CN113755448A - 联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞及其制备和应用。本发明将含有NKG2D胞外域的CAR分子与CCR2b及CD40L同时联合表达于CAR‑T细胞中，因此既能通过CCR2b提高CAR‑T细胞对趋化因子的灵敏度及其向实体瘤病灶的迁移能力；也能通过CD40L激活机体内源的天然和适应性免疫应答，提高肿瘤治疗效果并降低复发风险；还能通过NKG2D CAR分子识别恶性实体瘤细胞表面的多种靶点抗原，降低因肿瘤异质性或靶点抗原丢失而导致疗效下降的风险，从而提高肿瘤治疗的效果。本发明的工程化免疫细胞，可协同地显著提高针对肿瘤细胞的体外杀伤作用。

Description

联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞及其制备和应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫和细胞治疗领域，具体地，涉及一种联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养、修饰改造和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

T细胞是参与细胞免疫的一类重要的淋巴细胞，通过抗原呈递细胞的信号传递，可以特异性地识别并杀伤肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞也会通过减少或丢失抗原表位、免疫抑制作用、肿瘤异质性(即同一种恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位肿瘤细胞间从基因型到表型上存在的差异)等方式阻碍T细胞的特异性识别，从而逃避机体的免疫应答。

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)疗法正是针对该问题应运而生的。具体来说，CAR分子是一种人为设计和构建的受体分子，由信号肽、胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、胞内信号传导结构域等部分组成。因此，CAR分子具有特异性识别肿瘤表面抗原、激活T细胞杀伤活性和刺激T细胞增殖等功能。通过采集培养肿瘤患者的T细胞并以人工方法转导CAR分子的编码基因，使患者自体的T细胞表达CAR分子。回输至患者体内后，T细胞可以通过CAR分子高效且特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，达到癌症治疗的效果。

CAR-T疗法的概念从1989年首次被首次提出以来，经历了三十年的发展及多轮的技术更迭(图1)。第一代CAR-T仅有作为胞外抗原结合域的单链抗体和作为胞内信号传导结构域的CD3ζ，无法完全激活T细胞的活性，治疗效果不佳。第二代CAR-T在第一代CAR-T的基础上引入了一个共刺激结构域，提高了T细胞的体外增殖能力和细胞因子释放水平。第三代CAR-T在第二代CAR-T的基础上，增加了一个共刺激结构域，虽然可以提高T细胞的杀伤活性，但有可能诱发细胞因子的过量释放。因此，新一代CAR-T在第二代CAR-T的基础上联合表达其他辅助因子，例如联合表达IL-12或IL-2Rβ胞内的STAT3/5结合结构域等，有助于提高肿瘤杀伤活性和安全性等效果。

虽然在血液瘤中CAR-T治疗获得令人满意的效果，但CAR-T对于实体瘤的治疗效果仍有很大的提升空间。原因在于：(1)很多实体肿瘤都难以在早期被发现，具有恶性程度高、复发率高、预后差等特点。例如，83%的结直肠癌患者在首次确诊时已处于中晚期，且44%的患者已经出现了肝、肺等部位的转移，近半数患者生存期不到5年；约70%的卵巢癌患者在确诊时，癌细胞已经发生转移，难以通过手术、化疗、放疗手段治愈，治疗后的复发率仍高达70%以上；90%的胰腺癌患者被确诊时已属晚期，5年生存率仅7%。(2)在实体瘤治疗过程中，肿瘤组织往往具有免疫抑制性的微环境，可以阻碍CAR-T细胞的迁移和浸润。(3)很多恶性实体肿瘤还具有异质性高的特点，单一靶点抗原往往不能达到最佳的治疗效果，且有复发的风险。因此，用于结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性实体肿瘤患者的CAR-T细胞疗法，需要更进一步提高其作用效率和有效性。

综上所述，本领域仍然需要进一步的研究，针对恶性肿瘤(尤其是实体瘤) 开发一种能更高效、治疗效果更好的工程化免疫细胞。

发明内容

本发明的目的是针对恶性肿瘤(尤其是实体瘤) 提供一种能更高效、治疗效果更好的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)。

本发明的又一目的是提供一种联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)及其制法和应用。

本发明的第一方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞具有以下特征：

(a) 所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物，其中所述CAR的抗原结合结构域包括NKG2D的胞外结构域；

(b) 所述的免疫细胞表达外源的CCR2b蛋白；和

(c) 所述的免疫细胞表达外源的CD40L蛋白。

在另一优选例中，所述的T细胞包括αβT、γδT细胞、NKT细胞、MAIT细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：

(i) 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii) 嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述的CCR2b蛋白和/或CD40L可以是组成型表达或诱导型表达。

在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下一个或多个特征：

(a) 所述细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物；和

(b) 当所述CAR-T细胞接触诱导剂时，所述CAR-T细胞诱导表达CCR2b和/或CD40L蛋白。

在另一优选例中，在所述的CAR细胞中，CAR、CCR2b和CD40L蛋白是串联表达的。

在另一优选例中，在所述的CAR细胞中，CAR、CCR2b和CD40L蛋白各自独立地表达的。

在另一优选例中，所述“激活”指所述CAR与肿瘤细胞的表面标志物结合。

在另一优选例中，所述“肿瘤的表面标志物”指肿瘤表面的特异性抗原。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR定位于所述工程化免疫细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR定位于所述CAR-T细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述的CCR2b蛋白定位于所述CAR-T细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：

L-NKG2D-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

L为无或信号肽序列；

NKG2D为NKG2D胞外结构域或其活性片段；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；

所述“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述L分别选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137、或其突变/修饰体、或其组合。

在另一优选例中，所述H选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG、或其组合。

在另一优选例中，所述TM选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233、CD314、或其突变/修饰体、或其组合。

在另一优选例中，所述C选自下组的蛋白的共刺激结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、或其突变/修饰体、或其组合。

在另一优选例中，C为4-1BB来源的共刺激结构域。

在另一优选例中，所述NKG2D的胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第73-216位所示或如SEQ ID No: 4所示。

在另一优选例中，除了式I所示的第一CAR之外，所述CAR细胞还含有用于针对第二抗原的第二CAR，所述的第二CAR的结构如式II所示：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (II)

式中，

L为无或信号肽序列；

scFv为抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列或其突变/修饰体；

所述“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述scFv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。

在另一优选例中，所述scFv为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：CD19、CD20、CD22、CD123、CD47、CD138、CD33、CD30、CD271、GUCY2C、CD24、CD133、CD44、CD166、CD133、CD276 、ABCB5、ALDH1、间皮素(mesothelin, MSLN)、EGFR、GPC3、BCMA、ErbB2、NKG2D配体(ligands)、LMP1、EpCAM、VEGFR-1、Lewis-Y、ROR1、Claudin18.2、CEA、TAG-72、TROP2或其组合。

在另一优选例中，所述NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中胞外结构域为第73-216位。

在另一优选例中，所述的CCR2b蛋白包括全长CCR2b蛋白或其活性片段(即保留可与相应配体发生结合的功能的活性片段)。在另一优选例中，所述CCR2b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的CD40L蛋白包括全长CD40L蛋白或其活性片段(即保留可与CD40发生结合的功能的活性片段)。

在另一优选例中，所述CD40L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，式I所示的第一CAR和式II所示的第二CAR可合而为一，从而构成如式IIIa或IIIb所示的CAR：

L-NKG2D-scFv-H-TM-C-CD3ζ (IIIa)

L-scFv-NKG2D-H-TM-C-CD3ζ (IIIb)

式中，

L为无或信号肽序列；

NKG2D为NKG2D胞外结构域或其活性片段；

scFv为抗原结合结构域；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列或其突变/修饰体；

所述“-”为连接肽或肽键。

本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(A) 提供一待改造的免疫细胞；和

(B) 对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达CAR分子以及外源的CCR2b蛋白和外源的CD40L蛋白，从而获得本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物，其中所述CAR的抗原结合结构域包括NKG2D的胞外结构域。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括：

(B1) 将表达所述CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；(B2)将表达CCR2b的第二表达盒导入所述免疫细胞；(B3)将表达CD40L的第三表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)、(B2)和(B3)可以按任意次序进行。

在另一优选例中，所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，所述的步骤(B1)可在步骤(B3)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，所述的步骤(B2)可在步骤(B3)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，所述的步骤(B1)、(B2)和(B3)同时或交替进行。

在另一优选例中，提供了一种制备本发明所述的CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

(A) 提供一种待改造的T细胞；

(B) 对所述的T细胞进行改造，使得所述的T细胞表达所述的CAR分子以及外源的CCR2b蛋白和外源的CD40L蛋白，从而获得本发明第一方面所述的工程化免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括： 将表达所述CAR的第一表达盒导入所述T细胞；和将表达CCR2b的第二表达盒和表达CD40L的第三表达盒导入所述T细胞；其中所述的导入步骤可以按任意次序进行。

在另一优选例中，对于所述的第一、第二和第三表达盒中任何两个表达盒(以第一表达盒和第二表达盒为例)，其转录方向是同向的(→→)、相向的(→←)或相背的(←→)。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒位于同一载体。

在另一优选例中，当所述的CAR分子、外源的CCR2b蛋白和外源的CD40L蛋白中的两个或三个串联表达时，在两个蛋白之间，还包括连接肽。

在另一优选例中，所述连接肽为P2A或T2A。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体，较佳地所述病毒载体含有串联形式的第一和第二表达盒。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为pCDH系列慢病毒载体。

本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂含有本发明所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症的药物或制剂。

在另一优选例中，提供了如本发明第一方面所述的CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述制剂含有CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：结肠癌、直肠癌、卵巢癌、或胰腺癌。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体高表达和/或趋化因子高表达和/或CD40高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体高表达和趋化因子高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体高表达和趋化因子高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体高表达和CD40高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述的趋化因子选自下组：CCL2、CCL7、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体高表达、趋化因子CCL2和/或CCL7高表达和CD40高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体(包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6中的任意一种，或其组合)高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤为NKG2D配体(包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6中的任意一种，或其组合)高表达和/或趋化因子(包括CCL2、CCL7、CCL8、CCL12、CCL13、CCL16中的任意一种，或其组合)高表达和/或CD40高表达的肿瘤。

本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1) 第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒，其中所述CAR的抗原结合结构域为NKG2D的胞外结构域；

(2) 第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达CCR2b的第二表达盒；和

(3) 第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于联合表达CD40L的第三表达盒。

在另一优选例中，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1) 第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；

(2) 第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达CCR2b的第二表达盒；和

(3) 第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于联合表达CD40L的第三表达盒。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三核酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三核酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三核酸序列位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三核酸序列位于同一载体。

在另一优选例中，当所述的第一、第二和第三核酸序列中两个或三个位于同一载体时，在所述其之间，还包括用于表达连接肽的连接肽表达盒。

在另一优选例中，所述连接肽为P2A或T2A。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体，较佳地所述病毒载体含有串联形式的第一、第二和第三核酸序列。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了历代CAR分子的结构。

图2显示了CAR分子的结构。

图3显示了流式检测各CAR-T细胞的NKG2D CAR分子的表达率。

图4显示了流式检测各CAR-T细胞的CCR2b的表达率。

图5显示了流式检测各CAR-T细胞的CD40L的表达率。

图6显示了流式检测靶细胞中NKG2D配体(MICA/MICB)的表达率。

图7显示了流式检测靶细胞中NKG2D配体(ULBP-1)的表达率。

图8显示了流式检测靶细胞中NKG2D配体(ULBP-2/5/6)的表达率。

图9显示了流式检测靶细胞中NKG2D配体(ULBP-3)的表达率。

图10显示了流式检测靶细胞中NKG2D配体(ULBP-4)的表达率。

图11显示了流式检测靶细胞中CD40的表达率。

图12显示了Incucyte实时检测BN009的趋化迁移能力的结果。

图13显示了EuTDA检测各NKG2D CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

图14显示了ELISA检测各NKG2D CAR-T细胞的IFN-γ释放水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次将特定的CAR和CCR2b以及CD40L蛋白共表达工程化的免疫细胞，即将含NKG2D胞外结构域(ED)的CAR与CCR2b和CD40L联合表达于CAR-T等免疫细胞中。本发明的CAR-T细胞同时具备NKG2D的多靶点识别能力、CCR2b的增强趋化迁移能力和CD40L的免疫激活能力，并且出乎意料地表现出协同的针对肿瘤细胞的体外杀伤作用。在此基础上完成了本发明。

实验提示，与现有技术相比，本发明的免疫细胞既能通过CCR2b提高CAR-T细胞对CCL2、CCL7等趋化因子的灵敏度，向结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等实体瘤的病灶高效迁移，提高治疗效率；同时又能通过NKG2D CAR分子识别结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞表面的多种靶点抗原(包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6)，降低因肿瘤异质性或靶点抗原丢失而导致疗效下降的风险。此外，共表达的CD40L可有效激活机体内源的天然和适应性免疫应答，从而有助于T细胞克服免疫抑制的肿瘤微环境，提高肿瘤治疗，降低肿瘤复发风险。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞(或T细胞可替换为NK细胞)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、瘤内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

抗体

如本文所用，术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

抗原结合结构域

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。

在本发明中，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达的抗原的NKG2D胞外结构域或其活性片段。

此外，本发明的免疫细胞还可含有额外的特异性识别肿瘤高表达的抗原的抗体，较佳地为单链抗体或Fv抗体。

嵌合抗原受体(CAR)

如本文所用，嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)包括细胞外结构域、任选的铰链区、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括任选的信号肽和靶点特异性结合结构域(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激结构域和CD3ζ链部分。CAR在T细胞中表达时，胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子如IL-2和IFN-γ等，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

在一个实施方式中，本发明CAR靶向NKG2D配体，能与MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6特异性结合。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-T细胞。本发明CAR-T细胞可用于治疗NKG2D配体高表达的肿瘤，如结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗NKG2D配体高表达的肿瘤，如结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有以下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

蛋白NKG2D

在本发明中，NKG2D包括野生型或其突变型或其衍生形式或其活性片段。优选的NKG2D来自于哺乳动物(如人和非人灵长动物)的NKG2D。

人NKG2D蛋白的氨基酸序列的登录号为NP_031386，核苷酸氨基酸序列的登录号为NM_007360。人NKG2D的全长氨基酸序列如下所示：

MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQD LLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(SEQID No: 1)

其中，第1-51位是胞内结构域；第52-72位是跨膜区；第73-216位是NKG2D胞外结构域(下划线部分)。

趋化因子

趋化因子是一类特殊的细胞因子，包含50多个成员。根据结构分为CC、CXC、CX3C和XC四类；趋化因子受体则相应分为CCR、CXCR、CX3CR和XCR4种，约有20个成员。

在本发明的工程化免疫细胞中，表达的趋化因子受体是CCR2b蛋白，可以结合的趋化因子包括CCL2、CCL7、CCL8、CCL12、CCL13、CCL16等。

CCR2b蛋白的氨基酸序列的登录号为NP_001116868.1，核苷酸氨基酸序列的登录号为NM_001123396.4。具体序列如下所示：

氨基酸序列：

MLSTSRSRFIRNTNESGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL (SEQ ID No:2)

蛋白CD40L

白细胞分化抗原40配体(cluster of differentiation 40 ligand, CD40L)，也称CD154或肿瘤坏死因子相关激活蛋白(tumor necrosis factor-associated activationprotein, TRAP)。

人CD40L蛋白的氨基酸序列的登录号为NP_000065.1，核苷酸氨基酸序列的登录号为NM_000074.3。人CD40L的全长氨基酸序列如下所示：

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID No: 5)

在本发明中，合适的CD40L包括野生型和突变型的CD40L，只要该突变型CD40L具有野生型CD40L的基本功能。此外，在本发明中，优选的CD40L来自哺乳动物，如人和非人哺乳动物。

CD40L主要表达于活化的CD4+ T淋巴细胞、活化的CD8⁺ T细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞。CD40L与其受体CD40是体内炎症和免疫反应系统中的一对共同刺激分子。在天然免疫中，CD40L/CD40共刺激途径是单核细胞成熟过程的重要触发因素，主要驱动单核细胞分化为M1谱系的巨噬细胞和DC细胞。同时，该途径也可促进DC细胞释放细胞因子和趋化因子，诱导其他共刺激分子的表达，并促进抗原的交叉呈递。在体液免疫中，该途径也参与T细胞依赖性的B淋巴细胞应答过程、生发中心的形成、长期记忆性B细胞的产生、抗体的产生及抗体类别转换。在细胞免疫中，该途径能促进T细胞活化并放大T细胞介导的免疫应答，在CD4⁺ T细胞分化的过程中起重要作用，也能够促进CD8+ T细胞的扩增和多能性，是产生记忆性CD8+ T细胞的基础。

在抗肿瘤免疫反应中，CD40L/CD40共刺激途径也发挥多种作用，如激活T细胞的增殖和细胞因子的释放，诱导M2谱系的巨噬细胞向具有抗肿瘤活性的M1谱系的巨噬细胞转变等。在某些靶点抗原丢失但CD40高表达的肿瘤中，该途径还可以介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

在本发明中，当与特定的CAR分子和CCR2b共表达CD40L时，CD40L作为CAR-T细胞的辅助因子，可以在CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的同时，激活机体内源的免疫应答，增强和延长治疗效果。此外，出乎意料的是，CD40L还可与CCR2b一起发挥协同作用，从而协同地显著提高针对肿瘤细胞的体外杀伤作用。

表达盒

如本文所用，“表达盒”或“本发明表达盒”包括第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒。本发明表达盒如本发明第五方面所述，第一表达盒包含编码所述CAR的核酸序列。所述第二表达盒表达外源的CCR2b蛋白。所述第二表达盒表达外源的CD40L蛋白。

在本发明中，CCR2b和CD40L蛋白可以是组成型表达或诱导型表达。

在诱导表达情况下，在所述CAR-T细胞被相应诱导剂激活时，第二表达盒表达CCR2b蛋白，第三表达盒表达CD40L蛋白；这样，在本发明CAR-T细胞在未接触相应诱导剂时，第二表达盒不表达CCR2b蛋白，第三表达盒不表达CD40L蛋白。

在一个实施方式中，所述第一表达盒、第二表达盒和/或第三表达盒分别还包括启动子和/或终止子。第二表达盒和第三表达盒的启动子可以为组成型或诱导型启动子。

载体

本发明还提供了含有本发明表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定地整合于细胞基因组中并随子细胞基因组的复制而复制。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，且具有低免疫原性的优点。

通常，可通过常规操作将本发明的表达盒或核酸序列连接至启动子下游，并将其并入表达载体。该载体可整合至真核细胞基因组中并随之复制。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达载体也可用于标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体等。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Sambrook等,Cold SpringHarbor Laboratory,New York, 2001)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含至少一种在有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经有许多基于病毒的系统被开发出来，并用于哺乳动物细胞的基因转导。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒随后可被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。许多DNA病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些元件位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个元件被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50 bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，能够在需要时，启动连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或在不需要时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报告基因中的任一个或两者，以便于通过病毒载体从被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记基因和报告基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neomycin等等。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、阳离子复合物转染法、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual ( Sambrook等,ColdSpring Harbor Laboratory,New York, 2001)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体法转染法和阳离子复合物聚乙烯亚胺转染法。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。例如见美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂类物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

应理解，在本发明中，除了采用多个慢病毒进行转导，还用直接转染mRNA或质粒，或者通过表达人工转录因子等方法，从而在T细胞等免疫细胞中联合表达CCR2b、CD40L和NKG2D CAR分子。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括含本发明表达盒的载体(如慢病毒载体)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的表面标志物并表达CCR2b蛋白，协同而显著地提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激靶向哺乳动物肿瘤细胞群或组织的T细胞所介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式使移植物抗宿主反应的发生概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续控制肿瘤的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳定的体内扩增并可持续数月至数年的时间。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中，CAR-T细胞可诱导对CAR抗原结合结构域所识别的抗原的高表达肿瘤细胞的特异性免疫应答。例如，本发明的CAR-T细胞引起针对NKG2D配体高表达的肿瘤细胞的特异性免疫应答。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于：结直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。

通常地，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防肿瘤等疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-T细胞。

本发明的CAR-T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度等因素确定，或可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁷个细胞/kg体重的剂量(包括范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J. of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象容易地确定，并以此调整治疗。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁵个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点

(1) 本发明利用CCR2b蛋白使得本发明的免疫细胞更高效地迁移到肿瘤部位，从而显著提高抑制肿瘤的效果，并可减少毒副作用。实验表明，本发明显著提高了CAR-T细胞向CCL2浓度高处迁移(如病灶部位)的能力。

(2) 本发明的工程化免疫细胞的抗原结合域采用NKG2D的胞外结合域，可通过NKG2D CAR分子识别恶性肿瘤(如结直肠癌细胞、卵巢癌、胰腺癌等)细胞表面的8种靶点抗原(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6)，降低因肿瘤异质性或靶点抗原丢失而导致疗效下降的风险。

(3) 本发明采用CD40L作为第二辅助因子，以便更有效地激活机体内源的天然和适应性免疫应答。通过CD40L激活T细胞的增殖和细胞因子的释放，诱导M2谱系的巨噬细胞向具有抗肿瘤活性的M1谱系的巨噬细胞转变，增强DC细胞的抗原呈递功能等，同时提高T细胞对某些抗原丢失但CD40高表达的肿瘤细胞的杀伤作用。

(4) NKG2D胞外域的CAR分子与CCR2b及CD40L同时联合时，可出乎意料地显著提高了CAR-T细胞向高浓度CCL2的趋化迁移能力。

(5)出乎意料地，当本发明NKG2D CAR分子、外源CCR2b蛋白和外源CD40L蛋白的联合表达时，可协同地显著提高针对肿瘤细胞的体外杀伤作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等人，New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另外说明，实施例中采用的试剂和材料为市售获得。

材料与方法

CAR分子及其结构

在实施例中，各NKG2D CAR包含以下部分结构：人CD8信号肽[简称CD8(SP)]、人NKG2D胞外结构域[简称NKG2D(ED)]、优化了的人CD8铰链区[简称CD8(hinge)]、人CD8跨膜结构域[简称CD8(TM)]、人4-1BB胞内结构域[简称4-1BB(ID)]、人CD3ζ胞内信号转导结构域[简称CD3ζ(ID)]、自剪切肽P2A、人CCR2b、自剪切肽T2A、人CD40L。

作为对照的第二代NKG2D CAR分子命名为BN001，联合表达CCR2的新一代NKG2DCAR分子命名为BN003，联合表达CD40L的新一代NKG2D CAR分子命名为BN004，联合表达CCR2和CD40L的新一代NKG2D CAR分子命名为BN009。

所述CAR分子的具体结构如图2所示，具体如下：

BN001从其氨基端至羧基端由CD8(SP)、NKG2D(ED)、CD8(hinge)、CD8(TM)、4-1BB(ID)、CD3ζ(ID)依次串联组成。

BN003从其氨基端至羧基端由CD8(SP)、NKG2D(ED)、CD8(hinge)、CD8(TM)、4-1BB(ID)、CD3ζ(ID)、P2A、CCR2b依次串联组成。

BN004从其氨基端至羧基端由CD8(SP)、NKG2D(ED)、CD8(hinge)、CD8(TM)、4-1BB(ID)、CD3ζ(ID)、P2A、CD40L依次串联组成。

BN009从其氨基端至羧基端由CD8(SP)、NKG2D(ED)、CD8(hinge)、CD8(TM)、4-1BB(ID)、CD3ζ(ID)、P2A、CCR2b、T2A、CD40L依次串联组成。

SEQ ID NO:1(人NKG2D氨基酸序列)

MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV

SEQ ID NO:2(人CCR2b氨基酸序列)

MLSTSRSRFIRNTNESGEEVTTFFDYDYGAPCHKFDVKQIGAQLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVVLILINCKKLKCLTDIYLLNLAISDLLFLITLPLWAHSAANEWVFGNAMCKLFTGLYHIGYFGGIFFIILLTIDRYLAIVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWLVAVFASVPGIIFTKCQKEDSVYVCGPYFPRGWNNFHTIMRNILGLVLPLLIMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRVIFTIMIVYFLFWTPYNIVILLNTFQEFFGLSNCESTSQLDQATQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRRYLSVFFRKHITKRFCKQCPVFYRETVDGVTSTNTPSTGEQEVSAGL

SEQ ID No: 3(人CD8信号肽氨基酸序列)

MALPVTALLLPLALLLHAARPS

SEQ ID No: 4(人NKG2D胞外结构域氨基酸序列)

IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV

SEQ ID No: 5(人CD40L氨基酸序列)

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL

SEQ ID No: 6(优化了的人CD8铰链区氨基酸序列)

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFA

SEQ ID No: 7(人CD8跨膜结构域氨基酸序列)

CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR

SEQ ID No: 8(人4-1BB胞内结构域氨基酸序列)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID No: 9(人CD3ζ胞内信号转导结构域氨基酸序列)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No: 10(自剪切肽P2A氨基酸序列)

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEQ ID No: 11(自剪切肽T2A氨基酸序列)

GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP

实施例1 慢病毒制备

1.1 慢病毒载体质粒的获得

全基因合成BN001、BN003、BN004和BN009的核苷酸序列，再通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP质粒中，使之在人EF1α启动子和Kozak序列的调控下表达。

慢病毒载体质粒转染293T细胞

将上述各慢病毒载体质粒与慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G用聚乙烯亚胺转染试剂混合，共转染293T细胞。培养48 h后，分别收集病毒上清液，于4°C下4500rpm离心10～15 min，经0.5 μm孔径的滤膜过滤后用中空纤维柱超滤系统进行慢病毒浓缩，再用层析法进行慢病毒纯化，最后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌后分装置于-80℃保存。

慢病毒滴度测定

将Jurkat细胞的浓度调整至1×10⁵个/300μl，充分混匀后取300μl重悬的细胞至24孔板的每个孔中。取70 μl慢病毒浓缩液用Opti-MEM培养基进行5倍梯度稀释。将各稀释梯度的慢病毒以200 μl/孔的用量加入上述24孔板中，使慢病毒感染Jurkat细胞(阴性对照组的Jurkat细胞只加入Opti-MEM培养基)，并置于细胞培养箱中培养(培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%)。培养3天后，将各孔内的细胞轻柔混匀并转移至1.5-ml离心管中，用染色缓冲液(100 ml PBS + 1%BSA)清洗两次，每次800 g离心3 min。用相应抗体对上述细胞进行染色，再用流式细胞仪进行检测成功被慢病毒转导的Jurkat细胞的比例。将Jurkat细胞的慢病毒感染率记为P(%)，病毒液体积记为V(ml)，病毒液稀释倍数记为N，通过以下公式计算慢病毒滴度：

慢病毒滴度(TU/ml) = P/V ×N ×10⁵

结果：BN001滴度为5.46×10⁸ TU/ml，BN003滴度为2.46×10⁸ TU/ml，BN004滴度为6.31×10⁸ TU/ml，BN009滴度为9.51×10⁸ TU/ml。

实施例2 CAR-T细胞的制备和检测

(a) 制备T细胞

将健康供者的外周血单个核细胞密度调整至2 × 10⁶/ml，加入50 ng/ml抗CD3抗体、50 ng/ml抗CD28抗体，以及200 IU/ml重组IL-2，置于细胞培养箱中培养24 h(培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%)。

慢病毒转导T细胞

清洗获得的T细胞，并将细胞密度调整至2 × 10⁶/ml。以MOI = 1～10 TU/cell的用量加入慢病毒进行转导，同时补充50 ng/ml抗CD3抗体、50 ng/ml抗CD28抗体，以及200IU/ml重组IL-2，置于细胞培养箱中培养(培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%)。24 h后，将细胞密度调整至1.5～2 × 10⁶/ml，并补充300 IU/ml的IL-2。转导后第4天，清洗细胞以去除上清中残留的慢病毒粒子，并继续置于细胞培养箱中培养5天(培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%)，期间保持细胞密度为1～2 × 10⁶/ml。转导后第10天收取细胞，并用冻存液(含有5%人血清白蛋白的冻存培养基:生理盐水 = 1:1)冻存于液氮中备用。获得的CAR-T细胞沿用相应CAR分子的命名，分别为BN001、BN003、BN004和BN009，未用慢病毒转导的T细胞命名为Ctrl T。

检测CAR分子的表达

用PBS清洗待检测的Ctrl T、BN001、BN003、BN004和BN009细胞两次，并用FACS缓冲液(含0.1%叠氮化钠和0.4%BSA的PBS)重悬。按照抗体说明书将APC标记的抗人NKG2D抗体和BV421标记的抗人CD3抗体加入待检测细胞悬液中，4°C孵育60 min。以Ctrl T细胞为阴性对照，用流式细胞仪检测BN001和BN009细胞的NKG2D CAR分子的表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图3所示，根据Ctrl T细胞的APC荧光信号水平设门，将作为阴性对照的Ctrl T细胞中CAR分子的表达率视为0.64%，BN001细胞的CAR分子表达率约为92.17%，BN003细胞的CAR分子表达率约为98.31%，BN004细胞的CAR分子表达率约为97.71%，BN009细胞的CAR分子表达率约为85.29%。

检测CCR2b的表达

用PBS清洗待检测的Ctrl T、BN001、BN003、BN004和BN009细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将PE标记的抗人CCR2b抗体和BV421标记的抗人CD3抗体加入待检测细胞悬液中，4°C孵育60 min。以未用慢病毒转染的Ctrl T细胞为阴性对照，用流式细胞仪检测上述CAR-T细胞的CCR2b表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图4所示，由于T细胞有一定水平的内源性CCR2表达，Ctrl T细胞可分为CCR2阴性和CCR2阳性细胞群。根据CCR2阴性的Ctrl T细胞群的PE荧光信号水平设门，CtrlT的CCR2表达率约为44.20%，BN001的CCR2b表达率约为23.71%，BN003细胞的CCR2b表达率约为99.37%，BN004细胞的CCR2b表达率约为24.55%，BN009细胞的CCR2b表达率约为96.11%。

检测CD40L的表达

用PBS清洗待检测的Ctrl T、BN001、BN003、BN004和BN009细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将PE标记的抗人CD40L抗体和BV421标记的抗人CD3抗体加入待检测细胞悬液中，4°C孵育60 min。以未用慢病毒转染的Ctrl T细胞为阴性对照，用流式细胞仪检测上述CAR-T细胞的CD表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图5所示，由于T细胞有一定水平的内源性CD40L表达，Ctrl T细胞可分为CD40L阴性和CD40L阳性细胞群。根据CD40L阴性的Ctrl T细胞群的PE荧光信号水平设门，Ctrl T的CD40L表达率约为2.75%，BN001的CD40L表达率约为21.43%，BN003的CD40L表达率约为41.85%，BN004的CD40L表达率约为86.74%，BN009细胞的表达率约为71.86%。

实施例3 靶细胞检测

(a)靶细胞培养条件

供试结直肠癌细胞系(又称靶细胞或靶细胞系)：HCT 116(McCoy's 5a培养基 +10%胎牛血清 + 100 U/ml青霉素 + 100 μg/ml链霉素)，LS174T(EMEM培养基 + 10%胎牛血清 + 100 U/ml青霉素 + 100 μg/ml链霉素)，LoVo(F-12K培养基 + 10%胎牛血清 + 100U/ml青霉素 + 100 μg/ml链霉素)，SW480(Leibovitz's L-15 Medium培养基 + 10%胎牛血清 + 100 U/ml青霉素 + 100 μg/ml链霉素)。供试卵巢癌细胞系：SK-OV-3(McCoy's 5a培养基 + 10%胎牛血清 + 100 U/ml青霉素 + 100 μg/ml链霉素)。

检测NKG2D配体(MICA/MICB)的表达

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将APC标记的抗人MICA/MICB抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的MICA/MICB表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图6所示，HCT 116、LS174T和SW480的MICA/MICB表达率均高于96%以上，LoVo和SK-OV-3的MICA/MICB表达率低于8%。

检测NKG2D配体(ULBP-1)的表达率

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将 PC5.5标记的抗人ULBP-1抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的ULBP-2/5/6表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图7所示，HCT116的ULBP-1表达率约为77.25%，LoVo的ULBP-1表达率约为9.09%，其他细胞的ULBP-1表达率均低于3%。

检测NKG2D配体(ULBP-2/5/6)的表达率

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将 PE标记的抗人ULBP-2/5/6抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的ULBP-2/5/6表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图8所示，HCT116和SW480的ULBP-2/5/6表达率均高于92%，LoVo的ULBP-2/5/6表达率约为86.82%，SK-OV-3的ULBP-2/5/6表达率约为56.90%，LS174T的ULBP-2/5/6表达率约为33.42%。

检测NKG2D配体(ULBP-3)的表达率

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将 PE标记的抗人ULBP-3抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的ULBP-3表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图9所示，HCT116和SW480的ULBP-3表达率均高于92%，LS174T的ULBP-3表达率约为46.57%，LoVo和SK-OV-3的ULBP-3表达率均低于34%。

检测NKG2D配体(ULBP-4)的表达率

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将PE标记的抗人ULBP-4抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的ULBP-4表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图10所示，HCT 116、LS174T、LoVo和SW480的ULBP-4表达率均在80%以上，SK-OV-3的ULBP-4表达率约为71.64%。

检测CD40的表达率

用PBS清洗上述靶细胞两次，并用FACS缓冲液重悬。按照抗体说明书将APC标记的抗人CD40抗体加入各靶细胞悬液中，4°C孵育60 min。以不加抗体孵育的靶细胞作为阴性对照，用流式细胞仪检测靶细胞的CD40表达率。采用CytExpert软件分析。

结果如图11所示，HCT 116的CD40表达率约为94.56%，SK-OV-3的表达率约为86.61%，其他细胞的表达率均低于3%。

实施例4 CAR-T细胞的趋化迁移

在本实施例中，使用Incucyte S3活细胞动态成像分析仪，对T细胞迁移进行实时检测。ClearView 96孔趋化运动微孔板前处理：在微孔板的上室加入20 μg/ml的Protein-G蛋白，37°C放置1 h，以包被上室微孔滤膜；用D-PBS清洗后，在微孔板的上室加入5 μg/ml的ICAM-1蛋白，37°C放置2 h，对上室微孔滤膜进行二次包被；最后用1% BSA对上室微孔滤膜的上下表面进行封闭30 min。用含0.5% FBS 的RPMI 1640培养基清洗并重悬待检测的T细胞，将细胞密度调整至2 ～ 8 × 10⁴个/ml。用D-PBS清洗后，在微孔板的上室加入60 μl待检测的T细胞悬液(5000个/孔)。静置1 h后，在下室加入含0.5% FBS的RPMI 1640培养基及相应浓度的CCL2，并置于Incucyte S3活细胞动态影像成像分析仪中，以30 min为间隔，对上室的T细胞进行24 h成像记录。通过Incucyte趋化迁移分析模块软件对上室T细胞总面积的变化情况进行分析，以反映T细胞的趋化迁移能力(从上室迁移至下室的细胞越多，上室的细胞数量和相应的细胞总面积越小，趋化迁移能力越强)。

结果如图12所示，在24 h内，未加入CCL2诱导的BN001、BN003、BN004和BN009的迁移效率没有显著差异(图12中的A)；当在下室培养基中加入100 ng/ml CCL2后，BN004向下室的迁移效率与BN001没有显著差异，但BN003和BN009细胞的迁移效率都显著高于BN001(图12中的B)，且BN009的迁移效率最高。从该迁移曲线可知，加入CCL2后，BN003中趋化迁移的程度是逐渐缓慢提高的，而BN009中发生迁移的程度则是在约6 h开始出现显著提高，说明BN009能以更灵敏的方式响应CCL2的诱导而进行更高效的趋化迁移，联合表达CCL2和CD40L可以有效提升BN009向高浓度CCL2的趋化迁移能力。

此外，虽然BN009和BN003都表达CCR2b，而原本认为CD40L和NKG2D胞外域等结构对于趋化迁移能力无实质性影响(图12B中，BN001和BN004向高浓度CCL2的趋化迁移能力基本差别)，图12B的结果出乎意料地显示：NKG2D胞外域的CAR分子与CCR2b及CD40L同时联合表达于CAR-T细胞所制备的BN009，居然具有显著优于BN003的高浓度CCL2的趋化迁移能力(如图12B中10-24小时的数据)。

实施例5 CAR-T细胞的体外功能

(a)通过EuTDA法检测杀伤效果

用AIM-V培养基清洗靶细胞一次。将靶细胞密度调节至1 × 10⁶/ml，并以2 μl/ml的用量加入DELFIA BATDA Reagent混匀，37°C下孵育30 min。用AIM-V培养基清洗靶细胞三次后，以1 × 10⁴/孔的密度将靶细胞接种于96孔板中。加入100 μl T细胞，并置于二氧化碳培养箱培养2 h(培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%)。最后，以500 × g离心5 min，取20 μl上清液转移至加有Europium solution(200 μl/孔)的96孔板中。室温孵育15 min后，在酶标仪中检测。

结果如表1和图13所示，与Ctrl T相比，BN001、BN003、BN004和BN009对各靶细胞都有显著的杀伤效果。与BN001相比，BN003和BN004对各靶细胞的杀伤率没有显著提升，而BN009的杀伤率则显著高于BN001(P＜0.05)。

为分析在CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的过程中，同时联合表达CCR2和CD40L是否对杀伤效果有协同增效作用，统计BN003、BN004、BN009相对于BN001的杀伤率提升幅度(提升幅度=相应CAR-T细胞杀伤率-BN001杀伤率)。结果如表2所示，BN009对各靶细胞杀伤效果的提升幅度均高于BN003和BN004提升幅度之和，说明在CAR-T细胞中同时联合表达CCL2和CD40L对杀伤效果有协同增效作用，显著优于在CAR-T细胞中单独表达CCL2或CD40L的方案。

表1 EuTDA检测各NKG2D CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率(n=3)

表2 各NKG2D CAR-T细胞相对于BN001的杀伤率提升幅度(n=3)

*:当BN009的相对于BN001的提升幅度(即CCR2b及CD40L的总体提升幅度)大于“BN003提升幅度(CCR2b的提升幅度)+BN004提升幅度(CD40L的提升幅度)”之和，则表明存在协同效应。

检测细胞因子分泌

将Ctrl T、BN001、BN003、BN004和BN009分别与相应的靶细胞共培养于不含IL-2的AIM-V培养基中(效靶比为2.5:1)。24 h后，用ddH₂O溶解INF-γ标准品，室温放置15 ～ 20min保证充分溶解，将标准品按推荐梯度倍比稀释。吸取上述共培养的细胞上清，用ddH₂O进行2倍和20倍稀释。分别将标准品和实验样品加入相应反应孔中，每孔100 μl。室温孵育1～ 3 h后，配制1 × 清洗液，每孔用360 μl清洗液清洗4次，并将孔中液体拍干，每孔加入200 μl酶标检测抗体，室温孵育1 ～ 3 h。每孔用360 μl清洗液清洗4次，并将孔中液体拍干后，加入200 μl显色底物。室温避光孵育30 ～ 60 min后，每孔加入50 μl终止液，用酶标仪测定450 nm的吸光值。

结果如表3和图14所示，与Ctrl T细胞相比，BN001、BN003、BN004和BN009与各靶细胞共培养后都有显著的IFN-γ释放。对于SW480和SK-OV-3细胞，均未检测到BN003、BN004和BN009相对于BN001的IFN-γ释放水平的提高。对于LS174T细胞，BN004和BN009的IFN-γ显著高于BN001(P ＜ 0.05).对于HCT116和SK-OV-3，只有BN009的IFN-γ释放水平显著高于BN001(P ＜ 0.05)。上述结果说明，对于部分靶细胞，在CAR-T细胞中同时联合表达CCL2和CD40L可以显著提升IFN-γ的释放水平。

表3 ELISA检测各NKG2D CAR-T细胞的IFN-γ释放水平(pg/ml)

^*信号低于检测阈值。

实施例6 CAR-T细胞体内抑瘤功能

以LoVo为靶细胞，以BN001和BN009为效应细胞进行小鼠皮下移植瘤抑制效果测试。用免疫缺陷的B-NDG小鼠进行实验，以观察联合表达CCR2的NKG2D CAR-T细胞对肿瘤浸润和抑制效果。取6 ～ 8周龄的B-NDG小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)进行皮下瘤药效实验。共取24只小鼠进行实验，随机分为4组，每组6只，分别为溶媒对照组、Ctrl T对照组、BN001对照组、BN009实验组。

用胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的靶细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为2 × 10⁷/ml。在B-NDG小鼠右侧靠近腋下部位皮下注射100 μl细胞悬液，即每只小鼠接种2 × 10⁶的靶细胞，接种日记为第0天。

接种靶细胞后第7天(或肿瘤平均体积约为100 mm³时)，通过尾静脉分别注射CAR-T细胞(1 × 10⁷/只)、Ctrl T细胞(1 × 10⁷/只)和溶媒(100 μl/只)，注射受试物当天记为治疗的第0天。每周测量肿瘤大小和小鼠体重2～3次，在第3天、第10天、第28天采集血样，加入EDTA抗凝后，用qPCR检测血细胞中CAR-T细胞在小鼠体内的留存情况，通过ELISA检测INF-γ以监测细胞因子的释放水平。治疗28天后，对小鼠实施安乐死，取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢等组织称重，每组取2只小鼠的组织保存在80℃冰箱，用于提取DNA，检测CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润情况及其在各器官的分布情况；每组取2只小鼠的组织进行固定，用HE染色法检测肿瘤细胞的形态和用免疫组化检测组织中抗原的表达情况。

结果如表4所示，在注射CAR-T细胞后28天，溶媒对照组小鼠的平均肿瘤体积约为947 mm³，平均肿瘤负荷约为1.215 g；Ctrl T对照组小鼠的平均肿瘤体积约为895 mm³，平均肿瘤负荷约为1.192 g；BN001对照组小鼠的平均肿瘤体积约为1178 mm³，平均肿瘤负荷约为1.267 g；BN009实验组小鼠的平均肿瘤体积约为623 mm³，平均肿瘤负荷约为0.860 g。与BN001相比，注射BN009细胞的小鼠的平均肿瘤负荷显著下降，下降幅度约为32.1%。

用qPCR检测肿瘤组织中的LTR序列，以衡量CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润情况。结果发现，溶媒对照组小鼠的肿瘤组织内LTR的平均本底信号水平为8.18 copies/μg DNA；Ctrl T对照组小鼠的肿瘤组织内LTR的平均本底信号水平为42.86 copies/μg DNA；BN001对照组小鼠的肿瘤组织内平均LTR含量为2055.38 copies/μg DNA；BN009实验组小鼠的肿瘤组织内平均LTR含量为3872.70 copies/μg DNA。与BN001相比，BN009向小鼠的皮下移植瘤组织的归巢能力获得显著提升，提升幅度约为88.4%。

表4 体内药效实验中CAR-T抑瘤效果与归巢情况

讨论

在针对结直肠癌等实体瘤的CAR-T治疗中，主要识别的靶点有CD133、CEA、EGFR、HER-2和NKG2D配体等。其中，NKG2D配体包括MICA、MICB、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP-5和ULBP-6，广泛表达于多种肿瘤细胞中。NKG2D(又称CD314)是天然免疫系统中的一个重要的激活性受体，主要表达于自然杀伤细胞、γδT细胞和CD8+ T细胞的表面。以NKG2D作为CAR分子的抗原识别结构域具有众多优点。与针对单一靶点的特异性抗体CAR分子不同，基于NKG2D改造获得的CAR分子可以识别上述8种不同的NKG2D配体，更有利于治疗于异质性高或容易丢失靶点抗原的肿瘤。另外，这些NKG2D配体都位于靶细胞表面。因此，与TCR-T相比，NKG2D CAR-T不需要MHC分子的抗原呈递过程即可直接识别肿瘤细胞。重要的是，NKG2D配体在结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、白血病等上皮源性的肿瘤细胞上有高水平表达，但在正常细胞中不表达或者表达水平极低，是肿瘤特异性治疗的理想靶点。此外，NKG2D CAR-T细胞表面不携带任何外来的可能引发患者免疫反应的蛋白结构，从而降低了CAR-T细胞被患者免疫系统排斥的可能性。

实体瘤细胞可以通过分泌趋化因子CXCL12和CXCL5，阻止CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移和浸润。相反，实体瘤细胞较少分泌可促进CAR-T细胞迁移的趋化因子。这两个因素使CAR-T细胞难以到达实体瘤部位。因此，提高CAR-T细胞对肿瘤趋化因子的特异性识别和灵敏度是影响CAR-T治疗效果的关键因素之一，而在CAR-T细胞中联合表达趋化因子受体是解决改问题的重要方法。趋化因子是一类特殊的细胞因子，包含50多个成员。根据结构分为CC、CXC、CX3C和XC四类；趋化因子受体则相应分为CCR、CXCR、CX3CR和XCR4种，约有20个成员。趋化因子的一种主要作用机制是通过形成可溶性的或固定于基质中的浓度梯度来诱导免疫细胞的定向迁移，从而调免疫细胞在组织中的浸润。目前，有部分CAR-T技术已采用联合表达趋化因子受体的方式来促进CAR-T细胞快速迁移至癌细胞处，从而提高CAR-T细胞的肿瘤治疗效果。不同类型的实体瘤释放的趋化因子的种类和水平都不尽相同，也有不同的免疫逃逸机制。因此，针对特定癌种选择适合的靶点抗原，再联合表达合适的趋化因子受体，是提高这类型CAR-T细胞治疗效果的关键。

本发明通过特定CAR分子和特定趋化因子受体以及CD40L的特定组合，既高效解决了靶向恶性肿瘤病灶的问题，又有效克服了恶性肿瘤异质性的问题，并实现了协同的优异的治疗效果。

一方面，本发明通过CCR2b作为联合表达的趋化因子受体，提高了CAR-T细胞向恶性肿瘤病灶的迁移能力，从而提升了治疗效率。CCR2b主要识别的趋化因子CCL2在结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中有异常的高表达，且在正常组织细胞中表达水平极低。同时，CCR2b与CCL2的亲和力极高(约为0.7 nM，IC₅₀数值越小，对应的亲和力和灵敏度越高)，灵敏度远高于其他趋化因子受体和趋化因子的组合(如CCR2a/CCL2组合的IC₅₀数值约为5 nM,CXCR3/CXCL11的组合C₅₀数值约为8.2 nM)。

另一方面，本发明采用NKG2D作为CAR分子的胞外识别结构域，可以识别肿瘤细胞表面的多种靶点抗原(包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6)，可降低因肿瘤异质性或抗原丢失而降低疗效的风险，更有利于提高对结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤的治疗效果。因此，本发明进一步提升了治疗的有效性，提高了CAR-T细胞等免疫细胞对抗恶性肿瘤的高度异质性的能力。同时，研究还表明NKG2D CAR-T也会靶向肿瘤微环境中的免疫抑制细胞和新生血管，有助于T细胞等免疫细胞克服免疫抑制的肿瘤微环境，提高肿瘤治疗的效果。

再一方面，本发明采用CD40L作为第二辅助因子，以便更有效地激活机体内源的天然和适应性免疫应答。通过CD40L激活T细胞的增殖和细胞因子的释放，诱导M2谱系的巨噬细胞向具有抗肿瘤活性的M1谱系的巨噬细胞转变等，同时提高T细胞对某些抗原丢失但CD40高表达的肿瘤细胞的杀伤作用。此外，出乎意料的是，在本发明中，当本发明NKG2D CAR分子、外源CCR2b蛋白和外源CD40L蛋白的联合表达时，可协同地显著提高针对肿瘤细胞的体外杀伤作用。

综上，本发明提供一种新颖的更高效的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)，它可对结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性实体肿瘤进行高效趋化迁移，可有效激活内源的免疫系统，并有效对抗肿瘤异质性的CAR-T细胞。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外，应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 广州百吉生物制药有限公司

<120> 联合表达CCR2b和CD40L的工程化免疫细胞及其制备和应用

<130> P2021-2173

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser

1 5 10 15

Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr

20 25 30

Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu

35 40 45

Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly

50 55 60

Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn

65 70 75 80

Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys

85 90 95

Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln

100 105 110

Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met

115 120 125

Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp

130 135 140

Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile

145 150 155 160

Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro

165 170 175

Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr

180 185 190

Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

210 215

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser

1 5 10 15

Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys

20 25 30

His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu

35 40 45

Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val

50 55 60

Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro

85 90 95

Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met

100 105 110

Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile

115 120 125

Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His

130 135 140

Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr

145 150 155 160

Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile

165 170 175

Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro

180 185 190

Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile

195 200 205

Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly

210 215 220

Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg

225 230 235 240

Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp

245 250 255

Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe

260 265 270

Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln

275 280 285

Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile

290 295 300

Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val Phe Phe

305 310 315 320

Arg Lys His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr

325 330 335

Arg Glu Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser Thr Gly

340 345 350

Glu Gln Glu Val Ser Ala Gly Leu

355 360

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser

20

<210> 4

<211> 144

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

<210> 5

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

35 40

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg

20 25 30

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

Claims (10)

1.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞具有以下特征：

(a) 所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物，其中所述CAR的抗原结合结构域包括NKG2D的胞外结构域；

(b) 所述的免疫细胞表达外源的CCR2b蛋白；和

(c) 所述的免疫细胞表达外源的CD40L蛋白。

2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述CAR的结构如式I所示：

L-NKG2D-H-TM-C-CD3ζ (I)

式中，

L为无或信号肽序列；

NKG2D为NKG2D胞外结构域或其活性片段；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号结构域；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

所述“-”为连接肽或肽键。

3.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述NKG2D的胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第73-216位所示。

4.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述CCR2b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或

所述CD40L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5.一种制备权利要求1所述的工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A) 提供一待改造的免疫细胞；和

(B) 对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的CAR分子以及外源的CCR2b蛋白和外源的CD40L蛋白，从而获得权利要求1所述的工程化免疫细胞。

6.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

7.一种如权利要求1所述的工程化免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备可预防和/或治疗癌症的药物或制剂。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：结肠癌、直肠癌、卵巢癌、或胰腺癌。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为NKG2D配体高表达和/或趋化因子高表达和/或CD40高表达的肿瘤。

10.一种用于制备权利要求1所述的工程化免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1) 第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒，其中所述CAR的抗原结合结构域为NKG2D的胞外结构域；

(2) 第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达CCR2b的第二表达盒；和

(3) 第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于联合表达CD40L的第三表达盒。

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