JP2023522112A - 汎用型ヒト化ｃａｒ１９－ｄｎｔ細胞を製造する技術およびその使用 - Google Patents

汎用型ヒト化ｃａｒ１９－ｄｎｔ細胞を製造する技術およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、汎用型ヒト化ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞を製造する技術およびその使用を提供する。具体的に、本発明は、ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞であって、外因性のＣＡＲ構築物を発現し、当該ＣＡＲ構築物は式Ｉで表される構造を有し、Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（式Ｉ）、式中において、Ｌはなしか、シグナルペプチド配列で、ｓｃＦｖはＣＤ１９を標的とする抗体一本鎖可変領域配列で、Ｈはなしか、ヒンジ領域で、ＴＭは膜貫通ドメインで、Ｃは共刺激シグナル分子で、ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。本発明によって提供される汎用型ヒト化ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞は、免疫原性が低く、遺伝子編集でＧｖＨＤを避けることがなく、安全性が高く、特異性が高く、腫瘍殺傷効果が顕著であるといった利点を有し、そして提供される構築方法は大規模生産が実現可能で、生産コストが低い。【選択図】なし

Description

本発明は、腫瘍免疫細胞治療の技術分野に属し、具体的に、汎用型ヒト化キメラ抗原受容体ＣＡＲＴ－１９細胞を製造する技術方法およびその使用に関する。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ、ＣＡＲＴ）は、現在、最も将来性のある腫瘍免疫療法の一つで、２０１７年に既に米国ＦＤＡによって許可された２つのＣＡＲＴ細胞製品はどちらも腫瘍患者自身から分離された末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）で、遺伝子工学によって特定の抗原受容体（ＣＡＲ）を導入することにより、ＰＢＭＣにおけるＴ細胞の標的性、殺傷活性および持久性が増強し、腫瘍細胞の表面抗原に対する認識がＭＨＣの制限性に依存しない。よく見られるＣＡＲは、細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、および細胞内のＴ細胞受容体のシグナル伝達領域（たとえばＣＤ３ζやＣＤ２８）からなる。細胞外抗原結合領域は、モノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）からなり、中間がヒンジによって連結して一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ、ｓｃＦｖ）になり、特定の腫瘍抗原を認識することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞技術は、既に第三世代まで発展し、第一世代のＣＡＲは腫瘍表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原結合部位および免疫受容体チロシン活性化モチーフからなり、細胞外では、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）で腫瘍マーカー分子を認識するが、共刺激シグナルがないため、臨床において、Ｔ細胞の体内存続時間が短く、サイトカイン分泌能力が低いといった問題と、効果が良くない。第二世代のＣＡＲＴ技術は、共刺激シグナル配列を導入し、Ｔ細胞の細胞毒活性、増殖能力および体内生存時間を向上させ、サイトカインの放出を促進することができ、臨床において急性リンパ性白血病の治療に成功した。第三世代のＣＡＲＴは、細胞質領域で直列にＣＤ２８、４－１ＢＢの２種の共刺激分子およびＣＤ３ζ分子が並んでおり、二重共刺激のシグナル配列がより優れた効果を有する。第三世代のＣＡＲＴの構造概略図を図１に示す。
現在、自家ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１９を標的とするＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂ－ＡＬＬ）の治療に使用され、９０％以上と高い完全緩和率が得られた。リンパ腫の治療においても、完全緩和率が６４％と高い。ＣＡＲＴ技術はこの２種の疾患の治療で得られた効果がほかの薬物のいずれにも比べ物にならない。我が国では、急性リンパ性白血病は小児急性白血病の８０％を占め、発症率が十万分の一で、すべの成人白血病の発症率の２０％を占める。免疫細胞治療は、多くの重病の重要な治療手段で、癌、自家免疫疾患を含め、ひいては重度のウイルス感染でさえ、免疫細胞治療が成功した症例がある。
ＣＤ１９標的ＣＡＲＴは臨床試験における効果が非常に顕著であるが、多くの欠点があり、サイトカインストームなどの重度な副作用以外、４つの大きな問題がある：まず、一部のリンパ球の数が低いか、質が劣る末期患者は、十分な数の自家免疫細胞がないため、ＣＡＲＴ治療のチャンスを失う；次に、患者の自家細胞で製造されるＣＡＲＴ製品を使用する場合、ウイルス遺伝子を末梢血の残存腫瘍細胞に形質導入し、患者の死亡につながったことが報告された；さらに、現在、開発中の汎用型ＣＡＲＴ細胞製品の大半は、遺伝子編集技術によって移植片対宿主病を起こしうる遺伝子をノックアウトした、たとえば、ＴＣＲ受容体などであるが、これらの遺伝子のノックアウトには、煩雑な構築過程および大規模シークエンシングが必要で、そしてオフターゲット率が高い；最後に、自家ＣＡＲＴ細胞製品の製造は１対１の個体化治療で、製造コストが高く、製造プロセスの要求が複雑であるため、製品が高価で、多くの患者は負担できず、社会医療負担を増やす。
そのため、本分野では、健常者ドナーの末梢血からの、複雑な遺伝子編集方法で移植片対宿主病を起こすＴＣＲ遺伝子をノックアウトする必要がなく、免疫原性が低く（宿主の抗移植片に対する免疫応答を起こさず、体内存続時間が長い）、安全性が高く、殺傷効果が顕著で、そして生産コストが低い汎用（即席）型ＣＡＲＴ細胞およびその構築方法の開発が切望されている。
既存の関連技術の一連の問題に鑑みると、本発明は、汎用型キメラ抗原受容体ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞を製造する技術方法およびその使用を提供する。
本発明の目的は、健常者ドナーの末梢血からの、複雑な遺伝子編集方法で移植片対宿主病を起こすＴＣＲ遺伝子をノックアウトする必要がなく、免疫原性が低く（宿主の抗移植片に対する免疫応答を起こさず、体内存続時間が長い）、安全性が高く、殺傷効果が顕著で、そして生産コストが低い汎用（即席）型ＣＡＲＴ細胞およびその構築方法を提供することである。
本発明の第一の側面では、ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞であって、外因性のＣＡＲ構築物を発現し、前記ＣＡＲ構築物は式Ｉで表される構造を有する細胞を提供する。
Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （式Ｉ）
（式中において、
Ｌはなしか、シグナルペプチド配列である。
ｓｃＦｖはＣＤ１９を標的とする抗体一本鎖可変領域配列である。
Ｈはなしか、ヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
各「－」は独立に上記各エレメントを連結する連結ペプチドまたはペプチド結合を表す。）
もう一つの好適な例において、前記ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－二重陰性Ｔ細胞（ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞）である。
もう一つの好適な例において、前記汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲがノックアウトされたものか、ノックアウトされていないものである。
もう一つの好適な例において、前記汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲがノックアウトされたものである。
もう一つの好適な例において、前記のＬは、ＣＤ８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、前記のＬは、ＣＤ８由来のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、前記ｓｃＦｖに配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記ｓｃＦｖに、さらに、ＶＨとＶＬの間の連結ペプチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記の連結ペプチド配列は配列番号７で示されるアミノ配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記ｓｃＦｖは、配列番号４で示されるアミノ配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８由来のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通領域である。
もう一つの好適な例において、ＴＭは、ＣＤ８由来の膜貫通領域、および／またはＣＤ２８由来の膜貫通領域である。
もう一つの好適な例において、前記のＣは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ （ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の共刺激シグナル分子である。
もう一つの好適な例において、Ｃは、４－１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子、および／またはＣ２８由来の共刺激シグナル分子である。
もう一つの好適な例において、前記ＣＡＲ構築物は配列番号１４で示されるアミノ配列を有する。
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を製造する方法であって、
（ｉ） 式Ｉで示されるＣＡＲ構築物をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （式Ｉ）
（式中において、
Ｌはなしか、シグナルペプチド配列である。
ｓｃＦｖはＣＤ１９を標的とする抗体一本鎖可変領域配列である。
Ｈはなしか、ヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
各「－」は独立に上記各エレメントを連結する連結ペプチドまたはペプチド結合を表す。）
（ｉｉ） 少なくとも一つのＤＮＴ細胞を含有するＤＮＴ細胞培養液を提供し、工程（ｉ）の発現ベクターで前記ＤＮＴ細胞に対して形質導入することにより、本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｉｉｉ） 任意の工程（ｉｉ）で得られた反応型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を検出する工程
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、プラスミド、ウイルス発現ベクター、トランスポゾン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ウイルス発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはウイルス発現ベクターで、そして前記方法は、工程（ｉｉ）の前に、さらに、工程（ｉ）のウイルス発現ベクターに対してドウイルスパッケージングを行う工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記ウイルス発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクターで、好ましくはレンチウイルス発現ベクターである。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）のウイルス発現ベクターに配列番号１６で示されるポリヌクレオチド配列が組み込まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉ）におけるウイルス発現ベクターをパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．０Ｇとウイルスパッケージング宿主細胞に共形質移入する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号１５で示される式（Ｉ）におけるｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号８で示される式（Ｉ）におけるＬをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号９で示される式（Ｉ）におけるＨをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号１０で示される式（Ｉ）におけるＴＭをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号１１で示される式（Ｉ）におけるＣをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のポリヌクレオチド配列に配列番号１２で示される式（Ｉ）におけるＣＤ３ζをコードするヌクレオチド配列が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記ウイルスパッケージ宿主細胞は哺乳動物細胞、好ましくは２９３Ｔ細胞である。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）の前に、さらに、
（ｉｉａ）健常者のドナーから末梢血のサンプルを収集する工程、
（ｉｉｂ）末梢血サンプルにおけるＣＤ４＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を除去することにより、ＤＮＴ細胞を得る工程、
（ｉｉｃ）ＣＤ３モノクローナル抗体がコーティングされた培養瓶において、適切な培地で（ｉｉｂ）で得られたＤＮＴ細胞を培養・増幅することにより、工程（ｉｉ）に必要なＤＮＴ細胞含有培養系を得る工程
を含む。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｃ）の培地に、ゲンタマイシン、組み換えインターロイキン－２、組み換えインターロイキン－７、組み換えインターロイキン－１２、組み換えインターロイキン－１５、自家血漿、ＡＢ血清、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる物質を添加してある。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｃ）の培地に、組み換えまたは野生型のヒトインターロイキン－４が含まれていない。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｃ）の培地に、ＡＢ血清が含まれていない。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｃ）の培地では、前記ゲンタマイシンの濃度が４０－８０単位／ｍｌ（好ましくは６０単位／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が１５０－１０００ ＩＵ／ｍｌ（好ましくは２００－２５０ ＩＵ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－１５の濃度が５－２０ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－７の濃度が１－５ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２ ｎｇ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－１２の濃度が５－２０ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌ）、前記自家血漿の濃度が３－２５ ｖ％（好ましくは１０－２０ ｖ％）、および／または前記ＡＢ血清の濃度が４－８ ｖ％（好ましくは６ ｖ％）である。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）では、前記ＤＮＴ細胞培養液におけるＤＮＴ細胞の濃度が１×１０６細胞／ｍｌ～４×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０６細胞／ｍｌ～２×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは０．５×１０６細胞／ｍｌ～１×１０６細胞／ｍｌである。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）では、前記ウイルスのＭＯＩが０．１～１０、好ましくは０．１～８、より好ましくは５である。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）の検出は、工程（ｉｉ）の形質導入後の７－１４日目、好ましくは８日目または１３日目に行われる。
本発明の第三の側面では、
（ａ） 本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞、および
（ｂ） 薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は液状の薬物組成物である。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物では、前記ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度が１×１０６～５×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０６～２×１０６細胞／ｍＬである。
本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用であって、癌を予防および／または治療する薬物組成物または製剤を製造するための使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は血液腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳膠細胞腫、子宮内膜癌、肺扁平上皮癌、肛門癌、頭頸部腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第五の側面では、疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的の汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞、または本発明の第三の側面に記載の薬物組成物を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記疾患は癌または腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記必要な対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
第三世代のＣＡＲＴの構造を示す。 ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ構築体の構造概略図を示す。 ＣＤＲ１ドメイン（Ｖ２７Ｇ）が突然変異したヒト化ＣＤ１９三次元モデルを示す。 培養の８日目と１３日目に、フローサイトメーターによってＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体マーカーで同定された培養系におけるＤＮＴ細胞の比率、および特異性抗ヒトＣＤ１９可変領域抗体マーカーで測定されたＤＮＴ細胞の抗体遺伝子担持レンチウイルスに感染される効率、それから計算された細胞製品におけるＣＡＲＴ細胞の百分率を示す。 培養の８日目と１３日目に、ヒト化ＣＡＲ１９－ＤＮＴのＨｅｌａとＨｅｌａ－ＣＤ１９標的細胞それぞれの体外特異的腫瘍殺傷活性の比較を示す。中では、５－Ａはエフェクター細胞対標的細胞比が２：１の場合、ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞毒性アッセイ、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ）でモニタリングされたリアルタイムの殺傷状況を示す。５－Ｂはエフェクター細胞対標的細胞比が２：１の場合、エフェクター細胞の添加から１８時間後、ＲＴＣＡでモニタリングされたリアルタイムの殺傷状況を示す。 培養の８日目と１３日目に、ヒト化ＣＡＲ１９－ＤＮＴのＨｅｌａとＨｅｌａ－ＣＤ１９標的細胞それぞれの体外特異的腫瘍殺傷活性の比較を示す。中では、５－Ａはエフェクター細胞対標的細胞比が２：１の場合、ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞毒性アッセイ、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ）でモニタリングされたリアルタイムの殺傷状況を示す。５－Ｂはエフェクター細胞対標的細胞比が２：１の場合、エフェクター細胞の添加から１８時間後、ＲＴＣＡでモニタリングされたリアルタイムの殺傷状況を示す。
本発明者は、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて、汎用型キメラ抗原受容体ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞の構築方法を開発した。実験では、本発明によって提供される汎用型キメラ抗原受容体ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞は、健常者ドナーの末梢血からの、複雑な遺伝子編集方法で移植片対宿主病を起こすＴＣＲ遺伝子をノックアウトする必要がなく、免疫原性が低く（宿主の抗移植片に対する免疫応答を起こさず、体内存続時間が長い）、安全性が高く、特異的にヒトＣＤ１９抗原を標的とし、腫瘍殺傷効果が顕著であるという利点があり、殺傷効果が顕著で、そして本発明によって提供される構築方法は大規模生産が実現可能で、生産コストが低い。これに基づき、本発明を完成させた。
用語
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるように、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有する。
本明細書で用いられるように、用語「約」とは当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内にある値または組成で、それによって部分的にどのように値または組成を計量または測定するかというのが決まる。
本明細書で用いられるように、用語「投与」、「施用」とは、当業者に既知の様々な方法および送達システムの任意の一つによって本発明の製品を物理的に被験者に導入することで、静脈内、筋肉内、皮下、腹膜内、脊髄またはほかの胃腸外の投与経路、たとえば注射または輸注によるものを含むが、入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「ＤＮＴ細胞」とは二重陰性Ｔ細胞（Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ）で、表現型が独特なＴＣＲαβ＋および／またはＴＣＲγδ＋ Ｔ細胞で、ＣＤ３分子を発現するが、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ｉＮＫＴなどの細胞の特徴的表面分子（マーカー）を発現せず、生体免疫系において独特で多様化の生理作用を発揮する。
二重陰性Ｔ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ、ＤＮＴ）細胞とは、末梢血に正常に存在するＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８－成熟Ｔリンパ球のサブグループで、末梢血の単核球の約１－３％を占める。ＤＮＴ細胞の表面にＣＤ３分子およびαβ－またはγδ－Ｔ細胞受容体（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）が発現されるが、ＣＤ４およびＣＤ８分子を発現せず、かつインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｎａｔｕｒｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ、ｉＮＫＴ）細胞特異的αＧａｌＣｅｒに反応しないため、通常のＴ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞と異なる。ＤＮＴ細胞は、多くの人体の天然機序を介して細胞毒性、抗原提示機能を発揮すると同時に、サイトカイン／ケモカインを放出し、より幅広い免疫応答を活性化させ、これによって幅広い将来性のある臨床治療薬物の候補になる。
ＤＮＴ細胞の細胞免疫治療薬物の候補としての利点は、以下のものを含む。
ＤＮＴ細胞は、多くの腫瘍適応症に使用することができ、細胞表面のＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１などの受容体を介してＡＭＬ、リンパ腫、子宮頸癌、肺癌などの多くの血液または固形腫瘍に発現される相応するリガンドを標的とし、そしてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇｒａｚｙｍｅ Ｂ、Ｐｅｆｏｒｉｎ、ＩＬ－２、ＩＬ－４などを分泌して直接および間接的な腫瘍殺傷活性を発揮する。そして、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント阻害剤および化学治療薬と併用することができ、協同治療効果がある。
ＤＮＴ細胞は、腫瘍細胞の殺傷がＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子に制限されず、健常者のドナーからの異体ＤＮＴ細胞を患者体内に注入し、患者体内の正常細胞に殺傷毒性がなく、かつ造血幹細胞の更なる分化に影響せず、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＧｖＨＤ）につながらず、宿主対移植片（Ｈｏｓｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｇｒａｆｔ）反応がなく、注入される異体ＤＮＴ細胞が患者体内に長時間持続し、よって腫瘍殺傷活性を発揮する。
健常者のドナーのＤＮＴ細胞は、１ ｍｌの末梢血から効率的に５×１０８以上のオーダーに増幅することができ、収集して凍結保存後、複数の患者の治療に供することが可能で、臨床で患者が明確に診断されると治療が実施可能で、自家ＣＡＲＴ製品に必要な製品の製造などを待つ必要がなく、本当の意味でオフザシェルフ（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）の汎用型（即席）細胞製品になる。ＤＮＴ細胞が有する上記幅広い抗腫瘍、高安全性、汎用およびほかの免疫療法との併用などの特性と合わせ、本発明では、ＣＤ１９を標的とする汎用型ヒト化キメラ抗原受容体ＣＡＲＴ－１９製品が設計され、そしてそれからＤＮＴ細胞プラットフォームに基づいた一連の遺伝子編集の必要のない汎用性ＣＡＲＴ細胞製品が開発された。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ免疫抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＣＡＲｓ）は、細胞外抗原認識ドメイン、通常、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖可変断片）、膜貫通領域および細胞内共刺激シグナルドメインからなる。ＣＡＲの設計は以下の過程を経てきた。第一世代のＣＡＲは一つのみの細胞内シグナル成分のＣＤ３ζまたはＦｃγＲＩ分子を有し、細胞内に一つの活性化ドメインしかないため、短時間のＴ細胞増殖および少ないサイトカイン分泌しか引き起こせず、長時間のＴ細胞増殖シグナルおよび持続的な体内抗腫瘍効果を提供することができるため、臨床治療効果が十分に得られない。第二世代のＣＡＲは元の構造に基づいて一つの共刺激分子、たとえばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳが導入され、第一世代のＣＡＲよりも機能が大幅に向上し、さらにＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および腫瘍細胞に対する殺傷能力を強化する。第二世代のＣＡＲに基づいて一部の新たな免疫共刺激分子、たとえばＣＤ２７、ＣＤ１３４を直列連結すると、第三世代および第四世代のＣＡＲに発展してきた。
ＣＡＲの細胞外断片は一つまたは複数の特異的な抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）を認識し、さらに細胞内ドメインによって当該シグナルを伝達し、細胞の活性化・増殖、細胞溶解毒性およびサイトカインの分泌を引き起こし、よって標的細胞を除去する。まず、患者の自家または異体（健常者のドナー）のＰＢＭＣを分離し、活性化させて遺伝子改変し、ＣＡＲの免疫細胞が生成した後、患者の体内に注入し、ＭＨＣに制限されずに直接腫瘍細胞の表面抗原を認識して特異的に殺傷する。
具体的に、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域および／またはζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子で、抗原受容体またはそのリガンドではない。
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、リンカーを導入してもよい。
本明細書で用いられるよう、用語「リンカー」、「ヒンジ領域」とは、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに連結させる作用を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドをいうが、入れ替えて使用することができる。リンカーは、０～３００個のアミノ酸、好ましくは２～１００個のアミノ酸、最も好ましくは３～５０個のアミノ酸を含んでもよい。
本発明のＣＡＲが免疫細胞において発現される場合、抗原結合の特異性に基づいて抗原を認識することができる。腫瘍細胞における関連抗原に結合すると、腫瘍細胞の死亡につながり、患者の腫瘍負荷が軽減または解消する。抗原結合ドメインは、共刺激分子および／またはζ鎖から由来する一つまたは複数の細胞内ドメインと融合することが好ましい。好ましくは、抗原結合ドメインはＣＤ２８共刺激シグナル分子、４－１ＢＢ共刺激シグナル分子およびＣＤ３ζシグナルドメインと組み合わせた細胞内ドメインと融合している。
本明細書で用いられるように、本発明に係るキメラ抗原受容体の基本構造は、腫瘍関連抗原結合領域、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含む。腫瘍関連抗原の選択は、直接腫瘍に対する治療効果に影響する。本発明において、本発明のキメラ抗原受容体はＣＤ１９を標的とする。
ＣＤ１９は主に早期のＢ細胞に発現され、９５ＫＤａ程度のＢ細胞系に特有の膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は正常と悪性Ｂ細胞のいずれにも発現され、Ｂ細胞の発育過程におけるカバーする段階の長い、最も信頼できる表面マーカーとされる。
本発明の一つの好適な例において、抗ＣＤ１９の一本鎖抗体を本発明のＣＡＲにおけるＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインとして選択される。
一つの好適な実施形態において、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号４で示され、効率的にＣＤ１９分子と結合する。
本発明において、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインは、さらに前記ｓｃＦｖの保存的変異体を含み、本発明のｓｃＦｖのアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸数は、好ましくは元のアミノ酸配列の合計アミノ酸数の４０％以下、より好ましくは３５％以下、より好ましくは１～３３％、より好ましくは５～３０％、より好ましくは１０～２５％、より好ましくは１５～２０％である。本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸の数は、通常、１、２、３、４または５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個である。
ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、ＣＡＲはＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天然のＣＡＲにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例において、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このようなドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。
好ましくは、本発明のＣＡＲ構築物は、ＣＤ８リード配列－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ （ＶＬ－リンカー－ＶＨ）－ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３－ζという構造を有する。
一つの好適な実施形態において、本発明のＣＡＲのアミノ酸配列は配列番号１４の１－４８９番目で示される。なお、本発明のＣＤ１９を標的とするＣＡＲのアミノ酸配列において、配列番号１４の１７３番目がグリシン（Ｇｌｙ）に相応する。
ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞」、「ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」、「本発明の汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、いずれも本発明の第一の側面に記載の式Ｉの構造を有する特異的にヒトＣＤ１９分子を標的とするキメラ抗原受容体を発現する汎用型二重陰性Ｔ細胞をいうが、入れ替えて使用することができる。
本発明において、前記のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞内で本発明のＣＡＲ構築物が発現される。
好ましくは、前記のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞におけるＴＣＲがノックアウトされたものである。
製造方法
また、本発明において、本発明のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を製造する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ） 本発明のＣＡＲ構築物をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
（ｉｉ） 少なくとも一つのＤＮＴ細胞を含有するＤＮＴ細胞培養液を提供し、工程（ｉ）の発現ベクターで前記ＤＮＴ細胞に対して形質導入することにより、本発明のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｉｉｉ） 任意の工程（ｉｉ）で得られた反応型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を検出する工程。
好ましくは、本発明の製造方法における発現ベクターはウイルス発現ベクターで、特に好ましくは、レンチウイルス発現ベクターである。
なお、前記方法の工程（ｉｉ）におけるＤＮＴ細胞培養液の獲得について、以下の工程が必要である：
（ｉｉａ）健常者のドナーから末梢血のサンプルを収集する工程、
（ｉｉｂ）末梢血サンプルにおけるＣＤ４＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を除去することにより、ＤＮＴ細胞を得る工程、
（ｉｉｃ）ＣＤ３モノクローナル抗体がコーティングされた培養瓶において、適切な培地で（ｉｉｂ）で得られたＤＮＴ細胞を培養・増幅することにより、工程（ｉｉ）に必要なＤＮＴ細胞含有培養系を得る工程。
好ましくは、前記工程（ｉｉｃ）の培地に、ゲンタマイシン、組み換えインターロイキン－２、組み換えインターロイキン－７、組み換えインターロイキン－１２、組み換えインターロイキン－１５、自家血漿、ＡＢ血清、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる物質を添加してある。
もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｃ）の培地では、前記ゲンタマイシンの濃度が４０－８０単位／ｍｌ（好ましくは６０単位／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が１５０－１００ ＩＵ／ｍｌ（好ましくは２００－２５０ ＩＵ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－１５の濃度が５－２０ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－７の濃度が１－５ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは２ ｎｇ／ｍｌ）、前記組み換えヒトインターロイキン－１２の濃度が５－２０ ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１０ ｎｇ／ｍｌ）、前記自家血漿の濃度が３－２５ ｖ％（好ましくは１０－２０ ｖ％）、および／または前記ＡＢ血清の濃度が４－８ ｖ％（好ましくは６ ｖ％）である。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記工程（ｉｉｃ）の培地に、組み換えまたは野生型のヒトインターロイキン－４が含まれておらず、かつＡＢ血清が含まれていない。
薬物組成物
本発明は、本発明の第一の側面に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する製剤を提供する。一つの実施形態において、前記薬物組成物は液体製剤である。好ましくは、前記製剤は注射剤である。好ましくは、前記製剤で、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度が１×１０５～１×１０８細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０５～１×１０６細胞／ｍＬである。
一つの実施形態において、前記製剤は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の製剤は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。
治療的使用
また、本発明は、本発明の第一の側面のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞と本発明の第三の側面に記載の薬物組成物の使用であって、癌を予防および／または治療する薬物組成物または製剤を製造するための使用、ならびに癌を治療および／または予防するための使用を提供する。
前記の癌は、各進行期の腫瘍を含み、臨床上のＩ期～ＩＶ期の腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（たとえば血液腫瘍、たとえば白血病やリンパ腫）または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで治療する癌の種類は、癌、胚細胞腫瘍や肉腫、および一部の白血病やリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、たとえば肉腫、癌やメラノーマを含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌および児童腫瘍／癌も含む。
血液癌は血液または骨髄の癌である。血液（または血液原性）癌の例は、白血病を含み、それに急性白血病（たとえば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球型、単核球性や赤白血病）、慢性白血病（たとえば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髓性白血病や慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫（無痛および重症の場合）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病や脊髄形成異常が含まれる。
固形腫瘍は、通常、嚢腫や液体領域の組織の腫瘤を含まない。固形腫瘍は良性でも悪性でもよい。異なる種類の固形腫瘍はこれらを形成する細胞の種類によって命名される（たとえば肉腫、癌やリンパ腫）。固形腫瘍は、たとえば肉腫および癌の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、卵巣癌を含む。
本発明の汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞は哺乳動物に対する体外免疫および／または体内療法のワクチンとしても有用である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
体外免疫細胞の製造について、ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも一つが細胞製造細胞を哺乳動物に施用する前に体外で行われる。
体外細胞処理プロトコールは本分野では公知で、そして後記でより完全に検討される。簡単に言えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離して本明細書で公開されるＣＡＲを発現するベクターで上記細胞に対して遺伝子修飾を行う（すなわち体外形質転換または形質導入）。ＣＡＲ修飾細胞は哺乳動物のレシピエントに施用し、治療の有益な効果を提供することができる。哺乳動物のレシピエントはヒトでもよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントの自家細胞でもよく、同種異系、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）の細胞でもよい。
体外免疫について細胞に基づいたワクチン以外、本発明は、体内で患者における標的抗原に対する免疫応答を増強させるための組成物および方法も提供する。
本発明は、腫瘍を治療する方法であって、必要な対象に有効量の本発明の汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
本発明の汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞は単独で、または薬物組成物として希釈剤および／またはほかの成分、たとえばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、本明細書に記載の標的細胞を含み、一つまたは複数の薬学または臨床的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせてもよい。このような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。
本発明の薬物組成物は、治療（または予防）される疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病症の特徴、疾患の種類、重篤度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。
「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０４～１０９個細胞／ｋｇ体重の投与量、好ましくは１０５～１０７個細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８）によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、患者の疾患の状況をモニタリングすることにより、治療プランは医学分野の技術者によって決定することができる。
対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹膜内、胸膜内で患者に施用されてもよい。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物はｉ．ｖ．静脈内注射によって施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい。（ＣＡＲＴ細胞製品は主に静脈輸液で、直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい）
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのＴ細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増幅細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビル、インターロイキン－２、ＩＦＮ－γ、アザシチジン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）のようなほかの細胞毒性化学治療薬、チェックポイント阻害剤、たとえば、ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびサイトカインストームを抑制する薬物、たとえば、抗ＩＬ－６受容体のトシリズマブなどで治療するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルや、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増幅した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増幅した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。
患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。ヒトへ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０６個～１×１０１０個の本発明の汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。
本発明の主な利点は以下の通りである。
１） 本発明におけるＣＤ１９ ＣＡＲはヒト化のキメラ抗原受容体で、全マウス由来キメラ抗原受容体と比べ、免疫原性が低く、免疫拒絶反応が生じにくいといった利点がある。
２） 本発明におけるＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞は遺伝子編集なしに製造される汎用型免疫細胞製品で、プロセスが簡単で、安全性が良く、ＤＮＴ細胞の腫瘍殺傷にＴＣＲ分子の関与が不要で、ＭＨＣ制限性がなく、ＧｖＨＤおよびＨｖＧが生じず、汎用型免疫細胞製品になり、ＴＣＲなどの遺伝子のノックアウトに必要な煩雑な構築過程および大規模のシークエンシングおよびオフターゲット率が高いといった問題が解消される。
３） 本発明で提供されるＣＡＲ－ＤＮＴを構築および増幅する方法は、大規模生産が可能で、生産コストが低下し、１対１の個体化治療と比べ、当該汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞製品は、生産コストが大幅に低下し、患者の負担が軽減する。
４） 本発明で提供されるＣＡＲ－ＤＮＴ細胞は、患者の由来に制限されず、健常者のドナーからの免疫細胞を大規模で増幅することができ、細胞活性がより良く、かつ即席に患者に治療を提供することができ、現在、自家ＣＡＲＴ細胞治療過程において腫瘍中末期患者のリンパ球数が少なく、質が劣り、そして数不足といった問題を解消する。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
本発明では、第二世代のＣＤ１９－ＣＡＲを使用し、ＶＨのＣＤＲ１領域に突然変異Ｖ２７Ｇが含まれるヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（クローン１１）で、図２はヒト化のＣＤ１９ ＣＡＲ構築体の構造概略図を示す。以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの具体的な実施形態に限定されない。
実施例１：ヒト化の抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの構築
本発明は、レンチウイルスベクターのＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位の間にヒト化のＣＤ１９－ＳｃＦｖ－ＣＡＲ構造を挿入し、当該構造はＸｂａＩとＥｃｏＲＩクローニング部位の間にヒト化ＣＤ１９ ＳｃＦｖ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの挿入断片が含まれている。
１．１ ヒト化ＣＤ１９抗体：ＶＨとＶＬとｓｃＦｖの配列
本発明は、マウスＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖクローンからヒト化のＣＤ１９ ｓｃＦｖを獲得し、そのＣＤＲ１突然変異体をヒト化のｓｃＦｖ（クローン１１）とした。ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖの構造は、ＶＬ－連結ペプチド－ＶＨである。連結ペプチド配列は、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号：７）である。
ヌクレオチド配列では、太字はヒト化ＣＤ１９ ＶＬの配列（配列番号１）で、デフォルトのフォントはＶＨのヌクレオチド配列（配列番号２、太字でコードＧの突然変異（ｇｇｃ）を表示する）で、中間の斜体は（配列番号３）連結ペプチド配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＧＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）である。
ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（配列番号４）：太字はＶＬで、デフォルトフォントはＶＨで、下線はＣＤＲ領域で、突然変異した位置はＶＨ（配列番号６）の２７番目で、大きい斜体のＧ（ＶＨのＶ２７Ｇ）で表示されている。
アミノ酸配列では、太字はＶＬのアミノ酸配列（配列番号５）で、デフォルトフォントはＶＨのアミノ酸配列（配列番号６）で、斜体は連結ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）である。
本発明は三次元モデル（図３）および抗原抗体結合実験により、ヒト化ＣＤ１９抗体ＶＨの ＣＤＲ１領域の突然変異によって抗体とＣＤ１９抗原の結合能力が改善できたことが見出された。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号４）
１．２ ヒト化のＣＤ１９－ＣＡＲ配列
ヒト化ＣＤ１９－ＣＡＲ構造は図２に示す。ＥＦ１ａプロモーターのレンチウイルスベクターでヒト化ｓｃＦｖ ＣＡＲ配列をクローニングした。
以下のヌクレオチド配列はヒト化のＣＤ１９ＳｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ－ＴＭ８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζのＣＤ８リード配列である。ＣＡＲ構造は、ヒトＣＤ８シグナルペプチド、ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＬ－ヒンジ－ＶＨ）、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通、４１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ活性化ドメインを含む（図２）。
ＣＤ８リード配列－ＣＤ１９ ｓｃＦｖ （ＶＬ－リンカー-ＶＨ）－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ：
＜ＣＤ８リード＞
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ （配列番号８）
＜ヒト化ＣＤ１９ （ＶＬ－リンカー－ＶＨ）、クローン１１ ｓｃＦｖ＞ （太字で表示されるのはＶ２７Ｇをコードする突然変異配列ｇｇｃである）
ｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｇａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｇｃｇｔｇａｃｃ
ａｔｔａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇｇａｔａｔｔａｇｃａａａｔａｔｃｔｇａａｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇ
ｇｇｃａａａｇｃｇｃｃｇａａａｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｔｃａｔａｃｃａｇｃｃｇｃｃｔｇｃａｔａｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｇａｇｃ
ｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｇ
ｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇａｃｃｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｔａｔａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃ
ｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｔａａａ
ｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃ
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇａａａｇｃｇｇｃｃｃｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇｃｇａａａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇ
ａｃｃｔｇｃａｃｃｇｔｇａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｃｇｇａｔｔａｔｇｇｃｇｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｇ
ｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｔｇｇｃｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｇｃａｇｃｇａａａｃｃａｃｃｔａｔｔａｔａａｃ
ａｇｃｇｃｇｃｔｇａａａａｇｃｃｇｃｇｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｇｔｇｇａｔａｃｃａｇｃａａａａａｃｃａｇｔｔｔａｇｃｃｔｇ
ａａａｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｇｃｇｇｃｇｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｃｇａａａｃａｔｔａｔｔａｔ
ｔａｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｔｔａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃ
（配列番号１５）
＜ＣＤ８ヒンジ＞
ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号９）
＜ＣＤ８ ＴＭ＞
ＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣ （配列番号１０）
＜４－１ＢＢ共刺激ドメイン＞
ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ （配列番号１１）
＜ＣＤ３ζ＞
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＧ （配列番号１２）
＜ＥｃｏＲＩ制限部位＞
ｇａａｔｔｃ （配列番号１３）
ヒト化ＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＤ３－ＣＡＲタンパク質のアミノ酸配列は以下の通り（関連構築体の構造は図３を参照する）で、ここで、ＣＤＲ１ ＶＨ における突然変異は太字・下線で表示する。
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲ
ＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴ
ＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＳＧ
ＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＬＰＤＹＧ
ＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦ
ＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴ
ＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩ
ＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴ
ＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬ
ＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭ
ＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰ
ＰＲ（配列番号１４）
ヒト化ＣＤ１９－４－１ＢＢ－ＣＤ３－ＣＡＲタンパク質のヌクレオチド配列は以下の通りである。
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ
ｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｇａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｇｃｇｔｇａｃｃ
ａｔｔａｃｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇｇａｔａｔｔａｇｃａａａｔａｔｃｔｇａａｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇ
ｇｇｃａａａｇｃｇｃｃｇａａａｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｔｃａｔａｃｃａｇｃｃｇｃｃｔｇｃａｔａｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｇａｇｃ
ｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｇ
ｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇａｃｃｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃａｃｃｃｔｇｃｃｇｔａｔａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃ
ｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｔａａａ
ｇｇｃｔｃｃａｃｃｔｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇａｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃ
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇａａａｇｃｇｇｃｃｃｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇｃｇａａａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇ
ａｃｃｔｇｃａｃｃｇｔｇａｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｃｇｇａｔｔａｔｇｇｃｇｔｇａｇｃｔｇｇａｔｔｃｇｃｃａｇｃｃｇ
ｃｃｇｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｔｇｇｃｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｇｃａｇｃｇａａａｃｃａｃｃｔａｔｔａｔａａｃ
ａｇｃｇｃｇｃｔｇａａａａｇｃｃｇｃｇｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｇｔｇｇａｔａｃｃａｇｃａａａａａｃｃａｇｔｔｔａｇｃｃｔｇ
ａａａｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｇｃｇｇｃｇｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｃｇａａａｃａｔｔａｔｔａｔ
ｔａｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｔｔａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃ
ＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴ
ＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣ
ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＧ （配列番号１６）
実施例２：レンチウイルスパッケージング
２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、培地はＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳである。２日目に、細胞が９０％のコンフルエンスに達したとき、発現プラスミドおよびパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．０Ｇで共形質導入し、適切なモル比で混合されたプラスミドを培養容器に入れ、軽く振とうし、均一に混合し、インキュベーターに入れた。４８－７２時間後、ウイルスを回収し、遠心で浮かんだ死亡した２９３Ｔ細胞を除去した後、ウイルス含有培地をろ過し、濃縮し、精製し、分けて－８０℃で凍結保存し、そして力価を測定した。
実施例３：ＣＡＲ－１９ＤＮＴ細胞の製造
３．１ 人体末梢血サンプルの採取
健常者のドナーから末梢血を３０－４００ ｍｌ収集してヘパリンナトリウム含有管に入れた。
３．２ ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞の製造および検出
３．２．１ ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞の製造
方法１：
０日に、メーカーの説明書に従い、Ｒｏｓｓｅｔｔｓｅｐ(R)キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用し、ＲＢＣとのＲｏｓｅｔｔｉｎｇでＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を除去した。血液サンプルと抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８除去試薬マーカーを室温で２０分間インキュベートした後、血液を５０ ｍｌ遠心管で等体積Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅの密度勾配と層分離させた。２５００ ｒｐｍで２５分間遠心した後、Ｆｉｃｏｌｌと血漿の界面ですでにＰＢＭＣのうちのＣＤ４＋およびＣＤ８＋が除去された細胞、すなわち、ＤＮＴ細胞を収集し、０．９％生理食塩水で１回洗浄した。得られたＤＮＴ細胞を７５ ｃｍ２培養瓶において１－６×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地で３７℃と５％ＣＯ２で培養し、前記の培養瓶は抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（クローンＯＫＴ３）（５－２０μｇ／ｍｌ）でコーティングされ、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（２５０ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－７（２ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）、自家血漿（２０ ｖ％）を含む。
１日目に、製造されたＤＮＴ細胞を一晩培養した後、ＭＯＩが５のレンチウイルスを入れて一晩感染させた後、細胞の状態によって毎日または１日おきにＡＩＭ－Ｖ培地を追加した。
５日目に、ＤＮＴ細胞が十分に活性化し、増殖が盛んで、新鮮なＡＩＭ－Ｖ増殖培地（６０単位／ｍｌのゲンタマイシン、５００ ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン－２および組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－７（２ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）、自家血漿（１０ ｖ％）を含む）でＤＮＴ細胞を１－３×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように調整して続いて増幅培養を行った。
７日目に、１７５ ｃｍ２培養瓶に継代し、１－３×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地において続いて３日培養し、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（２５０ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）および５０ ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を含む。
１０日目に、１７５ ｃｍ２培養瓶の細胞を培養バッグに継代し、１－３×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地で１４日目まで続いて培養し、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（５００ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）および１００ ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を含む。
１４日目に、ＣＡＲ－１９ ＤＮＴ細胞を回収し、２５０ ｍｌ円錐底遠心瓶尖で細胞を収集し、９００×ｇで１０分間遠心し、さらに２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水（「溶媒」とも呼ばれる）で洗浄した。収集されたＣＡＲ－１９－ＤＮＴ細胞を０．１－１×１０７細胞／ｍＬの濃度で液体窒素において凍結保存し、これをＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞製剤の完成品とし、品質チェックに合格した後、臨床における使用に供した。
方法２：
０日に、メーカーの説明書に従い、Ｒｏｓｓｅｔｔｓｅｐ(R)キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用し、ＲＢＣとのＲｏｓｅｔｔｉｎｇでＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を除去した。血液サンプルと抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８除去試薬マーカーを室温で２０分間インキュベートした後、血液を５０ ｍｌ遠心管で等体積Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅの密度勾配と層分離させた。２５００ ｒｐｍで２５分間遠心した後、Ｆｉｃｏｌｌと血漿の界面ですでにＰＢＭＣのうちのＣＤ４＋およびＣＤ８＋が除去された細胞、すなわち、ＤＮＴ細胞を収集し、０．９％生理食塩水で１回洗浄した。分離して精製されたＤＮＴ細胞（磁気ビーズ：ＤＮＴ細胞＝１：１）をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズと均一に混合し、７５ ｃｍ２培養瓶において１－６×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地で３７℃と５％ＣＯ２で培養し、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（５００ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（２ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－７（２ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）および自家血漿（２０ ｖ％）を含む。
１日目に、製造されたＤＮＴ細胞を一晩培養した後、ＭＯＩが５のレンチウイルスを入れて一晩感染させた後、細胞の状態によって毎日または１日おきにＡＩＭ－Ｖ培地を追加した。
５日目に、培養瓶におけるＤＮＴ細胞を吹いて均一に混ぜた後、磁気ラックに通させてＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを除去し、新鮮なＡＩＭ－Ｖ増殖培地（６０単位／ｍｌのゲンタマイシン、５００ ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン－２およびヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－７（２ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）、自家血漿（１０ ｖ％）を含む）でＤＮＴ細胞を１－３×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように調整して続いて増幅培養を行った。
７日目に、１７５ ｃｍ２培養瓶に継代し、１－３×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地において続いて３日培養し、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（５００ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）を含む。
１０日目に、１７５ ｃｍ２培養瓶の細胞を培養バッグに継代し、１－３×１０６細胞／ｍｌでＡＩＭ－Ｖ培地で１４日目まで続いて培養し、前記ＡＩＭ－Ｖ培地はゲンタマイシン（６０単位／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－２（５００ ＩＵ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１５（１０ ｎｇ／ｍｌ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（１０ ｎｇ／ｍｌ）を含む。
１４日目に、ＣＡＲ－１９ ＤＮＴ細胞を回収し、２５０ ｍｌ円錐底遠心瓶尖で細胞を収集し、９００×ｇで１０分間遠心し、さらに２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水（「溶媒」とも呼ばれる）で洗浄した。収集されたＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞を０．１－１×１０７細胞／ｍＬの濃度で液体窒素において凍結保存し、これをＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞製剤の完成品とし、品質チェックに合格した後、臨床における使用に供した。
３．２．２ ＣＡＲ－１９ ＤＮＴ細胞の発現型および陽性率の検出
８日目と１３日目にそれぞれＤＮＴ発現型およびＣＡＲ１９－ＤＮＴ陽性率を検出し、このとき高純度のＤＮＴ細胞（純度が８５％以上に達し、図４に示す）およびｈＣＤ１９－ＣＡＲ陽性が高いＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞を得、フローサイトメーターによって抗ヒトのＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体マーカーで培養系におけるＤＮＴ細胞を同定し（図４）、同時に抗ヒト化ＣＤ１９のＦＭＣ６３－ＣＤ１９抗体で標識して形質導入陽性率を検出した（図４）。
実施例４：細胞殺傷実験
レンチウイルス感染の方法によってＣＤ１９分子を発現するＨｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ－ＣＤ１９の安定細胞系）を標的細胞として構築し、ＣＤ１９を発現しないＨｅｌａ細胞を標的細胞対照とした。培養の８日目と１３日目にそれぞれ収集されたＣＡＲ－ＣＤ１９が形質導入されていないＤＮＴ細胞およびヒト化ＣＡＲ－ＣＤ１９が形質導入されたＣＤ１９ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞をエフェクター細胞とし、エフェクター細胞対標的細胞比が２：１で、ＲＴＣＡ（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ）によってリアルタイムで殺傷状況をモニタリングした。
結果は図５に示すように、ＣＤ１９－ＣＡＲが形質導入されていないＤＮＴ細胞と比べ、ヒト化ＣＤ１９ＣＡＲが形質導入されたＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞は特異的にＨｅｌａ－ＣＤ１９細胞を殺傷し、上記２種の細胞はＣＤ１９陰性のＨｅｌａ細胞の殺傷において顕著な差がなかった。これによって、ヒト化ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞が特異的にＣＤ１９抗原を発現するＨｅｌａ－ＣＤ１９標的細胞を標的とすることが示された（図５）。５－Ａでは、 エフェクター細胞対標的細胞比が２：１の場合、ＲＴＣＡによってリアルタイムで動的殺傷状況が示された。最大殺傷時間（１８時間）に達した後、ＲＴＣＡによってモニタリングされたリアルタイム定量殺傷結果を５－Ｂに示す。定量殺傷結果から、培養の８日目と１３日目のＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞のＨｅｌａ－ＣＤ１９に対する特異的殺傷がそれぞれ９８．５２％と９８．１０％と高く（図５－Ｂ）、かつ最大殺傷効果が殺傷時間の延長に伴って継続したことが示された（図５－Ａ）。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (10)

  1. ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞であって、外因性のＣＡＲ構築物を発現し、前記ＣＡＲ構築物は式Ｉで表される構造を有することを特徴とする細胞。
    Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （式Ｉ）
    （式中において、
    Ｌはなしか、シグナルペプチド配列であり、
    ｓｃＦｖはＣＤ１９を標的とする抗体一本鎖可変領域配列であり、
    Ｈはなしか、ヒンジ領域であり、
    ＴＭは膜貫通ドメインであり、
    Ｃは共刺激シグナル分子であり、
    ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列であり、
    各「－」は独立に上記各エレメントを連結する連結ペプチドまたはペプチド結合を表す）。
  2. 前記ＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－二重陰性Ｔ細胞（ＣＡＲ１９－ＤＮＴ細胞）であることを特徴とする請求項１に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞。
  3. 前記汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲがノックアウトされたものであることを特徴とする請求項１に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞。
  4. 前記ＣＡＲ構築物が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞。
  5. 請求項１に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を製造する方法であって、
    （ｉ） 式Ｉで示されるＣＡＲ構築物をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
    Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （式Ｉ）
    （式中において、
    Ｌはなしか、シグナルペプチド配列であり、
    ｓｃＦｖはＣＤ１９を標的とする抗体一本鎖可変領域配列であり、
    Ｈはなしか、ヒンジ領域であり、
    ＴＭは膜貫通ドメインであり、
    Ｃは共刺激シグナル分子であり、
    ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列であり、
    各「－」は独立に上記各エレメントを連結する連結ペプチドまたはペプチド結合を表す）
    （ｉｉ） 少なくとも一つのＤＮＴ細胞を含有するＤＮＴ細胞培養液を提供し、工程（ｉ）の発現ベクターで前記ＤＮＴ細胞に対して形質導入することにより、請求項１に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を得る工程、ならびに
    （ｉｉｉ） 任意の工程（ｉｉ）で得られた反応型ＣＡＲ－ＤＮＴ細胞を検出する工程
    を含むことを特徴とする方法。
  6. 前記発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記工程（ｉ）のウイルス発現ベクターに配列番号１６で示されるポリヌクレオチド配列が組み込まれていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  8. 薬物組成物であって、
    （ａ） 請求項１または２に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞、および
    （ｂ） 薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
    を含むことを特徴とする組成物。
  9. 請求項１または２に記載のＣＤ１９を標的とする汎用型ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用であって、癌を予防および／または治療する薬物組成物または製剤を製造するためであることを特徴とする使用。
  10. 前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の使用。
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