CN115873802A - 嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用 - Google Patents

嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用。本发明的嵌合抗原受体免疫细胞表面表达靶向特异性抗原的受体，同时表达信号转换蛋白，该信号转换蛋白是含显性失活受体TGFBR2胞外元件和IL‑7Rα胞内元件的融合蛋白。本发明的嵌合抗原受体免疫细胞，可通过信号转换蛋白将肿瘤微环境中不利于免疫细胞存活的TGF‑β免疫抑制因子的抑制信号进一步转化成细胞因子激活信号，从而显著增强免疫细胞的存活并肿瘤杀伤作用更为持续。

Description

嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞治疗领域，更具体涉及一种具有将肿瘤微环境抑制信号转换成激活性信号功能的靶向实体瘤和血液瘤的工程化免疫细胞。
背景技术
淋巴细胞疗法目前主要有αβT细胞疗法、NK细胞疗法，包括自体的和异体的免疫疗法。
自体免疫疗法采用病人的免疫细胞，而异体免疫疗法采用同种异体对象(如健康人)的免疫细胞。对所需的免疫细胞进行体外培养、基因编辑和扩增后回输病人体内，使这些细胞以非MHC限制方式识别肿瘤细胞，激活增强机体免疫，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗或缓解疾病的目的。
针对肿瘤相关抗原靶点(TAA)，已经开发了一些免疫疗法，此类疗法包括LAK、DC、CIK、DC-CIK、TCR-T、CAR-T、NK、CAR-NK等等。其中CAR-T细胞免疫疗法包括自体和通用型CAR-T疗法，通用型CAR-T具有同种异体、off-the-shelf等优势，利用通用型CAR-T治疗血液瘤和实体瘤的市场前景十分可观，但还有很多问题尚待解决。目前，免疫治疗血液瘤已有突出的疗效，而在实体瘤中疗效并不理想。主要原因包括三方面，一是安全的肿瘤特异性抗原靶点，二是实体肿瘤的异质性，三是存在复杂的肿瘤细胞微环境等因素，包括免疫抑制细胞Tregs和MDSCs等以及免疫抑制因子的存在，不利于免疫细胞存活，从而抑制免疫治疗效果。
综上所述，本领域迫切需要开发更有效、更持续的靶向实体瘤的免疫疗法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种更有效、更持续的可靶向实体瘤、血液瘤的嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞具有以下特征：
(a)所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物；和
(b)所述的免疫细胞表达外源的信号转换蛋白，并且所述信号转换蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜上，并且具有免疫抑制性受体的胞外结构域、跨膜区(或跨膜结构域)和免疫激动性受体的胞内结构域。
在另一优选例中，所述的免疫抑制性受体为TGF-β受体。
在另一优选例中，所述的免疫激动性受体选自下组：IL-7受体、IL-15受体、IL-12受体、IL-2受体、IL-18受体、IL-21受体，或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫激动性受体为IL-7受体。
在另一优选例中，所述的跨膜区来自免疫抑制性受体、或免疫激动性受体、或其组合。
在另一优选例中，所述的跨膜区不来自免疫抑制性受体，也不来自免疫激动性受体。
在另一优选例中，所述的跨膜区和胞外结构域来自相同或不同的免疫抑制性受体。
在另一优选例中，所述的跨膜区和胞内结构域来自相同或不同的免疫激动性受体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括自体或异体的αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体αβT细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体γδT细胞(CAR-T细胞)；
(iii)嵌合抗原受体NKT细胞(CAR-NKT细胞)；
(iv)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。
在另一优选例中，如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，其中所述的CAR具有式Ia或Ib所示结构：
L1-scFv-H-TM1-C-CD3ζ (Ia)
L1-scFv-H-TM1-C-CD3ζ-(A-S)n1-A-E-(A-S)n2 (Ib)
式中，
L1为无或信号肽序列；
scFv为靶向抗体的单链可变结构域；
H为无或铰链区；
TM1为跨膜结构域；
C为共刺激信号结构域；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；
A为自剪切2A肽；
S为其他的外源重组蛋白；
n1或n2各自独立地为0或1；
E为信号转换蛋白；
所述“-”连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述L1分别选自下组蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，L1为CD8蛋白的信号肽。
在另一优选例中，所述scFv分别靶向间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2，或其组合。
在另一优选例中，scFv靶向P4人特异性间皮素。
在另一优选例中，所述H选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG，或其组合。
在另一优选例中，H为CD8蛋白的铰链区。
在另一优选例中，所述TM1选自下组蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，TM1为CD28蛋白的跨膜区。
在另一优选例中，所述C选自下组蛋白的共刺激结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD-1、Dap10、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、2B4、TLR，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，C为CD28蛋白的共刺激结构域。
在另一优选例中，A为P2A、T2A，或其组合；
在另一优选例中，所述S选自下组：IL-15突变体-IL-15Ra、mbIL-15、IL-12p40、IL-2、IL-18、IL-21等，或其组合。
在另一优选例中，S为IL-15突变体-IL-15Ra。
在另一优选例中，所述的S具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述E可以是组成型表达或诱导型表达。
在另一优选例中，如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，其中所述的信号转换蛋白具有式V所示结构：
L2-Z1-TM2-Z2 (V)
式中，
L2为无或信号肽序列；
Z1为免疫抑制性受体的胞外结构域；
TM2为跨膜区；
Z2为免疫激动性受体的胞内结构域；
所述“-”连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述的免疫抑制性受体选自下组：TGF-受体及其亚型或其组合(包括野生型、或其突变体/修饰体)。
在另一优选例中，所述的TGF-β受体为TGFBR2受体。
在另一优选例中，TGFBR2受体包括：TGFBR2受体isoform A或TGFBR2受体isoformB。
在另一优选例中，L2为免疫抑制性受体的信号肽序列。
在另一优选例中，L2为TGFBR2受体的信号肽序列。
在另一优选例中，所述的L2具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的Z1选自下组TGF-β受体的胞外结构域：TGFBR2受体isoform A或TGFBR2受体isoform B。
在另一优选例中，所述的Z1具有SEQ ID NO.:3或SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，TM2选自IL-7受体、IL-15受体、IL-12受体、IL-2受体、IL-18受体、IL-21受体，或其组合。
在另一优选例中，TM2为IL-7受体及其亚型或其组合(包括野生型、或其突变体/修饰体)的跨膜区。
在另一优选例中，所述的IL-7受体为IL-7Rα。
在另一优选例中，TM2选自IL-7Rα、IL-7Rα突变体的跨膜区。
在另一优选例中，所述的TM2具有SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的免疫激动性受体选自下组：IL-7受体及其亚型或其组合(包括野生型、或其突变体/修饰体)。
在另一优选例中，所述的IL-7受体为IL-7Rα。
在另一优选例中，Z2为IL-7Rα的胞内结构域。
在另一优选例中，所述的Z2具有SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，其中所述编码信号转换蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第523-933位、SEQ ID NO.:9中第523-908位、SEQID NO.:10中第523-936位、SEQ ID NO.:11中第523-911位、SEQ ID NO.:16中第937-1347位、SEQ ID NO.:17中第937-1350位所示。
在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T细胞具有以下一个或多个特征：
(a)所述细胞表达嵌合抗原受体CAR，所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物；和
(b)当所述CAR-T细胞接触诱导剂时，所述CAR-T细胞诱导表达信号转换蛋白。
在另一优选例中，在所述的CAR细胞中，CAR和信号转换蛋白是串联表达的。
在另一优选例中，在所述的CAR细胞中，CAR和信号转换蛋白各自独立地表达的。
在另一优选例中，所述“激活”指所述CAR与肿瘤细胞的表面标志物结合。
在另一优选例中，所述“肿瘤的表面标志物”指肿瘤表面的特异性抗原。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR定位于所述工程化免疫细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR定位于所述CAR-T细胞的细胞膜。
在另一优选例中，所述的信号转换蛋白定位于所述CAR-T细胞的细胞膜。
在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(a)提供一待改造的免疫细胞；和
(b)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的CAR分子和外源的信号转换蛋白，从而获得本发明第一方面所述的工程化免疫细胞。
在另一优选例中，在步骤(b)包括：
(b1)将表达所述CAR的第一表达载体导入所述免疫细胞；和(b2)将表达信号转换蛋白的第二表达载体导入所述免疫细胞；
其中所述的步骤(b1)可在步骤(b2)之前、之后、同时，或交替进行。
在另一优选例中，所述的第一表达载体和第二表达载体是相同或不同的表达载体。
在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、质粒。
在另一优选例中，所述的CAR具有式Ia或Ib所示结构。
在另一优选例中，当步骤(a)中的待改造的免疫细胞已经表达CAR时，则在步骤(b)中，包括(b2)将表达信号转换蛋白的第二表达载体导入所述免疫细胞。
在另一优选例中，所述的第一表达载体和第二表达载体的转录方向是同向的(→→)、相向的(→←)、相背的(←→)。
在另一优选例中，所述的第一表达载体、第二表达载体位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达载体、第二表达载体位于同一载体。
在另一优选例中，当所述的第一、第二表达载体位于同一载体时，在所述第一、第二表达载体之间，还包括用于表达自剪切2A肽的第三表达载体。
在另一优选例中，所述自剪切2A肽为P2A、T2A，或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体，较佳地所述病毒载体含有串联形式的第一和第二表达载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统，或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为FUW系列慢病毒载体。
在本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂含有本发明所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)的浓度为1×103-1×108个细胞/mL，较佳地1×104-1×107个细胞/mL。
在本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的用途，可用于制备可预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，提供了如本发明第一方面所述的CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述制剂含有CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：实体瘤、血液瘤、淋巴瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤表达选自下组的标志物：间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSMA、Her2、5T4、EGFR、CD20、NY-ESO-1，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：卵巢癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、间皮素瘤等。
本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达信号转换蛋白的第二表达盒。
在另一优选例中，提供了一种用于制备本发明所述的CAR-T细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达信号转换蛋白的第二表达盒。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列为独立的或相连的。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述的第一、第二核酸序列位于同一载体。
在另一优选例中，当所述的第一、第二核酸序列位于同一载体时，在所述第一、第二核酸序列之间，还包括第三核酸序列，所述第三核酸序列含有用于表达自剪切2A肽的第三表达盒。
在另一优选例中，所述自剪切2A肽为P2A、T2A，或其组合。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体，较佳地所述病毒载体含有串联形式的第一和第二核酸序列。
在本发明的第六方面，提供了一种重组的信号转换蛋白，所述信号转换蛋白为位于细胞膜上膜蛋白，并且具有免疫抑制性受体的胞外结构域、跨膜区(或跨膜结构域)和免疫激动性受体的胞内结构域。
在另一优选例中，所述的信号转换蛋白如本发明第一方面中所定义。
在本发明的第七方面，提供了一种核苷酸序列，所述的核苷酸编码如本发明第六方面所述的信号转换蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第七方面所述的核苷酸序列。
在本发明的第九方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第八方面所述的载体，或宿主细胞基因组中整合有如本发明第七方面所述的核苷酸序列。
在本发明的第十方面，提供了一种制备如本发明第六方面所述的信号转换蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)培养如本发明第九方面所述的宿主细胞，从而表达如本发明第六方面所述的信号转换蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了MesoCAR01、02、03、04、09、10以及E1m1质粒编码的蛋白序列简图。其中，以图1F为例，CAR序列用下划线，T2A为粗体，信号肽TGFBR2为斜体，TGFBR2(TGFBRIIisoform A NP_001020018.1)胞外区用着重号(.)标出，IL-7Rα(NP_002176.2)跨膜区用粗体和下划线标出，IL-7Rα胞内区用双下划线标出。图1G-1L用类似方式表示。
图2显示了CAR-T表面蛋白的表达(MSLN、TGFBR2、IL-15R)。
图3显示了冻融后CAR-T增殖率、存活率和CAR阳性率。
图4显示了体外瞬时杀伤(RTCA方法，Target：OVCAR3和HCC70)的效果。
图5显示了pSTAT5 signaling(+/-TGF-β1)的结果。
图6显示了CAR-T与靶细胞共培养后，分析CAR-T细胞凋亡情况，图中显示AnnexinV staining结果。
图7显示了体外药效实验-多轮杀伤(A.设计方案，B.杀伤率，C.CAR+阳性率，D.CAR+T细胞扩增，E.Exhaustion Marker)的效果。
图8显示了体外药效实验-多轮杀伤(+TGF-β1Target：MDA-MB231-E10)A.设计方案，B.第四、五轮持续体外杀伤实验：细胞杀伤率，阳性率和阳性细胞数，C.比较不同CAR-T细胞在多轮杀伤时增殖率，D.PD-1表达)的效果。
图9显示了体内药效实验(OVCAR3)的效果。TGI表示tumor growth inhibition。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次将CAR结构和信号转换蛋白(如将CAR的基本结构及TGFBR2胞外区和IL-7Rα胞内区)联合表达于CAR-T细胞中。体内外实验显示，显性失活受体TGFBR2的胞外结构，能有效阻断或者减少TGF-β信号传导，保护CAR-T细胞，对抗免疫抑制环境的影响；IL-7Rα胞内结构域可进一步将抑制信号转化为细胞因子信号，改善CAR-T的增殖能力、耗竭程度和持续性，增加疗效。
与现有技术相比，本发明的免疫细胞既能通过CAR识别靶抗原(如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞表面的多种靶点抗原，包括但并不限于：间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2等)，从而靶向实体瘤、血液瘤、淋巴瘤等的病灶；同时又能通过信号转换蛋白，将肿瘤微环境中不利于免疫细胞存活的TGF-β免疫抑制因子的抑制信号进一步转化成细胞因子激活信号，增强免疫细胞的存活和肿瘤杀伤的持续作用，减少肿瘤复发。在此基础上完成了本发明。
本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞(或T细胞可替换为NK细胞)。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、瘤内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“跨膜结构域”、“跨膜区”可互换使用，指用于连接膜蛋白的胞外结构域和胞内结构域的连接序列，通常该跨膜区整体或大部分处于细胞膜中。常见的膜蛋白的跨膜区是已知的或可用常规方法确定。
术语“TGF-β受体”、“TGF-βR”、“TGFBR”、“TGFBR受体”可互换使用，指转化生长因子-β受体，许多细胞表面都有TGF-β受体，存在着Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种形式，其中Ⅰ、Ⅱ型TGF-βR均为糖蛋白，Ⅲ型受体是一种蛋白聚糖。
抗体
如本文所用，术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
抗原结合结构域
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。
肿瘤相关抗原
以间皮素(mesothelin,MSLN)为例，间皮素是一种常见的肿瘤相关抗原(TAA)。有文献报道，间皮素高表达于卵巢癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞，正常组织中有限表达。间皮素作为有效的免疫治疗靶点，其抗体和靶向间皮素的嵌合抗原抗体等免疫治疗方法都有报道。
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用，嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)包括细胞外结构域、任选的铰链区、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括任选的信号肽和靶点特异性结合结构域(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激结构域和CD3ζ链部分。CAR在T细胞中表达时，胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子如IL-2和IFN-γ等，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)
如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-T细胞。本发明CAR-T细胞可用于治疗间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2等高表达的肿瘤，如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等。
CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)
如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2等高表达的肿瘤，如卵巢癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等。
自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有以下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。
TGF-β及其受体
如本文所用，术语“TGF-β”指Transforming growth factor beta。应理解，所述术语包括野生型和突变型TGF-β。在本发明中，TGF-β包括人和非人哺乳动物的TGF-β。
如本文所用，术语“TGF-β受体”指Transforming growth factor beta receptor。
已有文献证实，卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤细胞分泌大量的TGF-β细胞因子，该因子作为免疫抑制因子，能明显抑制T细胞的活化增殖，促进其分化成Tregs，降低其效应功能。
信号转换蛋白
如本文所用，术语“信号转换蛋白”(signaling convertor，简称Sc)、“信号转换受体”、或“本发明的信号转换蛋白”可互换使用，指串联表达的显性失活受体TGFBR2的胞外域和IL-7Rα蛋白胞内元件所构成的融合蛋白。出乎意料地，本发明的信号转换蛋白能将肿瘤微环境中不利于免疫细胞存活的TGF-β免疫抑制因子的抑制信号转化成激活信号，以增强免疫细胞存活和肿瘤杀伤的持续作用，提高免疫疗法的效果，减少肿瘤复发。
根据TGFBR2胞外结构域的类型和连接胞外结构域与胞内结构域的跨膜区类型的不同，即式V中Z1与TM2的不同组合，将信号转换蛋白分为不同类型或亚型。如表1所示，基于Z1与TM2的组合，一些代表性的类型包括(但并不限于)：
表1
信号转换蛋白类型 Z1类型 TM2类型
Sc1型信号转换蛋白 TGFBR2 isoA IL-7Rα
Sc2型信号转换蛋白 TGFBR2 isoB IL-7Rα
Sc3型信号转换蛋白 TGFBR2 isoA IL-7Rα突变体
Sc4型信号转换蛋白 TGFBR2 isoB IL-7Rα突变体
表达盒
如本文所用，“表达盒”或“本发明表达盒”包括第一表达盒和第二表达盒。本发明表达盒如本发明第五方面所述，第一表达盒包含编码所述CAR的核酸序列。所述第二表达盒表达外源的信号转换蛋白。
在本发明中，信号转换蛋白可以是组成型表达或诱导型表达。
在诱导表达情况下，在所述CAR-T细胞被相应诱导剂激活时，第二表达盒表达信号转换蛋白；这样，在本发明CAR-T细胞在未接触相应诱导剂时，第二表达盒不表达信号转换蛋白。
在一个实施方式中，所述第一表达盒和第二表达盒分别还包括启动子和/或终止子。第二表达盒的启动子可以为组成型或诱导型启动子。
载体
本发明还提供了含有本发明表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定地整合于细胞基因组中并随子细胞基因组的复制而复制。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，且具有低免疫原性的优点。
通常，可通过常规操作将本发明的表达盒或核酸序列连接至启动子下游，并将其并入表达载体。该载体可整合至真核细胞基因组中并随之复制。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达载体也可用于标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。
所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体等。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等,Cold SpringHarbor Laboratory,New York,2001)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含至少一种在有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经有许多基于病毒的系统被开发出来，并用于哺乳动物细胞的基因转导。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒随后可被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。许多DNA病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些元件位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个元件被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，能够在需要时，启动连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或在不需要时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报告基因中的任一个或两者，以便于通过病毒载体从被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记基因和报告基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neomycin等等。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、阳离子复合物转染法、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等,ColdSpring Harbor Laboratory,New York,2001)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体法转染法和阳离子复合物聚乙烯亚胺转染法。
将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。例如见美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂类物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的工程化免疫细胞(如CAR-T细胞)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/mL，更优地1×104-1×107个细胞/mL。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括含本发明表达盒的载体(如慢病毒载体)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的表面标志物并表达信号转换蛋白，协同而显著地提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
因此，本发明也提供了刺激靶向哺乳动物肿瘤细胞群或组织的T细胞所介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式使移植物抗宿主反应的发生概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续控制肿瘤的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳定的体内扩增并可持续数月至数年的时间。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中，CAR-T细胞可诱导对CAR抗原结合结构域所识别的抗原的高表达肿瘤细胞的特异性免疫应答。例如，本发明的CAR-T细胞引起针对NKG2D配体高表达的肿瘤细胞的特异性免疫应答。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于：卵巢癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等。
通常地，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防肿瘤等疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-T细胞。
本发明的CAR-T细胞可被单独给予或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度等因素确定，或可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至107个细胞/kg体重的剂量(包括范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象容易地确定，并以此调整治疗。
对象组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×105个至1×1010个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点
1.本发明免疫细胞同时含有CAR和信号转换蛋白，从而可更高效地激活免疫细胞。
2.本发明的信号转换蛋白，不仅能够有效阻断或减少TGF-β免疫抑制因子对T细胞的抑制信号(包括TGF-β抑制T细胞的增殖及诱导细胞凋亡等)，在此基础上还能将TGF-β免疫抑制信号进一步转化成细胞因子激活信号，从而延长CAR-T细胞在体内存活时间，并有效持续杀伤肿瘤细胞，减少肿瘤复发。
3.与不含有信号转换蛋白的CAR-T细胞相比，本发明免疫细胞在抗原刺激情况下，表现出较低表达耗竭性蛋白PD-1，减少肿瘤治疗中出现的免疫抑制，明显延长免疫细胞存活时间，疗效更佳。
4.本发明的CAR-T细胞共表达转换蛋白的胞内分子还可以是其他的外源重组蛋白胞内结构域(如IL-15R、IL-12Rα、IL-2Rα、IL-18R、IL-21R等)，能够将TGFβ免疫抑制信号并将转化成激活信号，并发挥相应的功能。
5.以含有胞外TGFBR2和IL-7Rα胞内区的信号转换蛋白为例，不仅其自身可以将抑制转为激活，并且还可与其他的外源重组蛋白(如IL-15突变体-IL-15Ra融合蛋白、mbIL-15、IL-12p40、IL-2、IL-18、IL-21等)一起导入免疫细胞，发挥相应的功能，并不干扰CAR结构的功能，如对CAR-T细胞的扩增、活率及阳性率无不利影响，甚至有促进作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料与方法
CAR分子及其结构
在实施例中，所构建的CAR分子均为Meso-CAR，即靶向间皮素的CAR分子。Meso-CAR分子的构成选自以下结构：信号肽[简称SP]、靶向间皮素的单链可变结构域[简称P4scFv]、CD8铰链区[简称CD8H]和CD28跨膜结构域[简称28TMD]、CD28共刺激信号结构域[简称28CSD]、CD3ζ胞浆信号传导序列[简称CD3ζ]、自剪切2A肽(P2A、T2A，或其组合)、信号转化蛋白[简称Sc型](Sc1型、Sc2型、Sc3型、Sc4型)、免疫抑制性受体的信号肽序列(TGFBR2 SP)、免疫抑制受体胞外结构域(TGFBR2 isoA、TGFBR2 isoB)、其他的外源重组蛋白IL-15突变体-IL-15Ra融合蛋白[简称IL-15m1/IL-15Ra]的相关结构(IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、连接肽Linker、IL-15Ra)，或其组合。
其中，作为对照的第二代不表达任何细胞因子的Meso-CAR分子命名为MesoCAR。
在第二代Meso-CAR分子基础上还额外表达IL-15突变体-IL-15Ra融合蛋白的第四代Meso-CAR分子命名为E1m1。在第二代Meso-CAR分子基础上还联合表达信号转换蛋白，或仅联合表达信号转换蛋白其中部分结构的第四代Meso-CAR分子，根据其从氨基端至羧基端结构中TGFBR2胞外结构域的类型和连接胞外结构域与胞内结构域的跨膜区类型的不同，即式V中Z1与TM2的不同组合，分别命名为MesoCAR01-MesoCAR10。所述不同类型CAR分子其结构具体如实施例3中表2所示。
氨基酸序列
SEQ ID NO.:1(S元件：IL-15m1-IL-15Ra)
MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
SEQ ID NO.:2(L2元件：TGFBR2受体的信号肽序列)
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS
SEQ ID NO.:3(Z1元件：选自TGFBR2受体isoform A的胞外结构域)
TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:4(Z1元件：选自TGFBR2受体isoform B的胞外结构域)
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:5(TM2元件：选自IL-7Rα的跨膜区)
PILLTISILSFFSVALLVILACVLW
SEQ ID NO.:6(TM2元件：选自IL-7Rα突变体的跨膜区)
PILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW
SEQ ID NO.:7(Z2元件：IL-7Rα的胞内结构域)
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:8(MesoCAR01氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:9(MesoCAR02氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:10(MesoCAR03氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:11(MesoCAR04氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:12(MesoCAR05氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:13(MesoCAR06氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:14(MesoCAR07氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:15(MesoCAR08氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLEGRGSLLTCGDVEENPGPGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ
SEQ ID NO.:16(MesoCAR09氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:17(MesoCAR10氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
SEQ ID NO.:18(E1m1氨基酸序列)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL
实施例1 从供体血液中分离PBMC和扩增T细胞
从外周血中分离单核细胞，使用Ficoll进行密度梯度离心，并富集T细胞(Pan Tkit，美天旎)，使用CD3/CD28磁珠激活培养和扩增细胞，细胞培养体系采用x-vivo 15(5％FBS，300IU/mL rhIL-2)，细胞培养在37℃，5％CO2培养箱连续培养。
实施例2 细胞培养及构建
表达MSLN的细胞系：OVCAR3(人卵巢癌细胞系，ATCC HTB-161)，HCC70(人乳腺癌细胞系)。培养基按照ATCC指引配制。
实施例3 CAR结构设计与转导
本发明在第二代Meso-CAR分子上构建第四代Meso-CAR分子，Meso-CAR即靶向间皮素的CAR结构，基本结构包括信号肽、P4 scFV(特异性靶向人间皮素)、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激信号结构域，采用不同的胞内段共刺激信号，共构建了10种Meso-CAR，其具体结构组成如表2所示。
表2
Figure BDA0003288422860000251
Figure BDA0003288422860000261
其中，所述CAR分子从其氨基端至羧基端的具体结构如下：
MESOCAR由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ依次串联组成。
E1m1由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、P2A、IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、Linker、IL-15Ra依次串联组成。
MesoCAR01由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、Sc1型依次串联组成。
MesoCAR02由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、Sc2型依次串联组成。
MesoCAR03由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、Sc3型依次串联组成。
MesoCAR04由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、Sc4型依次串联成。
MesoCAR05由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、TGFBR2 SP、TGFBR2 isoA依次串联组成。
MesoCAR06由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、TGFBR2 SP、TGFBR2 isoB依次串联组成。
MesoCAR07由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、TGFBR2 SP、TGFBR2 isoA、P2A、IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、Linker、IL-15Ra依次串联组成。
MesoCAR08由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、T2A、TGFBR2 SP、TGFBR2 isoB、T2A、IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、Linker、IL-15Ra依次串联组成。
MesoCAR09由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、P2A、IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、Linker、IL-15Ra、T2A、Sc1型依次串联组成。
MesoCAR10由SP、P4scFv、CD8H、28TMD、28CSD、CD3ζ、P2A、IL-15m1/IL-15Ra SP：IgE、IL-15m1、Linker、IL-15Ra、T2A、Sc3型依次串联组成。
其中，自剪切2A肽P2A、T2A可互换使用。
将上列Meso-CAR基因分别克隆至FUW慢病毒载体中，与慢病毒包装质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和psPAX2(Addgene，Plasmid#12260)使用PEI转染试剂转入293T细胞中，表达载体，分别收集48小时和72小时病毒，超离浓缩后，感染激活T细胞。
实施例4 CAR-T细胞制备——慢病毒感染、CAR阳性率检测和体外增殖
原代T细胞在激活48小时后，分别加入实施例3中浓缩的慢病毒，细胞感染72小时后检测CAR阳性率，分别使用MSLN抗原、TGFBR2及IL-15R抗体检测。
流式结果见图2，4种CAR-T细胞的CAR表达都在10％以上，MesoCAR01、MesoCAR02和MesoCAR10 CAR细胞表面都同时表达TGFBR2和MSLN CAR，其中MesoCAR10 CAR细胞表面同时表达TGFBR2、IL-15R和MSLN CAR。
转染后T细胞置于37℃，5％CO2培养箱中连续培养，培养基使用x-vivo15+300IUIL-2+5％FBS,隔天补液，在Day10收获细胞。细胞冻存后复苏，继续培养,每2-3天测CAR阳性率、活率和计数，计算CAR阳性细胞增殖率，实验结果如图3所示，复苏后Day0-Day7，MESOCAR与表达信号转换蛋白MesoCAR01 CAR-T细胞扩增、细胞活率和CAR阳性率无明显差异。
实施例5 细胞体外杀伤
对实施例4中收获的T细胞进行体外杀伤实验。通过RTCA方法，将CAR-T细胞与靶细胞按3：1、1：1、1：3共孵育，连续培养1-2天，实时记录靶细胞生长状况，检测细胞的存活率，即得到CAR-T细胞的杀伤效率。
结果如图4所示，将CAR-T细胞MesoCAR01、MESOCAR分别与肿瘤细胞OVCAR3或HCC70进行共培养时(E:T＝3:1,1:1,1:3)，杀伤无明显差异。Non-transduced T cell(NT)分别与肿瘤细胞OVCAR3或HCC70进行共培养时(E:T＝3:1,1:1,1:3)对肿瘤细胞没有明显杀伤。
实施例6 pSTAT5
对实施例4中收获的T细胞进行体外杀伤实验，将CAR-T细胞与靶细胞OVCAR3按E:T＝1：1共孵育3小时，培养过程中分两组，分别为添加/不添加TGF-β1组，FACS检测各组细胞胞内pSTAT5的表达，计数其Mean MFI值。结果如图5所示，在有TGF-β1情况下，MesoCAR01的pSTAT5表达明显上调，而MesoCAR05的pSTAT5表达没有明显变化。说明MesoCAR01 CAR-T在TGF-β1处理0.5小时后,pSTAT5信号通路被明显激活，而MesoCAR05因其胞内不表达细胞因子传导信号，其pSTAT5信号通路未被激活。
实施例7 Annexin V staining
对实施例4中收获的T细胞进行体外杀伤实验，CAR-T细胞与靶细胞(MDA-MB231)按1：2共孵育，连续培养3天，培养过程中分两组分别为添加/不添加TGF-β1组，检测CAR-T细胞的凋亡情况。结果如图6所示，Annexin V和7-AAD双阴细胞，MesoCAR01 CAR-T活细胞比例最高，为80％，加入不同浓度TGF-β，其活率也没有明显变化，而MESOCAR组受TGF-β1诱导的凋亡细胞，随着TGF-β浓度升高，凋亡细胞明显增多。
实施例8 体外药效研究——多轮杀伤
对实施例4中收获的T细胞进行体外多轮杀伤实验。实验方法见示意图(图7A)，将CAR-T细胞与靶细胞按1：3共孵育，连续培养3天，显微镜下观察靶细胞的生长状况，在共孵育第四天，取一半细胞检测T细胞的表型及细胞数，胰酶消化靶细胞后，计数即得到CAR-T细胞的杀伤效率＝(对照组-实验组)/对照组*100％，余下一半细胞继续与新的靶细胞共培养，按上述方法连续杀伤数轮。
结果如图7B所示，各组CAR-T与OVCAR3共培养下(E:T＝1:3)，MesoCAR01在第三轮连续培养后显示明显杀伤优势，如图7C,7D显示MesoCAR01显示稳定的CAR阳性率和持续的细胞扩增率。如7E显示MesoCAR01在第三轮连续杀伤后，PD-1表达远低于MESOCAR。
实施例9 体外药效研究——TGF-β存在下多轮杀伤
对实施例4中收获的T细胞进行体外多轮杀伤实验。实验方案如图8A所示。将CAR-T细胞与靶细胞按1：5共孵育，培养过程中加入不同浓度重组TGF-β，每两天补加一次，连续培养3天，实时记录靶细胞生长状况，在共孵育第四天，取一半细胞检测T细胞的表型，细胞数，胰酶消化靶细胞后，计数即得到CAR-T细胞的杀伤效率＝(对照组-实验组)/对照组*100％，余下一半细胞继续与靶细胞共培养，按上述方法连续杀伤数轮。
结果如图8B所示，各组CAR-T与MDA-MB231-MSLN-E10(在MDA-MB231细胞上转染MSLN表达质粒，构建高表达MSLN的细胞系)共培养下(E:T＝1:5)，MesoCAR01在第四(R4)、五轮(R5)连续培养后显示明显杀伤优势，如图8B和8C显示稳定的CAR阳性率和细胞扩增率。
如图8D所示，MesoCAR01在第一、四轮连续杀伤后，PD-1表达明显低于MESOCAR，结果表明，对肿瘤治疗不利的免疫抑制作用被进一步降低。
实施例10 体内药效研究
选取NOD小鼠，皮下注射5E6 OVCAR3细胞，连续检测肿瘤负荷，待肿瘤处于高速生长时，分组，每组2-3只小鼠，分组后一天尾静脉注射200μL DPBS/鼠与3E6 CAR-T/鼠，CAR-T注射后Day1，取小量小鼠血检测CAR-T细胞体内存活数量，其后每周取一次血样，检测CAR-T细胞各种表型，每周两次检测皮下瘤大小。
结果如图9A所示，相比对照组，注射MESOCAR与MesoCAR01细胞的小鼠肿瘤负荷明显减小，其中MESOCAR组小鼠在CAR-T注射后20天，动物肿瘤体积回升，MesoCAR01组未复发。
图9B所示，注射CAR-T后，MESOCAR和MesoCAR01组动物的体重无明显变化。
图9C所示肿瘤生长抑制率，注射MESOCAR与MesoCAR01细胞的小鼠肿瘤抑制率明显高于对照组(NT，Vehicle)。
讨论
本发明构建了基于靶向肿瘤抗原(如人间皮素)的工程化免疫细胞，该工程化免疫细胞还表达TGFBR2和IL-7Rα融合所形成的融合蛋白，所述融合蛋白可作为信号转换蛋白，将阻断肿瘤微环境中免疫抑制信号，并将其转化成激活信号，从而显著和意外地增强免疫细胞存活和肿瘤杀伤作用。
在本发明中，具有靶向肿瘤抗原的CAR以及本发明信号转换蛋白(如TGFBR2和IL-7Rα的融合蛋白)的免疫细胞，能将TGF-β对T细胞的抑制信号(包括TGF-β抑制T细胞的增殖，诱导细胞凋亡和抑制炎症因子产生等)转化成激活信号，延长CAR-免疫细胞(如CAR-T细胞)在体内存活时间，抵御肿瘤微环境，有效并持续杀伤肿瘤细胞，减少肿瘤复发。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 亘喜生物科技（上海）有限公司
<120> 嵌合抗原受体免疫细胞及其制法和应用
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1220 1225 1230
Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr
1235 1240 1245
Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly
1250 1255 1260
Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser
1265 1270 1275
Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln
1280 1285 1290
Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro
1295 1300 1305
Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala
1310 1315 1320
Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu
1325 1330 1335
Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
1340 1345 1350
<210> 18
<211> 921
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Antigen Receptor named E1m1
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro
50 55 60
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro
85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala
165 170 175
Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile
180 185 190
Asn Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser
195 200 205
Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln
210 215 220
Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala
225 230 235 240
Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala
245 250 255
Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly
260 265 270
Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
290 295 300
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
305 310 315 320
Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
325 330 335
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
340 345 350
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
355 360 365
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
370 375 380
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
385 390 395 400
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
420 425 430
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
500 505 510
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp
515 520 525
Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val His Ser
530 535 540
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
545 550 555 560
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
565 570 575
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
580 585 590
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
595 600 605
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
610 615 620
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
625 630 635 640
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
645 650 655
Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
660 665 670
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr Cys Pro
675 680 685
Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser
690 695 700
Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys
705 710 715 720
Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn
725 730 735
Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala
740 745 750
Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr Ala Gly
755 760 765
Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala
770 775 780
Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile
785 790 795 800
Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr
805 810 815
Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser Gln Thr
820 825 830
Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro
835 840 845
Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr
850 855 860
Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu Ala Cys
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu Met Glu
885 890 895
Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg Asp Glu
900 905 910
Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
915 920

Claims (10)

1.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为T细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞具有以下特征：
(a)所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，其中所述CAR靶向肿瘤细胞的表面标志物；和
(b)所述的免疫细胞表达外源的信号转换蛋白，并且所述信号转换蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜上，并且具有免疫抑制性受体的胞外结构域、跨膜区(或跨膜结构域)和免疫激动性受体的胞内结构域。
在另一优选例中，所述的免疫抑制性受体为TGF-β受体。
在另一优选例中，所述的免疫激动性受体选自下组：IL-7受体、IL-15受体、IL-12受体、IL-2受体、IL-18受体、IL-21受体，或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫激动性受体为IL-7受体。
2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述的CAR具有式Ia或Ib所示结构：
L1-scFv-H-TM1-C-CD3ζ (Ia)
L1-scFv-H-TM1-C-CD3ζ-(A-S)n1-A-E-(A-S)n2 (Ib)
式中，
L1为无或信号肽序列；
scFv为靶向抗体的单链可变结构域；
H为无或铰链区；
TM1为跨膜结构域；
C为共刺激信号结构域；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；
A为自剪切2A肽；
S为其他的外源重组蛋白；
n1或n2各自独立地为0或1；
E为信号转换蛋白；
所述“-”连接肽或肽键。
3.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述的信号转换蛋白具有式V所示结构：
L2-Z1-TM2-Z2 (V)
式中，
L2为无或信号肽序列；
Z1为免疫抑制性受体的胞外结构域；
TM2为跨膜区；
Z2为免疫激动性受体的胞内结构域；
所述“-”连接肽或肽键。
4.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述编码信号转换蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8中第523-933位、SEQ ID NO.:9中第523-908位、SEQ ID NO.:10中第523-936位、SEQ ID NO.:11中第523-911位、SEQ ID NO.:16中第937-1347位、SEQ ID NO.:17中第937-1350位所示。
5.一种制备权利要求1所述的工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供一待改造的免疫细胞；和
(b)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的CAR分子和外源的信号转换蛋白，从而获得权利要求1所述的工程化免疫细胞。
6.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
7.一种如权利要求1所述的工程化免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备可预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：实体瘤、血液瘤、淋巴瘤，或其组合。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤表达选自下组的标志物：间皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2，或其组合。
10.一种用于制备权利要求1所述的工程化免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一核酸序列，所述第一核酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和
(2)第二核酸序列，所述第二核酸序列含有用于联合表达信号转换蛋白的第二表达盒。
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