CN113528560A - 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法 - Google Patents

靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种对白蛋白具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。本公开还提供了包含CAR的组合物、编码CAR的多核苷酸、包含编码CAR的多核苷酸的载体、包含CAR的工程细胞及其使用方法。

Description

靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
相关申请
本申请是申请号为202110761493.0、申请日为2021年07月06日、发明名称为“靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请要求于2021年04月02日提交的PCT申请PCT/CN2021/085179的优先权日，所述PCT申请通过全文引用的方式并入。
技术领域
本公开大体上涉及细胞疗法领域。特别地，本公开涉及用于在白蛋白存在下扩增免疫细胞并刺激免疫反应的组合物和方法。
背景技术
哺乳动物的免疫系统能够识别和消除已被感染或受损的细胞以及那些已癌变的细胞。在癌症的情况下，免疫细胞如细胞毒性T细胞可以与癌细胞表面上的特定抗原(癌症抗原)结合并杀死癌细胞。利用免疫系统的这种天然能力，已开发出过继性细胞疗法，也称为细胞免疫疗法，以对抗癌症。根据细胞的来源和基因工程的方法，细胞免疫疗法可分为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、工程T细胞受体(TCR)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和自然杀伤(NK)细胞疗法。
癌症患者体内天然存在的T细胞通常能够靶向癌细胞。然而，仅这些T细胞的存在并不总是足以保证它们能够消除肿瘤。一个潜在的障碍是这些T细胞必须首先被激活，然后将活性保持足够长的时间以维持有效的抗肿瘤反应。为了解决这些问题，TIL疗法收获了已经浸润患者肿瘤的天然存在的T细胞，然后将其激活并扩增。然后将大量这些激活的T细胞重新注入患者体内，以摧毁肿瘤。
TIL疗法的一个问题是，并非所有患者都具有已经识别其肿瘤的T细胞。为了解决这个问题，TCR疗法从患者获取T细胞，并为T细胞配备新的T细胞受体，其使T细胞能够靶向特定的癌症抗原。
TIL和TCR疗法都只能靶向和消除通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递其抗原的癌细胞。为了克服这一限制，科学家们已经工程改造T细胞或NK细胞来表达与癌细胞表面上表达的抗原特异性结合的CAR，即使这些抗原没有通过MHC呈递在表面上。
当前细胞免疫疗法涉及激活和/或扩增从人类受试者分离的免疫细胞的步骤，这些步骤是昂贵且耗时的。因此，免疫细胞的离体激活和/或扩增已成为阻碍细胞免疫疗法广泛实施的主要障碍之一。因此，需要开发用于激活和/或扩增用于细胞免疫疗法的免疫细胞的新方法。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种编码嵌合抗原受体(CAR)蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，CAR包含(1)包含第一抗原结合域的胞外域，(2)跨膜域和(3)胞内信号传导域，其中第一抗原结合域与白蛋白特异性结合。
在一些实施方案中，第一抗原结合域是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，VH区包含HCDR1，其具有如表1所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；HCDR2，其具有如表2所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及HCDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，VL区包含LCDR1，其具有如表4所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；LCDR2，其具有如表5所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及LCDR3，其具有如表6所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，抗原结合域是单域抗体(SDAB)。在一些实施方案中，SDAB包含CDR1，其具有如表1所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表2所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，抗原结合域是纳米抗体。在一些实施方案中，纳米抗体包含CDR1，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，CAR蛋白还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含CD8α的信号肽。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:130的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，跨膜域包含CD8α的跨膜域。在一些实施方案中，CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO:132的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，胞外域通过铰链区连接至跨膜域。在一些实施方案中，铰链区包含CD8α的铰链区。在一些实施方案中，CD8α的铰链区包含SEQ ID NO:133的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域。在一些实施方案中，共刺激域包含CD137的胞内域。在一些实施方案中，CD137的胞内域包含SEQ ID NO:134的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，胞内域包含CD3ζ的信号传导域。在一些实施方案中，CD3ζ的信号传导域包含SEQ ID NO:135的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，CAR蛋白具有以下结构(从左至右为N末端到C末端)：S-AB-H-TM-IC，其中S是信号肽，AB是抗原结合域，H是铰链区，TM是跨膜域并且IC是胞内信号传导域。在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。
在一些实施方案中，CAR蛋白具有以下结构：S-SDAB-TM-IC，其中SDAB是单域抗体。
在一些实施方案中，CAR蛋白具有以下结构：S-N-TM-IC，其中N是纳米抗体。
在一些实施方案中，胞外域还包含第二抗原结合域，其与第一抗原结合域特异性结合白蛋白的不同表位。
在一些实施方案中，胞外域还包含与细胞表面抗原特异性结合的第二抗原结合域。在一些实施方案中，细胞表面抗原是癌症抗原。在一些实施方案中，癌症抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些实施方案中，胞外域还包含与白蛋白特异性结合的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域和第二抗原结合域结合白蛋白的不同表位。在一些实施方案中，胞外域还包含与癌症抗原特异性结合的第三抗原结合域。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸是RNA。
在另一个方面，本公开提供了由本文提供的多核苷酸编码的多肽。
在另一个方面，本公开提供了一种包含本文提供的多核苷酸的载体，其中编码CAR的多核苷酸可操作地连接于至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达CAR。
在一些实施方案中，载体是质粒载体、病毒载体、转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。
在另一个方面，本公开提供了一种包含本文提供的多核苷酸的工程细胞。在一些实施方案中，工程细胞是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，本文提供的工程细胞还包含第二CAR蛋白，其中第二CAR包含与癌症抗原特异性结合的第二抗原结合域。在一些实施方案中，癌症抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些实施方案中，本文提供的工程细胞还包含第二CAR蛋白，其中第二CAR包含与白蛋白特异性结合的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域和第二抗原结合域结合白蛋白的不同表位。在一些实施方案中，本文提供的工程细胞还包含第三CAR蛋白，其中第三CAR包含与癌症抗原特异性结合的第三抗原结合域。
在另一个方面，本公开提供了一种用于刺激免疫反应的方法，其包括使本文提供的工程细胞与白蛋白接触。在一些实施方案中，工程细胞与白蛋白离体接触。在一些实施方案中，通过向需要免疫刺激的受试者施用工程细胞而使工程细胞与白蛋白在体内接触。
在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(Pre-B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性赘瘤和真性红细胞增多症。
在一些实施方案中，刺激免疫反应包括增加免疫刺激细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子和/或分子是TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子中的一种或多种。
在一些实施方案中，刺激免疫反应包括增加免疫细胞的增殖。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种体外扩增细胞的方法，所述方法包括使本文提供的工程细胞在体外与包含白蛋白的组合物接触。在一些实施方案中，组合物还包含IL-2。在一些实施方案中，所述方法还包括使工程细胞与饲养细胞接触。在一些实施方案中，饲养细胞被辐照。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗患者的疾病或病理状况的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本文提供的工程细胞。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一些实施方案中，用于治疗疾病或病理状况的方法还包括通过包括使本文提供的工程细胞与包含白蛋白的组合物在体外接触的方法在体外扩增工程细胞。
附图说明
并入本文的附图构成本说明书的一部分。与此书面描述一起，附图进一步用于解释本公开的原理，并使相关领域的技术人员能够制造和使用本公开。
图1A示出了白蛋白通过CAR对免疫细胞的激活。将白蛋白CAR引入免疫细胞中。白蛋白二聚体诱导CAR二聚化并激活工程免疫细胞(阴影)。
图1B示出了白蛋白通过两种CAR对免疫细胞的激活。第一CAR包含第一抗原结合域，并且第二CAR包含针对白蛋白的第二抗原结合域。两种CAR在相同的工程免疫细胞中表达，并与同一白蛋白分子的不同表位结合。当两种CAR通过同一白蛋白分子二聚化时，工程免疫细胞被激活。
图1C示出了包含两个白蛋白结合域的CAR对免疫细胞的激活。当CAR在工程免疫细胞中表达时，一个白蛋白分子与两个CAR分子结合，为CAR的二聚化和细胞的激活搭建桥梁。
图1D示出了靶向白蛋白的CAR的瞬时表达。CAR通过DNA或mRNA转染表达，细胞被白蛋白激活。激活的细胞增殖，而最终细胞没有靶向白蛋白的CAR。
图2示出了示例性CAR构建体的示意图。
图3示出了表达靶向白蛋白的CAR会增强T细胞的离体扩增。通过慢病毒载体将靶向白蛋白的CAR递送至T细胞中。通过细胞计数监测细胞生长。与在约30天内扩增了200多倍的对照细胞相比，CAR阳性细胞扩增了60,000多倍。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可能会有变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于为限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利均被具体和单独指示为通过引用并入一般，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
如对本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个具有离散的组件和特征，其可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，容易地与其他若干实施方案中的任何一个的特征分离或组合。任何叙述的方法可以按照叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
定义
提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语或用语旨在具有本领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应被解释为表示与本领域通常理解的术语的定义相比具有实质性差异。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指代物。
“抗原”是指引起免疫反应的分子。这种免疫反应可以是体液反应，或细胞介导的反应，或两者兼有。本领域技术人员应理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。显而易见，本公开的抗原包括能够引发免疫反应的治疗性抗体。
“抗体”是指与抗原结合的免疫球蛋白(Ig)家族的多肽。例如，天然存在的IgG类型的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域(本文缩写为CL)构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其间散布着更保守的区，称为框架区(FR)。本文公开的抗体的CDR边界可以根据Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的惯例定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.),273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》,12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然》(Nature),12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,美国国家卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学》(Developmental and Comparative Immunology),27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究》(Immunome Research),1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学》(Molecular Biology of B cells)(第二版),第26章,481-514,(2015))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。
如本文所用，“抗原结合片段”是指由完整抗体的一部分形成的包含一个或多个CDR的抗体片段，或可以与抗原结合但不包含完整原生抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、单链Fv-Fc抗体(scFv-Fc)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、域抗体和二价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。
“自体细胞”是指来源于同一受试者的任何细胞，所述细胞随后将被重新引入。
“同种异体细胞”是指来源于相同物种的不同受试者的任何细胞。
“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供信号，除了由例如TCR/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合而提供的初级信号外，还介导T细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
在免疫细胞的上下文中使用的“效应细胞”是指可被激活以响应刺激而执行效应功能的细胞。效应细胞可包括但不限于NK细胞、细胞毒性T细胞和辅助T细胞。
“有效量”或“治疗有效量”是指有效实现所需生物学结果的在此描述的细胞、组合物、制剂或任何材料的量。此类结果可包括但不限于消除表达特定B细胞受体(BCR)的B细胞和由此产生的抗体。
“表位”是指抗体或其抗原结合片段所识别的抗原的一部分。表位可以是线性的或构象的。
多肽或多核苷酸上下文中的“同一性”或“序列同一性”的百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可能包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即间隙)，以便对两个序列进行最佳比对。如下计算百分比：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得出匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数，并且将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。
“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸序列之间的功能关系。在编码融合蛋白(如本公开的CAR的多肽链)的多核苷酸的上下文中，该术语是指两个或更多个多核苷酸序列接合，使得这些片段编码的氨基酸序列保持在框内。在转录或翻译调节的上下文中，该术语是指调节序列与编码序列的功能关系，例如，启动子在编码序列的正确位置和方向上，以便调节转录。
“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸链。如本文所用，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有多核苷酸序列，所述手段包括但不限于重组手段和合成手段。
“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
“单链可变片段”或“单链Fv抗体”或“scFv”是指包含轻链可变区直接或通过肽连接子序列与重链可变区融合的工程抗体。
“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞表面上的蛋白质复合物，其负责识别作为与MHC分子结合的肽的抗原片段。
“载体”是指可操作地插入多核苷酸，以便递送、复制或表达多核苷酸的载体。载体可以含有多种调节元件，包括但不限于复制起点、启动子、转录起始序列、增强子、可选标记基因和报告基因。载体还可以包括帮助其进入宿主细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或离子或两亲化合物。
注意，在本公开中，如“包含(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性的或开放式的，并且不排除额外未引用的要素或方法步骤。如“基本上由……组成(consistingessentially of/consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予的含义；它们允许包括不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的额外成分或步骤。术语“由……组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。
嵌合抗原受体
当前细胞免疫疗法涉及激活和/或扩增从人类受试者分离的免疫细胞的步骤，这些步骤是昂贵且耗时的。免疫细胞的离体激活和/或扩增是阻碍细胞免疫疗法广泛实施的主要障碍之一。在一个方面，本公开涉及一种特异性识别白蛋白的嵌合抗原受体(CAR)。可溶性形式的抗原通常缺乏触发CAR信号传导的能力，因为CAR激活需要抗原诱导的CAR二聚化。白蛋白是相当可溶的，但白蛋白分子之间的频繁接触提供了形成明确定义的聚集体(如二聚体、三聚体，甚至更大的结构)的机会：。在不希望受到任何理论束缚的情况下，本文公开的CAR能够对白蛋白聚集体作出反应，从而激活携带CAR的免疫细胞(图1A)。本文公开的CAR在离体、体外或体内响应于白蛋白增强免疫细胞(如T细胞)的激活和扩增方面是有用的。无论基于肿瘤浸润淋巴细胞、T细胞受体(TCR)工程或其他CAR，CAR也可用作辅助受体，以增强所有过继性T细胞疗法中T细胞介导的反应。
在一个方面，本公开提供了一种CAR蛋白，其包含与白蛋白特异性结合的胞外域、跨膜域和胞内信号传导域。在另一个方面，本公开提供了编码本文所述的CAR蛋白的多核苷酸。
术语“白蛋白”或“血清白蛋白”是指在脊椎动物血液中发现的白蛋白(一种球状蛋白)。血清白蛋白由肝脏产生，溶解在血浆中，是哺乳动物中最丰富的血液蛋白。在一些实施方案中，血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)、食蟹猕猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。在一些实施方案中，本文提供的血清白蛋白是HSA。
血清白蛋白高度可溶，可以聚集成二聚体、三聚体或甚至更大的结构。在一些实施方案中，白蛋白形成共价连接的二聚体，例如具有二硫键连接的Cys-34的二聚体。在一些实施方案中，白蛋白形成具有明确定义的结构的非共价二聚体。非共价二聚体的形成可以在生理学上相关的浓度下或响应于例如pH、流体动力学或温度的条件的变化而发生。非共价形成的二聚体可以容易地逆转为单体。二聚化与HSA在运输、结合和其他生理过程中的作用有关(Chubarov A.等人,《分子》(Molecules)2021,26,108)。
胞外域
在一些实施方案中，CAR的胞外域包含特异性结合白蛋白的第一抗原结合域。第一抗原结合域可以是抗体或其抗原结合片段(例如Fv、Fab、(Fab)2、scFv、SDAB、纳米抗体)，或本领域中已知的充当抗原结合域的任何替代性骨架。
在一些实施方案中，第一抗原结合域来源于CAR最终将被用于的同一物种。例如，CAR的抗原结合域包含的抗体或抗体片段的抗原结合域具有人残基或人源化残基可能是有益的。在一些实施方案中，抗原结合域包含人抗体或人源化抗体或其抗体片段。术语“人抗体”是指整个分子来源于人类或由与人类形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成的抗体。术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的序列(例如CDR序列)的抗体。人抗体或人源化抗体或其片段可以通过各种方式制备，例如通过重组方法或通过用感兴趣的抗原对小鼠进行免疫，该小鼠经基因修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体。
在一些实施方案中，第一抗原结合域是单链可变片段(scFv)。scFv可以在其VL和VH区之间包含至少1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的肽连接子。连接子序列可包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，连接子序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。连接子长度的变化可以保留或增强活性。
在一些实施方案中，scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，VH包含CDR1，其具有如表1所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表2所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，VL区包含CDR1，其具有如表4所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表5所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表6所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
表1
CDR1 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
HCDR1 克隆1 NYAIN 1
HCDR1 克隆2 NYGIH 2
HCDR1 克隆3 GFSLSSNAMG 3
HCDR1 克隆4 GFSFSSSYWIC 4
表2
CDR2 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
HCDR2 克隆1 IIWASGTTFYATWAKG 5
HCDR2 克隆2 SISPSGGLTYYRDSVKG 6
HCDR2 克隆3 IISVGGFTYYASWAKG 7
HCDR2 克隆4 CVFTGDGTTYYASWAKG 8
表3
CDR3 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
HCDR3 克隆1 TVPGYSTAPYFDL 9
HCDR3 克隆2 GGEGIFDY 10
HCDR3 克隆3 RDRHGGDSSGAFLY 11
HCDR3 克隆4 RPVSVYYYGMDL 12
表4
CDR1 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
LCDR1 克隆1 QSSPSVWSNFLS 13
LCDR1 克隆2 CRATQSIYNALA 14
LCDR1 克隆3 QSSESVYSNNQLS 15
LCDR1 克隆4 QASQIISSRSA 16
表5
CDR2 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
LCDR2 克隆1 EASKLTS 17
LCDR2 克隆2 NANTLHT 18
LCDR2 克隆3 DASDLAS 19
LCDR2 克隆4 QASKLAS 20
表6
CDR3 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
LCDR3 克隆1 GGGYSSISDTT 21
LCDR3 克隆2 QQYYDYPLT 22
LCDR3 克隆3 AGGFSSSSDTA 23
LCDR3 克隆4 QCTYIDSNFGA 24
在一些实施方案中，VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其具有选自由以下组成的组的序列：(1)SEQ ID NO:1、5和9，(2)SEQ ID NO:2、6和10，(3)SEQ ID NO:3、7和11，以及(4)SEQID NO:4、8和12，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，VL包含一组CDR1、CDR2和CDR3，其具有选自由以下组的序列：(1)SEQ ID NO:13、17和21，(2)SEQ ID NO:14、18和22，(3)SEQ ID NO:15、19和23，以及(4)SEQ ID NO:16、19和24，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，scFv包含：
包含SEQ ID NO:1、5和9的VH和包含SEQ ID NO:13、17和21的VL；
包含SEQ ID NO:2、6和10的VH和包含SEQ ID NO:14、18和22的VL；
包含SEQ ID NO:3、7和11的VH和包含SEQ ID NO:15、19和23的VL；或
包含SEQ ID NO:4、8和12的VH和包含SEQ ID NO:16、20和24的VL。
在一些实施方案中，scFv包含VH和VL，其包含表7中列出的序列，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或与其具有1、2、3、6、7、8、9、10个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，差异发生在CDR以外的区(例如FR中)。
表7
Figure BDA0003219799630000141
在一些实施方案中，scFv包含表8中列出的序列，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或与其具有1、2、3、6、7、8、9、10个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，差异发生在CDR以外的区(例如FR中)。
表8
Figure BDA0003219799630000142
在一些实施方案中，第一抗原结合域是单域抗体(SDAB)。术语“单域抗体”是指含有重链的单个可变域或轻链的单个可变域的抗体片段。在一些实施方案中，单域抗体含有1、2或3个互补决定区(CDR)。单域抗体的大小相当小，例如其分子量不超过25kD、不超过20kD、不超过15kD或不超过10kD。在一些实施方案中，单域抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，单个可变域来源于常规抗体(例如来自人或小鼠)重链的可变域(VH域)或普通抗体轻链的可变域(VL域)。
在一些实施方案中，SDAB包含CDR1，其具有如表9所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表10所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表11所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
表9
Figure BDA0003219799630000151
Figure BDA0003219799630000161
表10
CDR 克隆编号 序列 SEQ ID NO.
LCDR2 dAb7m12 AASRLQS 55
LCDR2 dAb7m16 GASRLQS 56
LCDR2 dAb7m26 KASTLQS 57
LCDR2 dAb7r1 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r3 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r7 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r4 NGSQLQS 59
LCDR2 dAb7r5 GAVSLQS 60
LCDR2 dAb7r8 YASILQS 61
LCDR2 dAb7r13 QASRLQS 62
LCDR2 dAb7r14 QASRLQS 62
LCDR2 dAb7r15 RTSWLQS 63
LCDR2 dAb7r16 NSSILQS 64
LCDR2 dAb7r17 NTSILQS 65
LCDR2 dAb7r18 QSSLLQS 66
LCDR2 dAb7r19 DASRLQS 67
LCDR2 dAb7h1 RNSFLQS 68
LCDR2 dAb7h2 RSSSLQS 69
LCDR2 dAb7h6 RLSVLQS 70
LCDR2 dAb7h7 RNSQLQS 71
LCDR2 dAb7h8 RNSPLQS 72
HCDR2 dAb7r20 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r21 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r22 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r23 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r24 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r25 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r26 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r27 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r28 TIHQTGFSTYYADSVKG 74
HCDR2 dAb7r29 MISSSGLWTYYADSVKG 75
HCDR2 dAb7r30 LIKPNGSPTYYADSVKG 76
HCDR2 dAb7r31 WIRPDGTFTYYADSVKG 77
HCDR2 dAb7r32 FIGREGYGTYYADSVKG 78
HCDR2 dAb7r33 SISSWGTGTYYADSVKG 79
HCDR2 dAb7h30 SITSSGSTYYADSVKG 80
HCDR2 dAb7h31 TITGTGAATYYADSVKG 81
表11
CDR 克隆编号 序列 SEQ ID NO:
LCDR3 dAb7m12 QQVALYPKT 82
LCDR3 dAb7m16 QQGARWPQT 83
LCDR3 dAb7m26 QQVRKVPQT 84
LCDR3 dAb7r1 QQRYRMPYT 85
LCDR3 dAb7r3 QQRYMQPFT 86
LCDR3 dAb7r4 QQRYLQPYT 87
LCDR3 dAb7r5 QQRYITYNT 88
LCDR3 dAb7r7 QQRYSSPYT 89
LCDR3 dAb7r8 QQTFSKPST 90
LCDR3 dAb7r13 QQKYLPPYT 91
LCDR3 dAb7r14 QQRYRVPYT 92
LCDR3 dAb7r15 QQTSQWPHT 93
LCDR3 dAb7r16 QQRYLSPYT 94
LCDR3 dAb7r17 QQRWRAPYT 95
LCDR3 dAb7r18 QQYHQMPRT 96
LCDR3 dAb7r19 QQTHNPPKT 97
LCDR3 dAb7h1 QQTYTVPPT 98
LCDR3 dAb7h2 QQTYAVPPT 99
LCDR3 dAb7h6 QQTYNVPPT 100
LCDR3 dAb7h7 QQTFAVPPT 101
LCDR3 dAb7h8 QQTYRLPPT 102
HCDR3 dAb7r20 GGKDFDY 103
HCDR3 dAb7r21 GNLEPFDY 104
HCDR3 dAb7r22 KLSNGFDY 105
HCDR3 dAb7r23 VVKDNTFDY 106
HCDR3 dAb7r24 NTGGKQFDY 107
HCDR3 dAb7r25 KTGPSSFDY 108
HCDR3 dAb7r26 RTENRGVSFDY 109
HCDR3 dAb7r27 SDVLKTGLDGFDY 110
HCDR3 dAb7r28 VRSMRPYKFDY 111
HCDR3 dAb7r29 GFRLFPRTFDY 112
HCDR3 dAb7r30 GRGRFNVLQFDY 113
HCDR3 dAb7r31 SYMGDRFDY 114
HCDR3 dAb7r32 SVASFDY 115
HCDR3 dAb7r33 GGQGSFDY 116
HCDR3 dAb7h30 VNSLYKFDY 117
HCDR3 dAb7h31 QNSRYRFDY 118
在一些实施方案中，SDAB包含LCDR1，其具有如表9所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；相应的LCDR2，其具有如表10所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及相应的LCDR3，其具有如表11所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，SDAB包含HCDR1，其具有如表9所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；相应的HCDR2，其具有如表10所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及相应的HCDR3，其具有如表11所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，SDAB包含VH，其包含表12中列出的序列，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，SDAB包含VL，其包含表12中列出的序列，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或与其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，差异发生在CDR以外的区(例如FR中)。
表12
Figure BDA0003219799630000181
在一些实施方案中，单域抗体是纳米抗体，其中单个可变域来源于骆驼科抗体的可变域(VHH域)或软骨鱼抗体的可变域(VNAR域)。骆驼科抗体和软骨鱼抗体都天然缺乏轻链而由一对重链组成。
在一些实施方案中，纳米抗体包含CDR1，其具有如表13所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表14所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表15所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
表13
CDR 克隆编号 序列 SEQ ID NO:
HCDR1 克隆1 TTCMA 123
HCDR1 克隆2 DYTTG 124
表14
CDR 克隆编号 序列 SEQ ID NO:
HCDR2 克隆1 TITTGGTYPYYADSVLG 125
HCDR2 克隆2 CISRSDGNTYYAESVL 126
表15
CDR 克隆编号 序列 SEQ ID NO:
HCDR3 克隆1 DASWGCRLSGSWSTVYNY 127
HCDR3 克隆2 ADRYRSGFLGNGYEYD 128
在一些实施方案中，纳米抗体包含HCDR1，其具有如表13所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；相应的HCDR2，其具有如表14所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及相应的HCDR3，其具有如表15所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方案中，纳米抗体包含VHH，其包含表16中列出的序列，或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或与其具有1、2、3、6、7、8、9、10个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，差异发生在CDR以外的区(例如FR中)。
表16
Figure BDA0003219799630000191
Figure BDA0003219799630000201
在一些实施方案中，胞外域还包含信号肽。如本文所用，术语“信号肽”是指存在于多肽的N端，通常具有5-30个氨基酸残基的长度，是分泌途径上跨膜转位和控制多肽进入分泌途径所必需的肽。
在一些实施方案中，信号肽包含CD8α的信号肽：在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:130的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgG的信号肽。
还设想，胞外域可以通过使抗原结合域多聚化，结合相同抗原(多价)或不同抗原(多特异性)而成为多特异性或多价的。
在一些实施方案中，CAR包含第二抗原结合域。第二抗原结合域可以是与抗原结合的任何域，包括但不限于抗体或其片段(例如Fv、Fab、(Fab)2、scFv、SDAB、纳米抗体)，以及本领域中已知的充当抗原结合域的替代性骨架。
在一些实施方案中，第二抗原结合域与第一抗原结合域特异性结合白蛋白的不同表位。包含识别不同表位的抗原结合域的CAR可以同时结合白蛋白，并促进配体诱导的CAR二聚化。
在一些实施方案中，第二抗原结合域与癌症抗原特异性结合。术语“癌症抗原”是指在肿瘤中产生的抗原物质。正常细胞和癌细胞都表达的癌症抗原，与正常细胞相比，在癌细胞中过度表达，或仅在癌细胞的细胞表面表达。在一些实施方案中，癌症抗原选自CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、mAb IgE靶向的TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些实施方案中，第一和第二抗原结合域串联排列，任选地由多肽连接子分开(图1B)。多肽连接子可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基。连接子序列可包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，连接子序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。
跨膜域
本文所述的CAR的跨膜域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。
在一个实施方案中，本文所述的CAR包含CD8α、CD28或ICOS的跨膜域。在某些实施方案中，CD8α的跨膜域具有SEQ ID NO:132的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜域是合成的，例如主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜域被修饰或设计为避免与相同或不同表面膜蛋白的跨膜域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，本文所述的CAR还包含铰链区，其形成CAR的胞外域和跨膜域之间的连接。铰链和/或跨膜域提供了CAR的胞外域的细胞表面呈现。
铰链区可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。
在一些实施方案中，铰链区包含CD8α的铰链区、人类免疫球蛋白(Ig)的铰链区或富含甘氨酸-丝氨酸的序列。
在一些实施方案中，CAR包含CD8α、CD28、ICOS或IgG4m的铰链区。在某些实施方案中，铰链区具有SEQ ID NO:133的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
胞内域
本文所述的CAR的胞内域负责激活CAR所处的免疫细胞的至少一种正常效应功能。在免疫细胞的上下文中使用的术语“效应功能”是指细胞的专门功能，例如T细胞的细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
众所周知，T细胞的完全激活需要通过T细胞受体(TCR)产生的信号和次级或共刺激信号。因此，T细胞的激活是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：那些通过TCR启动抗原依赖性初级激活的信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)和那些以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号的信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。
CAR的胞内域可以来源于转导效应功能信号并指导细胞执行效应功能的分子，或此类分子的截短部分，只要其转导信号即可。此类蛋白质分子包括但不限于B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(CD18、LFA-1、ITGAL)、CD11b、CD11c、CD11d、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49d、CD49f、CD69、CD79a、CD79b、CD83、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD127、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM、SLAMF1、IPO-3)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(SLAMF4、2B4)、CEACAM1、CRTAM、DAP10、DAP12、常见FcRγ、FcRβ(FcεRib)、FcγRIIa、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、ICAM-1、ICOS、LIGHT、LTBR、LAT、NKG2C、NKG2D,NKp44、NKp30、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PD-1、PAG/Cbp、PSGL1、SLP-76、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体(TCR)、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的分子的任何合成序列及其任何组合。
在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域，其中当CAR与白蛋白结合时，共刺激域提供共刺激细胞内信号传导而不需要其原始配体，并且信号传导域提供初级激活信号传导。CAR的共刺激域和信号传导域可以随机或指定的顺序相互连接。
共刺激域
在一些实施方案中，共刺激域来源于共刺激分子的胞内域。
共刺激分子的实例包括B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD7、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD 18、CD 19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD83、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD127、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM、SLAMF1、IPO-3)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(SLAMF4、2B4)、CEACAM1、CRTAM、CDS、OX40、PD-l、ICOS、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-l、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、LAT、LFA-l、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。
在一些实施方案中，CAR的共刺激域包含共刺激分子CD137(4-1BB)、CD28、OX40或ICOS的胞内域。在一些实施方案中，CAR的共刺激域具有SEQ ID NO:134的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
信号传导域
TCR复合物的初级激活可以由初级细胞质信号传导序列以刺激性方式或抑制性方式调节。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。在本公开中特别使用的含有ITAM的初级信号传导序列的实例包括那些来源于CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FCRβ和TCRζ的初级信号传导序列。
在一些实施方案中，本公开的CAR的信号传导域包含ITAM，其在CAR与白蛋白结合后提供刺激性胞内信号传导，而不受HLA限制。在一些实施方案中，CAR的信号传导域包含CD3ζ(CD247)的信号传导域。在一些实施方案中，CAR的信号传导域包含SEQ ID NO:135的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
其他区
在一些实施方案中，CAR还包含连接子。如本文所提供的术语“连接子”是连接CAR的各种组分的多肽。
在一些实施方案中，连接子插入scFv的VH和VL之间。在一些实施方案中，连接子插入跨膜域和胞内域之间。在一些实施方案中，连接子在胞内域的信号传导域和共刺激域之间。
在一些实施方案中，连接子包含长度在2至20个氨基酸残基之间的甘氨酸-丝氨酸(GS)双联体。示例性GS双联体包括(G4S)3：SEQ ID NO:136。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码连接子的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的CAR从N端到C端包含：CD8α的信号肽、与白蛋白特异性结合的抗原结合域、CD8α的铰链区、CD8α的跨膜域、CD137的胞内域和CD3ζ的信号传导域。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸编码CAR，其从N端到C端包含：CD8α的信号肽、与白蛋白特异性结合的抗原结合域、CD8α的铰链区、CD8α的跨膜域、CD137的胞内域和CD3ζ的信号传导域。
在一些实施方案中，CAR表现出对白蛋白的高亲和力。如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。结合亲和力可以用Kd值，即解离常数表示，其通过本领域已知的任何方法确定，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振或流式细胞术(如FACS)。在某些实施方案中，CAR对白蛋白的结合亲和力小于50nM、25nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。
在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-AB-H-TM-IC，其中S是信号肽，AB是抗原结合域，H是铰链区，TM是跨膜域并且IC是胞内信号传导域。在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。
在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-SDAB-TM-IC，其中SDAB是单域抗体。
在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-N-TM-IC，其中N是纳米抗体。
在一些实施方案中，CAR具有以下结构：S-AB1-L-AB2-H-TM-IC或S-AB2-L-AB1-H-TM-IC，其中AB1是与白蛋白特异性结合的第一抗原结合域，而AB2是与第一抗原结合域特异性结合白蛋白的不同表位或与癌症抗原特异性结合的第二抗原结合域。在一些实施方案中，AB1和AB2可以独立地是scFV、SDAB或纳米抗体。
载体
在另一个方面，本公开提供了一种载体，其包含编码本文所述的CAR的多核苷酸。编码CAR的多核苷酸可以插入本领域已知的不同类型的载体中，例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、来源于动物病毒的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如CRISPR、锌指核酸酶、TALEN)、体外转录的RNA或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是DNA或RNA。
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接于载体中的至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达CAR。典型的载体含有各种调节性多核苷酸元件，例如调节插入的多核苷酸表达的元件(例如转录和翻译终止子、起始序列和启动子)，调节载体在宿主细胞中复制的元件(例如复制起点)，以及调节载体整合到宿主基因组中的元件(例如转座子的末端重复序列)。CAR的表达可以通过将编码CAR的多核苷酸可操作地连接于启动子，并将该构建体掺入载体中来实现。组成型启动子(如CMV启动子、SV40启动子和MMTV启动子)或诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子和孕酮启动子)都可考虑用于本公开。在一些实施方案中，载体是表达载体，表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。
为了评估CAR的表达，载体还可以包含可选标记基因或报告基因或两者，以用于鉴定和选择引入载体的细胞。有用的可选标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。有用的报告基因包括例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体可以来源于例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和慢病毒。有用的病毒载体一般含有在至少一种生物体内起作用的复制起点、启动子、限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选标记。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体，如慢病毒载体。慢病毒载体对于将编码CAR的多核苷酸长期、稳定地整合到非增殖细胞的基因组中特别有用，从而使CAR在宿主细胞，如宿主T细胞中稳定表达。
在一些实施方案中，载体是RNA(例如mRNA)。由于RNA会随着细胞分裂而被稀释，所以RNA的表达不会是永久性的。在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以瞬时表达的形式引入到细胞中(图1D)。
具有促进稳定性和/或翻译效率能力的化学结构也可以用于RNA中。生成用于转染的RNA的方法可以涉及用专门设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加聚A，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基的聚A尾的构建体。这样产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。
RNA可以使用许多不同方法中的任一种引入目标细胞中，例如可用的方法包括但不限于电穿孔或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物囊封、肽介导的转染或生物弹粒子递送系统(如“基因枪”)。
在一些实施方案中，载体是表达DNA载体(例如质粒、病毒)。当表达DNA载体瞬时引入细胞中时，CAR的mRNA将在宿主细胞中转录。由于DNA载体和mRNA会随着细胞分裂而被稀释，所以RNA的表达不会是永久性的。在一个实施方案中，DNA载体可以CAR的瞬时表达形式引入细胞中。
在一些实施方案中，载体是基于转座子的表达载体。转座子是可以改变其在基因组内位置的DNA序列。在转座子系统中，编码CAR的多核苷酸侧面是由介导转座子移动的转座酶可识别的末端重复序列。转座酶可以作为蛋白质共递送、与CAR编码在同一载体上或编码在单独的载体上。转座子系统的非限制性实例包括Sleeping Beauty、Piggyback、FrogPrince和Prince Charming。
载体可以通过本领域已知的任何方法，例如通过物理、化学或生物手段引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞中。将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生物方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，将基因插入哺乳动物，例如人类细胞中。化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒，以及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
细胞
在一个方面，本公开提供了一种工程细胞，其包含或表达如本文所述的CAR。在一些实施方案中，工程细胞包含编码CAR的多核苷酸或包含CAR多核苷酸的载体。
在一些实施方案中，工程细胞还包含或表达第二CAR(图1B)。在一些实施方案中，第二CAR包含第二抗原结合域，其与第一抗原结合域特异性结合白蛋白的不同表位。在一些实施方案中，第二CAR包含与癌症抗原特异性结合的第二抗原结合域。在一些实施方案中，癌症抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些实施方案中，双CAR-T细胞可以通过引入和表达包含编码第一CAR和第二CAR的核苷酸的载体来生成。在一些实施方案中，双CAR-T细胞可以通过引入和表达包含编码第一CAR的核苷酸的第一载体和包含编码第二CAR的核苷酸的第二载体来生成。
在一些实施方案中，第一载体和第二载体属于同一类型，例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、来源于动物病毒的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如CRISPR、锌指核酸酶、TALEN)、体外转录的RNA或自杀式表达载体。在一些实施方案中，第一载体和第二载体属于不同类型。在一些实施方案中，第一载体和第二载体独立地选自能够永久或瞬时表达的载体。在一些实施方案中，包含对白蛋白具有特异性的第一抗原结合域的CAR由RNA载体(例如，体外转录的RNA)表达，而包含对癌症抗原具有特异性的第二抗原结合域的CAR由非RNA载体表达。
如本文所述的工程细胞是经基因修饰的免疫细胞，可用于本公开的免疫细胞包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、不变NK细胞或NKT细胞，以及其他效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代细胞、来源于原代细胞的扩增细胞或来源于体外分化的干细胞的细胞。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括例如T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种制造表达如本文所述的CAR的工程细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：从来源获得细胞、培养细胞、激活细胞、扩增细胞和工程改造细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种使用工程细胞进行细胞疗法的方法，其中工程细胞被引入受试者体内。在一些实施方案中，受试者是获得细胞的同一受试者。
细胞来源
工程细胞可以来源于从受试者，例如人类受试者分离的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是从感兴趣的受试者获得，例如疑似患有特定疾病或病况的受试者，疑似具有特定疾病或病况倾向的受试者，将接受、正在接受或已经接受特定疾病或病况治疗的受试者，作为健康志愿者或健康捐赠者的受试者，或来自血库。因此，细胞对于感兴趣的受试者可以是自体的或同种异体的。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(HLA)不相容，因此可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
免疫细胞可以从其在受试者体内驻留的任何位置收集，包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、胸腔积液、脾脏组织、肿瘤和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或其可以储存一段时间，如通过冷冻。
在一些实施方案中，工程细胞来源于T细胞。T细胞可以通过本领域技术人员已知的许多技术，如单采血液成分术从受试者采集的血液中获得。
在一些实施方案中，一个或多个T细胞群被富集或耗尽对特定标志物，如表面标志物呈阳性，或对特定标志物呈阴性的细胞。此类标志物是在某些T细胞群上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他T细胞群上存在或以相对较高的水平表达的标志物。在一些实施方案中，分离出CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，CD8+和CD4+T细胞被进一步富集或耗尽初始干细胞、中央记忆干细胞、效应记忆和/或中央记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关的表面抗原的正向或负向选择。
细胞的激活和扩增
免疫细胞的激活和/或扩增是免疫细胞功能的主要步骤之一。在一些实施方案中，免疫细胞在基因修饰的同时、之前或/和之后被激活和扩增。在一些实施方案中，免疫细胞在体外、离体或体内被激活和/或扩增。
激活和扩增免疫细胞的方法已经在本领域中描述，并且可以用于本文描述的方法中。例如，T细胞可以通过与附接有刺激CD3/TCR复合体相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来激活和扩增。特别地，可以刺激T细胞群体，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或与蛋白激酶C激活剂(例如苔藓虫素)以及钙离子载体接触。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可以与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。在某些实施方案中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。
在一些方面，所述方法还包括通过使本公开的工程细胞与包含白蛋白的组合物接触，在体外或离体扩增和/或诱导T细胞的增殖。在一些实施方案中，工程细胞是T细胞。使本公开的工程细胞与包含白蛋白的组合物接触可以改善当前的免疫细胞培养过程，并在培养过程中增加CAR阳性T细胞的百分比。
在一些实施方案中，组合物包含0.1-10mg/mL的白蛋白。在一些实施方案中，组合物包含至少、至多或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10mg/mL的白蛋白(或其中任何可推导的范围)。
在一些实施方案中，组合物还包含IL-2。在一些实施方案中，组合物包含20-400U/mL的IL-2。在一些实施方案中，组合物包含至少、至多或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600U/mL的JL-2(或其中任何可推导的范围)。
在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与饲养细胞接触。在一些实施方案中，饲养细胞被辐照。饲养细胞或支持细胞可以包括例如成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、JK1细胞、SNL 76/7细胞、人胎儿皮肤细胞、人成纤维细胞、人PBMC和人包皮成纤维细胞。
在一些实施方案中，所述方法不包括使T细胞与饲养细胞接触。在一些情况下，排除的饲养细胞来自与T细胞不同的动物物种。
在一些方面，所述方法包括通过使本公开的工程细胞与血液中的白蛋白接触而在体内扩增和/或诱导T细胞的增殖。在一些实施方案中，工程细胞是T细胞。
刺激免疫反应的方法
在另一个方面，本公开涉及刺激免疫反应的方法。免疫反应刺激可以在体外、离体或体内进行。在一些实施方案中，所述方法涉及如本文所述的能够在白蛋白存在下刺激免疫反应的细胞。
在一些实施方案中，刺激免疫反应包括增加免疫刺激细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子和/或分子是TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子中的一种或多种。
在一些实施方案中，刺激免疫反应包括增加免疫细胞的增殖。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。
如本文所述的表达或增殖的增加可以是比基线表达水平如对照(非疾病、非白蛋白或非抗原结合多肽对照)至少、至多或正好增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、500或1000倍。
在一些实施方案中，刺激是在体外或离体进行的，其中如本文所述的工程细胞与包含白蛋白的组合物接触。
在一些实施方案中，刺激是在体内进行的，其中如本文所述的工程细胞与需要免疫刺激的人类受试者体内产生的内源性白蛋白接触。在一些实施方案中，所述方法包括将如本文所述的包含本公开的CAR或核酸的细胞施用于人类受试者(例如，从其获得细胞的个体)，并且所述经基因修饰的细胞在体内被激活(即，通过内源性产生的白蛋白)。
体内刺激免疫反应可以增加体内免疫细胞的增殖，使体内细胞扩增更加有效，缩短体外细胞培养的时间，降低商品成本。在一些实施方案中，如本文所述的工程细胞的体内扩增可以比对照(例如，非工程免疫细胞或表达非白蛋白结合的CAR的工程细胞)至少有效2、5、10、20、30、40、50、100倍。
在一些实施方案中，人类受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(Pre-B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性赘瘤和真性红细胞增多症。
治疗方法
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗患者的疾病或病理状况的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本文提供的工程细胞。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是如本文所述的实体肿瘤或血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中，治疗疾病或病理状况的方法包括提供从受试者分离的T细胞，工程改造T细胞以表达如本文提供的CAR，并将工程T细胞输回受试者体内。在一些实施方案中，所述方法还包括如本文所述体外或离体激活和/或扩增工程细胞，例如通过包括使工程细胞与包含白蛋白的组合物接触的方法。在一些实施方案中，组合物还包含IL-2。在一些实施方案中，体外或离体激活和/或扩增工程细胞还包括使工程细胞与饲养细胞接触。在一些实施方案中，饲养细胞被辐照。
在某些实施方案中，治疗方法还包括施用增加工程细胞功效的药剂。例如，将促进本公开的工程细胞的生长和激活的生长因子与细胞同时或随后施用细胞于受试者。生长因子可以是促进免疫细胞生长和激活的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以各种组合使用，如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7、IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。
在一些实施方案中，治疗方法还包括施用减少或改善与施用工程细胞相关的副作用的药剂。示例性副作用包括细胞因子释放综合征(CRS)和嗜血细胞淋巴组织细胞增生症(HLH，也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。经施用以治疗副作用的药剂可以是中和可溶性因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-6的药剂。此类药剂包括但不限于TNF-α的抑制剂(例如依那西普(entanercept))和IL-6的抑制剂(例如托珠单抗(tocilizumab))。
治疗有效量的工程细胞可以通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输注。
工程细胞可以各种治疗方案施用，例如在一天至数天内单次或数次给药，或在较长时间内定期给药。所采用的精确剂量也将取决于施用途径以及患者疾病或病理状况的严重程度，并应根据从业者的判断和每个病人的情况来决定。工程细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人类受试者的剂量范围为至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109或至少3.8×1010个细胞/m2。在某个实施方案中，用于治疗人类受试者的剂量范围为约3.8×109至约3.8×1010个细胞/m2。在另外的实施方案中，工程细胞的治疗有效量可以在每公斤体重约5×106个细胞至每公斤体重约7.5×108个细胞之间，如每公斤体重约2×107个细胞至约5×108个细胞，或每公斤体重约5×107个细胞至约2×108个细胞。本领域技术人员可以根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况容易地确定工程细胞的精确量。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推算出来。
在另一个方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包含工程细胞和药学上可接受的稀释剂和/或载体。示例性的稀释剂和/或载体包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
表17.CAR中包含的域的示例性序列
Figure BDA0003219799630000331
实施例
虽然已经参照具体实施方案(其中一些是优选实施方案)特别显示和描述了本公开，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式上和细节上的各种改变。
实施例1
实施例1说明表达针对白蛋白的CAR会增强T细胞的离体扩增。如图2所述，设计并生成了Alb CAR构建体。从TPCS获得健康供体全血中的人T细胞。用CD3/CD28Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)以1:1的细胞:珠粒比例刺激T细胞24小时，然后用含有CAR构建体的慢病毒进行转导。T细胞在XF T细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies)中培养，并且每2至3天馈入50U/ml IL-2(Thermo Fisher Scientific)。在培养9天后去除Dynabeads。将T细胞以5×105个细胞/1mL/孔接种于24孔板中。培养物每2天补充一次50U/mL IL-2。每2或3天对细胞进行计数，并在24孔板中以5×105个细胞/1mL/孔进行次培养。与扩增200多倍的对照细胞相比，CAR阳性细胞扩增了60,000多倍(图3)。
其他实施例
项目1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中所述CAR包含(1)包含第一抗原结合域的胞外域，(2)跨膜域和(3)胞内信号传导域，其中所述第一抗原结合域与白蛋白特异性结合。
项目2.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述第一抗原结合域是单链可变片段(scFv)。
项目3.根据项目2所述的多核苷酸，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
项目4.根据项目3所述的多核苷酸，其中所述VH区包含HCDR1，其具有如表1所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；HCDR2，其具有如表2所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及HCDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
项目5.根据项目3所述的多核苷酸，其中所述VL区包含LCDR1，其具有如表4所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；LCDR2，其具有如表5所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及LCDR3，其具有如表6所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
项目6.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域是单域抗体(SDAB)。
项目7.根据项目6所述的多核苷酸，其中所述SDAB包含CDR1，其具有如表9所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表10所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表11所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
项目8.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域是纳米抗体。
项目9.根据项目8所述的多核苷酸，其中所述纳米抗体包含CDR1，其具有如表13所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表14所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表15所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
项目10.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域包含SEQ ID NO:131的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
项目11.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述CAR还包含信号肽。
项目12.根据项目11所述的多核苷酸，其中所述信号肽包含CD8α的信号肽。
项目13.根据项目12所述的多核苷酸，其中所述CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:130的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
项目14.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述跨膜域包含CD8α的跨膜域。
项目15.根据项目14所述的多核苷酸，其中所述CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO:132的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目16.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述胞外域通过铰链区连接至所述跨膜域。
项目17.根据项目16所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含CD8α的铰链区。
项目18.根据项目17所述的多核苷酸，其中所述CD8α的铰链区包含SEQ ID NO:133的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目19.根据项目1所述的多核苷酸，其中胞内域包含共刺激域和信号传导域。
项目20.根据项目19所述的多核苷酸，其中所述共刺激域包含CD137的胞内域。
项目21.根据项目20所述的多核苷酸，其中所述CD137的胞内域包含SEQ ID NO:134的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目22.根据项目19所述的多核苷酸，其中所述胞内域包含CD3ζ的信号传导域。
项目23.根据项目22所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ的信号传导域包含SEQ IDNO:135的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
项目24.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下结构：S-AB-H-TM-IC，其中S是信号肽，AB是抗原结合域，H是铰链区，TM是跨膜域并且IC是胞内信号传导域。
项目25.根据项目24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下结构：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。
项目26.根据项目24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下结构：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重链可变区，L是连接子，VL是轻链可变区。
项目27.根据项目24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下结构：S-SDAB-H-TM-IC，其中SDAB是单域抗体。
项目28.根据项目24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下结构：S-N-H-TM-IC，其中N是纳米抗体。
项目29.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述胞外域还包含与癌症抗原特异性结合的第二抗原结合域。
项目30.根据项目29所述的多核苷酸，其中所述癌症抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
项目31.根据项目1所述的多核苷酸，其中所述胞外域还包含与白蛋白特异性结合的第二抗原结合域，其中所述第一抗原结合域和第二抗原结合域结合白蛋白的不同表位。
项目32.根据项目31所述的多核苷酸，其中所述胞外域还包含与癌症抗原特异性结合的第三抗原结合域。
项目33.根据项目1至32中任一项所述的多核苷酸，其为DNA或RNA。
项目34.一种多肽，其由根据项目1至33中任一项所述的多核苷酸编码。
项目35.一种载体，其包含根据项目1至33中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述CAR的所述多核苷酸可操作地连接于至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达所述CAR。
项目36.根据项目35所述的载体，其中所述载体是质粒载体、病毒载体、转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。
项目37.根据项目36所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。
项目38.一种工程细胞，其包含根据项目34所述的多肽。
项目39.根据项目38所述的工程细胞，其中所述工程细胞是T细胞或NK细胞。
项目40.根据项目38所述的工程细胞，其还包含第二CAR，其中所述第二CAR包含与癌症抗原特异性结合的第二抗原结合域。
项目41.根据项目40所述的工程细胞，其中所述癌症抗原选自由以下组成的组：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k轻链、LeY、LI细胞粘附分子、MAGE-Al、间皮素、MUCl、KG2D配体、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
项目42.根据项目38所述的工程细胞，其还包含第二CAR，其中所述第二CAR包含与白蛋白特异性结合的第二抗原结合域，其中所述第一抗原结合域和第二抗原结合域结合白蛋白的不同表位。
项目43.根据项目42所述的工程细胞，其还包含第三CAR，其中所述第三CAR包含与癌症抗原特异性结合的第三抗原结合域。
项目44.一种用于刺激免疫反应的方法，其包括使根据项目38至43中任一项所述的工程细胞与白蛋白接触。
项目45.根据项目44所述的方法，其中所述工程细胞与白蛋白离体接触。
项目46.根据项目44所述的方法，其中通过向需要免疫刺激的受试者施用所述工程细胞而使所述工程细胞与白蛋白在体内接触。
项目47.根据项目46所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
项目48.根据项目47所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。
项目49.根据项目47所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(Pre-B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性赘瘤和真性红细胞增多症。
项目50.根据项目44至49中任一项所述的方法，其中刺激免疫反应包括增加免疫刺激细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。
项目51.根据项目50所述的方法，其中所述免疫刺激细胞因子和/或分子是TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子中的一种或多种。
项目52.根据项目45至50中任一项所述的方法，其中刺激免疫反应包括增加免疫细胞的增殖。
项目53.根据项目52所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
项目54.一种体外扩增细胞的方法，所述方法包括在包含白蛋白的培养基中体外培养根据
项目38至43中任一项所述的工程细胞。
项目55.根据项目54所述的方法，其中所述培养基还包含IL-2。
项目56.根据项目54或55所述的方法，其中所述方法还包括使所述工程细胞与饲养细胞接触。
项目57.根据项目56所述的方法，其中所述饲养细胞被辐照。
项目58.一种体外扩增细胞的方法，所述方法包括将根据项目1至33中任一项所述的多核苷酸引入体外细胞，从而表达CAR；以及在包含白蛋白的培养基中培养所述细胞。
项目59.根据项目58所述的方法，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
项目60.根据项目58所述的方法，其中所述CAR是瞬时表达的。
项目61.一种用于治疗患者的疾病或病理状况的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据项目38至43中任一项所述的工程细胞。
项目62.根据项目61所述的方法，其中所述疾病是癌症。
项目63.根据项目62所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。
项目64.根据项目62所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(Pre-B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性赘瘤和真性红细胞增多症。
项目65.根据项目61至64中任一项所述的方法，其中所述工程细胞已通过包括在包含白蛋白的培养基中体外培养所述工程细胞的方法在体外扩增。
项目66.根据项目65所述的方法，其中所述培养基还包含IL-2。
项目67.根据项目65或66所述的方法，其中所述方法还包括使所述工程细胞与饲养细胞接触。
项目68.根据项目67所述的方法，其中所述饲养细胞被辐照。
序列表
<110> 苏州博腾生物制药有限公司
<120> 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
<130> 077963-8004CN02
<160> 137
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Asn Ala Asn Thr Leu His Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Ala Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser Asp Thr Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala
1 5 10
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<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn
20 25 30
Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser
85 90 95
Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 29
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
85 90 95
Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
115 120 125
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
130 135 140
Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
210 215 220
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 30
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
115 120 125
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
130 135 140
Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn Asn Gln
145 150 155 160
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
165 170 175
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
195 200 205
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser
210 215 220
Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
225 230 235
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His Leu Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His Leu Lys
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His Leu Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Arg Gln Leu Arg
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Arg Gln Leu Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Arg Ala Ser Gln His Ile His Arg Glu Leu Arg
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Arg Leu Lys
1 5 10
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Asn Asn Leu Arg
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Lys Ser Leu Gly
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Arg His Leu Arg
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Pro Tyr Thr Met Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Ala Tyr Gln Met Ala
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Asp Tyr Asp Met Thr
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Asp Tyr Val Met Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
His Tyr Arg Met Gly
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Trp Asp Lys Met Gly
1 5
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Ala Tyr Pro Met Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Thr Tyr Thr Met Ala
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Pro Thr Asn Met Ser
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Asn Gly Ser Gln Leu Gln Ser
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Gly Ala Val Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Gln Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Arg Thr Ser Trp Leu Gln Ser
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Asn Ser Ser Ile Leu Gln Ser
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Asn Thr Ser Ile Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Gln Ser Ser Leu Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Arg Asn Ser Phe Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Arg Leu Ser Val Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
Arg Asn Ser Gln Leu Gln Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Arg Asn Ser Pro Leu Gln Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Thr Ile His Gln Thr Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
Met Ile Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Leu Ile Lys Pro Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Trp Ile Arg Pro Asp Gly Thr Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Phe Ile Gly Arg Glu Gly Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Ser Ile Ser Ser Trp Gly Thr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Ser Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Thr Ile Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys Thr
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Gln Thr
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr Thr
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Gln Gln Arg Tyr Met Gln Pro Phe Thr
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Gln Gln Arg Tyr Leu Gln Pro Tyr Thr
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Gln Gln Arg Tyr Ile Thr Tyr Asn Thr
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Gln Gln Thr Phe Ser Lys Pro Ser Thr
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Gln Gln Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Gln Gln Arg Tyr Arg Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Gln Gln Thr Ser Gln Trp Pro His Thr
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Gln Gln Arg Trp Arg Ala Pro Tyr Thr
1 5
<210> 96
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<220>
<223> 合成
<400> 96
Gln Gln Tyr His Gln Met Pro Arg Thr
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Gln Gln Thr His Asn Pro Pro Lys Thr
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Gln Gln Thr Tyr Thr Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Gln Gln Thr Tyr Asn Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Gln Gln Thr Phe Ala Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Gln Gln Thr Tyr Arg Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Asn Thr Gly Gly Lys Gln Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 9
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<220>
<223> 合成
<400> 108
Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
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1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
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1 5 10
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Arg Gly Arg Phe Asn Val Leu Gln Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Ser Tyr Met Gly Asp Arg Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Ser Val Ala Ser Phe Asp Tyr
1 5
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<220>
<223> 合成
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Gly Gly Gln Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 9
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<220>
<223> 合成
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Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr
1 5
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<220>
<223> 合成
<400> 118
Gln Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr
20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 122
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Arg Val Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Thr Thr Cys Met Ala
1 5
<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Asp Tyr Thr Thr Gly
1 5
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Thr Ile Thr Thr Gly Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
<210> 127
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Asp Ala Ser Trp Gly Cys Arg Leu Ser Gly Ser Trp Ser Thr Val Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 128
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Ala Asp Arg Tyr Arg Ser Gly Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Glu Tyr Asp
1 5 10 15
<210> 129
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Gln Val Gln Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Thr
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ala Ser Trp Gly Cys Arg Leu Ser Gly Ser Trp Ser Thr
100 105 110
Val Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 130
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys His Ala Ser Gly Leu Asp Asp Tyr Ile Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu Ser Cys
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Asp Arg Tyr Arg Ser Gly Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 132
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His
20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 133
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 134
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 135
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 136
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中所述CAR包含(1)包含第一抗原结合域的胞外域，(2)跨膜域和(3)胞内信号传导域，其中所述第一抗原结合域与白蛋白特异性结合。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一抗原结合域是单链可变片段(scFv)。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述VH区包含HCDR1，其具有如表1所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；HCDR2，其具有如表2所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及HCDR3，其具有如表3所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述VL区包含LCDR1，其具有如表4所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；LCDR2，其具有如表5所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及LCDR3，其具有如表6所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域是单域抗体(SDAB)。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述SDAB包含CDR1，其具有如表9所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表10所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表11所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
8.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域是纳米抗体。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述纳米抗体包含CDR1，其具有如表13所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；CDR2，其具有如表14所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列；以及CDR3，其具有如表15所示的序列，或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3个氨基酸残基差异的序列。
10.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述抗原结合域包含SEQ ID NO:131的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
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