CN108276495B

CN108276495B - 靶向csf1r嵌合抗原受体修饰的nk92mi细胞和t细胞及其制法和应用

Info

Publication number: CN108276495B
Application number: CN201810069667.5A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 张平
Original assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Current assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN108276495A

Abstract

本发明涉及一种靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用，具体地，本发明提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域结合CSF1R抗原。本发明的融合蛋白可杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而破坏肿瘤(尤其是实体瘤)微环境，并且可与其他治疗癌症或肿瘤的药物联用，用来治疗癌症或肿瘤。

Description

靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用。

背景技术

癌症一直是危害人类健康的重大疾病，在过去的几十年里，癌症的发病率和死亡率一直在不断的增加。近年来，作为肿瘤的治疗策略之一的肿瘤免疫治疗在临床上取得了重大的进展。但是，无论是内源性T细胞还是外源性T细胞都会受到肿瘤微环境的抑制，肿瘤微环境由于其免疫抑制特性，导致新一代免疫治疗技术应用于实体瘤时遇到归巢、免疫耐受等多重障碍。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的一个重要组成部分，在肿瘤的发生发展中扮演着关键而复杂的作用。它们通过分泌促肿瘤新生血管生成因子和生长因子来促进肿瘤的发展，同时还能释放免疫抑制性的细胞因子来抑制T细胞的功能与代谢。巨噬细胞分为M1型和M2型，肿瘤细胞能够将巨噬细胞募集并塑造成M2型巨噬细胞。相关研究表明，M2型肿瘤相关巨噬细胞的遍布已经与不良的预后联系起来。

近年来，以免疫检验点抗体药物(例如PD-1和PD-L1抗体药物)和嵌合体抗原受体修饰的T细胞(CAR-T细胞)为代表的新一代治疗技术和药物，在临床上取得了重大进展^1-4。例如，靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗技术在难治、复发的急性淋巴细胞白血病上，可以达到90％以上的完全缓解率⁵。但是，无论是内源性T细胞还是外源性T细胞都会受到肿瘤微环境的抑制，肿瘤微环境由于其免疫抑制特性，导致新一代免疫治疗技术应用于实体瘤时遇到归巢、免疫耐受等多重障碍⁴。在肿瘤免疫微环境中，存在着多种抑制信号可以抑制效应T细胞的作用。

因此，本领域迫切需要开发特异性针对实体瘤的、有效的、疗效稳定、副作用小的，并且能够打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用的工程化免疫细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性针对实体瘤的、有效的、疗效稳定、副作用小的，并且能够打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用的工程化免疫细胞。

本发明第一方面提供了一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域特异性结合于CSF1R抗原。

在另一优选例中，所述的CAR的结构如式I所示：

L-scFv-Z-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为靶向CSF1R的抗体单链可变区序列；和

Z为无或Fc序列；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的scFv的结构如式A2或A3所示：

V_L1-V_H1 (A2)；或

V_L2-V_H2 (A3)；

其中，V_L1、V_L2为抗CSF1R抗体的轻链可变区；V_H1、V_H2为抗CSF1R抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。

在另一优选例中，所述的V_L1和V_H1通过柔性接头相连。

在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的SEQ ID NO.:3(GGGGS)所示的序列。

在另一优选例中，V_L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第160-270位所示，且V_H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第23-144位所示。

在另一优选例中，V_L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2的第159-264位所示，且V_H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2的第23-138位所示。

在另一优选例中，所述的CAR的结构如式II所示：

L-V_L1-V_H1-Z-TM-C-CD3ζ (II)

式中，各元件分别如上所述。

在另一优选例中，所述的CAR的结构如式III所示：

L-V_L2-V_H2-Z-TM-C-CD3ζ (III)

式中，各元件分别如上所述。

在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述L的信号肽序列为MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO.:4)。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，所述的C为CD28和/或CD137来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2所示。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一优选例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5或6所示。

在另一优选例中，所述核酸分子表达CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或SEQ IDNO.:2所示。

在另一优选例中，所述的核酸分子为多核苷酸。

本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述的CAR-T细胞靶向CSF1R抗原。

在另一优选例中，所述CAR-T细胞靶向CSF1R抗原时，表现为杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞。

本发明第五方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的细胞是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述CAR-T细胞或CAR-NK细胞的浓度为1×10³-1×10⁶个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁵个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、其他CAR-T药物或化疗药物)。

在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。

在另一优选例中，所述CAR-T药物靶向选自下组的肿瘤抗原：Muc-1、CD22、CD30、CS1、Her-2、或其组合。

本发明第七方面提供了一种如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

本发明第八方面提供了一种用于制备本发明第四方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。

本发明第九方面提供了一种本发明第四方面所述细胞、或本发明第六方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞。

本发明第十方面提供了一种杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞的方法，包括：给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第四方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第十一方面提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用安全有效量的(i)本发明第六方面所述的药物组合物；和(ii)治疗癌症或肿瘤的其他药物。

在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞系的构建和表达，(A)A2-CAR和A3-CAR三代CAR的结构简图和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体的结构简图。A2-CAR和A3-CAR三代CAR的结构包括：最前端的信号肽序列(SP)，特异性识别抗原的单链抗体部分(ScFv),维持空间构像的Fc,协同共刺激分子CD28的跨膜区和胞内区，共刺激分子CD137以及胞内传递信号的CD3ζ序列。(B)A2-CAR，A3-CAR在A2-CAR-NK92MI，A3-CAR-NK92MI细胞中表达的流式分析，收集NK92MI,A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞(每组平行重复3组)，全部都染上Fc抗体，用流式细胞仪进行分析。A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的阳性率和平均荧光强度都很高(C)。(D)Western Bloting检测A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞CD3ζ融合蛋白的表达。从左到右的顺序分别是：NK92MI,A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞蛋白所对应的位置。

图2显示了CSF1R抗原分子在293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞中表达的流式分析。

图3显示了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞增加对293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的杀伤。(A)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对293T和293T-CSF1R细胞的杀伤，杀伤的条件分别为E:T＝1:1杀伤时间为5h，E:T＝3:1杀伤时间为5h，E:T＝1:1杀伤时间为7h。(B)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤，杀伤条件分别为E:T＝0.5:1杀伤时间为2h，E:T＝0.5:1杀伤时间为3h，E:T＝0.5:1杀伤时间为4h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。(C)用MTT法来分析NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的增殖能力，检测的时间分别为24h、48h和72h。(D)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤293T和293T-CSF1R,在E:T＝3:1杀伤时间在5h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的granzyme B和IFN-γ分泌。(E)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤K562和K562-CSF1R,在E:T＝0.5:1杀伤时间在3h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的颗粒酶B(granzyme B)和IFN-γ分泌。

图4显示了A3-CAR-T细胞增加了对K562-CSF1R细胞的杀伤。(A)A3-CAR在A3-CAR-T细胞的表达情况，通过流式细胞仪检测结果。平行对照重复3组，A3-CAR的平均荧光强度也是比较高的(B)。(C)对制备的A3-CAR-T细胞的表型进行分析，在A3-CAR-T细胞中CD8阳性的CAR-T细胞占有更高的比例。(D)激活后的T细胞和A3-CAR-T细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤，效靶比E:T＝2:1，杀伤时间为24小时(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。(E)取激活后的T细胞和A3-CAR-T细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤的上清进行检测granzyme B和IFN-γ。

图5显示了A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞对外周血单核细胞无细胞毒性。(A)用磁珠分选法分得外周血中的单核细胞，用流式检测CD14和CSF1R在分选所得的单核细胞的表达。(B)将外周血单核细胞的CSF1R的平均荧光强度与构建的K562-CSF1R细胞的CSF1R的平均荧光强度做了比较，发现K562-CSF1R细胞的CSF1R的平均荧光强度远高于外周血的单核细胞(P<0.001)。(C)NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对外周血单核细胞的杀伤，E:T＝5:1,杀伤时间t＝5h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。通过统计学分析，NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对外周血单核细胞的杀伤无统计学差异。(D)活化后的T细胞和A3-CAR-T细胞对外周血单核细胞的杀伤，E:T＝2:1,杀伤时间t＝24h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种能够显著破坏或影响肿瘤微环境的CAR。具体地，本发明提供了一种抗CSF1R嵌合抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞或T细胞，所述融合蛋白可杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而破坏肿瘤(尤其是实体瘤)微环境，具有优化的式I所示结构。实验结果表明，本发明所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞或T细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI、A3-CAR-T细胞)能杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而破坏肿瘤(尤其是实体瘤)微环境，并且可与其他治疗癌症或肿瘤的药物(包括CAR-T药物，所述CAR-T药物靶向选自下组的肿瘤抗原：Muc-1、CD22、CD30、CS1、Her-2、或其组合)联用，用来治疗癌症或肿瘤。在此基础上完成了本发明。

CSF1R

CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体)是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码，CSF1R主要表达在单核细胞谱系细胞上及女性生殖道和胎盘中表达。CSF1R是CSF-1和IL34的配体且介导这些细胞因子的生物学效应。CSF1R控制M2型巨噬细胞的生成、分化和功能，这继而支持肿瘤生长和转移形成并分泌免疫抑制性细胞因子，从而导致患者的不良预后。

CSF1R在单核细胞、巨噬细胞及骨髓细胞的前体、胎膜滋养层和绒毛膜瘤细胞中表达,其mRNA的转录由功能特异的两个独立的启动子控制,受转录因子PU1的调控,CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)和转录因子AML1(CBFα2)可以协同激活CSF1R的启动子.人CSF1R是由972个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白,分子量为150ku.其膜外区、跨膜区和细胞内的胞浆区分别由512,25和435个氨基酸残基组成.其胞外区有5个二硫键和11个可能的糖基化位点,胞内区有Gly-X-Gly-X-X-Gly基序(motif),位于616位的Lys是ATP的结合位点,此位点的侧翼有一个72个氨基酸残基的激酶插入区,推测它具有识别专一性底物的功能.CSF1R,PDGFR,干细胞生长因子受体(SCFR,Kit)和FLT3同属Ⅲ型酪氨酸激酶受体.CSF1R与CSF-1结合后,其构象发生变化,形成二聚体或更高聚体,受体的酪氨酸激酶活性被激活,受体酪氨酸激酶活性可能与CSF1R聚合后磷酸基的转移有关.人CSF1R与配体作用后,第699,708,723,809和969位的酪氨酸发生磷酸化.第699位的酪氨酸与生长激素受体结合蛋白(Grb2)结合；第708位酪氨酸的磷酸化与STAT1的激活有关；第723位的酪氨酸与3-磷酯酰肌醇激酶(PI3-K)作用；至今尚未确切发现与第809位的酪氨酸结合的配体,此氨基酸发生突变时,极早期基因可以表达,但细胞不能分裂,它及其前后氨基酸序列与src基因产物、胰岛素受体的主要磷酸化位点及其前后序列均类似,Src类蛋白的激活可能与之有关；Van der Gee等的报道表明,CSF1R的第969位酪氨酸不发生磷酸化。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡(减少)是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。而NK92细胞是目前唯一被FDA批准临床试验的细胞系，细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92MI细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。在本发明中，选择NK细胞作为效应细胞。

NK92MI细胞

通过基因修饰的NK92MI(CAR-NK92MI)细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。NK92MI细胞对各种各样的肿瘤都具有很强的细胞毒作用，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及一些实体肿瘤。一些临床试验表明高剂量的NK92MI细胞输入也具有很大的安全性。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK92MI还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似，CAR-NK92或者CAR-NK92MI不会引起免疫耐受。

Fc片段

如本文所用，术语“Fc片段”、“Fc序列”、“Fc元件”具有相同的含义，没有特别的限制，是本发明融合蛋白的连接肽片段(或绞链域)。

在本发明中，Fc片段可以是哺乳动物免疫球蛋白的Fc片段，优选为人的免疫球蛋白的Fc片段。在优选例中，Fc片段为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc片段，优选地，Fc片段为IgG的Fc片段，更优选地，Fc片段为IgG1或IgG2的Fc片段。

典型地，Fc片段的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。

在本发明的优选例中，Fc片段具有如SEQ ID NO.:1中第272-502位所示的氨基酸序列。在另一优选例中，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2中第267-496位。

抗原结合部分

如本文所用，术语“抗原结合部分”、“抗原结合结构域”可互换使用。

在一优选实施方式中，本发明的CAR包含靶特异性结合元件。部分的选择取决于限定了靶细胞表面的配体类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物起作用的配体。因此，可以作为本发明CAR中抗原部分结构域的配体起作用的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫病以及癌细胞相关的那些。

在一优选实施方式中，可以通过工程改造特异性结合肿瘤细胞上抗原的所需抗原结合部分，将本发明的CAR工程改造为靶向目的肿瘤抗原。在本发明中，“肿瘤抗原”指癌症所共有的抗原。

CAR的抗原结合结构域可靶向例如CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、CD37PSMA、糖脂F77、HER2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR和MAGE A3TCR。或者，CAR的抗原结合结构域部分靶向的抗原包括但不限于，FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌激素受体、孕酮受体、HER-2/neu、uPA、PAI-1等。

抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、单链抗体(例如scFv)、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、及其片段。

在一优选实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分靶向CSF1R抗原。在一优选实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分是靶向CSF1R的scFV。

在一优选实施方式中，所述的scFv的结构如下式A2或A3所示：

V_L1-V_H1 (A2)；或

V_L2-V_H2 (A3)；

其中，V_L1、V_L2为抗CSF1R抗体轻链可变区；V_H1、V_H2为抗CSF1R抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在一优选实施方式中，V_L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第160-270位所示，且V_H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第23-144位所示。

在一优选实施方式中，V_L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2的第159-264位所示，且V_H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2的第23-138位所示。

在一优选实施方式中，scFV包含变体形式，所述变体与其野生型的scFV序列具有≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同源性。

融合蛋白

如本文所用，术语“本发明的嵌合抗原受体CAR”、“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“活性多肽”和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有式I的结构。本发明融合蛋白包括：任选的信号肽序列、能够与CSF1R特异性结合的scFV、铰链域(Fc)、跨膜结构域TM(来自CD28分子的跨膜区)、共刺激结构域(CD28和CD137)和CD3ζ等一系列的信号区域。

本发明的所述融合蛋白具有以下特点：

a)本发明融合蛋白表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上，形成一个将胞外区段元件暴露在胞外的膜蛋白。此外，本发明融合蛋白还具有位于胞内的共刺激分子(或元件)和CD3ζ。此外，本发明融合蛋白还可含有任选的信号肽、连接肽元件(linker)、或其他元件。

b)本发明构建两种能够特异性地识别人的CSF1R分子的CAR(优选三代CAR，其结构包括能够特异性识别CSF1R分子的单链抗体部分、维持空间构象的Fc片段、协同共刺激分子CD28、共刺激分子CD137及向胞内传递信号的CD3ζ分子)，通过慢病毒转染的形式，将构建的CAR转染到NK92MI细胞和人的外周血T细胞上，形成CAR-NK和CAR-T细胞，从而开展针对于表达CSF1R分子的人为构建的细胞系和外周血的单核细胞的靶向杀伤试验。本发明的CAR-NK和CAR-T细胞能够特异性的杀伤肿瘤微环境中的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用。在体外杀伤试验中，成功地验证了本发明所构建的靶向CSF1R的两种CAR均具有较好的细胞毒性和特异性，为靶向CSF1R的CAR-NK和CAR-T疗法的临床转化研究提供了依据。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1(A2-CAR)或SEQ ID NO.:2(A3-CAR)所示。

其中，在SEQ ID NO.:1中第1-22位为信号肽；第23-270位为scFV；第273-502位为连接肽(Fc)；第503-570位为跨膜区和胞内区(如CD28的跨膜区和胞内区)；第571-612位为共刺激元件(CD137)；第613-724位为CD3ζ。

其中，在SEQ ID NO.:2中第1-22位为信号肽；第23-264位为scFV；第267-496位为连接肽(Fc)；第497-564位为CD28的跨膜区和胞内区；第565-606位为共刺激元件CD137；第607-718位为CD3ζ。

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDNYMIWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGGTTFNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESPYFSNLYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASQSVDYDGDNYMNWYQQKPGQAPRLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHLSNEDLSTFGGGTKVEIKASESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

(SEQ ID NO.：1)

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDISWVRQAPGQGLEWMGVIWTDGGTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDQRLYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDVNTYVSWYQQKPGKAPKLLIYAASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSYPTFGQGTKLEIKGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

(SEQ ID NO.:2)

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白(即CAR)的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:2所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1或2所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的的序列如SEQ ID NO.:5(A2-CAR的核苷酸序列)或6(A3-CAR的核苷酸序列)所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:5或6所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞或T细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞或T细胞。一般来说包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述NK细胞或T细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞或T细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

制备方法

本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。本发明采用常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。

本发明提供了一种工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸或载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)。

一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体(尤其是病毒载体，如慢病毒载体)转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞(如T细胞或NK细胞)。

药物组合物和施用方法

本发明的工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)可以特异性的杀伤肿瘤微环境中的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用，进而改善肿瘤微环境。

另一方面，本发明还提供了一种药物(包括疫苗)组合物，它含有(a)安全有效量的本发明的工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)。

本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用于杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞。

在一优选实施方式中，本发明的药物组合物还包括治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、CAR-T药物或化疗药物等)。

在一优选实施方式中，所述其他药物包括CAR-T药物。

在一优选实施方式中，所述CAR-T药物靶向选自下组的肿瘤抗原：Muc-1、CD22、CD30、CS1、Her-2、或其组合。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片或一支注射针剂。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。

“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分一种或多种混合：

(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和/或(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。

胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物，较佳地为注射剂或液体制剂。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明药物组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明药物组合物也可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式和剂量保持不变，而同时或随后服用本发明药物组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用本发明药物组合物与其它一种或几种已知药物。当本发明药物组合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，本发明药物组合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药时的剂量较低。

本发明的主要优点

(1)本发明提供的工程化免疫细胞(如A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)能够特异性的杀伤肿瘤微环境中的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用，进而改善肿瘤微环境。因此靶向CSF1R的CAR-NK和CAR-T有望成为联合其他抗体药物和靶点的新的细胞免疫治疗策略。

(2)本发明设计的CAR具有较好的靶向特异性和细胞毒性。

(3)本发明提供的工程化免疫细胞(A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI和/或A3-CAR-T细胞)可与其他治疗癌症或肿瘤的药物联用，从而有效治疗癌症或肿瘤(优选实体瘤)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另有说明，否则实施例中的材料或试剂均为市售产品。

材料和方法

1.1细胞系和细胞培养

K562细胞使用的培养基是RPMI1640,添加10％FBS；293T细胞使用的培养基是DMEM,添加10％FBS；NK92MI，A2-CAR-NK92MI,A3-CAR-NK92MI细胞使用的培养基是MEM-α培养基，添加12.5％FBS、0.2mM肌醇、0.02mM叶酸和0.01mMβ-巯基乙醇；从正常人外周血中用Ficoll法提得PBMC细胞，T细胞所用的培养基是TexMACS^TM GMP培养基。所有的细胞系来自ATCC,所有的细胞培养在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。

1.2 A2-CAR和A3-CAR的构建

A2-CAR and A3-CAR构建的是三代CAR，构建方法和参加之前的构建方法⁶，具体地，将两种CSF1R的scFv构建到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上，在ScFv序列的后面是Fc序列，接下来依次是CD28跨膜区和胞内区序列，CD137胞内区序列，CD3ζ序列。

1.3慢病毒和转染

慢病毒的制备参见文献⁶。

收集NK92MI细胞计数，取1×10⁶个细胞放入15ml离心管中，加入浓缩过后的A2-CAR和A3-CAR病毒液，混匀，MOI＝10。37℃孵育6小时后，转移到细胞皿中培养。72小时后，取转染A2-CAR和A3-CAR的NK92MI细胞，同时取未转染的NK92MI细胞作为阴性对照，在FACSCalibur(BD Biosciences)上进行检测A2-CAR和A3-CAR的表达情况。并通过流式细胞分选仪(FACS Aria Ⅲ，BD Biosciences)分选联合药物筛选青霉素-链霉素(HyClone公司)的方法获得稳定表达A2-CAR和A3-CAR的A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI的细胞。

CAR-T细胞的构建过程如下：抽取的健康人外周血，用Ficoll法提取PBMC，吸取单核细胞层，放于24孔板中培养，每孔种植约1×10⁶个T细胞，每孔体系为1毫升培养基，然后每孔加入10ul anti-CD3/CD28beads(Miltenyi biotec)。激活48h后将T细胞转移到48孔板中，用浓缩后的病毒上清(MOI＝10)转染T细胞，每孔种植5×10⁵个激活后的T细胞，终体系为100ul，转染16小时后去除上清，加入培养基进行培养，转染后的细胞为A3-CAR-T细胞。T细胞从激活、转染到以后的培养都是在TexMACS^TMGMP medium(Miltenyi biotec)培养基中进行的，整个T细胞培养过程都要加IL-2，浓度为50IU/ml。转染效率在FACS Calibur(BDBiosciences)上进行检测。

1.4 K562-CSF1R和293T-CSF1R细胞的构建

为了验证构建的CAR-NK杀伤的靶点特异性，将CSF1R抗原分别构建到K562和293T细胞上，使K562和293T细胞表达CSF1R抗原分子，作为后续实验的杀伤靶细胞。构建方式参见文献⁷。在NCBI上查找相应的CSF1R抗原序列，应用SignaIP 4.1Server软件和Uniprot软件进行处理，然后分别插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体上，包装成慢病毒，对K562和293T细胞进行转染6h，之后进行培养。然后染上相应抗体后在FACSAria^TMIII Cell Sorter(BD Biosciences)上分选，直至阳性率基本达到百分之百。

1.5 MTT试验

使用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)法检测NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的体外增殖能力。将NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞细胞以1×10 ⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在孵育24,48或72小时后，向每个孔中加入20μL MTS溶液，并在37℃孵育2小时。记录650nm处的吸光度作为参考，并从OD₄₉₀读数中减去以消除非特异性吸光度。

1.6流式细胞术和免疫印迹(Western Blots)

NK92MI、A2-CAR-NK92MI、A3-CAR-NK92MI、293T、293T-CSF1R、K562和K562-CSF1R细胞收集起来，离心弃掉上清，然后用PH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)重悬洗一遍，染上相应抗体。NK92MI、A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI染APC荧光的Fc抗体(BD Biosciences)。293T、K562、293T-CSF1R和K562-CSF1R染带APC荧光的CSF1R抗体(BD Biosciences)。T细胞被转染后培养72h染带APC荧光的Fc抗体(BD Biosciences)，然后检测阳性率，T细胞并且分别染带FITC荧光的CD4抗体(BD Biosciences)和带PE-CY7荧光的CD8抗体(BD Biosciences)检测表型。外周血中的单核细胞用CD14的磁珠分选后，染FITC荧光的CD14抗体和带APC荧光的CSF1R抗体，检测分选的纯度及CSF1R的平均荧光强度。所有细胞染上抗体后都是37℃孵育30min，用PBS清洗2遍后，在FACS Calibur(BD Biosciences)机器检测分析。

取适量A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞和NK92MI细胞，提取总蛋白后做Western Blots，一抗为小鼠来源的anti-CD3ζ抗体(BD Biosciences)，二抗为带HRP山羊抗小鼠的抗体(Solarbio)。

1.7体外杀伤

体外杀伤试验中，A2-CAR-NK92MI,A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T效应细胞对应的靶细胞是构建的293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞以及从健康人的外周血中分选出的单核细胞(外周血单核细胞分离采用磁珠分选，所用的试剂为BD公司的Anti-Human CD14MagneticParticles-DM)，杀伤结果检测的方法用的是CFSE/7-AAD流式检测方式^8,9，具体地，取靶细胞于15ml离心管中，PBS重悬，加微量CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)于37℃孵育30min，取靶细胞4×10⁵个于24孔板中，再加入相应数量的效应细胞，混匀，终体系为1.5ml。效应细胞和靶细胞共培养，其中CAR-NK与靶细胞共培养时间在2-7小时不等，CAR-T与靶细胞共培养24小时然后去除上清，用PBS洗一遍，再PBS重悬后每组加入2ul 7-AAD(7-aminoactinomycin D；BD Pharmingen)，然后在FACSCalibur(BD Biosciences)机器上进行检测。CFSE阳性细胞群为靶细胞，该群里边7-AAD阳性的细胞群所占比例即为靶细胞的死亡率。

1.8IFN-γ和granzyme B的检测

NK和T细胞被激活以及对肿瘤杀伤时会释放一些细胞因子，其中IFN-γ和granzyme B就是其中主要的两种。为了证实检测NK和T细胞被有效激活、以及对靶细胞产生杀伤，取相应杀伤实验的上清，然后用Cytometric Bead Array(CBA)的方式进行检测，所用到的试剂有IFN-γKit(Human IFN-γFlex Set；BD)和granzyme B Kit(Human granzyme BFlex Set；BD)。具体讲就是每组各取50ul上清，加入细胞因子捕获微球室温孵育1h，然后加入相应的细胞因子抗体，室温孵育2h，wash butter洗两次，然后上流式机器(NovoCyte；ACEA)检测，数据用软件FCAP Array v3处理，每组各做三个平行组实验。

1.9数据分析

体外数据是用软件GraphPad Prism5和Social Sciences 23.0(SPSS Inc.,USA)来进行处理的，每组都至少进行了三次重复试验，用Student’s t test分析，P值小于0.05被认为有效果。

实施例1 A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞系的构建和表达

A2-CAR和A3-CAR构建的是三代CAR(图1A)，ScFv包含重链和轻链，前面含有信号肽序列(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO.:4))，后面是Fc序列和共刺激因子序列、CD3ζ，然后将该序列构建到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体上(图1A)。

将构建好的A2-CAR和A3-CAR通过慢病毒转染的形式转染到NK92MI细胞上，通过细胞流式分选仪分选联合药物筛选得到稳转细胞A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI(图1B)。并且A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的平均荧光强度都是非常高的(图1C)。为了确认CAR确实转到了NK92MI细胞体内，并且得到表达，做了Western Blotting来检测CD3ζ融合蛋白的表达(图1D)。NK92MI细胞本身的内源化的CD3ζ约为15kD，二聚体为30kDa，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI外源融合蛋白清晰地在胶片上显现出来。

图1：A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞系的构建和表达。(A)A2-CAR和A3-CAR三代CAR的结构简图和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体的结构简图。A2-CAR和A3-CAR三代CAR的结构包括：最前端的信号肽序列(SP)，特异性识别抗原的单链抗体部分(ScFv),维持空间构像的Fc,协同共刺激分子CD28的跨膜区和胞内区，共刺激分子CD137以及胞内传递信号的CD3ζ序列。(B)A2-CAR，A3-CAR在A2-CAR-NK92MI，A3-CAR-NK92MI细胞中表达的流式分析，收集NK92MI,A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞(每组平行重复3组)，全部都染上Fc抗体，用流式细胞仪进行分析。A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的阳性率和平均荧光强度都很高(C)。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。(D)Western Bloting检测A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞CD3ζ融合蛋白的表达。从左到右的顺序分别是：NK92MI,A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞蛋白所对应的位置。从图1的结果来看，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的外源性CD3ζ融合蛋白在70-100kDa之间。

实施例2 293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的构建及CSF1R抗原的检测

为了得到高表达CSF1R抗原分子的细胞系，人为将CSF1R分子(NP_005202.2)构建到pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上，制备成慢病毒后转染293T和K562细胞，通过流式细胞仪分选和药物筛选得到293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞(图2)。

图2：CSF1R抗原分子在293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞中表达的流式分析。收集293T，K562，293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞，全部都染上抗人的CSF1R分子的抗体，其中293T和K562细胞作为对照，流式细胞仪结果分析如图2所示。

实施例3 A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞增加对293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的杀伤

为了检测相对于未转染的NK92MI细胞，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞有没有特异性提高对293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的杀伤，用CFSE/7-AAD染色的方式进行了相应的检测。采用了不同的效靶比和时间，对293T和293T-CSF1R细胞的杀伤分别为效靶比E:T＝1:1杀伤时间为5h，E:T＝3:1杀伤时间为5h，E:T＝1:1杀伤时间为7h(图3A)。对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤分别为E:T＝0.5:1杀伤时间为2h，E:T＝0.5:1杀伤时间为3h，E:T＝0.5:1杀伤时间为4h(图3B)。实验发现，相较于NK92MI细胞很明显地提高了对293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的杀伤能力(图3A,3B)。

为了确认CAR修饰的NK92MI细胞对其增殖能力是否有影响，用MTT法来分析验证，实验结果表明A2-CAR或A3-CAR的稳定表达并不影响NK92MI细胞的增殖能力(图3C)。

NK细胞与靶细胞密切接触，可通过不同的途径发挥杀伤效应，其中穿孔素和颗粒酶系统介导的靶细胞坏死是其杀伤机制之一，活化的NK细胞也可大量分泌IFN-γ。所以检测了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞与肿瘤细胞作用后是否特异性释放更多的granzyme B和IFN-γ。选取A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤293T和293T-CSF1R,在E:T＝3:1杀伤时间在5h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的granzyme B和IFN-γ分泌有无明显差异(图3D)。实验结果表明当与靶细胞293T-CSF1R接触时A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞相对与NK92MI细胞，能够特异性的分泌更多的granzyme B和IFN-γ。选取A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤K562和K562-CSF1R,在E:T＝0.5:1杀伤时间在3h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的granzyme B和IFN-γ分泌有无明显差异(图3E)。实验结果表明当与靶细胞K562-CSF1R接触时A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞相对与NK92MI细胞，能够特异性的分泌更多的granzyme B和IFN-γ。

图3：A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞增加对293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞的杀伤。(A)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对293T和293T-CSF1R细胞的杀伤，杀伤的条件分别为E:T＝1:1杀伤时间为5h，E:T＝3:1杀伤时间为5h，E:T＝1:1杀伤时间为7h。(B)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤，杀伤条件分别为E:T＝0.5:1杀伤时间为2h，E:T＝0.5:1杀伤时间为3h，E:T＝0.5:1杀伤时间为4h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。(C)用MTT法来分析NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的增殖能力，检测的时间分别为24h、48h和72h。(D)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤293T和293T-CSF1R,在E:T＝3:1杀伤时间在5h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的granzyme B和IFN-γ分泌。(E)NK92MI，A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤K562和K562-CSF1R,在E:T＝0.5:1杀伤时间在3h条件下，取相应杀伤组别的上清测效应细胞的granzyme B和IFN-γ分泌。

每组数据至少设平行对照组3组，在图示中一颗“*”表示P值小于0.05，二颗“*”表示P值小于0.01，三颗“*”表示P值小于0.001，四颗“*”表示P值小于0.0001。

实施例4 A3-CAR-T细胞增加了对K562-CSF1R细胞的杀伤

通过对A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI杀伤效果和细胞因子分泌等方面比较，发现A3-CAR有更好的杀伤效果，特异性更好，从而选取A3-CAR来构建CAR-T细胞。将构建好的A3-CAR转染到激活后的健康人T细胞内，A3-CAR-T细胞的表达率为45％-70％(图4A)。并且A3-CAR-T细胞的平均荧光强度是比较高的(图4B)。转染后的T细胞中CD4+、CD8+的T细胞的阳性率的情况就像图4C描述的那样，发现在A3-CAR-T细胞中CD8+的T细胞占用更高的比例。

采用CFSE/7-AAD染色的方法来进行检测，杀伤时间为24小时，效靶比为2:1(图4D)。从结果来看，A3-CAR-T细胞对K562-CSF1R细胞的杀伤率远远超过了活化的T细胞(UNT)。T细胞对肿瘤的毒性通过两种方式起作用(1)释放穿孔素和颗粒酶(2)通过Fas/FasL或TNF/TNFL信号通路激活死亡受体。CAR-T细胞除了通过识别TAA起杀伤作用外，CAR-T释放的IFN-γ和肿瘤表面的IFN-γR相互作用也对肿瘤细胞具有毒性，接下来检测了CAR-T细胞与肿瘤细胞作用后是否特异性释放granzyme B和IFN-γ。取杀伤时间为24小时，效靶比为2:1的相应组别的上清进行检测(图4E)。结果充分地说明了CAR-T细胞和肿瘤细胞的共培养释放了大量的granzyme B和IFN-γ，这些细胞因子反过来促进了肿瘤细胞的死亡。

图4：A3-CAR-T细胞增加了对K562-CSF1R细胞的杀伤。(A)A3-CAR在A3-CAR-T细胞的表达情况，通过流式细胞仪检测结果。平行对照重复3组，A3-CAR的平均荧光强度也是比较高的(B)。(C)对制备的A3-CAR-T细胞的表型进行分析，在A3-CAR-T细胞中CD8阳性的CAR-T细胞占有更高的比例。(D)激活后的T细胞和A3-CAR-T细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤，效靶比E:T＝2:1，杀伤时间为24小时(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。(E)取激活后的T细胞和A3-CAR-T细胞对K562和K562-CSF1R细胞的杀伤的上清进行检测granzyme B和IFN-γ。

实施例5 A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞对外周血单核细胞无细胞毒性

正常人的外周血的单核细胞也是表达CSF1R分子的，因此设计相关实验，来验证本发明所设计的A3-CAR当构建在NK92MI和T细胞上时，是否会对正常人外周血的单核细胞有毒性。首先提取正常人的外周血PBMC，用磁珠分选得到外周血中的单核细胞。然后，用流式细胞分析仪来检测CD14和CSF1R分子的双阳性占多少比例(图5A),同时也比较了外周血中的单核细胞CSF1R分子和所构建的K562-CSF1R细胞的CSF1R分子的平均荧光强度(图5B)。

接下来，分别用A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞来杀伤从外周血中分离所得的单核细胞，A3-CAR-NK92MI细胞杀伤单核细胞采用的效靶比为5:1，杀伤的时间为5小时(图5C)；A3-CAR-T细胞杀伤单核细胞采用的效靶比为2:1，杀伤的时间为24小时(图5D)。

实验结果表明，A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞对正常人外周血单核细胞没有细胞毒性。这一现象的出现可能是由于外周血单核细胞的CSF1R分子的平均荧光强度比较低等原因，导致本发明所设计的CAR-NK和CAR-T细胞对它们没有杀伤作用。

图5：A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞对外周血单核细胞无细胞毒性。(A)用磁珠分选法分得外周血中的单核细胞，用流式检测CD14和CSF1R在分选所得的单核细胞的表达。(B)将外周血单核细胞的CSF1R的平均荧光强度与构建的K562-CSF1R细胞的CSF1R的平均荧光强度做了比较，发现K562-CSF1R细胞的CSF1R的平均荧光强度远高于外周血的单核细胞(P<0.001)。(C)NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对外周血单核细胞的杀伤，E:T＝5:1,杀伤时间t＝5h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。通过统计学分析，NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞对外周血单核细胞的杀伤无统计学差异。(D)活化后的T细胞和A3-CAR-T细胞对外周血单核细胞的杀伤，E:T＝2:1,杀伤时间t＝24h(其中CONT表示肿瘤细胞的自然死亡率)。通过统计学分析，活化后的T细胞和A3-CAR-T对外周血单核细胞的杀伤无统计学差异。

讨论

本发明以人CSF1R为靶点，通过慢病毒转染的形式，成功的构建了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞(两种CAR-NK细胞)和A3-CAR-T(一种CAR-T细胞)，并通过体外杀伤实验证明所构建的三代CAR的靶向特异性和细胞毒性，为靶向CSF1R的CAR-NK和CAR-T的细胞免疫疗法提供理论依据。

近年来，迅速发展的CAR-T疗法无疑是给很多肿瘤患者带来了福音，在肿瘤的免疫治疗上取得了重大的进展，被誉为是肿瘤免疫治疗的终极疗法。但是无论是CAR-T，还是近年来新兴的抗体药物，在治疗实体瘤时都会遇到肿瘤微环境的抑制。虽然CAR-T疗法在治疗血液肿瘤方面取得了重大进展，但是要让CAR-T疗法在治疗实体瘤上也能取得重大的进展，还需要进一步的努力。

本发明以CSF1R为靶点设计了三代CAR的A3-CAR-T细胞，在体外杀伤试验中可以看到A3-CAR-T细胞在对K562-CSF1R细胞具有更强的细胞毒性，结果证明了本发明所设计的A3-CAR-T细胞具有靶向特异性。在体外杀伤试验中，本发明发现A3-CAR-T细胞对CSF1R阴性的细胞K562细胞的细胞毒性较活化T细胞的杀伤也有了显著性的提高(图4D)。为了探索这一现象的原因，本发明取A3-CAR-T和活化T细胞杀伤K562和K562-CSF1R细胞的杀伤组别对应的上清，检测Granzyme B和IFN-γ细胞因子分泌的情况，结果显示，A3-CAR-T细胞与K562-CSF1R细胞接触时能分泌极多的Granzyme B和IFN-γ细胞因子相对与A3-CAR-T细胞与K562细胞接触时，表明了A3-CAR-T细胞的靶向特异性。同时，本发明也发现A3-CAR-T细胞对K562细胞杀伤时相对与活化T细胞，能分泌更多的Granzyme B和IFN-γ细胞因子，这可能是由于的CAR的修饰会对T细胞的活化有促进作用(图4E)。

和CAR-T细胞一样，CAR-NK细胞在过继细胞免疫治疗中也是具有极大潜力的，通过基因改造的CAR-NK细胞，可以获得一些新的特性，能够特异性的识别肿瘤抗原，增强其抗肿瘤的细胞毒性的能力。NK-92细胞对于白血病，淋巴瘤及一些实体瘤都有较强的细胞毒性，同时，一些临床研究也已经验证了NK-92细胞输注的安全性。和CAR-T细胞治疗技术一样，CAR-NK92MI细胞治疗技术也具有很多的优点，例如它们可以通过释放有毒颗粒物质直接杀伤肿瘤细胞；它们在体外可以进行大规模的培养；和CAR-T细胞治疗技术一样，它们同样也可以克服机体的耐药机制。

本发明以CSF1R为靶点，通过慢病毒转染的形式，成功的构建了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞两种CAR-NK细胞，并通过体外对K562，K562-CSF1R，293T和293T-CSF1R细胞的杀伤实验证明本发明所构建的A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞的靶向特异性和细胞毒性(图3A,B)。从杀伤的结果来看，当A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞与CSF1R阴性的293T和K562细胞接触时，它们的细胞毒性与对照组NK92MI细胞无统计学差异；然而，当A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞与CSF1R阳性的293T-CSF1R和K562-CSF1R细胞接触时，相对与对照组的NK92MI细胞，细胞毒性有了显著性的提高，说明了本发明所构建的A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞具有靶向特异性。需要指出的是，K562细胞是一株对NK92MI细胞非常敏感的细胞系，然而在这样非常敏感的细胞系上本发明仍然能够看到显著的统计学差异，这进一步说明了，本发明所构建的三代CAR的靶向特异性。通过MTT法试验，发现经过基因修饰的A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞与亲本的NK92MI细胞的体外增殖能力无统计学差异(图3C)。检测相关条件下A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞杀伤靶细胞时Granzyme B和IFN-γ细胞因子分泌的情况(图3D)，结果显示，相对于对照组A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞能够分泌更多的Granzyme B和IFN-γ，具有显著的统计学差异。

为了加强CAR-NK细胞的活性，本发明采用了包含CD28和CD137共刺激信号域的三代CAR结构。

正常人的外周血的单核细胞，也是表达CSF1R分子的。为了了解本发明所设计的A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T对正常人的外周血单核细胞是否具有细胞毒性，本发明提取了正常人的PBMC，通过磁珠分选的方式分选得到正常人的外周血的单核细胞，同时设计杀伤试验。试验结果表明，A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T对正常人的外周血单核细胞没有细胞毒性(图5C,D)。这一结果出现的原因可能是由于正常人的外周血的单核细胞虽然有20％左右的CSF1R阳性率，但是其平均荧光强度较低(图5B)，导致A3-CAR-NK92MI和A3-CAR-T细胞对其无细胞毒性。

总的来说，本发明以CSF1R为靶点，通过慢病毒转染的形式，成功的构建了A2-CAR-NK92MI和A3-CAR-NK92MI细胞和A3-CAR-T，并通过体外杀伤实验证明本发明人所构建的三代CAR的靶向特异性和细胞毒性，为靶向CSF1R的CAR-NK和CAR-T的细胞免疫疗法提供理论依据。由于本发明的CAR-NK和CAR-T细胞能够特异性的杀伤肿瘤微环境中的M2型肿瘤相关的巨噬细胞，从而打破M2型肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤微环境中的抑制作用，进而改善肿瘤微环境，因此靶向CSF1R的CAR-NK和CAR-T有望成为联合其他抗体药物和靶点的新的细胞免疫治疗策略。

参考文献

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用

<130> P2017-2237

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asp Asn Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr

65 70 75 80

Thr Phe Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys

85 90 95

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Pro Tyr Phe Ser Asn Leu

115 120 125

Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly

180 185 190

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195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg

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225 230 235 240

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Ser Asn Glu

245 250 255

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275 280 285

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

290 295 300

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

305 310 315 320

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

325 330 335

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Leu Pro Pro Arg

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<211> 718

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

195 200 205

Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

225 230 235 240

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr Phe Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

260 265 270

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

275 280 285

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

305 310 315 320

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

325 330 335

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

340 345 350

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

355 360 365

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

370 375 380

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

385 390 395 400

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

405 410 415

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

420 425 430

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

435 440 445

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

450 455 460

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

465 470 475 480

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met

485 490 495

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

500 505 510

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

515 520 525

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

530 535 540

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

545 550 555 560

Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

565 570 575

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

580 585 590

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

595 600 605

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

610 615 620

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

625 630 635 640

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

645 650 655

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

660 665 670

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

675 680 685

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

690 695 700

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

705 710 715

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 5

<211> 2175

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60

atccctcagg tgcagctggt gcagtcagga gccgaagtga agaagccagg cagctcagtg 120

aaggtgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcaccgaca actacatgat ttgggtccgg 180

caggctccag gacagggact cgagtggatg ggagatatca acccctacaa cggcggcacc 240

accttcaacc agaagttcaa gggccgcgtg accatcaccg ccgataagag caccagcacc 300

gcctacatgg agctgtctag cctgaggagc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgccagg 360

gagagcccct acttcagcaa cctgtacgtg atggactatt ggggccaggg cacactggtg 420

acagtgtcta gcggaggagg aggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgaa 480

atcgtgctga cccagagccc agctacactg tctctgagcc caggagagag agccacactg 540

tcttgcaagg ccagccagag cgtggactac gacggcgaca actacatgaa ttggtaccag 600

cagaaacccg gacaggctcc tagactgctg atctacgccg cctctaacct ggagagcgga 660

atcccagcca gattcagcgg cagcggaagc ggaaccgact tcaccctgac catcagcagc 720

ctggagccag aggacttcgc cgtctactac tgccacctga gcaacgagga cctgagcaca 780

ttcggcggag gcaccaaggt ggagatcaag gctagcgaga gcaaatacgg ccctccttgc 840

cctccttgtc cagctccaga gtttctgggc ggacctagcg tgttcctgtt ccctcccaag 900

cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc cccgaagtga cttgcgtggt ggtggacgtg 960

tctcaggagg accccgaggt gcagttcaat tggtacgtgg acggagtgga ggtgcacaac 1020

gctaagacca agcccaggga ggagcagttc aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg 1080

acagtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 1140

ggcctgccca gcagcatcga gaagaccatc agcaaggcca aaggccagcc tagagaacct 1200

caggtgtaca ccctgccccc ttctcaggag gagatgacca agaaccaggt gtccctgact 1260

tgcctcgtca agggcttcta ccccagcgat atcgccgtgg agtgggaatc taacggccag 1320

ccagagaaca actacaagac caccccccca gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 1380

tacagcaggc tgaccgtgga caaaagtcgc tggcaggagg gcaacgtgtt cagttgcagc 1440

gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct gtccctgggc 1500

aagatgtttt gggtgctggt ggtcgtggga ggagtgctgg cttgttacag cctgctggtg 1560

accgtggcct tcatcatctt ctgggtccgg agcaagagaa gcagaggcgg ccacagcgac 1620

tacatgaaca tgacccccag aagaccaggc cctaccagaa agcactacca gccctacgcc 1680

cctcctagag acttcgccgc ctacagaagc aagcggggcc ggaagaagct gctgtacatc 1740

ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcag acaacacagg aggaggacgg ttgctcttgc 1800

aggttccctg aagaagaaga gggcggttgc gagctgagag tgaagttcag caggagcgcc 1860

gacgctccag cttatcagca gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcagg 1920

agggaggagt acgacgtgct ggacaagagg aggggaagag accccgagat gggcggcaag 1980

cctagaagga agaaccccca ggagggcctg tacaacgagc tgcagaagga caagatggcc 2040

gaggcttaca gcgagatcgg catgaagggc gagaggagaa gaggcaaggg ccacgacgga 2100

ctgtaccagg gactgagcac agccaccaag gatacctacg acgccctgca tatgcaggct 2160

ctgcctccta gatga 2175

<210> 6

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgtgagctgc cccatcccgc cttcctcctc 60

atcccccagg tgcagctggt gcagtcagga gcagaagtga agaagcccgg agccagcgtg 120

aaagtgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct acgacatctc ttgggtccgg 180

caggctccag gacagggact cgagtggatg ggagtgattt ggaccgacgg cggaaccaac 240

tacgcccaga aactgcaggg cagggtgacc atgaccaccg ataccagcac cagcaccgcc 300

tacatggagc tgagaagcct gagaagcgac gacaccgcag tgtactattg cgccagggac 360

cagaggctgt acttcgacgt ctggggacag ggaaccacag tgaccgtgtc tagcggagga 420

ggaggatctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatctg gaggaggcgg cagcgatatc 480

cagatgacac agagcccttc ttctctgagc gccagcgtgg gcgacagagt gaccatcact 540

tgcagggcca gcgaggacgt caacacctac gtctcttggt accagcagaa gccaggcaag 600

gctcctaagc tgctgatcta cgccgccagc aacaggtaca ccggcgtgcc tagcagattc 660

agcggaagcg gaagcggcac cgacttcacc ctgaccatca gctctctgca gccagaggac 720

ttcgccacct actactgcca gcagagcttc agctacccta cctttggcca gggcaccaag 780

ctggaaatca agggatccga gagcaaatac ggccctcctt gccctccttg tccagctcca 840

gagtttctgg gcggacctag cgtgttcctg ttccctccca agcccaagga caccctgatg 900

atcagcagga cccccgaagt gacttgcgtg gtggtggacg tgtctcagga ggaccccgag 960

gtgcagttca attggtacgt ggacggagtg gaggtgcaca acgctaagac caagcccagg 1020

gaggagcagt tcaacagcac ctacagggtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat 1080

tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc cagcagcatc 1140

gagaagacca tcagcaaggc caaaggccag cctagagaac ctcaggtgta caccctgccc 1200

ccttctcagg aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cttgcctcgt caagggcttc 1260

taccccagcg atatcgccgt ggagtgggaa tctaacggcc agccagagaa caactacaag 1320

accacccccc cagtgctgga cagcgacggc agcttcttcc tgtacagcag gctgaccgtg 1380

gacaaaagtc gctggcagga gggcaacgtg ttcagttgca gcgtgatgca cgaggccctg 1440

cacaaccact acacccagaa gagcctgagc ctgtccctgg gcaagatgtt ttgggtgctg 1500

gtggtcgtgg gaggagtgct ggcttgttac agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc 1560

ttctgggtcc ggagcaagag aagcagaggc ggccacagcg actacatgaa catgaccccc 1620

agaagaccag gccctaccag aaagcactac cagccctacg cccctcctag agacttcgcc 1680

gcctacagaa gcaagcgggg ccggaagaag ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1740

aggcccgtgc agacaacaca ggaggaggac ggttgctctt gcaggttccc tgaagaagaa 1800

gagggcggtt gcgagctgag agtgaagttc agcaggagcg ccgacgctcc agcttatcag 1860

cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggca ggagggagga gtacgacgtg 1920

ctggacaaga ggaggggaag agaccccgag atgggcggca agcctagaag gaagaacccc 1980

caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag gacaagatgg ccgaggctta cagcgagatc 2040

ggcatgaagg gcgagaggag aagaggcaag ggccacgacg gactgtacca gggactgagc 2100

acagccacca aggataccta cgacgccctg catatgcagg ctctgcctcc tagatga 2157

Claims

1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域特异性结合于CSF1R抗原，

所述的CAR的结构如式I所示：

L-scFv-Z-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为靶向CSF1R的抗体单链可变区序列；和

Z为无或Fc序列；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

所述的scFv的结构如式A3所示：

V_H2-V_L2 (A3)；

其中，V_L2为抗CSF1R抗体的轻链可变区；V_H2为抗CSF1R抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键；

V_L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2的第159-264位所示，且V_H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2的第23-138位所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1所述的CAR。

6.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，所述的工程化免疫细胞表达权利要求1所述的CAR，包括以下步骤：将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

8.一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或权利要求5所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞的药物或制剂。

9.一种用于制备权利要求5所述细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的权利要求3所述的核酸分子、或权利要求4所述的载体。

10.一种权利要求5所述细胞、或权利要求7所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于杀伤肿瘤微环境的M2型肿瘤相关的巨噬细胞。