CN101970472B

CN101970472B - Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途

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Publication number: CN101970472B
Application number: CN2008801004835A
Authority: CN
Inventors: J·蒂莫西·斯托特; 特雷弗·麦可法兰德; 本诺伊·阿普库坦
Original assignee: RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Current assignee: RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION; Research Development Foundation
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2028-06-06
Also published as: AU2008261969A1; EP2170938B1; CA2689913A1; JP2013215210A; WO2008154351A9; IL202338A0; CN101970472A; DK2170938T3; ATE553771T1; IL202338A; JP5410416B2; US20140322205A1; EP2170938A1; CA2689913C; US20090117119A1; US9937269B2; US20170081377A1; AU2008261969B2; WO2008154351A1; JP2010528663A

Abstract

描述了转录增强因子1相关(RTEF-1)的显性失活(DN)变体。DN RTEF-1多肽可以直接靶向至细胞或者在核酸表达载体中递送，以改变细胞转录。描述了用于抑制VEGF产生并由此治疗血管生成性病症，诸如癌症的方法。例如，在某些方面中，DN RTEF-1可用于治疗眼睛的血管生成性病症，诸如年龄相关的黄斑变性(AMD)。

Description

RTEF-1变体及其用于抑制血管发生的用途

本申请要求于2007年6月6日提出的美国申请号60/942,249的优先权，其全部公开通过参考全部地明确并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域并且特别是涉及血管形成中所涉及的过程(血管发生)。

背景技术

转录增强因子1相关(RTEF-1)基因是TEA DNA结合结构域基因家族成员。TEA DNA结合结构域基因家族从构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、酵母、果蝇属(Drosophila)、小鼠至人高度保守。TEA DNA结合家族蛋白质可参与不同基因的活化或阻抑，并且它们的这些特定功能可以通过与其他蛋白质的结合而改变(Kaneko和DePamphilis，1998)。已经在多种哺乳动物组织，包括心脏、骨骼肌、胰、胎盘、脑和肺中鉴定出这些基因特定成员的表达(Stewart等，1996；Yasunami等，1996；Farrance等，1996)。对于转录增强因子-1(TEF-1)，已经在一种组织如胰中鉴定出源于一个基因的选择性剪接的同种型(Zuzarte等，2000；Jiang等，2000)。这些基因在哺乳动物眼中的表达谱尚未见报道。

RTEF-1基因转录物从鸡组织中首次鉴定出来，并且证明在心肌和骨骼肌中富集(Farrance等，1996)。鸡RTEF-1结合肌细胞特异性CAT(M-CAT)顺式DNA元件并且调节肌肉特异性基因的表达，并且对于完全的转录活化需要肌肉特异性辅因子。随机筛选2166个人结肠直肠癌cDNA文库鉴定出部分cDNA RTEF-1序列，这导致从心cDNA文库分离出禽RTEF-1的全长人同系物(Stewart等，1996；Frigerio等，1995)。对人组织的Northern印迹分析表明在骨骼肌和胰中表达水平最高，在心、肾和胎盘中表达水平较低，而在肝、肺或脑中未检测到信使(Stewart等，1996)。对小鼠RTEF-1同系物的Northern印迹分析显示了与人不同的组织表达方式。成年小鼠肺组织表达水平最高，在肾、心和骨骼肌中水平极低，在肝、胸腺、脾和脑中未检测到，而RTEF-1信使在小鼠胚胎骨骼肌中丰富(Yockey等，1996)。已经在小鼠骨骼肌细胞中鉴定出RTEF-1的小鼠选择性剪接同种型，与全长基因相比，该同种型缺乏外显子5(Yockey等，1996)。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种促血管生成因子，已知在视网膜组织中，低氧条件将其上调(Young等，1997；Pierce等，1996；Donahue等，1996；Pe′er等，1995)。最近，已经鉴定出全长RTEF-1蛋白质不但结合VEGF启动子，而且还上调VEGF表达，例如在低氧条件下的牛主动脉内皮细胞中(BAEC)(Shie等，2004)。微列阵分析显示，低氧条件下的BAEC中RTEF-1表达上调3倍。令人惊讶地，RTEF-1通过与VEGF启动子内的Sp1元件，而非M-CAT模体相互作用介导VEGF基因活化。而且，RTEF介导的VEGF表达的实现不依赖于低氧诱导因子(HIF-1)和低氧应答元件(HRE)途径的活化(Shie等，2004)。

VEGF过表达已经牵涉许多种血管生成性病症，如肿瘤血管发生和异常新血管形成。例如，已经非常确定，VEGF在早产儿视网膜病变(ROP)和其他眼睛新血管形成疾病的发展和严重性中起着重要的作用(Lashkari等，2000；Miller，1997；Vannay等，2005；Young等，1997)。考虑到VEGF在此类病症中的突出作用，已经开发出用于抑制VEGF活性的许多治疗策略。然而，当前的VEGF阻断治疗典型地引起抑制细胞外VEGF与相应细胞表面受体的相互作用。因此，需要用于VEGF阻断的可替代的策略，例如用于抑制VEGF产生的方法。

发明内容

在第一个实施方案中，本发明提供分离的显性失活(DN)的RTEF-1多肽，包含具有一个或一个以上内部缺失的RTEF-1氨基酸序列。如本文所使用的术语显性失活意思是指RTEF-1变体抑制或降低如SEQ ID NO：1所例举的完整RTEF-1多肽的活性。例如，在某些方面中，DN RTEF-1变体可以定义为当在细胞表达时抑制或者降低VEGF启动子活性的多肽。此外，在一些情况下，DN RTEF-1可以定义为降低或抑制低氧诱导的或RTEF-1(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)诱导的VEGF启动子活性的多肽。在某些方面中，RTEF-1氨基酸序列可以是哺乳动物RTEF-1氨基酸序列，优选人RTEF-1氨基酸序列。

因此，在某些方面中提供包含一个或一个以上内部氨基酸缺失的DNRTEF-1多肽。例如，在某些情况下DN RTEF-1可以包含由外显子3、4、5、6、7、8、9或10编码的氨基酸的缺失。例如，在某些特定实施方案中，DN RTEF-1可以包含由外显子4、5、6、7、8和/或9编码的全部氨基酸序列的缺失。此外，在某些特定情况下，DN RTEF-1可以包含来自外显子3和/或外显子10的氨基酸的部分缺失，例如由外显子3编码的大约最后5个氨基酸的缺失或者由外显子10编码的大约最初11个氨基酸的缺失。此外，本领域技术人员将会理解，与野生型RTEF-1序列，诸如人RTEF-1序列相比，DN RTEF-1可以包含氨基酸替代。因此，在某些情况下，DN RTEF-1可以定义为包含一个或一个以上内部氨基酸缺失的RTEF-1多肽，其中DN RTEF-1与野生型RTEF-1序列(例如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)在非缺失氨基酸区域范围内有大约或者至少大约70、75、80、85、90、95、98或99％相同。在一些非常特别的方面中，RTEF-1显性失活多肽可以包含与SEQ ID NO：3(由651bp cDNA编码的氨基酸序列)有大约或者至少大约70、75、80、85、90、95、98或99％相同的RTEF-1氨基酸序列。在一些非常特别的方面中，DN RTEF-1多肽可以包含由SEQ ID NO：3给出的序列。本发明考虑的DN RTEF-1多肽的更多实施方案在具体实施方式中提供。

在一些进一步的方面中，DN RTEF-1多肽可以包含细胞内化部分。在一些情况下，细胞内化部分可以结合或缀合至DN RTEF-1多肽。例如，DN RTEF-1可以与脂质体囊泡的复合体提供，由此使多肽穿过细胞膜成为可能。此外，在一些特定实施方案中，细胞内化部分可以是肽、多肽、适体或高亲合性多聚体(avimer)(见例如美国申请号20060234299和20060223114)序列。例如，细胞内化部分可以包含来自HIV tat、HSV-1间层蛋白VP22或果蝇属触角蛋白(antennopedia)的氨基酸。在某些近一步的方面中，细胞内化部分可以是工程化的内化部分，诸如由Wright等(2003)和Rothbard等(2000)等描述的聚精氨酸、聚甲硫氨酸和聚甘氨酸肽。例如，细胞内化部分可以是此处例举的RMRRMRRMRR(SEQ ID NO：23)。因此，在一些情况下，多肽细胞内化部分和DN RTEF-1多肽可以包含融合蛋白。

因此，在某些情况下，提供包含细胞内化部分和DN RTEF-1序列的DNRTEF-1融合蛋白。技术人员会理解，此类融合蛋白可额外包含将细胞内化部分与DN RTEF-1多肽序列分开的一个或一个以上氨基酸序列。例如，在一些情况下，连接体序列可分开这样的两个结构域。例如，连接体序列可以包含带有大量或者大程度构象自由的“挠性”氨基酸，诸如多聚甘氨酸连接体。在一些情况下，连接体序列可以包含蛋白酶切割位点。例如，在某些方面中，连接体序列可以包含被细胞内蛋白酶识别和切割的切割位点，因此一旦融合蛋白被内化，则将DN RTEF-1序列从内化序列释放出来。

在本发明的进一步的方面中，细胞内化部分可以进一步定义为细胞靶向部分，其是仅仅被所选择细胞群体，诸如表达特定细胞受体的细胞结合或内化的部分。此类细胞靶向可以包括例如结合细胞表面蛋白的抗体、生长因子、激素、细胞因子、适体或高亲合性多聚体。如本文所使用的术语抗体可以指IgA、IgM、IgE、IgG、Fab、F(ab’)2、单链抗体或者互补位肽。在某些情况下，本发明的细胞靶向部分可以靶向特定类型的细胞，诸如视网膜细胞、内皮细胞、虹膜细胞或神经元细胞。在仍然进一步的方面中，本发明的细胞靶向部分可以定义为癌细胞结合部分。例如，在一些非常特别的情况下，本发明的细胞靶向部分可靶向癌细胞相关抗原，如gp240或Her-2/neu。

在本发明的仍然进一步的方面中，DN RTEF-1多肽可以包含额外的氨基酸序列，诸如细胞运输信号(例如细胞分泌信号、核定位信号或者细胞核输出信号)或者报告分子多肽，诸如酶或荧光蛋白。在优选的方面中，例如，DN RTEF-1多肽包含细胞分泌信号。例如，如本文所例举，DN RTEF-1多肽可以包含来自人基因的分泌序列，诸如IL-2分泌信号序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS，SEQ ID NO：22)。因此，在某些情况下，DN RTEF-1多肽可以包含细胞内化部分和细胞分泌信号，由此允许多肽被一种细胞分泌并被内化进入周围的细胞内。

在本发明的进一步的实施方案中，提供包含编码如上所述DN RTEF-1多肽序列的分离的核酸序列。因此，编码本文所述任何DN RTEF-1多肽或多肽融合蛋白的核酸序列也作为本发明的部分包括在内。技术人员会理解，鉴于遗传密码子的简并性，许多种核酸序列可用于编码相同的多肽。在某些情况下，例如编码任何特定氨基酸的密码子可以被改变以改善细胞表达或者降低核酸在基因组RTEF-1位点重组的机会。

在优选的方面中，编码DN RTEF-1多肽的核酸序列包含在表达盒内。如本文所使用的术语“表达盒”意思是指使得DN RTEF-1在细胞、或更特别地在真核细胞内表达的所包含的额外核酸序列。此类额外的序列可以包含例如启动子、增强子、内含子序列(例如在DN RTEF-1编码区之前、之后或者之内)或者多腺苷化信号序列。技术人员会认识到，表达盒中包含的序列可以用于改变DNRTEF-1的表达特性。例如，细胞类型特异性、条件性或可诱导启动子序列可用于将DN RTEF-1限制在所选择的细胞类型或生长条件下。例如，在某些情况下，低氧可诱导启动子可用于本发明的RTEF-1表达盒中。此外，在一些情况下，在眼的癌细胞或细胞中具有增强活性的启动子可以使用。此外，考虑了可对RTEF-1多肽序列做某些改变以便增强表达盒，例如如本文所例举的表达盒的表达，DNRTEF-1的起始密码子可以改变成ATG以促进高效翻译。

在本发明的仍然进一步的方面中，DN RTEF-1编码序列可以包含在表达载体中，诸如病毒表达载体。用于根据本发明使用的病毒表达载体包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、SV-40、反转录病毒和痘苗病毒载体系统。在某些优选的方面中，反转录病毒载体可以进一步定义为慢病毒载体。在一些情况下，此类慢病毒载体可以是自失活(SIN)慢病毒载体，诸如美国申请号20030008374和20030082789中描述的那些，美国申请号20030008374和20030082789并入本文作为参考。

在仍然进一步的实施方案中，本发明涉及用于降低或抑制RTEF-1依赖性转录活性的方法。如本文所使用的术语RTEF-1依赖性转录活性指，被如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所例举的全长或者完全活性RTEF-1多肽的表达所介导或增强的转录。因此，在一些方面，本发明提供用于抑制或降低VEGF启动子活性(并且由此抑制或降低VEGF表达)的方法，包括在细胞中表达DN RTEF-1多肽。因此，在特定实施方案中，提供用于治疗患有血管生成性病症的患者的方法，包括向患者施用有效量的治疗组合物，所述治疗组合物包含如上所述的RTEF-1显性失活多肽或者编码RTEF-1显性失活多肽的核酸表达载体。在优选的方面中，本文所描述的方法可用于治疗人患者。

如本文所使用的术语血管生成性病症指涉及不良血管形成的病症，诸如眼新血管形成、动静脉畸形、冠状动脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球肾炎、风湿性关节炎或癌症(例如肿瘤血管形成)。因此，在某些情况下，本发明方法可以用于治疗眼病，诸如黄斑变性(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早产儿视网膜病变(ROP)和糖尿病视网膜病变。例如，本发明方法可以用于治疗湿性或干性AMD。因此，在某些情况下，本发明方法可用于治疗多种AMD相关的眼病变，诸如典型为主性、微小典型性和隐匿无典型性损害(Gragoudas等，2004)。

技术人员会理解，额外的抗血管生成治疗可以与本发明方法组合或结合使用。此种额外的治疗可以在本文所述方法之前、之后或者基本上同时施用。例如，额外的抗血管生成治疗可以拮抗VEGF和/或FGF信号途径。因此，在一些情况下，额外的治疗可以包括施用结合VEGF、VEGF受体、FGF或FGF受体的抗体。在某些特定方面中，本发明的方法和组合物可以与

(贝伐单抗)、

(兰尼单抗)、

(哌加他尼钠)或抗炎药结合使用。因此，在某些特定情况下，提供包含在可药用载体中的DN-RTEF-1成分和贝伐单抗或哌加他尼钠的治疗组合物。在仍然进一步的方面中，调节血管发生的基因可以与本发明方法结合递送。例如，在一些方面中，调节血管发生的基因可以是金属蛋白酶组织抑制剂、内皮抑制素、血管抑制素、内皮抑制素XVIII、内皮抑制素XV、kringle 1-5、PEX、基质金属蛋白酶-2的C末端血管素结合蛋白结构域、人纤维蛋白溶酶原的kringle 5结构域、内皮抑制素和血管抑制素的融合蛋白、内皮抑制素和人纤维蛋白溶酶原kringle 5结构域的融合蛋白、干扰素γ诱导的单核因子(Mig)、干扰素α可诱导蛋白10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(鳍样酪氨酸激酶1受体)、和激酶插入结构域受体(KDR)基因。在某些特定方面中，此类血管生成调节物基因可以可以在病毒载体，诸如美国专利7,122,181中所述的慢病毒载体中递送，美国专利7,122,181通过参考并入本文。

如上所述，在某些方面中，本发明提供用于治疗癌症的方法。因此，在某些情况下，所述方法可以用于限制或者减少向肿瘤的血液流动，由此降低肿瘤生长或转移。在某些情况下，本文的方法可以用于抑制或治疗转移癌。许多种癌症类型可以用本发明方法治疗，例如治疗的癌症可以是膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、眼癌、肠胃道癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。此外，额外的抗癌治疗可以与本发明方法组合或结合使用。此类额外治疗可以在本发明方法之前、之后或同时施用。例如，额外的抗癌治疗可以是化学疗法、手术疗法、免疫疗法或放射疗法。

考虑了本发明的DN RTEF-1组合物可以向患者局部性或者全身性施用。例如，本发明的方法可以包括局部、静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、球囊内(intravesicularly)、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、经吸入、经注射、经灌注、经连续灌注、经直接浸浴靶细胞的局部灌注、经导管或经灌洗施用DN RTEF-1组合物。如上所述，在DNRTEF-1组合物向眼睛递送的一些情况下，施用可以是例如经局部、结膜下、眼周、眼球后、筋膜囊、前房内、玻璃体内、眼内、视网膜下、后近巩膜或脉络膜上施用。在某些方面中，DN RTEF-1组合物可以通过眼内注射、局部施用而向眼睛局部性施用(例如以滴眼剂制剂)。

在一些进一步的实施方案中提供包含在瓶中的本发明的药物组合物，所述瓶包含能够使组合物点滴施用的出射口。在一些情况下，瓶中所包含的药物组合物包含多剂量，然而在某些方面中，瓶包含用于向一只或两只眼睛施用的单一剂量单位，优选地在1-2滴制剂中包含单一剂量单位。如本文所使用的术语“瓶”指任何流体容器，诸如安瓿、滴管或注射器。

在本发明方法和/或组合物背景下所讨论的实施方案可以用于本文所述的任何其他方法或组合物。因此，关于一种方法或组合物的实施方案同样可以应用于本发明的其他方法和组合物中。

如本说明书所使用，“一”可以指一个或一个以上。如权利要求书中所使用，词“一”与词“包含”结合使用时意思是指一个或一个以上。

权利要求书中“或”的使用用于指“和/或”，除非明确指出是仅指替代物或者替代物相互排斥，虽然本公开支持指仅仅替代物和“和/或”的定义。如本文所使用“另一”可以指至少第二个或者更多。

在本申请通篇中，术语“大约”用于指数值包括设备、被采用来测定数值的方法或者研究受试者当中所存在变化的固有误差变动。

不分明的其他目标、特征和优势根据下列详细描述会变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和指示本发明优选实施方案时的特定实例仅以例举的方式给出，因为根据该详细描述，处于本发明精神和范围之内的各种改变和修改对本领域技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图是本说明书的一部分，并且内含着进一步说明本发明的某些方面。通过参考附图并结合着本文所提出的特定实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。

图1A-B：RTEF-1mRNA剪接在低氧时被改变。视网膜和虹膜内皮细胞置于低氧条件下并且通过RT-PCR分析RTEF-1剪接。图1A，通过RT-PCR鉴定的RTEF-1剪接变体的示意图。显示了每一剪接变体的非翻译区(斜影线)和氨基酸编码区(空柱)的外显子序列。也图示了推定的RTEF-1功能结构域，方格框指示TEA DNA结合结构域(星号显示预测的α-螺旋的位置)，实心框指示核定位信号(外显子4)，垂直影线指示活化结构域(脯氨酸丰富结构域(PRD))并且水平影线指示外显子9和10内的两个STY结构域。图1B，琼脂糖凝胶电泳的再现，显示从人视网膜血管内皮细胞(RVEC)原代培养制备的RTEF-1特异性RT-PCR产物。泳道1和4：DNA梯带；泳道2：从正常含氧量条件下的RVEC制备的cDNA，得到2个产物(1305和936bp大小)；泳道3：从低氧条件下的RVEC制备的cDNA，得到3个产物(1305、936和447bp大小)。

图2：RTEF-1变体活化或抑制VEGF启动子。293T细胞以VEGF启动子报告分子构建体(VEGF启动子驱动分泌的碱性磷酸酶)连同包含所标明RTEF-1变体的表达载体转染。结果显示，以pSEAP-VEGF启动子加上包含1305bp(柱1)、936bp(柱2)、651bp(柱3)、ss-651-RMR bp(柱6)或447bp(柱4)RTEF-1变体的pcDNA表达构建体转染6小时后的培养基AP活性。柱5显示与无插入片段的pcDNA对照质粒共转染的对照VEGF启动子活性。

图3：RTEF-1对VEGF启动子活性的调节依赖于包含4个SP1结合位点的VEGF启动子部分。如上所述，细胞以包含1305bp(柱1)、936bp(柱2)、651bp(柱3)、ss-651bp(柱6)或447bp(柱4)RTEF-1变体的pcDNA表达构建体和包含完整VEGF启动子(实柱)或带有从-113位核苷酸至-57位核苷酸缺失的VEGF启动子(空柱)的报告载体转染。柱5显示与无插入片段的pcDNA对照质粒共转染的对照VEGF启动子活性。

图4：651bp RTEF-1以显性失活起作用。如上所述，细胞以pSEAP-VEGF和单独的(柱1、3和5)或者外加ss-651-RMR bp RTEF-1变体(柱2、4和6)的1305bp(柱1、2)、936bp(柱3、4)或447bp(柱5、6)RTEF-1变体转染。

图5A-C：RTEF-1多肽的检测。针对RTEF-1独特的、但每一天然存在变体共有的氨基酸序列产生抗体。图5A是RTEF-1的一个区域与相关转录因子之间的氨基酸比对。用于产生抗体的氨基酸序列加下划线。图5B，使用抗RTEF-1抗体的免疫印迹的再现。用于分析的细胞裂解物来自转染有pcDNA空载体(泳道2和8)或1305bp(泳道3、9)、936bp(泳道4、10)、651bp(泳道5、11)或447bp(泳道6、11)RTEF-1变体的pcDNA表达载体的细胞。对每一RTEF-1变体的检测通过椭圆形标明。泳道1和7为分子量标准。泳道1-6代表来自泳道7-12的过曝光图像。图5C，使用抗RTEF-1抗体从转染有pcDNA 651bp RTEF-1表达载体的细胞中检测RTEF-1变体的免疫印迹的再现。预期的～24KDa多肽通过箭头标明。

图6A-B：RTEF-1变体在眼睛中表达。图6A，免疫印迹的再现，显示正常灵长类眼组织中的RTEF-1表达。免疫印迹分析在来自视网膜(泳道1)、脉络膜(泳道2)和虹膜(泳道3)组织裂解物的蛋白质上开展。M指示分子量标准。图6B，溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的再现，用于显示使用RTEF-1特异性引物产生的半定量RT-PCR产物。泳道1显示来自CRAO视网膜的结果而泳道2显示来自对照视网膜RNA的结果。

图7A-D：RTEF-1在灵长类眼组织中表达的免疫组织化学分析。图7A-B，RTEF-1强染色定位于虹膜(I)、睫状体(CB)、视神经(ON)和视网膜(R)。角膜(C)和晶状体(L)为RTEF-1抗体杂交阴性。图7C-D，最强的RTEF-1染色出现在神经节细胞层(GCL)和内核层(INL)。染色定位在细胞质和细胞核中。在外层缺乏染色。

具体实施方式

最近，已经开发出许多种抑制血管生成信号的策略，用于治疗癌症和血管生成性病症诸如AMD目的的。具体而言，许多种策略集中于通过抑制VEGF与一种或两种其表面受体的结合而阻断VEGF信号。然而，这些策略不能够解决启动异常血管发生的VEGF最初产生。因此，抑制VEGF产生的新方法和组合物可以提供用于VEGF阻断的新方法和对所产生的血管发生的治疗。为此目的，在某些方面中，本发明提供在VEGF活化中所必需的显性失活转录因子。此外，由于本发明涉及靶向细胞内过程，因此本发明的治疗可以靶向特定细胞类型，由此减少不良的全身性副作用。因此，本发明提供治疗血管生成性病症的新方法和/或增强当前VEGF阻断策略有效性的途径。

RTEF-1是多功能转录因子家族的成员，并且已经证明是VEGF转录、包括低氧诱导的VEGF转录的激活剂。然而，如本文所显示，细胞中产生多种RTEF-1剪接变体并且从选择性RNA剪接变体产生的RTEF-1多肽包含改变的转录功能(图1A，B)。具体而言，一种大约651碱基对的RTEF-1转录物产生抑制VEGF启动子活性的多肽(图2，比较柱3和5)。此外，已经证明，当该RTEF-1变体以与分泌信号和细胞内化多肽的融合蛋白提供时，它是VEGF启动子的甚至更有效的抑制剂(图2，柱6)。重要的是，如图4中所示，来自651bp RTEF-1转录物的多肽以显性失活方式作用。这就是说，多肽不但降低VEGF启动子活性，而且还阻断其他RTEF-1蛋白质同种型对VEGF启动子的增强作用。此外，如图6和7中所示，RTEF表达于眼组织中，由此暗示其在眼新血管形成病症发展中起重要作用。本文研究表明，RTEF-1对VEGF产生的活化可能是促成新血管形成病症发展的因素之一。因此，本发明的方法和组合物可以提供用于预防早期阶段新血管形成的手段。

本发明提供新DN RTEF-1多肽及其预防或抑制血管生成性病症的用途。DNRTEF-1多肽可以直接递送至细胞内环境中或者在所靶向细胞内表达以阻断VEGF产生。此类显性失活多肽不但下调新生VEGF的产生，而且还下调在诸如低氧过程中常常被RTEF-1刺激的VEGF的产生。因此，本发明的组合物可以用于降低所靶向细胞和组织募集新血管形成的能力。这对于例如血管侵入与疾病发病机制直接相关的眼新血管形成病症，诸如AMD具有重要意义。此外，DN RTEF-1可以用于通过降低肿瘤或肿瘤转移灶经新血管形成获得营养物质的能力来治疗肿瘤或肿瘤转移灶。因此，还提供减慢肿瘤生长和/或引起肿瘤消退的方法。此外，由于本发明的组合物靶向细胞内转录物，因此本发明的组合物可以用于通过使用特异性细胞靶向/内化部分来靶向受累组织，由此降低在其他非靶向组织中的副作用。

I.显性失活RTEF-1多肽

许多RTEF-1变体在本文描述并表征了其功能。例如，本文特别研究的四个序列包含下列氨基酸序列。

由1305bp RTEF-1人cDNA编码的SEQ ID NO：1是具有下列序列的434个氨基酸的蛋白质：

LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKDQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHSSMRLARGPGRPAVSGFWQGALPGQAETSHDVKPFSQQTYAQPPLPLPGFESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRRRGSSKLWMLEFSAFLEQQQDPDTYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWADLNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVVEKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE

由936bp人cDNA编码的SEQ ID NO：2是具有下列序列的311个氨基酸的蛋白质：

LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWADLNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVVEKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE

由651bp人cDNA编码的SEQ ID NO：3是具有下列序列的216个氨基酸的蛋白质：

LEGTAGTTTSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVVEKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE

由447bp人cDNA编码的SEQ ID NO：4是具有下列序列的148个氨基酸的蛋白质：

LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKFWQGALPGQAETSHDVKPFSQHHIYRLVKE

如上所述，在本发明的某些方面中，显性失活(DN)RTEF-1多肽可以包含一个或一个以上内部氨基酸缺失。例如，在一些情况下，DN RTEF-1可以包含由外显子3、4、5、6、7、8、9或10编码的氨基酸的缺失。例如，在某些方面中，DN-RTEF1包含SEQ ID NO：3氨基酸序列或其衍生物。

表1：由编码外显子编码的RTEF-1氨基酸序列

外显子	编码的氨基酸序列
		1	N/A
2	LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDAEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYG ^*(SEQ ID NO：5)
		3	RNELIARYIKLRTGKTRTRKQ(SEQ ID NO：6)
4	VSSHIQVLARRKAREIQAKLK(SEQ ID NO：7)
		5	DQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHSSMALARGPGRPAVSG(SEQ ID NO：8)
6	FWQGALPGQAGTSHD ^*(SEQ ID NO：9)
		7	VKPFSQQTYAVQPPLPLPG ^*(SEQ ID NO：10)
8	FESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRSVASSKL WMLEFSAFLEQQQDPDT(SEQ ID NO：11)

9	YNKHLFVHIGQSSPSYSDPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFW(SEQ ID NO：12)
		10	ADLNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVVEKVE(SEQ ID NO：13)
11	TEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQ(SEQ ID NO：14)
		12	VVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE(SEQ IDNO：15)

^*指在外显子之间的被剪接的核酸密码子编码的氨基酸。

在本发明的另外的方面，DN RTEF-1多肽可以被一个或一个以上氨基替代物进一步修饰而保留它们的转录功能。例如，氨基酸替代可以在一个或一个以上位点进行，其中替代是具有相似亲水性的氨基酸的替代。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质活性相互作用生物学功能中的重要性在本领域普遍理解(Kyte和Doolittle，1982)。一般公认，氨基酸的相对亲水特征促成所生成蛋白质的二级结构，这反过来限定了蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。因此，此类保守替换可以在RETF-1序列中进行，并且将会对它们抑制VEGF启动子活性的活性和能力具有较小影响。如美国专利4,554,101中所描述，对下列氨基酸残基指定亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可以用作指导，并且因此其亲水性值在±2之内的氨基酸替换是优选的，其亲水性值在±1之内的氨基酸替换是特别优选的，并且其亲水性值在±0.5之内的氨基酸替换是甚至更加特别优选的。因此，本文所述的任何DN RTEF-1多肽可以通过不同的、但具有相似亲水性值的同源氨基酸的氨基酸替换修饰。具有+/-1.0或+/-0.5分值内的亲水性的氨基酸认为是同源性的。

II.细胞内化和靶向部分

用于在本文使用的细胞内化部分可以是与DN RTEF-1复合(共价或非共价)介导DN RTEF-1跨细胞膜转运的任何分子。此类内化部分可以是肽、多肽、激素、生长因子、细胞因子、适体或高亲合性多聚体。此外，细胞内化部分可以介导非特异性细胞内化或者可以是被所靶向细胞亚群内化的细胞靶向部分。

例如，在某些实施方案中，用于在本发明中使用的细胞靶向部分是抗体。通常，术语抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、人源化抗体、微型抗体、双体(dibody)、三体(tribody)以及抗体片段，诸如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体及其任何混合物。在一些情况下，优选细胞靶向部分是单链抗体(scFv)。在优选实施方案中，细胞靶向结构域可以是高亲合性多聚体多肽。因此，在某些情况下，本发明的细胞靶向构建体是包含DN RTEF-1和scFv或高亲合性多聚体的融合蛋白。在一些极特别的实施方案中，细胞靶向构建体是包含融合至单链抗体的DN RTEF-1多肽的融合蛋白。

在本发明的某些方面中，细胞靶向部分可以是生长因子。例如，转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、B淋巴细胞刺激因子(BLyS)、调蛋白、血小板衍生的生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)或低氧诱导因子可以用作本发明的细胞靶向部分。这些生长因子能够将构建体靶向表达相应生长因子受体的细胞。例如，VEGF可用于靶向表达FLK-1和/或Flt-1的细胞。在仍然进一步的方面中，细胞靶向部分可以是多肽BLyS(见美国申请号20060171919)。

在本发明的进一步的方面中，细胞靶向部分可以是激素。用于本发明的激素的一些实例包括，但不限于，人绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、雄激素、雌激素、甲状腺刺激激素、促卵泡激素、促黄体生成激素、促乳素、生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、催产素、促甲状腺素释放激素、生长激素释放激素、促肾上腺皮质激素释放激素、促生长素抑制素、多巴胺、褪黑素、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素、糖皮质激素类、盐皮质激素类、肾上腺素、去甲肾上腺素、孕酮、胰岛素、胰高血糖素、胰淀粉样多肽、促红细胞生成素、骨化三醇、钙化醇、心房钠尿肽、促胃液素、促胰液素、缩胆囊素、神经肽Y、生长素释放肽、PYY3-36、胰岛素样生长因子-1、瘦蛋白、血小板生成素、血管紧张素原、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35或IL-36。如上面所讨论，包含激素的靶向构建体使得靶向包含所标明激素的细胞外受体的细胞群的方法成为可能。

在本发明的更多实施方案中，细胞靶向部分可以是细胞因子。例如，IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL-16、IL-17、IL-18、粒细胞集落形成刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、制癌蛋白M、白血病抑制因子、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、TGF-α、IL1β、IL-1β、IL-1RA、MIF和IGIF全部可以用作本发明的靶向部分。

在本发明的某些方面中，本发明的细胞靶向部分可以是癌细胞靶向部分。众所周知，某些类型癌细胞异常表达与周围组织相比独特的表面分子。因此，结合这些表面分子的细胞靶向部分能将DN RTEF-1特异性地靶向递送至癌细胞。例如，细胞靶向部分可以被肺癌、乳腺癌、脑癌、前列腺胞、脾癌、胰癌、宫颈癌、卵巢癌、头和颈癌、食道癌、肝癌、皮肤癌、肾胞、白血病、骨癌、睾丸癌、结肠癌或膀胱癌细胞结合并内化。技术人员会理解，在一些情况下，DNRTEF-1的癌细胞靶向有效性根据癌细胞上特定的癌标志物的表达或表达水平而定。因此，在某些方面中提供以靶向的DN RTEF-1治疗癌症的方法，包括确定癌细胞是否(或者以什么程度)表达特定细胞表面标志物和取决于标志物基因或多肽的表达水平向癌细胞施用DN RTEF-1靶向治疗(或另一抗癌治疗)。

如上面所讨论，根据本发明的细胞靶向部分可以是，例如抗体。例如，根据本发明的细胞靶向部分可结合皮肤癌细胞，诸如黑素瘤细胞。已经证明，gp240抗原表达于多种黑素瘤中，但在正常组织中不表达。因此，在本发明的某些方面中，提供细胞靶向构建体，其包含DN RTEF-1和结合gp240的细胞靶向部分。在一些实例中，gp240结合分子可以是抗体，诸如ZME-018(225.28S)抗体或者9.2.27抗体。在甚至更优选的实施方案中，gp240结合分子可以是单链抗体，诸如scFvMEL抗体。

在本发明的仍然进一步的特定实施方中，细胞靶向构建体可以定向至乳腺癌细胞。例如结合Her-2/neu的细胞靶向部分，诸如抗Her-2/neu抗体可以缀合至DN RTEF-1。此类细胞靶向构建体的一个实例是包含单链抗Her-2/neu抗体scFv23和DN RTEF-1的融合蛋白。其他scFv抗体，诸如结合Her-2/neu的scFv(FRP5)也可用于本发明的组合物和方法中(von Minckwitz等，2005)。

在本发明的某些另外的实施方案中，设想了根据本发明的癌细胞靶向部分可具有结合多类型癌细胞的能力。例如，8H9单克隆抗体和源于它们的单链抗体结合在乳腺癌、肉瘤和神经母细胞瘤上表达的糖蛋白(Onda等，2004)。另一实例是美国申请号2004005647和Winthrop等，2003中描述的细胞靶向剂，其结合在多种癌症类型上表达的抗原MUC-1。因此，应当理解，在某些实施方案中，根据本发明的细胞靶向构建体可以靶向多数的癌症或肿瘤类型。

III.产生抗体的方法

下列方法例举一些最常见的抗体产生方法。

A.多克隆抗体

多克隆抗体通常通过向动物多点皮下(sc)或腹膜内(ip)注射抗原产生。如本文所使用的术语“抗原”指将用于产生抗体的任何多肽。根据本发明使用的抗原在一些实例中包括癌细胞表面标志物多肽和眼睛特异性细胞表面标志物。

使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)，将包含靶氨基酸序列的抗原或片段与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合是有用的。

通过混合1mg或者1μg缀合物(分别对于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂并将溶液多点真皮内注射，达到免疫原性缀合物或衍生物对动物的免疫。一个月之后，动物以最初量的1/5至1/10量的弗氏完全佐剂内的缀合物多点皮下注射来加强免疫。7至14天后，从动物取血并且分析血清的特异性抗体滴度。将动物加强免疫直到滴度达到高峰。优选地，动物以与不同蛋白质缀合的同一抗原的缀合物和/或通过不同的交联剂加强免疫。缀合物也可以在重组细胞培养中作为蛋白质融合物制成。同样，聚集剂诸如明矾用于增强免疫应答。

B.单克隆抗体

单克隆抗体从一群基本上均一的抗体得到，即各个抗体包含完全相同的群体，除了可能少量存在的可能的天然存在突变之外。因此，修饰词“单克隆的”表明抗体不是分离的抗体的混合物的特性。

例如，本发明的单克隆抗体可以使用Kohler和Milstein(1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或者通过重组DNA方法(美国专利4,816,567)产生。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或者其他适当的宿主动物，诸如仓鼠，以诱发出产生或者能够产生将特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。备选地，淋巴细胞可体外免疫。然后使用适宜的融合剂，诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding 1986)。

如此制备的杂交瘤细胞在适宜培养基上接种并生长，所述培养基优选包含一种或一种以上抑制非融合的、亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基有代表性地会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养及)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持由所选择的抗体产生细胞稳定高水平表达抗体、和对培养基诸如HAT培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。在这些骨髓瘤细胞当中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如从可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diego，Calif.USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤以及可从American Type Culture Collection(Rockville，Md.USA)获得的SP-2细胞衍生的那些细胞。

对其中杂交瘤细胞生长的培养基开展分析，以分析抗靶抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或者通过体外结合分析，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。

单克隆抗体的结合亲和性可以通过例如Munson和Pollard的Scatchard分析(1980)确定。

在鉴定出产生目的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释方法将克隆进行亚克隆并通过标准方法生长，Goding(1986)。用于此目的的适宜培养基包括例如Dulbecco氏改良Eagle氏培养基或者RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为动物内的腹水瘤体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规的免疫球蛋白纯化方法，诸如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法从培养基、腹水液体或血清中适当分离。

使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码本发明单克隆抗体的DNA并测序。本发明的杂交瘤细胞担当此类DNA的优选来源。一旦分离了DNA，可将其置入表达载体中，然后其被转染进入宿主细胞，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞之中，以达到单克隆抗体在重组宿主细胞内的合成。DNA还可以通过例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源鼠序列Morrison等(1984)，或者通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接而修饰。以该种方式，制备了具有针对本文所述任何特定抗原的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

有代表性地，此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定结构域，或者它们替代本发明抗体的一个抗原结合部位的可变结构域，以产生嵌合双价抗体，该抗体包含具有靶抗原特异性的一个抗原结合部位和具有另一不同抗原特异性的另一抗原结合部位。

嵌合或杂合抗体还可以使用合成蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法体外制备。例如，免疫毒素类可使用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键构建。用于此目的的适宜试剂的实例包括亚氨基硫羟酸和甲基-4-巯基丁酰胺。

对于诊断应用，本发明的抗体有代表性地以可检测部分标记。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I，荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；生物素；放射性同位素标记，例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I，或者酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

可以采用本领域已知的用于单独缀合抗体与可检测部分的任何方法，包括Hunter等(1962)；David等(1974)；Pain等(1981)和Nygren(1982)描述的那些方法。

本发明的抗体可以用于任何已知的测定法中，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、和免疫沉淀测定(Zola，1987).

竞争性结合测定依赖于所标记标准(其可以是纯化的靶抗原或者其免疫反应部分)与测试样品分析物竞争结合有限量抗体的能力。测试样品中抗原的量与结合至抗体的标准的量成反比。为了帮助确定所结合的标准的量，通常在竞争之前或之后将抗体固相化，以致于结合至抗体的标准和分析物可以方便地与未结合的标准和分析物分离开。

夹心测定涉及使用两种抗体，每一种抗体能够结合待检测蛋白质的不同的免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物被固定化在固体支持物上的第一种抗体结合，此后第二种抗体结合分析物，由此形成了不溶性的三部分复合体，David和Greene，美国专利号4,376,110。第二种抗体自身可以用可检测部分标记(直接夹心测定)或者使用以可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测定(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，其中可检测部分是酶。

C.人源化抗体

如先前所讨论，用于在本发明方法中使用的抗体可以是多克隆抗体或多克隆抗体或其片段。然而，在一些方面中，优选抗体被人源化以致于它们在待治疗的受试者内不引起免疫应答。用于将非人抗体人源化的方法在本领域众所周知。一般来说，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或一个以上氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，其代表性地从“输入”可变结构域而来。人源化基本上可以按照下列的Winter和其同事(Jones等，1986)；Riechmann等，1988；Verhoeyen等，1988)的方法通过啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体相应序列完成。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，见上)，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体有代表性地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似部位残基替代的人抗体。

重要的是，抗体被人源化而保留了对抗原的高亲和性和其他有利的生物学性质，例如结合至靶细胞并被内化的能力。为了实现该目标，根据优选的方法，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和多种概念上的人源化产物的分析过程制备。这些三维免疫球蛋白模型通常可以得到并且对本领域技术人员而言是熟悉的。图解和展示所选择候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可以得到的。检查这些展示可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析残基影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。以该方式，可以从共有序列和输入序列中选择FR残基并组合，以致于达到目的抗体特性，诸如对于一种或多种靶抗原的提高的亲和性。通常，CDR残基直接且几乎基本上涉及影响抗原结合。对于进一步的细节见于1992年8月21日提出的美国专利申请系列号07/934,373，其是于1991年6月14日提出的申请系列号07/715,272的部分继续申请案。

D.人抗体

人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法产生。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系已经由例如Kozbor(1984)和Brodeur等(1987)描述。

现在，产生能够在免疫时产生人抗体库而缺乏内源性免疫球蛋白产生的转基因动物(例如小鼠)是可能的。例如，已经描述，在嵌合和种系突变型小鼠中抗体重链结合区(JH)基因的纯合性缺失导致完全抑制内源性抗体的产生。人种系免疫球蛋白基因排布转移入此种种系突变型小鼠中会导致在抗原刺激时产生人抗体。见例如Jakobovits等(1993)；Jakobovits等(1993)。

备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等，1990)可以用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因框内克隆入丝状细菌噬菌体，诸如M13或fd的主要外壳蛋白基因或次要外壳蛋白基因中，并且作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒表面上展示。

由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能抗性的选择会选择出编码具有这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以许多种形式开展；对于它们的综述见例如Johnson等(1993)。几种来源的V基因片段可以用于噬菌体展示。Clackson等(1991)从基于免疫小鼠脾的V基因的小随机组合文库分离出不同排列的抗噁唑酮抗体。按照Marks等(1991)或Griffith等(1993)所述的技术可以构建来自未免疫人供体的V基因库并且可以基本上分离抗不同排列抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高的比率积累突变(体细胞高变)。引入的一些改变会赋予更高的亲和性，并且显示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞在以后的抗原刺激过程中优先复制和分化。该天然过程可以通过采用称作“链改组”的技术模拟(Marks等，1992)。在该方法中，通过噬菌体展示得到的“初级”人抗体的亲和性可以通过用从未免疫供体得到的V结构域基因的全部天然存在变体(库)连续替代重链和轻链V区基因改善。该技术允许产生具有nM范围亲和性的抗体和抗体片段。产生极大的噬菌体抗体库(也称作“所有文库之母”)的策略已经由Waterhouse等(1993)描述，并且也报道了从此类大噬菌体文库直接分离高亲和性人抗体。基因改组也可用于从啮齿动物抗体得到人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿动物抗体相似的亲和性和特异性。该方法也称作“表位印记”，根据该方法，通过噬菌体展示技术得到的啮齿动物抗体重链或轻链V结构域基因以全部人V结构域基因替换，产生啮齿动物-人嵌合体。对抗原的选择导致分离出能够恢复功能性抗原结合部位的人可变区，即表位支配着(影响着)配偶体选择。当为了替换剩余的啮齿动物V结构域而重复该过程时，得到人抗体(见PCT专利申请WO 93/06213，1993年4月1日公布)。与传统的通过CDR移植将啮齿动物抗体人源化不同，该技术提供完全的人抗体，其没有啮齿动物来源的框架或CDR残基。

IV.核酸分子

在某些方面中，本发明涉及编码DN RTEF-1多肽的核酸分子。在某些方面中，DN RTEF-1核酸序列包含在核酸载体中。术语“载体”用于指可以向其中插入核酸序列的、用于导入到其可以在其中复制的细胞中的载体核酸分子。核酸序列可以是“外源性的”，意思是指它对于载体将导入的细胞而言是外来的，或者序列对于细胞内的序列而言是同源的，但是该序列位于通常在宿主细胞核酸内不能发现的位点。载体包括质粒、粘粒、病毒(细菌噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将会熟练掌握通过标准重组技术(见例如，Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，两篇文献通过参考并入本文)构建载体。

术语“表达载体”指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子然后将被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译，例如在产生反义分子或核糖核酸酶中。表达载体可包含许多种“控制序列”，其指的是对于有效连接的编码序列在特定宿主细胞中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了调控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可以包含起其他作用并在下文描述的核酸序列。

A.启动子和增强子

“启动子”是控制序列，其是核酸序列中控制着转录起始和频率的一个区域。它可以包含在此可结合调节蛋白和分子，诸如RNA聚合酶和其他转录因子的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“有效放置的”、“有效连接的”、“处于控制下的”和“处于转录控制下的”意思是指启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能性位置和/或定向，以控制所述序列的转录起始和/或表达。

启动子通常包含功能为定位RNA合成起始位点的序列。最熟悉的实例是TATA盒，但是在一些启动子中缺乏TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的分开的元件自身帮助定位起始位置。额外的启动子元件调节转录起始频率。有代表性地，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然已经表明许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。为了使编码序列“处于启动子控制之下”，要将转录读码框的转录起始位点的5′端置于所选择启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激DNA的转录和促进所编码RNA的表达。

启动子元件之间的间隔常常是挠性的，以致于当元件彼此相对倒转或移动时，维持了启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp的间隔而活性才开始降低。似乎各个元件可以协同或独立地起作用以活化转录，这取决于启动子。启动子可以与或者不与“增强子”联合使用，增强子指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然连接的启动子，可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5′非编码序列得到。此种启动子可以称作“内源性的”。同样，增强子可以是位于序列下游或上游的、与核酸序列天然连接的增强子。备选地，通过将编码核酸片段置于重组或异源启动子控制下降会得到某些优势，所述启动子指在其天然环境中与核酸序列通常不连接的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中与核酸序列通常不连接的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子、从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子、和非“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。例如，在重组DNA构建中最常使用的启动子包括内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成性产生启动子和增强子核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM与本文所公开组合物结合产生序列(见美国专利号4,683,202和5,928,906，每一专利通过参考并入本文)。此外，考虑了也可以采用指导序列在非细胞核细胞器，诸如线粒体、叶绿体等中转录和/或表达的控制序列。

自然地，采用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中表达的启动子和/或增强子将会是重要的。分子生物学领域技术人员普遍知道启动子、增强子和细胞类型的组合用于蛋白质表达的应用(见例如Sambrook等1989，通过参考并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导性的，和/或在适当条件下用于指导所引入DNA片段高水平表达，这在大规模生产重组蛋白和/或肽中有利。启动子可以是异源的或内源的。

额外的任何启动子/增强子组合(根据例如真核启动子数据库EPDB，http://www.epd.isb-sib.ch/)也可以用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果作为递送复合体的一部分或者作为额外的遗传表达构建体提供适当的细菌聚合酶的话，真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录。

组织特异性启动子或元件的鉴定，以及表征它们的活性的分析法是本领域技术人员众所周知的。此类区域的非限定性实例包括人LIMK2基因(Nomoto等1999)、促生长素抑制素受体2基因(Kraus等，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki等，1998)，D1A多巴胺受体基因(Lee等，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)和人血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。

B.起始信号和内部核糖体结合位点

对于编码序列的有效翻译还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源性的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员能够容易地确定这点和能够提供必需信号。众所周知，起始密码子与目的编码序列的读码框必须是“同框的”，以保证全部插入片段的翻译。外源性的翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或者合成的。可以通过包含适当转录增强子元件增强表达效率。

在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用用于产生多基因或者多顺反子信使。IRES元件能够绕过5′甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小RNA病毒家族两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可连接至异源性开放读码框。多重开放读码框可以一起转录，每一个通过IRES分开，产生多顺反子信使。凭借着IRES元件，核糖体可接近每一个开放读码框以有效翻译。可以使用单一启动子/增强子使多基因有效表达以转录出单一信使(见美国专利号5,925,565和5,935,819，每一专利通过参考并入)。

C.多克隆位点

载体可以包括多克隆位点(MCS)，它是包含多个限制性酶切位点的核酸区域，其中的任何限制性酶切位点可以与标准重组技术结合用于消化载体(见例如，Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，通过参考并入本文)。“限制性酶消化”指用仅在核酸分子上特异位置起作用的酶对核酸分子进行催化性切割。这些限制性酶多数是商业可得的。本领域技术人员广泛理解此类酶的用途。常常使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或者片段化，以便外源性序列能够与载体连接。“连接”指在彼此可能连续或者不连续的两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。关于限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员众所周知的。

D.剪接位点

大多数转录的真核RNA分子会经历RNA剪接以将内含子从最初转录物中去除。包含基因组真核序列的载体可需要供体和/或受体剪接位点以保证转录物的正确加工以便蛋白质表达(见例如，Chandler等，1997，通过参考并入本文)

E.终止信号

本发明的载体或构建体通常会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与RNA转录物被RNA聚合酶的特异性终止的DNA序列组成。因此，在某些实施方案中，考虑了终止RNA转录物产生的终止信号。终止子可能是为达到目的信使水平在体内是必需的。

在真核系统中，终止子区域还可以包含允许新转录物的位点特异性切割以致于暴露多腺苷化位点的特异性DNA序列。这向专门的内源聚合酶发出向转录物的3’端加入一段大约200个A残基(polyA)的信号。以该polyA尾修饰的RNA分子显得更稳定和更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的其他实施方案中，优选的是终止子包含切割RNA的信号，并且更优选的是终止子信号促进信使的多腺苷化。终止子和/或多腺苷化位点元件可用于提高信使水平和使得从表达盒向其他序列的通读最小化。在某些特定情况下，多腺苷化信号可以是来自如美国申请号20050175591中所述的神经毡蛋白-1的信号。

考虑用于在本发明中使用的终止子包括本文所述的或者本领域技术人员已知的任何已知转录终止子，包括但不限于，例如基因的终止序列，诸如例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，诸如例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以缺乏可转录或可翻译序列，诸如由于序列截断所致。

F.复制起点

为了载体在宿主细胞中繁殖，载体可包含一个或一个以上复制起点(常称作“ori”)，它是起始复制的特异性核酸序列。备选地，如果宿主细胞是酵母，可以采用自主复制序列(ARS)。

G.选择标记和筛选标记

在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中包括标记在体外或在体内鉴定包含本发明核酸构建体的细胞。此类标记将赋予细胞可识别的变化，允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标记是赋予能够进行选择的特性的标记。阳性选择标记是标记的存在能够用于选择的标记，而阴性选择标记是标记的存在妨碍选择的标记。阳性选择标记的实例是药物抗性标记。

通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予抗新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、吉欧霉素(zeocin)和组氨醇的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的实现鉴别转化体的表型的标记之外，还考虑其他类型的标记，包括筛选标记诸如GFP，其基础是比色分析。备选地，可以采用筛选酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何在可能与FACS分析联合中应用免疫学标记。不认为所使用的标记是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。更多的选择标记和筛选标记的实例是本领域技术人员众所周知的。

H.质粒载体

在某些实施方案中，考虑了质粒载体用于转化宿主细胞。通常，包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体用于与这些宿主组合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在所转化细胞中提供表型选择的标记序列。在非限定性实例中，常常使用来源于大肠杆菌物种的质粒pBR322的衍生物转化大肠杆菌(E.coli)。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此能够提供用于鉴定所转化细胞的容易的手段。pBR质粒或其他微生物质粒或噬菌体还必须包含、或者必须修饰成包含例如可以被微生物使用来表达其自身蛋白质的启动子。

此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体能够用作转化载体与这些宿主组合使用。例如，噬菌体λGEMTM 11可以用来产生重组噬菌体载体，该载体可以用于转化宿主细胞，诸如例如大肠杆菌LE392。

更多的有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等，1985)和pGEX载体，其用于产生用于后期纯化和分离或切割的谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白。其他适宜融合蛋白是带有半乳糖苷酶、遍在蛋白等的那些融合蛋白。

包含表达载体的细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，在任意多种适宜培养基中，例如LB中生长。在某些载体中的重组蛋白的表达可以通过将宿主细胞与某些启动子特异性的试剂接触，例如通过向培养基中加入IPTG或者通过转换至较高温度下培养来诱导，这将是本领域技术人员能够理解的。在培养细菌另外一段时间(通常在2和24小时之间)之后，通过离心收集细胞并且洗涤去除残留的培养基。

I.病毒载体

某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或者进入细胞的能力、和整合入宿主细胞基因组和稳定高效表达病毒基因的能力使得它们成为将外来核酸转移入细胞(例如哺乳动物细胞)的有吸引力的候选物。本发明的DN RTEF-1成分可以是编码DN RTEF-1多肽的病毒载体。可以用于递送本发明核酸的病毒载体的非限定性实例在下面描述。

1.腺病毒载体

用于递送核酸的特定方法涉及使用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体整合入基因组DNA的能力低，但是该特征通过由这些载体所提供的基因转移的高效率所弥补。“腺病毒表达载体”旨在包括包含这样的腺病毒序列的那些构建体，即所述腺病毒序列足以(a)支持购建体包装和(b)最终表达已克隆至其中的组织或细胞特异性构建体。遗传结构的知识，或者腺病毒，一种36kb的线性双链DNA病毒，允许用多达7kb的外来序列替代大片段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。

2.AAV载体

可以使用腺病毒辅助转染将核酸引入到细胞中。已经报道，使用腺病毒偶联系统提高在细胞系统中的转染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotten等，1992；Curiel，1994)。腺伴随病毒(AAV)是用于递送本发明DN RTEF-1表达盒的有吸引力的载体系统，因为它具有高频率的整合并且它可以感染非分裂细胞，因此使得它可以用于递送基因进入哺乳动物细胞中，例如组织培养物中(Muzyczka，1992)或体内。AAV对广大的宿主具有感染性(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。涉及rAAV载体产生和用途的细节描述于美国专利号5,139,941和4,797,368中，每一专利通过参考并入本文。

3.反转录病毒载体

反转录病毒作为治疗中的DN RTEF-1递送载体是有希望的，因为它们具有将它们的基因整合入宿主基因组内的能力、能转移大量外来遗传物质、能感染光谱的物种和细胞类型和能被包装在特定细胞系中(Miller，1992)。

为了构建DN RTEF-1反转录病毒载体，将核酸(例如编码DN RTEF-1的核酸)插入到病毒基因组中的某些病毒序列的位置，以产生复制缺陷性的病毒。为了产生病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因，但没有LTR和包装成分的包装细胞系(Mann等，1983)。当包含cDNA的重组质粒与反转录病毒LTR和包装序列一起引入到特定细胞系中时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列使得重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，然后病毒颗粒被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集包含重组反转录病毒的培养基，任选浓缩并用于基因转移。反转录病毒载体能够感染广泛多种的细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。

慢病毒是复杂的反转录病毒，它除了包含共有的反转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。用慢病毒载体递送抗血管生成分子的方法先前已经描述，见例如美国专利7,122,181，通过参考并入本文。慢病毒载体在本领域众所周知(见例如，Naldini等，1996；Zufferey等，1997；Blomer等，1997；美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。已经通过将HIV致病基因多次弱化产生慢病毒载体，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被缺失，使得载体在生物学上是安全的。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和间接体内方式的基因转移和核酸序列表达。例如，美国专利号5,994,136中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中适宜宿主细胞以携带有包装功能，即gag、pol和env，以及rev和tat的两种或两种以上的载体转染，所述专利通过参考并入本文。人们可以通过将包膜蛋白与用于靶向特定细胞类型的受体的抗体或者特定配体连接，来靶向重组病毒。例如，通过将目的序列(包括调节区)连同编码针对特异靶细胞上受体的配体的另一基因插入到病毒载体中，则载体具有了靶特异性

4.其他病毒载体

其他病毒载体可以用作本发明的疫苗构建体。可以采用衍生自病毒，诸如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、新培斯病毒(sindbis virus)、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。它们赋予许多种哺乳动物细胞几种有吸引力的特性(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

5.使用修饰病毒的递送

待递送的核酸可以包含在已经工程化表达特异性结合配体的感染性病毒内。病毒颗粒因此会特异性结合至靶细胞上的相应受体并且递送内容物至细胞。基于通过向病毒包膜化学性加入乳糖残基而化学修饰反转录病毒，开发出允许特异性靶向反转录病毒载体的新方法。该修饰使得可以通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。

设计了靶向重组反转录病毒的另一种方法，其中使用生物素化的抗反转录病毒包膜蛋白和抗特异性细胞受体的抗体。通过使用链亲和素将抗体经由生物素成分偶联(Roux等，1989)。他们使用抗主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，证明了亲嗜性病毒能够在体外感染携带有这些表面抗原的许多种人细胞(Roux等，1989)。

J.载体递送和细胞转化

据信在本发明中使用的用于转化细胞器、细胞、组织或生物而递送核酸的适宜方法实际上可以包括如本文所述的或者如本领域技术人员将已知的、可以将核酸(例如DNA)引入细胞器、细胞、组织或生物中的任何方法。此类方法包括，但不限于，DNA的直接递送，诸如通过间接体内转染(Wilson等，1989，Nabel等，1989)、经注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每一专利通过参考并入本文)包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过参考并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过参考并入本文；Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van DerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE葡聚糖然后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接的声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等，1991)和受体介导转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,7835,563,055，5,550,318，5,538,877和5,538,880，并且每一文献通过参考并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，每一文献通过参考并入本文)；通过土壤杆菌属介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，每一文献通过参考并入本文)；通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，每一文献通过参考并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)，和此类方法的任何组合。通过诸如这些技术的应用，可稳定或瞬时转化一种或多种细胞器、一种或多种细胞、一种或多种组织或一种或多种生物。

V.治疗方法

A.药物制剂

用于在本发明方法中使用的治疗组合物可以配制成可药用的形式。短语“可药用的或药物可接受的”指当施用至适当的动物，例如人时不产生不利反应、变态反应或其他不良反应的分子实体和组合物。依据本公开本领域技术人员将会知道包含至少一种DN RTEF-1多肽或核酸活性成分的药物组合物的制剂，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990中所例举，该文献通过参考并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解制剂应该满足FDA Office of Biological Standards所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所使用，“可药用载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类的物质及其组合，这是本领域普通技术人员已知的(见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，通过参考并入本文)。优选配制可药用载体用于向人施用，虽然在某些实施方案中，希望配制可药用载体用于向非人动物诸如犬施用，而不适合(例如由于政府规制的原因)用于向人施用。考虑了任何常规载体在治疗或药物组合物中的用途，除非它与活性成分不相容。

施用至受试者的本发明组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素，诸如体重、疾病的严重性、待治疗的疾病类型、先前或者并行的治疗干预、患者的特发症和施用途径确定。负责施用的医师在任何情况下会确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于各个受试者的适当的剂量。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少大约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可以包含单位重量的大约2％至大约75％，或者大约25％至大约60％，以及从它们当中推导出的任何范围。在其他非限定性实例中，剂量还可以包括从每次施用大约1微克/kg/体重、大约5微克/kg/体重、大约10微克/kg/体重、大约50微克/kg/体重、大约100微克/kg/体重、大约200微克/kg/体重、大约350微克/kg/体重、大约500微克/kg/体重、大约1毫克/kg/体重、大约5毫克/kg/体重、大约10毫克/kg/体重、大约50毫克/kg/体重、大约100毫克/kg/体重、大约200毫克/kg/体重、大约350毫克/kg/体重、大约500毫克/kg/体重至大约1000mg/kg/体重或更多，以及从它们当中推导出的任何范围。在从此处所列数字推导出范围的非限定性实例中，基于上述数字可以施用大约5mg/kg/体重至大约100mg/kg/体重、大约5微克/kg/体重至大约500毫克/kg/体重等范围。

在特定实施方案中，本发明的组合物适宜应用于哺乳动物眼睛。例如，制剂可以是溶液剂、混悬剂或凝胶剂。在某些实施方案中，组合物通过生物蚀解植入物，诸如玻璃体内植入物或者眼嵌入物，诸如设计靠结膜表面放置的眼嵌入物施用。在一些实施方案中，用治疗剂包被医疗装置或者可植入装备。

在优选的方面中，本发明的制剂将以滴剂形式的水溶液应用于眼睛。这些滴剂可以从一次剂量的安瓿递送，其优选是无菌的，并且因此无需给制剂提供制菌剂成分。备选地，滴剂可以从多次剂量瓶递送，其可以优选包含在递送时从制剂中提取出防腐剂的装置，此类装置在本领域已知。

在其他方面中，本发明的成分可以作为形成置于眼睑之下的可溶解嵌入物的浓缩凝胶或者相似媒介物递送至眼睛。

此外，本发明的治疗组合物可以以液体溶液或混悬液的可注射组合物的形式施用；也可制备成适宜在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。这些制剂也可以是乳化的。用于此类目的的有代表性的组合物包含可药用载体。例如，组合物可包含每毫升磷酸缓冲盐水有10mg、25mg、50mg或者直至大约100mg人血清白蛋白。其他可药用载体包括水性溶液、非毒性赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲液等。

非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、酒精溶液/水溶液、盐溶液、肠胃外媒介物诸如氯化钠、林格葡萄糖等。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物组合物的各种成分的pH和确切浓度根据众所周知的参数调整。

额外的制剂适宜口服施用。口服制剂包括这样的有代表性的赋形剂，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。组合物采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂形式。当途径是局部施用时，形式可以是乳膏剂、软膏剂、油剂或喷雾剂。

治疗组合物的有效量基于预期目标确定。术语“单位剂量”或“剂量”指适宜在受试者中使用的物理上离散的单位，每一单位包含经计算产生与其施用，即适宜途径和治疗方案相关的上述期望反应的预定量治疗组合物。根据治疗次数和单位剂量的待施用的量取决于所希望的保护作用。因此，在一些情况下，可以通过测定例如受试者血清胰岛素或葡萄糖水平的变化确定剂量。

治疗组合物的准确量还取决于医师的判断并且对每一个体都是独特的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(例如症状的缓解与达到特定的血清胰岛素或葡萄糖浓度)和特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。

B.额外的治疗

如上所讨论，在某些方面中，本发明的治疗方法可以与额外的抗血管生成或抗癌治疗组合或联合使用。

1.化学疗法

在本发明的某些实施方案中，DN RTEF-1与化学治疗即联合施用。例如顺铂(CDDP)、碳铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、红豆紫杉醇、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、万珂硼替佐米、长春碱和甲氨蝶呤、或上述的任何类似物或衍生变体可以在本发明的方法中使用。

2.放射治疗

在某些更多实施方案中，本发明的DN RTEF-1组合物可以用于使细胞对放射疗法敏感。放射疗法可以包括，例如γ-射线、X-射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。在某些情况下，微波和/或紫外线照射也可以根据本发明使用。对于X-射线的剂量范围为从对于长期的(3-4周)的每日50至200伦琴的剂量至2000至6510伦琴的一次剂量。对于放射性同位素的剂量范围变动很大，并且依赖于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型、和瘤细胞的摄取。

当术语“接触”和“暴露”应用于细胞时，在本文中用于描述治疗构建体和化疗剂或放射治疗剂被递送至靶细胞或者被直接与靶细胞并列放置的过程。为了达到细胞杀灭或停滞，两种试剂均以有效杀死细胞或者阻止其分裂的组合量递送至细胞。

3.免疫疗法

免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向和破坏癌细胞。免疫效应器可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以担当治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞，而募集的其他细胞实际上起细胞杀灭作用。抗体也可以缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅仅充当靶向剂。备选地，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒T细胞和NK细胞。

因此，免疫疗法可以用作联合治疗的一部分与基因治疗联合使用。联合治疗的一般方法在下描述。通常，肿瘤细胞必须具有适宜靶向的一些标志物，即它在大多数的其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标志物并且这些标志物中的许多中可以适宜在本发明中用于靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B、Her-2/neu、gp240和p155。

4.基因

在另一实施方案中，采用基因治疗，其中治疗性多核苷酸在本发明的细胞靶向构建体施用之前、之后或者同时施用。DN RTEF-1与编码一个或一个以上额外基因产物的载体相结合递送对靶组织具有组合抗高增殖作用。许多种基因被包含在本发明之内，例如编码p53的基因可以与DN RTEF-1组合物组合递送。

5.手术

大约60％的患有癌症的人会经历一些类型的手术，这包括预防性手术、诊断性手术或分期手术、治疗性手术和姑息性手术。治疗性手术是可以与其他治疗法，诸如本发明的治疗法、化学疗法、放射治疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法结合使用的癌症疗法。本发明的DN RTEF-1疗法可以单独采用或者与作为新辅助手术疗法的细胞毒性疗法组合使用以便例如在行切除术之前缩小肿瘤大小，或者它可以作为后辅助手术疗法(postadjuvant surgicaltherapy)使用，以便例如在切除部分或全部肿瘤之后将手术台消毒。

治疗性治疗包括切除术，其中全部或者部分的癌性组织被物理性移除、切下和/或破坏。肿瘤切除术指物理性移除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(Mohs手术)。进一步考虑了本发明可以与浅表癌、前期癌或附带量的正常组织的移除结合使用。

当切除部分或者全部癌性细胞、组织或者肿瘤时，会在身体内形成一个空腔。可以通过灌注、直接注射或区域局部应用额外的抗癌治疗实现治疗。此类治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗的剂量同样可以变动。

6.其他药剂

激素疗法也可以与本发明结合使用，或者与先前所述的任何其他癌症疗法组合使用。激素的使用可以用来治疗某些癌症，诸如乳腺、前列腺、卵巢或宫颈癌症以降低某些激素，诸如睾酮或雌激素的水平或者阻断它们的效应。该疗法常与至少一种其他癌症疗法组合使用作为一种治疗选择或者降低转移风险。

实施例

下面的实施例进一步说明本发明的多个方面。本领域的技术人员应该认识到，下面实施例中公开的技术代表着发明人发现的在实施本发明中良好地发挥作用的技术和/或组合物，并且因此可以考虑构成实施的优选模式。然而，依照本公开，本领域技术人员会意识到，可以对所公开的特定实施方案进行多种改变并且仍然得到相同或相似的结果，这没有脱离部分明的精神和范围。

实施例1

试验方法

原代眼血管内皮细胞分离和培养

所有的人细胞和组织的使用均按照批准的机构评审委员会的方法。使用所建立的方法建立从人视网膜分离的内皮细胞的原代培养，并用作mRNA的来源(Kanda等，1998；Silverman等，2005)。从死亡24小时内的无名供体(Lion’s EyeBank，Portland，OR)得到人尸体眼睛。供体没有心血管或眼疾病史并且年龄范围为16-42。简单地说，这些视网膜和虹膜组织被无菌切开，并从供体眼睛中分离出来并在0.2％胶原酶(Sigma Chemical Co，，St Louis，MO)中消化，并且通过使用抗人CD31小鼠单克隆抗体包被的磁珠(Dynal Biotech，Inc.，Lake Success，NY)将内皮细胞(EC)从其他细胞类型中分离。EC在添加有10％胎牛血清和抗生素的MCDB-131完全培养基(Clonetics/BioWhittaker，Walkersville，MD)中培养。使用传代2-5次的细胞。在2轮磁珠分离之后，EC培养物纯度大于99.5％，如通过形态学标准、CD31和冯维勒布兰德氏(von Willebrand)因子表达以及乙酰化低密度脂蛋白的摄取(Silverman等，2005)所评估。

低氧诱导

视网膜和虹膜内皮细胞在60mm直径培养皿中培养至80％汇合，然后置于空气密封的调节器培养室(Modulator Incubator Chamber)(Billups-Rothenberg，DelMar，CA)中。1％O₂、5％CO₂和余数量的N₂气体混合物将室充气精确5分钟，于是将室密封并置于潮湿的37℃培养箱内。在8小时之后，再次用低氧气体混合物将室充气5分钟，并且密封和培养另外8小时，然后再次充气和培养另外8小时，在此时分离总RNA。

总RNA提取和RT-PCR

使用RNAqueous试剂盒(Ambion Inc，Austin，TX)按照厂商的方法分离总RNA并且50ng的该RNA用于与oligo-dT引物进行第一链合成(SuperScript II，Stratagene，La Jolla，CA)。根据所公开的RTEF-1序列(NCBI登录号U63824)设计的下列引物F1：5’-ttggagggcacggccggca-3’(SEQ ID NO：20)和R1：5’-tcattctttcaccagcctgta-3’(SEQ ID NO：21)用于使用标准条件进行第二链PCR扩增。所扩增的产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳和观察，然后从凝胶中纯化(Qiaquick凝胶提纯，Qiagen，Valencia，CA)用于在Abi 310自动测序仪上开展标准双脱氧核苷酸测序。

报告基因分析

全长RTEF-1同种型定向克隆入pcDNA 3.1表达质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在正向引物序列中将预测的TTG密码子转变成ATG。包含54bp 5’UTR和转录起始位点上游1,082bp的1,136bp的人VEGF 5’近端启动子片段定向克隆至pSEAP报告质粒(Clontech，Mountain View，CA)中可分泌的碱性磷酸酶(SEAP)基因的5’。具有缺失的启动子片段如下构建：首先扩增启动子的5’端和启动子的3’端，然后将所扩增产物连接。然后将缺乏目的区域的所连接产物扩增并定向克隆至无启动子pSEAP载体中。在转染研究之前，所有构建体均双链测序以验证序列。

转染分析。

使用Amaxa核转染设备(Nucleofection Device)(Amaxa Inc，Gaithersburg，MD)、Amaxa试剂和标准的厂商方法开展转染。简言之，293T细胞培养在10％DMEM培养基中直至80％汇合，用胰蛋白酶消化并收集。每次核转染使用一百万细胞。一百万细胞重悬于100μl核转染溶液和5μl(包含2μg)总质粒DNA中，电穿孔(核转染设备上的程序号A023)，然后立即重悬于1ml预温培养基中并接种于6孔板的一个孔中。使细胞恢复16-18小时并且小心地去除培养基并用精确的500ml新鲜培养基替代。在培养精确6小时后，小心取出150μl培养基，其25μl用于立即分析或者储存于-20℃用于以后的SEAP分析。三个独立的25μ1培养基等分试样用于按照厂商的方法(BD Biosciences，San Jose，CA)开展SEAP分析，并且将对于所有三次的读数的SEAP值进行平均以用于三次重复试验的比较。

在单次试验中每一共转染重复至少3次，并且每次试验用单独的质粒制备物(n＝9-12)独立地重复2次以上。在图中给出了一次代表性的试验。使用Student’s t-检验(双尾)开展统计学分析，以比较单次试验中的3个或4个样品。对于多重检验使用Bonferroni修正，并且认为P＜0.01为具有显著性。

对于每一共转染测定(当2种质粒在同一管中一起转染时)每一质粒的拷贝数调整至与所使用最大质粒的拷贝数相同。无启动子的pSEAP载体和无插入片段的pcDNA 3.1表达质粒充当阴性对照。对于每一核转染试验，同时转染2种单独的阳性对照质粒：SV40启动子pSEAP质粒和pGFPmax载体以保证有效转染和相等的转染效率。带有SV40启动子的pSEAP质粒充当阳性对照用于随后的SEAP蛋白质分析。pGFPmax载体也充当每一批次细胞转染的阳性对照，允许通过视觉观察证实一致的转染效率。在所有试验中，对于293T细胞，核转染总能达到80-90％的转染效率。

实施例2

RTEF-1新同种型存在于低氧和正常眼血管内皮细胞中

使用F1和R1引物对，对从人视网膜(PRVEC)和虹膜(PIVEC)血管内皮细胞原代培养物制备的cDNA扩增得到大约1305bp和936bp的产物(图1B)。使用同样的引物对，对分离自在分离mRNA前已经在低氧条件下培养24小时的PRVEC的cDNA扩增得到大约447bp的额外产物(图1B)。651bp cDNA从人原代视网膜血管内皮细胞(PRVEC)分离。

测序分析显示，最大的产物与跨域起始密码子与终止密码子的全长1305bpRTEF-1基因相同(SEQ ID NO：1)，而936bp、651bp和447bp转录物是1305bp产物的选择性剪接转录物。下面对于密码子的描述将根据1305bp转录物中的序列编号，该转录物包含435个密码子，蛋白质起始密码子为1，终止密码子为435。在936bp同种型中，预测编码1305bp转录物蛋白质部分的11个外显子当中的4个外显子，即外显子5至8被剪接掉(图1A)。在447bp同种型中，不但缺乏外显子5，而且在外显子7的中间出现了罕见的框内剪接事件，其将从外显子7内的Gln-83至外显子12内的密码子Gln-425剪接掉(图1A)。在651bp同种型中，将外显子3的5‘部分与外显子10内的内部剪接接纳位点直接剪接，由此从转录物中完全去除了外显子4、5、6、7、8和9。

1305bp的产物显示与最初从人心、骨骼肌、胰和肺组织鉴定的转录增强因子-1相关(RTEF-1)基因(Stewart等，1996)相同。先前已经报道了两个其他的RTEF同种型，即缺乏外显子5的Asp-119至Gly-161的变体2(登录号NM_201441)和采用下游蛋白质起始位点Met-130的变体3(登录号NM_201443)。在人眼血管细胞中鉴定的936bp、651bp和447bp同种型目前还没有在人的任何其他组织中鉴定出。

全长1305bp转录物编码具有434个氨基酸的多肽，预测分子量为～48.6KDa。该多肽包含50个强碱性氨基酸(K、R)、47个强酸性氨基酸(D、E)、133个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)和124个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。预测的等电点是8.248，预测的电荷为pH 7.0时4.799。每一种鉴定的RTEF-1同种型利用非标准TTG(UUG)起始密码子，导致氨基末端为赖氨酸残基。

936bp转录物编码具有311个氨基酸的多肽，预测分子量为～35.6KDa。该多肽包含40个强碱性氨基酸(K、R)、38个强酸性氨基酸(D、E)、93个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)和92个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。预测的等电点是8.037，预测的电荷是pH 7.0时3.458。

651bp转录物编码具有216个氨基酸的多肽，预测分子量是～24.4KDa。该多肽包含22个强碱性氨基酸(K、R)、27个强酸性氨基酸(D、E)、60个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)和71个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。预测的等电点是6.039，预测的电荷是pH 7.0时-4.046。651bp同种型为从外显子3内Thr-92之后到外显子10中间的Ser-311被框内剪接(全部编号均基于最大的RTEF-1同种型(SEQID NO：1))。因此，651bp同种型包含全部的外显子2、大多数的外显子3(缺乏外显子3内22个氨基酸内的5个氨基酸)、大多数的外显子10(缺乏外显子10中的前11个氨基酸)和完整的外显子11和12。这导致保留了大多数的TEA结合结构域，但缺少所预测的3个α-螺旋中的一个和在72个氨基酸的TEA结构域中正常包含的推定核定位信号(Leu-105至Lys-109)。在651bp同种型中还缺乏脯氨酸丰富结构域(PRD)、活化结构域和第一STY结构域(Ser-253至Ser-271)。有趣的是，进入外显子10内的剪接事件在该外显子内的Ser-11开始(即外显子10内的第11个氨基酸)，这恰恰是第二STY结构域(Ser-253至Ser-336)的起点。该剪接事件导致缺乏推定核定位信号的部分TEA结构域直接与STY结构域融合。

447bp转录物编码具有148个氨基酸的多肽，预测分子量是～16.5KDa。该多肽包含22个强碱性氨基酸(K、R)、17个强酸性氨基酸(D、E)，43个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)和40个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。预测的等电点是9.444，预测的电荷是pH 7.0时5.561。

936bp和447bp同种型的预测蛋白质序列均包含72个氨基酸的TEA结构域(Asp-38至Lys-109)，其包含3个预测的α-螺旋和推定的核定位信号(Leu-105至Lys-109)。然而在C末端结构域中的跨外显子7的最后6个氨基酸和外显子8的最初19个残基的脯氨酸丰富结构域(Pro-189至Pro-213)从447bp同种型中消失(图1A)。此外，在447bp同种型中还丢失两个STY结构域(Ser-253至Ser-271和Ser-311至Ser-336)，它们是羟基化残基诸如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸丰富区，一个位于外显子9中，另一个位于外显子10中(图1A)。

实施例3

新RTEF-1同种型对从VEGF启动子表达的影响

已经证明，来自1305bp同种型的多肽在牛主动脉内皮细胞中通过结合至Sp1位点充当VEGF的转录刺激剂(Shie等，2004)。因此开展研究以研究新同种型是否能够刺激从人VEGF启动子的表达。将包含54bp 5’UTR和转录起始位点上游1,082bp的人VEGF基因5’近端启动子克隆入pSEAP报告质粒并且将RTEF-1同种型克隆入pcDNA表达载体。由于将质粒DNA核转染入原代培养眼血管内皮细胞中存在困难，使用293T细胞系作为替代细胞系用于转染研究。VEGF启动子-报告质粒与RTEF-1同种型中的一种共转染显示，1305bp、936bp和447bp同种型上调报告基因从VEGF启动子的表达(柱1、2和4，图2)。然而，有趣的是651bp同种型下调从VEGF启动子的表达(柱3，图2)。全长1305bpRTEF-1产物和936bp同种型增强表达比背景显著高3-4倍(P＝0.001)，并且在多重检验修正之后没有观察到这两种同种型之间存在差异(P＝0.01)。447bp同种型刺激表达比背景高大约10-15倍(平均12倍)(P＝0.0003)。在三次独立的试验中，每一共转染试验一试三份重复，得到相同的结果。

651bp同种型(柱3，图2)相对于对照(柱5，图2)显著下调从VEGF启动子的表达(P＝0.0026)。令人惊讶地，改良的651bp同种型，即下面描述的SS-651bp-RMR产物(柱6，图2)不但相对于对照抑制从VEGF启动子的表达(P＝0.0009)，并且在抑制表达时比651bp同种型甚至更有效(P＝0.0008)。651bp同种型(柱3，图2)抑制表达比在对照中观察到的表达低大约3倍，而SS-651bp-RMR同种型(柱6，图2)抑制表达比对照低大约10倍(示于柱5，图2)。SS-651bp-RMR的抑制能力可能归因于该分子被生产细胞分泌出这一事实与其被输入邻近细胞的能力的结合。

ss-651-RMR bp RTEF-1包含651bp的同种型RTEF-1编码区，该编码区在N-末端融合至人IL-2分泌信号序列(SEQ ID NO：22)和在C-末端融合至内化部分(SEQ ID NO：23)。这产生“ss-651-RMR”产物，其可从表达细胞中分泌并且可输入到周围细胞中。

实施例4

Sp1元件为最大VEGF启动子活性所必需，但不是RTEF增强子活性所必需

先前研究证明，全长RTEF-1同种型结合至Sp1元件并需要Sp1元件以增强VEGF启动子活性。在以前的研究中，位于-97至-89bp的该Sp1位点的突变导致RTEF-1增强子活性丧失(Shie等，2004)。在同样的研究中，发现在-86至-58bp的同样区域内的三个其他Sp1位点对于RTEF-1增强子活性不是必需的。为了验证新RTEF-1同种型的增强子活性是否需要Sp1位点，将缺失所有四个Sp1位点，即从-113bp至-58bp的VEGF启动子克隆入pSEAP载体并与每个同种型共转染。通过比较背景报告基因从全长启动子和Sp1阴性VEGF启动子的表达表明，Sp1元件的丧失导致报告基因表达急剧降低30倍(图3)。这将暗示近端启动子内4个Sp1元件当中的至少一个对于增强总体表达是必需的。在Sp1-阴性和每一同种型共转染试验中显示了相似水平的表达抑制(图3，比较实柱与空柱)。然而，同样的增强趋势还在Sp1-阴性启动子分析中的与每一同种型共转染试验中观察到(图3)。对于1305bp、936bp和447bp同种型分别观察到高于背景3倍、4倍和12倍的增强。因此，每一同种型所赋予的高于背景的增强作用水平是相同的，不管VEGF启动子中是否存在Sp1元件。

在VEGF启动子中缺乏Sp1位点的情况下，651bp同种型仍然能够相对于对照抑制表达。因此，对于每一同种型，对VEGF启动子的调节作用是相同的，而不管Sp1元件存在与否。651bp片段能够以竞争性方式抑制1305bp、936bp和447bp同种型从VEGF启动子的增强子效应。即引入增加量的651bp与通常上调从VEGF启动子表达的任何其他增强性同种型会导致增强子活性的竞争性抑制。

实施例5

来自651bp RTEF-1cDNA的多肽的显性失活转录活性

为了研究651bp同种型对其他RTEF-1同种型的VEGF启动子增强作用的影响，进一步开展了239T转染试验。简言之，细胞以所标明RTEF-1增强子表达构建体(即1305bp、936bp或447bp)、VEGF报告载体与651bp RTEF-1同种型表达质粒或者空载体对照转染。转染之后，通过以前描述的报告基因测定法测定VEGF启动子活性。这些研究的结果示于图4。在每一情况下，RTEF-1同种型(1305bp、936bp和447bp)对VEGF启动子活性的增强活性被共表达RTEF-1651bp同种型所抑制。

实施例6

RTEF-1 cDNA表达载体在细胞中产生预期的多肽

为了证实所标明的RTEF-1多肽在细胞内表达，293T细胞以对照(空载体)pcDNA表达载体或者对于1305bp、936bp、651bp或447bp cDNA序列的表达载体转染。转染之后，细胞裂解物通过使用抗RTEF-1抗血清的Western印迹分析。抗RTEF-1抗血清针对对应于全长序列中第2-14位氨基酸的RTEF-1肽产生。用于Western印迹的抗体定向RTEF-1表位，该表位相对于相关人TEA蛋白质是独特的，但是被所转染的每一种RTEF-1同种型所共有(图5A)。研究结果(图5B)证明，虽然来自651bp cDNA的多肽表达水平十分低，但是每一种预期RTEF-1多肽在所转染细胞中表达。

实施例7

RTEF-1在眼组织中的体内表达

进一步研究了RTEF-1同种型在正常灵长类眼睛组织中的表达。使用结合每一种蛋白质同种型的抗RTEF-1抗体开展的Western印迹分析证明RTEF-1在眼睛的某些组织中表达。RTEF-1表达在脉络膜中最高，在视网膜中最低(图6A)。所检测到的比75kD分子量标准迁移较慢的蛋白质产物似乎是全长RTEF-1(1305bp)同种型(图6A，上图)。迁移在23和25kD分子量标准之间的产物源于651bp同种型(图6A，下图)。

在进一步研究中，通过RT-PCR研究了RTEF-1同种型在CRAO模型中的表达。结果显示，相对于对照视网膜组织，全长(1305bp)RTEF-1RNA在CRAO视网膜中优先表达(图6B，比较泳道1和2)。

为了进一步评价眼组织中RTEF-1表达的细胞分布，通过使用RTEF-1结合抗体的免疫组织化学分析眼组织。结果证明RTEF-1在虹膜、睫状体、视神经和视网膜中表达(图7A-B)。

实施例8

RTEF-1同种型的定位

RTEF-1同种型(1305bp、651bp和447bp)分别克隆入带有融合至每一同种型羧基端的不同荧光蛋白的pMAX-FP-N载体中(Amaxa Inc，Gaithersburg，MD)。1305bp同种型与绿色荧光蛋白(GFP)融合，而651bp同种型与红色荧光蛋白(RFP)融合，447bp同种型与黄色荧光蛋白(YFP)融合。651bp同种型还克隆入带有hIL-2分泌信号和RMR运输模体的pHR-CMV-eGFP载体中，以产生ss-651-RMRRTEF-1-GFP融合蛋白。每一构建体通过测序分析验证。人293T细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度铺于6孔板中。细胞在添加10％FBS和1X浓度青霉素-链霉素-两性霉素的DMEM培养基中生长至80％汇合。每一构建体用Amaxa核转染仪II仪器(Amaxa Inc，Gaithersburg，MD)通过电穿孔转染入经处理的293T细胞中。细胞在37℃、5％CO₂下培养24小时。使用荧光显微镜观察所有转染反应的荧光活性，并且照相以记录RTEF-1蛋白质同种型的定位模式。

荧光显微镜分析证明，包含核定位信号的两种VEGF-增强子RTEF-1同种型(1305bp和447bp)定位至细胞核。此外，抑制性同种型651集中在细胞核外和周围的细胞质中。然而，发现带有hiL-2分泌信号序列和RMR运输模体的ss-651-RMR RTEF-1同种型定位在细胞核中。

为了证实RTEF-1同种型的定位模式，对于转染RTEF-1同种型的细胞的每一细胞部分开展western免疫印迹分析。对于这些研究，细胞以2μg RTEF-1同种型转染并生长24小时。然后将培养基换成无血清DMEM并且再生长48小时。分离并收集细胞部分。培养基以TCA处理以沉淀培养基中的所有残余蛋白质。不能区别三种同种型的RTEF-1特异性抗体以1/5000的浓度使用以检测RTEF-1蛋白质的存在。分析来自转染有pcDNA空载体或者1305bp、936bp、651bp、ss-651-RMR或447bp RTEF-1变体的pcDNA表达载体的细胞样品的核部分、细胞质部分和培养基。结果表明，VEGF增强子同种型1305bp和447bp通过结合至染色体DNA增加VEGF表达。然而，令人惊讶的是651bp RTEF-1显性失活同种型定位于细胞质，尽管它可以竞争性地抑制定位于细胞核内的增强子RTEF-1同种型的作用。

实施例9

在人眼黑素瘤细胞中存在RTEF-1蛋白质

VEGF是负责许多种眼新血管形成疾病发展和眼肿瘤建立的关键蛋白质。对调节VEGF基因表达的蛋白质的鉴定将有助于理解眼肿瘤的病因和进展。成人中最常见的眼内癌症是眼黑素瘤(OM)，其可以导致局部组织损伤、失明并且具有转移的倾向，转移对患者发病率和死亡率具有重大后果。

不同的人RTEF-1同种型能够有差别地增强从VEGF 5’近端启动子区表达。由于VEGF上调介导血管发生、炎症和肿瘤进展，发明人相信RTEF-1会在血管化人眼肿瘤诸如黑素瘤，和可能的其他非眼肿瘤的发展和恶化中起作用。发明人通过免疫组织化学方法研究了RTEF-1蛋白质是否存在于人眼黑素瘤细胞中。具有黑素瘤肿瘤的人眼睛切片用识别人RTEF-1蛋白质(但是不区分三种同种型)的抗体染色。使用显微镜检查带有切片的载玻片。结果证明RTEF-1蛋白质(作为红色染色观察)存在于人眼黑素瘤细胞内。黑素瘤细胞由于存在黑色素看上去是棕色。染成红色和棕色的细胞是具有RTEF-1蛋白质的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞中的高水平的RTEF-1表明RTEF-1可以上调这些细胞中的VEGF基因，并且促进细胞增殖和肿瘤扩散。

因此，使用651bp RTEF-1同种型可以用于抑制这些黑素瘤细胞细胞中的VEGF表达和抑制该类型眼肿瘤的生长。651bp RTEF-1同种型的应用可以有益于依赖于VEGF刺激肿瘤扩散的其他癌症的治疗。

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本文公开和请求保护的所有组合物和方法可以按照本公开无需过度的实验即可产生和执行。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的方式描述，但是可以在不脱离本发明概念、精神和范围的情况下对本文所述组合物和方法以及和方法的步骤或顺序做更改，这对本领域技术人员而言是显而易见的。更加具体而言，显而易见的是，某些化学和生理相关的试剂可以代替本文所述的试剂而可以达到相同或相似的结果。所有此类对本发明技术人员显而易见的相似替代和修改认为处于如后附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之中。

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特雷弗·麦可法兰德

本诺伊·阿普库坦

<120>RTEF-1变体及其用于抑制血管发生的用途

<130>CLFR：275WO

<140>未知

<141>2008-06-06

<150>60/942,249

<151>2007-06-06

<160>23

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>436

<212>PRT

<213>人

<400>1

Leu Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn Asp Gly Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu

35 40 45

Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly Arg Asn Glu Leu

65 70 75 80

Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr Arg Thr Arg Lys

85 90 95

Gln Val Ser Ser His Ile Gln Val Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg Glu

100 105 110

Ile Gln Ala Lys Leu Lys Asp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Ala Leu Gln

115 120 125

Ser Met Ala Ala Met Ser Ser Ala Gln Ile Ile Ser Ala Thr Ala Phe

130 135 140

His Ser Ser Met Arg Leu Ala Arg Gly Pro Gly Arg Pro Ala Val Ser

145 150 155 160

Gly Phe Trp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Gln Ala Glu Thr Ser His Asp

165 170 175

Val Lys Pro Phe Ser Gln Gln Thr Tyr Ala Val Gln Pro Pro Leu Pro

180 185 190

Leu Pro Gly Phe Glu Ser Pro Ala Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Ala

195 200 205

Pro Pro Ala Pro Pro Trp Gln Gly Arg Arg Arg Gly Ser Ser Lys Leu

210 215 220

Trp Met Leu Glu Phe Ser Ala Phe Leu Glu Gln Gln Gln Asp Pro Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Asn Lys His Leu Phe Val His Ile Gly Gln Ser Ser Pro Ser

245 250 255

Tyr Leu Arg Pro Tyr Leu Glu Ala Val Asp Ile Arg Gln Ile Tyr Asp

260 265 270

Lys Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp Leu Phe Glu Arg Gly

275 280 285

Pro Ser Asn Ala Phe Phe Leu Val Lys Phe Trp Ala Asp Leu Asn Thr

290 295 300

Asn Leu Leu Glu Glu Asp Glu Gly Ser Ser Phe Tyr Gly Val Ser Ser

305 310 315 320

Gln Tyr Glu Ser Pro Glu Asn Met Ile Ile Thr Cys Ser Thr Lys Val

325 330 335

Cys Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys Val Glu Thr Glu Tyr Ala

340 345 350

Arg Tyr Glu Asn Gly His Tyr Ser Tyr Arg Ile His Arg Ser Pro Leu

355 360 365

Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys His Leu Pro Glu

370 375 380

Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile Leu Gln Val

385 390 395 400

Val Thr Asn Arg Asp Thr Gln Glu Thr Leu Leu Cys Ile Ala Tyr Val

405 410 415

Phe Glu Val Ser Ala Ser Glu His Gly Ala Gln His His Ile Tyr Arg

420 425 430

Leu Val Lys Glu

435

<210>2

<211>311

<212>PRT

<213>人

<400>2

Leu Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn Asp Gly Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu

35 40 45

Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly Arg Asn Glu Leu

65 70 75 80

Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr Arg Thr Arg Lys

85 90 95

Gln Val Ser Ser His Ile Gln Val Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg Glu

100 105 110

Ile Gln Ala Lys Leu Lys Tyr Asn Lys His Leu Phe Val His Ile Gly

115 120 125

Gln Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Arg Pro Tyr Leu Glu Ala Val Asp Ile

130 135 140

Arg Gln Ile Tyr Asp Lys Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp

145 150 155 160

Leu Phe Glu Arg Gly Pro Ser Asn Ala Phe Phe Leu Val Lys Phe Trp

165 170 175

Ala Asp Leu Asn Thr Asn Ile Glu Asp Glu Gly Ser Ser Phe Tyr Gly

180 185 190

Val Ser Ser Gln Tyr Glu Ser Pro Glu Asn Met Ile Ile Thr Cys Ser

195 200 205

Thr Lys Val Cys Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys Val Glu Thr

210 215 220

Glu Tyr Ala Arg Tyr Glu Asn Gly His Tyr Ser Tyr Arg Ile His Arg

225 230 235 240

Ser Pro Leu Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys His

245 250 255

Leu Pro Glu Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile

260 265 270

Leu Gln Val Val Thr Asn Arg Asp Thr Gln Glu Thr Leu Leu Cys Ile

275 280 285

Ala Tyr Val Phe Glu Val Ser Ala Ser Glu His Gly Ala Gln His His

290 295 300

Ile Tyr Arg Leu Val Lys Glu

305 310

<210>3

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<212>PRT

<213>人

<400>3

Leu Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn Asp Gly Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu

35 40 45

Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly Arg Asn Glu Leu

65 70 75 80

Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr Ser Ser Phe Tyr

85 90 95

Gly Val Ser Ser Gln Tyr Glu Ser Pro Glu Asn Met Ile Ile Thr Cys

100 105 110

Ser Thr Lys Val Cys Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys Val Glu

115 120 125

Thr Glu Tyr Ala Arg Tyr Glu Asn Gly His Tyr Ser Tyr Arg Ile His

130 135 140

Arg Ser Pro Leu Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys

145 150 155 160

His Leu Pro Glu Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr

165 170 175

Ile Leu Gln Val Val Thr Asn Arg Asp Thr Gln Glu Thr Leu Leu Cys

180 185 190

Ile Ala Tyr Val Phe Glu Val Ser Ala Ser Glu His Gly Ala Gln His

195 200 205

His Ile Tyr Arg Leu Val Lys Glu

210 215

<210>4

<211>148

<212>PRT

<213>人

<400>4

Leu Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn Asp Gly Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu

35 40 45

Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly Arg Asn Glu Leu

65 70 75 80

Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr Arg Thr Arg Lys

85 90 95

Gln Val Ser Ser His Ile Gln Val Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg Glu

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Ile Gln Ala Lys Leu Lys Phe Trp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Gln Ala

115 120 125

Glu Thr Ser His Asp Val Lys Pro Phe Ser Gln His His Ile Tyr Arg

130 135 140

Leu Val Lys Glu

145

<210>5

<211>76

<212>PRT

<213>人

<400>5

Leu Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn Asp Ala Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu

35 40 45

Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly

65 70 75

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>人

<400>6

Arg Asn Glu Leu Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr

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Arg Thr Arg Lys Gln

20

<210>7

<211>21

<212>PRT

<213>人

<400>7

Val Ser Ser His Ile Gln Val Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg Glu Ile

1 5 10 15

Gln Ala Lys Leu Lys

20

<210>8

<211>43

<212>PRT

<213>人

<400>8

Asp Gln Ala Ala Lys Asp Lys Ala Leu Gln Ser Met Ala Ala Met Ser

1 5 10 15

Ser Ala Gln Ile Ile Ser Ala Thr Ala Phe His Ser Ser Met Ala Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Pro Gly Arg Pro Ala Val Ser Gly

35 40

<210>9

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>9

Phe Trp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Gln Ala Gly Thr Ser His Asp

1 5 10 15

<210>10

<211>19

<212>PRT

<213>人

<400>10

Val Lys Pro Phe Ser Gln Gln Thr Tyr Ala Val Gln Pro Pro Leu Pro

1 5 10 15

Leu Pro Gly

<210>11

<211>46

<212>PRT

<213>人

<400>11

Phe Glu Ser Pro Ala Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Ala Pro Pro Ala

1 5 10 15

Pro Pro Trp Gln Gly Arg Ser Val Ala Ser Ser Lys Leu Trp Met Leu

20 25 30

Glu Phe Ser Ala Phe Leu Glu Gln Gln Gln Asp Pro Asp Thr

35 40 45

<210>12

<211>58

<212>PRT

<213>人

<400>12

Tyr Asn Lys His Leu Phe Val His Ile Gly Gln Ser Ser Pro Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Asp Pro Tyr Leu Glu Ala Val Asp Ile Arg Gln Ile Tyr Asp Lys

20 25 30

Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp Leu Phe Glu Arg Gly Pro

35 40 45

Ser Asn Ala Phe Phe Leu Val Lys Phe Trp

50 55

<210>13

<211>47

<212>PRT

<213>人

<400>13

Ala Asp Leu Asn Thr Asn Ile Glu Asp Glu Gly Ser Ser Phe Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Ser Gln Tyr Glu Ser Pro Glu Asn Met IleIle Thr Cys Ser

20 25 30

Thr Lys Val Cys Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys Val Glu

35 40 45

<210>14

<211>51

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<213>人

<400>14

Thr Glu Tyr Ala Arg Tyr Glu Asn Gly His Tyr Ser Tyr Arg Ile His

1 5 10 15

Arg Ser Pro Leu Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys

20 25 30

His Leu Pro Glu Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr

35 40 45

Ile Leu Gln

50

<210>15

<211>37

<212>PRT

<213>人

<400>15

Val Val Thr Asn Arg Asp Thr Gln Glu Thr Leu Leu Cys Ile Ala Tyr

1 5 10 15

Val Phe Glu Val Ser Ala Ser Glu His Gly Ala Gln His His Ile Tyr

20 25 30

Arg Leu Val Lys Glu

35

<210>16

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>16

Met Glu Arg Met Ser Asp Ser Ala Asp Lys Pro Ile Asp Asn

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<210>17

<211>39

<212>PRT

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Met Gly Glu Pro Arg Ala Gly Ala Ala Leu Asp Asp Gly Ser Gly Trp

1 5 10 15

Thr Gly Ser Glu Glu Gly Ser Glu Glu Gly Thr Gly Gly Ser Glu Gly

20 25 30

Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro

35

<210>18

<211>29

<212>PRT

<213>人

<400>18

Met Ala Ser Asn Ser Trp Asn Ala Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ala Arg

1 5 10 15

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<210>19

<211>37

<212>PRT

<213>人

<400>19

Met Glu Gly Thr Ala Gly Thr Ile Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Pro Glu Gly Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Ala Leu Asp

20 25 30

Lys Pro Ile Asp Asn

35

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工引物

<400>20

ttggagggca cggccggca 19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工引物

<400>21

tcattctttc accagcctgt a 21

<210>22

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>22

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工引物

<400>23

Arg Met Arg Arg Met Arg Arg Met Arg Arg

1 5 10

Claims

1.包含具有一个或多个内部缺失的RTEF-1氨基酸序列的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF启动子活性，RTEF-1氨基酸序列包含由RTEF-1外显子2、3、10、11和12编码的氨基酸、由外显子3和10编码的氨基酸的部分缺失、和由RTEF-1外显子4、5、6、7、8和9编码的氨基酸的缺失，其中所述多肽的序列示于SEQ ID NO:3。

2.包含具有一个或多个内部缺失的RTEF-1氨基酸序列的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF启动子活性，RTEF-1氨基酸序列包含由RTEF-1外显子2、3、10、11和12编码的氨基酸、由外显子3和10编码的氨基酸的部分缺失、和由RTEF-1外显子4、5、6、7、8和9编码的氨基酸的缺失，其中所述多肽通过将SEQ ID NO:3与分泌信号序列相连接而形成。

3.包含具有一个或多个内部缺失的RTEF-1氨基酸序列的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF启动子活性，RTEF-1氨基酸序列包含由RTEF-1外显子2、3、10、11和12编码的氨基酸、由外显子3和10编码的氨基酸的部分缺失、和由RTEF-1外显子4、5、6、7、8和9编码的氨基酸的缺失，其中所述多肽通过将SEQ ID NO:3与细胞内化部分相连接而形成。

4.权利要求3的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中内化部分是肽、适体或者高亲合性多聚体。

5.权利要求4的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中肽是多肽。

6.权利要求4或5的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中内化部分包含来自HIV tat、HSV-1间层蛋白VP22或果蝇属触角蛋白的内化序列。

7.权利要求4或5的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中内化部分包含聚精氨酸、聚甲硫氨酸和/或聚甘氨酸肽。

8.权利要求3的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中内化部分的氨基酸序列为RMRRMRRMRR，示于SEQ ID NO:23。

9.权利要求3的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中内化部分是抗体。

10.权利要求9的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中抗体内化部分是IgA、IgM、IgE、IgG、Fab、F(ab’)2、单链抗体或互补位肽。

11.包含具有一个或多个内部缺失的RTEF-1氨基酸序列的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF启动子活性，RTEF-1氨基酸序列包含由RTEF-1外显子2、3、10、11和12编码的氨基酸、由外显子3和10编码的氨基酸的部分缺失、和由RTEF-1外显子4、5、6、7、8和9编码的氨基酸的缺失，其中所述多肽通过将SEQ ID NO:3与细胞分泌信号和细胞内化部分相连接而形成。

12.权利要求11的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中分泌信号序列为人IL-2分泌信号序列，示于SEQ ID NO:22。

13.权利要求12的分离的RTEF-1显性失活多肽，其中所述多肽通过将SEQID NO:3与SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23相连接而形成。

14.分离的核酸序列，其编码权利要求1-13任一项的RTEF-1显性失活多肽。

15.核酸表达盒，包含权利要求14的分离的核酸序列。

16.权利要求15的核酸表达盒，其中表达盒包含细胞类型特异性或可诱导启动子。

17.权利要求16的核酸表达盒，其中可诱导启动子是低氧可诱导启动子。

18.权利要求16的核酸表达盒，其中可诱导启动子是血管发生可诱导启动子。

19.权利要求15的核酸表达盒，还包含第二抗血管发生基因。

20.病毒表达载体，包含权利要求14的分离的核酸序列。

21.权利要求20的病毒表达载体，其中病毒表达载体是腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、SV-40、反转录病毒或痘苗病毒载体。

22.权利要求21的病毒表达载体，其中病毒表达载体是腺伴随病毒。

23.权利要求21的病毒表达载体，其中病毒表达载体是慢病毒表达载体。

24.权利要求23的病毒表达载体，其中慢病毒表达载体是HIV载体。

25.权利要求20的病毒表达载体，还包含第二抗血管发生基因。

26.有效量的治疗组合物在制备用于治疗患有血管生成性病症患者的药物中的用途，所述治疗组合物包含权利要求1-13任一项的RTEF-1显性失活多肽或者权利要求15-19任一项的核酸表达盒或权利要求20-25任一项的病毒表达载体。

27.权利要求26的用途，其中血管生成性病症是眼新血管形成、动静脉畸形、冠状动脉再狭窄、外周血管再狭窄、肾小球肾炎或风湿性关节炎。

28.权利要求27的用途，其中血管生成性病症是眼新血管形成。

29.权利要求26的用途，其中病症是黄斑变性、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早产儿视网膜病变或糖尿病视网膜病变。

30.权利要求29的用途，其中病症是年龄相关的黄斑变性。

31.权利要求26的用途，其中所述治疗组合物与第二抗血管生成治疗联合。

32.权利要求31的用途，其中第二抗血管生成治疗是结合VEGF、VEGF受体、FGF、FGF受体、贝伐单抗、兰尼单抗或哌加他尼钠的抗体。

33.权利要求26的用途，其中血管生成性病症是癌症。

34.权利要求33的用途，其中癌症是转移癌。

35.权利要求33的用途，其中癌症是膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、食道癌、眼睛癌、肠胃道癌、牙龈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。

36.权利要求33的用途，其中癌症是胃癌。

37.权利要求33的用途，其中癌症是结肠癌。

38.权利要求33的用途，其中癌症是眼黑素瘤。

39.权利要求33的用途，其中所述治疗组合物与第二抗癌治疗联合。

40.权利要求39的用途，其中第二抗癌治疗是化学疗法、手术疗法、免疫疗法或放射疗法。

41.权利要求26的用途，其中患者是人。

42.权利要求26的用途，其中治疗组合物包含权利要求1-13任一项的RTEF-1显性失活多肽。

43.权利要求26的用途，其中治疗组合物包含权利要求15-19任一项的核酸表达盒或权利要求20-25任一项的病毒表达载体。

44.权利要求26的用途，其中治疗组合物适于全身施用。

45.权利要求26的用途，其中治疗组合物适于局部施用。

46.权利要求26的用途，其中治疗组合物适于施用至眼睛。

47.权利要求46的用途，其中治疗组合物适于局部地或者眼内注射施用至眼睛。

48.权利要求47的用途，其中治疗组合物适于作为滴眼剂施用。

49.治疗组合物，其包含根据权利要求1-13任一项的RTEF-1显性失活多肽或编码所述多肽的核酸表达载体。