CN107602703B - 靶向人EpCAM的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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CN107602703B CN201710682143.9A CN201710682143A CN107602703B CN 107602703 B CN107602703 B CN 107602703B CN 201710682143 A CN201710682143 A CN 201710682143A CN 107602703 B CN107602703 B CN 107602703B
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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及靶向人EpCAM的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途。本发明要解决的技术问题是为肿瘤的免疫治疗提供新的有效手段。本发明解决技术问题的技术方案首先是提供了一种能够识别人EpCAM的单链抗体；含有该单链抗体的嵌合型抗原受体(CAR)；携带该嵌合抗原受体的载体；以及该嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。本发明EpCAM靶向嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在特异识别过表达EpCAM的肿瘤细胞后，可以通过细胞因子的释放及细胞毒效应发挥抗肿瘤作用；其在体内可以显著抑制肿瘤的肿瘤形成、肿瘤生长及肺部转移，具有好的应用前景。

Description

靶向人EpCAM的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及靶向人EpCAM的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途。
背景技术
在细胞免疫过程中，T淋巴细胞扮演着主要的角色。T细胞所介导的细胞免疫主要是通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)特异识别细胞表面由主要组织相容性复合物(MHC) 所展示的抗原肽，进而激活T细胞胞内信号，对该靶细胞进行特异杀伤。这对及时清除体内病变的细胞以及预防肿瘤的发生起着至关重要的作用。
肿瘤能够通过多种途径逃避免疫系统的监视而产生免疫逃逸，使得肿瘤细胞能够在体内生存从而发生肿瘤。但是，在肿瘤病人体内，仍然有少部分免疫细胞能够识别并杀伤肿瘤。该类免疫细胞能够浸润到肿瘤组织中发挥杀伤功能，因此，通常称这类免疫细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。TIL能够表达特异识别肿瘤抗原的TCR,进而可以靶向肿瘤细胞，发挥杀伤活性。目前，国内外已经利用TIL进行临床肿瘤治疗并取得了一定的成效。然而，由于自身的特点，TIL的临床应用有一定的局限性。首先，TIL的分离有一定的难度，并非所有分离得到的TIL都具有肿瘤杀伤活性。其次，分离所得的TIL数量有限，必须经过体外扩增，达到治疗所需的数目后才能够应用于临床。然而，经过长期的体外扩增，TIL的肿瘤杀伤活性显著下降。这可能跟由于多次的扩增而导致的T细胞受体(T cell receptor，TCR)的改变以及表面共刺激因子的缺乏有关。另外，TIL所介导的肿瘤杀伤是依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的，而肿瘤细胞免疫逃逸的一个重要机制就是MHC的下调。这又使得TIL的临床应用增加了一定的难度1。因此，理想的TIL是易于获得，同时能够在经过体外扩增后还具有较强的、特异的肿瘤杀伤活性的淋巴细胞。
随着生物基因工程技术的成熟，利用基因工程手段获得类似TIL的淋巴细胞已经成为可能。目前，国外很多科学小组通过不同的基因转染手段，将表达类似TCR的目的基因导入淋巴细胞从而获得了能够识别肿瘤特异抗原的淋巴细胞。该类TCR结构为scFv-Tm-SD。其中， scFv为识别肿瘤抗原的单链抗体；Tm为胞外及跨膜结构域，辅助该表达产物的膜定位并介导二聚化及scFv的空间延伸；SD为胞内信号结构区，介导淋巴细胞的活化。这样的类TCR 结构也被称为嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。目前，该类基因工程化的 CAR T细胞(CAR-Tc)在国外已经用于临床治疗黑色素瘤2,3、淋巴瘤4,5，并取得了显著的疗效。
与TIL相比，CAR-Tc有比较明显的优势。首先，CAR对肿瘤抗原的识别是非MHC依赖型的。在CAR结构中，scFv来源于能够识别肿瘤抗原的抗体。与TCR识别抗原肽-MHC 复合物不同，CAR对肿瘤细胞抗原的识别只依赖于其对抗原的亲和力，与是否该抗原肽被 MHC展示无关。这不仅克服了肿瘤细胞通过下调自身MHC而产生的免疫逃逸，而且扩大了 CAR-Tc的应用范围。其次，CAR-Tc是利用基因工程手段得到的，省去了分离TIL过程中比较繁琐的步骤。另外，CAR-Tc所靶向的抗原有很多的选择，可以针对目前研究比较成熟的抗原进行主动设计，无须被动进行TIL分选。
研究表明,EpCAM参与细胞增殖、分化、迁移等多种生物学功能，与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。EpCAM作为一种重要的细胞表面抗原，在肿瘤免疫治疗中的作用备受关注。近年来，以EpCAM为靶点的肿瘤药物开发越来越多，其中，EpCAM/CD3双特异性单链抗体MT110和三功能抗体Catumaxomab在多种恶性肿瘤中均取得不错效果6,7，正在进行Ⅱ期和Ⅲ期临床试验。而且，EpCAM还被用于肿瘤的检查、分期和疗效评估8。
本领域目前还没有的针对EpCAM的有效嵌合型抗原受体报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为肿瘤的免疫治疗提供新的有效手段。本发明解决技术问题的技术方案首先是提供了一种单链抗体。该单链抗体ScFv，能够识别人EpCAM，是通过串联针对EpCAM的抗体轻链、重链可变区而得。
进一步的，上述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGG GSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLGWIGDIF PGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQ GTTVTVSS。
此外，本发明还提供了编码上述的单链抗体的基因。
进一步的，上述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：
GAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGG TCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTAC TTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATC CACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTTGAGATCAAAggtggtggtggttctggcgg cggcggctccggtggtggtggttctGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGG CCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAACTACTGG CTAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGGATGGATTGGAGATATTTTCCCT GGAAGTGGTAATATCCACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACTGCAG ACAAATCTTCGAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGTAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCTG TCTATTTCTGTGCAAGACTGAGGAACTGGGACGAGCCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC。
同时，本发明还提供了一种嵌合型抗原受体。该嵌合型抗原受体CAR是通过氮端到碳端顺次上述抗EpCAM单链抗体(Ep-ScFv)、CD8α链的铰链区和跨膜区(CD8α)和CD28 胞内段、4-1BB以及CD3ζ链(CD3-z)得到的。该抗原受体CAR的结构可表示为Sp-(Ep-ScFv)- (CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)。
其中，上述的CD8α链的铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSL VIT。
其中，上述的CD28胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。
其中，上述的4-1BB胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
其中，上述的CD3-z的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示：
APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
进一步的，该嵌合型抗原受体相应的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：
ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSG GGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLGWIG DIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYW GQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL AGTCGVLLLSLVITRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
本发明还提供了一种在嵌合型抗原受体的氮端增加信号肽的嵌合型抗原受体。该嵌合型抗原受体CAR是通过氮端到碳端顺次拼接信号肽(Sp)、上述抗EpCAM单链抗体(Ep-ScFv)、 CD8α链的铰链区和跨膜区(CD8α)和CD28胞内段、4-1BB以及CD3ζ链(CD3-z)得到的。显然，信号肽可以根据需要进行合适的选择、
该嵌合型抗原受体CAR的结构可表达为Sp-(Ep-ScFv)-(CD8α)-(CD28)-(4-1BB) -(CD3-z)。
其中，上述的信号肽的一种优选方案为氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的信号肽：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSA。
其中，上述的CD8α链的铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVL LLSLVIT。
其中，上述的CD28胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。
其中，上述的4-1BB胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
其中，上述的CD3-z的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示：
APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
具体的，上述嵌合型抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYL TWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSY PLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNY WLGWVKQRPGHGLGWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSA VYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
本发明也提供了编码上述嵌合型抗原受体(CAR)的基因。
进一步的，上述编码嵌合型抗原受体(CAR)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
GAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGG TCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTAC TTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATC CACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTTGAGATCAAAggtggtggtggttctggcgg cggcggctccggtggtggtggttctGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGG CCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAACTACTGG CTAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGGATGGATTGGAGATATTTTCCCT GGAAGTGGTAATATCCACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACTGCAG ACAAATCTTCGAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGTAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCTG TCTATTTCTGTGCAAGACTGAGGAACTGGGACGAGCCTATGGACTACTGGGGCCAAGGG ACCACGGTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGC CCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGG GGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCC TGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAGGAGTAAGAGGAGC AGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAA GCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCA GAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGC CCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGA GAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGC CGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGAT GGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。
进一步的，上述编码氮端拼接信号肽的嵌合型抗原受体(CAR)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示：
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAA CTCGGCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGA AGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAA CTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGG CATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAAT GATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTTGAGATCAAAggtggtggtggttct ggcggcggcggctccggtggtggtggttctGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTA AGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAACTAC TGGCTAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGGATGGATTGGAGATATTTT CCCTGGAAGTGGTAATATCCACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACTG CAGACAAATCTTCGAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGTAGCCTGACATTTGAGGACTCT GCTGTCTATTTCTGTGCAAGACTGAGGAACTGGGACGAGCCTATGGACTACTGGGGCCA AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCG GCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGG CGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCG CCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAGGAGTAAGAG GAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCC GCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGG GGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACT CAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAC TGGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGA AGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAA AGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATA AGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。
同时，本发明也提供了含有上述基因的表达载体。
其中，上述的表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座酶/转座子载体、质粒载体或mRNA载体等本领域常用的载体。在本发明实施例中使用慢病毒载体。
进一步的，上述的载体为CD510B-1-pCDH。本发明后附的实例中将插入上述的嵌合型抗原受体CAR的基因后得到的重组质粒为命名为CD510B-1-pCDH-CAR。
其中，上述表达载体可用以下方法制备：将具有嵌合抗原受体积基因装入慢病毒载体 CD510B-1-pCDH中，并与另外两个辅助载体psPAX2和pMD2.G共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒载体。
自然，本发明也提供了含有上述的表达载体的宿主细胞。
其中，上述的宿主细胞优选为免疫细胞。进一步的，所述免疫细胞为淋巴细胞。免疫细胞优选但不限于T淋巴细胞、NK细胞等。
此外，本发明还提供了制备上述宿主细胞的方法。该方法将上述的表达载体转染淋巴细胞，从而获得能表达特异识别EpCAM的CAR的基因工程化的淋巴细胞。
本发明还提供了上述的(ScFv-V)-(CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)嵌合抗原受体、上述的表达载体、上述的宿主细胞在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。本发明也还提供了在预防或治疗肿瘤的药物。该药物是由上述的(ScFv-V)-(CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z) 嵌合抗原受体、上述的表达载体、上述的宿主细胞中的至少一种作为主要活性成分制备而成。自然的，本领域技术人员能够容易的添加各种可以接受的辅助性成分制备上述药物；此外，也能制成各种可用的剂型。甚至还能加入其它的抗肿瘤成分制成复方制剂。
本发明的有益效果在于：本发明设计得到了一种嵌合性抗原受体，该嵌合型抗原受体的 scFv具有识别EpCAM的能力。将该嵌合抗原受体基因克隆至慢病毒载体，通过生产慢病毒颗粒并感染T细胞，使该嵌合型抗原受体在人淋巴细胞表面的高效表达，从而将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别人EpCAM分子并介导对过表达EpCAM的肿瘤细胞进行靶向杀伤的特异性淋巴细胞。其中的特别优选的抗EpCAM的单链抗体(scFv)可以使得嵌合性抗原受体更好地发挥作用。EpCAM靶向嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在特异识别过表达EpCAM的肿瘤细胞后，可以通过细胞因子的释放及细胞毒效应发挥抗肿瘤作用；其在体内可以显著抑制肿瘤的肿瘤形成、肿瘤生长及肺部转移，且没有明显的毒副作用，提供了一种新的安全、有效的肿瘤治疗治疗方案。
附图说明
图1为CAR基因转染后的表达检测。一抗为兔抗人CD3链，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。第一泳道为未经感染的T细胞，第二泳道为感染空载体的T细胞，第三泳道为感染载有EpCAM CAR基因载体的T细胞。
图2为携带EpCAM CAR基因的病毒载体感染T细胞后T细胞表面CAR的表达水平，流式抗体为藻红蛋白(PE，P-phycoerytherin)标记的抗CAR单链抗体框架区的抗体。黑色实线为T细胞未经感染的T细胞的CAR表达水平，灰色实线为经EpCAM CAR病毒载体感染的T细胞的CAR表达水平。
图3为不同种类细胞株的EpCAM表达水平的检测。利用PE标记的抗人EpCAM检测了人宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MDA-MB 231、人结肠癌细胞株SW480和HT29.流式图中的黑色实线为同型抗体对照，灰色(箭头所示)为抗人EpCAM的抗体。
图4为经EpCAM CAR病毒感染的T细胞(EpCAM CAR-T细胞)对不同EpCAM表达水平的种类细胞的杀伤水平。利用标准的4小时51铬释放试验，检测了未经感染(No-CAR) 和经EpCAM CAR病毒感染的T细胞(EpCAM CAR-T)的杀伤水平。纵坐标显示为杀伤水平的百分数，横轴为不同的效应细胞与靶细胞的比例(效靶比)。
图5为EpCAM CAR-T细胞在体内对HT29结直肠癌肿瘤生长的抑制作用，观测生理盐水组、未修饰T细胞组、EpCAM CAR-T细胞治疗组的肿瘤体积至接种第26天。
具体实施方式
本发明的第一方面通过核糖体展示技术优选到了一种能够识别EpCAM的单链抗体(ScFv)。该单链抗体是通过串联针对EpCAM的抗体轻链、重链可变区而得，具有优秀的特异性识别EpCAM的能力。抗EpCAM的单链抗体(ScFv-E)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1) 所示：
ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSG GGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLGWIG DIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYW GQGTTVTVSS。
编码基因(SEQ ID NO:2)如下所示：
GAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGG TCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTAC TTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATC CACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCA CTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTTGAGATCAAAggtggtggtggttctggcgg cggcggctccggtggtggtggttctGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGG CCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAACTACTGG CTAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGGATGGATTGGAGATATTTTCCCT GGAAGTGGTAATATCCACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACTGCAG ACAAATCTTCGAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGTAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCTG TCTATTTCTGTGCAAGACTGAGGAACTGGGACGAGCCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC。
其中，小写字母部分为(G4S)3linker。
本发明的第二个方面是提供了一种嵌合型抗原受体(CAR)重组基因及其合成方法。具体为通过顺次拼接hIL-2信号肽、抗EpCAM单链抗体(scFv)、CD8α链的铰链区和跨膜区(CD8α)和CD28胞内段、4-1BB、CD3ζ链(CD3-z)，得到完整的CAR基因：(ScFv-V)-(CD8 α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)。最后，将全长CAR基因插入目的载体。其中信号肽将CAR 分子分泌到胞外；scFv介导对EpCAM的靶向识别；CD8α链的铰链区和跨膜区将CAR分子锚定在细胞膜上，同时还有使ScFv具有一定的空间展示度；CD28、4-1BB和CD3-z为胞内信号，在scFv识别EpCAM后介导胞内的信号激活，引发细胞毒作用。上述元件互相配合，起到了良好的靶向介导淋巴细胞尤其是T淋巴细胞至表达EpCAM的肿瘤细胞并引发杀伤作用并抑制肿瘤生长的效果。
本发明在提供的实例中使用了质粒载体为慢病毒载体CD510B-1-pCDH。最终，插入CAR 基因的重组质粒为CD510B-1-pCDH-CAR。插入位置为以Xba1和Sgf1为酶切位点插入。可以与另外两个辅助载体psPAX2和pMD2.G共同转染293T等细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒载体。
本发明的第三个方面为提供了一种获得具有靶向EpCAM的工程化淋巴细胞。利用本发明第二个方面提供的慢病毒载体，转染人淋巴细胞，从而获得表达CAR的基因工程化的淋巴细胞。
使用本发明表达CAR的基因工程化的淋巴细胞，能够有效的预防和治疗肿瘤。
实施例1获得CAR全长基因，完成重组质粒载体的构建
1，合成引物，利用重叠PCR方法得到(ScFv-V)-(CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)融合片段。
2，以重叠PCR的方法获得全长的CAR基因。
具体方案如下：
a)利用引物F1、R1扩增ScFv-E段的编码基因,利用F2、R2扩增(CD8α)-(CD28)-(4-1BB) -(CD3-z)的编码基因。其中，ScFv-E，(CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)的编基因码均通过化学合成获得(由广州复能基因有限公司合成)。
b)以ScFv-E和(CD8α)-(CD28)-(4-1BB)-(CD3-z)为模板，F1、R2为引物，PCR获得全长CAR基因。
获得CAR基因所用的引物(5’到3’)：
F1(SEQ ID NO:12)：
5’-GCtctagaATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGC-3’；
R1(SEQ ID NO:13)：
5’-TTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTGGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’；
F2(SEQ ID NO:14)：
5’-ACCACGGTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCA CCA-3’；
R2(SEQ ID NO:15)：
5’-AATATGCGCgcgatcgcTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3’。
3，构建CD510B-1-pCDH-CAR质粒载体。
以Xba1和Sgf1为酶切位点，连接目的基因及CD510B-1-pCDH载体(购自SBI(SystemBiological Incorporation)公司)，获得CD510B-1-pCDH-CAR质粒载体。
实施例2 淋巴细胞的转染，表达检测
1，淋巴细胞的病毒转染及目的基因的表达检测。
将实施例一制得的具有嵌合抗原受体基因装入慢病毒载体CD510B-1-pCDH中，并与另外两个辅助载体psPAX2和pMD2.G共同转染293T细胞(购自ATCC细胞库)，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒载体。利用密度梯度离心法，从人外周血分离得到T淋巴细胞后，以CD3抗体(1ug/ml)和IL-2(300IU/ml)刺激淋巴细胞。两天后收集淋巴细胞进行病毒转染，后培养淋巴细胞48小时，收集转染的淋巴细胞，提取细胞总蛋白进行免疫印迹实验(western blotting)。结果显示转染后的T淋巴细胞中CAR得到了较高的表达(参见图1)。
本发明还检测了经携带EpCAM CAR基因的慢病毒感染T细胞后CAR分子在T细胞表面的表达水平。同时利用识别抗体Fab片段的特异性抗体，经流式细胞仪检测证实，CAR分子在淋巴细胞表面高效表达(参见图2)。
本发明还用流式细胞仪检测不同肿瘤细胞株EpCAM的表达水平(参见图3)。具体方法是利用藻青蛋白(APC)标记的特异识别人EpCAM的抗体赋予Hela、MDA-MB 231和SW480 细胞，经流式细胞仪检测，最终发现不同的肿瘤细胞EpCAM的表达水平不同。其中SW480 细胞的EpCAM表达水平最高，MDA-MB 231中度表达EpCAM，Hela细胞EpCAM表达为阴性(见图3)。
实施例3 对表达EpCAM的肿瘤细胞的杀伤作用
考察能特异识别EpCAM的CAR基因工程化T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。利用51Cr释放试验，检测基因工程化T细胞依赖于EpCAM表达水平的靶向杀伤作用。
实施过程：将不同EpCAM表达水平的靶细胞Hela、MDA-MB 231和SW480经铬酸钠标记后接种至96孔板中。同时以经EpCAM CAR病毒感染的T细胞(EpCAM CAR-T)细胞为效应细胞，以10：1、5：1和2.5：1的效靶比计数，将EpCAM CAR-T细胞加入96孔板中，与靶细胞孵育。同时，以未感染EpCAM CAR病毒的T细胞(No CAR-T)作为对照，以相同的效靶比计数，加入96孔板与靶细胞孵育。每个样本三个副孔。同时，设置两组未加入任何效应细胞的靶细胞作为自发释放与最大释放组。
37摄氏度，5％CO2培养4小时后，在最大释放组中加入1％Triton-100，裂解细胞，收取100微升上清，作为最大释放样本；直接收取未加入任何效应细胞的自发释放组中的等体积上清，作为自发释放样本。同时在加入效应细胞的组中收取等体积样本，作为实验样本。将样本进行γ计数仪读数，分别获得自发释放、最大释放、实验释放值，计算杀伤比例。计算公式为：(实验释放值-自发释放值)÷最大释放值×100％。
实验结果发现：与No CAR-T组相比，EpCAM CAR-T能够有效杀伤表达EpCAM的肿瘤细胞(MDA-MB 231和SW480)，对EpCAM表达阴性的Hela细胞则无杀伤活性；同时，效靶比越高，杀伤比例越高(见图4)。因此我们证实：EpCAM CAR-T细胞能够产生对EpCAM 阳性的肿瘤细胞的特异杀伤活性。
实施例4 EpCAM CAR-T细胞在体内对HT29结直肠癌肿瘤生长的抑制作用
利用免疫缺陷小鼠，建立人结直肠癌皮下肿瘤模型，回输EpCAM CAR-T细胞，评估EpCAM CAR-T细胞对HT29结直肠癌肿瘤的生长的抑制作用。
实施过程：1)购买5周龄的Nod-SCID BALB/c小鼠，于动物房饲养1周适应环境，后随机分成三组，分别为生理盐水组、未修饰T细胞组及EpCAM CAR-T细胞组，每组实验鼠数目为5只。EpCAM CAR-T细胞的制备过程按照实施例2进行。
2)收集T淋巴细胞、HT29肿瘤细胞，进行细胞计数。
3)按T淋巴细胞：肿瘤细胞＝4：1，即分别收集5×106HT29肿瘤细胞，然后各加入2×107 T细胞，用无血清培养基洗涤3次。生理盐水组组只有肿瘤细胞，无T淋巴细胞，体积以生理盐水配平。
4)将上述收集的细胞最终重悬于100μl无血清RPMI 1640培养基中，进行皮下接种。
5)观察动物成瘤性，记录肿瘤体积大小，计算公式：肿瘤体积＝肿瘤长径×肿瘤宽2×0.52。
试验结果发现；HT29结肠癌肿瘤模型中，接种第26天时，生理盐水组肿瘤平均体积为 799.51±170.20mm3，未修饰T细胞组组为724.72±125.05mm3，而EpCAM CAR-T细胞治疗组为313.06±92.50mm3(图5)。与生理盐水组、未修饰T细胞组相比，EpCAM CAR-T 细胞能够抑制HT29肿瘤细胞的肿瘤生长。
【参考文献】
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SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 靶向人EpCAM的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途
<130> A170590K
<150> 201610662941.0
<151> 2016-08-12
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 单链抗体ScFv的氨基酸序列
<400> 1
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
130 135 140
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Gly Trp
165 170 175
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 744
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码单链抗体ScFv基因的核苷酸序列
<400> 2
gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc 360
ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg 420
gtaaggcctg ggacttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaac 480
tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct ggacatggac ttggatggat tggagatatt 540
ttccctggaa gtggtaatat ccactacaat gagaagttca agggcaaagc cacactgact 600
gcagacaaat cttcgagcac agcctatatg cagctcagta gcctgacatt tgaggactct 660
gctgtctatt tctgtgcaag actgaggaac tgggacgagc ctatggacta ctggggccaa 720
gggaccacgg tcaccgtctc ctcc 744
<210> 3
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合型抗原受体CAR的氨基酸序列
<400> 3
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
130 135 140
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Gly Trp
165 170 175
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
180 185 190
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Ala Pro Ala
385 390 395 400
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
405 410 415
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
420 425 430
Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
435 440 445
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
450 455 460
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
485 490 495
Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 4
<211> 522
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氮端联接信号肽的嵌合型抗原受体CAR的氨基酸序列
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
65 70 75 80
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
180 185 190
His Gly Leu Gly Trp Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile
195 200 205
His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
210 215 220
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp
225 230 235 240
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg
325 330 335
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
340 345 350
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
355 360 365
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
370 375 380
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
385 390 395 400
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
405 410 415
Glu Leu Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
420 425 430
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
435 440 445
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro
450 455 460
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
465 470 475 480
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
485 490 495
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
500 505 510
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 5
<211> 1506
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码嵌合型抗原受体CAR的核苷酸序列
<400> 5
gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc 360
ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg 420
gtaaggcctg ggacttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaac 480
tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct ggacatggac ttggatggat tggagatatt 540
ttccctggaa gtggtaatat ccactacaat gagaagttca agggcaaagc cacactgact 600
gcagacaaat cttcgagcac agcctatatg cagctcagta gcctgacatt tgaggactct 660
gctgtctatt tctgtgcaag actgaggaac tgggacgagc ctatggacta ctggggccaa 720
gggaccacgg tcaccgtctc ctccaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 780
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 840
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccctg 900
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccaggagtaa gaggagcagg 960
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1020
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccaaacg gggcagaaag 1080
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1140
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact ggcccccgcg 1200
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1260
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg 1320
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1380
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1440
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1500
cgctaa 1506
<210> 6
<211> 1569
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码氮端联接信号肽的嵌合型抗原受体CAR的核苷酸序列
<400> 6
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaactcg 60
gccgagctcg tgatgacaca gtctccatcc tccctgactg tgacagcagg agagaaggtc 120
actatgagct gcaagtccag tcagagtctg ttaaacagtg gaaatcaaaa gaactacttg 180
acctggtacc agcagaaacc agggcagcct cctaaactgt tgatctactg ggcatccact 240
agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctggaacaga tttcactctc 300
accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagaa tgattatagt 360
tatccgctca cgttcggtgc tgggaccaag cttgagatca aaggtggtgg tggttctggc 420
ggcggcggct ccggtggtgg tggttctgag gtgcagctgc tcgagcagtc tggagctgag 480
ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cgccttcact 540
aactactggc taggttgggt aaagcagagg cctggacatg gacttggatg gattggagat 600
attttccctg gaagtggtaa tatccactac aatgagaagt tcaagggcaa agccacactg 660
actgcagaca aatcttcgag cacagcctat atgcagctca gtagcctgac atttgaggac 720
tctgctgtct atttctgtgc aagactgagg aactgggacg agcctatgga ctactggggc 780
caagggacca cggtcaccgt ctcctccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ctggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcaccaggag taagaggagc 1020
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1080
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1140
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1200
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actggccccc 1260
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1320
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 1380
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1440
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1500
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1560
cctcgctaa 1569
<210> 7
<211> 66
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α链的铰链区和跨膜区的氨基酸序列
<400> 7
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr
65
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28胞内段的氨基酸序列
<400> 8
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB胞内段的氨基酸序列
<400> 9
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 10
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3-z的氨基酸序列
<400> 10
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
1 5 10 15
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
35 40 45
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
50 55 60
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
85 90 95
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氮端连接的信号肽的氨基酸序列
<400> 11
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala
20
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 获得CAR基因所用的引物F1
<400> 12
gctctagaat gtacaggatg caactcctgt cttgc 35
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 获得CAR基因所用的引物R1
<400> 13
ttggtggtcg cggcgctggc gtcgtggtgg aggagacggt gaccgtggt 49
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 获得CAR基因所用的引物F2
<400> 14
accacggtca ccgtctcctc caccacgacg ccagcgccgc gaccacca 48
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 获得CAR基因所用的引物R2
<400> 15
aatatgcgcg cgatcgctta gcgagggggc agggc 35

Claims (15)

1.单链抗体ScFv，该单链抗体能够识别人EpCAM，是通过串联针对EpCAM的抗体轻链、重链可变区而得；氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的单链抗体ScFv的基因；核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.嵌合型抗原受体，其特征在于：该嵌合型抗原受体是通过氮端到碳端依次联接权利要求1所述的抗EpCAM单链抗体、CD8α链的铰链区和跨膜区与CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ链得到的；氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求3所述的嵌合型抗原受体，其特征在于：该嵌合型抗原受体是通过氮端到碳端顺次联接信号肽、权利要求1所述的抗EpCAM单链抗体、CD8α链的铰链区和跨膜区与CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ链得到的；氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.编码权利要求3所述的嵌合型抗原受体的基因；具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
6.编码权利要求4所述的嵌合型抗原受体的基因；具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
7.含有权利要求5或6所述的基因的表达载体。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座酶/转座子载体、质粒载体或mRNA载体中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于所述的载体为CD510B-1-pCDH慢病毒载体。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述的载体用以下方法制备：将嵌合抗原受体基因装入慢病毒载体CD510B-1-pCDH中，并与两个辅助载体psPAX2和pMD2.G共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的重组慢病毒载体。
11.含有权利要求8-10任一项所述的表达载体的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为免疫细胞。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于：所述免疫细胞为淋巴细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于：所述淋巴细胞为T淋巴细胞或NK细胞。
15.制备权利要求14所述的宿主细胞的方法，其特征在于：将权利要求8-10任一项所述的表达载体转染淋巴细胞，从而获得能表达特异识别EpCAM的嵌合型抗原受体的基因工程化的淋巴细胞。
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