CN113906140A - A2/ny-eso-1特异性t细胞受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了对来自癌症抗原NY‑ESO‑1的表位特异的遗传修饰的T细胞受体。还提供了相关的多肽和蛋白质，以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群，包括但不限于基因工程化细胞和药物组合物。本申请还提供了这种经修饰的T细胞受体和相关组合物用于癌症免疫治疗(例如过继细胞治疗)的用途。

Description

A2/NY-ESO-1特异性T细胞受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月18日提交的美国临时申请第62/819，988号的优先权，其公开内容通过引用整体结合于此。
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，并通过引用将其全部内容并入本文。所述ASCII副本创建于2020年7月16日，名称为252457_000009_SL.txt，大小为65,448字节。
发明领域
本发明涉及对来自癌症抗原NY-ESO-1的表位特异的遗传修饰的T细胞受体。本发明涉及相关的多肽和蛋白质，以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群，包括但不限于基因工程化细胞，以及药物组合物。本发明进一步涉及这种修饰的TCRs和相关组合物用于癌症免疫治疗的用途。
背景
癌症免疫疗法通过利用和/或增强患者自身对癌细胞的免疫反应，已经成为细胞毒性化疗、放疗和手术等标准护理方法的可行替代方案和有力补充(Mellman,I.,G.Coukos,和G.Dranoff,Nature,2011.480:p.480)。在众多方面中，过继性T细胞疗法早已在临床上证明了它的有效性(Restifo,N.P.,M.E.Dudley,和S.A.Rosenberg,NatureReviews Immunology,2012.12:p.269)。在这种类型的癌症治疗中，患者接受自体的离体扩增肿瘤浸润淋巴细胞，该淋巴细胞能够天然识别并杀死其肿瘤靶点(Rosenberg,S.A.等人,Clin Cancer Res,2011.17(13):p.4550-7)。或者，可以通过在扩增和过继转移之前肿瘤特异性T细胞受体(TCRs)或嵌合抗原受体(CARs)的异位表达对患者的外周血T细胞进行遗传修饰，以识别肿瘤细胞。基于NY-ESO-1 TCR(Robbins,P.F.等人,J Clin Oncol,2011.29(7):p.917-24)和基于CD19 CAR(Kochenderfer,J.N.等人,Blood,2012.119:p.2709-2720)的T细胞疗法是癌症免疫疗法的非凡范例，在临床上显示出巨大的前景，分别用于实体瘤和血液系统恶性肿瘤。
NY-ESO-1或纽约食管鳞状细胞癌1是一种由一系列肿瘤表达的肿瘤抗原(Chen,Y.T.等人,Proc Natl Acad Sci U S A,1997.94(5):p.1914-1918)。这些癌细胞的I类人白细胞抗原(HLA)分子呈现来自该抗原的肽，包括来自位置157-165的9-氨基酸片段(SLLMWITQC(SEQ ID NO:8))。因此，NY-ESO-1157-165表位-HLA-A2复合物提供了TCRs可以靶向的癌症标记，例如在过继细胞转移治疗中，其中患者接受已用编码对NY-ESO-1157-165表位(SLLMWITQC(SEQ ID NO:8))特异的T细胞受体(TCR)的核酸转导的自体细胞。然而，为此目的，如果TCR对所述肽-HLA复合物的亲和力高于对该复合物特异的天然TCR，将是理想的。
因为针对“自身”肿瘤抗原的TCR可能比病毒表位特异性TCR具有更低的亲和力，例如由于胸腺负选择，所以在本领域中需要开发维持特异性(即不与健康组织交叉反应)、并具有更高亲和力的TCR，其能够具有更高的活性。
尽管免疫疗法可能是一种非常有效的策略，但许多患者仍然没有表现出过继性T细胞治疗的临床益处，或者不能维持持久的反应，因此，其应用仍然有限。尽管与治疗相关的毒性仍然是一个主要的关注点(Gust,J.等人Cancer Discovery,2017.7:p.1404-1419)，过继转移的T细胞不能实现有效肿瘤控制的主要原因在于肿瘤本身的免疫抑制性微环境(Zou,W.Nature Reviews Cancer,2005.5:p.263)。肿瘤采用多种策略来逃避免疫系统的检测。其中包括改变趋化因子表达谱以防止T细胞化学吸引；通过增强周围组织的胶原蛋白和促进异常的肿瘤内脉管系统来增强物理屏障，以阻止适当的T细胞外渗；建立以低葡萄糖水平为特征的不利于T细胞功能的代谢微环境；免疫抑制性细胞如调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的化学吸引进入肿瘤微环境或其他细胞的极化以获得免疫抑制表型，如M2巨噬细胞；最后，通过上调免疫检查点受体和其他具有类似性质的膜结合型或可溶性因子，直接抑制T细胞功能(Baruch,E.N.等人,Cancer,2017.123(S11):p.2154-2162)。
这些障碍可以通过组合治疗策略来克服，这些策略通过处理免疫抑制性肿瘤微环境的不同方面来增强过继性转移的T细胞的活性。目前有无数的方法正在临床前和临床水平上进行测试，包括免疫检查点阻断抗体、细胞因子疗法、代谢酶抑制剂、使肿瘤脉管系统正常化的试剂和耗竭抑制性免疫细胞的抗体与化疗和放疗的结合(Zhang,H.和J.Chen,Journal of Cancer,2018.9(10):p.1773-1781)。另一种更精细、更有针对性的方法是，通过用直接影响T细胞活性或靶向肿瘤微环境的分子进行遗传修饰，对转移的T细胞进行微调。具有趋化因子受体的T细胞加工已被证明可增强T细胞向肿瘤部位的转运，靶向VEGF受体的CARs可导致脉管系统正常化，共刺激性配体在CARs中的过度表达或整合为转移的T细胞提供了额外的优势。此外，靶向T细胞相关的检查点配体可能减轻肿瘤来源的检查点介导的T细胞抑制(Kunert,A.和R.Debets,Current Opinion in Immunology,2018.51:p.133-139)。
尽管大多数基于工程化的策略旨在直接提高T细胞活性并不令人惊讶(Yoon,D.H.等人,International journal of molecular sciences,2018.19(2):p.340)，目前还没有描述过用可以利用或增强其他肿瘤驻留免疫细胞的潜在有益活性的试剂来修饰过继转移的T细胞的努力。肿瘤相关巨噬细胞和粒细胞已成为建立或阻碍成功抗肿瘤反应的关键角色，刺激它们的抗肿瘤对比促瘤特性可能非常重要(Noy,R.和J.W.Pollard,Immunity,2014.41(1):p.49-61；Fridlender,Z.G.和S.M.Albelda,Carcinogenesis,2012.33(5):p.949-55)。朝着同样的方向，由异位表达的肿瘤衍生的可溶性因子对树突状细胞(DC)的免疫吸引和刺激已经显示能够引发由激活的内源性T细胞介导的强抗肿瘤反应(Mach,N.等人,Cancer Res,2000.60(12):p.3239-46)。这些观察强调了对合适的T细胞工程化候选药剂的需求，该药剂可以有效地利用上述肿瘤驻留免疫细胞谱系的抗肿瘤潜力。
这里公开的发明解决了这个需求和其他相关需求。
发明概述
本领域非常需要开发对癌症抗原具有更高亲和力的TCR。本发明通过提供对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位特异的经修饰的TCR，以及用于将这种TCR用于癌症免疫治疗(例如过继细胞治疗)的相关组合物和方法来解决这一需求和其他需求。
在一个方面，本文提供了编码经修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段的多核苷酸，其中相对于未取代的野生型(WT)TCR的β链的CDR2，所述经修饰的TCR在其β链的互补决定区(CDR)2内包含单个氨基酸取代。
在一些实施方案中，在所述经修饰的TCR或其功能性片段的β链的CDR2区域之外，所述经修饰的TCR的β链序列包含与未取代的WT TCR或其功能性片段的β链至少80％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段的β链包含未取代的WT TCR或其功能性片段的β链的氨基酸序列，在CDR2区域具有单个氨基酸取代。
在一些实施方案中，未取代的WT TCR的β链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于WT TCR，所述单个氨基酸取代发生在残基50、51、53或55处。在一些实施方案中，相对于WT TCR，所述单个氨基酸取代发生在残基53或55处。在一些实施方案中，所述单个氨基酸取代是I53E、I53F、I53W或D55E。
在一些实施方案中，所述被修饰的TCR以比WT TCR更高的结合亲和力结合癌症抗原。在一些实施方案中，所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约5至约75倍。在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约10至约75倍。在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约25至约75倍。在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约40至约75倍。在一些实施方案中，与WTTCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约40至约60倍。在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约40至约50倍。在一些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力大约高50倍。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约0.30至约4.5μM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约0.30至约2μM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约2μM至约3μM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约3μM至约4μM之间。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)为约0.41μM。在一些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)为约3.89μM。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2-5中任一所示的氨基酸序列，或其功能性片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR由SEQ ID NO:11-14中任一所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:11-14中任一序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列所编码。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至少一个调节元件，用于表达所述经修饰的TCR。在一些实施方案中，所述至少一个调节元件是启动子。
在各种实施方案中，所述多核苷酸是DNA分子。
在各种实施方案中，所述多核苷酸是RNA分子或其衍生物。
另一方面，本文提供了包含本文所述多核苷酸的重组载体，其中所述多核苷酸与至少一个调节元件可操作地连接，用于表达所述经修饰的T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体、疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。
在一些实施方案中，所述载体是非病毒载体。
另一方面，本文提供了经修饰的T细胞受体(TCR)，其包含由本文所述多核苷酸编码的经修饰的TCR的β链或其功能性片段。
另一方面，本文提供了经修饰的T细胞受体(TCR)，其包含a)由本文所述多核苷酸编码的经修饰的TCR的β链或其功能性片段，和b)α链或其功能性片段。
在另一个方面，本文提供了修饰的T细胞受体(TCR)，其包含由本文所述多核苷酸编码的经修饰的TCR的β链的CDR。
在另一方面，本文提供了修饰的T细胞受体(TCR)，其包含a)修饰的TCR的β链的功能性片段，其中该功能性片段包含由本文所述多核苷酸编码的β链的CDR，和b)α链的功能性片段，其中该功能性片段包含α链的CDR。
在一些实施方案中，a)的功能性片段进一步包含TCRβ链的恒定区，和/或b)的功能性片段进一步包含TCRα链的恒定区。在一个实施方案中，任一恒定区域都是人源的。在一个实施方案中，任一恒定区都是小鼠源的。
在一些实施方案中，α链包含WT TCR的α链或其功能性片段。在一个实施方案中，WTTCR的α链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2-5中任一氨基酸序列，或其片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种修饰的T细胞受体(TCR)，其包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链和含有SEQ ID NO:2-5中任一所示氨基酸序列的β链。
另一方面，本文提供了包含本文所述的经修饰的T细胞受体(TCR)的分离的宿主细胞。
另一方面，本文提供了包含本文所述多核苷酸的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至少一个调节元件，该调节元件能够介导宿主细胞中所述经修饰的T细胞受体(TCR)的表达。
另一方面，本文提供了包含本文所述载体的分离的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是淋巴样细胞。在一些实施方案中，所述淋巴样细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴样细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在各种实施方案中，所述宿主细胞获自外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。
在各种实施方案中，所述宿主细胞已经被离体激活和/或扩增。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是同种异体细胞。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是自体细胞。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是从患有疾病的受试者中分离的。在一些实施例中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
在各种实施方案中，所述宿主细胞被进一步工程化以表达一种或多种外源分子。在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是免疫信号传导分子。
在一些实施方案中，所述免疫信号传导分子是细胞因子。
在一些实施方案中，所述免疫信号传导分子是趋化因子。
在一些实施方案中，所述免疫信号传导分子是生长因子。在一个实施方案中，所述生长因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
本文还提供了分离的宿主细胞，其包含结合癌症抗原的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，其中所述宿主细胞被进一步工程化以表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述T细胞受体(TCR)是一种WT TCR。在一个实施方案中，WT TCR的β链包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，WT TCR的α链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，GM-CSF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21、34或15，或与SEQ IDNO:21、34或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22、35或16，或与SEQ ID NO:22、35或16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是可溶性受体。
在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是配体。
在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是磷酸二酯酶。在一些实施方案中，所述磷酸二酯酶是PDE4B2。
本文还提供了分离的宿主细胞，其包含结合癌症抗原的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，其中所述宿主细胞被进一步工程化以表达PDE4B2。在一些实施方案中，所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述T细胞受体(TCR)是一种WT TCR。在一个实施方案中，WT TCR的β链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，WT TCR的α链包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PDE4B2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:27或29，或与SEQ IDNO:27或29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或30，或与SEQ ID NO:28或30具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是细胞表面受体。在一些实施方案中，所述细胞表面受体是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述细胞表面受体是不结合癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的T细胞受体。
另一方面，本文提供了双功能分子，其包含本文所述的经修饰的T细胞受体或其功能性片段，以及特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的免疫效应多肽。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，所述免疫效应多肽特异性结合CD3。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含衍生自OKT3、UCHT-1、BMA031或12F6的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含衍生自OKT3的抗体或抗体片段(例如scFv)。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含衍生自UCHT-1的抗体或抗体片段(例如scFv)。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含衍生自BMA031的抗体或抗体片段(例如scFv)。在一些实施方案中，所述免疫效应多肽包含衍生自12F6的抗体或抗体片段(例如scFv)。
另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的宿主细胞或本文所述的双功能分子，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，该组合物用于过继细胞转移治疗。
另一方面，本文提供了一种生产本文所述宿主细胞的方法，包括用本文所述多核苷酸或本文所述载体对宿主细胞进行基因工程改造。
另一方面，本文提供了基因工程改造宿主细胞以表达本文所述的经修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段的方法。在一些实施方案中，该方法包括用本文描述的多核苷酸或本文描述的载体对宿主细胞进行基因工程改造。在一些实施方案中，所述基因工程改造步骤通过病毒基因递送进行。在一些实施方案中，所述基因工程改造步骤通过非病毒基因递送进行。在一些实施方案中，该方法离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括体外活化和/或扩增所述宿主细胞。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2-5中任一氨基酸序列，或其片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，该方法进一步包括基因工程改造宿主细胞以进一步表达一种或多种外源分子。在一些实施方案中，所述一种或多种外源分子是免疫信号传导分子。在一些实施方案中，所述外源分子是细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、磷酸二酯酶、抗原结合蛋白或细胞表面受体。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，所述生长因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一个实施方案中，GM-CSF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21、34或15，或与SEQ ID NO:21、34或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22、35或16，或与SEQ ID NO:22、35或16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，所述磷酸二酯酶是PDE4B2。在一个实施方案中，PDE4B2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:27或29，或与SEQ ID NO:27或29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ IDNO:28或30，或与SEQ ID NO:28或30具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体或抗体片段。
在细胞工程改造方法的一些实施方案中，所述细胞表面受体是不结合癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的嵌合抗原受体或T细胞受体。
在细胞工程改造方法的各种实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是淋巴样细胞。在一些实施方案中，所述淋巴样细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴样细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在细胞工程改造方法的各种实施方案中，所述宿主细胞获自外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。
在各种实施方案中，所述宿主细胞已经被离体激活和/或扩增。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是同种异体细胞。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是自体细胞。
在各种实施方案中，所述宿主细胞是从患有疾病的受试者中分离的。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症在其细胞表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
另一方面，本文提供了一种刺激或增强有此需要的哺乳动物的免疫反应的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的淋巴细胞，所述淋巴细胞包含本文所述的经修饰的T细胞受体(TCR)、本文所述的宿主细胞、本文所述的双功能分子、本文所述的组合物或通过本文所述方法产生的宿主细胞。
另一方面，本文提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，包括给受试者施用有效量的淋巴细胞，所述淋巴细胞包含本文所述的经修饰的T细胞受体(TCR)、本文所述的宿主细胞、本文所述的双功能分子、本文所述的组合物或通过本文所述方法产生的宿主细胞。在一些实施方案中，所述癌症的细胞在其表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
在所述治疗方法的一些实施方案中，所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
在一些实施方案中，所述治疗方法包括:
a)从受试者或哺乳动物中分离T细胞；
b)用本文描述的多核苷酸或本文描述的载体离体遗传修饰所述T细胞；
c)任选地，在步骤b)之前、之后或期间扩增和/或激活所述T细胞；和
d)将遗传修饰的T细胞引入所述受试者或哺乳动物。
在各种实施方案中，所述受试者或哺乳动物是人。
在以下描述、权利要求和附图中，本发明的这些和其他方面对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
附图简述
图1A-1E显示了NY-ESO TCR突变体的α链和β链的氨基酸序列。图1A显示了TCR BC1和β链的氨基酸序列。图1B显示了TCR I53Eα和β链的氨基酸序列。图1C显示了TCR I53Fα和β链的氨基酸序列。图1D显示了TCR I53Wα和β链的氨基酸序列。图1E显示了TCR D55Eα和β链的氨基酸序列。
图2A-2B显示了用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD4+T细胞的流式细胞分析。图2A显示用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD4+T细胞的流式细胞术TCRVb13.1分析。图2B显示用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD4+T细胞的流式细胞术HLA-A2.1NY-ESO四聚体分析。
图3A-3B显示了用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD8+T细胞的流式细胞分析。图3A显示用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD8+T细胞的流式细胞术TCRVb13.1分析。图3B显示用不同NY-ESO TCR突变体转导的CD8+T细胞的流式细胞术HLA-A2.1 NY-ESO四聚体分析。
图4A-4B显示了对NY-ESO特异性TCR转基因CD4+和CD8+T细胞的功能性亲和力分析。用不同的NY-ESO TCR突变体转导的CD4+T细胞产生的白细胞介素-2(图4A)和CD8+T细胞产生的干扰素-γ(IFN-g)(图4B)。使用的靶细胞是装载了10倍系列稀释的NY-ESO157-165肽的HLA-A2.1阳性细胞系T2。“NT”指非转导细胞。
图5显示了NY-ESO TCR转基因CD4+细胞的IL-2产生。使用的靶细胞是Me275(天然表达HLA/A2-NY-ESO-1的肿瘤细胞系)、A2008-A2 NLM和OVCAR5 NLM(表达HLA-A2-NY-ESO-1的基因工程化细胞)和NA8、A2008-A2和OVCAR5(不表达HLA/A2-NY-ESO-1的肿瘤细胞系)。
图6显示了NY-ESO TCR转基因CD4+细胞的IL-2产生。使用的靶细胞是HLA.A2.1阳性、NY-ESO阴性细胞系NA8和HLA-A2.1阳性、NY-ESO阳性细胞系Me275、A375、Saos-2和U266。
图7显示了NY-ESO TCR转基因CD8+细胞的IFN-γ产生。使用的靶细胞是Me275(天然表达HLA/A2-NY-ESO-1的肿瘤细胞系)、A2008-A2 NLM和OVCAR5 NLM(表达HLA-A2-NY-ESO-1的基因工程细胞)和NA8、A2008-A2和OVCAR5(不表达HLA/A2-NY-ESO-1的肿瘤细胞系)。
图8显示了NY-ESO TCR转基因CD8+细胞的IFN-γ产生。使用的靶细胞是HLA.A2.1阳性、NY-ESO阴性细胞系NA8和HLA-A2.1阳性、NY-ESO阳性细胞系Me275、A375、Saos-2和U266。
图9显示了在肽脉冲的靶细胞的情况下，NY-ESO TCR转基因CD4+细胞(表达野生型BC1 TCR、I53E和I53F的CD4+细胞)的IL-2产生。CD4+T细胞与负载肽的T2靶细胞24小时共培养。
图10显示了在肽脉冲的靶细胞的情况下，NY-ESO TCR转基因CD8+细胞(表达野生型BC1 TCR、I53E和I53F的CD8+细胞)的IFN-γ产生。CD4+T细胞与负载肽的靶细胞24小时共培养。
图11显示了针对不同肿瘤细胞系用I53F、I53W和1G4LY TCR转导的CD8+T细胞的IFN-γ产生。使用的靶细胞是NY-ESO阴性细胞系U87MG、OVCAR3、A431、A673、SKOV3、RD-ES、SK-N-AS和HT-29，以及NY-ESO阳性细胞系A375。
图12显示了表达野生型BC1 TCR、I53E TCR和I53F TCR的CD8+细胞在不同时间点的细胞杀伤活性(通过IncuCyte测量)。“NT”指非转导细胞。
图13A-13B显示了使用WINN测定对NY-ESO TCR转基因细胞的体内评估。图13A显示了测定的示意图。图13B显示了测定的结果。将HLA-A2+/NY-ESO+肿瘤细胞系Me275与NY-ESO转导的T细胞混合，皮下注射到NSG小鼠的右侧。CD4+和CD8+的百分比分别为30％和70％。每周测量两次肿瘤大小。
图14A-14B显示了使用NSG小鼠对NY-ESO TCR转基因细胞的体内评估。图14A显示了测定的示意图。图14B显示了测定的结果。在第0天，将5×106个Me275细胞皮下注射到NSG小鼠的腹侧。当肿瘤大小约为50-100mm3时，在第10天和第13天在肿瘤周围注射10×106个NY-ESO特异性T细胞。CD4+和CD8+T细胞的百分比分别为30％和70％。
图15A-15B显示了使用NSG小鼠对NY-ESO TCR转基因细胞的体内评估。图15A显示了测定的示意图。图15B显示了测定的结果。第0天，将5×106个Me275细胞皮下注射到NSG小鼠的腹侧。当肿瘤大小约为50-100mm3时，在第10天和第13天静脉注射10x106个NY-ESO特异性T细胞。CD4+和CD8+T细胞的百分比分别为30％和70％。
图16A-16B显示了使用NSG小鼠对NY-ESO TCR转基因细胞的体内评估。图16A显示了测定的示意图。图16B显示了测定的结果。第0天，将5×106个Me275细胞皮下注射到NSG小鼠的腹侧。当肿瘤大小约为50-100mm3时，在第10天和第13天静脉注射不同数量的NY-ESO特异性T细胞。CD4+和CD8+T细胞的百分比分别为30％和70％。
图17A-17C证明了人T细胞可以被有效地共工程化以稳定表达NY-ESO-1 TCR并分泌小鼠GM-CSF。图17A描绘了逆转录病毒小鼠GM-CSF和慢病毒NY-ESO-1 TCR构建体的示意图。图17B显示了病毒转导后第7天人CD8+和CD4+T细胞的代表性等高线图。使用HLA-A2限制性的NY-ESO-1157-165四聚体证实了NY-ESO-1 TCR的表达，而小鼠GM-CSF的表达是通过检测表面Thy1.1报告蛋白进行的。图17C显示分泌的小鼠GM-CSF可以通过ELISA在转导的CD8+T细胞培养物的上清液中检测到。“NT”指非转导的T细胞。
图18A-18B证明分泌的小鼠GM-CSF对人T细胞活性没有影响。图18A显示，对由NY-ESO-1 TCR工程化T细胞分泌的IFNγ的检测是基于对HLA-A2+NY-ESO-1+肿瘤细胞的识别。小鼠粒细胞集落刺激因子对干扰素γ水平没有影响。图18B显示，NY-ESO-1 TCR工程化的T细胞可以容易地杀死HLA-A2+NY-ESO-1+肿瘤细胞，并且它们的细胞毒性活性不受小鼠GM-CSF的影响。图18A和18B指的是同一个实验。“NT”指非转导的。统计学显著性由单因素方差分析确定。＊＊＊＊p<0.0001。
图19A-19C证明在NSG人黑色素瘤异种移植小鼠模型中，肿瘤微环境中分泌的T细胞衍生的小鼠GM-CSF可以显著增强NY-ESO-1特异性T细胞对肿瘤生长的控制。图19A显示了来自Winn测定的小鼠中的肿瘤生长。与单独表达NY-ESO-1 TCR的对照T细胞相比，共工程化以分泌小鼠GM-CSF的表达人NY-ESO-1 TCR的T细胞可以有效地减缓Me275黑色素瘤细胞的植入和建立。图19B显示了来自Winn测定的小鼠的存活百分比。用表达NY-ESO-1 TCR并分泌小鼠GM-CSF的T细胞治疗的小鼠中，40％是无肿瘤的。图19C显示，与单独使用NY-ESO-1TCR相比，过继转移表达2×107个表达NY-ESO-1 TCR并分泌小鼠GM-CSF的T细胞显示出对已建立的Me275肿瘤的更好的肿瘤控制。“NT”指非转导的T细胞。体内反应的统计学显著性由单因素方差分析或不成对t检验确定。＊＊＊p<0.001。生存曲线的统计显著性由Mantel-Cox对数秩检验确定。＊＊p<0.01。
图20A-20B为小鼠和人GM-CSF提供了示例性的蛋白质和核苷酸序列。
图21证实了原代人T细胞可被有效转导以表达外源性磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)，或被共转导以表达外源性PDE4B2和NY-ESO-1 TCR变体β-I53F。描述了未诱导的、PDE4B2转导的以及PDE4B2&NY-ESO-1 TCR转导的CD4+和CD8+T细胞，在第7天通过流式细胞术分析外源性PDE4B2或NY-ESO-1 TCR变体β-I53F的表达。
图22证明了PDE4B2过表达阻止细胞内cAMP积累。图中显示了暴露于毛喉素(Fsk)或PGE2 1小时后，静息的eGFP(灰线)或PDE4B2(黑线)转导的CD4 T细胞的细胞内cAMP水平。处理后，裂解T细胞，通过ELISA定量cAPM水平。显示的结果来自单个实验，其中所有的cAMP测量都进行了三次。误差线代表标准偏差(SD)。
图23A-23B显示了PDE4B2转导的T细胞D Th-1细胞因子产生。图23A显示了在存在毛喉素或PGE2的情况下，用平板结合的αCD3和可溶性αCD28刺激(实线)或未用其刺激(虚线)7小时后，通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定的静息的eGFP-或PDE4B2-转导的CD4 T细胞产生IFNγ或TNF-α的情况。描绘了活CD45+eGFP+(灰色线)或活CD45+外源性PDE4B2+(黑线)淋巴细胞中干扰素γ+或肿瘤坏死因子-α+细胞的百分比以及代表性图。显示的结果来自单个实验，其中所有条件都重复进行。误差线代表标准差。图23B显示了通过ELISA评估的静息的eGFP-、PDE4B2-、eGFP&NY-ESO-1 TCR-或PDE4B2-&NY-ESO-1TCR-转导的CD8 T细胞对在PGE2或毛喉素存在下与NY-ESO-1呈递黑色素瘤细胞A375共培养48小时的干扰素γ分泌。描述了共培养上清液的干扰素γ浓度。误差线代表标准差。
图24证明PDE4B2过表达在诱导细胞内cAMP积累的条件下促进增殖。eGFP-(灰色)或PDE4B2转导的(黑色)CD4 T细胞的增殖能力通过BrDU掺入试验测定。在PGE2或毛喉素存在下，用(实线)或不用(虚线)平板结合的αCD3重新刺激T细胞48小时。描绘了活的CD45+淋巴细胞中的BrDU+细胞的百分比(左图)、这些群体的BrDU MFI(中间的图)以及代表性的图。显示的结果来自单个实验，其中所有条件都一式两份进行。误差线代表标准差。
图25证明PDE4B2过表达在PGE2存在下促进细胞毒性。在存在PGE2(黑线)或不存在PGE2(灰线)的情况下，通过IncuCyte评估静息的eGFP(空心三角形)-、PDE4B2(空心圆)-、eGFP&NY-ESO-1 TCR(闭合三角形)-或PDE4B2&NY-ESO-1 TCR(闭合圆)-转导的CD4(左图)或CD8(右图)T细胞抑制NY-ESO-1呈递黑色素瘤细胞A375扩增的能力。所描绘的是红色物体面积值，其对应于每个孔中A375细胞的细胞核所占据的mm2。显示的结果来自单个实验，其中所有条件都一式三次进行。将每孔四个不同平面纳入分析。误差线代表标准差。
图26提供了人和鼠PDE4B2的示例性蛋白质序列。
详细描述
本发明总体上提供了经修饰的T细胞受体(TCR)，其对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位具有改善的结合亲和力。
本发明还提供了相关的多肽和蛋白质，以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体，包括但不限于基因工程化细胞。此外，本发明提供了具有修饰的TCR的基因工程化细胞。本发明还提供了与本发明的经修饰的TCRs和细胞相关的药物组合物。
此外，本发明提供了表达修饰的TCR的淋巴细胞的基因工程化方法。本发明进一步提供了基因工程化淋巴细胞，其表达修饰的TCR和额外的受体，包括但不限于嵌合抗原受体或不针对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位的受体，或可溶性蛋白质，包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、抗体片段和抗原结合域。本文还提供了在过继细胞转移治疗中使用这种基因工程化淋巴细胞的方法。
本发明还提供了一种治疗受试者癌症的方法。该方法包括给患有这种癌症的受试者施用有效量的呈现本发明的经修饰的TCR的淋巴细胞。本发明还提供了一种刺激或增强哺乳动物中免疫反应的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用有效量的本发明基因工程化淋巴细胞。
一方面，本文提供了一种基因工程化淋巴细胞，其表达经修饰的TCR和来自集落刺激因子细胞因子/趋化因子家族的细胞因子和/或趋化因子。众所周知，集落刺激因子细胞因子/趋化因子家族的成员作用于大多数的髓样细胞并调节其活性(Ushach,I.和A.Zlotnik,Journal of Leukocyte Biology,2016.100:p.481-489)。具体而言，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已知在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞(DCs)的生物学中发挥免疫刺激作用。最初被描述为造血生长因子的GM-CSF已经成为包括自身免疫性疾病和癌症在内的多种病理状态的关键免疫调节剂。造血起源的细胞即巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、活化的T细胞和非造血起源的细胞如内皮细胞和成纤维细胞均分泌GM-CSF。在健康个体的血清中检测不到GM-CSF，而GM-CSF水平在炎症期间迅速升高(Becher,B.,S.Tugues,和M.Greter,Immunity,2016.45:p.963-973)。GM-CSF通过其同源受体，即主要在单核细胞/巨噬细胞和粒细胞谱系以及树突状细胞上发现的GM-CSF受体(GM-CSF-R)发挥其多效性作用。在配体结合时，GM-CSF受体转导与细胞存活、增殖、分化和激活相关的信号(Hercus,T.R.等人,Blood.2009.114:p.1289-1298)。通过控制这种专业抗原呈递细胞(APCs)的命运，GM-CSF可以间接调节T细胞的活性，从而充当适应性免疫和先天免疫之间的桥梁(Shi,Y.等人,Cell Res.2006.16(2):126-33)。
在癌症治疗中，GM-CSF在癌症患者的支持性护理以及在化疗和/或干细胞移植方案后加速和增强免疫系统髓室的恢复方面发挥了核心作用(Arellano,M.和S.Lonial,Biologics.2008.2(1):13-27)。此外，其在DC发育和分化中的关键作用已将GM-CSF置于基于DC的免疫疗法的核心，其形式为分泌激活DC的GM-CSF的癌症疫苗(Gupta,R.和L.A.Emens.Discovery medicine,2010.10(50):p.52-60)或过继转移GM-CSF激活/偏斜树突状细胞作为主要免疫疗法(Mookerjee,A.,M.Graciotti,和L.Kandalaft,BioImpacts:BI,2018.8(3):p.211-221)。树突状细胞在使用强制过度表达GM-CSF的肿瘤的临床前研究中也已成为强抗肿瘤反应的关键介质(Shi,F.S.等人,Cancer Gene Ther,1999.6(1):p.81-8)或在癌症患者施用可溶性GM-CSF后(Nasi,M.L.等人,Cytokines Cell Mol Ther,1999.5(3):p.139-44)。尽管结果令人鼓舞，但在临床上使用GM-CSF作为单一辅助治疗已被证明相当不令人满意(Lawson,D.H.等人,J Clin Oncol,2015.33(34):p.4066-76)并且受到剂量相关毒性出现的限制(Antman,K.S.等人,N Engl J Med,1988.319(10):p.593-8)。有趣的是，另一组研究揭示了GM-CSF驱动的抗肿瘤反应的免疫抑制机制，其中肿瘤来源的GM-CSF负责肿瘤微环境中CD11b+Gr-1+髓系来源的抑制细胞(MDSCs)的免疫吸引，进而促进肿瘤逃避(Pylayeva-Gupta,Y.等人,Cancer Cell,2012.21:p.836-847)。
为了最大限度地利用过继性T细胞转移策略的益处，并利用GM-CSF的免疫调节性抗癌特性，同时避免任何不良副作用和脱靶毒性，开发了一种组合方法，其中T细胞被遗传共工程化以异位表达高亲和力的NY-ESO-1特异性TCR和GM-CSF。表达NY-ESO-1特异性TCR和GM-CSF的T细胞的一个实施方案在下面的实施例6中举例说明。结果表明，人T细胞在不影响其增殖能力或抗肿瘤活性的情况下高效分泌全功能的可溶性GM-CSF，并在体内诱导对人NY-ESO-1+黑色素瘤的强烈抗肿瘤反应。
另一方面，本文提供了表达修饰的TCR和磷酸二酯酶的基因工程化淋巴细胞。在一些实施方案中，所述磷酸二酯酶是磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)。细胞内第二信使环AMP(cAMP)在T细胞中作为一种有效的免疫抑制信号分子，由多种肿瘤相关抑制因子上调，包括前列腺素E2(PGE2)、腺苷和调节性T细胞的功能。磷酸二酯酶的过表达可减少cAMP信号传导，增加抗肿瘤T细胞对抑制因子如前列腺素E2抑制的抗性。参见美国专利第9,976,121号和Schmetterer,KG.,Front.Immunol.,2019年7月30日，在此将其全部内容引入作为参考。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用，术语“抗原”是能够特异性结合抗体或产生被T细胞受体识别的肽片段和/或诱导免疫反应的分子和/或物质。抗原可能包含一个或多个“表位”。在某些实施方案中，抗原具有几个表位。在MHC分子的情况下，表位被抗体或淋巴细胞识别。在各种实施方案中，抗原是NY-ESO-1。在各种实施方案中，表位是NY-ESO-1157-165。
如本文所用，可互换使用的术语“肿瘤抗原”或“癌症抗原”被广泛定义为由肿瘤或癌细胞特异性表达或与肿瘤相关的抗原，例如过表达或异常表达的抗原、致癌病毒产生的抗原、癌胚抗原、改变的细胞表面糖脂和糖蛋白抗原、细胞类型特异性分化抗原。存在于癌细胞表面上的肿瘤抗原是不存在于个体的正常体细胞表面上的抗原，即该抗原暴露于癌细胞中的免疫系统，但不暴露于正常体细胞中的免疫系统。抗原可以在肿瘤细胞的细胞表面表达，在那里它被体液免疫系统的成分如B淋巴细胞(B细胞)识别。细胞内肿瘤抗原被加工成较短的肽片段，这些肽片段与主要组织相容性复合体(MHC)分子形成复合物，并呈现在癌细胞的细胞表面上，在那里它们被T淋巴细胞(T细胞)或自然杀伤细胞的T细胞受体(TCR)识别。优选地，肿瘤抗原是正常细胞不表达、或者至少不以与肿瘤细胞相同的水平表达的抗原。
本文使用的术语“功能性片段”是指多肽或蛋白质的片段，或编码多肽或蛋白质的多核苷酸，其保留全长多肽或蛋白质的至少一种功能。功能性片段可以包含全长多肽或蛋白质的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少6个连续氨基酸残基、至少7个连续氨基酸残基、至少8个连续氨基酸残基、至少9个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少11个连续氨基酸残基、至少12个连续氨基酸残基、至少13个连续氨基酸残基、至少14个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基酸残基，至少20个连续氨基酸残基，至少25个连续氨基酸残基，至少40个连续氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续氨基酸残基，至少70个连续氨基酸残基，至少80个连续氨基酸残基，至少90个连续氨基酸残基，至少100个连续氨基酸残基，至少125个连续氨基酸残基，至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基。多肽或蛋白质的功能性片段可以保留全长蛋白质或多肽的一个、两个、三个、四个、五个或更多功能。例如，免疫特异性结合特定抗原(或表位)的TCR功能性片段可以保留免疫特异性结合抗原(或表位)的能力。在一些实施方案中，TCR的功能性片段包含TCR的α链和/或β链的一个或多个互补决定区。在一些实施方案中，TCR的功能性片段包含TCR的α链和/或β链。
本文使用的术语“变体”是指修饰的多肽、蛋白质或多核苷酸，其与野生型多肽、蛋白质或多核苷酸具有实质或显著的序列同一性或相似性。相对于其为变体的野生型多肽、蛋白质或多核苷酸，变体可以保持相同的生物活性，或者具有改变的(例如，改善的、降低的或消除的)生物活性。变体可以包含至少一个氨基酸残基或核苷酸的插入、缺失、取代。
术语“抗原结合蛋白”是指与感兴趣的抗原或其多肽或片段结合的任何蛋白。所述蛋白可以是天然来源的，也可以是合成的。抗原结合蛋白的例子包括、但不限于抗体；源自抗体的多肽或片段，例如单链可变片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；源自T细胞受体的多肽，例如TCR可变结构域；分泌因子(如细胞因子、生长因子)，可以人工融合到信号结构域(如“zytokines”)；以及与目的抗原结合的任何配体或受体片段(如CD27、NKG2D)。组合文库也可用于鉴定与治疗目标以高亲和力结合的肽。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗体片段(例如单链抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段如(Fab)2’-片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体、微抗体、双抗体、三抗体、十抗体和其他结构域抗体(例如Holt(2003),21,11,484-490))。术语“抗体”也指共价二联体，例如美国专利公开2007/0004909中公开的那些，和Ig-DARTS，例如美国专利公开2009/0060910中公开的那些。可用于本文所述方法的抗体包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可将DNA或RNA序列(如外源基因)导入宿主细胞、从而对宿主进行遗传修饰并促进所导入序列的表达(如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、合成的RNA和DNA分子、转座子、噬菌体、病毒等。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体，例如、但不限于腺病毒、腺相关病毒、α病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或痘苗病毒载体。
术语“调节元件”是指控制核酸序列表达的某些方面的任何顺式作用遗传元件。在一些实施方案中，术语“启动子”包括启动转录所需的基本上最小的序列。在一些实施方案中，术语“启动子”包括启动转录的序列，此外，还包括能够上调或下调转录的序列，通常分别称为“增强子元件”和“阻遏子元件”。在一些实施方案中，所述启动子是淋巴细胞特异性启动子。
这里使用的术语“可操作地连接”是指一种核苷酸序列被置于与另一核苷酸序列处于有功能的关系。例如，如果编码序列可操作地连接启动子序列，这通常意味着所述启动子可以促进该编码序列的转录。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区时，是连续的并且在阅读框中。然而，由于增强子在与启动子分开几千个碱基时可以发挥作用，并且内含子序列可以是可变长度的，所以一些核苷酸序列可能是可操作连接的，但不是连续的。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，在本文中用作同义词。如本文所用，T细胞包括胸腺细胞、幼稚T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助细胞，例如T辅助细胞1(Th1)或T辅助细胞2(Th2)。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞，细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)，肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或任何其他T细胞亚群。适用于特定实施方案的其他说明性T细胞群包括原始T细胞和记忆T细胞。还包括“NKT细胞”，它是指表达半不变αβT细胞受体的特化T细胞群，但也表达通常与自然杀伤细胞相关的多种分子标记，如NK1.1。NKT细胞包括NK1.1+和NK1.1-，以及CD4+、CD4-、CD8+和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR是独特的，因为它识别由MHC I样分子CD Id呈递的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可能具有保护性或有害性作用。还包括“γ-δT细胞”(γδT细胞)，它指的是一个特殊的T细胞小群体，在其表面上具有独特TCR，并且与其中TCR由两个糖蛋白链(称为α-和β-TCR链组成)的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ链和δ链组成。γδT细胞可在免疫监视和免疫调节中发挥作用，并被发现是IL-17的重要来源，诱导强大的CD8+细胞毒性T细胞反应。还包括“调节性T细胞”或“Tregs”，指抑制异常或过度免疫反应并在免疫耐受中发挥作用的T细胞。Tregs细胞通常是转录因子Foxp3阳性的CD4+T细胞，也可以包括转录因子Foxp3阴性的调节性T细胞，它们是产生白介素-10的CD4+T细胞。
术语“自然杀伤细胞”和“NK细胞”可互换使用，并在本文中同义使用。如本文所用，自然杀伤细胞是指具有CD 16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NKs的特征在于能够结合并通过激活特定的细胞溶解酶来杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死肿瘤细胞或其他表达NK激活受体的配体的患病细胞，并能够释放被称为细胞因子、能刺激或抑制免疫反应的蛋白质分子。
如本文所用，“外源性”是指不是来源于自然界中发现的特定细胞的任何分子。外源分子可以通过人工或天然方式从导入宿主细胞的核酸分子中表达。
术语“治疗”一种状态、障碍或病症包括:(1)预防、延迟或降低在可能患有或易患所述状态、障碍或病症，但尚未经历或显示所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状的受试者中发展的所述状态、障碍或病症的至少一种临床或亚临床症状出现的发生率和/或可能性；或(2)抑制所述状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟所述疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解所述疾病，即引起所述状态、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。对要治疗的受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对患者或医生是可察觉的。
用于剂量或量的术语“有效”是指化合物或药物组合物的足以在给予有此需要的受试者时产生所需活性的量。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可以包括或不包括单独施用时有效的每种成分的量。所需的确切量因受试者而异，取决于受试者的种类、年龄和一般状况、所治疗疾病的严重程度、所使用的一种或多种具体药物、给药方式等。
与本文所述组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指这种组合物的分子实体和其它成分，它们是生理上可耐受的，并且当给予哺乳动物(例如人)时通常不会产生不良反应。优选地，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，尤其是人类的药物。
术语“患者”、“个体”、“受试者”和“动物”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于人类和兽类动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)和实验动物模型。在一个优选实施方式中，受试者是人。
术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液优选用作载体，特别是用于注射溶液。或者，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压制丸剂)、助流剂、包封剂、香料和着色剂中的一种或多种。合适的药物载体描述在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。
单数形式“一个/种”和“所述/该”包括复数的提及物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种方法”包括一种或多种方法，和/或在此描述的类型的步骤，和/或对于阅读本公开的本领域技术人员来说将变得显而易见的方法和/或步骤。
术语“大约”或“近似”包括处于数值的统计上有意义的范围内。这样的范围可以在给定值或范围的数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，还更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“大约”或“近似”所包含的容许变化取决于所研究的特定系统，并且可以被本领域普通技术人员容易地理解。
除非本文中另有说明，否则本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独数值和每个端点的简写方法，并且每个单独数值和端点被结合到说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。
除非另有说明，否则本发明的实施采用本领域技术范围内的统计分析、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。这种工具和技术详细描述于例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.3rd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York；Ausubel等人编(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Bonifacino等人编(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wileyand Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coligan等人编(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coico等人编(2005)Current Protocols inMicrobiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；Coligan等人编(2005)CurrentProtocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ；和Enna等人编(2005)Current Protocols in Pharmacology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,NJ中。
修饰的T细胞受体
在一个方面，本发明提供了修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，其中所述经修饰的T细胞受体包含相对于未取代的野生型(WT)T细胞受体β链的CDR2而言在所述经修饰的T细胞受体β链的互补决定区(CDR)2内的单个氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的T细胞受体(TCR)，其包含野生型(WT)TCR的氨基酸序列，并且在TCRβ链的互补决定区(CDR)2内具有不超过一个氨基酸取代，其中所述经修饰的TCR保留了WT TCR的抗原特异性，并且与WT TCR相比，对癌症抗原具有更高的结合亲和力，并且包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在SEQ ID NO:1的CDR2中具有不超过一个氨基酸取代
在某些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的结合亲和力高约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、大约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍或100倍以上。
解离常数(KD)可用于评估修饰的TCR与癌症抗原的结合亲和力。在某些实施方案中，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约0.1至约10μM之间。作为非限制性实例，所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)可以是约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约1.2μM、约1.5μM、约1.7μM、约2μM、约2.2μM、约2.5μM、约2.7μM、约3μM、约3.2μM、约3.5μM、约3.7μM、约3.9μM、约4μM、约4.2μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM或约10μM。
在一个实施方案中，本发明提供了修饰的T细胞受体(TCR)，其包含野生型(WT)TCR的氨基酸序列，其具有位于TCRβ链的互补决定区(CDR)2中的不超过一个氨基酸取代，其中所述经修饰的TCR保留了WT TCR的抗原特异性，并且与WT TCR相比，对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的结合亲和力更高，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，具有位于SEQ ID NO:1的CDR2中的不超过一个氨基酸取代。
在某些实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约2倍至约100倍。作为非限制性实例，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力可以比WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍或100倍以上。在各种实施方案中，所述表位是NY-ESO-1157-165。
在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约5至约75倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约10至约75倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约25至约75倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约40至约75倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约40至约60倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约40至约50倍。在一个实施方案中，与WT TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力相比，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力高约50倍。在各种实施方案中，所述表位是NY-ESO-1157-165。
解离常数(KD)可用于评估修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的结合亲和力。在某些实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)在约0.1至约10μM之间。作为一个非限制性实例，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)可以是约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约1.2μM、约1.5μM、约1.7μM、约2μM、约2.2μM、约2.5μM、约2.7μM、约3μM、约3.2μM、约3.5μM、约3.7μM、约3.9μM、约4μM、约4.2μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM或约10μM。在各种实施方案中，所述表位是NY-ESO-1157-165。
在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)在约0.3至约4.5μM之间。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)在约0.3至约2μM之间。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)在约2至约3μM之间。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)在约3至约4μM之间。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)为约0.4μM。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)约为0.4μM。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)为约0.41μM。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)为约3.9μM。在一个实施方案中，经修饰的TCR对癌症抗原NY-ESO-1的解离常数(KD)为约3.89μM。在各种实施方案中，所述表位为NY-ESO-1157-165。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含位于TCRβ链的CDR2内残基53处的单个氨基酸取代。所述单个氨基酸取代可以包括但不限于I53E、I53F和I53W。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含位于TCRβ链CDR2内的残基55处的单个氨基酸取代。所述单个氨基酸取代可以包括但不限于D55E。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含位于TCRβ链CDR2内的残基50、51或52处的单个氨基酸取代。所述单个氨基酸取代可以包括但不限于G50V、G50A、A51D、A51E或G52Q。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR的β链序列在修饰的TCR的β链或其功能性片段的CDR2区之外包含与未取代的WT TCR的β链或其功能性片段至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，在一个实施方案中，所述经修饰的TCR的β链或其功能性片段包含未取代的WT TCR的β链或其功能性片段的氨基酸序列，所述单个氨基酸取代位于CDR2区域内。在一个实施方案中，未取代的WT TCR的β链包含SEQ ID NO:1.的氨基酸序列。
在某些实施方案中，经修饰的TCR包含与选自SEQ ID NO:2-5中任一序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR包含位于β链的CDR2内的单个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含选自SEQ ID NO:2-5中任一序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含由与选自SEQ ID NO:11-14中任一序列的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由与SEQ IDNO:11的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由与SEQID NO:12的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR包含位于β链的CDR2内的单个氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述经修饰的TCR包含由选自SEQ ID NO:11-14中任一序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由SEQ ID NO:12的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由SEQ IDNO:13的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR包含由SEQID NO:14的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了一种修饰的T细胞受体(TCR)，其包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链，和包含与选自SEQ ID NO:2-5中任一序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链，和包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链，和包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链，和包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链，和包含与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的β链。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR包含位于β链的CDR2内的单个氨基酸取代。
一方面，本发明提供了一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链以及含有SEQ ID NO:2-5中任一所示的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链以及含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链以及含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链以及含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含含有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的α链以及含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的β链。
一方面，本发明提供了一种修饰的T细胞受体(TCR)，其包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由与选自SEQ ID NO:11-14中任一所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由与SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由与SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的β链。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR包含位于β链CDR2内的单个氨基酸取代。
一方面，本发明提供了一种修饰的T细胞受体(TCR)，其包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由SEQ ID NO:11-14中任一所示的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由SEQ ID NO:12的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的T细胞受体(TCR)包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的α链以及由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码的β链。
本发明还提供了相关的多肽和蛋白质，以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体，包括但不限于基因工程细胞。
在一个方面，本发明提供了分离的多肽，其包含本文所述的经修饰的TCR的功能性部分，其中该功能性部分包含TCR的α和β链的可变区，并且其中该功能性部分包含所述氨基酸取代。在某些实施方案中，所述分离的多肽包含选自SEQ ID NO:2-5的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了分离的多肽，其包含本文所述的经修饰的TCR的功能性部分，其中该功能性部分进一步包含TCR的α和β链的恒定区。在某些实施方案中，所述恒定区是人源的。在其他实施方案中，所述恒定区是小鼠源的。
在一个方面，本发明提供了编码本文所述的经修饰的TCRs的任何氨基酸序列的核酸序列。
应当理解，保守氨基酸取代可以被引入到本文所述的任何多肽中，以获得与参考序列具有例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的多肽，并且优选保留该序列的活性。如本领域已知的和本文所指的，保守氨基酸取代包括用在例如结构、大小和/或化学性质方面具有相似侧链的氨基酸取代蛋白质中的氨基酸。例如，下列各组中的氨基酸可以与同一组中的其它氨基酸互换：具有脂族侧链的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有非芳香族的含羟基侧链的氨基酸，如丝氨酸和苏氨酸；具有酸性侧链的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；具有酰胺侧链的氨基酸，包括谷氨酰胺和天冬酰胺；碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有芳香环侧链的氨基酸，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸，包括半胱氨酸和甲硫氨酸。此外，具有酸性侧链的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸，在本文中被认为可与具有酰胺侧链的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺互换。
下面提供了在本发明的各种实施方案中有用的序列的例子。
BC1 WTβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGAAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:1)
I53Eβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGETDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGAAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:2)
I53Fβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGFTDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGAAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:3)
I53Wβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGWTDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGAAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:4)
D55Eβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITEQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGAAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:5)
A97Lβ链
MAPRLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGLAGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG＊(SEQ ID NO:6)
BC1 WTα链
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPQTGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS＊(SEQ ID NO:7)
NY-ESO-1157-165肽
SLLMWITQC(SEQ ID NO:8)
BC1 WTα链
ATGGAAACCCTGCTGGGCCTGCTGATCCTGTGGCTGCAGCTGCAGTGGGTGTCCAGCAAGCAGGAAGTGACCCAGATCCCTGCCGCCCTGAGCGTGCCCGAGGGCGAGAACCTGGTGCTGAACTGCAGCTTCACCGACAGCGCCATCTACAACCTGCAGTGGTTCCGGCAGGACCCCGGCAAGGGCCTGACCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCAGCCAGCGGGAGCAGACCAGCGGCAGGCTGAACGCCAGCCTGGACAAGAGCAGCGGCAGAAGCACCCTGTACATCGCCGCCAGCCAGCCCGGCGACTCCGCCACCTACCTGTGCGCCGTGCGGCCTCAGACCGGCGGCAGCTACATCCCCACCTTCGGCAGGGGCACCAGCCTGATCGTGCACCCCTACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGTCCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGAGCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATCATCCCCGAGGACACCTTTTTCCCCAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGAGCTTCGAGACCGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATTCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGT(SEQ IDNO:9)
BC1 WTβ链
ATGGCCCCGCGGCTGCTGTGTTGTGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAACGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTACAGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACAGCGTGGGAGCCGGCATCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAACGTGAGCAGAAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGAGGCTGCTGTCTGCCGCCCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGAGCCGCCGGAGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCAGCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCCCCCGAAGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAAGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGATAGCAGATACTGCCTGAGCAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCAGAGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGTGTCCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCAGGGGCTGA(SEQ ID NO:10)
I53Eβ链
ATGGCCCCGCGGCTGCTGTGTTGTGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAACGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTACAGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACAGCGTGGGAGCCGGCGAGACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAACGTGAGCAGAAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGAGGCTGCTGTCTGCCGCCCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGAGCCGCCGGAGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCAGCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCCCCCGAAGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAAGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGATAGCAGATACTGCCTGAGCAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCAGAGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGTGTCCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCAGGGGCTGA(SEQ ID NO:11)
I53Fβ链
ATGGCCCCGCGGCTGCTGTGTTGTGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAACGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTACAGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACAGCGTGGGAGCCGGCTTCACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAACGTGAGCAGAAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGAGGCTGCTGTCTGCCGCCCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGAGCCGCCGGAGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCAGCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCCCCCGAAGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAAGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGATAGCAGATACTGCCTGAGCAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCAGAGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGTGTCCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCAGGGGCTGA(SEQ ID NO:12)
I53Wβ链
ATGGCCCCGCGGCTGCTGTGTTGTGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAACGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTACAGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACAGCGTGGGAGCCGGCTGGACCGACCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAACGTGAGCAGAAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGAGGCTGCTGTCTGCCGCCCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGAGCCGCCGGAGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCAGCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCCCCCGAAGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAAGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGATAGCAGATACTGCCTGAGCAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCAGAGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGTGTCCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCAGGGGCTGA(SEQ ID NO:13)
D55Eβ链
ATGGCCCCGCGGCTGCTGTGTTGTGCCGCCCTGAGCCTGCTGTGGGCCGGACCTGTGAACGCCGGCGTGACCCAGACCCCCAAGTTCCAGGTGCTGAAAACCGGCCAGAGCATGACCCTGCAGTGCGCCCAGGACATGAACCACGAGTACATGAGCTGGTACAGGCAGGACCCCGGCATGGGCCTGCGGCTGATCCACTACAGCGTGGGAGCCGGCATCACCGAGCAGGGCGAGGTGCCCAACGGCTACAACGTGAGCAGAAGCACCACCGAGGACTTCCCCCTGAGGCTGCTGTCTGCCGCCCCTAGCCAGACCAGCGTGTACTTCTGCGCCAGCAGCTATGTGGGAGCCGCCGGAGAGCTGTTCTTCGGCGAGGGCAGCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCCCCCGAAGTGGCCGTGTTCGAGCCCAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTGAACGGCAAGGAAGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGACCCCCAGCCCCTGAAGGAGCAGCCCGCCCTGAACGATAGCAGATACTGCCTGAGCAGCCGGCTGAGAGTGAGCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCCGCCGAGGCCTGGGGCAGAGCCGACTGCGGCTTCACCAGCGTGTCCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTGAAGCGGAAGGACAGCAGGGGCTGA(SEQ ID NO:14)。
基因工程细胞
在一个方面，本发明提供了一种表达本文所述的经修饰的TCR的淋巴细胞的基因工程方法。在一个实施方案中，所述淋巴细胞经过基因工程改造，以表达包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的经修饰的TCR。在一个实施方案中，所述淋巴细胞经过基因工程改造，以表达包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的经修饰的TCR。在一个实施方案中，所述淋巴细胞经过基因工程改造，以表达包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的经修饰的TCR。在一个实施方案中，所述淋巴细胞经过基因工程改造，以表达包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的经修饰的TCR。所述淋巴细胞可以从PBMC、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物中获得。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达一种或多种外源分子。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达一种或多种细胞表面受体。细胞表面受体的例子包括但不限于嵌合抗原受体和不针对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的T细胞受体。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达一种或多种可溶性蛋白质。可溶性蛋白质的例子包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、抗体、抗体片段和抗原结合域。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达一种或多种另外的受体和可溶性蛋白。
一方面，本发明提供了表达本文所述的经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞。在一个实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞表达经修饰的TCR，所述经修饰的TCR包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞表达经修饰的TCR，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞表达经修饰的TCR，所述经修饰的TCR包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞表达经修饰的TCR，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR包含位于β链CDR2内的单个氨基酸取代。
所述淋巴样细胞可以获自PBMC、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达额外的受体。额外的受体包括但不限于嵌合抗原受体和不针对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的T细胞受体。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达可溶性蛋白质。可溶性蛋白质包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、抗体、抗体片段和抗原结合域。在某些实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞被进一步工程化以表达额外的受体和可溶性蛋白。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在各种实施方案中，所述基因工程化淋巴细胞表达经修饰的TCR，所述经修饰的TCR相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)而言包含位于β链CDR2内的单个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文提供的基因工程化淋巴细胞可以被基因工程化以进一步表达一种或多种外源分子。
淋巴细胞是免疫系统的细胞，其与抗原发生特异性反应，产生特定的细胞产物。包含淋巴细胞的样品可以从受试者的多种来源获得，包括但不限于例如组织(包括肿瘤组织，病毒感染组织，炎症部位、淋巴细胞浸润部位和白细胞浸润部位的组织)、胸腺、肿瘤组织(例如样品、碎片)或酶消化组织、解离/悬浮细胞、淋巴结样品或体液样品(例如血液、腹水、淋巴)。示例性组织包括皮肤、脂肪组织、心血管组织如静脉、动脉、毛细血管、瓣膜；神经组织、骨髓、乳房、胃肠、肺组织、眼组织如角膜和晶状体、软骨、骨和粘膜组织。
样品可以是未处理的、酶促处理的和/或解离/悬浮以形成细胞悬浮液。当样品被酶促处理时，可以使用的酶的非限制性例子包括胶原酶、分散酶(dispase)、透明质酸酶、释放酶(liberase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。
在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括肿瘤浸润免疫细胞。肿瘤浸润性免疫细胞由不同比例的单核和多形核免疫细胞(即T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等)组成。在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL是离开血流并向肿瘤迁移的白细胞。TIL通常可以在肿瘤基质和肿瘤内部发现。
在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括外周血淋巴细胞(PBLs)。在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞包括T淋巴细胞(T细胞)和/或自然杀伤细胞(NK细胞)。
在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞是T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞是CD4+细胞。在某些实施方案中，所述T细胞是调节性T细胞。
在某些实施方案中，用于本发明的淋巴细胞是自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，所述自然杀伤细胞是CD16+CD56+和/或CD57+自然杀伤细胞。NK的特点是其能够结合并通过激活特定的细胞溶解酶来杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死肿瘤细胞或其他表达NK激活受体的配体的患病细胞，以及能够释放刺激或抑制免疫反应、被称为细胞因子的蛋白质分子。
适合淋巴细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小必需培养基(MEM)、RPMIMedia 1640,Lonza RPMI 1640,Advanced RPMI,Clicks,AIM-V,DMEM,a-MEM,F-12,TexMACS,X-Vivo 15,和X-Vivo20,Optimizer,，添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其或者无血清或者补充了适量的血清(或血浆)或确定组的激素，和/或足以生长和扩增的细胞因子的量)。
用于淋巴细胞扩增的其他添加剂的例子包括、但不限于表面活性剂、磷脂酸盐、pH缓冲剂如HEPES和还原剂如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。抗生素(如青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注给受试者的细胞培养物中。目标细胞保持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如空气加上5％CO2)。
淋巴细胞的扩增可以使用本领域已知的方法和条件进行。在某些实施方案中，淋巴细胞的扩增根据国际申请号PCT/EP2018/080343中描述的方法进行。
淋巴细胞的基因工程改造可以通过转染、转导或暂时细胞膜破裂(即细胞挤压)中的至少一种来完成，以将编码所述经修饰的TCR的至少一种多核苷酸引入淋巴细胞。在某些实施方案中，通过用重组表达载体转导基本上均一的细胞群，将上述多核苷酸引入淋巴细胞。这种载体可以是病毒载体或非病毒载体。用于本发明的示例性病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体。在一个实施方案中，用于本发明的病毒载体是慢病毒载体。
可以将额外的受体工程化到表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞中。在基因工程化淋巴细胞上具有额外的受体可以增强淋巴细胞功能(例如抗肿瘤功能)。
在某些实施方案中，上述额外的受体是嵌合抗原受体。嵌合抗原受体(CARs)通常具有抗原结合结构域，该结构域与能够激活或刺激免疫细胞的细胞内信号传导结构域融合。CAR的细胞外结合结构域可以由单链可变片段(scFv)组成，该片段来源于融合鼠或人源化单克隆抗体的可变重链区和轻链区。或者，可以使用来自Fab(而不是来自抗体，例如从Fab文库获得的抗体)的scFv。scFv可以融合跨膜区，然后融合细胞内信号传导区。CAR可以是第一代、第二代或第三代CAR。“第一代”CARs包括那些仅在抗原结合时提供CD3ζ信号的CARs。“第二代”CARs包括同时提供共刺激(如CD28或CD137)和激活(CD3ζ)的CARs。“第三代”CARs包括提供多重共刺激(如CD28和CD137)和激活(CD3ζ)的CARs。CAR可以特异性识别癌症抗原。
在某些实施方案中，所述额外的受体是对癌症抗原NY-ESO-1157-165表位不特异的TCR。这种TCR可以特异性识别除NY-ESO-1157-165表位以外的癌症抗原。
在某些实施方案中，所述癌症抗原可以选自CD7、CD74、CDS、CEA、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2、3、4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、GD2、GD3、HER2、hTERT、IL-13R-a2、KDR、K-轻链、LeY、L1细胞、MAGE-Al、间皮素、MUC1、MUC16、NKG2D配体、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2和WT-1。
表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞可以被工程化以表达和分泌一种或多种可溶性蛋白质。用于本发明的可溶性蛋白质包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、抗体、抗体片段和抗原结合域及其功能性变体。
可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的细胞因子包括、但不限于白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-33(IL-33)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFN-alpha或IFN-α)干扰素β(IFN-beta或IFN-β)、干扰素γ(IFN-gamma或IFN-γ)转移生长因子β(TGF-β)、CCL19和红细胞生成素。在一些实施方案中，基因工程化淋巴细胞表达的细胞因子是白介素-2。在一些实施方案中，基因工程化淋巴细胞表达的细胞因子是干扰素-γ。在一些实施方案中，基因工程化淋巴细胞表达的细胞因子是GM-CSF。
可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的趋化因子包括但不限于CXC趋化因子，如白细胞介素-8(IL-8)、中性粒细胞激活蛋白-1(NAP-1)、中性粒细胞激活蛋白-2(NAP-2)、GRO、GROβ、GROγ、ENA-78、GCP-2、IP-10、MIG、CXCL1、CXCL12、CXCL16、CXCL19和PF4；以及CC趋化因子、RANTES、MIP-1α、MIP-2β、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、CCL5和嗜酸性粒细胞趋化因子。在国际公开号WO2000078334A1(例如表1)中描述的合适的趋化因子也涵盖在本发明的范围内，该国际公开号WO2000078334 A1全文引入本文作为参考。
可以由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的生长因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、角质细胞生长因子、睫状神经营养生长因子、施万细胞衍生生长因子、痘苗病毒生长因子、家蚕素、neu分化因子、v-Sis和睫状生长因子。
可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的可溶性受体包括但不限于可溶性细胞因子受体，如IL-1RI、IL-1RII、TNFRI、TNFRII、IFN-α/βR、IL-4受体、IL-6受体、IL-10受体、IL-11受体、IL-13受体、IL-18结合蛋白和TGF-β受体；以及可溶性生长因子受体，例如可溶性表皮生长因子受体(sEGFRs)、可溶性血管内皮生长因子受体和PD-1外域，以及可溶性VEGFR-1和SIRP-α分子。可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的可溶性受体可进一步融合到CD28内结构域或41BB内结构域或本领域已知的任何其他共刺激内结构域。
可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达和/或分泌的配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)配体，例如神经生长因子(NGF)、CD40L(CD154)、CD137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFα)、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、Fas配体激动剂(FasL激动剂)、LAG3配体、VEGFR1配体、TIM3配体、TIGIT配体、SIRP-α配体、CD30L/CD153、肿瘤坏死因子β(TNFβ)/淋巴毒素-α(LTα)、淋巴毒素-β(LTβ)、CD257/B细胞激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Ta11-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和LIGHT(TNFSF14)；免疫球蛋白超家族配体，如CD80和CD86；以及toll样受体(TLRs)的配体、4-1BB配体、激动剂、OX40配体激动剂、ICOS配体激动剂、Flt3配体、磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)、磷酸二酯酶4A(PDE4A)、磷酸二酯酶7A(PDE7A)、磷酸二酯酶4C(PDE4C)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)配体。
本文所述的基因工程化淋巴细胞可表达和/或分泌抗体包括特异性结合癌症抗原的抗体。这种癌症抗原可选自CD7、CD19、CD74、CDS、CEA、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2、3、4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、GD2、GD3、HER2、hTERT、IL-13R-a2、KDR、K-轻链、LeY、L1细胞、MAGE-Al、间皮素、MUC1、MUC16、NKG2D配体、NY-ESO-1、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2和WT-1。特异性结合所述抗原的氨基酸序列是本领域已知的，或者可以使用本领域已知的方法制备。
在某些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体(例如，双特异性T细胞抗体(BiT))。双特异性抗体是含有两个不同抗原结合域的重组合成抗体。例如，抗原结合域之一可以靶向癌症抗原，而另一个结合淋巴细胞活化分子。
对癌症抗原具有亲和力的抗体片段或抗原结合域可由本文所述的基因工程化淋巴细胞表达。抗体片段包括但不限于单链抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段如(Fab)2’-片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体(intrabodies)、微抗体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)和十抗体(decabodies)。
表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞可被工程化以进一步表达抑制/检查点分子的基因敲除，包括但不限于PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、VISTA、TIM-3和Cbl-b。在一些实施方案中，表达可被工程化以表达基因敲除的经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞可被进一步工程化以表达和分泌额外的可溶性蛋白，例如但不限于IL-2、IL-33、GM-CSF、CD40激动剂等。
还提供了在过继细胞转移治疗中使用这种基因工程化淋巴细胞的方法。在某些实施方案中，所述淋巴细胞相对于受试者而言可以是自体的、同种异体的、同基因的或异基因的。在某些实施方案中，所述淋巴细胞是自体的，以便在重新引入受试者进行免疫治疗时减少针对淋巴细胞的免疫反应。
在一个实施方案中，本文提供了表达TCR并进一步表达一种或多种蛋白质的基因工程化淋巴细胞。在某些实施方案中，至少一种所述蛋白质是可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是例如生长因子(例如GM-CSF)。在某些实施方案中，至少一种所述蛋白质是细胞间蛋白质。所述细胞间蛋白可以是例如磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。在某些实施方案中，TCR是外源野生型TCR。在某些实施例中，TCR是经修饰的TCR。
在一个实施方案中，本文提供了表达TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是生长因子。所述生长因子可以是GM-CSF。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是生长因子。所述生长因子可以是GM-CSF。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是生长因子。所述生长因子可以是GM-CSF。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是生长因子。所述生长因子可以是GM-CSF。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述经修饰的TCR包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种可溶性蛋白质。所述可溶性蛋白质可以是生长因子。所述生长因子可以是GM-CSF。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一些实施方案中，所述GM-CSF是小鼠GM-CSF或其功能性片段。小鼠GM-CSF的UniProt标识符为UniProtKB-P01587。
在一些实施方案中，GM-CSF包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，GM-CSF包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在一些实施方案中，GM-CSF的功能性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，GM-CSF的功能性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码GM-CSF的功能性片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码GM-CSF的功能性片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述GM-CSF是人GM-CSF或其功能性片段。人GM-CSF的UniProt标识符为UniProtKB-P04141。
在一些实施方案中，GM-CSF包含SEQ ID NO:21或34的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:21或34具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，GM-CSF包含SEQ ID NO:21或34的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或35的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:22或35具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或35的核苷酸序列。
在一些实施方案中，GM-CSF的功能性片段包含SEQ ID NO:25或36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或36具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，GM-CSF的功能性片段包含SEQ ID NO:25或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码GM-CSF的功能性片段的核苷酸序列包含SEQ IDNO:26或37的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:26或37具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码GM-CSF的功能性片段的核苷酸序列包含SEQ ID NO:26或37的核苷酸序列。
下面提供了可用于表达GM-CSF或其功能性片段的序列的例子。
小鼠GM-CSF(全长蛋白序列)
MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPGQK(SEQID NO:15)
小鼠GM-CSF(全长DNA序列)
ATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACATTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAA(SEQ ID NO:16)
小鼠GM-CSF(信号肽的蛋白质序列)
MWLQNLLFLGIVVYSLS(SEQ ID NO:17)
小鼠GM-CSF(信号肽的DNA序列)
ATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCA(SEQ ID NO:18)
小鼠GM-CSF(活性可溶性GM-CSF的蛋白质序列)
APTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPGQK(SEQ ID NO:19)
小鼠GM-CSF(活性可溶性GM-CSF的DNA序列)
GCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACATTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAA(SEQ ID NO:20)
人GM-CSF(全长蛋白质1)
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:21)
人GM-CSF(全长DNA 1)
ATGTGGCTGCAATCTCTGCTGCTGCTGGGCACAGTGGCCTGTTCTATTAGCGCCCCTGCCAGATCTCCATCTCCTAGCACACAGCCTTGGGAGCACGTGAACGCCATCCAAGAAGCCAGACGGCTGCTGAACCTGAGCAGAGATACAGCCGCCGAGATGAACGAGACAGTGGAAGTGATCAGCGAGATGTTCGACCTGCAAGAGCCTACCTGCCTGCAGACCAGACTGGAACTGTACAAGCAGGGCCTGAGAGGCAGCCTGACCAAGCTGAAAGGCCCTCTGACAATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACACCTGAGACAAGCTGTGCCACACAGACCATCACCTTCGAGAGCTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTCCTGCTGGTCATCCCCTTCGACTGCTGGGAGCCCGTGCAAGAA(SEQ ID NO:22)
人GM-CSF(信号肽的蛋白质序列)
MWLQSLLLLGTVACSIS(SEQ ID NO:23)
人GM-CSF(信号肽的DNA序列)
ATGTGGCTGCAATCTCTGCTGCTGCTGGGCACAGTGGCCTGTTCTATTAGC(SEQ ID NO:24)
人GM-CSF(活性可溶性GM-CSF 1的蛋白质序列)
APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:25)
人GM-CSF(活性可溶性GM-CSF 1的DNA序列)
GCCCCTGCCAGATCTCCATCTCCTAGCACACAGCCTTGGGAGCACGTGAACGCCATCCAAGAAGCCAGACGGCTGCTGAACCTGAGCAGAGATACAGCCGCCGAGATGAACGAGACAGTGGAAGTGATCAGCGAGATGTTCGACCTGCAAGAGCCTACCTGCCTGCAGACCAGACTGGAACTGTACAAGCAGGGCCTGAGAGGCAGCCTGACCAAGCTGAAAGGCCCTCTGACAATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACACCTGAGACAAGCTGTGCCACACAGACCATCACCTTCGAGAGCTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTCCTGCTGGTCATCCCCTTCGACTGCTGGGAGCCCGTGCAAGAA(SEQ ID NO:26)
人GM-CSF(全长蛋白2)
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:34)
人GM-CSF(全长蛋白2)
ATGTGGCTGCAATCTCTGCTGCTGCTGGGCACAGTGGCCTGTTCTATTAGCGCCCCTGCCAGATCTCCATCTCCTAGCACACAGCCTTGGGAGCACGTGAACGCCATCCAAGAAGCCAGACGGCTGCTGAACCTGAGCAGAGATACAGCCGCCGAGATGAACGAGACAGTGGAAGTGATCAGCGAGATGTTCGACCTGCAAGAGCCTACCTGCCTGCAGACCAGACTGGAACTGTACAAGCAGGGCCTGAGAGGCAGCCTGACCAAGCTGAAAGGCCCTCTGACAATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACACCTGAGACAAGCTGTGCCACACAGATCATCACCTTCGAGAGCTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTCCTGCTGGTCATCCCCTTCGACTGCTGGGAGCCCGTGCAAGAA(SEQ ID NO:35)
人GM-CSF(活性可溶性GM-CSF 2的蛋白质序列)
APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO:36)
人GM-CSF(活性可溶性GM-CSF 2的DNA序列)
GCCCCTGCCAGATCTCCATCTCCTAGCACACAGCCTTGGGAGCACGTGAACGCCATCCAAGAAGCCAGACGGCTGCTGAACCTGAGCAGAGATACAGCCGCCGAGATGAACGAGACAGTGGAAGTGATCAGCGAGATGTTCGACCTGCAAGAGCCTACCTGCCTGCAGACCAGACTGGAACTGTACAAGCAGGGCCTGAGAGGCAGCCTGACCAAGCTGAAAGGCCCTCTGACAATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACACCTGAGACAAGCTGTGCCACACAGATCATCACCTTCGAGAGCTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTCCTGCTGGTCATCCCCTTCGACTGCTGGGAGCCCGTGCAAGAA(SEQ ID NO:37)
在一个实施方案中，本文提供了表达TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种细胞内蛋白质。所述细胞内蛋白质可以是磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种细胞内蛋白质。所述细胞内蛋白质可以是磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种细胞内蛋白质。所述细胞内蛋白质可以是磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种细胞内蛋白质。所述细胞内蛋白质可以是磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一个实施方案中，本文提供了表达修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞，所述TCR包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能性片段，或与SEQ ID NO:5具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并进一步表达一种或多种细胞内蛋白质。所述细胞内蛋白质可以是磷酸二酯酶(例如，PDE4B2)。所述基因工程化淋巴细胞可以进一步表达一种或多种细胞表面受体。
在一些实施方案中，本文公开的基因工程化淋巴细胞除了表达本发明的经修饰的TCRs之外，还表达磷酸二酯酶。在一些实施方案中，所述磷酸二酯酶是磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)、磷酸二酯酶4A(PDE4A)、磷酸二酯酶7A(PDE7A)或磷酸二酯酶4C(PDE4C)。在一个实施方案中，所述磷酸二酯酶是磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)。
在一个实施方案中，PDE4B2是人PDE4B2或其功能性片段。人PDE4B2的GenInfo标识符为82799482，NCBI登录号为NP_001032416。
在一些实施方案中，PDE4B2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，PDE4B2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:28具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
在一个实施方案中，PDE4B2是小鼠PDE4B2或其功能性片段。小鼠PDE4B2的GenInfo标识符为295789129，NCBI登录号为NP_001171451。
在一些实施方案中，PDE4B2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，PDE4B2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:30具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
下面提供了可用于表达PDE4B2或其功能性片段的序列的例子。
人PDE4B2氨基酸序列
MKEHGGTFSSTGISGGSGDSAMDSLQPLQPNYMPVCLFAEESYQKLAMETLEELDWCLDQLETIQTYRSVSEMASNKFKRMLNRELTHLSEMSRSGNQVSEYISNTFLDKQNDVEIPSPTQKDREKKKKQQLMTQISGVKKLMHSSSLNNTSISRFGVNTENEDHLAKELEDLNKWGLNIFNVAGYSHNRPLTCIMYAIFQERDLLKTFRISSDTFITYMMTLEDHYHSDVAYHNSLHAADVAQSTHVLLSTPALDAVFTDLEILAAIFAAAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDESVLENHHLAVGFKLLQEEHCDIFMNLTKKQRQTLRKMVIDMVLATDMSKHMSLLADLKTMVETKKVTSSGVLLLDNYTDRIQVLRNMVHCADLSNPTKSLELYRQWTDRIMEEFFQQGDKERERGMEISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIVHPLWETWADLVQPDAQDILDTLEDNRNWYQSMIPQSPSPPLDEQNRDCQGLMEKFQFELTLDEEDSEGPEKEGEGHSYFSSTKTLCVIDPENRDSLGETDIDIATEDKSPVDT(SEQ ID NO:27)
人PDE4B2核苷酸序列
ATGAAGGAACACGGCGGCACCTTTAGCAGCACAGGCATCTCTGGTGGCAGCGGCGATAGCGCCATGGATTCTCTGCAACCCCTGCAGCCTAACTACATGCCCGTGTGCCTGTTCGCCGAGGAAAGCTACCAGAAACTGGCCATGGAAACCCTGGAAGAACTGGACTGGTGCCTGGACCAGCTGGAAACCATCCAGACCTACAGATCCGTGTCCGAGATGGCCAGCAACAAGTTCAAGCGGATGCTGAACAGAGAGCTGACCCACCTGAGCGAGATGAGCCGCTCTGGAAATCAGGTGTCCGAGTATATCAGCAACACCTTCCTGGACAAGCAGAACGACGTGGAAATCCCATCTCCTACACAGAAGGACCGCGAGAAGAAGAAAAAGCAGCAGCTGATGACCCAGATCAGCGGCGTGAAGAAACTGATGCACAGCAGCAGCCTGAACAACACCAGCATCAGCAGATTCGGCGTGAACACCGAGAACGAGGACCACCTGGCCAAAGAGCTGGAAGATCTGAACAAATGGGGCCTGAACATCTTCAACGTGGCCGGCTACAGCCACAACAGACCCCTGACCTGCATTATGTACGCCATCTTCCAAGAGCGGGACCTGCTGAAAACCTTCCGGATCAGCAGCGACACCTTCATCACCTACATGATGACCCTTGAGGACCACTACCACAGCGACGTGGCCTACCACAATAGCCTGCATGCCGCTGATGTGGCCCAGAGCACACACGTGCTGCTGTCTACACCAGCTCTGGATGCCGTGTTCACCGACCTGGAAATTCTGGCCGCCATCTTTGCCGCCGCTATCCACGATGTTGATCACCCCGGCGTGTCCAACCAGTTCCTGATCAATACCAACAGCGAGCTGGCCCTGATGTACAACGACGAGAGCGTGCTGGAAAACCACCATCTGGCCGTGGGCTTCAAGCTGCTGCAAGAGGAACACTGCGACATCTTCATGAACCTGACCAAGAAGCAGCGGCAGACCCTGCGGAAGATGGTCATCGATATGGTGCTGGCCACCGACATGAGCAAGCACATGTCTCTGCTGGCCGACCTGAAAACCATGGTCGAGACAAAGAAAGTGACCAGCAGCGGCGTTCTGCTGCTGGACAACTACACCGACAGAATCCAGGTGCTGAGAAACATGGTGCACTGCGCCGATCTGAGCAACCCCACCAAGAGCCTGGAACTGTACAGACAGTGGACCGACCGGATCATGGAAGAGTTCTTTCAGCAAGGCGACAAAGAACGCGAGCGCGGCATGGAAATCTCCCCAATGTGCGATAAGCACACCGCCAGCGTGGAAAAGTCCCAAGTGGGCTTTATCGACTACATCGTGCACCCTCTGTGGGAGACATGGGCCGATCTGGTTCAGCCTGACGCTCAGGACATCCTGGACACACTGGAAGATAACCGGAACTGGTATCAGAGCATGATCCCTCAGAGCCCCTCTCCACCTCTGGATGAGCAGAACAGAGATTGCCAGGGCCTGATGGAAAAGTTCCAGTTCGAGCTGACACTGGACGAAGAGGACTCTGAGGGCCCCGAGAAAGAAGGCGAGGGCCACAGCTACTTCAGCAGCACAAAGACCCTGTGCGTGATCGACCCCGAGAACAGGGATAGCCTGGGCGAGACAGACATCGACATTGCCACCGAGGACAAGAGCCCCGTGGATACA(SEQ ID NO:28)
小鼠PDE4B2氨基酸序列
MKEQGGTVSGAASSRGGGDSAMASLQPLQPNYLSVCLFPEESYQKLAMETLEELDWCLDQLETIQTYRSVSEMASNKFKRMLNRELTHLSEMSRSGNQVSEYISNTFLDKQNDVEIPSPTQKDREKKKKQQLMTQISGVKKLMHSSSLNNTSISRFGVNTENEDHLAKELEDLNKWGLNIFNVAGYSHNRPLTCIMYAIFQERDLLKTFKISSDTFVTYMMTLEDHYHSDVAYHNSLHAADVAQSTHVLLSTPALDAVFTDLEILAAIFAAAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDESVLENHHLAVGFKLLQEEHCDIFQNLTKKQRQTLRKMVIDMVLATDMSKHMSLLADLKTMVETKKVTSSGVLLLDNYTDRIQVLRNMVHCADLSNPTKSLELYRQWTDRIMEEFFQQGDKERERGMEISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIVHPLWETWADLVQPDAQDILDTLEDNRNWYQSMIPQSPSPPLDERSRDCQGLMEKFQFELTLEEEDSEGPEKEGEGHSYFSSTKTLCVIDPENRDSLEETDIDIATEDKSPIDT(SEQ ID NO:29)
小鼠PDE4B2核苷酸序列
ATGAAGGAACAGGGCGGCACCGTGTCTGGCGCCGCTTCTAGTAGAGGCGGAGGCGATAGCGCCATGGCCAGTCTGCAGCCACTGCAGCCCAACTACCTGAGCGTGTGCCTGTTCCCCGAGGAAAGCTACCAGAAACTGGCTATGGAAACCCTGGAAGAACTGGACTGGTGCCTGGACCAGCTGGAAACCATCCAGACCTACAGATCCGTGTCCGAGATGGCCAGCAACAAGTTCAAGAGGATGCTGAACAGAGAGCTGACCCACCTGAGCGAGATGAGCAGATCCGGCAACCAGGTGTCCGAGTATATCAGCAACACCTTCCTGGACAAGCAGAACGACGTGGAAATCCCCAGCCCCACCCAGAAGGACCGCGAGAAGAAGAAAAAGCAGCAGCTGATGACCCAGATCAGCGGCGTGAAGAAACTGATGCACAGCAGCAGCCTGAACAACACCAGCATCAGCAGATTCGGCGTGAACACCGAGAACGAGGACCACCTGGCCAAAGAGCTGGAAGATCTGAACAAATGGGGCCTGAACATCTTCAACGTGGCCGGCTACAGCCACAACAGACCCCTGACCTGCATTATGTACGCCATCTTCCAGGAACGGGACCTGCTGAAAACCTTCAAGATCAGCAGCGACACCTTCGTGACCTACATGATGACACTGGAAGATCACTACCACAGCGACGTGGCCTACCACAACTCTCTGCACGCCGCCGATGTGGCCCAGAGCACTCATGTGCTGCTGAGCACCCCTGCCCTGGACGCCGTGTTCACCGATCTGGAAATCCTGGCCGCTATCTTCGCCGCTGCCATCCACGATGTGGACCACCCTGGCGTGTCCAACCAGTTCCTGATCAACACAAACAGCGAGCTGGCCCTGATGTACAACGACGAGAGCGTGCTGGAAAACCACCATCTGGCCGTGGGCTTCAAGCTGCTGCAGGAAGAACACTGCGACATCTTTCAGAACCTGACCAAGAAGCAGAGGCAGACCCTGAGAAAGATGGTCATCGACATGGTGCTGGCCACCGACATGAGCAAGCACATGTCCCTGCTGGCCGACCTGAAAACCATGGTGGAAACAAAGAAAGTGACCAGCTCCGGCGTGCTGCTGCTGGACAACTACACCGACAGAATCCAGGTGCTGAGGAACATGGTGCACTGCGCCGACCTGTCCAACCCCACCAAGAGCCTGGAACTGTACAGACAGTGGACCGACAGGATCATGGAAGAGTTCTTTCAGCAAGGCGACAAAGAACGCGAGAGGGGCATGGAAATCAGCCCCATGTGCGACAAGCACACCGCCAGCGTGGAAAAGTCCCAAGTGGGCTTTATCGACTACATCGTGCACCCCCTGTGGGAGACATGGGCCGATCTGGTGCAGCCTGACGCCCAGGACATCCTGGACACTCTGGAAGATAACCGGAACTGGTATCAGAGCATGATCCCCCAGAGCCCCAGCCCTCCACTGGACGAGAGATCCAGAGACTGCCAGGGCCTGATGGAAAAGTTCCAGTTCGAGCTGACTCTGGAAGAAGAGGACAGCGAGGGCCCCGAGAAAGAAGGCGAGGGCCACTCTTACTTCAGCAGCACCAAGACACTGTGCGTGATCGACCCCGAGAACAGGGACAGCCTCGAAGAGACTGACATCGACATTGCCACCGAGGACAAGAGCCCCATCGATACA(SEQ ID NO:30)
双功能分子
克服缺乏有效抗肿瘤T细胞免疫力的一种方法是通过使用从如上所述的T细胞受体或抗体衍生受体产生的亲和力增强的受体，对T细胞进行离体遗传修饰以靶向肿瘤。一种不需要体外操作T细胞的补充方法包括使用融合蛋白，该融合蛋白结合了肿瘤识别和T细胞接合结构域，以将T细胞重定向而靶向肿瘤。这种融合蛋白的特异性和抗肿瘤活性描述于例如Cancer Immunol Immunother(2013)62:773-785,Nat Med.2012年6月；18(6):980-7),以及美国专利7,763,718和10,130,721，出于所有目的，它们都通过引用整体结合于此。
在一个方面，本文提供了双功能分子，其包含本文公开的经修饰的TCR或其功能性片段，以及特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的多肽。T细胞上的细胞表面蛋白的例子包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD8、CD44、CD45RA、CD45RB、CD45RO、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD16、CD28和IL-2R。
在某些实施方案中，所述多肽是免疫效应多肽。
如本文所用，术语“免疫效应多肽”通常指通过直接或间接激活免疫系统的体液或细胞分支，如通过激活T细胞，诱导或刺激免疫反应的任何分子。免疫效应多肽的例子包括但不限于：IL-1、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、TNFα、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD44抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RB抗体、抗CD45RO抗体、抗CD49a抗体、抗CD49b抗体、抗CD49c抗体、抗CD49d抗体、抗CD49e抗体、抗CD49f抗体、抗CD16抗体、抗CD28抗体、抗IL-2R抗体、病毒蛋白和肽以及细菌蛋白或肽。
在一些实施方案中，所述多肽包含抗体或抗体片段。抗体片段可包括但不限于单链抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段如(Fab)2’-片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体、微抗体、双抗体、三抗体和十抗体。在一个具体实施方案中，所述多肽包含scFv。在某些实施方案中，所述多肽是免疫效应多肽。
在一些实施方案中，所述多肽特异性结合CD3。在一些实施方案中，所述多肽包含抗CD3抗体。抗CD3抗体的例子包括但不限于OKT3、UCHT-1、BMA031和12F6。在一些实施方案中，所述多肽包含来源于抗CD3抗体的scFv。在一些实施方案中，所述多肽包含来源于OKT3、UCHT-1、BMA031或12F6的scFv。在某些实施方案中，特异性结合CD3的多肽是免疫效应多肽。
在某些实施方案中，TCR的N末端连接到特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的多肽的C末端。在某些实施方案中，TCR的C末端连接到特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的多肽的N末端。在某些实施方案中，所述TCR是异二聚αβTCR多肽对，或单链αβTCR(scTCR)多肽，其中所述异二聚TCR多肽对的α或β链的N端或scTCR多肽的N端与特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的多肽的C端氨基酸相连。在某些实施方案中，所述TCR是异二聚αβTCR多肽对，或单链αβTCR多肽，其中所述异二聚TCR多肽对的α或β链的C端或scTCR多肽的C端与特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的多肽的N端氨基酸连接。
TCR和特异性结合T细胞上细胞表面蛋白的多肽的连接可以是直接的，也可以是通过接头序列间接的。接头序列通常是柔性的，因为它们由没有可能会限制柔性的大侧链的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。在任何给定的TCR双功能分子的情况下，接头序列的可用或最佳长度很容易确定。在一些情况下，接头长度将少于约12个，例如少于约10个，或5-10个氨基酸。
在本文描述的双功能分子的一些实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有与选自SEQ ID NOs:2-5中任一所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的β链。在任何上述实施方案中，相对于未取代的WT TCRβ链(例如，如SEQ ID NO:1所示)，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含位于β链的CDR2内的单个氨基酸取代.
在本文描述的双功能分子的某些实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有选自SEQ ID NO:2-5中任一所示的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的β链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的β链。
在本文描述的双功能分子的某些实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段进一步包含含有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的α链。在一个实施方案中，所述经修饰的TCR或其功能性片段进一步包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α链。
在各种实施方案中，本文所述的双功能分子可以与本文所述的宿主细胞或药物组合物结合使用。
治疗方法
一方面，本文提供了一种治疗受试者中癌症的方法。该方法包括给患有这种癌症的受试者施用有效量的呈现本发明的修饰的TCR的淋巴细胞或包含这些细胞的药物组合物。可通过本文所述方法治疗的癌症的非限制性实例包括例如神经母细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌。
在一个方面，本文提供了一种刺激或增强哺乳动物中免疫反应的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用有效量的本发明基因工程化淋巴细胞或包含该细胞的药物组合物。
癌症的其他例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(例如骨肉瘤或横纹肌肉瘤)和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、腺鳞状细胞癌、肺癌(例如包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(例如包括胃肠癌、胰腺癌)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌、肾癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、原发性或转移性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、脑(如高级别胶质瘤、弥漫性脑桥胶质瘤、室管膜瘤、神经母细胞瘤或胶质母细胞瘤)以及头颈癌和相关转移瘤。肿瘤的其他例子可见于Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第19版,§on Hematology andOncology,Merck Sharp&Dohme Corp.出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；The MerckManual of Diagnosis and Therapy,第20版,§on Hematology and Oncology,MerckSharp&Dohme Corp.出版,2018(ISBN 978-0-911-91042-1)(Merck Manuals互联网址上的2018数字线上版)；以及SEER Program Coding and Staging Manual 2016，出于所有目的，每一份都通过引用整体并入本文。
在各种实施方案中，可通过本文所述方法治疗的癌症在其细胞表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
在上述任何治疗方法的一些实施方案中，组合物以治疗有效量给药。根据受试者的身体参数、给药频率、给药方式、清除率等，在本发明的方法中给药的组合物的剂量将有很大变化。初始剂量可能较大，随后可能是较小的维持剂量。该剂量可以像每周或每两周给药一次较不频繁进行，或者分成更小的剂量并每天、半周等给药，以保持有效剂量水平。预期多种剂量将有效实现修饰的宿主细胞的体内持久性。还预期多种剂量将有效改善修饰的宿主细胞的体内效应子功能。
在一些实施方案中，可以以102至1010个细胞/千克体重、105至109个细胞/千克体重、105至108个细胞/千克体重、105至107个细胞/千克体重、107至109个细胞/千克体重或107至108个细胞/千克体重的剂量施用包含通过本文所述方法制备的经修饰的宿主细胞的组合物，包括这些范围内的所有整数值。经修饰的宿主细胞的数量将取决于组合物预期的治疗用途。
经修饰的宿主细胞可以以上面列出的剂量多次给药。对于接受治疗的患者，经修饰的宿主细胞可以是同种异体的、同基因的、异基因的或自体的。
本公开中描述的组合物和方法可以与其他类型的肿瘤治疗结合使用，例如化疗、手术、放射、基因治疗等。
还预期当用于治疗各种疾病/障碍时，本公开的组合物和方法可以与适用于相同或相似疾病/障碍的其他治疗方法/药剂一起使用。这种其他治疗方法/药剂可以共同给药(同时或依次)以产生加和或协同作用。由于这种加和作用或协同作用，每种药物的合适的治疗有效剂量可以降低。
在任何上述治疗方法的一些实施方案中，该方法还包括给受试者施用选自免疫抑制剂、生物制剂、益生菌、益生元和细胞因子(例如GM-CSF、IFN或IL-2)的一种或多种额外化合物。
在一些实施方案中，除了由免疫细胞产生的GM-CSF之外，本文所述的方法进一步包括提供外源GM-CSF，以增强表达本公开的嵌合细胞因子受体的免疫细胞的功能。外源性GM-CSF可以通过、例如但不限于下述方式来提供：i)注射FDA批准的GM-CSF药物Sargramostin(LeukineTM)，或ii)使用非病毒或病毒载体来表达GM-CSF(例如，FDA批准的表达GM-CSF的溶瘤病毒talimogene laherparepveec[TVEC，ImlygicTM])。这些药物可以在向患者施用(例如输注)表达本发明嵌合细胞因子受体的免疫细胞之前、之中或之后给药。
作为非限制性实例，本发明可以与阻断炎症的其他疗法(例如，通过阻断IL1、INFα/β、IL6、肿瘤坏死因子、IL23等)结合。
本发明的方法和组合物可以与其他免疫调节治疗相结合，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)，检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂)或活化剂(包括但不限于增强4-1BB、OX40等的药剂)。本发明的方法还可以与具有调节NKT功能或稳定性的能力的其他治疗方法结合，包括但不限于CD1d、CD1d-融合蛋白、CD1d二聚体或者未负载或负载抗原的CD1d的较大聚合物、CD1d-嵌合抗原受体(CD1d-CAR)或人类中存在的五种已知CD1异构体中的任何其他异构体(CD1a、CD1b、CD1c、CD1e)。本发明的方法也可以与其他治疗方法如米多司他林、依那西尼或其组合联合使用。
本发明的治疗方法可以与额外的免疫疗法和疗法相结合。例如，当用于治疗肿瘤时，根据肿瘤的类型、患者状况、其他健康问题和各种因素，本发明的组合物可以与常规疗法结合使用，例如手术、放疗、化疗或其组合。在某些方面，可用于与本发明抑制剂组合治疗肿瘤的其它治疗剂包括抗血管生成剂。许多抗血管生成药物已被鉴定并为本领域所知，包括例如TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑素(纤溶酶原的38-Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增生相关蛋白(placentalproliferin-related protein)，以及Carmeliet和Jain(2000)列出的那些。在一个实施方案中，本发明的修饰宿主细胞可以与VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂结合使用，例如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGF受体的适体、中和性的抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂及其任何组合(例如抗hVEGF抗体A4.6.1、贝伐珠单抗或拉尼珠单抗)。
可用于本公开的联合治疗的化疗化合物的非限制性实例包括例如氨基鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、bcg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、地西他滨、二烯雌酚、己烯雌酚(diethylstilbestrol,)、多西他赛、阿霉素、表柔比星、雌二醇、estramnustine、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、染料木素、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、铁立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、甲氧丙胺酮、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁他胺、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、泊菲姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫代鸟嘌呤、噻替派、二氯二茂钛、拓扑替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
这些化学治疗化合物可根据其作用机制分类为例如以下组：抗代谢物/抗肿瘤剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)，微管破坏剂，如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花素、诺考达唑、埃坡霉素和navelbine、表鬼臼毒素(依托泊苷，替尼泊苷)、DNA药剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、细胞黄素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、hexamethyhnelamineoxaliplatin、异磷酰胺、美法仑、美氯胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其全身代谢L-天冬酰胺并剥夺没有能力合成自身天冬酰胺的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如氮芥(氯乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和methylmelamines(六甲蜜胺和噻替哌)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲嘧啶)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨基鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤溶剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如TNP-470、染料木黄酮、贝伐珠单抗)和生长因子抑制剂(例如成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、艾尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、氢化尼可松、泼尼松龙、氢化尼可松)和生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；和染色质破坏物。
在本文描述的方法的各种实施方案中，受试者是人。受试者可以是任何年龄或性别的青少年或成年人。
药物组合物、剂型和给药
一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含具有本文所述的经修饰的TCR的淋巴细胞和药学上可接受的载体。
载体可以是含有例如水、盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以通过本领域已知的各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
可以使用一种或多种生理上可接受的载体和/或赋形剂以任何常规方式配制基于具有本文所述的经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞群体的药物组合物。淋巴细胞可以配制用于通过例如注射、肠胃外、阴道、直肠给药或直接给药于肿瘤来给药。
药物组合物可以配制成通过注射进行肠胃外给药，例如通过团注或连续输注。注射制剂可以单位剂量形式存在，例如处于安瓿或多剂量容器中，任选加入防腐剂。药物组合物可以进一步配制成在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含其它试剂，包括悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
适合注射使用的药物形式可以包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或含水丙二醇；和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流体。它必须在制造条件和某些储存参数(如冷藏和冷冻)下保持稳定，并且必须防腐以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
配制后，溶液可以以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量给药。给药的剂量范围和频率可以根据具有本文所述的经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞群体的性质、特定患者的医学状况和参数以及所用的给药途径而变化。
在一些实施方案中，具有本文所述的经修饰的TCR的基因工程化淋巴细胞群可以以约107至约1012的剂量给予受试者。更准确的剂量还取决于给药对象。例如，如果受试者是青少年，可能需要较低的剂量，如果受试者是成人受试者，可能需要较高的剂量。在某些实施方案中，更准确的剂量可以取决于受试者的体重。
实施例
本发明也通过以下实施例进行描述和说明。然而，在说明书中的任何地方使用这些和其他例子仅仅是说明性的，决不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于这里描述的任何特定优选实施方式。实际上，本发明的许多修改和变化对于阅读本说明书的本领域技术人员来说是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神或范围的情况下可以进行这些变化。因此，本发明仅由所附权利要求的条款以及这些权利要求的等同物的全部范围来限定。
实施例1可溶性的合理设计的BC1 TCR变体的结合亲和力
材料和方法
TCR氨基酸取代是通过基于结构的计算机辅助蛋白质工程设计的。从野生型TCR-p-MHC复合物(PDB ID 2bnr)的实验结构出发，使用分子力学-广义玻恩表面积(MolecularMechanics-Generalized Born Surface Area，MM-GBSA)估算了每个TCR和pMHC残基对结合自由能的贡献。这些结果被用于确定可能增加TCR对pMHC亲和力的序列修饰。后者实际上是在TCR结构中引入的，由此产生的结合自由能变化再次用MM-GBSA方法估算。为了实验验证，保留了计算机预测的序列修饰，以有利地增加结合自由能。可溶性TCR在哺乳动物细胞培养系统和细菌包涵体中都有产生。使用针对可溶性pMHC的直接滴定ELISA来与野生型TCR比较结合强度。感兴趣的TCR由α和β链的细菌包涵体的重折叠产生，用表面等离子共振来表征，以测量亲和力和动力学。
野生型TCR被命名为BC1，与明确鉴定的TCR 1G4仅相差4个氨基酸(α链2个，β链2个)(Chen,J.L.等人,J Exp Med 2005.201,1243-1255，出于所有目的将其全部内容引入本文作为参考)。BC1 TCR具有临床意义，因为它来源于长期存活的癌症患者的免疫显性克隆。在HEK-293细胞中产生可溶性TCR及纯化
将TCR BC1的α链和β链分别克隆到表达载体pHYK8中处于CMV启动子的控制下。按照Chang等人(Chang,H.C.等人,Proc Natl Acad Sci U S A,1994.91,11408-11412)的策略，通过酸性-碱性拉链促进异二聚体链配对。TCRβ链在Cys242位后被截短，并替换上柔性接头区、凝血酶位点、酸性拉链和HIS标签，α链在Cys209后被截短，并替换上接头区、凝血酶位点和碱性拉链取代。通过将质粒与线性25kDa聚乙烯亚胺共转染到HEK-293细胞中产生可溶性TCR。转染的细胞在添加了4mM丙戊酸(以使酸化最小化)的Pro293 CDM培养基(Lonza)中悬浮培养长达7天。按照制造商的建议，通过离心收集培养上清液，并使用镍-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化TCR。
从细菌包涵体产生可溶性TCR和pMHC
BL21(DE3)pLys细菌细胞用于产生TCRα链和β链(克隆到pGMT7中)作为包涵体，如前所述通过透析将其溶解和重折叠(Boulter，J.M.等人，Protein Eng 2003。16,707-711)。然后浓缩和过滤TCR，之后用Ni2+固定的金属螯合琼脂糖凝胶(GE Healthcare)和咪唑洗脱进行快速蛋白质液相色谱HIS-tag纯化。在进行SPR分析之前，将样品在10kDa MWCO旋转过滤器(Millipore)上浓缩，并使用S200色谱柱将其凝胶过滤到HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，0.15M氯化钠，3mM乙二胺四乙酸，0.005％v/v P20表面活性剂)中，以去除聚集体。如前所述制备生物素化A2/NY-ESO157-165(Altman,J.D.等人,Science,1996.274,94-96)。
合理开发的TCR的滴定ELISA
生物素化的pMHC(A2/NY-ESO157-165复合物)被捕获在包被有SA的平板(96孔，高结合平板，Corning Life Sciences)上，用2％牛血清白蛋白在Tris缓冲盐水(TBS，pH 7.4)中封闭。在每一步之间用0.1％吐温的TBS彻底清洗平板。在室温下用溶于TBS、1％牛血清白蛋白、0.1％吐温的TBS孵育1.5h后，SA上的游离位点被生物素封闭，然后用TBS、1％BSA、0.1％tween中的可溶性TCR在室温孵育1.5小时。用在TBS、1％BSA、0.1％tween中稀释1/1500的抗β链TCR mAb(TCR 1151，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)检测结合的TCR，，随后用在TBS、0.1％tween中稀释1/1500的HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG-Ab(ThermoScientific)检测结合的TCR，用在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的含有H2OO2的2,2’-叠氮-双(3-乙基苯并噻唑烷-6-磺酸)检测HRP。30分钟后在OD405-490处进行平板读数。每个TCR的ELISA至少重复三次。
在表1中，WT BC1 TCR结合被定义为“+++”，大于WT BC1 TCR的结合被显示为“++++”，小于WT的结合被显示为“++”，非常弱的结合被显示为“+”，没有结合被显示为“-”。
表1相对于野生型TCR BC1的结合，可溶性的合理设计的TCR与平板捕获的pMHC的直接ELISA结合
Figure BDA0003322953500000751
Figure BDA0003322953500000761
合理开发的TCR的表面等离子体共振(SPR)
在25℃下在BIAcore 3000和SA涂层的CM5传感器芯片(BIAcore，GE Healthcare)上进行SPR。流动细胞以10μl/分钟的速率装载200个响应单位的生物素化pMHC，以均匀分布。链霉亲和素(SA)上的游离位点被生物素封闭，参考细胞用作对照，防止样品溶液注射后体积折射率的变化。为了进行动力学分析，在装载的芯片上以50-100μl/分钟的速度注射6-8个TCR系列稀释液。数据代表至少两个独立实验中的一个实验，一式两份或三份进行，给出最佳的Chi2值。假设1:1Langmuir结合，计算每个TCR的kon和koff值，并使用BIAevaluation4.1和全局拟合算法分析数据。KD由koff/kon计算。
在表2中，“＊”表示A97L和DMb是先前公开的赋予T细胞以最佳功能活性的TCR(Irving,M.等人,JBC 2012.287,23068-23078，出于所有目的将其全部内容引入本文作为参考)。“＊＊”表示1G4是从具有结合NY-ESO-1157-165特性的患者中分离的野生型TCR(Dunn,S.M.等人,Protein Sci 2006.15,710-721；Robbins,P.F.等人,J Clin Oncol 2011.29,917-924；Rapoport,A.P.等人,Nat Med 2015.21,914-921；Chen,J.L.,JExp Med2005.201,1243-1255，出于所有目的，这些专利中的每一个都通过引用整体结合于此)。“＊＊＊”表明1G4LY是用于临床试验的1G4的高亲和力变体(Dunn,S.M.等人,Protein Sci2006.15,710-721；Robbins,P.F.等人,J Clin Oncol 2011.29,917-924；Rapoport,A.P.等人,Nat Med 2015.21,914-921；Chen,J.L.,J Exp Med 2005.201,1243-1255，出于所有目的，这些文献中的每一个都通过引用整体结合于此)。BC1TCR变体中的突变以粗体突出显示。
表2选择的合理设计的TCR的Biocore分析
Figure BDA0003322953500000771
Figure BDA0003322953500000781
结果和讨论
如上所述，通过理性设计(MM-GBSA计算)(Zoete,V.等人,JMR2010.23,142-152；Zoete,V.,和Michielin,O.Proteins 2007.67,1026-1047；Zoete,V.等人,Proteins2005.61,79-93)，开发了一组HLA-A2-NY-ESO157-165TCR被开发出来，与原始人类T细胞相比，它们的亲和力和功能都有所增加(Zoete,V.等人,JMR 2010.23,142-152；Schmid,D.A.等人,Journal of immunology 2010.184,4936-4946；Irving,M.等人,JBC 2012.287,23068-23078)。
如表1和表2所示，TCR组显示对HLA-A2-NY-ESO157-165的亲和力增加。表1显示了通过滴定ELISA测定的TCR与pMHC的直接结合，表2显示了针对这些TCR的子集测定的亲和力和动力学。如表1中粗体突出显示的，有几个单个氨基酸置换的TCR与pMHC结合的亲和力比用“++++”描述的WT TCR结合的亲和力高。如表2所示，与WT BC1TCR相比，WT BC1 TCR残基53处的至少两个不同的单氨基酸取代(I53E和I53F)导致更高的结合亲和力(KD WT>I53E>I53F)，其中I53F对HLA-A2-NY-ESO-1157-165具有最高的亲和力。
流式细胞术分析工程化CD4+和CD8+细胞，其具有用抗TCR BV13.1 Ab和荧光四聚体染色的几种不同的BC1 TCR变体(图2A-2B和图3A-3B)显示，所有测试的变体(I53E、I53F、I53W、D55E和DMb)表达与野生型(BC1 TCR转导细胞)和阳性对照A97L和1G4LY相当。
实施例2表达NY-ESO-1 TCR变异体的T细胞的细胞因子产生
材料和方法
细胞系培养
293T和Jurkat细胞系是从ATCC购买的。所有细胞系都在RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加10％热灭活的牛血清白蛋白、2mmol/l L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100U/ml链霉素。293T细胞系用于慢病毒包装和制备。
TCRα和TCRβ链的克隆及慢病毒产生
TCRa23和TCRb13.1开放阅读框都被整合到慢病毒载体pRRL中，其中3’长末端重复的大部分U3区被删除，导致3’长末端重复的自失活，或SIN。TCRa和TCRb链由小核糖核酸病毒衍生的2A序列隔开。
慢病毒是通过用TurboFect瞬时转染293T细胞产生的。简而言之，用编码NY-ESOTCRa和TCRb链的慢病毒载体pRRL和慢病毒辅助质粒(R8.74和pMD2G)共转染293T细胞。转染后48h收获慢病毒上清液，过滤，并通过超速离心浓缩。将沉淀重新悬浮在适当体积的RPMI10％PBS中，储存在-80℃或直接使用。
慢病毒转导前，在50IU/ml白细胞介素-2的存在下，用1×106αCD3/αCD28珠刺激总共0.5×106个CD4+或CD8+T细胞18-20小时。第5天，取出珠子，在10ng/ml IL-7和10ng/mlIL-15的存在下培养T细胞。通过流式细胞分析在转导后的第6天和更后的时间点测定TCR的表达。使用的抗体是，PE标记的人TCRVb13.1，和APC标记的抗人CD4和抗人CD8。呈现NY-ESO157-165的PE标记的HLA-A2四聚体用于检测引入的TCR的正确折叠。使用FlowJo软件分析染色细胞。
细胞系
HLA-A2.1+/NY-ESO+黑色素瘤细胞系Mw275和A375，以及NY-ESO阴性细胞系NA8在补充10％FBS和抗生素(100IE/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的IMDM中培养。将Saos-2(骨肉瘤)和U266(B细胞)(二者均为HLA-A2.1/NY-ESO+)以及OVCAr3(卵巢)和SKO#(卵巢)(二者均为NY-ESO阴性)在补充10％FBS和抗生素的RPMI中培养。
在添加了10％FBS和抗生素的DMEM中培养NY-ESO阴性细胞系U87MG(脑)、A431(皮肤)、A673(肉瘤)、RD-ES(肉瘤)、HT-29(肺)和SK-N-AS(神经母细胞瘤)。
原代T细胞的纯化和转导
原代人T细胞是从来源于健康供体的血沉棕黄层的外周血单核细胞中分离出来的。所有血样都是在捐献者知情同意的情况下采集的，然后经过沃州伦理委员会的批准进行基因改造。使用标准的离心方案，通过Lymphoprep(Axonlab)分离溶液获得总的PBMC，并使用结合磁珠分离的阴性选择试剂盒分离CD4+和CD8+T细胞(easySEP，Stem Celltechnology)。T细胞在完全培养基(RPMI 1640，含Glutamax，补充10％热灭活胎牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml硫酸链霉素)中培养(Invitrogen，Lifetechnologies)，用抗CD3和抗CD28单克隆抗体包被的珠子(Lifetechnologies)以T细胞:珠子为1:2的比例刺激。活化后12至24小时，用慢病毒颗粒转导T细胞，感染复数(MOI)约为5-10。人重组白细胞介素-2(h-IL2；葛兰素)每隔一天加入，以获得50IU/ml的最终浓度，直到刺激后5天(第+5天)。此时，除去磁珠，加入10毫克/毫升的h-IL15(Miltenyi Biotec GmbH)，不再加入IL2。保持0.5-1×106个细胞/毫升的细胞密度进行扩增。导入的TCR在转导后5天通过荧光多聚体染色进行测量。在所有功能性分析之前，针对相同的转基因表达对静息的工程化T细胞进行调整。
细胞因子的产生
细胞因子释放分析是通过在96孔圆底平板中，在最终体积为200μl的RPMI培养基中，每孔共培养5×104个T细胞和5×104个靶细胞一式两份来进行的。24小时后，收集共培养上清液，并根据制造商的方案(BioLegend)使用酶联免疫试剂盒检测干扰素-γ和白细胞介素-2的存在。所报告的值代表来自四个健康供体(HD)的转导的T细胞的平均值。
结果和讨论
为了评估TCR结合参数对细胞因子产生的影响，将未转导的和用不同TCR变体和WTBC1 TCR转导的CD4+和CD8+细胞与装载了10倍系列稀释的NY-ESO157-165肽的T2细胞一起孵育。对于响应于TCR介导的激活而产生的IL-2，表达TCR I53F、I53W、D55E、DMb和1G4LY的工程化CD4+细胞的分泌达到最大。与WT TCR相比，表达TCR I53F、I53W、D55E和DMb的工程化CD4+细胞在IL2生产方面似乎功能更好，它们的功能类似于1G4LY TCR(图4A)。工程化的TCR变体I53E在该试验中显示出与WT TCR相似的功能。在相同条件下，未转导的CD4+细胞不产生白细胞介素-2(图4A)。
与非转导(NT)细胞(阴性对照)、野生型BC1 TCR转导细胞和转导表达TCR I53E的细胞以及转导表达A97L的细胞相比，在天然表达HLA/A2-NY-ESO-1(Me275)或基因工程改造以表达HLA/A2-NY-Eso-1(OVCAR5 NLM和A2008-A2-NLM)的肿瘤T细胞系中，在工程化以表达TCR I53E的健康供体(HD)T细胞最有效地产生IL-2。与不表达HLA/A2-NY-ESO-1(OVCAR5和A2008-A2和NA8)的肿瘤细胞系没有交叉反应性(图5)。
与非转导(NT)细胞(阴性对照)相比，在Me275、Saos-2和U266细胞中表达TCR I53F和I53W的CD4+T细胞产生白细胞介素-2的效率最高。与其中工程化而表达TCR DMb和1G4LY的CD4+T细胞不明显产生白细胞介素-2的其他NY-ESO阳性细胞系相比，在Saos-2和U266细胞中工程化而表达TCR DMb和1G4LY的CD4+T细胞中有白细胞介素-2产生。在任何NY-ESO阳性细胞系中，经工程改造表达TCR I53E、D55E的CD4+细胞、野生型BC1 TCR转导细胞和经转导表达TCR A97L的细胞都不产生IL-2(图6)。在用WT BC1 TCR转导的CD4+T细胞中，A2/NY-ESO-NY-1157-165识别是CD8受体依赖性的。在这种情况下，WT BC1 TCR转导的CD4+T细胞似乎对与MHC I类结合的NY-ESO表位没有反应性。然而，当CD4+T细胞被与MHC I类结合的NY-ESO表位具有更高结合亲和力(与WT BC1 TCR相比)的TCR变体(即，I53F和I53W TCR)转导时，观察到这些工程化T细胞产生的IL-2更高，表明I53F TCR转导的细胞较少依赖CD8共受体。
在图9中，与被工程化表达野生型BC1 TCR和I53E TCR的细胞相比，被工程化表达TCR I53F的CD4+T细胞最有效地产生IL-2。当与野生型BC1 TCR工程化细胞和工程化表达I53E的细胞相比时，用TCR I53F工程化的CD4+T细胞具有较少的CD8共受体依赖性的趋势(图9)，并且当在图5中比较时，与野生型BC1 TCR工程化细胞、工程化表达I53E的细胞和表达A97L TCR的细胞相比时，可以观察到相同的趋势。
对于响应于TCR介导的激活而产生的IFNγ，在本试验中，表达TCR A97L、I53E、I53F、I53W、D55E、DMb和1G4LY的工程化CD8+细胞显示出与WT BC1 TCR相似的功能。在相同条件下，未转导的CD8+细胞不产生干扰素γ(图4B)。
与自然表达HLA/A2-NY-ESO-1(Me275)或基因工程化表达HLA/A2-NY-ESO-1(OVCAR5 NLM和A2008-A2-NLM)的肿瘤T细胞系中的非转导(NT)细胞(阴性对照)相比，工程化表达TCR A97L、I53E和I53F的健康供体(HD)T细胞高效产生IFN-γ。与不表达HLA/A2-NY-ESO-1的肿瘤细胞系(OVCAR5和A2008-A2和NA8)没有交叉反应性。亲和力增强的BC1 TCR变体组的IFN-γ产生与工程化表达野生型BC1 TCR的T细胞相似(图7)。在图10中，当与表达野生型BC1 TCR和I53E TCR的细胞相比时，工程化表达I53F TCR的CD8+细胞最有效地产生IFN-γ。
在Me275细胞中工程化表达TCR I53F、D55E和DMb、在A375细胞中工程化表达I53F和DMb、在Saos-2细胞中工程化表达I53F、I53W、D55E和DMb以及在U266细胞中工程化表达I53F、I53W、D55E和DMb的CD8+T细胞最有效地产生IFN-γ。在被工程化以在所有NY-ESO阳性细胞系中，表达A97L(野生型BC1 TCR的阳性对照突变体)和1G4LY(野生型1G4 TCR的阳性对照突变体)的CD8+T细胞高效产生IFN-γ。在除A375外的所有NY-ESO阳性细胞系中，通过工程化表达野生型BC1 TCR的CD8+T细胞以中等水平产生IFN-γ(图8)。
当使用NY-ESO阳性细胞系A375时，工程化表达I53F TCR的CD8+T细胞产生与1G4Y相似水平的干扰素-γ，而与I53F和1G4(LY)相比，I53W产生较少的干扰素-γ。当使用NY-ESO阴性细胞系时，没有IFN-γ的产生(图11)。
实施例3表达NY-ESO-1 TCR变体的T细胞的细胞毒活性
NY-ESO TCR特异性CD8+T细胞的细胞毒活性是用IncuCyte测定的。简而言之，将1×104个T2靶细胞与每孔2.5×104个NY-ESO四聚体阳性CD8+T细胞在细胞毒性红试剂存在下共培养(Essen Biosceince,Ann Arbor,Michigan,USA)。使用IncuCyte变焦软件每2小时拍摄一次图像。
用I53F和I53E转导的CD8+T细胞的细胞毒活性类似于表达野生型BC1 TCR的CD8+细胞的细胞毒活性(图12)。
实施例4表达NY-ESO-1 TCR变体的T细胞的抗肿瘤活性
在皮下注射到NOD SCID gamma KO小鼠(NSG)前不久，进行了Winn试验，其中3×106个Me275细胞与6×106个NY-ESO特异性T细胞混合。T细胞由30％的CD4+T细胞和70％的CD8+T细胞组成。肿瘤大小每周测量两次。一旦肿瘤体积达到1000mm3，就处死小鼠。
如图13B所示，A97L和I53F转导的T细胞都有效地将肿瘤大小保持在大约0mm3达43天。在该试验中，I53E转导的T细胞的表现类似于野生型BC1 TCR转导的T细胞。在未转导的T细胞中，肿瘤大小在第43天达到约700mm3。
实施例5表达NY-ESO-1 TCR变体的T细胞的抗肿瘤活性
NSG小鼠注射5×106个Me275细胞。一旦肿瘤达到50-100mm3大小，将10×106个NY-ESO特异性T细胞在瘤周或静脉注射两次(第10天和第13天)。T细胞由30％的CD4+T细胞和70％的CD8+T细胞组成。每周用测径器测量肿瘤大小两次。一旦肿瘤达到1000mm3，就处死小鼠。
当肿瘤周给药时，A97L和I53F转导的T细胞有效地将肿瘤大小保持在小于100mm3达30天。在该试验中，I53E转导的T细胞的表现类似于野生型BC1 TCR转导的T细胞。在未转导的T细胞中，肿瘤在第30天达到约275mm3的大小(图14B)。
当静脉给药时，用I53F TCR转导的T细胞(从健康供体1获得)在50天内有效地将肿瘤保持在可忽略的大小(图15B，左侧)。当来自另一个健康供体(健康供体2)的T细胞用于用I53F TCR进行转导时，这种转导的细胞在六十五天期间有效地将肿瘤保持在小于约350mm3(图15B，右)。
当静脉给药时，分别用I53F和1G4LY转导的T细胞(从健康供体3获得)都是有效的，并且在增加滴度时，与未转导的T细胞相比，在保持肿瘤体积尺寸较低方面具有相似的特征(图16B)。
实施例6表达NY-ESO-1 TCR和GM-CSF的经修饰的T细胞
材料和方法
小鼠
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠在无特定性-也无机会性病原体(Specific Opportunistic Pathogen Free，SOPF)条件下进行内部繁殖，所有动物实验均在洛桑大学的动物设施中在无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)条件下进行。所有实验都得到沃州兽医当局的批准，并根据瑞士联邦法律进行。
细胞系
野生型亲本A375(HLA-A2+，NY-ESO-1+)、MelAvl3(HLA-A2+，NY-ESO-1-)和NA8(HLA-A2+，NY-ESO-1-)黑色素瘤、H1650(HLA-A2+，NY-ESO-1-)非小细胞肺癌和LN-18(HLA-A2+，NY-ESO-1+)胶质母细胞瘤细胞系由ATCC购买。Me275(HLA-A2+，NY-ESO-1+)黑色素瘤细胞系由D.Speiser教授(Lausanne branch of Ludwig Institute for Cancer Research,University of Lausanne)惠赠，并被工程化以稳定表达荧光素酶以跟踪其体内活性。OVCAR5(HLA-A2+，NY-ESO-1-)和A2008-A2(HLA-A2+，NY-ESO-1-)卵巢癌细胞系从宾夕法尼亚大学获得，并被工程化以稳定表达全长NY-ESO-1癌症/睾丸家族肿瘤抗原序列以及mCherry和荧光素酶，以分别在体外和体内跟踪它们的活性。所有黑色素瘤细胞系都在补充了10％FCS和1％青霉素/链霉素的IMDM+Glutamax(Thermo)中维持，而其余细胞系在补充了10％FCS和1％青霉素/链霉素的RPMI(Thermo)中维持。
分子扩增
小鼠CSF2(GM-CSF)cDNA全序列(Uniprot:P01587)由Invitrogen合成。随后使用PCR和标准分子克隆技术将该序列克隆到pMSGV逆转录病毒载体中(Hughes,Human GeneTherapy,2005；16:457-472)，Thy1.1-T2A(CD90.1)报告基因盒之后，产生pMSGV-Thy1.1-T2A-mGM-CSF逆转录病毒质粒。pMSGV-Thy1.1-T2A被用作对照载体。
流式细胞术
APC抗人CD8、APC抗人CD4、APC抗鼠Thy1.1(CD90.1)购自BioLegend。NY-ESO-1 TCR四聚体是由洛桑大学肽和四聚体工厂内部生产的。FITC抗人MCSP购自Miltenyi Biotec。APC抗小鼠CD45、APCCy7抗小鼠F4/80和PECy7抗小鼠CD11b由the Flow CytometryFacility,FBM,LICR/UNIL惠赠和/或内部生产。采集在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)中进行，数据在FlowJo(TreeStar)上分析。
逆转录病毒/慢病毒的生产
为了生产逆转录病毒颗粒，用pMSGV转移质粒和逆转录病毒包装质粒pMD-Gag/Pol和pMD RD114(Milone et al,2018Leukemia 32,1529-1541)猫内源性病毒包膜糖蛋白共转染HEK293T细胞。转染后24小时、48小时和72小时收集培养上清液，并通过超速离心在24，000g×下浓缩2小时。浓缩的病毒保存在-80℃直到使用。病毒滴度和MOIs由HEK293T细胞中Thy1.1报告基因表达测定。
人T细胞刺激和慢病毒/逆转录病毒转导
健康供体单采血液成分产品是根据经批准的大学机构审查委员会协议，经书面同意从Transfusion Interrégionale CRS SA,Epalinges,Switzerland购买的。按照制造商的方案，使用Lymphoprep(StemCell Technologies)密度梯度离心制备PBMC，并使用CD8或CD4磁性微珠(Miltenyi)负分离CD8或CD4 T细胞。用抗CD3/CD28珠(Invitrogen)以2:1珠:T细胞比例在人白细胞介素-2(GlaxoSmithKline)存在时刺激分离的CD8或CD4 T细胞。
人T细胞的慢病毒/逆转录病毒转导
T细胞的慢病毒转导是在活化后24小时通过在培养基中直接添加病毒颗粒(MOI20)进行的，并通过同时添加Lentiboost(Sirion Bitechnology)来增强。活化后48h进行T细胞的逆转录病毒转导。简而言之，将T细胞转移到预先用逆转录病毒颗粒以2000×g旋转的连接蛋白包被的平板中1.5小时。第二天将T细胞从回连蛋白包被的平板上移除。激活后5天取出CD3/CD28珠，然后以0.5-1×106个T细胞/ml将T细胞保持在RPMI 1640-Glutamax(ThermoFisher Scientific)中，其中补充了10％热灭活胎牛血清(ThermoFisherScientific)、1％青霉素/链霉素、10ng/ml人白细胞介素-7(Miltenyi)和10ng/ml白细胞介素-15(Miltenyi)，直至下游使用。
干扰素γ产生/T细胞的细胞毒性试验
将105个静息的T细胞(4:1CD8+:CD4+)与105个肿瘤细胞在完全培养基中共同培养48h。根据转导效率对T细胞数量进行标准化，并在需要时添加未转导的T细胞，以在不同条件下获得相似的T细胞频率。48小时后，按照制造商的方案，通过ELISA(ThermoFisherScientific)测定收集的无细胞培养上清液中的干扰素γ水平。通过流式细胞术分析细胞来测定T细胞毒性，并将其定义为培养物中膜联蛋白V+/DAPI+肿瘤细胞的百分比。结果被标准化为仅含肿瘤细胞的培养物中膜联蛋白V+/DAPI+的百分比。
人T细胞生产转基因小鼠GM-CSF
将T细胞(CD8或CD4)以106个T细胞/ml的浓度在补充有10ng/ml IL-7/IL-15的无血清培养基中培养24h。生存力和细胞数量先前使用血细胞比容仪测定。根据转导效率对T细胞数量进行标准化，并在需要时添加未转导的T细胞，以在不同条件下获得相似的T细胞频率。24小时后，按照制造商的方案，通过ELISA(ThermoFisher Scientific)测定收集的无细胞上清液中的小鼠GM-CSF水平。
骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的产生
通过冲洗NSG小鼠的股骨和胫骨分离全骨髓细胞。通过在补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素、50μMβ-巯基乙醇和50ng/mL小鼠M-CSF(Peprotech)的DMEM+Glutamax(Thermo)培养基中孵育全骨髓细胞7天并收获贴壁部分而产生巨噬细胞。在第3天和第6天更换培养基。
Winn试验
将6-12周龄雄性NSG小鼠在侧腹皮下接种预先与5×106个(或其他说明的量)表达NY-ESO-1 TCR、分泌小鼠GM-CSF的人T细胞(4:1CD8+:CD4+)或同等数量的模拟转导的分泌小鼠GM-CSF的人T细胞混合的5×106个Me275黑色素瘤细胞。通过测径器每周测量两次监测肿瘤生长，并使用公式V＝1/2(L x W2)计算肿瘤体积，其中L是最大纵向直径，宽度W是最大横向直径。当肿瘤达到1000mm3、体重减轻超过20％或变得虚弱和奄奄一息时，处死小鼠。每组由≥5只小鼠组成。
异种移植模型
6-12周龄雄性NSG小鼠侧腹皮下接种5×106个Me275黑色素瘤细胞。同时，如上所述激活、转导和扩增人T细胞。当大约在接种后2周肿瘤达到50-100mm3时，T细胞被过继转移到小鼠体内。在第13天和第15天施用T细胞两次，每次注射用1×107个表达NY-ESO-1 TCR、分泌小鼠GM-CSF的人T细胞(4:1CD8+:CD4+)或同等数量的模拟转导的分泌小鼠GM-CSF的人T细胞。如上所述通过测径仪测量监测肿瘤生长。
结果和讨论
研究中使用的逆转录病毒小鼠GM-CSF和慢病毒NY-ESO-1 TCR构建体的示意图如图17A所示。在病毒转导后第7天，通过流式细胞术证实了人CD8+和CD4+T细胞的NY-ESO-1TCR和小鼠GM-CSF表达(图17B)。分泌的小鼠GM-CSF可以通过ELISA在转导的CD8+T细胞培养物的上清液中检测到(图17C)。这表明人T细胞可以被有效地共工程化以稳定表达NY-ESO-1TCR和分泌小鼠GM-CSF。
在识别HLA-A2+NY-ESO-1+肿瘤细胞后，可以检测NY-ESO-1TCR工程化T细胞的IFNγ分泌(图18A)。小鼠GM-CSF对干扰素γ水平没有影响。NY-ESO-1 TCR工程化的T细胞可以很容易地杀死HLA-A2+NY-ESO-1+肿瘤细胞，并且它们的细胞毒性活性不受小鼠GM-CSF的影响(图18B)。这表明分泌的小鼠粒细胞集落刺激因子对人T细胞活性没有影响。
与单独表达NY-ESO-1 TCR的对照T细胞相比，共工程化以分泌小鼠GM-CSF的人NY-ESO-1 TCR表达T细胞可有效减缓Me275黑色素瘤细胞的植入和建立(图19A)。这极大地反映了小鼠的存活率，用表达NY-ESO-1 TCR并分泌小鼠GM-CSF的T细胞处理的小鼠的40％是无肿瘤的(图19B)。与单独NY-ESO-1 TCR相比，过继转移2×107个表达NY-ESO-1 TCR、分泌小鼠GM-CSF的T细胞表现出对已建立的Me275肿瘤有更好的肿瘤控制(图19C)。这表明在NSG人黑素瘤异种移植小鼠模型中，肿瘤微环境中分泌的T细胞衍生的小鼠GM-CSF可以显著增强NY-ESO-1特异性T细胞对肿瘤生长的控制。
实施例7表达NY-ESO-1 TCR“I53F”变体和PDE4B2的修饰的T细胞
材料和方法
分子扩增
采用Bobisse,S.et al.Cancer Res.69,9385-9394(2009)中使用的慢病毒载体pRRL用于在人T细胞中过表达人PDE4B2同源物。特别地，克隆在人类PGK启动子下游的序列和Kozak元件(GCCACC(SEQ ID NO:31))编码人类WT PDE4B2(NCBI参考序列:NP_001032416.1；图26中的SEQ ID NO:27)，并通过DGGG(SEQ ID NO:32)接头与下列氨基酸序列连接:GKPIPNPLLGLDSTGGSGGGKPIPNPLLGLDST GSGSGSGKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:33)。该序列包含V5标签表位的三个重复以及Reddy Chichili et al.,Protein Sci.22,153-167(2013)中使用的两个接头。对于对照T细胞的工程化，使用相同的pRRL载体主链，其中将eGFP编码序列引入人PGK启动子和Kozak元件的下游。为了赋予T细胞以NY-ESO-1抗原特异性，采用Lamers,C.H.J.et al.Cancer Gene Ther.15,268-274(2008)中使用的SFG逆转录病毒载体，其编码NY-ESO-1 TCR变体β-I53F的α链和β链。所有引入的DNA序列都进行密码子优化用于在人细胞中进行蛋白质表达。
浓缩慢病毒或逆转录病毒生产
转染HEK-293T细胞，目的是产生病毒颗粒。简而言之，对于慢病毒颗粒的产生，将18μg编码gag/pol的R8.74质粒、7μg编码包膜蛋白的VSVG质粒以及15μg编码转基因的pRRL载体用已经与3mL Opti-MEM(11058-021，Thermo Fisher Scientific)预混合的120μlTurboFect(R0532，Thermo Fisher Scientific)稀释。以类似的方式，为了生产逆转录病毒颗粒，将18μg编码gag/pol的PegPam、7μg编码包膜蛋白的RD114质粒以及22μg SFG逆转录病毒载体用与3mL Opti-MEM预混合的120μl TurboFect稀释。值得注意的是，在用于稀释包装/转基因质粒之前，将TurboFect/Opti-MEM溶液在室温下孵育5分钟。随后，转染混合物在室温下温育30分钟，然后在含有90-95％汇合的HEK-293T细胞的T150组织培养瓶中加入到新鲜R10培养基的上面，该培养基由补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素(4-01F00-H,Bioconcept)的RPMI 1640(11875085，Thermo Fisher Scientific)组成。24小时后，用新鲜的R10代替培养上清液，再经过24小时后收获，过滤(45μm)并24000g离心2小时。最后，将病毒颗粒重新悬浮在400μl R10中，然后用干冰快速冷冻并置于-80℃
T细胞的分离、转导和培养
根据制造商的说明，在第0天通过标准Ficoll-Paque离心分离来自健康供体的PBMC，并通过使用相应的负分离试剂盒(130-096-533、130-096-495Miltenyi)纯化CD4+或CD8+T细胞。分离后，立即在50U/毫升重组人IL2(Glaxo SmithKline惠赠)存在下用抗CD3/CD28包被的微珠(11132D，Thermo Fisher Science)刺激R10中的T细胞，每个T细胞2个微珠。在48孔板中激活T细胞，每孔0.5×106个T细胞，浓度为每毫升1×106个T细胞。对于慢病毒转导，刺激18-22小时后，在以1:500稀释度使用的LentiBOOSTTM(Sirion Biotech GmbH)存在下，每孔加入100微升浓缩慢病毒，其中含有0.5×106个T细胞。逆转录病毒转导发生在未经处理的48孔细胞培养板的孔中。具体而言，在用PBS洗涤之前，在4℃下用20纳克/毫升的RetroNectin(T100B，Takara)溶液将这些孔涂布过夜，然后用PBS洗涤这些孔，在37℃下用R10连续封闭30分钟。用PBS洗涤这些孔后，加入50μl浓缩逆转录病毒和50μl R10，将平板在2000g离心90分钟，温度为25度。为了进行逆转录病毒共转导，在刺激后40-44小时内，将先前暴露在慢病毒中的T细胞转移到RetroNectin/逆转录病毒包被的孔中，并在260g下旋转10分钟。逆转录病毒转导后24小时，将这种T细胞转移到组织培养物处理的孔中。为了支持T细胞扩增，向培养物中加入补充有IL2(50U/毫升)的R10，直到第5天，即移除T细胞活化微珠的时间点。从第5天开始，向T细胞培养物中加入补充有10纳克/毫升重组人IL7和IL15(130-095-764，130-095-362，Miltenyi)的R10。在第7天，通过流式细胞仪评估转导效率，而在第8-21天的任何时间，使用T细胞进行细胞内cAMP定量或功能性测定。
cAMP的测量
将静息的T细胞洗涤并暴露于不同浓度的毛喉素或PGE2中1小时。在12孔板中以每毫升1×106个T细胞的浓度处理T细胞，而每个条件下使用2.5×106个T细胞。随后，用250μl0.1M盐酸溶解T细胞，并根据制造商的说明用直接cAMP ELISA试剂盒(ADI-900-066，EnzoLife Sciences)评估其细胞内cAMP含量。
流式细胞术
所有流式细胞仪数据均在LCRII流式细胞仪(BD)上采集，并使用FlowJo软件进行分析。根据制造商的说明，使用可固定的水性死染料L34965或L34975(Invitrogen)用于死细胞排除，同时使用以下抗体进行T细胞染色:CD45:Pac Blue(304029，BioLegend)，抗V5tag:FITC(R96325，Thermo Fisher Scientific)，抗V5tag:Dy650(NBP2-52653C，Novusbiologicals)，Vb13.1:PE(IM2292，BD)，IFNγ:PeCy7(502527，BioLegend)，TNF-α:PE(502909，BioLegend)，抗BrDU:APC(12-5071-42,Thermo Fisher Scientific)。为了通过流式细胞术评估细胞内细胞因子的产生，在圆底96孔板中，用板上涂敷的aCD3(5μg/mL)和可溶性αCD28(2μg/mL)的组合激活每孔50×103个活T细胞7小时。为了防止细胞因子分泌，在测定开始后1.5小时，以1:400的稀释度向孔中加入高尔基终止物(Golgi stop)(554724，BD)。在评估T细胞的转导效率或其产生细胞因子的能力之前，根据制造商的说明使用标准固定/透化试剂盒(554714，BD)来固定和透化T细胞。流式细胞术的BrdU染色试剂盒(8817-6600-42，Thermo Fisher Scientific)用于T细胞增殖定量。简而言之，每个孔中1×105个活的T细胞用平板包被的αCD3(5μg/mL)在平底96孔板中活化48小时，并且在测定终止前7小时，以10μM的工作浓度向孔中加入BrdU。
干扰素γ分泌的定量
静息的eGFP-、PDE4B2-、eGFP&NY-ESO-1 TCR-或PDE4B2&NY-ESO-1 TCR-转导的CD8T细胞NY-ESO-1呈递黑色素瘤细胞A375在不同浓度的PGE2或毛喉素中共培养48小时，并根据制造商的说明，通过ELISA试剂盒(88-7316-88，Thermo Fisher Scientific)评估共培养上清液中IFNγ的存在。共培养在平底96孔板中进行，每个孔中加入1×105个A375细胞和1×105个TCR+活T细胞，或相应数量的eGFP-/PDE4B2转导的T细胞。
细胞毒性试验
静息的eGFP-、PDE4B2-、eGFP&NY-ESO-1 TCR-或PDE4B2&NY-ESO-1 TCR-转导的CD4或CD8 T细胞在存在或不存在PGE2的情况下分别与A375细胞共培养47或44小时。共培养由IncuCyte仪器监测，在平底96孔板中进行，每个孔中加入1×104个A375肿瘤细胞和25×103个TCR+活T细胞，或相应数量的eGFP-/PDE4B2转导的T细胞。所用的A375肿瘤细胞被工程化成表达核荧光蛋白mCherry，以便能够在孔中直接检测。
结果和讨论
通过流式细胞术证实了在原代人T细胞中外源性PDE4B2的表达或外源性PDE4B2和NY-ESO-1 TCR变体β-I53F的共表达(图21)。由于NY-ESO-1 TCR包含TCRβ链的Vβ13.1变体，因此可以通过检测Vβ13.1来推断前者的存在，尽管不完全准确。
暴露于Fsk或PGE2 1小时后，测定静息的eGFP-或PDE4B2-转导的CD4 T细胞的细胞内cAMP水平。处理后，裂解T细胞，通过酶联免疫吸附试验定量cAMP水平。结果显示PDE4B2过表达阻止细胞内cAMP积累(图22)。
在PGE2或毛喉素存在下，用或不用平板结合的aCD3和可溶性aCD28刺激7小时后，通过细胞内细胞因子染色(ICS)测定静止的eGFP-或PDE4B2-转导的CD4 T细胞产生IFNγ或TNF-α的能力。通过酶联免疫吸附试验评估在PGE2或毛喉素存在的情况下，静息的eGFP-、PDE4B2-、eGFP&NY-ESO-1 TCR-或PDE4B2&NY-ESO-1 TCR-转导的CD8 T细胞响应于与NY-ESO-1呈递黑色素瘤细胞A375共培养48小时的干扰素γ分泌。这两个结果都表明，在诱导细胞内cAMP积累的条件下，PDE4B2过表达促进Th-1细胞因子的产生(图23A、23B)。
eGFP或PDE4B2转导的CD4 T细胞的增殖能力通过BrDU掺入试验测定。在存在PGE2或毛喉素的情况下用或不用板结合的αCD3重新刺激T细胞48小时。结果显示，PDE4B2过表达在诱导细胞内cAMP积累的条件下促进增殖(图24)。
通过IncuCyte评估在存在或不存在PGE2的情况下静息的eGFP-、PDE4B2-、eGFP&NY-ESO-1 TCR-或PDE4B2&NY-ESO-1TCR-转导的CD4或CD8 T细胞抑制NY-ESO-1呈递黑色素瘤细胞A375的扩增的能力。如图25所示，PDE4B2过表达促进了PGE2存在下T细胞的细胞毒性。
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＊＊＊
本发明的范围不受这里描述的具体实施方式的限制。实际上，除了这里描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料在此全部引入作为参考，如同物理上存在于本说明书中一样。

Claims (132)

1.编码经修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段的多核苷酸，其中所述经修饰的T细胞受体相对于未取代的野生型(WT)T细胞受体β链的互补决定区(CDR)2而言在该经修饰的T细胞受体的β链的CDR2内包含单个氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中在所述经修饰的TCR或其功能性片段的β链的CDR2区域之外，所述经修饰的TCR的β链序列包含与未取代的WT TCR的β链或其功能性片段至少80％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR或其功能性片段的β链包含未取代的WT TCR的β链或其功能性片段的氨基酸序列，并且在所述CDR2区域内具有所述单个氨基酸取代。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其中所述未取代的WT TCR的β链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述单个氨基酸取代发生在相对于WT TCR的残基50、51、53或55处。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述单个氨基酸取代发生在相对于所述WT TCR的残基53或55处。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述单个氨基酸取代是I53E、I53F、I53W或D55E。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR以比所述WT TCR更高的结合亲和力结合癌症抗原。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ IDNO:8)。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约5至约75倍。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约10至约75倍。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约25至约75倍。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约40至约75倍。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约40至约60倍。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约40至约50倍。
16.根据权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸，其中与WT TCR对所述癌症抗原的结合亲和力相比，所述经修饰的TCR对该癌症抗原的结合亲和力高约50倍。
17.根据权利要求8或权利要求9所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约0.30和约4.5μM之间。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约0.30和约2μM之间。
19.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约2μM和约3μM之间。
20.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)在约3μM和约4μM之间。
21.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)约为0.41μM。
22.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR对所述癌症抗原的解离常数(KD)约为3.89μM。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR包含SEQ IDNO:2-5中任一所示的氨基酸序列，或其功能性片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸，其中所述经修饰的TCR由SEQ ID NO:11-14中任一所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11-14中任一所示序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至少一个调节元件用于表达所述经修饰的TCR。
26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中所述至少一个调节元件是启动子。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其为DNA分子。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其为RNA分子或其衍生物。
29.一种重组载体，其包含权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至少一个调节元件用于表达所述经修饰的T细胞受体(TCR)。
30.根据权利要求29所述的载体，其是病毒载体。
31.根据权利要求30所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体、疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。
32.根据权利要求29所述的载体，其中该载体是非病毒载体。
33.一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其中包含由权利要求1-28中任一项的多核苷酸编码的经修饰的T细胞受体的β链或其功能性片段。
34.一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其中包含a)由权利要求1-29中任一项的多核苷酸编码的经修饰的T细胞受体的β链或其功能性片段，和b)α链或其功能性片段。
35.一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其中包含由权利要求1-28中任一项的多核苷酸编码的经修饰的T细胞受体的β链的CDR。
36.一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其中包含a)经修饰的TCR的β链的功能性片段，其中所述功能性片段包含由权利要求1-28中任一项的多核苷酸编码的β链的CDR，和b)α链的功能性片段，其中所述功能性片段包含α链的CDR。
37.根据权利要求36所述的经修饰的TCR，其中a)的功能性片段进一步包括TCRβ链的恒定区，和/或b)的功能性片段进一步包括TCRα链的恒定区。
38.根据权利要求37所述的经修饰的TCR，其中任一恒定区是人类来源的。
39.根据权利要求37所述的经修饰的TCR，其中任一恒定区是小鼠来源的。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的TCR，其中所述α链包括WT TCR的α链或其功能性片段。
41.根据权利要求40所述的经修饰的TCR，其中所述WT TCR的α链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的经修饰的TCR，其中所述经修饰的TCR包含SEQID NO:2-5中任一所示的氨基酸序列，或其片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
43.一种经修饰的T细胞受体(TCR)，其中包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的α链和含有SEQ ID NO:2-5中任一所示的氨基酸序列的β链。
44.一种分离的宿主细胞，其中包含权利要求33-43中任一项所述的经修饰的T细胞受体(TCR)。
45.一种分离的宿主细胞，其中包含权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸。
46.根据权利要求45所述的分离的宿主细胞，其中所述多核苷酸可操作地连接至少一个调节元件，所述调节元件能够介导所述经修饰的T细胞受体(TCR)在所述宿主细胞中的表达。
47.包含根据权利要求29-32中任一项所述的载体的分离的宿主细胞。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是淋巴样细胞。
50.根据权利要求49所述的分离的宿主细胞，其中所述淋巴样细胞是T细胞。
51.根据权利要求49所述的分离的宿主细胞，其中所述淋巴样细胞是自然杀伤(NK)细胞。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞获得自外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。
53.根据权利要求44-52中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞已经被离体激活和/或扩增。
54.根据权利要求44-53中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是同种异体细胞。
55.根据权利要求44-53中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是自体细胞。
56.根据权利要求55所述的分离的自体宿主细胞，其中所述宿主细胞是从患有疾病的受试者中分离的。
57.根据权利要求56所述的分离的自体宿主细胞，其中所述疾病是癌症。
58.根据权利要求57所述的分离的自体宿主细胞，其中所述癌症在其细胞表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的分离的自体宿主细胞，其中所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、泌尿膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
60.根据权利要求44-59中任一项所述的分离的宿主细胞，其被进一步工程化以表达一种或多种外源分子。
61.根据权利要求60所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是免疫信号传导分子。
62.根据权利要求61所述的分离的宿主细胞，其中所述免疫信号传导分子是细胞因子。
63.根据权利要求61所述的分离的宿主细胞，其中所述免疫信号传导分子是趋化因子。
64.根据权利要求61所述的分离的宿主细胞，其中所述免疫信号传导分子是生长因子。
65.根据权利要求64所述的分离的宿主细胞，其中所述生长因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
66.一种分离的宿主细胞，其包含结合癌症抗原的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，其中所述宿主细胞被进一步工程化以表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
67.根据权利要求66所述的分离的宿主细胞，其中所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
68.根据权利要求66或67所述的分离的宿主细胞，其中所述T细胞受体(TCR)是一种野生型T细胞受体(WT TCR)。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述野生型TCR的β链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
70.根据权利要求66-69中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述野生型TCR的α链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述GM-CSF的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21、34或15，或与SEQ ID NO:21、34或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的分离的宿主细胞，其中编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22、35或16，或与SEQ ID NO:22、35或16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
73.根据权利要求60或61所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是可溶性受体。
74.根据权利要求60或61所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是配体。
75.根据权利要求60或61所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是抗原结合蛋白。
76.根据权利要求75所述的分离的宿主细胞，其中所述抗原结合蛋白是抗体或抗体片段。
77.根据权利要求60所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是磷酸二酯酶。
78.根据权利要求77所述的分离的宿主细胞，其中所述磷酸二酯酶是PDE4B2。
79.一种分离的宿主细胞，其包含结合癌症抗原的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，其中所述宿主细胞被进一步工程化以表达PDE4B2。
80.根据权利要求79所述的分离的宿主细胞，其中所述癌症抗原是NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
81.根据权利要求79或80所述的分离的宿主细胞，其中所述T细胞受体(TCR)是野生型T细胞受体。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述野生型TCR的β链包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述野生型TCR的α链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
84.根据权利要求78-83中任一项所述的分离的宿主细胞，其中PDE4B2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:27或29，或与SEQ ID NO:27或29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
85.根据权利要求78-84中任一项所述的分离的宿主细胞，其中编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或30，或与SEQ ID NO:28或30具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
86.根据权利要求60所述的分离的宿主细胞，其中所述一种或多种外源分子是细胞表面受体。
87.根据权利要求86所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞表面受体是嵌合抗原受体。
88.根据权利要求86所述的分离的宿主细胞，其中所述细胞表面受体是不结合癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的T细胞受体。
89.一种双功能分子，其包含权利要求33-43所述的经修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段，以及特异性结合T细胞上的细胞表面蛋白的免疫效应多肽。
90.根据权利要求89所述的双功能分子，其中所述免疫效应多肽包含抗体或抗体片段。
91.根据权利要求89或90所述的双功能分子，其中所述免疫效应多肽包含单链可变片段(scFv)。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的双功能分子，其中所述免疫效应多肽特异性结合CD3。
93.根据权利要求92所述的双功能分子，其中所述免疫效应多肽包括源自OKT3、UCHT-1、BMA031或12F6的抗体或抗体片段。
94.一种药物组合物，其中包含权利要求44-88中任一项所述的宿主细胞或权利要求89-93中任一项所述的双功能分子，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
95.根据权利要求94所述的药物组合物，其中该组合物用于过继细胞转移治疗。
96.一种生产权利要求44-88中任一项所述的宿主细胞的方法，其中包括用权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸或权利要求29-32中任一项所述的载体对所述宿主细胞进行基因工程改造。
97.一种基因工程改造宿主细胞以表达权利要求33-43中任一项所述的经修饰的T细胞受体(TCR)或其功能性片段的方法。
98.根据权利要求97所述的方法，其中包括用权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸或权利要求29-32中任一项所述的载体对宿主细胞进行基因工程改造。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的方法，其中所述基因工程改造步骤通过病毒基因递送进行。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述基因工程改造步骤通过非病毒基因递送进行。
101.根据权利要求96-100中任一项所述的方法，其中该方法在离体进行。
102.根据权利要求96-101中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括离体活化和/或扩增所述宿主细胞。
103.根据权利要求96-102中任一项所述的方法，其中所述经修饰的TCR包含SEQ IDNO:2-5中任一所示的氨基酸序列，或其片段，或与SEQ ID NO:2-5中任一所示序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
104.根据权利要求96-103中任一项所述的方法，其中进一步包括基因工程改造所述宿主细胞以进一步表达一种或多种外源分子。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述一种或多种外源分子是免疫信号传导分子。
106.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述外源分子是细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、配体、磷酸二酯酶、抗原结合蛋白或细胞表面受体。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述生长因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
108.根据权利要求107所述的方法，其中GM-CSF的氨基酸序列包括SEQ ID NO:21、34或15，或与SEQ ID NO:21、34或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中编码GM-CSF的核苷酸序列包含SEQ IDNO:22、35或16，或与SEQ ID NO:22、35或16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
110.根据权利要求106所述的方法，其中所述磷酸二酯酶是PDE4B2。
111.根据权利要求110所述的方法，其中PDE4B2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:27或29，或与SEQ ID NO:27或29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中编码PDE4B2的核苷酸序列包含SEQ IDNO:28或30，或与SEQ ID NO:28或30具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。
113.根据权利要求106所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是抗体或抗体片段。
114.根据权利要求106所述的方法，其中所述细胞表面受体是不结合癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)的嵌合抗原受体或T细胞受体。
115.根据权利要求96-114中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
116.根据权利要求96-115中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是淋巴样细胞。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述淋巴样细胞是T细胞。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述淋巴样细胞是自然杀伤(NK)细胞。
119.根据权利要求115-118中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞获得自外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤引流淋巴结或肿瘤浸润物。
120.根据权利要求96-119中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞已经被离体激活和/或扩增。
121.根据权利要求96-120中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是同种异体细胞。
122.根据权利要求96-120中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是自体细胞。
123.根据权利要求96-122中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是从患有疾病的受试者中分离的。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述疾病是癌症。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述癌症的细胞在其表面呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
126.根据权利要求124或权利要求125所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
127.一种在有此需要的哺乳动物中刺激或增强免疫反应的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的淋巴样细胞，所述淋巴样细胞包含权利要求33-43中任一项所述的经修饰的T细胞受体(TCRs)、权利要求44-88中任一项所述的宿主细胞、权利要求89-93中任一项所述的双功能分子、权利要求94或权利要求95所述的组合物、或通过权利要求96-126中任一项所述的方法产生的宿主细胞。
128.一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，包括给受试者施用有效量的淋巴细胞，所述淋巴细胞包含权利要求33-43中任一项所述的经修饰的T细胞受体(TCRs)、权利要求44-88中任一项所述的宿主细胞、权利要求89-93中任一项所述的双功能分子、权利要求94或权利要求95所述的组合物、或通过权利要求96-126中任一项所述的方法产生的宿主细胞。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述癌症的细胞在其表面上呈现癌症抗原NY-ESO-1157-165表位(SEQ ID NO:8)。
130.根据权利要求128或权利要求129所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿膀胱癌、皮肤癌、肺癌、卵巢癌或脑癌。
131.根据权利要求128-130中任一项所述的方法，该方法包括:
a)从所述受试者或哺乳动物中分离T细胞；
b)用权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸或权利要求29-32中任一项所述的载体离体遗传修饰所述T细胞；
c)任选地，在步骤b)之前、之后或期间扩增和/或激活所述T细胞；和
d)将遗传修饰的T细胞引入所述受试者或哺乳动物。
132.根据权利要求128-131中任一项所述的方法，其中所述受试者或哺乳动物是人。
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