CN109306016B - 共表达细胞因子il-7的nkg2d-car-t细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了共表达细胞因子IL‑7的NKG2D‑CAR‑T细胞及其在肿瘤杀伤方面的应用，具体地，本发明提供了特异靶向NKG2D配体蛋白的CAR及其CAR‑T细胞，所述嵌合抗原受体CAR包含抗原结合结构域和/或IL‑7。本发明的CAR‑T细胞具有良好的肿瘤杀伤效果。

Description

共表达细胞因子IL-7的NKG2D-CAR-T细胞及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及共表达细胞因子IL-7的NKG2D-CAR-T细胞及其在肿瘤杀伤方面的应用。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病，随着医学、科学的发展，目前已诞生了许多治疗肿瘤的方案，如手术切除治疗，化学药物治疗和放射治疗等，这些方法对于新发现的肿瘤病人具有良好的疗效，可显著缓解肿瘤病人的症状、延长病人生存期，而对于复发难治型肿瘤患者，以及发生肿瘤转移的患者，上述方法往往疗效甚微。近年来，一种新肿瘤免疫疗法疗法逐渐走入人们的视野，即嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR-T)。临床前和临床试验的一些深入研究显示CAR-T疗法在对多种癌症治疗中取得了令人鼓舞的治疗效果。然而，同CAR-T细胞免疫治疗恶性血液病取得显著的临床反应相比，用CAR-T细胞治疗实体瘤受到实体瘤组织结构，强大的免疫抑制环境所限制，理想靶标的缺失也是治疗实体瘤的另外一个关键不足。因此寻找更有效的靶点从而推进CAR-T细胞治疗实体瘤是现阶段的一大重要挑战。

因此，本领域迫切需要开发一类针对肿瘤特异性表达的靶标，且具有肿瘤良好杀伤效果的工程化的免疫细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一类针对肿瘤特异性表达的靶标，且具有肿瘤良好杀伤效果的工程化的免疫细胞。

本发明第一方面提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于NKG2D配体；

并且所述的嵌合抗原受体CAR还包括：任选的与所述胞内结构域连接并可共表达的IL-7元件。

在另一优选例中，所述NKG2D配体选自下组：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、或其组合。

在另一优选例中，所述NKG2D配体选自下组：MICA、MICB、或其组合。

在另一优选例中，所述NKG2D配体包括MICA。

在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：

Z1-T-H-TM-C-Z2-(Z3-P)m (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

Z1为无或信号肽序列；

T为NKG2D的胞外段或靶向NKG2D配体的抗体单链可变区序列；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

Z2为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

Z3为自剪切蛋白；

P为IL-7；

m为0、1、2、3、或4。

在另一优选例中，所述NKG2D的胞外段蛋白的氨基酸序列选自下组：

(a)如SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，编码所述NKG2D的胞外段蛋白的核苷酸序列选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有靶向或结合于NKG2D配体活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有靶向或结合于NKG2D配体活性的多核苷酸。

在另一优选例中，所述NKG2D的胞外段为人源。

在另一优选例中，所述的Z1为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述Z1为选自下组的蛋白的信号肽：CD8。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的绞链区：CD8。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1、LAG-3、或其组合。

在另一优选例中，所述TM包括CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、或其组合。

在另一优选例中，所述C包括4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括T2A。

在另一优选例中，所述IL-7包括野生型IL-7和突变型IL-7、或其活性片段。

在另一优选例中，所述IL-7具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID No.:4或7所示。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一优选例中，所述编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子如SEQ ID NO.：5或8所示。

本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的免疫细胞还表达外源IL－7蛋白。

在另一优选例中，所述的外源IL-7蛋白是独立表达的和/或与靶向NKG2D配体的CAR共表达的。

在另一优选例中，所述的与靶向NKG2D配体的CAR共表达包括IL-7蛋白与靶向NKG2D配体的CAR的串联表达。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为异体的。

在另一优选例中，所述的细胞是CAR－T细胞，所述CAR－T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体CAR。

本发明第五方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，其中所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述导入包括同时、先后、或依次导入。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有选择性杀伤肿瘤细胞的其他药物(如抗体药物、化疗药物或其他CAR-T药物)。

本发明第七方面提供了一种本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述的药物组合物的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括NKG2D配体阳性的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞来源于实体瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、卵巢癌、食管腺癌、前列腺癌、宫颈癌、多发性骨肉瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤包括前列腺癌。

本发明第八方面提供了一种用于选择性杀伤肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或使用说明书。

本发明第九方面提供了一种选择性杀伤肿瘤细胞的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第十方面提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括NKG2D配体阳性的肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、卵巢癌、食管腺癌、前列腺癌、宫颈癌、多发性骨肉瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤包括前列腺癌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示了制备CAR-T细胞所构建的载体结构图；

图2显示了CAR-T细胞中高水平的NKG2D以及IL-7，说明其有效表达；

图3显示了制备的CAR-T细胞纯度可达90％以上，可用于后续研究；

图4显示了两种CAR-T细胞杀伤前列腺癌细胞PC3的流式结果，表明两种CAR-T均可有效杀伤肿瘤，且IL-7组效果更强；

图5显示了两种CAR-T细胞有效杀伤前列腺癌细胞PC3的折线统计结果，表明两种CAR-T均可有效杀伤肿瘤，且IL-7组效果更强；

图6显示了通过eFlour-670来标记CAR-T细胞增殖，IL-7可有效促进CAR-T细胞的增殖；

图7显示了两种CAR-T细胞治疗前列腺癌的动物实验结果，表明两种CAR-T细胞均能有效杀伤肿瘤，延长小鼠的生存期，且IL-7组效果更强；

图8显示了共表达四种细胞因子的NKG2D-CAR-T细胞在效靶比4：1时对肿瘤细胞的杀伤效果比较，表明IL-7组杀伤效果强于其他细胞因子；

图9显示了四种细胞因子对NKG2D-CAR-T细胞增殖的影响，IL-15、IL-18对增殖没有影响，IL-7、IL-21能促进CAR-T细胞增殖，且IL-7效果更强。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现在T细胞或NK细胞中共表达CAR和IL-7，能够显著提高抗肿瘤(尤其是实体瘤)活性。本发明的嵌合抗原受体(CAR)可用于NKG2D配体阳性的肿瘤患者的治疗。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化的免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)；当免疫细胞为T细胞时，TCR等同于CAR(或CAR可替换为TCR)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人TX103抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

NKG2D配体

NKG2D的配体包括六个成员：MICA、MICB、ULBP1-6，其配体在正常细胞中不表达或者表达量很低，但当细胞受到感染或者发生癌变时，这些配体的表达量会大幅度上升，尤其是很多实体瘤，如乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌等等，因此将NKG2D受体设计入CAR结构中，当其与配体结合时，便会激活T细胞，产生一系列的抗肿瘤反应。

在本发明中，前列腺癌肿瘤细胞仅表达NKG2D的两个配体即MICA、MICB，因此NKG2D-CAR-T细胞对前列腺癌的杀伤作用主要通过识别此两种配体。同时本发明进一步检测了前列腺癌细胞PC3中两种配体的表达高低，发现MICA表达高于MICB，这表明MICA在NKG2D-CAR-T识别配体发挥杀伤作用时发挥主要作用。

NKG2D蛋白

NKG2D是NKG2家族的成员，为II型C-凝集素样受体，表达在所有的NK细胞，CD8+T细胞，大多数NKT细胞，部分病理条件下的CD4+T细胞中。NKG2D通过二硫键形成同源二聚体结合在细胞膜上，但其胞内段很短，不具备信号传递能力，需要与共刺激分子结合进行信号传递，因此NKG2D受体发挥功能区域主要是通过其胞外段。

本发明选取了NKG2D蛋白的胞外段与CD8蛋白的跨膜区、共刺激分子4-1BB、信号传递区CD3ζ等连接，从而使得NKG2D与配体结合后能更有效的激活T细胞，发挥细胞毒性作用。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD47和MSLN的抗体，较佳地为单链抗体。

在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR的胞外结构域包括NKG2D胞外段蛋白，优选具有特定序列的NKG2D胞外段蛋白。

在本发明中，本发明的CAR中的胞内结构域包括CD8的跨膜区、4-1BB的共刺激因子、CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列(含IL-7的CAR的氨基酸序列)如SEQ ID NO.:4所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSEGRGSLLTCGDVEENPGPMFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列(不含IL-7的CAR的氨基酸序列)如SEQ ID NO.:7所示：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的核苷酸序列(含IL-7的CAR的核苷酸序列)如SEQ ID NO.:5所示：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATA TAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACACTAA

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的核苷酸序列(不含IL-7的CAR的核苷酸序列)如SEQ ID NO.:8所示：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTAT ATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明所述的CAR-T细胞，本发明CAR-T细胞可靶向NKG2D配体蛋白，用来治疗NKG2D配体高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

在本发明中，本发明的CAR包含(i)胞外结构域，其包含NKG2D胞外段蛋白；(ii)跨膜域；(iii)共刺激因子；和(iv)CD3ζ的信号传导结构域；以及；(v)任选的自剪切蛋白；(vi)IL-7。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可靶向NKG2D配体蛋白，用于治疗NKG2D配体高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种本发明第一方面所述的CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/Kg体重，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/Kg体重。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物MUC1蛋白，协同激活T细胞，引起细胞免疫应答，从而显著提高其对来自恶性肿瘤的肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，MUC1的CAR-T细胞引起抗表达MUC1的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗NKG2D配体的NKG2D的胞外段蛋白、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域、任选的T2A、IL-7的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或i ii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的工程化免疫细胞可特异性的靶向NKG2D配体蛋白，从而选择性的杀伤肿瘤(尤其是实体瘤)。

(2)本发明首次发现，表达IL-7的CAR可更加特异性的杀伤肿瘤细胞，尤其是NKG2D配体高表达或阳性的肿瘤细胞

(3)本发明首次发现，在CAR修饰的T细胞或NK细胞内，随CAR一起表达外源的IL-7能够显著提高肿瘤抑制活性，并具有协同效果。

(4)本发明首次将CD8分子的信号肽与NKG2D胞外段结合，这种组合可有效提高NKG2D蛋白的表达，其表达效率≥90％，接近95％。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

实施例1NKG2D胞外段基因序列以及人的IL-7基因全长序列的获取

通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/查到NKG2D基因全长的CDS区，并且在https://www.uniprot.org/网站找到NKG2D蛋白的胞外段区域，在NKG2D全长基因序列中找到对应的胞外段基因序列。由于NKG2D蛋白为二型跨膜蛋白，因此其胞外段序列位于N端，且不包含信号肽，因此我们将现有的CD19-CAR中的信号肽序列加入NKG2D胞外段序列前端。用SnapGene软件设计并在公司合成引物(引物中包含细胞肽序列)，以人的T细胞cDNA为模板，通过RT－PCR的方式扩增NKG2D的胞外段，将RT-PCR产物测序得到Sig-NKG2D胞外段序列如下：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGATGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG(SEQ ID NO.:2)

胞外段的氨基酸序列如下：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTI IEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(SEQ ID NO.:1)

同样的方法在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/查到人的IL-7基因全长的CDS区，用SnapGene软件设计并在公司合成引物，以人的T细胞cDNA为模板，通过RT－PCR的方式扩增IL-7全长序列，将RT-PCR产物测序得到IL-7序列如下：

ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACAC(SEQID NO.:6)

IL-7的氨基酸序列如下：

MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH(SEQ ID NO.:3)

实施例2PCDH-NKG2D-CAR、PCDH-NKG2DIL7-CAR载体的构建

将得到的sigNKG2DEX序列与已经构建好的二代CAR序列(CD8-CD3zeta-4-1BB)(获自上海邦耀生物科技有限公司)通过重叠PCR的方式连接到一起。通过RT－PCR以及测序鉴定后确定构建成功，获得PCDH-NKG2D-CAR载体，在此载体基础上通过重叠PCR将IL-7基因序列构建在CAR和GFP之间，通过RT－PCR以及测序鉴定后确定构建成功，获得PCDH-NKG2DIL7-CAR载体，结构图如图1所示。

实施例3病毒包装

PCDH-NKG2D-CAR、PCDH-NKG2DIL7-CAR质粒的扩增与病毒包装

3.1质粒转染

将质粒，PEI，Opti-MEM培养基置于室温5min；

2)取Opti-MEM 436μl于1.5ml EP管中，再加入64μg PEI混匀，室温静置5min；

3)取12μg载体质粒PCDH-NKG2D-CAR和PCDH-NKG2DIL7-CAR，8μg psPA×2，4μgpMD2.G，加入Opti-MEM至500μl，室温静置5min；

4)将配好的PEI-Opti-MEM溶液加入含质粒的Opti-MEM中，室温静置20min；

5)将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入前一天铺好的293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。

3.2病毒收集和浓缩

1)质粒转染48h后，收集上清后，添加10ml新鲜培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；

2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；

3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；

4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；

5)将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。

3.3病毒滴度测定

1)消化293T细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为2×105/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液；

2)用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27；

3)分别将100μl病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；

4)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；

5)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；

6)计算滴度，滴度＝2*105*感染效率*稀释倍数。

结果如下：病毒收集浓缩后，经滴度检测，PCDH-NKG2D-CAR、PCDH-NKG2DIL7-CAR两种慢病毒的滴度分别为2.98*10⁸、1.26*10⁸。

实施例4CAR-T细胞制备

将从医院采取的人的外周血裂解红细胞后，通过磁珠分选获得CD4+、CD8+两种T细胞，用CD3、CD28抗体激活2天后，离心换液，将制备的两种慢病毒PCDH-NKG2D-CAR、PCDH-NKG2DIL7-CAR分别按照MOI＝20:1的比例加入到培养基中，16h后离心换液，加入新鲜的完全培养基继续培养，得到两种CAR-T细胞，分别命名为NKG2D-CAR-T和NKG2DIL7-CAR-T。

两种CAR-T细胞培养两天后，收集细胞，提取RNA,通过RT－PCR检测NKG2D及IL-7的表达，CAR-T细胞中两种RNA表达明显高于未转染组。用APC-hNKG2D抗体染色后流式检测CAR-T细胞阳性率，两种CAR-T细胞的阳性率分别为94.6％和95.3％，如图2、3所示：

实施例5靶细胞的选择及两种CAR-T杀伤功能研究

5.1通过查阅文献(Exploiting natural killer group 2D receptors for CART-cell therapy)，找到高表达NKG2D配体的前列腺癌细胞株PC3。

5.2靶细胞标记

制备前列腺癌细胞PC3

单细胞悬液1*10⁶/ml。加入2ml PBS离心洗涤两次，清洗掉血清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度为2*10⁶/ml。加入等体积的10μM eFluor 670试剂，涡旋细胞，37℃避光孵育10分钟；加入4-5倍体积预冷的10％血清的完全培养基，冰上孵育5分钟；完全培养基洗3次。将前列腺癌细胞株PC3标记eFluor670染料。

5.3靶细胞与效应细胞混合培养

将上述经eFluor 670染色后的PC3分别按照4*10⁴/孔的数量接种至超低吸附细胞培养48孔板中；

将NKG2D-CAR-T和NKG2DIL-7-CAR-T两种CAR-T细胞和未感染病毒的T细胞分别按照效靶比1:1、2:1、4:1接种至靶细胞PC3中，每组设两个重复，每孔补液至200ul；

将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养14h；14h后，收集每孔中所有细胞，将细胞转移至流式管中,流式细胞仪检测靶细胞比例变化。

5.4杀伤效率分析

如图4、5所示，与未转染组相比，NKG2D-CAR-T和NKG2DIL-7-CAR-T均具有很强的杀伤前列腺癌的效果，并且与NKG2D-CAR-T相比，NKG2DIL-7-CAR-T具有更强的杀伤效率，此实验表明，NKG2D可以很好的靶向前列腺癌细胞发挥功能，并且IL-7能够增强NKG2D-CAR-T的杀伤效率。

实施例6 IL-7促进NKG2D-CAR-T体外增殖功能研究

依照5.2的方法将未转染的T细胞以及NKG2D-CAR-T和NKG2DIL-7-CAR-T进行eFluor 670标记，用未添加任何外源细胞因子的培养基进行培养，于第四天进行流式检测，分析T细胞的增殖变化，如图6所示，与未转染组T细胞以及NKG2D-CAR-T细胞相比，NKG2DIL-7-CAR-T细胞的增殖明显增多，表明IL-7能够有效地促进NKG2D-CAR-T细胞的体外增殖。

实施例7 NKG2D-CAR-T及NKG2DIL-7-CAR-T体内抗肿瘤功能研究

选取同周龄的NSG免疫缺陷小鼠(购自南京模式动物中心)，将前列腺癌肿瘤细胞PC3皮下荷瘤于小鼠右侧背部，待肿瘤长大约200mm3时，将小鼠依据肿瘤大小分为三组：未治疗组、NKG2D-CAR-T治疗组、NKG2DIL-7-CAR-T治疗组，尾静脉注射相应的细胞进行治疗，每隔2天测量计算小鼠肿瘤的大小，记录肿瘤的生长变化，于第30天对小鼠实行安乐死，剥离肿瘤进行拍照称重，如图7所示，与体外实验结果一致，NKG2D-CAR-T和NKG2DIL-7-CAR-T均具有很强的杀伤前列腺癌的效果，并且与NKG2D-CAR-T相比，NKG2DIL-7-CAR-T具有更强的杀伤能力。

对比例

与IL-7同样方法，同时构建了IL-15、IL-18、IL-21与NKG2D CAR共表达的CAR-T细胞，比较了后三者细胞因子对NKG2D-CAR-T细胞杀伤以及其他功能的影响。

结果如图8和图9所示。结果显示，共表达细胞因子IL-7的NKG2D-CAR-T对前列腺癌细胞的杀伤效果显著高于共表达细胞因子IL-15、IL-18、IL21；三者在对CAR-T细胞增殖影响中，IL-15、IL-18并没有促进NKG2D-CAR-T细胞的杀伤，IL-21能够促进T细胞增殖，但促增殖效率低于IL-7，同时IL-15、IL-18、IL-21对记忆性T细胞的分化没有影响，而IL-7能够促进NKG2D-CAR-T细胞向Tcm细胞分化，从而能够迅速有效抵抗肿瘤细胞的侵袭。

结果表明，相较于IL-15、IL-18、IL-21，共表达IL-7后能够协同地和更有效地促进NKG2D-CAR-T细胞的增殖、杀伤以及记忆T细胞的分化等功能，从而更有效地杀灭肿瘤细胞以及抵抗肿瘤细胞的侵袭。

讨论

嵌合抗原受体(CAR)的修饰赋予T细胞具有肿瘤特异性细胞毒性，从而诱导抗肿瘤免疫。然而实体肿瘤的组织结构特性，特异性抗原的缺失和强的免疫抑制环境，使得用CAR-T细胞靶向实体肿瘤比治疗B细胞恶性肿瘤更具有挑战性。因此寻找合适的靶标，并且提高CAR-T细胞杀伤实体肿瘤的效率是治疗实体瘤的关键所在。本发明通过构建靶向实体肿瘤的NKG2D-CAR-T细胞，并且共表达能够提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的细胞因子IL-7，发现共表达IL-7后能够有效地提高NKG2D-CAR-T细胞的抗肿瘤能力，包括增殖能力增强，T细胞活化水平升高，分泌更高水平的IFN-γ，同时能够促进记忆性T细胞的分化，能够更有效的抵御肿瘤，这些研究为治疗实体瘤提供了新的方向和思路。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> 共表达细胞因子IL-7的NKG2D-CAR-T 细胞及其用途

<130> P2018-1278

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Met Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu

20 25 30

Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys

35 40 45

Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser

50 55 60

Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met

85 90 95

Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly

100 105 110

Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly

115 120 125

Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

145 150 155

<210> 2

<211> 471

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120

cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180

tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240

aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300

attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360

acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420

atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt g 471

<210> 3

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 4

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Met Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu

20 25 30

Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys

35 40 45

Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser

50 55 60

Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met

85 90 95

Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly

100 105 110

Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly

115 120 125

Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr

145 150 155 160

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

165 170 175

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

180 185 190

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

195 200 205

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

210 215 220

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

225 230 235 240

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

245 250 255

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

260 265 270

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu

275 280 285

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

290 295 300

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

305 310 315 320

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

325 330 335

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

340 345 350

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

355 360 365

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Glu Gly

370 375 380

Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

385 390 395 400

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

405 410 415

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

420 425 430

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

435 440 445

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

450 455 460

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

465 470 475 480

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

485 490 495

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

500 505 510

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

515 520 525

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

530 535 540

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

545 550 555 560

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

565 570 575

His

<210> 5

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

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ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120

cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180

tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240

aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300

attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360

acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420

atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt gaccacgacg 480

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cacagcccct gtccctgcgc 540

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 600

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 660

gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 720

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 780

gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 840

tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 900

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 960

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1020

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1080

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1140

ggatccgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 1200

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 1260

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 1320

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 1380

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 1440

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 1500

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<210> 6

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

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gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca c 531

<210> 7

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

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1 5 10 15

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Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys

35 40 45

Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser

50 55 60

Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met

85 90 95

Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly

100 105 110

Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly

115 120 125

Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys

130 135 140

Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr

145 150 155 160

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

165 170 175

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

180 185 190

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

195 200 205

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

210 215 220

Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

225 230 235 240

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

245 250 255

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

260 265 270

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu

275 280 285

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

290 295 300

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

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325 330 335

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340 345 350

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

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Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 8

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgatgttat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttactg tggcccatgt 120

cctaaaaact ggatatgtta caaaaataac tgctaccaat tttttgatga gagtaaaaac 180

tggtatgaga gccaggcttc ttgtatgtct caaaatgcca gccttctgaa agtatacagc 240

aaagaggacc aggatttact taaactggtg aagtcatatc attggatggg actagtacac 300

attccaacaa atggatcttg gcagtgggaa gatggctcca ttctctcacc caacctacta 360

acaataattg aaatgcagaa gggagactgt gcactctatg cctcgagctt taaaggctat 420

atagaaaact gttcaactcc aaatacatac atctgcatgc aaaggactgt gaccacgacg 480

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cacagcccct gtccctgcgc 540

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 600

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 660

gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 720

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 780

gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 840

tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 900

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 960

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1020

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1080

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1140

Claims (14)

1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体CAR包括：抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合于NKG2D配体；

并且所述的嵌合抗原受体CAR还包括：与所述胞内结构域连接并可共表达的IL-7元件；

所述CAR的结构如下式I所示：

Z1-T-H-TM-C-Z2-(Z3-P)m (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

Z1为无或信号肽序列；

T为NKG2D的胞外段，所述NKG2D的胞外段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

Z2为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

Z3为自剪切蛋白；

P为IL-7；

m为1、2、3、或4。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述IL-7的氨基酸序列如SEQID NO.:3所示。

3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列如SEQ IDNo.: 4所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子如SEQ ID NO.：5所示。

6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求4所述的核酸分子。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括工程化的免疫细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的免疫细胞还表达外源IL－7蛋白。

10.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，所述的工程化免疫细胞表达权利要求1所述的CAR，其中所述方法包括步骤：将权利要求4所述的核酸分子或权利要求6所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

12.一种权利要求1所述的 CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求11所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤细胞的药物或制剂。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞包括NKG2D配体阳性的肿瘤细胞。

14.一种用于选择性杀伤肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的权利要求1所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞。

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