CN116375883A - 重组car元件及其在her2阳性肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用。本发明提供的靶向HER2基因的CAR元件，增加有CD147胞内段和iCaspse9基因，增加了MMPs的分泌，进而降解肿瘤周围坚硬的基质，促进其他免疫细胞的浸润。在治疗结束或治疗中途发现毒副作用时，还可以快速启动多余CAR‑单核/巨噬细胞自杀。来源于THP1细胞系的CAR‑单核/巨噬细胞同时也扩增了细胞来源，为HER2阳性肿瘤的临床治疗提供了有效参考。

Description

重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用。

背景技术

近年来细胞免疫治疗势如破竹，迄今为止已有多种嵌合受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T)治疗产品获得美国食品药物管理局批准上市。而嵌合抗原受体(CAR)免疫细胞治疗淋巴母细胞白血病和B淋巴瘤的成功，促进了更多针对CD19以外的特定肿瘤抗原的CAR产品的发展。在这些CAR候选细胞中，anti-HER2 CAR细胞(HER2-CAR)是市场应用最成熟的细胞，其中的原癌基因：人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowth factor receptor-2，HER2)基因，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185kD的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。大量研究表明，HER2基因的过表达与多种人类恶性肿瘤相关，是目前公认的肿瘤相关抗原，并且已经应用于肿瘤治疗20多年。

但目前嵌合受体T细胞疗法仍主要用于血液系统恶性肿瘤的治疗。这主要是因为实体瘤自身致密的细胞和基质屏障，使得CAR-T细胞难以进入肿瘤内部而极大限制了其疗效的发挥。研究表明，髓系来源的单核/巨噬细胞可以穿透肿瘤周围致密基质组织，并在瘤内富集。并且巨噬细胞在直接杀伤肿瘤的同时，又能通过抗原呈递增强适应性免疫应答，这些特点使巨噬细胞成为抗肿瘤细胞疗法开发的独特选择。尝试将髓系来源的单核/巨噬细胞作为CAR蛋白的宿主，开发针对实体瘤的嵌合受体免疫疗法具有非常重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用。本发明提供的靶向HER2的重组CAR元件，能够使单核/巨噬细胞杀伤肿瘤细胞。

本发明提供了一个靶向HER2基因的CAR元件，其结构包括特异性HER2抗体的单链可变区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

所述胞外铰链区为CD8a铰链区；

所述胞内信号域为CD3ζ胞内段和CD147胞内段。

进一步的，所述CAR元件自N端至C端依次为：

HER2抗体轻链Fab端-Linker-HER2抗体重链Fab端-CD8a铰链区-跨膜区域-CD3ζ胞内段-CD147胞内段。

本发明提供的CAR元件能够靶向HER2基因，同时增加的CD147胞内段，使其在促ADCP的同时促进CAR-单核细胞的MMPs分泌，从而降解肿瘤基质，协助T细胞瘤内浸润。相比于其他结构的CAR元件，本发明所述的CAR元件能够更有效杀伤肿瘤细胞，且具有安全性，能够可持续性供应。

本发明提供的所述CAR元件，具体的，

所述HER2抗体轻链Fab端的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Linker(G₄S₁)₃的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述HER2抗体重链Fab端的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述跨膜区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述CD3ζ胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述CD147胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明所述的CAR元件，其全长氨基酸序列为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCYEKRRKPEDVLDDDDAGSAPLKSSGQHQNDKGKNVRQRNSSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

本发明提供了编码所述CAR元件的核酸。具体的，

编码所述HER2抗体轻链Fab端的核酸序列如SEQ ID NO:9所示；

编码所述Linker(G₄S₁)₃的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；

编码所述HER2抗体重链Fab端的核酸序列如SEQ ID NO:11所示；

编码所述CD8a铰链区的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

编码所述跨膜区域的核酸序列如SEQ ID NO:13所示；

编码所述CD3ζ胞内段的核酸序列如SEQ ID NO:14所示；

编码所述CD147胞内段的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。

本发明所述的CAR元件，其全长核酸序列为：

gacatccagatgacccagtctccgtcttctctgtctgcttctgttggtgaccgtgttaccatcacctgccgtgcttctcaggacgttaacaccgctgttgcttggtaccagcagaaaccgggtaaagctccgaaactgctgatctactctgcttctttcctgtactctggtgttccgtctcgtttctctggttctcgttctggtaccgacttcaccctgaccatctcttctctgcagccggaagacttcgctacctactactgccagcagcactacaccaccccgccgaccttcggtcagggtaccaaagttgaaatcaaaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaagttcagctggttgaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgctgcttctggtttcaacatcaaagacacctacatccactgggttcgtcaggctccgggtaaaggtctggaatgggttgctcgtatctacccgaccaacggttacacccgttacgctgactctgttaaaggtcgtttcaccatctctgctgacacctctaaaaacaccgcttacctgcagatgaactctctgcgtgctgaagacaccgctgtttactactgctctcgttggggtggtgacggtttctacgctatggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttctaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgctacgagaagcgccggaagcccgaggacgtcctggatgatgacgacgccggctctgcacccctgaagagcagcgggcagcaccagaatgacaaaggcaagaacgtccgccagaggaactcttccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

本发明中，所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。

本发明提供了所述CAR元件的包装载体，其包括骨架载体和所述的CAR元件。

本发明所述的包装载体，能够将核酸或者蛋白包被起来，传递至培养的细胞或者人体内，具有递送遗传物质的功能，其可以是病毒载体也可以是质粒载体，其中病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒；质粒载体包括原核载体和真核载体。在本发明的实施例中，选择慢病毒载体构建CAR元件的包装载体，再用HEK-293FT细胞包装慢病毒。一些具体实施方式中，所述慢病毒载体为PCDH。

iCaspse9基因能够诱发细胞的自杀机制，防止THP-1无限生长，彻底清除治疗后体内残留的THP1，避免产生不必要的毒副作用。本发明将iCaspse9基因引入靶向HER2基因的CAR-免疫细胞的构建。本发明中，所述iCaspse9的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述iCaspse9基因的核酸序列如SEQ IDNO:16所示。

一些实施方式中，iCaspse9基因位于所述CAR元件的包装载体中。即，所述CAR元件的包装载体中还包括iCaspse9基因。

另一些实施例中，iCaspse9基因位于另一个的质粒中，与所述CAR元件的包装载体组成质粒组合。所述iCaspse9质粒包括依次连接的iCaspse9片段基因、linker和报告基因。

本发明所述的质粒组合中，包括两个质粒，分别为CAR质粒：PCDH-EF1A-HER2抗体轻链Fab端-Linker(G₄S₁)₃-HER2抗体重链Fab端-CD8a铰链区-跨膜区域-CD3ζ胞内段-CD147胞内段，和iCaspse9质粒：PCDH-EF1A-iCaspse9-furin P2A-ZsGreen。

本发明所述质粒组合还包括慢病毒转染辅助质粒。所述慢病毒转染辅助质粒分别包含不同的元件，能够提高病毒在体内的安全性。在本发明的实施例中，所述慢病毒转染辅助质粒为商品化慢病毒包装质粒，其包括但不限于PLP1、PLP2和PLP-VSVG。

本发明提供了转化或转染如前所述CAR元件、包装载体或质粒组合的宿主。所述为免疫细胞或原核细胞。本发明中，所述原核细胞用于编码CAR元件核酸的保存和扩增。所述免疫细胞用于制备治疗肿瘤的药物。本发明中，所述免疫细胞选自为T细胞、NK细胞、髓系来源的单核或巨噬细胞。

本发明所述的表达宿主，能够在体内稳定表达外源DNA，其包括动物细胞、植物细胞、微生物细胞、细菌和酵母。在本发明的实施例中，选择髓系来源的单核或巨噬细胞作为CAR元件、包装载体或质粒组合的表达宿主。一些具体实施例中，所述髓系来源的单核或巨噬细胞为人类髓系来源的单核或巨噬细胞。

本发明中，CAR元件、包装载体或质粒组合转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。在一些具体的实施例中，本发明通过病毒转染方式进行所述宿主的构建。

本发明提供的CAR元件、包装载体或质粒组合转染或转化进入宿主细胞后，能够持续性高表达，并且不会影响宿主的增殖与非特异性吞噬杀伤。

本发明提供了所述靶向HER2基因的CAR元件、核酸、包装载体、质粒组合或表达宿主在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明中，所述肿瘤可为HER2阳性肿瘤或非HER2阳性肿瘤，或者，所述肿瘤为实体瘤或非实体瘤。所述实体瘤包括：乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌；所述非实体瘤选自胶质瘤、白血病和/或淋巴瘤。

具体的，在本发明的实施例中，将表达质粒组合的单核细胞与HER2阳性的SKOV3卵巢癌细胞共培养，探究其对HER2阳性肿瘤的作用。结果表明CAR单核细胞可以靶向吞噬与杀伤肿瘤细胞，CD147元件促进了MMPs分泌，进而增加了CAR单核细胞的侵袭和迁移能力。

本发明还提供了靶向HER2基因的CAR-免疫细胞，其包括本发明所述的CAR元件、核酸、包装载体、质粒组合或表达宿主。

本发明还提供了靶向HER2基因的药物，其包括本发明所述的CAR-免疫细胞，还包括药学上可接受的辅料。

本发明所述的药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、金属离子螯合剂、抑菌剂或等渗调节剂。

本发明提供的靶向HER2基因的药物，其剂型包括但不限于溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬性、气体分散型、微粒分散性或固体分散型。

具体的，在本发明的实施例中，所述靶向HER2基因的药物剂型为溶液型或混悬型，其辅料包括但不限于注射用水、盐酸、亚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、苯酚或氯化钠。

本发明还提供了治疗HER2阳性肿瘤的方法，其包括给予本发明所述的药物；给药方式为注射给药。

本发明提供的包含有重组CAR元件的CAR-单核/巨噬细胞来源于永生化人单核细胞系THP-1，克服了CAR-单核/巨噬细胞来源不足的缺陷，在治疗HER2阳性肿瘤时，能够增加MMPs的分泌，进而降解肿瘤周围坚硬的基质，促进其他免疫细胞的浸润，解决了CAR-T在实体瘤中应用局限，浸润不足的问题；在治疗完毕后或治疗中途发现毒副作用时，增加的iCaspse9自杀基因能够快速启动多余CAR-单核/巨噬细胞自杀，减少了毒副作用的产生。

附图说明

图1示iCaspse9基因表达效率分析图；

图2示CAR元件表达效率分析图；

图3示CAR元件安全性分析；

图4示给予不同浓度药物AP1903后，CAR细胞30min内的自杀效率；

图5示给予20nM药物AP1903后，CAR细胞14天内的自杀效率；

图6示MMP13含量检测图；

图7示CAR细胞的侵袭和迁移能力染色图；

图8示CAR细胞靶向吞噬与杀伤肿瘤细胞能力分析图。

具体实施方式

本发明提供了重组CAR元件及其在HER2阳性肿瘤中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1拥有自杀功能的iCasp9-THP1构建

1、质粒构建

具体片段如前所述，将iCaspse9基因与CAR元件分别插入商业化慢病毒载体PCDH骨架中(淼灵生物，中国)，置于EF1A启动子下，形成PCDH-EF1A-iCasp9-furin P2A-ZsGreen(简称iCasp9质粒)和PCDH-EF1A-HER2抗体轻链Fab端-Linker(G4S1)3-HER2抗体重链Fab端-CD8a铰链区-跨膜区域-CD3ζ胞内段-CD147胞内段(简称CAR质粒)表达质粒。

2、细胞培养条件

THP1(ATCC，美国)使用RPMI-1640(Gibco，美国)培养基，HEK-293FT(ATCC，美国)使用DMEM(Gibco，美国)培养基，SKOV3(ATCC，美国)使用DMEM培养基。所有培养基均需添加10％(v/v)FBS和100U/mL的青霉素/链霉素双抗(索莱宝，中国)。

3、包病毒

选择状态良好的HEK-293FT细胞，待其生长融合至80％～90％时开始用于病毒包装工作。具体如下：

针对10mm细胞培养皿培养体系而言:

(1)、500μL Opti-MEM(Gibco，美国)+PEI MAX 40000(Polysciences Inc.美国)42μg，充分混匀，室温静置20min。

(2)、500μL Opti-MEM(Gibco，美国)+病毒包装系统(PLP1 3.6μg+PLP2 3.6μg+PLP-VSVG 1.8μg)+iCaspse9质粒5μg，混合均匀，室温静置20min。

(3)、待上述复合物准备完毕后，将1中复合物加入2中，并混合均匀，继续室温静置20min。

(4)、将准备好的复合物加入HEK-293FT中(原培养基体积8mL)，37℃，5％ CO₂孵箱培养48h后，取上清，即为病毒上清。

4、感染目标细胞

选择状态良好的THP1细胞，待其达到指数生长期时，进行病毒感染使其表达iCaspse9基因，操作如下：

(1)、1*10^{^6}个THP1细胞+2mL含iCaspse9病毒上清+8μg/mL poly-brene(Sigma-Aldrich,美国)，37℃，5％CO₂孵箱培养48h后，获得高表达iCaspse9的THP1细胞。

(2)、添加含嘌呤霉素(终浓度1μg/mL，碧云天，中国)的完全培养基，继续培养1周，获得稳定高表达iCaspse9的THP1细胞(简称iCaspse9-THP1)。

5、iCaspse9表达效率分析

由于iCaspse9质粒中存在zsGreen片段(绿色荧光)，因此可以通过检测zsGreen荧光强度间接检测iCaspse9表达情况。通过流式GFP通道检测zsGreen表达效率，结果如图1所示。

结果表明，稳转后iCaspse9持续性高表达，至感染后30天仍然存在。实施例2同时拥有特异性吞噬功能与自杀功能的CAR-THP1构建

1、设计CAR骨架

不同元件排列组合后进行吞噬率分析(每组3个重复)，结果见表1。

表1

结果表明，CAR骨架组合为Car-CD3z-CD147时，对肿瘤细胞的吞噬率最高。

2、构建CAR骨架

2.1、包病毒

选择状态良好的HEK-293FT细胞，待其生长融合至80～90％时开始用于病毒包装工作。具体如下：

针对10mm细胞培养皿培养体系而言:

(1)、500μL Opti-MEM(Gibco，美国)+PEI MAX 40000(Polysciences Inc.美国)42μg，充分混匀，室温静置20min。

(2)、500μL Opti-MEM(Gibco，美国)+病毒包装系统(PLP1 3.6μg+PLP2 3.6μg+PLP-VSVG 1.8μg)+CAR质粒5μg，混合均匀，室温静置20min。

(3)、待上述复合物准备完毕后，将1中复合物加入2中，并混合均匀，继续室温静置20min。

(4)、将准备好的复合物加入HEK-293FT中(原培养基体积8mL)，37℃，5％ CO₂孵箱培养48h后，取上清，即为病毒上清。

2.2、感染目标细胞

选择状态良好的iCaspse9-THP1细胞，待其达到指数生长期时，进行病毒感染使其表达CAR元件，操作如下：

1*10^{^6}个iCaspse9-THP1细胞+2mL含CAR元件病毒上清+8μg/mL poly-brene(Sigma-Aldrich,美国)，37℃，5％CO₂孵箱培养48h后，获得高表达CAR元件与iCaspse9基因的THP1细胞(简称CAR-THP1)。

3、CAR表达效率分析

流式染色分析，具体操作如下：

取2*10^{^5}个CAR-THP1及其对照细胞，首先利用FcR-Block(BD,美国)室温封闭10min，尽可能降低非特异背景，而后添加Bion-proteinL 0.2μL,4℃孵育40min,用PBS400g x 6min清洗2次后，再次添加Streptavidin-PE(BD，美国)0.5μL,室温孵育15min，而后用PBS 400g x 6min清洗2次后上机，利用流式PE通道进行检测，并以相同染色处理的对照THP1细胞为对照，评估CAR-THP1细胞表达程度，结果如图2所示。

结果表明，稳转后CAR持续性高表达。

实施例3安全性分析

1、不影响THP1细胞增殖

首先，利用EdU参入实验进行增殖分析增殖，具体实验步骤如下：

选择生长状态良好的细胞进行铺板24孔板)，每孔铺1*10^{^5}个细胞，并通过低血清培养体系即1％FBS/1640对细胞进行饥饿24h，次日更换为完全培养液即10％ FBS/1640，并以1：1000比例添加EdU，使其在S期DNA合成期掺入DNA链中。在37℃，5％CO₂孵箱中继续培养2～3h后收细胞，并根据EdU掺入实验检测试剂盒(凯基，中国)说明书进行后续染色操作，最后在流式上通过PE通道检测EdU参入效率。

2、不影响THP1细胞非特异吞噬

非特异吞噬实验,具体步骤如下：

选择生长状态良好的细胞进行铺板(24孔板)，每孔铺1*10^{^5}个细胞，并添加1.5μL偶联有APC的荧光微球(Sigma-Aldrich，美国)，37℃，5％CO₂孵箱中继续培养4h后收细胞，利用流式检测APC阳性细胞比例，即为非特异吞噬荧光微球的单核细胞比例。结果如图3所示。

结果表明，该CAR元件不会影响THP1的增殖与非特异性吞噬杀伤。

实施例4功能评估

1、自杀效率分析

选择生长状态良好的细胞进行铺板(24孔板)，每孔铺1*10^{^5}个细胞，并添加不同浓度AP1903小分子药物(即0，5，10，20，40，80，100，120，160nM)与细胞共培养30min后，按照凋亡试剂盒(凯基，中国)说明书，进行凋亡染色，而后用流式检测细胞凋亡率。此外以20nMAP1903单次给药，并作用不同时间点(即0min，30min,1h，2h,4h,6h,8h,12h,24h,48h,72h,7days,14days)后，用相同方法进行凋亡染色与检测。结果如图4、图5所示。

结果表明，给予AP1903后在30min内可以快速启动自杀，体外单次给药后，可以稳定自杀，14天内未见到细胞回复或存活。

2、MMPs分泌能力分析

由于MMP13是MMPs家族中在CD147信号活化后上升最显著的蛋白，因为重点检测CAR-细胞活化后MMP13分泌。选择生长状态良好的细胞进行铺板(24孔板)，每孔铺1*10^{^5}个细胞，并添加0.5ug/mL HER2蛋白共培养24小时后，收集细胞上清，按照ProteinTechMMP13-ELISA试剂盒操作说明书进行MMP13检测。结果如图6所示。

由于MMPs分泌会促进细胞侵袭和迁移，因此检测CAR细胞的侵袭和迁移能力。选择生长状态良好的细胞进行铺板，每孔裹胶的Transwell上室(24孔板规格)铺2*10^{^5}个细胞，并控制上室完全培养基体积为200uL，而下室补完全培养基600uL,并添加PMA进行单核巨噬细胞分化诱导，37℃，5％CO₂孵箱中继续48h后，弃上下室内完全培养基，将上室补为2％FBS/1640低血清培养基200uL,并维持HER2蛋白(孚博生物，中国)终浓度为0.5ug/mL进行刺激活化，而下室部位20％ FBS/1640高血清培养基600uL，37℃，5％CO₂孵箱中继续培养24h后，取出上室，用4％多聚甲醛固定20min后，用结晶紫染色3min，并用棉签温柔除去上室内层未穿越的细胞，流动清水洗净，最后在显微镜下，以观察CAR-THP1侵袭迁移程度。结果如图7所示。

结果表明，CAR细胞活化后促进了MMP13分泌，进而增加CAR-单核细胞的侵袭和迁移能力。

3、特异性吞噬能力分析

在SKOV3卵巢癌细胞中的应用

取1mM APC-cell tracker(赛默飞，美国)或CFSE(碧云天，中国)与细胞在无血清情况下在37℃，5％CO₂孵箱中共培养15min,而后用完全培养液终止15min，PBS清洗2遍，便得到荧光标记好的细胞。

选择APC荧光标记的SKOV3细胞与CFSE标记的单核细胞共培养以1：1和1：4例在37℃，5％CO₂孵箱中共培养24h，而后收集混合细胞，通过流式分析CFSE阳性细胞中APC阳性细胞比例以评估单核细胞吞噬效率。结果如图8所示。

结果表明，与HER2阳性的SKOV3卵巢癌细胞共培养后，CAR单核细胞可以靶向吞噬与杀伤肿瘤细胞。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.靶向HER2基因的CAR元件，其特征在于，其结构包括特异性HER2抗体的单链可变区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域；

所述胞外铰链区为CD8a铰链区；

所述胞内信号域为CD3ζ胞内段和CD147胞内段。

2.根据权利要求1所述的CAR元件，其特征在于，自N端至C端依次为：

HER2抗体轻链Fab端-Linker-HER2抗体重链Fab端-CD8a铰链区-跨膜区域-CD3ζ胞内段-CD147胞内段。

3.根据权利要求2所述的CAR元件，其特征在于，

所述HER2抗体轻链Fab端的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述HER2抗体重链Fab端的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述CD8a铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述跨膜区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述CD3ζ胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述CD147胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述CAR元件的核酸。

5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，

编码所述HER2抗体轻链Fab端的核酸序列如SEQ ID NO:9所示；

编码所述Linker(G4S1)3的核酸序列如SEQ ID NO:10所示；

编码所述HER2抗体重链Fab端的核酸序列如SEQ ID NO:11所示；

编码所述CD8a铰链区的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

编码所述跨膜区域的核酸序列如SEQ ID NO:13所示；

编码所述CD3ζ胞内段的核酸序列如SEQ ID NO:14所示；

编码所述CD147胞内段的核酸序列如SEQ ID NO:15所示。

6.权利要求1～3任一项所述CAR元件的包装载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求1～3任一项所述的CAR元件。

7.根据权利要求6所述的CAR元件的包装载体，其特征在于，还包括iCaspse9基因。

8.质粒组合，包括权利要求6或7所述的包装载体，和iCaspse9质粒；

所述iCaspse9质粒包括依次连接的iCaspse9基因、linker和报告基因。

9.根据权利要求8所述的质粒组合，其特征在于，还包括慢病毒转染辅助质粒。

10.表达权利要求1～3任一项所述CAR元件或权利要求6～9任一项所述的包装载体或质粒组合的宿主；所述宿主为免疫细胞或原核细胞。

11.根据权利要求10所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、髓系来源的单核或巨噬细胞。

12.权利要求1～10任一项所述靶向HER2基因的CAR元件、核酸、包装载体、质粒组合或表达宿主在制备治疗HER2阳性肿瘤的药物中的应用。

13.靶向HER2基因的药物，其特征在于，其包括权利要求10或11所述的CAR-免疫细胞。

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