JP7207786B2 - インターロイキン２１タンパク質（ｉｌ２１）変異体およびその適用 - Google Patents

インターロイキン２１タンパク質（ｉｌ２１）変異体およびその適用 Download PDF

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Description

本発明は、医療技術の分野に属し、特に、インターロイキン２１タンパク質（ＩＬ２１）変異体およびその適用に関する。
腫瘍免疫療法における免疫抑制の問題を解決するために、サイトカインや低分子阻害剤による治療が免疫調節の役割を果たす場合がある。サイトカインや低分子阻害剤による治療は、抑制性細胞サブセットの数または機能を特異的に抑制するか、免疫刺激分子によって抗腫瘍エフェクター細胞を活性化して患者の抗腫瘍免疫応答を増強する。ＩＬ２（インターロイキン－２）は、免疫応答における重要なメディエーターであるだけでなく、最も強力な抗腫瘍サイトカインの１つとしても知られており、広範な生物活性を有する。ＩＬ２は、胸腺Ｔ細胞に直接作用し、Ｔｒｅｇ細胞の分化を促進し、自己免疫を抑制し、また、抗原刺激によって活性化される最初のＴ細胞（イニシャルＴ細胞）のエフェクターＴ細胞および記憶Ｔ細胞への分化を促進することができる。これにより、ヒトを感染から保護することができる。しかし、ＩＬ２の全身投与は、強い有害反応を引き起こす場合があるため、ＩＬ２の治療量を制限することになる（非特許文献１および２）。さらに、ＩＬ２の血漿半減期は短く（約０．５～２時間）、腫瘍の局所微小環境における最適用量を達成することができない（非特許文献３）。このことによっても、ＩＬ２の臨床適用は制限される。
サイトカインファミリーでは、ＩＬ２、ＩＬ１５およびＩＬ２１はすべて共通のサイトカイン受容体γ鎖ファミリーに属する。これらはすべて、Ｔ細胞とＮＫ細胞の活性を促進し、標的細胞に対する致死効果を高めることができる。これらの特徴により、ＩＬ２、ＩＬ１５およびＩＬ２１は腫瘍免疫療法研究において魅力的なサイトカインとなっている（非特許文献４～５）。
ＩＬ２１（インターロイキン２１）は、２０００年に発見されたＩ型サイトカインであり、γｃファミリーに属し、１３４アミノ酸から構成される。ＩＬ２１は、主にＴＨ１７細胞やＴＦＨ（Ｔ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ）細胞などのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットから分泌される。ＮＫＴ細胞も、高濃度のＩＬ２１を分泌することができる（非特許文献１９～２０）。ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および単球／マクロファージの表面に発現し、ＩＬ２１は、広範囲の免疫調節作用を有するサイトカインであることが報告されている。
多くの前臨床試験によると、ＩＬ２１が自然免疫系および獲得免疫系を含む種々のメカニズムによって腫瘍に抵抗することが示唆されている（非特許文献６）。ＩＬ２１は、メラノーマおよび腎癌を治療するためのヒト臨床試験に使用することが承認されており、良好な治療効果を示している（非特許文献７～８）。ＩＬ２１は、セツキシマブでプレコートされた膵癌細胞に対するＮＫ細胞の反応を増強することができる（非特許文献９）。動物実験において、ＩＬ２１およびモノクローナル抗体リツキシマブ（抗ＣＤ２０）によって構築された融合タンパク質は、アポトーシスを直接的に誘導するか、またはエフェクター細胞を介して非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を死滅させることが分かった（非特許文献１０）。
本発明者らは、先行研究により、マウス乳癌モデルにおいて、ＩＬ２１が、腫瘍の薬剤耐性や悪性度を高めるＭ２マクロファージを、抗腫瘍機能を有するＭ１マクロファージに形質転換することにより、乳癌の抗体（ハーセプチン）の腫瘍殺傷作用が有意に向上することを見出した（非特許文献１１）。
一方、ＩＬ２１に関する臨床適用研究の多くは、ＩＬ２１の毒性副作用が同用量のＩＬ２またはＩＦＮ－αより少なく、これらは主に発熱、疲労、頭痛、発疹などの軽度の症状として発現し、腹痛、血小板減少症、低リン酸血症、肝機能障害などの重篤な症状としても発現することを示唆した。それにもかかわらず、３０ｇ／ｋｇの通常の投与量では、種々の毒性副作用の発生率は依然として１００％までである（非特許文献１２）。この問題は必然的に、全身投与において慎重に取り扱われるべきである。実際、ＩＬ２１の臨床適用は長年研究されてきたが、未だに前臨床第Ｉ相、第ＩＩ相試験が進行中である。重要な理由は、毒性副作用の発生率が高いという問題があることである。
腫瘍部の局所におけるサイトカインの有効濃度を高めて全身性の毒性反応を避けるために、抗体のターゲティング能力を利用してサイトカインの送達を試みる研究者もいる。サイトカインの免疫療法力と抗体の標的抗腫瘍反応を組み合わせることにより、腫瘍部の局所に高濃度のサイトカインが集中し、細胞性免疫応答を効果的に刺激する場合がある。サイトカインと細胞特異的抗体との組合せは、免疫サイトカインと呼ばれる（非特許文献１３）。
しかしながら、ＩＬ２１の血漿中半減期が短く、約３．０９時間しかないことを示した臨床研究もある。ＩＬ２１およびモノクローナル抗体によって構築された融合タンパク質は約１８０ｋＤまでの分子量を有するが、血漿半減期は依然として短い。ＩＬ２１およびリツキシマブ（抗ＣＤ２０）によって構築された融合タンパク質の血漿半減期は、動物実験においてわずか約１８．９４時間であり、依然として創薬可能性が低い（非特許文献１０）。従って、ＩＬ２１の安定性を向上し、その半減期を増加させて創薬可能性を向上することが必要である。
構造解析によると、ＩＬ２１タンパク質は、安定的な立体構造および不安定な立体構造の２つの立体構造を有しており、これが、ＩＬ２１の半減期が短い理由である。キメラＩＬ２１／４は、ＩＬ２１のタンパク質構造における不安定領域をＩＬ４（インターロイキン－４）の相同領域で置換することによって構築できることが報告されている。この結果から、キメラＩＬ２１／４が独特で安定的なタンパク質立体構造を有し、向上した生物学的活性を有していることが分かった（非特許文献１４）。
本発明者らは、先行研究において、タンパク質立体構造のｉｎ ｖｉｔｒｏ制御のための安定的な哺乳動物細胞表面タンパク質ディスプレイシステムを確立したが（特許文献１、特許文献２）、これは合理的に設計されたタンパク質またはランダム変異をスクリーニング、および同定するために使用することができる。本発明において、このシステムを使用して、インターロイキン－２１（ＩＬ２１）を安定的にディスプレイし、タンパク質構造解析に基づく設計を通して、変異体ＩＬ２１タンパク質の群を最適化して取得する。
中国特許出願公開第２０１４１０８０３４２２号明細書 中国特許出願公開第２０１８１０７９５４９９号明細書
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本発明のインターロイキン－２１タンパク質（ＩＬ２１）変異体は、野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列における１６位のＩＬＥ、および７０位のＳＥＲの両者が、ＣＹＳに変異され、前記２つの変異ＣＹＳの間にジスルフィド結合が形成され、前記野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列が配列番号１に示されることを特徴とする。
本発明の別のインターロイキン－２１タンパク質（ＩＬ２１）変異体は、野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列における１６位のＩＬＥ、１７位のＶＡＬ、７０位のＳＥＲ、および１１２位のＬＹＳの全てが、ＣＹＳに変異され１６位－７０位の間および１７位－１１２位の間にジスルフィド結合の２つのグループが形成され、前記野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列が配列番号１に示されることを特徴とする。
本発明のインターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）変異体は、インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラ（ＩＬ２１／４）におけるアミノ酸配列の１６位のＩＬＥ、および７０位のＳＥＲの両者が、ＣＹＳに変異され、前記２つの変異ＣＹＳの間にジスルフィド結合が形成され、インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）のアミノ酸配列が配列番号２に示されることを特徴とする。
本発明の別のインターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）変異体は、インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラ（ＩＬ２１／４）におけるアミノ酸配列の１６位のＩＬＥ、１７位のＶＡＬ、７０位のＳＥＲ、および１０６位のＬＹＳの全てが、ＣＹＳに変異され、１６位－７０位の間および１７位－１０６位の間にジスルフィド結合の２つのグループが形成され、インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）のアミノ酸配列が配列番号２に示されることを特徴とする。
本発明のヌクレオチド配列は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体をコードすることを特徴とする。
本発明の融合タンパク質は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体を含む融合タンパク質であって、
（１）ＩＬ２１変異体またはＩＬ２１／４変異体である機能性断片１と、
（２）モノクローナル抗体機能を有する機能性断片２と、
異なる機能性断片を連結する連結ドメインと、
を含むことを特徴とする。
本発明の使用は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体の使用であって、免疫を調整または活性化するための医薬であるか、または抗腫瘍薬である医薬の調製における使用であることを特徴とする。
本発明の使用は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体を含む融合タンパク質の使用であって、免疫を調整または活性化するための医薬であるか、または抗腫瘍薬である医薬の調製における使用であることを特徴とする。
本発明の使用は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体の使用であって、Ｂ細胞の分化および増殖、Ｔ細胞の分化および増殖、ＮＫ細胞の分化および増殖を促進するための製剤の調製における使用であることを特徴とする。
本発明の使用は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体を含む融合タンパク質の使用であって、Ｂ細胞の分化および増殖、Ｔ細胞の分化および増殖、ＮＫ細胞の分化および増殖を促進するための製剤の調製における使用であることを特徴とする。
本発明の医薬または医薬組成物は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体を有効成分とする医薬または医薬組成物であって、治療有効量の前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体と、必要な医薬賦形剤と、を含むことを特徴とする。
本発明の医薬または医薬組成物は、前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体を含む融合タンパク質を有効成分とする医薬または医薬組成物であって、治療有効量の前記融合タンパク質と、必要な医薬賦形剤と、を含むことを特徴とする。
図１は、ＩＬ２１／４とハーセプチン抗体との融合タンパク質の組換え置換プラスミド断片を示す。 図２は、ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミドが相同組換えによりＣＨＯワーキングセルゲノムに置換されたことを示す模式図である。 図３は、ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミドがＣＨＯワーキングセルに置換された後のＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率を示す。左のパネルはＣＨＯワーキングセルのネガティブコントロール群を示し、右のパネルは、トランスフェクション後の実験群を示す。縦軸は、ハーセプチン重鎖の定常領域と結合した後のハーセプチンＨＣのディスプレイ率を示す。ｐ３領域は、置換が成功した後のＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率を示し、これは約０．２６９％であった。 図４は、ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミドがＣＨＯワーキングセルに置換された後、選別され、濃縮されたＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率を示す。左のパネルはＣＨＯワーキングセルのネガティブコントロール群を示し、右のパネルは、トランスフェクション後の実験群を示す。横軸は、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した後のディスプレイ率を示し、縦軸はＩＬ２１受容体γｃの細胞外ドメインに結合した後のディスプレイ率を示す。実験群は、ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合後のディスプレイ率は１７．２％であり、γｃの細胞外ドメインに結合後のディスプレイ率は０．３％以下であることを示した。 図５は、マウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体にＩＬ２１／４－ハーセプチン細胞が結合した後のディスプレイ率を示す。左のパネルはＣＨＯワーキングセルのネガティブコントロール群を示し、右のパネルは、トランスフェクション後の実験群を示す。横軸はＩＬ２１受容体γｃの細胞外ドメインに結合した後のディスプレイ率を示し、縦軸はハーセプチン重鎖の定常領域に結合した後のハーセプチンＨＣのディスプレイ率を示す。その結果、融合タンパク質に結合後のハーセプチンのディスプレイ率は２．５４％であった。 図６は、ジスルフィド結合を変異させた後に検出されたＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率を示す。示されたディスプレイ率の結果は、１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン、１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよび４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンタンパク質がディスプレイされた濃縮後のＣＨＯ細胞からのものであった。横軸は、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した後のディスプレイ率を示し、縦軸は標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体にハーセプチン重鎖の定常領域が結合した後のディスプレイ率を示す。ハーセプチン重鎖の定常領域に結合した後の１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群および４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群のディスプレイ率は、濃縮前よりも有意に高かったが、ハーセプチン重鎖の定常領域に結合した後の１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群のディスプレイ率は濃縮後わずか１％であった。これは、受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した後の１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群および４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群のディスプレイ率が濃縮前よりも有意に高かったことを示している。一方、１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群と受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインとの間にはコントロール群と同様に、明らかな結合は認められなかった。 図７は、種々の変異タンパク質ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１および１６ｃｌＬ２１／４の発現プラスミドの構築を示す（構造グラフ）。各変異タンパク質をコードする遺伝子をＰＣＥＰ４ベクターに挿入し、Ｈｉｓタグを付加した発現プラスミドを構築した。 図８は、ＩＬ２１および各変異タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。 図９Ａは、酵素加水分解後の１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４変異タンパク質の質量分析図を示す。 図９Ｂは、酵素加水分解後の１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４変異タンパク質の質量分析図を示す。 図１０は、ＩＬ２１および各変異タンパク質の熱安定性を決定するためのＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４の融解温度（Ｔｍ）を示す。 図１１は、ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４タンパク質によって刺激されたＫＯＢ細胞の増殖を示す。 図１２は、マウスにおける、融合タンパク質１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよびハーセプチンによりｉｎ ｖｉｖｏで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。 図１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの融合タンパク質１６ｃｌＬ２１／４－ハーセプチンの抗腫瘍試験結果を示す。同図において、「コントロール」は、ＰＢＳが注射されたコントロール群を表し、「ハーセプチン」は、ハーセプチン単独が注射された実験群を表し、「ＩＬ－２１ｍｕｔａｎｔ－ハーセプチン」は、１６ｃＩＬ２１／４およびハーセプチンの融合タンパク質を用いた実験群を表し、「ＩＬ－２１ｍｕｔａｎｔ＋ハーセプチン」は、融合タンパク質の代わりに１６ｃＩＬ２１／４およびハーセプチンの混合液を用いた実験群を表す。
ＰＣＲおよびＤＮＡ消化生成物およびプラスミドの抽出、精製および調製
ＰＣＲおよびＤＮＡ消化生成物を、ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡゲル抽出キット（ＡＸＹＧＥＮ）によって抽出した。Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ、Ｃｈｉｎａ）によって、少量のプラスミドを抽出および精製した。ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔにより中量のプラスミドを抽出および精製した。Ｔｉａｎｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｍａｘｉプラスミドキットにより大量のプラスミドを抽出および精製した。具体的な手順は、指示に従って行った。
細胞培養
ＣＨＯ／ｄｈＦｒ－（ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞）：前記細胞を、５％のＣＯ２恒温器中、３７℃で、１０％のウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬの二重抗体、０．１ｍｍｏｌ／ｌのヒポキサンチンおよび０．０１６ｍｍｏｌ／ｌのチミンを含むＩＭＤＭ培地を使用して培養した。
２９３Ｆ細胞：ヒト胚腎細胞であり、５％ＣＯ２恒温器中、１２５ｒｐｍおよび３７℃で、振盪フラスコ内で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地を使用して培養した。
ＫＯＢ細胞：ＩＬ２１受容体を高発現する成人Ｔリンパ腫細胞であり、中国科学アカデミー生物物理研究所のＷＡＮＧ Ｓｈｅｎｇｄｉａｎグループから提供された。前記細胞を、５％ＣＯ２恒温器中、３７℃で、１０％のウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１００Ｕ／ｍＬの二重抗体を含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して培養した。
細胞トランスフェクション
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
細胞調製：前記細胞を、トランスフェクションの１日前にウェルあたり２００，０００細胞の量で６ウェルプレートに播種し、トランスフェクションの時点で、８０％コンフルエンスに達し、均一に分布され、十分に増殖されるようにした。
トランスフェクション複合体の調製：５μｌのＬｉｐｏ２０００および１５０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ無血清培地を均等に混合し、２μｇの標的プラスミドを１５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ無血清培地と均等に混合した。室温で５分間静置した後、これら２つの混合物を混合してトランスフェクション複合体を調製し、これを穏やかに混合し、室温で２５分間置いた。
元の培養液を６ウェルプレートから除去し、ウェルをＯｐｔｉ－ＭＥＭ無血清培地で３回洗浄した後、トランスフェクション複合体を細胞表面上に滴下し、その後、５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ無血清培地を添加した。４～６時間後、培地を一般的な培養液に交換し、培養を続けた。
２９３Ｆ細胞のトランスフェクション（例：５０ｍｌの培養液）
細胞調製：トランスフェクションの１日前に６×１０５－７×１０５細胞／ｍｌを播種し、トランスフェクション時の細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌとした。
トランスフェクション複合体の調製： ５０μｇの標的プラスミドを２ｍｌのＯｐｔｉＰＲＯＴＭＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）無血清培地で希釈し、完全に混合してＤＮＡ希釈剤を調製した。２５０μｌのトランスフェクション試薬ＰＥＩを前記ＤＮＡ希釈剤に添加してトランスフェクション複合体を調製し、これを完全に混合し、室温で１５分間置いた。前記トランスフェクション複合体を２９３Ｆ細胞培養液に添加した後、５％ＣＯ２の恒温器中、１２５ｒｐｍおよび３７℃で、振盪フラスコ内で９６時間培養した。
タンパク質の発現および精製
（１）真核細胞の発現および精製
標的遺伝子を含むプラスミドを２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした後、前記細胞をシェーカー内で９６時間連続的に培養し、その後２００ｇで３分間遠心分離して細胞沈殿物を除去した。上清培地を回収し、１００００ｇで１５分間遠心分離して培養液中の不純物を除去し、０．４５μｍフィルター膜でろ過し、３０ｋｄの濃縮管中で４℃、３８００ｒｍｐで遠心分離し、体積の２０倍に濃縮した。
（２）Ｈｉｓタグタンパク質の精製
硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ４）を充填したSepharose high performance（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）クロマトグラフィーカラムを使用した。５ｍｍｏｌ／ｌ、３０ｍｍｏｌ／ｌ、６０ｍｍｏｌ／ｌ、９０ｍｍｏｌ／ｌ、１２０ｍｍｏｌ／ｌ、および２５０ｍｍｏｌ／ｌのイミダゾールを含有する緩衝液をそれぞれ調製した。前記緩衝液中の他の成分は、２０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、５００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌおよび１０％のグリセロールであった。
ニッケルカラムの洗浄および平衡化：ニッケルカラムを、まず、５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏで洗浄し、その後５ｍｍｏｌ／ｌイミダゾールを含む５０ｍｌの緩衝液で洗浄し、平衡化した。
試料充填：標的タンパク質を含有する上清を前記ニッケルカラムに滴下し、これを２～３回繰り返した。
溶出：前記試料を充填した後、カラムを、５ｍｍｏｌ／ｌ、３０ｍｍｏｌ／ｌ、６０ｍｍｏｌ／ｌ、９０ｍｍｏｌ／ｌ、１２０ｍｍｏｌ／ｌおよび２５０ｍｍｏｌ／ｌのイミダゾールをそれぞれ含有する３０ｍｌの緩衝液で溶出し、溶出液を回収した。標的タンパク質の分子量に応じて、異なる仕様の限外濾過管を選択した。前記溶出液を限外濾過管で体積の５０～１００倍に濃縮した。
タンパク質保存：最終的に得られたタンパク質を別々に包装し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。
（３）全長抗体および全長抗体融合タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｆｉｎｏｓｅＴＭ－５ｍｌ（プレパックグラヴィティーカラム）クロマトグラフィーカラムを使用した。
事前調製
結合緩衝液：０．１ｍｏｌ／ｌ Ｎａ３ＰＯ４、０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
溶出緩衝液：０．１ｍｏｌ／ｌ クエン酸、ｐＨ２．７
中和緩衝液：１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０
洗浄および平衡化：まず、前記クロマトグラフィーカラムを５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏで洗浄した後、５０ｍｌの溶出緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍｌの結合緩衝液で平衡化した。
試料充填：標的タンパク質を含有する上清を前記クロマトグラフィーカラムに滴下し、これを２～３回繰り返した。
溶出：前記試料を充填した後、前記カラムを５０ｍｌの結合緩衝液で洗浄して、非特異的結合物を除去した。１０本の１５ｍｌの遠沈管を準備し、それぞれに、８００μｌの予め調製した中和緩衝液を添加した。タンパク質を３０ｍｌの溶出緩衝液で溶出し、中和緩衝液を含む１５ｍｌの遠沈管によって回収し、各管に溶出液を３ｍｌ回収した。
画分回収：溶出液を回収した後、各管中のタンパク質の濃度をナノドロップによって検出した。タンパク質濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌ未満の溶出液を廃棄した。標的タンパク質の分子量に応じて、異なる仕様の限外濾過管を選択した。前記溶出液を限外濾過管で濃縮した。
タンパク質保存：最終的に得られた前記タンパク質を別々に包装し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保存した。
クロマトグラフィーカラムの洗浄および保存：前記クロマトグラフィーカラムを５０ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、その後、５０ｍｌのｄｄＨ２Ｏで洗浄し、最後に５０ｍｌの２０％エタノールで洗浄し、密封した。
タンパク質の融解温度（Ｔｍ）の決定
タンパク質の融解温度（Ｔｍ）の決定原理：タンパク質の温度が周囲温度と共に上昇し、融解温度（Ｔｍ）に達すると、タンパク質の立体構造が破壊され、疎水性コアを開く。染料は、疎水性領域と結合して、検出可能な蛍光を発することができる。
被測定タンパク質を、まず、２０～４０μｍｏｌ／ｌの濃度および２４μｌの体積に調整した。
Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（５０００×）を染料として使用し、これをＤＭＳＯで２５×に希釈した。
２５μｌの検出システムの調製：９６ウェルプレートの各ウェルに２４μｌのタンパク質（２０～４０μｍｏｌ／ｌ）を添加し、その後、１μｌのＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（２５×）を添加し、十分に混合し、光を避けて室温で保持した。
ｑＰＣＲ装置中のＳｔｅｐｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．１を検出に使用し、手順に従って操作およびパラメーター設定を行った。
実験結果を決定し、保存した。結果を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ ３．１のプログラムによって分析した。
［実施例１］
キメラＩＬ２１／４を安定的に発現可能なＣＨＯ細胞株の確立
ＩＬ２１は、安定的な構造および不安定な構造の２つのタンパク質構造を有する。ＩＬ２１のタンパク質構造中の不安定領域をＩＬ４の相同領域で置換することによって、キメラＩＬ２１／４を構築した。その結果によると、キメラＩＬ２１／４のタンパク質立体構造は独特で安定的であり、向上した生物学的活性を有していることが分かった。ＩＬ２１変異体とハーセプチンの融合タンパク質の構築が実験の重要な目的であることを考慮すると、ＣＨＯワーキングセルの表面上にキメラＩＬ２１／４とハーセプチンの融合タンパク質をディスプレイした後、ハーセプチン重鎖の定常領域を検出することによってキメラＩＬ２１／４のディスプレイ効率を検出することも有益であった。従って、本発明者らは、まず、ＣＨＯワーキングセルの表面上にキメラＩＬ２１／４およびハーセプチンの融合タンパク質をディスプレイした。
キメラＩＬ２１／４をディスプレイするための効率的かつ安定的なＣＨＯ細胞株を取得するために、本発明者らの実験室で以前に確立されたタンパク質ディスプレイシステムを使用して、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によってＣＨＯ細胞株を構築した（詳細については特許文献１を参照のこと）。
ＩＬ２１／４とハーセプチンの融合タンパク質をディスプレイするために、まず、組換置換プラスミド断片（ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミド）を構築した。融合タンパク質の断片は、シグナルペプチドを有するハーセプチン軽鎖、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）、ハーセプチン重鎖のシグナルペプチド、３（Ｇ４Ｓ）リンカーを介してハーセプチン重鎖のＮ末端に連結されたＩＬ２１／４、およびハーセプチン重鎖のＣ末端に連結された膜貫通領域（ＴＭ）であった。これにより、ＩＬ２１／４とハーセプチンとの融合タンパク質を、膜貫通領域によってＣＨＯワーキングセルの表面に固定し、ディスプレイすることができた。融合タンパク質の配列構造を図１に示した（左から右へ、ＦＲＴ組換え部位、ハーセプチン軽鎖のシグナルペプチド、ハーセプチン軽鎖、リボソームに結合して翻訳を開始することができるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）、ハーセプチン重鎖のシグナルペプチド、ＩＬ２１／４、３（Ｇ４Ｓ）リンカー、ハーセプチン重鎖、細胞表面にタンパク質分子を固定しディスプレイ可能な膜貫通領域（ＴＭ）、およびＬＯＸｐ組換え部位を含む融合タンパク質）。
組換え置換領域ＦＲＴ－ｐｕｒｏｍｙｓｉｎ－Ｌｏｘｐの単一コピーがゲノムに挿入され、本発明者らの研究室で樹立されたＣＨＯワーキングセル（詳細については特許文献１を参照のこと）に、ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミドと本発明者らの研究室で事前に構築されたｐＣＩ－２Ａプラスミドを同時にトランスフェクトした。ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンプラスミドのＬｏｘｐ部位とＦＲＴ部位の間のハーセプチンとＩＬ２１／４の融合タンパク質配列は、図２に示すように、単一コピーでＣＨＯワーキングセルのゲノムに組み換え、置換することができた。
トランスフェクション後、前記細胞を定時に回収し、その後、マウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体で標識した。ＩＬ２１／４－ハーセプチン置換後のディスプレイ率をフローサイトメトリーにより検出した。その結果（図３）によると、ディスプレイ率は０．２６９％で、トランスフェクション後の置換組換えの確率が非常に低いことが示された。したがって、置換が成功し、試験結果が陽性である細胞は、濃縮後に再び検出する必要があった。偽陽性シグナルを避けるために、図３の左上象限のｐ３領域に強い陽性シグナルを有する細胞をｆｌｏｗ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩによって選別し、その後、培養し、増殖させた。
濃縮後、再び検出を行った。今回は、事前に発現および精製したＩＬ２１Ｒα細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰ－ｈｉｓ融合タンパク質、γｃ細胞外ドメインリンカー－ｍＲＦＰ－ｈｉｓ融合タンパク質およびマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体を標識し、ＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質におけるＩＬ２１／４およびハーセプチンドメインの完全性を同時に検出した。その結果を図４および図５に示す。図４に示すように、横軸はＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した後のＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質におけるＩＬ２１／４のディスプレイ率（１７．２％）を示し、縦軸は、ＩＬ２１受容体γｃの細胞外ドメインに結合した後のＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質におけるＩＬ２１／４のディスプレイ率（＜０．３％）を示す。報告されているように、ＩＬ２１の受容体γｃへの結合の親和性は、受容体ＩＬ２１Ｒαへの結合のそれよりもはるかに低く、このことは今回の実験でも数回確認された。
図５に示すように、横軸は、ＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質におけるＩＬ２１／４のディスプレイ率が、ＩＬ２１受容体γｃの細胞外ドメインに結合した後、０．３％未満であったことを示し、縦軸は、融合タンパク質におけるハーセプチン重鎖の定常領域のディスプレイ率が、標識抗体であるＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ＡＰＣ抗体に結合した後、２．５４％であり、濃縮前のディスプレイ率（０．２６％）よりも高かったことを示す。ＩＬ２１Ｒα細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰ融合タンパク質の標識結果と組み合わせると、標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体に対するハーセプチン重鎖定常領域の親和性は、ＩＬ２１Ｒα細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰに対するそれよりも低いことが示された。
ＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質を安定的にディスプレイした上記ＣＨＯ細胞を、ｆｌｏｗ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩによって選別し、ｓ０細胞と命名した。
分子生物学実験プロセスにおいて、ＣＨＯ細胞の表面上にキメラＩＬ２１／４を安定的にディスプレイ可能なプラスミドを構築するための工程は、以下の通りであった。
１．ｐＦＲＴ－ハーセプチン ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＩＬ２１／４－リンカー－ハーセプチン ＨＣ－ＴＭ－Ｌｏｘｐプラスミドを構築し、ＣＨＯ細胞の表面上に変異ＩＬ２１／４を安定的にディスプレイする工程。
（１）ＩＬ２１を鋳型として用いてプライマーを設計し、ＩＬ２１／４断片をオーバーラップＰＣＲにより取得した。
（２）前記ＩＬ２１／４断片を、オーバーラップＰＣＲにより、リンカーを介してハーセプチン重鎖ＨＣのＮ末端に連結し、その後、ｓｐ－ＩＬ２１／４－リンカー－ハーセプチンＨＣ断片を、本発明者らの研究室において構築された抗体ディスプレイプラスミドｐＦＲＴの重鎖部分に置換し、ｐＦＲＴ－ハーセプチン ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＩＬ２１／４－リンカー－ハーセプチン ＨＣ－ＴＭ－Ｌｏｘｐプラスミドを構築した。プラスミドは、ＣＨＯ細胞の表面上に変異体ＩＬ２１／４を安定的にディスプレイすることができた。
２．ＩＬ２１Ｒα－リンカー－ＧＦＰ融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築し、ＩＬ２１の機能活性を調べるためにＩＬ２１受容体αの細胞外ドメインを分泌・発現させる工程。
（１）データベースを照会し、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒα鎖の細胞外ドメインを合成し、その後、ＧＦＰを鋳型として用いたＰＣＲによってＧＦＰ断片を増幅するようにプライマーを設計した。
（２）ＩＬ２１Ｒα鎖の細胞外ドメインを、オーバーラップＰＣＲによりリンカーを介してＧＦＰのＮ末端に連結し、その後、ｓｐ－ＩＬ２１Ｒα鎖の細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰ断片をｐＣＥＰ４に連結し、ＩＬ２１Ｒα－リンカー－ＧＦＰ融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
３．γｃ－リンカー－ｍＲＦＰ融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築し、ＩＬ２１の機能活性を調べるために、ＩＬ２１受容体γｃの細胞外ドメインを分泌・発現する工程。
データベースを照会して、ＩＬ２１受容体γｃ鎖の細胞外ドメインを合成し、その後、再度、ｍＲＦＰを鋳型として用いたＰＣＲによってｍＲＦＰ断片を増幅するようにプライマーを設計した。γｃ鎖の細胞外ドメインを、オーバーラップＰＣＲによりリンカーを介してｍＲＦＰのＮ末端に再度連結し、その後、ｓｐ－γｃ鎖の細胞外ドメインリンカーｍＲＦＰ断片をｐＣＥＰ４に再度連結して、γｃリンカー－ＧＦＰ融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
４．ＩＬ２１変異体と融合タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築する工程。
（２）ＩＬ２１の種々の変異体を安定的にディスプレイ可能なプラスミドの構築：ＩＬ２１の別の変異体をＣＨＯ細胞表面に安定的にディスプレイするために、点変異ＰＣＲ法を用いてプラスミドを構築した。ｐＦＲＴ－ハーセプチン ＬＣ－ＩＲＥＳ－ＩＬ２１／４－リンカー－ハーセプチン ＨＣ－ＴＭ－Ｌｏｘｐプラスミドを鋳型として使用してプライマーを設計し、ＩＬ２１の異なる変異体を安定してディスプレイ可能なプラスミドを構築した。
（３）ＩＬ２１変異タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドの構築：種々のＩＬ２１変異体をディスプレイ可能なプラスミドを鋳型としてプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりＩＬ２１変異断片を増幅した後、ｐＣＥＰ４に連結し、ＩＬ２１変異タンパク質を分泌・発現可能なプラスミドを構築した。
［実施例２］
タンパク質設計により異なる部位にジスルフィド結合を導入することによるＩＬ２１／４の安定性に関する研究
１．タンパク質構造を分析および設計することにより、ＩＬ２１／４タンパク質上の異なる部位を変異のために選択し、ジスルフィド結合を導入して、以下の群の変異体を取得した。ジスルフィド結合は以下のように導入した。
（１）１６位のＩＬＥ、および７０位のＳＥＲの両方をＣＹＳに変異させ、１６－７０ジスルフィド結合を導入し、１６ｃｌＬ２１／４と命名した。
（２）１７位のＩＬＥ、および１０６位のＳＥＲの両方をＣＹＳに変異させ、１７－１０６ジスルフィド結合を導入し、１７ｃｌＬ２１／４と命名した。
（２）１６位のＩＬＥ、７０位のＳＥＲ、１７位のＶＡＬ、および１０６位のＬＹＳをすべてＣＹＳに変異させ、２つのジスルフィド結合群を同時に導入し、４ｃｌＬ２１／４と命名した。
２．ＩＬ２１／４変異体の各々を安定的にディスプレイ可能なＣＨＯ細胞の取得。
ＦＲＴ－ＩＬ２１／４－ハーセプチンを鋳型として、ＩＬ２１／４変異体の各々を安定的にディスプレイ可能なＣＨＯ細胞株を取得するために、まず、ＩＬ２１／４変異体の各々の組換置換プラスミドを、点突然変異法により取得し、１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン、１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよび４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンと命名した。ＣＨＯワーキングセルに、再度、上記のプラスミド、および事前に構築したｐｃｉ－２Ａプラスミドを同時トランスフェクトし、組換えおよび置換の成功後に濃縮した。ディスプレイ率は、標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体への結合によって検出した。
図６に示すように、横軸は、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した後の種々の変異ＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質のディスプレイ率を示す。縦軸は、標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体に結合した後の融合タンパク質中のハーセプチン重鎖の定常領域のディスプレイ率を示す。図６に示すように、１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよび４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率は、濃縮前よりも有意に高く、受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに非常によく結合していた。しかしながら、コントロール群である１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンの縦軸は、標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体に結合した後のディスプレイ率が、わずか１％であることを示す。受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインへの明らかな結合は認められなかった。このことから、コントロール群の変異体である１７ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンがディスプレイされないことがわかった。
本発明者らは、細胞膜表面に２種類のＩＬ２１／４変異体を安定的にディスプレイ可能なＣＨＯワーキングセルを取得し、これら２つのＩＬ２１／４変異体の予備的安定性試験を行った。
［実施例３］
ＩＬ２１／４変異体の各々の予備的安定性試験
ＩＬ２１／４変異体の各々の安定性を試験するために、ＩＬ２１／４－ハーセプチンをディスプレイするＣＨＯワーキングセル、変異１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン、および変異４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンをディスプレイするＣＨＯワーキングセルを実験群として用いた。それぞれの群を４℃～５０℃の様々な温度勾配で加熱し、その後、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒα細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰ－ｈｉｓと結合し、標識した。様々な温度勾配で受容体に結合した後、各群のディスプレイ率を、フローサイトメトリーによって検出した。温度が変化すると、まず、熱安定性が不十分なタンパク質が変性し、正常な構造が破壊され、そして受容体結合の能力が失われる。このようにして、各変異体の熱安定性を調べることができた。
具体的な実験プロセスは以下の通りであった。
（１）細胞膜の表面にＩＬ２１変異体を安定的にディスプレイするＣＨＯ細胞を、０．０２％のＥＤＴＡ－ＰＢＳで消化し、血清を含む培養液で溶出し、８３０ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を回収した。
（２）前記細胞を、４℃で予め冷却した１ｍｌの無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再懸濁し、８３０ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、前記細胞を回収した。その後、前記細胞を、再び４℃で予冷した無血清のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中に、約５×１０６細胞／５０μｌまで再懸濁した。
（３）前記細胞懸濁液をＰＣＲチューブに添加し、ＰＣＲ装置によって設定された温度勾配で加熱した。前記ＰＣＲチューブを、予め設定した温度で０．５時間加熱した。前記ＰＣＲチューブを４℃で１５分間保持した後、取り出した。
（４）ＩＬ２１受容体の細胞外ドメインを特定の割合で添加し、蛍光タンパク質融合タンパク質と完全に混合した。前記混合物を、光を避けて４℃で１時間シェーカーに保持した。
（５）前記混合物を８３０ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。４℃で予冷した新たなＯｐｔｉ－ＭＥＭを添加し、遠心分離し上清を捨てることにより沈殿物を２回洗浄した。次に、沈殿物を、４℃で予冷した２００μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭで再懸濁した。標識細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）またはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによって検出または選別した。
結果は以下の通りであった。
（１）４℃では、ネガティブコントロール群を除き、全ての群がＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒαの細胞外ドメインに結合した。変異１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンのディスプレイ率は２０％であり、最も高い結合率であった。
（２）４９℃で加熱した後、ＩＬ２１／４－ハーセプチン群および４ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群のＩＬ２１受容体の細胞外ドメインへの結合は実質的に失われたが、変異１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン群のＩＬ２１受容体の細胞外ドメインへの結合は依然として検出可能であった。このことは、変異１６ｃＩＬ２１／４の熱安定性が向上していることを予備的に示唆しているといえる。
［実施例４］
野生型ＩＬ２１変異体の構築と予備的安定性試験
１．フローサイトメトリーによる変異体の熱安定性の検出
野生型ＩＬ２１分子の安定性に及ぼす、同じ位置（１６位および７０位）でのジスルフィド結合の導入の効果を検討するために、２つの他の構造を構築した。
ＩＬ２１－ハーセプチン：野生型ＩＬ２１とハーセプチンの融合タンパク質
１６ｃＩＬ２１－ハーセプチン：ＩＬ２１とハーセプチンによって構築された融合タンパク質であって、同じ位置（１６位のＩＬＥ、７０位のＳＥＲ）がＣＹＳに変異し、ジスルフィド結合を導入されている
これらも、トランスフェクションおよび置換組換えによってＣＨＯワーキングセル膜の表面上にディスプレイされ、その後、１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよびＩＬ２１／４－ハーセプチンと比較した。これらを、４℃～５５℃まで異なった温度勾配で加熱し、ＩＬ２１受容体ＩＬ２１Ｒα細胞外ドメインリンカー－ＧＦＰ－ｈｉｓおよび標識抗体であるマウス抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ抗体に結合することにより標識した。各群のディスプレイ率は、様々な温度勾配で受容体に結合させた後、フローサイトメトリーによって検出した。
これらの結果から、１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチンおよび１６－７０ジスルフィド結合が導入された１６ｃＩＬ２１－ハーセプチンが、４８℃での加熱後に受容体と結合させた後も、依然として部分的なディスプレイ率を有し、これらの安定性がＩＬ２１／４－ハーセプチンおよびＩＬ２１－ハーセプチンのそれより高いことが分かった。これらの４つのタンパク質は融合タンパク質であった。フローサイトメトリーによる検出は、予備選別のみであった。ＩＬ２１および変異タンパク質のそれぞれを発現させ、精製後の熱安定性をさらに同定することが必要であった。
２．ＩＬ２１、その変異タンパク質の発現、およびジスルフィド結合構造の検出
ＩＬ２１とその変異タンパク質を取得するために、まず、プラスミドを構築した。ＩＬ２１および変異コード遺伝子を、それぞれ、Ｈｉｓタグを付加したＰＣＥＰ４ベクタープラスミドに挿入した。ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４変異タンパク質を発現する３つのプラスミドをそれぞれ構築した（図７）。
ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１／４タンパク質についてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、その結果を図８に示した。結果によると、ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１、および１６ｃＩＬ２１／４のバンドは、理論上分子量と一致していた。分子量から、これら３つのタンパク質が標的タンパク質とした。
質量分析をさらに行い、１６ｃＩＬ２１／４タンパク質における標的ジスルフィド結合の形成を確認した。１６ｃｌＬ２１／４タンパク質を質量分析によって検出したが、電気泳動中のジスルフィド結合の切断は防がれているものとする。試料タンパク質は、まず、プロテアーゼによって加水分解され、様々なサイズのペプチドセグメントに切断された。タンパク質中のジスルフィド結合は、酵素分解の結果に影響を及ぼす。ジスルフィド結合が切断されたか否かの条件下で、試料タンパク質は異なるサイズのペプチドセグメントに切断されることになるが、ペプチドセグメントは異なる質量対電荷比の分布を有するものとする。検出された分布と理論的分布との一貫性によって、試料タンパク質中にジスルフィド結合が存在するかどうかを判定することができた。
試料１６ｃＩＬ２１／４中のジスルフィド結合の分析
理論上ジスルフィド結合を生成する２つのセグメントのアミノ酸配列は、ＩＩＮＶＣＩＫおよびＱＬＩＤＣＶＤＱＬＫであった。酵素分解を還元状態で行った場合、ジスルフィド結合が切断され、Ｃがアルキル化される（分子量が５７Ｄａ増加する）。２つのペプチドセグメントの質量電荷比の理論値は、それぞれ８５９．５０７および１２３１．６３５であった。図９Ａに示すように、還元状態（ＤＴＴを有する）では８５９．５８７および１２３１．７６９に明らかなシグナルピークが存在したが、２つのシグナルピークは非還元状態では非常に低かった。この結果によると、ＤＴＴを添加すると、ジスルフィド結合が切断され、２つのペプチドセグメントが１６ｃＩＬ２１／４試料タンパク質において生成されたことが示唆された。ＤＴＴを添加しないと、ジスルフィド結合は切断されず、２つのペプチドセグメントのシグナルは存在しなかった。これは、理論的予測のジスルフィド結合構造と一致した。
酵素分解を非還元状態で行った場合、２つのペプチドセグメント間のジスルフィド結合は切断されなかった。本発明者らは、２つのペプチドセグメントの合計に等しい質量電荷比を有するペプチドを検出することができた。２つのペプチドセグメントの合計の理論上の質量電荷比は、非還元状態で（８５９．５８７－５７）＋（１２３１．７６９－５７）－２－１＝１９７４．３５６となる。図９Ｂでは、非還元状態で１９７４．２３０の質量電荷比を有する明らかなピークを見ることができたが、このピークのシグナルは還元状態では非常に低かった。このことから、ＤＴＴを添加しないと、試料タンパク質のジスルフィド結合は切断されず、したがって、酵素分解生成物は大きなペプチドセグメントのシグナルを有することが示唆された。ＤＴＴを添加すると、ジスルフィド結合が切断され、より大きなペプチドセグメントが分割され、したがってシグナルが消失した。
上記の結果は、１６ｃＩＬ２１タンパク質の酵素分解の間においても観察され、これは、ジスルフィド結合が１６位のＣと７０位のＣとの間に正しく形成されたことを示した。
３．ＩＬ２１および各変異タンパク質の融解温度（Ｔｍ）の決定
１６ｃＩＬ２１／４タンパク質の１６位と７０位とのｃｙｓ間のジスルフィド結合の形成を確認した後、ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１および１６ｃＩＬ２１／４の３つのタンパク質の融解温度（Ｔｍ）を測定し、ＩＬ２１と各変異タンパク質の熱安定性を決定した。結果を図１０に示す。
その結果によると、ＩＬ２１、１６ｃＩＬ２１、および１６ｃＩＬ２１／４のＴｍ値は、１６ｃＩＬ２１（６５．６２℃）＞１６ｃＩＬ２１／４（５６．５２℃）＞ＩＬ２１（４８．５４℃）であった。
その結果によると、ジスルフィド結合を有する１６ｃＩＬ２１、および１６ｃＩＬ２１／４タンパク質の２つの変異体の熱安定性が、野生型ＩＬ２１タンパク質のそれよりも有意に高いことを示唆した。ジスルフィド結合の導入が、熱安定性を向上する理由であると考えられる。
［実施例５］
種々のＩＬ２１変異体の生物学的活性の判定
１．ＫＯＢ細胞の増殖を刺激する能力
熱安定性が向上しても、ＩＬ２１、１６ｃｌＬ２１、および１６ｃｌＬ２１／４の３つのタンパク質の生物活性が維持されているかどうかを検出した。ＫＯＢ細胞は、ＩＬ２１受容体を発現し、ＩＬ２１によって刺激されて増殖することができる。種々のＩＬ２１変異体の生物学的活性は、ＫＯＢ細胞の増殖を刺激する能力によって決定することができる。具体的なプロセスは、以下の通りであった。
（１）ＫＯＢ細胞の調製：ＫＯＢ細胞を、５％のＣＯ２恒温器中、３７℃で、１０％ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１００Ｕ／ｍＬの二重抗体を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
（２）ＩＬ２１および変異タンパク質の調製：ＩＬ２１とＨｉｓ ｔａｇ付き変異タンパク質の発現プラスミドを構築し、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。培養、発現、およびニッケルカラムによる精製の工程は、従来通りに行った。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイによって決定した。
（３）生物学的活性の判定：ＫＯＢ細胞を、２×１０４細胞／ウェルになるように９６ウェルプレートに播種し、２００μｌの培養液、およびＩＬ２１または変異タンパク質を各ウェル添加した。ＩＬ２１または変異タンパク質の勾配濃度を、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌに設定した。前記細胞を３７℃で５％のＣＯ２恒温器中で培養し、９６時間後に計数した。
結果を図１１に示す。
繰り返しのない二元配置分散分析の結果によると、コントロール群と各タンパク質群のｐ値は０．０５未満（ｐ＜０．０５）であり、群の間に有意な差が認められた。３つのタンパク質群の間のｐ値は０．０５以上（Ｐ＞０．０５）であり、３つのタンパク質群の間に有意な差は認められなかった。異なる濃度の３つのタンパク質の群の間のｐ値は、０．０５を超え（Ｐ＞０．０５）、異なる濃度の３つのタンパク質の群の間に有意な差は認められなかった。
この結果によると、３つのタンパク質はいずれもＫＯＢ細胞の増殖を刺激する効果があり、生物活性に有意な差は無かった。添加したタンパク質の勾配濃度が０．０４μｇ／ｍｌ、０．２ｇ／ｍｌ、および１ｇ／ｍｌであった場合、異なる濃度のタンパク質の群の間に有意な差が無かった。
したがって、２つの変異タンパク質、１６ｃｌＬ２１、および１６ｃｌＬ２１／４は熱安定性が向上しており、生物学的活性が維持された。
２．マウスにおけるハーセプチンとＩＬ２１または各変異体の融合タンパク質の血漿中半減期の試験結果
ＩＬ２１の安定性の向上により動物における血漿半減期を増加できるかどうかを判定するために、ＩＬ２１－ハーセプチン融合タンパク質、変異１６ｃＩＬ２１－ハーセプチン融合タンパク質、および１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質を選択し、マウスにおけるそれらの血漿半減期を検出する比較試験を行った。ハーセプチン群をコントロール群とした。結果を表４に示す：
Figure 0007207786000001
結果に示されるように、１６ｃＩＬ２１－ハーセプチンおよび１６ｃｌ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質に含まれる非常に安定的なＩＬ２１変異体は、野生型ＩＬ２１と比較して、マウスにおける血漿半減期を有意に増加した。前記１６ｃｌＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質の血漿半減期が最も長かった。これは、ＩＬ２１の安定性の向上が血漿半減期を増加させる重要な理由であることを示唆した。
３．ＩＬ２１融合タンパク質により刺激されたＴ細胞増殖の判定
１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質の機能活性を、ＢＴ４７４乳癌担癌マウスモデルを用いて検出した。１．５×１０７ヒトＢＴ４７４乳癌細胞をマウスの右腹部または背部に接種した。前記融合タンパク質を３５日後に投与した。マウスにおける１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質とハーセプチンの刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を検出した。結果を図１２に示す。１６ｃｌ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質群では、腫瘍接種後約５３日目に末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が明らかな増加を示した。一方、ハーセプチン群のＴ細胞は緩やかに減少する傾向を示した。
４．ＩＬ２１融合タンパク質の腫瘍抑制効果
１６ｃＩＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質の腫瘍抑制効果を、ＢＴ４７４乳癌担癌マウスモデルを用いて検出した。それぞれのマウスに１×１０７のＢＴ４７４細胞（ヒト乳癌細胞）を接種した。マウスに、ＰＢＳ（コントロール）、ハーセプチン（ハーセプチン単独）、１６ｃｌＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質（ＩＬ－２１ｍｕｔａｎｔ－ハーセプチン）および１６ｃｌＬ２１／４とハーセプチンの混合液（ＩＬ－２１ｍｕｔａｎｔ＋ハーセプチン）を４日に１回腹腔内注射した。各注射の用量は５００μｇであった。結果を図１３に示す。コントロール群、ハーセプチン群、および混合溶液群と比較して、１６ｃｌＬ２１／４－ハーセプチン融合タンパク質群は腫瘍体積を有意に減少させた。
最後に、上記の例は、当業者が本発明の本質を理解するのを助けるためにのみ使用され、本発明の保護範囲を限定するために使用されるべきではないことに留意されたい。

Claims (8)

  1. （１）野生型インターロイキン－２１（ＩＬ２１）のアミノ酸配列の１６位のＩＬＥおよび７０位のＳＥＲの両者が、それぞれ、ＣＹＳに変異され、前記２つの変異ＣＹＳの間にジスルフィド結合が形成され、前記野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列が配列番号１に示される、または
    （２）野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列の１６位のＩＬＥ、１７位のＶＡＬ、７０位のＳＥＲ、および１１２位のＬＹＳの全てが、それぞれ、ＣＹＳに変異され、１６位と７０位との間、および１７位と１１２位との間にジスルフィド結合の２つのグループが形成され、前記野生型ＩＬ２１のアミノ酸配列が配列番号１に示される、
    ことを特徴とする、（１）配列番号３に示される、又は（２）配列番号５に示される、インターロイキン－２１（ＩＬ２１）変異体。
  2. （１）インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）のアミノ酸配列の１６位のＩＬＥおよび７０位のＳＥＲの両者が、それぞれ、ＣＹＳに変異され、前記２つの変異ＣＹＳの間にジスルフィド結合が形成され、または
    （２）インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）のアミノ酸配列の１６位のＩＬＥ、１７位のＶＡＬ、７０位のＳＥＲ、および１０６位のＬＹＳの全てが、それぞれ、ＣＹＳに変異され、１６位と７０位との間、および１７位と１０６位との間にジスルフィド結合の２つのグループが形成され、
    前記インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）のアミノ酸配列が配列番号２に示される、
    ことを特徴とする、（１）配列番号４に示される、又は（２）配列番号６に示される、インターロイキン－２１およびインターロイキン－４キメラタンパク質（ＩＬ２１／４）変異体。
  3. 請求項１記載のＩＬ２１変異体または請求項２記載のＩＬ２１／４変異体をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
  4. 請求項１記載のＩＬ２１変異体または請求項２記載のＩＬ２１／４変異体を含む融合タンパク質であって、
    （１）前記ＩＬ２１変異体または前記ＩＬ２１／４変異体である機能性断片１と、
    （２）モノクローナル抗体機能を有する機能性断片２と、
    異なる前記機能性断片を連結する連結ドメインと、
    を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
  5. 請求項１記載のＩＬ２１変異体、請求項２記載のＩＬ２１／４変異体または請求項４記載の融合タンパク質を含む、免疫調整用または免疫活性化用医薬品。
  6. 請求項１記載のＩＬ２１変異体、請求項２記載のＩＬ２１／４変異体または請求項４記載の融合タンパク質を含む、抗腫瘍用医薬品。
  7. 請求項１記載のＩＬ２１変異体、請求項２記載のＩＬ２１／４変異体または請求項４記載の融合タンパク質を含む、Ｂ細胞の分化および増殖、Ｔ細胞の分化および増殖、またはＮＫ細胞の分化および増殖の促進剤。
  8. 請求項１記載のＩＬ２１変異体、請求項２記載のＩＬ２１／４変異体または請求項４記載の融合タンパク質を有効成分として含み、
    治療有効量の前記ＩＬ２１変異体、前記ＩＬ２１／４変異体または前記融合タンパク質と、
    医薬賦形剤と、
    を含む、医薬組成物。
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