CN111154727A - 一种精准杀伤肿瘤的car-t细胞的制备及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精准杀伤肿瘤的CAR‑T细胞的制备及其用途。具体地，本发明提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如CXCL12或MUC1高表达的肿瘤细胞，并且本发明的CAR‑T细胞对其杀伤效果很显著。

Description

一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T，CAR-T)细胞疗法是当前肿瘤免疫细胞治疗的研究热点及重点。它将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤机制有机结合，使CAR-T能特异性地识别肿瘤细胞，还能不依赖MHC的限制性而直接杀伤肿瘤细胞。有研究表明，它在血液系统肿瘤治疗已经取得重要进展，并且正在逐渐延伸到实体瘤的临床治疗中，有望攻克实体瘤治疗的难关。嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一种融合分子，由胞外抗原结合区，跨膜区及与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的胞内信号区构成。其中胞外抗原结合区是赋予CAR-T细胞识别特定肿瘤抗原的关键部分，它源于抗体的抗原结合基序，具备连接VH和VL序列构建单链可变区(single chain fragment variable，ScFv)的作用。这决定了重组CARs与抗原的结合可以不依靠MHC的递呈，这可以避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；跨膜区连接胞外抗原结合区和胞内信号区，一般由二聚体膜蛋白组成，主要包括CD3ζ、CD4、CD8、CD28等，能将CARs结构锚定于T细胞膜上。胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(immune-receptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM)，CARs接受肿瘤相关抗原(tumor-associated angtige，TAA)信息后，不直接传递信号，而是通过CD3或高亲和性受体Fc RI的胞内区使T细胞活化，活化后的T细胞分泌孔蛋白、颗粒酶及细胞因子协同作用杀死肿瘤细胞，发挥效应功能。免疫细胞治疗技术中的CAR-T疗法近年来发展非常迅速，通过基因改造的技术给T细胞加入嵌合抗体后，其靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的T细胞有所提高。CAR-T技术不仅可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，还可以每次只靶向一种类型的肿瘤抗原，为肿瘤治疗带来了新的希望。

前列腺癌(prostate cancer，PC)是危害人类健康的恶性肿瘤之一，前列腺癌是全球第二大常见癌症，也是全球男性癌症死亡的第五大原因。每年诊断出一百万个新PC病例，死亡率有逐年升高趋势，目前排男性恶性肿瘤发病率的第6位。前列腺癌是一种好发于中老年男性的上皮性恶性肿瘤，由于该病早期缺乏典型症状，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机，前列腺癌的早期诊断困难，病程发展快，转移发生早，预后极差。因此，近年来新兴的CAR-T疗法成为前列腺癌治疗的新希望。

然而，CAR-T疗法固然有效，但也存在不少亟待解决的问题，其中一大挑战就是CAR-T细胞向肿瘤组织中的归巢问题。

因此，本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞靶向归巢、精准杀伤肿瘤的治疗目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞靶向归巢、精准杀伤肿瘤的治疗目的。

本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为T细胞。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR含有靶向MUC1的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。

在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，所述“-”为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向MUC1的抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述靶向MUC1的抗原结合结构域包括Siglec-9的胞外段或靶向MUC1的抗体单链可变区序列。

在另一优选例中，所述Siglec-9的胞外段的氨基酸序列选自下组：

(a)如SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，编码所述Siglec-9的胞外段的核苷酸序列选自下组：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有靶向或结合于MUC1活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有靶向或结合于MUC1活性的多核苷酸。

在另一优选例中，所述Siglec-9的胞外段为人源。

在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8a、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述L为CD8a来源的信号肽。

在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8a、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述H为CD8a来源的铰链区。

在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3 epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1、LAG-3、或其组合。

在另一优选例中，所述TM为CD8a来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、DAP10、CDS、ICAM-1、或其组合。

在另一优选例中，所述C为4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述CXCR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述靶向MUC1的CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达CXCR4的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。

在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的免疫细胞已经表达所述CAR时，则步骤(B1)可以省略。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。

在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列。

在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码CXCR4的核酸序列。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第三方面提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述制剂还含有治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、其他CAR-T药物或化疗药物)。

本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述药物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：

(a)增强所述免疫细胞向肿瘤细胞的迁移作用；

(b)促进所述免疫细胞的归巢。

在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达CXCL12的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达MUC1的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。

本发明第五方面提供了一种用于制备用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR的第一表达盒；和

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达CXCR4的第二表达盒。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。

本发明第六方面提供了一种选择性杀伤肿瘤的方法，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明第七方面提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述方法还包括给需要治疗的对象施用治疗癌症或肿瘤的其他药物。

在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达CXCL12的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达MUC1的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。

本发明第八方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。

在另一优选例中，所述CAR和所述CXCR4通过连接肽连接。

在另一优选例中，所述连接肽包括自剪切蛋白。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括T2A。

在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式III所示：

L-S-H-TM-C-CD3ζ-(Z3-P)m (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向MUC1的抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

Z3为连接肽；

P为CXCR4；

m为1、2、3、或4。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

本发明第九方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第八方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:5所示融合蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:6所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；

(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

本发明第十方面提供了一种载体，所述载体包括本发明第九方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第九方面所述的多核苷酸的载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达本发明第八方面所述的融合蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pCDH-Siglec-9-CAR2-IRES-zsGREEN、pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4-IRES-zsGREEN载体示意图。

图2显示了pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4-IRES-zsGREEN质粒图谱。

图3显示了质粒pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4酶切鉴定结果

1：DNA Ladder；2：pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4质粒/Not I+Xba I；3：pCDH-Siglec-9质粒/Not I+Xba I。

图4显示了流式细胞术测定慢病毒感染T细胞效率。

图5显示了不同效靶比下T细胞、Siglec-9-CAR-T细胞和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对PC3杀伤作用的流式结果折线图。

图6显示了CXCR4对Siglec-9-CAR-T细胞迁移能力影响的检测。

图7显示了Transwell下室中T细胞、Siglec-9-CAR-T细胞和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞数。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现含有靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4的工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如CXCL12或MUC1高表达的肿瘤细胞，并且表达量越高，CXCR4工程化的CAR-T细胞(即本发明的工程化的免疫细胞)对其杀伤效果越显著。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CAR及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

MUC1

粘蛋白(mucins，简称MUC)及其相关糖抗原是近年来非常受重视的肿瘤相关抗原。粘蛋白家族为一类高分子量糖蛋白，低量存在于人的胰腺、卵巢等上皮细胞的腺腔或管腔面，其不会被免疫系统所识别，属于一种隐蔽抗原。MUC1是粘蛋白家族最典型的代表，属于跨膜型粘蛋白，在细胞表面呈顶端表达(apical expression)，极性分布。

本发明的研究发现，广泛高表达于前列腺癌、肝癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞中的MUC1是一种大分子跨膜糖蛋白，其胞外段是MUC1蛋白糖基化修饰位点，主要由20个氨基酸(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)的核心重复序列所组成，不同于正常组织细胞，肿瘤细胞表面MUC1具有不同的糖基化结构，在发生癌变的细胞中，其MUC1的表达量会异常增加，且与病变程度呈现正相关，这使MUC1成为免疫治疗较为理想的靶点。

CXCL12/CXCR4趋化因子轴

趋化因子受体CXCL12又称为基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，其具有三种剪接变体：SDF-1α，SDF-1β和SDF-1γ。SDF-1在脑，肺，肝，乳腺和淋巴结的基质成纤维细胞上表达。它会促进许多类型癌细胞的存活，增殖和转移。

CXCR4是一个七跨膜结构域G蛋白偶联受体，是内皮细胞上最普遍的趋化因子受体。CXCR4会促进肿瘤细胞如乳腺癌，非小细胞肺癌和神经母细胞瘤向高表达SDF-1的器官的迁移。SDF-1表达影响前列腺癌细胞的侵袭性，粘附性和迁移性。

在一优选实施方式中，CXCR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS(SEQ ID NO.:4)

Siglec-9的胞外段

Siglec-9是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding Ig-likelectins，Siglecs)家族的成员，属于一次跨膜蛋白。

本发明意外发现，本发明特定的Siglec-9的胞外段蛋白可以与MUC1特异性结合。

此外，本发明还首次发现，Siglec-9本身为高表达与中性粒细胞和单核细胞表面的T细胞和NK细胞功能的抑制性受体，与MUC-1的结合可能介导抗肿瘤免疫应答的抑制。因此，Siglec-9-CAR-T细胞的输入可以减少这些细胞表面的siglec-9与MUC-1的结合，减少免疫抑制，从而促进免疫杀伤作用。而且，Siglec-9-CAR与MUC1特异性结合可以激活CAR-T细胞从而可以特异性杀伤肿瘤细胞。由于Siglec-9胞外段可以与高表达MUC1蛋白的前列腺癌细胞PC-3发生特异性结合，因此以Siglec-9为靶向的CAR-T细胞可以杀伤表面高表达MUC1蛋白的前列腺癌细胞。

在本发明的一优选实施方式中，本发明的Siglec-9的胞外段蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

编码本发明的Siglec-9的胞外段蛋白的核苷酸序列(AY358913.1)如SEQ ID NO.:2所示。

ATGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTCTGGGGGAGGGAGAGGGCGGAAGGACAGACAAGTAAACTGCTGACGATGCAGAGTTCCGTGACGGTGCAGGAAGGCCTGTGTGTCCATGTGCCCTGCTCCTTCTCCTACCCCTCGCATGGCTGGATTTACCCTGGCCCAGTAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGAAGGGGCCAATACAGACCAGGATGCTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGCTCGGGCAGTGTGGGAGGAGACTCGGGACCGATTCCACCTCCTTGGGGACCCACATACCAAGAATTGCACCCTGAGCATCAGAGATGCCAGAAGAAGTGATGCGGGGAGATACTTCTTTCGTATGGAGAAAGGAAGTATAAAATGGAATTATAAACATCACCGGCTCTCTGTGAATGTGACAGCCTTGACCCACAGGCCCAACATCCTCATCCCAGGCACCCTGGAGTCCGGCTGCCCCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTGAGCAGGGGACACCCCCTATGATCTCCTGGATAGGGACCTCCGTGTCCCCCCTGGACCCCTCCACCACCCGCTCCTCGGTGCTCACCCTCATCCCACAGCCCCAGGACCATGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTCCCTGGGGCCAGCGTGACCACGAACAAGACCGTCCATCTCAACGTGTCCTACCCGCCTCAGAACTTGACCATGACTGTCTTCCAAGGAGACGGCACAGTATCCACAGTCTTGGGAAATGGCTCATCTCTGTCACTCCCAGAGGGCCAGTCTCTGCGCCTGGTCTGTGCAGTTGATGCAGTTGACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCCTGAGCTGGAGAGGCCTGACCCTGTGCCCCTCACAGCCCTCAAACCCGGGGGTGCTGGAGCTGCCTTGGGTGCACCTGAGGGATGCAGCTGAATTCACCTGCAGAGCTCAGAACCCTCTCGGCTCTCAGCAGGTCTACCTGAACGTCTCCCTGCAGAGCAAAGCCACATCAGGAGTGACTCAGGGG(SEQ ID NO.:2)

抗原结合结构域

在本发明中，嵌合抗原受体CAR的抗原结合结构域特异性结合于MUC1。

铰链区和跨膜区

对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的CAR中的铰链区为CD8a的铰链区，本发明的跨膜区为CD8a的跨膜区。

胞内结构域

本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。

在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。优选地，包括4-1BB(CD137)等。

本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域(共刺激分子)以及CD3ζ的信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达NKG2D配体的抗体，较佳地为单链抗体。

在一优选实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分靶向MUC1。在一优选实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分是靶向MUC1的Siglec-9的胞外段蛋白。

在一优选实施方式中，Siglec-9的胞外段蛋白包含变体形式，所述变体与其野生型的Siglec-9的胞外段蛋白序列表具有≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同源性。

在本发明中，本发明的Siglec-9的胞外段蛋白还包括其保守性变异体，指与本发Siglec-9的胞外段蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR的胞外结构域包括Siglec-9的胞外段蛋白，优选具有特定序列的Siglec-9的胞外段蛋白。

在本发明中，本发明的CAR中的胞内结构域包括CD8a的跨膜区、4-1BB的共刺激因子、CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示：MLLLLLPLLWGRERAEGQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。MLLLLLPLLWGRERAEGQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSEGRGSLLTCGDVEENPGPMEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的核苷酸序列SEQ ID NO.:6所示。

ATGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTCTGGGGGAGGGAGAGGGCGGAAGGACAGACAAGTAAACTGCTGACGATGCAGAGTTCCGTGACGGTGCAGGAAGGCCTGTGTGTCCATGTGCCCTGCTCCTTCTCCTACCCCTCGCATGGCTGGATTTACCCTGGCCCAGTAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGAAGGGGCCAATACAGACCAGGATGCTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGCTCGGGCAGTGTGGGAGGAGACTCGGGACCGATTCCACCTCCTTGGGGACCCACATACCAAGAATTGCACCCTGAGCATCAGAGATGCCAGAAGAAGTGATGCGGGGAGATACTTCTTTCGTATGGAGAAAGGAAGTATAAAATGGAATTATAAACATCACCGGCTCTCTGTGAATGTGACAGCCTTGACCCACAGGCCCAACATCCTCATCCCAGGCACCCTGGAGTCCGGCTGCCCCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTGAGCAGGGGACACCCCCTATGATCTCCTGGATAGGGACCTCCGTGTCCCCCCTGGACCCCTCCACCACCCGCTCCTCGGTGCTCACCCTCATCCCACAGCCCCAGGACCATGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTCCCTGGGGCCAGCGTGACCACGAACAAGACCGTCCATCTCAACGTGTCCTACCCGCCTCAGAACTTGACCATGACTGTCTTCCAAGGAGACGGCACAGTATCCACAGTCTTGGGAAATGGCTCATCTCTGTCACTCCCAGAGGGCCAGTCTCTGCGCCTGGTCTGTGCAGTTGATGCAGTTGACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCCTGAGCTGGAGAGGCCTGACCCTGTGCCCCTCACAGCCCTCAAACCCGGGGGTGCTGGAGCTGCCTTGGGTGCACCTGAGGGATGCAGCTGAATTCACCTGCAGAGCTCAGAACCCTCTCGGCTCTCAGCAGGTCTACCTGAACGTCTCCCTGCAGAGCAAAGCCACATCAGGAGTGACTCAGGGGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGAGGGGATCAGTATATACACTTCAGATAACTACACCGAGGAAATGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGGAACCCTGTTTCCGTGAAGAAAATGCTAATTTCAATAAAATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCAATGGATTGGTCATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAACTGAGAAGCATGACGGACAAGTACAGGCTGCACCTGTCAGTGGCCGACCTCCTCTTTGTCATCACGCTTCCCTTCTGGGCAGTTGATGCCGTGGCAAACTGGTACTTTGGGAACTTCCTATGCAAGGCAGTCCATGTCATCTACACAGTCAACCTCTACAGCAGTGTCCTCATCCTGGCCTTCATCAGTCTGGACCGCTACCTGGCCATCGTCCACGCCACCAACAGTCAGAGGCCAAGGAAGCTGTTGGCTGAAAAGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGATCCCTGCCCTCCTGCTGACTATTCCCGACTTCATCTTTGCCAACGTCAGTGAGGCAGATGACAGATATATCTGTGACCGCTTCTACCCCAATGACTTGTGGGTGGTTGTGTTCCAGTTTCAGCACATCATGGTTGGCCTTATCCTGCCTGGTATTGTCATCCTGTCCTGCTATTGCATTATCATCTCCAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACCACAGTCATCCTCATCCTGGCTTTCTTCGCCTGTTGGCTGCCTTACTACATTGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTCCTGGAAATCATCAAGCAAGGGTGTGAGTTTGAGAACACTGTGCACAAGTGGATTTCCATCACCGAGGCCCTAGCTTTCTTCCACTGTTGTCTGAACCCCATCCTCTATGCTTTCCTTGGAGCCAAATTTAAAACCTCTGCCCAGCACGCACTCACCTCTGTGAGCAGAGGGTCCAGCCTCAAGATCCTCTCCAAAGGAAAGCGAGGTGGACATTCATCTGTTTCCACTGAGTCTGAGTCTTCAAGTTTTCACTCCAGCTAA

其中，在SEQ ID NO.:5中第1－17位为信号肽；第1－348位为Siglec-9的胞外段蛋白；第349－393位为铰链区；第394－417位为跨膜区(如CD8a的跨膜区)；第418－459位为共刺激元件(如4-1BB)；第460－571位为CD3ζ，第572－591位是连接肽(如自剪切蛋白)，第592－943位为CXCR4。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明所述的CAR-T细胞，本发明CAR-T细胞可靶向肿瘤表面抗原(如MUC1)，用来治疗CXCL12或MUC1高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

在本发明中，本发明的CAR包含(i)胞外结构域，其包含靶向肿瘤细胞表面抗原的抗原；(ii)跨膜域；(iii)共刺激因子；和(iv)CD3ζ的信号传导结构域；以及；(v)连接肽(如自剪切蛋白)；(vi)CXCR4。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可靶向肿瘤表面抗原(如MUC1)，用于治疗CXCL12或MUC1高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/Kg体重，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/Kg体重。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物(比如MUC1)蛋白，协同激活T细胞，引起细胞免疫应答，从而选择性杀伤肿瘤细胞，比如CXCL12或MUC1高表达的肿瘤细胞。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，肿瘤细胞的标志物(比如MUC1)的CAR-T细胞引起抗表达肿瘤细胞的标志物(比如MUC1)的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括靶向肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域、T2A、CXCR4的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括前列腺癌、肝癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，本发明的CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

融合蛋白

如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第八方面所述的结构。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:5所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:5所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:5所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次发现含有靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4的工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如CXCL12或MUC1高表达的肿瘤细胞，并且表达量越高，本发明的CAR-T细胞对其杀伤效果越显著。

2.本发明首次发现，本发明的工程化的免疫细胞还可以(a)增强所述免疫细胞向肿瘤细胞的迁移作用；和/或(b)促进所述免疫细胞的归巢。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

材料与方法

1实验材料

1.1主要试剂

1.2主要试剂调配

LB液体培养基成分表

固体培养基成分表

1×PBS缓冲液成分表

50×TAE缓冲液表

1.3主要仪器

1.4主要耗材

2实验方法

2.1CXCR4胞外段基因序列的获取

从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得Siglec-9(AY358913.1)和CXCR4(NM_003467.3)基因全长的CDS区，并且从https://www.uniprot.org/网站获得Siglec-9胞外段基因序列和CXCR4全长基因序列。

2.2pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4-IRES-zsGREEN慢病毒表达载体的构建

用SnapGene Viewer软件设计引物并将其交于公司合成该引物，以实验室保存的含pCDH-Siglec-9的质粒和CXCR4基因序列的cDNA为模板，PCR扩增得到CXCR4全长基因。因为前列腺癌细胞高表达趋化因子CXCL12，与之唯一匹配的趋化因子受体是CXCR4，且现有的Siglec-9-CAR-T对前列腺癌细胞杀伤效果显著，。利用快切酶BamH1对已经构建好的pCDH-Siglec-9-CAR2-IRES-zsGREEN质粒(以下简称pCDH-Siglec-9)进行酶切，再用T4 DNALigase连接CXCR4片段和酶切后的pCDH-Siglec-9片段。通过菌落PCR以及测序鉴定后确定构建成功，获得pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4-IRES-zsGREEN重组质粒(图1)。

2.3病毒包装

通过三质粒转染系统将目的质粒送入293T细胞内，按照质量比辅助质粒PS:辅助质粒PM:目的质粒＝5:3:3比例添加进入Opti-MEM培养基，加入50μLPEI溶液，反复吹打20次吹打混匀后，室温静置20min。将1mLDNA/PEI混合物慢慢滴入前一天铺好的293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h后更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。质粒转染48h后，收集上清后，添加10mL新鲜Opti-MEM培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤得到的上清；将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000rpm离心2h，用1/100上清体积的PBS进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μL病毒进行滴度测定。消化293T细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为2×10⁵/mL，向24孔培养板的每孔中加入0.5mL细胞悬液；用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27分别将100μL病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；16h后弃去感染上清，添加0.5mL新鲜全培养基；48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达。

2.4CAR-T细胞制备

将制备的两种慢病毒pCDH-Siglec-9-CAR、pCDH-Siglec-9-CXCR4-CAR分别按照MOI＝10:1的比例加入到含有人源T细胞的培养基中，16h后离心换液，加入新鲜的完全培养基继续培养，得到两种CAR-T细胞，分别命名为Siglec-9-CAR-T和Siglec-9-CXCR4-CAR-T。两种CAR-T细胞培养两天后，收集CAR-T细胞，通过流式检测CAR-T细胞阳性率。

2.5两种CAR-T杀伤功能研究

制备前列腺癌细胞株PC3的单细胞悬液1×10⁶个/ml。加入7～8mL PBS离心洗涤两次，清洗掉血清。用1mL PBS重悬细胞。该1mL细胞悬液中加入1μL羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)试剂，轻轻吹打，37℃避光孵育15min；加入4-5mL 10％血清的DMEM完全培养基后离心；用7～8mL PBS洗一次后离心；去上清，再加入1mL新鲜的x-vivo完全培养基重悬计数。

将已调整过阳性率的CAR-T细胞以1200rpm离心3min；再加入1mL新鲜的x-vivo培养基重悬计数。在96孔低吸附板中加入每孔3×10⁴个靶细胞，并按照1:1、3:1、9:1的效靶比添加相应个数的CAR-T细胞，并用x-vivo培养基补齐液面至200μl。将其吹打均匀后放入37℃、5％CO₂培养箱中培养14h。

杀伤检测前将孔内细胞转移至EP管内3000rpm离心3min；弃上清后在沉淀中加入100μL 1×Annexin V Binding Buffer(BD Pharmingen^TM)重悬；再样品中加入0.3μL APCAnnexin V抗体避光孵育15min后进行流式检测。

流式细胞仪上选择FL1-FITC通道进行CFSE的检测，圈出所有CFSE阳性的细胞群；CFSE阳性圈出后，选择FL1-APC通道进行Anexin-Ⅴ染色检测，Anexin-Ⅴ染色阳性的细胞即为凋亡靶细胞。根据流式结果，计算Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T两组别对前列腺癌细胞PC3的杀伤效率。

2.6CXCR4对靶细胞迁移能力影响的检测

消化靶细胞PC-3后重悬计数，调整细胞个数，使24孔板中孔内有5×10⁵个靶细胞。放置于37℃5％细胞培养箱内培养24h后取上清3000rpm，离心5min，将其转移至新的24孔板中，并放入0.3μm Transwell小室，向上室分别加入5×10⁵个T细胞或CAR-T细胞，培养24h。

第二天取下室液体计数；将Transwell上室取出后加入500μL细胞组织固定液固定10min；再加入500μL 0.15％结晶紫染液进行染色30min；之后加入500μL PBS洗去染液沉淀。放置于显微镜下进行观察并拍照。

3.结果与分析

3.1pCDH-Siglec-9-CXCR4质粒载体鉴定

根据质粒图谱(图2)，选择NotI和XbalI两个酶切位点对pCDH-Siglec-9-CAR2-CXCR4-IRES-zsGREEN质粒进行酶切，若CXCR4成功连接，则切出条带大小应为2893bp，若CXCR4未成功连接，则所得条带大小应为1877bp。根据电泳结果图(图3)可以得出，实验组条带大小约为2893bp，而对照组条带大小约为1877bp，证明质粒连接成功，最终确认得到目的载体。

3.2Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞的制备及细胞阳性率测定

将Siglec-9和CXCR4-Siglec-9两种慢病毒感染T细胞(MOI＝10)，感染时细胞密度为1×10⁶个/mL。48h后，流式细胞术测定感染T细胞阳性率(图4)，Siglec-9-CAR-T细胞与CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞的阳性率可达70％左右。根据所获得结果调整两种CAR-T细胞的阳性率至一致。

3.3Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞的杀伤效果

以PC-3自体凋亡以及T细胞为对照，用流式细胞仪检测Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞在1:1、3:1、9:1的效靶比下对前列腺癌细胞株PC-3的杀伤效果，结果如图5所示。从图中可以看出，在三个效靶比下，Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对MUC1阳性的PC3细胞的均具有明显的杀伤效果，且随着效靶比的增加杀伤效果更明显。但Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对PC3细胞杀伤能力并无显著差异，这表明共表达CXCR4基因并不会影响Siglec-9-CAR-T细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用。

3.4CXCR4过表达对Siglec-9-CAR-T迁移能力的影响

以T细胞为对照，用Transwell小室迁移实验检测Siglec-9-CAR-T和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对前列腺癌细胞的迁移能力的影响，培养24h后取Transwell上室染色后在显微镜下观察，由结果图6可知，CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对于PC-3上清液的迁移能力显著高于T细胞组和Siglec-9-CAR-T细胞组。取下室液进行细胞计数，根据结果图7可知，过表达趋化因子受体CXCR4的CAR-T细胞受到趋化因子肿瘤细胞PC3分泌的CXCL12的趋化作用而进入下室，且细胞数显著高于T细胞组和Siglec-9-CAR-T细胞组，表明过表达CXCR4可以使CAR-T细胞定向迁移到高表达CXCL12的前列腺癌细胞处，起到精准定位作用。

讨论

1实验小结

本发明的实验结果表明，在同一效靶的情况下，Siglec-9-CAR-T细胞和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对MUC1阳性的PC3细胞杀伤效果均明显高于T细胞，说明过表达CXCR4并不影响Siglec-9-CAR-T细胞的杀伤作用。同时，本发明检测到过表达CXCR4可以增强Siglec-9-CAR-T向肿瘤细胞的迁移作用，证明在不同效靶比下，Siglec-9-CAR-T细胞和CXCR4-Siglec-9-CAR-T细胞对MUC1阳性的PC3细胞均具有一定的杀伤效果，表明过表达CXCR4并不影响Siglec-9-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。

本发明还检测了过表达CXCR4对Siglec-9-CAR-T细胞迁移能力的影响，证明过表达CXCR4的Siglec-9-CAR-T细胞相较Siglec-9-CAR-T细胞和T细胞对PC-3有更好的趋化作用。因此，CXCR4基因过表达可以增强CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移。

本发明从CAR-T疗法存在的问题——CAR-T细胞的归巢(homing)问题入手，通过在CAR-T细胞表面过表达趋化因子受体CXCR4，帮助CAR-T细胞迁移至前列腺癌细胞部位，从而发挥杀伤作用。

CAR-T细胞归巢，即CAR-T细胞准确定位到肿瘤细胞，是发挥其抗肿瘤功能的先决条件，只有从外周血迁移至肿瘤部位的CAR-T细胞才有机会杀伤肿瘤。本发明是在检测到前列腺癌细胞PC3可以高表达CXCL12的基础上，通过在CAR-T细胞上过表达趋化因子受体CXCR4从而促使其归巢的一个重要突破。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> 一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途

<130> P2019-2331

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu

1 5 10 15

Gly Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu

50 55 60

Gly Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala

65 70 75 80

Arg Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp

85 90 95

Pro His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser

100 105 110

Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp

115 120 125

Asn Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His

130 135 140

Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln

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Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro

165 170 175

Met Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr

180 185 190

Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly

195 200 205

Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr

210 215 220

Asn Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr

225 230 235 240

Met Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Asp Lys Pro Lys Leu Phe Ser

245 250 255

Met Lys Arg Gly Glu Val Tyr Ile Pro Ser Ile Ser Thr Val Leu Gly

260 265 270

Asn Gly Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val

275 280 285

Cys Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu

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Ser Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly

305 310 315 320

Val Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr

325 330 335

Cys Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val

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Ser Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly

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<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgctgctgc tgctgctgcc cctgctctgg gggagggaga gggcggaagg acagacaagt 60

aaactgctga cgatgcagag ttccgtgacg gtgcaggaag gcctgtgtgt ccatgtgccc 120

tgctccttct cctacccctc gcatggctgg atttaccctg gcccagtagt tcatggctac 180

tggttccggg aaggggccaa tacagaccag gatgctccag tggccacaaa caacccagct 240

cgggcagtgt gggaggagac tcgggaccga ttccacctcc ttggggaccc acataccaag 300

aattgcaccc tgagcatcag agatgccaga agaagtgatg cggggagata cttctttcgt 360

atggagaaag gaagtataaa atggaattat aaacatcacc ggctctctgt gaatgtgaca 420

gccttgaccc acaggcccaa catcctcatc ccaggcaccc tggagtccgg ctgcccccag 480

aatctgacct gctctgtgcc ctgggcctgt gagcagggga caccccctat gatctcctgg 540

atagggacct ccgtgtcccc cctggacccc tccaccaccc gctcctcggt gctcaccctc 600

atcccacagc cccaggacca tggcaccagc ctcacctgtc aggtgacctt ccctggggcc 660

agcgtgacca cgaacaagac cgtccatctc aacgtgtcct acccgcctca gaacttgacc 720

atgactgtct tccaaggaga cggcacagta tccacagtct tgggaaatgg ctcatctctg 780

tcactcccag agggccagtc tctgcgcctg gtctgtgcag ttgatgcagt tgacagcaat 840

ccccctgcca ggctgagcct gagctggaga ggcctgaccc tgtgcccctc acagccctca 900

aacccggggg tgctggagct gccttgggtg cacctgaggg atgcagctga attcacctgc 960

agagctcaga accctctcgg ctctcagcag gtctacctga acgtctccct gcagagcaaa 1020

gccacatcag gagtgactca gggg 1044

<210> 3

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列(srtificial sequence)

<400> 3

Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu

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Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His

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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu

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Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro

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Met Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr

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Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly

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Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Thr Thr Thr Pro

340 345 350

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355 360 365

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Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

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Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

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<210> 4

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列(srtificial sequence)

<400> 4

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Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu

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Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile

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65 70 75 80

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Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser

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Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn

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245 250 255

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Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val

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Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly

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His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser

340 345 350

<210> 5

<211> 943

<212> PRT

<213> 人工序列(srtificial sequence)

<400> 5

Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu

1 5 10 15

Gly Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His

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Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu

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Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro

165 170 175

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180 185 190

Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly

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Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr

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Met Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn

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Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser

275 280 285

Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val

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Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys

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Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser

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Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Thr Thr Thr Pro

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Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

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Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

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Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

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Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

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His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

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Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Glu Gly Arg

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Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

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Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val

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Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu Ile

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Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys

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Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile

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Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly

850 855 860

Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala

865 870 875 880

Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu

885 890 895

Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val Ser

900 905 910

Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His

915 920 925

Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser

930 935 940

<210> 6

<211> 1670

<212> DNA

<213> 人工序列(srtificial sequence)

<400> 6

ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc 60

ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata 120

tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct 180

gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg 240

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gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa 360

agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg 420

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atggattggt catcctggtc atgggttacc agaagaaact gagaagcatg acggacaagt 840

acaggctgca cctgtcagtg gccgacctcc tctttgtcat cacgcttccc ttctgggcag 900

ttgatgccgt ggcaaactgg tactttggga acttcctatg caaggcagtc catgtcatct 960

acacagtcaa cctctacagc agtgtcctca tcctggcctt catcagtctg gaccgctacc 1020

tggccatcgt ccacgccacc aacagtcaga ggccaaggaa gctgttggct gaaaaggtgg 1080

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cactcacctc tgtgagcaga gggtccagcc tcaagatcct ctccaaagga aagcgaggtg 1620

gacattcatc tgtttccact gagtctgagt cttcaagttt tcactccagc 1670

Claims (10)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。

2.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。

3.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

5.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。

6.一种用于制备用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR的第一表达盒；和

(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达CXCR4的第二表达盒。

7.一种选择性杀伤肿瘤的方法，其特征在于，包括：

给需要治疗的对象施用安全有效量的权利要求1所述的工程化免疫细胞、或权利要求3所述的制剂。

8.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。

9.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求8所述的融合蛋白。

10.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求9所述的多核苷酸。

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