KR20220128988A - 항-cd3 scfv 및 사이토카인 생산용 인공 항원 제시 세포 - Google Patents

항-cd3 scfv 및 사이토카인 생산용 인공 항원 제시 세포 Download PDF

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KR20220128988A
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제임스 엘. 라일리
가빈 엘리스
준 수
잔 제이. 멜렌호르스트
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 CD3에 특이적인 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 이용하여 T-세포를 확장하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.

Description

항-CD3 SCFV 및 사이토카인 생산용 인공 항원 제시 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 제 62/941,062호에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
T 림프구(T-세포)의 프라이밍 및 확장을 포함하는 면역요법은 암 및 감염성 질병의 효과적인 치료의 가능성을 유지한다. 암 및 바이러스 감염 환자에서 입양 전달 요법의 현재 임상적 사용은 일정하게 시험관내에서 수주 동안 자기유래(autologous) 수지상 세포(DC), 바이러스에 감염된 B 세포 및/또는 동종이계 피더 세포(allogeneic feeder cell) 상에 자극, 클로닝 및 확장되는 T-세포의 주입을 포함한다. 그러나 입양(adoptive) T-세포 면역요법 임상 시험에는 일반적으로 환자당 수십억 개의 세포가 필요하다. 이러한 양의 세포를 생성하려면 T-세포를 시험관내에서 다수의 확장 배수에 적용해야 하며 최대 40개의 집단 배가가 필요하다. 또한, 최적의 이식 가능성과 재주입 시 가능한 치료 이점을 위해 확장된 T-세포가 기능을 유지하고 노화되거나 소진되지 않도록 하는 것이 중요하다.
입양 면역요법을 위한 T-세포 클론 및/또는 계통을 확장하는 방법은 특정 결점을 갖는 것으로 나타났다. 순수한 CD8+ 세포의 표준 배양은 아폽토시스(apoptosis), 생물학적 기능 및/또는 증식의 감소에 의해 제한되며, 유용한 충분한 수의 세포를 얻는 것이 특히 어려웠다. 실제로, 현재 환자에게 주입되는 이러한 T-세포는, 제한된 복제 능력을 가질 수 있으며, 따라서 질병으로부터 장기간 보호를 제공하기 위해 안정하게 생착되지 못할 수 있다. 또한, 인간 T-세포를 확장하는데 사용할 수 있는 다양한 기술은 주로 보조 세포(즉, PBMC, DC, B 세포, 단핵구 등과 같은 T-세포 생존 및 증식을 지원하거나 촉진하는 세포) 및/또는 인터루킨-2(IL-2), IL-7 및 IL-15와 같은 외인성(exogenous) 성장 인자의 사용에 의존해 왔다. 보조 세포에 대한 필요성은 이러한 세포가 상대적으로 수명이 짧기 때문에 장기 배양 시스템에 중요한 문제를 나타낸다. 따라서 장기 배양 시스템에서는 APC를 지속적으로 확보하고 보충해야 한다. 보조 세포의 재생 가능한 공급의 필요성은 보조 세포가 영향을 받는 면역 결핍증의 치료에 문제가 된다. 마찬가지로, 배양된 T-세포의 확장 및 기능을 지원하기 위한 사이토카인의 외인성 혼합물에 대한 필요성은 특히 GMP 등급 물질의 안정적인 공급원이 필요한 경우 비용을 상당히 추가한다.
따라서, 다양한 급성 및 만성 질병을 퇴치하기 위해 T-세포를 자극하고 입양 면역요법을 위해 충분한 수의 치료 T-세포를 제공하는 방법을 제공할 필요가 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 다룬다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 CD3에 특이적인 단일 사슬 가변 단편(scFv) 및 항-CD3 scFv를 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)뿐만 아니라, 상기 aAPC 및 aAPC-유래 막 소포(membrane vesicle)를 포함하는 조성물뿐만 아니라, 상기 항-CD3 scFv, 인공 APC, aAPC-유래 막 소포, 및 이의 조성물을 포함하는 T-세포를 확장하는 방법에 관한 것이다.
이와 같이, 일 양상에서, 본 발명은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성(specificity)을 갖는 항원 결합 도메인(antigen binding domain), 및 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 키메라 수용체 분자(chimeric receptor molecule)로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (heavy chain complementarity determining region, HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (light chain complementarity determining region, LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(light chain variable region)으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다.
일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)이다.
일부 실시형태에서, 비-인간 영장류는 마카카 물라타(Macaca mulatta)이다.
임의의 상기 항의 aAPC로서, 키메라 수용체 분자는 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타(zeta)의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 및 막관통 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다.
일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 힌지 도메인(hinge domain)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩(encoding)된다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열로 이루어진 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 구성적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
일부 실시형태에서, 조작된 K562 세포는 HLA 클래스(class) I, HLA 클래스 II, CD1d, CD16, CD64, CD83, CD86, 4-1BBL, OX40L, ICOSL, CD40L, PD-L1, PD-L2, B7-H3, 및 B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 내인성(endogenous)으로 발현하지 않는다.
일부 실시형태에서, aAPC는 세포 표면에 발현된 Fc 수용체를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 수용체는 CD64이다.
일부 실시형태에서, aAPC는 세포 표면에 발현된 공-자극 분자(co-stimulatory molecule)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공-자극 분자는 CD86이다.
일부 실시형태에서, aAPC는 세포 표면에 발현된 Fc 수용체, 및 세포 표면에 발현된 공-자극 분자를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 수용체는 CD64이고 공-자극 분자는 CD86이다.
일부 실시형태에서, aAPC는 항체가 로딩(loading)되고, 항체의 Fc 단편은 Fc 수용체에 의해 결합된다.
일부 실시형태에서, 항체는 CD3, CD28, PD-1, B7-H3, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HLA-DR, MHCII, Toll 리간드(ligand) 수용체 및 LFA-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 대해 특이성을 갖는다.
일부 실시형태에서, aAPC는 공-자극(co-stimulatory) 리간드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 공-자극 리간드는 4-1BBL이다.
본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, aAPC는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-35, 및 TGF-β으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 발현한다.
본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, aAPC는 IL-7을 발현한다.
본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, aAPC는 IL-15를 발현한다.
본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, aAPC는 IL-7 및 IL-15을 발현한다.
본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 일부 실시형태에서, aAPC는 IL-15R을 발현한다.
일부 바람직한 실시형태에서, IL-15R은 IL-15Rα이다.
일부 바람직한 실시형태에서, 사이토카인은 구성적으로 발현된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은
인간 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
일부 실시형태에서, aAPC는 IL-15R을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IL-15R은 IL-15Rα이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 임의의 상기 항의 aAPC를 포함하는 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 본 개시내용의 상기 양상 또는 임의의 양상 또는 실시형태 중 어느 하나의 인공 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, T-세포는 자기유래 T-세포이다.
일부 실시형태에서, T-세포는 인간 T-세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 조절 T-세포 (Treg)를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태 중 어느 하나의 인공 제시 세포 (aAPC)와 Treg를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조절 T-세포는 인간 T-세포이다.
일부 실시형태에서, 조절 T-세포는 비-인간 영장류 T-세포이다.
일부 바람직한 실시형태에서, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스이다.
일부 바람직한 실시형태에서, 비-인간 영장류는 마카카 물라타이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
aAPC는
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
aAPC는
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86;
4-1BBL;
IL-15Rα
를 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)로부터 유래된 막 소포를 포함하는 조성물을 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄(disruption)에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화(nitrogen cavitation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
CD64; 및
CD86; 및
4-1BBL; 및
IL-15Rα
를 포함하고;
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물을 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 본 발명의 상기 양상 또는 임의의 다른 양상 또는 실시형태의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 포함하고, 이는 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
CD64; 및
CD86; 및
4-1BBL; 및
IL-15Rα
를 포함하고;
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
일부 실시형태에서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
본 발명의 특정 실시형태에 대한 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 예시적인 실시형태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1a 내지 도 1c는 OKT3 CAR-발현 K562 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 개발을 나타낸다. 도 1a는 OKT3 CAR-발현 K562 세포를 생성하는 단계를 상세히 나타낸 순서도이다. 도 1b는 OKT3 CAR을 발현하는 형질도입된 K562 세포(K562.OKT3)를 예시하는 유세포 분석 그래프 세트이다. 도 1c는 CD64, CD86 및 OKT3 CAR을 발현하는 형질도입된 K562 세포(K562.64.86.OKT3)를 예시하는 유세포 분석 그래프(flow cytometry plot) 세트이다. 결과는 형질도입되지 않은 대조군(UTD)과 비교된다.
도 2는 새로 생성된 K562.OKT3 세포주의 다양한 클론에서 OKT3 CAR 작제물의 발현을 나타낸다. 히스토그램(histogram)은 유세포 분석에 의해 평가된 CD3 CAR 작제물의 발현 수준을 나타낸다. 범례는 CD3 CAR 염색에 상응하는 채널의 각 클론의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 상자와 화살표는 가장 높은 MFI를 나타내는 클론(클론 4 및 5)이 추가 개발을 위해 선택되었음을 나타낸다.
도 3은 새로 생성된 K562.64.86.OKT3 세포주의 다양한 클론에서 OKT3 CAR 작제물의 발현을 나타낸다. 히스토그램은 유세포 분석에 의해 평가된 CD3 CAR 작제물의 발현 수준을 나타낸다. 범례는 CD3 CAR 염색 채널에서 각 클론의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 상자와 화살표는 가장 높은 MFI를 나타내는 클론(클론 8 및 11)이 추가 개발을 위해 선택되었음을 나타낸다.
도 4는 인간 T-세포의 확장을 자극하는 K562.OKT3 및 K562.64.86.OKT3 세포주의 능력을 나타낸다. 정상 공여체 T-세포는 다양한 시점에서 T-세포의 수가 평가되는 동안 9 내지 12일의 배양 동안 다양한 K562 세포주와 공동 인큐베이션되었다. 데이터는 세포 수의 상대적인 증가 배수(fold)로 표시된다. 항-CD3/CD28 코팅된 비드를 양성 대조군으로 사용하였다. 자극되지 않은 T-세포만을 음성 대조군으로 사용하였다.
도 5는 PCT/EP2009/062795의 배경기술을 통해 F12Q 항-CD3 scFv가 개발된 인간 및 사이노몰구스 원숭이 유래 모두의 흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸(MCSP) 및 CD3에 특이적인 이중특이적 T-세포 결합인자(BiTE) 분자의 특이성을 나타낸다. MCSP-발현 CHO 세포 및 인간/원숭이 T-세포에 대한 다수의 CD3/MCSP BiTE의 친화도를 나타내는 유세포 분석 그래프가 표시된다. 음영은 F12Q 항-CD3 scFv에서 유래된 BiTE가 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대해 가장 높은 친화도를 나타내었고 이후 항-CD3 scFv CAR로의 추가 개발을 위해 선택되었음을 나타낸다.
도 6은 F12Qz CAR-발현 aAPC를 개발하는 과정을 나타낸다. K562 세포를 발현하는 모 K562 또는 CD64/CD86은 F12Qz-기반 CAR 작제물로 형질도입되었고, 이어서 CAR 발현 및 인간 T-세포 확장을 자극하는 능력에 대해 선택되었다.
도 7은 K562.64.86.F12Qz 세포가 인간 특이성의 다수의 항-IgG 항체를 사용하여 검출할 수 없음을 나타낸다. 숫자는 양성으로 염색된 세포의 백분율을 나타낸다.
도 8은 인간 및 비-인간 영장류 T-세포 둘 모두의 증식을 유도하는 F12Qz CAR-발현 K562.64.86 세포의 능력을 나타낸다. OKT3-CAR(가운데) 또는 F12Qz-CAR(오른쪽)을 발현하는 K562.64.86 세포를 붉은털 원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이의 T-세포 또는 인간 T-세포와 공동 인큐베이션했다. T-세포 확장은 12일에 걸쳐 다양한 시점에서 평가되었으며, 데이터는 T-세포 수의 증가 배수로 표시된다. 음성 대조군으로서, T-세포는 자극되지 않은 채로 유지되었다(왼쪽 패널).
도 9는 K562.64.86.F12Qz aAPC가 비-인간 영장류(NHP) T-세포를 선택적으로 자극하고 확장함을 나타낸다. 2개의 사이노몰구스 원숭이 공여체 또는 붉은털 원숭이 공여체의 T-세포 집단을 9일 동안 K562.64.86.F12Qz 세포로 자극한 후 CD3 및 CD8 발현에 대해 염색하고 유세포 분석에 의해 판독했다. 확장 전에 염색된 공여체 세포가 맨 위 행에 표시된다. 9일 확장 후 염색된 상응하는 세포 그룹이 맨 아래 행에 표시된다.
도 10은 K562.64.86.F12Qz 세포를 염색하는데 사용되는 가용성 CD3ε 단백질의 개발을 나타낸다. 세포를 표시된 양의 가용성 비오틴화(biotinylated) CD3ε 단백질로 염색한 다음 2차 염색으로 PE-접합 스트렙타비딘으로 대조 염색했다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 염색된 세포를 분석했다. 상단 행은 각 그룹의 전방/양상 분산 특성과 PE(CD3ε) 염색(하단 행)의 추가 평가에 사용되는 게이팅(gating)을 나타낸다.
도 11은 새로 생성된 K562.64.86.F12Qz 세포주로부터 유래된 다양한 클론에서 F12Qz CAR 작제물의 발현을 나타낸다. 히스토그램은 가용성 비오틴화된 CD3ε 단백질로 염색한 후 스트렙타비딘-PE로 염색하여 평가한 작제물 발현 수준을 나타낸다. 범례는 각 클론에 대한 염색의 평균 형광 강도를 나타낸다. 상자와 화살표는 가장 높은 MFI를 나타내는 클론(클론 7 및 8)이 추가 개발을 위해 선택되었음을 나타낸다.
도 12는 다양한 세대의 K562-기반 인공 APC의 특징을 나타내는 차트이다.
도 13은 T-세포 확장 시스템의 비교를 나타낸다. 통상의 (WAVE) 과정의 기능과 비용을 새로 개발된(GREX) 과정과 비교한다.
도 14a 및 도 14b는 6회 계대 후 APC4.1 세포(K562.64.41BBL.CAR3.IL7.IL15-15R)의 10개 클론에서 형질도입된 분자의 발현을 나타낸다. 모 K562 세포의 염색을 음성 대조군으로 사용했다. 화살표는 이중 음성 세포의 수가 최소인 고발현 클론을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 4 내지 6회 계대 후 APC5.1 세포(K562.64.41BBL.86.CAR3.IL7.IL15-15R)의 10개 클론에서 형질도입된 분자의 발현을 나타낸다. 모 K562 세포의 염색을 음성 대조군으로 사용했다. 화살표는 이중 음성 세포의 수가 최소인 고발현 클론을 나타낸다.
도 16은 인간 T-세포의 확장을 자극하는 10개의 APC4.1(왼쪽) 및 APC5.1(오른쪽) 클론의 능력을 나타낸다. 각 클론을 6일 동안 정상 인간 공여체 T-세포와 공동 배양하고, 웰당 총 세포 수를 결정하여 표시된 시점에서 T-세포 확장을 평가하였다.
도 17은 2개의 APC4.1 클론에서 전이유전자 발현의 안정성을 나타낸다. 각 전이유전자의 발현(열)은 시험관내에서 3 및 9회 계대 후 각 클론에서 평가되었다. 비교를 위해 모 K562 세포를 음성 대조군으로 사용했다(상단 행).
도 18은 이전 계대에서 도 17에 사용된 APC4.1 클론의 전이유전자 발현을 나타낸다. 클론 6(상단 행) 및 클론 20(하단 행)의 세포는 표시된 단백질에 대해 3회 계대 후 염색되었다.
도 19는 2개의 APC5.1 클론에서 전이유전자 발현의 안정성을 나타낸다. 각 전이유전자(열)의 발현은 시험관내에서 3, 4, 및 8회 계대 후 각 클론에서 평가되었다. 비교를 위해 모 K562 세포를 음성 대조군(상단 행)과 동일한 항체 패널(panel)로 염색했다.
도 20은 6개의 APC4.1(상단 행) 및 6개의 APC5.1(하단 행) 클론에서 형질도입된 사이토카인(cytokine)의 발현 수준을 나타낸다. 5e5 세포/mL를 2 mL 총 부피에서 밤새 배양한 후 ELISA에 의한 IL-7(왼쪽) 및 IL-15(오른쪽) 농도의 사이토카인 측정을 위해 조정된 배지를 수확했다.
도 21a 내지 도 21c는 X-VIVO 또는 OpTmizer 무혈청 배지에서 다양한 인공 APC 또는 비드로 자극한 후 8일 후 T-세포 배양물에서 사이토카인 존재의 지속성을 나타낸다. T-세포는 8일 동안 표시된 APC(APC2.0, 3.0, 2.1, 3.1, 4.1 또는 5.1), 항-CD3 항체 로딩된 APC(2D11) 또는 항-CD3/CD28 비드(BDS)와의 공동 배양에 의해 자극되었다. 외인성 IL-7 및 IL-15를 내인성으로 생성하지 않는 APC(비드, 2D11 및 APC3.1/2.1/3.0/2.0)가 있는 배양물에 추가했다. X-VIVO 및 OpTmizer 배지에서만 배양된 자극되지 않은 T-세포를 음성 대조군(기본)으로 사용했다. 이어서, 배양 배지를 ELISA에 의해 IL-7(도 21a), IL-15(도 21b) 및 IL-15/15R(도 21c)의 농도에 대해 평가하였다.
도 22는 7일 후 T-세포 공동-배양물에서 인공 APC의 지속성의 부재를 나타낸다. IL-7-mCherry 발현 APC를 다양한 배양 조건에서 7일 동안 환자 #3-07409_104의 공여체 T-세포와 공동 배양했다. 그런 다음 배양물을 생존성 염료 7-AAD로 염색하고 유세포 분석을 통해 mCherry 발현을 평가했다. 대조군 배양물은 항-CD3/CD28 다이나비드(dynabead) 및 다이나비드 + 사이토카인(quad)으로 자극되었다.
도 23은 다른 인간 환자(#3-13406_03)의 세포를 사용한 T-세포 공동 배양에서 인공 APC의 지속성의 부재를 나타낸다. 배양 7일 후, 세포를 생존성 염료 7-AAD로 염색하고 mCherry 발현을 유세포 분석으로 평가했다. 이중 양성 및 이중 음성 집단은 사분면 게이팅으로 분리되었고, 각 집단은 전방/양상 분산 및 CD3 발현에 대해 평가되어 나머지 생존 세포가 T-세포임을 나타냈다.
도 24는 조사된 인공 APC가 7일 배양 후에 지속되지 않음을 나타낸다. APC4.1(왼쪽) 및 APC5.1(오른쪽) 세포에 조사하고 시험관내에서 7일 동안 배양했다. 그런 다음 세포를 7-AAD로 염색하고 생존성 염료 염색 및 mCherry 발현을 비교하는 유세포 분석에 의해 판독했다.
도 25는 GREX 배양 장치에서 다양한 무혈청 배지를 사용하여 3명의 인간 환자로부터 T-세포의 확장을 나타낸다. 각 배양 조건/환자 세포군에 대한 확장 정도는 배양 개시(0일)과 종료(7일)의 세포 수를 비교하고 확장 배수(FE)를 결정하여 결정했다.
도 26은 GREX 배양 장치에서 다양한 배양 조건하에서 인간 환자 T-세포의 T-세포 크기의 변화를 나타낸다. 3명의 다른 환자의 T-세포는 다양한 무혈청 배지 및 aAPC를 사용하여 유사한 유도된 배양 조건에 적용되었다.
도 27a 및 도 27b는 APC3.1과의 공배양에 의한 인간 공여체 말초혈액으로부터의 CD4+ CD25+ CD127low/- CD45RA+ 조절 T-세포(Treg)의 확장을 나타낸다. 세포를 5% 인간 AB 혈청, 1X 글루타맥스, 1X pen/strep 및 200 IU/mL IL-2가 포함된 XVIVO 배지에서 14일 동안 배양했다. 9일차에 세포를 APC3.1로 재자극했다. 14일차에 세포를 CD4-BV421(OKT4), CD8-BV510(RPA-T8), CD25-APC(BC96) 및 FoxP3-PE-Dazzle594(206D)로 염색했다. 도 27a는 14일 배양 동안 다양한 시점에서의 세포 수를 나타낸다. 도 27b는 14일차에 확장된 Treg의 유세포 분석 염색을 나타낸다. CD4 대 CD8(왼쪽) 및 CD25 대 Foxp3(오른쪽).
도 28은 비-인간 영장류 조절 T-세포(Treg)의 확장 및 형질도입을 나타낸다. 사이노몰구스 마카크 조절 T-세포는 0일차에 irr로 자극되었다. RPMI + 10% FBS + 10 mM HEPES + 1x 글루타멕스 + 1X pen/strep + IL-2 중 K562.F12Q.64.86. 2일차에, 인간 HLA-A2 특이적 CAR을 인코딩하는 바이러스를 세포 배양물에 첨가하였다. 7일차에, 세포를 조사된 K562.A2.86 세포로 재자극하여 세포를 재자극함으로써 CAR+ 세포만을 확장시켜 CAR+ 세포의 백분율을 증가시켰다.
도 29는 GREX 배양 장치를 사용한 다양한 자극 방법 및 무혈청 배지 제형을 사용한 T-세포의 확장 배수를 나타낸다.
도 30은 도 25, 도 26, 및 도 29에 사용된 바와 같은 다양한 aAPC 및 자극 방법을 사용한 확장 및 다양한 무혈청 배지 조건에서 배양된 후 재자극된 T-세포에 의한 사이토카인 생성을 나타낸다.
도 31a 및 도 31b는 APC-유사 막 소포를 생성하기 위해 aAPC를 파괴하기 위한 질소 공동화의 사용을 나타낸다. 도 31a는 예시적인 질소 공동화 용기("폭탄")의 다이어그램이다. 도 31b는 질소 공동화를 사용하여 aAPC 세포로부터 aAPC 막 소포 생성의 예시적인 작업 흐름도를 나타낸다.
도 32는 질소 공동화 방법을 사용하여 생성된 4개의 독립적인 막 소포 aAPC 제제의 입자 크기를 나타낸다.
도 33은 APC5.1 세포로부터 생성된 aAPC 막 소포로 자극 후 T-세포 상의 CD64 및 CD86을 나타내는 일련의 현미경 사진이다.
도 34는 항-CD3/항-CD28 코팅된 마이크로비드("비드")와 비교하여 다양한 농도의 aAPC 막 소포 제제와 함께 인큐베이션한 후 인간 공여체 CD4+ T-세포의 증식을 나타낸다. 삽입된 표는 각 막 소포 제제의 입자 농도 및 평균 입자 크기를 나타낸다.
도 35는 항-CD3/항-CD28 코팅된 마이크로비드("비드")와 비교하여 다양한 농도의 aAPC 막 소포 제제와 함께 인큐베이션 후 인간 공여체 CD8+ T-세포의 증식을 나타낸다. 삽입된 표는 각 막 소포 제제에서 발생하는 분할 지수, 확장 지수, 복제 지수 및 분할 퍼센트를 나타낸다.
도 36은 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드와 비교하여 다양한 농도의 aAPC 막 소포 제제를 사용한 확장 동안 T-세포의 렌티바이러스(lentiviral) 형질도입을 나타낸다.
도 37은 항-CD3/항-CD28 비드의 10 ml 병으로 자극될 수 있는 다수의 T-세포의 자극을 위한 세포 및 배지 요건을 나타내는 표이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 기재하고 청구함에 있어 다음과 같은 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "~를 포함하는"이라는 용어와 "~를 포함하다" 및 "~가 포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 잘 알려져 있고 일반적으로 당업계에 사용된다. 본 명세서에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 수행되며 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조자의 지침에 따라 수행된다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 실험실 절차 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형, 전달 및 환자 치료에 사용된다.
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 선택된 용어가 하기에 정의된다.
단수형 관사 ("a" 및 "an")은 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
양, 시간 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본 명세서에서 사용되는 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더욱 바람직하게는 ±1%, 및 여전히 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 의미이며, 이는 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T-세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성 및 검출 가능한 효과기 기능과 관련될 수 있다. "활성화된 T-세포"라는 용어는 특히 세포 분열이 진행되고 있는 T-세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 질병을 "경감"시키는 것은 질병의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있고 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 일반적으로 면역글로불린 분자의 사량체(tetramer)이다. 사량체는 천연적으로 발생하거나 단일 사슬 항체 또는 항체 단편에서 재작제될 수 있다. 항체는 또한 천연적으로 발생하거나 단일 사슬 항체 또는 항체 단편으로부터 작제될 수 있는 이량체를 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 다클론항체, 단일클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab')2뿐만 아니라, 단일 사슬 항체 (scFv), 인간화된 항체, 및 인간 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(문헌[Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426]).
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭하고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 표적에 대해 충분한 친화도를 나타내는 VL 또는 VH 도메인으로 구성된 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 단일-도메인 항체, 예컨대 낙타류 항체(문헌[Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38]), 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체 단편은 또한 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 인간화된 항체의 일부를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항체 중쇄"는 천연 발생 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항체 경쇄"는 천연 발생 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. κ 및 λ 경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 박테리오파지에 의해 발현되는 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 획득된다.
"인간화" 및 "키메라" 형태의 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 및 키메라 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기가 적절한 특이성, 친화도 및 기능을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크(framework) 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 및 키메라 항체는 수용체 항체나 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 및 키메라 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역에 상응하는 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 및 키메라 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 세계보건기구(WHO) 국제 일반 명칭(INN) 전문가 그룹은 "인간화"로 고려되는 비-인간 유래 항체에 대한 요건을 정의했다. 가이드라인에 따르면, 후보 항체와 인간 서열의 비교는 International Immunogenetics Information System®(IMGT®) DomainGapAlign 툴(www.imgt.org)를 통해 수행해야 한다. 이 툴은 정렬 점수가 생식계통 서열 가변 영역 엑손(exon)에 대해서만 이루어지는 항체 생식계통 가변 영역 유전자의 IMGT® 데이터베이스를 조사하여 분석에서 CDR3 및 J 영역의 일부를 생략한다. 항체가 "인간화"되기 위해서는 "다른 종보다 인간에 더 가깝다"는 것 외에도 최상위 "적중"이 인간이어야 하고 인간 서열에 대한 동일성이 적어도 85%이어야 하며, 그렇지 않으면 항체가 "키메라"로 지정된다. 자세한 내용은 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생성 또는 면역학적으로 적합한 특정 세포의 활성화 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 따라서 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 일부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장(full length) 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 인코딩될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 다음에 제한되는 것은 아니나, 하나 초과의 유전자의 일부 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함한다는 것과 이러한 뉴클레오타이드 서열은 적절한 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 쉽게 명백하다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 다음에 제한되는 것은 아니나, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "자기유래"는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하며, 이는 나중에 개체 내로 재도입된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공-자극 리간드"는 T-세포 상의 동족(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, 펩타이드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T-세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공-자극 리간드는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공-자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체와 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다.
"공-자극 분자"는 공-자극 리간드와 특이적으로 결합하여 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식과 같은 T-세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는 T-세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공-자극 분자에는 다음에 제한되는 것은 아니나 CD86, 4-1BBL, BTLA 및 Toll 리간드 수용체가 포함된다.
"질병"은 동물이 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태이며, 질병이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화된다. 이와 달리, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있는 건강 상태이지만 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 상태이다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 본 명세서에서 상호 혼용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하거나 치료 또는 예방 이익을 제공하는데 효과적인 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는 다음에 제한되는 것은 아니나 포유류에게 투여될 때, 본 발명의 조성물의 부재 하에 검출된 면역 반응과 비교하여 검출가능한 수준의 면역 억제 또는 내성을 야기하는 양을 포함할 수 있다. 면역 반응은 당업계에서 인정하는 다수의 방법으로 쉽게 평가할 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 투여되는 조성물의 양이 다양하고, 치료되는 질병 또는 병태, 치료되는 포유류의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질병의 중증도, 투여되는 특정 화합물 등과 같은 다수의 인자에 기반하여 용이하게 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
"인코딩"은 소정의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 서열 또는 소정의 아미노산 서열 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성의 주형으로서 작용할 수 있도록 하는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 내의 특정 뉴클레오타이드 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 모두를 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물을 인코딩하는 것으로 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 생성되거나 그 내부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 B 및/또는 T-세포 반응을 유도하는 면역 반응을 유발할 수 있는 항원 상의 작은 화학 분자로 정의된다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 대부분의 항원에는 많은 에피토프가 있으며; 즉, 이는 다가이다. 일반적으로 에피토프는 대략 10개의 아미노산 및/또는 당(sugar) 크기이다. 바람직하게는, 에피토프는 약 4 내지 18개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 5 내지 16개 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 6 내지 14개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 12개, 가장 바람직하게는 약 8 내지 10개 아미노산이다. 당업자는 일반적으로 분자의 특정 선형 서열보다는 전체 3차원 구조가 항원 특이성의 주요 기준이며 따라서 하나의 에피토프를 다른 에피토프와 구별한다는 것을 이해한다. 본 개시내용에 기반하여, 본 발명에서 사용되는 펩타이드는 에피토프일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 외부의 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "확장"은 T-세포의 수의 증가에서와 같은 수의 증가를 지칭한다. 일 실시형태에서, 생체외(ex vivo)에서 확장된 T-세포는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 실시형태에서, 생체외에서 확장된 T-세포는 배양물에서 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생체외"는 생존 유기체(예를 들어, 인간)로부터 제거되고 유기체 외부(예를 들어, 배양 접시, 시험관 또는 생물반응기)에서 증식된 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 이의 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코스미드(cosmid), 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜 내 포함) 및 바이러스(예를 들어, 센다이 바이러스(Sendai virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus))와 같은 당업계에 알려진 모든 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 특히 2개의 아미노산 분자 사이, 예를 들어 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 하위단위 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 분자 각각의 위치가 아르기닌에 의해 점유된다면, 이들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 아미노산 서열이 정렬의 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 동일성 또는 정도는 종종 백분율로 표시된다. 두 아미노산 서열 사이의 동일성은 매칭(matching)되거나 동일한 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열에 있는 위치의 절반(예를 들어, 10개 아미노산 길이의 중합체의 5개 위치)이 동일한 경우, 2개의 서열은 50% 동일하며; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 동일한 경우 두 아미노산 서열은 90% 동일하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 림프구가 항원 분자를 외래(foreign)로 확인하고 항체 형성을 유도하고/거나 림프구를 활성화하여 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로 정의된다.
용어 "면역억제제"는 전체 면역 반응을 감소시키는 것을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
"단리된"은 천연 상태에서 변이되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 생존 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "렌티바이러스"는 레트로비리대 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 고유하고; 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된"은 본 발명의 분자 또는 세포의 변경된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자는 화학, 구조, 기능 등 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산의 도입을 통해 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절"은 치료 또는 화합물의 부재 하에 대상체에서의 반응 수준과 비교하고/하거나, 동일하지만 치료를 받지 않은 대상체의 반응 수준과 비교하여, 대상체에서의 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 이 용어는 본래의 신호 또는 반응을 교란시키고/시키거나, 이에 영향을 주어 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, C, G)로 표시될 때, 이는 "U"가 "T"로 대체되는 RNA 서열(즉, A, U, C, G)을 또한 포함한다는 것을 이해할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴 형태이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 형태에서 인트론(intron)(들)을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬로 정의된다. 또한 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호 혼용된다. 당업자는 핵산이 단량체 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 다음에 제한되는 것은 아니나, 일반적인 클로닝 기술과 PCR 등을 이용하여, 합성 수단에 의해 제한 없이, 재조합 수단, 즉, 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 당업계에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 획득된 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 혼용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 사슬 및 많은 유형 중 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 보다 긴 사슬 둘 다 지칭한다. "폴리펩타이드"는 예를 들어 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체(heterodimer), 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이의 조합을 포함한다.
항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 항원을 인식하지만, 샘플 중 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종의 항원에 결합할 수 있다. 그러나 이러한 종간 반응성 자체가 항체의 특이적 분류를 변경하지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립형질 형태에 결합할 수 있다. 그러나 이러한 교차 반응성 자체가 항체의 특이적 분류를 변경하지는 않는다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질 또는 펩타이드와 제2 화학 종과의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있으며, 이는 상호작용이 화학종의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 좌우되고; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리, 표지되지 않은 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"자극"이라는 용어는 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 이의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되고, 이에 의해 다음에 제한되는 것은 아니나, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 사건을 매개하는 1차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-베타의 하향조절 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T-세포 상의 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 T-세포 상의 동족 결합 파트너(본 명세서에서 "자극 분자"로 지칭됨)와 특이적으로 결합하여, 이에 의해 다음에 제한되는 것은 아니나, 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하는 T-세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 펩타이드가 로딩된 MHC 클래스 I 분자, 항-CD3 항체, 초작용제 항-CD28 항체, 및 초작용제 항-CD2 항체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 생존 유기체(living organism)(예를 들어, 포유류)를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유류일 수 있다. 비-인간 포유류는 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양과(ovine), 소과(bovine), 돼지과(porcine), 개과(canine), 고양이과(feline) 및 뮤린(murine) 포유류를 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합이 일어나기에 충분한 조건 하에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 결합 분자가 결합이 일어나기에 충분한 조건 하에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "T-세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 제시에 반응하여 T-세포의 활성화에 관여하는 막 단백질(membrane protein)의 복합체를 지칭한다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다. TCR은 알파(α) 및 베타(β) 사슬의 이종이량체로 구성되지만 일부 세포에서는 TCR이 감마 및 델타(γ/δ) 사슬로 이루어진다. TCR은 구조적으로 유사하지만 구별되는 내부 위치와 기능을 갖는, 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있다. 각 사슬은 두 개의 세포외 도메인, 즉 가변 도메인과 불변 도메인으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, TCR은 예를 들어 보조 T-세포, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포, 조절 T-세포, 천연 살해 T-세포, 및 감마 델타 T-세포를 포함하는 TCR을 포함하는 임의의 세포에서 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억제, 관해 또는 근절에 의해 얻어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포에는 1차 대상 세포와 그 자손이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어로 질병을 "치료"한다는 것은 대상체가 경험하는 질병 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어 폴리리신(polylysine) 화합물, 리포솜(liposome) 등과 같은 핵산의 세포내로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함한다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양상이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 비가변적 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위와 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같은 하위 범위 및 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
인공 항원 제시 세포 (aAPC)
본 발명은 CD3에 특이적인 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))를 발현하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)가 T-세포의 활성화 및 확장을 촉진할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 키메라 수용체는 인간 CD3 및/또는 비-인간 영장류(예를 들어, 마카카 파시쿨라리스 및/또는 마카카 물라타) CD3에 특이적이다. 특정 실시형태에서, aAPC는 인간 적혈구 세포주 K562를 기반으로 한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 자극 및/또는 공-자극 분자를 발현하고/거나 사이토카인을 분비한다. 본 발명은 또한 인간 및 비-인간 영장류 둘 모두로부터의 T-세포 하위집합, 특히 조절 T-세포(Treg)의 확장을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 활성화 및 확장은 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 공-자극 분자를 내인적으로 발현하는 aAPC 및/또는 그렇지 않으면 사용 전 제조 단계 중에 외인성 공급원에서 제공해야 하는 성장 지원 사이토카인에 의해 일반적으로 사용되는 방법보다 더 효율적으로 이루어진다. 다음은 본 발명을 실시하는데 필요한 방법 및 다양한 고려 사항에 대한 설명을 제공한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일 양상은 CD3에 특이적으로 결합하는 키메라 수용체를 포함하도록 조작된 aAPC에 관한 것이다. 키메라 수용체는 CD3에 특이적인 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. aAPC는 선택적으로 세포내 도메인 및/또는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, aAPC는 적어도 하나의 공-자극 분자를 포함하고/거나 적어도 하나의 성장-촉진 사이토카인을 분비한다.
항원 제시 세포(APC)는 표면 상에 주 조직적합 복합체(major histocompatibility complex, MHC)와 복합체를 형성한 항원을 디스플레이하는 세포이다. T-세포에 의해 발현되는 T-세포 수용체(TCR) 복합체는 항원/MHC 복합체를 인식하여 T-세포의 활성화를 초래한다. APC의 역할은 항원을 지속적으로 처리하여 T-세포에 제시하는 것이다. 일반적인 천연 발생 APC의 비제한적인 예는 대식세포, B 세포 및 수지상 세포를 포함한다.
APC는 면역계가 효과적인 후천적 면역 반응을 일으키는데 필수적이며; 세포독성 T-세포와 보조 T-세포 모두의 기능은 APC에 의해 제시되는 항원의 인식이 필요하다. 항원 제시는 후천적 면역의 특이성을 결정하고 세포내 및 세포외 병원체에 대한 면역 반응에 관여한다. APC는 또한 변형된 세포, 예를 들어 악성 세포 또는 종양을 인식하도록 면역계를 준비시키는데 중요한 역할을 한다.
항원 결합 도메인
본 발명은 CD3(예를 들어, 인간 CD3 및/또는 비-인간 영장류 CD3)에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함한다. 항원 결합 도메인은 특정 표적 항원(예를 들어, CD3)에 결합하는 키메라 수용체의 세포외 영역이다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3(예를 들어, 마카카 파시쿨라리스 및/또는 마카카 물라타로부터의 CD3)에 특이적이다.
항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함할 수 있고 다음에 제한되는 것은 아니나, 단일클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 비-인간 항체, 및 이의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 항원 결합 도메인 일부분은 포유류 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 항체, 항원-결합 단편(Fab), 및 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 공유 결합되어 VH::VL 이종이량체를 형성하는 면역글로불린(예를 들어, 마우스 또는 인간)의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역의 융합 단백질이다. 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)는 VH의 N-말단과 VL의 C-말단 또는 VH의 C-말단과 VL의 N-말단을 연결하는 펩타이드 인코딩 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)에 의해 연결되거나 직접 연결된다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, CD3 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로의 구성, VH - 링커 - VL을 갖는 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, CD3 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로의 구성, VL - 링커 - VH를 갖는 scFv를 포함한다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 구성을 선택할 수 있을 것이다.
링커는 일반적으로 가변성을 위한 글리신뿐만 아니라, 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 다존재한다. 링커는 세포외 항원 결합 도메인의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 연결할 수 있다. 링커의 비제한적인 예는 문헌[Shen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)] 및 WO 2014/087010에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. 제한 없이 (GS)n, (GSGGS)n (서열번호 27), (GGGS)n (서열번호 28), 및 (GGGGS)n (서열번호 29)과 같은 글리신 세린(GS) 링커를 포함하는 다양한 링커 서열이 당업계에 공지되어 있으며, n은 적어도 1의 정수를 나타낸다. 예시적인 링커 서열은 제한 없이, GGSG (서열번호 30), GGSGG (서열번호 31), GSGSG (서열번호 32), GSGGG (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GSSSG (서열번호 35), GGGGS (서열번호 36), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 37) 등을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 링커 서열을 선택할 수 있을 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 도메인(예를 들어, CD3 결합 도메인)은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, VH 및 VL은 핵산 서열 ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt ggcggcggatct(서열번호 38)에 의해 인코딩될 수 있는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 37)을 갖는 링커 서열에 의해 분리된다.
불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단일 사슬 Fv 폴리펩타이드 항체는 문헌[Huston, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)]에 의해 기재된 바와 같이 VH 및 VL-인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국 특허 제 5,091,513, 5,132,405 및 4,956,778; 및 미국 특허 공개 제 20050196754호 및 제 20050196754호를 참조한다. 억제 활성을 갖는 길항제 scFv가 기재되어 있다(예를 들어, Zhao et al., Hybridoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51; Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12; Shieh et al., J Imunol 2009 183(4):2277-85; Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63; Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61; Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84; Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)] 참조). 자극 활성을 갖는 작용제 scFv가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Peter et al., J Bioi Chem 2003 25278(38):36740-7; Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71; Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55; Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66] 참조).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fab"는 항원에 결합하지만 1가이고 Fc 부분을 갖지 않는 항체 구조의 단편을 지칭하며; 예를 들어, 효소 파파인에 의해 분해된 항체는 2개의 Fab 단편 및 Fc 단편(예를 들어, 중쇄(H) 사슬 불변 영역; 항원에 결합하지 않는 Fc 영역)을 생성한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "F(ab')2"는 전체 IgG 항체의 펩신 분해에 의해 생성된 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 2개의 항원-결합(ab')(2가) 영역을 갖고, 각각의 (ab')) 영역은 두 개의 개별 아미노산 사슬, 항원-결합을 위한 S-S 결합으로 연결된 경쇄(L) 및 H 사슬의 일부를 포함하며, 나머지 H 사슬 부분은 함께 연결되어 있다. "F(ab')2" 단편은 2개의 개별 Fab' 단편으로 분할될 수 있다.
일부 경우에, 항원 결합 도메인은 키메라 수용체가 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, 키메라 수용체의 항원 결합 도메인은 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같은 인간 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 1 내지 3에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR 및/또는 서열번호 4 내지 6에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 LCDR을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 11 내지 13에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR 및/또는 서열번호 14 내지 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 LCDR을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다. 특정 실시형태에서, scFv는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, scFv는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
항원 결합 도메인은 키메라 수용체의 다른 도메인, 예를 들어, 막관통 도메인 또는 세포내 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 둘 모두 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산은 막관통 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 도메인(예를 들어, CD3에 결합하는 scFv)은 본 명세서에 기재된 임의의 막관통 도메인, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 세포내 도메인과 조합될 수 있다.
막관통 도메인
대상 키메라 수용체의 막관통 도메인은 aAPC의 원형질막에 걸쳐 있을 수 있는 영역이다. 막관통 도메인은 세포막, 예를 들어 aAPC 세포막으로의 삽입을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 항원 결합 도메인과 키메라 수용체의 세포내 도메인 사이에 삽입된다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 키메라 수용체에서 하나 이상의 도메인과 천연적으로 결합되어 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 방지하기 위해 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합(membrane-bound) 또는 막관통 단백질, 예를 들어 유형 I 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 공급원이 합성인 경우, 막관통 도메인은 CAR의 세포막 내로의 삽입을 용이하게 하는 임의의 인공 서열, 예를 들어 인공 소수성 서열일 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 막관통 영역의 예는 제한 없이, T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134 (OX-40), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), Toll-유사 수용체 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 및 TLR9의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된(즉, 적어도 막관통 영역(들)을 포함하는) 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 이 경우 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼량체(triplet)가 합성 막관통 도메인의 각 말단에 존재할 것이다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다. 특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 막관통 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본 명세서에 기재된 임의의 세포내 도메인, 또는 키메라 수용체에 포함될 수 있는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 본 발명의 대상 키메라 수용체는 또한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 키메라 수용체의 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 친수성 영역이다. 일부 실시형태에서, 이 도메인은 키메라 수용체에 대한 적절한 단백질 접힘을 촉진한다. 힌지 영역은 키메라 수용체에 선택적 구성요소이다. 힌지 영역은 항체의 Fc 단편, 항체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 힌지 서열 또는 이의 조합으로부터 선택된 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 영역의 예는 제한 없이, CD8a 힌지, 3개의 글리신(Gly) 크기일 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 인공 힌지뿐만 아니라, IgG(예를 들어, 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 대상 키메라 수용체는 항원 결합 도메인을 막관통 도메인과 연결하는 힌지 영역을 포함하고, 이는 결과적으로 세포내 도메인에 연결된다. 힌지 영역은 바람직하게는 표적 세포 상의 표적 항원을 인식하고 결합하도록 항원 결합 도메인을 지원할 수 있다(예를 들어, 문헌[Hudecek et al., Cancer Immunol. Res. (2015) 3(2): 125-135] 참조). 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 가요성 도메인이고, 따라서 항원 결합 도메인이 종양 세포와 같은 세포 상의 표적 항원의 특이적 구조 및 밀도를 최적으로 인식하는 구조를 갖도록 한다(문헌[Hudecek et al., supra] 참조). 힌지 영역의 가변성으로 인해 힌지 영역이 다양한 입체형태를 채택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 수용체로부터 유래된 힌지 영역 폴리펩타이드(예를 들어, CD8-유래 힌지 영역)이다.
힌지 영역은 약 4개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 예를 들어, 약 4 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa 내지 약 50 aa의 길이를 가질 수 있다.
적합한 힌지 영역은 용이하게 선택될 수 있고 다수의 적합한 길이, 예를 들어 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산을 포함하여, 1개 아미노산 (예를 들어, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산 중 임의의 것일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 힌지 영역은 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 27) 및 (GGGS)n(서열번호 38) 포함, n은 적어도 하나의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 기타 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체를 사용할 수 있고; Gly와 Ser은 모두 상대적으로 구조화되지 않았으므로 구성 요소 사이의 중립적인 연결 고리 역할을 할 수 있다. 글리신 중합체를 사용할 수 있고; 글리신은 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한적이다(예를 들어, 문헌[Scheraga, Rev. Computational. Chem. (1992) 2: 73-142] 참조). 예시적인 힌지 영역은 다음에 제한되는 것은 아니나, GGSG (서열번호 30), GGSGG (서열번호 31), GSGSG (서열번호 32), GSGGG (서열번호 33), GGGSG (서열번호 34), GSSSG (서열번호 35) 등을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 문헌[Tan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87(1):162-166; and Huck et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14(4): 1779-1789]을 참조한다. 비제한적 예로서, 면역글로불린 힌지 영역은 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함할 수 있다: DKTHT (서열번호 39); CPPC (서열번호 40); CPEPKSCDTPPPCPR (서열번호 41) (예를 들어, 문헌[Glaser et al., J. Biol. Chem. (2005) 280:41494-41503] 참조); ELKTPLGDTTHT (서열번호 42); KSCDKTHTCP (서열번호 43); KCCVDCP (서열번호 44); KYGPPCP (서열번호 45); EPKSCDKTHTCPPCP (서열번호 46) (인간 IgG1 힌지); ERKCCVECPPCP (서열번호 47) (인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열번호 48) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ (서열번호 49) (인간 IgG4 힌지); 등.
힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 힌지 영역은 야생형(천연 발생) 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지의 His229는 Tyr로 치환되어 힌지 영역이 서열 EPKSCDKTYTCPPCP(서열번호 50)를 포함할 수 있고; 예를 들어, 문헌[Yan et al., J. Biol. Chem. (2012) 287: 5891-5897]을 참조한다. 일 실시형태에서, 힌지 영역은 인간 CD8, 또는 이의 변이체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 키메라 수용체는 CD8 힌지 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 힌지 도메인은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
세포내 도메인
본 발명의 특정 양상은 CD3 (예를 들어 인간 및/또는 비-인간 영장류 CD3)에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
명칭 서열번호 유형 서열
F12Q HCDR1 1 단백질 GFTFNSYA
F12Q HCDR2 2 단백질 IRSKYNNYAT
F12Q HCDR3 3 단백질 VRHGNFGNSYVSWWAY
F12Q LCDR1 4 단백질 TGAVTSGNY
F12Q LCDR2 단백질 GTK
F12Q LCDR3 5 단백질 VLWYSNRWV
F12Q VH 6 단백질 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS
F112Q VL 7 단백질 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
F12Q scFv 8 단백질 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
F12Q CAR 9 단백질 MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
OKT3 HCDR1 10 단백질 GYTFTRYT
OKT3 HCDR2 11 단백질 INPSRGYT
OKT3 HCDR3 12 단백질 ARYYDDHYCLDY
OKT3 LCDR1 13 단백질 SSVSY
OKT3 LCDR2 단백질 DTS
OKT3 LCDR3 14 단백질 QQWSSNPFT
OKT3 VH 15 단백질 QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
OKT3 VL 16 단백질 SIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
OKT3 scFv 17 단백질 QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAAA
OKT3 CAR 18 단백질 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK
F12Q CAR 세포내 도메인 19 단백질 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
OKT3 CAR 세포내 도메인 20 단백질 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK
CD8 힌지 도메인 21 단백질 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8 TM 도메인 22 단백질 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
F12Q 키메라 수용체 23 단백질 MALPVTALLLPLALLLHAARPGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
OKT3 키메라 수용체 24 단백질 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK
F12Q 키메라 수용체 25 DNA atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccgaagtacaacttgtagagtctggagggggactcgtccagcccggtggctccctgaaactttcatgcgcagcaagcgggttcacgtttaactcttatgcaatgaattgggtccgacaagctccaggcaaaggacttgaatgggtcgccaggattcggagcaaatacaacaactacgcgacatattatgctgatagtgtaaaaggacggttcacgatctcaagagacgattctaagaatacagcgtatcttcaaatgaacaacttgaaaacagaagacaccgccgtttattattgcgtcagacatggcaactttggaaacagttacgtttcttggtgggcctactggggtcaagggacgcttgtcaccgtcagctcaggaggcgggggatctggcggcggcggttcaggtggtggtggatctcagacagtggtcacacaagagccatcacttaccgtatcccctggggggactgtaacccttacctgcgggtcctctacgggggctgttactagcggcaactatccaaactgggtgcaacaaaagcctggtcaagctccccgcgggctgatcggcggtactaagttccttgcgccgggcactcctgcaagattttcaggttctcttcttgggggaaaagctgcattgactctcagtggtgtccagccggaggacgaagccgagtattactgtgtcctctggtattccaataggtgggtgttcgggggtggtactaaactcactgtgctttccggaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
OKT3 키메라 수용체 26 DNA Atggcactgcccgtgaccgccctcctcctgcccctcgcgctactcctgcacgccgccagaccccaggtgcagctgcagcagagtggcgctgagctggcccgccccggcgcctccgtgaagatgtcctgcaaggctagtgggtataccttcaccaggtatactatgcactgggtgaagcagcgtccggggcaggggctcgagtggatcggctacatcaatccctcccgcggctacaccaattacaaccagaagttcaaggataaggccacgctgaccacagacaagagtagctccacggcctacatgcagttatcaagtctgacctctgaggactccgctgtgtactattgtgcgaggtactacgacgaccactactgtctggactactggggccaaggcacaaccctgactgtaagttcctccggcggcggggggtccggcggcggcggctccggcggggggggtagtatcgtgctgacacagagtcccgcaatcatgtccgcaagccccggagagaaggtgaccatgacgtgtagtgcttccagctccgtgtcctatatgaactggtaccagcagaaatccgggacttcccccaagagatggatctacgacaccagtaagctggccagtggcgtgcctgcacacttccgcggcagtggctccggcactagttacagtctcaccatctccgggatggaagctgaggacgccgctacctactactgccagcagtggagctcgaacccattcaccttcggttcggggaccaagctcgagatcaacagggcggccgccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagtaataa
특정 실시형태에서, aAPC는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산에 의해 인코딩된다. 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체는 또한 F12Q 키메라 수용체로서 본 명세서에서 지칭된다.서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체는 OKT3 키메라 수용체로 본 명세서에 지칭된다.
키메라 수용체 또는 이의 구성 요소 부분(예를 들어, 항원 결합 도메인(HCDR, LCDR, VH, VL 또는 scFv), 막관통 도메인, 힌지 또는 세포내 도메인)의 허용 가능한 변이는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 CAR 또는 이의 구성요소 중 어느 하나는 서열번호 1 내지 26에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 키메라 수용체는 서열번호 27 내지 28 중 어느 하나에 제시된 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
특정 실시형태에서, 키메라 수용체 분자는 aAPC에서 구성적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, aAPC는 HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD1d, CD16, CD64, CD83, CD86, 4-1BBL, OX40L, ICOSL, CD40L, PD-L1, PD-L2, B7-H3, 및 B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 내인성으로 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
특정 실시형태에서, aAPC는 세포 표면 상에서 발현되는 Fc 수용체를 추가로 포함한다. 제한 없이, CD64, CD32, CD16a, CD16b, CD23, 및 CD89를 포함하는 다양한 Fc 수용체가 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, Fc 수용체는 CD64이다.
특정 실시형태에서, aAPC는 세포 표면에서 발현되는 공-자극 분자를 추가로 포함한다. 제한 없이, 4-1BB, OX40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하여 다양한 공-자극 분자가 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 공-자극 분자는 CD86이다.
특정 실시형태에서, aAPC는 세포 표면에 발현된 Fc 수용체, 및 세포 표면에 발현된 공-자극 분자를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 수용체는 CD64이고, 공-자극 분자는 CD86이다.
특정 실시형태에서 aAPC는 Fc 수용체를 포함하고, aAPC는 항체가 로딩되고, 항체의 Fc 단편은 Fc 수용체에 의해 결합된다. 특정 실시형태에서, 항체는 CD3, CD28, PD-1, B7-H3, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HLA-DR, MHCII, Toll 리간드 수용체 및 LFA-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 대해 특이성을 갖는다.
특정 실시형태에서, aAPC는 공-자극 리간드를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 공-자극 리간드는 4-1BBL이다. 본 명세서에 제공된 교시를 적용하여 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 공-자극 리간드가 본 발명에 포함된다. 이러한 리간드는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이전에 기재된 천연 리간드의 돌연변이, 변이체, 단편 및 상동체를 포함한다.
이들 및 기타 리간드는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Schwartz et al., 2001, Nature 410:604-608; Schwartz et al., 2002, Nature Immunol. 3:427-434; 및 Zhang et al., 2004, Immunity. 20:337-347]에 기재된 바와 같이 잘 특성화되어 있다. 리간드에 관한 당업계의 광범위한 지식을 사용하여, 본 명세서에 제공된 교시를 적용하여 당업자는 리간드의 돌연변이 또는 변이체가 본 발명에 포함되고 본 발명의 aAPC를 생성하기 위해 렌티바이러스를 사용하여 세포내로 형질도입될 수 있음을 이해할 것이며, 이러한 돌연변이 및 변이체는 본 명세서의 다른 부분에서 보다 완전하게 논의된다. 즉, 본 발명은 대상 리간드의 돌연변이 또는 변이체를 사용하는 것을 포함하고 이러한 돌연변이 및 변이체를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
특정 실시형태에서, aAPC는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-35, 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 발현하고, 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-7을 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-7 및 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, 사이토카인은 구성적으로 발현된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 일부 경우에 IL-15Rα 및 IL-15의 동시 발현은 IL15Rα/IL15의 안정한 발현에 중요하다. 예를 들어, 문헌[Hasan et al. Clin. Exp. Immunol. (2016) 186(2):249-265]을 참조한다. 따라서, 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-15 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-15 및 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-15 및 IL-15Rα의 복합체를 발현한다. 예를 들어 문헌[Guo et al. Cytokine Growth Factor Rev (2017) Dec; 38: 10-21 and Tamzalit et al. PNAS June 10, 2014 111 (23) 8565-8570]을 참조한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-15/IL-15Rα의 복합체를 분비한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 IL-21을 발현한다. 특정 실시형태에서, IL-21은 막 결합되도록 변형되었다.
특정 실시형태에서 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체 및 공-자극 리간드를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64 및 공-자극 리간드 4-1BBL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체, 공-자극 분자, 및 공-자극 리간드를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 분자 CD86, 및 공-자극 리간드 4-1BBL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체, 공-자극 리간드 및 항-CD3 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 및 OKT3 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 및 F12Q 키메라 수용체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체, 공-자극 분자, 공-자극 리간드 및 항-CD3 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 분자 CD86, 공-자극 리간드 4-1BBL, 및 OKT3 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 분자 CD86, 공-자극 리간드 4-1BBL, 및 F12Q 키메라 수용체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체, 공-자극 리간드, 항-CD3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7 및 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7 및 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및 IL-15Rα를 발현한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 aAPC은 Fc 수용체, 공-자극 리간드, 공-자극 분자, 항-CD3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7 및 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, OKT3 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및/또는 IL-15Rα를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7 및 IL-15를 발현한다. 특정 실시형태에서, aAPC는 Fc 수용체 CD64, 공-자극 리간드 4-1BBL, 공-자극 분자 CD86, F12Q 키메라 수용체를 포함하고, IL-7, IL-15, 및 IL-15Rα를 발현한다.
특정 실시형태에서, aAPC는 적어도 하나의 면역 자극 및/또는 공-자극 리간드를 발현하고/하거나 적어도 하나의 면역 자극 사이토카인을 분비하도록 형질도입된 K562 세포를 포함한다. 본 명세서에 개시된 데이터는 K562 세포에 형질도입된 약 6개의 다른 분자를 인코딩하는 약 6개의 핵산이 장기간 배양에서 안정적이고 높게 발현되었음을 보여주지만, 이는 이들 세포에 도입될 수 있는 분자의 수 또는 종류에 제한이 있음을 시사하는 것이 아니다. 대신에, 자극, 공-자극, 사이토카인, 항원, Fcγ 수용체 등에 상관없이 임의의 분자 또는 리간드를 이들 세포에 도입하여 본 발명의 aAPC를 생성할 수 있다.
당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여 본 명세서에 제공된 교시를 적용하여 거의 무한한 다양한 aAPC를 생성하기 위해 수많은 면역조절 분자가 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 즉, T-세포의 활성화 및 유도에 관여하는 사건 및 분자에 관한 당업계에 광범위한 지식이 있으며, T-세포-매개된 면역 반응 및 이를 매개하는 인자에 대해 논의하는 논문이 당업계에 잘 공지되어 있다. 보다 구체적으로, 일반적으로 T-세포의 T-세포 수용체/CD3 복합체를 통해 매개되는 1차 신호는 T-세포 활성화 과정을 개시한다. 또한, T-세포 표면에 존재하는 수많은 공-자극 분자는 휴지기 T-세포에서 세포 증식으로의 전환을 조절하는데 관여한다. 각각의 리간드와 특이적으로 결합하는 "공-자극제"라고도 하는 이러한 공-자극 분자에는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD28 (B7-1 [CD80], B7-2 [CD86]와 결합), PD-1 (리간드 PD-L1 및 PD-L2와 결합), B7-H3, 4-1BB (리간드 4-1BBL과 결합), OX40 (리간드 OX40L과 결합), ICOS (리간드 ICOS-L과 결합), 및 LFA (리간드 ICAM과 결합)가 포함된다. 따라서, 1차 자극 신호는 T-세포 자극을 매개하지만, 증식에 의해 입증되는 바와 같이 공-자극 신호는 T-세포 활성화에 필요하다.
따라서, 본 발명의 aAPC는 1차 신호가 형질도입되도록 TCR/CD3 복합체와 특이적으로 결합하는 키메라 수용체를 포함하는 세포를 포함한다. 추가로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여, aAPC는 T-세포 상에 존재하는 적어도 하나의 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 공-자극 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 공-자극 분자에는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD27, CD28, CD30, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 4-1BB, PD-1, OX40, ICOS, LFA-1, CD30L, NKG2C, B7-H3, MHC 클래스 I, BTLA, Toll 리간드 수용체 및 LIGHT가 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 aAPC는 적어도 하나의 자극 리간드(예를 들어, 키메라 수용체) 및 적어도 하나의 공-자극 리간드를 포함하여, aAPC가 aAPC 상의 자극 리간드와 특이적으로 결합하여, aAPC 상의 리간드와 T-세포 상의 상응하는 분자 사이의 상호작용이 특히 적절한 바에 따라 T-세포 증식 및 확장을 매개하는 동족 결합 파트너 자극 분자를 포함하는 T-세포를 자극 및 확장할 수 있도록 한다. 당업자는 대상 T-세포 상의 특정 자극 및 공-자극 분자가 공지되어 있는 경우, 본 발명의 aAPC를 용이하게 생성하여 해당 T-세포를 확장시킬 수 있음을 이해할 것이다. 역으로, 대상 T-세포 상의 자극 및 공-자극 분자가 알려져 있지 않은 경우, 본 발명의 aAPC 패널을 사용하여 어떤 분자 및 이의 조합이 T-세포를 확장할 수 있는지 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 T-세포의 확장을 위한 도구 뿐만 아니라 T-세포 활성화 및 증식을 매개하는 특정 T-세포 상의 분자를 도출하기 위한 도구를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 항원 결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. aAPC는 또한 CD64, CD86, 4-1BBL, IL-7, 및 IL-15를 포함하고, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 포함한다. 항원 결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. aAPC는 또한 CD64, CD86, 4-1BBL, IL-7, 및 IL-15를 포함하고, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
당업자는 본 발명의 핵산이 세포가 부재하거나 세포와 관련된 경우, 뉴클레오타이드 서열을 더욱 안정하게 하는 DNA 또는 RNA의 화학적 변형을 포함하여, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열, 및 이의 임의의 변형된 형태를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 뉴클레오타이드의 화학적 변형은 또한 뉴클레오타이드 서열이 세포에 의해 흡수되는 효율성 또는 세포에서 발현되는 효율성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 변형의 임의의 모든 조합이 본 발명에서 고려된다.
또한, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russell (2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), and Ausubel et al. (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)]에 기재된 것과 같이, 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 방법을 사용하여 본 발명의 단백질의 돌연변이, 유도체 또는 변이체 형태의 생성을 위해 임의의 수의 절차가 사용될 수 있다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 변이시킴으로써 단백질 또는 폴리펩타이드에 아미노산 변화를 도입하는 절차는 당업계에 잘 알려져 있고 또한 이들 및 기타 논문에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 돌연변이, 유도체 및 변이체가, 하나 이상의 아미노산에서 변이되어(또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭하는 경우, 하나 이상의 염기쌍에서 변이됨), 생성된 펩타이드(또는 DNA)가 본 명세서에 열거된 서열과 동일하지 않지만, 펩타이드가 본 발명의 공-자극 리간드, 사이토카인, 항원 등의 생물학적/생화학적 특성(예를 들어, 단백질을 발현하는 aAPC를 T-세포와 접촉시키는 것이 T-세포의 증식을 매개하거나 T-세포에 영향을 미치는 경우 aAPC에 의한 발현)을 갖는다는 점에서 본 명세서에 개시된 펩타이드와 동일한 생물학적 특성을 갖는 공-자극 리간드, 사이토카인, 항원(예를 들어, 종양 세포, 바이러스 및 기타 항원)인 본 발명의 펩타이드(또는 이를 인코딩하는 DNA)의 "돌연변이", "유도체" 및 "변이체"를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가로, 본 발명은 공-자극 리간드가 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 동족 결합 파트너인 aAPC뿐만 아니라, 리간드가 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체인 aAPC, 및 이의 임의의 조합을 포함하여; 단일 aAPC는 공-자극 리간드 및/또는 T-세포에 존재하는 공-자극 분자에 특이적인 항체를 인코딩하는 핵산, 및 이의 임의의 조합을 모두 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명은 적어도 하나의 사이토카인, 적어도 하나의 케모카인, 또는 둘 모두를 인코딩하는 핵산으로 형질도입된 aAPC를 포함한다. 이는 본 명세서의 다른 부분에서 개시된 데이터가 인터루킨(예를 들어, IL-7, IL-15 등)을 인코딩하는 핵산으로 형질도입된 aAPC가 인터루킨을 안정하게 발현한다는 것을 충분히 입증하기 때문이다. 또한, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 LV 벡터를 사용하여 인터루킨이 aAPC(예를 들어, 다음에 제한되는 것은 아니나, pCLPS CD32-IRES-IL-7, -12, -15, -18, 및 -21과 같은 LV 벡터로 형질도입된 K562)로부터 분비될 수 있다. aAPC에 의해 발현될 수 있는 다른 사이토카인은 다음에 제한되는 것은 아니나, 인터페론-γ(IFNγ), 종양 괴사 인자-α(TNFα), SLC, IL-2, IL-4, IL-23, IL-27 등을 포함한다. 본 발명은 다음에 제한되는 것은 아니나, 케모카인, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, SDF-1, 에오탁신(eotaxin) 등을 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 사이토카인의 전장, 단편, 상동체, 변이체 또는 돌연변이를 포함하는 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 다른 세포의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있는 단백질을 포함한다. 사이토카인에 의해 영향을 받는 생물학적 기능은 다음에 제한되는 것은 아니나, 세포 성장, 세포 분화 또는 세포 사멸을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 사이토카인은 세포 표면의 특정 수용체에 결합할 수 있어 세포의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있다.
바람직한 사이토카인은 특히, 조혈 성장 인자, 인터루킨, 인터페론, 면역글로불린 슈퍼패밀리 분자, 종양 괴사 인자 패밀리 분자 및/또는 케모카인을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 사이토카인은 특히, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 종양 괴사 인자 베타(TNFβ), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15 (IL-15), 인터루킨-21 (IL-21), 인터페론 알파 (IFNα), 인터페론 베타 (IFNβ), 인터페론 감마(IFNγ), 및 IGIF를 포함한다.
이의 상동체, 변이체, 돌연변이 또는 단편을 포함하는 케모카인은 다음에 제한되는 것은 아니나, C5a, 인터루킨-8(IL-8), 단핵구 주화성 단백질 1알파(MIP1α), 단핵구 주화성 단백질 1베타(MIP1β), 단핵구 주화성 단백질 1(MCP-1), 단핵구 주화성 단백질 3(MCP-3), 혈소판 활성화 인자(PAFR), N-포르밀-메티오닐-류실-[ 3H]페닐알라닌(FMLPR), 류코트리엔 B4(LTB4R), 가스트린 방출 펩타이드(GRP), RANTES, 에오탁신, 림포탁틴, IP10, I-309, ENA78, GCP-2, NAP-2 및/또는 MGSA/gro를 포함하는 알파-케모카인 또는 베타-케모카인을 포함한다. 당업자는 본 명세서에 제공된 교시를 적용하여, 본 발명이 당업계에 잘 알려진 것과 같은 케모카인 및 사이토카인뿐만 아니라, 미래에 발견되는 임의의 것을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
당업자는 본 명세서에 제공된 교시를 적용하여, 본 발명의 aAPC가 임의의 특정 항원, 사이토카인, 공-자극 리간드, 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다는 것을 인식할 것이다. 오히려, 본 발명은 단일 프로모터/조절 서열의 제어 하에 또는 하나 초과의 이러한 서열의 제어 하에 모두 발현되는 수많은 분자를 포함하는 aAPC를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 다양한 aAPC가 상이한 분자를 인코딩하는 본 발명의 하나 이상의 aAPC의 투여를 포함한다. 즉, 다양한 분자(예를 들어, 공-자극 리간드, 항원, 사이토카인 등)는 시스에서(즉, 동일한 aAPC에서 및/또는 동일한 인접 핵산에 의해 인코딩되거나 동일한 aAPC 내에서 별도의 핵산 분자 상에서) 또는 트랜스에서(즉, 다양한 분자가 다른 aAPC에 의해 발현됨) 작용할 수 있다.
이러한 방식으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여, aAPC의 투여량 및 투여 시간은 각각의 적용에 대해 구체적으로 조정될 수 있다. 보다 구체적으로, aAPC 또는 다수의 aAPC에 의해 발현되는 특정 분자를 사용하여 T-세포에 자극을 제공한 후, 중복되더라도 다른 분자 세트를 발현하는 다른 aAPC 또는 다수의 aAPC를 사용하여 자극을 제공하는 것이 바람직한 경우, 시스 및 트랜스 접근 방식의 조합을 사용할 수 있다. 필수적으로, 본 발명의 aAPC, 및 본 명세서에 개시된 방법은 거의 무한한 수의 변형을 제공하며 본 발명은 임의의 특정한 조합 또는 접근 방식으로 제한되지 않는다. 본 명세서에 제공된 교시 및 당업계에서 이용 가능한 지식을 적용하여, 당업자는 각각의 특정 T-세포에 대한 적절한 접근 방식을 쉽게 결정할 수 있다.
당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여 본 발명의 aAPC에서 발현될 분자의 다양한 조합이 유리할 수 있음을 이해할 것이다. 다음에 제한되는 것은 아니나, 도 12에 예시된 조합을 포함하는 분자의 이러한 조합 중 다수가 본 명세서 전체에 걸쳐 제시되지만, 본 발명은 분자의 임의의 특정 조합을 포함하여, 이들 또는 임의의 다른 aAPC에 결코 제한되지 않는다. 오히려, 당업자는 본 명세서에 제공된 교시에 기반하여 분자의 매우 다양한 조합이 세포내로 형질도입되어 본 발명의 aAPC를 생성할 수 있음을 이해할 것이다. 분자는 본 명세서에 논의된 것과 같은 당업계에 공지된 것뿐만 아니라, 장래에 발견될 분자를 포함한다.
방법
본 발명은 T-세포(예를 들어, 조절 T-세포(Treg))를 자극하고 확장하는 방법을 제공한다. 본 방법은 T-세포를 본 명세서에 개시된 임의의 인공 제시 세포(aAPC)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 명세서의 다른 부분에서 입증된 바와 같이, CD3에 특이적인 키메라 수용체, 및 선택적으로, T-세포 표면 상에 발현된 동족 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 공-자극 리간드를 포함하는 aAPC와 T-세포의 접촉은 T-세포를 자극하고 T-세포 증식을 유도하여, 많은 수의 특정 T-세포가 쉽게 생성될 수 있도록 한다. aAPC는 특정 공-자극 분자를 발현하는 T-세포만이 aAPC에 의해 확장된다는 점에서 T-세포를 "특이적으로" 확장한다. 따라서, 확장될 T-세포가 세포의 혼합물에 존재하고, 그 중 일부 또는 대부분이 공-자극 분자를 발현하지 않는 경우, 대상 T-세포만이 세포 수에서 증식 및 확장하도록 유도될 것이다. T-세포는 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 명세서의 다른 부분에서 기재된 것과 같은 매우 다양한 세포 분리 및 정제 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여, 대상 T-세포는 aAPC를 사용한 확장 전에 확인되거나 단리되어야 하는 것은 아니다. 이는 aAPC가 선택적이고 동족 공-자극 분자를 발현하는 T-세포(들)만을 확장하기 때문이다.
바람직하게는, 특정 T-세포의 확장은 다음에 제한되는 것은 아니나, 항원, 사이토카인, 공-자극 리간드, 및 T-세포에 존재하는 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 리간드를 포함하는 다양한 분자를 발현하는 다수의 aAPC 또는 단일 aAPC를 사용하여 달성된다. 본 명세서의 다른 부분에 개시된 바와 같이, aAPC는 CD32 및/또는 CD64를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있어 aAPC 표면 상에 발현된 CD32 및/또는 CD64가 Fcγ 수용체인 CD32 및/또는 CD64에 결합하는 한, 적절한 임의의 항체가 "로딩"될 수 있다. 이에 의해 "기성(off the shelf)" aAPC를 임의의 적절한 T-세포를 자극하도록 쉽게 조정할 수 있다.
본 발명은 공지된 공-자극 분자를 발현하는 T-세포의 증식을 특이적으로 유도하는 방법을 포함한다. 본 방법은 공지된 공-자극 분자를 발현하는 적어도 하나의 T-세포를 포함하는 T-세포의 집단을 공-자극 분자의 리간드를 인코딩하는 렌티바이러스를 포함하는 aAPC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서의 다른 부분에 개시된 바와 같이, aAPC가 T-세포 상의 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 공-자극 리간드를 발현하는 경우, 공-자극 분자와 이의 동족 공-자극 리간드의 결합은 T-세포의 증식을 유도한다. 따라서, 대상 T-세포는 먼저 세포 집단으로부터 세포를 정제할 필요 없이 증식하도록 유도된다. 또한, 본 방법은 세포를 aAPC와 접촉시키는 것이 증식 및 성장 세포의 검출을 유도하여 대상 공-자극 분자를 발현하는 T-세포가 샘플에 존재하는지를 확인할 수 있으므로, 집단 내의 임의의 세포가 특정 대상 공-자극 분자를 발현하는지를 결정하기 위한 신속한 분석을 제공한다. 이러한 방식으로, 세포 표면 상의 적어도 하나의 공-자극 분자가 공지된 임의의 대상 T-세포는 확장되고 단리될 수 있다.
본 발명은 T-세포 집단 하위집합을 특이적으로 확장하는 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 방법은 대상 하위집합의 적어도 하나의 T-세포를 포함하는 T-세포의 집단을 해당 T-세포를 확장할 수 있는 aAPC, 또는 T-세포 표면의 동족 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 공-자극 리간드를 발현하는 적어도 하나의 aAPC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서의 다른 부분에서 이전에 입증된 바와 같이, 공-자극 분자와 이의 결합 파트너 공-자극 리간드의 결합은 T-세포의 증식을 유도하여 T-세포 집단 하위집합을 특이적으로 확장시킨다. 당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여 T-세포 하위집합이 T 보조(TH1 및 TH2) CD4 발현, 세포독성 T 림프구(CTL)(Tc1 또는 Tc2) T 조절(TREG), TC/S, 나이브, 기억, 중추 기억, 효과기 기억 및 γδT-세포를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특정 T-세포 하위집합에 대해 농축된 세포 집단은 본 발명의 방법을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 확장되는 T-세포는 자기유래 T-세포이다. 특정 실시형태에서, T-세포는 인간 T-세포이다. 조절 T-세포 (Treg). 특정 실시형태에서, T-세포는 비-인간 영장류 T-세포이다. 특정 실시형태에서, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스이다. 비-인간 영장류는 마카카 물라타이다.
일 양상에서, 본 발명은 인간 및/또는 비-인간 영장류 조절 T-세포 (Treg)를 자극하고 확장하는 방법을 제공한다. 본 방법은 aAPC는 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 Treg를 접촉시키는 단계를 포함한다. 항원 결합 도메인은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. aAPC는 또한 CD64, CD86, 4-1BBL, IL-7, 및 IL-15를 포함하고, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 및/또는 비-인간 T-세포를 자극 및 확장하는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 인공 항원-제시 세포(aAPC) 중 임의의 것으로부터 생성된 막 소포를 포함하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, aAPC 막 소포는 aAPC에 의해 발현되는 기능성 세포 표면 단백질을 보유하는 소포를 생성하고, 이에 의해 T-세포를 자극하고 T-세포 배양의 확장을 지원하는 소포 능력을 보유하는 방식으로 본 발명의 aAPC를 파괴함으로써 생성된다. 이러한 aAPC-유래 소포 조성물은 전체적으로 온전한 aAPC 세포와의 공동 배양에 비해 다수의 이점을 제공하며, 여기에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 배양된 T 세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 세포독성 화학물질, 방사선 조사 등과 같은 처리를 통한 aAPC의 불활성화 필요성의 제거; aAPC 막 소포의 대사적 불활성 또는 생성된 확장된 T 세포 집단으로부터 제거의 필요성으로 인한 대규모 배양물의 생성의 최적화; 및 바이러스 입자와 aAPC 막 소포 사이의 현저하게 감소된 상호작용으로 인한 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터에 의한 확장 T 세포의 보다 효율적인 형질도입 가능성이 포함된다.
일부 실시형태에서, aAPC 막 소포는 aAPC 세포의 파괴에 의해 생성된다. 세포 파괴의 많은 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, 소형 장치 또는 전동 장치와 같은 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 동결 및 해동의 반복 주기를 포함하는 온도 처리, 저장성 용액 중 삼투 용해, 다양한 세제 또는 용매의 사용을 포함한 화학적 용해, 질소 공동화 등을 포함하여 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자는 어떤 파괴 방법이 aAPC 소포를 포함하는 막 소포 생성의 특정 적용에 가장 적용 가능한지 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, APC의 파괴 방법은 질소 공동화이다. 이 방법은 종종 "폭탄"이라고 하는 압력 용기에 aAPC의 배양물을 넣고 질소가 풍부한 대기에서 고압으로 세포를 평형화하여 세포의 세포질에 용해된 질소 및 다른 기체를 증가시키는 단계를 포함한다. 대기압에 세포가 갑자기 노출되면 세포의 세포질에 질소 기포가 형성되어 세포 용해가 발생한다. 압력 및 방출 시간은 다양한 정도의 세포 용해 및 세포, 막, 단백질 및 세포 소기관 구조의 보존을 초래하도록 다양할 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 압력은 원형질막과 소포체만 파괴하고, 높은 압력은 핵과 리소좀 및 미토콘드리아를 포함한 기타 세포 소기관의 파괴를 초래한다. 일부 실시형태에서, 종종 "폭탄"이라고 하는 압력 용기는 고압을 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스 스틸 또는 유사한 금속 수용기로 구성되며, 여기에는 탱크에서 질소 기체를 전달하기 위한 입구 및 조정 가능한 배출 밸브가 장착된 출구가 장착되어 있다. 당업자는 본 발명의 aAPC 막 소포를 생성하기에 충분한 질소 공동화의 정확한 조건 및 본 발명의 방법에서의 이의 용도를 인식할 것이다.
약제학적 조성물
본 발명은 활성 구성요소로서 본 발명의 aAPC를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 및 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 조성물은 본 발명의 aAPC로부터 유래된 막 소포의 혼합물을 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 대상체에 투여하거나 대상체로부터 T-세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기에 적합한 형태로 활성 구성요소 단독(예를 들어, 본 발명의 세포 및 이의 제제)으로, 적어도 하나의 활성 구성요소(예를 들어, APC의 유효 투여량)의 조합으로 구성될 수 있거나, 약제학적 조성물은 활성 구성요소 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 하나 이상의 추가(활성 및/또는 불활성) 구성요소, 또는 이의 일부 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 구성요소가 조합될 수 있고 조합 후에 활성 구성요소를 대상체에게 투여하거나 대상체로부터 T-세포를 활성화 및 확장시키기 위해 사용될 수 있는 화학적 조성물을 의미한다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법에는 활성 구성요소를 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 구성요소과 결합시킨 다음, 필요하거나 적절한 경우 제품을 적절한 단일 또는 다중 투여량 단위로 성형하거나 포장하는 단계가 포함된다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물에 대한 설명이 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에 투여하기에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물이 되도록 하기 위해 인간에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 보통의 숙련된 수의 약리학자는 이러한 변형을 필요한 경우, 단지 통상적인 실험으로 설계하고 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 다음에 제한되는 것은 아니나, 인간 및 기타 영장류, 상업적으로 관련된 포유류, 예컨대 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스, 마카 물라타), 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개를 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위, 및 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류, 농장에서 사육되는 어류 및 수족관 어류를 포함하는 어류, 농장에서 사육하는 조개와 같은 갑각류를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 병변내, 협측, 안내, 정맥, 기관내 또는 다른 투여 또는 사용 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 투사된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 구성요소를 포함하는 재밀봉된 적혈구, 및 면역학적-기반 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량으로서, 또는 복수의 단일 단위 투여량으로서 대량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단위 투여량"은 소정의 양의 활성 구성요소를 포함하는 약제학적 조성물의 별도의 양이다. 활성 구성요소의 양은 일반적으로 대상체에게 투여되거나 대상체로부터 T-세포의 활성화 및 확장에 사용하기 위해 활성 구성요소의 투여량 또는 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 투여량의 편리한 분획과 동일하다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 구성요소, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의의 추가 구성요소의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및 상태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 본 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w) 활성 구성요소를 포함할 수 있다.
활성 구성요소에 더하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제어 또는 지속 방출 제형은 통상적인 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 약제학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 파괴 및 조직의 파괴를 통한 약제학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서 비경구 투여는 다음에 제한되는 것은 아니나, 조성물의 주사에 의한 약제학적 조성물의 투여, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 침투 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 다음에 제한되는 것은 아니나, 피하, 복강내, 근육내, 흉골내 주사 및 신장 투석 주입 기술을 포함하는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수(sterile water) 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 활성 구성요소를 포함한다. 이러한 제형은 일시 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 보존제가 포함된 앰플 또는 다중 투여량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 다음에 제한되는 것은 아니나, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클(vehicle) 중의 에멀젼, 페이스트(paste), 및 이식가능한 지속 방출 또는 생분해성 제형을 포함한다. 이러한 제형은 다음에 제한되는 것은 아니나, 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하는 하나 이상의 추가 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 구성요소에 추가하여 본 명세서에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사 제형은 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올과 같은 무독성 비경구 허용 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용 가능한 희석제 및 용매에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 링거 용액(Ringer's solution), 등장성(isotonic) 염화나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 디-글리세리드와 같은 고정 오일이 포함된다. 유용한 기타 비경구 투여 가능한 제형은 활성 구성요소를 미세결정질 형태, 리포솜 제제, 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성요소로 포함하는 것을 포함한다. 지연 방출 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포 및/또는 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포를 사용하여 확장된 T-세포는 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 본 발명의 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포를 사용하여 확장된 T-세포가 투여되는 경우, 투여되는 세포의 양은 약 100만개의 세포 내지 약 3000억 개의 범위일 수 있다. aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포 자체가 이에 의해 확장된 T-세포의 존재 또는 부재 하에 투여되는 경우, 이들은 약 100,000 내지 약 100억 개의 세포 또는 소포 범위의 양으로 투여될 수 있으며, 세포 및 소포는 동물, 바람직하게는 필요한 인간 환자 내로 주입된다. 투여되는 정확한 투여량은 다음에 제한되는 것은 아니나, 동물의 유형 및 치료되는 질병 상태의 유형, 동물의 연령 및 투여 경로를 포함하는 임의의 수의 인자에 따라 달라질 것이다.
aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포는 동물에게 하루에 다회의 빈도로 투여될 수 있거나, 1일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 1달 1회 또는 그 이하의 빈도, 예컨대 수개월에 1회 또는 1년에 1회 또는 그 이하의 빈도로 투여될 수 있다. 투여량의 빈도는 당업자에게 쉽게 명백할 것이며 다음에 제한되는 것은 아니나, 치료되는 질병의 유형 및 중증도, 동물의 유형 및 연령 등과 같은 임의의 수의 인자에 따라 달라질 것이다.
aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포(또는 이에 의해 확장된 세포)는 다양한 다른 화합물(특히, 사이토카인, 화학요법 및/또는 항바이러스 약물)과 공동 투여될 수 있다. 대안적으로, 화합물(들)은 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포(또는 이에 의해 확장된 세포), 또는 이의 임의의 순서보다 1시간, 1일, 1주, 1개월 또는 훨씬 더 앞서 투여될 수 있다. 추가로, 화합물(들)은 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포(또는 이에 의해 확장된 세포)의 투여, 또는 이의 임의의 순서 후에 1시간, 1일, 1주 이상 후에 투여될 수 있다. 빈도 및 투여 요법은 당업자에게 쉽게 명백할 것이며 다음에 제한되는 것은 아니나, 치료되는 질병의 유형 및 중증도, 동물의 연령 및 건강 상태, 투여되는 화합물 또는 화합물들의 정체, 다양한 화합물 및 aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포(또는 이에 의해 확장된 세포)의 투여 경로 등과 같은 임의의 수의 인자에 따라 달라질 것이다.
추가로, 당업자는 본 명세서에 제공된 개시내용에 기반하여, aAPC 또는 aAPC-유래 막 소포가 포유류에게 투여되어야 하는 경우, 세포가 "성장이 없는 상태"에 존재하도록; 즉, 세포가 포유류에게 투여될 때 분열할 수 없도록 처리됨을 이해할 것이다. 본 명세서의 다른 부분에 개시된 바와 같이, 세포는 포유류에 투여되면 세포가 성장 또는 분열할 수 없도록 조사될 수 있다. 합텐화(haptenization)를 포함하는 다른 방법(예를 들어, 디니트로페닐 및 기타 화합물 사용)은 세포를 특히 인간에게 투여하여 성장이 불가능하게 하는 것으로 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 방법은 본 명세서에서 더 이상 논의되지 않는다. 더욱이, 생체내에서 분열할 수 없게 된 aAPC의 투여 안전성은 본 명세서에서 논의된 분자 중 일부를 인코딩하는 플라스미드 벡터로 형질감염된 aAPC를 사용한 I상 임상 시험에서 확립되었다.
실험예
이제 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않고, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변형을 포함한다.
재료 및 방법
플라스미드: pTRPE-CD86은 Genscript에 의해 합성되었으며,pTRPE-IL-15/IL-15 수용체 알파 (IL-15/15Ra), pTRPE-IL-7 mcherry, pTRPE-F12Q (F12Q) 및 pTRPE-OKT3.8 (OKT3)은 CCI에서 클로닝되었다.
aAPC 세포주의 생성: Fc 수용체 CD64 및 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 발현하는 K562 세포를 형질도입하여 CD86 작제물을 발현시켜, K562.64.4-1BBL.86 세포주(APC3.0)를 생성시켰다. 또한, K562.64.4-1BBL.86(APC3.0) 및 K562.64.4-1BBL(APC2.0) 세포주를 형질도입하여 항-CD3 OKT3 작제물을 발현시켜 각각 K562.64.41BBL.OKT3 (APC2.1) 및 K562-64.86.4-1BBL.OKT3 (APC3.1) 세포주를 생성시켰다. 그런 다음 APC2.1 및 APC3.1을 형질도입하여 IL-7 mcherry 및 IL-15/15R 작제물을 모두 발현시켜, K562.64.4-1BBL.OKT3.IL-7mcherry.IL-15/15R (APC4.1) 세포주 및 K562-65.4-1BBL.86.OKT3.IL-7mcherry.IL-15/15R (APC5.1) 세포주를 생성했다. CD64, 4-1BBL, CD86, OKT3, IL-7, IL-15/15R 표면 단백질의 발현을 유세포 분석에 의해 확인하였다. 새로 생성된 APC4.1 및 APC5.1의 다양한 클론을 단일 세포 분류 후 시험관내 확장에 의해 확립하였다. 특히, CD64, 4-1BBL, OKT3, IL-7, IL-15R의 발현을 유지하는 APC4.1의 다수의 클론을 추가 배양을 위해 선택하였다(도 14a 및 도 14b). 유사하게, APC5.1의 다수의 클론을 추가의 CD86 발현에 기반하여 추가 확장 및 사용을 위해 유사하게 선택하였다(도 15a 및 도 15b). 증식을 기반으로 APC4.1 및 APC5.1의 두 클론을 추가 시험을 위해 선택했다(도 16). 그 다음, APC4.1 클론 6(4B3) 및 20(4G4)의 선택된 클론을 전이유전자 발현을 유지하기 위해 다른 계대에서 확인하였다(도 17 내지 도 18). APC5.1 클론 33(6F2)은 시간이 지남에 따라 안정적인 전이유전자 발현을 나타냈다(도 19). 선택된 클론을 IL-7, IL-15 및 IL-15Ra 검출을 위해 밤새 5x105 세포/mL의 세포 밀도로 플레이팅했다. ELISA 분석은 APC4.1 클론 20이 4 ng/mL IL-7 및 7.5 ng/mL IL-15를 분비할 수 있고 APC5.1 클론 33이 3 ng/mL IL-7 및 8 ng/mL IL-15를 분비할 수 있음을 보여주었다. K562.64.86 세포를 항-CD3 F12Q 작제물로 형질도입하여 K562.F12Q.64를 생성하였다.
유세포 분석용 항체: CD64-PE-cy7 (Biolegend, Cat # 305022), 41BBL-APC (Cat # 311506), CD86-BV650 (Biolegend, Cat # 305428) 및 IL-15Ra-FITC (eBioscience, Cat #11-7159-42)를 유세포 분석을 위해 구입했다. 비오틴-염소-항-마우스 IgG Fab(Jackson Immuno Research, Cat # 115-065-072) 및 스트렙타비딘-PE(BD, Cat # 554061)를 항-CD3 OKT3의 검출에 사용했다. 비오틴화된 인간 CD3 엡실론 단백질(AcroBiosystems Cat #CDE-H82E1) 및 스트렙타비딘-PE를 항 CD3 F12Q의 검출에 사용했다.
aAPC의 조사: AAPC를 RPMI 1640 + 5% 인간 혈청에서 확장시키고 세포를 2.5x107 세포/mL로 재현탁하고 조사기 XRAD 320iX를 사용하여 100Gy에서 조사하였다.
시험관내 T-세포 확장: 다발성 골수종 환자(n=3)의 동결보존된 세척 림프구 또는 백혈구 성분채집을 해동하고 CD4 및 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Cat # 130-045-101 및 130-045-201)를 사용하여 CD4 및 CD8 T-세포를 선택하였다. T-세포를 7일 동안 다른 배양 배지로 1:1의 T 대 조사된 aAPC 비율의 상이한 aAPC 또는 1:3의 T 대 비드 비율의 CTS CD3/CD28 다이나비드(Thermo Fisher, Cat # 40203D) 또는 가용성 항-CD3/CD28 Cloudz(Quad Technologies, 제조업체의 프로토콜에 따름)로 자극하였다. 2x106개 T-세포를 APC4.1 및 APC5.1을 사용한 T-세포 자극을 제외하고, 사이토카인 5 ng/mL IL-7(Miltenyi Biotec, Cat # 170-076-111) 및 IL-15(Miltenyi Biotec, Cat # 170-076-114)를 포함하는 상이한 배양 배지 중 G-REX 24-웰 플레이트 (Wilson Wolf, Cat # 80192M)에 플레이팅하였다. T-세포 확장을 비교하기 위해 다수의 배양 배지 제형을 사용하였다. OpTmizer(Thermo Fisher, Cat # A1048501) 또는 5% CTS 면역 세포 SR의 존재 및 부재 하의 1B2H(Thermo Fisher, Cat # A2596101)를 앞서 기재한(인용) X-VIVO15(Lonza, Cat # 04-744Q)-기반 변형 배지와 비교했다. 세포 수 및 부피를 Coulter Counter Multisizer 4에 의해 측정하였다. 배지에서 ELISA에 의한 IL-7 및 IL-15의 검출을 위해 상청액을 수집했다.
실시예 1: OKT3-기반 CAR을 발현하는 aAPC 세포의 생성
세포를 외인성 항체로 코팅하는 장기간의 제조 단계 없이 시험관내에서 인간 T-세포를 확장할 수 있는 인공 APC를 개발하기 위해, 항-인간 CD3 항체 OKT3의 막-결합 scFv 형태를 발현하는 K562-기반 APC를 생성하기 위한 일련의 연구를 수행하였다. 개발 단계의 흐름도는 도 1a에 나와 있다. K562 모 세포뿐만 아니라, 공-자극 단백질 CD86 및 Fc 수용체 CD64를 발현하는 K562 세포를 형질도입하여 OKT-CAR 작제물을 발현시켜, 각각 K562.OKT3 및 K562.64.86.OKT3 세포주를 생성하였다. OKT3 CAR, CD64 및 CD86 표면 단백질의 발현을 유세포 분석에 의해 확인하였다(도 1b 및 도 1c). 결과는 형질도입되지 않은 대조군(UTD)과 비교한 것이다.
새로 생성된 K562.OKT3 세포주의 다양한 클론을 단일 세포 분류 후 시험관내 확장에 의해 확립하였다. 그런 다음 OKT3 CAR의 가장 높은 발현을 갖는 두 개의 클론을 추가 배양을 위해 선택했다(도 2). 마찬가지로, K562.64.86.OKT3 세포주의 두 클론을 CD3 CAR 발현 수준에 따라 추가 확장 및 사용을 위해 유사하게 선택했다(도 3).
선택된 aAPC 계통을 시험관내에서 인간 T-세포의 확장을 자극하는데 사용하였다. 정상 공여체 T-세포를 다양한 K562 세포주와 함께 9 내지 12일 동안 공동 인큐베이션한 동안 다양한 시점에서 T-세포의 수를 평가했다(도 4). 이 연구에서 항-CD3/CD28 코팅된 비드를 양성 대조군으로 사용했다. 자극되지 않은 T-세포만을 음성 대조군으로 사용하였다. 가장 큰 T-세포 확장을 초래한 aAPC 클론은 OKT3 CAR 및 CD86을 모두 발현하는 클론으로, 이에 의해 최적의 활성화에 필요한 신호 1 및 2를 T-세포에 제공하는 이들 세포의 능력을 확인했다. K562-기반 aAPC를 사용한 자극은 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 상업적으로 이용 가능한 마이크로비드 제제보다 더 효율적이었다.
실시예 2: 인간 및 영장류 T-세포 모두를 확장할 수 있는 aAPC의 개발
OKT3-기반 aAPC는 인간 T-세포를 확장할 수 있지만, 인간 및 비-인간 영장류 유래 모두의 T-세포를 확장할 수 있는 aAPC에 대한 필요성이 존재했다. 두 종 모두에 대해 가능한 가장 높은 친화도를 갖는 항체를 선택하기 위해 이미 작제된 다수의 이중특이적 T-세포 결합인자(BiTE) 분자를 스크리닝했다(PCT/EP2009/062795 참조). 이들 분자는 흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸(MCSP) 및 인간 및 사이노몰구스 원숭이 유래 둘 모두의 CD3에 대해 특이적이었다(도 5, PCT 출원 PCT/EP2009/062795에서 배경기술로 인용됨). F12Q 항-CD3 scFv에서 유래된 BiTE는 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대해 가장 높은 친화도를 나타내었고, 이를 후속적으로 항-CD3 scFv CAR로의 추가 개발을 위해 선택하였다.
이어서, F12Q-기반 CAR을 K562 모 세포 및 CD86 및 CD64를 발현하는 K562 세포로 형질도입한 다음, 가장 높은 CD3 CAR 발현 및 인간 및 영장류 T-세포를 확장하는 가장 큰 능력을 보유하는 세포에 대한 클론 선택을 수행하였다. 이들 연구의 흐름도는 도 6에 예시되어 있다. 세포 표면에서 F12Q scFv의 발현을 검출하기 위해, 결합에 대해 다수의 항-IgG 항체를 스크리닝하였다(도 7). 시험된 항체 중 어느 것도 검출 가능한 결합을 나타내지 않았기 때문에 후속 연구에서는 비오틴화된 CD3 단백질을 1차 염색으로 사용한 후 PE-접합 스트렙타비딘으로 대조염색했다.
F12Q CAR-발현 K562.64.86 세포를 사용하여 인간 공여체 및 2개의 비-인간 영장류: 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이로부터 T-세포를 확장하였다. 대조군으로 OKT3-CAR-기반 APC를 비교용으로 사용하였다. F12Q 항체의 종간 특이성과 일치하게, F12Q-CAR 기반 aAPC는 세 종 모두에서 T-세포의 확장을 효율적으로 촉진했다(도 8). 유사하게, OKT3-CAR 발현 aAPC로 자극 후에 인간 T-세포만이 확장되었다. 두 연구에서 확장을 세포 수의 증가 배수를 평가하여 결정하였다. 배양 9일 후 CD3 및 CD8에 대한 염색은 CD3-음성 T-세포의 손실, 따라서 CD3+ T-세포의 우선적인 확장 및 생존을 추가로 나타냈다(도 9).
유세포 분석을 사용한 확인을 위한 항-CD3 CAR 발현 aAPC의 특이적 염색을 가능하게 하기 위해, 가용성 CD3-엡실론 단백질 및 PE-접합된 스트렙타비딘 대조염색을 사용하였다. 0.6025 μg/ml 내지 5 μg/ml 범위의 다양한 농도의 CD3ε 단백질을 사용한 적정 연구는 최소한의 배경으로 명확한 염색을 나타내었다(도 10). 이 CD3 CAR 염색 전략을 사용하여, 추가 사용을 위한 최고 수준의 발현을 나타내는 2개의 F12Q-CAR 발현 aAPC 클론을 선택하였다(도 11).
실시예 3: 최적의 T-세포 자극을 전달하기 위한 aAPC의 향상
CD3-CAR 발현 aAPC 세포의 개발은 이전 세대의 APC가 필요한 단계인 T-세포와 공동 배양하기 전에 내인적으로 발현된 막-결합된 항-CD3 scFv 작제물이 Fc 수용체 상에 항-CD3 항체의 시험관내 로딩을 제거한다는 점에서 K562-기반 aAPC의 이전 반복에 비해 상당한 개선을 나타낸다. CAR-기반 면역요법이 보다 일반적인 임상 치료법으로 발전함에 따라 점점 더 중요해진 과정에서 시간과 노동을 절약하는 것 외에도 항-CD3 CAR은 항-CD3 항체를 공급하고 시험하는 일정한 비용을 없애준다.
T-세포 배양에서 IL-7 및 IL-15와 같은 외인성 사이토카인의 사용은 다회의 시험관내 자극 후에도 효과기 기능의 최적 확장 및 유지를 촉진한다. 항-CD3 CAR의 사용과 유사하게, IL-7 및 IL-15를 분비하기 위한 aAPC의 변형은 정제된 제제로 배양물을 보충할 필요 없이 이러한 인자의 이점을 제공한다. K562 OKT3-CAR 발현 aAPC를 추적 가능한 마커로서 적색 형광 단백질(RFP) mCherry를 또한 발현하는 작제물로 IL-7을 분비하도록 형질도입하였다. 그런 다음 링커를 통해 IL-15R 알파 사슬(sushi 도메인)에 연결된 IL-15의 이종복합체(heterocomplex)를 분비하도록 세포를 추가로 조작했다. 이 변형된 형태의 IL-15는 재조합 사이토카인 단독보다 친화도가 더 높은 IL-15 작용제인 것으로 나타났다. K562-기반 aAPC 개발의 진행 상황은 도 12에 나와 있다. 각 "형태"는 처리 및 T-세포 자극의 효율성을 개선하기 위해 추가 기능을 혼입한다.
형질도입된 "APC4.1" 세포(CD64+ 4-1BBL+ OKT3-CAR+ IL-7+ IL-15+ CD86neg)로부터 10개의 클론을 확립하고, 형질도입된 분자의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다(도 14a 및 도 14b). 형질도입된 "APC5.1" 세포(CD64+ 4-1BBL+ OKT3-CAR+ IL-7+ IL-15+ CD86+)의 유사한 염색은 또한 형질도입된 단백질의 높은 발현을 보유하는 다수의 클론을 확인하였다(도 15a 및 도 15b). 7개의 "APC4.1" 및 6개의 "APC5.1" 클론을 인간 T-세포를 확장하는 능력의 추가 스크리닝을 위해 선택하였다(도 16). 결과는 인간 T-세포를 확장하는 "APC4.1" 및 "APC5.1" 유형 aAPC 모두의 능력을 보여주었지만 "APC5.1" aAPC는 더 큰 정도의 확장을 초래했다. 각 "형태"의 2개의 클론을 전이유전자 발현 및 T-세포 확장을 자극하는 능력을 기반으로 추가 개발을 위해 선택하였다. 전이유전자 발현의 안정성을 평가하기 위해 이러한 클론을 최대 9회 계대 배양하고 CD64, 4-1BBL, CD86, IL-15R, 및 OKT3-CAR 발현에 대해 염색했다(IL-7 발현은 mCherry 발현에 의해 결정됨). "APC4.1"(도 17) 및 "APC5.1"(도 19) 모두 저-계대 세포(도 18, "APC4.1" 클론으로 표시됨)와 비교하여 높은 수준의 단백질 발현을 유지했다. 다양한 클론에 의한 사이토카인 분비를 또한 ELISA로 평가하였다(도 20). 유세포 분석 염색에 의한 자극 효능 및 전이유전자 발현에 기반하여 이전에 확인된 클론은 또한 ELISA에 의해 측정된 상당한 양의 사이토카인을 생성하는 능력을 나타냈다.
T-세포 확장 8일 후 배양 배지에서 사이토카인의 존재를 결정하였다. 이 연구에서 APC5.1 및 APC4.1 세포가 IL-7 및 IL-15를 지속적으로 생성하는 능력을 APC2.0, 3.0, 2.1, 및 3.1 aAPC 세포, 항-CD3 항체 (2D11)뿐만 아니라, 상업적으로 이용가능한 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드를 포함하여, 외인성 IL7 및 IL-15가 첨가된 다양한 배양 조건과 비교하여 평가했다. 또한 X-VIVO 및 OpTmizer의 두 종류의 무혈청 배양 배지를 평가했다. ELISA에 의한 IL-7(도 21A), IL-15(도 21B) 및 IL-15/15R(도 21C)의 측정은 APC4.1 및 APC5.1 세포에 의한 IL-15의 균등한 생성을 나타내었다. 마찬가지로 이 세포는 예상대로 IL-15R을 생성하는 유일한 세포였다. 그러나 IL-7 생성은 외인성 IL-7이 제공된 그룹보다 이들 세포에서 더 낮았다.
T-세포의 확장을 자극한 후 배양에서 APC의 지속적인 존재는 비-T-세포가 과밀화에 관여하고 T-세포를 지원하는데 필요한 영양분을 소비한다는 점에서 생성된 T-세포의 건강에 유해할 수 있다. 이와 같이 기존의 T-세포 배양 프로토콜에는 조사 또는 미토마이신 C 처리를 포함하여 성장을 억제하는 자극 세포의 처리가 포함되는 경우가 많다. 이 단계는 환자에게 주입하기 전에 비 T-세포를 제거하기 위해 배양에 수행해야 하는 필요한 정제의 양을 최소화하기 때문에 면역요법을 위한 T-세포 생성의 핵심이기도 하다. APC4.1 및 APC5.1 aAPC를 T-세포 확장 공동 배양에 사용하기 전에 조사하였다. 7일 후, 생존율 염료 7-AAD로 세포를 염색하고 mCherry 발현을 평가함으로써 남아 있는 aAPC 세포에 대해 배양물을 평가하였다(도 22). 결과는 실질적으로 지속되는 aAPC가 없음을 보여주었다(도 23). mCherry에 대해 양성인 세포는 7-AAD 양성으로 표시된 바와 같이 균일하게 생존할 수 없었다(도 24).
실시예 4: 치료 용도를 위한 T-세포의 고효율 확장
T-세포를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 세포-기반 면역요법은 GMP-적합성 방법을 사용하여 개별 환자로부터 많은 수의 T-세포의 생성이 필요하다. 현재 방법은 종종 WAVE 생물반응기 기술을 사용하지만 GREX 생물반응기는 더 낮은 비용으로 더 짧은 시간에 동일한 수의 세포를 확장할 수 있는 가능성을 제공한다(도 13). APC4.1 및 APC5.1 aAPC를 GREX 생물반응기와 조합하는 가능성을 평가하기 위해, 다수의 유형의 배지 제조에서 이러한 aAPC를 기존의 항-CD3/CD28 마이크로비드(BDS) 및 가용성 항-CD3/CD28 자극제 Cloudz(QUAD)와 비교하는 일련의 연구를 수행하였다(도 25). 3명의 인간 환자로부터 얻은 T-세포의 확장 배수를 7일 동안 평가했다. 조건에 따라, APC4.1 및 APC5.1 세포는 마이크로비드와 유사하거나 더 나은 확장을 유도했다. 마찬가지로, 각 자극 조건에서 각 환자에 대한 0일 내지 7일의 세포 크기 비교는 일관된 결과를 발견했다(도 26 및 도 29). 그런 다음 이러한 방법을 사용하여 확장된 T-세포를 재자극하고, TNFα 및 IFNγ의 생성을 평가했다(도 30). APC4.1 및 APC5.1 세포를 사용한 확장은 가장 큰 사이토카인 생성을 유도하는 APC5.1에 의한 항-CD3/항-CD28 다이나비드와 유사하거나 더 나은 수준의 사이토카인 생성을 초래했다. 이러한 결과는 APC4.1 및 APC5.1 aAPC 세포가 효율적인 생물반응기와 함께 성공적으로 사용되어 면역요법과 같은 적용 분야에서 추가 사용에 충분히 많은 수의 T-세포를 생성할 수 있음을 나타냈다.
CD4+ 조절 T-세포(Treg)의 고-부피 확장은 부적절하거나 과도한 면역 활성화로부터 발생하는 면역 장애를 감소 또는 개선하기 위해 입양 T-세포 요법을 사용할 수 있는 능력을 제공한다. 본 개시내용의 aAPC 및 배양 방법이 조절 T-세포를 효율적으로 확장할 수 있는지를 결정하기 위해, CD4+ Treg를 공여체 말초혈액으로부터 분류하고 13일 동안 5% 인간 AB 혈청, 1X 글루타맥스, 1X pen/strep 및 200 IU/mL IL-2가 포함된 XVIVO 배지에서 APC3.1과 공동 배양하여 확장시켰다. 이어서, 세포를 9일째에 APC3.1로 재자극하였다. 도 27a는 연구 과정에 걸친 CD4+ Treg의 효율적인 확장을 예시하는 성장 곡선이다. 14일째에, CD4, CD8, CD25 및 Foxp3의 발현에 대해 세포를 염색하였고(도 27b), 이는 확장된 세포가 CD4+ 조절 T-세포와 일치하는 발현 표현형을 보유함을 나타내었다. 세포가 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다면 확장된 Treg의 임상적 유용성이 증가할 것이다. 이러한 방식으로 확장된 Treg는 특정 항원 표적을 유도할 수 있다. CD4+ Treg가 본 발명의 aAPC를 사용하여 확장되었는지 평가하기 위해, 비-인간 영장류(사이노몰구스 마카키) 말초혈액으로부터 분류된 Treg를 IL-2로 조사된 K562.F12Q.64.86 세포로 자극하였다. 2일째에, 인간 HLA-A2 특이적 CAR을 인코딩하는 바이러스를 세포 배양물에 첨가하였다. 7일째에 세포를 조사된 K562.A2.86 세포로 재자극하여 CAR+ 세포만 확장하여 CAR+ 세포의 백분율을 증가시켰다. 7일 및 14일째에, CAR의 발현 및 CD25 발현은 확장 Treg에서 평가된 바와 같다(도 28). 이러한 염색은 Treg가 효율적으로 형질도입되고 CD25 발현을 유지한다는 것을 나타냈다. 전반적으로, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이들 결과는 인간 및 비-인간 영장류 공여체로부터의 CD4+ 조절 T-세포의 시험관내 확장을 위한 본 발명의 aAPC의 유용성을 나타내어, 확장된 세포가 임상적 유용성을 증가시키는 키메라 항원 수용체 작제물을 발현하도록 효율적으로 형질도입되는 능력을 유지하였음을 시사한다.
실시예 5: aAPC-유래 막 소포를 이용한 T-세포의 확장
본 개시내용의 APC로부터 기능성 나노입자 또는 막 소포의 생성은 온전한 aAPC에 비해 대규모 T-세포 확장에 대한 다수의 이점을 제공할 것이다. 확장 T-세포의 동시 형질도입이 필요한 적용의 경우, aAPC-유래 소포를 사용하면 바이러스 형질도입 시스템의 효율성을 높일 수 있다. 예를 들어, aAPC-유래 소포는 바이러스 입자와 덜 상호작용할 수 있어 배양 혼합물의 aAPC 부분이 상당한 양의 바이러스를 흡수하는 것을 방지한다. 마찬가지로, aAPC-유래 소포는 배양된 T-세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 세포독성 화학물질, 조사 등과 같은 처리를 통해 aAPC를 불활성화할 필요가 없다. 또한, aAPC 소포는 대사적으로 활성이 아니며 결과적으로 확장된 T-세포 집단에서 제거하기 위한 후속 정제 절차가 필요하지 않다. 많은 세포 파괴 방법이 당업계에 알려져 있고 aAPC-유래 소포 또는 나노입자의 생성에 적절할 것이지만, 질소 공동화 방법은 본 방법이 간단하고 최소한의 세포 조작 및 화학 세제가 필요하지 않다는 점에서 다수의 이점을 제공한다. 도 31a는 질소 공동화 압력 용기("폭탄"이라고도 함)의 두 가지 예를 나타낸다. 도 31b는 aAPC-유래 막 소포 생성의 샘플 작업 흐름도를 나타낸다. 도 32는 본 발명의 APC5.1 세포를 사용하여 질소 공동화를 사용하여 소포 제제를 생성한 일련의 연구를 나타낸다. 그래프는 절차로 인한 입자의 평균 크기를 나타낸다. 그런 다음 이러한 APC5.1 유래 소포 제제를 9일 동안 인간 공여체 T-세포와 함께 인큐베이션했다. 도 33은 소포 제제로부터 유래된 CD86 및 CD64 분자가 T-세포의 표면에 존재하는 것으로 관찰되어 세포와 소포 사이의 성공적인 상호작용을 나타내는 것을 보여준다. 도 34 및 35는 시험관내에서 T-세포의 증식을 유도하는 aAPC-유래 소포의 능력을 나타낸다. 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드를 T-세포를 확장하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나로 비교용으로 사용하였다. CD8+ 및 CD4+ T-세포는 모두 3.125 μl 내지 50 μl 범위의 다양한 소포 농도에서 비드와 비교하여 동등하거나 더 나은 증식을 보였다. T-세포의 aAPC-유래 소포 자극이 GFP-발현 작제물을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T-세포의 동시 바이러스 형질도입을 지원할 수 있는지를 관찰하기 위해 유사한 연구를 또한 수행하였다(도 36). 증식 데이터와 유사하게, aAPC-유래 소포 확장 T-세포는 다수의 농도에서 비드 자극 T-세포와 유사한 수준에서 GFP의 강력한 발현을 나타냈다. 전체적으로, 이들 데이터는 항-CD3/항-CD28 마이크로비드에 유사한 T-세포의 효율적인 확장 방법으로서 aAPC-유래 소포의 유용성을 시사하였다(도 37).
열거된 실시형태
다음의 열거된 실시형태가 제공되며, 그 번호는 중요도 수준을 지정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시형태 1은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 및 막관통 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다.
실시형태 2는 실시형태 1의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 3은 실시형태 1 또는 2의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 4는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 5는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다.
실시형태 6은 실시형태 5의 aAPC를 제공하고, scFv는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 7은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스이다.
실시형태 8은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 비-인간 영장류는 마카카 물라타이다.
실시형태 9는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
실시형태 10은 실시형태 9의 aAPC를 제공하고, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다.
실시형태 11은 실시형태 9의 aAPC를 제공하고, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 12는 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다.
실시형태 13은 실시형태 12의 aAPC를 제공하고, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함한다.
실시형태 14는 실시형태 12의 aAPC를 제공하고, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 15는 인간 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 및 막관통 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공한다.
실시형태 16은 실시형태 15의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 17은 실시형태 15 또는 16의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 18은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
실시형태 19는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다.
실시형태 20은 실시형태 19의 aAPC를 제공하고, scFv는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 21은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
실시형태 22는 실시형태 21의 aAPC를 제공하고, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다.
실시형태 23은 실시형태 21의 aAPC를 제공하고, 힌지 도메인은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 24는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다.
실시형태 25는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 막관통 도메인은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 26은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
실시형태 27은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태 28은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
실시형태 29는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열로 이루어진 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태 30은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 키메라 수용체 분자는 구성적으로 발현된다.
실시형태 31은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 조작된 K562 세포이다.
실시형태 32는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, 조작된 K562 세포는 HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, CD1d, CD16, CD64, CD83, CD86, 4-1BBL, OX40L, ICOSL, CD40L, PD-L1, PD-L2, B7-H3, 및 B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자를 내인성으로 발현하지 않는다.
실시형태 33은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 세포 표면에 발현된 Fc 수용체를 추가로 포함한다.
실시형태 34는 실시형태 33의 aAPC를 제공하고, Fc 수용체는 CD64이다.
실시형태 35는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 세포 표면에서 발현된 공-자극 분자를 추가로 포함한다.
실시형태 36은 실시형태 35의 aAPC를 제공하고, 공-자극 분자는 CD86이다.
실시형태 37은 임의의 상기 항의 aAPC를 제공하고, aAPC는 세포 표면에서 발현된 Fc 수용체, 및 세포 표면에 발현된 공-자극 분자를 추가로 포함한다.
실시형태 38은 실시형태 37의 aAPC를 제공하고, Fc 수용체는 CD64, 및 공-자극 분자는 CD86이다.
실시형태 39는 실시형태 33 내지 38 중 어느 하나의 aAPC를 제공하고, aAPC는 항체가 로딩되고, 항체의 Fc 단편은 Fc 수용체에 의해 결합된다.
실시형태 40은 실시형태 39의 aAPC를 제공하고, 항체는 CD3, CD28, PD-1, B7-H3, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HLA-DR, MHCII, Toll 리간드 수용체 및 LFA-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 대해 특이성을 갖는다.
실시형태 41은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 공-자극 리간드를 추가로 포함한다.
실시형태 42는 실시형태 41의 aAPC를 제공하고, 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6, 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태 43은 실시형태 41 또는 42의 aAPC를 제공하고, 공-자극 리간드는 4-1BBL이다.
실시형태 44는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-35, 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 발현한다.
실시형태 45는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-7을 발현한다.
실시형태 46은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-15를 발현한다.
실시형태 47은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-7 및 IL-15을 발현한다.
실시형태 48은 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-15R을 발현한다.
실시형태 49는 실시형태 49의 aAPC를 제공하고, IL-15R은 IL-15Rα이다.
실시형태 50은 실시형태 44 내지 49 중 어느 하나의 aAPC를 제공하고, 사이토카인은 구성적으로 발현된다.
실시형태 51은
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
실시형태 52는
인간 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 제공하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
실시형태 53은 실시형태 51 또는 52의 aAPC를 제공하고, aAPC는 IL-15R을 추가로 포함한다.
실시형태 54는 실시형태 53의 aAPC를 제공하고, IL-15R은 IL-15Rα이다.
실시형태 55는 임의의 상기 실시형태의 aAPC를 포함하는 조성물을 제공한다.
실시형태 56은 실시형태 55의 조성물을 제공하고, 이는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
실시형태 57은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 제공하고, 이는 실시형태 1 내지 56 중 어느 하나의 인공 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 58은 실시형태 57의 방법을 제공하고, T-세포는 자기유래 T-세포이다.
실시형태 59는 실시형태 57 또는 58의 방법을 제공하고, T-세포는 인간 T-세포이다.
실시형태 60은 조절 T-세포 (Treg)를 자극하고 확장하는 방법을 제공하고, 이는 실시형태 1 내지 56 중 어느 하나의 인공 제시 세포 (aAPC)와 Treg를 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 61은 실시형태 60의 방법을 제공하고, 조절 T-세포는 인간 T-세포이다.
실시형태 62는 실시형태 60의 방법을 제공하고, 조절 T-세포는 비-인간 영장류 T-세포이다.
실시형태 63은 실시형태 62의 방법을 제공하고, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스이다.
실시형태 64는 실시형태 62의 방법을 제공하고, 비-인간 영장류는 마카카 물라타이다.
실시형태 65는 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 제공하고, 이는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, aAPC는
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
실시형태 66은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, aAPC는
인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86;
4-1BBL;
IL-15Rα
를 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이다.
실시형태 67은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)로부터 유래된 막 소포를 포함하는 조성물을 제공하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
실시형태 68은 실시형태 67의 조성물을 제공하고, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
실시형태 69는 실시형태 68의 조성물을 제공하고, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
실시형태 70은 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대해 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
CD64; 및
CD86; 및
4-1BBL; 및
IL-15Rα
를 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물을 제공하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
실시형태 71은 실시형태 69의 조성물을 제공하고, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
실시형태 72는 실시형태 71의 조성물을 제공하고, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
실시형태 73은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 제공하고, 이는 실시형태 67 내지 69 또는 실시형태 70 내지 72의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태 74는 T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자;
CD64;
CD86; 및
4-1BBL
을 포함하고,
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
실시형태 75는 실시형태 74의 방법을 제공하고, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
실시형태 76은 실시형태 75의 방법을 제공하고, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
실시형태 77은 T-세포를 자극하고 확장하는 방법을 제공하고, 이는 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
CD64; 및
CD86; 및
4-1BBL; 및
IL-15Rα
를 포함하고;
IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
aAPC는 조작된 K562 세포이고,
막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성된다.
실시형태 78은 실시형태 77의 방법을 제공하고, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성된다.
실시형태 79는 실시형태 78의 방법을 제공하고, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성된다.
다른 실시형태
본 명세서에서 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 열거는 임의의 단일 요소 또는 나열된 요소의 조합(또는 하위 조합)으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 실시형태의 열거는 그 실시형태를 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 다른 실시형태 또는 이의 부분과 조합하여 포함한다.
값 및 범위가 본 명세서에 제공되는 경우, 이들 값 및 범위에 포함되는 모든 값 및 범위는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 범위 내에 속하는 모든 값뿐만 아니라, 값 범위의 상한 또는 하한 또한 본 출원에서 고려된다.
본 명세서에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명이 특정 실시형태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 실시형태 및 변형예가 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시형태 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania Riley, James L. Ellis, Gavin Xu, Jun Melenhorst, Jan J. <120> Anti-CD3 scFv and Cytokine Producing Artificial Antigen Presenting Cells <130> 046483-7268WO1(02461) <150> U.S. Provisional Patent Application No. 62/941,062 <151> 2019-11-27 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q HCDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q HCDR2 <400> 2 Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q HCDR3 <400> 3 Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q LCDR1 <400> 4 Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q LCDR3 <400> 5 Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5 <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q VH <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F112Q VL <400> 7 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F12Q scFv <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 130 135 140 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr 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Leu Lys 100 105 110 Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly 115 120 125 Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 130 135 140 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser 165 170 175 Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val 180 185 190 Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 195 200 205 Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro 210 215 220 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu 225 230 235 240 Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp 245 250 255 Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 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taaactcact gtgctttccg gaaccacgac gccagcgccg 840 cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900 tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960 tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020 ctttactgca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1080 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1140 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1200 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1260 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1320 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1368 <210> 26 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3 chimeric receptor <400> 26 atggcactgc ccgtgaccgc cctcctcctg cccctcgcgc tactcctgca cgccgccaga 60 ccccaggtgc agctgcagca gagtggcgct gagctggccc gccccggcgc ctccgtgaag 120 atgtcctgca aggctagtgg gtataccttc accaggtata ctatgcactg ggtgaagcag 180 cgtccggggc aggggctcga gtggatcggc tacatcaatc cctcccgcgg ctacaccaat 240 tacaaccaga agttcaagga taaggccacg ctgaccacag acaagagtag ctccacggcc 300 tacatgcagt tatcaagtct gacctctgag gactccgctg tgtactattg tgcgaggtac 360 tacgacgacc actactgtct ggactactgg ggccaaggca caaccctgac tgtaagttcc 420 tccggcggcg gggggtccgg cggcggcggc tccggcgggg ggggtagtat cgtgctgaca 480 cagagtcccg caatcatgtc cgcaagcccc ggagagaagg tgaccatgac gtgtagtgct 540 tccagctccg tgtcctatat gaactggtac cagcagaaat ccgggacttc ccccaagaga 600 tggatctacg acaccagtaa gctggccagt ggcgtgcctg cacacttccg cggcagtggc 660 tccggcacta gttacagtct caccatctcc gggatggaag ctgaggacgc cgctacctac 720 tactgccagc agtggagctc gaacccattc accttcggtt cggggaccaa gctcgagatc 780 aacagggcgg ccgccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840 gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900 cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960 tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagtaa 1020 taa 1023 <210> 27 <211> 5 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Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln 1 5 10 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 50 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15

Claims (79)

  1. 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성(specificity)을 갖는 항원 결합 도메인(antigen binding domain), 및 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 키메라 수용체 분자(chimeric receptor molecule)로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
  2. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)인, aAPC.
  6. 제5항에 있어서, scFv는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)인, aAPC.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 영장류는 마카카 물라타(Macaca mulatta)인, aAPC.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 세포내 도메인을 추가로 포함하는, aAPC.
  10. 제9항에 있어서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함하는, aAPC.
  11. 제9항에 있어서, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  12. 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
  13. 제12항에 있어서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 세포내 도메인을 포함하는, aAPC.
  14. 제12항에 있어서, 세포내 도메인은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  15. 인간 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 및 막관통 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
  16. 제15항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, aAPC.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)인, aAPC.
  20. 제19항에 있어서, scFv는 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 힌지 도메인(hinge domain)을 추가로 포함하는, aAPC.
  22. 제21항에 있어서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인인, aAPC.
  23. 제21항에 있어서, 힌지 도메인은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인인, aAPC.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, aAPC.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩(encoding)되는, aAPC.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, aAPC.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 서열번호 25 또는 26에 제시된 핵산 서열로 이루어진 핵산에 의해 인코딩되는, aAPC.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체 분자는 구성적으로(constitutively) 발현되는, aAPC.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 조작된 K562 세포인, aAPC.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 K562 세포는 HLA 클래스(class) I, HLA 클래스 II, CD1d, CD16, CD64, CD83, CD86, 4-1BBL, OX40L, ICOSL, CD40L, PD-L1, PD-L2, B7-H3, 및 B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자를 내인성(endogenous)으로 발현하지 않는, aAPC.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 세포 표면에 발현된 Fc 수용체를 추가로 포함하는, aAPC.
  34. 제33항에 있어서, Fc 수용체는 CD64인, aAPC.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 세포 표면에서 발현된 공-자극 분자(co-stimulatory molecule)를 추가로 포함하는, aAPC.
  36. 제35항에 있어서, 공-자극 분자는 CD86인, aAPC.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 세포 표면에서 발현된 Fc 수용체, 및 세포 표면에 발현된 공-자극 분자를 추가로 포함하는, aAPC.
  38. 제37항에 있어서, Fc 수용체는 CD64이고, 공-자극 분자는 CD86인, aAPC.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 항체가 로딩(loading)되고, 항체의 Fc 단편은 Fc 수용체에 의해 결합되는, aAPC.
  40. 제39항에 있어서, 항체는 CD3, CD28, PD-1, B7-H3, 4-1BB, OX40, ICOS, CD30, HLA-DR, MHCII, Toll 리간드 수용체 및 LFA-1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 대한 특이성을 갖는, aAPC.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 공-자극 리간드를 추가로 포함하는, aAPC.
  42. 제41항에 있어서, 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6, 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, aAPC.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 공-자극 리간드는 4-1BBL인, aAPC.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-35, 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인을 발현하는, aAPC.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 IL-7을 발현하는, aAPC.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 IL-15를 발현하는, aAPC.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 IL-7 및 IL-15를 발현하는, aAPC.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, aAPC는 IL-15R을 발현하는, aAPC.
  49. 제49항에 있어서, IL-15R은 IL-15Rα인, aAPC.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 구성적으로 발현되는, aAPC.
  51. 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86; 및
    4-1BBL
    을 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로서,
    aAPC는 조작된 K562 세포인, 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
  52. 인간 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 DTS를 포함하고, LCDR3은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86; 및
    4-1BBL
    을 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로서,
    aAPC는 조작된 K562 세포인, 인공 항원 제시 세포 (aAPC).
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, aAPC는 IL-15R을 추가로 포함하는, aAPC.
  54. 제53항에 있어서, IL-15R은 IL-15Rα인, aAPC.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 aAPC를 포함하는, 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  57. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, T-세포는 자기유래(autologous) T-세포인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, T-세포는 인간 T-세포인, 방법.
  60. 조절 T-세포 (Treg)를 자극하고 확장하는 방법으로서, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 제시 세포 (aAPC)와 Treg를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 조절 T-세포는 인간 T-세포인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 조절 T-세포는 비-인간 영장류 T-세포인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 비-인간 영장류는 마카카 파시쿨라리스인, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 비-인간 영장류는 마카카 물라타인, 방법.
  65. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, aAPC는
    인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86; 및
    4-1BBL
    을 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하고,
    aAPC는 조작된 K562 세포인, 방법.
  66. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, aAPC는
    인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86;
    4-1BBL;
    IL-15Rα
    를 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하고,
    aAPC는 조작된 K562 세포인, 방법.
  67. 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86; 및
    4-1BBL
    을 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)로부터 유래된 막 소포(membrane vesicle)를 포함하는 조성물로서,
    aAPC는 조작된 K562 세포이고,
    막 소포는 aAPC의 파쇄(disruption)에 의해 생성되는, 조성물.
  68. 제67항에 있어서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화(nitrogen cavitation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성되는, 조성물.
  69. 제68항에 있어서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성되는, 조성물.
  70. 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
    CD64; 및
    CD86; 및
    4-1BBL; 및
    IL-15Rα
    를 포함하고;
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물로서,
    aAPC는 조작된 K562 세포이고,
    막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성되는, 조성물.
  71. 제69항에 있어서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성되는, 조성물.
  72. 제71항에 있어서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성되는, 조성물.
  73. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 제67항 내지 제69항 또는 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  74. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자;
    CD64;
    CD86; 및
    4-1BBL
    을 포함하고,
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
    aAPC는 조작된 K562 세포이고,
    막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성되는, 방법.
  77. T-세포를 자극하고 확장하는 방법으로서, 인간 CD3 및 비-인간 영장류 CD3에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 수용체 분자로서, 항원 결합 도메인은
    3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역으로서, HCDR1은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역으로서, LCDR1은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 아미노산 서열 GTK를 포함하고, LCDR3은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 키메라 수용체 분자; 및
    CD64; 및
    CD86; 및
    4-1BBL; 및
    IL-15Rα
    를 포함하고;
    IL-7 및 IL-15를 발현하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로부터 유래되는 막 소포를 포함하는 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함하고,
    aAPC는 조작된 K562 세포이고,
    막 소포는 aAPC의 파쇄에 의해 생성되는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, aAPC의 파쇄는 기계적 균질화, 초음파 균질화, 압력 균질화, 온도 순환, 및 질소 공동화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 달성되는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, aAPC의 파쇄는 질소 공동화에 의해 달성되는, 방법.






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