JP2022528024A - Ｃａｒを発現する免疫細胞に抗原提示細胞を係合させるための二重特異性ポリペプチド及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本出願は、抗原提示細胞（ＡＲＣ）上の抗原に結合する第１結合ドメイン及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞上の抗原に結合する第２結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドに向けられる。本発明のポリペプチドを生成する際に使用される核酸、ベクター及び宿主細胞についても開示される。前記二重特異性ポリペプチドを含む組成物並びに癌を治療する、インビボ及びインビトロでの免疫細胞の活性化及び増殖を刺激する方法も又開示される。

Description

本開示は、概して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合することができる第１結合ドメイン及びＴ細胞に結合することができる第２結合ドメインを含む、その部分を含む二重特異性ポリペプチド及びその使用に関する。

関連出願の相互参照
本願は、これによりそれらの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月３０日出願のオーストラリア国仮特許出願第２０１８９０４１１７号明細書及び２０１９年９月４日出願の同第２０１９９０３２５５号明細書からの優先権を主張するものである。

養子細胞移入（ＡＣＴ）は、癌治療のための感動的な可能性を証明しつつある。ＡＣＴでは、多数の自家腫瘍応答性Ｔ細胞が、患者に再注入される前にインビトロで生成される。腫瘍応答性Ｔ細胞は、血液又は腫瘍から単離し、ペプチド及び／又はサイトカインによる刺激を用いてインビトロで増殖させることができる。現在までのＡＣＴへの最も印象的な応答は、Ｔ細胞移入がＩＬ－２の投与並びに化学療法及び／又は全身照射を包含するプリコンディショニングレジメンと一緒に患者９３例中５２例（５６％）において客観的応答を生じさせた黒色腫等の特定の腫瘍タイプにおいて観察されており、この場合には患者９３例中２０例が完全寛解を達成し、それらの患者２０例中１９例は治療後５年間を超えて進行中の永続的な完全緩解を示している（非特許文献１）。骨髄移植後にエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）関連性リンパ組織増殖性疾患を有する患者もまたＡＣＴから利益を得ることができ、実質的に全ての患者が、ＥＢＣ特異的Ｔ細胞の養子移入後に、疾患の完全消退を達成した（非特許文献２）。しかしながら、他のタイプの癌に対する応答性を備える自家Ｔ細胞が単離されることは、希である。

ＡＣＴに対するＴ細胞の応答性を向上させる方法としては、固形癌及び血液癌を含む大多数の悪性腫瘍に対する腫瘍応答性Ｔ細胞を生成するための患者リンパ球の遺伝子改変が挙げられる。遺伝子改変の２つの主要なアプローチは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子を包含する。ＣＡＲは、Ｔ細胞のエフェクター機能を腫瘍細胞に向け直すＴ細胞シグナル伝達ドメインと融合した抗体由来ドメインから成る。どちらのアプローチもＴ細胞を腫瘍応答性にさせることができるが、非ＭＨＣ限定性であるＣＡＲアプローチは、より広範囲の患者により幅広く適用することができる。

ＣＡＲは様々な形態を取り得るが（非特許文献３）、典型的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的な抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から成る細胞外ドメインから構成される。このｓｃＦｖは、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、１つ以上のシグナル伝達部分から構成される細胞内領域に連結されている。ＣＡＲは、Ｈｅｒ２、ＣＥＡ、ＦＢＰ、ＣＤ１９及びＣＤ２０９を含む一連のＴＡＡに対する特性を備えて開発されてきた。最も進歩的な臨床試験は、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫を治療するためのＣＤ１９に対して特異的なＣＡＲを利用してきた（非特許文献３）。２０１７年には、これらのＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞療法のうちの２つが、米国ＦＤＡによってＢ細胞性悪性腫瘍を治療するために承認された（非特許文献４）。これらの結果にもかかわらず、固形腫瘍について報告された客観的応答は余り多くないが、これはＣＡＲ Ｔ細胞の活性化、増殖及び存続が不十分であること及び／又は免疫抑制性の腫瘍微小環境に起因する可能性がある。

このタイプの療法を最適化する試みは、ＣＡＲ Ｔ細胞のα－ＰＤ－１モノクローナル抗体との共治療（非特許文献５）、シグナル伝達及びサイトカイン経路の遺伝子改変（非特許文献６）並びにアゴニスト性α－４－１ＢＢモノクローナル抗体（ｍＡＢ）（非特許文献７）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）等のアジュバントの使用を含む腫瘍誘導性免疫抑制を克服するために設計された他の治療アプローチと組み合わせることをもたらしてきた。これらのアプローチの一部は、造血性癌細胞においてＴ細胞増殖をもたらし得るＴ細胞と癌細胞との間の直接相互作用を可能にすることに成功することを証明してきたが、固形癌の状況において有意な増殖が観察されたことは希である（非特許文献８）。

Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５７（１）：５６－７１ Ｈｅｓｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ，１１５（５）：９２５－３５ Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１３（８）：５２５－４１ Ｋｙｍｒｉａｈ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ ａｎｄ Ｙｅｓｃａｒｔａ，Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ／Ｇｉｌｅａｄ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５６３６－４６ Ｋｏｎｅｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４：ｅ９９４４４６ Ｍａｒｄｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９３（３）：２９０－６

ＣＡＲ Ｔ細胞を送達するための治療アプローチの最適化は、多剤治療歴を有する患者からの細胞のリンパ球数が低く、状態が不良であるために、インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及び生成において直面する困難によって悪影響を受けることが多い（米国食品医薬品局：ＫＹＭＲＩＡＨ（チサゲンレクルユーセル）、２０１７年８月３０日）。更に、十分なドナー細胞を入手できる場合でさえ、患者にこれらの療法の有効用量を提供するにはかなりの数の細胞を生成することが必要とされ、健常ドナーからの同種異系細胞がこの問題にとっての解決策であることが示唆されてきたが、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る、ドナーとレシピエントとの間のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ミスマッチ等の数多くの問題がある。従って、ＡＣＴのためのＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ及びインビボ増殖を改善するための新規な試薬の開発に対する差し迫った必要が依然としてある。

本明細書に開示した一態様では、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドであって、第１結合ドメインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上、好ましくはプロフェッショナルＡＰＣ上で発現する抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片であり、及び第２結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞上の抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片である二重特異性ポリペプチドが提供される。

本明細書に開示した一態様では、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドであって、第１結合ドメインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現する抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片であり、第２結合ドメインは、免疫細胞によって発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片である二重特異性ポリペプチドが提供される。

本明細書に開示した別の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドをコードする核酸が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、制御配列に作動可能に連結した本明細書に記載した核酸配列を含むベクターが提供される。

本明細書に開示した別の態様では、本明細書に記載したベクターを含む細胞が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、二重特異性ポリペプチドを生成するための方法であって：（ｉ）二重特異性ポリペプチドを発現させるために好適である培養培地中及び条件下で本明細書に記載した細胞を培養するステップ；及び（ｉｉ）発現した二重特異性ポリペプチドを細胞又は培養培地から単離するステップを含む方法が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）本明細書に開示した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドが、対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及び免疫細胞上の抗原に同時に結合し、好ましくは免疫細胞上の抗原はＣＡＲ上の抗原であり、それにより癌を治療するための免疫細胞のインビボでの活性化及び増殖を刺激する方法が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、インビボでの免疫細胞の活性化及び増殖を刺激するための方法であって、対象に有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）本明細書に開示した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドは対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及び免疫細胞上の抗原に同時に結合し、好ましくは免疫細胞上の抗原はＣＡＲ上の抗原であり、それにより免疫細胞のインビボでの活性化及び増殖を刺激する方法が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、インビトロでの免疫細胞の活性化及び増殖を刺激するための方法であって：（ｉ）ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体、及び（ｉｉ）本明細書に開示した二重特異性ポリペプチドを含む培養培地中でＣＡＲを発現する単離免疫細胞を培養するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドが、ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体上で発現した抗原及び免疫細胞上の抗原に同時に結合し、好ましくは免疫細胞上の抗原はＣＡＲ上の抗原であり、それにより免疫細胞のインビトロでの活性化及び増殖を刺激する方法が提供される。

本明細書に開示した別の態様では、癌を治療するための医薬品の製造における本明細書に記載した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物の使用が提供される。

更に別の態様では、癌の治療において使用するための、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物が提供される。

更に別の態様では、本発明は、本発明の１種以上の二重特異性ポリペプチド、上述した前記二重特異性ポリペプチドをコードする核酸及び／又は医薬組成物を含むキット又は製造品を提供する。

他の態様では、上述した治療適用において使用するためのキットであって：
（ａ）本発明の二重特異性ポリペプチド、核酸、ベクター若しくは医薬組成物を保持する容器；及び
（ｂ）使用上の注意を備えるラベル又は添付文書
を含むキットが提供される。

所定の実施形態では、キットは、癌を治療するための１種以上の活性成分又は有効成分を更に含み得る。例えば、キットは、ＣＡＲを発現する免疫細胞を更に含み得る。

ＣＡＲ Ｔ細胞上の抗原に対して特異的である結合ドメインは、Ｅｘｐｉ２９３細胞発現系を使用して発現させられ得ることを示す図である。 全長二重特異性ポリペプチドは、２９３Ｔ細胞系及びリポフェクタミン系を使用して発現させられ得ることを示す図である。（Ａ～Ｂ）ＢＥＡＴ１を発現している２９３Ｔ細胞からのタンパク質溶解物のＨｉｓタグについてのウェスタンブロットの写真画像（９Ｅ１０－Ｍ５／１１４）。 全長二重特異性ポリペプチドは、２９３Ｔ細胞系及びｊｅｔＰＥＩ系を使用して発現させられ得ることを示す図である。（Ａ～Ｂ）ＢＥＡＴ２（ＭＨＣＩＩ／ｃ－ｍｙｃ）及びＢＥＡＴ３（ＣＤ４０／ＣＤ３）を発現している２９３Ｔ細胞からのタンパク質溶解物のＨｉｓタグについてのウェスタンブロットの写真画像。 全長二重特異性ポリペプチドは、細胞均質化後に細胞から発現且つ遊離させられ得ることを示す図である。（Ａ）６ウエルプレートからの均質化した０．７５％のＳｕｐｅ＋細胞、及び（Ｂ）６ウエルプレートからの非均質化細胞ペレットからのＢＥＡＴ２（ＭＨＣＩＩ／ｃ－ｍｙｃ）及びＢＥＡＴ３（ＣＤ４０／ＣＤ３）を発現している２９３Ｔ細胞からのタンパク質溶解物のＨｉｓタグについてのウェスタンブロットの写真画像。 二重特異性ポリペプチドであるブドウ球菌腸毒素Ｂ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）（ＳＥＢ）がＴ細胞増殖及びＩＦＮ－γ分泌を媒介することを示す図である。（Ａ）ＳＥＢの存在下又は非存在下（ｘ軸）におけるＢ６マウス又はヒトＰＢＭＣ由来の脾細胞に対するＴ細胞増殖（ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）ＳＥＢの存在下又は非存在下におけるＢ６マウス又はヒトＰＢＭＣ由来の脾細胞（ｘ軸）に対するＩＦＮ－γ分泌（ｙ軸）のグラフ表示。（Ｃ）ＳＥＢの存在下又は非存在下における４８時間後の定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳腺腫瘍を有するマウスの脾臓内でのＴＣＲ－Ｖβ８^＋細胞のパーセンテージ（ｘ軸）のグラフ表示。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。 ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性がインビボでのＳＥＢの共投与によって増強されることを示す図である。（Ａ）定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）定着２４ＪＫ－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｃ）定着ＭＣ３８－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。エラーバー：ＳＥＭ。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。（Ｄ）まさにＳＥＢ単独又はＣＡＲ Ｔ細胞単独の投与を受けたマウスを含む、定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。他に言及しない限り、非治療群とＳＥＢ＋ＣＡＲ群との間で有意性を比較した。 ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性がインビボでのＳＥＢの共投与によって増強されることを示す図である。（Ａ）定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）定着２４ＪＫ－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｃ）定着ＭＣ３８－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。エラーバー：ＳＥＭ。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。（Ｄ）まさにＳＥＢ単独又はＣＡＲ Ｔ細胞単独の投与を受けたマウスを含む、定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。他に言及しない限り、非治療群とＳＥＢ＋ＣＡＲ群との間で有意性を比較した。 ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性がインビボでのＳＥＢの共投与によって増強されることを示す図である。（Ａ）定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）定着２４ＪＫ－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｃ）定着ＭＣ３８－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。エラーバー：ＳＥＭ。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。（Ｄ）まさにＳＥＢ単独又はＣＡＲ Ｔ細胞単独の投与を受けたマウスを含む、定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。他に言及しない限り、非治療群とＳＥＢ＋ＣＡＲ群との間で有意性を比較した。 ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性がインビボでのＳＥＢの共投与によって増強されることを示す図である。（Ａ）定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）定着２４ＪＫ－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｃ）定着ＭＣ３８－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。エラーバー：ＳＥＭ。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。（Ｄ）まさにＳＥＢ単独又はＣＡＲ Ｔ細胞単独の投与を受けたマウスを含む、定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスにおける時間（治療後日数；ｘ軸）に対する腫瘍のサイズ（ｍｍ^２；ｙ軸）のグラフ表示。他に言及しない限り、非治療群とＳＥＢ＋ＣＡＲ群との間で有意性を比較した。 腫瘍へのＣＡＲ Ｔ細胞の浸潤がＳＥＢの共投与によって増強されることを示す図である。ＳＥＢの非存在下（Ａ）又は存在下（Ｂ）におけるＣＤ８で染色した細胞のグラフ表示。ＣＡＲ＋ＳＥＢでは、暗色染色は、浸潤しているＣＡＲ Ｔ細胞（即ち、ＣＤ８^＋）を表す。スケールバー：５０μｍ。 ＣＡＲ特異的結合ドメインの結合がＣＡＲ媒介性Ｔ細胞機能を妨害しないことを示す図である。（Ａ）Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２細胞及びコントロール又は抗ｍｙｃ抗体（ｙ軸）と共にインキュベートしたＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌（ｐｇ／ｍＬ；ｙ軸）のグラフ表示。（Ｂ）抗ｍｙｃ抗体の存在下又は非存在下（ｘ軸）においてＥ０７７１－Ｈｅｒ２細胞と共培養したＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性（殺滅率（％）；ｙ軸）のグラフ表示。 二重特異性ポリペプチド（即ち、ＢＥＡＴ）がインビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞増殖を促進することを示す図である。ＣＳＦＥで標識し、７２時間に渡りＢＥＡＴ（抗ＣＤ４０／抗ｍｙｃ）又は抗ＣＤ４０及び抗ｍｙｃ抗体の混合物と共にインキュベートした、トランスジェニックＣＡＲマウス由来の脾細胞の細胞数を示すグラフ表示。 ＢＥＡＴがＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び増殖を媒介することを示す図である。ＢＥＡＴの３つの例は、ｍｙｃタグ（ＣＡＲ中に存在する）に対して特異的な抗体を様々なサブセットのＡＰＣ上で発現しているＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ２又はＣｌｅｃ９ａの何れかに対して特異的である抗体に化学的にコンジュゲート化させることによって生成した。マウスＣＡＲ Ｔ細胞をＢＥＡＴの存在下又は非存在下において（ＡＰＣの起源としての）マウス脾細胞と共にインキュベートした。ＣＡＲの発現が欠如するＴ細胞をコントロールとして使用した。（列挙した）非コンジュゲート化抗体の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞とＡＰＣとのインキュベーションもまたコントロールとして使用した。（Ａ）各ＢＥＡＴの存在下で、ＣＡＲ Ｔ細胞（右のパネル）はＩＦＮ－γを分泌するが、コントロールＴ細胞（左のパネル）は分泌しない。（Ｂ）ＣＡＲ Ｔ細胞は、蛍光色素ＣＦＳＥを装填し、各代替ＢＥＡＴの存在下又は非存在下においてＡＰＣと共にインキュベートした。増殖の程度は、コントロール非形質移入Ｔ細胞（左のパネル）と比較して、形質移入ＣＡＲ Ｔ細胞の蛍光強度の減少（右のパネル）から明らかである。 ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴがマウスにおけるＥ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌の根絶を可能にすることを示す図である。定着皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するＨｅｒ２－トランスジェニックマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）及び／又はｍｙｃ－ＣＤ４０に対して特異的なＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療した。他のマウス群は、非コンジュゲート化抗ｍｙｃ及び抗ＣＤ４０抗体の投与を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）。（Ａ）腫瘍増殖率及び（Ｂ）マウス生存率。１群当たりマウス６匹を用いた３件の独立実験を表すデータ。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、対応のないスチューデントのｔ検定。 ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴが腫瘍内でのＴ細胞の蓄積を可能にすることを示す図である。皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスは、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）をＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ、ｉ．ｐ）と一緒に投与された。他のマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくはＢＥＡＴ単独の投与を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）。（Ａ）治療開始後第７日に、腫瘍を採取し、分離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。１群当たり３匹の個別マウスを表すデータ。（Ｂ）腫瘍をホルマリン固定し、切片作製し、ＤＡＰＩ（青色）及び抗ＣＤ８（褐色）により染色した。列挙した治療を受けているマウスからの３切片を表す画像を示した。 ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴが腫瘍内でのＴ細胞の蓄積を可能にすることを示す図である。皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスは、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）をＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ、ｉ．ｐ）と一緒に投与された。他のマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくはＢＥＡＴ単独の投与を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）。（Ａ）治療開始後第７日に、腫瘍を採取し、分離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。１群当たり３匹の個別マウスを表すデータ。（Ｂ）腫瘍をホルマリン固定し、切片作製し、ＤＡＰＩ（青色）及び抗ＣＤ８（褐色）により染色した。列挙した治療を受けているマウスからの３切片を表す画像を示した。 ＣＡＲ Ｔ細胞がマウスにおいて長期間存続することを示す図である。脾臓は、ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴによるＥ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍の根絶後に長期間（＞２００日間）生残しているマウス（左のパネル）又はナイーブマウス（右のパネル）から採取し、ＣＡＲ Ｔ細胞を検出するために抗ｍｙｃ及びＣＤ８により染色した。マウス３匹を表すデータ。 ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＢＥＡＴ療法後にＨｅｒ２－陽性腫瘍を拒絶していたマウスがＨｅｒ２陽性腫瘍による再投与に対して完全に抵抗性であることを示す図である。Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴによって媒介された皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を根絶した長期生存マウスに、反対側の側腹上で皮下注射により同一のＨｅｒ２陽性腫瘍細胞（５×１０^５）を再投与した。腫瘍増殖率（上のパネル）及びマウス生存率（下のパネル）。腫瘍増殖は、コントロールとしてのナイーブマウスにおいて描出した。（再投与群のマウス８匹及びコントロール群の６匹、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 Ｈｅｒ２陰性腫瘍増殖は、ＣＡＲ Ｔ細胞及びＢＥＡＴ療法によって媒介されたＨｅｒ２－陽性腫瘍を拒絶していたマウスでは阻害される。以前にＨｅｒ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ投与後のＥ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を拒絶していたマウスを同一のＨｅｒ２発現が欠如するＥ０７７１（細胞５×１０^５個）を用いて反対側の側腹上で再投与した。ナイーブマウスにおける腫瘍増殖をコントロールとして示した。腫瘍増殖率（上のパネル）及びマウス生存率（下のパネル）。（再投与群のマウス１５匹及びコントロール群のマウス５匹、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＣＤ４０－ｍｙｃコンジュゲート化ＢＥＡＴと組み合わせた抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲ Ｔ細胞がマウスにおけるＭＣ３８－Ｈｅｒ２結腸癌の増殖を阻害することを示す図である。定着皮下ＭＣ３８－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスを抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ）により治療した。他のマウス群は、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくは（列挙した）抗体単独の投与を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）。マウス７匹を有していたＢＥＡＴ＋ＣＡＲ群を除き、１群当たりマウス６匹であった。^＊＊ｐ＜０．０１）。 ＰＤ－Ｌ２－ｍｙｃ及びＣｌｅｃ９ａ ＢＥＡＴコンジュゲートが、腫瘍増殖のＣＡＲ Ｔ細胞による阻害を可能にすることを示す図である。ＡＰＣ発現分子であるＰＤ－Ｌ２若しくはＣｌｅｃ９ａに対して特異的なＢＥＡＴは、モノクローナル抗体の抗ｍｙｃ抗体への化学的コンジュゲート化によって調製した。定着皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスは、列挙した治療を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）（１群当たり３～６匹、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。 組み換えヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴがヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を媒介することを示す図である。ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲのレトロウイルス導入を用いてヒト末梢血から生成した。ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^５／ｍｌ）をＣＦＳＥにより標識し、ＡＰＣの起源としての５Ｇｙ照射ＣＴＶ標識ヒト血液白血球の存在下（左のパネル）において、化学的コンジュゲート化又は組み換えＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（コンジュゲート化３μｇ／ｍｌ、組み換え０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに５日間インキュベートした。空ベクターを用いて形質移入したＴ細胞は、コントロール（右のパネル）として機能した。細胞は、フローサイトメトリーを用いて分析した。 組み換えヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴがＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌を増強することを示す図である。ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを用いて末梢血から生成した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、化学的に又は組み換えにより調製したＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴの存在下又は非存在下において５日間に渡りＡＰＣの起源としてのヒト血液白血球と共にインキュベートした。抗ＣＤ３は、陽性コントロールとしての一部の培養ウエル内に含まれた。上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ－γについて分析した。 コンジュゲート化ヒトＢＥＡＴと組み合わせたヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、マウスにおける腫瘍増殖を阻害する。定着皮下ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳腺腫瘍を有するＮｏｄ－ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスは、コンジュゲート化ヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴを含む又は含まないＣＡＲ Ｔ細胞の投与を受けた（第０日、３６μｇ、ｉ．ｐ．）。ＡＰＣの起源として機能させるために、ヒト血液由来白血球（１×１０^６）もまた静脈内注射により送達した。１群のマウスは、コントロールとして非治療のまま置かれた。（１群当たりマウス５匹、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。 ＢＥＡＴは、一連の腫瘍抗原に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞及びＣＡＲ内の様々な位置に配置された様々な抗原を含むＣＡＲを発現するＴ細胞からの応答を誘導することができる。腫瘍抗原ＣＥＡを結合するためのＣＡＲを有し、及びｍｙｃタグ（ＣＥＡ－ｍｙｃ ＣＡＲ）を有するＴ細胞は、マウス脾細胞並びにｍｙｃに結合するための第１結合ドメイン及びＣＤ４０に結合するための第２結合ドメインを有するＢＥＡＴと共にインキュベートしたときにより多くのＩＦＮ－γ（ｐｇ／ｍＬ；ｙ軸）を分泌した。腫瘍抗原Ｈｅｒ２を結合するためのＣＡＲを有し、及びＣＡＲのＮ末端に位置するａ－ＦＬＡＧタグ（Ｈｅｒ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲ）を有するＴ細胞は、マウス脾細胞並びにＦＬＡＧに結合するための第１結合ドメイン及びＣＤ４０に結合するための第２結合ドメインを有するＢＥＡＴと共にインキュベートした場合により多くのＩＦＮ－γを分泌した。ＦＬＡＧ及びＣＤ４０に対して特異的なＢＥＡＴは、ＣＤ４０発現脾細胞の存在下においてＨｅｒ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌もまた誘導した。

本明細書の全体を通して、状況が他のことを要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、規定の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の包含を意味するが、任意の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。

本明細書における任意の先行刊行物（又はそれに由来する情報）についての、又は公知である任意の物質についての言及は、先行刊行物（又はそれに由来する情報）又は公知の内容がこの明細書が関連する努力の分野における一般的知識の一部を形成することのいかなる形での確認、承認若しくは示唆ではない、及びその確認若しくは承認であると見なすべきではない。

他に特別に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通例理解される意味と同一の意味を有すると見なすべきである。

他に特に指示しない限り、本明細書で利用する分子生物学、細胞培養及び実験技術は、当業者には周知である標準手技である。そのような技術は、例えば、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれるＪ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ等の出典において文献を通して記載及び説明されている。本明細書に記載した方法は、当分野において周知であると考えられ、読者の便宜性のために提供される。本明細書で言及した全ての他の刊行物は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する単数形「１つの」及び「その」には、状況が明確に他のことを指示しない限り、複数の態様が含まれる。従って、例えば、「ポリペプチド」についての言及には、単一ポリペプチド、並びに２つ以上のポリペプチドが含まれ；「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」についての言及には、単一ＡＰＣ並びに２つ以上のＡＰＣが含まれる等である。

アミノ酸及びヌクレオチド配列は、下記の表１に示したように、配列識別番号（配列番号）によって言及される。

本開示は、少なくとも一部には、ＣＡＲ Ｔ細胞の二重特異性ポリペプチドを用いた抗原提示細胞（ＡＰＣ）との係合が、治療効果を達成するために必要とされるＣＡＲ Ｔ細胞の有効用量を減少させながら、傷害性を伴わずに高度の腫瘍阻害を伴ってインビトロ及びインビボでのＴ細胞増殖を増強するという本発明者らの予想外の発見において予測されている。重要なことに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫抑制性腫瘍微小環境から離れた場所でリンパ組織における活性化シグナル及び増殖シグナルを受信する。

このため、本明細書に開示した一態様では、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドであって、第１結合ドメインが、抗原ＡＰＣ上で発現する抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片であり、第２結合ドメインは、免疫細胞によって発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）上の抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片である二重特異性ポリペプチドが提供される。

二重特異性ポリペプチド
本明細書で使用する用語「二重特異性ポリペプチド」は、２種の異なる標的抗原に同時に特異的に結合し得るポリペプチドを意味する。本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドは、それらのそれぞれが単一標的抗原に特異的に結合する、２つの構造的に別個の結合ドメイン（即ち、領域）を含む。二重特異性ポリペプチドは、ＡＰＣ上の標的抗原及びＣＡＲを発現する免疫細胞上の異なる標的抗原に結合するために使用することができる。更に、二重特異性ポリペプチドは、ＡＰＣ上の標的抗原及び免疫細胞によって発現したＣＡＲ上の異なる標的抗原に結合するために使用することができる。二重特異性ポリペプチドは、１つ以上の抗体若しくは抗体断片（例えば、１つ以上のｓｃＦｖ）のポリペプチド配列（即ち、ドメイン）を含み得る。別の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、１つ以上のリガンドのポリペプチド配列を含み得る。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、第１ｓｃＦｖ及び第２ｓｃＦｖを有するタンデム一本鎖可変断片抗体（ｔａＦｖ）である。

本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドは、「ＡＰＣ及びＴ細胞の二重特異性エンゲージャー」又は「ＢＥＡＴ」と様々に言うことができる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」及び「タンパク質性分子」は、アミノ酸残基のポリマーを含む、若しくはそれから成る分子及び同一物の変異体及び合成類似体を指すために、本明細書では互換的に使用される。従って、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の非天然型アミノ酸、例えば対応する天然型アミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、並びに天然型アミノ酸ポリマーに適用される。

本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、天然型アミノ酸及び合成アミノ酸並びに天然型アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模擬体を指す。天然型アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸並びに例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリン等の後に修飾されるそれらのアミノ酸である。アミノ酸類似体は、天然型アミノ酸と同一の基本化学構造を有する化合物、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合している炭素を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド主鎖を有し得る。アミノ酸模擬体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なるが、天然型アミノ酸と同様に機能する構造を有する化学的化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に使用されるフルネーム（例えば、システイン）、それらの一般に公知の３文字記号（例えば、Ｃｙｓ）又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法によって推奨される１文字記号（例えば、Ｃ）によって言及することができる。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に許容された１文字コードによって言及することができる。

本明細書で使用する用語「抗原」は、本明細書では「抗体」、「抗体断片」又は「二重特異性ポリペプチド」によって結合される分子を指す。抗原は、その場合には免疫グロブリンによって結合されたタンパク質上の部位が「エピトープ」と呼ばれる免疫グロブリンによって認識されるタンパク質であり得る。一実施形態では、抗原は、細胞表面受容体（例えば、ＭＨＣＩＩ、Ｃｌｅｃ９ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ガレクチン、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４０及びＣＤ８３）のリガンドであり得る。別の実施形態では、抗原は、免疫細胞によって発現したＣＡＲ上のタグである。

本明細書で使用する用語「抗原提示細胞」若しくは「ＡＰＣ」は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、上皮細胞等）又は非プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓β細胞等、血管内皮細胞等）であり得る。好ましい実施形態では、ＡＰＣは、プロフェッショナル抗原提示細胞であり、腫瘍細胞ではない。

一実施形態では、第１結合ドメインは、ＭＨＣＩＩ、Ｃｌｅｃ９ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ガレクチン、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４０及びＣＤ８３から成る群から選択されるＡＰＣ上で発現した抗原に特異的に結合する。ＭＨＣＩＩは、樹状細胞（ＤＣ）、単核食細胞、一部の内皮細胞、胸腺上皮細胞及びＢ細胞上で発現する；Ｃｌｅｃ９ａは、ＢＤＣＡ＋樹状細胞及び小さなサブセットのＣＤ１４＋／ＣＤ１６－単球上で発現する；ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、マクロファージ、骨髄性ＤＣ、Ｂ細胞及び血管内皮細胞上で発現する；ガレクチンは、Ｔヘルパー細胞及びＢ細胞によって発現する；ＣＤ１１ｃは、ＤＣによって高レベルで発現する；ＣＤ１９は、Ｂ細胞及び小胞性ＤＣを成熟させるために全プロフェッショナルＢ細胞上で発現する；ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージによって発現する；並びにＣＤ８３は、主として成熟ＤＣによって発現する。好ましい実施形態では、第１結合ドメインによって特異的に結合される抗原は、腫瘍関連抗原ではない。

一実施形態では、第２結合ドメインは、ＣＡＲ又は類似の受容体を発現する免疫細胞上の抗原に特異的に結合する。更に別の実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、免疫細胞上の抗原に結合し得るが、ここで抗原はＣＡＲの一部ではないが、免疫細胞の細胞表面上に存在する抗原である。

所定の実施形態では、免疫細胞は、典型的には遺伝子組み換えＴ細胞若しくはＮＫ細胞であるが、ここで遺伝子組み換えＴ細胞若しくはＮＫ細胞上の抗原は、ＣＡＲの一部である。これらの実施形態によると、本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分に結合し得る。第２結合ドメインは、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合し得る、又は第２結合ドメインは、抗原結合に含まれていないＣＡＲの細胞外領域に結合し得る。

所定の実施形態では、免疫細胞上に存在するＣＡＲは、第２結合ドメインと結合するために更に追加のアミノ酸若しくは分子を含み得る。当分野において公知であるように、ＣＡＲ構築物は、典型的には抗体によって特異的に認識される短鎖のアミノ酸配列である「タグ」を含むように設計することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、タグを含むＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞若しくはＮＫ細胞である。そのような実施形態の状況では、二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、タグに結合し得る、又はタグ以外のＣＡＲの領域に結合し得る。免疫細胞がタグを含むＣＡＲを発現するために遺伝子組み換えされたＴ細胞若しくはＮＫ細胞である一部の実施形態では、二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、タグ以外のＣＡＲの一領域に結合する。

ＣＡＲ上に存在するタグの具体的な例としては、ペプチドタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｅＸａｃｔタグ）及びタンパク質タグ（例えば、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＧＦＰタグ、抗体若しくは他のタンパク質に結合するためのドメインの形態にあるタグ、核タンパク質（ロイシンジッパー等）又はＣＡＲへの任意の他のタンパク質修飾）が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲ上の抗原又は親和性タグは、ｃ－Ｍｙｃタグである。

一部の実施形態では、免疫細胞は、タグを含まないＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞又はＮＫ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、タグを含まないＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞若しくはＮＫ細胞、又は任意の異種腫瘍関連抗原若しくは腫瘍関連抗原の断片である。

所定の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えされたＴ細胞又はＮＫ細胞であり、二重特異性ポリペプチドは、ＣＡＲの細胞外部分に結合する。当分野において公知であるように、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを天然では単一タンパク質中では見出されない組み合わせで含む細胞表面受容体である。細胞外ドメインは、抗体又は抗体断片であり得る抗原結合ドメインを含む。抗体若しくは抗体断片は、ヒト抗体若しくは断片、ヒト化抗体若しくは断片又は非ヒト抗体若しくは断片であり得る。典型的には、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ等の抗体断片である。最も典型的には、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。細胞外ドメインは、典型的には、膜貫通ドメインに抗原結合ドメインを連結するスペーサー（又はヒンジ）領域を更に含む。スペーサー領域は、ＩｇＧｌ若しくはＩｇＧ４等の免疫グロブリンに由来し得る、又はＣＤ４、ＣＤ８若しくはＣＤ２８を含むがそれらに限定されない代替細胞表面タンパク質に由来し得る。

所定の実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドは、抗イディオタイプ抗体又はその抗原結合断片に由来する第２結合ドメインを含むが、ここで抗イディオタイプ抗体は、ＣＡＲの抗体部分の抗イディオタイプ抗体である。これを言い換えると、第２結合ドメインは、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する。

抗イディオタイプ抗体は、当分野において公知であり、当業者であれば、本発明の二重特異性ポリペプチドの設計においてこれらの抗体の抗原結合ドメインを確実に利用することができるであろう。従って、一部の実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、抗ＣＤ１９、抗Ｈｅｒ２又は他の抗体に対して特異的である抗イディオタイプ抗体に由来する抗体若しくは抗体断片、又はＣＡＲにおいて見出される抗体に結合するための抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。

当分野においては、多数の抗イディオタイプ抗体が公知である。例えば、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレット及びＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（３）：ｅ５７８３８は、最新の開発において多数のＣＡＲ構築物において使用されている抗ＣＤ１９＾ ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３を認識する抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂクローン番号１３６．２０．１）について記載している。

所定の実施形態では、本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的である抗イディオタイプ抗体に由来する抗体若しくは抗原結合ドメイン、又は第１３６．２０．１号のｍＡｂクローンとしての同一のＣＤＲの１つ以上（即ち、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義又はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せを使用して、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３の１つ以上又は全部）を有する可能性がある抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する抗体若しくは抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的である抗イディオタイプ抗体由来の抗原結合ポリペプチド構築物又は第１３６．２０．１号のｍＡｂクローン由来の１つ以上（例えば、２つ）の可変領域を有する可能性がある抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的である抗イディオタイプ抗体由来の抗原結合ポリペプチド構築物又は第１３６．２０．１号のｍＡｂクローンと同一エピトープに結合する、抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。

抗イディオタイプ抗体の他の例としては、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（登録商標）から市販で入手できる抗イディオタイプ抗体、国際公開第２０１３／１８８８６４号パンフレットに記載された抗ＣＤ２２抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、国際公開第９７／３４６３６号パンフレットに記載された抗ＣＥＡ抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、米国特許第５，９３５，８２１号明細書に記載された抗ＧＤ２抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体及びＪａｋｋａ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（１０）：４１８９－４２０に記載された抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体が挙げられる。特別仕様の抗イディオタイプ抗体もまた、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（登録商標）から入手できる。

或いはまた、ＣＤ１９又は他の腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体は、上記のＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．に記載された方法に従って作製することができ、抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチド構築物を構築するために使用することができる。

一部の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、ＣＡＲの抗原結合には含まれていない細胞外領域に結合する第２結合ドメインを含む。本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、免疫細胞上に存在するＣＡＲの細胞外ドメイン上の任意の抗原に結合し得る。例えば、二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、ＣＡＲのヒンジ領域（即ち、ＣＡＲの膜貫通ドメインとｓｃＦｖ部分との間）又はＣＡＲのｓｃＦｖ部分の可変重鎖と可変軽鎖との間のスペーサー領域又はＣＡＲの任意の他の領域に結合し得る。

一部の実施形態では、ヒンジ領域は、第２結合ドメインによって標的化され得るネオエピトープを含む、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８又はｓｃＦｖ－ＣＤ８接合部であり得る。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、第２結合ドメインによって標的化され得る突然変異（Ｆｃ結合ヌル）ＩｇＧ ＣＨ２／３を含み得る。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、第２結合ドメインによって標的化され得る、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４：４３０－４３４）によって記載されたＳｔｒｅｐタグＩＩ等のスペーサーを含み得る。

ＣＡＲ分子のヒンジ領域に結合する抗ＣＡＲ抗体の例は、ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ領域に結合する、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットに記載された２Ｄ３抗体である。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ領域に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ領域に結合する、及び２Ｄ３と同一のＣＤＲ（即ち、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３の１つ以上又は全部）の１つ以上を有する、又は国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットに記載された２Ｄ３の１つ以上（例えば、２つ）の可変領域を有する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。一部の実施形態では、二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインは、ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジ領域に結合し、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットに記載された２Ｄ３と同一のエピトープに結合する。

本明細書で使用する用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインに連結している抗原結合ドメインを含む組み換えポリペプチドを意味する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、癌細胞上で発現した抗原（即ち、「腫瘍関連抗原」）に特異的に結合する（即ち、特異的に標的とする）ＣＡＲの機能的部分である。腫瘍関連抗原の例は、当業者には公知であり、それらの具体的な例としては、Ｈｅｒ２、ＣＥＡ、ＦＢＰ、ＣＤ１９及びＣＤ２０９が挙げられる。

本明細書で使用する「腫瘍関連抗原」は、癌細胞によって発現する抗原を指す。腫瘍関連抗原は、非腫瘍細胞によって発現する場合がある、又は発現しない場合がある。腫瘍関連抗原が非腫瘍細胞によって発現しない場合は（即ち、腫瘍細胞に固有である場合は）、「腫瘍特異的抗原」と呼ぶこともできる。腫瘍関連抗原が腫瘍細胞に固有ではない場合、それは抗原に免疫寛容の状態を誘導できない条件下では非腫瘍細胞上でもまた発現する。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で発生し得る。腫瘍関連抗原は、免疫系が未成熟で応答できない場合に胎児の発育中に非腫瘍細胞上で発現する抗原であり得る、又は正常細胞上では通常低レベルで存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高レベルで発現する抗原であり得る。最も臨床上関心の高いそれらの腫瘍関連抗原は、対応する非腫瘍組織に比較して示差的に発現し、特異的Ｔ細胞若しくは免疫グロブリンによる腫瘍細胞の優先的認識を可能にさせる。

完全及び持続性のＴ細胞活性化及び増殖には、一次開始シグナル（シグナル１）、二次共刺激性受容体係合シグナル（シグナル２）及びサイトカイン受容体係合シグナル（シグナル３）が必要とされる。ＣＡＲ Ｔ細胞はＭＨＣ制限法では作動しないので、それらのＡＰＣとの相互作用は一般に欠損しており、シグナル２及びシグナル３は、重度に弱まっている。従って、１つ以上のシグナル伝達ドメインの組み込みは、腫瘍関連抗原に応答したＴ細胞の活性化のレベル及び維持に強い影響を及ぼす可能性があり、これは増加したサイトカイン産生を生じさせ得る。

一実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。好適なシグナル伝達ドメインは、当業者であれば習熟しており、それらの具体的な例としては、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１２、ＫＩＲ２ＤＳ２、４－１ＢＢ、ＣＤ３ε、ＣＤ３５、ＣＤ３υ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＦｃＲａ、Ｆｃｆｔｐ、ＦｃＲｙ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｉｐ７６、ｐＴａ、ＴＣＲａ、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２及びＬＩＧＨＴが挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

別の実施形態では、第２結合ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞上の抗原に結合するが、ここで抗原は、ＣＡＲではない、又はＣＡＲの上に存在しない。これを言い換えると、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、本発明の二重特異性ポリペプチドの第２結合ドメインによって結合され得る１つ以上の抗原を更に含み得る。例えば、抗原は、免疫細胞表面上に存在する天然型タンパク質（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１９７及びＨＬＡ－ＤＲ等）を含み得る。或いは、免疫細胞上の抗原は、親和性タグ等の人工的に導入された抗原であり得る。免疫細胞の表面上に存在し得るペプチドタグの例としては、ペプチドタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｅＸａｃｔタグ）及びタンパク質タグ（例えば、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＧＦＰタグ）が挙げられる。

本発明の二重特異性ポリペプチドの第１及び第２結合ドメインは、好ましくは抗体又は抗体断片の形態にある。本明細書で使用する用語「抗体」は、広範に４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。本明細書で更に開示されるのは、抗体分子の必須エピトープ結合機能を保持している抗原結合断片、それらの突然変異体、変異体及び誘導体である。そのような突然変異体、変異体及び誘導体は、当業者には公知であり、それらの具体例は、本明細書の他の場所で記載されている。

抗体重鎖は、典型的には重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を含むであろう。重鎖定常領域は、典型的には３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬ）及び軽鎖定常領域ＣＬを含むであろう。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）を間に挟んで、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である超可変性領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には次の：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。

本明細書で使用する用語「抗原結合断片」若しくは「抗体断片」は、標的抗原に特異的に結合する能力を維持している抗体の１つ以上の断片を意味する。抗原結合断片の具体的な例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから成る一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；（ｖ）単一可変ドメインを含む、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４－６）；及び（ｖｉ）単離ＣＤＲが挙げられる。

一実施形態では、第１結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。別の実施形態では、第２結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。

好適な免疫細胞は、当業者であれば習熟しており、それらの具体的な例としては、Ｔ細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である。

１つの好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、Ｔ細胞である。好適なＴ細胞の具体的な例としては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞又はＴ細胞の任意の他のサブセットのＴ細胞が挙げられる。好適なＴ細胞の他の具体的な例としては、次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７及びＨＬＡ－ＤＲの１つ以上を発現するＴ細胞が挙げられる。

本発明に従って使用するための細胞の起源は、当業者には公知であり、それらの具体的な例としては、末梢血、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍が挙げられる。一実施形態では、細胞は、全血に由来する。

本明細書で使用する用語「配列同一性」若しくは「配列相同性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＤＮＡ分子等の２つの核酸分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同一モノマーサブユニットによって占められる場合、例えば、各２つのＤＮＡ分子内の１つの位置がアデニンによって占められる場合は、それらは相同である、又はその位置で同一である。２つの配列間の相同性は、整合又は相同位置の数の一次関数である、例えば、２つの配列における位置の半数（例えば、長さが１０サブユニットのポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同である；位置の９０％（即ち、１０中９）が整合又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号２若しくは４から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号２若しくは４から成る群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１結合ドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号６若しくは８のアミノ酸配列又は配列番号６若しくは８との少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２結合ドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号１６、１８、２０若しくは２２から成る群から選択されるアミノ酸配列又は配列番号１６、１８、２０若しくは２２から成る群から選択されるアミノ酸との少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸を含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸、又は配列番号２と少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％若しくはより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１結合ドメイン；及び配列番号６のアミノ酸、又は配列番号６との少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２結合ドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸、又は配列番号２と少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％若しくはより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１結合ドメイン；及び配列番号８のアミノ酸、又は配列番号８との少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２結合ドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸、又は配列番号４と少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％若しくはより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１結合ドメイン；及び配列番号６のアミノ酸、又は配列番号６との少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２結合ドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸、又は配列番号４と少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％若しくはより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１結合ドメイン；及び配列番号８のアミノ酸、又は配列番号８との少なくとも少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２結合ドメインを含む。

本発明の二重特異性ポリペプチドは、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを連結するリンカー配列を含み得る。リンカーは、例えば、抗原結合ポリペプチド構築物の２つのドメイン（ｓｃＦｖ又はダイアボディのＶＨ及びＶＬ等）を結合するために機能するか、又はそれらは２つの抗原結合ポリペプチド構築物（２つ以上のＦａｂ又はｓｄＡｂ等）を一緒に結合させるために機能し得るか、又はそれらは抗原結合ポリペプチド構築物をスカフォールドに結合させるために機能し得る。一部の実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、複数（即ち、２つ以上）のリンカーを含むことができ、例えば、スカフォールドに連結した１つ以上のｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬを結合するリンカー及びｓｃＦｖをスカフォールドに結合するリンカーを含み得る。適切なリンカーは当分野において公知であり、当業者であれば、リンカーの意図された使用に基づいて容易に選択することができる（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．２０１４を参照されたい）。

有用なリンカーとしては、当分野において周知であり、様々な順序で組み合わされたグリシン及びセリン単位を含むグリシン－セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーを含む。例としては、（ＧＳ）、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎ及び（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、典型的には１～約１０の間、例えば、１～約８、１～約６又は約１～約５の間の整数が挙げられるが、それらに限定されない。

他の有用なリンカーとしては、免疫グロブリンヒンジ配列に由来する配列が挙げられる。リンカーは、４つのＩｇＧクラスの任意の１つからのヒンジ配列の全部又は一部を含むことができ、任意選択的に追加の配列を含むことができる。例えば、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ配列及びグリシン－セリン配列の一部分を含み得る。非限定的な例は、ＩｇＧ１ヒンジの最初の１５残基、その後に続く上述したような長さが約１０アミノ酸であるＧｌｙＳｅｒリンカー配列を含むリンカーである。

リンカーの長さは、その用途に基づいて変動するであろう。適切なリンカーの長さは、当業者が容易に選択することができる。例えば、リンカーがｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのドメインを結合しなければならない場合は、リンカーは、典型的には長さが約５～約２０アミノ酸、例えば、約１０～約２０アミノ酸又は長さが約１５～約２０アミノ酸である。リンカーがダイアボディのＶＨ及びＶＬドメインを結合しなければならない場合、リンカーは、同一鎖内のこれらの２つのドメインの結合を防止するために十分に短くなければならない。例えば、リンカーは、長さが約２～約１２アミノ酸、例えば長さが約３～約１０アミノ酸又は長さが約５アミノ酸であり得る。

一部の実施形態では、リンカーが２つのＦａｂ断片を結合しなければならない場合は、リンカーは、Ｆ（ａｂ’）断片のパラトープの相対的空間構造を維持するように、及びＩｇＧのコアヒンジ内のジスルフィド結合と同等である共有結合を形成することができるように選択され得る。この状況では、好適なリンカーとしては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４からのようなＩｇＧヒンジ領域が挙げられる。これらの典型的なリンカーの修飾バージョンもまた使用することができる。例えば、ＩｇＧ４ヒンジの安定性を向上させるための修飾は、当分野において公知である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：７６７－７７１を参照されたい）。

リンカーは、第１及び第２結合ドメインを結合するアミノ酸残基の配列を含み得る。又は、第１及び第２結合ドメインは、化学的結合によって（例えば、ドメイン間でビス－アリール結合を形成するために）連結させられ得る。結合ドメインの化学的結合のための好適な方法の例は、当分野において公知である。そのような方法としては、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのバイオコンジュゲーション試薬において使用される、リシン残基上に存在する第１級アミンのスクシンイミジル化合物修飾の使用が挙げられる。一実施形態では、第１及び／又は第２結合ドメインがｓｃＦｖである場合は、二重特異性ポリペプチドは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬドメインとの間のリンカー配列を含む。好適なリンカー配列は、当業者には公知であろうと思われ、それらの具体的な例としては、相当にフレキシブル且つ親水性のアミノ酸残基が挙げられる。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号１０、１２若しくは１４、又は配列番号１０、１２若しくは１４との少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る群から選択される。

抗体若しくは抗体断片は、精製又は同定のための追加のアミノ酸若しくは分子を含有し得る。例えば、抗体は、エピトープ又は親和性タグを含有し得る。そのようなエピトープ又は親和性タグの具体的な例としては、ペプチドタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｅＸａｃｔタグ）及びタンパク質タグ（例えば、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＧＦＰタグ）が挙げられる。一実施形態では、エピトープ又は親和性タグは、Ｈｉｓタグである。

核酸及びベクター
本明細書に開示した別の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドをコードする核酸が提供される。更に尚別の態様では、本明細書に記載したベクターを含む細胞が提供される。

本明細書では用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ヌクレオチド配列」「核酸」又は「核酸配列」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指定するために互換的に使用される。用語は、典型的には、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド何れか又はヌクレオチドの修飾形若しくは何れかのタイプの、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形を指す。この用語には、ＲＮＡ及びＤＮＡの一本鎖形及び二本鎖形が含まれる。

本明細書で使用する用語「遺伝子」には、任意選択的にこのプロセスに役立つように要素を追加してｍＲＮＡを生成するために使用され得る核酸分子が含まれる。遺伝子は、機能的タンパク質を生成するために使用できる場合がある、又は使用できない場合がある。遺伝子は、コーディング領域及び非コーディング領域（例えば、イントロン、制御要素、プロモーター、エンハンサー、終結配列並びに５’及び３’非翻訳領域）の両方を含み得る。

本明細書では、「導入遺伝子」は、宿主生物のゲノム内に人工的に導入されている、又は導入されようとしている、及び宿主の子孫に遺伝される遺伝物質を記載するために使用される。一部の実施形態では、導入遺伝子は、それが導入されるＴ細胞に所望の特性を付与する、又はさもなければ所望の治療転帰をもたらす。

本明細書で使用する用語「コードする」、「コードすること」等は、核酸が別の核酸若しくはポリペプチドを提供する能力を指す。例えば、核酸配列は、それがポリペプチドを生成するために転写及び／又は翻訳され得る場合、又はポリペプチドを生成するために転写及び／又は翻訳され得る形態に加工されなければならない場合に、「コードする」と言われる。そのような核酸配列は、コーディング配列又はコーディング配列及び非コーディング配列の両方を含み得る。従って、用語「コードする」、「コードすること」等としては、ＤＮＡ分子の転写の結果として生じるＲＮＡ生成物、ＲＮＡ分子の翻訳の結果として生じるタンパク質、ＲＮＡ生成物を生成するためのＤＮＡ分子の転写並びにＲＮＡ生成物のその後の翻訳の結果として生じるタンパク質、又はＲＮＡ生成物を提供するためのＤＮＡ分子の転写の結果として生じるタンパク質、プロセスされたＲＮＡ生成物（例えば、ｍＲＮＡ）を提供するためのＲＮＡ生成物をプロセスするステップ及びプロセスされたＲＮＡ生成物のその後の翻訳が挙げられる。

一実施形態では、二重特異性ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１５、１７、１９、２１、３１若しくは３３から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列、又は配列番号１５、１７、１９、２１、３１若しくは３３との少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。

別の態様では、制御配列に作動可能に連結した本明細書に記載した核酸を含むベクターが提供される。

用語「制御エレメント」若しくは「制御配列」は、特定細胞において作動可能に連結したコーディング配列を発現させるために必要とされる核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を指す。真核細胞のために好適な制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、ｍＲＮＡ安定性を制御するリーダー若しくは末尾配列並びに転写ポリヌクレオチドによってコードされた生成物を細胞内の細胞内区画又は細胞外環境へ標的化する配列が挙げられる。

典型的には、制御配列としては、プロモーター配列、５’非コーディング領域、転写制御タンパク質若しくは翻訳制御タンパク質のための機能的結合部位等のシス制御領域、上流オープンリーディングフレーム、リボソーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位及び／又はリーダー配列、終止コドン、翻訳停止部位及び３’非翻訳領域をコードする核酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。当分野において公知である構成的若しくは誘導性プロモーターは企図されている。プロモーターは、天然型プロモーター又は２つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターの何れかであり得る。

企図されたプロモーター配列は、哺乳動物細胞にとって天然であり得る、又はその領域が選択された生体において機能的である別の起源に由来し得る。プロモーターの選択は、意図された宿主細胞に依存して異なるであろう。例えば、哺乳動物細胞において発現させるために使用できるプロモーターとしては、カドミウム等の重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーター、β－アクチンプロモーター並びに特にＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーター及びＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流制御領域（ＵＲＲ）等のウイルスプロモーターが挙げられる。これら全てのプロモーターは、当分野において明確に記載されており、容易に入手できる。

エンハンサーエレメントは、本明細書ではベクター構築物内の核酸配列の発現レベルを増加させるために使用され得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８５，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，４：７６１）において記載されたＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、例えばＧｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＵＳＡ，７９：６７７７）に記載されたラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター及びＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント等の例えばＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｃｅｌｌ，４１：５２１）に記載されたヒトＣＭＶに由来するエレメントが挙げられる。

ベクター構築物は、更に３’非翻訳配列も含み得る。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナル並びにｍＲＮＡプロセッシング若しくは遺伝子発現を実行できる任意の他の制御シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子のその部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸区域の付加を実行することによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、一般に変形が珍しくはないが、カノニカル形５’ＡＡＴＡＡＡ－３’との相同性の存在によって認識される。３’非翻訳制御ＤＮＡ配列は、好ましくは約５０～１，０００ｎｔを含み、ポリアデニル化シグナル並びにｍＲＮＡプロセッシング若しくは遺伝子発現を実行できる任意の他の制御シグナルに加えて転写及び翻訳終結配列を含有し得る。

本明細書で使用する用語「作動可能に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」若しくは「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、そのように記載された成分がそれらがそれらの意図された方法において機能することを許容する関係にある並置を指す。例えば、コーディング配列に「作動可能に連結した」制御配列は、制御配列と適合性のある条件下でコーディング配列の発現を許容するコーディング配列に比較した制御配列のポジショニング及び／又は配向を指す。

本明細書で使用する用語「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」は、本明細書ではコーディング配列の翻訳開始コドンと終結コドンとの間でコードされたアミノ酸配列を指すために互換的に使用される。用語「開始コドン」（例えば、ＡＴＧ）及び「終結コドン」（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び鎖終結を各々特定するコーディング配列内の３つの隣接ヌクレオチドの単位（「コドン」）を指す。

「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」等に適用される、本明細書で使用する用語「組み換え」は、本明細書で記載した細胞内で転写及び／又は翻訳できる人工核酸構造（即ち、非複製ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ；又はレプリコン、自己複製ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を意味すると理解されている。

組み換え核酸分子若しくはポリヌクレオチドは、ベクター内に挿入され得る。プラスミド発現ベクター等の非ウイルスベクター又はウイルスベクターを使用することができる。本発明に従ったベクターの種類及び核酸構築物の挿入技術は、当分野において公知であり、それらの具体的な例としては、コスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミド又はリポソーム内に含有されるプラスミド）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。

一実施形態では、ベクターは、配列番号２３～２６から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本明細書で記載する核酸配列、ポリヌクレオチド若しくはベクター構築物は、天然では発生しない異種配列を含む。

更に尚別の態様では、本明細書に記載したベクターを含む宿主細胞が提供される。好適な宿主細胞は、当業者には公知であろうと思われ、その具体的な例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、真菌細胞（例えば、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐ．パストリア（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉａ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ２１、Ｈｉ－５）又は哺乳動物細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。好適な哺乳動物細胞は、当業者には公知であろうと思われ、それらの具体的な例としては、ＣＨＯ又は２９３Ｔ細胞が挙げられる。これらの細胞は、市販の供給業者から広く入手することができる。

二重特異性ポリペプチドを生成するための方法
別の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドを生成するための方法であって：（ｉ）二重特異性ポリペプチドを発現させるために好適である培養培地中及び条件下で本明細書に記載した細胞を培養するステップ；及び（ｉ）二重特異性ポリペプチドを細胞又は培養培地から単離するステップを含む方法が提供される。

本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドは、当業者には公知であろう任意の数の発現系を用いて生成することができるが、それらの具体的な例としては、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ））、真菌（例えば、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐ．パストリア（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉａ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、植物若しくは植物細胞、昆虫若しくは昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ２１、Ｈｉ－５）又は哺乳動物細胞中の生成又はそれらによる生成が挙げられる。一実施形態では、発現系は、哺乳動物発現系である。好適な哺乳動物発現系は、当業者には公知であろうと思われ、それらの具体的な例としては、ＣＨＯ又は２９３Ｔ発現系が挙げられる。これらの発現系は、市販の供給業者から広く入手することができる。一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、哺乳動物発現系を用いて生成される。

他の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドを生成するための方法であって、第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む化学的にコンジュゲート化された二重特異性ポリペプチドを生成するために好適である条件下で第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを結合するステップを含む方法が提供される。

１つの好ましい実施形態では、化学的コンジュゲート化二重特異性ポリペプチドは、本明細書のどこかで記載したように、リシン残基上に存在する第１級アミンのスクシミジル化合物の修飾後に形成される。

本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドを生成するためには、市販で入手できる抗体又はそれらの抗原結合ドメインを利用することは当業者の範囲内に含まれるであろう。更に、所望の特異性を有する抗体若しくは抗原結合ドメインに関する公表された配列情報に基づいて抗体若しくは抗原結合ドメインを複製すること及びそれにより本発明に従って二重特異性ポリペプチドにおけるそのような抗体若しくは抗原結合ドメインを含めることは、当業者の能力の範囲内に含まれる。特に、本発明が本明細書に記載した第１及び第２結合ドメイン（即ち、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞上の抗原に結合するための第１結合ドメイン及び抗原がＣＡＲ上の抗原である場合を含む、ＣＡＲを発現する免疫細胞上の抗原に結合するための第２結合ドメイン）の特異的結合親和性を有するように設計されている任意の二重特異性抗体の生成を含むことは理解されるであろう。当業者であれば、抗原結合ドメインと所望の結合特異性との任意の組み合わせが本発明の二重特異性ポリペプチドを得るために利用できることを理解するであろう。

医薬組成物
別の態様では、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。

本明細書に記載した組成物は、当分野において公知の方法で調製することができ、哺乳動物、特にヒトへの非経口投与のために好適であり、１種以上の薬学的に許容される担体又は希釈剤を備える治療有効量の組成物を含む組成物である。

本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、好適な担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。これらには、酸化防止剤、緩衝剤及び溶質を含有し得る、組成物を意図されるレシピエントの血液と等張性にさせる全ての水性及び非水性等張性無菌注射液；懸濁化剤及び増粘剤、分散媒、抗真菌剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収剤等を含み得る水性及び非水性無菌懸濁剤が含まれる。本発明の組成物は、更に他の追加の生理学的活性剤もまた含み得る。

担体は、組成物中の他の成分と適合性であり、対象にとって有害ではないという意味で、典型的には薬学的に「許容される」。組成物としては、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内投与を含む非経口投与のために好適な組成物が挙げられる。組成物は、便宜的には単位剤形で提示することができ、製薬学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。そのような方法としては、単離Ｔ細胞と結び付けるための担体を調製するステップが含まれる。一般に、組成物は、任意の有効成分と液体担体とを均一且つ密接に結合させるステップによって調製される。

一実施形態では、本組成物は、非経口投与のために好適である。別の実施形態では、本組成物は、静脈内投与のために好適である。

非経口投与のために好適な組成物としては、酸化防止剤、緩衝剤、殺菌剤及び溶質を含有し得る、組成物を意図されるレシピエントの血液と等張性にさせる水性及び非水性等張性無菌注射液；並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁剤が挙げられる。

本開示は更に、本明細書に記載した組成物の他の活性物質との組み合わせ及び／又は放射線療法又は手術等の他の治療レジメン又は治療様式に加えた組み合わせもまた企図している。本明細書に記載した組成物が公知の活性物質と組み合わせて使用される場合、この組み合わせは、連続して（連続的又は治療のない期間を挟んで）又は同時に又は混合物としての何れかで投与することができる。好適な抗癌剤は、当業者には公知であろう。本発明の組成物の後に公知の治療が続く、又は公知の物質を用いた治療の後に維持療法としての本発明の組成物を用いた治療が続く、組み合わせ治療もまた企図されている。例えば、癌の治療においては、本発明の組成物をアルキル化剤（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イフォスファミドシスプラチン又はシスプラチン、カルボプラチン及びオキシプラチン等の白金含有アルキル化剤）、代謝拮抗物質（プリン若しくはピリミジン類似体又は例えばアザチオプリン及びメルカプトプリン等の抗葉酸剤）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルビシン、ミトキサントロン若しくはアントラサイクリン類似体等）、植物性アルカロイド（ビンカアルカロイド等又はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、パクリタキセル若しくはドエスタキセル（ｄｏｅｓｔａｘｅｌ）等のタキサン）、トポイソメラーゼ阻害剤（Ｉ型若しくはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤等）、ポドフィロトキシン（エトポシド若しくはテニポシド等）、チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブメシレート、ニロチニブ若しくはダサチニブ等）、アデノシン受容体阻害剤（Ａ２ａＲ阻害剤、ＳＣＨ５８２６１、ＣＰＩ－４４４、ＳＹＮ１１５、ＺＭ２４１３８５、ＦＳＰＴＰ若しくはＡ２_ＢＲ阻害剤、ＰＳＢ－１１１５等）、アデノシン受容体アゴニスト（ＣＣＰＡ、ＩＢ－ＭＥＣＡ及びＣＩ－ＩＢ－ＭＥＣＡ等）、ＰＤＬ－１：ＰＤ－１軸、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３３２８０Ａ若しくはＭＳＢ００１０７１８Ｃのチェックポイント阻害剤を含むチェックポイント阻害剤）、ＣＴＬＡ－４経路の阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ等）、ＴＩＭ－３経路の阻害剤若しくはＴ細胞機能を促進することが公知であるアゴニストモノクローナル抗体（ＭＥＤＩ６４６９等の抗ＯＸ４０；及びＰＦ－０５０８２５６６等の抗ＢＢを含む）と組み合わせて投与できることが企図されている。

更に別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上の二重特異性ポリペプチド、上述した前記二重特異性ポリペプチド及び／又は医薬組成物をコードする核酸を含むキット又は製造品を提供する。

更に他の態様では、上述した治療適用において使用するためのキットであって：
（ａ）本発明の二重特異性ポリペプチド、核酸、ベクター若しくは医薬組成物を保持する容器；及び
（ｂ）使用上の注意を備えるラベル又は添付文書を含むキットが提供される。

キットは、癌を治療するための１種以上の有効成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ又はｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）を更に含み得る。例えば、キットは、ＣＡＲを発現する免疫細胞を更に含み得る。

「キット」又は「製造品」は、容器及び容器上若しくは容器と結び付いているラベル又は添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成することができる。容器は、その状態を治療するために有効である治療用組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射液バッグ若しくはバイアルであり得る）。ラベル又は添付文書は、その治療用組成物が最適条件を治療するために使用されることを示す。一実施形態では、ラベル又は添付文書は、使用上の注意を含み、その治療用又は予防用組成物が本明細書に記載した癌又は他の状態を治療するために使用できることを示す。

本キットは、（ａ）治療用又は予防用組成物；及び（ｂ）その中に含有される第２の有効成分を有する第２容器を含み得る。本発明の実施形態によるキットは、本組成物及び他の有効成分が本明細書に記載した癌又は状態を治療するために使用できることを示す添付文書を更に含み得る。代わりに、又は追加して、本キットは、無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩液、リンゲル液及びデキストロース液等の薬学的に許容される緩衝剤を含む第２（又は第３）容器を更に含み得る。キットは、当業者には公知であろう、商業的及び使用者の観点から望ましい他の物質を更に含み得るが、それらの好適な例としては、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジが挙げられる。

治療方法
別の態様では、癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）本明細書に記載した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドが、対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及び癌を治療するための免疫細胞の活性化及び増殖を刺激するためにインビボで免疫細胞によって発現したＣＡＲ上の抗原に同時に結合する方法が提供される。

ＣＡＲを発現する免疫細胞と本明細書に記載した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物の共投与は、免疫細胞及び二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物を（例えば、同時共投与のために）同一組成物中で薬剤化することによって、又は連続投与するための異なる組成物として製剤化することによって達成され得る。「連続的」投与は、免疫細胞と二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物との投与の間に間隔があることが意味される。連続的投与の間の間隔は、数秒間、数分間、数時間又は数日間であり得る。一実施形態では、免疫細胞と二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物との定期的再投与が、所望の治療効果を達成するために必要とされることがある。連続的投与は、任意の順序であり得る。

本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドが、免疫細胞のインビボでの活性化及び増殖を刺激し、それによりＣＡＲ Ｔ細胞療法等の免疫細胞療法の有効性を向上させることを証明した。従って、二重特異性ポリペプチドは、「アジュバント」と呼ぶことができる。本明細書で使用する用語「アジュバント」は、ＣＡＲ単独を発現する免疫細胞から予測されるであろう免疫応答の大きさを超えてＣＡＲを発現する免疫細胞によって引き出される免疫応答の大きさを増加させ得る二重特異性ポリペプチドを指す。

免疫細胞の活性化は、例えば、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体若しくはＣＤ２表面タンパク質の刺激を通しての一次刺激シグナルを提供するステップ、及び例えば、ＣＤ２８若しくは４－１ＢＢＬ等のアクセサリー分子を通しての第２共刺激シグナルを提供するステップによって遂行することができる。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通して、又はＣＤ２を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答を誘導するには、第２の共刺激シグナルが必要とされる。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体及びＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるがそれらに限定されない。

用語「増殖した」、「増殖」、「増殖させるステップ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」、「伝播」等は、本明細書では、対象への細胞の投与前又は投与後の医薬組成物の調製何れかにおける多数の免疫細胞における増加を指すために互換的に使用される。免疫細胞は、当分野において公知の任意の細胞培養法を用いて増殖させることができる。例えば、免疫細胞は、液体培養、単層等を含むインビトロ組織培養系において増殖させることができる。

癌を治療するための治療レジメンは、当業者によって決定され得るが、典型的には、対象の年齢、体重及び全身的健康に加えて、腫瘍のタイプ、サイズ、病期及び受容体の状態を含むがそれらに限定されない因子に左右されるであろう。別の決定因子は、再発疾患を発生するリスクであり得る。例えば、再発疾患を発生する高リスク若しくはより高リスク状態にある、又は再発疾患を発生している対象については、再発疾患を発生する低リスク若しくはより低リスク状態にある対象と比較して、より積極的な治療レジメンが処方され得る。同様に、癌のより進行した病期、例えば、第ＩＩＩ若しくはＩＶ期の疾患を有すると同定された対象については、癌のより進行性の低い病期を有する対象に比較して、より積極的な治療レジメンが処方され得る。

本明細書で使用する用語「癌」は、異常な細胞増殖と関連する任意の状態を意味する。そのような条件は、当業者には公知である。一実施形態では、癌は、固形癌である。別の実施形態では、癌は、Ｈｅｒ２陽性癌である。別の実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌及び肺癌から成る群から選択される。

本明細書で使用する用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、それが何であれ何らかの方法で癌の状態若しくは症状、又はさもなければ癌又は他の望ましくない症状の発生又は進行を防止する、妨げる、遅延させる、無効にする、又は逆転させる任意及びあらゆる使用を指す。従って、用語「治療すること」等は、それらの極めて広い可能性のある状況において考察することができる。例えば、治療は、対象が完全回復若しくは治癒まで治療されることを必ずしも意味しない。複数の症状を提示する、又は複数の症状を特徴とする状態では、治療は、前記症状の全部を必ずしも救済する、予防する、妨害する、遅延させる、無効にする、又は逆転する必要はないが、前記症状の１つ以上を救済する、予防する、妨害する、遅延させる、無効にする、又は逆転することができる。

癌が治療されなければならない対象は、ヒト又はヒトにとって経済的に重要及び／又は社会的に重要な哺乳動物、例えば、それらがヒトにとって経済的に重要であるので、ヒト以外の肉食動物（例えば、ネコ及びイヌ）、ブタ（例えば、ブタ、家畜のブタ及びイノシシ）、反芻動物（例えば、ウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ）、ウマ及び絶滅危惧の動物園で飼養されている鳥の種類を含む鳥類及び家禽類及びより特別には飼い慣らされた家禽、例えば七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等であり得る。用語「対象」は、特定の年齢を示さない。従って、成体、若年及び新生対象が含まれることが意図されている。

用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書では本開示を適用可能であるあらゆる対象を言及するために互換的に使用される。一実施形態では、対象は、哺乳動物である。別の実施形態では、対象は、ヒトである。

本明細書で使用する用語「治療有効量」は、そのような治療を必要とする哺乳動物、特にヒトに投与された場合に癌を治療するために十分である細胞の量を意味する。投与されるべき修飾細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染又は転移の程度及び状態における個々の差を考慮に入れて医師が決定できる。

典型的には、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法の投与は、体重１ｋｇ当たりの細胞数によって規定される。しかしながら、修飾細胞は、導入後に複製及び増殖するであろうから、投与される細胞用量は、細胞の最終定常状態数には似ていないであろう。一実施形態では、本発明の修飾細胞を含む医薬組成物は、細胞１０^４～１０^９個／ｋｇ（体重）の用量で投与することができる。別の実施形態では、本発明の修飾細胞を含む医薬組成物は、それらの範囲内の全整数値を含む細胞１０^５～１０^６個／ｋｇ（体重）の用量で投与することができる。

本明細書に記載した二重特異性ポリペプチドを含む組成物は、これらの用量で複数回投与することができる。特定の対象にとって最適な用量及び治療レジメンは、当業者であれば、疾患の徴候について患者を監視し、それに従って治療を調整することによって容易に決定することができる。

一実施形態では、免疫細胞は、自家細胞に由来する。別の実施形態では、免疫細胞は、同種異系細胞に由来する。

用語「自家」は、その物質がその個体に後に再導入されるべき同一個体に由来する任意の物質を指す。

用語「同種異系」は、物質が導入される個体と同一種の異なる個体に由来する任意の物質を指す。２体以上の個体は、１つ以上の遺伝子座にある遺伝子が同一ではない場合に相互に同種異系であると言われる。一部の態様では、同一種の個体由来の同種異系の物質は、抗原性で相互作用するには遺伝学的に十分に別個である。

細胞の製造
十分な治療用量の免疫細胞組成物を達成するためには、免疫細胞を生成するための方法は、典型的には、１ラウンド以上の刺激、活性化及び／又は増殖を包含した。本明細書に開示した方法に従うと、免疫細胞は、インビボ及びインビトロで活性化及び増殖するために刺激することができる。

従って、本明細書に開示した別の態様では、インビボでの免疫細胞の活性化及び増殖を刺激するための方法であって、対象に有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）本明細書に記載した二重特異性ポリペプチド又は医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドが、対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及びインビボで免疫細胞によって発現したＣＡＲ上の抗原に同時に結合する方法が提供される。

本明細書に記載した免疫細胞のインビボ活性化及び増殖は、免疫細胞の各治療用量のために必要とされる免疫細胞の数の減少を促進する。

別の態様では、免疫細胞のインビトロでの活性化及び増殖を刺激するための方法であって：（ｉ）ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体、及び（ｉｉ）本明細書に開示した二重特異性ポリペプチドを含む培養培地中でＣＡＲを発現する単離免疫細胞を培養するステップを含み、ここで二重特異性ポリペプチドが、ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体上で発現した抗原及び免疫細胞によって発現したＣＡＲ上の抗原に同時に結合する方法が提供される。

免疫細胞生成法は、本明細書では、極めて優れた治療用生成物である結果として生じる免疫細胞組成物に寄与する、単純及び堅牢な培養の開始及び活性化ステップを企図した。一実施形態では、培養の開始及び活性化は、細胞培養容器、例えば、細胞培養バッグ、ＧＲＥＸバイオリアクター、ＷＡＶＥバイオリアクター等において細胞集団を播種するステップ並びに一次及び共刺激免疫細胞シグナル伝達経路を通して免疫細胞を活性化するステップを含む。細胞組成物は、更に、１種以上の追加の増殖因子若しくはサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ７及び／又はＩＬ－１５又はそれらの任意の好適な組み合わせの存在下で更に培養され得る。

別の実施形態では、免疫細胞の活性化及び増殖は、単離免疫細胞をＡＰＣ若しくはＡＰＣ模擬体と培養するステップを含む。一実施形態では、ＡＰＣ若しくはＡＰＣ模擬体は、ドナー由来ＡＰＣ、合成人工的ＡＰＣ（ａＡＰＣ）、ＣＤ３及びＣＤ８のための活性化抗体を用いて官能化したマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、自家単球由来樹状細胞（ｍｏ－ＤＣ）及びＡＰＣを模擬するスカフォールドから成る群から選択される。

特定の実施形態では、培養の開始は、例えば１種以上の追加のサイトカイン、一次刺激性リガンド及び共刺激性リガンドを含有する好適な細胞培養培地中の細胞培養容器中でＴ細胞を含む細胞の集団、例えばＰＢＭＣを所望の密度、細胞１～５×１０^６個／ｍＬで播種するステップを含む。別の実施形態では、サイトカイン、刺激性及び共刺激性リガンドは、引き続いて細胞培養培地中のＰＢＭＣに添加することができる。

一実施形態では、細胞培養容器は、本明細書の他の場所で検討したように、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ細胞増殖バッグ、ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ細胞分化バッグ、ＥＸＰ－Ｐａｋ（商標）細胞増殖用バイオコンテナー、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）バッグ、ＫｒｙｏＶｕｅ（商標）バッグ、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）バッグ、ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ、Ｘ－Ｆｏｌｄ（商標）バッグ、Ｓｉ－Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ及びＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグを含むがそれらに限定されない細胞培養バッグである。

特定の実施形態では、細胞は、好適な細胞培養培地を含む細胞培養容器中で播種される。好適な細胞培養培地の具体的な例としては、無血清又は適切な量の血清（若しくは血漿）又は規定セットのホルモン及び／又は免疫細胞を成長及び増殖させるために十分な量のサイトカインが補給された何れかを含む、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミン類が添加されたＴＣＧＭ；２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５％のヒトＡＢ血清が補給されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５）、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖用ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）無血清培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０（Ｌｏｎｚａ）が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書で企図される細胞培養培地は、血清（例えば、胎児ウシ若しくはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－αを含むがそれらに限定されない１種以上の因子を更に含み得る。

一実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体は、ドナー由来ＡＰＣ、合成人工的ＡＰＣ（ａＡＰＣ）、ＣＤ３及びＣＤ８のための活性化抗体を用いて官能化したマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、自家単球由来樹状細胞（ｍｏ－ＤＣ）及びＡＰＣを模擬するスカフォールドから成る群から選択される。

当業者であれば、本明細書に記載した本発明は、詳細に記載した以外の変形及び修飾を受け易いことを理解するであろう。本発明が本発明の精神及び範囲内に含まれる全てのそのような変形及び修飾を含むことを理解すべきである。本発明は、本明細書に言及又は指示したステップ、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に、又は集合的に、並びに前記ステップ若しくは特徴の２つ以上の任意及び全ての組み合わせを更に含む。

他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

本明細書で可能にされる様々な実施形態について下記の非限定的な実施例によって詳細に記載する。

Ａ． 材料
細胞培養
Ｅ０７７１は、マウス乳癌細胞系であり（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，８：２３７－５１）、２４ＪＫは、メチルコラントレン誘導性線維肉腫であり（Ｓｈｉｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３７：２８６－９２）、及びＭＣ３８は、化学的誘導性結腸腺癌である（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：２４３４－９）。これらの細胞系はＣ５７ＢＬ／６マウスを起源とし、親細胞系は、マウス幹細胞ウイルスＬＴＲプロモーターの制御下でヒトＨｅｒ２抗原を発現するようにレトロウイルスによって形質移入された。これらのＨｅｒ２＋細胞系は、２４ＪＫ－Ｈｅｒ２、ＭＣ３８－Ｈｅｒ２及びＥ０７７１－Ｈｅｒ２と呼ばれる。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＡＮＣ１及びＡ５４９細胞系は、Ｈｅｒ２＋である。

全細胞系は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌの非必須アミノ酸、１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む補給物を含むＲＰＭＩ培地中において３７℃、５％のＣＯ２中で維持した。Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２は補給されたＤＭＥＭ中で培養したが、ＤＭＥＭはフラスコへの付着を強化した。

ＣＡＲ Ｔ細胞
ＰＢＭＣは、ヒト又はマウスドナーから採取した全血の軟膜から収集した。Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲレトロウイルスベクター若しくはコントロール空ベクターを用いたヒトＴ細胞の形質導入は、Ｒｉｔｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２１（１１）：２１２２－２９）に記載された方法に従って実施した。Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲレトロウイルスベクター若しくはコントロール空ベクターを用いたマウスＴ細胞の形質導入は、Ｍａｒｄｉａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に記載された方法に従って実施した。

他の免疫細胞
ＡＰＣは、照射ＰＢＭＣ、ＰＢＭＣからのＦＡＣＳ分別ＣＤ１９＋Ｂ細胞又は単球由来樹状細胞（Ｍｏ－ＤＣ）を用いて生成した。市販で入手できるキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、未成熟及び成熟ｍｏ－ＤＣの混合物中でｍｏ－ＤＣを生成した。

Ｂ． ＢＥＡＴの設計
ＢＥＡＴは、２つの抗体ｓｃＦｖドメインを単一ポリペプチド鎖内にフレキシブルリンカーを用いて結び付けることによって設計した。第１ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ４０（配列番号２）又はＭＨＣＩＩ（配列番号４）に特異的に結合するように設計した。ｃＤＮＡは、ＣＤ４０（ＦＧＫ４５）及びＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系から単離した。これらのモノクローナル抗体の可変Ｈ及びＬドメインをコードする遺伝子をクローン化し、ＡＰＣ特異的ｓｃＦｖを生成するために（Ｇ４Ｓ）３－リンカー配列によって遺伝的に融合させた。第２ｓｃＦｖドメインは、上述したＨｅｒ２特異的ＣＡＲのＣＤ３（配列番号６）又はｃ－ｍｙｃタグ（配列番号８）に特異的に結合するように設計し、ＣＡＲ特異的ｓｃＦｖは、同一方法を用いて生成した。

ＡＰＣ特異的ｓｃＦｖ及びＣＡＲ特異的ｓｃＦｖは、ＢＥＡＴをコードする遺伝子（配列番号１７及び１９）を生成するために組み換え的に連結された。

Ｃ． ＢＥＡＴの生成
ＢＥＡＴコーディング配列は、哺乳動物細胞培養中で天然タンパク質を高レベルで発現させるためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有するｐＣＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター内にクローン化した。インサートのコーディング配列は、標準プロトコールに従って検証した。ＢＥＡＴの迅速且つ超高収率のタンパク質産生を得る目的で哺乳動物細胞をトランスフェクトするために、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓ．Ａ．）及びリポフェクタミンを使用した。

ＢＥＡＴの細菌生成のためには、Ｇａｔｅｗａｙクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。従って、ｐＤＯＮＲ２２１ＺｅｏＢＥＡＴを作製するために、ＢＥＡＴコーディング配列をエントリープラスミド内に挿入した。次にコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換させ、ｐＤＯＮＲ２２１ＺｅｏＢＥＡＴを含有する陽性クローンを選択且つ配列決定した。その後、ｐＤＯＮＲ２２１ＺｅｏＢＥＡＴをｐＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターｐＥＴ１５ｂＧＷと組み合わせてｐＥＴ１５ｂＢＥＡＴを作製した。次にコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換させ、ｐＥＴ１５ｂＢＥＡＴを含有する陽性クローンを選択且つ配列決定した。次にｐＥＴ１５ｂＢＥＡＴをＢＬ２１ＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質変換させ、ＩＰＴＧを用いて誘導してＢＥＡＴポリペプチドを生成した。

Ｈｉｓタグを含有するＢＥＡＴポリペプチドは、Ｈｉｓ６０ Ｎｉ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂／Ｎｉｃｋｅｌビーズを用いて収集した。ＢＥＡＴの純度及び濃度は、６Ｈｉｓチェックキット（Ｃｉｓｂｉｏ）エレクトロフォレーシス及びウェスタンブロットを用いて試験した。

組み換えＢＥＡＴポリペプチドの結合を確証するためには、ＢＥＡＴは、蛍光染料とコンジュゲート化されるであろう。標識化ＢＥＡＴの結合は、フローサイトメトリーを用いて確証されるであろう。更に、本発明者らは、競合的結合アッセイを用いてＢＥＡＴ及び元のモノクローナル抗体が同一分子に結合することを確証するであろう。

化学的にコンジュゲート化したＢＥＡＴポリペプチドは、タンパク質－タンパク質コンジュゲーションキット（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調製した。手短には、ｍｙｃタグ（ＣＡＲ中に存在する）、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ２又はＣｌｅｃ９ａに対して特異的な抗体を脱塩し、ｚｅｂｒａカラムを用いて修飾用緩衝剤に濃縮した。

ＢＥＡＴポリペプチドを調製する場合、どちらもモル置換比５で、一方の抗体はＳ－ＨｙＮｉｃによって、他方の抗体はＳ－４ＦＢによって修飾した。抗体を室温で２．５時間に渡りＳ－ＨｙＮｉｃ又はＳ－４ＦＢと共にインキュベートした後、ｚｅｂｒａカラムを用いて修飾抗体を脱塩し、コンジュゲーション緩衝剤に移した。続いて、等モル量のＳ－ＨｙＮｉｃ及びＳ－４ＦＢ修飾抗体を一緒に混合し、１０倍のＴｕｒｂｏＬｉｎｋ触媒緩衝剤を混合物に１／１０の体積で添加した。タンパク質混合物を次に４℃で一晩インキュベートした。コンジュゲーションプロトコルの第２日に、凝集物を除去するために５０００ｇで５分間に渡り試料を遠心分離した。

抗体のコンジュゲーションは、エレクトロフォレーシス（ＮｕＰＡＧＥゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確証した。その後、コンジュゲート化生成物は、ＰＢＳ－／－に対する高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）上でＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。ＦＰＬＣを用いた精製後、化学的にコンジュゲート化したＢＥＡＴの異なる画分の分子量は、エレクトロフォレーシス（ＮｕＰＡＧＥ ｇｅｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確証した。一部の例では、精製化学的コンジュゲート化ＢＥＡＴは、Ｖｉｖａｓｐｉｎｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて更に濃縮した。

Ｅ． ＳＥＢの機能分析
ヒト又はマウスＴ細胞をＡＰＣ及びＳＥＢと共培養し、共培養の２４～７２時間後に細胞増殖、ＩＦＮ－γ分泌及び脾臓へのＴＣＲＶβ８^＋Ｔ細胞の浸潤について評価した。

ＳＥＢがＴ細胞増殖を増強することによってＣＡＲ Ｔ細胞治療有効性を増強できたかどうかを決定するために、本発明者らは、３種の異なるマウス癌モデルＥ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌、２４ＪＫ－Ｈｅｒ２肉腫及びＨｅｒ２トランスジェニックマウスに移植されたＭＣ３８－Ｈｅｒ２癌腫について試験した。これらの免疫応答性Ｈｅｒ２トランスジェニックマウスは、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターの制御下で正常乳房及び大脳内でヒトＨｅｒ２を発現するので、それらはＨｅｒ２＋細胞系に対して耐性である（Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７１：５７８７－９４）。Ｈｅｒ２＋腫瘍が定着したら、ＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入し、ＳＥＢの２回の投与は、同日及び５日後にｉ．ｐ．投与した。

Ｆ． ＢＥＡＴの機能分析
細胞増殖にＢＥＡＴが及ぼす作用を評価するために、化学的にコンジュゲート化された二重特異性ポリペプチドを抗ＣＤ４０／抗ｍｙｃ抗体から生成した。上述したＨｅｒ２特異的ＣＡＲ上に既に存在するｃ－ｍｙｃタグは、ＣＡＲ特異的抗原として機能した。

Ｔ細胞、ＢＥＡＴ及びＡＰＣは、共培養され、Ｔ細胞及びＡＰＣ上の機能的変化を確証するためには多数のアッセイが使用されるであろう。細胞増殖（トリチウム化チミジン組み込み、ＣＦＳＥ標識化及び細胞計数）、サイトカイン分泌（ＥＬＩＳＡ、サイトカイン・ビーズアレイアッセイ及び細胞内染色）及び細胞活性化／分化状態（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＣＲ７を含むマーカー）は、共培養の２４～７２時間後に計測されるであろう。

ＢＥＡＴによって刺激されたＴ細胞の細胞傷害性能力は、細胞溶解について試験するためのクロム遊離アッセイ、Ｔ細胞上のグランザイムＢ及びＣＤ１０７ａ染色、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／７ＡＡＤ並びにリアルタイムアポトーシス／ネクローシス分析（ＲｅａｌＴｉｍｅ－Ｇｌｏ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアポトーシス及びネクローシスアッセイキット、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む一連のアッセイを用いて評価されるであろう。特異性を決定するためには、適切なＢＥＡＴ、Ｔ細胞及び腫瘍細胞コントロールが使用されるであろう。

ＢＥＡＴ生成ＣＡＲ Ｔ細胞が様々な固形腫瘍細胞系に対して応答する能力を決定するために、本発明者らは、免疫欠損性マウスにおける移植後の標的として、Ｈｅｒ２陽性ヒト細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌、ＰＡＮＣ１膵臓癌及びＡ５４９肺癌細胞系（又はコントロール）又はＨｅｒ２トランスジェニックマウスにおけるＥ０７７１－Ｈｅｒ２、ＭＣ３８－Ｈｅｒ２、２４ＪＫ－Ｈｅｒ２マウス腫瘍細胞系を使用するであろう。Ｈｅｒ２＋腫瘍が定着したら、ＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入し、ＢＥＡＴの２回の投与は、同日及び５日後にｉ．ｐ．投与される。

結果
哺乳動物系を用いたＢＥＡＴの生成
哺乳動物系は、可溶性形態にあるＢＥＡＴを生成するために使用することができ、適切な翻訳後修飾の利点を有するが、収率は相当に低い（即ち、細胞１０^８個当たり１ｎｍｏｌ未満のｓｃＦｖタンパク質を生成した）。

Ｅｘｐｉ２９３細胞発現系を用いると、ＣＤ３に対してｓｃＦｖを生成するのに成功した（ＣＡＲ－特異的；配列番号６；図１）。全長ＢＥＡＴは、リポフェクタミン（図２）及びｊｅｔＰＥＩ（図３）系の両方を用いてＢＥＡＴ２（ＭＨＣＩＩ／ｃ－ｍｙｃ）；配列番号１８）及びＢＥＡＴ３（ＣＤ４０／ＣＤ３；配列番号２０）に対して生成した。しかしながらｊｅｔＰＥＩ系は、細胞均質化後の組み換えＢＥＡＴより効率的な遊離を可能にした（図４）。

ＳＥＢはインビトロでのＴ細胞増殖及びＩＦＮ－γ分泌を増強した
ＳＥＢは、ＡＰＣ上のペプチド結合溝及び特にＴＣＲ Ｖβ鎖、特にマウスにおけるＶβ３、７、８及び１７を有するＴ細胞上のＴＣＲの外側でＭＨＣＩＩ分子に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドである。ＭＨＣＩＩ及びＴＣＲへのＳＥＢの同時結合は、極めて多数のＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞を刺激し、それらの活性化及び増殖をもたらす。ＭＨＣＩＩによって提示された従来型抗原は０．０００１～０．００１％のＴ細胞を活性化するが、他方ＳＥＢ等の二重特異性ポリペプチドは、全Ｔ細胞の２～２０％を刺激する（Ｆｒａｓｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｆｔ，２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２５：２２６－４３；Ａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９９（１）：１５７－６８）。従って、ＳＥＢは、インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞を活性化及び増殖させるための戦略を開発するための概念実証の分子として使用されたが、しかしながら、本明細書に記載したアプローチ及び試薬は、最小傷害性を備えるより制御された方法でこの目的を達成する。

ＳＥＢとのインキュベーション後、マウス及びヒトＴ細胞は有意により大きな程度まで増殖し（図５Ａ）、及びＳＥＢが存在する場合はより多量のＩＦＮ－γを分泌した（図５Ｂ）。ＳＥＢを定着Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌を有するマウスに注射すると、脾臓内のＴＣＲ－Ｖβ８＋（ＳＥＢ係合のためのＴＣＲβ型の１つ）細胞のパーセンテージは、非処理群（図５Ｃ）におけるより有意に高かった（図５Ｃ）。

驚くべきことに、腫瘍増殖は、ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入及びＳＥＢの２回の投与後に全３種のマウスモデルにおいて有意に阻害され、マウスの３０～５０％は腫瘍がない状態になり、長期生存を獲得した（図６）。腫瘍は、ＣＡＲ Ｔ細胞又はＳＥＢ単独の投与を受けたマウスと比較した場合に、ＣＡＲ Ｔ細胞及びＳＥＢの組み合わせの投与を受けているマウスにおいて有意により大きな程度まで阻害された。

腫瘍の抑制率は、腫瘍部位内へのＣＡＲ Ｔ細胞浸潤における＞１０倍の増加と関連していた（図７）。ＳＥＢの係合のための正しいＶβタイプであった用量当たりのＣＡＲ Ｔ細胞の数は、およそ２×１０^５（形質移入された全ＣＡＲ Ｔ細胞の１０％）であると推定された。免疫応答性モデルにおけるそのような低有効用量のＣＡＲ Ｔ細胞を用いて観察された、傷害性を伴わない高度の腫瘍阻害は、ＣＡＲ Ｔ細胞についての他の公知の有効量と比較して有意且つ予想外の結果を提示し、ＣＡＲ Ｔ細胞とＡＰＣとの係合が非ＭＨＣ制限法又は非Ｖβ制限法で発生する場合にはより大きな有効性さえ可能であることを示唆している。

ＢＥＡＴによるＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び増殖
重要なことに、ＣＡＲ Ｔ細胞への抗ｍｙｃの結合がＣＡＲ媒介性Ｔ細胞機能を妨害しないことが確証された（図８）。更に、化学的にコンジュゲート化した二重特異性ポリペプチドは、インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞増殖を極めて大きく増強したこともまた証明された（図９）。対照的に、同一モル濃度での２つの単一抗体の組み合わせは、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖を媒介しなかった。これらのデータは、二重特異性ポリペプチドがＡＰＣにＣＡＲ Ｔ細胞と共に係合すること、及びこの係合が増強したＣＡＲ Ｔ細胞増殖をもたらすことを示唆している。

ＢＥＡＴは、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び増殖を媒介する
ＢＥＡＴの３つの例は、ｍｙｃタグ（ＣＡＲ中に存在する）に対して特異的な抗体を様々なサブセットのＡＰＣ上で発現しているＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ２又はＣｌｅｃ９ａ何れかに対して特異的である抗体に化学的にコンジュゲート化させることによって生成した。マウスＣＡＲ Ｔ細胞をＢＥＡＴの存在下又は非存在下において（ＡＰＣの起源としての）マウス脾細胞と共にインキュベートした。ＣＡＲの発現が欠如するＴ細胞をコントロールとして使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞と非コンジュゲート化抗体の存在下でのＡＰＣとのインキュベーションもまたコントロールとして使用した。

図１０に示した結果は、各ＢＥＡＴの存在下においてＣＡＲ Ｔ細胞はＩＦＮ－γを分泌するがコントロールＴ細胞は分泌しないことを証明している。（図１０Ａ）。

ＣＡＲ Ｔ細胞は、蛍光色素ＣＦＳＥを装填し、各代替ＢＥＡＴの存在下又は非存在下においてＡＰＣと共にインキュベートした。増殖の程度は、コントロール非形質移入Ｔ細胞と比較して形質移入ＣＡＲ Ｔ細胞の蛍光強度における減少から明らかである（図１０Ｂ）。

これらをまとめると、これらの結果は、ＢＥＡＴがＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、それらの増殖を誘導できることを証明している。更に、様々なＡＰＣ分子及びＡＰＣサブセットがＢＥＡＴの標的として使用できることを示している。

ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴはマウスにおけるＥ０７７１－Ｈｅｒ２乳癌の根絶を可能にする
定着皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するＨｅｒ２－トランスジェニックマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）及び／又はｍｙｃ－ＣＤ４０に対して特異的なＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療した。他のマウス群は、非コンジュゲート化抗ｍｙｃ及び抗ＣＤ４０抗体の投与を受けた、又は非治療に置かれた（コントロール）。

図１１の結果は、ＣＡＲ Ｔ細胞と結び付けたＢＥＡＴの投与後の腫瘍増殖及びマウス生存率を示している。このデータは、正常乳腺及び脳においてＨｅｒ２を発現する免疫応答性マウスにおける定着乳癌腫瘍のＣＡＲ Ｔ細胞媒介性根絶を可能にするＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ の能力を証明している。

ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴは腫瘍内でのＴ細胞の蓄積を可能にする
皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスは、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）をＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ、ｉ．ｐ）の投与と一緒に受けた。他のマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくはＢＥＡＴ単独の投与を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）。

治療開始後第７日に、腫瘍を採取し、分離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。１群当たり３匹の個別マウスを表すデータ。腫瘍をホルマリン固定し、切片作製し、ＤＡＰＩ（青色）及び抗ＣＤ８（褐色）により染色した。列挙した治療を受けているマウスからの３切片を表す画像を示した。

図１２に示した結果は、ＢＥＡＴが、ＢＥＡＴの非存在下におけるよりはるかに大きな程度までＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍内で蓄積することを可能にする能力を証明している。

ＣＡＲ Ｔ細胞はマウスにおいて長期間存続する
脾臓は、ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴによるＥ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍の根絶後に長期間（＞２００日間）生残しているマウス又はナイーブマウスから採取し、ＣＡＲ Ｔ細胞を検出するために抗ｍｙｃ及びＣＤ８により染色した。マウス３匹を表すデータ。

図１３に示したデータは、ＢＥＡＴがマウスにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の長期存続を可能にする能力を証明しており、これはマウスが腫瘍再投与から保護されるであろうことを示唆している。

ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＢＥＡＴ療法後にＨｅｒ２－陽性腫瘍を拒絶したマウスはＨｅｒ２陽性腫瘍による再投与に対して完全に抵抗性である
Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴによって媒介された皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を根絶した長期生存マウスを同一のＨｅｒ２陽性腫瘍細胞（５×１０^５）を用いて反対側の側腹上で皮下注射により再投与した。腫瘍増殖率（上のパネル）及びマウス生存率（下のパネル）は、図１４に示した。腫瘍増殖は、コントロールとしてのナイーブマウスにおいて描出した。（再投与群のマウス８匹及びコントロール群の６匹、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

これらのデータは、ＣＡＲ Ｔ＋ＢＥＡＴ療法後に（移植された）存続しているＣＡＲ Ｔ細胞がＨｅｒ２陽性腫瘍のその後の再発に対して応答できるという結論を支持している。

Ｈｅｒ２陰性腫瘍増殖はＣＡＲ Ｔ細胞及びＢＥＡＴ療法によって媒介されたＨｅｒ２－陽性腫瘍を拒絶したマウスでは阻害される
以前にＨｅｒ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴの投与を受けた後にＥ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を拒絶していたマウスにＨｅｒ２発現が欠如するＥ０７７１（細胞５×１０^５個）を反対側の側腹上に再投与した。ナイーブマウスにおける腫瘍増殖をコントロールとして示した。腫瘍増殖率（上のパネル）及びマウス生存率（下のパネル）は、図１５に示した（再投与群のマウス４匹及びコントロール群のマウス５匹、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

これらのデータは、ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＢＥＡＴ療法がエピトープ拡散を誘導し、それによりＨｅｒ２とは異なる他の特異性のＴ細胞が誘導され、これが抗腫瘍活性に参加し得ることを示唆している。

ＣＤ４０－ｍｙｃコンジュゲート化ＢＥＡＴと組み合わせた抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲ Ｔ細胞がマウスにおけるＭＣ３８－Ｈｅｒ２結腸癌の増殖を阻害する
定着皮下ＭＣ３８－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスを抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^６、ｉ．ｖ．）及びＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（第０日に３６μｇ）により治療した。他のマウス群は、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくは（列挙した）抗体単独の投与を受けた、又は非治療で置かれた（コントロール）。（マウス７匹を有していたＢＥＡＴ＋ＣＡＲ群を除き、１群当たりマウス６匹。^＊＊ｐ＜０．０１）。

図１６に示した結果は、乳癌以外の腫瘍タイプがＣＡＲ Ｔ細胞＋ＢＥＡＴを用いて制御され得ることを示している。

ＰＤ－Ｌ２－ｍｙｃ及びＣｌｅｃ９ａ ＢＥＡＴコンジュゲートは腫瘍増殖のＣＡＲ Ｔ細胞による阻害を可能にする
ＡＰＣ発現分子であるＰＤ－Ｌ２又はＣｌｅｃ９ａに対して特異的なＢＥＡＴは、モノクローナル抗体の抗ｍｙｃ抗体への化学的コンジュゲート化によって調製した。定着皮下Ｅ０７７１－Ｈｅｒ２腫瘍を有するマウスは、列挙した治療を受けた、又は非治療のまま置かれた（コントロール）（１群当たり３～６匹、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。

図１７に示した結果は、様々なＡＰＣサブセット上で見出される数種の異なる分子に対して特異的なＢＥＡＴがマウスにおける腫瘍に対するＣＡＲ Ｔ細胞応答を増強できることを証明している。

組み換えヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴはヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を媒介する
ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲのレトロウイルス導入を用いてヒト末梢血から生成した。ＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０^５／ｍｌ）をＣＦＳＥにより標識し、ＡＰＣの起源としての５Ｇｙ照射ＣＴＶ標識ヒト血液白血球の存在下において、化学的にコンジュゲート化させた、又は組み換えＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴ（コンジュゲート化３μｇ／ｍｌ、組み換え０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、又は用いずに５日間インキュベートした。空ベクターを用いて形質移入したＴ細胞は、コントロールとして機能した。細胞は、フローサイトメトリーを用いて分析した。

図１８に示した結果は、抗ヒトＣＤ４０を用いて抗ｍｙｃに連結したＢＥＡＴがヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を媒介できることを証明している。その結果は更に、組み換えＢＥＡＴがＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を媒介することに関して化学的にコンジュゲート化したＢＥＡＴと同様に有効であることも証明している。

組み換えヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴは、ＣＡＲ Ｔ細胞からのＩＦＮ－γ分泌を増強する
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、抗Ｈｅｒ２ ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを用いて末梢血から生成した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、化学的に又は組み換えにより調製したＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴの存在下又は非存在下において５日間に渡りＡＰＣの起源としてのヒト血液白血球と共にインキュベートした。抗ＣＤ３は、陽性コントロールとしての一部の培養ウエル内に含めた。上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ－γについて分析した。

図１９に示したように、組み換えＢＥＡＴは、ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ－γを分泌させることができる。

コンジュゲート化ヒトＢＥＡＴと組み合わせたヒトＣＡＲ Ｔ細胞はマウスにおける腫瘍増殖を阻害する
定着皮下ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳腺腫瘍を有するＮｏｄ－ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスは、コンジュゲート化ヒトＣＤ４０－ｍｙｃ ＢＥＡＴを含む又は含まないＣＡＲ Ｔ細胞の投与を受けた（第０日、３６μｇ、ｉ．ｐ．）。ＡＰＣの起源として機能させるために、ヒト血液由来白血球（１×１０^６）もまた静脈内注射により送達した。１群のマウスは、コントロールとして非治療のまま置かれた（１群当たりマウス５匹、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。

図２０に示したデータは、マウスにおいて定着したヒト癌に対するヒトＣＡＲ Ｔ細胞の効力を増強する能力を証明している。

ＣＡＲ内の様々な位置に所在する一連の抗原に対して特異的なＢＥＡＴはＣＡＲ Ｔ細胞からの応答を誘導することができる
ＣＡＲ内の一連の抗原に対して特異的なＢＥＡＴの能力は、ＣＡＲ内の異なる場所に組み込まれた抗原（即ち、親和性タグ）を備えるＣＡＲを生成することによって評価した。特に、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的ＣＡＲは、ＣＡＲ内の中心に所在するｍｙｃ抗原を組み込むことによって調製し、Ｈｅｒ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲは、ＣＡＲのアミノ末端内にＦＬＡＧ抗原を組み込むことによって調製した。

ＣＥＡ－ｍｙｃ ＣＡＲ又はＨｅｒ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲを有している５×１０^５個のマウスＣＡＲ Ｔ細胞を５×１０^５個のＣＤ４０陽性マウス脾細胞（ＡＰＣの起源として）と共に抗ｍｙｃ抗体に対するモノクローナル抗体の化学的コンジュゲート化によって調製したＡＰＣ発現分子ＣＤ４０に対して特異的なＢＥＡＴ（ＢＥＡＴ１；本明細書の別の場所で記載）又は抗ＦＬＡＧ抗体に対するモノクローナル抗体の化学的コンジュゲート化によって調製したＡＰＣ発現分子ＣＤ４０に対して特異的なＢＥＡＴ（ＢＥＡＴ５）の存在下又は非存在下でインキュベートした。非形質移入脾細胞をコントロールとして使用した。ＣＡＲ Ｔ細胞と非コンジュゲート化抗体の存在下でのＡＰＣとのインキュベーションもまたコントロールとして使用した。ＩＦＮ－γの分泌は、共培養の７２時間後にＥＬＩＳＡによって決定した。

図２１に示した結果は、ＣＥＡ－ｍｙｃ ＣＡＲ Ｔ細胞がコントロールと比較すると、ＢＥＡＴ１の存在下でＩＦＮ－γを分泌したことを証明している。同様に、ＨＥＲ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲ Ｔ細胞は、コントロールと比較すると、ＢＥＡＴ５の存在下でＩＦＮ－γを分泌した。

これらの結果は、ＢＥＡＴがＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を向上させることに幅広い用途を有することを証明している。第一に、ＢＥＡＴは、ＣＡＲ Ｔ細胞からの応答を誘導することが証明されてきたが、ここでＣＡＲ Ｔ細胞は、様々な腫瘍関連抗原に向けられる。

第二に、ＢＥＡＴは、様々な組織タイプにおいて発生する癌の状況においてＣＡＲ Ｔ細胞が使用される場合に、Ｔ細胞からの応答を誘導することが証明されている。

ＢＥＡＴの広範な有用性は、ＣＡＲ Ｔ療法の状況において様々な異なるＣＡＲの構造の有効性を増加させるために、ＢＥＡＴの設計を修飾することが可能であるという事実によって更に証明されている。例えば、本明細書に提示した結果は、ＢＥＡＴがＣＡＲ上の様々な抗原に結合し、ＣＡＲ Ｔ細胞からの応答を誘導する能力を保持するように設計され得ることを証明している。従って、ＣＡＲ内の一連の抗原は、ＢＥＡＴの標的として使用することができる。

重要なことには、更に、ＣＡＲ上の抗原の場所をＢＥＡＴの有効性に有意に影響を及ぼすことなく変化させられることもまた証明されてきた。より特別には、中央に所在するｍｙｃタグ（即ち、Ｈｅｒ２－ｍｙｃ及びＣＥＡ－ｍｙｃ ＣＡＲ）及びＮ末端に所在するＦＬＡＧエピトープ（即ち、Ｈｅｒ２－ＦＬＡＧ ＣＡＲ）は、どちらもＢＥＡＴにとっての有用な結合標的であることが明らかになった。これらのデータは、ＣＡＲ内の様々な位置に所在する抗原がＣＡＲ Ｔ細胞応答を誘導するために有効であることも更に証明している。

結論
本明細書に提示した結果は、ＣＡＲ Ｔ療法の有効性を増加させるために広範囲の様々なＣＡＲ構造と結び付けて使用できるように、ＢＥＡＴを設計且つ特別仕立てできることを証明している。

本試験で生成した二重特異性ポリペプチド（即ち、ＢＥＡＴ）は、ＡＰＣの係合を通してＣＡＲ Ｔ細胞を活性化及び増殖させることに効果的であることが証明されている。更に、ＢＥＡＴは、様々な腫瘍抗原及び／又はＣＡＲ内の異なる位置での様々な異なる抗原を標的とする場合に有効であることが証明されている。このアプローチは、ＭＨＣハプロタイプに関する制限がないので、Ｔ細胞療法を支持する他の方法に比して特に有利である。

ＢＥＡＴの薬物動態学は、有利にも、「要求に応じた」活性化及び増殖を誘導し、それにより抗腫瘍有効性の要求をワクチン等のＣＡＲ Ｔ細胞支持の他の方法を用いては達成されていない正常組織に対する傷害性を制御しながらバランスを取ることによってＣＡＲ Ｔ細胞全体へのより高度の制御を可能にする。

Claims (44)

1. 第１結合ドメイン及び第２結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドであって、前記第１結合ドメインは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現する抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片であり、及び前記第２結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞上の抗原に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片である二重特異性ポリペプチド。
2. 前記第２結合ドメインは、前記免疫細胞によって発現した前記ＣＡＲ上の抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性ポリペプチド。
3. 前記ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞から成る群から選択されるプロフェッショナルＡＰＣであり、好ましくは、前記ＡＰＣは樹状細胞である、請求項１又は２に記載の二重特異性ポリペプチド。
4. 前記第１結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
5. 前記第２結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む、請求項１～４の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
6. 前記第１結合ドメインは、ＭＨＣＩＩ、Ｃｌｅｃ９ａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ガレクチン、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４０及びＣＤ８３から成る群から選択される前記ＡＰＣ上で発現した抗原に特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
7. 前記ＡＰＣは、腫瘍細胞又は癌細胞ではない、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド。
8. 前記ＡＰＣ上で発現した前記抗原は、腫瘍関連抗原ではない、請求項６又は７に記載の二重特異性ポリペプチド。
9. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）及び制御性Ｔ細胞から成る群から選択される、請求項１～８の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
10. 前記免役細胞は、Ｔ細胞である、請求項９に記載の二重特異性ポリペプチド。
11. 前記第２結合ドメインは、前記ＣＡＲ上の親和性タグに特異的に結合する、請求項１～１０の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
12. 前記第２結合ドメインは、免疫細胞上の親和性タグに特異的に結合する、請求項１～１０の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
13. 前記第２結合ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合する、請求項１及び３～１０の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
14. 前記第２結合ドメインは、ｃ－ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｅＸＡＣＴタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ又はＧＦＰタグから選択される親和性タグに特異的に結合する、請求項２～１２の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
15. 前記親和性タグは、ｃ－ｍｙｃタグである、請求項１４に記載の二重特異性ポリペプチド。
16. 前記第１結合ドメインは、配列番号２若しくは４から成る群から選択されるアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１５の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
17. 前記第２結合ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の二重特異性ポリペプチド。
18. 前記第２結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１、１４及び１５の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
19. 前記第１及び第２結合ドメインを連結するフレキシブルリンカーを更に含み、前記リンカーは、配列番号１０、１２若しくは１４から成る群から選択されるアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１８の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
20. 前記第１及び第２結合ドメインは、化学的にコンジュゲートされている、請求項１～１８の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
21. 配列番号１６及び１８から成る群から選択されるアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１、１４及び１５の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
22. 配列番号２０及び２２から成る群から選択されるアミノ酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、３～１０及び１３の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
23. 約５時間～約１５時間の血漿半減期を特徴とする、請求項１～２２の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
24. 前記血漿半減期が約１０時間～約１２時間である、請求項２３に記載の二重特異性ポリペプチド。
25. 請求項１～２４の何れか一項に記載の二重特異性ポリペプチドをコードする核酸配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列。
26. 配列番号１５、１７、１９又は２１から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列又はそれとの少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の核酸配列。
27. 制御配列に作動可能に連結した請求項２５又は２６に記載の核酸配列を含むベクター。
28. 配列番号２３～２６から成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載のベクター。
29. 請求項２７又は２８に記載の前記ベクターを含む細胞。
30. 二重特異性ポリペプチドを生成するための方法であって：（ｉ）前記二重特異性ポリペプチドを発現させるために好適である培養培地中及び条件下で請求項２９に記載した細胞を培養するステップ；及び（ｉｉ）前記二重特異性ポリペプチドを前記細胞又は前記培養培地から単離するステップを含む方法。
31. 請求項１～２４の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
32. 癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）請求項１～２４の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチド又は請求項３１に記載の前記医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで前記二重特異性ポリペプチドは、癌を治療するためのインビボでの前記免疫細胞の前記活性化及び増殖を刺激するために、前記対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及び前記免疫細胞によって発現した前記ＣＡＲ上の抗原に同時に結合する方法。
33. インビボでの免疫細胞の前記活性化及び増殖を刺激するための方法であって、対象に有効量の：（ｉ）ＣＡＲを発現する免疫細胞；及び（ｉｉ）請求項１～２４の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチド又は請求項３１に記載の前記医薬組成物を共投与するステップを含み、ここで前記二重特異性ポリペプチドは前記対象の内因性ＡＰＣ上で発現した抗原及び前記免疫細胞によって発現した前記ＣＡＲ上の抗原に同時に結合し、それにより前記免疫細胞のインビボでの前記活性化及び増殖を刺激する方法。
34. インビトロでの免疫細胞の前記活性化及び増殖を刺激するための方法であって：（ｉ）ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体、及び（ｉｉ）請求項１～２３の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチドを含む培養培地中でＣＡＲを発現する単離免疫細胞を培養するステップを含み、ここで前記二重特異性ポリペプチドは、前記ＡＰＣ又はＡＰＣ模擬体上で発現した抗原及び前記免疫細胞上で発現した前記ＣＡＲ上の抗原に同時に結合し、それによりインビトロでの前記免疫細胞の前記活性化及び増殖を刺激する方法。
35. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＴＩＬ及び制御性Ｔ細胞から成る群から選択される、請求項３２～３４の何れか一項に記載の方法。
36. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記免疫細胞は、自家細胞に由来する、請求項３２～３６の何れか一項に記載の方法。
38. 前記免疫細胞は、異種同系細胞に由来する、請求項３２～３６の何れか一項に記載の方法。
39. 前記二重特異性ポリペプチドは、ＭＨＣ－ハロタイプ非依存方法で前記免疫細胞の前記活性化及び増殖を刺激する、請求項３２～３８の何れか一項に記載の方法。
40. 前記二重特異性ポリペプチドは、任意選択的に樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞から成る群から選択される、前記対象の前記内因性プロフェッショナルＡＰＣに特異的に結合する、請求項３２～３９の何れか一項に記載の方法。
41. 前記二重特異性ポリペプチドは、腫瘍細胞又は癌細胞上の抗原に結合しない、請求項４０に記載の方法。
42. 前記二重特異性ポリペプチドによって結合される前記抗原は、腫瘍関連抗原ではない、請求項３２～４１の何れか一項に記載の方法。
43. 癌を治療するための医薬品の製造における、請求項１～２４の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチド又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
44. 癌の治療において使用するための、請求項１～２４の何れか一項に記載の前記二重特異性ポリペプチド又は請求項３１に記載の医薬組成物。

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