TW202227616A

TW202227616A - 分離ｃｄ８＋選擇ｔ細胞的方法

Info

Publication number: TW202227616A
Application number: TW110131063A
Authority: TW
Inventors: 曼塔卡爾拉; 加岡巴杰瓦; 湯姆士魯卡斯; 阿里莫罕默德; 史蒂芬華特
Original assignee: 美商英麥提克斯股份有限公司
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-07-16
Also published as: US20220056411A1; WO2022040631A1

Abstract

一種產生工程化 T 細胞群的方法包括獲得包含 CD8+ T 細胞的細胞群、從獲得的細胞群中分離 CD8+ T 細胞、啟動分離的 CD8+ T 細胞、引入編碼 T 細胞受體 (TCR)（其結合與 MHC 分子複合的抗原）的核酸至啟動 CD8+ T 細胞中、並擴增引入的 CD8+ T 細胞以獲得工程化 T 細胞群。

Description

分離　CD8+　選擇　T　細胞的方法

相關申請的交叉引用

這是一項根據專利合作條約的國際申請，要求於 2020 年 8 月 21 日提交的美國臨時專利申請號 63/068,688 的優先權，其內容透過引用整體併入本文。 對作為相容 ASCII 文字文件 (.txt) 提交的序列表參考

根據 EFS-Web 法律框架和 37 CFR §§ 1.821-825（參見 MPEP § 2442.03(a)），採用 ASCII 相容文字文件形式的序列表（標題為「3000011-018977_Seq_Listing_ST25.txt」，創建於 2021 年 8 月 19 日，大小為 227,656 位元組）與本申請同時提交，序列表的全部內容透過引用併入本文。 發明領域

本公開一般涉及用於過繼免疫療法的 T 細胞製造方法。本公開還提出了基因轉導 T 細胞的方法、使用 T 細胞及其 T 細胞群的方法。

背景

在過繼細胞療法中，從患者中分離的淋巴細胞可離體基因修飾以表達重組蛋白，使細胞在隨後轉移回患者體內後能夠執行新的治療功能。例如，T 細胞可從淋巴細胞中分離並進行基因修飾以表達重組嵌合抗原受體（「CAR T 細胞」）和/或 T 細胞受體（「TCR療法」）。在 CAR T 細胞療法中，細胞可識別細胞表面上表達的抗原，而 TCR 療法細胞可識別以 MHC 複合體提呈於表面之細胞內腫瘤特異性蛋白質。TCR 細胞通常被改造為可識別腫瘤特異性抗原/MHC 組合。

在將修飾 T 細胞轉移回患者體內之前，修飾 T 細胞被離體擴增以產生足夠數量的細胞從而達到治療效果。當淋巴細胞被分離並返還至同一患者時，通常稱為「自體細胞療法」。當淋巴細胞從相容供體中分離並注入新的不同患者時，該過程通常稱為「同種異體細胞療法」。

可從中衍生用於過繼免疫療法的 CD8+ T 細胞的淋巴細胞庫可能包含初始和長壽有抗原經歷的記憶 T 細胞 (T _M)。T _M可進一步分為中央記憶 (T _CM) 和效應子記憶 (T _EM) 細胞的子集，它們的表型、歸巢特性和功能不同。CD8+ T _CM表達 CD62L 和 CCR7，它們可促進向淋巴結遷移，如果再次暴露於抗原，會迅速增殖。CD8+ T _EM缺乏 CD62L，能夠遷移至外周組織並表現出即時效應子功能。當應答抗原刺激時，CD8+ T _CM和 T _EM均分化為細胞溶解效應子 T 細胞 (T _E)，其表達高水準顆粒酶和穿孔蛋白，但壽命短。因此，臨床免疫治療試驗中 T 細胞存活率差可能僅僅是因為它們在體外培養過程中分化為註定會死亡的 T _E。

本領域需要一種快速、高效、安全的方法來分離淋巴細胞、基因修飾和離體擴增基因修飾淋巴細胞。此類方法可擴大過繼細胞治療方法（例如嵌合抗原受體技術 (CAR-T) 和 T 細胞受體技術 (TCR-T)）的部署，這些技術可為目前需要有效癌症治療的許多患者帶來希望。

各種實施方案小結

本公開涉及產生 CD8+ 細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 的方法，其包括 (a) 從外周血單核細胞 (PBMC) 中分離 CD8+ T 細胞，(b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動分離的 CD8+ T 細胞，(c) 將核酸引入啟動的 CD8+ T 細胞，(d) 擴增轉化的 CD8+ T 細胞，和 (e) 收穫轉化的 CD8+ T 細胞，其中步驟 (a) 至步驟 (e) 在 6 天內進行。另一方面，所述方法用時不超過 6 天來完成。一方面，所述方法可能需要 1、2、3、4、5、6、7、10 或 14 天來完成。所述方法可能進一步包括冷凍保存收穫的 T 細胞。另一方面，完成步驟 (b)、(c)、(d) 和 (e) 的總時間可以為約 6 天至約 10 天。另一方面，啟動 (b) 可在約 15 小時至約 24 小時的時間段內進行，轉導 (c) 可進行約 20 小時至約 28 小時，而擴增 (d) 可進行約 5 天至約 6 天。

在一實施方案中，外周血單核細胞 (PBMC) 可從健康供體中獲得。外周血單核細胞 (PBMC) 可從患者中獲得。外周血單核細胞 (PBMC) 可以為自體細胞。

在一實施方案中，分離 CD8+ T 細胞的數量可以為約 1 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 2 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 3 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 4 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 5 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 6 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 7 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 8 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 9 x 10 ⁸至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 3 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2.5 x 10 ⁹、約 1 x 10 ⁹至約 2 x 10 ⁹或約 1 x 10 ⁹至約 1.5 x 10 ⁹個。分離 CD8+ T 細胞的數量可以為約 1 x 10 ⁸個細胞、2 x 10 ⁸個細胞、3 x 10 ⁸個細胞、4 x 10 ⁸個細胞、5 x 10 ⁸個細胞、6 x 10 ⁸個細胞、7 x 10 ⁸個細胞、8 x 10 ⁸個細胞、9 x 10 ⁸個細胞、1 x 10 ⁹個細胞、2 x 10 ⁹個細胞、3 x 10 ⁹個細胞、4 x 10 ⁹個細胞、5 x 10 ⁹個細胞、6 x 10 ⁹個細胞、7 x 10 ⁹個細胞、8 x 10 ⁹個細胞、9 x 10 ⁹個細胞或 1 x 10 ¹⁰個細胞。

在一實施方案中，製劑中分離 CD8+ T 細胞的純度可以為約 60% 至約 100%、約 65% 至約 100%、約 70% 至約 100%、約 75% 至約 100%、約 80% 至約 100%、約 85% 至約 100%、約 90% 至約 100%、約 95% 至約 100%、約 96% 至約 100%、約 97% 至約 100%、約 98% 至約 100% 或約 99% 至約 100%。製劑中分離 CD8+ T 細胞的純度可以為約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。

在一實施方案中，CD8+ T 細胞為 CD4+。

在一實施方案中，抗 CD3 抗體的濃度可以為約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml。抗 CD3 抗體的濃度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml。

在一實施方案中，抗 CD28 抗體的濃度可以為約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml。抗 CD28 抗體的濃度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml。

在任何實施方案中，抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體的各自濃度可以為約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml 或約 0.4 µg/ml 至約 0.5 µg/ml。抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體的濃度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml。在一實施方案中，抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體組合的濃度可以為約 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 µg/ml。

在一實施方案中，CD8+ T 細胞的啟動可以在約 1 小時至約 120 小時、約 1 小時至約 108 小時、約 1 小時至約 96 小時、約 1 小時至約 84 小時、約 1 小時至約 72 小時、約 1 小時至約 60 小時、約 1 小時至約 48 小時、約 1 小時至約 36 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 2 小時至約 24 小時、約 4 小時至約 24 小時、約 6 小時至約 24 小時、約 16 小時至約 20 小時、約 8 小時至約 24 小時、約 10 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 24 小時、約 12 小時至約 72 小時、約 24 小時至約 72 小時、約 6 小時至約 48 小時、約 24 小時至約 48 小時、約 6 小時至約 72 小時或約 1 小時至約 12 小時的時間段內完成。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119 或 120 小時內完成。CD8+ T 細胞的啟動可以進行約 1-10 小時、11-30 小時、31-50 小時、51-100 小時或 101-120 小時。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 天內完成。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 1-14 天內完成。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 13 天內完成。

在一實施方案中，抗 CD3 抗體、抗 CD28 抗體或兩者可以固定在固體支持物上。固體支持物形式可以為珠、盒、柱、圓柱體、盤、皿（例如玻璃皿、PETRI 皿）、纖維、膜、過濾器、微量滴定板（例如，96 孔微量滴定板）、多刀片式棒、網、丸、板、環、棒、卷、片、載玻片、條、托盤、試管或西林瓶。固相支持物可以為單個離散體（例如，單個試管、單個珠）、任意數量的多個基底體（例如，10 試管的架、數個珠）或其組合（例如，一個托盤包括多個微量滴定板、填充有珠的柱、填充有珠的微量滴定板）。固體支持物可以為珠、試管、罐、托盤、皿、板、燒瓶或袋的表面。固體支持物可以為陣列。固體支持物可以為袋。

在一實施方案中，將核酸引入 T 細胞可包括轉染包含核酸的裸 DNA。將核酸引入 T 細胞可包括轉導包含核酸的病毒載體。病毒載體可以為逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體。核酸可以編碼重組蛋白。重組蛋白可以為嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞因子、抗體或雙特異性結合分子。核酸可以編碼 T 細胞受體 (TCR)。

在一實施方案中，T 細胞擴增可在存在細胞因子的情況下進行。細胞因子可以為干擾素 α (IFN-α)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-9 (IL-9)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、巨噬細胞集落刺激因子 (MCSF)、白介素-6 (IL-6)、嗜酸粒細胞趨化因子-1/CCL11、干擾素γ 誘導蛋白 10 (IP-10)、IL-RA、巨噬細胞炎症蛋白 1α (MIP-1α)、巨噬細胞炎症蛋白 1β (MIP-1β)、白介素 13 (IL-13)、IL-2R，或其組合。T 細胞可以在存在 IL-2 的情況下擴增。

在一實施方案中，T 細胞啟動可在存在細胞因子的情況下進行。細胞因子可以為干擾素 α (IFN-α)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-9 (IL-9)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、巨噬細胞集落刺激因子 (MCSF)、白介素-6 (IL-6)、嗜酸粒細胞趨化因子-1/CCL11、干擾素γ 誘導蛋白 10 (IP-10)、IL-RA、巨噬細胞炎症蛋白 1α (MIP-1α)、巨噬細胞炎症蛋白 1β (MIP-1β)、白介素 13 (IL-13)、IL-2R，或其組合。T 細胞可在存在 IL-2，優選為人 IL-2，更優選為重組人 IL-2 (rhIL-2) 的情況下被啟動。

在任何實施方案中，細胞因子可以為干擾素 α (IFN-α)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-9 (IL-9)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、巨噬細胞集落刺激因子 (MCSF)、白介素-6 (IL-6)、嗜酸粒細胞趨化因子-1/CCL11、干擾素γ 誘導蛋白 10 (IP-10)、IL-RA、巨噬細胞炎症蛋白 1α (MIP-1α)、巨噬細胞炎症蛋白 1β (MIP-1β)、白介素 13 (IL-13)、IL-2R，或其組合，並且細胞因子的含量可以為約 1 ng/mL 和 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1 ng/mL 和 100 ng/mL、約 100 ng/mL 和 200 ng/mL、約 100 ng/mL 和 500 ng/mL、約 250 ng/mL 和 400 ng/mL、約 10 ng/mL 和 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 和 350 ng/mL 之間。

在一實施方案中，細胞因子可以包括 IL-7 和 IL-15 的組合。

在一實施方案中，IL-7 的濃度可以為約 1 ng/ml 至 100 ng/ml、約 1 ng/ml 至 90 ng/ml、約 1 ng/ml 至 80 ng/ml、約 1 ng/ml 至 70 ng/ml、約 1 ng/ml 至 60 ng/ml、約 1 ng/ml 至 50 ng/ml、約 1 ng/ml 至 40 ng/ml、約 1 ng/ml 至 30 ng/ml、約 1 ng/ml 至 20 ng/ml、約 1 ng/ml 至 15 ng/ml 或約 1 ng/ml 至 10 ng/ml。

在一實施方案中，IL-7 的含量可以為約 1 ng/mL 和 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1 ng/mL 和 100 ng/mL、約 100 ng/mL 和 200 ng/mL、約 100 ng/mL 和 500 ng/mL、約 250 ng/mL 和 400 ng/mL、約 10 ng/mL 和 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 和 350 ng/mL 之間。

在一實施方案中，IL-15 的濃度可以為約 5 ng/ml 至 500 ng/ml、約 5 ng/ml 至 400 ng/ml、約 5 ng/ml 至 300 ng/ml、約 5 ng/ml 至 200 ng/ml、約 5 ng/ml 至 150 ng/ml、約 5 ng/ml 至 100 ng/ml、約 10 ng/ml 至 100 ng/ml、約 20 ng/ml 至 100 ng/ml、約 30 ng/ml 至 100 ng/ml、約 40 ng/ml 至 100 ng/ml 或約 50 ng/ml 至 100 ng/ml。

在一實施方案中，IL-15 的含量可以為約 1 ng/mL 和 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490 或 500 ng/mL。細胞因子的含量可以為約 1 ng/mL 和 100 ng/mL、約 100 ng/mL 和 200 ng/mL、約 100 ng/mL 和 500 ng/mL、約 250 ng/mL 和 400 ng/mL、約 10 ng/mL 和 100 ng/mL 或約 150 ng/mL 和 350 ng/mL 之間。

在一實施方案中，步驟 (a) 至步驟 (e) 可以在封閉系統中進行。

在一實施方案中，透過本文所述方法產生的收穫 T 細胞數量可以為約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹³、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹²、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹²、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹¹、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹¹、約 1 x 10 ⁹至約 5 x 10 ¹⁰、約 1 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 2 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 3 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 4 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 5 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 6 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 7 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰、約 8 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰或約 9 x 10 ⁹至約 1 x 10 ¹⁰個細胞。

在一實施方案中，透過本文所述方法產生的收穫 T 細胞數量可以為約 1 x 10 ⁹個細胞、2 x 10 ⁹個細胞、3 x 10 ⁹個細胞、4 x 10 ⁹個細胞、5 x 10 ⁹個細胞、6 x 10 ⁹個細胞、7 x 10 ⁹個細胞、8 x 10 ⁹個細胞、9 x 10 ⁹個細胞、1 x 10 ¹⁰個細胞、1 x 10 ¹⁰個細胞、2 x 10 ¹⁰個細胞、3 x 10 ¹⁰個細胞、4 x 10 ¹⁰個細胞、5 x 10 ¹⁰個細胞、6 x 10 ¹⁰個細胞、7 x 10 ¹⁰個細胞、8 x 10 ¹⁰個細胞、9 x 10 ¹⁰個細胞、1 x 10 ¹¹個細胞、2 x 10 ¹¹個細胞、3 x 10 ¹¹個細胞、4 x 10 ¹¹個細胞、5 x 10 ¹¹個細胞、6 x 10 ¹¹個細胞、7 x 10 ¹¹個細胞、8 x 10 ¹¹個細胞、9 x 10 ¹¹個細胞、1 x 10 ¹²個細胞、2 x 10 ¹²個細胞、3 x 10 ¹²個細胞、4 x 10 ¹²個細胞、5 x 10 ¹²個細胞、6 x 10 ¹²個細胞、7 x 10 ¹²個細胞、8 x 10 ¹²個細胞、9 x 10 ¹²個細胞、1 x 10 ¹³個細胞、2 x 10 ¹³個細胞、3 x 10 ¹³個細胞、4 x 10 ¹³個細胞、5 x 10 ¹³個細胞、6 x 10 ¹³個細胞、7 x 10 ¹³個細胞、8 x 10 ¹³個細胞、9 x 10 ¹³個細胞或 1 x 10 ¹⁴個細胞。

在一實施方案中，可以透過本文所述方法產生基因修飾 T 細胞群。

在一實施方案中，治療癌症患者的方法可以包括向患者施用包含本文所述的基因修飾 T 細胞群的組合物，其中基因修飾 T 細胞可殺滅表面提呈與 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自SEQ ID NO: 1-160，並且所述癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食管癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、默克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌 (GBC, CCC)、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴細胞白血病 (ALL)、子宮癌 (UEC)、滑膜肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、圓形細胞脂肪肉瘤、轉移性直腸黏膜黑色素瘤、尿路上皮癌、黑色素瘤、食管胃交界部 (EGJ) 癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、頭頸癌、粘液樣/圓細胞脂肪肉瘤 (MRCLS)、多發性骨髓瘤、腫瘤或其組合組成的組。MHC 分子可以為 MHC I 類。

在一實施方案中，組合物進一步包括佐劑。

在一實施方案中，佐劑可以為抗 CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG) 的顆粒製劑、病毒體、白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-12 (IL-12)、白介素-13 (IL-13)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、白介素-23 (IL-23) 或其組合。

在一實施方案中，在癌症患者引發免疫應答的方法可以包括向患者施用包含本文所述的基因修飾 T 細胞群的組合物，其中基因修飾 T 細胞可殺滅提呈與表面 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自SEQ ID NO: 1-160，其中所述癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食管癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、默克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌 (GBC, CCC)、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴細胞白血病 (ALL)、子宮癌 (UEC)、滑膜肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、圓形細胞脂肪肉瘤、轉移性直腸黏膜黑色素瘤、尿路上皮癌、黑色素瘤、食管胃交界部 (EGJ) 癌、頭頸癌、粘液樣/圓細胞脂肪肉瘤 (MRCLS)、多發性骨髓瘤、腫瘤或其組合組成的組。

在一實施方案中，啟動可以在無血清培養基中進行。

在另一實施方案中，引入可以在無血清培養基中進行。

在另一實施方案中，啟動和引入可以在無血清培養基中進行。

在另一實施方案中，啟動和引入可以在無血清培養基中進行，擴增可以在存在血清的情況下進行。

在一實施方案中，病毒載體可以用水泡性口炎病毒 (VSV-G) 的包膜蛋白進行假型化處理。

在另一實施方案中，啟動可以在存在他汀類藥物的情況下進行。

在另一實施方案中，他汀類藥物可以選自阿托伐他汀、西立伐他汀、達伐他汀、氟吲他汀、氟伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、維洛他汀和瑞舒伐他汀。

在一實施方案中，所述方法可以進一步包括施用化療藥物。化療藥物的劑量可足以耗竭患者的 T 細胞群。化療可在施用 T 細胞前約 4-7 天或約 5-7 天施用。化療藥物可以為環磷醯胺、氟達拉濱或其組合。化療藥物可包括以約 400–600 mg/m ²/天的環磷醯胺給藥。化療藥物可包括以約 10–30 mg/m ²/天的氟達拉濱給藥。

在一實施方案中，所述方法還可以包括在施用包含 T 細胞的組合物之前用低劑量輻射對患者進行預治療。在施用包含 T 細胞的組合物之前，低劑量輻射可包括約 1.4 Gy，持續 1-6 天，優選約 5 天。

在一實施方案中，患者可以為 HLA-A*02。

在一實施方案中，患者可以為 HLA-A*06。

在一實施方案中，所述方法可以進一步包括施用抗 PDl 抗體。抗 PD1 抗體可以為人源化抗體。抗 PD1 抗體可以為 pembrolizumab。抗 PD1 抗體的劑量可以為約 200 mg。抗 PD1 抗體可以在施用 T 細胞後每 3 週施用一次。

在一實施方案中，T 細胞的劑量可以為約 0.8–1.2 x 10 ⁹個 T 細胞之間。T 細胞的劑量可以為約 0.5 x 10 ⁸至約 10 x 10 ⁹個 T 細胞。T 細胞的劑量可以為約 1.2–3 x 10 ⁹個 T 細胞、約 3–6 x 10 ⁹個 T 細胞、約 10 x 10 ⁹個 T 細胞、約 5 x 10 ⁹個 T 細胞、約 0.1 x 10 ⁹個 T 細胞、約 1 x 10 ⁸個 T 細胞、約 5 x 10 ⁸個 T 細胞、約 1.2–6 x 10 ⁹個 T 細胞、約 1–6 x 10 ⁹個 T 細胞或約 1–8 x 10 ⁹個 T 細胞。

在一實施方案中，T 細胞可以 3 個劑量施用。T 細胞劑量可能會隨每次劑量增加。T 細胞可以透過靜脈輸注施用。

在一實施方案中，產生工程化 T 細胞群的方法可以包括獲得包含 CD8+ T 細胞的細胞群、從獲得的細胞群中分離 CD8+ T 細胞、啟動分離的 CD8+ T 細胞、引入編碼 T 細胞受體 (TCR)（其結合與 MHC 分子複合的抗原）的核酸至啟動 CD8+ T 細胞中、並擴增引入的 CD8+ T 細胞以獲得工程化 T 細胞群。

在一實施方案中，所述細胞群可以包含外周血單核細胞 (PBMC)。

在一實施方案中，PBMC 可包含少於 25% 的 CD8+ 細胞。

在一實施方案中，分離可包括使 CD8+ 細胞與抗 CD8 抗體接觸。

在一實施方案中，啟動可以在存在抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體的情況下進行。

在一實施方案中，TCR 可選自表 1。

在一實施方案中，抗原可選自 SEQ ID NO: 1-161。

在一實施方案中，TCR 可以與 SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 50) 結合。

在一實施方案中，TCR 可選自 R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 163）、R11P3D3（SEQ ID NO: 204 和 205）、R16P1C10（SEQ ID NO: 206 和 207）、R16P1E8（SEQ ID NO: 208 和 209）、R17P1A9（SEQ ID NO: 210 和 211）、R17P1D7（SEQ ID NO: 212 和 213）、R17P1G3（SEQ ID NO: 214 和 215）、R17P2B6（SEQ ID NO: 216 和 217）和 R11P3D3KE（SEQ ID NO: 218 和 219）。

在一實施方案中，MHC 分子可以為 I 類 MHC 分子。

在一實施方案中，組合物可包含透過本公開的方法產生的工程化 T 細胞群。

在一實施方案中，所述組合物還可包含至少一種佐劑，所述佐劑選自抗 CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG) 的顆粒製劑、病毒體、白介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL -12、IL-13、IL-15、IL-21 和 IL-23。

在一實施方案中，產生工程化 T 細胞群的方法可以包括獲得包含 T 細胞的細胞群、使獲得的細胞群靜息、啟動靜息的細胞群、引入編碼 T 細胞受體 (TCR)（其結合與 MHC 分子複合的抗原）的核酸至在不存在血清的情況下的啟動細胞群中、並擴增引入的細胞群以獲得工程化 T 細胞群。

在一實施方案中，靜息可以進行約 2-8 小時、約 2-6 小時或約 2-8 小時。

在一實施方案中，靜息可以在存在血清的情況下進行。

在一實施方案中，靜息可以進行約 2-8 小時、約 2-6 小時或約 2-4 小時。

在一實施方案中，啟動可以在不存在血清的情況下進行。

在一實施方案中，產生工程化 T 細胞群的方法可以包括獲得包含 CD8+ T 細胞的細胞群、從獲得的細胞群中分離 CD8+ T 細胞、啟動分離的 CD8+ T 細胞、引入編碼嵌合抗原受體 (CAR)（其與抗原結合）的核酸至啟動 CD8+ T 細胞中、並擴增引入的 CD8+ T 細胞以獲得工程化 T 細胞群。

在一實施方案中，產生工程化 T 細胞群的方法可以包括獲得包含 T 細胞的細胞群、使獲得的細胞群靜息、啟動靜息的細胞群、引入編碼嵌合抗原受體 (CAR)（其與抗原結合）的核酸至在不存在血清的情況下的啟動細胞群中、並擴增引入的細胞群以獲得工程化 T 細胞群。

優選實施方案的詳細說明過繼 T 細胞療法

使用基因修飾 T 細胞的過繼 T 細胞療法在不同臨床環境中是一種有吸引力的策略。Ho et al. Cancer Cell(2003) 3:431

437，其內容透過引用整體併入本文。用於生產表達重組蛋白（例如嵌合抗原受體 (CAR)、T 細胞受體 (TCR)、細胞因子、抗體和雙特異性結合分子）的基因修飾 T 細胞產品較短製造工藝（例如 6 天），與較長（例如 8-10 天）工藝相比，可產生具有較低分化記憶表型的產品。儘管較短製造工藝可能是過繼性 T 細胞療法的一項優點，但較短製造工藝可能會影響功能性轉導 T 細胞的總細胞數，尤其是當癌症患者的輸注首選為更高劑量 T 細胞時。為了滿足更高劑量的需要，可以使用不同策略來增加功能性轉導細胞的總產量。這些可能包括擴大整個工藝、提高轉導效率或從 CD8+ 選擇 T 細胞而不是未分離 PBMC 開始以轉導 CD8 依賴性 TCR。儘管可以實現製造工藝進一步放大，但是費用可能更高、時間可能更長並可能影響製造能力。

為了解決此問題，發明人使用 CD8+ 選擇 T 細胞作為起始材料來生產表達重組蛋白（例如 CAR、TCR、細胞因子、抗體和雙特異性結合分子）的基因修飾 T 細胞產品，其與使用 PBMC 作為起始材料製造的大規模或 GMP 規模相比，可產生更多的基因修飾 T 細胞產品（例如 CAR 或 TCR 轉化 T 細胞產品），同時保持了與任一工藝製造的基因修飾 T 細胞產品相當的功能。這導致所需 T 細胞產量驚人增加，而無需昂貴的放大複製成本或長時間處理（例如，大於 7 天）。

本文使用的「啟動」泛指 T 細胞已被充分刺激而誘導可檢測細胞增殖的狀態。啟動還可與誘導細胞因子產生和可檢測的效應子功能相關。術語「啟動的 T 細胞」尤其系指正在增殖的 T 細胞。

本文使用的「抗體」和「免疫球蛋白」泛指任何同種型的抗體或免疫球蛋白、抗體片段（其保留與抗原特異性結合，包括但不限於 Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’) ₂Fv、scFv、二價 scFv 和 Fd 片段）、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體和融合蛋白（包括抗體的抗原特異性靶區和非抗體蛋白）。

本文使用的「雙特異性結合分子」和「雙特異性抗原結合分子」泛指能夠同時與兩種不同抗原結合的抗原結合蛋白，例如雙特異性抗體。例如，與常規抗體不同，本公開的雙特異性抗原結合分子可包含來自 TCR 的至少 6 個 CDR。在一實施方案中，與常規抗體不同，本公開的抗原結合蛋白可以包含來自 TCR 的至少一個可變 α 結構域和至少一個可變 β 結構域。

本文使用的「嵌合抗原受體」或「CAR」或「CARs」泛指基因修飾受體，其將抗原特異性移植至細胞（例如 T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞和幹細胞）上。CAR 可包括至少一個抗原特異性靶向區 (ASTR)、鉸鏈或莖結構域、跨膜結構域 (TM)、一個或多個共刺激結構域 (CSD) 和細胞內啟動結構域 (IAD)。在某些實施方案中，CSD 是可選的。在另一實施方案中，CAR 為雙特異性 CAR，其對兩種不同的抗原或表位具有特異性。在 ASTR 與靶抗原特異性結合後，IAD 會啟動細胞內信號傳導。例如，IAD 可以利用抗體的抗原結合特性，以非 MHC 限制方式將 T 細胞的特異性和反應性重定向至選定靶標。非 MHC 限制性抗原識別賦予表達 CAR 的 T 細胞能力，使之能夠獨立於抗原加工而識別抗原，從而繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在 T 細胞中表達時，CAR 有利地不與內源性 T 細胞受體 (TCR) α 和β 鏈進行二聚化。

本文公開的 T 細胞製造方法可包括修飾 T 細胞以表達一個或多個 CAR。T 細胞可以為 αβ T 細胞、γδ T 細胞或天然殺傷 T 細胞。在各種實施方案中，本公開提出了採用設計用於表達將細胞毒性重定向至腫瘤細胞的 CAR 的載體進行基因學工程改造的 T 細胞。CAR 分子結合針對靶抗原（例如，腫瘤抗原）的基於抗體的特異性與 T 細胞受體啟動細胞內結構域，以產生表現出特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白。本文所用的術語「嵌合」描述由不同來源的不同蛋白質或 DNA 的部分組成。

CAR 可以包含與特異性靶抗原結合的細胞外結構域（也稱為結合結構域或抗原特異性結合結構域）、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。CAR 的主要特徵可能是其能夠重新定向免疫效應細胞特異性，從而觸發增殖、細胞因子產生、吞噬作用或產生以主要組織相容性 (MHC) 非依賴方式介導靶抗原表達細胞死亡的分子，利用單克隆抗體、可溶性配體或細胞特異性共受體的細胞特異性靶向作用能力。

在特定的實施方案中，CAR 可以包含細胞外結合結構域，其包括但不限於抗體或其抗原結合片段、束縛配體、或共受體的細胞外結構域，其與腫瘤相關抗原 (TAA) 或腫瘤特異性抗原 (TSA) 靶抗原特異性結合。在某些實施方案中，TAA 或 TSA 可以在血液癌細胞上表達。在另一實施方案中，TAA 或 TSA 可以在實體瘤細胞上表達。在特定的實施方案中，實體瘤可以是膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌、除非小細胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、攝護腺癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、胃癌、脾癌、皮膚癌、除膠質母細胞瘤以外的腦癌、腎癌、甲狀腺癌等等。

在特定實施方案中，TAA 或 TSA 可選自由 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 和 VEGFR2 組成的組。

一方面，表達 CAR 的 T 細胞可選擇性地識別提呈 SEQ ID NO: 1-161中所述 TAA 肽的細胞。

CAR 的結合結構域

在特定的實施方案中，本文考慮的 CAR 包含與腫瘤細胞上表達的靶多肽（例如，靶抗原）特異性結合的細胞外結合結構域。本文所用的術語「結合結構域」、「細胞外結構域」、「細胞外結合結構域」、「抗原特異性結合結構域」和「細胞外抗原特異性結合結構域」可以互換使用，並提供能與目標靶抗原特異性結合的 CAR。結合結構域可以包括具有特異性識別並結合生物分子（例如，細胞表面受體或腫瘤蛋白、脂質、多糖或其他細胞表面靶分子或其組分）能力的任何蛋白、多糖、寡肽或肽。結合結構域可包括目標生物分子的任何天然存在、合成、半合成或重組產生的結合伴侶。

在特定實施方案中，CAR 的細胞外結合結構域可包括抗體或其抗原結合片段。「抗體」系指結合劑，其為至少包含一條輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽，其特異性地識別並結合靶抗原（例如肽、脂質、多糖或含有抗原決定簇的核酸，例如被免疫細胞識別的那些靶抗原）的表位。抗體可包括其抗原結合片段。所述術語還可以包括基因工程改造的形式，如嵌合抗體（例如，人源化鼠抗體）、異源綴合物抗體（例如，雙特異性抗體）及其抗原結合片段。另請參閱 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997。

在特定實施方案中，靶抗原可以為 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽的表位。

輕鏈和重鏈可變區可以包含被三個高變區也稱為「互補決定區」或「CDR」打斷的「框架」區。CDR 可透過常規方法定義或鑒定，例如透過根據 Kabat et al (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84:2440-2443 (1987) 所述的序列；（請參閱 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其透過引用併入本文），或透過根據 Chothia et al (Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol.Biol, 196(4):901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)) 所述的結構。上述參考文獻的內容透過引用整體併入本文。不同輕鏈或重鏈的框架區序列在諸如人之類的物種中可能是相對保守的。抗體的框架區（亦即組成輕鏈和重鏈的組合框架區）可用於在三維空間中定位和排列 CDR。CDR 主要負責與抗原表位結合。每條鏈的 CDR 通常可以稱為 CDR1、CDR2 和 CDR3（從 N 端開始依次編號），並且通常還可以透過特定 CDR 所在位置的鏈來識別。因此，位於抗體重鏈可變結構域中的 CDR 可以稱為 CDRH1、CDRH2 和 CDRH3，而位於抗體輕鏈可變結構域中的 CDR 稱為 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。具有不同特異性（即，不同抗原的不同組合位點）之抗體可具有不同 CDR。儘管不同的抗體之間 CDR 不同，但 CDR 內僅有限數量的氨基酸位置直接參與抗原結合。CDR 內的這些位置稱為特異性決定殘基 (SDR)。

提及「VH」或「VH」系指免疫球蛋白重鏈的可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab 或其他抗體片段的可變區。提及「VL」或「VL」系指免疫球蛋白輕鏈的可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab 或其他抗體片段的可變區。

「單克隆抗體」是由 B 淋巴細胞的單個克隆或由轉染了單個抗體輕鏈和重鏈基因的細胞產生的抗體。單克隆抗體可以透過本領域技術人員已知的方法來產生，例如，透過將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞融合而製備雜交抗體形成細胞。單克隆抗體可以包括人源化單克隆抗體。

「嵌合抗體」具有來自一種物種（例如人）的框架殘基和來自另一物種（諸如小鼠）的 CDR（通常賦予抗原結合特性）。在特定優選的實施方案中，本文公開的 CAR 可以包含是嵌合抗體或其抗原結合片段的抗原特異性結合結構域。

在某些實施方案中，抗體可以是與腫瘤細胞上表面蛋白特異性結合的人源化抗體（例如人源化單克隆抗體）。「人源化」抗體為免疫球蛋白，包括人框架區和來自非人（例如小鼠、大鼠或合成的）免疫球蛋白的一個或多個 CDR。人源化抗體可以透過基因工程改造構建（例如，參見美國專利號 5,585,089，其內容透過引用整體併入本文）。

在實施方案中，CAR 的細胞外結合結構域可包含抗體或其抗原結合片段，包括但不限於駱駝 Ig（駱駝科抗體 (VHH)）、Ig NAR、Fab 片段、Fab' 片段、F(ab)'2 片段、F(ab)'3 片段、Fv、單鏈 Fv 抗體（「scFv」）、bis-scFv、(scFv)2、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、二硫鍵穩定的 Fv 蛋白（「dsFv」）和單結構域抗體（sdAb、納米抗體）。

本文所用的「駱駝 Ig」或「駱駝科 VHH」系指重鏈抗體的最小已知抗原結合單位（Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21:3490-3498 (2007)，其內容透過引用整體併入本文）。「重鏈抗體」或「駱駝科抗體」系指含有兩個 VH 結構域且無輕鏈的抗體（Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)；WO94/04678；W094/25591；美國專利號 6,005,079；其內容透過引用整體併入本文）。

「免疫球蛋白新抗原受體」的「IgNAR」系指來自鯊魚免疫庫的一類抗體，其由一個可變新抗原受體 (VNAR) 結構域和五個恒定新抗原受體 (CNAR) 結構域的同二聚體組成。

抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩種相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段都有一個抗原結合位點和殘餘「Fc」片段，其名稱反映了其能夠容易結晶。Fab 片段包含重鏈和輕鏈可變結構域，還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域 (CH1)。Fab' 片段與 Fab 片段的區別在於，在重鏈 CH1 結構域的羧基末端添加了一些殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH 是本文中 Fab′ 的名稱，其中恒定結構域的半胱氨酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2 抗體片段最初生成為成對 Fab' 片段，在它們之間有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。

「Fv」是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在單鏈 Fv (scFv) 物種中，一個重鏈和一個輕鏈可變結構域可以透過柔性肽接頭共價連接，這樣，輕鏈和重鏈就可以締合成類似於兩鏈 Fv 物種的「二聚體」結構。

術語「雙抗體」是指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段包含與相同多肽鏈 (VH-VL) 內輕鏈可變結構域 (VL) 連接的重鏈可變結構域 (VH)。透過使用太短以至於無法允許同一條鏈上兩個結構域之間配對的接頭，所述結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體在，例如， EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；和 Hollinger et al, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993) 中更完全地描述。三抗體和四抗體也在 Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中進行了描述。上述參考文獻的內容透過引用整體併入本文。

「單結構域抗體」或「sdAb」或「納米抗體」系指由抗體重鏈的可變區（VH 結構域）或抗體輕鏈的可變區（VL 結構域）組成的抗體片段（Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11):484-490，該文中的內容透過引用整體併入本文）。

「單鏈 Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的 VH 和 VL 結構域，其中這些結構域以單個多肽鏈和任一方向（例如 VL-VH 或 VH-VL）存在。通常情況下，scFv 多肽進一步包括 VH 和 VL 結構域之間的多肽接頭，其使得 scFv 能夠形成所需的抗原結合結構。

在某一實施方案中，scFv 結合於 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽。

CAR 的接頭

在某些實施方案中，CAR 可以在各個結構域之間，例如在 VH 和 VL 結構域之間包含接頭殘基，其被添加以適當地間隔和構象分子。CAR 可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或五個以上的接頭。在特定實施方案中，接頭的長度可以為約 1 至約 25 個氨基酸、約 5 至約 20 個氨基酸或約 10 至約 20 個氨基酸，或任何中間的氨基酸長度。在一些實施方案中，接頭的長度可以為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 個或更多氨基酸。接頭的說明性示例包括甘氨酸聚合物 (G)n；甘氨酸-絲氨酸聚合物 (Gi_sSi_5)n，其中 n 為至少一、二、三、四或五的整數；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；和本領域已知的其他柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物相對而言是非結構化的，因此可能能夠充當融合蛋白（例如 CAR）的結構域之間的中性系鏈。甘氨酸可能甚至比丙氨酸進入顯著更多的 phi-psi 空間，並且與具有較長側鏈的殘基相比受到的限制要少得多（請參閱 Tang et al, Pharmaceutics 2021, 13, 422，其內容透過引用整體併入本文）。普通技術人員可認識到，在特定實施例中，CAR 的設計可以包括可能是全部或部分柔性的接頭，使得所述接頭可以包括柔性接頭以及賦予柔性較差結構的一個或多個部分，以提供所需的 CAR 結構。

在特定實施方案中，CAR 可以包括 scFV，其可以進一步包含可變區連接序列。「可變區連接序列」是一個氨基酸序列，其將重鏈可變區連接至輕鏈可變區，並提供與兩個亞結合結構域相互作用相容的間隔子功能，從而獲得的多肽保留包含相同輕鏈和重鏈可變區的抗體對同一靶分子的特異性結合親和力。在一實施方案中，可變區連接序列的長度可以為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 個或更多個氨基酸。在一特定實施方案中，可變區連接序列可以包含甘氨酸-絲氨酸聚合物 (Gi_sSi_5)n，其中 n 為至少 1、2、3、4 或 5 的整數。在另一實施方案中，可變區連接序列包含 (G ₄S) ₃氨基酸接頭。

CAR 的間隔子結構域

在特定實施方案中，CAR 的結合結構域可跟隨一個或多個「間隔子結構域」，其是指使抗原結合結構域遠離效應細胞表面以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合和啟動的區域（Patel et al, Gene Therapy, 1999; 6:412-419，該文中的內容透過引用整體併入本文）。間隔子結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。在某些實施方案中，間隔子結構域可以為免疫球蛋白的一部分，包括但不限於一個或多個重鏈恒定區，例如，CH2 和 CH3。間隔子結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列。在一實施方案中，間隔子結構域可以包括 IgG1 的 CH2 和 CH3。

CAR 的鉸鏈結構域

CAR 的結合結構域通常可跟隨一個或多個「鉸鏈結構域」，其可以在使抗原結合結構域遠離效應細胞表面定位以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合和啟動中起作用。CAR 通常可以包括結合結構域和跨膜結構域 (TM) 之間的一個或多個鉸鏈結構域。鉸鏈結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。鉸鏈結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列。適用於 CAR 的示例性鉸鏈結構域可能包括源自 1 型膜蛋白（例如，CD8a、CD4、CD28 和 CD7）的細胞外區的鉸鏈區，其可能為這些分子的野生型鉸鏈區，也可能被改變。在另一實施方案中，鉸鏈結構域可以包括 CD8α 鉸鏈區。

CAR 的跨膜 (TM) 結構域

「跨膜結構域」可以是 CAR 的一部分，其可以融合細胞外結合部分和細胞內信號傳導結構域，並且將 CAR 錨定至免疫效應細胞的質膜。TM 結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。示例性 TM 結構域可以衍生自 T 細胞受體的 α、β 或 ζ 鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137 和 CD154（至少包括其跨膜區）。在一實施方案中，CAR 可以包含衍生自 CD8a 的 TM 結構域。在另一實施方案中，本文考慮的 CAR 包含衍生自 CD8α 的 TM 結構域和短寡肽或多肽接頭，優選長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個氨基酸之間，其連接 CAR 的 TM 結構域和細胞內信號傳導結構域。甘氨酸-絲氨酸接頭提供了特別合適的接頭。

CAR 的細胞內信號傳導結構域

在特定實施方案中，CAR 可以包含細胞內信號傳導結構域。「細胞內信號傳導結構域」系指 CAR 的一部分，其參與結合於靶抗原的有效 CAR 的信息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如啟動、細胞因子產生、增殖和細胞毒性活性，包括向 CAR 結合的靶細胞釋放細胞毒性因子，或用結合於細胞外 CAR 結構域的抗原引發其他細胞反應。

術語「效應子功能」是指細胞的專門功能。例如，T 細胞的效應子功能可以是溶細胞活性或幫助或包括細胞因子分泌的活性。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」是指蛋白質的一部分，其可以轉導效應子功能信號並指導細胞執行專門的功能。雖然通常可以使用整個細胞內信號傳導結構域，但是在很多情況下，不必使用整個結構域。就可以使用細胞內信號傳導結構域的截短部分程度而言，可使用此類截短部分代替整個結構域，只要可以轉導效應子功能信號即可。術語細胞內信號傳導結構域可指包括足以轉導效應子功能信號的細胞內信號傳導結構域的任何截短部分。

已知僅透過 TCR 產生的信號不足以完全啟動 T 細胞，並且還可能需要次級或共刺激信號。因此，可以說 T 細胞啟動是由以下兩類不同細胞內信號傳導結構域介導的：透過 TCR（例如，TCR/CD3 複合體）啟始抗原依賴性一級啟動的一級信號傳導結構域；以抗原非依賴性方式作用從而提供次級或共刺激信號的共刺激信號傳導結構域。在優選實施方案中，CAR 可以包括細胞內信號傳導結構域，其可包含一個或多個「共刺激信號傳導結構域」和「一級信號傳導結構域」。一級信號傳導結構域可以以刺激性方式或抑制性方式調節 TCR 複合體的一級啟動。以刺激方式起作用的一級信號傳導結構域可能包含信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序或 ITAM。在本發明中特別有用之包含 ITAM 的一級信號傳導結構域的說明性示例可以包括衍生自 TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的結構域。在特定優選實施方案中，CAR 可以包括 CD3ζ 一級信號傳導結構域和一個或多個共刺激信號傳導結構域。細胞內一級信號傳導和共刺激信號傳導結構域可以以任何順序串聯連接至跨膜結構域的羧基末端。

CAR 可以包含一個或多個共刺激信號傳導結構域，以增強表達 CAR 受體的 T 細胞的療效和擴增。本文所用的術語「共刺激信號傳導結構域」或「共刺激結構域」系指共刺激分子的細胞內信號傳導結構域。此類共刺激分子的說明性示例可以包括 CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS (CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM、NKD2C 和 CD83。在一實施方案中，CAR 可以包含一個或多個選自由 CD28、CD137 和 CD134 組成組的共刺激信號傳導結構域以及一個 CD3ζ 一級信號傳導結構域。

在一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-Al+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽結合；源於選自以下組成組的多肽的跨膜結構域：CD8α；CD4、CD45、PD1 和 CD152；以及一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274 和 CD278；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。

在再一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽結合；鉸鏈結構域，其選自由以下組成的組：IgG1 鉸鏈/CH2/CH3 和 CD8α 以及 CD8α；源於選自由以下組成組的多肽的跨膜結構域：CD8α；CD4、CD45、PD1 和 CD152；以及一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD 134 和 CD 137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。

在再一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，進一步包括接頭，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽結合；鉸鏈結構域，其選自由以下組成的組：IgG1 鉸鏈/CH2/CH3 和 CD8α 以及 CD8α；跨膜結構域，其包含源自選自由以下組成組的多肽的 TM 結構域：CD8a；CD4、CD45、PD1 和 CD 152，以及一個短寡肽或多肽接頭，優選長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個氨基酸之間，其將 TM 結構域連接至 CAR 的細胞內信號傳導結構域；以及一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，選自由以下組成的組：CD28、CD 134 和 CD137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。

在一特別實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM 或 VEGFR2 多肽結合；含有 CD8α 多肽的鉸鏈結構域；含有約 3 個氨基酸的多肽接頭的 CD8α 跨膜結構域；一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD134 和 CD137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。

本文使用的「細胞毒性 T 淋巴細胞」(CTL) 泛指在其表面表達 CD8 的 T 淋巴細胞（例如，CD8+ T 細胞）。此類細胞可優選為有抗原經歷的「記憶」T 細胞（TM 細胞）。

本文使用的「供體」泛指獻血的人類受試者。

本文使用的「有效量」、「治療有效量」或「有療效量」泛指一種藥劑的量或兩種藥劑組合的量，當給予哺乳動物或其他受試者治療疾病時，該量足以影響該疾病的治療。「治療有效量」將根據藥劑、疾病及其嚴重程度以及需治療受試者的年齡、體重等而變化。

本文使用的「基因修飾」泛指將外源核酸引入細胞的方法，無論外源核酸是否整合至細胞的基因組中。

本文使用的「基因修飾細胞」泛指含有外源核酸的細胞，無論外源核酸是否整合至細胞的基因組中。

本文使用的「免疫細胞」泛指源自骨髓中所產生造血幹細胞 (HSC) 的白血細胞（白細胞）。「免疫細胞」包括但不限於淋巴細胞（T 細胞、B 細胞、天然殺傷 (NK) (CD3-CD56+) 細胞）和髓源性細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞）。「T 細胞」包括表達 CD3 的所有類型的免疫細胞，包括 T 輔助細胞（CD4+ 細胞）、細胞毒性 T 細胞（CD8+ 細胞）、T 調節細胞 (Treg) 和γ-δ T 細胞以及 NK T 細胞（CD3+ 和 CD56+）。技術人員將理解，如本公開通篇所使用的 T 細胞和/或 NK 細胞可包括僅 T 細胞、僅 NK 細胞或 T 細胞和 NK細胞兩者。在本文提供的某些說明性實施方案和方面，T 細胞被啟動和轉導。此外，在本文提供的某些說明性組合物實施方案和方面中提供了 T 細胞。「細胞毒性細胞」包括 CD8+ T 細胞、自然殺傷 (NK) 細胞、NK-T 細胞、γδ T 細胞和中性粒細胞，這些細胞是能夠介導細胞毒性反應的細胞。

本文中可互換使用的「個體」、「受試者」、「宿主」和「患者」泛指哺乳動物，包括但不限於人類、鼠類（例如大鼠、小鼠）、兔類（例如兔）、非人靈長類、犬科、貓科和有蹄類（例如馬、牛、綿羊、豬、山羊）。

本文使用的「外周血單核細胞」或「PBMC」泛指具有圓形細胞核的任何外周血細胞。PBMC 包括淋巴細胞，例如 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞以及單核細胞。

本文可互換使用的「多核苷酸」和「核酸」泛指任何長度的核苷酸聚合形式，為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。因此，該術語包括但不限於單股、雙股或多股 DNA 或 RNA、基因組 DNA、cDNA、DNA-RNA 雜交體，或多聚體（包括嘌呤和嘧啶鹼基或其他天然、化學或生化修飾的、非天然的或衍生而得的核苷酸鹼基）。

「T 細胞」或「T 淋巴細胞」是本領域公認的術語，包括胸腺細胞、幼稚 T 淋巴細胞、未成熟 T 淋巴細胞、成熟 T 淋巴細胞、靜息 T 淋巴細胞或啟動 T 淋巴細胞。適用於特定實施方案的示例性 T 細胞群包括但不限於輔助性 T 細胞（HTL；CD4+ T 細胞）、細胞毒性 T 細胞（CTL；CD8+ T 細胞）、CD4+CD8+ T 細胞、CD4-CD8− T 細胞或其他任何 T 細胞亞群。適用於特定實施方案的其他示例性 T 細胞群包括但不限於表達以下一種或多種標誌物的 T 細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197 和 HLA-DR，如果需要，可透過正向或負向選擇技術進一步分離。

本文所用的「T 細胞受體 (TCR)」泛指 T 細胞上的蛋白質受體，其由 α (α) 和 β (β) 鏈的異二聚體組成，儘管在一些細胞中 TCR 由 γ 和 δ (γ/δ) 鏈組成。可能在包含 TCR 的任何細胞上修飾 TCR，包括輔助 T 細胞、細胞毒性 T 細胞、記憶 T 細胞、調節性 T 細胞、天然殺傷 T 細胞或 γδ T 細胞。

TCR 一般存在於 T 淋巴細胞（或 T 細胞）表面上，其通常負責識別與主要組織相容性複合體 (MHC) 分子結合的抗原。在 95% T 細胞中，它是由 α 和 β 鏈組成的異二聚體，而 5% 的 T 細胞具有由 γ 和 δ 鏈組成的 TCR。TCR 與抗原和 MHC 的結合透過由相關酶、共同受體和特化輔助分子介導的一系列生化事件導致其 T 淋巴細胞的啟動。在免疫學中，CD3 抗原（CD 代表分化簇）是由哺乳動物中四條不同鏈（CD3-γ、CD3δ 和兩次 CD3 ε）組成的蛋白質複合體，其與被稱為 T 細胞受體 (TCR) 和 ζ鏈的分子相關聯以在 T 淋巴細胞中產生啟動信號。TCR、ζ-鏈和 CD3 分子一起構成 TCR 複合體。CD3-γ、CD3δ 和 CD3ε 鏈是含有單個細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關細胞表面蛋白。CD3 鏈的跨膜區帶負電荷，這種特徵可使這些鏈與帶正電荷的 TCR 鏈（TCRα 和 TCRβ）相關聯。CD3 分子的細胞內尾部含有一種稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序（簡稱 ITAM）的單個保守基序，其對於 TCR 的信號傳導能力至關重要。

T 細胞可以表達美國專利申請公開號 2017/0267738、美國專利申請公開號 2017/0312350、美國專利申請公開號 2018/0051080、美國專利申請公開號 2018/0164315、美國專利申請公開號 2018/0161396、美國專利申請公開號 2018/0162922、美國專利申請公開號 2018/0273602、美國專利申請公開號 2019/0016801、美國專利申請公開號 2019/0002556、美國專利申請公開號 2019/0135914、美國專利 10,538,573、美國專利 10,626,160、美國專利申請公開號 2019/0321478、美國專利申請公開號 2019/0256572、美國專利 10,550,182、美國專利 10,526,407、美國專利申請公開號 2019/0284276、美國專利申請公開號 2019/0016802、美國專利申請公開號 2019/0016803、美國專利申請公開號 2019/0016804、美國專利 10,583,573、美國專利申請公開號 2020/0339652、美國專利 10,537,624、美國專利 10,596,242、美國專利申請公開號 2020/0188497、美國專利 10,800,845、美國專利申請公開號 2020/0385468、美國專利 10,527,623、美國專利 10,725,044、美國專利申請公開號 2020/0249233、美國專利 10,702,609、美國專利申請公開號 2020/0254106、美國專利 10,800,832、美國專利申請公開號 2020/0123221、美國專利 10,590,194、美國專利 10,723,796、美國專利申請公開號 2020/0140540、美國專利 10,618,956、美國專利申請公開號 2020/0207849、美國專利申請公開號 2020/0088726、和美國專利申請公開號 2020/0384028 中所述的 TCR 和抗原結合蛋白；本文所述的這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。T 細胞可以為 αβ T 細胞、γδ T 細胞或天然殺傷 T 細胞。

此外，TCR 可以包含 α 鏈 (TCRα) 和 β 鏈 (TCRβ)。可用於 TCR 的 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈可選自 R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 163）、R20P1H7（SEQ ID NO: 164 和 165）、R7P1D5（SEQ ID NO: 166 和 167）、R10P2G12（SEQ ID NO: 168 和 169）、R10P1A7（SEQ ID NO: 170 和 171）、R4P1D10（SEQ ID NO: 172 和 173）、R4P3F9（SEQ ID NO: 174 和 175）、R4P3H3（SEQ ID NO: 176 和 177）、R36P3F9（SEQ ID NO: 178 和 179）、R52P2G11（SEQ ID NO: 180 和 181）、R53P2A9（SEQ ID NO: 182 和 183）、R26P1A9（SEQ ID NO: 184 和 185）、R26P2A6（SEQ ID NO: 186 和 187）、R26P3H1（SEQ ID NO: 188 和 189）、R35P3A4（SEQ ID NO: 190 和 191）、R37P1C9（SEQ ID NO: 192 和 193）、R37P1H1（SEQ ID NO: 194 和 195）、R42P3A9（SEQ ID NO: 196 和 197）、R43P3F2（SEQ ID NO: 198 和 199）、R43P3G5（SEQ ID NO: 200 和 201）、R59P2E7（SEQ ID NO: 202 和 203）、R11P3D3（SEQ ID NO: 204 和 205）、R16P1C10（SEQ ID NO: 206 和 207）、R16P1E8（SEQ ID NO: 208 和 209）、R17P1A9（SEQ ID NO: 210 和 211）、R17P1D7（SEQ ID NO: 212 和 213）、R17P1G3（SEQ ID NO: 214 和 215）、R17P2B6（SEQ ID NO: 216 和 217）、R11P3D3KE（SEQ ID NO: 218 和 219）、R39P1C12（SEQ ID NO: 220 和 221）、R39P1F5（SEQ ID NO: 222 和 223）、R40P1C2（SEQ ID NO: 224 和 225）、R41P3E6（SEQ ID NO: 226 和 227）、R43P3G4（SEQ ID NO: 228 和 229）、R44P3B3（SEQ ID NO: 230 和 231）、R44P3E7（SEQ ID NO: 232 和 233）、R49P2B7（SEQ ID NO: 234 和 235）、R55P1G7（SEQ ID NO: 236 和 237）或 R59P2A7（SEQ ID NO: 238 和 239）。T 細胞可以為 αβ T 細胞、γδ T 細胞或天然殺傷 T 細胞。

表 1 顯示了當肽與 MHC 分子複合時，該肽與哪些 TCR 結合的實例。（人類的 MHC 分子可稱為 HLA，即人白細胞抗原）。表 1 ： T 細胞受體和肽

TCR 名稱	肽 (SEQ ID NO:)
R20P1H7, R7P1D5, R10P2G12	KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 118)
R10P1A7	KIQEILTQV (SEQ ID NO: 240)
R4P1D10, R4P3F9, R4P3H3	FLLDGSANV (SEQ ID NO: 141)
R36P3F9, R52P2G11, R53P2A9	ILQDGQFLV (SEQ ID NO: 26)
R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5, R59P2E7	KVLEYVIKV (SEQ ID NO: 105)
R11KEA, R11P3D3, R16P1C10, R16P1E8, R17P1A9, R17P1D7, R17P1G3, R17P2B6, R11P3D3KE	SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 50)
R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R41P3E6, R43P3G4, R44P3B3, R44P3E7, R49P2B7, R55P1G7, R59P2A7	ALSVLRLAL (SEQ ID NO: 151)

表 2 ： TCR 序列

SEQ ID NO：	描述	序列
162	R11KEA α 鏈	MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRKETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
163	R11KE β 鏈	MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRETMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
164	R20P1H7 α 鏈	MEKMLECAFIVLWLQLGWLSGEDQVTQSPEALRLQEGESSSLNCSYTVSGLRGLFWYRQDPGKGPEFLFTLYSAGEEKEKERLKATLTKKESFLHITAPKPEDSATYLCAVQGENSGYSTLTFGKGTMLLVSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
165	R20P1H7 β 鏈	MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLGPGLAAYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
166	R7P1D5 α 鏈	MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEYSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
167	R7P1D5 β 鏈	MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRANTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
168	R10P2G12 α 鏈	MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEGNSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
169	R10P2G12 β 鏈	MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLSSGSHQETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
170	R10P1A7 α 鏈	MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAESKETRLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
171	R10P1A7 β 鏈	MLLLLLLLGPGISLLLPGSLAGSGLGAWSQHPSVWICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARAGGHEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWVWNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
172	R4P1D10 α 鏈	MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNFHDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
173	R4P1D10 β 鏈	MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVASAYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
174	R4P3F9 α 鏈	MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
175	R4P3F9 β 鏈	MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
176	R4P3H3 α 鏈	MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKAGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
177	R4P3H3 β 鏈	MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSLLTSGGDNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
178	R36P3F9 α 鏈	METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATVSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
179	R36P3F9 β 鏈	MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSSTSGGLSGETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
180	R52P2G11 α 鏈	MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSAYGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
181	R52P2G11 β 鏈	MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLGSPDGNQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
182	R53P2A9 α 鏈	MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYNSYAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
183	R53P2A9 β 鏈	MGPGLLCWVLLCLLGAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPISGHKSVSWYQQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSLDGTSEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
184	R26P1A9 α 鏈	METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCLIGASGSRLTFGEGTQLTVNPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
185	R26P1A9 β 鏈	MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSYFGWNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
186	R26P2A6 α 鏈	MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSDVSGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
187	R26P2A6 β 鏈	MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASTTPDGTDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
188	R26P3H1 α 鏈	MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
189	R26P3H1 β 鏈	MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSRAEGGEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
190	R35P3A4 α 鏈	MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASPTGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
191	R35P3A4 β 鏈	MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSLGGASQEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
192	R37P1C9 α 鏈	MKLVTSITVLLSLGIMGDAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIHWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRATLRDAAVYYCILFNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
193	R37P1C9 β 鏈	MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSSGETNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
194	R37P1H1 α 鏈	MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESNYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFGYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
195	R37P1H1 β 鏈	MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSNEGQGWEAEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
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本文使用的術語「細胞毒性 T 淋巴細胞」(CTL) 系指在其表面表達 CD8 的 T 淋巴細胞（例如，CD8+ T 細胞）。在一些實施方案中，此類細胞優選為有抗原經歷的「記憶」T 細胞（T _M細胞）。

本文使用的術語「基因修飾」包括將外源核酸引入細胞的方法，無論外源核酸是否整合至細胞的基因組中。

本文使用的術語「基因修飾細胞」包括含有外源核酸的細胞，無論外源核酸是否整合至細胞的基因組中。

本文使用的「治療」等泛指獲得所需的藥理學和/或生理學作用。所述作用在完全或部分預防疾病或其症狀方面可以是預防性的，和/或在部分或完全治癒疾病和/或歸因於該疾病的不良作用方面可以是治療性的。本文使用的「治療」涵蓋對哺乳動物（例如人）疾病的任何治療，包括：(a) 防止可能易患該疾病但尚未確診有該疾病的受試者發生此疾病；(b) 抑制疾病，例如阻止其發展；(c) 緩解疾病，例如，使疾病消退。 CD8+ T 細胞的分離

由於 CD8+ T 細胞與其他細胞（例如樹突細胞、CD4+ T 細胞和 NK 細胞）相比具有相對簡單的功能，因此 CD8+ T 細胞在抗癌免疫治療期間不太可能引起非預期副作用。通常情況下，抗原特異性 CD8+ T 細胞可以透過使用 MHC I 類/肽多聚體來分離，但是該 MHC I 類/肽多聚體可能刺激 T 細胞受體 (TCR)。因此，此方法可能有一些缺點，包括細胞分離後細胞凋亡引起的高細胞死亡率和產生足量抗原特異性 CD8+ T 細胞所需的長時間培養。

CD8+ T 細胞可透過正向或負向選擇或兩者選擇從外周血單核細胞 (PBMC) 製備物中分離。正向選擇可能產生高度純化的 CD8+ 細胞群。負向選擇（例如，耗盡 CD4+ 細胞，同時產生足量 CD8+ 細胞）可能在選擇程序後仍然存在較低水準的污染非 CD8+ 群。CD8+ T 細胞可以使用例如抗 CD8 抗體從 PBMC 製備物中分離，所述抗體對 CD8+ 細胞可能具有高親和力，在選擇過程中可能不會啟動細胞，並且能夠容易地從細胞中洗脫。抗 CD8 抗體是本領域已知的並且為市售的。

在本公開的另一實施方案中，CD8+ 細胞可以為 CD8+CD62L+ T 細胞，其可以使用兩步程序分離。在耗盡非 CD8+ 細胞（例如 CD4+ T 細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、B 細胞、幹細胞、樹突狀細胞、NK 細胞、粒細胞、γ/δ T 細胞或紅細胞，這些可使用一種生物素偶聯抗體混合物標記，其中可能含有針對 CD4、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ 和/或 CD235a（血型糖蛋白 A）的抗體）後，CD8+CD62L+ T 細胞可以使用 CD62L 微珠進行正向分離。磁性標記 CD8+CD62L+ T 細胞可以保留在柱內，例如 MACS 柱 (Miltenyi Biotec)，並在從磁場中取出柱後洗脫。收集 CD8+T 細胞，並任選地保存，直至用於本文所述的方法中，以產生基因修飾 CD8+ T 細胞。 T 細胞啟動

可以啟動 CD8+ 選擇 T 細胞，其中 T 細胞已被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖。啟動還可與誘導細胞因子產生和可檢測的效應子功能相關。僅透過 TCR 產生的信號不足以完全啟動 T 細胞，還需要一種或多種次級信號或共刺激信號。因此，T 細胞啟動包括透過 TCR/CD3 複合體的一級刺激信號以及一種或多種次級共刺激信號。共刺激可以透過已經接受一級啟動信號的 T 細胞的增殖和/或細胞因子產生來證明，例如透過 CD3/TCR 複合體或透過 CD2 的刺激。

可透過啟動 T 細胞並用與輔助分子結合的配體刺激 T 細胞表面上的輔助分子來誘導 T 細胞群增殖。可透過使 T 細胞與第一製劑接觸來完成 T 細胞群的啟動，所述第一製劑可刺激 T 細胞中 TCR/CD3 複合體相關信號。可以透過連接 T 細胞受體 (TCR)/CD3 複合體或 CD2 表面蛋白或透過直接刺激受體偶聯信號傳導途徑來完成T 細胞中 TCR/CD3 複合體相關信號的刺激。因此，抗 CD3 抗體、抗 CD2 抗體或蛋白激酶 C 啟動劑可與鈣離子載體一起使用來啟動 T 細胞群。抗 CD3 和抗 CD2 抗體都是本領域已知的並且為市售的。

為了誘導增殖，可使啟動的 T 細胞群與第二製劑接觸，所述第二製劑可刺激 T 細胞表面上的輔助分子。例如，可用針對 T 細胞表面上 CD28 分子的抗 CD28 抗體來刺激 CD4+ T 細胞群增殖。抗 CD28 抗體是本領域已知的並且為市售的。

或者，CD4+ T 細胞可以用 CD28 的天然配體（例如：B7-1 和 B7-2）來刺激。天然配體可為可溶性、在細胞膜上、或與固相表面偶聯。可透過使用單克隆抗體 ES5.2D8 來完成 CD8+ T 細胞群的增殖，所述單克隆抗體 ES5.2D8 與 CD9（啟動 T 細胞上存在的分子量為約 27kD 的輔助分子）結合。或者，可透過刺激一種或多種細胞內信號誘導啟動 T 細胞群的增殖，所述細胞內信號由連接輔助分子（如：CD28）產生。

T 細胞可以在存在細胞因子（例如，干擾素 α (IFN-α)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-7 (IL-7)、白介素-9 (IL-9)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、巨噬細胞集落刺激因子 (MCSF)、白介素-6 (IL-6)、嗜酸粒細胞趨化因子-1/CCL11、干擾素γ 誘導蛋白 10 (IP-10)、IL-RA、巨噬細胞炎症蛋白 1α (MIP-1α)、巨噬細胞炎症蛋白 1β (MIP-1β)、白介素 13 (IL-13)、IL-2R，或其組合）的情況下進行啟動。T 細胞可在存在 IL-2，優選為人 IL-2，更優選為重組人 IL-2 (rhIL-2) 的情況下被啟動。細胞因子可以約 50 至 150 U/mL、約 50 至約 100 U/mL 或約 100U/mL 的濃度存在。

提供一級啟動信號的製劑和提供共刺激劑的製劑可以以可溶性形式加入或偶聯至固相表面。在一項優選實施方案中，兩種製劑可以偶聯至相同的固相表面。

在啟動和刺激 T 細胞表面上的輔助分子之後，可監測應對持續暴露於配體或其他製劑（其在細胞內作用以模擬輔助分子介導的途徑）的 T 細胞增殖進展。當 T 細胞增殖速率降低時，可用另外的抗 CD3 抗體和共刺激配體等重新啟動和重新刺激 T 細胞，以誘導進一步的增殖。可透過檢查細胞大小來監測 T 細胞增殖速率。或者，可透過測定應對暴露於配體或其他製劑（例如 B7-1 或 B7-2）的細胞表面分子表達來監測 T 細胞增殖。可重複監測和再刺激 T 細胞以持續增殖，從而產生比原始 T 細胞群數量增加約 100 倍至約 100,000 倍的 T 細胞群。

抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體各自的濃度可能不超過約 0.1 µg/ml、不超過約 0.2 µg/ml、不超過約 0.3 µg/ml、不超過約 0.4 µg/ml、不超過約 0.5 µg/ml、不超過約 0.6 µg/ml、不超過約 0.7 µg/ml、不超過約 0.8 µg/ml、不超過約 0.9 µg/ml、不超過約 1.0 µg/ml、不超過約 2.0 µg/ml、不超過約 4.0 µg/ml、不超過約 6.0 µg/ml、不超過約 8.0 µg/ml 或不超過約 10.0 µg/ml。

抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體各自的濃度可能為約 0.1 µg/ml 至約 1.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.8 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.6 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 0.25 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.3 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.3 µg/ml 至約 0.4 µg/ml、約 0.2 µg/ml 至約 0.5 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 10.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 8.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 6.0 µg/ml、約 0.1 µg/ml 至約 4.0 µg/ml 或約 0.1 µg/ml 至約 2.0 µg/ml。

抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體可以固定在固相支持物上。固相支持物形式可以為珠、盒、柱、圓柱體、盤、皿（例如玻璃皿、PETRI 皿）、纖維、膜、過濾器、微量滴定板（例如，96 孔微量滴定板）、多刀片式棒、網、丸、板、環、棒、卷、片、載玻片、條、托盤、試管或西林瓶。固相支持物可以為單個離散體（例如，單個試管、單個珠）、任意數量的多個基底體（例如，10 試管的架、數個珠）或其組合（例如，一個托盤包括多個微量滴定板、填充有珠的柱、填充有珠的微量滴定板）。Conti et al.(2003) Current Protocols in Cytometry John Wiley & Sons, Inc. 固相支持物可以為珠、試管、罐、托盤、皿、板、燒瓶或袋的表面。固相支持物可以為陣列。

CD8+ T 細胞的啟動可以進行約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119 或 120 小時。T 細胞的啟動可以進行約 1-10 小時、11-30 小時、15-25 小時、31-50 小時、51-100 小時或 101-120 小時。

CD8+ T 細胞的啟動可以在約 0°C 至約 42°C 之間的溫度下進行。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 1 ^oC、2 ^oC、3 ^oC、4 ^oC、5 ^oC、6 ^oC、7 ^oC、8 ^oC、9 ^oC、10 ^oC、11 ^oC、12 ^oC、13 ^oC、14 ^oC、15 ^oC、16 ^oC、17 ^oC、18 ^oC、19 ^oC、20 ^oC、21 ^oC、22 ^oC、23 ^oC、24 ^oC、25 ^oC、26 ^oC、27 ^oC、28 ^oC、29 ^oC、30 ^oC、31 ^oC、32 ^oC、33 ^oC、34 ^oC、35 ^oC、36 ^oC、37 ^oC、38 ^oC、39 ^oC、40 ^oC 或 41 ^oC 的溫度下進行。CD8+ T 細胞的啟動可以在約 30°C 至約 40°C 之間的溫度下進行。

啟動 T 細胞的常規方法可能涉及開放系統和勞動密集型工藝，其使用市售珠或非組織培養物處理的 24 孔或 6 孔板且包覆有抗 CD3 和抗 CD28 抗體（「板結合」），各抗體的濃度為 1 ug/mL。但是，開放系統方法可能需要較長的時間（例如，大約 8 小時）才能完成。為了簡化開放系統和勞動密集型工藝，發明人將系統簡化為適用於封閉系統的工藝，所述封閉系統可與市售封閉系統（例如，G-Rex ^®（細胞擴增）系統和 Xuri ^®細胞擴增系統）的容器（例如，袋）配合使用，從而使 T 細胞啟動特徵、T 細胞轉導性和終產物功能性與使用常規方法啟動的 T 細胞相當。另外，本公開所述的方法（例如，燒瓶結合方法）可能需要較短的時間（例如，約 1 小時）即可完成，這比傳統方法快約 8 倍。

封閉系統可以為 CliniMACS Prodigy®（用於細胞製造的封閉和自動化平臺）、WAVE (XURI ^®) 生物反應器（細胞擴增系統）、WAVE (XURI ^®) 生物反應器（細胞擴增系統）與 BioSafe Sepax ^®II（細胞分離系統）的組合、G-Rex ^®封閉系統（細胞擴增系統）或 G-Rex ^®封閉系統（細胞擴增系統）與 BioSafe Sepax ^®II（細胞分離系統）的組合。 T 細胞轉化

編碼重組蛋白（例如 CAR、TCR、細胞因子、抗體和/或雙特異性結合分子）的核酸可以作為裸 DNA 或在合適的載體（例如病毒載體）中引入 CD8+ T 細胞中。使用裸 DNA 透過電穿孔或其他非病毒基因轉移（例如但不限於聲穿孔）穩定轉染 T 細胞的方法是本領域已知的。例如，參見美國專利第 6,410,319 號； T Cell Protocols(2 ^ndEdition) De Libero (Ed.) 2009 Humana Press; Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4 ^thEdition) Green & Sambrook (Ed.) 2012 Cold Spring Harbor Press。裸 DNA 通常系指以適當表達方向包含於質粒表達載體中的編碼重組蛋白的 DNA。有利的情況是，使用裸 DNA 可減少產生表達重組蛋白的 T 細胞所需的時間。

可以使用病毒載體（例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體）將編碼重組蛋白的核酸引入 CD8+ T 細胞。根據本公開的方法使用的合適載體在受試者的 T 細胞中為非複製型。已知有大量基於病毒的載體，其中細胞中維持的病毒拷貝數足夠低，可維持細胞的存活性。可用於本文所述方法的示例性載體包括 pFB-neo 載體 (STRATAGENE®) 以及基於 γ-逆轉錄病毒、慢病毒 (LV)（例如人類免疫缺陷病毒 (HIV)）、猿猴空泡病毒 40 ( SV40)、愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV)、單純皰疹病毒 (HSV) 或牛乳頭瘤病毒 (BPV) 的載體。用病毒載體穩定轉染 T 細胞的方法和材料是本領域已知的。 Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and ProtocolsMachida (Ed.) 2003 Humana Press。 例如參見 T Cell Protocols(2 ^ndEdition) De Libero (Ed.) 2009 Humana Press; Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4 ^thEdition) Green & Sambrook (Ed.) 2012 Cold Spring Harbor Press。

一方面，病毒可指天然存在的病毒以及人造病毒。根據本公開一些實施方案的病毒可能是包膜病毒或無包膜病毒。細小病毒（例如 AAV）是無包膜病毒的實例。在一優選實施方案中，病毒可能是包膜病毒。在優選實施方案中，病毒可能是逆轉錄病毒，特別是慢病毒。可以促進真核細胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括 HIV-1 衍生慢病毒載體 (LV)，這些載體用水皰性口炎病毒 (VSV-G)、修飾的貓內源性逆轉錄病毒 (RD114TR) 和修飾的長臂猿白血病病毒 (GALVTR) 的包膜糖蛋白 (GP) 處理成為假型。這些包膜蛋白可以有效地促進其他病毒的進入，例如細小病毒，包括腺相關病毒 (AAV)，從而證明它們的廣泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括莫洛尼鼠白血病病毒 (MLV) 4070 env（如 Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、RD114 env、嵌合包膜蛋白 RD114pro 或 RDpro（透過用 HIV-1 基質/衣殼 (MA/CA) 切割序列取代 RD114 的 R 肽切割序列構建的 RD114-HIV嵌合體，如 Bell et al. Experimental Biology and Medicine2010; 235:1269–1276 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、桿狀病毒 GP64 env（如 Wang et al. J. Virol. 81:10869-10878, 2007 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或 GALV env（如 Merten et al., J. Virol. 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或其衍生物。

術語「他汀類藥物」、「伐他汀類藥物」或在本文中可互換使用的「3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (HMG-CoA) 還原酶抑制劑」系指抑制 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (HMG-CoA) 的藥劑。該酶參與 HMG-CoA 轉化為甲羥戊酸，這是膽固醇生物合成的步驟之一。此類抑制很容易根據本領域技術人員眾所周知的標準測定方法確定。

可根據本公開使用的代表性他汀類藥物包括：阿托伐他汀，其公開於美國專利號 4,681,893；阿托伐他汀鈣，公開於美國專利號 5,273,995；西伐他汀，公開於美國專利號 5,502,199；達伐他汀，公開於美國專利號 5,316,765；氟吲他汀，公開於美國專利號 4,915,954；氟伐他汀，公開於美國專利號 4,739,073；洛伐他汀，公開於美國專利號 4,231,938；美伐他汀，公開於美國專利號 3,983,140；普伐他汀，公開於美國專利號 4,346,227；辛伐他汀，公開於美國專利號 4,444,784；維洛他汀，公開於美國專利號 4,448,784和美國專利號 4,450,171；瑞舒伐他汀，公開於美國專利號 6,858,618 和美國專利號 7,511,140。這些參考文獻的每一項均透過引用整體併入本文。優選的 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A 還原酶抑制劑可包括阿托伐他汀、阿托伐他汀鈣（也稱為立普妥®）、洛伐他汀（也稱為 Mevacor®）、普伐他汀（也稱為 Pravachol®）、辛伐他汀（也稱為舒降之®）和瑞舒伐他汀。

因為低密度脂蛋白受體 (LDLR) 是水泡性口炎病毒 (VSV) 的受體並且他汀類藥物可增加 LDLR 表達，因此，VSV-G 假型慢病毒的轉導效率可透過誘導更高 LDLR 表達的他汀類藥物來提高。（Gong et al, 「Rosuvastatin Enhances VSV-G Lentiviral Transduction of NK Cells via Upregulation of the Low-Density Lipoprotein Receptor,」 Mol Ther Methods Clin Dev.(2020) 17: 634-646；該文中的內容透過引用整體併入本文）。

一方面，本公開可包括製備用於免疫治療的 T 細胞的方法，包括 (a) 從外周血單核細胞 (PBMC) 中分離 CD8+ T 細胞，(b) 在存在他汀類藥物的情況下啟動分離的 CD8+T 細胞，(c) 使 VSV-G 包膜蛋白假型處理的病毒載體至啟動 CD8+ T 細胞中來轉導啟動 T 細胞，(d) 擴增轉化的 CD8+ T 細胞，以及 (e) 收穫擴增的 CD8+ T 細胞，其中完成步驟 (b)、(c)、(d) 和 (e) 的總時間為約 6 天至約 10 天、約 6 天、約 7 天、約 8 天、約 9 天或約 10 天。

一旦確立轉染或轉導 T 細胞能夠將重組蛋白（例如 CAR 和 TCR）表達為具有所需調節和所需水準的表面膜蛋白，則可以確定 CAR 和TCR 在宿主細胞中是否具有提供所需信號誘導的功能。隨後，可將轉導的 T 細胞重新引入或給予受試者以啟動受試者的抗腫瘤反應。 T 細胞擴增

T 細胞轉導後，細胞可能在基因轉移入細胞後約 1、2、3、4、5 天或更長時間內離體繁殖數天、數週或數月作為未分離群。另一方面，轉導後，克隆轉導的細胞，並可能離體擴增證明存在單個整合或附加體型維持的表達盒或質粒且表達重組蛋白（例如 TCR）的克隆。選擇用於擴增的克隆顯示出了特異性識別和裂解肽表達靶細胞的能力。可透過用 IL-2 或結合共同 γ 鏈的其他細胞因子（例如，IFN-α、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL- 15、IL-21 等）刺激來擴增基因修飾 T 細胞。可透過用人工抗原提呈細胞刺激來擴增基因修飾 T 細胞。基因修飾 T 細胞可用人工抗原提呈細胞進行擴增，或者用抗體（如：OKT3，其與 T 細胞表面上的 CD3 交聯）進行擴增。基因修飾 T 細胞亞群可用人工抗原提呈細胞進行刪除，或者用抗體（如：Campath，其與 T 細胞表面上的 CD52 結合）進行刪除。可冷凍保存基因修飾 T 細胞。

T 細胞擴增可在存在 T 細胞啟動刺激物的情況下進行。

T 細胞擴增可在不超過約 1 天、不超過約 2 天、不超過約 3 天、不超過約 4 天、不超過約 5 天或不超過約 6 天的時間段內進行。T 細胞擴增可以持續約 1、2、3、4、5 或 6 天。

T 細胞擴增可在約 1 天至約 6 天、約 1 天至約 5 天、約 1 天至約 4 天、約 1 天至約 3 天、約 1 天至約 2 天或約 1 天的時間段內進行。

T 細胞擴增可以在存在干擾素 (IFN)-α、白介素 (IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-21 或其組合的情況下進行。一方面，擴增在存在 IL-7 和 IL-15 組合的情況下發生。

在 T 細胞群擴增至足夠數量後，可將擴增的 T 細胞恢復至個體。本公開的方法還可提供可再生的 T 細胞來源。因此，來自個體的 T 細胞可以離體擴增，一部分擴增的細胞群可重新給予個體，而另一部分則可等分冷凍長期保存，隨後擴增和給予個體。類似地，可從患有癌症的個體中獲得腫瘤浸潤淋巴細胞群，並刺激 T 細胞增殖至足夠數量並恢復至個體。

本公開還可能涉及的組合物含有向 T 細胞提供共刺激信號以用於 T 細胞擴增的製劑（例如，抗 CD28 抗體、B7-1 或 B7-2 配體），其與固相表面偶聯，可能另外包括與相同的固相表面偶聯的向 T 細胞提供一級啟動信號的製劑（例如，抗 CD3 抗體）。這些製劑可能優選附著於珠或燒瓶或袋上。包含每種製劑與不同固相表面偶聯（例如，提供一級 T 細胞啟動信號的製劑與第一固相表面偶聯和提供共刺激信號的製劑與第二固相表面偶聯）的組合物也可能在本公開的範圍內。 T 細胞製造中的無血清培養基

本文所指的術語「無血清培養基」系指所使用的生長培養基未用血清（例如，人血清或牛血清）補充。換言之，為了支持培養細胞的生存力、啟動和生長，未將血清作為單獨分離和不同的成分添加至培養基中。任何合適的培養基 T 細胞生長培養基可用於根據本文所述的方法培養細胞。例如，T 細胞生長培養基可包括但不限於無菌、低濃度葡萄糖溶液，其包括適量的緩衝液、鎂、鈣、丙酮酸鈉和碳酸氫鈉。在一實施方案中，T 細胞生長培養基可包括無血清培養基（例如 OPTI-MEM®、D-MEM/F-12 和/或病毒生產 (VP) 培養基 (Life Technologies)），但本領域技術人員將瞭解如何生成類似的培養基。與用於產生工程化 T 細胞的典型方法相反，本文所述的方法使用可能不補充血清（例如，人或牛血清）的培養基。

在人細胞中產生的 VSV-G 假型 HIV 和 FIV 載體可能會被人血清補體滅活（DePolo et al.「VSV-G Pseudotyped Lentiviral Vector Particles Produced in Human Cells Are Inactivated by Human Serum,」 Molecular Therapy(2000) 2:218-222；其內容在此透過引用整體併入）。此外，降低培養基的血清濃度可能導致具有相同生長動力學和產品品質的更可持續的工藝（Tyagarajan et al.「Optimizing CAR-T Cell Manufacturing Processes during Pivotal Clinical Trials,」 Molecular Therapy:Methods & Clinical Development, (2020) 16:136-144；其內容在此透過引用整體併入）。因此，在 T 細胞製造工藝中加入無血清培養基可能是有利的。

一方面，T 細胞啟動、T 細胞轉化和/或 T 細胞擴增可在無血清培養基中進行。

一方面，T 細胞啟動可以在無血清培養基中或在存在血清的情況下進行。

一方面，T 細胞啟動可以在無血清培養基中進行。

一方面，T 細胞轉化可以在無血清培養基中或在存在血清的情況下進行。

一方面，T 細胞轉化可以在無血清培養基中進行。

一方面，T 細胞擴增可以在無血清培養基中或在存在血清的情況下進行。

一方面，T 細胞擴增可以在無血清培養基中進行。

一方面，冷凍保存的 T 細胞可以在存在血清的情況下解凍和靜息約 2-8 小時、2-6 小時或 2-4 小時。

一方面，冷凍保存的 T 細胞可以在存在血清的情況下解凍和靜息約 2-4 小時，在存在血清的情況下啟動，在不存在血清的情況下轉導，在存在血清的情況下擴增。

一方面，冷凍保存的 T 細胞可以在存在血清的情況下解凍和靜息約 2-4 小時，在不存在血清的情況下啟動，在不存在血清的情況下轉導，在存在血清的情況下擴增。 藥物組合物

為了便於用藥，可以將根據本公開所述的轉導 CD8+ T 細胞用藥用載劑或稀釋劑製成藥物組合物或製成適於體內給藥的植入體。本領域描述了製備這種組合物或植入物的方法。例如，參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)。

可將轉導 T 細胞配製成半固體或液體形式的製劑，例如：膠囊、溶液、輸注劑或注射劑。可利用本領域已知的方法來防止或最小化組合物到達靶組織或器官之前的釋放和吸收，或確保組合物定時釋放。但是，理想的情況是，使用不妨礙細胞表達 CAR 或 TCR 的藥用形式。因此，理想的情況是，轉導 T 細胞可以製成含有載劑的藥物組合物。透過本文所述方法產生的T細胞可以與生理學上可接受的載劑或賦形劑一起配製以製備藥物組合物。載劑和組合物可為無菌。例如，優選載劑包括平衡鹽溶液（優選為 Hanks 平衡鹽溶液或生理鹽水）。製劑應滿足給藥方式。合適的藥用載劑包括但不限於水、鹽溶液（例如 NaCl）、生理鹽水、緩衝鹽水及其組合。如需要，藥物製劑可以與助劑（例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑）混合，這些助劑不會與 T 細胞發生有害反應。

本發明的組合物可以提供為單位劑量形式，其中每個劑量單位（例如：注射劑）含有單獨或與其他活性劑適當組合之預定量的組合物。

組合物可包含有效量的分離轉導 T 細胞，並引入受試者中，從而實現長期、特異性抗腫瘤反應，相較於這種治療不存在將導致的情況降低腫瘤大小或消除腫瘤生長或再生長。例如，與除了不存在轉導 T 細胞以外相同的條件相比，重新引入受試者的轉導 T 細胞數量使腫瘤大小降低約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98% 或約 99%。

因此，轉導 T 細胞的給予量可考慮給予途徑，並且應該使得引入足夠數量的轉導 T 細胞以實現所需的治療反應。此外，本文所述組合物中所含每種活性劑的量（例如，依照每種待接觸細胞的量或依照特定體重的量）在不同應用中可能不同。一般而言，轉導 T 細胞的理想濃度在接受治療的受試者中應足夠，例如，轉導 T 細胞的有效量可為約 1×10 ⁶至約 1×10 ⁹個轉導 T 細胞/患者 m ²（或 kg），更理想的情況是，約 1×10 ⁷至約 5×10 ⁸個轉導 T 細胞/患者 m ²（或 kg）。可使用任何合適量，例如，大於 5×10 ⁸個細胞/患者 m ²（或 kg），或低於，例如，小於 1×10 ⁷個細胞/患者 m ²（或 kg），因為這是達到治療效果所必要的。給藥方案可以基於公認的基於細胞的療法（參見，例如，美國專利號 4,690,915），或者可採用交替連續輸注策略。

T 細胞可以靜脈內施用給患者。T 細胞可以靜脈輸注施用給患者。T 細胞的劑量可以為約 0.8–1.2 x 10 ⁹個 T 細胞之間。T 細胞的劑量可以為約 1.2–3 x 10 ⁹個 T 細胞、約 3–6 x 10 ⁹個 T 細胞、約 10 x 10 ⁹個 T 細胞、約 5 x 10 ⁹個 T 細胞、約 0.1 x 10 ⁹個 T 細胞、約 1 x 10 ⁸個 T 細胞、約 5 x 10 ⁸個 T 細胞、約 1.2–6 x 10 ⁹個 T 細胞、約 1–6 x 10 ⁹個 T 細胞或約 1–8 x 10 ⁹個 T 細胞。T 細胞可以在 1-3 週的過程中施用，優選為約 3 週。T 細胞可以以遞增劑量施用。

本文所述的 T 細胞產品也可以冷凍保存。因此，冷凍保存的 T 細胞組合物可包含基因修飾 T 細胞和冷凍培養基。 預治療

本文所述的方法可以進一步包括施用化療藥物。化療藥物的劑量可足以耗竭患者的 T 細胞群。化療可在施用 T 細胞前約 5-7 天施用。化療藥物可以為環磷醯胺、氟達拉濱或其組合。化療藥物可包括以約 400–600 mg/m ²/天的環磷醯胺給藥。化療藥物可包括以約 10–30 mg/m ²/天的氟達拉濱給藥。

本文所述的方法還可以包括在施用包含 T 細胞的組合物之前用低劑量輻射對患者進行預治療。在施用包含 T 細胞的組合物之前，低劑量輻射可包括約 1.4 Gy，持續約 1 至約 6 天、約 2 至約 5 天、約 6 天、約5天、約 6 天。

患者可以為 HLA-A*02。

患者可以為 HLA-A*06。

本文所述的方法可以進一步包括施用抗 PDl 抗體。抗 PD1 抗體可以為人源化抗體。抗 PD1 抗體可以為 pembrolizumab。抗 PD1 抗體的劑量可以為約 200 mg。抗 PD1 抗體可以在施用 T 細胞後每 3 週施用一次。 免疫療法

治療患有癌症或需要治療的患者或個體的方法可包括向患者施用有效量的本文所述的擴增基因修飾 T 細胞。有此需要的患者或個體可能是癌症患者。本文所述的 T 細胞所治療的癌症可以為肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴細胞白血病 (ALL)、子宮癌 (UEC) 或其組合。

基於 T 細胞的免疫治療靶向來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位，該腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白系由主要組織相容性複合體 (MHC) 分子提呈。腫瘤特異性 T 淋巴細胞所識別的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，他們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比通常上調。

MHC 分子有兩類：MHC I 類和 MHC II 類。MHC I 類分子由一條 α 重鏈和 β-2-微球蛋白組成，MHC II 類分子由一條 α 和一條 β 鏈組成。其三維構形形成一個結合槽，用於與肽進行非共價相互作用。大部分有核細胞上都可發現 MHC-I 類分子。他們提呈主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物 (DRIP) 和較大肽蛋白裂解切割生成的肽。然而，源自內體隔室或外源性來源的肽也經常在 MHC-I 類分子上發現。這種 I-類分子非經典提呈方式被稱為交叉提呈。MHC II 類分子主要發現於專業抗原提呈細胞 (APC) 上，並且主要提呈，例如，在內吞作用過程中由 APC 攝入並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

肽和 MHC I 類的複合體由負載適當 T 細胞受體 (TCR) 的 CD8+ T 細胞進行識別，而肽和 MHC II 類分子的複合體由負載適當 TCR 的 CD4 陽性輔助 T 細胞進行識別。本領域已熟知 TCR、肽和 MHC 由此按 1:1:1 的化學計算量而存在。

CD4+ 輔助 T 細胞在誘導和維持 CD8+ 細胞毒性 T 細胞的有效反應中發揮重要作用。腫瘤相關抗原 (TAA) 衍生的 CD4 陽性 T 細胞表位的識別對開發能觸發抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要。在腫瘤部位，T 輔助細胞維持著對細胞毒性 T 細胞 (CTL) 友好的細胞因子環境並吸引效應子細胞，如 CTL、天然殺手 (NK) 細胞、巨噬細胞和粒細胞。

對於MHC I 類肽若要觸發（引發）細胞免疫反應，其也必須與 MHC 分子結合。這一過程依賴於 MHC 分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-1 類結合肽的長度通常為 8-12 個氨基酸殘基，並且在其與 MHC 分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基（「錨」）。這樣，每個 MHC 的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合。

在 MHC I 類依賴性免疫反應中，肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些 MHC-I 類分子結合，而且它們之後還必須能被負載特異性 T 細胞受體 (TCR) 的T 細胞識別。

對於被 T 淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。所述抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健康組織表達，或表達數量相對較少。與正常健康組織相比，所述肽應由腫瘤細胞過度提呈。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度（例如，每個細胞的相應肽拷貝數目）亦高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自因其在細胞週期控制或凋亡抑制中的功能而直接參與正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能為間接腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。表位存在於抗原氨基酸序列中，以確保這種肽（「免疫原性肽」）源自腫瘤相關抗原，並可導致體外或體內 T 細胞反應。

TAA 是基於 T 細胞療法（包括但不限於腫瘤疫苗）研發的起點。識別和表徵 TAA 的方法通常基於使用可分離自患者或健康受試者的 T 細胞，或基於腫瘤與正常組織之間的差別轉錄特性或差別肽表達模式的產生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過度表達或選擇性表達的基因的識別並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應 TCR 的 T 細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水準，因此，這些抗原的表位只有單個亞群適合這種應用。因此，在本說明書的一個非常優選的實施方案中，只選擇那些針對可發現功能性和/或增殖性 T 細胞的過量提呈或選擇性提呈的肽，這一點非常重要。這種功能性 T 細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴增並能夠執行效應子功能的 T 細胞（「效應子 T 細胞」）。

能夠與本文所述方法和實施方案一起使用的 TAA 肽包括，例如，美國專利申請公開號2016/0187351；2017/0165335；2017/0035807；2016/0280759；2016/0287687；2016/0346371；2016/0368965；2017/0022251；2017/0002055；2017/0029486；2017/0037089；2017/0136108；2017/0101473；2017/0096461；2017/0165337；2017/0189505；2017/0173132；2017/0296640；2017/0253633；2017/0260249；2018/0051080 和 2018/0164315 中所述的那些TAA肽，其各自內容透過引用整體併入。

本文所述的 T 細胞選擇性地識別提呈上述一個或多個專利和公開內容中所述 TAA 肽的細胞。

能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的 TAA 包括 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 161 的至少一個氨基酸序列。T 細胞選擇性地識別提呈 SEQ ID NO:1-161 的氨基酸序列或本文所述任何專利或申請中所述 TAA 肽的細胞。

表 3. 腫瘤相關抗原 (TAA) 列表

SEQ ID NO：	氨基酸序列	SEQ ID NO：	氨基酸序列	SEQ ID NO：	氨基酸序列
1	YLYDSETKNA	54	LLWGHPRVALA	106	VLLNEILEQV
2	HLMDQPLSV	55	VLDGKVAVV	107	SLLNQPKAV
3	GLLKKINSV	56	GLLGKVTSV	108	KMSELQTYV
4	FLVDGSSAL	57	KMISAIPTL	109	ALLEQTGDMSL
5	FLFDGSANLV	58	GLLETTGLLAT	110	VIIKGLEEITV
6	FLYKIIDEL	59	TLNTLDINL	111	KQFEGTVEI
7	FILDSAETTTL	60	VIIKGLEEI	112	KLQEEIPVL
8	SVDVSPPKV	61	YLEDGFAYV	113	GLAEFQENV
9	VADKIHSV	62	KIWEELSVLEV	114	NVAEIVIHI
10	IVDDLTINL	63	LLIPFTIFM	115	ALAGIVTNV
11	GLLEELVTV	64	ISLDEVAVSL	116	NLLIDDKGTIKL
12	TLDGAAVNQV	65	KISDFGLATV	117	VLMQDSRLYL
13	SVLEKEIYSI	66	KLIGNIHGNEV	118	KVLEHVVRV
14	LLDPKTIFL	67	ILLSVLHQL	119	LLWGNLPEI
15	YTFSGDVQL	68	LDSEALLTL	120	SLMEKNQSL
16	YLMDDFSSL	69	VLQENSSDYQSNL	121	KLLAVIHEL
17	KVWSDVTPL	70	HLLGEGAFAQV	122	ALGDKFLLRV
18	LLWGHPRVALA	71	SLVENIHVL	123	FLMKNSDLYGA
19	KIWEELSVLEV	72	YTFSGDVQL	124	KLIDHQGLYL
20	LLIPFTIFM	73	SLSEKSPEV	125	GPGIFPPPPPQP
21	FLIENLLAA	74	AMFPDTIPRV	126	ALNESLVEC
22	LLWGHPRVALA	75	FLIENLLAA	127	GLAALAVHL
23	FLLEREQLL	76	FTAEFLEKV	128	LLLEAVWHL
24	SLAETIFIV	77	ALYGNVQQV	129	SIIEYLPTL
25	TLLEGISRA	78	LFQSRIAGV	130	TLHDQVHLL
26	ILQDGQFLV	79	ILAEEPIYIRV	131	SLLMWITQC
27	VIFEGEPMYL	80	FLLEREQLL	132	FLLDKPQDLSI
28	SLFESLEYL	81	LLLPLELSLA	133	YLLDMPLWYL
29	SLLNQPKAV	82	SLAETIFIV	134	GLLDCPIFL
30	GLAEFQENV	83	AILNVDEKNQV	135	VLIEYNFSI
31	KLLAVIHEL	84	RLFEEVLGV	136	TLYNPERTITV
32	TLHDQVHLL	85	YLDEVAFML	137	AVPPPPSSV
33	TLYNPERTITV	86	KLIDEDEPLFL	138	KLQEELNKV
34	KLQEKIQEL	87	KLFEKSTGL	139	KLMDPGSLPPL
35	SVLEKEIYSI	88	SLLEVNEASSV	140	ALIVSLPYL
36	RVIDDSLVVGV	89	GVYDGREHTV	141	FLLDGSANV
37	VLFGELPAL	90	GLYPVTLVGV	142	ALDPSGNQLI
38	GLVDIMVHL	91	ALLSSVAEA	143	ILIKHLVKV
39	FLNAIETAL	92	TLLEGISRA	144	VLLDTILQL
40	ALLQALMEL	93	SLIEESEEL	145	HLIAEIHTA
41	ALSSSQAEV	94	ALYVQAPTV	146	SMNGGVFAV
42	SLITGQDLLSV	95	KLIYKDLVSV	147	MLAEKLLQA
43	QLIEKNWLL	96	ILQDGQFLV	148	YMLDIFHEV
44	LLDPKTIFL	97	SLLDYEVSI	149	ALWLPTDSATV
45	RLHDENILL	98	LLGDSSFFL	150	GLASRILDA
46	YTFSGDVQL	99	VIFEGEPMYL	151	ALSVLRLAL
47	GLPSATTTV	100	ALSYILPYL	152	SYVKVLHHL
48	GLLPSAESIKL	101	FLFVDPELV	153	VYLPKIPSW
49	KTASINQNV	102	SEWGSPHAAVP	154	NYEDHFPLL
50	SLLQHLIGL	103	ALSELERVL	155	VYIAELEKI
51	YLMDDFSSL	104	SLFESLEYL	156	VHFEDTGKTLLF
52	LMYPYIYHV	105	KVLEYVIKV	157	VLSPFILTL
53	KVWSDVTPL			158	HLLEGSVGV
				159	ALREEEEGV
				160	KEADPTGHSY
				161	TLDEKVAEL
				240	KIQEILTQV

儘管為了清楚理解之目的已透過說明和實施例的方式對本發明進行了一些詳細描述，但是應當理解，在所附權利要求範圍內可實施某些改變和修改。用於實施本發明的上述模式修改將根據前述公開內容理解或透過本發明的常規實踐或實施使腫瘤學、生理學、免疫學和/或相關領域技術人員明瞭預期在以下權利要求的範圍內。

本說明書中提及的所有出版物（例如，非專利文獻）、專利、專利申請出版物和專利申請均表示本發明所屬領域技術人員的技術水準。所有這些出版物（例如，非專利文獻）、專利、專利申請出版物和專利申請均以引用方式併入本文，引用程度如同每篇單獨的出版物、專利、專利申請出版物或專利申請都被具體和單獨指明透過引用併入。 實施例 實施例 1 CD8 衍生對比 PBMC 衍生 T 細胞產品

可以比較源自未分離外周血單核細胞 (PBMC) 和 CD8+ 選擇 T 細胞作為來自健康人類供體或患者（例如癌症患者）起始材料的基因修飾 T 細胞產品的製造和功能。可以使用不同規模的 6 天短製造工藝從來自每個供體的未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞中生成基因修飾 T 細胞產品。從每名供體獲得的白細胞分離產品可分為兩半，一半可經處理用於 PBMC 分離，另一半用於 CD8+ T 細胞選擇。這兩種細胞類型都可以用抗 CD3/抗 CD28 抗體啟動，並用編碼 CAR (LV-CAR) 或 TCR (LV-TCR) 的慢病毒 (LV) 轉導。轉導細胞可以在存在 IL-7 和 IL-15 的情況下擴增並收穫用於表型和功能比較。

源自 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞的基因修飾 T 細胞產品可基於啟動標誌物特徵、倍數擴增、轉導效率、記憶表型和載體拷貝數進行表型比較。TCR 轉化 PBMC 和 TCR 轉化 CD8 產品的功能可以基於細胞內細胞因子分泌、殺傷測定（IncuCyte 測定和基於流式細胞術的連續殺傷測定）和回應靶細胞的細胞外細胞因子分泌情況進行評估。發明人驚奇地發現，與 PBMC 衍生 T 細胞產品相比，CD8 衍生 T 細胞產品表現出更長的壽命、優選的細胞因子特徵和較強的抗腫瘤細胞活性。 實施例 2 CD8+ T 細胞選擇和 TCR 轉化 T 細胞產品的製造 方法

來自健康獻血者的白細胞分離產品獲自 Hema Care, North Ridge California。每種白細胞分離產品分成兩半，一半經處理用於 PBMC 分離，另一半用於 CD8+ T 細胞選擇以進行配對比較。從 PBMC 或 CD8+ 選擇細胞製造基因修飾 T 細胞產品在不同規模下進行。本文描述了所執行的每個步驟的簡要說明。 PBMC 和 CD8+ T 細胞製備

根據製造商的建議，使用封閉和自動化 Sepax C-pro 系統和 NeatCell C-Pro 軟體（細胞分離方案軟體，GE Healthcare Life Sciences），透過 Ficoll 從一半的白細胞分離單位分離 PBMC。根據製造商的建議，使用 CliniMACS® CD8 試劑和 CliniMACS® Plus 儀器（用於細胞處理的封閉和自動化平臺，Miltenyi Biotech）從另一半的白細胞分離單位正向選擇 CD8+ T 細胞。CD8+ T 細胞純度透過流式細胞術評估。 T 細胞啟動

750-AC 或 290-AC 袋 (Saint-Gobain) 用抗人CD3 (0.5 μg/ml) 和抗人CD28 (0.5 μg/ml) 抗體在 4℃ 下包被 16-24 小時。將新鮮製備的 PBMC 或 CD8+ 選擇 T 細胞以 1x10 ⁶/ml 的濃度放置於 37°C 下在抗 CD3/抗 CD28 包被袋中的不含細胞因子的完全 TexMACS 培養基（補充有 5% 人 AB 血清）中 16-20 小時。轉導

16-24 小時後收穫抗 CD3/抗 CD28 啟動 PBMC 或 CD8+ 選擇 T 細胞並計數。啟動 PBMC 或 CD8+ 選擇 T 細胞與含有以下產品的轉導混合物混合：編碼 TCR 的慢病毒（2.5 µl/10 ⁶個細胞）、硫酸魚精蛋白 (1 µg/ml)、IL-7 (10 ng/ml) 和 IL-15 (50 ng/ml) 在完全 TexMACS 培養基（2x10 ⁶個細胞/ml）中在 Grex100 或 Grex-500 中於 37 ^oC 下混合 24 小時。24 小時後，用含有 IL-7 和 IL-15 的 TexMACS 培養基餵養轉導細胞，獲得最終接種密度為 0.5-0.8 x10 ⁶/cm ²。 收穫和冷凍保存

第 6 天時，在 CryoStor CS5 冷凍培養基中收穫、計數和冷凍保存轉導和未轉導細胞。在冷凍保存的基因修飾 T 細胞產品解凍後進行表型和功能分析。 流式細胞術

對 1.0x10 ⁶個轉導細胞進行活-死可固定染料和啟動組或右旋糖體組或記憶 T 細胞組染色。表 4 ：啟動、右旋糖體和記憶 T 細胞組以及使用的抗體

組	使用的抗體
啟動組	CD8a-BV421、CD3-AF488、hLDL-R PE、CD69-PerCP Cy5.5、CD25-PE-Cy7、CD4-APC-Fire750
右旋糖體組	CD8a-AF488、CD3-PerCP-Cy5.5、Dextramer-PE、CD4-PE-Cy7
記憶 T 細胞組	CD8a-AF488、CD3-PerCP-Cy5.5、Dextramer-PE、CD27-PE-Dazzle594、CD4-PE-Cy7、CD57-APC、CD127-AF700、CD45RA-APC-Cy7、CCR7-BV421、CD45RO-BV605、CD28-BV650 和 CD62L-BV785
連續殺傷測定	CD3-BV421
CD8+ 純度	CD3-BV421、CD8a-APC、CD4 PE-Cy7
ICS 組	CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-FITC、CD4-APC-Cy7、VB8-BV605、CD107a-PE、IL-2-BV421、IFN-γ-AF700、TNF-α-BV786、Granzyme B-PE-CF594、MIP-1b-PE Cy7

對於細胞內染色 (ICS)，TCR 轉化 PBMC 或 TCR 轉化 CD8 產品與 UACC257 以 1:1 的比例共培養 12 小時，收穫前 4 小時將佈雷菲爾德菌素 A 加入培養物中。收穫細胞並根據製造商的建議進行表面和細胞內染色。用衍生自補償珠的自補償基質獲取樣品。 載體拷貝數測定

源自 PBMC 和 CD8+T 細胞的基因修飾 T 細胞產品的載體拷貝數透過本領域已知的方法進行測定，例如 Charrier, S., Ferrand, M., Zerbato, M. et al., Gene Ther18, 479–487 (2011)，其內容透過引用整體併入本文。或者，載體拷貝數可透過從源自 PBMC 或選擇 CD8 的轉導產物中分離 DNA 來測定。可使用慢病毒 psi 序列引物，應用相對定量方法進行 qPCR。白蛋白可用作管家對照物。已知數量表達 psi 和白蛋白兩者的質粒可稀釋 10 倍以創建標準曲線。載體拷貝數可透過將 psi 拷貝標準化為白蛋白拷貝並乘以因子 2 進行計算，因為每個基因組有 2 個白蛋白拷貝。 IncuCyte 細胞殺傷測定

PBMC 或 CD8 衍生的基因修飾 T 細胞產品（標準化為 %CD8+Dex+）與表達不同水準靶抗原的靶細胞系：UACC257-RFP（約 1080 拷貝）、U2-OS-RFP（約 250 拷貝）、A375-RFP（約 50 拷貝）和 MCF7-GFP（0 拷貝）在 4:1::E:T 比例下共培養 72 小時。測量腫瘤生長情況。將 24 小時培養物的上清液保存於 ‒80 ^oC 下以進行細胞因子分析。 連續殺傷測定

源自 PBMC 或CD8+ 選擇 T 細胞的基因修飾 T 細胞產品與靶細胞系 THP-1-RFP 在不含細胞因子的完全 TexMACS 中以 E:T 比例為 1:1 和 1:5 在24孔板中共培養 17 天。每 3-4 天，根據製造商的建議，使用 FACS 計數珠 (Thermofisher) 分析殘留腫瘤細胞和 CD3+ T 細胞計數。用與啟始時相同數量的新鮮腫瘤細胞重新激發共培養物中的 T 細胞，每 3 天重複分析一次。 Luminex 測定

根據製造商的建議，使用 Procarta 人細胞因子組 1A 34-重免疫測定試劑盒（EPX340-12167-901，Thermofisher）和人訂制 ProcartaPlex16-重 Luminex 試劑盒（GM-CSF，顆粒酶 A/B、IFN-γ、IL-10、IL-13、IL-18、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IP-10、MIP-1α 和 MIP-1β、穿孔素和 RANTES；Thermofisher）定量 24小時共培養上清液中釋放的細胞因子。

CD8+ T 細胞產品表現出理想的細胞因子特徵和腫瘤殺傷能力。 相當的啟動標誌物特徵

從整個白細胞分離袋中回收的 CD8+ 選擇細胞平均數量約為 1x10 ⁹（範圍 7x10 ⁸- 2x10 ⁹，圖 1A），（總活淋巴細胞的）平均 CD8+ T 細胞純度為 83%（圖 1B）。用抗 CD3 和抗 CD28 啟動 24 小時的 PBMC 和 CD8+ T 細胞在生存力（圖 2A）和啟動後回收率（圖 2B）方面無顯著差異。在未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇細胞中，抗 CD3/CD28 啟動前後的活淋巴細胞、CD3+、CD8+ 和 CD4+ T 細胞頻率無差異（圖 2C）。這表明對製備方法的加快速度或使用 CD8+ 細胞替代未分離 PMBC 群無有害影響。

從啟動 PBMC 和 CD8+ T 細胞獲得的啟動標誌物（例如 CD69、CD25 和 hLDL-R）呈陽性的 CD8+ 細胞百分比相當（圖 2D）。記憶 T 細胞亞群（門控CD3+CD8+）、初始細胞 (T _Naive)、中央記憶 (T _CM)、效應記憶 (T _EM) 和終末分化效應細胞 (T _EMRA) 以 CCR7+ 和 CD45RA+ 表達為特徵，它們的分佈在不同供體之間差異很大，但在每個供體的 PBMC 和 CD8+ 選擇細胞之間相似（圖 3）。當在完全 TexMACS 培養基中培養 24 小時時，與分泌細胞毒性以及輔助細胞因子的啟動未分離 PBMC（IL-13（圖 4G）、IL-17A（圖 4H）和 IL-10（圖 4I））相比，抗 CD3/抗 CD28 啟動的 CD8+ 細胞僅分泌細胞毒性（IFN-γ（圖 4A）、TNF-α（圖 4B）、穿孔素（圖 4C））細胞因子。與 TCR 轉化 PBMC T 細胞產品相比，TCR 轉化 CD8 選擇 T 細胞產品令人驚訝地具有更高數量的轉導細胞。 CD8 衍生和 PBMC 衍生 T 細胞產品的轉導

用編碼重組 TCR (LV-TCR) 的慢病毒轉導啟動的未分離 PBMC 和 CD8+ T 細胞並擴增 6 天。在第 6 天，PBMC 和 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品之間生存力（圖 5A）、倍數擴增（圖 5B）和絕對計數（圖 5C）無顯著差異。PBMC 和 CD8 衍生 LV-TCR 轉化 T 細胞產品之間以 TCR 特異性葡聚糖 (Dex) 結合為特徵的轉基因 TCR 表達相似（圖 5D）。同樣，PBMC 和 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品之間未觀察到載體拷貝數 (VCN) 有顯著差異（圖 5E）。在 5 名供體的 3 名中，與配對的 PBMC 衍生 LV- TCR 轉化 T 細胞產品相比，來自 CD8+ 選擇 LV-TCR 轉化 T 細胞產品的 CD8+Dex+ 細胞表現出記憶 T 細胞特徵改善，即較低分化的幼稚樣和中央記憶 T 細胞數量增加（圖 6A）。但是，在源自兩種細胞類型的最終產物中，包括 CD27、CD28 和 CD127 在內的其他記憶標誌物在 CD8+Dex+ 上的表達無顯著差異（圖 6B）。此外，與 PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品相比，從 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品門控的CD8+Dex+ 具有較低的 PD-1 和 LAG-3 表達（圖 6C）。

為了確定轉導 CD8 選擇細胞對 T 細胞製造規模的影響，將 PBMC 或 CD8+ T 細胞解凍，然後用抗人 CD3/CD28 抗體啟動 16-20 小時，並與含有 LV-R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 SEQ ID NO: 163）的轉導混合物一起溫育 24 小時，製造規模如下：中等規模（例如，轉導細胞在 Grex10/6 孔 Grex 板中接種和擴增）、大規模（例如，轉導細胞在 Grex100 中接種和擴增）和 GMP 規模（例如，轉導細胞在 Grex500 中接種和擴增）。轉導後細胞在含有 IL-7 和 IL-15 的完全 TexMACS 中擴增 5 天。第 6 天，即從解凍到收穫的總持續時間為 6 天，收穫 PBMC 和 CD8 產品，進行細胞計數。使用表 4 中所示的 T 細胞記憶組進行 PRAME 右旋糖體百分比 FACS 分析。圖 7 顯示，最重要的是，在所有測試規模（例如中等規模、大規模和 GMP 規模）下，與未分離 PBMC 相比，最終 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中由活 CD3+CD8+Dex+ 細胞代表之顯著更高的轉導細胞。與在 PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中相比，在 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中，起始 PBMC 材料中 CD8+ 頻率較低（例如＜ 25%）的供體具有顯著更高數量的轉導細胞 (CD3+CD8+Dex+)。這表明對 CD8 選擇細胞與 PMBC 未分離細胞群的轉導無有害影響。 相當的抗腫瘤功能

首先，為了確定 LV-TCR 轉化 PBMC 和 LV-TCR 轉化 CD8 T 細胞產品的功能，透過流式細胞術評估回應 HLA-A*02+ 靶細胞系 UACC257 的細胞因子反應。當與 UACC257 腫瘤細胞系共培養時，從 PBMC 或 CD8+T 細胞中獲得的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品分泌相當數量的 IFN-γ、顆粒酶 B、TNF-α、IL-2 和 MIP-1β（圖 8）。為了進一步評估 PBMC 和 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品的抗腫瘤活性，進行了體外共培養殺傷測定，並對回應靶標的細胞因子分泌進行了量化。PBMC 或 CD8+ T 細胞衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品與表達不同水準靶抗原的 HLA-A*02+ 細胞系（UACC257：約 1080 拷貝（圖 9A）、U2-OS：約 250 拷貝（圖 9B）、A375：約 50 拷貝（圖 9C）和 MCF7：0 拷貝（圖 9D））以 E:T 比例為 4:1 進行共培養，然後使用 IncuCyte 測定進行 72 小時腫瘤生長評估。來自未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇細胞的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品顯示對靶細胞具有同等殺傷作用。此外，PBMC 或 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品在與靶細胞共培養 24 小時後分泌相當數量的大部分細胞因子，包括 IFN-γ、顆粒酶 B、GM-CSF、MIP-1α 和 MIP-1β（圖 10）。但是，與 PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品相比，CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品具有 TNF-α、IL-2、RANTES 和 IP-10 分泌增加的趨勢。來自 PBMC 或 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品的細胞因子分泌水準與靶標上的抗原表達相關（圖 10）。

為了確定 LV-TCR 轉化 T 細胞產品多次殺傷靶標的能力，進行了長期連續殺傷測定。LV-TCR 轉化 PBMC 或 LV-TCR 轉化 CD8 產物與靶細胞系 THP-1（第 0 天）以 E:T 比例為 1:1（圖 11A，左圖）和 1:5（高腫瘤負荷）（圖 11A，右圖）共培養 17 天，然後進行殘留腫瘤細胞和 CD3+ T 細胞分析。LV-TCR 轉化 CD8 T 細胞產品在兩種測試比例下在第 3、7、10、14 和 17 天都能比 LV-TCR 轉化 PBMC T 細胞產品更好地抑制腫瘤生長（CD8 和 PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品分別為 3.5 倍對 2.5 倍），此時將新鮮的靶細胞重新添加至測定中。與 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品相比，E:T 比例為 1:1 時，在 PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品的共培養物中觀察到 CD3+ T 細胞增殖增加（圖 11B，左圖）。但是，在 E:T 比為 1:5 時，PBMC 和 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中 T 細胞增殖相似（圖 11B，右圖）。此外，與 PBMC 衍生的產物相比，在 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品與 THP-1 細胞系的 24 小時共培養上清液中（E:T 比例為 1:1），觀察到大多數細胞因子（包括 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18、IL-6、GM-CSF、MIP-1α 和 MIP-1β RANTES）分泌增加（圖 12）。與 CD8 LV-TCR 轉化 T 細胞產品相比，PBMC 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中的穿孔素分泌更高（圖 12）。在 E:T 比例為 1:5 下觀察到類似的細胞因子分泌趨勢（資料未顯示）。每次殺傷後，PBMC 和 CD8 衍生的 LV-TCR 轉化 T 細胞產品中分化 T 細胞、T _EM和 T _EMRA的數量在兩種測試比率下均有增加。（圖 13，未顯示 E:T 為 1:5的數據）。

總之，這些結果表明在源自未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞的 CD8+ 上啟動標誌物的表達無差異。轉導和擴增後，重組 TCR 的生存力、倍數擴增、載體拷貝數和右旋糖體結合在源自未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞的基因修飾 T 細胞產品之間具有可比性。但是，與衍生自未分離 PBMC 的產品相比，整體基因修飾 T 細胞產品具有更多數量的 CD3+CD8+Dextramer203+ 細胞。此外，PBMC 和 CD8 衍生的基因修飾 T 細胞產品皆回應腫瘤靶標而表現出的短期腫瘤細胞殺傷力相當，並分泌數量相當的細胞因子。但是，在長期共培養連續殺傷測定中，CD8 衍生的基因修飾 T 細胞產品表現出多次殺傷靶細胞能力改善。

進行此研究的目的是比較從作為起始細胞群的未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T細胞獲得的 TCR 轉化 T 細胞產品的製造和功能。與 TCR 轉化 PBMC T 細胞產品相比，TCR 轉化 CD8 T 細胞產品具有更多數量的轉導細胞 (CD3+CD8+Dex+)，且表型和功能相當或更好。

除其他優點外，本發明的優點包括：在所有測試規模下，與 TCR 轉化 PBMC T 細胞產品相比，TCR 轉化 CD8 T細胞產品中具有明顯更高的總轉導細胞 (CD3+CD8+Dex+)。CD8 衍生產品中轉導細胞的數量較多可歸因於：CD8+ T 細胞內容物中可能富含起始材料（約 90% CD3+），而不是從含有 CD8+（14-45% CD3+）和 CD4+（32-82% CD3+）T 細胞混合物的未分離 PBMC 起始。此外，由於進入製造的細胞總數可能限制為 30 億個 PBMC，因此，平均而言，在當前基於 PBMC 的工藝中，平均只有一半的可用起始材料可以使用。因此，白細胞分離中只有一半可用的 CD8+ T 細胞可用於製造，這對於 CD8 頻率低的患者而言尤其令人擔憂。相反，預先進行 CD8 選擇並用 CD8+ 細胞啟始製造可以最大限度地富集起始材料中的目標細胞群而作為轉化 T 細胞產品的起始材料。此外，本文所述的方法避免處理大量細胞之需要。從白細胞分離中回收的 CD8+ 細胞平均數量可能約為 10 億個，這遠低於作為本文所述方法起始數量的 30 億最大容量。因此，開始用 CD8+ 選擇細胞製造 TCR 轉化 T 細胞產品可能會產生具有更高頻率的功能性轉導細胞 (CD3+CD8+Dex+) 的產品。因而，在起始材料中 CD8+ 頻率低（例如，＜ 25% CD3+ 細胞）的供體的 CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品中可能具有顯著更高數量的 CD3+CD8+Dex+ 細胞（相較於未分離 PBMC）。

本發明人還驚奇地發現，與 PBMC 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品中的 CD8+Dex+ 細胞相比，CD8 衍生的 TCR 轉化的 T 細胞產品中的 CD8+Dex+ 細胞包含數量顯著更高的幼稚樣和中央記憶 T 細胞，並表現出耗竭標誌物（包括 PD-1 和 LAG-3）表達降低。這表明，與 PBMC 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品相比，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品有望擁有更年輕和分化程度較低的 T 細胞群，並具有較少消耗表型從而能夠持續更長時間。在不受特定理論束縛的情況下，發明人將最終產品品質的意外改善歸因於：與 CD8+ T 細胞單獨生長時相比，PBMC 中存在的其他細胞所產生的背景差異的重要性，這透過啟動後觀察到各種細胞因子的差異表達得到反映。

CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品在短的 72 小時共培養殺傷測定中顯示出對表達低、中和高水準 PRAME 抗原的腫瘤靶細胞殺傷率與 PMBC 衍生產品相同。此外，與靶細胞系共培養 24 小時後分泌的細胞因子（IFN-γ、顆粒酶 A/B、穿孔素、GM-CSF、MIP-1α 和 MIP-1β）相當。因此，本文的方法可在不損害 T 細胞產品活性的情況下快速、簡化地分離 CD8+ TCR 轉化 T 細胞。

與PBMC 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品相比，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品在其多次殺傷 THP-1 靶細胞的能力方面表現出意料之外的優越性。在與 THP-1 細胞靶標共培養 24 小時後，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞也令人驚訝地分泌更多的細胞因子。在不受單一理論束縛的情況下，一種可能的解釋是，與 PBMC 衍生的 T 細胞產品相比，CD8 衍生的 T 細胞產品富含具有細胞毒性可能性的 CD8+ T 細胞，並且缺乏任何潛在的免疫抑制細胞（例如 Treg）。因此，本文的方法可快速、簡化地分離特性優於 PBMC 衍生 T 細胞產品的 CD8+ TCR 轉化 T 細胞。

本發明人還驚奇地發現，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品比 PMBC 衍生的TCR 轉化 T 細胞產品更純，因為後者由含有雜質的未分離 PBMC（例如 CD4+ T 細胞、Tregs、B 細胞、單核細胞）製造，而前者由純 CD8+ T 細胞群製造。從安全性角度來看，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品的問題較少，因為它們的功能可能與 PMBC 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品相當。總之，CD8 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品可能比 PMBC 衍生的 TCR 轉化 T 細胞產品具有更少的雜質和更多數量的功能性轉導細胞，並且表型和抗腫瘤功能非常類似。當患者的 CD8+ T 細胞計數較低時，從 CD8+ 選擇 T 細胞中製造 TCR 轉化 T 細胞產品可能優於未分離 PBMC。這可能是一項選擇，可滿足臨床試驗中需要更高劑量的基因修飾 T 細胞產品。 實施例 3 無血清培養基中 TCR 轉化 T 細胞產品的製造

血清對 T 細胞製造中轉導的影響

圖 14 顯示了從兩名供體中獲得的 T 細胞 6 天製造工藝，所述 T 細胞用表達靶向 MAGEA4/8 的 TCR 的病毒載體進行轉導。為了比較血清在轉導中對 T 細胞產品的影響，將標準條件下產生的 T 細胞產品（其中在 5% 人 AB (hAB) 血清中進行解凍/靜息、啟動、轉導和擴增）與修改條件下產生的產品進行比較。修改條件與標準條件的不同之處在於：前者轉導在存在 0%（即，無血清培養基）、2.5%、5% 或 10% hAB 血清的情況下進行，而後者轉導在存在 5% hAB的情況下進行。在存在 5% hAB 血清的情況下進行對照非轉導。

從兩名供體（上圖和下圖）中獲得的 CD8+TCR+ T 細胞產品百分比（CD8+Dextramer 百分比）透過在存在血清（例如 2.5%、5% 或 10% hAB 血清）的情況下進行轉導產生，這低於透過在無血清培養基（即，0% hAB）中進行轉導產生的百分比（圖 15）。此外，從兩名供體（上圖和下圖）中獲得的 T 細胞產品載體拷貝數透過在存在血清（例如 2.5%、5% 或 10% hAB 血清）的情況下進行轉導產生，這低於透過在無血清培養基（即，0% hAB）中進行轉導產生的載體拷貝數（載體拷貝數保持低於 5 以符合安全性要求）（圖 16）。這些結果表明，與存在血清（例如，常規 5% hAB）的情況下進行的轉導相比，在無血清培養基中進行的轉導可能是有利的，如更高載體拷貝數產生更多 CD8+TCR+ T 細胞所示。

血清對 T 細胞製造中啟動和轉導的影響

圖 17 顯示了用表達靶向 PRAME 的 TCR 的病毒載體轉導的 T 細胞 6 天製造工藝。為了比較血清在啟動和轉導中對 T 細胞產品的影響，將標準條件下產生的 T 細胞產品（其中在 5% 人 AB (hAB) 血清中進行解凍/靜息、啟動、轉導和擴增）與修改條件下產生的產品進行比較。修改條件與標準條件的不同之處在於：前者啟動和轉導各自在存在 0%（即，無血清培養基）、2.5%、5% 或 10% hAB 血清的情況下進行，而後者轉導在存在 5% hAB的情況下進行。

啟動後，在無血清培養基 (0% hAB) 中和存在2.5% 和 5% hAB 的情況下產生的 T 細胞產品 (N = 2) 的存活率百分比（左圖）、總活細胞（中圖）和回收率相當（圖 18），這表明在無血清培養基中進行的啟動可能不會損害細胞從啟動中進行回收。此外，在無血清培養基 (0% hAB) 中產生的 T 細胞產品 (N = 2) 的啟動標誌物（例如人低密度脂蛋白 (hLDL)（左圖）、CD69（中圖）和 CD25（右圖））的表達高於或相當於存在血清的情況下產生的產品（圖 19）。請注意，啟動標誌物表達的供體變異性顯著小於存在血清情況下產生的產品。具體而言，在無血清培養基 (0% hAB) 中產生的來自供體的 CD25+ T 細胞產品的量（CD25+ %親本（圖20，上圖）和 CD25+ MFI（圖20，下圖））、CD69+ T 細胞產品的量（CD69+ %親本（圖21，上圖）和 CD69+ MFI（圖 21，下圖））以及 hLDL+ T 細胞產品的量（hLDL+ % 親本（圖 22，上圖）和 hLDL+ MFI（圖 22，下圖））高於或相當於存在血清的情況下產生的產品。此外，啟動和/或轉導期間在無血清培養基 (0% hAB) 中產生的獲得自供體的 T 細胞產品的第 6 天總細胞（圖 23，上圖）和第 6 天存活力（圖 23，下圖）和 CD8+Dex+ % 親本（圖 24，上圖）和 CD8+Dex+ MFI（圖 24，下圖）與啟動和/或轉導期間存在血清情況下產生的相當。如上所述，培養基中使用的人 AB 血清量被確定為潛在限速步驟，並需要減少以克服全球供應限制。因此，這些結果支持啟動和/或轉導中使用無血清培養基，因為由此產生的 T 細胞產品與在存在血清（例如，常規 5% hAB）情況下所產生的相當。

在無血清培養基中進行的啟動和轉導也產生更多的 CD8+ 細胞，其中 48.8% 的 CD8+ 細胞在無血清培養基中獲得，38.7% 的 CD8+ 細胞在 5% hAB（供體編號 6）中獲得，26.5% 的 CD8+ 細胞在無血清中獲得，17.9% 的 CD8+ 細胞在 5% hAB（供體編號 7）中獲得（圖 25）。透過在存在血清（例如 2.5%、5% 血清）的情況下進行啟動和/或轉導產生的 T 細胞產品中載體拷貝數 (VCN) 低於透過在無血清培養基（即，0% hAB）中進行啟動和/或轉導產生的產品（其中載體拷貝數保持低於 5 以符合安全性要求）（圖 26）。這些結果表明，與存在血清情況下進行啟動和/或轉導相比，在無血清培養基中進行啟動和/或轉導可能產生更多具有更高載體拷貝數的 CD8+ T 細胞產品。

總之，血清（例如 hAB 血清）可以在 T 細胞製造期間抑制表達轉基因（例如 TCR）的病毒載體的轉導效率。儘管在擴增過程中對所有樣品使用了完全的 5% hAB 血清 TexMACS 培養基，但在轉導過程中 hAB 血清的存在可能對擴增產生抑制作用。流式分析和載體拷貝數的結果顯示，與存在血清（例如，常規 5% hAB）情況下相比，不存在 hAB 血清時轉導效率顯著提高。換言之，在啟動過程中減少血清可提高轉導效率。與存在血清情況下進行啟動相比，在無血清培養基中進行啟動可能導致啟動後標誌物信號最大和最一致的增加。與存在血清情況下進行啟動和轉導相比，在無血清培養基中進行啟動和轉導也可能產生最高的轉導效率，並可最小化供體與供體之間的變異性，但是擴增步驟可能仍需要血清。

應當理解，上述每個元素或者兩個或更多個元素一起也可以在與上述類型不同的其他類型方法中找到有用的應用。在無進一步分析的情況下，前述內容充分地揭示本公開的要點，其他人可以透過應用當前知識，容易地將其適用於各種應用場合而不會遺漏從現有技術觀點來看公平構成所附權利要求中闡述的本公開的通用或具體方面基本特點的特徵。前述實施方案僅作為示例呈現；本公開內容的範圍僅透過以下權利要求進行限制。

無

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圖 1A描繪了來自健康供體全 leukopak®（從正常外周血收集的富集白細胞分離產物）的 CD8+ 選擇 T 細胞的回收率。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7，單個點代表一名供體。

圖 1B描繪了來自健康供體全 leukopak®（從正常外周血收集的富集白細胞分離產物）的 CD8+ 選擇 T 細胞的純度。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7，單點代表一名供體。

圖 2A描繪了來自未分離 (bulk) 外周血單核細胞 (PBMC) 或 CD8+ 選擇 T 細胞的 CD8+ T 細胞在抗 CD3/CD28 啟動後的生存力。單點代表一名供體。結果表示為平均值 ± SD，n = 5-7。

圖 2B描繪了來自未分離 PBMC 或 CD8+ 選擇 T 細胞的 CD8+ T 細胞在抗 CD3/CD28 啟動後的回收率。單點代表一名供體。結果表示為平均值 ± SD，n = 5-7。

圖 2C描繪了抗 CD3/CD28 啟動前後活淋巴細胞百分比、CD3+ 細胞 %、CD8+ 細胞 % 和 CD4+ 細胞 %。單點代表一名供體。結果表示為平均值 ± SD，n = 5-7。

圖 2D描繪了抗 CD3/CD28 啟動前後來自未分離 PBMC 或 CD8+ 選擇 T 細胞的 CD69、CD25 和 h-LDLR 呈陽性的 CD8+ T 細胞百分比。單點代表一名供體。結果表示為平均值 ± SD，n = 5-7。

圖 3描繪了抗 CD3/CD28 啟動前後來自未分離 PBMC 的 CD8+ T 細胞或獲得自供體（供體編號 1-4）的 CD8+ 選擇 T 細胞中的記憶 T 細胞亞群分佈。基於 CD45RA+ 和 CCR7+ 表達的 CD3+CD8+ 門控細胞記憶表型：T _naive；CD45RA+CCR7+；T _cm；CD45RA-CCR7；T _em；CD45RA-CCR7- T _emra；CD45RA+CCR7-。

圖 4A-4I描繪了抗 CD3/CD28 啟動前後 PBMC 和 CD8+ 選擇細胞的細胞因子分泌特徵 IFNγ (A)、TNF-α (B)、穿孔素 (C)、IL-1β (D)、RANTES (E)、MIP-1α (F)、IL-13 (G)、IL-17A (H) 和 IL-10 (I)。在培養 24 小時後使用 34 重 Luminex 技術量化啟動前和啟動後 PBMC 和 CD8+ 選擇細胞分泌的細胞因子 (N = 2)。單點代表一名供體。

圖 5A描繪了從未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞獲得的 PBMC 和 CD8 選擇 T 細胞產品的生存力，這些所述 T 細胞使用 LV-TCR（例如，與 SLLQHLIGL (PRAME-004) 肽/MHC 分子複合體結合的 TCR R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 163））啟動和轉導並在 IL-7 和 IL-15 中擴增 6 天。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7；t 檢驗，p ＞ 0.05 不具顯著性。

圖 5B描繪了從未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞獲得的 PBMC 和 CD8 選擇 T 細胞產品的擴增倍數，這些所述 T 細胞使用 LV-TCR 啟動和轉導並在 IL-7 和 IL-15 中擴增 6 天。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7。

圖 5C描繪了從未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞獲得的 PBMC 和 CD8 選擇 T 細胞產品的絕對細胞計數，這些所述 T 細胞使用 LV-TCR 啟動和轉導並在 IL-7 和 IL-15 中擴增 6 天。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7。

圖 5D描繪了從未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞獲得的 PBMC 和 CD8 選擇 T 細胞產品的 CD8+ 細胞上 Dextramer+ 百分比，這些所述 T 細胞使用 LV-TCR 啟動和轉導並在 IL-7 和 IL-15 中擴增 6 天。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7；t 檢驗，p ＞ 0.05 不具顯著性。

圖 5E描繪了從未分離 PBMC 和 CD8+ 選擇 T 細胞獲得的 PBMC 和 CD8 選擇 T 細胞產品的載體拷貝數，這些所述 T 細胞使用 LV-TCR 啟動和轉導並在 IL-7 和 IL-15 中擴增 6 天。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7；t 檢驗，p ＞ 0.05 不具顯著性。

圖 6A描繪了基於 CD45RA+ 和 CCR7+ 表達的來自 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物的 CD3+CD8+Dex+ 門控細胞中記憶 T 細胞分佈：T _naive；CD45RA+CCR7+；T _cm；CD45RA-CCR7；T _em；CD45RA-CCR7- T _emra；CD45RA+CCR7-。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7。單點代表一名供體。

圖 6B描繪了來自 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物的 CD3+CD8+Dex+ 細胞上 CD27、CD28 和 CD127 的 MFI（平均螢光強度）。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7。單點代表一名供體。

圖 6C描繪了來自 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物的 CD3+CD8+Dex+ 細胞上耗竭標誌物的表達。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。結果表示為平均值 ± SD，N = 5-7。單點代表一名供體。

圖 7描繪了在中等規模、大規模和 GMP 規模下測試的 PBMC LV-TCR 和 CD8 LV-TCR 產物中 CD3+CD8+Dex+ 細胞總計數。單點代表一名供體。結果表示為平均值 ± SD，不同規模下 N = 5-7。

圖 8顯示了源自未分離 PBMC 和 CD8+ T 細胞的 LV-TCR 產物回應 HLA-A*02+ 靶細胞系的細胞內細胞因子分泌情況。PBMC 或 CD8 衍生的 LV-TCR 產物與 PRAME+ UACC257（~1080 拷貝）細胞系以 1:1::E:T 比例共培養 12 小時，並在細胞內對顆粒酶 B、IFN-γ、TNF-α、MIP-1 和 IL-2 進行染色。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。結果表示為平均值 ± SD，N = 3。

圖 9A描繪了 IncuCyte 殺傷測定，其中 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與 HLA-A*02+ UACC257 細胞系（提呈約 1080 拷貝的 PRAME 抗原）在 E:T 比例為 4:1 下共培養 24 小時。腫瘤生長使用 IncuCyte S3 評估。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。顯示了代表性供體，N = 2。

圖 9B描繪了 IncuCyte 殺傷測定，其中 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與 HLA-A*02+ U2-OS 細胞系（提呈約 250 拷貝的 PRAME 抗原）在 E:T 比例為 4:1 下共培養 24 小時。腫瘤生長使用 IncuCyte S3 評估。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。顯示了代表性供體，N = 2。

圖 9C描繪了 IncuCyte 殺傷測定，其中 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與 HLA-A*02+ A375 細胞系（提呈約 50 拷貝的 PRAME 抗原）在 E:T 比例為 4:1 下共培養 24 小時。腫瘤生長使用 IncuCyte S3 評估。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。顯示了代表性供體，N = 2。

圖 9D描繪了 IncuCyte 殺傷測定，其中 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與 HLA-A*02+ MCF7 細胞系（提呈約 0 拷貝的 PRAME 抗原）在 E:T 比例為 4:1 下共培養 24 小時。腫瘤生長使用 IncuCyte S3 評估。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。顯示了代表性供體，N = 2。

圖 10描繪了 PBMC LV-TCR 和 CD8 LV-TCR 產物回應靶標的細胞因子分泌情況。PBMC LV-TCR 和 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與表達不同水準 PRAME 抗原的多種 HLA-A*02+ 靶細胞系：UACC257（約 1080 拷貝）、U2-OS（約 250 拷貝）、A375（約 50 拷貝）和 MCF7（0 拷貝）在 E:T 比例為 4:1 下共培養 24 小時。使用訂制 16 重 Luminex 試劑盒 (Thermo Fisher) 定量培養上清液中釋放的細胞因子。非轉導細胞（PBMC NT 和 CD8 NT）作為對照。結果表示為平均值 ± SD，N = 3。

圖 11A描繪了 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與不含細胞因子的完全 TexMACS 培養基中之 THP-1 靶細胞系（PRAME+，約 80 個拷貝）在 E:T 比例為 1:1 和 1:5 下共培養 17 天後的殘留腫瘤細胞。結果透過使用流式細胞術計數珠進行分析。未轉導的細胞作為對照。顯示了 2 名供體的平均值。

圖 11B描繪了 PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與不含細胞因子的完全 TexMACS 培養基中之 THP-1 靶細胞系（PRAME+，約 80 個拷貝）在 E:T 比例為 1:1 和 1:5 下共培養 17 天後的殘留 CD3+ T 細胞。結果透過使用流式細胞術計數珠進行分析。未轉導的細胞作為對照。顯示了 2 名供體的平均值。

圖 12描繪了 PBMC LV-TCR 和 CD8 LV-TCR 產物回應 THP-1 靶細胞系的細胞因子分泌情況。PBMC LV-TCR 或 CD8 LV-TCR 產物（標準化為 %CD8+Dex+）與 THP-1 靶細胞系（PRAME+，約 80 個拷貝）在 E:T 比例為 1:1 下共培養 24 小時。使用 34 重 Luminex 試劑盒 (Thermo Fisher) 定量培養上清液中釋放的細胞因子。未轉導的細胞作為對照。顯示了 2 名供體的平均值。

圖 13描繪了 PBMC LV-TCR 和 CD8 LV-TCR 產物中每輪殺傷後殘留 T 細胞中記憶 T 細胞分佈。基於 CD45RA+ 和 CCR7+ 表達的 CD3+CD8+Dextramer+ 門控細胞記憶表型：T _naive；CD45RA+CCR7+；T _cm；CD45RA-CCR7；T _em；CD45RA-CCR7- T _emra；CD45RA+CCR7-（E:T 比值為 1:1）。顯示了代表性供體。

圖 14描繪了根據本公開一實施方案進行 T 細胞製造的 6 天工藝。

圖 15描繪了血清對根據本公開一實施方案從兩名供體（上圖和下圖）中獲得的 CD8+TCR+T 細胞產品頻率（CD8+Dextramer 百分比）的影響。

圖 16描繪了血清對根據本公開一實施方案從兩名供體（上圖和下圖）中獲得的 T 細胞產品載體拷貝數的影響。

圖 17描繪了根據本公開另一實施方案進行 T 細胞製造的 6 天工藝。

圖 18描繪了啟動後，血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的生存力百分比（左圖）、總存活細胞（中圖）和回收率百分比的影響。

圖 19描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的啟動標誌物表達（例如人低密度脂蛋白 (hLDL)（左圖）、CD69（中圖）和CD25（右圖））的影響。

圖 20描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的啟動標誌物 CD25 表達（CD25+ % 親本（上圖）和 CD25+ MFI（下圖））的影響。

圖 21描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的啟動標誌物 CD69 表達（CD69+ % 親本（上圖）和 CD69+ MFI（下圖））的影響。

圖 22描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的啟動標誌物 hLDL 表達（hLDL+ % 親本（上圖）和 hLDL+ MFI（下圖））的影響。

圖 23描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的總細胞（上圖）和生存力（下圖）的影響。

圖 24描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品的 CD8+TCR+（CD8+Dex+ % 親本（上圖）和 CD8+Dex+ MFI（下圖））的影響。

圖 25描繪了血清對根據本公開一實施方案的 CD8+ 細胞群的影響。

圖 26描繪了血清對根據本公開一實施方案的 T 細胞產品中載體拷貝數 (VCN) 的影響。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims

一種產生工程化 T 細胞群的方法，其包括獲得包含 CD8+ T 細胞的細胞群，從所獲得細胞群中分離 CD8+ T 細胞，啟動分離的 CD8+ T 細胞，引入編碼 T 細胞受體 (TCR)（其結合與 MHC 分子複合的抗原）的核酸至啟動 CD8+ T 細胞中，以及擴增引入的 CD8+ T 細胞以獲得工程化 T 細胞群。
權利要求 1 所述的方法，其中所述細胞群包括外周血單核細胞 (PBMC)。
權利要求 2 所述的方法，其中 PBMC 包含少於 25% 的 CD8+ 細胞。
權利要求 1-3 中任一項所述的方法，其中分離包括使 CD8+ 細胞與抗 CD8 抗體接觸。
權利要求 1-4 中任一項所述的方法，其中啟動在存在抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體的情況下進行。
權利要求 1-5 中任一項所述的方法，其中所述 TCR 選自表 1。
權利要求 1-6 中任一項所述的方法，其中抗原選自 SEQ ID NO: 1-161。
權利要求 1-7 中任一項所述的方法，其中 TCR 與 SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 50) 結合。
權利要求 8 所述的方法，其中 TCR 選自 R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 163）、R11P3D3（SEQ ID NO: 204 和 205）、R16P1C10（SEQ ID NO: 206 和 207）、R16P1E8（SEQ ID NO: 208 和 209）、R17P1A9（SEQ ID NO: 210 和 211）、R17P1D7（SEQ ID NO: 212 和 213）、R17P1G3（SEQ ID NO: 214 和 215）、R17P2B6（SEQ ID NO: 216 和 217）和 R11P3D3KE（SEQ ID NO: 218 和 219）。
權利要求 1-9 中任一項所述的方法，其中 MHC 分子為 I 類 MHC 分子。
一種組合物，其包含透過權利要求 1-10 中任一項所述的方法產生的工程化 T 細胞群。
權利要求 11 所述的組合物，還可包括至少一種佐劑，所述佐劑選自抗 CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG) 的顆粒製劑、病毒體、白介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL -12、IL-13、IL-15、IL-21 和 IL-23。
一種產生工程化 T 細胞群的方法，其包括獲得包含 T 細胞的細胞群，使獲得的細胞群靜息，啟動靜息的細胞群，引入編碼 T 細胞受體 (TCR)（其結合與 MHC 分子複合的抗原）的核酸至在不存在血清的情況下的啟動細胞群中，以及擴增引入的細胞群以獲得工程化 T 細胞群。
權利要求 13 所述的方法，其中所述細胞群包括外周血單核細胞 (PBMC)。
權利要求 13 或 14 所述的方法，其中進行靜息約 2-8 小時、約 2-6 小時或約 2-4 小時。
權利要求 13-15 中任一項所述的方法，其中靜息在存在血清的情況下進行。
權利要求 13-16 中任一項所述的方法，其中啟動在存在抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體的情況下進行。
權利要求 13-17 中任一項所述的方法，其中啟動在不存在血清的情況下進行。
權利要求 13-18 中任一項所述的方法，其中所述 TCR 選自表 1。
權利要求 13-19 中任一項所述的方法，其中抗原選自 SEQ ID NO: 1-161。
權利要求 13-20 中任一項所述的方法，其中 TCR 與 SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 50) 結合。
權利要求 21 所述的方法，其中 TCR 選自 R11KEA（SEQ ID NO: 162 和 163）、R11P3D3（SEQ ID NO: 204 和 205）、R16P1C10（SEQ ID NO: 206 和 207）、R16P1E8（SEQ ID NO: 208 和 209）、R17P1A9（SEQ ID NO: 210 和 211）、R17P1D7（SEQ ID NO: 212 和 213）、R17P1G3（SEQ ID NO: 214 和 215）、R17P2B6（SEQ ID NO: 216 和 217）和 R11P3D3KE（SEQ ID NO: 218 和 219）。
權利要求 13-22 中任一項所述的方法，其中 MHC 分子為 I 類 MHC 分子。
一種組合物，其包含透過權利要求 13-23 中任一項所述的方法產生的工程化 T 細胞群。
權利要求 24 所述的組合物，還可包括至少一種佐劑，所述佐劑選自抗 CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG) 的顆粒製劑、病毒體、白介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL -12、IL-13、IL-15、IL-21 和 IL-23。
一種在癌症患者中引發免疫應答的方法，包括向患者施用權利要求 11、12、24 和 25 中任一項所述的組合物，其中所述癌症為肝細胞癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤、胃癌、食道癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、良性攝護腺增生、攝護腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、默克爾細胞癌、小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、膽囊癌和膽管癌、膀胱癌、急性淋巴細胞白血病、子宮癌、滑膜肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、圓形細胞脂肪肉瘤、轉移性直腸粘膜黑色素瘤、尿路上皮癌、黑色素瘤、食管胃交界部癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、粘液樣/圓細胞脂肪肉瘤或多發性骨髓瘤、腫瘤。
一種治療癌症患者的方法，包括向患者施用權利要求 11、12、24 和 25 中任一項所述的組合物，其中所述癌症為肝細胞癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤、胃癌、食道癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、良性攝護腺增生、攝護腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、默克爾細胞癌、小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、膽囊癌和膽管癌、膀胱癌、急性淋巴細胞白血病、子宮癌、滑膜肉瘤、粘液樣脂肪肉瘤、圓形細胞脂肪肉瘤、轉移性直腸粘膜黑色素瘤、尿路上皮癌、黑色素瘤、食管胃交界部癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、粘液樣/圓細胞脂肪肉瘤或多發性骨髓瘤、腫瘤。
一種產生工程化 T 細胞群的方法，其包括獲得包含 CD8+ T 細胞的細胞群，從所獲得細胞群中分離 CD8+ T 細胞，啟動分離的 CD8+ T 細胞，引入編碼嵌合抗原受體 (CAR)（其與抗原結合）的核酸至啟動 CD8+ T 細胞中，以及擴增引入的 CD8+ T 細胞以獲得工程化 T 細胞群。
一種產生工程化 T 細胞群的方法，其包括獲得包含 T 細胞的細胞群，使獲得的細胞群靜息，啟動靜息的細胞群，引入編碼嵌合抗原受體 (CAR)（其與抗原結合）的核酸至在不存在血清的情況下的啟動細胞群中，以及擴增引入的細胞群以獲得工程化 T 細胞群。