CN109476723A - Ny-eso-1肿瘤抗原hla-a*02复合物的特异性t细胞受体 - Google Patents

Ny-eso-1肿瘤抗原hla-a*02复合物的特异性t细胞受体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结合源自癌抗原NY‑ESO‑1的HLA‑A*02限制性肽SLLMWITQC的T细胞受体(TCR)。所述TCR可以包含α和/或β可变结构域内的相对于天然NY‑ESO‑1TCR的突变。本发明的TCR特别适合用作治疗恶性疾病的新型免疫治疗剂。

Description

NY-ESO-1肿瘤抗原HLA-A*02复合物的特异性T细胞受体
技术领域
本发明涉及与源自癌抗原NY-ESO-1的HLA-A*02限制性肽SLLMWITQC结合的T细胞受体(TCR)。所述TCR可以包含α和/或β可变结构域内的相对于天然NY-ESO-1TCR的突变。本发明的TCR是特别适合用作治疗恶性疾病的新型免疫治疗剂。
背景技术
T细胞受体(TCR)由CD4+和CD8+T细胞天然表达。TCR设计为识别在抗原呈递细胞表面上展示的与主要组织相容性复合体(MHC)分子(在人类中，MHC分子也被称为人类白细胞抗原或HLA)复合的短肽抗原(Davis,et al.,(1998),Annu Rev Immunol 16:523-544.)。CD8+T细胞也被称为细胞毒性T细胞，其特异性识别与MHC I类结合的肽，并且通常负责发现和介导受感染或癌细胞的破坏。
NY-ESO-1属于种系编码的癌抗原家族(Chen,et al.,(1997),Cytogenet CellGenet 79(3-4):237-240:WO9814464)并且Uniprot登录号为P78358。已发现这种种系抗原经常在各种癌症中表达，而在正常组织中的表达仅限于成人睾丸和其他免疫特异性位点。这些抗原的癌症特异性性质使其成为抗癌治疗的理想靶点。NY-ESO-1的确切功能仍然未知，但其据报道在胎儿和成人睾丸(Satie,et al.,(2002),Lab Invest 82(6):775-780)、卵巢和子宫肌层以及各种各样的癌症(包括骨髓瘤(Andrade,et al.,(2008),CancerImmun 8:2)、卵巢癌(Odunsi,et al.,(2003),Cancer Res 63(18):6076-6083)、非小细胞肺癌(Konishi,et al.,(2004),Oncol Rep 11(5):1063-1067)和黑色素瘤(Barrow,etal.,(2006),Clin Cancer Res 12(3Pt 1):764-771))中表达。九聚体肽SLLMWITQC(SEQ IDNO 1)对应于全长NY-ESO-1蛋白的氨基酸157-165。在LAGE-1A(Acc.号O75638-2)(一种替代的癌症抗原)中也发现了相同的肽(Lethe,et al.,(1998),Int J Cancer 76(6):903-908)。该肽与HLA-A*02结合，肽-HLA复合物能够刺激细胞毒性T细胞，导致NY-ESO-1+、HLA-A*02+、肿瘤细胞裂解(Duffour,et al.,(1999),Eur J Immunol 29(10):3329-3337和WO2000020445)。因此SLLMWITQC HLA-A*02复合物为免疫治疗干预提供了有用的靶抗原。
鉴定与SLLMWITQC HLA-A*02复合物结合的特定TCR序列，对于开发新的免疫疗法是有利的。例如，这种治疗性TCR可用作可溶性靶向剂，用于将细胞毒素或免疫效应剂递送至肿瘤的目的(Lissin,et al.,(2013).“High-Affinity Monocloncal T-cell receptor(mTCR)Fusions.Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals:Applicationsand Challenges”.S.R.Schmidt,Wiley；Boulter,et al.,(2003),Protein Eng 16(9):707-711；Liddy,et al.,(2012),Nat Med 8:980-987)，或者可选地，它们可以用于工程化T细胞进行过继性治疗(June,et al.,(2014),Cancer Immunol Immunother 63(9):969-975)。理想的是，用于免疫治疗用途的TCR能够强烈识别靶抗原，这意味着TCR应该对靶抗原具有高亲和性和/或长结合半衰期以发挥有效应答。当存在于自然界中时，TCR通常对靶抗原具有低亲和性(低微摩尔范围)，因此，通常需要鉴定给定TCR序列可执行的突变(包括但不限于取代、插入和/或删除)以促进抗原结合。为了用作可溶性靶向剂，优选纳摩尔至皮摩尔范围内的TCR抗原结合亲和性和数小时的结合半衰期。还期望治疗性TCR对靶抗原表现出高水平的特异性以减轻临床应用中由脱靶结合引起的毒性风险。考虑到TCR抗原识别的天然简并性，这种高特异性可能特别具有挑战性(Wooldridge,et al.,(2012),J Biol Chem287(2):1168-1177；Wilson,et al.,(2004),Mol Immunol 40(14-15):1047-1055)。最后，理想的是治疗性TCR能够以高度稳定的形式表达和纯化。
本申请定义的TCR序列参考IMGT命名法进行描述，该命名法对于TCR领域的技术人员而言广为人知且可以获得。例如，请参阅：LeFranc and LeFranc,(2001).“T cellReceptor Factsbook”,Academic Press；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc2011(6):595-603；Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 1O；和Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266。αβTCR由两条二硫键相连的链组成。通常认为每个链(α和β)具有两个结构域，即可变结构域和恒定结构域。可变结构域和恒定结构域由短连接区连接，该连接区通常认为是可变区的一部分。另外，β链通常在可变区和连接区之间包含短多样性区。
每条链的可变结构域位于N端，并包含嵌入框架序列中的三个互补决定区(CDR)。CDR包含肽-MHC结合的识别位点。有若干α链可变区(Vα)的编码基因和若干β链可变区(Vβ)的编码基因。这些基因通过它们的框架、CDR1和CDR2序列以及部分定义的CDR3序列来区分。Vα和Vβ基因在IMGT命名中分别用前缀'TRAV'和'TRBV'表示(Folch and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(1):42-54；Scaviner and Lefranc,(2000),Exp ClinImmunogenet 17(2):83-96；LeFranc and LeFranc,(2001),“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press)。同样，α和β链各有若干连接基因或称J基因，分别称为“TRAJ”或“TRBJ”，而β链的多样性或D基因称为'TRBD'(Folch and Lefranc,(2000),ExpClin Immunogenet 17(2):107-114；Scaviner and Lefranc,(2000),Exp ClinImmunogenet 17(2):97-106；LeFranc and LeFranc,(2001),“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press)。α和β可变区序列的巨大多样性来源于各种V、J和D基因之间的组合重排，其包括等位基因变体和额外的连接多样性(Arstila,et al.,(1999),Science286(5441):958-961；Robins et al.,(2009),Blood 114(19):4099-4107)。TCRα和β链的恒定区或C区分别称为“TRAC”和“TRBC”(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix1:Appendix 1O)。
在本说明书和权利要求书中，术语“TCR阿尔法(或α)可变结构域”是指TRAV和TRAJ区的串联；仅TRAV区域；或TRAV和部分TRAJ区，并且术语TCR阿尔法(或α)恒定结构域是指细胞外TRAC区，或指C端截短或全长TRAC序列。同样，术语“TCR贝塔(或β)可变结构域”可以指TRBV和TRBD/TRBJ区的串联；仅TRBV和TRBD区；仅TRBV和TRBJ区；或TRBV和部分TRBD和/或TRBJ区，且术语TCR贝塔(或β)恒定结构域是指细胞外TRBC区或C端截短或全长TRBC序列。
以前曾报道过靶向NY-ESO-1的TCR(WO05113595；WO08039818；McCormack,et al.,(2013),Cancer Immunol Immunother 62(4):773-785)。
本发明人已经鉴定了结合至NY-ESO-1HLA-A*02复合物的可选TCRα和β可变结构域序列。这些序列特别适合用作治疗性TCR，所述治疗性TCR用于呈递SLLMWITQC HLA-A*02复合物的癌症靶向免疫治疗。
本发明人已经鉴定了包含采用以下链的天然TCR：
α链：TRAV3*01/TRAJ28*01
β链：TRBV29-1*01/TRBD2*01/TRBJ2-3*01
(注意，术语“*01”表示如IMGT命名法所指定的该序列的等位变体)
使用该天然TCR作为产生本发明的突变序列的模板。
发明内容
作为第一方面，本发明提供了具有结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的性质且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域的T细胞受体(TCR)，其中，
所述α链可变结构域包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-117具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，和/或
所述β链可变结构域包含与SEQ ID No：3的氨基酸1-115具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
作为第二方面，本发明提供了以大于50μM的亲和性结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的TCR，其中：α链CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO：41、42和43，和/或β链CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO：44、45和46，和/或至少一个所述CDR包含相对于SEQ ID NO：41至46的一个或多个保守取代；和/或至少一个所述CDR包含相对于SEQ ID NO：41至46的至多三个耐受取代。
第一或第二方面的α链可变结构域可以参照SEQ ID NO：2的编号具有以下至少一个突变：
残基编号
I51 L
T52 G
G53 D
D54 S
N55 A
D95 S
I96 S
N97 D
S98 Q
G99 H
和/或第一或第二方面的β链可变结构域可以参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一个突变：
残基编号
S27
Q28
V29
T30
M31
N50
Q51
S53
G100
α链可变结构域可以参照SEQ ID NO：2的编号具有以下至少一个突变：
残基编号
I51 L
G53 D
和/或β链可变结构域可参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一个突变：
残基编号
T30 A
N50 W
G100 A
α链可变结构域可以参照SEQ ID NO：2的编号具有以下2至6个突变：
残基编号
I51 L
T52 G
G53 D
D54 S
N55 A
D95 S
I96 S
N97 D
S98 Q
G99 H
和/或β链可变结构域可以参照SEQ ID NO：3的编号具有以下3至9个突变：
α链可变结构域可以具有以下至少一组突变
第1组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A
第2组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97D
第3组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97R
第4组：I96S、N97D、S98Q、G99H
第5组：D95S、I96S、N97R、S98Q、G99H
第6组：I51L、G53D
和/或β链可变结构域可以具有以下至少一组突变
第1组：N50W、Q51T、S53G
第2组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G
第3组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G、G100A
第4组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T
第5组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G
第6组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G、G100A
第7组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M3IL、N50W、Q51T
第8组：T30A、N50W、G100A
α链可变结构域和β链可变结构域可以分别具有以下组的突变：
本发明的TCR参考SEQ ID NO：2的编号可以包含具有以下突变的α链可变结构域：
残基编号
Q10 L
和/或β链可变结构域参照SEQ ID NO：3的编号可以具有至少一个以下突变：
残基编号
C13 K
L43 P
在α链可变结构域中，氨基酸残基27-32、50-57和91-107的序列选自以下：
TCRα链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：12具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
在β链可变结构域中，氨基酸残基27-31、49-55和93-106的序列选自以下：
残基27-31 残基49-55 残基93-106
KRLAL AWTGGEA CSVGGSGGADTQYF
KRLAL AWTGGEA CSVGGSGAADTQYF
KRLAM AWTGGEA CSVGGSGGADTQYF
KRLAL AWTGSEA CSVGGSGGADTQYF
KRLAM AWTGGEA CSVGGSGAADTQYF
KRLAM AWTGSEA CSVGGSGGADTQYF
SQVTM AWTGGEA CSVGGSGGADTQYF
SQVAM AWQGSEA CSVGGSGAADTQYF
TCRβ链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：15具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
α链可变结构域可以具有氨基酸残基27-32、50-57和91-107的序列，并且β链可变结构域可以具有选自以下的氨基酸残基27-31、49-55和93-106的序列：
α链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：12具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％一致性，并且β链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：15具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
α链可变结构域可以为选自SEQ ID NO：6-12或51的氨基酸序列，并且β链可变结构域可以为选自SEQ ID NO：13-23或52的氨基酸序列。
α链可变结构域和β链可变结构域可以为选自以下的氨基酸序列：
α链可变结构域 β链可变结构域
SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：18
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
本发明的TCR可以是具有α链TRAC恒定结构域序列和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列的α-β异源二聚体。
可通过截短或取代来修饰α和β链恒定结构域序列，来删除TRAC外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键，和/或可以通过半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57来修饰α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成非天然二硫键。
本发明的TCR可以是Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型的单链形式，其中Vα和Vβ分别为TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别为TCRα和β恒定区，L为接头序列。
本发明的TCR可以与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相关联。
本发明还提供了TCR抗CD3融合物，所述融合物包含本发明的TCR和与TCR的α或β链的C或N端共价连接的抗CD3抗体，并且这样的TCR抗CD3融合物可以包含选自SEQ ID NO：6-12或51中的任一个的α链可变结构域和选自SEQ ID NO：13-23或52中的任一个的β链可变结构域。β链可以通过接头序列与抗CD3抗体序列连接；该接头序列可以选自GGGGS(SEQ IDNO：24)、GGGSG(SEQ ID NO：25)、GGSGG(SEQ ID NO：26)、GSGGG(SEQ ID NO：27)、GSGGGP(SEQID NO：28)、GGEPS(SEQ ID NO：29)、GGEGGGP(SEQ ID NO：30和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID NO：31)。
本发明的TCR抗CD3融合物可以包含α链氨基酸序列和β链氨基酸序列对，所述氨基酸序列对与下表所述的氨基酸序列对具有至少90％一致性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
本发明还提供了编码本发明的TCR或TCR抗CD3融合物的核酸。
还提供了呈递本发明的TCR或TCR抗CD3融合物的非天然存在的和/或纯化的和/或工程化细胞，所述细胞具有(a)TCR表达载体，所述载体包含本发明的核酸，其中核酸在单一开放阅读框中或两个分别编码α链和β链的不同的开放阅读框中；或(b)第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码本发明的TCR或TCR抗CD3融合物的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明的TCR或TCR抗CD3融合物的β链的核酸。
呈递TCR或TCR抗CD3融合物的细胞或携带表达载体的细胞可以是T细胞。
本发明还提供了包含本发明的TCR或TCR抗CD3融合物或本发明的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
还提供了用于医学的本发明的TCR、TCR抗CD3融合物或其核酸或细胞。所述TCR、TCR抗CD3融合物、细胞或核酸可以用于治疗人类对象的癌症的方法中。
人类对象可以具有表达NY-ESO-1和/或LAGE-1A的肿瘤，并且该肿瘤可以是实体瘤且可以选自滑膜肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、乳房肿瘤、卵巢肿瘤、食道肿瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌和头颈部肿瘤。人类对象可以是HLA-A*02亚型对象。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了具有结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的性质的T细胞受体(TCR)，所述TCR包含TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域，其中，所述α链可变结构域包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-117具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，和/或所述β链可变结构域包含与SEQ ID NO：3的氨基酸1-115具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。TCR可以是分离的、无细胞的和/或可溶性的，即其可能不是在人体T细胞内天然存在的TCR。
本发明提供了以大于50μM的亲和性结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的TCR，其中：α链CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO：41、42和43，和/或β链CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO：44、45和46，和/或至少一个所述CDR含有相对于SEQ ID NO：41至46的一个或多个保守取代；和/或至少一个所述CDR含有相对于SEQ ID NO：41至46的至多三个耐受取代。TCR对SLLMWITQC HLA-A*02复合物的亲和性可以在50uM至100nM的范围内。优选地，相对于未取代的TCR，所述取代不会使结合亲和性改变超过+/-50％，或更优选不超过+/-20％。
为了产生本发明的稳定的可溶性TCR，使用可溶形式的天然TCR作为具有图2所示序列的起始序列。为此目的，将半胱氨酸取代引入TRAC和TRBC区，使得可以形成非天然的链间二硫键。WO03020763描述了用于定位所述半胱氨酸取代的合适位置。图2分别以可溶形式显示野生型TCRα和β链的细胞外序列。除了TRAC的Thr48已被Cys替代外，SEQ ID NO：4与天然α链细胞外序列SEQ ID NO：2相同。同样，除了TRBC的Ser57已经被Cys替代，Cys75已经被Ala替代并且Asn201已经被Asp替换之外，SEQ ID NO：5与天然β链细胞外序列SEQ ID NO：3相同。上述可溶性野生型TCR可以用来提供参照，用于比较本发明的突变TCR的结合特性。第一方面的TCR也可以是第二方面的TCR。
本发明的任一方面或两个方面的TCR可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。本发明的TCR可以在α链可变结构域和/或β链可变结构域中存在多于一个相对于天然NY-ESO-1TCR的突变。
“工程化TCR”和“突变TCR”在本申请中同义地使用，并且通常意指具有一个或多个相对于野生型NY-ESO-1TC而引入的突变的TCR，特别是在α链可变结构域和/或β链可变结构域。优选在CDR区内进行突变。这些突变通常会提高TCR与SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的结合亲和性。α链可变结构域可以参照SEQ ID NO：2的编号具有以下至少一、二、三、四、五或六个突变：
残基编号
I51 L
T52 G
G53 D
D54 S
N55 A
D95 S
I96 S
N97 D
S98 Q
G99 H
(表1)
和/或β链可变结构域可以参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一、二、三、四、五或六个突变：
残基编号
S27
Q28
V29
T30
M31
N50
Q51
S53
G100
(表2)
α链可变结构域可以参照SEQ ID NO：2的编号具有以下至少一个突变：
残基编号
I51 L
G53 D
(表3)
和/或β链可变结构域可以参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一个突变：
(表4)
α链可变结构域可以具有以下至少一组突变
第1组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A
第2组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97D
第3组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97R
第4组：I96S、N97D、S98Q、G99H
第5组：D95S、I96S、N97R、S98Q、G99H
第6组：I51L、G53D
和/或β链可变结构域具有以下至少一组突变
第1组：N50W、Q51T、S53G
第2组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G
第3组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G、G100A
第4组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T
第5组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G
第6组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G、G100A
第7组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M3IL、N50W、Q51T
第8组：T30A、N50W、G100A
突变组的特定组合可以如下表所示：
(表5)
突变的特定组合可以存在于本发明的TCR中，如下表所示：
α链
残基27-32 残基50-57 残基91-107
VSGNPY YITGDNLV CAVRDSDQHAGSYQLTF
VSGNPY YLGDSALV CAVRDINSGAGSYQLTF
VSGNPY YITGDNLV CAVRSSRQHAGSYQLTF
VSGNPY YLGDSALV CAVRDIDSGAGSYQLTF
VSGNPY YLGDSALV CAVRDIRSGAGSYQLTF
VSGNPY YLTDDNLV CAVRDINSGAGSYQLTF
(表6)
β链
(表7)
特别地，α和β链可变结构域可以包含以下氨基酸序列的组合：
(表8)
在某些实施例中，在α链CDR中存在1、2、3、4、5、6、7或8个突变，例如2至6个突变，和/或β链CDR中存在1、2、3、4、5、6、7、8或9个突变，例如3至9个突变。在一些实施例中，本发明的TCR的α链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-117的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列，条件是α链可变结构域至少具有如上所述的突变之一。在一些实施例中，本发明的TCR的β链可变结构域可以包含与SEQ ID NO：3的氨基酸残基1-115的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列，条件是β链可变结构域至少具有如上所述的突变之一。α链可变结构域可以包含SEQ ID NO：6-12或51中任一个氨基酸序列。β链可变结构域可以包含SEQ ID NO：13-23或52中任一个氨基酸序列。
也可以在CDR之外进行突变，这种突变可以促进结合，但优选促进纯化产率和稳定性。参考SEQ ID NO：2的编号，α链可变结构域中的这种突变的例子可以是：
残基编号
Q10 L
(表9)
和/或β链可变结构域可以参照SEQ ID NO：3的编号为以下至少一个突变：
残基编号
C13 K
L43 P
(表10)
对于亲本TCR的突变可包括能够增加TCR对SLLMWITQC的结合亲和性(kD和/或结合半衰期)的突变。突变可以包括能够减少非特异性结合的量，即，减少与除SLLMWITQC之外的抗原的结合，或者增加TCR与SLLMWITQC结合的特异性。突变可以包括提高折叠和/或制造效率的突变。一些突变可能有利于每一个所述特征，另一些可能有利于例如亲和性而非特异性，或者有利于特异性而非亲和性等。
本申请公开的本发明的任何TCR的表型沉默变体属于本发明的范围内。如本申请所用，术语“表型沉默变体”应理解为指如下TCR：除上述列举外还包含一个或多个其他氨基酸变化，且该TCR的表型与没有该变化的TCR类似。为了本申请的目的，TCR表型包含抗原结合亲和性(KD和/或结合半衰期)和抗原特异性。在相同条件下(例如在25℃和在相同的SPR芯片上)测量时，表型沉默变体对SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的KD和/或结合半衰期可以在无所述变化的相应TCR的KD和/或结合半衰期测量值的20％内。实施例3中进一步限定了合适的条件。以下进一步定义抗原特异性。如本领域技术人员所知，可能产生相对于上文详细描述的TCR在可变结构域中包含变化，而与SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的相互作用亲和性不变的TCR。特别地，可以将这种沉默突变包含在已知不直接参与抗原结合的序列的部分(例如在不与肽抗原接触的CDR或CDR部分之外)。这种细微细微变体包括在本发明的范围内。含有一个或多个保守和/或耐受取代的TCR也构成本发明的一部分。
耐受取代也是表型沉默，但可能不是保守性的，如下所定义。与不具有耐受取代的TCR相比，耐受取代可导致对SLLMWITQC HLA-A*02复合物的亲和性降低。亲和性的降低可以是无耐受取代的TCR的5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％。亲和性的降低不会导致亲和性小于(即弱于)50μm。
本发明的TCR还可以包括一个或多个保守取代，其具有相似的氨基酸序列和/或保持相同功能。本领域技术人员知道具有相似的性质因此而“保守的”各种氨基酸。蛋白质、多肽或肽的一个或多个此类氨基酸通常可被一个或多个其他此类氨基酸取代，而不会消除该蛋白质、多肽或肽的期望活性。
因此，氨基酸中的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可以互相取代(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的取代中，优选使用甘氨酸和丙氨酸来互相取代(因为它们具有相对短的侧链)并且缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸被用于互相取代(因为它们具有较大的疏水性脂肪族侧链)。其他可经常互相取代的氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
这种性质的取代常被称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。因此，本发明延伸至包含上述氨基酸序列但在序列中具有一个或多个保守取代的TCR的使用，使得TCR的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、6-12或51的氨基酸1-117和/或SEQ ID NO：3、13-23或52的氨基酸1-115具有至少90％一致性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
α链可变结构域和β链可变结构域的特定组合可以是：
α链可变结构域 β链可变结构域
SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：18
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：18
(表11)
相对于上述序列的氨基酸改变，可以使用任何合适的技术来获得，例如，通过使用定点诱变或固态合成。
应该认识到，可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行本发明范围内的氨基酸取代。例如，本申请构思了丙氨酸上的甲基可以被乙基取代，和/或可以对肽骨架进行微小改变。无论是否使用天然或合成的氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。
本领域已知的“一致性”，是通过序列比对所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，一致性也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过这些序列的片段之间的匹配所确定。虽然存在许多方法来测量两个多肽或两个多核苷酸序列之间的一致性，但是通常用于确定一致性的方法已被编入计算机程序中。用于确定两个序列之间的一致性的优选计算机程序包括但不限于GCG程序包((Devereux,et al.,Nucleic Acids Research,12,387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul et al.,J.Molec.Biol.215,403(1990))。
可以使用CLUSTAL程序等程序来比较氨基酸序列。这个程序比较氨基酸序列，并通过在任一序列中适当地插入间隔来找到最佳比对。为了获得最佳比对，可以计算氨基酸一致性或相似性(一致性加上氨基酸类型的保守性)。像BLASTx这样的程序对齐最长的相似序列，并为该拟合赋值。因此该比较可以获得发现若干相似区域、每个区域具有不同的分数。两种类型的一致性分析均包含在本发明的构思内。
两种氨基酸序列或两种核酸序列的一致性百分比，可通过将序列以最优化对照目的(例如，可以在第一序列中引入间隔来得到与序列的最佳比对)进行比对，并比较对应位点上的氨基酸残基或核苷酸。“最佳比对”是两条序列之间获得最高一致性百分比的比对。一致性百分比的测定是通过被比序列中的相同氨基酸残基或核苷酸的数目来确定的(即，％一致性＝一致位点数目/位点总数目X 100)。
两条序列之间的一致性百分比的测定，可以通过使用本领域技术人员所知的数学算法来完成。用于比对两条序列的数学算法的例子之一，为Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，并在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改进。Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序包含了所述算法。可以用NBLAST程序(score＝100,wordlength＝12)来执行BLAST核酸检索，得到与核酸分子同源的核酸序列。可以用XBLAST程序(score＝50,wordlength＝3)来执行BLAST蛋白检索，得到与本发明使用的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比对目的的空位比对，可以使用GappedBLAST，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。可选地，可以使用PSI-Blast来执行重复检索，以检测分子(Id.)之间的远缘关系。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于序列比对的数学算法的另一例子为Myers和MillerCABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(版本2.0)是CGC序列比对软件包的一部分，包含了所述算法。本领域所知的用于序列分析的其他算法包括如Torellis and Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.,10:3-5所述的ADVANCE和ADAM，以及如Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8所述的FASTA。在FASTA中，ktup是一个控制选项，用于设定检索的敏感性和速度。
可以使用任何合适的方法进行突变，所述方法包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)、限制酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)步骤的方法。这些方法在许多标准分子生物学文本中都有详细描述。有关聚合酶链式反应(PCR)和基于限制酶的克隆的更多细节，参见Sambrook&Russell，(2001)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第3版)CSHLPress。有关连接独立克隆(LIC)程序的更多信息可以在Rashtchian,(1995)Curr OpinBiotechnol 6(1):30-6中找到
第二方面的TCR可以包含α链框架2(FM2)区和α链框架3(FM3)区，其中，FM2和FM3区分别包含SEQ ID NO：47和48，和/或含有一个或多个保守取代和/或至多三个耐受取代。
第二方面的TCR可以包含β链FM2区和β链FM3区域，其中，FM2和FM3区分别包含SEQID NO：49和50，和/或含有一个或多个保守取代和/或至多三个耐受取代。
第二方面的TCR可包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-117和/或SEQ ID NO：3的氨基酸1-115，其分别可含有一个或多个保守取代和/或至多三个容忍突变和/或表1或表2中定义的一种或多种突变。
本发明的TCR具有结合SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的性质。已发现本发明的TCR相对于其他无关表位对此表位具有高度特异性，因此特别适合作为用于将治疗剂或可检测标记物递送至细胞的靶向载体。在本发明的TCR背景下的特异性涉及其识别对肽SLLMWITQC阳性的HLA-A*02靶细胞且同时识别对该肽阴性的HLA-A*02靶细胞的能力最小的能力。为了测试特异性，TCR可以是可溶形式和/或可以在T细胞表面表达。识别可以通过测量存在TCR和靶细胞时的T细胞活化水平来确定。在这种情况下，肽阴性靶细胞的最小识别定义为低于在相同条件下测量且存在肽阳性靶细胞时产生水平的20％，优选10％，更优选5％的T细胞活化水平。对于本发明的可溶性TCR，可以在治疗相关的TCR浓度下测定特异性。治疗相关浓度可以定义为10-9M或更低的TCR浓度，和/或至多相应EC50值的100或1000倍的浓度。肽阳性细胞可以通过肽脉冲获得，或者更优选地，它们可以天然存在所述肽。优选地，肽阳性和肽阴性细胞都是人细胞。例如，可以在例如实施例6-8中描述的细胞测定中测量特异性。例如，如Biacore所测定，特异性可以另外涉及结合至NY-ESO-1-HLA-A*02复合物而不是多个天然存在的肽HLA复合物的能力。优选地，与NY-ESO-1-HLA-A*02复合物的结合比与其他天然存在的肽HLA复合物的结合至少高400倍。
本发明的TCR对NY-ESO-1-HLA-A*02复合物可具有大于(即，强于)50μM的KD，例如50μM和1pM之间。本发明的某些TCR对复合物可具有约1pM至约50nM，约1pM至约400pM，约20pM至约200pM的KD。本发明的TCR对复合物可具有约1秒至约60小时或更长时间，约30分钟至约60小时或更长时间，或约6小时至约60小时或更长时间的结合半衰期(T1/2)。当与可检测标记物或治疗剂偶联时用作可溶性治疗剂和/或诊断剂的TCR，对所述复合物优选具有如使用实施例3的BIAcore方法所测定为约1pM至约200pM或约20pM至约100pM的KD，和/或对复合物具有使用实施例3的BIAcore方法所测定的约2小时至60小时或更长时间或约20小时至约60小时或更长时间的结合半衰期。本发明的某些TCR可适用于过继性治疗应用；这种TCR对复合物可具有约50nM至约50μM，或约100nM至约1μM的KD，和/或对复合物具有约3秒至约12分钟的结合半衰期。
本发明的某些TCR对SLLMWITQC-HLA-A*02复合物具有大幅高于天然TCR的结合亲和性和/或结合半衰期。增加天然TCR的结合亲和性通常会降低TCR对其肽-MHC配体的特异性，这在Zhao Yangbing et al.,The Journal of Immunology,The AmericanAssociation of Immunologists,US,vol.179,No.9,1November 2007,5845-5854中证实。然而，本发明的TCR可以保持对SLLMWITQC-HLA-A*02复合物的特异性，尽管具有远高于天然TCR的结合亲和性。
可以使用本申请实施例3的表面等离子体共振(BIAcore)和/或Octet方法测定结合亲和性(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应该认识到，TCR的亲和性加倍导致KD减半。T1/2计算为ln2除以解离率(koff)。因此，T1/2加倍导致koff减半。对TCR的KD和koff值的测量通常是对TCR的可溶形式进行，即对截短以去除细胞质结构域和跨膜结构域残基的形式。优选使用相同的测定方案多次测量给定TCR的结合亲和性或结合半衰期，例如3次或更多次，并取结果的平均值。
为了用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂，TCR可以是可溶形式(即，不具有跨膜或胞质结构域)。为了稳定性，例如WO 03/020763中所述，本发明的TCR，优选为可溶性αβ异二聚体TCR，可以在各个恒定结构域的残基之间引入二硫键。存在于本发明的αβ异二聚体的恒定结构域之一或两者可以在C端阶段例如至多15，或至多10或至多8或更少个氨基酸。α链细胞外恒定区的C端可以截短8个氨基酸。为了用于过继性治疗，可以例如将αβ异二聚体TCR转染为具有细胞质结构域和跨膜结构域的全长链。用于过继性治疗的TCR可以包含与相应的α和β恒定结构域之间的天然二硫键相对应的二硫键，额外地或可选地，可以存在非天然二硫键。
本发明的TCR可以是αβ异二聚体或可以是单链形式。单链形式包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ或Vα-L-Vβ-Cβ型的αβTCR多肽，其中，Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，L是接头序列。在某些实施例中，本发明的单链TCR可以在各个恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如WO 2004/033685中所述。WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanz et al.(1998)J Immunol Methods 221(1-2):59-76；Hoo etal.(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89(10):4759-4763；Schodin(1996)Mol Immunol33(9):819-829)进一步描述了单链TCR。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，有可能在所提供序列的C端和/或N端截短1、2、3、4、5或更多个残基，而基本不影响TCR的结合特性。所有这些细微变体都包含在本发明中。
本发明的α-β异二聚体TCR通常包含α链TRAC恒定结构域序列和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。可通过截短或取代来修饰α和β链恒定结构域序列，以删除TRAC外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键。还可以通过半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57，来修饰α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸形成TCR的α和β恒定结构域之间的二硫键。
在一个进一步的方面，本发明提供了编码本发明第一和/或第二方面的TCR的核酸。在一些实施例中，所述核酸是cDNA。在一些实施例中，本发明提供了包含编码本发明TCR的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施例中，本发明提供了包含编码本发明TCR的β链可变结构域的序列的核酸。核酸可以是非天然的和/或纯化的和/或工程化的。
在另一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。优选地，所述载体是TCR表达载体。
本发明还提供了携带本发明载体的细胞，优选TCR表达载体。载体可以包含编码在单个开放阅读框中或α链和β链分别编码在两个不同的开放阅读框中的本发明核酸。另一方面提供携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本发明TCR的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明TCR的β链的核酸。这种细胞在过继性治疗中特别有用。本发明的细胞可以是分离的和/或重组的和/或非天然存在的和/或工程化的。
由于本发明的TCR可用于过继性治疗，本发明包括呈递本发明的TCR的非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，特别是T细胞。本发明还提供了呈递本发明的TCR的T细胞的扩增群体。有许多用于以编码本发明TCR的核酸(如DNA、cDNA或RNA)转染T细胞的适宜方法(参见例如Robbins et al.,(2008)J Immunol.180:6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞适用于癌症的基于过继性疗法的治疗。如本领域技术人员将知晓，存在许多可以进行过继性治疗的合适方法(参见例如Rosenberg et al.,(2008)Nat Rev Cancer 8(4):299-308)。
本发明的可溶性TCR可用于将可检测标记物或治疗剂递送至含抗原呈递细胞的抗原呈递细胞和组织。因此，它们可以与可检测标记物(用于诊断目的，其中，TCR用于检测呈递SLLMWITQC-HLA-A*02复合物的细胞的存在)；治疗剂；或PK修饰部分(例如通过PEG化)相关联(共价或其他方式)。
用于诊断目的的可检测标记物，包括例如荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针和造影剂。
可能与本发明的TCR相关联的治疗剂包括免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化学治疗剂(例如顺铂)。为了确保毒性效应在期望的位置进行，毒素可以在与TCR连接的脂质体内部，使得化合物缓慢释放。这将防止体内运输过程中的破坏性作用，并确保毒素在TCR与相关抗原呈递细胞结合后具有最大效应。
其他合适的治疗剂包括：
·小分子细胞毒素剂，即具有杀死分子量小于700道尔顿的哺乳动物细胞的能力的化合物。这些化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应该理解，这些小分子细胞毒素剂还包括药物前体，即在生理条件下衰变或转化以释放细胞毒素剂的化合物。这些药物的例子包括顺铂、美登素(maytansine)衍生物、雷卡霉素(rachelmycin)、加利车霉素(calicheamicin)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、美法仑(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、索菲莫德索替芬II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺(temozolomide)、拓扑替康(topotecan)、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥瑞斯他汀E长春新碱(auristatin E vincristine)和多柔比星(doxorubicin)；
·肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；
·放射性核素，即随着同时发射α或β粒子或γ射线中的一种或多种而衰变的元素的不稳定同位素。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；螯合剂可用于促进这些放射性核素与高亲和性TCR或其多聚体的缔合；
·免疫刺激剂，即刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子如IL-2和IFN-γ，
·超抗原及其突变体；
·TCR-HLA融合物，例如融合至肽-HLA复合物，其中，所述肽源自普通人类病原体，例如爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)；
·趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白等；
·抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；
·具有抗体样结合特征的替代性蛋白质支架
·补体激活剂；
·异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
一个优选的实施例由TCR抗CD3融合物提供，所述TCR抗CD3融合物包含本发明的TCR和与其联合(通常通过融合至α或β链的N或C端)的抗CD3抗体或所述抗CD3抗体的功能性片段或变体。(这种TCR抗CD3融合物可称为ImmTACTM分子)如本申请所用，术语TCR涵盖TCR融合物，例如TCR抗CD3融合物。如本申请所用，术语“抗体”涵盖这种片段和变体。抗CD3抗体的例子包括但不限于OKT3、UCHT-1、BMA-031和12F6。适用于本申请所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微型抗体、Fab片段、F(ab')2片段、dsFv和scFv片段、纳米抗体TM(这些构建体由Ablynx(比利时)销售，其包含衍生自骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体的合成单免疫球蛋白可变重链结构域和结构域抗体(Domantis(比利时)，其包含亲和性成熟的单免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域)或展现抗体样结合特性的可选蛋白质支架，例如Affibody(Affibody(瑞典)，其包含工程化蛋白A支架)或Anticalins(Pieris(德国))，其包括工程化的anticalins)，略举数例。
TCR和抗CD3抗体的连接可以是直接连接的，或通过接头序列间接连接。接头序列通常是柔性的，因为它们主要由氨基酸组成，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，所述氨基酸不具有可能限制柔性的庞大侧链。易于确定接头序的可用或最佳长度列。通常接头序列长度小于约12，例如小于10，或5-10个氨基酸。可以在本发明的TCR抗CD3融合物中使用的合适的接头包括但不限于：GGGGS(SEQ ID NO：24)、GGGSG(SEQ ID NO：25)、GGSGG(SEQ ID NO：26)、GSGGG(SEQ ID NO：27)、GSGGGP(SEQ ID NO：28)、GGEPS(SEQ ID NO：29)、GGEGGGP(SEQ IDNO：30)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID NO：31)(如WO2010/133828所述)。
本发明的抗CD3-TCR融合构建体的具体实施例包括下表中所示的α和β链配对。
(表7)
特别优选的抗CD3-TCR融合物包含α链SEQ ID NO：37和β链SEQ ID NO：38。
出于某些目的，本发明的TCR可以聚集成复合物，其包含数个TCR以形成多价TCR复合物。有许多人类蛋白质含有可用于生产多价TCR复合物的多聚化结构域。例如已用于生产scFv抗体片段四聚体的p53的四聚化结构域，与单体scFv片段相比，其表现出增加的血清持久性和显著降低的解离速率(Willuda et al.(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白还有可用于这种应用的四聚化结构域。与本发明的非多聚体野生型或T细胞受体异二聚体相比，本发明的多价TCR复合物可以对SLLMWITQC-HLA-A*02复合物具有增强的结合能力。因此，本发明的TCR多价复合物也包括在本发明内。根据本发明所述的这种多价TCR复合物特别适用于在体外或体内跟踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作产生具有这种用途的其他多价TCR复合物的中间体。
如本领域中众所周知，TCR可能会受到翻译后修饰。糖基化就是这样一种修饰，其包括寡糖部分与TCR链中限定的氨基酸的共价连接。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是众所周知的寡糖附着位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于许多因素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价键和总附着数)可影响蛋白质功能。因此，在生产重组蛋白时，通常需要控制糖基化。受控糖基化已被用于促进基于抗体的治疗剂(Jefferis R.,Nat Rev Drug Discov.2009Mar；8(3):226-34)。对于本发明的可溶性TCR，可通过体内例如使用特定细胞系或体外通过化学修饰控制糖基化。这种修饰是期望的，因为糖基化可以促进药物动力学，降低免疫原性并更近似地模拟天然人蛋白质(Sinclair AM and Elliott S.,Pharm Sci.2005Aug；94(8):1626-35)。
为了对患者给药，本发明的TCR或TCR抗CD3融合物(优选与可检测标记物或治疗剂相关或在转染的T细胞上表达)或本发明的细胞可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起以药物组合物提供。根据本发明所述的治疗性或成像TCR、TCR融合物或细胞，通常作为无菌药物组合物的一部分提供，该组合物通常包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于将向患者给药的所需方法)。它可以以单位剂量形式提供，通常提供在密封容器中并且可以作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(但不一定)包括使用说明。它可以包括多个所述单位剂量形式。
药物组合物可以通过任何适当的途径给药，例如肠胃外(包括皮下、肌内或静脉内)、肠内(包括口服或直肠)、吸入或鼻内途径。这样的组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合。
本发明物质的剂量可以在宽范围内变化，取决于待治疗的疾病或病症、待治疗的个体的年龄和状况等，本发明的与抗CD3抗体相关的可溶性TCR的合适剂量范围，可以在25ng/kg和50μg/kg之间。合适的使用剂量由医生最终确定。
本发明的TCR、药物组合物、载体、核酸和细胞可以以基本纯的形式提供，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。
本发明还提供了：
·本发明的TCR、TCR抗CD3融合物、核酸或细胞，用于医学且优选用于治疗癌症的方法中；
·本发明的TCR，TCR抗-CD3融合体，核酸或细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途；
·治疗患者的癌症的方法，包括对患者以本发明的TCR、TCR抗-CD3融合物、核酸或细胞给药。
待治疗的癌症可以是滑膜肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、乳房肿瘤、卵巢肿瘤、食道肿瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌和头颈部肿瘤。
本发明的每个方面中的优选特征，可在变更必要的细节的基础上用于其他方面。本申请中提到的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入本申请。
以下参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明，其中：
图1提供了本发明的天然α和β链可变结构域的细胞外区的氨基酸序列；
图2提供了本发明的天然α和β链的可溶性细胞外区的氨基酸序列；
图3提供了本发明的突变的TCRα链可变区的氨基酸序列；
图4提供了本发明的突变的TCRβ链可变区的氨基酸序列；
图5提供了包含本发明的TCR序列的ImmTAC分子的氨基酸序列；
图6提供了包含本发明的TCR序列的ImmTAC分子的氨基酸序列；
图7提供了包含本发明的TCR序列的ImmTAC分子的氨基酸序列；
图8提供了包含本发明的TCR序列的ImmTAC分子的氨基酸序列；
图9显示了本发明的ImmTAC分子的有效和特异性结合；
图10显示了本发明的2种ImmTAC分子的进一步效力测试；
图11显示了本发明的3种ImmTAC分子的进一步特异性测试；和
图12显示了通过ImmTAC重定向T细胞杀死肿瘤细胞。
实施例
实施例1-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化
使用标准方法将编码本发明的可溶性TCR的α和β细胞外区的DNA序列分别克隆到基于pGMT7的表达质粒中(如Sambrook,et al.Molecular cloning.Vol.2.(1989)NewYork:Cold spring harbor laboratory press所描述)。将表达质粒分别转化到大肠杆菌菌株Rosetta(BL21pLysS)中，令单氨苄青霉素抗性菌落在TYP(+氨苄青霉素100μg/ml)培养基中于37℃生长至OD600为约0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时通过离心收集细胞。根据制造商的说明书，用BugBuster蛋白提取试剂(Merck Millipore)裂解细胞团块。通过离心回收包涵体团块。用Triton缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.1，0.5％Triton-X100，100mM NaCl，10mM NaEDTA)洗涤团块两次，最后重悬浮于不含去垢剂的缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.1,100mM NaCl，10mM NaEDTA)。通过用6M盐酸胍溶解并测量OD280来定量包涵体蛋白产量。然后使用消光系数计算蛋白质浓度。通过用8M尿素溶解并在还原条件下在4％至20％SDS-PAGE上加载～2μg来测量包涵体纯度。然后使用密度测定软件(Chemidoc，Biorad)估计或计算纯度。包涵体在+4℃下短期储存并在-20℃或-70℃下长期储存。
对于可溶性TCR重折叠，首先将含有α和β链的包涵体混合并稀释到10ml增溶/变性缓冲液(6M盐酸胍，50mM Tris HCl pH 8.1,100mM NaCl，10mM EDTA，20mM DTT)中，随后在37℃下培养30分钟。通过进一步稀释到1L重折叠缓冲液(100mM Tris pH 8.1,400mM L精氨酸HCL，2mM EDTA，4M尿素，10mM半胱胺盐酸盐和2.5mM胱胺二盐酸盐)中来启动重折叠，并将该溶液充分混合。将重折叠混合物在5℃±3℃下以10L H2O透析18-20小时。此后，将透析缓冲液用10mM Tris pH 8.1(10L)替换两次，并继续透析另外15小时。然后将再折叠混合物通过0.45μm纤维素滤器过滤。
可溶性TCR的纯化始于通过将透析后的重折叠加载至50HQ阴离子交换柱，并且使用纯化器(GE Healthcare)用20mM Tris pH 8.1中的0-500mM NaCl梯度以50柱体积洗脱结合的蛋白(GE Healthcare)。通过SDS PAGE鉴定峰TCR级分，然后将其合并及浓缩。然后将浓缩的样品加载至以Dulbecco's PBS缓冲液预平衡的75HR凝胶过滤柱(GE Healthcare)。合并峰值TCR级分并浓缩，并计算纯化物质的最终产率。
实施例2-ImmTAC分子(可溶性TCR抗CD3融合蛋白)的表达、重折叠和纯化
如实施例1所述制备ImmTAC，不同之处在于TCRβ链通过接头与抗CD3单链抗体融合。此外，在阴离子交换之后进行纯化，纯化期间进行阳离子交换步骤。在这种情况下，将来自阴离子交换的峰级分在20mM MES(pH 6.5)中稀释20倍，并施加到50HS阳离子交换柱上。用20mM MES中的0-500mM NaCl梯度洗脱结合蛋白。合并峰值ImmTAC级分并调节至50mM Tris pH 8.1，然后浓缩并如实施例1中所述直接加载至凝胶过滤基质。
实施例3-结合表征
纯化的可溶性TCR和ImmTAC分子结合至相关肽-HLA复合物的分析，使用BIAcore3000或BIAcore T200仪器通过表面等离子体共振进行、或使用ForteBio Octet仪器通过生物层干涉测量进行。生物素化的I类HLA-A*02分子用目标肽重折叠并使用本领域技术人员已知的方法纯化(O'Callaghan et al.(1999).Anal Biochem266(1):9-15；Garboczi,etal.(1992).Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429-3433)。所有测量均在25℃下在补充有0.005％P20的Dulbecco's PBS缓冲液中进行。
BIAcore
将生物素化的肽-HLA单体固定在链霉亲和素偶联的CM-5传感器芯片上。平衡结合常数使用连续稀释的可溶性TCR/ImmTAC来测定，所述可溶性TCR/ImmTAC以30μl/min的恒定流速在涂覆有～200个响应单位(RU)的肽-HLA-A*02复合物的流动池上注射。通过减去含有不相关肽-HLA的对照流动池的本体缓冲液响应，来对每种TCR浓度的平衡响应进行归一化。通过使用Prism软件的非线性曲线拟合和Langmuir结合等温线获得KD值，bound(结合)＝C*Max/(C+KD)，其中“bound”是在注入的TCR浓度C下RU中的平衡结合，Max是最大结合。
对于高亲和性相互作用，通过单循环动力学分析确定结合参数。将5种不同浓度的可溶性TCR/ImmTAC以50-60μl min-1的流速注射到用约100-200RU肽-HLA复合物包被的流动池上。通常，以100-200nM的最高浓度注射60-120μl可溶性TCR/ImmTAC，并以连续2倍稀释进行其他四次注射。首先注入最低浓度。然后，为了测量解离相，注入缓冲液直至发生≥10％解离，通常在1-3小时后。使用软件计算动力学参数。解离相拟合为单指数衰减方程，可以用于计算半衰期。平衡常数KD由koff/kon计算。
Octet
将生物素化的肽-HLA单体捕获至1nm用链霉亲和素预先固定的(SA)链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio)。传感器用游离生物素(2μM)封闭2分钟。通过将装载好的生物传感器浸入在96孔或384孔样品板中连续稀释的可溶性TCR/ImmTAC中来测定平衡结合常数。平板摇动设定为1000rpm。对于低亲和性相互作用(μM范围)，使用短结合时间(约2分钟)和短解离时间(约2分钟)。使用Octet数据分析软件(Pall ForteBio)，通过减去加载有无关pHLA的参考生物传感器的双参照，来处理结合曲线。在拟合至等式“响应＝Rmax*浓度/(KD+浓度)”的稳定状态图上，使用平衡时的响应(nm)来估计KD值，其中，“响应”是在每种TCR浓度(浓度)下以nm计的平衡结合，并且Rmax是pHLA饱和时的最大结合响应。
对于高亲和性相互作用(nM-pM范围)，动力学参数通过≥3TCR/ImmTAC浓度(通常10nM、5nM和2.5nM)的结合曲线确定。结合时间为30分钟，解离时间1-2小时。通过减去加载有无关pHLA并用生物素封闭的参考生物传感器的双参照，来处理结合曲线。使用Octet数据分析软件(Pall ForteBio)通过全局拟合直接计算结合曲线来计算动力学参数kon和koff。从koff/kon计算KD，并且从t1/2＝0.693/koff计算解离半衰期。
实施例4-本发明的可溶性非突变TCR的结合表征
根据实施例1中所述的方法制备可溶性野生型TCR，并根据实施例3分析其与pHLA的结合。α和β链的氨基酸序列对应于图2所示的氨基酸序列。用野生型(SLLMWITQC)或异源NY-ESO-1肽(SLLMWITQV SEQ ID NO：34)制备可溶性生物素化的HLA-A*02，并将其固定在BIAcore传感器芯片上。KD值分别确定为5.2μM和4.3μM。未检测到对15种无关肽HLA-A*02复合物的显著结合。
这些数据表明TCR以合适的亲和性和特异性与靶标物结合。因此，这些TCR链为识别本发明的其他TCR提供了有用的支架。
实施例5-结合表征本发明的可溶性高亲和性TCR和ImmTAC分子
如实施例1和2所述制备可溶性突变TCR和ImmTAC分子，并根据实施例3测定其结合特性。相对于图2所示的CDR序列(SEQ ID NO：41至46)，TCRα和/或β链在至少一个CDR区中包含突变。图4和5中分别提供了本发明的某些突变的TCRα和β链可变区的氨基酸序列。下表提供了包含所示的α和β可变区的可溶性TCR和/或ImmTAC分子的结合特征。使用变态NY-ESO-1肽(SLLMWITQV)测量结合。
nd＝未测定。
1对应于来自实施例6的ImmTAC1，图5中提供了完整的α和β链序列
2对应于来自实施例6的ImmTAC2，图6中提供了完整的α和β链序列
3对应于来自实施例6的ImmTAC3，图7中提供了完整的α和β链序列
4对应于来自实施例6的ImmTAC4，图8中提供了完整的α和β链序列
这些数据表明本发明的TCRα和β链序列产生了具有适合开发免疫治疗剂的结合特征的可溶性TCR和ImmTAC分子。
实施例6-通过本发明的ImmTAC分子进行的有效的特异性T细胞重定向
使用干扰素-γ(IFN-γ)分泌作为T细胞激活的读数，通过ELISPOT测定来测试含有本发明的α和β可变链序列的ImmTAC分子有效特异性介导CD3+T细胞重定向的能力。
图5-8中提供了所测试的四种ImmTAC分子的α和β链的序列。
使用人IFN-γELISPOT试剂盒(BD Biosciences)进行测定。在测定培养基(含有10％热灭活的FBS和1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的RPMI 1640)中以1x106/ml的密度制备靶细胞，并以每孔50μl体积50,000个细胞铺板。本例中使用以下靶细胞系：
·NCI-H1755(NY-ESO-1+ve；HLA-A*02+ve)人肺癌细胞系(由ATCC提供，目录号：CRL-5892)
·HAo5(NY-ESO-1+ve；HLA-A*02+ve)人心脏细胞(由Promocell提供，目录号：C-12271)
使用从新鲜供体血液中分离的外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞并以每孔50μl体积40,000个细胞的浓度铺板。使用不同浓度的ImmTAC，覆盖预期的临床相关范围，并以50μl的体积添加到孔中。
根据制造商的说明书制备板。将靶细胞、效应细胞和ImmTAC分子加入到相关的孔中，并用测定培养基补足至终体积为200μl。所有反应一式三份进行。还制备了对照孔，其中省去了ImmTAC、效应细胞或靶细胞。然后将板培养过夜(37℃/5％CO2)。第二天，用洗涤缓冲液(1xPBS小袋，含有0.05％P20，在去离子水中配制)将板洗涤三次。然后将初级检测抗体以50μl的体积加入到每个孔中。将板在室温下培养2小时，然后再次洗涤三次。通过向各孔中加入50μl稀释的链霉亲和素蛋白-HRP，在室温下培养1小时，并重复洗涤步骤，来进行二次检测。然后用200μl PBS(pH 7.4)将板洗涤两次。在使用前不超过15分钟，向每1ml AEC底物中加入一滴(20μl)AEC生色团并混合，并向每个孔中加入50μl。定期监测点显影，并将板在自来水中洗涤以终止显影反应。然后在室温下干燥板至少2小时，然后使用具有免疫印迹软件的CTL分析仪(Cellular Technology Limited)计算斑点。
图9中呈现的数据显示，含有本发明的α和β可变链序列的ImmTAC分子，能够介导对表达靶抗原的HLA-A*02+ve癌细胞的有效T细胞重定向。未观察到对HLA-A*02+ve抗原阴性细胞的活性。这些数据表明ImmTAC分子在临床相关浓度范围(≤1nM)内是对靶细胞有特异性的。
对ImmTAC分子3和4进行有效性的进一步评估以确定EC50值。如上所述进行ELISpot测定，其中ImmTAC浓度范围在10-13M至10-8M。使用Prism 5.0软件(GraphPad)分析数据以计算EC50值。ImmTAC分子3和4的值分别确定为95pM和121pM(图10)。这些数据证实了这些ImmTAC分子介导有效重定向T细胞应答的能力。
实施例7-对本发明的ImmTAC分子的进一步特异性检测
对一组正常细胞进行ImmTAC分子的进一步特异性测试。在本实施例中使用ImmTAC分子2-4(图6-8)。干扰素-γ(IFN-γ)分泌被用作T细胞激活的读数。
使用IFN-γDuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems，目录号：DY285)按照制造商的指示进行测定。简而言之，将IFN-γ稀释至10,000pg/ml并进行2倍稀释以产生标准曲线。对靶细胞进行计数，并在测定培养基中以10μl体积10,000个细胞/孔铺板。稀释ImmTAC分子以使每孔10ul的终浓度为2nM和1nM。还制备了没有ImmTAC的对照样品。将效应PBMC解冻并以10ul体积10，000个细胞/孔铺板。培养板48小时后显影并读数。
在本实施例中，NCI-H1755细胞用作抗原阳性对照，而HTC-116细胞用作抗原阴性对照。细胞组包括心肌细胞(CM12、CM5和CM10)、主动脉内皮细胞(HAo5)、气道上皮细胞(HCAEC2和HCAEC5)骨骼肌成肌细胞(HSkMM3)和HPF9细胞。所有细胞系都是HLA-A*02+ve。测试按一式三份地进行。
图11中呈现的数据证明在治疗相关的ImmTAC浓度范围内，相对于抗原阳性癌细胞系，存在来源于正常组织的细胞系时最小的IFN-γ产量。这些数据表明本发明的ImmTAC分子具有高水平的特异性，因此特别适用于治疗用途。
实施例8-通过ImmTAC重定向的T细胞有效杀死肿瘤细胞
使用IncuCyte平台(Essen BioScience)研究本发明的ImmTAC分子介导有效重定向T细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞的能力。该测定允许通过显微镜检测凋亡标志物Caspase-3/7的释放来实时检测。
使用CellPlayer96孔Caspase-3/7细胞凋亡测定试剂盒(Essen BioScience，目录号4440)按照制造商的指示进行测定。简而言之，将靶细胞(NCI-H1755-NYESO+ve HLA A*02+ve或HCT-116-NYESO-ve HLA A*02+ve)以每孔5000个细胞铺板并培养过夜，以使它们粘附。制备ImmTAC溶液，浓度在2.16nM和8.8pM之间。将25ul的各浓度添加到相关的孔中。使用PBMC作为效应细胞并以每孔50ul 50,000个铺板。还制备了没有ImmTAC的对照样品。制成30μMNucView测定试剂，并向每个孔中加入25μl(最终浓度为5μM)。将板放入IncuCyte仪器中，并在3天内每2小时(每孔1个图像)成像。确定每个图像中凋亡细胞的数量并记录为每平方毫米目标数。测试按一式三份地进行。
图12所示数据显示了通过ImmTAC重定向的T细胞实时杀死肿瘤细胞。如图所示为ImmTAC3和ImmTAC4的结果。两种ImmTAC分子均在低至26pM的浓度下显示出T细胞重定向杀伤抗原阳性肿瘤细胞。ImmTAC3在低于10pM时显示T细胞重定向杀伤。仅在最高浓度(2.16nM)处观察到抗原阴性细胞的低水平杀伤。
这些数据证实ImmTAC3和immTAC4在治疗相关浓度范围内介导有效的重定向T细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞。
序列表
<110> 英美偌科有限公司
<120> NY-ESO-1肿瘤抗原HLA-A*02复合物的特异性T细胞受体
<130> P100579WO
<150> 1522592.3
<151> 2015-12-22
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 9
<212> PRT
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<212> PRT
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<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant beta chain (b67l)
<400> 21
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35 40 45
Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50 55 60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant beta chain (b68)
<400> 22
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35 40 45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50 55 60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant beta chain (b68l)
<400> 23
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala Met Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr
35 40 45
Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50 55 60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 25
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 26
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 28
Gly Ser Gly Gly Gly Pro
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 29
Gly Gly Glu Pro Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 30
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 31
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC alpha chain (comprising SEQ ID NO: 7(a24) and the constant
domain of SEQ ID NO: 4, truncated by 8 amino acids)
<400> 32
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85 90 95
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100 105 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115 120 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130 135 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180 185 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195 200
<210> 33
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC beta chain (comprising an anti-CD3 scFv fused via a
linker to a TCR beta chain comprising SEQ ID NO: 15(b52)
and the constant domain of SEQ ID NO: 3)
<400> 33
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260 265 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290 295 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305 310 315 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325 330 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340 345 350
Val Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355 360 365
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370 375 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385 390 395 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405 410 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420 425 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450 455 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465 470 475 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485 490 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heteroclitic NY-ESO-1 peptide
<400> 34
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5
<210> 35
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC alpha chain (comprising SEQ ID NO: 7(a24) and the constant
domain of SEQ ID NO: 4, truncated by 8 amino acids)
<400> 35
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85 90 95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115 120 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130 135 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180 185 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195 200
<210> 36
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC beta chain (comprising an anti-CD3 scFv fused via a linker
to a TCR beta chain comprising SEQ ID NO: 18(b65) and the
constant domain of SEQ ID NO: 5)
<400> 36
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260 265 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290 295 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305 310 315 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325 330 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340 345 350
Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355 360 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370 375 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385 390 395 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405 410 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420 425 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450 455 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465 470 475 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485 490 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210> 37
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC alpha chain (comprising SEQ ID NO: 12(a82) and the
constant domain of SEQ ID NO: 4, truncated by 8 amino acids)
<400> 37
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Leu Gly Asp Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50 55 60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85 90 95
Arg Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115 120 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130 135 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180 185 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195 200
<210> 38
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC beta chain (comprising an anti-CD3 scFv fused via a linker
to a TCR beta chain comprising SEQ ID NO: 15(b52) and the
constant domain of SEQ ID NO: 5)
<400> 38
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260 265 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290 295 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Gly Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305 310 315 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325 330 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340 345 350
Val Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355 360 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370 375 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385 390 395 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405 410 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420 425 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450 455 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
465 470 475 480
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
485 490 495
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
500
<210> 39
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC alpha chain (comprising SEQ ID NO: 12(a82) and the
constant domain of SEQ ID NO: 4, truncated by 8 amino acids)
<400> 39
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85 90 95
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100 105 110
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
115 120 125
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
130 135 140
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
145 150 155 160
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
165 170 175
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
180 185 190
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195 200
<210> 40
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ImmTAC beta chain (comprising an anti-CD3 scFv fused via a linker
to a TCR beta chain comprising SEQ ID NO: 18(b65) and the
constant domain of SEQ ID NO: 5)
<400> 40
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln
260 265 270
Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile
290 295 300
Ala Thr Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val
305 310 315 320
Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu
325 330 335
Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser
340 345 350
Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
355 360 365
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
370 375 380
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
385 390 395 400
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
405 410 415
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
420 425 430
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg
450 455 460
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
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500
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Val Ser Gly Asn Pro Tyr
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Cys Ala Val Arg Asp Ile Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr
1 5 10 15
Phe
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ser Gln Val Thr Met
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Ala Asn Gln Gly Ser Glu Ala
1 5
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Cys Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys
<210> 48
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser
1 5 10 15
Phe His Leu Lys Lys Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
20 25 30
Phe
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 50
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro
1 5 10 15
Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp
20 25 30
Ser Ser Ile Tyr Leu
35
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant alpha chain (a86)
<400> 51
Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Leu Thr Asp Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu
50 55 60
Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser
65 70 75 80
Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile
85 90 95
Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Val Ile Pro
115
<210> 52
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant beta chain (b71)
<400> 52
Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly
1 5 10 15
Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Ala Met Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr
35 40 45
Ala Trp Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp
50 55 60
Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly
85 90 95
Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115

Claims (46)

1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物的性质且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，
所述α链可变结构域包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-117具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性，和/或
所述β链可变结构域包含与SEQ ID No：3的氨基酸1-115具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
2.一种TCR，其以大于50μM的亲和性结合至SLLMWITQC(SEQ ID NO：1)HLA-A*02复合物，其中：α链CDR1、2和3分别包含SEQ ID NO：41、42和43，和/或β链CDR 1、2和3分别包含SEQ IDNO：44、45和46，和/或至少一个所述CDR含有相对于SEQ ID NO：41至46的一个或多个保守取代；和/或至少一个所述CDR含有相对于SEQ ID NO：41至46的至多三个耐受取代。
3.根据权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域参照SEQ ID NO：2的编号具有以下至少一个突变：
残基编号 I51 L T52 G G53 D D54 S N55 A D95 S I96 S N97 D或R S98 Q G99 H
和/或β链可变结构域参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一个突变：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域参照SEQID NO：2的编号具有2至6个以下突变：
和/或所述β链可变结构域参照SEQ ID NO：3的编号具有3至9个以下突变：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域具有以下至少一组突变：
第1组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A
第2组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97D
第3组：I51L、T52G、G53D、D54S、N55A、N97R
第4组：I96S、N97D、S98Q、G99H
第5组：D95S、I96S、N97R、S98Q、G99H
第6组：I51L、G53D；
和/或所述β链可变结构域具有以下至少一组突变：
第1组：N50W、Q51T、S53G
第2组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G
第3组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T、S53G、G100A
第4组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T
第5组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G
第6组：S27K、Q28R、V29L、T30A、N50W、Q51T、S53G、G100A
第7组：S27K、Q28R、V29L、T30A、M31L、N50W、Q51T
第8组：T30A、N50W、G100A。
6.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域和所述β链可变结构域分别具有以下至少一组突变：
7.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域参照SEQID NO：2的编号具有以下至少一个突变：
残基编号 Q10 L
和/或所述β链可变结构域参照SEQ ID NO：3的编号具有以下至少一个突变：
8.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，在所述α链可变结构域中，氨基酸残基27-32、50-57和91-107的序列选自以下：
9.根据权利要求8所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含与SEQ ID No：12具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％一致性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于,在所述α链可变结构域中，氨基酸残基27-31、49-55和93-106的序列选自以下：
11.根据前述权利要求10所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含与SEQ IDNO：15具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％一致性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，氨基酸残基27-32、50-57和91-107的α链可变结构域序列和氨基酸残基27-31、49-55和93-106的β链可变结构域序列选自以下：
13.根据前述权利要求12所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含与SEQ IDNO：12具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％一致性，并且所述β链可变结构域包含与SEQ ID NO：15具有至少90％一致性的氨基酸序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域选自氨基酸序列SEQ ID NO：6-12或51，并且所述β链可变结构域选自氨基酸序列SEQ ID NO：13-23或52。
15.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域和所述β链可变结构域分别选自以下至少一组突变：
16.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR是α-β异源二聚体，其具有α链TRAC恒定结构域序列和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。
17.根据权利要求16所述的TCR，其特征在于，通过截短或取代修饰α和β链恒定结构域序列，以删除TRAC外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然二硫键。
18.根据权利要求16或17所述的TCR，其特征在于，通过半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57来修饰α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸形成TCR的α和β恒定结构域之间的非天然二硫键。
19.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，其是Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα,Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型的单链形式，其中Vα和Vβ分别为TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别为TCRα和β恒定区，L为接头序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，其与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相关联。
21.一种TCR抗CD3融合物，其包含前述权利要求中任一项所述的TCR和与TCR的α或β链的C端或N端共价连接的抗CD3抗体。
22.根据权利要求21所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，其包含选自SEQ ID NO：6-12或51的α链可变结构域和包含选自SEQ ID NO：13-23或52的β链可变结构域。
23.根据权利要求22所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，所述β链通过接头序列与抗CD3抗体序列连接。
24.根据权利要求23所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，所述接头序列选自GGGGS(SEQ ID NO：24)、GGGSG(SEQ ID NO：25)、GGSGG(SEQ ID NO：26)、GSGGG(SEQ ID NO：27)、GSGGGP(SEQ ID NO：28)、GGEPS(SEQ ID NO：29)、GGEGGGP(SEQ ID NO：30)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID NO：31)。
25.根据权利要求24所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，其包含与下表所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的α和β链，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性：
26.根据权利要求25所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，其包含由SEQ ID NO：37组成的α链和由SEQ ID NO：38组成的β链。
27.根据权利要求21至24中任一项所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，其包含由SEQID NO：12的氨基酸序列组成的α链可变结构域和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的β链可变结构域，其中，所述β链通过接头序列与抗CD3抗体连接。
28.根据权利要求21至24中任一项所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，其包含由SEQID NO：12的氨基酸序列组成的α链可变结构域和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的β链可变结构域，其中，所述α链通过接头序列与抗CD3抗体连接。
29.根据权利要求28所述的TCR抗CD3融合物，其特征在于，所述α链可变结构域由SEQID NO：12的氨基酸序列组成且所述β链可变结构域由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成，其中，所述β链通过SEQ ID NO：24作为接头序列与抗CD3抗体连接。
30.编码如前述权利要求中任一项所述的TCR或TCR抗CD3融合物的核酸。
31.包括根据权利要求30所述核酸的表达载体。
32.呈递根据权利要求1至20中任一项所述的TCR或权利要求21-29中任一项所述的TCR抗CD3融合物的非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞。
33.一种细胞，其携带：
(a)根据权利要求31所述的TCR表达载体，其在单一开放阅读框中的根据权利要求或分别编码α链和β链的两个不同的开放阅读框中；或
(b)第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码根据权利要求1至20中任一项所述的TCR的α链或根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物的α链的核酸，所述第二表达载体包含根据权利要求1至20中任一项所述的TCR的β链或根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物的β链的核酸。
34.根据权利要求32或33所述的细胞，其为T细胞。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的TCR，或根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合体、根据权利要求30所述的核酸或根据权利要求32至34中任一项所述的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
36.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR或根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸或根据权利要求32至34中任一项所述的细胞，其特征在于，用于人类对象的医疗用途。
37.用于治疗有需要的人类对象的方法，其包括以药学有效剂量的根据权利要求35所述的药物组合物向所述对象给药。
38.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于治疗人类对象癌症的方法的用途。
39.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于根据权利要求38所述的用途，其中所述人类对象具有表达NY-ESO-1和/或LAGE-1A的肿瘤。
40.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于根据权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是实体瘤。
41.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合体、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于根据权利要求39或40所述的用途，其中所述肿瘤选自滑膜肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、乳房肿瘤、卵巢肿瘤、食管肿瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌和头颈部肿瘤。
42.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于根据权利要求38至41中任一项所述的用途，其中所述人类对象是HLA-A*02亚型的对象。
43.根据权利要求37所述的用于治疗人类对象的方法，其特征在于，其进一步包括分开、联合或依次以抗肿瘤剂给药。
44.用于向人类对象给药的可注射制剂，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物。
45.根据权利要求1至20中任一项所述的TCR、根据权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物、根据权利要求30所述的核酸、根据权利要求32至34中任一项所述的细胞或根据权利要求35所述的药物组合物，其特征在于，用于根据权利要求36或38至42中任一项所述的用途，其中所述TCR、TCR抗CD3融合物、核酸、细胞或药物组合物通过注射给药，例如静脉内或直接瘤内注射。
46.用于生产根据权利要求1至20中任一项所述的TCR或权利要求21至29中任一项所述的TCR抗CD3融合物的方法，其包括a)将根据权利要求33所述的宿主细胞保持在用于表达所述核酸的最佳条件下和b)分离由所述核酸编码的TCR或TCR抗CD3融合物。
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