CN117024598A - 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117024598A
CN117024598A CN202310659011.XA CN202310659011A CN117024598A CN 117024598 A CN117024598 A CN 117024598A CN 202310659011 A CN202310659011 A CN 202310659011A CN 117024598 A CN117024598 A CN 117024598A
Authority
CN
China
Prior art keywords
target
cells
domain
cancer
chimeric antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310659011.XA
Other languages
English (en)
Inventor
肖忠党
沈杨
孙博
严凯
李占萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN202310659011.XA priority Critical patent/CN117024598A/zh
Publication of CN117024598A publication Critical patent/CN117024598A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明公开了一种长效的Meso‑B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述Meso‑B7H3双靶嵌合抗原受体包含两条独立跨膜蛋白组成的CAR链，第一条CAR链靶向第一靶点的scFv，胞内信号包含第二信号和胞内转导信号或只有胞内转导信号，第二条CAR链靶向第二靶点的scFv，胞内信号包含共刺激信号和JAK酶激活转导域。由本发明制备的CAR‑T细胞对同时表达第一靶点和第二靶点的肿瘤细胞有很强的持久杀伤作用，可用于实体瘤的抗肿瘤治疗。

Description

长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和免疫治疗技术领域，具体来说，涉及长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用。本发明是申请号为2022111797820，发明名称为长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用的分案申请。
背景技术
CAR-T细胞技术是基于免疫系统识别与活化理论，通过基因工程技术，将特异识别肿瘤抗原(单链抗体scFv)、启动免疫活性的元件整合成一个基因，并在体外通过病毒等方法将其转导入患者自身T淋巴细胞中并扩增，之后输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，激活自身T细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞技术具有对肿瘤杀伤不受主要组织相容性复合体限制等优势，在难治复发的B细胞白血病和淋巴瘤患者中取得了令人振奋的效果，近几年CAR-T细胞疗法在脑胶质瘤、前列腺癌、肺癌等实体瘤方面的研究也取得了巨大进展，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。迄今，全世界已有300多项CAR-T细胞疗法进入临床试验。CAR-T细胞技术的核心就是利用基因工程手段对T细胞进行改造，通过CAR分子识别肿瘤细胞并同时激活T细胞，从而发挥强大杀伤肿瘤细胞的作用。但是，现有的CAR-T细胞技术治疗肿瘤有着固有缺陷，这是因为现阶段还很难找到肿瘤特异性靶标，主要都是通过肿瘤相关抗原识别肿瘤细胞，不可避免会出现脱靶毒性，甚至严重致死。
在很多类型肿瘤细胞表面会同时两种靶点蛋白，例如有部分卵巢癌组织同时高表达间皮素(Mesothelin)和B7H3，而正常组织同时高表达两个靶点概率很低，如果将这两个靶点蛋白设计成双靶点CAR，使得CAR-T细胞同时靶向肿瘤细胞高表达的两个靶点时，CAR-T细胞才被完全激活，发挥杀伤功能，对正常细胞只表达作为第一激活信号的靶点时或只表达作为第二激活信号的靶点时，CAR-T细胞则没有杀伤作用或只有较弱的杀伤作用，这样，我们就可以通过合适的双靶点CAR设计可以大大降低体内脱靶毒副作用。
此外，现有的CAR-T细胞技术治疗肿瘤还普遍存在体内扩增能力和存续时间不足的缺点，导致临床疗效有限和治疗后容易复发等。解决这个问题，通常利用各种细胞因子实现CAR-T细胞的持续扩增，如IL-2、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21，IL-23、GM-CSF-R等，这些细胞因子的作用是通过结合到CAR-T细胞上细胞因子受体而激活细胞内下游转导信号。例如IL-15先与IL-15膜受体的α亚基结合，再与效应CAR-T细胞上的IL2R-γc/IL-15Rβ形成免疫突触，激活细胞内的JAK1/JAK3和STAT3/STAT5途径等，进而促进CAR-T细胞的分化和增殖。目前有两种方式实现这一目的，第一种，与CAR-T细胞治疗的同时直接体内注射这些细胞因子，但这种方式如果要达到扩增CAR-T细胞效果，细胞因子必须大剂量，这必然引起其它免疫细胞的反应，带来不可预知的副作用，甚至导致死亡。第二种，有研究者将CAR设计成在激活扩增CAR-T细胞的同时分泌细胞因子，可以有效地阻止CAR-T在体内的耗竭，但是，这种分泌型细胞因子不会仅对自身的CAR细胞起作用，也会游离到体液中，引起体内其它免疫细胞的剧烈反应，带来不可预知的副作用。
发明内容
发明目的：针对CAR-T细胞技术存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种长效的双靶点嵌合抗原受体，所述双靶点嵌合抗原受体能够降低体内脱靶的毒副作用，通过引入第三信号增强CAR-T在体内的扩增能力和持久性。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种核酸分子，其编码所述的长效的双靶点嵌合抗原受体。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种载体或包含其的重组病毒。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的长效的双靶点嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体或其重组病毒、或其细胞在制备治疗抗靶点蛋白的阳性表达的实体肿瘤药物中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种长效的双靶点嵌合抗原受体，所述长效的双靶点嵌合抗原受体包括两条独立跨膜蛋白组成的嵌合抗原受体，其中，第一条嵌合抗原受体包括第一信号肽、第一靶点肿瘤抗原的结合结构域、第一铰链结构域、第一跨膜结构域、第一胞内共刺激结构域和第一靶点CAR的胞内信号转导域；第二条嵌合抗原受体包括第二信号肽、第二靶点肿瘤抗原的结合结构域、第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二胞内共刺激结构域和JAK酶激活信号转导结构域，所述JAK酶激活信号转导结构域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1、JAK2或JAK3，所述JAK1的Gene ID为3716，JAK2的Gene ID为3717，JAK3的Gene ID为3718，Tyk2的Gene ID为7297，所述第一条嵌合抗原受体与第二条嵌合抗原受体通过连接子连接。
其中，所述JAK酶激活信号结构域通过招募JAK激酶并在其催化下发生酪氨酸残基的磷酸化，后续激活STAT信号，进而引发胞内的基因转录和表达，因此，起到与细胞因子异曲同工的作用，一旦能够捕获JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2中的任何酶的序列均属于本发明的保护范围之内。
其中，作为优选，所述JAK酶为JAK1酶，所述JAK1酶激活信号转导结构域，其90-99％同一性的氨基酸序列选自以下一个或者其中两个以上叠加：SEQ ID No.1(JAKAcS1)、SEQ ID No.2(JAKAcS2)、SEQ ID No.3(JAKAcS3)、SEQ ID No.4(JAKAcS4)、SEQ ID No.5(JAKAcS5)、SEQ ID No.6(JAKAcS6)、SEQ ID No.7(JAKAcS7)、SEQ ID No.8(JAKAcS8)、SEQID No.9(JAKAcS9)、SEQ ID No.10(JAKAcS10)，以上序列均包括JAK1激酶的结合位点和激活信号；以上序列能够捕获JAK1激酶并能够催化其发生氨酸残基的磷酸化激活STAT信号，引发胞内基因转录和表达。
其中，作为优选，所述JAK1酶激活信号转导结构域的核苷酸序列如下：SEQ IDNo.11(JAKAcS1)、SEQ ID No.12(JAKAcS2)、SEQ ID No.13(JAKAcS3)、SEQ ID No.14(JAKAcS4)、SEQ ID No.15(JAKAcS5)、SEQ ID No.16(JAKAcS6)、SEQ ID No.17(JAKAcS7)、SEQ ID No.18(JAKAcS8)、SEQ ID No.19(JAKAcS9)、SEQ ID No.20(JAKAcS10)。
其中，作为优选，所述JAK酶为JAK3酶，同样能够激活JAK3酶的结构域也在本发明的保护范围之内。
作为优选地，所述第一靶点CAR的胞内信号转导域包括以下分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD40L、CD45、CD66d、CD79、CD80、CD86、CD278、DAP10、DAP12、FcγR或Zap70，例如CD3ζ信号信号转导结构域，或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列信号转导域，例如CD3ζ信号转导结构域包含的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
作为优选地，所述第一靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达第一靶点的单链抗体scFv，所述第二靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达第二靶点的单链抗体scFv，所述第一靶点和第二靶点包含Claudin18.2、GPC3、B7H3、PD-L1、MUC1、Mesothelin、Her2、EGFR、PSMA、CEA、GD2、EpCAM、EGFRvIII、CD70、CD20、CD133、CD177、AFP、AXL、CD171、CD117、C-MET、FAP、MUC16、NKG2D、NY-ESO-1、PSCA、VEGFR-2、Lewis-Y、Gp100、FAP或EPHA2中的任意一种。根据不同肿瘤细胞表面的表达情况选择上述靶点进行组合。本发明的一个实施例中第一个靶点选择Claudin18.2，其核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，第二个靶点选择B7H3，其核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。本发明的另一个实施例中第一条嵌合抗原受体为第一靶点Mesothelin的第一代或第二代CAR或者第三代CAR设计(CAR-chain)，Mesothelin的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；第二条嵌合抗原受体的胞外由靶向B7H3的scFv、胞内由第二信号和JAK酶激活信号转导结构域，其中，CAR-chain的胞外区由靶向mesothelin的scFv组成，胞内由CD3ζ胞内区组成。
其中，信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外，任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。所述第一信号肽和第二信号肽包括T细胞受体的α链及β链、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD33、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、GM-CSF、免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的信号肽。作为优选，信号肽选取CD8α中如SEQ ID No.25所示的信号肽。
其中，本发明所述靶点结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接，任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。所述第一铰链结构域和第二铰链结构域包括以下分子的铰链区：IgG、CD8α、CD28、IL-2受体，例如CD8α的铰链区的核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示。
其中，所述第一跨膜结构域和第二跨膜结构域包括T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的一种或几种。其中一个优选方案，第一和第二跨膜结构域为CD8的跨膜区，其核苷酸序列如SEQ ID No.27所示。
其中，所述第一胞内共刺激结构域和第二胞内共刺激结构域通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％；或同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD137、CDS、ICAM-1、LFA-1、CLAUDIN、CD278或GITR中的一种或几种。其中，第一靶点不包含共刺激结构域也能实现本发明的目的，属本发明保护范围；一个优选方案第一靶点和第二靶点的胞内共刺激结构域都选择CD137，其核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；另一个优选方案第一靶点的胞内共刺激结构域选择CD28，其核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；第二靶点的胞内共刺激结构域选择CD137。
其中，所述连接子选择P2A、T2A、E2A、F2A、IRES中任意一个。一个优选方案为P2A，其核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；另一个优选方案为T2A，其核苷酸序列如SEQ ID No.31所示。
另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。
在本发明的一个实施方式中，发明人采用化学合成方法获得靶点的结合结构域。
本发明内容还包括一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的双靶点嵌合抗原受体。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述两个靶点识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。
本发明内容还包括一种载体或包含其的重组病毒，所述载体包含所述的核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。
本发明的内容还包括载体的构建方法，是将整个双靶点嵌合抗原受体的基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后连接于质粒载体上，通过含有同源臂的PCR引物，扩增嵌合抗原受体编码序列，并通过同源重组的方法将嵌合抗原受体编码序列插入病毒载体，病毒载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统的一种或多种组合，其中一种优选慢病毒载体为Plvx-EF1α-MCS-(PGK-puro)。
本发明内容还包括一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的核酸分子、所述的双靶点嵌合抗原受体，或所述的载体，所述重组细胞包括经修饰的T细胞。
在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的T细胞。所述T细胞可以来自外周血、骨髓等，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，经分离、纯化后得到。同时，所述T细胞可以为CD4+T细胞、CD8+T细胞或γδT细胞。所述T细胞可以以合适的方式替换为NK细胞、NKT细胞、辅助性T细胞或巨噬细胞，其也视为包含在本发明的保护范围之内。
本发明内容还包括一种应用，所述应用包括以下任一项：所述的双靶点嵌合抗原受体、所述的核酸分子，所述的重组载体或重组病毒、所述的重组细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用。
其中，所述实体瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、食道癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、头颈部细胞癌、骨癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、甲状腺癌、宫颈癌、神经膀胱癌或前列腺癌。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，长春新碱、柔红霉素、门冬酞胺酶、环磷酞胺、泼尼松等。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述药物组合物在制备抗靶点蛋白的阳性表达的实体肿瘤药物中的应用。
综上，本发明的双靶点嵌合抗原受体同时表达出两条跨膜蛋白链，其中一条链为第一代或第二代CAR或者第三代CAR设计(CAR-chain)；第二条链的胞外由靶向肿瘤抗原结合结构域组成，胞内由第二信号和JAK酶激活信号转导结构域组成(costimulatory chain，Cos-chain)；两条链的胞外结合结构域可以是靶向同一抗原表位的结构域，或者靶向同一抗原不同表位的结合结构域，或者靶向不同抗原的结合结构域组成。
本发明CAR设计的一个优势是CAR-chain的胞外结合区由靶向第一靶点的scFv组成，胞内由共刺激分子的胞内区和胞内信号转导第一信号的胞内区组成。Cos-chain的胞外结合区由靶向第二靶点的scFv组成，胞内由共刺激分子的胞内区和JAK酶激活信号转导结构域组成，这样设计可以使肿瘤细胞表面高表达第一靶点的阳性肿瘤细胞与第一靶点scFv结合后给T细胞提供第一信号和第二信号，启动T细胞杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞表面高表达第二靶点的阳性肿瘤细胞与第二靶点scFv结合后给T细胞提供第二和第三信号，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的功能和持久性；正常细胞表面不表达两个靶点蛋白或者只表达第二靶点时，T细胞不具备杀伤功能，降低了CAR-T细胞的脱靶毒副作用。本发明CAR设计的另一个优势是直接通过第二个靶点CAR的结构设计使该CAR的胞内区富集CAR-T细胞内的JAK酶激活信号转导元件，当第二个CAR胞外区scFv结合到肿瘤细胞上的抗原后激活CAR-T细胞内的JAK/STAT信号转导途径等，促进CAR-T细胞的分化和增殖，从而阻止CAR-T细胞的耗竭。
例如，本发明的一个实施例中，第一靶点为Mesothelin，第二靶点为B7H3，其CAR设计的一个优势是肿瘤细胞表面高表达第一靶点Mesothelin的阳性肿瘤细胞与第一靶点scFv结合后给T细胞提供第一信号和第二信号，启动T细胞杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞表面高表达第二靶点B7H3的阳性肿瘤细胞与第二靶点scFv结合后给T细胞提供第二和第三信号，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的功能和持久性；正常细胞表面不表达两个靶点蛋白或者只表达第二靶点B7H3时，T细胞不具备杀伤功能，大大地降低了CAR-T细胞的脱靶毒副作用；另一个优势是直接通过第二个靶点CAR的结构设计使该CAR的胞内区富集CAR-T细胞内的JAK酶激活信号转导结合元件，当第二个CAR胞外区scFv结合到靶细胞上的抗原后激活CAR-T细胞内的JAK/STAT信号转导途径等，促进CAR-T细胞的分化和增殖，从而阻止CAR-T细胞的耗竭。
有益效果：本发明的CAR比已有类似产品的好处在于：首先，CAR在发挥了细胞因子作用的前提下并没有细胞因子的分泌，不会引起其它免疫细胞的过度激活，避免副作用。其次，只有第二个靶点CAR的scFv与肿瘤细胞的抗原结合才能激起CAR-T细胞的扩增，使CAR-T细胞扩增只集中在肿瘤细胞附近，不仅加强了杀伤肿瘤细胞的作用，而且一旦肿瘤细胞被清除完，CAR-T细胞即停止扩增，进一步保证体内安全性。本发明实施例显示由本发明设计的CAR制备的CAR-T细胞比第三代CAR-T细胞具备显著的重复杀伤肿瘤细胞的能力。
附图说明
图1为长效双靶点CAR的结构示意图。
图2为实施例4的CLDN18.2/B7H3 CART细胞的GFP表达荧光图，GFP为CLDN18.2/B7H3 CART的荧光标记蛋白，以及用流式检测CLDN18.2/B7H3 CART细胞的阳性表达量。
图3为实施例5的CLDN18.2/B7H3 CART细胞与靶细胞(效靶比为1∶1)共培养40个小时后的肿瘤细胞GFP动态荧光统计值。
图4为实施例5的CLDN18.2/B7H3 CART细胞与靶细胞共培养24h后IL2和IFN-γ释放的ELISA检测结果。
图5为实施例5设计的双靶CLDN18.2/B7H3 CART、第三代CAR-T细胞(即第一靶点scFv-CD28-CD137-CD3ζ)、未做修饰的T细胞对相同剂量(105个)的靶细胞进行多次重复杀伤结果比较。
图6为实施例9Meso-B7H3 CAR-T细胞用流式检测CAR-T细胞生长第七天的CAR阳性表达量。
图7为Meso-B7H3 CAR-T细胞的生长扩增曲线和T细胞体积大小变化。
图8为实施例10的Meso-B7H3 CAR-T细胞与靶细胞(效靶比为1∶1)共培养40个小时后的肿瘤细胞GFP动态荧光统计值。
图9为实施例10的Meso-B7H3 CAR-T细胞与靶细胞共培养24h后IL2和IFN-γ释放的ELISA检测结果。
图10本发明实施例10设计的双靶Meso-B7H3 CAR-T细胞、第三代CAR-T细胞(即靶点Meso scFv-CD28-CD137-CD3ζ)、未做修饰的T细胞对相同剂量(105个)的靶细胞进行多次重复杀伤实验结果。
具体实施方式
本发明公开了长效双靶CAR的构建及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1双靶CLDN18.2/B7H3 CAR(信号肽-第一靶点CLDN18.2scFv-CD8αhinge-CD8TM-CD3ζ-T2A-信号肽-第二靶点B7H3 scFv-CD8α hinge-CD8 TM-CD137-JAKAcS1)表达载体的构建
第一靶点选择Claudin18.2和第二靶点选择B7H3，构建双靶CAR：信号肽-第一靶点CLDN18.2scFv-CD8α hinge-CD8TM-CD3ζ-T2A-信号肽-第二靶点B7H3 scFv-CD8ahinge-CD8TM-CD137-JAKAcS1。
委托金斯瑞公司合成编码上述CLDN18.2/B7H3 CAR的核酸序列，序列为SEQ IDNo.32。
通过BamHI-MluI双酶切Plvx-EF1a-IRES-ZsGreen1，CLDN18.2/B7H3 CAR实现载体和片段线性化。酶切体系如下：
通过T4 DNA酶将含有粘性末端的嵌合抗原受体编码片段和线性化的Plvx-EF1a-IRES-ZsGreen1载体进行连接和转化。
连接Plvx-EF1α-IRES-ZsGreen1，CLDN18.2/B7H3 CAR体系如下：
连接重组产物的转化步骤如下：
1)将50μL感受态细胞XL1-Blue在冰上解冻5-10min。
2)取2μL重组产物加入到50μL的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
3)42℃准确热应激45s，立即置于冰上2min。
4)加入500μL的无抗生素的LB培养基，室温摇菌1h(270rpm)。
5)将氨苄抗性的LB固体培养基事先在37℃的温箱中预热30min。
6)5000rpm离心3min，倒掉上清，用剩余约30μL的LB培养基重悬菌体，用无菌涂布棒在含有卡那抗性的平板上轻轻涂匀。
7)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
实施例2双靶CLDN18.2/B7H3 CAR的慢病毒包装
采用EndoFree Plasmid Mid质粒抽提试剂盒(omega公司)对实施例1得到重组菌挑取单菌落培养得到的菌液进行抽提获得双靶点CLDN-B7H3 CAR表达质粒。双靶点CLDN18.2/B7H3 CAR表达质粒和包装质粒pSPAX、pMD2.G质粒以4∶3∶1比例用磷酸钙法转染HEK293T细胞。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3,000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用100,000g，4℃，1.5h超速离心后浓缩病毒液。
实施例3T细胞的制备
取来自于东南大学中大医院血液科健康捐献者的新鲜人外周血20ml，采用Ficoll-Paque PLUS(GE HealthCare公司)分离PBMC(具体步骤按照说明书)。按细胞：磁珠1∶1比例加入抗CD3/CD28磁珠(GibCo公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。
实施例4慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养
从-80℃中取出实施例2制得的病毒液上清，室温下融化，病毒滴度为5.6*107，按照病毒感染复数MOI＝5计算加入68μL的病毒浓缩液，即所需病毒浓缩液体积＝1*106(需感染细胞数量)*5/5.6*107，并加入10mg/ml的polybrene至终浓度为10pg/ml。于30℃，2,000rpm，离心2小时，转入5％CO2-37℃孵箱培养得到双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞。
流式细胞术检测CLDN18.2/B7H3 CART细胞的阳性率：收集细胞，标记兔抗鼠IgG-F(ab’)2抗体，流式细胞术分析CLDN18.2/B7H3 CART细胞F(ab’)2和GFP的表达。结果如图2所示，由图2中可以看出，CLDN18.2/B7H3 CART细胞的阳性率为27.7％。
实施例5双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞对双靶阳性表达的肿瘤细胞的杀伤作用
SGC-7901细胞系购自美国ATCC，其表面高表达Claudin18.2，较高表达B7H3。将SGC-7901细胞按照每孔105个接种于48孔板中，分别按照效靶比1∶1接种CLDN18.2/B7H3CART细胞或T细胞，进行共培养。在共培养后40小时统计共培养期间SGC-7901细胞GFP荧光值动态变化。结果如图3所示，结果显示双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞与靶细胞过表达Claudin18.2和B7H3的SGC-7901细胞共培养40h后，靶细胞荧光值随着时间推移逐渐降低，表明靶细胞数越来越少，双靶点CLDN18.2/B7H3 CART能特异性杀伤靶细胞。而在普通T细胞组，SGC-7901细胞的荧光值随着时间推移越来越高，因为普通T细胞对靶细胞没有杀伤，SGC-7901细胞正常生长扩增，与普通T细胞相比，双靶点CLDN18.2/B7H3CART细胞对Claudin18.2和B7H3阳性的SGC-7901细胞具有显著的杀伤作用。
24h后取培养液上清，对共培养上清进行检测(具体操作步骤按照ELISA检测试剂盒说明书进行)，结果如图4所示。结果表明，表达Claudin18.2和B7H3的SGC-7901细胞与双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞共培养上清中IL-2、IFN-γ细胞因子水平均较普通T共培养组有显著性升高(P＜0.001)，显示双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞对表达双靶的靶细胞有显著杀伤作用，而对敲低Claudin18.2的SGC-7901靶细胞与T细胞的杀伤作用相当，对敲低B7H3的SGC-7901靶细胞表现出较低的杀伤活性，这些结果表明双靶点CLDN18.2/B7H3 CART特异性和杀伤功能均达到了预期目的。
将本发明设计的双靶点CLDN18.2/B7H3 CART细胞与第三代CAR-T细胞(即靶点CLDN18.2scFv-CD28-CD137-CD3ζ，序列如SEQ ID No.33所示)对相同剂量(105个)的靶细胞SGC-7901进行多次重复杀伤试验，结果如图5所示。结果表明本发明设计的双靶点CLDN18.2/B7H3 CART比第三代CAR-T具有更持久的杀伤能力。
实施例6
将实施例1中的序列SEQ ID No.32中的JAKAcS1分别替换JAKAcS2、JAKAcS3、JAKAcS4、JAKAcS5、JAKAcS6、JAKAcS7、JAKAcS8、JAKAcS9得到对应的核苷酸序列，然后将其合成并按照以上具体的步骤操作获得对应的重组菌株。按照实施例2-5的具体的实验方法，重复以上的实验过程，得到对应的双靶点CART细胞。对以上的双靶点CART细胞的阳性率进行检测，其阳性率均能达到20-40％，且具有持久的杀伤靶细胞能力。
实施例7双靶点Meso-B7H3 CAR(信号肽-第一靶点Meso scFv-CD8αhinge-CD8TM-CD3ζ-P2A-信号肽-第二靶点B7H3 scFv-CD8α hinge-CD8 TM-CD137-JAKAcS1)表达载体的构建
委托金斯瑞公司合成编码上述双靶点Meso-B7H3 CAR的核酸序列，序列为SEQ IDNo.34。
通过BamHI-MluI双酶切Plvx-EF1α-IRES-ZsGreen1，Meso-B7H3 CAR实现载体和片段线性化。酶切体系如下：
通过T4 DNA酶将含有粘性末端的嵌合抗原受体编码片段和线性化的Plvx-EF1α-IRES-ZsGreen1载体进行连接和转化。
连接Plvx-EF1α-IRES-ZsGreen1，Meso-B7H3 CAR体系如下：
连接重组产物的转化步骤如下：
1)将50μL感受态细胞XL1-Blue在冰上解冻5-10min。
2)取2μL重组产物加入到50μL的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
3)42℃准确热应激45s，立即置于冰上2min。
4)加入500μL的无抗生素的LB培养基，室温摇菌1h(270rpm)。
5)将氨苄抗性的LB固体培养基事先在37℃的温箱中预热30min。
6)5000rpm离心3min，倒掉上清，用剩余约30μL的LB培养基重悬菌体，用无菌涂布棒在含有卡那抗性的平板上轻轻涂匀。
7)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
实施例8双靶Meso-B7H3 CAR慢病毒包装
采用EndoFree Plasmid Mid质粒抽提试剂盒(omega公司)对实施例6得到的重组菌挑取单菌落进行培养得到的菌液进行抽提获得双靶点Meso-B7H3 CAR表达质粒，将双靶点Meso-B7H3 CAR表达质粒和包装质粒pSPAX、pMD2.G以4∶3∶1比例用磷酸钙法转染HEK293T细胞。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3,000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用100,000g，4℃，1.5h超速离心后浓缩病毒液。
实施例9T细胞的制备
取来自于东南大学中大医院血液科健康捐献者的新鲜人外周血20ml，采用Ficoll-Paque PLUS(GE HealthCare公司)分离PBMC(具体步骤按照说明书)。按细胞：磁珠1∶1比例加入抗CD3/CD28磁珠(GibCo公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。
实施例10慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养
从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，病毒滴度为6.3*107，按照病毒感染复数MOI＝5计算加入79μL的病毒浓缩液，即所需病毒浓缩液体积＝1*106(需感染细胞数量)*5/6.3*107，并加入10mg/ml的polybrene至终浓度为10pg/ml。于30℃，2,000rpm，离心2小时，转入5％CO2-37℃孵箱培养。
流式细胞术检测Meso-B7H3 CAR-T细胞的阳性率：收集细胞，标记兔抗鼠IgG-F(ab’)2抗体，流式细胞术分析T细胞F(ab’)2和GFP的表达。结果如图6所示，由图中可以看出，Meso-B7H3 CAR-T细胞的阳性率为40.4％。
实施例11双靶点Meso-B7H3 CAR-T细胞对双靶阳性表达的肿瘤细胞的杀伤作用
SKOV3细胞系购自美国ATCC，其表面较低表达Mesothelin，高表达B7H3。将SKOV3细胞按照每孔105个接种于48孔板中，分别按照效靶比1∶1接种Meso-B7H3 CAR-T细胞或T细胞，进行共培养。在共培养后40小时统计共培养期间SKOV3细胞GFP荧光值动态变化。结果如图8所示，结果显示双靶点Meso-B7H3 CAR-T与靶细胞过表达Mesothelin和B7H3的SKOV3细胞共培养40h后，靶细胞荧光值随之时间推移逐渐降低，表明靶细胞数越来越少，双靶点CAR-T能特异性杀伤靶细胞。而在普通T细胞组，SKOV3细胞的荧光值随之时间推移越来越高，因为普通T细胞对靶细胞没有杀伤，SKOV3细胞正常生长扩增，与普通T细胞相比，双靶点Meso-B7H3 CAR-T细胞对Mesothelin和B7H3阳性的SKOV3细胞具有显著的杀伤作用。
24h后取培养液上清，对共培养上清进行检测(具体操作步骤按ELISA检测试剂盒说明书进行)，结果如图9所示。结果表明，表达Mesothelin和B7H3的SKOV3细胞与双靶点Meso-B7H3 CAR-T共培养上清中IL-2、IFN-γ细胞因子水平均较普通T共培养组有显著性升高(P＜0.001)，显示双靶点Meso-B7H3 CAR-T细胞对表达双靶的靶细胞有显著杀伤作用，而对敲低Mesothelin的SKOV3靶细胞与T细胞的杀伤作用相当，对敲低B7H3的SKOV3靶细胞表现出较低的杀伤活性，这些结果表明双靶点Meso-B7H3 CAR-T特异性和杀伤功能均达到了预期目的。
将本发明双靶点Meso-B7H3 CAR-T细胞与第三代CAR-T细胞(即靶点MesoscFv-CD28-CD137-CD3ζ，序列如SEQ ID No.35所示)对相同剂量(10/^5个)的靶细胞SKOV3进行多次重复杀伤试验，结果如图10所示。结果表明本发明设计的双靶点Meso-B7H3CAR-T比第三代CAR-T具有更持久的杀伤能力。
将实施例7中的序列SEQ ID No.33中的JAKAcS1分别替换JAKAcS2、JAKAcS3、JAKAcS4、JAKAcS5、JAKAcS6、JAKAcS7、JAKAcS8、JAKAcS9、JAKAcS10得到对应的核苷酸序列，然后将其合成并按照以上具体的步骤操作获得对应的重组菌株。按照实施例8-11的具体的实验方法，重复以上的实验过程，得到对应的双靶点CART细胞。对以上的双靶点CART细胞的阳性率进行检测，其阳性率在20-40％，且具有持久的杀伤靶细胞能力。

Claims (10)

1.一种长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体包括两条独立跨膜蛋白组成的嵌合抗原受体，其中，第一条嵌合抗原受体包括第一信号肽、第一靶点肿瘤抗原的结合结构域、第一铰链结构域、第一跨膜结构域、第一胞内共刺激结构域和第一靶点CAR的胞内信号转导域；第二条嵌合抗原受体包括第二信号肽、第二靶点肿瘤抗原的结合结构域、第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二胞内共刺激结构域和JAK酶激活信号转导结构域，所述JAK酶激活信号转导结构域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1，所述JAK1的Gene ID为3716，所述第一条嵌合抗原受体与第二条嵌合抗原受体通过连接子连接，所述第一靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达的第一靶点的单链抗体scFv，所述第二靶点肿瘤抗原的结合结构域包含肿瘤细胞表面高表达的第二靶点的单链抗体scFv，所述第一靶点为Mesothelin，所述第二靶点为B7H3，所述JAK1酶激活信号转导结构域氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述连接子选择P2A、T2A、E2A、F2A、IRES中任意一个。
2.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一靶点CAR的胞内信号转导域包括以下分子的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD40L、CD45、CD66d、CD79、CD80、CD86、CD278、DAP10、DAP12、FcγR或Zap70，优选地，所述第一靶点CAR的胞内信号转导域为CD3ζ信号转导结构域或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列信号转导域，包含的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
3.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一信号肽和第二信号肽包括T细胞受体的α链或β链、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD33、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、GM-CSF、免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一铰链结构域和第二铰链结构域包括以下分子的铰链区：IgG、CD8α、CD28、IL-2受体，例如CD8α的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示。
5.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一跨膜结构域和第二跨膜结构域包括T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一胞内共刺激结构域和第二胞内共刺激结构域通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％，或同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD137、CDS、ICAM-1、LFA-1、CLAUDIN、CD278或GITR中的一种或几种。
7.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项中所述的双靶点嵌合抗原受体。
8.一种重组载体或包含其的重组病毒或重组细胞，其特征在于，所述载体包含权利要求7中所述的核酸分子。
9.一种应用，所述应用包括以下任一项：权利要求1-6中任意一项所述的双靶点嵌合抗原受体、权利要求7所述的核酸分子，权利要求8中重组载体或重组病毒、所述的重组细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述实体瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、食道癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、头颈部细胞癌、骨癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、甲状腺癌、宫颈癌、神经膀胱癌或前列腺癌。
CN202310659011.XA 2022-09-26 2022-09-26 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用 Pending CN117024598A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310659011.XA CN117024598A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310659011.XA CN117024598A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN202211179782.0A CN115925989A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211179782.0A Division CN115925989A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117024598A true CN117024598A (zh) 2023-11-10

Family

ID=86699526

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310659011.XA Pending CN117024598A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN202211179782.0A Pending CN115925989A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211179782.0A Pending CN115925989A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 长效的双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、重组载体、细胞及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN117024598A (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069856B (zh) * 2023-08-08 2024-03-26 北京翊博生物集团有限公司 双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增t细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115925989A (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210277114A1 (en) Car based immunotherapy
JP6970991B2 (ja) トランスポザーゼポリペプチド及びその使用
US20220170012A1 (en) Rna engineered t cells for the treatment of cancer
US20220281944A1 (en) Spycatcher and spytag: universal immune receptors for t cells
US10844117B2 (en) Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
CN111247168B (zh) 靶向多种抗原的复合嵌合抗原受体(cCAR)及其组成和使用方法
JP2019088330A (ja) 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
US20160235787A1 (en) Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells
US20170296623A1 (en) INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (iCAR OR N-CAR) EXPRESSING NON-T CELL TRANSDUCTION DOMAIN
CN109562126A (zh) 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
US20130071414A1 (en) Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
CN109306016B (zh) 共表达细胞因子il-7的nkg2d-car-t细胞及其用途
CN108064252A (zh) 嵌合抗原受体及其使用方法
JP2015509716A (ja) 第二世代キメラ抗原受容体におけるｃｄ２シグナル伝達ドメインの使用
KR20220029584A (ko) 바이러스 벡터 및 입양 세포 요법에서 그 사용
CN114746438A (zh) 通过靶向成纤维细胞激活蛋白(fap)使肿瘤组织破裂
CN117024598A (zh) 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN114686436A (zh) 一种靶向fshr和folr1双打靶点car t的制备及应用
CN115960256A (zh) 一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用
WO2023051735A1 (zh) 嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用
JP2022547552A (ja) 前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む組成物および方法
EP4357369A1 (en) Preparation and application of chimeric antigen receptor immune cell constructed on basis of granzyme b
CN115975056B (zh) 利用天然蛋白tsh作为抗原结合位点构建靶向tshr的car-t细胞
EP4356970A1 (en) Preparation and application of lox1-based chimeric antigen receptor immune cell
CN115991790A (zh) 一种增强肿瘤抗原作用的car及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination