CN117247466A - 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种嵌合抗原受体，其包含编码来自靶向GPC3的scFv、铰链区、跨膜区、CD3ζ信号域、共刺激信号域、CD40L蛋白的基因；其中，scFv具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；共刺激信号域来自CD28；CD40L具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；CD3ζ信号域是天然CD3ζ信号域序列的如下变体之一：1)将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K；2)将天然CD3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；3)将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K、酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3， GPC3）的分离抗体、包含该抗体的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）、包含该嵌合抗原受体的细胞及其用途。
背景技术
肿瘤免疫细胞疗法尤其是嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor Tcell, CAR-T）在治疗恶性血液肿瘤方面已取得令人瞩目的疗效，在多项针对CD19及BCMA阳性的恶性血液肿瘤的临床研究中取得了巨大突破，在肝癌等实体瘤的临床前和探索性临床研究中也显示出较好的前景，为癌症患者带来了新希望。全球已有7款针对恶性血液肿瘤的CAR-T药物上市。
CAR-T技术结合了抗体的特异性及T细胞的杀伤效应，从而形成了一种过继性免疫的有效途径，CAR通常由胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激信号域和胞内CD3ζ信号域构成，CAR-T在实体瘤的治疗中通常面临疗效有限和脱靶效应等多重障碍。目前全球针对肝癌等恶性实体瘤的CAR-T药物研发尚处于临床试验阶段，国内外尚无相关产品上市。
GPC3在肝细胞癌（HCC）中高表达 (表达率约74.8%)，在肺鳞癌、卵黄囊瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等多种恶性实体瘤中也高表达，且在健康人肝脏、肾脏、胃等正常组织均不表达（Bi et al.,Oncotarget 8: 52866, 2017；Gao et al., Clin Cancer Res 20: 6418,2014）。靶向GPC3的单克隆抗体在临床试验中显示出很好的安全性（Abou-Alfa et al., JHepatol 65:289, 2016；Zhu et al., Clin Cancer Res, 19: 920, 2013）。全球公布的首个靶向GPC3的CAR-T细胞治疗晚期肝癌患者的早期临床研究结果显示（Shi et al., ClinCancer Res 19: 3259, 2020），CAR-T疗法在肝细胞癌中具有较好的安全性，13名患者中观察到了2例部分应答，显示出一定的临床应用潜力，但在疗效上仍有很大提升空间，因此如何通过合理的药物设计提高CAR-T治疗肝癌等实体瘤的疗效是需要解决的一个重要技术问题。
与血液瘤治疗比较，CAR-T在实体瘤患者体内接触靶抗原的几率低，且实体瘤微环境免疫抑制性强，CAR-T在实体瘤患者体内的扩增达峰值远远低于在血液瘤患者中的表现，这是CAR-T治疗实体瘤效果不佳的重要原因，因此实体瘤治疗需要CAR-T具有更强的杀伤活性、体内扩增能力和持续性。
发明内容
目前已知的靶向GPC3的CAR分子通常采用简单的二代CAR设计，其共刺激信号域和胞内CD3ζ信号域都采用野生型分子。本申请发明人发现，这些分子设计可能会导致CAR-T与靶分子结合时无法达到免疫突触形成的最佳结合状态，或者免疫突触形成后向胞内的信号传递过强或过弱，从而影响CAR-T细胞在体内的存活、扩增及对肿瘤细胞杀伤性能的持续性及整个免疫系统功能的调节，最终体现为临床疗效和安全性的差异。
胞内信号域是CAR-T活化和发挥杀伤作用的基础元件，其结构设计对CAR-T充分活化且持续生存至关重要。每个CD3ζ信号域具有3个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM），可以进行活化信号的放大。CD3ζ信号域的3个ITAM共有6个酪氨酸磷酸化位点，这6个酪氨酸位点发生磷酸化的次序及数目对T细胞是否能被激活起着关键作用，并对T细胞激活后的发育分化走向起着重要作用（Kersh et al., Science 281: 572, 2018）。CD3ζ信号域中冗余的ITAM活化可以促使T细胞分化和耗竭。此外，在CD3ζ信号域的活化过程中，其近膜区的空间构象也对免疫突触的形成起着重要作用（Guy et al., Immunol Rev 232: 7, 2009）。
因此，本申请申请人曾对CD3ζ信号域的近膜端和免疫受体酪氨酸激活基序的氨基酸进行突变，以改善CD3ζ信号域的信号活化强度和持续性（参考专利PCT/CN2021/076247）。
进一步地，本发明通过将CAR-T细胞共表达共刺激配体CD40L，以识别杀伤CD40阳性的肿瘤细胞，并活化CD40阳性的抗原呈递细胞，最终获得疗效更优的CAR-T细胞。
因此，本发明提供一种靶向GPC3的新型CAR，其包含编码来自靶向GPC3的人源化scFv、CD3ζ信号域和CD40L蛋白的基因。
具体地，本发明提供：
（1）嵌合抗原受体，其包含编码来自靶向GPC3的scFv、铰链区、跨膜区、CD3ζ信号域、共刺激信号域、以及CD40L蛋白的基因；其中，
所述scFv具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
所述共刺激信号域来自CD28；
所述CD40L具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
所述CD3ζ信号域是天然CD3ζ信号域序列的如下变体之一：
1）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K；
2）将天然CD3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
3）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K、以及酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
所述天然CD3ζ信号域序列是对应于NP_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位。
（2）根据上述（1）所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区或跨膜区来自CD8α、CD28、IgG1或IgG4。
（3）根据上述（1）或（2）所述的嵌合抗原受体，其进一步包含编码信号肽的基因。
（4）根据上述（1）至（3）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其中编码CD40L蛋白的基因通过连接肽连接在CD3ζ信号域的C端。
（5）根据上述（1）至（4）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其中所述CD3ζ信号域具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
（6）根据上述（1）至（5）中任意一项所述的嵌合抗原受体，其包含或具有SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列。
（7）一种分离的核酸，其编码上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原抗体。
（8）一种载体，其包含上述（7）所述的核酸。
（9）一种分离的细胞，其包含上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原抗体或上述（8）所述的载体，所述细胞不为生殖细胞或受精卵。
（10）根据上述（1）至（6）中任意一项所述的嵌合抗原受体、上述（7）所述的核酸、上述（8）所述的载体、上述（9）所述的细胞在制备治疗GPC3阳性的恶性肿瘤的药物中的用途。
（11）根据上述（10）所述的用途，其中所述药物用于制备治疗肝癌、肺癌、骨肉瘤或黑色素瘤的药物。
与现有CAR-T相比，包含本发明新型CAR的CAR-T细胞能显著提高靶向GPC3的CAR-T细胞在体内的杀伤能力、扩增效率和持续时间，提高杀伤肿瘤的效能，最终达到提高临床疗效和减少疾病复发的目的。
附图说明
图1显示GPC3 CAR慢病毒的转导效率。
图2是CAR-T制备过程中的总T细胞和CAR-T细胞增殖曲线。
图3显示 HepG2以及基因工程改造的HepG2细胞表面GPC3和CD40的表达。
图4是CAR-T-0和CAR-T-1对HepG2细胞的杀伤曲线。
图5显示CAR-T-1和CAR-T-2对含有不同GPC3和CD40表达水平的靶细胞的杀伤效应。
图6显示GPC3 CAR-T在HepG2细胞重复刺激下的扩增。
图7显示GPC3 CAR-T在Huh7和HepG2细胞刺激下的细胞因子分泌。
图8显示CAR-T-1和CAR-T-2对Daudi细胞表面抗原提呈相关蛋白表达的影响。
图9显示CAR-T制备过程中的总T细胞、CAR表达率及CAR-T细胞增殖曲线。
图10显示CAR-T在静息态下的分化和耗竭水平检测结果。
图11显示靶细胞重复刺激后肿瘤细胞和CAR-T细胞数量。
图12显示CAR-T-2在荷瘤小鼠中的肿瘤抑制作用（A）和体内扩增（B）。
具体实施方式
1. GPC3 CAR分子的scFv
本发明的GPC3 CAR分子的scFv由轻链可变区（VL）、连接子和重链可变区（VH）组成，其中VL和VH可以来源于特异识别GPC3靶点的单克隆抗体（参考专利CN200580000807.4），scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1，scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
2. GPC3 CAR分子信号域的设计
以天然CD3ζ信号域序列（对应于NP_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位）为基础，设计CAR分子的CD3ζ信号域，包括：
1）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
2）将天然CD3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F。
在一个实施方案中，优化的CD3ζ信号域包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列和SEQID NO：4所示核苷酸序列、或基本上由该序列组成、或由该序列组成。
在一个实施方案中，优化的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代，同时CD3ζ信号域C端增加P2A序列连接的CD40L蛋白。
CD40L的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5，核苷酸序列如SEQ ID NO: 6。
3. GPC3 CAR分子的组成
本发明涉及一种靶向GPC3的嵌合抗原受体，其包含编码信号肽、特异识别GPC3的scFv、铰链区、跨膜区、CD28共刺激信号域、CD3ζ信号域和CD40L的基因。
在一些具体实施方式中，信号肽是集落刺激因子2 受体α信号肽。
在一些具体实施方式中，scFv包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、或基本上由该序列组成、或由该序列组成。
在一些具体实施方式中，铰链区或跨膜区来自CD8α、CD28、IgG1或IgG4等。
在一些具体实施方式中，CD3ζ信号域是天然CD3ζ信号域序列（对应于NP_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位）的如下变体：
1）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
2）将天然CD3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F。
3）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K、以及酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F。
在一些更具体的实施方式中，CD3ζ信号域包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列和SEQID NO：4所示核苷酸序列、或基本上由该序列组成、或由该序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域的嵌合抗原受体（CAR-1），其具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和CD40L蛋白的嵌合抗原受体（CAR-2），其具有如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明以一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、天然的CD3ζ胞内信号域的嵌合抗原受体（CAR-0）为对比例，其具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明以一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和ICOSL蛋白的嵌合抗原受体（CAR-3）为对比例，其具有如SEQID NO：12所示的氨基酸序列；以一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和OX40L蛋白的嵌合抗原受体（CAR-4）为对比例，其具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；以一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和CD70蛋白的嵌合抗原受体（CAR-5）为对比例，其具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；以一种包含GPC3 scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和4-1BBL蛋白的嵌合抗原受体（CAR-6）为对比例，其具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明以一种包含对照GPC3 scFv（参考专利CN202110764887.1）、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ胞内信号域和CD40L蛋白的嵌合抗原受体（CAR-7）为对比例，其具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
序列说明
| SEQ ID NO | 说明 | 序列 |
| 1 | scFv氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS |
| 2 | scFv核苷酸序列 | gatgtcgtgatgacccagtccccactgtccctgccagtgacaccaggagagcctgcatccatctcttgccggagctcccagtctctggtgcacagcaacggcaatacctacctgcactggtatctgcagaagccaggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgtccaaccggttctctggagtgccagaccggttcagcggctccggctctggcaccgatttcacactgaagatcagcagggtggaggcagaggacgtgggcgtgtactattgctcccagaatacccacgtgccccctacatttggccagggcaccaagctggagatcaagGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTcaggtgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaagaagcctggagccagcgtgaaggtgtcctgtaaggcctctggctacaccttcacagattatgagatgcactgggtgcggcaggcacctggacagggactggagtggatgggcgccctggacccaaagaccggcgatacagcctactctcagaagtttaagggcagggtgaccctgacagccgacgagagcacctccacagcctatatggagctgtctagcctgcgcagcgaggataccgccgtgtactattgcacccgcttctacagttacacttattgggggcagggcactctggtcacagtctcttca |
| 3 | 优化的CD3ζ胞内信号域氨基酸序列 | RLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| 4 | 优化的CD3ζ胞内信号域核苷酸序列 | CGCCTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGGCCCCCGCCTACCAGAAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTTCCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGC |
| 5 | CD40L氨基酸序列 | IETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL |
| 6 | CD40L核苷酸序列 | atcgaaacatacaaccaaacttctccccgatctgcggccactggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttactgtttttcttatcacccagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttcatagaaggttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgatacagagatgcaacacaggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagccagtttgaaggctttgtgaaggatataatgttaaacaaagaggagacgaagaaagaaaacagctttgaaatgcaaaaaggtgatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaacaacatctgtgttacagtgggctgaaaaaggatactacaccatgagcaacaacttggtaaccctggaaaatgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcctctgcctaaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacagttccgccaaaccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccatggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactc |
| 7 | CAR-1氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| 8 | CAR-1核苷酸序列 | gatgtcgtgatgacccagtccccactgtccctgccagtgacaccaggagagcctgcatccatctcttgccggagctcccagtctctggtgcacagcaacggcaatacctacctgcactggtatctgcagaagccaggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgtccaaccggttctctggagtgccagaccggttcagcggctccggctctggcaccgatttcacactgaagatcagcagggtggaggcagaggacgtgggcgtgtactattgctcccagaatacccacgtgccccctacatttggccagggcaccaagctggagatcaagGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTcaggtgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaagaagcctggagccagcgtgaaggtgtcctgtaaggcctctggctacaccttcacagattatgagatgcactgggtgcggcaggcacctggacagggactggagtggatgggcgccctggacccaaagaccggcgatacagcctactctcagaagtttaagggcagggtgaccctgacagccgacgagagcacctccacagcctatatggagctgtctagcctgcgcagcgaggataccgccgtgtactattgcacccgcttctacagttacacttattgggggcagggcactctggtcacagtctcttcaATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGCCTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGGCCCCCGCCTACCAGAAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTTCCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGC |
| 9 | CAR-2氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL |
| 10 | CAR-2核苷酸序列 | gatgtcgtgatgacccagtccccactgtccctgccagtgacaccaggagagcctgcatccatctcttgccggagctcccagtctctggtgcacagcaacggcaatacctacctgcactggtatctgcagaagccaggccagagcccccagctgctgatctacaaggtgtccaaccggttctctggagtgccagaccggttcagcggctccggctctggcaccgatttcacactgaagatcagcagggtggaggcagaggacgtgggcgtgtactattgctcccagaatacccacgtgccccctacatttggccagggcaccaagctggagatcaagGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTcaggtgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaagaagcctggagccagcgtgaaggtgtcctgtaaggcctctggctacaccttcacagattatgagatgcactgggtgcggcaggcacctggacagggactggagtggatgggcgccctggacccaaagaccggcgatacagcctactctcagaagtttaagggcagggtgaccctgacagccgacgagagcacctccacagcctatatggagctgtctagcctgcgcagcgaggataccgccgtgtactattgcacccgcttctacagttacacttattgggggcagggcactctggtcacagtctcttcaATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGCCTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGAGGCCCCCGCCTACCAGAAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTTCCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCGGCAGCGGCGCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTatgatcgaaacatacaaccaaacttctccccgatctgcggccactggactgcccatcagcatgaaaatttttatgtatttacttactgtttttcttatcacccagatgattgggtcagcactttttgctgtgtatcttcatagaaggttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcatgaagattttgtattcatgaaaacgatacagagatgcaacacaggagaaagatccttatccttactgaactgtgaggagattaaaagccagtttgaaggctttgtgaaggatataatgttaaacaaagaggagacgaagaaagaaaacagctttgaaatgcaaaaaggtgatcagaatcctcaaattgcggcacatgtcataagtgaggccagcagtaaaacaacatctgtgttacagtgggctgaaaaaggatactacaccatgagcaacaacttggtaaccctggaaaatgggaaacagctgaccgttaaaagacaaggactctattatatctatgcccaagtcaccttctgttccaatcgggaagcttcgagtcaagctccatttatagccagcctctgcctaaagtcccccggtagattcgagagaatcttactcagagctgcaaatacccacagttccgccaaaccttgcgggcaacaatccattcacttgggaggagtatttgaattgcaaccaggtgcttcggtgtttgtcaatgtgactgatccaagccaagtgagccatggcactggcttcacgtcctttggcttactcaaactc |
| 11 | CAR-0氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR |
| 12 | CAR-3氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRLGSPGLLFLLFSSLRADTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAATWSILAVLCLLVVVAVAIGWVCRDRCLQHSYAGAWAVSPETELTGHV |
| 13 | CAR-4氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL |
| 14 | CAR-5氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP |
| 15 | CAR-6氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE |
| 16 | CAR-7氨基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTLGENASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFIQRPGQSPRILIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRLKFSRSAEAPAYQKGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL |
实施例
实施例1：GPC3 CAR分子的设计
本实施例以设计具有优化的CD3ζ信号域和CD40L蛋白的GPC3 CAR分子，以及CAR-T细胞制备为例。
CD3ζ信号域设计原则：通过对CD3ζ胞内信号区与信号传递相关的氨基酸位点进行改造，最终达到改善CAR-T细胞胞内信号传递通路，提升CAR-T细胞的扩增能力和持续能力，进而提升CAR-T细胞抗瘤性能。
共刺激分子CD40L设计原则：通过引入共刺激配体CD40L分子，一方面识别杀伤CD40阳性的肿瘤细胞，另一方面活化CD40阳性的抗原呈递细胞，最终获得疗效更优的CAR-T细胞。
GPC3 CAR的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO: 1，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2。将上述scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、及优化的CD3ζ信号域连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-1），其具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。将上述scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ信号域、及CD40L连接形成嵌合抗原受体CAR（CAR-2），其具有如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。
实施例2：GPC3 CAR慢病毒转移质粒的构建和慢病毒制备
1）将两端分别带有限制性酶切位点XbaI和SalI的编码N末端带有Strep tag II的GPC3CAR的嵌合基因通过基因合成的方法合成（北京博迈德基因技术有限公司），即设计合成相互重叠的单链寡核苷酸引物，利用重叠延伸方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中（参考文献Protein Eng, 1992, 5: 8277-829）。
2）通过限制性酶切的方法，将含有步骤1）合成的基因片段的质粒用XbaI和SalI（ThermoFisher，Waltham，MA，USA）双酶切，获得编码N末端带有Strep tag II的GPC3 CAR的基因片段。
3）通过限制性酶切的方法，将慢病毒载体pLenti6.3/V5（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）用XbaI和SalI双酶切，并与步骤2）获得的基因片段连接，获得载带靶向GPC3 CAR基因的慢病毒转移质粒。
4）将慢病毒包装质粒pLP/VSVG, pLP1/MDK, pLP2/RSK（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）与步骤3）获得的慢病毒转移质粒，用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）转染至HEK293T细胞，48小时后收集培养基，300 g离心去除细胞碎片后，用超速离心机25000 rpm离心3小时。将沉淀用1 mL生理盐水溶解，即为所需的慢病毒载体。
实施例3：CAR-T细胞制备
本实施例以含有上述scFv、天然的来自CD28共刺激信号域、天然的来自CD3ζ胞内信号域连接形成的嵌合抗原受体CAR（CAR-0）为对照。
使用CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）从健康志愿者的外周血单个核细胞（妙通（上海）生物科技有限公司，中国）中分离T细胞（记为Day 0时间点），将分离得到的T细胞在含IL-2（500 IU/mL，北京双鹭药业股份有限公司）的新鲜X-VIVO 15培养体系中培养48小时后，用上述慢病毒载体感染T细胞。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并于上述培养体系中继续培养。在细胞培养的不同时间点，取1×10^6个细胞，用磁力架去除Dynabeads，与PE标记的Strep tag II抗体（北京艺妙神州医药科技有限公司制备，具体方法详见专利ZL202011421882.0）和APC标记的CD40L抗体（Biolegend）室温孵育20分钟后，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，SanDiego，CA，USA）检测CAR-T-0、CAR-T-1和CAR-T-2细胞的CAR含量，以及CAR-T-2细胞表面CD40L含量。图1A显示，在慢病毒感染MOI=1时，各CAR基因在慢病毒感染后3天的转导效率在70%以上，且在感染后7天内保持稳定。图1B显示，在CAR-2慢病毒感染T细胞后3天，约72%的T细胞为CAR和CD40L双阳性的细胞，且在CAR-2阳性的细胞中，95%以上的细胞均稳定表达CD40L。
在CAR-T培养的不同时间点（Day 5、Day 9、Day 13、Day 17、Day21），对培养体系中的总T细胞计数，根据上述检测出的CAR阳性率，计算出培养体系中的CAR-T细胞数，绘制T细胞和CAR-T细胞扩增曲线，如图2A和图2B所示。
实施例4：GPC3 CAR-T杀伤靶细胞的效率
本实施例以检测包含上述scFv、CD28共刺激信号域、不同CD3ζ信号域、以及共表达或不共表达CD40L的CAR-T（CAR-T-0、CAR-T-1和CAR-T-2）对表达GPC3的靶细胞的杀伤效率为例。
将GPC3表达阳性的肝癌细胞系HepG2细胞与APC标记的CD40L抗体（Biolegend）室温孵育20分钟后，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA）检测CD40表达，发现HepG2呈GPC3和CD40双阳性（命名为HepG2GPC3+CD40+），于是将HepG2通过电转导的方法，转导了靶向GPC3的sgRNA（购自金斯瑞生物科技）和Cas9蛋白（购自恺佧生物）形成的复合物，通过单克隆筛选获得了GPC3敲除的HepG2细胞（HepG2GPC3-CD40+）；将HepG2通过电转导的方法，转导了靶向CD40的sgRNA（购自金斯瑞生物科技）和Cas9蛋白形成的复合物，通过单克隆筛选获得了CD40敲除的HepG2细胞（HepG2GPC3+CD40-）；将HepG2细胞感染载带CD40全基因的慢病毒载体，通过单克隆筛选获得了过表达CD40的HepG2细胞（HepG2GPC3+CD40++）；将HepG2GPC3-CD40+通过电转导的方法，转导了靶向CD40的sgRNA和Cas9蛋白形成的复合物，通过单克隆筛选获得CD40敲除的细胞（HepG2GPC3-CD40-）；将HepG2GPC3-CD40+感染载带CD40全基因的慢病毒载体，通过单克隆筛选获得了过表达CD40的细胞（HepG2GPC3-CD40++），各种靶细胞表面GPC3和CD40的表达如图3。
在细胞无标记实时杀伤检测仪（Agilent xCELLigence RTCA SP）配套的96孔板E-Plate孔中加入50 μL肿瘤细胞用培养基，放置于RTCA Station上，进行仪器自检；取出E-plate 96，在孔中加入100 μL（10^4个/孔）混合均匀的肿瘤细胞悬液，室温放置30 min；将E-plate 96放到培养箱中的RTCA Station上，过夜检测细胞增殖曲线。收集培养瓶中培养的CAR-T细胞，400×g离心5 min，用X-VIVO 15培养基重悬细胞，将细胞配制成密度为1×10^6个/mL，流式检测CAR表达率；取出E-plate96，置于生物安全柜中，用移液器从每个孔中吸出50 μL上清液；根据所需的E: T比、CAR表达率，计算每组CAR-T细胞所需添加体积，以每组两个平行，将各组CAR-T细胞加入至相应孔中，然后补加培养基至100 μL，阴性对照组（未转导的T细胞）补加培养基至100 μL。将E-Plate 96检测板置于实时杀伤仪器上开始监测，观察CAR-T对肿瘤细胞的杀伤作用。
图4显示，在效靶比（CAR-T：肿瘤细胞）为1:1时，CAR-T-0和CAR-T-1均能有效杀伤HepG2细胞（HepG2GPC3+CD40+），说明野生型CD3ζ信号域和突变的CD3ζ信号域均能诱导CAR-T对抗原阳性的靶细胞产生杀伤效应。
进一步地，图5比较了CAR-T-1和CAR-T-2对含有GPC3和CD40不同表达水平的HepG2细胞的杀伤效应，包括HepG2GPC3+CD40+、HepG2GPC3+CD40-、HepG2GPC3+CD40++、HepG2GPC3-CD40+、HepG2GPC3-CD40-、HepG2GPC3-CD40++，发现针对GPC3阳性的HepG2细胞（HepG2GPC3+CD40++、HepG2GPC3+CD40+、HepG2GPC3+CD40-），与阴性对照T细胞相比，两种CAR-T在各效靶比下均能有效杀伤靶细胞；针对GPC3和CD40均阴性的HepG2细胞，与阴性对照T细胞相比，两种CAR-T均无法杀伤HepG2GPC3-CD40-细胞，说明CAR-T-1和CAR-T-2只特异识别GPC3靶点，当靶细胞表面缺乏GPC3时，无法通过CAR激活T细胞发挥效应，且CAR-T-2中过表达的CD40L不能影响CD40阴性的靶细胞的活力；而针对GPC3阴性且CD40阳性表达的HepG2细胞，与阴性对照T细胞相比，CAR-T-1无法促进HepG2GPC3-CD40+和HepG2GPC3-CD40++靶细胞死亡，进一步说明了CAR-T-1识别GPC3的特异性，但CAR-T-2在效靶比为5:1时能略微增强CD40弱表达的靶细胞HepG2GPC3-CD40+死亡，在效靶比为1:1和5:1时能显著增强CD40强表达的靶细胞HepG2GPC3-CD40++死亡，说明CAR-T-2细胞表面过表达的CD40L能帮助CAR-T诱导GPC3抗原阴性但CD40阳性的肿瘤细胞凋亡。
实施例5：GPC3 CAR-T在靶细胞刺激下的增殖
本实施例以检测包含上述scFv、CD28共刺激信号域、不同CD3ζ信号域、以及共表达或不共表达CD40L的CAR-T（CAR-0、CAR-1和CAR-2）在表达GPC3的HepG2靶细胞刺激下的增殖效率为例。
向6孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning, NY, USA）每孔中加入2×10^5个CAR-T细胞，每隔两天按E: T = 1: 1加入HepG2细胞刺激，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，重复刺激3次后，用台盼蓝将细胞染色计活细胞总数，并将细胞用的偶联PE荧光分子的Strep tag II抗体和APC标记的CD3抗体（Biolegend）孵育，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，SanDiego，CA，USA）检测各组细胞中CAR-T细胞的比例，计算出各组中CAR-T细胞的数量。
图6显示，在HepG2细胞重复刺激后，CAR-1和CAR-2的扩增效率均优于CAR-0，说明与野生型的CD3ζ信号域相比，突变的CD3ζ信号域能增强CAR-T在靶细胞刺激后的扩增效率。
实施例6：GPC3 CAR-T在靶细胞刺激下的细胞因子分泌
本实施例以检测包含上述scFv、CD28共刺激信号域、不同CD3ζ信号域、以及共表达或不共表达CD40L的CAR-T（CAR-T-0、CAR-T-1和CAR-T-2）在表达GPC3的Huh7或HepG2靶细胞刺激下的细胞因子分泌为例。
向96孔细胞培养板（Corning Incorporated, Corning, NY, USA）每孔中加入1×10^5个Huh7或HepG2细胞，按E: T = 1: 1加入各种CAR-T细胞，培养总体积为500 μL。随后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24小时，用Cytometric Bead Array (CBA) kits (BD Biosciences)试剂盒标记各组上清中IFN-γ、TNF和IL-2，用流式细胞仪（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA）检测各组上清中细胞因子的分泌情况。
图7显示，在Huh7或HepG2细胞刺激后，与对照T细胞相比，CAR-T-0、CAR-T-1和CAR-T-2等CAR-T细胞均能显著分泌IFN-γ、TNF和IL-2等细胞因子，说明这些CAR-T细胞能有效识别GPC3抗原，并活化T细胞进行细胞因子表达。
实施例7：CAR-T-2细胞中的CD40L对抗原提呈细胞的活化功能
本实施例以检测包含上述scFv、CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ信号域、以及共表达或不共表达CD40L的CAR-T（CAR-T-1和CAR-T-2）对B细胞来源的Daudi细胞的活化作用。
分别取上述制备的T、CAR-T-1和CAR-T-2，以及Daudi细胞（国家实验细胞资源共享服务平台），在15mL离心管中用适量X-VIVO重悬，400g离心5min，再用适量X-VIVO重悬，400g离心5min，用适量X-VIVO重悬计数，根据计数结果，将T、CAR-T-1、CAR-T-2、Daudi细胞用X-VIVO调整浓度为1*10^6个/mL，将Daudi细胞按2*10^5/孔（即200μL/孔）的数量接种于24孔板。按照效靶比CAR-T：Daudi=1:3的比例分别接种CAR-T细胞，最后将各组总T细胞数调至一致，至总体积500μL，最后每孔补加300 μLX-VIVO至终体积1mL /孔，每组设2个复孔。细胞接种完后轻轻吹打混匀，在二氧化碳培养箱中共培养48 h。共培养结束后，用移液器将每孔吹打均匀，吸取500μL细胞悬液至1.5 mL 微量离心管中，400g离心5min，弃上清，将细胞沉淀用0.5 mL DPBS重悬，400g离心5min，弃上清。将所有组先用50μL DPBS配制的FCR阻断剂（Biolegend）和Zombie NIR™ Fixable Viability Kit（Biolegend）重悬细胞，室温避光孵育10min。使用DPBS溶解的1% BSA（翊圣生物）配制6种抗体，包括Alexa Fluor 532 CD3Monoclonal Antibody (UCHT1)（Thermo Fisher）、CD19-APC（Novusbio）、FITC anti-human CD86（Biolegend）、Alexa Fluor 647 anti-human CD80 Antibody（Biolegend）、Brilliant Violet 421TM anti-human CD40 Antibody（Biolegend）、PE anti-human HLA-DR（Biolegend），按50 μL/管加至各组中，室温避光继续孵育20 min。所有样品用DPBS溶解的1% BSA洗2次，0.5 mL /次，每组用200μL的1% BSA溶液重悬细胞。在全光谱多色流式细胞仪（NL-3000，Cytek）上样检测，每组收集50000个Daudi细胞用于分析。
图8显示，与T细胞和CAR-T-1相比，CAR-T-2能显著增强Daudi细胞表面CD40和CD80的表达，并能略微提高HLA-DR的表达，提示CAR-T-2中过表达的CD40L具有活化抗原提呈细胞的功能。
实施例8：过表达不同共刺激配体的GPC3 CAR-T的构建、CAR和共刺激配体表达率、以及CAR-T细胞增殖效率
参考实施例2的方法，合成5’端和3’端分别带有XbaI和SalI酶切位点的CAR-3、CAR-4、CAR-5、CAR-6和CAR-7的基因（北京博迈德基因技术有限公司）；将以上合成的5个基因质粒用XbaI和SalI双酶切，将载体pLenti6.3/V5（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）也同样用XbaI和SalI双酶切，将双酶切后的基因片段和质粒片段分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，再用T4 DNA连接酶连接，获得带有不同CAR基因的pLenti6.3/V5质粒。
使用CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）从健康志愿者的外周血单个核细胞（妙通（上海）生物科技有限公司，中国）中分离T细胞（记为Day 0时间点），将分离得到的T细胞在含IL-2（500 IU/mL，北京双鹭药业股份有限公司）的新鲜X-VIVO 15培养体系中培养24小时后，将T细胞密度调整2×10^6个/mL，取1mL T细胞悬液于24孔板中，按照MOI=1分别感染CAR-2、CAR-3、CAR-4、CAR-5、CAR-6和CAR-7不同慢病毒。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并于上述培养体系中继续培养。在CAR-T培养的不同时间点（Day 6、Day 8、Day 10、Day 12），对培养体系中的总T细胞计数，取1×10^6个细胞，用磁力架去除Dynabeads，与PE标记的Strep tag II抗体和APC标记的CD40L抗体（Biolegend）或APC标记的ICOSL抗体（Biolegend）或APC标记的OX40L抗体（Biolegend）或APC标记的CD70抗体（Biolegend）或APC标记的4-1BBL抗体（Biolegend），抗体室温孵育20 min后，所有样品用DPBS溶解的1% BSA洗2次，0.5 mL /次，每组用200 μL的1% BSA溶液重悬细胞。在全光谱多色流式细胞仪（NL-3000，Cytek）上样检测，每组收集50000个T细胞用于分析各组CAR含量，以及CAR-T-2和CAR-T-7细胞表面CD40L含量、CAR-T-3表面的ICOSL含量、CAR-T-4表面的OX40L含量、CAR-T-5表面的CD70含量、CAR-T-6表面的4-1BBL含量。计算出培养体系中的CAR-T细胞数，绘制T细胞和CAR-T细胞扩增曲线。
如图9所示，各CAR-T组的T细胞总数均高于未转染病毒的对照T细胞组，在各CAR-T组中，Day 8之前，各组之间细胞数差别不大；Day 8后，CAR-T-5细胞数量最多，CAR-T-7细胞数组最少。随着时间的培养，各组CAR表达稳定，CAR-T细胞持续增长，在Day12时，CAR-T-4和CAR-T-5的CAR-T细胞数组最多。
实施例9：过表达不同共刺激配体的GPC3 CAR-T的分化和耗竭
在各组CAR-T培养到Day 8，分别取1×106个T细胞，400×g离心5 min，弃上清，将细胞沉淀用0.5 mL DPBS重悬，400×g离心5 min，弃上清。将所有组先用50 μL DPBS配制的Zombie NIR™Fixable Viability Kit（Biolegend）重悬细胞，室温避光孵育10min。使用DPBS溶解的1% BSA（翊圣生物）配制9种抗体，包括anti-CD3-AF488（Biolegend）、anti-CAR-PE（艺妙神州自制）、anti-CD4-BV750（Biolegend）、anti-CD8 PerCP/eFlour710（Biolegend）、anti-CD45RA-BV510（Biolegend）、anti-CD62L-APC/Fire750（Biolegend）、anti-PD-1-BV650（Biolegend）、anti-LAG-3-PE/Cy7（Biolegend）、anti-CD39-BV421（Biolegend）抗体，将这些抗体加入各孔中，室温孵育20 min后，所有样品用DPBS溶解的1% BSA洗2次，0.5 mL /次，每组用200 μL的1% BSA溶液重悬细胞。在全光谱多色流式细胞仪（NL-3000，Cytek）上样检测，每组收集50000个T细胞用于分析各组CAR-T细胞的分化和耗竭。
如图10所示，在CAR-T培养第8天，各CAR-T组均出现不同程度的分化，均以初始（Naïve）和记忆干细胞（TSCM）为主，其中CAR-T-4的Naïve和TSCM比例最高，而CAR-T-7的中央记忆型T细胞（TCM）水平在各组CAR-T中比例最高。在耗竭水平上，各组均PD-1-LAG-3+所占比例最多，但无显著差别。研究表明CD39可作为T细胞的耗竭指标（Moesta, Achim K et al. Nature reviews. Immunologyvol. 20,12 (2020): 739-755），在各组CAR-T中， CAR-T-2具有最低的CD39阳性比例，而CAR-T-7具有最高的阳性比例。
实施例10：过表达不同共刺激配体的GPC3 CAR-T在GPC3阳性靶细胞重复刺激下的杀伤效应和扩增能力
在48孔板中每孔铺50000个肿瘤细胞，培养过夜。第二天，取1×10^6个T细胞，加入PE标记的Strep tag II抗体，流式检测各组CAR含量，按照效靶比CAR-T:肿瘤细胞=3:1，计算各组CAR-T所需的细胞数量，并使用未转导的T细胞将各组CAR-T的细胞总量调整一致，每组4个复孔，加入至铺好肿瘤细胞的48孔板中。设置阴性对照组（未转导的T细胞）和肿瘤细胞组。第三天，重新在48孔板中每孔铺50000个肿瘤细胞，肿瘤细胞贴壁后将各组CAR-T转入对应孔中进行靶细胞的重复刺激，重复3次后，收集各孔细胞至1.5 mL 微量离心管中，400 g离心5 min，弃上清，将细胞沉淀用0.5 mL DPBS重悬，400 g离心5 min，弃上清。将所有组先用100 μL DPBS配制的Zombie NIR™ Fixable ViabilityKit（Biolegend）重悬细胞，室温避光孵育10 min。然后向各孔中加入CD3-APC（BD Biosciences）和PE标记的CAR抗体（北京艺妙神州医药科技有限公司制备）两种流式抗体，室温孵育30 min。所有样品用DPBS溶解的1% BSA洗2次，0.5 mL /次，每组用200 μL的1% BSA溶液重悬细胞。在全光谱多色流式细胞仪（NL-3000，Cytek）上样检测，每组收集100 μL细胞悬液用于检测重复刺激后肿瘤细胞残余量和CAR-T的数量，具体结果如图11所示。
结果表明，在靶细胞重复刺激下，CAR-T-2和CAR-T-3较其他CAR-T具有最强的杀伤肿瘤的能力，显著优于其中CAR-T-4、CAR-T-5、CAR-T-6和CAR-T-7。在CAR-T持续性上，CAR-T-2的持续扩增能力最强，显著优于CAR-T-3、CAR-T-4和CAR-T-5。以上结果说明包含上述GPC3 scFv、CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ信号域、以及共表达CD40L的CAR-T-2在体外有很强的抗肿瘤效果及持续性。
实施例11：CAR-T-2细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力、扩增能力及持续性能
本实施例以检测含上述scFv、CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ信号域、以及共表达CD40L的CAR-T（CAR-T-2）对荷瘤小鼠的抗瘤能力、体内扩增能力及持续能力为例。
按照上述CAR-T细胞制备方法制备CAR-T-2细胞，培养至足够数量时，将细胞以冻存液重悬后保存至液氮中待用。6-8周龄NCG小鼠（江苏集萃药康生物科技有限公司，中国）共36只，分为6只/组，共6组。每只小鼠从皮下接种2.0×106个Huh7-LAE细胞（ATCC，USA）7天后，对小鼠进行荧光素酶活体成像（Lumina II小动物活体成像系统，PerkinElmer，USA）分析，以验证小鼠异种接种肝癌模型是否成功。肿瘤接种后第10天，每组小鼠分别从尾静脉注射生理盐水、对照T细胞、以及不同剂量的CAR-2细胞（1×10^6、3×10^6、5×10^6、1×10^7个CAR-T细胞/只）。小鼠于CAR-T细胞注射前1天、以及注射后第5、12、17、22、27、32天进行小鼠活体成像分析，于CAR-T细胞注射后第5、12、17、22、27、32天进行外周血CAR-T检测。
图12A显示，与生理盐水组和对照T细胞组的小鼠肿瘤负荷相比，不同剂量的CAR-T-2细胞均能在32天内有效降低肿瘤负荷，说明含有优化的CD3ζ信号域和共表达CD40L的GPC3 CAR-T具有显著的抗GPC3阳性肿瘤的活性。
图12B显示，小鼠尾静脉注射GPC3 CAR-T细胞并于不同时间检测小鼠外周血CAR-T细胞含量，在CAR-T回输后能检测到外周血中明显较高水平的CAR-T细胞，且在12天后CAR-T在体内进一步扩展，并维持一定的水平。
以上结果说明包含上述GPC3 scFv、CD28共刺激信号域、优化的CD3ζ信号域、以及共表达CD40L的CAR-T在体内有很强的抗肿瘤效果及持续性。
从上述体外、体内实验结果可知，本申请发明人设计的GPC3 CAR-T具有良好的抗肿瘤活性、体内的扩增效率和持续时间。
Claims (11)
1.嵌合抗原受体，其包含编码来自靶向GPC3的scFv、铰链区、跨膜区、CD3ζ信号域、共刺激信号域、以及CD40L蛋白的基因；其中，
所述scFv具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
所述共刺激信号域来自CD28；
所述CD40L具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
所述CD3ζ信号域是天然CD3ζ信号域序列的如下变体之一：
1）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K；
2）将天然CD3ζ信号域序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
3）将天然CD3ζ信号域序列中的近膜端氨基酸V2替代成L、D9替代成E、Q15替代成K、以及酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F；
所述天然CD3ζ信号域序列是对应于NP_000725.1中所列氨基酸序列第52-163位。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区或跨膜区来自CD8α、CD28、IgG1或IgG4。
3.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其进一步包含编码信号肽的基因。
4.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中编码CD40L蛋白的基因通过连接肽连接在CD3ζ信号域的C端。
5.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述CD3ζ信号域具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
6.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其包含或具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
7.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6中任意一项所述的嵌合抗原抗体。
8.一种载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.一种分离的细胞，其包含权利要求1-6中任意一项所述的嵌合抗原抗体或权利要求8所述的载体，所述细胞不为生殖细胞或受精卵。
10.权利要求1-6中任意一项所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的细胞在制备治疗GPC3阳性的恶性肿瘤的药物中的用途。
11.权利要求10所述的用途，其中所述药物用于制备治疗肝癌、肺癌、骨肉瘤或黑色素瘤的药物。
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