JP2021536435A - 核酸とcar修飾免疫細胞とを含む治療薬およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)腫瘍および/または癌の治療のための治療薬であって:
(a)第1の組成物であって、前記第1の組成物が、第1の活性成分を第1の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第1の活性成分が、腫瘍細胞および/または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており;前記標識ペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含んでおり;かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第1の組成物と;および
(b)第2の組成物であって、これにおいて前記第2の組成物が、第2の活性成分を第2の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第2の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み;前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る、該第2の組成物と、
を含む該治療薬。
(2)前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、(1)の治療薬。
(3)前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および他の全ての非哺乳類タンパク質を含む、(2)の治療薬。
(4)前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ:Mycタグ、HAタグ、StrepタグII、Flagタグ、HATタグ、Sタグ、S1タグ、プロテインCタグ、tag−100タグ、E2タグ、TAPタグ、HSVタグ、KT3タグ、V5タグ、VSV−Gタグ、Hisタグ、またはRFPタグ、のアミノ酸配列を含む、(1)の治療薬。
(5)前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5に示される通りである、(1)の治療薬。
(6)前記スペーサー部位が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し;好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号:6に示される通りであり;ここで前記膜貫通部位が、CD8,CD3ζ、CD4,またはCD28の膜貫通領域に由来し;好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号:7に示される通りである、(1)の治療薬。
(7)前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、または配列番号:15に示される通りである、(1)の治療薬。
(8)前記核酸がDNAまたはRNAを含み;かつ前記RNAが前記DNAから転写されたmRNAを含む、(1)の治療薬。
(9)前記第1の活性成分が、組換えウイルスであり、かつ前記組換えウイルスのゲノムが前記標識ポリペプチドコード配列を有しており;ここで、前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、(1)の治療薬。
(10)前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し;好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ(Malaba)ウイルスに由来する、(9)の治療薬。
(11)前記キメラ抗原受容体が、動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含み、かつ前記抗原結合ドメインが、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合する、(1)の治療薬。
(12)前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号:42、配列番号:43、または配列番号:44に示される通りである、(11)の治療薬。
(13)前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来しており、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、CD3ζまたはDAP12の細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され;前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、4−1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、および/またはICOSSの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、(11)の治療薬。
(14)前記スペーサー領域が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通領域が、CD8α、CD3ζ、CD4、またはCD28の膜貫通領域に由来する、(11)の治療薬。
(15)前記キメラ抗原受容体の前記アミノ酸配列が、配列番号:46、配列番号:47、または配列番号:48に示される通りである、(11)の治療薬。
(16)前記免疫細胞が、T細胞またはNK細胞を含む(1)の治療薬であって;ここで前記NK細胞が、自家NK細胞、同種NK細胞、またはNK細胞株を含み、かつ前記T細胞が、ナイーブT細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞、NKT細胞、またはT細胞株を含む、(1)の治療薬。
(17)前記第1の組成物および前記第2の組成物が、一緒に混合されることなく、別々に治療薬中に存在する、(1)の治療薬。
(18)前記第1の組成物が、治療上有効な量の前記DNAまたは治療上有効な量の前記mRNAを含む、(8)の治療薬。
(19)前記第1の組成物が、治療上有効な量の前記組換えウイルスを含む、(9)の治療薬。
(20)前記第2の組成物が、治療上有効な量の前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含む、(1)の治療薬。
(21)前記DNAが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され;かつ前記mRNAが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、(8)の治療薬。
(22)前記組換えウイルスが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、(9)の治療薬。
(23)前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、静脈内または局所に投与されるべく製剤化されている、(1)の治療薬。
(24)前記治療薬が第1の組成物と第2の組成物とから構成される、(1)の治療薬。
(25)腫瘍および/または癌の治療のための薬物の調製における、(1)から(24)のいずれか1つの治療薬の使用。
(26)前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、(25)の使用。
(27)標識ポリペプチドであって、前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有すること、および前記標識ポリペプチドが、腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得ること;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列が、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含むこと;かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列が、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まないこと、を特徴とする該標識ポリペプチド。
(28)前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、(27)の標識ポリペプチド。
(29)前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および全ての他の非哺乳類タンパク質を含む、(28)の標識ポリペプチド。
(30)前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ:Mycタグ、HAタグ、StrepタグII、Flagタグ、HATタグ、Sタグ、S1タグ、プロテインCタグ、tag−100タグ、E2タグ、TAPタグ、HSVタグ、KT3タグ、V5タグ、VSV−Gタグ、Hisタグ、またはRFPタグ、のアミノ酸配列を含む、(27)の標識ポリペプチド。
(31)前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5に示される通りである、(27)の標識ポリペプチド。
(32)前記スペーサー部位が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し;好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号:6に示される通りであり;ここで前記膜貫通部位が、CD8,CD3ζ、CD4,またはCD28の膜貫通領域に由来し;好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号:7に示される通りである、(27)の標識ポリペプチド。
(33)前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、または配列番号:15に示される通りである、(27)の標識ポリペプチド。
(34)(27)から(33)のいずれか1つの標識ポリペプチドのコード配列を有する、単離された核酸。
(35)前記核酸が、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および(27)から(33)の任意の1つの標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、(34)の核酸。
(36)前記核酸が、DNAおよびmRNAを含む、(34)の核酸。
(37)組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および(27)から(33)のいずれか1つの前記標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、該組換え発現ベクター。
(38)単離された組換えウイルスであって、前記組換えウイルスのゲノムが、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および(27)から(33)のいずれか1つの標識ポリペプチドのコード配列を含んでおり、かつこれにおいて、前記標識ポリペプチドが腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;かつ前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、該単離された組換えウイルス。
(39)前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、かつ前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し;好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ(Malaba)ウイルスに由来する、(38)の組換えウイルス。
(40)動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、かつ前記抗原結合ドメインが、(27)から(33)のいずれか1つの標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする、該キメラ抗原受容体。
(41)前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号:42、配列番号:43、または配列番号:44に示される通りである、(40)のキメラ抗原受容体。
(42)前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来し、これにおいて、細胞内活性化シグナル伝達領域が、CD3ζまたはDAP12の前記細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され;前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、4−1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、および/またはICOSSの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、(40)のキメラ抗原受容体。
(43)前記スペーサー領域が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し、かつ前記膜貫通領域が、CD8α、CD3ζ、CD4、またはCD28の膜貫通領域に由来する、(40)のキメラ抗原受容体。
(44)前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列が、配列番号:46、配列番号:47、または配列番号:48に示される通りである、(40)のキメラ抗原受容体。
(45)(40)から(44)の任意の1つのキメラ抗原受容体のコード配列を有する、単離されたDNA。
(46)そのヌクレオチド配列が、配列番号:53、配列番号:54、または配列番号:55に示される通りである、(45)のDNA。
(47)(45)または(46)のDNAから転写された、単離されたmRNA。
(48)組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および(40)から(44)のいずれか1つのキメラ抗原受容体のコード配列を順次に含む、該組換え発現ベクター。
(49)キメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって、前記免疫細胞の表面が、(40)から(44)のいずれか1つのキメラ抗原受容体によって修飾される、該キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
(50)前記免疫細胞が、NK細胞またはT細胞である(49)のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって;ここで前記NK細胞が、自家NK細胞、同種NK細胞、またはNK細胞株を含み、かつ前記T細胞が、未発達型T細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞、NKT細胞、またはT細胞株を含む、該キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
(51)腫瘍および/または癌の治療のための相乗効果をもつ、コンビナトリアルドラッグのキットであって:
(1)から(24)のいずれか1つの治療薬の前記第1の組成物を含む第1の容器と;
(1)から(24)のいずれか1つの治療薬の前記第2の組成物を含む第2の容器であって、これにおいて前記第1の容器が前記第2の容器から分離されている該容器と;および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含む該キット。
(52)腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、(34)から(36)のいずれか1つの核酸の使用。
(53)腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、(38)または(39)の組換えウイルスの使用。
(54)腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、(49)または(50)のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞の使用。
(55)腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、(51)のキットの使用。
(56)前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、(52)から(55)のいずれか1つの使用。
(57)腫瘍および/または癌を治療するための方法であって:
(1)から(24)のいずれか1つの治療薬の前記第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している患者に投与すること;および
(1)から(24)のいずれか1つの治療薬の前記第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を含む、該方法。
(58)以下の工程:
1)前記第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること;および
2)前記第1の組成物の投与後に、前記第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む、(57)の方法。
(59)前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、(57)の方法。
本発明は、腫瘍の治療におけるCAR修飾免疫細胞の効果を改善しかつ、腫瘍の治療におけるCAR修飾免疫細胞の適用を広げる目的で、腫瘍細胞および/または癌細胞の表面を標識するための外来標識ポリペプチドと、該標識ポリペプチドを認識するCAR修飾免疫細胞とを組合せた利用を提供して、腫瘍(特に固形腫瘍)抗原の発現の不均一性および腫瘍細胞および/または癌細胞の免疫監視からの回避という問題を効果的に解決し、腫瘍細胞および/または癌細胞に対するCAR修飾免疫細胞の認識感度を改善し、かつターゲティング/オフ・ターゲット毒性のリスクを効果的に低減して、それにより腫瘍細胞殺傷におけるCAR修飾免疫細胞の有効性を改善するようにする。腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性殺傷効果に加えて、腫瘍細胞における外来標識ポリペプチドの発現を媒介するベクターとして使用される場合、該標識ポリペプチドを標的とするCAR修飾免疫細胞は、腫瘍溶解性ウイルスに感染された残存する腫瘍細胞を効果的に除去することができる。同時に、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍微小環境を破壊することから、CAR修飾免疫細胞の腫瘍ホーミング能が改善されることとなり、それにより固形腫瘍の治療の有効性がさらに増強される。
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は、当該技術分野において一般的に認識される意味を包含する。
ウイルス粒子の数を指す。
(a)第1の組成物であって、前記第1の組成物が、第1の活性成分を第1の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第1の活性成分が、腫瘍細胞および/または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており;前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含んでおり;かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第1の組成物と;および
(b)第2の組成物であって、これにおいて前記第2の組成物が、第2の活性成分を第2の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第2の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み;前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合することができる、該第2の組成物と、
を含む該治療薬を提供する。
本発明は、具体的には、腫瘍細胞および/または癌細胞を修飾するべく使用される、標識ポリペプチドのアミノ酸配列を設計するが、ここで該標識ポリペプチドは、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、かつ腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含んでおり;これにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。
標識ポリペプチドコード配列は、細胞外抗原決定領域コード配列、スペーサー部位コード配列、および膜貫通部位コード配列を含んでおり、細胞外抗原決定領域コード配列は、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域をコードし、スペーサー部位コード配列は、標識ポリペプチドのスペーサー部位をコードし、そして膜貫通部位コード配列は、標識ポリペプチドの膜貫通部位をコードしている。細胞外抗原決定領域コード配列は、エピトープポリペプチドの1つ以上のコード配列を含み;これにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のコード配列は、エピトープポリペプチドのコード配列を含まない。
本発明の一実施形態においては、第1の活性成分は組換えウイルスであり、かつそのゲノムは、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および標識ポリペプチドコード配列を有しており;これにおいて、該組換えウイルスは、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む。
キメラ抗原受容体は、動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを順次に含む。抗原結合ドメインは、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る。スペーサー領域は、抗原結合ドメインと膜貫通領域とを分離するために使用され、かつ細胞内ドメインはシグナル伝達のために使用される。
本発明のキメラ抗原受容体のコードDNAは、動作可能なように連結された抗原結合ドメインコードエレメント、スペーサー領域コードエレメント、膜貫通コードエレメント、および細胞内ドメインコードエレメントを順次に含んでおり、それは、抗原結合ドメインコードエレメントによってコードされた抗原結合ドメインが本発明の標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする。
前記免疫細胞は、T細胞またはNK細胞を含み;ここでNK細胞は、自家NK細胞、同種NK細胞、またはNK細胞株を含み、かつT細胞は、未発達型T細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞、NKT細胞、またはT細胞株を含む。
本発明の治療薬の第1の組成物を含む第1の容器と;
本発明の治療薬の第2の組成物を含む第2の容器であって、これにおいて前記第1の容器が前記第2の容器から分離されている該容器と;および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含む、該キットも提供する。
本発明の治療薬の第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している患者に投与すること;および
本発明の治療薬の第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している該患者に投与すること、
を含む、該方法も提供する。
1)第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している患者に投与すること;および
2)第1の組成物の投与後に、治療薬の第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している該患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む。
PBMCは、健康なドナーの末梢血に由来する。
ヒト組換えIL−2(hrIL2)は、Peprotechより購入した。
DPBSは、Gibcoより購入した。
電気ショックカップは、Bio−Radより購入した。
他に特に指定しない限り、FBSはSigmaより購入した。
5x106個のJurkat、HCT116−luc、SKOV3−luc、またはSK−HEP−1細胞と、それぞれTT1(配列番号:11)、TT2(配列番号:12)、TT3(配列番号:13)、C1&2a(配列番号:14)、C1&2b(配列番号:15)コード配列(それぞれ調製例8の方法によって得られた)をもつ5μgのmRNAとを、それぞれエレクトロトランスファー液P3(製品名「P3Primary Cell 4D−XキットL」、Lonza、商品番号V4XP−3012)中で混合し、100μlのNucleocuvette(商標)チューブ(製品名「P3Primary Cell 4D−XキットL」、Lonza、商品番号V4XP−3012」)に入れて、氷浴中に5分間置いた。次に、4D−Nucleofector(商標)システム(Lonza)のエレクトロポレーターを使用し、かつその腫瘍細胞エレクトロトランスフェクションプログラムを用いてエレクトロトランスフェクションを行なった。エレクトロトランスフェクションの後、細胞を取出して、対応する腫瘍細胞培地中に置いた。Jurkat培地は、RPMI(Gibco)+10% FBS(Hyclone)、SKOV3−lucおよびHCT116−luc培地は、McCoy’s5A+10% FBSであり、かつSK−HEP−1培地は、EMEM(Gibco)+10% FBSである。DNase(Roche)を培地に添加して、10ng/mLの最終濃度とし、次いで37℃のインキュベーター内で5%CO2中に置いて、一晩回復させた。24時間後、細胞を収穫して、エレクトロトランスフェクトされた細胞をフローサイトメーター(BDより購入、C6Samplar)を用いて同定した。TT1、TT2、TT3、C1&2a、またはC1&2bでそれぞれ標識された腫瘍細胞が得られた。
調製例1の方法に従って、それぞれTT1(配列番号:11)、TT2(配列番号:12)、またはTT3(配列番号:13)コード配列(それぞれ調製例8の方法によって得られた)をもつmRNAを、Jurkat不死化Tリンパ球、ヒト卵巣癌細胞SKOV3−luc、ヒト結腸直腸癌細胞HCT116−luc、またはヒト肝臓癌細胞SK−HEP−1に対し、4D−Nucleofector(商標)システム(Lonza)により、それぞれエレクトロトランスフェクトした。染色は、FITCコンジュゲート抗Myc抗体(Santa Cruz)、FITCコンジュゲート抗HA抗体(Biolegend)、FITCコンジュゲート抗Strep−tagII抗体(Genscript)を用いて行なった(希釈率はそれぞれ1:50である)。細胞は、フローサイトメトリー(BDより購入、C6Samplar)により同定した。
2x106個のヒトPBMC細胞を、1mlのT細胞培地(1% ヒトAB血清(Valley Biomedical)を補足したAIMV(Gibco))中に再懸濁し、最終濃度100ng/mlのOKT3(eBioscience)、および300IU/mlのhrIL−2(Peprotech)を添加し、次いで24ウェルプレートの1つのウェル内へインキュベートし、5%CO2中で37℃の加湿された細胞培養インキュベーター(Thermo Fisher)内に置いた。最終濃度300IU/mlのhrIL−2を、2から3日ごとに補足した。新鮮なT細胞の細胞培地を、細胞増殖の状態に応じて補足して、細胞の数を1x106細胞/mlに調整した。
この実施例は、エレクトロトランスフェクションにより標識された後の、Jurkat細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、CAR−T細胞の殺傷能を試験した。調製例2の方法によって得られた、TT1またはTT2を標的とするCAR修飾T細胞、または非CAR修飾T細胞を、それぞれ、調製例1の方法によって得られた、エレクトロトランスフェクションによりTT1またはTT2で標識されたヒトT細胞系Jurkat細胞と、U型96ウェルプレートにおいて共培養し、上記のCAR−Tエフェクター細胞の、標的細胞に対する数の比(E:T)は、1.25:1から20:1の範囲である。各実験を3回繰返した。2時間の共培養の後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国)を用いて、CAR−T細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100.
この実施例は、エレクトロトランスフェクションにより標識された腫瘍細胞の殺傷について、CAR−T細胞の広範なスペクトルを試験した。調製例2の方法によって得られた、TT3を標的とするCAR修飾T細胞、または野生型T細胞(CARのネガティブコントロール群として)を、エレクトロトランスフェクションによりTT3で標識された、ヒトT細胞系Jurkat細胞またはヒト結腸直腸癌細胞系HCT116−lucと、U型96ウェルプレートにおいて共培養し、上述のエフェクター細胞の、標的細胞に対する数の比(E:T)は、2.5:1から20:1の範囲である。各実験を3回繰返した。2時間の共培養の後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国、より入手された)を用いて、CAR−T細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100.
この実施例は、本発明の標識ポリペプチドを標的とするCAR−T細胞の、標識された腫瘍細胞に対する特異性を試験した。調製例2の方法によって得られた、TT3を標的とするCAR−T細胞またはmGFP−Z修飾T細胞(GFP配列(Genbank番号はYP_002302326.1である)を、aTT3−CD8−41BB−CD3ζCARの抗原結合ドメインを置換えるべく使用し、CARのネガティブコントロール群として使用した)を、それぞれ、エレクトロトランスフェクションによりTT3で標識されているかまたは標識されていないヒト結腸直腸癌細胞系HCT116−lucと、U型96ウェルプレートにおいて共培養した。標的細胞に対するエフェクター細胞の数の比(E:T)は、5:1から20:1の範囲である。各実験を3回繰返した。2時間の共培養の後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国、より入手された)を用いて、CAR−T細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100.
2つのエピトープポリペプチドを1つの担体中にクローン化して、腫瘍細胞が2つのエピトープポリペプチドで同時に標識され得るようにし、それにより、異なるCAR−T細胞を用いて、標識された腫瘍細胞を同時にまたは順次に追跡して殺すことができる。さらに、調製例8に詳述される方法に従って、異なるスペーサー膜貫通領域を用いて、2つのエピトープポリペプチドをpFastbac1ベクター(Life Technologies)中にクローン化して、標識ポリペプチドC1&2aおよびC1&2bを発現するベクターが得られ(それぞれ、pFastbac1−C1&2aおよびpFastbac1−C1&2b)、次いでC1&2a(配列番号:14)およびC1&2b(配列番号:15)コード配列のmRNAを調製した。さらに、C1&2aまたはC1&2bで標識されたJurkat細胞を、調製例1の方法に従って得た。ここで、C1&2aは、Mycタグ由来の3つの反復したエピトープポリペプチドとHAタグ由来の3つの反復したエピトープポリペプチドとを含む。C1&2bは、Mycタグ由来の2つの反復したエピトープポリペプチドとHAタグ由来の2つの反復したエピトープポリペプチドとを含む。C1&2aのアミノ酸配列は、配列番号:14に示される通りであり、かつC1&2bのアミノ酸配列は、配列番号:15に示される通りである。標識ポリペプチドC1&2aのコード配列をもつ核酸のヌクレオチド配列は、配列番号:29に示される通りであり、かつ標識ポリペプチドC1&2bのコード配列をもつ核酸のヌクレオチド配列は、配列番号:30に示される通りである。
20x106個のヒトPBMC細胞と、2mLのNK細胞活性化剤1(Schenzhen Dakeweより購入、DKW35−CYT−NK001)とを、400mlの、NK培地(NK培地はAIM V(登録商標)培地(Life Technologiesより購入)+1%ヒト血清(Valley Biomedicalより購入、商品番号HP1022HI))中で均一に混合し、G−Rex100細胞培養装置(Wilson Wolfより購入)内に接種し、そしてIL2(最終濃度:50IU/ml)を添加し、37℃の細胞培養インキュベーター内に置き、IL2の体積全体(最終濃度:50IU/ml)を一日おきに補充し、10日間培養し、次いで細胞を収穫してカウント。収穫された細胞から20x106個の細胞を取り、400mlのNK培地中で別の2mLのNK細胞活性化剤1と均一に混合し、そして次にG−Rex100細胞培養装置に戻して、同じ条件においてさらに7日間培養した。上述の10日目の残りの細胞を、後の使用に向けて凍結し、16日目の細胞を収穫してカウントした。2x106個の細胞を、フローサイトメトリーによる細胞表現型分析用に取出した(それぞれ、抗CD3および抗CD56抗体を使用:PEコンジュゲート抗ヒトCD3抗体、およびAPCコンジュゲート抗ヒトCD56抗体(Miltenyiより購入)、1:50希釈)。
この実施例は、標識ポリペプチドを標的とするCAR修飾NK細胞の、エレクトロトランスフェクトされた標識されたSKOV3−lucまたはSK−HEP−1細胞に対する殺傷能力を試験した。TT3を標的とするCAR修飾NK細胞、またはmGFP−Z修飾NK細胞(GFP配列(Genbank番号はYP_002302326.1である)はaTT3−CD8−41BB−CD3ζCARの抗原結合ドメインを置換えるべく使用し、CARのネガティブコントロール群として使用した)を、それぞれ、エレクトロトランスフェクションによりTT3で標識された、ヒト卵巣癌細胞系SKOV3−luc、またはヒト肝臓癌細胞系SK−HEP−1と、U型96ウェルプレートにおいて共培養し、標的細胞に対するCAR−NKエフェクター細胞の数の比(E:T)は、10:1である。各実験を3回繰返した。2時間の共培養の後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国)を用いて、CAR−NK細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100.
まず、mRNA合成に使用可能な組換え発現ベクターpFastbac1−TT3を、Clal制限エンドヌクレアーゼを用いて直鎖化して、次に直鎖化されたフラグメントをゲル切出しによって回収した。4x105個のHCT116−luc細胞を、6ウェルプレートの1つのウェルに接種した。2μgの直鎖化されたプラスミドを、4μlのP3000(Life Technologiesより購入)および125μlのOpti−MEM(Gibco)と混合し、これを混合物1と命名し;6μlのLipo3000(Life Technologiesより購入)を125μlのOpti−MEMと混合し、これを混合物2と命名した。混合物1および混合物2を混合して、混合物3と命名し、次いで室温で15分間インキュベートした。6ウェルプレート内の培養液を捨て、2mlの、McCoy’s 5A+10%FBS培養液を添加し、そして混合物3を培養液に添加した。トランスフェクションの24時間後、培地を捨て、2mlの新鮮なMcCoy’s 5A+10%FBS培地で置換えた。1週間の培養の後、HCT116−luc細胞を、FITCコンジュゲート抗Strep−tagII抗体(Genscriptより購入、1:50まで希釈)を用いて染色し(4℃で30分間染色)、そしてBD FACSAriaIIソーターにより単一細胞ソーティングを行なった。TT3を発現する細胞(すなわち、FITC陽性)がソートされ、これを、増殖培養後に使用し得る。
TT3を標的とするキメラ抗原受容体のコード配列をもつDNAのヌクレオチド配列(配列番号:55に示される通り)を、第3世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクター(CD810A-1;System Biosciences)内へ、当該技術分野における通常の技術に従って挿入した。レンチウイルスは、HEK293FT細胞(Life Technologies)により産生された。ウイルス上清を収穫し、25,000rpmで3時間の超遠心分離により濃縮した。レンチウイルスが導入されたCAR−T細胞を調製するためには、まず、Ficoll−Paque密度勾配遠心分離(GE Healthcare)を用いて、健康なドナーの新鮮血からヒト末梢血単核球(PBMC)を単離した。単離されたPBMCをヒトCD3/CD28ダイナビーズ(dynabeads)(登録商標)(Life Technologies)を用いて活性化した後、それらを5%ヒトAB血清(Valley Biomedical)および300IU/mlのIL−2(Peprotech)を補足したAIM−V(Life Technologies)培地中で培養した。培養1週間後、活性化されたPBMC細胞を、TT3を標的とするキメラ抗原受容体の配列を含むレンチウイルスで感染させ、使用に先立ちさらに1週間培養した。
ヒト腫瘍を移植されたマウスモデルをさらに使用して、TT3を標的とするCAR−T細胞のインビトロの腫瘍殺傷効果を試験した。実験用マウスは、非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全/IL−2Rycnull(NSG)マウス(6週齢から8週齢、雌)であった。各マウスに、TT3で標識された1x107個のヒト結腸直腸細胞系HCT116−luc(調製例4によって調製された)を移植した。腫瘍移植の7日後、腫瘍増殖を、IVIS Spectrumイメージングプラットフォームにおいて、インビボの生物学的イメージング技術(BLI)を用いて観察し、腫瘍増殖を、イメージャー(PerkinElmer、米国より購入)を用いて記録した。同様のBLI強度(BLI強度は、インビボイメージャーによって記録された、マウス中の腫瘍細胞の蛍光強度を指す)をもつマウスを、各群に5匹のマウスで無作為に4つの群:リン酸緩衝食塩水(PBS)群、コントロールRNA CAR−T細胞群、TT3を標的とするRNA CAR−T細胞群、およびTT3を標的とするDNA CAR−T細胞群に分けた。コントロールRNA CAR−T(mGFPZ−CARでトランスフェクトした)およびTT3を標的とするRNA CAR−Tは、調製例2の方法によって調製され、TT3を標的とするDNA CAR−Tは、調製例5の方法によって調製された。CAR−T細胞群の全てのマウスに、マウス当たり1x107細胞/回を腹腔内に注射し、そしてPBS群の各マウスには、100μLのPBSを腹腔内注射した。細胞注射プロトコールは:腫瘍接種の7日目の注射である。マウスの挙動および生存を非常に注意深く観察し、腫瘍の発生状況をBLIによって記録した。全ての光シグナルおよび画像は、Xenogenインビボイメージングソフトウェアv2.5によって記録および分析した。
4x105個のCV−1細胞を、10%FBS(Sigma)を補足した2mlのDMEM(Gibco)中に再懸濁し、6ウェルプレート(Costar)の1つのウェル内に接種した。一晩インキュベートした後、古い培地を捨てた。ワクシニアウイルス(DDVV−RFP)を無血清DMEM培地で希釈し、1mlのウイルス希釈物(0.05MOI)を細胞に添加した。ウイルス感染の4時間後、ウイルスを含む培地を捨て、次いで5%FBSを含む2mlのDMEM培地を添加した。1.5μgのCas9タンパク質(IDTより購入)、9pmolのリーダーRNA−1、および9pmolのトレーサーRNA(IDTより購入)を、37.5μlのOpti−MEM(Gibco)中に希釈し、室温で10分間インキュベートして、混合物1と命名した。別の1.5μgのCas9タンパク質(IDTより購入)、9pmolのリーダーRNA−2、および9pmolのトレーサーRNA(IDTより購入)を、37.5μlのOpti−MEM(Gibco)中に希釈し、室温で10分間インキュベートして、混合物2と命名した。6μlのLipo3000(Life Technologiesより購入)および150μlのOpti−MEMを混合し、混合物3と命名した。混合物1、混合物2、および75μlの混合物3を一緒に混合し、室温で15分間インキュベートし、混合物4と命名した。2μgのドナープラスミドpFastbac1−TT3−PuroGFP(図3に示される通り)、4μlのP3000(Life Technologiesより購入)、および75μlのOpti−MEMを一緒に混合し、そしてさらに75μlの混合物3と混合し、室温で15分間インキュベートし、混合物5と命名した。最後に、混合物4および5を一緒に混合して、CV−1細胞の6ウェルプレートに添加した。トランスフェクションの48時間後、上清および細胞を収集し、凍結および融解を反復して、組換えワクシニアウイルスを得た。143B細胞を組換えワクシニアウイルスで感染させ、緑色蛍光をもつ組換え体を見ることができた。緑色蛍光を用いて、組換え体をスポットスクリーニングにより精製し、そしてTT3コード配列をもつ精製された組換えワクシニアウイルス(vvDD−TT3)が得られた。
0日目に、1.5x106細胞のSKOV3−luc、HCT116−luc、およびSK−HEP−1を、それぞれ10cmの細胞培養皿に接種した。1日目、細胞培地(SKOV3−lucおよびHCT116−lucの細胞培地は、McCoy5A+10%FBSであり、SK−HEP−1の培地は、EMEM+10%FBSであった)を捨てた。調製例6の方法によって得られた組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス(vvDD−TT3)を、それぞれ、5mlの対応する無血清細胞培地中に希釈し、次いで、SKOV3−luc、HCT116−luc、およびSK−HEP−1細胞培養皿にそれぞれ添加した。感染のMOIは、それぞれ0.02、0.2、0.02であり、細胞培養皿を30分ごとに穏やかに振とうした。2時間の感染後、ウイルス希釈物を捨て、5%FBSを含む細胞培地(Sigma)(SKOV3−lucおよびHCT116−lucは、McCoy5Aであり、SK−HEP−1培地は、EMEMであった)を添加した。46時間のさらなる培養の後、細胞を収穫した。ビオチンコンジュゲート抗Strep−tagII抗体(Genscript)を一次抗体として使用し、かつストレプトアビジン−APCを二次抗体として(双方とも1:50まで希釈された)染色に使用した。フローサイトメトメーター(BDより購入、C6 Samplar)を用いて、細胞表面上のTT3の発現を検出した。
この実施例は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染後の、標識されたSKOV3−lucまたはSK−HEP−1細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、CAR修飾NK細胞の殺傷能を試験した。調製例3の方法によって得られた、TT3を標的とするCAR修飾NK細胞、およびmGFP−Z修飾NK細胞(GFPを用いてaTT3−CD8−41BB−CD3ζ CARの抗原結合ドメインを置換えた;CARのネガティブコントロール群として使用)を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりTT3で標識された、SKOV3−lucおよびSK−HEP−1(調製例7の方法に従って得られた;各タイプの腫瘍細胞を、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染の48時間後にNK細胞と混合した)、および未標識のSKOV3−lucおよびSK−HEP−1と、U型96ウェルプレートにおいて共培養し、標的細胞に対するCAR−NKエフェクター細胞の数の比(E:T)は、10:1であった。各実験を3回繰返した。2時間の共培養後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国)を用いて、CAR−T細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100。
組換え発現ベクターpFastbac1−aTT1−CD8a−4−1BB−CD3ζ、pFastbac1−aTT2−CD8a−4−1BB−CD3ζ、pFastbac1−aTT3−CD8a−4−1BB−CD3ζの構築:当該技術分野における通常の技術に従いて、まず、順次にT7プロモーター、コザック配列をもつ5’UTR、GM−CSFα鎖シグナルペプチド、EcoRIと、SphIと、SalIと、HindIIIと、およびClaIとを含有する、マルチプルクローニングサイト、およびαグロブリン3’UTR(AIT Biotech)を含むフラグメントを合成し、次いでpFastbac1ベクター(Life Technologies)内に挿入し、ベクターpFBCMV−T7が構築されるようにした。次に、以下の配列:EcoRI制限部位のリンカー配列、TT1、TT2、またはTT3を標的とするキメラ抗原受容体のコード配列、およびSalI制限部位のリンカー配列、を含む別のフラグメントを合成した。pFBCMV−T7ベクターおよび合成された遺伝子フラグメントを、EcoRIおよびSalI(NEB)二重消化反応に供し、消化産物を、DNAフラグメント回収用のアガロースゲルDNA回収キットを用いて回収し、次いで連結してOne Shot(登録商標)Chemically Competent TOP10ケミカルコンピテントセル(Life Technologiesより購入)内に形質転換し、37℃で18時間培養した。単一クローンを採取し、37℃において250rpmで16時間培養し、プラスミドミニエクストラクションキット(Omega Bio Tekより購入)の使用によりプラスミドを抽出して、pFastbac1−aTT1−CD8a−4−1BB−CD3ζ、pFastbac1−aTT2−CD8a−4−1BB−CD3ζ、pFastbac1−aTT3−CD8a−4−1BB−CD3ζを得た。全てのプラスミドを、シーケンシングによって確認した。
再蒸留水(核酸酵素なし):25μL
2x KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix:25μL
P7(配列番号:15)(100μM):0.15μL
P8(配列番号:16)(100μM):0.15μL
ベクターDNA鋳型(500ng/μL):0.5μL
0日目に、1x106細胞のSK−HEP−1を、10cmの培養皿に接種した。1日目、細胞培地(EMEM+10%FBS)を捨てた。調製例6の方法によって得られた組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス(vvDD−TT3)を、5mlの対応する無血清細胞培地中に希釈し、次いでSK−HEP−1細胞培養皿に添加した。感染のMOIは、それぞれ0.25、または0.50であり、細胞培養皿を30分ごとに穏やかに振とうした。2時間の感染後、ウイルス希釈物を捨て、5%FBSを含むEMEM細胞培地(Sigma)を添加した。22時間のさらなる培養の後、細胞を収穫した。
この実施例は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によって標識されたSK−HEP−1細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、CAR修飾T細胞の殺傷能を試験した。調製例2の方法によって得られた、TT3を標的とするCAR修飾T細胞、およびmGFP−Z修飾T細胞(GFPを用いてaTT3−CD8−41BB−CD3ζ CARの抗原結合ドメインを置換えた;CARのネガティブコントロール群として使用)を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりTT3で標識されたSK−HEP−1(調製例9の方法に従って得られた;腫瘍細胞は、0.25MOIの組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた腫瘍細胞の感染の24時間後に、上述のT細胞と混合した;SK−HEP−1−vvDDとして表示された)、および未標識のSK−HEP−1(SK−HEP−1として表示された)と、U型96ウェルプレートにおいて共培養した。標的細胞に対するCAR−Tエフェクター細胞の数の比(E:T)は、40:1である(CAR−Tエフェクター細胞の数は2x105/ウェルである)。各実験を3回繰返した。3時間の共培養後、DELFIA EuTDA細胞傷害性キット(Perkin Elmer、米国)を用いて、CAR−T細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した:%特異的溶解=((実験群の放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))/(最大放出(読取値)−ブランク群の放出(読取値))x100。
この実験では、ELISAを用いて、標識ポリペプチドを標的とするCAR修飾NK細胞の、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで感染された標識されたSK−HEP−1細胞と一晩共培養された後の、GM−CSFの分泌を検査した。調製例3の方法に従って得られた、TT3を標的とするCAR修飾NK細胞およびmGFP−Z修飾NK細胞(GFPを用いてaTT3−CD8−41BB−CD3ζ CARの抗原結合ドメインを置換えた;CARのネガティブコントロール群として使用)を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりTT3で標識されたSK−HEP−1(調製例9の方法に従って得られた;これにおいて腫瘍細胞は、それぞれ0.25MOIまたは0.50MOIの組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた腫瘍細胞の感染後24時間に、上述のNK細胞と混合された;それぞれSK−HEP−1−vvDD(0.25MOI)およびSK−HEP−1−vvDD(0.5MOI)として示される)、TT3をコードするmRNAを用いたエレクトロトランスフェクションによってTT3で標識されたSK−HEP−1(調製例1の方法に従って得られた;SK−HEP−1−EPとして示される)、および未標識のSK−HEP−1(SK−HEP−1として示される)と、24ウェルプレートにおいて共培養した。上記のCAR−NKエフェクター細胞と標的細胞との数の比(E:T)は、5:1である(CAR−NKエフェクター細胞の数は2.5x104/ウェルである)。一晩の共培養の後、CAR−NK細胞によるGM−CSF分泌を、ヒトGM−CSF ELISA検出キット(R&D Company、米国)により検出した。各実験を2回繰返した。
この実験では、ELISAを用いて、標識ポリペプチドを標的とするCAR修飾T細胞の、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで感染された標識されたSK−HEP−1細胞と一晩共培養された後の、IFNγおよびGM−CSFの分泌を検査した。調製例3の方法に従って得られた、TT3を標的とするCAR修飾T細胞およびmGFP−Z修飾T細胞(GFPを用いてaTT3−CD8−41BB−CD3ζ CARの抗原結合ドメインを置換えた;CARのネガティブコントロール群として使用)を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりTT3で標識されたSK−HEP−1(調製例9の方法に従って得られた;これにおいて腫瘍細胞は、それぞれ0.25MOIまたは0.50MOIの組換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた腫瘍細胞の感染後24時間の、上述のT細胞と混合された;それぞれSK−HEP−1−vvDD(0.25MOI)およびSK−HEP−1−vvDD(0.5MOI)として示される)、TT3をコード化するmRNAを用いたエレクトロトランスフェクションによってTT3で標識されたSK−HEP−1(調製例1の方法に従って得られた;SK−HEP−1−EPとして示される)、および未標識のSK−HEP−1(SK−HEP−1として示される)と、24ウェルプレートにおいて共培養した。上記のCAR−NKエフェクター細胞と標的細胞との数の比(E:T)は、5:1である(CAR−NKエフェクター細胞の数は2.5x104/ウェルである)。一晩の共培養の後、ヒトIFNγ ELISA検出キット(Biolegend Company、米国)を用いて、CAR−T細胞によるIFNγの分泌を検出し、またヒトGM−CSF ELISA検出キット(R&D Company、米国)を用いて、CAR−T細胞によるGM−CSF分泌を検出した。各実験を2回繰返した。
実験用マウスは、非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全/IL−2Rycnull(NCG)マウス(6週齢から8週齢、雌、Jiangsu jicui Yaokang Biotechnology Co.,Ltdより入手)であった。各マウスに、1x107個のヒト肝臓癌細胞系SK−HEP−1を皮下移植した。腫瘍移植の6日後、良好な成形品質の80から120mm3の範囲の腫瘍サイズをもつ12匹のマウスを選択し、腫瘍内注射により、マウス当たり50μlの、5x106pfuのvvDD−TT3を注射した。ワクシニアウイルス注射の7、14、21、および29日後に、それぞれ3匹のマウスを無作為に犠牲にし、皮下の腫瘍組織を剥き出しにした。腫瘍組織を外科用メスによって中央から切断し、固定し、パラフィン中に包埋して、厚さ5μmの切片に調製した。全ての切片を、ヘマトキシリン(Shanghai Beyotime Biotechnology Co.,Ltd.)で核染色用に染色し、そしてTT3を、ビオチン抗Strep−tagII抗体(Genscript)を用いて同時に検出した。二次抗体は、ウサギ2段階検出キット(Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,Ltd.より入手)であり、かつ発色キットはDAB西洋ワサビペルオキシダーゼ発色キット(Shanghai Beyotime Biotechnology Co.,Ltd.より入手)であった。最後に、切片のパノラミックスキャンを、Jiangfeng自動デジタル病理切片スキャナーによって実施した。
実験用マウスは、非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全/IL−2Rycnull(NCG)マウス(6週齢から8週齢、雌、Jiangsu jicui Yaokang Biotechnology Co.,Ltdより入手)であった。各マウスに、1x107個のヒト肝臓癌細胞系SK−HEP−1を皮下移植した。腫瘍移植の6日後、良好な成形品質の80から120mm3の範囲の腫瘍サイズをもつ30匹のマウスを選択し、無作為に、各群に5匹のマウスで6つの群に分けた。第1の群は、「ブランクコントロール」群(IL−2/PBS/0.9%NaCl)であり、これにおいて、腫瘍接種の6日後に、50μlのPBSを腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、PBS注射の10日後(すなわち、投与後10日)に、100μlの0.9%NaClを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、および26日にIL−2を腹腔内注射した。第2の群は、「vvDD−TT3」群(すなわち、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの単剤群(IL−2/vvDD−TT3/0.9%NaCl))であり、これにおいて、腫瘍接種の6日後に、50μlのvvDD−TT3を腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、vvDD−TT3注射の10日後(すなわち、投与後10日)に、100μlの0.9%NaClを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、および26日にIL−2を腹腔内注射した。第3の群は、「NK mGFPZ」群(すなわち、ネガティブCAR−NKの単剤コントロール群(IL−2/PBS/NK mGFPZ)であり、これにおいて、腫瘍接種の6日後に、50μlのPBSを腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、PBS注射の10、13、16、19、23、26日後(すなわち、投与後10、13、16、19、23、26日)に、100μlのNK mGFPZを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、26日にIL−2を腹腔内注射した。第4の群は、「NK aTT3 CAR」群(すなわち、ポジティブCAR−NKの単剤群(IL−2/PBS/NK aTT3 CAR)であり、これにおいて、腫瘍接種の6日後に、50μlのPBSを腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、PBS注射の10、13、16、19、23、および26日後(すなわち、投与後10、13、16、19、23、26日)に、100μlのNK aTT3 CARを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、26日にIL−2を腹腔内注射した。第5の群は、「vvDD−TT3+NK mGFPZ」群(すなわち、組合せ投与コントロール群(IL−2/vvDD−TT3/NK mGFPZ)であり、これにおいては、腫瘍接種の6日後に、50μlのvvDD−TT3を腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、vvDD−TT3注射の10、13、16、19、23、および26日後(すなわち、投与後10、13、16、19、23、26日)に、100μlのNK mGFPZを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、26日にIL−2を腹腔内注射した。第6の群は、「vvDD−TT3+NK aTT3 CAR」群(すなわち、本発明の組合せ投与群(IL−2/vvDD−TT3/NK aTT3 CAR))であり、これにおいては、腫瘍接種の6日後に、50μlのvvDD−TT3を腫瘍内注射し(「投与後0日」として示される)、vvDD−TT3注射の10、13、16、19、23、および26日後(すなわち、投与後10、13、16、19、23、26日)に、100μlのNK aTT3 CARを腫瘍内注射し、そして投与後10、12、14、16、18、20、22、24、26日にIL−2を腹腔内注射した。NK mGFPZおよびNK aTT3 CARは、調製例3の方法に従って調製された。CAR−NK細胞は、マウス当たり1回当たり1x107細胞の腫瘍内注射として投与し、IL−2は、マウス当たり1回当たり20000IUの量で腹腔内に注射し、vvDD−TT3の投与用量は、マウス当たり5x106pfuであった。腫瘍の長径および短径を、グループ分けの日、第1の投与後の1週間に2回、および安楽死の前に、それぞれ、ノギスを用いて測定して記録した。腫瘍体積を計算し、腫瘍体積に基づいて腫瘍増殖曲線を描いた。腫瘍体積の計算式は、V=(1/2)x長径x短径2である。相対腫瘍体積(RTV)の計算式は、RTV=Vt/V0[式中、Vtは、各測定によって得られた腫瘍体積であり、V0は、最初の腫瘍体積(投与前)であった]である。腫瘍相対増殖率の計算式(T/C)%は、T/C%=(投与群の平均RTV/ブランクコントロール群の平均RTV)x100%であり、これにおいて、T/C%<40%の場合、モデル群のRTVに対する実験群のRTVは統計的にP<0.05であって、このことは、腫瘍増殖に対し阻害効果があることを意味する。反対に、T/C%>40%の場合には、腫瘍増殖に対する阻害効果はない。
Claims (59)
- 腫瘍および/または癌の治療のための治療薬であって:
(a)第1の組成物であって、前記第1の組成物が、第1の活性成分を第1の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第1の活性成分が、腫瘍細胞および/または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており;前記標識ペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含んでおり;かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第1の組成物と;および
(b)第2の組成物であって、これにおいて前記第2の組成物が、第2の活性成分を第2の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第2の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み;前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る、該第2の組成物と、
を含む該治療薬。 - 前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、請求項1に記載の治療薬。
- 前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および他の全ての非哺乳類タンパク質を含む、請求項2に記載の治療薬。
- 前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ:Mycタグ、HAタグ、StrepタグII、Flagタグ、HATタグ、Sタグ、S1タグ、プロテインCタグ、tag−100タグ、E2タグ、TAPタグ、HSVタグ、KT3タグ、V5タグ、VSV−Gタグ、Hisタグ、またはRFPタグ、のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の治療薬。
- 前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5に示される通りである、請求項1に記載の治療薬。
- 前記スペーサー部位が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し;好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号:6に示される通りであり;ここで前記膜貫通部位が、CD8,CD3ζ、CD4,またはCD28の膜貫通領域に由来し;好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号:7に示される通りである、請求項1に記載の治療薬。
- 前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、または配列番号:15に示される通りである、請求項1に記載の治療薬。
- 前記核酸がDNAまたはRNAを含み;かつ前記RNAが前記DNAから転写されたmRNAを含む、請求項1に記載の治療薬。
- 前記第1の活性成分が、組換えウイルスであり、かつ前記組換えウイルスのゲノムが前記標識ポリペプチドコード配列を有しており;ここで、前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、請求項1に記載の治療薬。
- 前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し;好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ(Malaba)ウイルスに由来する、請求項9に記載の治療薬。
- 前記キメラ抗原受容体が、動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含み、かつ前記抗原結合ドメインが、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合する、請求項1に記載の治療薬。
- 前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号:42、配列番号:43、または配列番号:44に示される通りである、請求項11に記載の治療薬。
- 前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来しており、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、CD3ζまたはDAP12の細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され;前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、4−1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、および/またはICOSSの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、請求項11に記載の治療薬。
- 前記スペーサー領域が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通領域が、CD8α、CD3ζ、CD4、またはCD28の膜貫通領域に由来する、請求項11に記載の治療薬。
- 前記キメラ抗原受容体の前記アミノ酸配列が、配列番号:46、配列番号:47、または配列番号:48に示される通りである、請求項11に記載の治療薬。
- 前記免疫細胞が、T細胞またはNK細胞を含む、請求項1に記載の治療薬。
- 前記第1の組成物および前記第2の組成物が、一緒に混合されることなく、別々に治療薬中に存在する、請求項1に記載の治療薬。
- 前記第1の組成物が、治療上有効な量の前記DNAまたは治療上有効な量の前記mRNAを含む、請求項8に記載の治療薬。
- 前記第1の組成物が、治療上有効な量の前記組換えウイルスを含む、請求項9に記載の治療薬。
- 前記第2の組成物が、治療上有効な量の前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含む、請求項1に記載の治療薬。
- 前記DNAが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され;かつ前記mRNAが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、請求項8に記載の治療薬。
- 前記組換えウイルスが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、請求項9に記載の治療薬。
- 前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、静脈内または局所に投与されるべく製剤化されている、請求項1に記載の治療薬。
- 前記治療薬が第1の組成物と第2の組成物とから構成される、請求項1に記載の治療薬。
- 腫瘍および/または癌の治療のための薬物の調製における、請求項1から請求項24のいずれか1項に記載の治療薬の使用。
- 前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項25に記載の使用。
- 標識ポリペプチドであって、前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有すること、および前記標識ポリペプチドが、腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得ること;前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列が、エピトープポリペプチドの1つ以上のアミノ酸配列を含むこと;かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列が、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まないこと、を特徴とする標識ポリペプチド。
- 前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、請求項27に記載の標識ポリペプチド。
- 前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および全ての他の非哺乳類タンパク質を含む、請求項28に記載の標識ポリペプチド。
- 前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ:Mycタグ、HAタグ、StrepタグII、Flagタグ、HATタグ、Sタグ、S1タグ、プロテインCタグ、tag−100タグ、E2タグ、TAPタグ、HSVタグ、KT3タグ、V5タグ、VSV−Gタグ、Hisタグ、またはRFPタグ、のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の標識ポリペプチド。
- 前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5に示される通りである、請求項27に記載の標識ポリペプチド。
- 前記スペーサー部位が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し;好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号:6に示される通りであり;ここで前記膜貫通部位が、CD8,CD3ζ、CD4,またはCD28の膜貫通領域に由来し;好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号:7に示される通りである、請求項27に記載の標識ポリペプチド。
- 前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、または配列番号:15に示される通りである、請求項27に記載の標識ポリペプチド。
- 請求項27から請求項33のいずれか1項に記載の標識ポリペプチドのコード配列を有する、単離された核酸。
- 前記核酸が、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および前記標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、請求項34に記載の核酸。
- 前記核酸が、DNAおよびmRNAを含む、請求項34に記載の核酸。
- 組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項27から請求項33のいずれか1項に記載の標識ポリペプチドのコード配列を順次に含む、組換え発現ベクター。
- 単離された組換えウイルスであって、前記組換えウイルスのゲノムが、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項27から請求項33のいずれか1つの前記標識ポリペプチドのコード配列を含んでおり、かつこれにおいて、前記標識ポリペプチドが腫瘍細胞および/または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得;かつ前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、単離された組換えウイルス。
- 前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、かつ前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し;好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ(Malaba)ウイルスに由来する、請求項38に記載の組換えウイルス。
- 順次にかつ動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、かつ前記抗原結合ドメインが、請求項27から請求項33のいずれか1項に記載の標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする、キメラ抗原受容体。
- 前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号:42、配列番号:43、または配列番号:44に示される通りである、請求項40に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来し、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、CD3ζまたはDAP12の前記細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され;前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、4−1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、および/またはICOSSの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、請求項40に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記スペーサー領域が、CD8αのヒンジ領域、IgGのヒンジ領域、またはIgDのヒンジ領域に由来し、かつ前記膜貫通領域が、CD8α、CD3ζ、CD4、またはCD28の膜貫通領域に由来する、請求項40に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列が、配列番号:46、配列番号:47、または配列番号:48に示される通りである、請求項40に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項40から44のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体のコード配列を有する、単離されたDNA。
- そのヌクレオチド配列が、配列番号:53、配列番号:54、または配列番号:55に示される通りである、請求項45に記載のDNA。
- 請求項45または46に記載のDNAから転写された、単離されたmRNA。
- 組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項40から44のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体のコード配列を順次に含む、組換え発現ベクター。
- キメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって、前記免疫細胞の表面が、請求項40から44のいずれか1項に記載のキメラ抗原受容体によって修飾される、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
- 前記免疫細胞が、NK細胞またはT細胞である、請求項49に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
- 腫瘍および/または癌の治療のための相乗効果をもつ、コンビナトリアルドラッグのキットであって:
請求項1から24のいずれか1項に記載の治療薬の前記第1の組成物を含む第1の容器と;
請求項1から24のいずれか1項に記載の治療薬の前記第2の組成物を含む第2の容器であって、これにおいて前記第1の容器が前記第2の容器から分離されている該容器と;および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含むキット。 - 腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項34から36のいずれか1項に記載の核酸の使用。
- 腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項38または39に記載の組換えウイルスの使用。
- 腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項49または50に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞の使用。
- 腫瘍および/または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項51に記載のキットの使用。
- 前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項52から55のいずれか1項に記載の使用。
- 腫瘍および/または癌を治療するための方法であって:
請求項1から24のいずれか1項に記載の治療薬の前記第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している患者に投与すること;および
請求項1から24のいずれか1項に記載の治療薬の前記第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を含む、該方法。 - 以下の工程:
1)前記第1の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること;および
2)前記第1の組成物の投与後に、前記第2の組成物を、腫瘍および/または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む、請求項57に記載の方法。 - 前記腫瘍および/または癌が:乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ(glucagon tumor)、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項57に記載の方法。
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