CN111378625A - 一种cxcl13趋化型car－t细胞的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CXCL13细胞因子趋化型的CAR－T细胞的制备和应用。具体地，本发明提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5。工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如NKG2D配体或NKG2D配体和CXCL13同时高表达的肿瘤细胞，并且本发明的CAR‑T细胞对其杀伤效果很显著。

Description

一种CXCL13趋化型CAR－T细胞的制备和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种CXCL13趋化型CAR－T细胞的制备和应用，更具体地，涉及一种CXCL13细胞因子趋化型CAR－T细胞的制备和应用。
背景技术
骨肉瘤作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，多发于青少年或儿童，手术和化疗是主要的治疗方案。由于初步诊断时全身转移率较高，单纯外科手术治愈是相当罕见的。骨肉瘤转移性患者，5年存活率小于20％，化疗对肺转移效果不显著。此外，肺转移灶经过初次转移瘤切除术后复发率较高，有时需要进行再次转移灶切除手术进行治疗。
CAR-T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T cell)将能识别肿瘤相关抗原(Tumor associate antigen，TAA)的单链抗体和能促进T细胞活化的信号传递结构域融合，并表达于自体T细胞的表面，从而赋予该T细胞以肿瘤靶向的杀伤活性和持久扩增的能力，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。不同于生理性的T细胞受体，重组CARs与抗原的结合不需要依赖于主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；同时，CARs不仅能够与蛋白质结合，还能识别糖类、神经节苷脂、蛋白多糖等，具备更加广谱肿瘤细胞杀伤作用。此外CAR-T细胞还具有T细胞的记忆性，清除肿瘤细胞后，CAR-T细胞会在淋巴结里形成记忆性T细胞，当肿瘤抗原再次出现时CAR-T细胞能够大量扩增进行再次肿瘤杀伤。
CAR-T治疗在血液瘤的治疗中展现出了显著的治疗效果，但CAR-T细胞在实体瘤的应用上还存在很多挑战：1.肿瘤组织表面有大量的成纤维细胞，其作为一种物理屏障使得CAR-T细胞和肿瘤细胞很难紧密接触。癌相关成纤维细胞(Cancer-associatedfibroblast，CAF)是肿瘤微环境中最丰富的细胞成分，并且具有来源、表型和功能异质性，它主要通过产生和分泌各种趋化因子以及促进上皮间充质转化从而在肿瘤发生、血管生成、耐药性、侵袭和转移中发挥重要作用。CAF是肿瘤微环境中最重要的组成成分，当其受到肿瘤相关活性介质(如TGF-β、PDGF、FGF)的刺激后进入活化状态，转化为具有肌成纤维细胞特性的成纤维细胞，从而通过分泌多种细胞因子和重塑细胞外基质等来调控肿瘤细胞的进展。2.同时肿瘤细胞周围还被调节性T细胞(Tregs)、Th2型T细胞、髓系抑制细胞(myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)以及肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)等抑制性免疫包围，它们和CAF组和像盔甲一样包裹着肿瘤细胞，使得T细胞很难浸润到肿瘤细胞附近发挥杀伤作用，即使部分肿瘤杀伤性T细胞浸润到肿瘤细胞附近也会受这些免疫抑制细胞分泌的免疫抑制分子的影响引起肿瘤杀伤性T细胞的细胞耗竭和凋亡。
因此，本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞精准、高效杀伤肿瘤的治疗目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞精准、高效杀伤肿瘤的治疗目的。
本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为T细胞。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR含有靶向MICA的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。
在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：
L-S-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
S为靶向MICA的抗原结合结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述靶向MICA的抗原结合结构域包括NKG2D的胞外段或靶向MICA的抗体单链可变区序列。
在另一优选例中，所述NKG2D的胞外段的氨基酸序列选自下组：
(a)如SEQ ID NO:1氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，编码所述NKG2D的胞外段的核苷酸序列选自下组：
(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有靶向或结合于MUC1活性的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有靶向或结合于MICA活性的多核苷酸。
在另一优选例中，所述NKG2D的胞外段为人源。
在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8a、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8a、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3 epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1、LAG-3、或其组合。
在另一优选例中，所述TM为CD8来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、DAP10、CDS、ICAM-1、或其组合。
在另一优选例中，所述C为4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述CXCR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5，从而获得本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述靶向MICA的CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达CXCR5的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。
在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。
在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的免疫细胞已经表达所述CAR时，则步骤(B1)可以省略。
在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体CAR的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码CXCR5的核酸序列。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
本发明第三方面提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，所述制剂还含有治疗癌症或肿瘤的其他药物(如新兴的抗体药物、其他CAR-T药物或化疗药物)。
本发明第四方面提供了如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述药物或制剂还用于选自下组的用途：
增强所述免疫细胞对CXCL13细胞因子的趋化功能，从而实现更强的肿瘤杀伤效果。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达NKG2D配体的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达NKG2D配体和CXCL13的肿瘤。
在另一优选例中，所述NKG2D配体选自下组：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：骨肉瘤、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。
本发明第五方面提供了一种用于制备用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR的第一表达盒；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达CXCR5的第二表达盒。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。
本发明第六方面提供了一种选择性杀伤肿瘤的方法，包括：
给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第七方面提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的工程化免疫细胞、或本发明第三方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述方法还包括给需要治疗的对象施用治疗癌症或肿瘤的其他药物。
在另一优选例中，所述其他药物包括CAR-T药物。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达NKG2D配体的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括高表达NKG2D配体和CXCL13的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合，优选地，所述肿瘤为实体瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：骨肉瘤、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤,膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。
本发明第八方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5。
在另一优选例中，所述CAR和所述CXCR5通过连接肽连接。
在另一优选例中，所述连接肽包括自剪切蛋白。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。
在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括T2A。
在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式II所示：
L-S-H-TM-C-CD3ζ-(Z3-P)m (II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
S为靶向MICA的抗原结合结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
Z3为连接肽；
P为CXCR5；
m为1、2、3、或4。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
本发明第九方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第八方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:5所示融合蛋白的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:6所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；
(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
本发明第十方面提供了一种载体，所述载体包括本发明第九方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第九方面所述的多核苷酸的载体。
在另一优选例中，所述载体用于表达本发明第八方面所述的融合蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了NKG2D-CXCR5-CAR质粒构建模式图。
图2显示了CAR-T细胞的增殖检测。
图3显示了CAR-T细胞的迁移检测。A.含有不同浓度的CXCl 13的细胞因子的培养基对NKG2D-CXCR5-CAR-T细胞趋化作用的影响；B.U2OS培养基上清对NKG2D-CXCR5-CAR-T趋化的影响。
图4显示了NKG2D-CXCR5-CAR-T细胞的体外杀伤效果检测。
图5显示了体内肿瘤抑制试验。A.治疗过程中小鼠生存率；B.治疗结束后不同处理组小鼠的肿瘤。
图6显示了不同处理组肿瘤组织中的CD3+T淋巴细胞的浸润情况。.
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现表达含有靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5的工程化免疫细胞可高效的选择性杀伤肿瘤细胞，比如NKG2D配体或NKG2D配体和CXCL13细胞因子同时高表达的肿瘤细胞，并且还意外的发现，靶向MICA的CAR-T细胞和CXCR5具有协同作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人LAG-3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CAR及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
MICA
MHCⅠ类链相关分子(MHC class I chain-related molecule A，MICA)是表达在自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)上NKG2D(natural killer group 2,member D)受体的一种重要活化性配体。MICA在正常细胞上不表达，但在上皮源性肿瘤细胞和应激条件下(如被细菌诱导、病毒感染及被致癌基因诱导)的细胞上高表达。
本发明的研究表明，NKG2D作为MICA的受体表达在NK细胞以及未激活的外周血CD8+αβT/γδT的细胞膜上，当刺激NKG2D-MICA介导的信号通路后，可有效加强NK细胞和部分T细胞的抗肿瘤效应，为免疫系统对肿瘤细胞的清除创造条件。
CXCL13/CXCR5
趋化因子CXCL13(chemokine C-X-C motif ligand 13)及其受体CXCR5(C-X-Cchemokine receptor type 5)在多种肿瘤研究中取得重要进展，其相关信号途径主要介导细胞趋化并影响肿瘤细胞转移、浸润，进而影响肿瘤的发展及预后，是肿瘤诊断及预后判断的重要标志物。
在一优选实施方式中，本发明的CXCR5的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示：
MASFKAVFVPVAYSLIFLLGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVADLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIALHKVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHRRLLSIHITCGTIWLVGFLLALPEILFAKVSQGHHNNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHVAGFLLPMLVMGWCYVGVVHRLRQAQRRPQRQKAVRVAILVTSIFFLCWSPYHIVIFLDTLARLKAVDNTCKLNGSLPVAITMCEFLGLAHCCLNPMLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLCQLFPSWRRSSLSESENATSLTTF。
NKG2D的胞外段
NKG2D是在NK细胞与CD8T细胞(αβ/γδ)膜表面表达的一种活化性受体，是C型凝集素超家族中的一员，其在NK细胞或T细胞介导的免疫效应中发挥着至关重要的作用。NKG2D的表达在正常生理条件下处于低水平，以避免机体过度免疫，但当细胞处于应激状态下，如发生病毒感染或者发生癌变时，NKG2D的表达水平会大幅增加，以加强NK细胞主导的免疫杀伤作用。本发明的研究表明，NKG2D与其配体结合后，不仅可以刺激NK细胞介导的免疫反应对癌细胞进行杀伤，同时在CD8T细胞上表达的NKG2D还可作为协同刺激分子使效应细胞发挥最大作用。
本发明意外发现，本发明特定的NKG2D的胞外段蛋白可以与MICA特异性结合。
在本发明的一优选实施方式中，本发明的NKG2D的胞外段蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.:1所示：
LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTI IEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
编码本发明的NKG2D的胞外段蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示：
TTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG
抗原结合结构域
在本发明中，嵌合抗原受体CAR的抗原结合结构域特异性结合于MICA。
铰链区和跨膜区
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。优选地，本发明的CAR中的铰链区为CD8a铰链区，本发明的跨膜区为CD8的跨膜区。
胞内结构域
本发明的CAR的胞内结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。优选地，包括4-1BB(CD137)等。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域(共刺激分子)以及CD3ζ的信号传导结构域。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。
CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。
CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。
具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合相关联抗原时，导致肿瘤细胞凋亡、坏死或受到其它方式的影响，从而导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达NKG2D配体的抗体，较佳地为单链抗体。
在一优选实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分靶向MICA。在一优选实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分是靶向MICA的NKG2D的胞外段蛋白。
在一优选实施方式中，NKG2D的胞外段蛋白包含变体形式，所述变体与其野生型的NKG2D的胞外段蛋白序列表具有≥80％、≥85％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同源性。
在本发明中，本发明的NKG2D的胞外段蛋白还包括其保守性变异体，指与本发NKG2D的胞外段蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本发明的CAR的胞外结构域包括NKG2D的胞外段蛋白，优选具有特定序列的NKG2D的胞外段蛋白。
在本发明中，本发明的CAR中的胞内结构域包括CD8的跨膜区、4-1BB的共刺激因子、CD3ζ的信号传导结构域。
在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSAAAEGRGS
在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSAAAEGRGSEGRGSLLTCGDVEENPGPMASFKAVFVPVAYSLIFLLGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVADLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIALHKVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHRRLLSIHITCGTIWLVGFLLALPEILFAKVSQGHHNNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHVAGFLLPMLVMGWCYVGVVHRLRQAQRRPQRQKAVRVAILVTSIFFLCWSPYHIVIFLDTLARLKAVDNTCKLNGSLPVAITMCEFLGLAHCCLNPMLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLCQLFPSWRRSSLSESENATSLTTF
在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的核苷酸序列SEQ ID NO.:6所示。
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGTTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCACAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCTCCTTCAAGGCCGTGTTCGTGCCCGTGGCCTACAGCCTCATCTTCCTCCTGGGCGTGATCGGCAACGTCCTGGTGCTGGTGATCCTGGAGCGGCACCGGCAGACACGCAGTTCCACGGAGACCTTCCTGTTCCACCTGGCCGTGGCCGACCTCCTGCTGGTCTTCATCTTGCCCTTTGCCGTGGCCGAGGGCTCTGTGGGCTGGGTCCTGGGGACCTTCCTCTGCAAAACTGTGATTGCCCTGCACAAAGTCAACTTCTACTGCAGCAGCCTGCTCCTGGCCTGCATCGCCGTGGACCGCTACCTGGCCATTGTCCACGCCGTCCATGCCTACCGCCACCGCCGCCTCCTCTCCATCCACATCACCTGTGGGACCATCTGGCTGGTGGGCTTCCTCCTTGCCTTGCCAGAGATTCTCTTCGCCAAAGTCAGCCAAGGCCATCACAACAACTCCCTGCCACGTTGCACCTTCTCCCAAGAGAACCAAGCAGAAACGCATGCCTGGTTCACCTCCCGATTCCTCTACCATGTGGCGGGATTCCTGCTGCCCATGCTGGTGATGGGCTGGTGCTACGTGGGGGTAGTGCACAGGTTGCGCCAGGCCCAGCGGCGCCCTCAGCGGCAGAAGGCAGTCAGGGTGGCCATCCTGGTGACAAGCATCTTCTTCCTCTGCTGGTCACCCTACCACATCGTCATCTTCCTGGACACCCTGGCGAGGCTGAAGGCCGTGGACAATACCTGCAAGCTGAATGGCTCTCTCCCCGTGGCCATCACCATGTGTGAGTTCCTGGGCCTGGCCCACTGCTGCCTCAACCCCATGCTCTACACTTTCGCCGGCGTGAAGTTCCGCAGTGACCTGTCGCGGCTCCTGACGAAGCTGGGCTGTACCGGCCCTGCCTCCCTGTGCCAGCTCTTCCCTAGCTGGCGCAGGAGCAGTCTCTCTGAGTCAGAGAATGCCACCTCTCTCACCACGTTCTAG
其中，在SEQ ID NO.:5中第1-21位为信号肽；第22-156位为NKG2D的胞外段蛋白；第157-201位为铰链区；第202-228位为跨膜区(如CD8a的跨膜区)；第229-276位为共刺激元件(如4-1BB)；第277-389位为CD3ζ，第390-407位是连接肽(如自剪切蛋白)，第408-734位为嵌合的趋化因子受体CXCR5。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)
如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明所述的CAR-T细胞，本发明CAR-T细胞可靶向肿瘤表面抗原(如MICA)，用来治疗NKG2D配体和CXCL13细胞因子同时高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。
CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
在本发明中，本发明的CAR包含(i)胞外结构域，其包含靶向肿瘤细胞表面抗原(如MICA)的抗原结合结构域；(i i)跨膜域；(ii i)共刺激因子；和(iv)CD3ζ的信号传导结构域；以及；(v)连接肽(如自剪切蛋白)；(vi)CXCR5。
嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)
如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可靶向肿瘤表面抗原(如MICA)，用于治疗NKG2D配体和/或CXCL13高表达或阳性的肿瘤，尤其是实体瘤。
自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。
外源T细胞抗原受体
如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。
外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/Kg体重，更优地1×104-1×107个细胞/Kg体重。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物(比如MICA)蛋白，协同激活T细胞，引起细胞免疫应答，从而选择性杀伤肿瘤细胞，比如NKG2D配体或NKG2D配和CXCL13同时高表达的肿瘤细胞。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，肿瘤细胞的标志物(比如MICA)的CAR-T细胞引起抗表达肿瘤细胞的标志物(比如MICA)的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括靶向肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域、T2A、CXCR5的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括骨肉瘤、肝癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌等。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或i ii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤或淋巴结位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，本发明的CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
融合蛋白
如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第八方面所述的结构。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:5所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
编码序列
本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:5所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:5所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。
编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的主要优点包括：
1.本发明首次发现表达含有靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5的工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如NKG2D配体或NKG2D配体和CXCL13细胞因子同时高表达的肿瘤细胞，并且靶向MICA的CAR-T细胞和CXCR5具有协同作用。
2.本发明首次发现，本发明的工程化的免疫细胞还可以增强NK细胞和CART细胞向CXCL13细胞因子的趋化功能，从而增强体内抗肿瘤的效果。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1 PCDH-NKG2D-CAR、PCDH-NKG2D-CXCR5-CAR载体的构建
将得到的NKG2D序列(获自GenBank，NCBI Reference Sequence::AF461811.1)与CXCR5序列(获自GenBank，NCBI Reference Sequence:NM_032966.2)通过重叠PCR的方式连接到一起。通过测序鉴定后确定构建成功，获得PLL3.7-NKG2D-CXCR5-CAR载体，结构图如图1所示：利用慢病毒表达系统表达NKG2D-CXCR5-CAR(骨架质粒为PLL3.7质粒)，使用EF1a启动子表达NKG2D的胞外段(含有外分泌信号肽)，与CD8跨膜区以及共刺激因子4-1BB和胞内信号激活序列CD3ζ相连，后端连接T2A，再与CXCR5相连接，末端使用PolyA终止密码子。
实施例2 CAR-T细胞制备
取人外周血，用淋巴细胞分离液分离人总淋巴细胞，用CD4+、CD8+两种磁珠分离T淋巴细胞，用CD3、CD28磁珠激活T细胞，48小时后，离心换液。将慢病毒按照MOI＝20:1进行感染，24小时后离心换液，加入新鲜培养基，用NKG2D抗体染色后检测T细胞的阳性率。
实施例3 CAR-T细胞增殖
eflour670标记NC组，NKG2D-CAR-T(G2D)组和NKG2D-CXCR5-CAR-T(G5)组的T细胞20min后，再分别与骨肉细胞U2OS进行孵育，流式细胞仪检测细胞增殖。细胞被eflour670标记后，细胞增殖越快，细胞的荧光强度会越低。通过流式细胞仪检测细胞荧光强度，荧光强度越强锋线图会向左偏移。当CAR-T细胞与靶细胞U2OS共孵育24h之后，细胞的增殖速度显著加快。NC组T细胞因为不能识别特异性的肿瘤抗原，所以不能进行特异细胞增殖信号的激活，细胞荧光强度高，增殖缓慢(图2)。G2D组细胞增殖与G5组细胞增殖没有明显的差异。当CART细胞与靶细胞接触后，CXCR5基因的插入对NKG2D-CART细胞的增殖没有显著地影响。CXCR5表达的CART细胞对CXCL13有协同作用，主要是促进CART细胞的趋化，即协助更多的CART细胞向肿瘤细胞迁移和浸润。
实施例4 CAR-T细胞趋化检测
将NC组，G2D和G5组CAR-T细胞置于Transwell的上室(小室孔径为3μm)，下室分别添加不同浓度的CXCL13细胞因子和U2OS细胞培养基的上清，2小时后对迁移到下室的细胞进行细胞计数。CXCR5高表达的CAR-T细胞向下室的迁移速率具有一定的CXCL13浓度依赖性(图3A)，即CXCL13浓度越高迁移速率越快。U2OS高表达CXCL13其上清中含有CXCL13细胞因子，transwell小室的下室中CXCL13细胞因子会刺激NKG2D-CXCR5-CAR-T向下室趋化。而NC组T细胞和NKG2D-CAR-T细胞向下室迁移的速率没有明显差异(图3B)。在体外实验中证明，含有CXCR5的CART细胞(NKG2D-CXCR5-CART)展现出良好的CXCL13协同作用，即带有CXCR5的CART细胞可以向CXCL13高浓度方向显著的趋化和迁移。
实施例5体外杀伤效果检测
靶细胞细胞U2OS(5×104/孔)，接种于低吸附的96孔圆底板，按照效应细胞(CART细胞)靶细胞比(E:T)为0:1、1.25:1、2.5:1、5:1的比例，加入相应的效应CART细胞，16h后用Annexin-V-APC抗体染色，进行流式检测。流式检测结果显示G2D和G5对靶细胞有很好的杀伤效果，且效靶比值增大后靶细胞凋亡的数量有明显增多的趋势，即使在低效靶比(1.25:1)的情况下也能对靶细胞U2OS进行很好的杀伤(图4)。
实施例6 NKG2D-CAR-T及NKG2D-CXCR5-CAR-T体内抗肿瘤功能研究
选取6到8周龄的NSG小鼠28只，皮下荷瘤U2OS骨肉瘤细胞(4×106/只)，2周后根据肿瘤大小将小鼠平均分为四组：PBS治疗组(注射PBS,100μl)，T细胞治疗组(注射5×106/只T细胞,100μl)，G2D细胞治疗组(注射5×106/只NKG2D-CART细胞,100μl)，G5细胞治疗组(注射5×106/只NKG2D-CXCR5-CART细胞,100μl)。每三天记录一次小鼠的生存率，治疗周期为28天。治疗结束后取小鼠肿瘤，并对肿瘤组织消化，通过流式细胞术检测肿瘤组织中T淋巴细胞比例，来确定CART细胞向肿瘤的趋化效果。
在整个治疗过程中G5治疗组没有出现小鼠死亡现象，G2D治疗组有一只小鼠死亡，PBS组与T细胞组出现了4只和3只小鼠死亡(图5A)，NKG2D-CXCR5-CART治疗还显著提高了小鼠生存状况。与PBS和T细胞治疗组相比，G2D和G5治疗组，都显著地抑制肿瘤增殖(图5B)，其中G5组比G2D组的肿瘤抑制效果更加明显。流式细胞术的检测结果显示(图6)，与T细胞治疗组相比，G2D细胞治疗组有更高的T淋巴细胞浸润。与G2D治疗组相比，G5治疗组肿瘤组织中有更高的T淋巴细胞的浸润比例(其中G5组的浸润比例为G2D组的约2.4倍)，由于CART细胞上CXCR5细胞受体的存在，骨肉瘤细胞表达的细胞因子CXCL13可以促进NKG2D—CXCR5-CART细胞向肿瘤组织中更好的趋化和浸润，所以能够发挥更好的肿瘤增殖抑制作用，而G2D-CART细胞治疗组因为不含有CXCL13趋化因子受体CXCR5，CART细胞在肿瘤组织中的浸润相对比较少，G2D-CART对肿瘤的增殖抑制效果也比较差。在体内实验中，还观察到了CXCL13细胞因子与表达CXCR5的CART细胞(NKG2D-CXCR5-CART)的协同作用，即CXCl13促进了CART细胞向肿瘤组织的趋化和浸润,从而可以实现更加优异的肿瘤细胞杀伤作用，从而更加明显地抑制肿瘤的增殖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种 CXCL13趋化型CAR－T细胞的制备和应用
<130> P2020-0138
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135
<210> 2
<211> 405
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 3
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
260 265 270
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
290 295 300
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Ala Ala Ala
370 375 380
Glu Gly Arg Gly Ser
385
<210> 4
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile
1 5 10 15
Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu
20 25 30
Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu
35 40 45
Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala
50 55 60
Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val
65 70 75 80
Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala
85 90 95
Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala
100 105 110
Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile
115 120 125
Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys
130 135 140
Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser
145 150 155 160
Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu
165 170 175
Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys
180 185 190
Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln
195 200 205
Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe
210 215 220
Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala
225 230 235 240
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245 250 255
Val Ala Ile Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu
260 265 270
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275 280 285
Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys
290 295 300
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305 310 315 320
Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
325
<210> 5
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
260 265 270
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
290 295 300
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Ala Ala Ala
370 375 380
Glu Gly Arg Gly Ser Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
385 390 395 400
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val
405 410 415
Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu Gly Val Ile Gly Asn Val
420 425 430
Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg Gln Thr Arg Ser Ser Thr
435 440 445
Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe
450 455 460
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465 470 475 480
Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr
485 490 495
Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala
500 505 510
Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser Ile
515 520 525
His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu Ala Leu
530 535 540
Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln Gly His His Asn Asn Ser
545 550 555 560
Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn Gln Ala Glu Thr His Ala
565 570 575
Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro
580 585 590
Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly Val Val His Arg Leu Arg
595 600 605
Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile
610 615 620
Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val
625 630 635 640
Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys
645 650 655
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Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly
675 680 685
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705 710 715 720
Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe
725 730
<210> 6
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcac agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840
aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1020
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcgga 1140
tccgcggccg ctgagggcag aggaagtgag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac 1200
gtggaggaga atcccggccc tatggcctcc ttcaaggccg tgttcgtgcc cgtggcctac 1260
agcctcatct tcctcctggg cgtgatcggc aacgtcctgg tgctggtgat cctggagcgg 1320
caccggcaga cacgcagttc cacggagacc ttcctgttcc acctggccgt ggccgacctc 1380
ctgctggtct tcatcttgcc ctttgccgtg gccgagggct ctgtgggctg ggtcctgggg 1440
accttcctct gcaaaactgt gattgccctg cacaaagtca acttctactg cagcagcctg 1500
ctcctggcct gcatcgccgt ggaccgctac ctggccattg tccacgccgt ccatgcctac 1560
cgccaccgcc gcctcctctc catccacatc acctgtggga ccatctggct ggtgggcttc 1620
ctccttgcct tgccagagat tctcttcgcc aaagtcagcc aaggccatca caacaactcc 1680
ctgccacgtt gcaccttctc ccaagagaac caagcagaaa cgcatgcctg gttcacctcc 1740
cgattcctct accatgtggc gggattcctg ctgcccatgc tggtgatggg ctggtgctac 1800
gtgggggtag tgcacaggtt gcgccaggcc cagcggcgcc ctcagcggca gaaggcagtc 1860
agggtggcca tcctggtgac aagcatcttc ttcctctgct ggtcacccta ccacatcgtc 1920
atcttcctgg acaccctggc gaggctgaag gccgtggaca atacctgcaa gctgaatggc 1980
tctctccccg tggccatcac catgtgtgag ttcctgggcc tggcccactg ctgcctcaac 2040
cccatgctct acactttcgc cggcgtgaag ttccgcagtg acctgtcgcg gctcctgacg 2100
aagctgggct gtaccggccc tgcctccctg tgccagctct tccctagctg gcgcaggagc 2160
agtctctctg agtcagagaa tgccacctct ctcaccacgt tctag 2205

Claims (10)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5。
2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR的结构如式I所示：
L-S-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，所述“-”为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
S为靶向MICA的抗原结合结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
3.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。
4.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
5.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
6.一种用于制备用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达靶向MICA的嵌合抗原受体CAR的第一表达盒；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于表达CXCR5的第二表达盒。
7.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含靶向MICA的嵌合抗原受体CAR和CXCR5。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如下式II所示：
L-S-H-TM-C-CD3ζ-(Z3-P)m (II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
S为靶向MICA的抗原结合结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
Z3为连接肽；
P为CXCR5；
m为1、2、3、或4。
9.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求7所述的融合蛋白。
10.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求9所述的多核苷酸。
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