701 Навіть при концентрації у 50 мг/мл, ТКС105 демонструє в'язкість, яка є меншою, ніж 2 сСт, що є значно нижчим, ніж будь-яке значення, яке буде спричинювати обмеження у застосуванні цього композиції та у поводженні з ним (див. Таблицю 7).
Дослідження струшування. 00371) Хоча тепловий стрес є корисним для розрізнення композицій різної стійкості, білки можуть зустрітися не тільки зі стресом. Також звичайно мають місце поверхневі пошкодження білків та чутливість до таких пошкоджень також треба оцінити. Це було здійснено з допомогою перевірки на струшування та повторюючихся циклів заморожування-відтавання (Р/1Т). 5О0
Таблиця 8
Отриманий шляхом ЗЕС мономерний вміст композицій ТКС105, який струшували протягом 24 год. при 150 об./хв.та відповідні зразки, які зберігали у стані спокою. Всі зразки тримали при температурі 4760 оженно | ШЕ | во | жене | мето
Композиція активна Білок Мономер (0) Мономер (5) речовина
РН 5, 20 мМ ацетат
РН 5, 20 мМ ацетат
РН 5,5, 20 мМ гістидин
РН 5,5, 20 мМ гістидин
І00372| Дослідники не спостерігали помітних втрат мономерів при струшуванні у всіх композицій, які показали більш, ніж 99,795 вмісту мономерів та відсутність значної різниці у порівнянні з контролем у стані спокою (Таблиця 8). Додавання поверхнево-активної речовини, як-то Ріигопіс Е-68 або полісорбат 80, схоже не погіршує та не покращує стійкості при струшуванні.
Дослідження заморожування/відтавання. 00373) Другі дослідження були присвячені перевірці чутливості ТКС105 до поверхневого стресу, викликаного впливом повторюючихся циклів заморожування-відтавання. Така перевірка не тільки надає інформацію про поверхневі пошкодження (як-то поверхня розділу льоду та води), але й також надає необхідну інформацію про те, чи можуть зразки ТКС105 бути заморожені для подальшого аналізу або під час їх перевезення.
Таблиця 9
Отриманий шляхом ЕС мономерний вміст композицій ТКС105, який піддали 0, З та 5 циклам заморожування/відтавання
Поверхнево- . речовина мл
РН 5, 20 мМ ацетат
РН 5, 20 мМ ацетат
РН 5,5, 20 мМ гістидин
РН 5,5, 20 мМ гістидин (00374) Змінень мономерного вмісту під час повторюючихся циклів заморожування/відтавання практично відмічено не було. (Таблиця 9). Несподівано було показано, що додавання поверхнево-активної речовини, як-то Рійгопіс Е-68 або полісорбат 80 не змінює стійкість під час цих циклів. Разом з результатами досліджень струшування це свідчить про відсутність показань того, що ТКС105 є настільки поверхнево-активним композиціяом, що поверхневі пошкодження будуть становити проблему. Отже, немає необхідності у додаванні поверхнево-активних речовин до рідкої композиції.
Підсумки: 003751) Скринінгові дослідження композиції були проведені з ТЕС105 з концентраціями білка до 50 мг/мл. Цей білок є досить стійким та ЗЕС-хроматографічний аналіз виявив тільки незначні зменшення мономерного вмісту навіть після чотирьохтижневого зберігання при 407С та не виявив жодного випадку його фрагментації. Тим часом сІЕКЕ-аналіз виявив тільки незначні змінення загальної ізоелектричної точки (рі), що свідчить про те, що деамідування у досліджуваному діапазоні рН (4.0-5.5)3 було мінімальним. Не виявлено доказів чутливості цієї композиції до поверхневого пошкодження, що свідчить про те, що рідка композиція ТКС105 не потребує додавання поверхнево-активної речовини.
ІЇ00376| У складі основних композицій було застосовано ацетатний буфер з рН 4.0 або гістидиновий буфер з рН 5.5 разом з сорбітом або трегалозою у якості модифікатора тонічності та стабілізатора.
Приклад 10: Оцінка довготривалої стійкості композицій ТКС105.
І00377| Оцінку довготривалої стійкості проводили з метою перевірки результатів досліджень 1 та 2. Наведені у Таблиці 10 зразки композицій зберігали при температурі 57С та 2576.
Таблиця 10
Композиції для перевірки досліджень
Результати та обговорення.
І00378| Сім тестових композицій досліджували протягом року при температурі 57С та 6 місяців при температурі 25"С. При температурі 5"С всі композиції показали добрі результати.
Візуальні спостереження всіх зразків у всі періоди часу досліджень показали, що вони були прозорими та безбарвними. Значення рН всіх нових композицій також головним чином залишалися постійними, доки тривали дослідження (див. Таблиці 11 та 12). Вони мали незначне підвищення на 0,1-0,2 одиниці порівняно з контрольними зразками, але залишалися надалі у такому стані. Значення концентрацій нових композицій, які були визначені шляхом Уф-детекції також залишалися постійними з відхиленням у межах «3-4 95 від оригінального контрольного
Зо значення незалежно від концентрації (див. Таблиці 11 та 12). Ці значення також значно не змінювалися протягом курсу досліджень. З допомогою ЗЕС-хроматографії було визначено мінімальний відсоток втрати мономерів при 5"С (див. Таблицю 13) та з допомогою СІЕЕ-аналізу були визначені мінімальні значення хімічної деградації (див. Таблиці 15 та 16). Незважаючи на деякі відмінності у результатах зв'язування СО105, отриманих шляхом ІФА, всі значення (за виключенням початкових результатів для ЕО5) знаходилися у межах критерію прийнятності, які дорівнювали 5095 - 15095 порівняно до подібних меж еталонного стандартного зразка, що узгоджується з етапом проведення ІФА-аналізу (див. Таблицю 17). Результати перевірки з допомогою капілярного електрофорезу у присутності додецилсульфату натрію (СЕ-505) свідчать про те, що зразки були прийнятними до порівняння з еталонним матеріалом при 57С протягом одного року зберігання (дані не наведені).
ІЇ00379| У той час, як зразки, які зберігали при 5"С суттєво не змінилися, параметри композицій мали вплив на стійкість зразків при температурі 25 "С. Перш за все, композиції, які містили ацетатну буферну систему (БО3, ЕО5, Б07) показали більше зменшення відсоткового мономерного вмісту у порівнянні з композиціями, які містили гістидиновий буфер (БО1, г02, РО4, та Е06) (див. Таблицю 14). При цьому змінення концентрації білка скоріш за все мали незначний ефект або взагалі не мали ефекту. Дві композиції з концентраціями 100 мг/мл (Б06, 07) можна порівняти з подібними композиціями з концентрацією 50 мг/мл (04, РО5) з точки зору їх 5ЕС та
СІЕЕ профілей.
Таблиця 11
Показники рН та отримані з допомогою УФ-спектроскопії концентрації композицій (у мг/мл) при
Початкове о, о. 2.
Мо композиції значення
Роб | 56 | 98 | 57 | 99 | 57 | 104 | 56 | 105
РО | 43 | 99 | 44 | 102 | 44 | лов | 43 | 102
Таблиця 12
Показники рН та отримані з допомогою УФ-спектроскопії концентрації композицій (у мг/мл) при 2Ус
Початкове о, о. 2.
Мо композиції значення рН | конш | рН | коні | | рн | коні | рн
Таблиця 13
Ексклюзійна хроматографія (ЗЕС) при 57С значення 99,36 99,36 99,38 99,37 99,37 99,37 99,34 99,37 99,37 99,35 99,31 99,24 99,35 99,33 99,32 99,31 99,38 99,35 99,31 99,24 99,24 99,22 99,19 99,18 99,35 99,29 99,23 9917
Таблиця 14
Ексклюзійна хроматографія (ЗЕС) при 257"
Мо композиції -- -- -2 99,36 99,27 96,37 99,37 99,28 96,25 99,37 96,02 93,64 99,35 99,18 96,51 99,38 96,07 93,70 99,24 98,99 96,23 99,35 96,02 93,84
Таблиця 15
Результати сІЕР-аналізу: середні значення ізоелектричної точки (рі) при 570 є: ши ши
З місяці 6 місяців 12 місяців значення 01777790 юЮ-| .ЮрЄВО | 90 2 2 Щ | 90 2 жжЖЄ 02 | 77/88 2 юЮюЮюЮГЮ|.ЮЙЮЗВО | 89 | 90 2 ж ж юЖЄ нини хни т и Хо ПО о осях НОЯ
Я | ./ю88 2 ЮюЮщ | 89 | 89 | 90 2 ж жЖфе
РОБ | .юЙйв88 2 2юЮюЮЙЯ.ЙЮюЮюилве |в 190
Роб | .юЙ88 2 ЮюЮюЮф | щ 89 | 89 | 90 2 ж жф
Ро | 88 2 6ЮюЮщ | 89 | 89 | 90
Таблиця 16
Результати сСІЕРЕ- аналізу: середні значення ізоелектричної точки (рі) при 2570 0177 Ї77777171717196602ЮюЮюЮЮЄ.БКБР(рК2 в 77717190 11102 | 7777789... 77171790 11111717117189 1 нин ши ши ших пиши пиши х пиши нини нини хни шин: ши пиши х пиши нин ши ши ши: х пиши пили я: пи нини ши: киш ших пол по ся: о нини сли хи о: У: я ПО с Я: о
Таблиця 17
Результати ІФА-аналізу зв'язування СО105 при 57С
Мо композиції й-- - у и тт я В Т:х Я ПО: Р НО з: ЗНО ни у ни и и ПО: То ПО с ПО ши с: и п ЕТ: Я ПОТ ПО Те ЗО 107 | 777777лоо7 | 77777777 м |! 77777786 71
Приклад 11: Оцінка довготривалої стійкості композиції ТКС105 (4 мг/мл). 00380) Дослідження стійкості проводили з застосуванням композиції ТКС105, отриманої з концентрацією 4 мг/мл у 17 мМ фосфатному буфері з 145 мМ Масі при рН 7.2 (І ої РІМ-0536).
Були отримані дані щодо стійкості композиції при її 3б-місячному зберіганні в рекомендованих умовах (з температурою 2-8"С) та зберіганні протягом одного місяця в умовах для прискорених досліджень (з температурою 25"С/ 6095 відносної вологості). Результати досліджень стійкості наведені у таблицях нижче. Оскільки у будь-якому з проведених тестувань не було відмічено жодних значних змінень, ці дослідження вказують на те, що композиція ТКС105, отримана з концентрацією 4 мг/мл у 17 мМ фосфатному буфері з 145 мМ Масі при рН 7.2 зберігає свою стійкість протягом принаймні 36 місяців при температурі 2-86.
Таблиця 18
Результати досліджень стійкості ТКС105 при зберіганні у рекомендованих умовах з температурою 2-87 . Початок о. о, 2.
Прозорий Прозорий Прозорий Прозорий безбарвний безбарвний безбарвний безбарвний
Зовнішній вигляд та розчин. розчин без розчин з розчин з опис Незначний сірий видимої незначною незначною пил, подібний до наявності кількістю білих кількістю білих частинок частинок частинок. частинок. невідновл. стандартом стандартом стандартом стандартом відновл. стандартом стандартом стандартом стандартом зв'язувальна зв'язувальна зв'язувальна зв'язувальна активність активність активність активність
ІФА-аналіз дорівнює 8890 дорівнює 11090 дорівнює 10490 дорівнює 9190 зв'язування СЮО105 порівняно з порівняно з порівняно з порівняно з еталонним еталонним еталонним еталонним стандартом стандартом стандартом стандартом
Таблиця 18 (продовження)
Прозорий Прозорий Прозорий Прозорий безбарвний безбарвний безбарвний безбарвний
Зовнішній вигляд та розчин з розчин без розчин без розчин без опис незначною видимої видимої . . ши . . . видимої наявності кількістю білих наявності наявності частинок частинок частинок частинок невідновл. стандартом стандартом стандартом стандартом відновл. стандартом стандартом стандартом стандартом зв'язувальна зв'язувальна зв'язувальна зв'язувальна активність активність активність активність
ІФА-аналіз дорівнює 8890 дорівнює 13690 дорівнює 8890 дорівнює 10590 зв'язування СЮО105 порівняно з порівняно з порівняно з порівняно з еталонним еталонним еталонним еталонним стандартом стандартом стандартом стандартом (Стерильність | неперевірене | - | неперевірене |: -
ЗО5-РАСЕ- аналіз шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (відновлених та невідновлених білків та пептидів)
ІЕЕ - аналіз шляхом ізоелектричного фокусування/капілярного електрофорезу.
ЗЕС-НРІ С- аналіз шляхом ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії.
Таблиця 19
Результати досліджень стійкості композиції І ої РІМ-0536, яку зберігали в умовах для прискорених досліджень (з температурою 25"С/6095 відносної вологості)
Зовнішній вигляд та опис Незначний сірий пил, подібний - . без видимої наявності частинок до частинок . зв'язувальна активність зв'язувальна активність зв'язування СЮО105 еталонним стандартом еталонним стандартом
Процедури аналізу шляхом ексклюзійної ВЕРХ-хроматографії та УФ-детекції були такими ж, як описано у Прикладі 9. Процедура ІФА-аналізу зв'язування СО105 була такою ж, як описано у
Прикладі 3. Процедури аналізу шляхом електрофорезу відновлених та невідновлених білків та пептидів в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію та ізоелектричного фокусування описані нижче.
Електрофорез невідновлених білків та пептидів в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію; фарбування барвником Кумассі.
І00381| Ідентичність та чистоту досліджуваних сполук оцінювали з застосуванням аналізу шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі. Розділення білків здійснювали в умовах денатурації з застосуванням готового розчину 4-1295 Вів-Ггів 505-, який містив гелі. 505 є аніонним детергентом, який взаємодіє з білками з утворенням негативно заряджених комплексів. Ці комплекси переміщуються крізь поліакриламідні гелі у відповідності до їх розмірів, наприклад, більш дрібні білюи переміщуються швидше, ніж білки більшого розміру.
Стандарти та контрольні та досліджувані сполуки денатурують та наносять на гель. Після завершення пробігу гелі фарбують барвником (Кумассі блакитним). Для сканування гелів застосовують скануючий денситометр. (003821 Відносну кількість кожної забарвленої смужки визначають шляхом денситометрії для лінії від кожної досліджуваної сполуки. Ці кількості наведені у вигляді відсотку від загальної кількості у повній смузі, отриманої для цієї лінії. Значення молекулярної маси (кДа) смужок досліджуваних сполук визначають на основі порівняння з маркерами молекулярної маси.
Електрофорез відновлених білків та пептидів в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію; фарбування барвником Кумассі.
Зо І00383| Електрофорез відновлених білків в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію є таким, як описано у Розділі 1.3.2 (вище) для невідновлених зразків, але з додаванням етапу відновлення (для розщеплення внутрішньо- та міжмолекулярних дисульфідних зв'язків для вивільнення білкових субодиниць, а також інших агрегатів). Для відновлення білків, до зразків та стандартів додають дитійотрейтол (50 мМ), після чого їх нагрівають протягом 5 хвилин при 85"С. При русі відновлених білків у гелі, до рухливого буферу додають антиоксидант.
Застосування горизонтального ізоелектричного фокусування (ТЕР). 00384) У цьому способі розділення білків здійснюють на основі їх різного заряду, який виникає при дії електричного струму. Градієнт РН встановлюють між катодом та анодом, з катодом, який має підвищений рН. Оскільки білки мають амфотерні властивості, вони будуть мати позитивно заряджені значення, які знаходяться нижче їх ізоелектричної точки та негативно заряджені значення, які знаходяться вище їх ізоелектричної точки. Під впливом електричного струму встановлюється градієнт рН та білки будуть переміщуватися та зосереджуватися у власних ізоелектричних точках. Ця процедура полягає у застосуванні ізоелектричного фокусування білкових зразків з допомогою готових гелів від виробника у горизонтальному форматі. Після електрофорезу гелі фарбують барвником Кумассі. Площину кожної смужки визначають шляхом денситометрії для кожної лінії зразка. Площину смужок обчислюють у вигляді відсотку від площини загальної смуги. Також для кожної зі смуг визначають значення рі та КІ.
Приклад 12: Клінічні дослідження колоректального раку.
Ї00385| У цьому прикладі описані рандомізовані, сліпі, плацебо-контрольовані, багатоцентричні дослідження другої фази, метою яких було отримання попередньої оцінки безпечності та ефективності анти-СО105 антитіл у пацієнтів з колоректальним раком. Для участі у цих дослідженнях записують приблизно 100-800 пацієнтів, з яких приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за лікувальною групою та приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за групою плацебо. Дослідження полягають у внутрішньовенному введенні пацієнтам повторюючихся доз анти-СО105 антитіла з концентрацією приблизно у 0.1-140 мг/кг або плацебо. Введення здійснюють кожні два тижні впродовж 6-10 циклів. У всіх групах також може бути застосована хіміотерапія та пригнічувач МЕСЕ. Час проведення досліджень оцінюють, як приблизно 6 місяців - 5 років, з продовженням терапії для пацієнтів без клінічної відповіді на лікування, як вказано наприкінці початкового дослідження.
Додаткові критерії оцінки є наступними: 00386) Головний критерій оцінки: загальна швидкість відповіді. Однією метою досліджень є проявлення підвищеної загальної швидкості відповіді на лікування анти-СО105 антитілами у порівнянні з контрольним Ідс.
І00387| Додатковим критерієм оцінки може бути тривалість відповіді, час розвитку пухлин, загальний рівень виживання, тяжкі та нетяжкі несприятливі події. Наприклад, лікування може запобігати розвитку захворювання (тобто досягнення стану спокою) або може привести до покращення стану хворого. Альтернативно або додатково можуть бути виміряні інші показники дослідження відносно однієї або кількох наступних ознак: знизилося пухлинного навантаження, зниження неоваскуляризації, зменшення побічних ефектів, зниження побічних реакцій та/або
Зо збільшення дотримання пацієнтом вимог лікаря.
Приклад 13: Клінічні дослідження раку нирок.
ЇОО388| У цьому прикладі описані рандомізовані, сліпі, плацебо-контрольовані, багатоцентричні дослідження другої фази, метою яких було отримання попередньої оцінки безпечності та ефективності анти-СО105 антитіла у пацієнтів з нирковоклітинним раком (рак нирки). Для участі у цих дослідженнях записують приблизно 100-800 пацієнтів, з яких приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за лікувальною групою та приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за групою плацебо. Дослідження полягають у внутрішньовенному введенні пацієнтам повторюючихся доз анти-СО105 антитіла з концентрацією приблизно у 0.1-30 мг/кг або плацебо. Введення здійснюють кожні 1-3 тижні впродовж 3-6 циклів або до появи прогресу у лікуванні . У обох лікувальних групах також може бути застосовано інтерферон та пригнічувач
МЕСРБ. Час проведення досліджень оцінюють, як приблизно 6 місяців - 5 років, з продовженням терапії для пацієнтів без клінічної відповіді на лікування, як вказано наприкінці початкового дослідження. Додаткові критерії оцінки є наступними:
Ї0О0389| Головний критерій оцінки: виживання без прогресування захворювання. Однією метою досліджень є проявлення підвищення виживання без прогресування захворювання після лікування з анти-СО105 антитілами у порівнянні до плацебо. 00390) Додатковим критерієм оцінки може бути тривалість відповіді, час розвитку пухлин, загальний рівень виживання, тяжкі та нетяжкі несприятливі події. Наприклад, лікування може запобігати розвитку захворювання (тобто досягнення стану спокою) або може привести до покращення стану хворого. Альтернативно або додатково можуть бути виміряні інші показники дослідження відносно однієї або кількох наступних ознак: знизилося пухлинного навантаження, зниження неоваскуляризації, зменшення побічних ефектів, зниження побічних реакцій та/або збільшення дотримання пацієнтом вимог лікаря.
Приклад 14: Клінічні дослідження гепатоклітинного раку.
ЇОО391| У цьому прикладі описані рандомізовані, сліпі, плацебо-контрольовані, багатоцентричні дослідження другої фази, метою яких було отримання попередньої оцінки безпечності та ефективності анти-СО105 антитіла у пацієнтів з гепатоклітинним раком (раком печінки). Для участі у цих дослідженнях записують приблизно 100-800 пацієнтів, з яких приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за лікувальною групою та приблизно 50-400 пацієнтів бо закріплюють за групою плацебо. Дослідження полягають у внутрішньовенному введенні пацієнтам повторюючихся доз анти-СО105 антитіла з концентрацією приблизно у 0.1-30 мг/кг або плацебо. Введення здійснюють кожні 1-3 тижні або до появи прогресу у лікуванні. У обох лікувальних групах також може бути застосовано пригнічувач МЕСЕ. Час проведення досліджень оцінюють, як приблизно 6 місяців - 5 років, з продовженням терапії для пацієнтів без клінічної відповіді на лікування, як вказано наприкінці початкового дослідження.
Додаткові критерії оцінки є наступними:
І00392| Головний критерій оцінки: виживання без прогресування захворювання. Однією метою досліджень є проявлення підвищення виживання без прогресування захворювання після лікування з анти-СО105 антитілами у порівнянні до плацебо.
І00393| Додатковим критерієм оцінки може бути тривалість відповіді, час розвитку пухлин, загальний рівень виживання, тяжкі та нетяжкі несприятливі події. Наприклад, лікування може запобігати розвитку захворювання (тобто досягнення стану спокою) або може привести до покращення стану хворого. Альтернативно або додатково можуть бути виміряні інші показники дослідження відносно однієї або кількох наступних ознак: знизилося пухлинного навантаження, зниження неоваскуляризації, зменшення побічних ефектів, зниження побічних реакцій та/або збільшення дотримання пацієнтом вимог лікаря.
Приклад 15: Клінічні дослідження раку яєчників.
Ї00394| У цьому прикладі описані рандомізовані, сліпі, плацебо-контрольовані, багатоцентричні дослідження другої фази, метою яких було отримання попередньої оцінки безпечності та ефективності анти-СО105 антитіла у пацієнтів з раком яєчників. Для участі у цих дослідженнях записують приблизно 100-800 пацієнтів, з яких приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за лікувальною групою та приблизно 50-400 пацієнтів закріплюють за групою плацебо. Дослідження полягають у внутрішньовенному введенні пацієнтам повторюючихся доз анти-СО105 антитіла з концентрацією приблизно у 0.1-30 мг/кг або плацебо. Введення здійснюють кожні 1-3 тижні впродовж 5 циклів. У обох лікувальних групах також може бути застосована хіміотерапія та/або пригнічувач МЕСЕ. Час проведення досліджень оцінюють, як приблизно 6 місяців - 5 років, з продовженням терапії для пацієнтів без клінічної відповіді на лікування, як вказано наприкінці початкового дослідження. Додаткові критерії оцінки є наступними:
Зо ІЇ00395| Головний критерій оцінки: виживання без прогресування захворювання. Однією метою досліджень є проявлення підвищення виживання без прогресування захворювання після лікування з анти-СО105 антитілами у порівнянні до плацебо. 00396) Додатковим критерієм оцінки може бути тривалість відповіді, час розвитку пухлин, загальний рівень виживання, тяжкі та нетяжкі несприятливі події. Наприклад, лікування може запобігати розвитку захворювання (тобто досягнення стану спокою) або може привести до покращення стану хворого. Альтернативно або додатково можуть бути виміряні інші показники дослідження відносно однієї або кількох наступних ознак: знизилося пухлинного навантаження, зниження неоваскуляризації, зменшення побічних ефектів, зниження побічних реакцій та/або збільшення дотримання пацієнтом вимог лікаря.
Приклад 16: Лікування вікової макулярної дегенерації.
Перше дослідження
І00397| Пацієнтів з ознаками вікової макулярної дегенерації лікують шляхом ін'єкційного введення у скловидне тіло анти-СО105 антитіла або контрольного антитіла для зменшення або запобігання розвитку неоваскуляризації, появи плям на рогівці та пошкоджень сітківки.
ІЇ00398| На першій стадії пацієнти проходять повне офтальмологічне обстеження для встановлення їх стану здоров'я очей на початок досліджень. Це офтальмологічне обстеження полягає у прямій офтальмоскопії, біомікроскопії з щілинною лампою, огляду периферичної частини сітківки, вимірюванні внутрішньоочного тиску, вимірюванні гостроти зору (без сторонніх засобів допомоги та кращої корекції) у застосуванні симптоматології, фотографування очного дна, флуоресцентної ангіографії, оптичної когерентної томографії, електроретинографії та вимірювань в амплітудному режимі. 00399) Після попередньої перевірки, пацієнту з ознаками вікової макулярної дегенерації здійснюють описану вище ін'єкцію у скловидне тіло. При ураженні обох очей їх можна лікувати по окремості. У око, яке підлягає лікуванню роблять ін'єкцію офтальмологічного розчину. (00400) Після лікування очі пацієнта піддають перевірці у перший (1), другий (2), сьомий (7), п'ятнадцятий (15), тридцятий (30) та шістдесятий (60) день лікування та ще через кожен місяць після цього впродовж двох років. Через можливість повторення хвороби, пацієнти також і в подальшому повинні звертатися для періодичних оглядів на щомісячній основі. У кожен день перевірки здійснюють контроль розрідження склоподібного тіла та, крім того, пацієнтів бо перевіряють на наявність задніх відшарувань скловидного тіла з застосуванням зворотної офтальмоскопії зі вдавлюванням склери. Нарешті, ступінь вікової макулярної дегенерації у пацієнтів постійно контролюють шляхом періодичних перевірок сітківки, оптичної когерентної томографії та флуоресцентних ангіограм з метою перевірки наявності субретинальної рідини, крові, ексудатів, відшарування пігментного епітелію сітківки, кістозних змін сітківки або наявності сірувато-зеленої субретинальної неоваскулярної мембрани. Додаткові лікарські процедури можуть знадобитися, якщо спостерігаються ознаки повторення неоваскуляризації. Додаткові способи лікування можуть бути здійснені на щотижневій або щомісячній основі. У кращому варіанті втілення, початкове лікування супроводжується наступними лікувальними заходами через 1-6 місяців.
Друге дослідження.
І00401| Метою досліджень є демонстрація ефективності введення у скловидне тіло анти-
СО105 антитіл для лікування неоваскулярної вікової макулярної дегенерації (ВМД). Крім того, у всіх пацієнтів може бути застосовано пригнічувач МЕСБЕ. (00402) Способи досліджень: У цих дослідженнях можуть брати участь 50-500 пацієнтів (50- 500 очей) з субфовеальною хороїдальною неоваскуляризацією (ХНВ), яка призводить до появи
ВМД. Дослідження здійснюють у призначеному для цього центрі. 00403) Критерієм повторної ін'єкції є наявність рідини у жовтій плямі сітківки, підвищена центральна товщина сітківки (СКТ) принаймні у 100 мікрон, пов'язана з підвищенням кількості рідини у жовтій плямі сітківки втрата можливості побачити принаймні 5 літер на таблиці
Снеллена, поява нової класичної хороїдальної неоваскуляризації або нового макулярного крововиливу. Головним підсумковим критерієм є відсоток втрати зору, як-то можливості побачити менш, ніж 15 літер на таблиці Снеллена через 12 місяців. Вимірювання гостроти зору з максимальною корекцією та клінічну офтальмологічну перевірку проводять через 1 тиждень, 1 місяць та потім щомісячно протягом 5-12 місяців. (00404| Середню гостроту зору та середню центральну товщину сітківки вимірюють у порівнянні з початковими значеннями з зазначенням офтальмологічних та/або системних побічних ефектів.
Приклад 17: Гуманізовані-деімунізовані послідовності антитіл. (00405) Виділене гуманізоване, деімунізоване анти-СО105 антитіло може містити змінну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ХЕО ІЮО Мо: 11 та змінну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як ХЕО ІЮ Мо: 12. (00406) 5ЕО ІЮО Мо: 11: Сім Маї Сіп І еи МаїЇ Сім Зег Сіу СіІу СІу І єи Ма! Гуз Рго Спіу Спу Зег І єи
Ага Гей Зег Суз Аа Аа бег Сіу Ре Тнг РНе 5ег Авр Аа Тр Меї Ар Тгр Маї Аг СіІп Аа Рго Сіу
Гуз СПУ Ї еи Спи Тер Ма! Спіу Спи Аа Агу 5ег І уз Аа 5ег Азп Ні Аа Тниг Туг Туг АІа Си Зег Маї Гуз
Сіу Агуд Рпе Тнг Пе Зег Агу Авр Авр Зег Гуз Авп ТАг Геи Туг Гей Сп Меї Авп 5ег Геи Гув ТНиг Сі
Азр Тиг Аїа Маї Туг Туг Сувз Тнг Аго Тгр Аго Ага Ріе РНе Авр 5ег Тгр Сіу Сіп Спіу Тиг Геи Маї ТнНг маї Зег Зег
І00407| 5ЕО ІЮО Мо: 12: Азр Пе СіІп Меї Тпг СіІп Зег Рго 5ег Зег І еи Зег АІа Зег Ма! Спу Азр Аг9
Аа Тпг Ше Тниг Суз Агу Аа бег 5ег Зег Ма! Зег Туг Меї Ніз Ттр Туг Сп СІп Гув Рго Спу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Тр Аа Туг Аа Тиг 5ег Авп Гей Аа 5ег Су Маї Рго Зег Агу Ріє Зег Сіу Зег Сіу Зег СПУ ТНг
Авр Туг ТНг І єи ТНг Пе Зег 5ег І єи Сіп Рго Сіи Авр Ріє Аа Тниг Туг Туг Суз Сп Сп Тур бег Бег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув
ЇО0О408| Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих важких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності 5ЕО ІЮ МеМео: 13, 14, 15 та 16.
І00409| 5ЕО ІЮО Мо: 13: Сім Маї Сіп І еи МаїЇ Сім Зег Сіу СіІу Су Геи Маї Гуз Рго Су Су Зег І еи
Ага Гей Зег Суз Аа Аа бег Сіу Ре Тнг РНе 5ег Авр Аа Тр Меї Ар Тгр Маї Аг СіІп Аа Рго Сіу
Гуз СПУ Геи Си Тр Маї Аа Сі Пе Агу 5ег Гуз Аа 5ег Авп Нів Аа ТАг Туг Туг Аа Сіи Зег Ма! Гув
Сіу Агуд Рпе Тнг Пе Зег Агу Авр Азвр 5ег Гуз Авп Тпг Геи Туг І еи Сп Меї Авп 5ег І єи Гуз ТАг Сі
Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз ТНиг Ага Тгр Агу Агу Рпе РНе Авр Зег Ттр Сіу Сіп Спу ТАг І еи Маї ТНг маї Зег Зег 00410) 5ЕО ІО Мо: 14: Сім Маї Сіп І еи МаїЇ Сім Зег СіІу СіІу СІУу Геи Маї Гуз Рго Су СІу Зегі еи
Ага Гей Зег Суз Аа Аа бег Сіу Ре Тнг РНе 5ег Авр Аа Тр Меї Ар Тгр Маї Аг СіІп Аа Рго Сіу
Гуз СПУ Геи Сім Тгр Маї Спу Сім Пе Аго Зег Сп Аа Зег Авп Ні Аа Тиг Туг Туг Аіа Спи Зег Ма! Гув
Спіу Агу Ре Тнг Пе 5ег Агу Азр Авр 5ег І уз Авп ТНг Гей ТугІ еи Сп Меї Авп 5ег І єи Гуз ТАг Спи
Азр Тиг Аїа Маї Туг Туг Сувз Тнг Аго Тгр Аго Ага Ріе РНе Авр 5ег Тгр Сіу Сіп Спіу Тиг Геи Маї ТнНг маї Зег Зег (00411) 5ЕО ІО Мо: 15: Сім Маї Сіп І єи Маї Сіи Зег Сіу Сіу Спу І єи Ма! Гуз Рго Сіу Спіу 5ег І еи
Ага Гей Зег Суз Аа Аа бег Сіу Ре Тнг РНе 5ег Авр Аа Тр Меї Ар Тгр Маї Аг СіІп Аа Рго Сіу 60 Гуз СІУу І єи СИ Тр Ма! Спу Сім Пе Ага 5ег Ага Аа 5ег Авп Ніз Аа Тнг Туг Туг АІа Сіи 5ег Ма! ГГ ув
Сіу Агуд Рпе Тнг Пе Зег Агу Авр Азвр 5ег Гуз Авп Тпг Геи Туг І еи Сп Меї Авп 5ег І єи Гуз ТАг Сі
Азр Тиг Аїа Маї Туг Туг Сувз Тнг Аго Тгр Аго Ага Ріе РНе Авр 5ег Тгр Сіу Сіп Спіу Тиг Геи Маї ТнНг маї Зег Зег (00412) 5ЕО ІО Мо: 16: Сім Маї Сіп Ї еи МаїЇ Сім Зег Сіу Спу Спу І єи Маї Г ув Рго Спу Спіу Зег І ей
Ага еи 5ег Су Аа Аіа бег СПу Рпе Тнг Рне Зег Азр Аа Тгр Меї Азвр Тгр Маї Аг ап Аїа Рго Спіу
Гуз СПУ Геи Сім Тгр Ма! бег Спи Пе Агу 5ег Гуз Аа 5ег Авзп Нів Аа ТАг Туг Туг Аа Сім Бег Маї Гуз
Сіу Агуд Рпе Тпг Пе Зег Агу Авр Авр 5ег Гуз Авп Тпг Геи Туг Геи Сп Меї Авп з5ег І єи Гув ТАг Сі
Азр Тиг Аїа Маї Туг Туг Сувз Тнг Аго Тгр Аго Ага Ріе РНе Авр 5ег Тгр Сіу Сіп Спіу Тиг Геи Маї ТнНг маї Зег Зег
ЇО0413| Інші необмежені приклади гуманізованих-деімунізованих легких ланцюгів охоплюють, але без обмеження, послідовності ЗЕО ІЮО МоМео: 17, 18, 19, 20, 21, 22, та 23. (00414) 5ЕО ІО Мо: 17: Ар Пе Сп І еи Тпг СіІп Зег Рго Зег 5ег І еи Зег АІа 5ег Ма! СІу Ар Ага
Аа Тит Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Зег Туг Меї Ні Ттр Туг Сп Сіп Гуз Рго Сіу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Тр Аа Туг Аа Тиг 5ег Авп Гей Аа 5ег Су Маї Рго Зег Агу Ріє Зег Сіу Зег Сіу Зег СПУ ТНг
Авр Тут Тпг ГГ еи Тпг Пе Зег Зег Їеи Сп Рго Сіи Авр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сп Сіп Тур бег Зег
Авп Рго Геи ТАг Рпе Сіу Спу Спу Тнг Гуз Маї Си Пе Гуз (00415) 5ЕО ІО Мо: 18: Ар Пе Сп І еи Тпг СіІп Зег Рго Зег 5ег І еи Зег АІа 5ег Ма! СІу Ар Ага
Аа Тит Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Зег Туг Меї Ні Тгр Туг Сп Сп ГГ ув Рго Су Гуз Аа Рго
Гуз Рго Ттр Пе Туг Аа 5ег 5ег Авп І єи Аа 5ег Су Маї Рго 5ег Агу Рпе бег Спу Зег Сіу Зег СПУ ТНг
Авр Туг ТНг І єи ТНг Пе Зег 5ег І ви Сіп Рго Сім Азр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сіп Сип Тер 5ег 5ег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув 00416) ЗЕО ІО Ме: 19: Авр Пе Сп еи ТАг Сп 5ег Рго Бег Зег Геи Бег Аа 5ег Ма! Спу А5р Ага маї Тит Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег 5ег Зег Ма! бег Туг Меї Ніз Ттр Туг Сп Сп Гуз Рго Сіу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Тр Аа Туг Аа ТАг Зег Авп Г еи Аїа 5ег Стпу Маї Рго 5ег Агу Рпе 5ег Спу Зег Спу Зег СПУ ТНг
Авр Туг ТНг І єи ТНг Пе Зег 5ег І ви Сіп Рго Сім Азр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сіп Сип Тер 5ег 5ег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув 00417) ЗЕО ІО Ме: 20: Авр ІПе Сп І єеи ТАг Стп 5ег Рго Зег Зег Геи Бег Аа 5ег Ма! Спу А5р Ага маї Тит Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег 5ег Зег Ма! бег Туг Меї Ніз Ттр Туг Сп Сп Гуз Рго Сіу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Ттр Пе Туг АІа бег Зег Авп Гей Аа Зег Спу Маї Рго Зег Аг Рпе Зег Сіу Зег СІу Зег Спу ТНг
Авр Тут ТПг ГГ еи Тпг Пе Зег Зег Їеи Сип Рго Сім Авр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сп Сп Тгтр Зег Зег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув 00418) 5ЕО ІО Ме: 21: Авр Пе Сіп Меї ТАг Сіп 5ег Рго Зег Зег Геи Бег Аа 5ег Ма! Спу А5р Ага маї Тит Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег 5ег Зег Ма! бег Туг Меї Ніз Ттр Туг Сп Сп І ув Рго Стпу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Ттр Пе Туг АІа бег Зег Авп Гей Аа Зег Спу Маї Рго Зег Аг Рпе Зег Сіу Зег СІу Зег Спу ТНг
Авр Тут ТПг ГГ єеи Тпг Пе Зег Зег Їеи Сп Рго Сім Авр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сіп Сіп Тур бег Зег
Авп Рго ГГ еи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Си Пе Гуз 00419) 5ЕО ІО Ме: 22: Авр Пе Сип Меї ТАиг Сіп 5ег Рго Зег Зег Геи Бег Аа 5ег Ма! Спу А5р Ага
Аа Тит Пе Тнг Суз Ага Аа 5ег 5ег 5ег Ма! Зег Туг Меї Ні Тгр Туг Сп Сп ГГ ув Рго Су Гуз Аа Рго
Гуз Рго Ттр Пе Туг Аа 5ег 5ег Авп І єи Аа 5ег Су Маї Рго Зег Агу Рпе Бег Спу Зег Сіу Зег СПУ ТНг
Авр Тут ТПг ГГ еи Тпг Пе Зег Зег Їеи Сп Рго Сім Авр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сіп Сіп Тур бег Зег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув (00420) 5ЕО ІО Ме: 23: Авр Пе Сіп Меї Тнг Сп 5ег Рго Бег 5ег Геи 5ег Аа 5ег Ма! Спу Авр Ага маї Тит Пе 5ег Суз Агу Аа 5ег 5ег Зег Ма! бег Туг Меї Ніз Ттр Туг Сп Сп Гуз Рго Сіу Гуз Аа Рго
Гуз Рго Тр Аа Туг Аа ТАг Зег Авп Г еи Аїа 5ег Стпу Маї Рго 5ег Агу Рпе 5ег Спу Зег Спу Зег СПУ ТНг
Авр Туг ТПг ГГ еи Тпг Пе Зег Зег Їеи Сп Рго Сім Авр РНе Аа Тниг Туг Туг Сув Сіп Сіп Тур бег Зег
Авп Рго Геи ТАиг Рпе Спу Спу Спу Тнг Гуз Маї Спи Пе Гув (00421) Аспекти описаних тут втілень можуть бути втілені у інших формах або впроваджені іншим шляхом без відступу від їх суті та основних характеристик. Отже, це відкриття треба розглядати у всіх зображених аспектах та без обмеження та всі змінення, які надходять до цього значення та межі еквівалентності, призначені охоплюватися цією заявкою.
Перетк песвідовностей «110 ТРЕЙКОН ФАКМАСУ ТКАНІ, НК. «Те» Компазиції виптятій! тв їх жастосування х18о» ЗАВІТ 14 ВО «Яд «14» «іо» БВ 11 «із ДИ АЬОВ «170» Раїегвй усні 5.5 «Ве» лок «а» штучна поспідовність «иа» ли штучним вестидевность синтетичний пагтзептяд «ад сі ему іеви Зег Сн бег Бгто Ав Пе ев Зег Ага Бег Рго Су і 5 10 15
Си бух Ма Те Маєте Сує Аго Ав ет Зег Зет Уа кнаЕ Тут Ме!
Ні їтв Ту си Си був РО СПУ Веб бер ето ув Бо Ттр Це Тут
АТ мегАзпіви Аве СНУ Уа! то Уві Ато РНе бен Му бат ща щ5 о
Су Бет су ТвР Зо Тут бег ей г Пе бег Аго ма 3 АВ и та 75 ВО
Ако дів Аа ТЕ тує Тут Су СУА МА їтр Ян Заг Ада то г ви ТВ я ВИ 5 не сну Ав Сну Пе гузівв сне уз
Не зо «10 «ей білок «их зутузчна послідовність «жи» Спи утучмої ПОСПіІДОеВнОСТтІ: синтетичний поптептид «а» о
Ага Тв Уа! Аа Ав то Зег уд бле Пе РБе Ето го їег Авр
З ї5 за 15 3 во уз бег у Пт Ав б Мара був во ви Ахп Авп Ве в2
З
Ту Бто Ат СО АВ ух УВІ СНИ то ув УВІ Авр Аза Дів ви ій
ЗВ а 45
Зег У Авт Бег ів Сни бЗет Уві Ті Спо Зп Азо Зегі уз Авр Вег
Те Ту бегівц баг Тв Тег ен Бегкув АВ Аво тує ЕН
Був Мвт ув Уа Тут Аів Су СМИ Уа ТВг Ні ОТ СЛУ Бен Заг бег
Бо уві ТР ув Бег РНе Або Ага СПУ СО був - г Ж я
Не їо5 «10 З «іі 118 «13 штучна послідовність ках иа» Син ЩТучне поольжнасті синтетичевяй полтелтид
Кз З ін Маг фу ев СПО Ми ет СНУ СНУ СПУ дви У а ба СПУ Є ї У 7 7 Я 4
І 5 то їк
Заг МегіК уз ен бег Суз Аа Ав Бе СНУ бе Тег Не баг Акр Ав ке зо
Тв МегАвро Тез У Ага сна Бек то Сб був СЛУ ес си тр мав!
Ар єни Пе дго бег ув Аза Сет Аап ів Аа ТВе Тут Тут Ага у ее Уві уз СНУ Дер ре Тв Не бег Аго Аве Авр Зегіув Зег бег
Ма тує ен ст Ме Аа Заг і ец Ага Ав ЄМи Дер Пк СНУ Пе Тут
Уві Туга с з ї у х
Ту Суб Пт Аг То Аго Аг мо Бе Авр бе ітв Сну СМП СПУ ТЕ чо 105 на
ТВгрец тб У Зег Кт 115 «Б їїе Ко «ей» БЛОК «1» штучна послідовність «еех «май» Слнсо штучної послідовност: синтетичний попе итид «ОД Я
Ага бек Тр був СНУ то Зег Уві Єва бо во АВ то Зеє бегі уз
З 5 та 15
Зег тт бат МУ Му Те Ав дів бе У Сувіво УВЕКув Авр Тут й ЗО
Біне вто з Бо ма Тег ві Бе тт деп бе Сну Ав бе; Твг г зе 0 «5
Су Манів Те вро те Ай УдЕ Кеи суп бег ег СНУ Се Пт Зет івц ет Уві Уві Тіт Уа бто БМ бег бен Гео СНУ ТР СВ
Туг Пе Сує Ав УВІ Авт нів ув го бе Ав п ув Уві Авр ув
В5 що ок
Ку У СНИ тб і уз ЕН Сув Авоіув ТВг Ні Те був Бгто то Сув
НВ 105 110 то Ав то СНО Мен бе єму МУ Рг бе ма! Ве ей Ре то Ето 115 180 125
Ку то і ув Ар Тр Сем Мей Пе бе Ата ТВ то Сми уд тТвг був
15о 135 140
Мама МВ Аз Уві ще ів Со Ар Бгто СО Уві ув Бе Ави Тв 145 150 155 во
Ту УЗ Авр Му Уа СУ Маг мів АБ А ув Тр ув то Аго СИМ сни в Буг Ав сег Те Туг Ат Уді Маг Зен Уві ей Те Уві Ге 180 185 155
Нв Сі Або ТТ бео Ази СПУ був МУ Тугі ув ув у Ма Зег Авт 195 Ов 205 цу Аа бе то Ав го Не сно уз ТР Ме бегікув Ав ув Сну 18 еко
Спбвп Бгто Ага Спи бто Сп Уа тує Тр бец бто Ро бе? Аго дер ЄЮ
Честі ує Або Сп Уві Зог бе Те Сувівн У ув СПУ Не Тут 545 КБ 255
Рго Бег Авр Не Ав а! Сн Тто сно бЗег Ав Спу НА Ро 6 Авл 250 Ко 270
Ап тугі Те Ям Бгто бто Уві без Аво бег Авросну Бог Ввпа ББе
Меи Туг бебі ув бец Те Уві Аво С ує Заг АгО Туз СНО Зв Му Дей жа зав за ча ее це Сув бета Ме Не сно Аів еи Нів Ава Мі Тук Те зов зо зів зо си уз бБег ец Кегіеи бе Рго СПУ Гуз еВ 330 кі 10 «и1йз Вілек «13» штучна посгідовнить «Ва» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «ад 5
Аг АВ БегсегБег Уві бег Тут Ме Нів ! 5 їа «ан в сеї хи ї1к ЇТлЛОК «В13» штучна послідевність «ВЕК
ДЖ» Снтає ШТУЧНОЇ пОосСпудевнесті синтетичний пептид «юе
Аіва Тв бег Ап ви Аз баг
З 5 кві» 7 «11» В «1 ШИН «Їй» штучна послідовність «ай» СОПИЄ ШТУЧНОЇ ге НДдОВнОсті; синтетичний пептид «Не спе ми Тгр ем бег Ап Бгто ї а і 5 «а В «їх 5 «ве» Би «13» штучна послідовність «ех «вих СНО штучної песлндоавноюті синтетичний пептид «ню В
Авр Ав То МеВ Ако і 5
«вті» З «ей БИК «в» штучна послідовне» «и» «иа» Опис штучної послідевчості; синтетичний пептид «ще З
Су бе Аг бегі уз Ав бег Аза Ні Аа Те Ту Та Ар ЄМО Баг
З 5 та 135 че уз Су «10 «вій» штучна послідевність «же» «ке» мис штучної постдовності: синтетичний
ВЕУ
«Ну» 10
Те Ат Аг На КБе Аво Зег «ати» білюк «15» штучна послідовність
«аа» «ТеЗ» сис штучної ПОСПІДОВНОСТІ: СИНТЕТИЧНИЙ полпиаптид кад сим ма сна Цево Узі о Бег ТУ Му СНУ зи Маг ув го Му СПУ ї 5 10 18 їегіви Арі Бег був Ав Ав Зег ЗУ Ре тв на Зег Аво дів
Ка: ай ЗО
ТТ Ме Аво Ттв Уа Ага ій А го ЗУ бу СНУ бе СНИ то Уві а ча 45
СНУ Сни Аа Ага Зег тв Аа бе АБ Мі Ав Те Туг Тут Ав С в Зб ва
Зег ма ув СЧУ Аг Не Твг Пе бе Ага Аво Авр Бе ув Ап ТА ца та 75 що
Гей бує ец сів Ме Аза Зег во був Те Спо Аве Тр Аа Ма Туг ва 5 5
ТУугСув ТВг Ага пр Аг Ат ле Не Аво Зег Тр СУ СМ СНУ ТНг 1 305 1 іец уві тн Уві Бег Бек 135 ка й «иї» 106 «кеш ТОК «й» штучна ЛОсліДОВНІТЬ
АН
«Вей спис штучної поспдовнесті: синтетичний понштзентид «Нюх їй
Авзо Не бів Ме Те Се бе Рг бет Зегі є бег Ада бе Уві СПУ
Авр Аг Ав НЕ Пе Ту Сув Ага Ава ет бег аег уа ег Гук Мей що «5 З
Мі ТТ Гук бій Єна був то СЛУ уз Ав Ро був то Тер Ав Тут а ща ав
Аів Тнг Зег Ал ви Ав Бек Су Уві Рто Заг Ага РМ Бег Му Зег
СНУ бБег у ТБЕ Аве Тут Тег зи ТВ Не Бег Бен ев п Ето С щ5 то т що дер Рне Ав ТНе Ту Тут ув СВ а Тер Зег сн Авиа то Беш тн не а ще
Вне сМу Му Су Мб ув Уві СУ Не бує
100 ще «кеіїМ В «віх Блек «13» штучна ВОСПІДСВНІЄТ» кох «вим» СМЄ ШТУЧНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ: СИНТетТИчНиЙ помпентив «а» 13 сів маснп ви маг сно бег СТУ ОБ СНУ Кец ув ув ЕТО СТУ Су і 5 10 15
Бегівец Ага ви Зег був Аа Ав бе СИУ Ре Те не бог Авр Ав «о 25 ЗО
Туз Ме Аво То Ме Аг 3 дів Ро СПУ уз СНУ Гео СНУ Тр Уві а «0 Я
Аа сни Не мо цегі ма Ав Зак Аза НІВ АВ ТВ Тує Ту АВ СИ
Цег Уві ув СПУ Ага Рне нт Це Кег Аг Аво Аве Зег бух Аа ТНг
Пе 75 ЕЗЕЮ. ій Тубви Сів Меї Ав Бег б еи ув Те Си Ар ТВ Аа Уді Тут
Тебсув Тит Аг тр Аг Ага Не пе Аво Заг тр СТУ ія Сну Тв
ВЕ НА та ізо Уві те ма! бек ог 115 каз 14 «Ві» 16 «ет ЩЛОК «иа» штучна песлідовнить «ОН х
КАМИ
«ее» пис штучної послідовності: синуетичний пеглентид «ню 14 си Уа бі ем Уві Со Бег слу СПУ СПУ ви Уа ув Бгто Му Су і 5 то їв же іеи Ап ву Зегсув Аа Ай ен СНУ не Те РНе бах Азо Ав 2-0 25 ЗО
Ттв Ме Азот Ма! Ат Зір Ав Ре СПУ ув СНУ Бец Сни Ттр Ма
СМУу СМ Пе Аг зег сія Аа ет Ал Нів Ада Те Туг Туг АВ СНИ а УВУ СУ Ат тн ТА; Не Зег Аго Авр дар нн ув Аза ТР цец туге ій Ме Авп Бе во уз ТВ ОО дер Те Аз Уві Туг 85 щО 95
Тег Суб Тег Аг Тр Ач Ага не Не Аво Бег Тр Су Сп СМуУ ТА 100 та5 НЕК;
Кер ві тт уві Берг Зег «10» 15 «вії 18 «ей» Білак «й» штучна послідеаніств как» тис штумНОЇ ПОСПІДОВНОСТЕ СИимуетичний повептид ка» 15
Со маг сно ем Уа і бек ЗУ Му СНУ Бе маг ув то Сну СПУ
Бегі ви Аг кен бег був Аза дів баг СТуУ Ро ТП ве бег Авр Аа 2 еВ Не
Тго Ме Азо То Уві Ата сій Ав Бгто Су суз СУ во и тв Уві «0 45
Су Си Не Аг Зег Ато Аа З Ав Мів Абз Те Ту Туг Ав СИ о 5о що
Зег ме і ув СНУ Аг еле Тнг Не Зег Ага Азо Аво бен і ув Ав ТТН 55 7а Т5 В вч туга п Ме АепЕенгіви ув ТК ОВО Аво ТУ АБ Уві Тут 55 в ЗБ
ТегбСув Пк Ага Тез Ат Ато Рне Ре Авр бе Тер СНУ Й СНУ ТЕ тов 110 іги ув те УВІ Зег Бег 315 «а» В «ії ів оку Кіа кі КО «ее штучна послідовність как» «жа Слисцтучної послідовності; синтетичний поліпептид «Ех ІВ
Сів МВС ев уві Спи Оеє су ЗУ СПУ во Магбуз Кто Сну Ну ї 5 16 15
Зегіви Аг кеу бе Сув Ав Ав бег СМуУ Рйе Ту Ро Кег Азр Аа
25 ЗО
Тео МегАво то ма Аг Зі Ав то СУ ув СНУ Ме ЄМО тра Уві
З Б 45
Зег іш Не Ага щег ук Аіа щег Ав Нів Ага ТАВРО тує Тує Ав СИ
БО 55 во ше Уві уз У Ат ре Три Не бе Ат Азо Ар бегі у Ав цен туге сна Маг Аюп бе і був ТВ СО Аво Пе АВ ОМ Тут во во об
ТУ був ТАМ Но Аг Ага пе ва Ако Зег ТО ЗУ СА СНУ ТР з5а то5 110 іо маг узі Бех Заг «від 17 «ті» Об «ат ОІЛюЮК иа» штучна песльквніст» хведе «ве Опис штучної посльцовності: синтетичний теги плечтТид
НИ
Аво Пе ій б ец ж іп Зет Рго бБег г Ге бег Ав бег Уві Му
З 5 то 15
Авр Ану Ав те Не ТР Сує Ага Ага Бен Бег Бег Уві Бе? Тут Ме
Ні Тв Гуг Іо Сі ув Ето СУ ув Ав то ув Бо ТТ Аа Тут
ЗВ СО 48 дів Те бог Аа ен Аа бек СНУ Ма Рго бет Ага Бр бог Су Вег що що
Су его ТР Аво Тут Тк бе) ТВ Пе бег Зегіви ів то Сі
Аво Бе Айва ПТ Тут Тук був ЗІЗ СА Тр бен Бег Авп то Беш Трг несу СЛУ СМу Тгбуз Уві Сню Пе ув 105 нь «во 18 «вії НІ «жів діпак «1» штучна поспідовність «вах Спиє штучної ПОСЛІДОВНОСТІ: синтетичний у у пектенвтид «а ТВ
Аве Не бій іви Тео Се Кто За бег ви Зег АВ бег уві СПУ
Азов Аг Аз Те Пе Тек ув Аго Ав Зег Бег бег Уві бе Тут Мей
МВ То туби Са ух Бто Бу ув Аа Кто був то То Не Тут
ЗВ о 45 а ин ог Ав ец Ав Зегіу УМ Бгто м Аго Ра жен «Му Бер о не БО су Мессчу ТВг АФ Тує Те ви Твг Не Бег бег бе сна то Сни ща Ме 75 во
Авр не Аа Тк Тут Туг був СН НА Тв чек беє Аа Б С ец пх
Рнесуу Му Сну Туз Уві Сни Пе ув ню 105 «а В кої» 308 «ве» лак кій» штучна поспідавність
«аа «вий» Сули штучної геноВдовності: синтетичний пола лпти «а» ТВ
Аво пе іт Ме Те Єна бе Бгто Бегбегі во бег Ав вн Уа СНУ і 5 та 15
Ар Ага Ма! ТВг Не бог Сух Ага Ада Заг нн бег Ма Вег Тут Мей
Кі: Ко За
Мі то тує Св Ой був бла Сну ув Ага то бух го Гр Аза Тут
ЗО 40 45
Ав Те бег Азов Ав Бек Су Уа го кенг Аг Не аг Оу сн
СУ Бек СПУ Тен Аво тує Те беи Те Не ех Зег бец бів Рг СЮ
Аво Кпе Аа тя Буг ТУг бух СА Си Тто Зег бе Ав то бе Те а ЩО ве
Бе сну Му СУ Тв був Ма Сну Не ув о 105 «в» 20 «11 Об «Жах лок
«13» штучна послідовність «иа» Спо штучної послідовності: синтетичний палінентид «ФО» єО
Авр Не Спо ви Тег Спа м Бгто бет бег і дет Ада Заг Уві Му дар Ат Уа Ти Пе ет ув Ат Ав бег ще мог Ма Зег Тут ММ о «5 Зо ва Те бут см Сл ув бто СМу ув Ада то ув бто ТТ Пе г зв 40 45
Аів ен баг деп ен Аа хм Су Март аг Ага бе бек Сму Бег
СМу мен Сну Те Ар о тує Тв бе Тег Не г Заг баб За Рго Св
Аво не Дів те Тут Туг Суб МА СА Тр бек Бек Аж Ето ви Те
Ва що 95 пе су См СУ ТВ ув Уа СМи Не Був «Ве в 8о ке1і» 105 «яд ЛОЖ кій» штучна послідовність кре «йеак Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «а» У дво Не біо Ме тТне ій Зех Рез Бег Че ер Зет Аїа бег Уві слу ї 5 зо їв
Аво Ага Ма т Не бег був Аго Аів З ет Зег Мі Зег Тут Мей о 25 ЗО
Ме Тер Туг ін іп буг Рго Му був Ада Рг ув Рго Тер Ме Туг
В 430 45
Ав бег Заг Авп ден Ав Щег (ЗЇУ Уві Бгто Заг Ато бло Зет Су Зог
СУ ще єму ПТН Авр Тує Тег бе Тег Пе кн аг во і его Св дер Ме Аа ТНг Тух Тук Сув ЄМ СА тв бе бег Ави Бгто Гей Тег ща що ча не сму СМу СУ ТВг ув ма! сну Не гук 109 108
«1 хе «вій» ЛЮК «й» штучна послідевнить «Ох «Ми» Слис штучної послідовності: синтетичний полпіпентид «а» ни
Авр не Сил Ме тя сп ат Кто ет Баг ви се Ав бе че Му ії 5 та 15
Авр Ат Аа Пе Не Ти ув ато Афа сим бе сни МщЕ нм тує Ме 2 ке КО
Нв т Ту ОВ СНИ бух Є му ув Аа его був то То пе отуг
ЗВ я 45 а бе бе Ап ем дів ен СОУ Мі то м Аг не Си СНУ бе щі 55 БО
СНУ Мет СПУ Те Аво Па Твг би Те Не бе дег і єна БРУС ца то 75 ВО
Аво не А Те Тут Гук Сув ій З Ттр хни бек Аа Кто ем Тв 85 що 5
ВНе СПУ Су СМу Тіх ув УВЕСНО Не уз
105 5 «иа» аа «вії ОВ «ік БІЛОК «ке» штучна послідовність «Ва» «Ва спис ШТУЧНОЇ ПОСТПДШОВНОСТІ: СИНТЄТИЧНИЙ пегпевзтид «НН» УЗ
Ао Не Ма Ме Тв сцв см то ех бегіви бег Ар бе Уві Му
Аз Аг ма ТА Не Баг бух Агу Ав Бет Бог Баг Уві бег Тут Ме! -В 25 Зо
Ма Те ту сни Сп ув го Су ув Ав Бгто і ув Кто тв Ага Туг
ЗВ 40 45
Ав Ту БегАвп во Ав бег Сну Ме го Бег Аг Не Заг СНУ що
Ба що
СУ Зег Му ТК Азр Туг Тг во Те Не ет Зег бец Сів Бго Спи
Аво Мне Аз Те Тує Тут Суб Мп ів Тр за бек Ави Бгто беш Тв во Бе З
Ре сіу пу СЗу Те ує уві Си Не був то 05

Claims (12)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Композиція, що містить від приблизно 25 до приблизно 100 мг/мл антитіла до СО105, від 10 до 20 мМ буферного агента, до приблизно 240 мМ поліолу та рН від приблизно 4,0 до приблизно 5,5; де буферним агентом є ацетат, гістидин або фосфат, де поліол є цукром, і де композиція підтримує стабільність та ефективність антитіла до СЮО105.
2. Композиція за п. 1, в якій буферний агент є гістидином.
3. Композиція за п. 1, в якій буферний агент є ацетатом.
4. Композиція за п. 1, в якій цукор є трегалозою, сорбітом або сахарозою.
5. Композиція за п. 1, яка містить приблизно 25 мг/мл антитіла до СО105.
6. Композиція за п. 1, яка містить приблизно 50 мг/мл антитіла до СО105.
7. Композиція за п. 1, яка містить приблизно 100 мг/мл антитіла до СО105.
8. Заздалегідь заповнений шприц, придатний для внутрішньовенного або інтравітреального введення, що включає композицію за п. 1.
9. Застосування композиції за п. 1 у формуванні лікарського засобу для лікування захворювання, пов'язаного з ангіогенезом.
10. Застосування за п. 9, в якому захворювання, пов'язане з ангіогенезом, є раком або його метастазом.
11. Застосування за п. 9, в якому захворювання, пов'язане з ангіогенезом, є офтальмологічним станом.
12. Застосування за п. 11, у якому офтальмологічним станом є вікова макулярна дегенерація, діабетична ретинопатія або хоріоїдальна неоваскуляризація.
Композиції знтичівй та їх застосування у" х й КУ УжУ ХУ ЖК ЧУ сок Ку х Й х йо Послідовність НЄ У СТВ заявка піхкуееневе х х. поання Де чо Я я -
В. Посицреннисть КС СХ, УТА КОВТКАМИ У ГЕНИ КЕНЕ КАУЕКНКо АЮ неви КиМУ БО 1 МО: і У Заг х У Ух. й Я х УК ї З сне: ; бо іТеслідовність ВСЦ У СО ізянеи візкреслевня ТЕЖ ТО МО їь Пеослізовить ТКС СУ АЕРО ЕВОКОВКО АСУ УВА ІКОНКИ еВ ВН НК З В ВЕН В ЗО В В ВН В НЕ ме М и о З НИК Ко ЗЕ ОБ ЗНИК ЕРКРКОТТЯТЕКІРЕУТСУ УТ УВНЕВСЕУКУМВУ УКУНМАКТКРВКВОУ МИТ ЕН, ТТН МОСК КОКУМИКАТУАІЕКТІсКАКООиВКВОоТХ ТЬМИ СУ КИТ АУБВЕОМООЕММиКТІТВУ ОВО СУчВоГУМКин УКОСУ МА, кину тТОокшьлоОиК ше ТО МО 4
КЕ. ЖЕ ВЕ: КАсИБУВУМИ ШЕ ТОЩО
Кк. У СОКЇ: АТЕНОАВ (ЗЖО Іо ВО: Є)
їх. Фе осв: сю що ТОМ 7)
Н. ча СЕКТ: ОПО ів ТБ ОСНО ЩІ
Її. чи оси 0 БІК ВОчКАТУ УА УКО о Я ВО Я ча Соня: МаБеЕВ іще Її ово: о чи 1 х
Композиції антитій та їх застосування Молель регожлювання знгіотевезу з допожнично СЮТОВ (Кедогліну) ; тулеююух фу 3 хрхуукрє
К. ТОв-В В. ТОБ ТВЕН Ве й х ». Ка Мч Сг НІ НЕ С - Кі З 5, Ж г Ж в Аа АК ік АК І К Н І ї і Ж Ж Ф Є ке ВЕУ Сх ЕК дв з и І скксеосстюя Кк В В В КВ из | ши НА ва рен Кен ПН 4 і х ї їх ї снейнкя їй ТЕЗЕЧЕМНІОННЯ ООН Ме шеечН МАСЕЛ Х СТАМЕСПОКОКІ АНГОГЕНЕЗ
UAA201501709A 2012-09-05 2013-05-09 Композиція антитіла до cd105 та її застосування UA115789C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261697111P 2012-09-05 2012-09-05
PCT/US2013/058265 WO2014039682A1 (en) 2012-09-05 2013-09-05 Antibody formulations and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA115789C2 true UA115789C2 (uk) 2017-12-26

Family

ID=50237600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201501709A UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2013-05-09 Композиція антитіла до cd105 та її застосування

Country Status (19)

Country Link
US (2) US10195281B2 (uk)
EP (1) EP2892559A4 (uk)
JP (3) JP2015532657A (uk)
KR (2) KR20180007014A (uk)
CN (2) CN108785669A (uk)
AU (2) AU2013312536B2 (uk)
BR (1) BR112015004875A2 (uk)
CA (1) CA2883343A1 (uk)
EA (1) EA029214B1 (uk)
GE (1) GEP201706789B (uk)
HK (1) HK1210714A1 (uk)
IL (1) IL237287A0 (uk)
MX (1) MX368996B (uk)
MY (1) MY180157A (uk)
NZ (1) NZ705109A (uk)
PH (1) PH12015500480A1 (uk)
SG (2) SG11201501659SA (uk)
UA (1) UA115789C2 (uk)
WO (1) WO2014039682A1 (uk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2564843T3 (en) 2005-06-01 2019-03-11 Bioelectron Tech Corp Redox-active therapeutics for the treatment of mitochondrial diseases and other conditions as well as modulation of energy biomarkers
US9278085B2 (en) 2006-02-22 2016-03-08 Edison Pharmaceuticals, Inc. Side-chain variants of redox-active therapeutics for treatment of mitochondrial diseases and other conditions and modulation of energy biomarkers
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
WO2016077451A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
WO2017106803A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Bioelectron Technology Corporation Flouroalkyl, flouroalkoxy, phenoxy, heteroaryloxy, alkoxy, and amine 1,4-benzoquinone derivatives for treatment of oxidative stress disorders
CN106928359B (zh) * 2015-12-30 2020-10-13 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb59
CN106928355B (zh) * 2015-12-30 2020-09-29 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb184
CN106478820A (zh) * 2016-10-10 2017-03-08 米度（南京）生物技术有限公司 一种肝癌pet诊断示踪剂及其制备方法与用途
US20200338164A1 (en) * 2017-11-17 2020-10-29 Amgen Inc. Vegfr-fc fusion protein formulations
SG11202006583VA (en) * 2018-02-09 2020-08-28 Genmab As Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies directed against cd3 and cd20 and their uses
KR20210114989A (ko) 2019-02-18 2021-09-24 일라이 릴리 앤드 캄파니 치료 항체 제제
CN112717129A (zh) * 2019-10-14 2021-04-30 百奥泰生物制药股份有限公司 抗vegf抗体制剂
AU2021342342A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
WO2022133169A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US928641A (en) 1908-10-09 1909-07-20 Levi E Edmunds Clasp for pilings.
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5308626A (en) 1985-06-28 1994-05-03 Toni N. Mariani Lymphokine activated effector cells for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) treatment of cancer and other diseases
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9022788D0 (en) 1990-10-19 1990-12-05 Cortecs Ltd Pharmaceutical formulations
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6096289A (en) 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20020136725A1 (en) 1996-01-17 2002-09-26 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
WO1997045450A1 (en) 1996-05-31 1997-12-04 Health Research Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
US6190660B1 (en) 1996-05-31 2001-02-20 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
US5796097A (en) 1997-03-05 1998-08-18 California Lightwave Laboratories, Inc. Chemical sensor and method
ATE230277T1 (de) 1997-06-13 2003-01-15 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
US6610293B1 (en) 1997-06-16 2003-08-26 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
WO2000042012A1 (en) 1999-01-13 2000-07-20 Bayer Corporation φ-CARBOXYARYL SUBSTITUTED DIPHENYL UREAS AS RAF KINASE INHIBITORS
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6635677B2 (en) 1999-08-13 2003-10-21 Case Western Reserve University Methoxyamine combinations in the treatment of cancer
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DE10013850A1 (de) * 2000-03-15 2001-09-20 Schering Ag Gasgefüllte Mikrokapseln enthaltend funktionalisiertes Polyalkylcyanacrylat, sowie Verfahren zu deren Herstellung
JP4340062B2 (ja) 2000-10-12 2009-10-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 粘度の減少した濃縮タンパク質製剤
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
MXPA03007316A (es) 2001-02-19 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Metodo para la identificacion de epitopes de celulas t y el uso para la preparacion de moleculas con inmunogenicidad reducida.
WO2002072824A2 (en) 2001-02-20 2002-09-19 Bayer Aktiengesellschaft Human transient receptor potential channel protein.
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
EP1610751A4 (en) 2001-04-26 2006-05-24 Univ Texas AGENTE / LIGAND CONJUGATED THERAPEUTIC COMPOSITIONS, METHODS OF SYNTHESIS AND USE THEREOF
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
EP1432447A2 (en) 2001-09-27 2004-06-30 The Board Of Regents, The University Of Texas System Combined compositions and methods for tumor vasculature coagulation and treatment
US7115716B2 (en) 2001-11-19 2006-10-03 Eli Lilly And Company Tumor specific monoclonal antibodies
WO2003068259A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing solution pharmaceuticals
EP2314316A1 (en) 2002-04-05 2011-04-27 Amgen, Inc Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US20040033228A1 (en) * 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US7754884B2 (en) 2005-01-03 2010-07-13 Vanderbilt University Targeted, NIR imaging agents for therapy efficacy monitoring, deep tissue disease demarcation and deep tissue imaging
US7217798B2 (en) 2003-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of Fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis
US7097836B1 (en) 2002-10-23 2006-08-29 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
US7691374B2 (en) 2002-10-23 2010-04-06 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
US7120987B2 (en) 2003-08-05 2006-10-17 Avery Dennison Corporation Method of making RFID device
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
KR20070114324A (ko) 2005-03-25 2007-11-30 글리카트 바이오테크놀로지 아게 Ｍｃｓｐ 에 향하며 증가된 ｆｃ 수용체 결합 친화도 및효과기 작용을 갖는 항원 결합 분자
DK1861116T3 (en) 2005-03-25 2015-11-09 Regeneron Pharma VEGF antagonist formulations
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US20070065437A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Greg Elson Anti-CD3 antibody formulations
WO2007041641A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 University Of Tennessee Research Foundation Methods of reducing the production of reactive oxygen species and methods of screening or identifying compounds and compositions that reduce the production of reactive oxygen species
US8142781B2 (en) 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
SI2364691T1 (sl) 2006-06-16 2013-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Formulacije antagonista VEGF, primerne za intravitrealno dajanje
US20100129379A1 (en) * 2006-09-25 2010-05-27 John Carpenter Stabilized antibody formulations and uses thereof
CA2663243A1 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Merck Serono S.A. Junctional adhesion molecule-c (jam-c) binding compounds and methods of their use
WO2008045373A2 (en) * 2006-10-06 2008-04-17 Amgen Inc. Stable antibody formulations
AU2007309616B2 (en) * 2006-10-20 2011-10-06 Amgen Inc. Stable polypeptide formulations
ZA200904860B (en) 2007-02-01 2010-09-29 Genentech Inc Combination therapy with angiogenesis inhibitors
CN101970472B (zh) 2007-06-06 2013-10-30 研究发展基金会 Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途
MX2010001723A (es) * 2007-08-17 2010-04-30 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos y moleculas de fusion-fc usando policationes.
WO2009033581A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Substituted tricyclic compounds and methods of use thereof
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
CN101970670B (zh) 2008-01-14 2013-08-21 健泰科生物技术公司 使用egfl8拮抗剂抑制血管发生的方法
MY149058A (en) 2008-08-29 2013-07-15 Bayer Ip Gmbh N-(2-aminophenyl)-4-[n-(pyridine-3-yl)-methoxycarbonyl-aminomethyl]-benzamide (ms-275) polymorph b
CA2737667A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Targeted binding agents directed to cd105 and uses thereof
US8699361B2 (en) 2008-09-30 2014-04-15 Qualcomm Incorporated Out-of-synchronization handling method and apparatus
US20100082438A1 (en) * 2008-10-01 2010-04-01 Ronnie Jack Garmon Methods and systems for customer performance scoring
EP2196476A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
RU2011140498A (ru) 2009-03-06 2013-04-20 Дженентек, Инк. Препарат антител
EP2467156B1 (en) 2009-08-17 2017-11-01 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
US20180057602A1 (en) 2009-08-17 2018-03-01 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
CA2803998A1 (en) * 2010-07-02 2012-01-05 Medimmune, Llc Antibody formulations
US9932386B2 (en) 2011-04-20 2018-04-03 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin polypeptides and uses thereof
EP2739645B1 (en) 2011-08-01 2018-12-19 Tufts Medical Center, Inc. Endoglin-specific antibody for use in a method of treating heart failure and related conditions
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
CA2962277C (en) 2013-09-20 2021-12-07 Tufts Medical Center, Inc. Methods and compositions for reducing cardiac damage and other conditions
WO2016077451A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201705070PA (en) 2017-07-28
US20180311359A1 (en) 2018-11-01
AU2013312536A1 (en) 2015-03-05
US10195281B2 (en) 2019-02-05
JP6445671B2 (ja) 2018-12-26
JP2018076350A (ja) 2018-05-17
GEP201706789B (en) 2017-12-11
MX2015002840A (es) 2015-08-12
NZ705109A (en) 2018-04-27
EP2892559A4 (en) 2016-05-11
AU2013312536B2 (en) 2018-04-19
MX368996B (es) 2019-10-23
EA201590412A1 (ru) 2015-08-31
JP6602446B2 (ja) 2019-11-06
CN104684580A (zh) 2015-06-03
AU2018204044A1 (en) 2018-06-28
US20150209430A1 (en) 2015-07-30
CN108785669A (zh) 2018-11-13
WO2014039682A1 (en) 2014-03-13
CA2883343A1 (en) 2014-03-13
KR101820582B1 (ko) 2018-01-22
KR20180007014A (ko) 2018-01-19
BR112015004875A2 (pt) 2017-11-21
JP2015532657A (ja) 2015-11-12
JP2019059753A (ja) 2019-04-18
EP2892559A1 (en) 2015-07-15
KR20150048877A (ko) 2015-05-07
EA029214B1 (ru) 2018-02-28
MY180157A (en) 2020-11-23
PH12015500480B1 (en) 2015-04-27
IL237287A0 (en) 2015-04-30
SG11201501659SA (en) 2015-04-29
PH12015500480A1 (en) 2015-04-27
HK1210714A1 (en) 2016-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA115789C2 (uk) Композиція антитіла до cd105 та її застосування
JP6000427B2 (ja) 抗エンドグリン抗体及び抗ｖｅｇｆ剤を用いる癌の併用療法
JP5960203B2 (ja) エンドグリン抗体
US20180057602A1 (en) Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
JP7460608B2 (ja) 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法