CN115003386A - 产生抗cd3 scfv和细胞因子的人工抗原呈递细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明包括利用人工抗原呈递细胞(aAPC)扩增T细胞的组合物和方法，人工抗原呈递细胞(aAPC)包含对CD3具有特异性的嵌合受体分子。

Description

产生抗CD3 SCFV和细胞因子的人工抗原呈递细胞
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)享有2019年11月27日提交的美国临时专利申请第62/941,062号的优先权，在此通过引用以其全部内容并入本文。
背景技术
涉及T淋巴细胞(T细胞)的引发和扩增的免疫疗法有望有效治疗癌症和传染病。目前在癌症和病毒感染患者中过继转移疗法的临床应用通常涉及在自体树突细胞(DC)、病毒感染的B细胞和/或同种异体饲养细胞上输注已在体外刺激、克隆和扩增数周的T细胞。然而，过继性T细胞免疫疗法临床试验通常需要每位患者数十亿个细胞。为了产生这些数量的细胞，T细胞必须在体外进行多倍扩增，需要多达40次群体倍增。此外，为了在再输注时获得最佳植入潜力和可能的治疗益处，重要的是要确保扩增的T细胞保持功能并且不会衰老或衰竭。
扩增用于过继免疫疗法的T细胞克隆和/或细胞系的方法已被证明具有某些缺点。纯 CD8+细胞的标准培养受到细胞凋亡、生物功能降低和/或增殖的限制，并且获得足够数量的有用细胞特别困难。事实上，可能目前输注到患者体内的这种T细胞具有有限的复制能力，并因此无法稳定地移植以提供对疾病的长期保护。此外，可用于扩增人类T细胞的各种技术主要依赖于使用辅助细胞(即，支持或促进T细胞存活和增殖的细胞，诸如PBMC、 DC、B细胞、单核细胞等)和/或外源性生长因子，诸如白细胞介素2(IL-2)、IL-7和IL-15。对辅助细胞的需求对于长期培养系统来说是一个重大问题，因为这些细胞的寿命相对较短。因此，在长期培养系统中，必须不断获得和补充APC。辅助细胞的可再生供应的必要性对于治疗影响辅助细胞的免疫缺陷是有问题的。同样，需要外源性细胞因子混合物来支持培养的T细胞的扩增和功能大大增加了成本，尤其是在需要稳定的GMP级材料来源时。
因此，需要提供刺激T细胞以对抗各种急性和慢性疾病并传播足够数量的治疗性T细胞用于过继性免疫疗法的方法。本发明解决了这种需要。
发明内容
如本文所述，本发明涉及对CD3具有特异性的单链可变片段(scFv)和包含抗CD3scFv 的人工抗原呈递细胞(aAPC)，以及包含所述aAPC和aAPC衍生的膜囊泡的组合物，以及扩增包含所述抗CD3 scFv的T细胞、人工APC、aAPC衍生的膜囊泡及其组合物的方法。
如此，在一个方面中，本发明包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方式中，所述scFv包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述非人类灵长类动物是食蟹猴。
在一些实施方式中，所述非人类灵长类动物是猕猴。
根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子还包含细胞内结构域。
在一些实施方式中，所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
在一些实施方式中，所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
在一些实施方式中，所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，抗原结合结构域对人 CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含 SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
在一些实施方式中，所述scFv包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子还包含铰链结构域。
在一些实施方式中，所述铰链结构域是CD8铰链结构域。
在一些实施方式中，所述铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子包含SEQ ID NO:23或24所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子由包含SEQ ID NO：25或26所示的核酸序列的核酸编码。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子由SEQ ID NO：23或24所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子由SEQ ID NO：25或26所示的核酸序列组成的核酸编码。
在一些实施方式中，所述嵌合受体分子是组成型表达的。
在一些实施方式中，所述aAPC是工程化的K562细胞。
在一些实施方式中，所述工程化的K562细胞不内源性表达选自以下的一种或多种分子：HLA I类、HLA II类、CD1d、CD16、CD64、CD83、CD86、4-1BBL、OX40L、ICOSL、 CD40L、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。
在一些实施方式中，所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体。
在一些实施方式中，所述Fc受体是CD64.
在一些实施方式中，所述aAPC还包含在细胞表面表达的共刺激分子。
在一些实施方式中，所述共刺激分子是CD86。
在一些实施方式中，所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体和在细胞表面表达的共刺激分子。
在一些实施方式中，所述Fc受体是CD64，和所述共刺激分子是CD86。
在一些实施方式中，所述aAPC载有抗体，其中所述抗体的Fc片段与所述Fc受体结合。
在一些实施方式中，所述抗体对选自以下的分子具有特异性：CD3、CD28、PD-1、B7-H3、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HLA-DR、MHCII、Toll配体受体和LFA-1。
在一些实施方式中，所述aAPC还包含共刺激配体。
在一些实施方式中，所述共刺激配体选自CD7、B7-1(CD80)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6、以及与B7-H3特异性结合的配体。
在一些实施方式中，所述共刺激配体是4-1BBL。
在上述方面的一些实施方式或本发明的任何其他方面或实施方式中，所述aAPC表达选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-35和TGF-β。
在上述方面的一些实施方式或本发明的任何其他方面或实施方式中，所述aAPC表达 IL-7。
在上述方面的一些实施方式或本发明的任何其他方面或实施方式中，所述aAPC表达 IL-15。
在上述方面的一些实施方式或本发明的任何其他方面或实施方式中，所述aAPC表达 IL-7和IL-15。
在上述方面的一些实施方式或本发明的任何其他方面或实施方式中，所述aAPC表达 IL-15R。
在一些优选实施方式中，所述IL-15R是IL-15Rα。
在一些优选实施方式中，所述细胞因子是组成型表达的。
在另一方面，本发明包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
在另一方面，本发明包括人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含 SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
在一些实施方式中，所述aAPC还包括IL-15R。
在一些实施方式中，所述IL-15R是IL-15Rα。
在另一方面，本发明包括包含任一前述权利要求所述的aAPC的组合物。
在一些实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与本公开的任何上述方面或任何方面或实施方式的人工呈递细胞(aAPC)接触。
在一些实施方式中，所述T细胞是自体T细胞。
在一些实施方式中，所述T细胞是人T细胞。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增调节T细胞(Treg)的方法，包括使所述Treg与本公开的任何上述方面或任何其他方面或实施方式的人工呈递细胞(aAPC)接触。
在一些实施方式中，所述调节T细胞是人T细胞。
在一些实施方式中，所述调节T细胞是非人灵长类动物T细胞。
在一些优选实施方式中，所述非人类灵长类动物是食蟹猴。
在一些优选实施方式中，所述非人类灵长类动物是猕猴。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和；
CD64；
CD86；
4-1BBL；
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
在另一方面，本发明包括包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，和
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
在另一方面，本发明包括包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与本发明的上述方面或任何其他方面或实施方式的组合物接触。
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过氮空化来完成
在另一方面，本发明包括刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15,
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
在一些实施方式中，所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的具体实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，附图中示出了示例性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
图1A-1C说明了表达OKT3 CAR的K562人工抗原呈递细胞(aAPC)的开发。图1A是详细说明产生表达OKT3 CAR的K562细胞的步骤的流程图。图1B是一组流式细胞术图，说明了表达OKT3 CAR的转导的K562细胞(K562.OKT3)。图1C是一组流式细胞仪术图，说明了表达CD64、CD86和OKT3 CAR的转导的K562细胞(K562.64.86.OKT3)。结果与未转导的对照(UTD)进行比较。
图2说明了OKT3 CAR构建体在新创建的K562.OKT3细胞系的各种克隆中的表达。直方图表明了流式细胞术评估的CD3 CAR构建体的表达水平。图例表明对应于CD3 CAR 染色的通道中每个克隆的平均荧光强度(MFI)。方框和箭头表明选择显示最高MFI的克隆 (克隆4和5)用于进一步开发。
图3说明了OKT3 CAR构建体在新创建的K562.64.86.OKT3细胞系的各种克隆中的表达。直方图表明了流式细胞术评估的CD3 CAR构建体的表达水平。图例表明CD3 CAR染色通道中每个克隆的平均荧光强度(MFI)。方框和箭头表明选择显示最高MFI的克隆(克隆 8和11)用于进一步开发。
图4说明了K562.OKT3和K562.64.86.OKT3细胞系刺激人T细胞的扩增的能力。将正常供体T细胞与各种K562细胞系共温育，以培养9-12天，在此期间在不同时间点评估 T细胞的数量。数据表示为细胞数的相对增加倍数。抗CD3/CD28包被的珠用作阳性对照。单独的未刺激的T细胞用作阴性对照。
图5通过来自PCT/EP2009/062795的背景技术说明了对人和食蟹猴起源的黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)和CD3具有特异性的双特异性T细胞接合剂(BiTE)分子的特异性，由此开发了F12Q抗CD3 scFv。显示的是流式细胞术图，说明了几种CD3/MCSP BiTE 对表达MCSP的CHO细胞和人/猴T细胞的亲和力。阴影表明衍生自F12Q抗CD3 scFv 的BiTE表现出对人和食蟹猴CD3的最高亲和力，随后被选择用于进一步开发成抗CD3 scFv CAR。
图6说明了开发表达F12Qz CAR的aAPC的过程。用基于F12Qz的CAR构建体转导亲本K562细胞或表达CD64/CD86的K562细胞，随后被选择其CAR表达和刺激人T细胞扩增的能力。
图7说明了K562.64.86.F12Qz细胞是使用几种人类特异性的抗IgG抗体无法检测到的。数字表明细胞染色阳性的百分比。
图8说明了表达F12Qz CAR的K562.64.86细胞诱导人和非人灵长类动物T细胞的增殖的能力。将表达OKT3-CAR(中)或F12Qz-CAR(右)的K562.64.86细胞与人T细胞或来自恒河猴或食蟹猴的T细胞共温育。在12天的不同时间点评估T细胞扩增，数据表示为T细胞数量的增加倍数。作为阴性对照，T细胞未受到刺激(左图)。
图9说明了K562.64.86.F12Qz aAPC选择性刺激和扩增非人灵长类动物(NHP)T细胞。用K562.64.86.F12Qz细胞刺激来自两个食蟹猴供体或恒河猴供体的T细胞群9天，然后对CD3和CD8表达进行染色并通过流式细胞术读出。扩增前染色的供体细胞显示在顶行。扩增9天后染色的相应细胞组显示在底行。
图10说明了用于染色K562.64.86.F12Qz细胞的可溶性CD3ε蛋白的开发。用指定量的可溶性生物素化CD3ε蛋白对细胞进行染色，然后用PE缀合的链霉抗生物素作为二次染色剂进行复染。然后使用流式细胞术分析染色的细胞。顶行显示每组的前向/侧向散射分布，以及用于进一步评估PE(CD3ε)染色的门控(底行)。
图11说明了F12Qz CAR构建体在衍生自新生成的K562.64.86.F12Qz细胞系的各种克隆中的表达。直方图表示构建体表达的水平，通过用可溶性生物素化CD3ε蛋白染色，然后用链霉抗生物素-PE染色来评估。图例表明每个克隆染色的平均荧光强度。方框和箭头表明选择显示最高MFI的克隆(克隆7和8)用于进一步开发。
图12是说明各代基于K562的人工APC的特征的图表。
图13说明了T细胞扩增系统的比较。将现有(WAVE)工艺的能力和成本与新开发的(GREX)工艺进行比较。
图14A-14B说明了6次传代后转导的分子在APC4.1细胞(K562.64.41BBL.CAR3.IL7.IL15-15R)的十个克隆中的表达。亲本K562细胞的染色用作阴性对照。箭头表明双阴性细胞数量最少的高表达克隆。
图15A-15B说明了6次传代后转导的分子在APC5.1细胞(K562.64.41BBL.86.CAR3.IL7.IL15-15R)的十个克隆中的表达。亲本K562细胞的染色用作阴性对照。箭头表明双阴性细胞数量最少的高表达克隆。
图16说明了10个APC4.1(左)和APC5.1(右)克隆刺激人T细胞的扩增的能力。每个克隆与正常人供体T细胞共培养六天，并通过确定每孔的细胞总数在指定的时间点评估T细胞扩增。
图17说明了转基因在两个APC4.1克隆中表达的稳定性。在体外3次和9次传代后，在每个克隆中评估每个转基因(列)的表达。为了比较，亲本K562细胞用作阴性对照(顶行)。
图18说明了图17在较早传代中使用的APC4.1克隆的转基因表达。来自克隆6(顶行) 和克隆20(底行)的细胞在3次传代后对所示蛋白进行染色。
图19说明了两个APC5.1克隆中转基因表达的稳定性。在体外3次、4次和8次传代后，在每个克隆中评估每个转基因(列)的表达。为了比较，亲本K562细胞用相同的抗体组染色作为阴性对照(顶行)。
图20说明了在六个APC4.1(顶行)和六个APC5.1(底行)克隆中转导的细胞因子的表达水平。5e5个细胞/mL在2mL总体积中培养过夜，然后收获条件培养基用于通过ELISA的IL-7(左)和IL-15(右)浓度的细胞因子测量。
图21A-21C说明了在X-VIVO或OpTmizer无血清培养基中使用各种人工APC或珠刺激8天后，T细胞培养物中细胞因子存在的持久性。通过与指定的APC(APC2.0、3.0、2.1、3.1、4.1或5.1)、抗CD3抗体负载的APC(2D11)或抗CD3/CD28珠(BDS)共培养，刺激T 细胞八天。将外源性IL-7和IL-15添加到具有内源性不产生它们的APC(珠、2D11和APC3.1/2.1/3.0/2.0)的培养物中。在X-VIVO和OpTmizer培养基中单独培养的未刺激T细胞用作阴性对照(基线)。然后通过ELISA评估培养培养基中IL-7(图21A)、IL-15(图21B) 和IL-15/15R(图21C)的浓度。
图22说明了7天后T细胞共培养物中人工APC缺乏持久性。在各种培养条件下，将表达IL-7-mCherry的APC与来自患者#3-07409_104的供体T细胞共培养7天。然后用活性染料7-AAD对培养物进行染色，并通过流式细胞术评估mCherry表达。用抗CD3/CD28 dynabeads和dynabeads加细胞因子(quad)刺激对照培养物。
图23说明了在使用来自另一名人类患者的细胞(#3-13406_03)的T细胞共培养物中人工APC缺乏持久性。培养7天后，用活性染料7-AAD对细胞进行染色，并通过流式细胞术评估mCherry表达。通过象限门控将双阳性和双阴性群体分开，并评估每个群体的前向 /侧向散射和CD3表达以证明剩余的活细胞是T细胞。
图24说明了经过照射的人工APC在7天培养后不会持久。APC4.1(左)和APC5.1(右)细胞在体外照射和培养7天。然后用7-AAD对细胞进行染色，并通过流式细胞术读出，比较活性染料染色和mCherry表达。
图25说明了在GREX培养装置中使用各种无血清培养基扩增来自三名人类患者的T细胞。通过比较培养开始(第0天)到结束(第7天)的细胞数量并确定倍数扩增(FE)来确定每个培养条件/患者细胞组的扩增程度。
图26说明了在GREX培养装置中各种培养条件下人类患者T细胞的T细胞大小的变化。使来自三名不同患者的T细胞经历使用各种无血清培养基和aAPC的类似的指定培养条件。
图27A-27B说明了通过与APC3.1共培养从人供体外周血中扩增CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+调节T细胞(Treg)。在含有5％人AB血清、1X glutamax、1X pen/strep和200IU/mL IL-2的XVIVO培养基中培养细胞14天。在第9天用APC3.1重新刺激细胞。在第14天，用CD4-BV421(OKT4)、CD8-BV510(RPA-T8)、CD25-APC(BC96)和 FoxP3-PE-Dazzle594(206D)对细胞进行染色。图27A显示了14天培养期间不同时间点的细胞数。图27B显示了第14天扩增的Treg的流式细胞术染色。CD4对比CD8(左)和CD25 对比Foxp3(右)。
图28说明了非人灵长类动物调节T细胞(Treg)的扩增和转导。在第0天用RPMI+10％ FBS+10mM HEPES+1x Glutamax+1X pen/strep+IL-2中的irr.K562.F12Q.64.86刺激食蟹猴调节T细胞。在第2天，将编码人HLA-A2特异性CAR的病毒添加到细胞培养物中。在第7天，用经过照射的K562.A2.86细胞重新刺激细胞以重新刺激细胞，使得只有CAR+ 细胞会扩增，从而增加CAR+细胞的百分比。
图29说明了使用各种刺激方法和使用GREX培养装置的无血清培养基制剂对T细胞的倍数扩增。
图30说明了使用各种aAPC和刺激方法扩增并在图25、26和29中使用的各种无血清培养基条件下培养后，通过再刺激的T细胞的细胞因子产生。
图31A-31B描绘了使用氮空化来破坏aAPC以产生APC样膜囊泡。图31A是示例氮空化容器(“弹式容器”)的示意图。图31B说明了使用氮空化从aAPC细胞产生aAPC膜囊泡的示例性工作流程。
图32说明了使用氮空化法的膜囊泡aAPC产生的四种独立制剂的颗粒大小。
图33是一系列显微照片，说明在用由APC5.1细胞产生的aAPC膜囊泡刺激后T细胞上的CD64和CD86。
图34说明了与抗CD3/抗CD28包被的微珠(“珠”)相比，人供体CD4+T细胞在与不同浓度的几种aAPC膜囊泡制剂温育后的增殖。插表说明了每个膜囊泡制剂的颗粒浓度和平均粒径。
图35说明了与抗CD3/抗CD28包被的微珠(“珠”)相比，人类供体CD8+T细胞在与不同浓度的几种aAPC膜囊泡制剂温育后的增殖。插表说明了每个膜囊泡制剂产生的分裂指数、扩增指数、复制指数和分裂百分比。
图36说明了与抗CD3/抗CD28包被的珠相比，用不同浓度的几种aAPC膜囊泡制剂扩增期间T细胞的慢病毒转导。
图37是说明对于刺激能够用10ml瓶的抗CD3/抗CD28珠进行刺激的许多T细胞的细胞和培养基要求。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不意在进行限制。
除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的其他形式的使用不是限制性的。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法是本领域公知且常用的。本文提供的方法和技术通常根据本领域知晓的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述，除非另有说明。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书进行的，如本领域通常实现的或如本文中所述的。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关的术语和实验室程序和技术是本领域公知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
以下定义所选择的术语可以更容易地理解本公开。
本文使用冠词“一个”和“一种”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
如本文所使用的，术语“减轻”疾病是指降低疾病的一或多种症状的严重程度。
术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是天然存在的或由单链抗体或抗体片段重建。抗体还包括可以天然存在的或由单链抗体或抗体片段构建的二聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')2，以及单链抗体(scFv)、人源化抗体和人抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、 scFv抗体、单结构域抗体(诸如骆驼科动物抗体(Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods 231:25-38)，其由对靶标表现出足够亲和力的VL或VH结构域组成)、和多特异性抗体。抗体片段还包括人抗体或人源化抗体或人抗体或人源化抗体的一部分。
“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如，例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由编码抗体的DNA分子的合成产生，并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列的抗体，其中DNA 或氨基酸序列已经利用本领域可用和广泛公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
非人(如鼠类)抗体的“人源化”和“嵌合”形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化和嵌合抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和容量的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化和嵌合抗体可以包括既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化和嵌合抗体将包括基本上所有如下项：至少一个和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且所有或基本上所有FR 区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化和嵌合抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc) 的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。世界卫生组织(WHO)国际非专利名称(INN)专家组定义了将非人类衍生抗体视为“人源化”的要求。根据指南，候选抗体与人类序列的比较应通过International Immunogenetics Information
Figure BDA0003764394080000141
DomainGapAlign工具(www.imgt.org)进行。该工具查询抗体种系可变区基因的
Figure BDA0003764394080000142
数据库，其中仅针对种系序列可变区外显子进行比对评分，从而从分析中省略部分CDR3和J区。对于要“人源化”的抗体，除了“比其他物种更接近人类”之外，最热门的“命中”应该是人类，并且与人类序列的同一性必须至少为85％，否则该抗体将被指定作为“嵌合体”。进一步的细节参见Jones et al.,Nature,321:522-525,1986；Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
如本文所用的术语“抗原”被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫感受态细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——基本上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。
此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是，本发明包括但不限于多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是，抗原可被产生、合成或可源自生物学样品。这种生物学样本可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(如，aAPC)、树突细胞、B细胞等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3 复合体与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3 特异性结合的配体。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合配偶体，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于CD86、4-1BBL、BLA和Toll配体受体。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“病症”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该病症相比不太有利。保持不治疗，病症不必定引起动物健康状态的进一步降低。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物有效地实现特定生物学结果，或提供治疗或预防益处的量。这类结果可包括但不限于当施用至哺乳动物时，与不存在本发明组合物时所检测到的免疫反应相比，引起可检测水平的免疫抑制或免疫耐受的量。免疫应答可以容易地以许多本领域所认可的方法进行评估。本领域技术人员会理解，本文所施用的组合物的量改变并且可以基于许多因素容易确定，诸如所治疗的疾病或病症、所治疗的哺乳动物的年龄和健康状况和身体状况、疾病的严重程度以及所施用的特定化合物等。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
如本文所使用的，术语“内源”指的是任何来自有机体、细胞、组织或系统或在有机体、细胞、组织或系统内部所产生的物质。
如本文所使用的，术语“表位”定义为抗原上的可引发免疫应答的小化学分子，诱导B 和/或T细胞应答。抗原可具有一个或多个表位。大多数抗原具有多个表位；即，这些抗原是多价的。通常，表位的大小约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位为约4至18个氨基酸，更优选地约5至16个氨基酸，和甚至更优选地为6至14个氨基酸，更优选地约7至 12个氨基酸，和最优选地约8至10个氨基酸。本领域技术人员理解，一般来说，抗原特异性的主要条件是分子的整体三维结构，而非其特定的线性序列，因而由此区分不同表位。基于本公开，本发明中使用的肽可以是表位。
如本文所用的，术语“外源”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所使用的，术语“扩增”是指数量增加，如T细胞数量的增加。在一个实施方式中，相对于培养基中初始存在的数量，离体扩增的T细胞数量有所增加。在另一实施方式中，相对于培养基中的其他细胞类型，离体扩增的T细胞数量有所增加。如本文所使用的，术语“离体(ex vivo)”是指已经从活有机体(如人)中移出，并在有机体外繁殖的细胞(如，在培养皿、试管或生物反应器中)。
如本文所用的，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/ 或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(如，裸露或包括在脂质体中)和病毒(如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
如本文所使用的，术语“同一性”是指两个聚合分子之间的次单元序列同一性，特别是在两个氨基酸分子之间，例如两个多肽分子之间。当两个氨基酸序列的相同位置具有相同的残基时，如，如果两个多肽分子中每个的位置都被精胺酸占据，则它们在该位置是同一的。两个氨基酸序列在相同比对位置中具有相同残基的同一性或程度通常以百分比进行表达。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或相同位置数目的直接函数，如，如果两个序列中有一半位置(如，长度为10个氨基酸的聚合物中有5个位置)是同一的，则这两个序列的同一性为50％；如果90％的位置(如，10个中有9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列的同一性为90％。
如本文所使用的，术语“免疫应答”定义为对于抗原的细胞应答，这种应答发生在淋巴细胞将抗原性分子鉴定为外来物并诱发抗体形成和/或活化淋巴细胞以去除抗原时。
本文使用术语“免疫抑制”是指降低总体免疫应答。
“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(诸如例如，宿主细胞)中。
如本文所用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
如本文所使用的，术语“经修饰的”是指本发明的分子或细胞状态或结构的改变。分子可以以多种方式进行修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸来进行修饰。
如本文所用的，术语“调制”指与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/ 或与以其他方式相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者(优选人)的有益的治疗性应答。
在本发明的内容中，对于通常存在的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、 C、G)表示时，这也包括其中“U”取代“T”的RNA序列(即A、U、C、G)。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包括内含子(一个或多个)。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸的链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员一般知晓核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段和通过合成手段获得的所有核酸序列，任何手段包括但不限于重组手段，即，使用普通克隆技术及PCR等从重组文库或细胞基因组的核酸序列克隆，以及通过合成手段。
如本文所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体，并且还指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的，关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的特异性类别。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的特异性类别。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包括标记的“A”和抗体的反应中存在包括表位A(或游离的、未标记的A)的分子将降低结合至抗体的标记的A 的量。
术语“刺激”指通过结合刺激分子(如，TCR/CD3复合体)与它的关联配体，由此介导信号转导事件(诸如但不限于经TCR/CD3复合体的信号转导)诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文所用的“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等)上时，可与T细胞上的关联结合配偶体(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子，等等。
术语“受试者”意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(如，哺乳动物)。如本文所使用的，“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，诸如绵羊、牛、猪、犬科动物、猫科动物和鼠类哺乳动物。优选地，受试者是人。
“靶位点”或“靶序列”是指限定核酸的一部分的核酸序列，结合分子可以在足以发生结合的条件下特异性结合至该核酸序列。在一些实施方式中，靶序列是指基因组核酸序列，它限定了在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性结合的核酸的一部分。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应抗原呈递而参与T细胞活化的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由alpha(α)和beta(β)链的异二聚体组成，尽管在某些细胞中TCR由gamma和delta(γ/δ)链组成。TCR 可能以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似，但具有不同的解剖位置和功能。每条链由两个细胞外结构域即可变结构域和恒定结构域组成。在一些实施方式中，TCR可以在包含TCR的任何细胞上进行修饰，包括，例如，辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
如本文所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括初级受试者细胞及其子代。
作为本文所使用的术语，“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。
“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒及病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：在本公开全文中，本发明的各个方面可以以范围的形式呈现。应理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被视为是具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单个数值。例如，从1到6的范围的描述应被视为具有特定公开的子范围，诸如1到3、1到4、1到5、2到4、 2到6、3到6等，以及在所述范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。无论范围的宽度如何，这都适用。
人工抗原呈递细胞(aAPC)
本发明涉及以下发现：表达对CD3具有特异性的嵌合受体(如，嵌合抗原受体(CAR)) 的人工抗原呈递细胞(aAPC)可以促进T细胞的活化和扩增。在某些实施方式中，嵌合受体对人CD3和/或非人灵长类动物(如，食蟹猴和/或猕猴)CD3具有特异性。在某些实施方式中，aAPC基于人红细胞系K562。在某些实施方式中，aAPC表达刺激和/或共刺激分子，和/或分泌细胞因子。本发明还提供了用于扩增来自人和非人灵长类动物的T细胞亚群，尤其是调节T细胞(Treg)的方法和组合物。活化和扩增比常用方法更有效发生，其中aAPC 内源性表达嵌合抗原受体(CAR)，和/或共刺激分子，和/或生长支持细胞因子，否则在使用前的制备过程中需要从外源性来源提供。下面提供对实施本发明所必需的方法和各种考虑的描述。
本文描述的本发明的一个方面涉及aAPC，其被工程化为包含特异性结合CD3的嵌合受体。嵌合受体包含抗原结合结构域和跨膜结构域，抗原结合结构域对CD3具有特异性。aAPC可以任选地包含细胞内结构域和/或铰链结构域。在某些实施方式中，aAPC包含至少一种共刺激分子，和/或分泌至少一种生长促进细胞因子。
抗原呈递细胞(APC)是在其表面展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。T细胞表达的T细胞受体(TCR)复合物会识别抗原/MHC复合物，这导致活化T细胞。APC的作用是不断处理抗原并将其呈递给T细胞。常见的天然存在的APC的非限制性实例包括巨噬细胞、B细胞和树突细胞。
APC对免疫系统产生有效的适应性免疫应答至关重要；细胞毒性T细胞和辅助T细胞的功能都需要识别APC呈递的抗原。抗原呈递决定了适应性免疫的特异性，并有助于针对细胞内和细胞外病原体的免疫应答。APC在引发免疫系统以识别转化的细胞(如恶性细胞或肿瘤)方面额外地发挥重要作用。
抗原结合结构域
本发明涵盖包含嵌合受体分子的人工抗原呈递细胞(aAPC)，该嵌合受体分子包含对 CD3(例如人CD3和/或非人灵长类动物CD3)具有特异性的抗原结合结构域。抗原结合结构域是嵌合受体的细胞外区域，它与特定的靶抗原(如CD3)结合。在某些实施方式中，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3(如，来自食蟹猴和/或猕猴的CD3)具有特异性。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体和其任何片段。因此，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(如，小鼠或人)的重链(VH) 和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其共价连接以形成VH::VL异二聚体。重链(VH)和轻链 (VL)或直接接合或通过肽编码接头或间隔子接合，肽编码接头或间隔子将VH的N末端与VL的C末端连接或将VH的C末端与VL的N末端连接。在一些实施方式中，抗原结合结构域(如，CD3结合结构域)包含具有从N-末端到C-末端VH-接头-VL的构型的scFv。在一些实施方式中，抗原结合结构域(如，CD3结合结构域)包含具有从N-末端到C-末端VL- 接头-VH的构型的scFv。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适当配置。
接头通常富含甘氨酸以提高灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。接头能够连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。在Shen et al.,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010中公开了接头的非限制性实例，其内容通过引用以其整体并入本文。各种接头序列在本领域是已知的，包括但不限于甘氨酸丝氨酸(GS)接头，诸如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:27)、(GGGS)n(SEQ ID NO:28)和(GGGGS)n(SEQ IDNO:29)，其中n表示至少为1的整数。示例性接头序列可以包括氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:30)、GGSGG(SEQ ID NO:31)、GSGSG(SEQ ID NO:32)、 GSGGG(SEQ ID NO:33)、GGGSG(SEQ ID NO:34)、GSSSG(SEQ ID NO:35)、GGGGS (SEQ ID NO:36)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)等等。本领域技术人员将能够选择合适的接头序列用于本发明。在一个实施方式中，本发明的抗原结合域(如，CD3结合域)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL被接头序列分开，该接头序列具有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)，该氨基酸序列可以由核酸序列 ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt ggcggcggatct(SEQ ID NO:38)编码。
尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH-和VL-编码序列的核酸表达，如Huston,et al.(Proc.Nat.Acad. Sci.USA,85:5879-5883,1988)所描述。还可以参见美国专利号5,091,513、5,132,405和 4,956,778；和美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，如，Zhao et al.,Hybridoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter et al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012August 12；Shieh et al.,JImunol 2009 183(4):2277-85； Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife et al.,J Clin Invst 2006 116(8):2252-61；Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2(10:31-40)。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，如，Peter et al., J Bioi Chem 200325278(38):36740-7；Xie et al.,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho et al.,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66)。
如本文所用，“Fab”是指与抗原结合但为单价且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，被木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个Fab片段和一个Fc片段(如，重(H)链恒定区；不与抗原结合的Fc区)。
如本文所用，“F(ab')2”是指通过胃蛋白酶消化整个IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包含两条单独的氨基酸链，H链的一部分和轻(L)链通过S-S键连接以结合抗原，并且其中剩余的H链部分连接在一起。“F(ab')2”片段可以分裂为两个独立的Fab'片段。
在一些情况下，抗原结合结构域可源自最终使用嵌合受体的同一物种。例如，对于用于人类，嵌合受体的抗原结合结构域可包含如本文别处所述的人类抗体或其片段。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列中任一序列的HCDR和/或包含SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列中任一序列的LCDR。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:11-13所示的氨基酸序列中任一序列的HCDR和/或包含SEQ ID NO:14-16所示的氨基酸序列中任一序列的LCDR.
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。在某些实施方式中，scFv 包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
抗原结合结构域可以与嵌合受体的另一个结构域可操作地连接，诸如跨膜结构域或细胞内结构域，两者都在本文别处描述。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸与编码跨膜结构域的核酸可操作地连接。
本文所述的抗原结合结构域(如，结合CD3的scFv)可以与本文所述的任何跨膜结构域或本文所述的任何细胞内结构域组合。
跨膜结构域
主题嵌合受体的跨膜结构域是能够跨越aAPC的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，如aAPC细胞膜。在一些实施方式中，跨膜结构域介于抗原结合结构域和嵌合受体的细胞内结构域之间。
在某些实施方式中，跨膜结构域与嵌合受体中的一个或多个结构域天然相关。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以来自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白，如I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是促进CAR插入细胞膜的任何人工序列，如，人工疏水序列。在本发明中特别使用的跨膜区的实例包括但不限于，衍生自以下的跨膜结构域(即，至少包括以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、 CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、 Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每一端。
在某些实施方式中，跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在某些实施方式中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
本文所述的跨膜结构域可与本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何细胞内结构域或本文所述的可包括在嵌合受体中的任何其他结构域组合。
在一些实施方式中，跨膜结构域还包含铰链区。本发明的主题嵌合受体还可以包括铰链区。嵌合受体的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方式中，该结构域有助于嵌合受体的正确蛋白质折叠。铰链区是嵌合受体的可选成分。铰链区可以包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链区的实例包括但不限于CD8a铰链、由可以小至三个甘氨酸(Gly)的多肽制成的人工铰链以及IgG(例如人IgG4)的CH1和CH3结构域。
在一些实施方式中，本公开的主题嵌合受体包括将抗原结合结构域与跨膜结构域连接起来的铰链区，而跨膜结构域又连接到细胞内结构域。铰链区优选能够支持抗原结合结构域识别并结合靶细胞上的靶抗原(参见，如，Hudecek et al.,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2): 125-135)。在一些实施方式中，铰链区是灵活的结构域，因此允许抗原结合结构域具有最佳识别细胞(诸如肿瘤细胞)上靶抗原的特定结构和密度的结构(Hudecek etal.,同上)。铰链区的灵活性允许铰链区采用许多不同的构象。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方式中，铰链区是衍生自受体的铰链区多肽(如，CD8衍生的铰链区)。
铰链区可具有约4个氨基酸至约50个氨基酸的长度，如约4aa至约10aa、约10aa 至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约 40aa、或约40aa至约50aa。
合适的铰链区可以容易地选择并且可以是许多合适长度中的任何一种，诸如从1个氨基酸(如，Gly)到20个氨基酸，从2个氨基酸到15个氨基酸，从3个氨基酸到12个氨基酸，包括4个氨基酸到10个氨基酸、5个氨基酸到9个氨基酸、6个氨基酸到8个氨基酸或7个氨基酸到8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
例如，铰链区包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:27)和(GGGS)n(SEQ ID NO:38)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸 -丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。可以使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser都是相对非结构化的，因此可以作为成分之间的中性系链。可以使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸进入显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基受到的限制要少得多(参见，如，Scheraga,Rev.Computational.Chem. (1992)2:73-142)。示例性铰链区可以包含氨基酸序列，包括但不限于，GGSG(SEQ ID NO: 30)、GGSGG(SEQ ID NO:31)、GSGSG(SEQ ID NO:32)、GSGGG(SEQ ID NO:33)、GGGSG (SEQ ID NO:34)、GSSSG(SEQ ID NO:35)等等。
在一些实施方式中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见，如，Tan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1):162-166；和 Huck et al.,Nucleic Acids Res.(1986)14(4):1779-1789。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可以包括以下氨基酸序列之一：DKTHT(SEQ ID NO:39)；CPPC(SEQ IDNO:40)； CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO:41)(参见，如，Glaser et al.,J.Biol.Chem.(2005) 280:41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:42)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO:43)；KCCVDCP(SEQ ID NO:44)；KYGPPCP(SEQ ID NO:45)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:46)(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:47)(人IgG2铰链)； ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ IDNO:48)(人IgG3铰链)；SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO:49)(人IgG4铰链)；等等。
铰链区可以包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。在一个实施方式中，与野生型(天然存在的)铰链区相比，铰链区可以包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可以被Tyr取代，使得铰链区包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO:50)；参见，如，Yan et al.,J.Biol.Chem.(2012)287: 5891-5897。在一个实施方式中，铰链区可以包括衍生自人CD8的氨基酸序列，或其变体。
在某些实施方式中，嵌合受体包括CD8铰链区。在某些实施方式中，铰链结构域包含 SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
细胞内结构域
本发明的某些方面包括包含嵌合受体分子的人工抗原呈递细胞(aAPC)，该嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对CD3(如人和/或非人灵长类动物CD3)具有特异性。
在某些实施方式中，细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。在某些实施方式中，细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
表1：氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003764394080000231
Figure BDA0003764394080000241
Figure BDA0003764394080000251
Figure BDA0003764394080000261
Figure BDA0003764394080000271
在某些实施方式中，aAPC包括包含SEQ ID NO:23或24所示的氨基酸序列的嵌合受体分子。在某些实施方式中，嵌合受体分子由SEQ ID NO：23或24所示的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，嵌合受体分子由包括SEQ ID NO:25或26所示的核酸序列或由其组成的核酸编码。包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的嵌合受体分子本文中也称为 F12Q嵌合受体。包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的嵌合受体分子本文中也称为 OKT3嵌合受体。
嵌合受体或其组分部分(如，抗原结合结构域(HCDR、LCDR、VH、VL或scFv)、跨膜结构域、铰链或细胞内结构域)的可耐受变异将为本领域技术人员所知。例如，在一些实施方式中，CAR或其任一组分包括如此氨基酸，该氨基酸至少具有与SEQ ID NO:1-26所示氨基酸序列中任一项至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方式中，嵌合受体由如此核酸序列编码，该核酸序列具有与SEQ ID NO: 27-28所示核酸序列中任一项至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在某些实施方式中，嵌合受体分子在aAPC中是组成型表达的。
在某些实施方式中，aAPC不外源性地表达选自以下的一种或多种分子：HLA I类、HLA II类、CD1d、CD16、CD64、CD83、CD86、4-1BBL、OX40L、ICOSL、CD40L、 PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。在某些实施方式中，aAPC是工程化的K562细胞。
在某些实施方式中，aAPC还包括在细胞表面上表达的Fc受体。各种Fc受体是本领域已知的，包括但不限于CD64、CD32、CD16a、CD16b、CD23和CD89。在某些实施方式中，Fc受体是CD64。
在某些实施方式中，aAPC还包含在细胞表面表达的共刺激分子。各种共刺激分子在本领域是已知的，包括但不限于4-1BB、OX40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、LIGHT、NKG2C、B7-H3、以及与 CD86特异性结合的配体。在某些实施方式中，共刺激分子是CD86。
在某些实施方式中，aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体和在细胞表面表达的共刺激分子。在某些实施方式中，Fc受体是CD64，和共刺激分子是CD86。
在其中aAPC包括Fc受体的某些实施方式中，aAPC加载有抗体，并且抗体的Fc片段被Fc受体结合。在某些实施方式中，抗体对选自以下的分子具有特异性：CD3、CD28、 PD-1、B7-H3、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HLA-DR、MHCII、Toll配体受体和LFA-1。
在某些实施方式中，aAPC还包含共刺激配体。在某些实施方式中，共刺激配体选自CD7、B7-1(CD80)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、 CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6、以及与B7-H3特异性结合的配体。在某些实施方式中，共刺激配体是4-1BBL。其他共刺激配体包括在本发明中，如掌握本文提供的教导的本领域技术人员将理解的。此类配体包括但不限于前述天然配体的突变体、变体、片段和同系物。
这些和其他配体在本领域中是众所周知的并且已经充分表征，如在Schwartz etal., 2001,Nature 410:604-608；Schwartz et al.,2002,Nature Immunol.3:427-434；和Zhang et al., 2004,Immunity.20:337-347所描述。使用本领域中关于配体的广泛知识，掌握本文提供的教导的技术人员将理解配体的突变体或变体包括在本发明中并且可以使用慢病毒转导到细胞中以产生本发明的aAPC，并且这类突变体和变体在本文别处更全面地讨论。也就是说，本发明包括使用感兴趣的配体的突变体或变体，并且产生这种突变体和变体的方法在本领域中是众所周知的。
在某些实施方式中，aAPC表达选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-35和TGF-β。在某些实施方式中，aAPC表达IL-7。在某些实施方式中，aAPC表达IL-15。在某些实施方式中，aAPC 表达IL-7和IL-15。在某些实施方式中，细胞因子是组成型表达的。如本领域所知晓，在一些情况中，IL-15Rα和IL-15的共表达对IL15Rα/IL-15的稳定表达是重要的。参见，如， Hasan etal.Clin.Exp.Immunol.(2016)186(2):249-265。因此，在某些实施方式中，aAPC表达IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC表达IL-15和IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC表达IL-15和IL-15Rα的复合物。参见，如，Guo et al.Cytokine Growth Factor Rev(2017)Dec；38:10–21和Tamzalit et al.PNAS June 10,2014 111(23)8565-8570。在某些实施方式中，aAPC分泌IL-15/IL-15Rα的复合物。在某些实施方式中，aAPC表达IL-21。在某些实施方式中，IL-21已经被修饰为膜结合的。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包括Fc受体和共刺激配体。在某些实施方式中，aAPC包括Fc受体CD64和共刺激配体4-1BBL。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包括Fc受体、共刺激分子和共刺激配体。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激分子CD86和共刺激配体4-1BBL。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包含Fc受体、共刺激配体和抗CD3嵌合受体。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL和OKT3嵌合受体。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL和F12Q嵌合受体。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包含Fc受体、共刺激分子、共刺激配体和抗CD3嵌合受体。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激分子CD86、共刺激配体 4-1BBL和OKT3嵌合受体。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激分子 CD86、共刺激配体4-1BBL和F12Q嵌合受体。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包含Fc受体、共刺激配体，抗CD3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、OKT3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中， aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、OKT3嵌合受体，并表达IL-7和IL-15。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、OKT3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体 4-1BBL、F12Q嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC 包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、F12Q嵌合受体，并表达IL-7和IL-15。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、F12Q嵌合受体，并表达IL-7、 IL-15和IL-15Rα。
在某些实施方式中，本公开的aAPC包含Fc受体、共刺激配体、共刺激分子、抗CD3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、OKT3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、 OKT3嵌合受体，并表达IL-7和IL-15。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、OKT3嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、 F12Q嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和/或IL-15Rα。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、F12Q嵌合受体，并表达IL-7和IL-15。在某些实施方式中，aAPC包含Fc受体CD64、共刺激配体4-1BBL、共刺激分子CD86、 F12Q嵌合受体，并表达IL-7、IL-15和IL-15Rα。
在某些实施方式中，aAPC包含转导以表达至少一种免疫刺激和/或共刺激配体和/或分泌至少一种免疫刺激细胞因子的K562细胞。虽然本文公开的数据表明，转导到K562细胞中的编码约六种不同分子的约六种核酸在长期培养中稳定且高度表达，但没有任何迹象表明这是对可以转导到这些细胞中的分子数量或种类的限制。相反，任何分子或配体，无论是刺激、共刺激、细胞因子、抗原、Fcγ受体等，都可以被引入这些细胞以产生本发明的APC。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，一旦掌握了本文提供的教导，许多免疫调节分子可用于产生几乎无限种类的aAPC。即，在本领域中存在关于参与T细胞活化和诱导的事件和分子的广泛知识，并且讨论T细胞介导的免疫反应以及介导它们的因素的论文在本领域中是众所周知的。更具体地说，通常通过T细胞上的T细胞受体/CD3 复合物介导的主要信号启动T细胞活化过程。此外，存在于T细胞表面的大量共刺激分子参与调节从静息T细胞到细胞增殖的转变。与它们各自的配体特异性结合的此类共刺激分子，也称为“共刺激物”，包括但不限于，CD28(其与B7-1[CD80]、B7-2[CD86]结合)、PD-1 (其与PD-L1和PD-L2结合)、B7-H3、4-1BB(结合配体4-1BBL)、OX40(结合配体OX40L)、 ICOS(结合配体ICOS-L)和LFA(结合配体ICAM)。因此，初级刺激信号介导T细胞刺激，但随后需要共刺激信号用于T细胞活化，如增殖所证明的。
因此，本发明的aAPC包括包含嵌合受体的细胞，嵌合受体与TCR/CD3复合物特异性结合，从而转导初级信号。此外，如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开内容，aAPC可进一步包含至少一种与存在于T细胞上的至少一种共刺激分子特异性结合的共刺激配体。此类共刺激分子包括但不限于CD27、CD28、CD30、与CD83特异性结合的配体、4-1BB、PD-1、OX40、ICOS、LFA-1、CD30L、NKG2C、B7-H3、MHC I类、BTLA、 Toll配体受体和LIGHT。
在某些实施方式中，本发明的aAPC包含至少一种刺激性配体(如，嵌合受体)和至少一种共刺激性配体，使得aAPC可以刺激和扩增包含关联结合配偶体刺激分子的T细胞，该关联结合配偶体刺激分子特异性结合aAPC上的刺激性配体，使得aAPC上的配体与T 细胞上的相应分子之间的相互作用介导T细胞增殖和所需的扩增等。本领域技术人员将理解，在已知感兴趣T细胞上的特定刺激分子和共刺激分子的情况下，可以容易地产生本发明的aAPC以扩增该T细胞。相反，在不知道感兴趣T细胞上的刺激分子和共刺激分子的情况下，本发明的一组aAPC可用于确定哪些分子及其组合可以扩增该T细胞。因此，本发明提供了用于扩增所需T细胞的工具，以及用于阐明特定T细胞上介导T细胞活化和增殖的分子的工具。
在一个方面，本发明包括包含嵌合受体分子的人工抗原呈递细胞(aAPC)，嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性。抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区。HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3 所示的氨基酸序列。LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。aAPC还包括CD64、CD86、4-1BBL、 IL-7和IL-15，以及aAPC是工程化的K562细胞。
在另一方面，本发明包括包含嵌合受体分子的人工抗原呈递细胞(aAPC)，嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3具有特异性。抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区。HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR2 包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和 LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。aAPC还包括CD64、CD86、4-1BBL、IL-7 和IL-15，以及aAPC是工程化的K562细胞。
本领域技术人员将理解，本发明的核酸包括编码本发明蛋白质的RNA或DNA序列，以及其任何修饰形式，包括DNA或RNA的化学修饰，其使得核苷酸序列在其是无细胞时或与细胞缔合时更稳定。核苷酸的化学修饰也可用于增强核苷酸序列被细胞吸收的效率或它在细胞中表达的效率。本发明考虑了核苷酸序列的任何和所有修饰组合。
此外，使用本领域熟知的重组DNA方法，例如Sambrook和Russell(2001,MolecularCloning,A Laboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)和 Ausubel et al.(2002,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY)中描述的方法，可使用许多程序产生本发明蛋白质的突变体、衍生物或变体形式。通过改变编码多肽的DNA序列在蛋白质或多肽中引入氨基酸变化的程序是本领域众所周知的并且也在这些论文和其他论文中进行了描述。
本发明还应解释为包括本发明的肽(或编码其的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”，这些突变体、衍生物和变体是共刺激配体、细胞因子、抗原(如，肿瘤细胞、病毒和其他抗原)，它们在一个或多个氨基酸上发生了改变(或者，当提到编码其的核酸序列时，在一个或多个碱基对上发生了改变)，从而得到的肽(或DNA)与本文所述的序列不同，但具有与本文公开的肽相同的生物学特性，因为该肽具有本发明的共刺激配体、细胞因子、抗原等的生物学/生化特性(如，通过aAPC表达，其中使表达蛋白质的aAPC与T细胞接触，介导T 细胞的增殖或以其他方式影响T细胞)。
此外，本发明包括这样的aAPC，其中共刺激配体是与共刺激分子特异性结合的关联结合配偶体，以及其中配体是与共刺激分子特异性结合的抗体，以及它们的任何组合；使得单个aAPC可以包含的两种核酸编码T细胞上存在的对共刺激分子具有特异性的共刺激配体和/或抗体，以及它们的任何组合。
此外，本发明包括用编码至少一种细胞因子、至少一种趋化因子或两者的核酸转导的 aAPC。这是因为本文别处公开的数据充分证明用编码白细胞介素(例如，IL-7、IL-15等) 的核酸转导的aAPC稳定地表达白细胞介素。此外，使用包含内部核糖体进入位点(IRES) 的LV载体，白细胞介素可以从aAPC(例如，用LV载体转导的K562，诸如但不限于pCLPS CD32-IRES-IL-7、-12、-15、-18和-21)分泌。可由aAPC表达的其他细胞因子包括但不限于干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、SLC、IL-2、IL-4、IL-23、IL-27等。本发明进一步包括但不限于趋化因子RANTES、MIP-1a、MIP-1b、SDF-1、eotaxin等。
因此，本发明包括细胞因子，包括细胞因子的全长、片段、同系物、变体或突变体。细胞因子包括能够影响另一细胞的生物学功能的蛋白质。受细胞因子影响的生物学功能可以包括但不限于细胞生长、细胞分化或细胞死亡。优选地，本发明的细胞因子能够与细胞表面的特异性受体结合，从而影响细胞的生物学功能。
优选的细胞因子包括造血生长因子、白细胞介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子等。本发明更优选的细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)和IGIF等。
趋化因子，包括其同系物、变体、突变体或其片段，涵盖了α-趋化因子或β-趋化因子，包括但不限于C5a、白细胞介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1α(MIP1α)、单核细胞趋化蛋白1β(MIP1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-[3H]苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素释放肽(GRP)、RANTES、eotaxin、淋巴细胞趋化素、IP10、I-309、ENA78、GCP-2、 NAP-2和/或MGSA/gro。一旦掌握了本文提供的教导，本领域技术人员将理解，本发明包括例如本领域众所周知的以及任何将来发现的趋化因子和细胞因子。
一旦掌握了本文提供的教导，本领域技术人员将理解，本发明的aAPC不以任何方式限于任何特定抗原、细胞因子、共刺激配体、特异性结合共刺激分子的抗体等。相反，本发明涵盖包含许多分子的aAPC，这些分子要么全部在单个启动子/调节序列的控制下表达，要么在多于一个这样的序列的控制下表达。此外，本发明包括施用一种或多种本发明的aAPC，其中各种aAPC编码不同的分子。也就是说，各种分子(例如，共刺激配体、抗原、细胞因子等)可以顺式(即，在相同的aAPC和/或由相同连续核酸编码的或在相同的aAPC 内的单独核酸分子上)或反式(即，各种分子由不同的aAPC表达)起作用。
以此方式，如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开内容，aAPC的施用剂量和时机可以针对每种应用具体定制。更具体地，如果希望使用由一种aAPC或几种aAPC 表达的某些分子向T细胞提供刺激，然后使用另一种aAPC或几种aAPC进行刺激，表达不同的，即使是重叠的分子组，那么可以使用顺式和反式方法的组合。本质上，本发明的 aAPC和本文公开的方法提供了几乎无限数量的变化，并且本发明不以任何方式限于任何特定的组合或方法。掌握本文提供的教导和本领域可获得的知识的熟练技术人员可以容易地确定每个特定T细胞的期望方法。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，在本发明的aAPC中表达的分子的各种组合可能是有利的。尽管在整个说明书中指出了这些分子组合中的几种，包括但不限于图12中例示的组合，但本发明决不限于这些或包含任何特定分子组合的任何其他aAPC。相反，本领域技术人员将理解，基于本文提供的教导，可以将多种分子组合转导到细胞中以产生本发明的aAPC。分子包括本领域已知的那些，例如本文所讨论的那些，以及将来要发现的那些分子。
方法
本发明提供了用于刺激和扩增T细胞(如调节T细胞(Treg))的方法。该方法包括使T 细胞与本文公开的任何人工呈递细胞(aAPC)接触。
如本文其他地方所证明的，使T细胞与包含对CD3具有特异性的嵌合受体和任选地特异性结合T细胞表面上表达的关联共刺激分子的共刺激配体的aAPC接触会刺激T细胞并诱导T细胞增殖，从而可以很容易地产生大量特异性T细胞。aAPC“特异性地”扩增T 细胞，因为只有表达特定共刺激分子的T细胞被aAPC扩增。因此，当待扩增的T细胞存在于细胞混合物中时，其中一些或大部分不表达共刺激分子，只有感兴趣T细胞将被诱导增殖并扩增细胞数量。可以使用多种细胞分离和纯化技术进一步纯化T细胞，例如本领域已知的和/或本文其他地方描述的那些。
如本领域技术人员将理解的，基于本文提供的公开，在使用aAPC扩增之前不需要鉴定或分离感兴趣T细胞。这是因为aAPC具有选择性，并且只会扩增表达关联共刺激分子的T细胞(一种或多种)。
优选地，某些T细胞的扩增通过使用表达各种分子的几种aAPC或单个aAPC来实现，各种分子包括但不限于抗原、细胞因子、共刺激配体和与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体配体。如本文其他地方所公开的，aAPC可以包含编码CD32和/或CD64的核酸，使得在aAPC表面上表达的CD32和/或CD64可以“加载”任何期望的抗体，只要它们结合CD32和/或CD64，其是Fcγ受体。这使得“现成的”aAPC可以轻松定制以刺激任何期望的T细胞。
本发明包括特异性诱导表达已知共刺激分子的T细胞增殖的方法。方法包括使包含表达已知共刺激分子的至少一种T细胞的T细胞群体与包含编码共刺激分子配体的慢病毒的 aAPC接触。如本文别处所公开，当aAPC表达与T细胞上的共刺激分子特异性结合的至少一种共刺激配体时，共刺激分子与其关联共刺激配体的结合诱导T细胞增殖。因此，感兴趣T细胞被诱导增殖，而不必首先从细胞群中纯化细胞。此外，该方法提供了用于确定群体中任何细胞是否正在表达特定的感兴趣共刺激分子的快速测定，因为将细胞与aAPC 接触将诱导增殖和检测正在生长的细胞，从而鉴定表达感兴趣共刺激分子的T细胞存在于样品中。以这种方式，可以扩增和分离细胞表面上至少一种共刺激分子已知的任何感兴趣 T细胞。
本发明包括用于特异性扩增T细胞群亚群的方法。更具体地，该方法包括将包含感兴趣亚组的至少一种T细胞的T细胞群与能够扩增该T细胞的aAPC，或表达与T细胞表面上的关联共刺激分子特异性结合的至少一种共刺激配体的aAPC接触。如本文其他地方先前所证明的，共刺激分子与其结合配偶体共刺激配体的结合诱导T细胞增殖，从而特异性地扩增T细胞群亚群。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，T细胞亚群包括T辅助(TH1和TH2)CD4表达细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Tc1或Tc2)T调节(TREG) 细胞、TC/S细胞、幼稚细胞、记忆细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞、和γδT细胞。因此，使用本发明的方法，可以容易地产生富含特定T细胞亚群的细胞群。
在某些实施方式中，待扩增的T细胞是自体T细胞。在某些实施方式中，T细胞是人T细胞、调节T细胞(Treg)。在某些实施方式中，T细胞是非人灵长类动物T细胞。在某些实施方式中，非人类灵长类动物是食蟹猴。非人灵长类动物是猕猴。
在一个方面，本发明提供了刺激和扩增人和/或非人灵长类动物调节T细胞(Treg)的方法。该方法包括使Treg与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中aAPC包含嵌合受体分子，嵌合受体分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性。抗原结合结构域包括包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区和包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区。HCDR1包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3 包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列， LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。aAPC 还包括CD64、CD86、4-1BBL、IL-7和IL-15，以及aAPC是工程化的K562细胞。
在另一方面，本发明提供刺激和扩增人和/或非人T细胞的方法，包括使细胞与包含由本文公开的任何人工抗原呈递细胞(aAPC)产生的膜囊泡的组合物接触。在一些实施方式中， aAPC膜囊泡是通过破坏本发明的aAPC产生的，从而产生保留由aAPC表达的功能性细胞表面蛋白的囊泡，从而保留囊泡刺激T细胞和支持T细胞培养物扩增的能力。与完全完整的aAPC细胞共培养相比，此类aAPC衍生的囊泡组合物提供了若干优点，包括但不限于通过可能不利地影响培养的T细胞的处理(诸如细胞毒性化学品、辐射等)来消除aAPC灭活的需要；优化大规模培养物的生产，因为aAPC膜囊泡没有代谢活性或需要从扩增的T 细胞群中去除；以及能够使用病毒载体(包括慢病毒载体)更有效地转导扩增T细胞，因为病毒颗粒和aAPC膜囊泡之间的相互作用显著降低。
在一些实施方式中，aAPC膜囊泡是通过破坏aAPC细胞产生的。多种细胞破坏方法在本领域中是众所周知的，包括但不限于机械均化(诸如使用手持或电动装置)、超声均化、压力均化、包括反复冻融循环的温度处理、在低渗溶液中渗透裂解、化学裂解(包括使用各种去污剂或溶剂)、氮空化等。本领域技术人员将认识到哪种破坏方法最适用于产生膜囊泡，包括aAPC囊泡的特定应用。在一些实施方式中，破坏aAPC的方法是氮空化。该方法包括将aAPC培养物置于压力容器(通常称为“弹式容器”)中，并在富含氮的气氛下在高压下平衡细胞，从而导致溶解在细胞质中的氮和其他气体增加。细胞突然暴露在大气压下会导致细胞的细胞质中形成氮气泡，从而导致细胞裂解。压力和释放时间可以变化，以导致不同程度的细胞裂解和细胞、膜、蛋白质和细胞器结构的保存。例如，相对较低的压力只会破坏质膜和内质网，而高压会导致细胞核和其他细胞器(包括溶酶体和线粒体)的破坏。在一些实施方式中，压力容器，通常被称为“弹式容器”，由能够承受高压的厚不锈钢或类似金属外壳组成，具有用于从罐中输送氮气的入口和带有可调节排放阀的出口。本领域技术人员将认识到足以产生本发明的aAPC膜囊泡的氮空化的精确条件以及它们在本发明的方法中的用途。
药物组合物
本发明包括包含本发明的aAPC作为活性成分的药物组合物的制备和用途。在一些实施方式中，该组合物包含衍生自本发明的aAPC的膜囊泡的混合物。这样的药物组合物可以由单独的活性成分(如，本发明的细胞及其制剂)组成，作为至少一种活性成分的组合(如，有效剂量的APC)，其形式适合于施用给受试者或在活化和扩增来自受试者的T细胞中的用途，或药物组合物可包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种额外的(活性和/或非活性)成分或这些的一些组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可与活性成分组合并且在组合之后可用于将活性成分施用于受试者或活化和扩增来自受试者的T细胞的化学组合物。本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括将活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如果需要或期望，将产品成型或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于合乎道德地施用于人类的药物组合物，但本领域技术人员将理解此类组合物通常适合施用于各种动物。对适用于人类施用的药物组合物的修改以使该组合物适用于各种动物的施用是众所周知的，并且普通的兽医药理学家可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和进行这种修改。考虑施用本发明药物组合物的对象包括但不限于人类和其他灵长类动物、哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物如非人类灵长类动物(如，猴子，如，食蟹猴、猕猴)、牛、猪、马、羊、猫和狗，禽类，包括商业相关的禽类，如鸡、鸭、鹅和火鸡，鱼类，包括养殖的鱼和观赏鱼，以及甲壳类动物，例如养殖的贝类。
可用于本发明方法的药物组合物可以以适合口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、病灶内、颊、眼、静脉内、器官内或其他施用或使用途径的制剂制备、包装或销售。其他考虑的制剂包括投射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量批量制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者或用于活化和扩增来自受试者的T细胞的活性成分的剂量，或此类剂量的方便部分，例如，这种剂量的二分之一或三分之一。
本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何其他成分的相对量将根据治疗的受试者的身份、大小和状况以及进一步取决于将施用组合物的途径而变化。例如，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种另外的药物活性剂。
本发明药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于受试者组织的物理破裂和通过组织中的破裂施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施加组合物、通过组织穿透性非手术伤口施加组合物等施用药物组合物。特别地，考虑肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体诸如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。此类制剂可以以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或出售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、油性或水性载体中的乳剂、糊剂和可植入的缓释或生物可降解制剂。此类制剂还可包含一种或多种额外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。
药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含另外的成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂例如水或1,3-丁二醇来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油，例如合成甘油单酯或甘油二酯。可用的其他肠胃外施用制剂包括那些包含微晶形式、脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统组分的活性成分的制剂。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，诸如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
本发明的aAPC或aAPC衍生的膜囊泡和/或使用aAPC或aAPC衍生的膜囊泡扩增的 T细胞可以施用于动物，优选人。当施用使用本发明的aAPC或aAPC衍生的膜囊泡扩增的T细胞时，施用的细胞量可以在约100万个细胞至约3000亿个的范围内。在施用aAPC 或aAPC衍生的膜囊泡本身时，无论有或没有由此扩增的T细胞，它们可以以约100,000 至约100亿个细胞或囊泡的量施用，其中将细胞和囊泡注入动物体内，优选地，有需要的人类患者。而施用的精确剂量将根据许多因素而变化，包括但不限于动物的类型和所治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。
aAPC或aAPC衍生的膜囊泡可以每天多次的频率施用给动物，或者可以不那么频繁地施用，诸如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至不那么频繁，诸如每几个月一次，甚至一年一次或更少。给药频率对技术人员来说是显而易见的，并且取决于许多因素，例如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
aAPC或aAPC衍生的膜囊泡(或由此扩增的细胞)可以与各种其他化合物(细胞因子、化疗剂和/或抗病毒药物等)共同施用。可选地，可以在aAPC或aAPC衍生的膜囊泡(或由此扩增的细胞)或其任何排列之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更长时间施用化合物。此外，可以在施用aAPC或aAPC衍生的膜囊泡(或由此扩增的细胞)或其任何排列之后一小时、一天、一周或甚至更长时间施用化合物。频率和施用方案对本领域技术人员来说是显而易见的，并且取决于许多因素，诸如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状况、所施用的一种或多种化合物的种类、各种化合物和aAPC或aAPC衍生的膜囊泡(或由此扩增的细胞)的施用途径等。
此外，本领域技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，在将aAPC或aAPC衍生的膜囊泡施用于哺乳动物的情况下，处理细胞以使其处于“无生长的状态”；也就是说，当施用给哺乳动物时，细胞不能分裂。如本文其他地方所公开的，细胞可以被照射以使它们一旦施用于哺乳动物就不能生长或分裂。其他方法，包括半抗原化(如，使用二硝基苯基和其他化合物)在本领域中是已知的，用于使要施用的细胞，尤其是对人类，不能生长，并且这些方法在本文中不作进一步讨论。此外，使用编码本文讨论的一些分子的质粒载体转染的aAPC，已经在I期临床试验中确立了施用已经使得不能在体内分裂的aAPC的安全性。
实验实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变化。
材料和方法
质粒：pTRPE-CD86由Genscript合成，pTRPE-IL-15/IL-15受体α(IL-15/15Ra)、pTRPE-IL-7mcherry、pTRPE-F12Q(F12Q)和pTRPE-OKT3.8(OKT3)被克隆到CCI。
aAPC细胞系的产生：转导表达Fc受体CD64和4-1BB配体(4-1BBL)的K562细胞，以表达CD86构建体，其得到K562.64.4-1BBL.86细胞系(APC3.0)。此外，转导 K562.64.4-1BBL.86(APC3.0)和K562.64.4-1BBL(APC2.0)细胞系以表达抗-CD3 OKT3构建体，分别得到K562.64.41BBL.OKT3(APC2.1)和K562-64.86.4-1BBL.OKT3(APC3.1)细胞系。然后，转导APC2.1和APC3.1以表达IL-7mcherry和IL-15/15R构建体，分别得到K562.64.4-1BBL.OKT3.IL-7mcherry.IL-15/15R(APC4.1)细胞系和K562-65.4-1BBL.86.OKT3. IL-7mcherry.IL-15/15R(APC5.1)细胞系。通过流式细胞术验证CD64、4-1BBL、CD86、OKT3、 IL-7、IL-15/15R表面蛋白的表达。通过单细胞分选，随后体外扩增，建立新创建的APC4.1 和APC5.1的各种克隆。具体地，然后选择APC4.1的维持CD64、4-1BBL、OKT3、IL-7、 IL-15R的表达的几种克隆用于进一步培养(图14A-14B)。同样地，基于另外的CD86表达，类似选择APC5.1的几种克隆用于进一步扩增和使用(图15A-15B)。根据增殖，选择APC4.1 和APC5.1的两个克隆进行进一步测试(图16)。然后在不同的传代检查APC4.1克隆6(4B3) 和20(4G4)的选定克隆，用于维持转基因表达(图17-18)。APC5.1克隆33(6F2)显示了随时间的稳定转基因表达(图19)。以每毫升5x105个细胞的细胞密度平板接种选择的克隆过夜，用于IL-7、IL-15和IL-15Ra检测。ELISA测定显示了APC4.1克隆20能够分泌4ng/mL IL-7 和7.5ng/mLIL-15，而APC5.1克隆33可以分泌3ng/mL IL-7和8ng/mL IL-15。用抗CD3 F12Q构建体转导K562.64.86细胞以创建K562.F12Q.64。
用于流式细胞术的抗体：购买CD64-PE-cy7(Biolegend,Cat#305022)、41BBL-APC(Cat #311506)、CD86-BV650(Biolegend,Cat#305428)和IL-15Ra-FITC(eBioscience,Cat#11-7159-42)用于流式细胞术。生物素-山羊-抗小鼠IgG Fab(Jackson Immuno Research,Cat #115-065-072)和链霉抗生物素-PE(BD,Cat#554061)用于检测抗CD3 OKT3。生物素化的人CD3ε蛋白(AcroBiosystems Cat#CDE-H82E1)和链霉抗生物素-PE用于检测抗CD3F12Q。
aAPC的照射：在RPMI 1640+5％人血清中扩增aAPC并将细胞重新悬浮至每毫升2.5x107个细胞并使用照射器XRAD 320iX在100Gy下进行照射。
体外T细胞扩增：解冻多发性骨髓瘤患者(n＝3)的冷冻保存的淘析淋巴细胞或白细胞分离术，并使用CD4和CD8微珠(Miltenyi Biotec,Cat#130-045-101和130-045-201)选择 CD4和CD8 T细胞。对不同的培养基，用CTS CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher,Cat#40203D)以1:3的T：珠比，或用可溶性抗CD3/CD28 Cloudz(Quad Technologies，根据制造商方案)，或用不同的aAPC以1:1的T：照射的aAPC比，刺激T细胞7天。将2x106个T 细胞平板接种在含有细胞因子5ng/mL IL-7(Miltenyi Biotec,Cat#170-076-111)和IL-15 (MiltenyiBiotec,Cat#170-076-114)的不同培养基中的G-REX 24-孔板中，用APC4.1和 APC5.1刺激T细胞除外。几种培养基制剂已经用于比较T细胞扩增。将具有或不具有5％ CTS免疫细胞SR(Thermo Fisher,Cat#A2596101)的OpTmizer(Thermo Fisher,Cat# A1048501)或1B2H与基于X-VIVO15(Lonza,Cat#04-744Q)的修饰的培养基进行比较，其在之前进行了描述。通过Coulter Counter Multisizer 4测量细胞数量和体积。收集上清液用于通过ELISA检测培养基中的IL-7和IL-15。
实施例1：表达基于OKT3的CAR的aAPC细胞的创建
为了开发能够在体外扩增人T细胞的人工APC而无需繁琐的制备步骤(包括用外源抗体包被细胞)，进行了一系列研究以创建基于K562的APC，该APC表达膜结合的抗人CD3 抗体OKT3的scFv版本。开发步骤的流程图在图1A中说明。K562亲代细胞以及表达共刺激蛋白CD86和Fc受体CD64的K562细胞被转导以表达OKT-CAR构建体，分别产生 K562.OKT3和K562.64.86.OKT3细胞系。通过流式细胞术验证OKT3 CAR、CD64和CD86 表面蛋白的表达(图1B-1C)。结果与未转导的对照(UTD)进行比较。
通过单细胞分选和然后体外扩增建立了新创建的K562.OKT3细胞系的各种克隆。然后选择两个具有最高表达OKT3 CAR的克隆进行进一步培养(图2)。同样，基于CD3 CAR 表达水平，类似地选择了K562.64.86.OKT3细胞系的两个克隆用于进一步扩增和使用(图 3)。
然后将选定的aAPC系用于体外刺激人T细胞的扩增。将正常供体T细胞与各种K562细胞系共温育9-12天，在此期间在不同时间点评估T细胞的数量(图4)。在这些研究中，抗CD3/CD28包被的珠用作阳性对照。单独的未刺激的T细胞用作阴性对照。得到最大T 细胞扩增的aAPC克隆是那些同时表达OKT3 CAR和CD86的克隆，这验证了这些细胞向 T细胞提供信号1和2的能力，这是最佳活化所需要的。使用基于K562的aAPC的刺激比使用包被抗CD3和抗CD28抗体的市售微珠制剂更有效。
实施例2：能够扩增人和灵长类动物T细胞的aAPC的开发
虽然基于OKT3的aAPC能够扩增人T细胞，但仍需要能够扩增人和非人类灵长类动物起源的T细胞的aAPC。为了选择对这两种物种具有最高可能亲和力的抗体，筛选了许多已经构建的双特异性T细胞接合剂(BiTE)分子(参见，PCT/EP2009/062795)。这些分子对人和食蟹猴起源的黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)和CD3具有特异性(图5，通过PCT 申请PCT/EP2009/062795的背景部分重现)。衍生自F12Q抗CD3 scFv的BiTE表现出对人和食蟹猴CD3的最高亲和力，随后被选择用于进一步开发成抗CD3 scFv CAR。
然后将基于F12Q的CAR转导到K562亲代细胞和表达CD86和CD64的K562细胞中，然后克隆选择那些具有最高CD3 CAR表达和扩增人和灵长类动物T细胞的最大能力的细胞。这些研究的流程图如图6所示。为了检测F12Q scFv在细胞表面的表达，筛选了大量抗IgG抗体的结合(图7)。由于测试的抗体均未表现出任何可检测的结合，随后的研究使用生物素化的CD3蛋白作为主要染色，然后用PE缀合的链霉抗生物素进行复染。
F12Q CAR-表达K562.64.86细胞用于扩增来自人供体和两类非人灵长类动物(恒河猴和食蟹猴)的T细胞。作为对照，基于的OKT3-CAR的aAPC被用于进行比较。与F12Q 抗体的跨物种特异性一致，基于F12Q-CAR的aAPC有效地促进了来自所有三个物种的T 细胞的扩增(图8)。类似地，只有人T细胞在用表达OKT3-CAR的aAPC刺激后扩增。在这两项研究中，通过评估细胞数量的倍数增加来确定扩增。培养9天后对CD3和CD8的染色进一步证明了CD3阴性T细胞的损失，因此CD3+T细胞优先扩增和存活(图9)。
为了使用流式细胞术对表达抗CD3 CAR的aAPC进行特异性染色以进行鉴定，使用可溶性CD3-ε蛋白和PE缀合的链霉抗生物素复染。使用从0.6025μg/ml到5μg/ml范围内的各种浓度的CD3ε蛋白进行滴定研究表明，染色清晰且背景最小(图10)。这种CD3 CAR 染色策略用于选择显示最高水平表达的两个表达F12Q-CAR的aAPC克隆，以供进一步使用(图11)。
实施例3：增强aAPC以递送最佳T细胞刺激
表达CD3-CAR的aAPC细胞的开发表示了对基于K562的aAPC先前迭代的实质性改进，因为内源性表达的膜结合抗CD3 scFv构建体避免了抗CD3抗体在与T细胞共培养之前在体外加载到Fc受体上，这是前几代aAPC所需的步骤。随着基于CAR的免疫疗法发展为更常见的临床治疗，除了在这个变得越来越重要的过程中节省时间和劳动力之外，抗 CD3 CAR还消除了寻找和测试抗CD3抗体的持续费用。
即使在多轮体外刺激后，在T细胞培养物中使用外源性细胞因子如IL-7和IL-15也可促进效应细胞功能的最佳扩增和维持。与使用抗CD3 CAR类似，修饰aAPC以分泌IL-7 和IL-15提供了这些因素的好处，而无需用纯化的制剂补充培养物。表达K562 OKT3-CAR 的aAPC被转导以分泌IL-7，其具有还表达红色荧光蛋白(RFP)mCherry作为可追踪标记的结构。然后对细胞进行进一步工程化，以分泌通过接头与IL-15Rα链(寿司(sushi)结构域) 连接的IL-15杂复合物。这种修饰版本的IL-15已被证明是比单独的重组细胞因子具有更高亲和力的IL-15激动剂。基于K562的aAPC开发进展如图12所示。每个“版本”都包含额外的功能，以提高处理和T细胞刺激的效率。
从转导的“APC4.1”细胞(CD64+4-1BBL+OKT3-CAR+IL-7+IL-15+CD86neg)建立十个克隆，并通过流式细胞术评估转导分子的表达(图14A-14B)。转导的“APC5.1”细胞 (CD64+4-1BBL+OKT3-CAR+IL-7+IL-15+CD86+)的类似染色也鉴定出许多具有高表达转导蛋白的克隆(图15A-15B)。然后选择七个“APC4.1”和六个“APC5.1”克隆进一步筛选它们扩增人T细胞的能力(图16)。结果表明“APC4.1”和“APC5.1”型aAPC都具有扩增人T细胞的能力，但是“APC5.1”aAPC得到更大程度的扩增。基于转基因表达和刺激 T细胞扩增的能力，选择每个“版本”的两个克隆用于进一步开发。为了评估转基因表达的稳定性，然后将这些克隆培养多达9次传代，并对CD64、4-1BBL、CD86、IL-15R和 OKT3-CAR表达进行染色(通过mCherry表达确定IL-7表达)。与低传代细胞相比，“APC4.1” (图17)和“APC5.1”(图19)均保持高水平的蛋白质表达(图18，显示“APC4.1”克隆)。还通过ELISA评估了各种克隆的细胞因子分泌(图20)。之前通过流式细胞术染色基于其刺激功效和转基因表达鉴定的那些克隆也证明了产生大量细胞因子的能力，如通过ELISA测量的。
然后确定T细胞扩增8天后培养基中细胞因子的存在。在这些研究中，与添加了外源 IL7和IL-15的各种培养条件(包括APC2.0、3.0、2.1和3.1aAPC细胞、抗CD3抗体(2D11)以及市售的抗CD3/抗CD28包被的珠相比，评估了APC5.1和APC4.1细胞连续产生IL-7 和IL-15的能力。此外，还评估了两种无血清培养基：X-VIVO和OpTmizer。通过ELISA 测量IL-7(图21A)、IL-15(图21B)和IL-15/15R(图21C)揭示了APC4.1和APC5.1细胞等效产生IL-15。同样，正如预期的那样，这些细胞是唯一产生IL-15R的细胞。然而，这些细胞中的IL-7产量低于接受外源IL-7的组。
在刺激T细胞扩增后，aAPC在培养物中的持续存在可能对生成的T细胞的健康有害，因为非T细胞会导致过度拥挤并消耗支持T细胞所需的营养。因此，传统的T细胞培养方案通常包括对刺激细胞进行阻止其生长的处理，包括照射或用丝裂霉素C处理。这一步骤也是生产用于免疫疗法的T细胞的关键，因为它最大限度地减少了在输注到患者体内之前去除非T细胞所需要对培养物进行的纯化的量。APC4.1和APC5.1 aAPC在用于T细胞扩增共培养之前进行照射。7天后，通过用活性染料7-AAD染色细胞并评估mCherry表达来评估培养物中剩余的aAPC细胞(图22)。结果显示几乎没有持续存在的aAPC(图23)。如 7-AAD阳性所示(图24)，那些对mCherry呈阳性的细胞一律无法存活。
实施例4：用于治疗用途的T细胞的高效率扩增
基于细胞的免疫疗法如表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞需要使用GMP相容的方法从个体患者中产生大量T细胞。虽然目前的方法通常使用WAVE生物反应器技术，但GREX 生物反应器提供了在更短的时间内以更低的成本扩增等量细胞数量的可能性(图13)。为了评估将APC4.1和APC5.1 aAPC与GREX生物反应器结合的可行性，进行了一系列研究，将这些aAPC与常规抗CD3/CD28微珠(BDS)和可溶性抗CD3/CD28刺激剂Cloudz(QUAD) 在几种培养基制剂中进行比较(图25)。在7天的时间里评估了来自三名人类患者的T细胞的倍数扩增。根据条件，APC4.1和APC5.1细胞诱导的扩增与微珠相似或更好。同样，在每种刺激条件下，每位患者在第0天和第7天之间的细胞大小比较发现了一致的结果(图 26和图29)。然后再刺激使用这些方法扩增的T细胞，然后评估TNFα和IFNγ的产生(图 30)。用APC4.1和APC5.1细胞扩增得到与抗CD3/抗CD28 dynabeads相似或更好的水平的细胞因子产生，其中APC5.1诱导最大的细胞因子产生。这些结果表明，APC4.1和APC5.1 aAPC细胞可以成功地与高效的生物反应器一起使用，以产生大量的T细胞，足以在诸如免疫疗法等应用中进一步使用。
CD4+调节T细胞(Tregs)的大量扩增提供了使用过继性T细胞疗法来减少或改善由不适当或过度免疫活化引起的免疫疾病的能力。为了确定本公开的aAPC和培养方法是否可以有效扩增调节T细胞，从供体外周血中分选CD4+Treg并通过在具有5％人AB血清、 1X谷氨酰胺、1X pen/strep和200IU/mL IL-2的XVIVO培养基中与APC3.1共培养来扩增 13天。然后在第9天用APC3.1再刺激细胞。图27A是说明CD4+Treg在研究过程中有效扩增的生长曲线。在第14天，针对CD4、CD8、CD25和Foxp3表达对细胞进行染色(图 27B)，这表明扩增的细胞保留了与CD4+调节T细胞一致的表达表型。如果细胞也可以被工程化以表达嵌合抗原受体，那么扩增的Treg的临床效用将会增加。通过这种方式，扩增的Treg可以针对特异性抗原靶标。为了评估CD4+Treg是否使用本发明的aAPC扩增，从非人灵长类动物(食蟹猴)外周血中分选的Treg用IL-2照射的K562.F12Q.64.86细胞刺激。在第2天，将编码人HLA-A2特异性CAR的病毒添加到细胞培养物中。在第7天，用照射的K562.A2.86细胞再刺激细胞，使得只有CAR+细胞会扩增，从而增加CAR+细胞的百分比。在第7天和第14天，对扩增Treg评估CAR的表达和CD25的表达(图28)。这些染色表明Treg被有效地转导并保留了CD25表达。总之，不希望受理论束缚，这些结果证明了本发明的aAPC在体外扩增来自人和非人灵长类动物供体的CD4+调节T细胞的效用，使得扩增的细胞保持有效地转导以表达嵌合抗原受体构建体的能力，这增加了它们的临床效用。
实施例5：使用aAPC衍生的膜囊泡扩增T细胞
从本公开的APC生产功能性纳米颗粒或膜囊泡将为大规模T细胞扩增提供相对于完整aAPC的若干益处。对于需要同时转导扩增T细胞的应用，使用aAPC衍生的囊泡可以提高病毒转导系统的效率。例如，aAPC衍生的囊泡与病毒颗粒相互作用的能力较低，从而阻止培养混合物的aAPC部分吸收大量病毒。同样，aAPC衍生的囊泡不需要通过可能不利影响培养的T细胞的处理(如细胞毒性化学品、辐射等)来灭活aAPC。此外，aAPC囊泡没有代谢活性，不需要后续纯化程序以从得到的扩增的T细胞群中去除它们。虽然许多细胞破坏方法在本领域中是已知的并且适用于产生aAPC衍生的囊泡或纳米颗粒，但氮空化方法提供了几个优点，因为该方法简单并且需要最少的细胞操作并且不需要化学去污剂。图31A展示了氮空化压力容器(也称为“弹式容器”)的两个实例。图31B说明了生成aAPC 衍生的膜囊泡的实例工作流程。图32说明了一系列研究，其中本发明的APC5.1细胞被用于使用氮空化创建囊泡制剂。该图说明了由该程序产生的颗粒的平均尺寸。然后将这些 APC5.1衍生的囊泡制剂与人类供体T细胞一起温育9天。图33说明了观察到起源自囊泡制剂的CD86和CD64分子存在于T细胞表面，表明细胞和囊泡之间的成功相互作用。图 34和35说明了aAPC衍生的囊泡在体外诱导T细胞增殖的能力。使用作为扩增T细胞的最常用方法之一的抗CD3/抗CD28包被的珠进行比较。在3.125μl至50μl的各种囊泡浓度下，CD8+和CD4+T细胞均表现出与珠相比相当或更好的增殖能力。还进行了类似的研究，以观察aAPC衍生的囊泡的T细胞刺激是否也可以支持使用带有GFP表达构建体的慢病毒载体同时进行T细胞的病毒转导(图36)。与增殖数据相似，aAPC衍生的囊泡扩增的T 细胞在许多浓度下表现出与珠刺激的T细胞相当的水平的GFP的稳健表达。总之，这些数据表明aAPC衍生的囊泡作为与抗CD3/抗CD28微珠相当的T细胞有效扩增方法的功效 (图37)。
列举的实施方式
提供了以下列举的实施方式，其编号不应被解释为指定重要性级别。
实施方式1提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
实施方式2提供了实施方式1的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ IDNO: 6所示的氨基酸序列的重链可变区。
实施方式3提供了实施方式1或2的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
实施方式4提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
实施方式5提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施方式6提供了实施方式5的aAPC，其中所述scFv包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
实施方式7提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述非人类灵长类是食蟹猴。
实施方式8提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述非人类灵长类是猕猴。
实施方式9提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子还包含细胞内结构域。
实施方式10提供了实施方式9的aAPC，其中所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
实施方式11提供了实施方式9的aAPC，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
实施方式12提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
实施方式13提供了实施方式12的aAPC，其中所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
实施方式14提供了实施方式12的aAPC，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
实施方式15提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，该抗原结合结构域对人CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
实施方式16提供了实施方式15的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列的重链可变区。
实施方式17提供了实施方式15或16的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
实施方式18提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含 SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
实施方式19提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
实施方式20提供了实施方式19的aAPC，其中所述scFv包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
实施方式21提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子还包含铰链结构域。
实施方式22提供了实施方式21的aAPC，其中所述铰链结构域是CD8铰链结构域。
实施方式23提供了实施方式21的aAPC，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
实施方式24提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
实施方式25提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列。
实施方式26提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子包含SEQID NO:23或24所示的氨基酸序列。
实施方式27提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子由包含SEQ ID NO：25或26所示的核酸序列的核酸编码。
实施方式28提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子由SEQ IDNO：23或24所示的氨基酸序列组成。
实施方式29提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子由SEQ IDNO：25或26所示的核酸序列组成的核酸编码。
实施方式30提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述嵌合受体分子是组成型表达的。
实施方式31提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
实施方式32提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述工程化的K562细胞不内源性表达选自以下的一种或多种分子：HLAI类、HLA II类、CD1d、CD16、CD64、CD83、 CD86、4-1BBL、OX40L、ICOSL、CD40L、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。
实施方式33提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体。
实施方式34提供了实施方式33的aAPC，其中所述Fc受体是CD64。
实施方式35提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的共刺激分子。
实施方式36提供了实施方式35的aAPC，其中所述共刺激分子是CD86。
实施方式37提供了任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体和在细胞表面表达的共刺激分子。
实施方式38提供了实施方式37的aAPC，其中所述Fc受体是CD64，和所述共刺激分子是CD86。
实施方式39提供了实施方式33-38中任一项的aAPC，其中所述aAPC载有抗体，其中所述抗体的Fc片段与所述Fc受体结合。
实施方式40提供了实施方式39的aAPC，其中所述抗体对选自以下的分子具有特异性：CD3、CD28、PD-1、B7-H3、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HLA-DR、MHCII、Toll 配体受体和LFA-1。
实施方式41提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC还包含共刺激配体。
实施方式42提供了实施方式41的aAPC，其中所述共刺激配体选自CD7、B7-1(CD80)、 PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6、以及与B7-H3特异性结合的配体。
实施方式43提供了实施方式41或42的aAPC，其中所述共刺激配体是4-1BBL。
实施方式44提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC表达选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、 IL-21、IL-35和TGF-β。
实施方式45提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC表达IL-7。
实施方式46提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC表达IL-15。
实施方式47提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC表达IL-7和IL-15。
实施方式48提供了任一项前述实施方式的aAPC，其中所述aAPC表达IL-15R。
实施方式49提供了实施方式49的aAPC，其中所述IL-15R是IL-15Rα。
实施方式50提供了实施方式44-49中任一项的aAPC，其中所述细胞因子是组成型表达的。
实施方式51提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
实施方式52提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
实施方式53提供了实施方式51或52的aAPC，其中所述aAPC还包括IL-15R。
实施方式54提供了实施方式53的aAPC，其中所述IL-15R是IL-15Rα。
实施方式55提供了包括任一项前述实施方式的aAPC的组合物。
实施方式56提供了实施方式55的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
实施方式57提供了刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与实施方式1-56中任一项的人工呈递细胞(aAPC)接触。
实施方式58提供了实施方式57的方法，其中所述T细胞是自体T细胞。
实施方式59提供了实施方式57或58的方法，其中所述T细胞是人T细胞。
实施方式60提供刺激和扩增调节T细胞(Treg)的方法，包括使所述Treg与实施方式 1-56中任一项所述的人工呈递细胞(aAPC)接触。
实施方式61提供了实施方式60的方法，其中所述调节T细胞是人T细胞。
实施方式62提供了实施方式60的方法，其中所述调节T细胞是非人灵长类T细胞。
实施方式63提供了实施方式62的方法，其中所述非人类灵长类是食蟹猴。
实施方式64提供了实施方式62的方法，其中所述非人类灵长类是猕猴。
实施方式65提供了刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
实施方式66提供了刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；
4-1BBL；
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
实施方式67提供了包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
实施方式68提供了实施方式67的组合物，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
实施方式69提供了实施方式68的组合物，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
实施方式70提供了包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
实施方式71提供了实施方式69的组合物，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
实施方式72提供了实施方式71的组合物，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
实施方式73提供了刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与实施方式67至69或实施方式70至72的组合物接触。
实施方式74提供了刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
实施方式75提供了实施方式74的方法，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
实施方式76提供了实施方式75的方法，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
实施方式77提供了刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
实施方式78提供了实施方式77的方法，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
实施方式79提供了实施方式78的方法，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
其他实施方式
在本文中对变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将该变量定义为任何单个元素或所列元素的组合(或子组合)。本文实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
应当理解，在本文中提供值和范围的任何地方，这些值和范围所涵盖的所有值和范围均意在涵盖在本发明的范围内。此外，本申请还考虑落入这些范围内的所有值，以及值范围的上限或下限。
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开均通过引用整体并入本文。虽然本发明已参照具体实施方式进行了公开，但明显的是，本领域的其它技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求意在解释为包括所有此类实施方式和等效变型。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学董事会
J·L·瑞里
G·埃利斯
J·许
J·J·梅伦霍斯特
<120> 产生抗CD3 SCFV和细胞因子的人工抗原呈递细胞
<130> 046483-7268WO1(02461)
<150> 美国临时申请号62/941,062
<151> 2019-11-27
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q HCDR1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q HCDR2
<400> 2
Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q HCDR3
<400> 3
Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q LCDR1
<400> 4
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q LCDR3
<400> 5
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q VH
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F112Q VL
<400> 7
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 8
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q scFv
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 9
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q CAR
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
100 105 110
Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly
115 120 125
Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser
165 170 175
Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val
180 185 190
Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
195 200 205
Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro
210 215 220
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp
245 250 255
Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260 265 270
Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
340 345 350
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
355 360 365
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
370 375 380
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
405 410 415
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
420 425 430
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
435 440 445
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 HCDR1
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 HCDR2
<400> 11
Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 HCDR3
<400> 12
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 LCDR1
<400> 13
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 LCDR3
<400> 14
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 VL
<400> 16
Ser Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 17
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 scFv
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
225 230 235 240
Arg Ala Ala Ala
<210> 18
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CAR
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met
165 170 175
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
195 200 205
Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q CAR 细胞内结构域
<400> 19
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 20
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CAR 细胞内结构域
<400> 20
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
65 70
<210> 21
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 铰链结构域
<400> 21
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 TM结构域
<400> 22
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 23
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q 嵌合受体
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
100 105 110
Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly
115 120 125
Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser
165 170 175
Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val
180 185 190
Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
195 200 205
Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro
210 215 220
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu
225 230 235 240
Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp
245 250 255
Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260 265 270
Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
340 345 350
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
355 360 365
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
370 375 380
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
405 410 415
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
420 425 430
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
435 440 445
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 24
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 嵌合受体
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met
165 170 175
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
195 200 205
Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Ala Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys
<210> 25
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F12Q 嵌合受体
<400> 25
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggatccg aagtacaact tgtagagtct ggagggggac tcgtccagcc cggtggctcc 120
ctgaaacttt catgcgcagc aagcgggttc acgtttaact cttatgcaat gaattgggtc 180
cgacaagctc caggcaaagg acttgaatgg gtcgccagga ttcggagcaa atacaacaac 240
tacgcgacat attatgctga tagtgtaaaa ggacggttca cgatctcaag agacgattct 300
aagaatacag cgtatcttca aatgaacaac ttgaaaacag aagacaccgc cgtttattat 360
tgcgtcagac atggcaactt tggaaacagt tacgtttctt ggtgggccta ctggggtcaa 420
gggacgcttg tcaccgtcag ctcaggaggc gggggatctg gcggcggcgg ttcaggtggt 480
ggtggatctc agacagtggt cacacaagag ccatcactta ccgtatcccc tggggggact 540
gtaaccctta cctgcgggtc ctctacgggg gctgttacta gcggcaacta tccaaactgg 600
gtgcaacaaa agcctggtca agctccccgc gggctgatcg gcggtactaa gttccttgcg 660
ccgggcactc ctgcaagatt ttcaggttct cttcttgggg gaaaagctgc attgactctc 720
agtggtgtcc agccggagga cgaagccgag tattactgtg tcctctggta ttccaatagg 780
tgggtgttcg ggggtggtac taaactcact gtgctttccg gaaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1080
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1140
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1200
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1260
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1320
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1368
<210> 26
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 嵌合受体
<400> 26
atggcactgc ccgtgaccgc cctcctcctg cccctcgcgc tactcctgca cgccgccaga 60
ccccaggtgc agctgcagca gagtggcgct gagctggccc gccccggcgc ctccgtgaag 120
atgtcctgca aggctagtgg gtataccttc accaggtata ctatgcactg ggtgaagcag 180
cgtccggggc aggggctcga gtggatcggc tacatcaatc cctcccgcgg ctacaccaat 240
tacaaccaga agttcaagga taaggccacg ctgaccacag acaagagtag ctccacggcc 300
tacatgcagt tatcaagtct gacctctgag gactccgctg tgtactattg tgcgaggtac 360
tacgacgacc actactgtct ggactactgg ggccaaggca caaccctgac tgtaagttcc 420
tccggcggcg gggggtccgg cggcggcggc tccggcgggg ggggtagtat cgtgctgaca 480
cagagtcccg caatcatgtc cgcaagcccc ggagagaagg tgaccatgac gtgtagtgct 540
tccagctccg tgtcctatat gaactggtac cagcagaaat ccgggacttc ccccaagaga 600
tggatctacg acaccagtaa gctggccagt ggcgtgcctg cacacttccg cggcagtggc 660
tccggcacta gttacagtct caccatctcc gggatggaag ctgaggacgc cgctacctac 720
tactgccagc agtggagctc gaacccattc accttcggtt cggggaccaa gctcgagatc 780
aacagggcgg ccgccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagtaa 1020
taa 1023
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复N次，其中N=至少1的整数
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(4)
<223> 重复N次，其中N=至少1的整数.
<400> 28
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 重复N次，其中N=至少1的整数.
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 30
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 31
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 32
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 33
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 34
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 35
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GS 接头核苷酸
<400> 38
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 40
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 41
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 42
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 43
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 44
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 45
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 46
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 47
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 48
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 49
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 50
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Tyr Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15

Claims (79)

1.人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
6.根据权利要求5所述的aAPC，其中所述scFv包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
7.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述非人类灵长类动物是食蟹猴。
8.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述非人类灵长类动物是猕猴。
9.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子还包含细胞内结构域。
10.根据权利要求9所述的aAPC，其中所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
11.根据权利要求9所述的aAPC，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
12.人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的aAPC，其中所述细胞内结构域包括CD3ζ的细胞内结构域。
14.根据权利要求12所述的aAPC，其中所述细胞内结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
15.人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域和跨膜结构域，该抗原结合结构域对人CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中其中HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区。
17.根据权利要求15或16所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
18.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域包括包含SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区。
19.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)。
20.根据权利要求19所述的aAPC，其中所述scFv包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
21.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子还包含铰链结构域。
22.根据权利要求21所述的aAPC，其中所述铰链结构域是CD8铰链结构域。
23.根据权利要求21所述的aAPC，其中所述铰链结构域包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
24.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
25.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
26.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子包含SEQ ID NO:23或24所示的氨基酸序列。
27.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子由包含SEQ ID NO：25或26所示的核酸序列的核酸编码。
28.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子由SEQ ID NO：23或24所示的氨基酸序列组成。
29.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子由SEQ ID NO：25或26所示的核酸序列组成的核酸编码。
30.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述嵌合受体分子是组成型表达的。
31.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
32.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述工程化的K562细胞不内源性表达选自以下的一种或多种分子：HLA I类、HLA II类、CD1d、CD16、CD64、CD83、CD86、4-1BBL、OX40L、ICOSL、CD40L、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。
33.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体。
34.根据权利要求33所述的aAPC，其中所述Fc受体是CD64。
35.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的共刺激分子。
36.根据权利要求35所述的aAPC，其中所述共刺激分子是CD86。
37.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC还包含在细胞表面表达的Fc受体和在细胞表面表达的共刺激分子。
38.根据权利要求37所述的aAPC，其中所述Fc受体是CD64，和所述共刺激分子是CD86。
39.根据权利要求33-38中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC载有抗体，其中所述抗体的Fc片段与所述Fc受体结合。
40.根据权利要求39所述的aAPC，其中所述抗体对选自以下的分子具有特异性：CD3、CD28、PD-1、B7-H3、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HLA-DR、MHCII、Toll配体受体和LFA-1。
41.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC还包含共刺激配体。
42.根据权利要求41所述的aAPC，其中所述共刺激配体选自CD7、B7-1(CD80)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6、以及与B7-H3特异性结合的配体。
43.根据权利要求41或42所述的aAPC，其中所述共刺激配体是4-1BBL。
44.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC表达选自以下的一种或多种细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-35和TGF-β。
45.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC表达IL-7。
46.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC表达IL-15。
47.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC表达IL-7和IL-15。
48.根据任一项前述权利要求所述的aAPC，其中所述aAPC表达IL-15R。
49.根据权利要求49所述的aAPC，其中所述IL-15R是IL-15Rα。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的aAPC，其中所述细胞因子是组成型表达的。
51.人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
52.人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列DTS，和LCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
53.根据权利要求51或52所述的aAPC，其中所述aAPC还包括IL-15R。
54.根据权利要求53所述的aAPC，其中所述IL-15R是IL-15Rα。
55.包括根据任一项前述权利要求所述的aAPC的组合物。
56.根据权利要求55所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
57.刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与权利要求1-56中任一项所述的人工呈递细胞(aAPC)接触。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述T细胞是自体T细胞。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述T细胞是人T细胞。
60.刺激和扩增调节T细胞(Treg)的方法，包括使所述Treg与权利要求1-56中任一项所述的人工呈递细胞(aAPC)接触。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述调节T细胞是人T细胞。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述调节T细胞是非人灵长类动物T细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述非人类灵长类动物是食蟹猴。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述非人类灵长类动物是猕猴。
65.刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
66.刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)接触，其中所述aAPC包括：
嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；
4-1BBL；
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞。
67.包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
70.包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
71.根据权利要求69所述的组合物，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
73.刺激和扩增T细胞的方法，其包括使所述T细胞与根据权利要求67至69或权利要求70至72所述的组合物接触。
74.刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
CD64；
CD86；和
4-1BBL，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
77.刺激和扩增T细胞的方法，包括使所述T细胞与包含衍生自人工抗原呈递细胞(aAPC)的膜囊泡的组合物接触，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括嵌合受体分子，所述嵌合受体分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，该抗原结合结构域对人CD3和非人灵长类动物CD3具有特异性，其中所述抗原结合结构域包括：
包含三个重链互补决定区(HCDR)的重链可变区，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；和
包含三个轻链互补决定区(LCDR)的轻链可变区，其中LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列GTK，和LCDR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
CD64；和
CD86；和
4-1BBL；和
IL-15Rα，并且
表达IL-7和IL-15，
其中所述aAPC是工程化的K562细胞，以及
其中所述膜囊泡由所述aAPC的破坏产生。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述aAPC的破坏通过选自机械均化、超声均化、压力均化、温度循环和氮空化的方法来完成。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述aAPC的破坏通过氮空化来完成。
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