ES2746240T3 - Composiciones y procedimientos para la utilización de receptores de células T recombinantes para el reconocimiento directo de un antígeno tumoral - Google Patents
Composiciones y procedimientos para la utilización de receptores de células T recombinantes para el reconocimiento directo de un antígeno tumoral Download PDFInfo
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Abstract
Célula T humana modificada que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un receptor de células T (TCR), en la que la célula T es capaz de reconocimiento directo de una célula de cáncer que expresa un antígeno NYESO- 1, en la que el reconocimiento directo de la célula de cáncer comprende la unión del TCR restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II al antígeno NY-ESO-1 expresado por la célula de cáncer; y en la que el polinucleótido recombinante codifica una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena beta del TCR tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una cadena beta del TCR tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para la utilización de receptores de células T recombinantes para el reconocimiento directo de un antígeno tumoral
CAMPO
[0001] La presente descripción se refiere en general a la inmunoterapia y más específicamente a receptores de células T recombinantes que pueden proporciona capacidad de reconocimiento de tumor directa a las células T.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Las células T auxiliares CD4+ específicas de antígenos tumorales desempeñan papeles críticos en la inducción y el mantenimiento de las respuestas inmunes antitumorales al proporcionar "ayuda de CD4". La activación de células T CD4+ en los sitios tumorales locales se cree que ayuda a superar múltiples mecanismos de inmunosupresión y promueven la erradicación del tumor por el sistema inmunitario. Sin embargo, debido a la frecuente falta de células presentadoras de antígenos funcionales en los sitios tumorales locales, la activación de las células T CD4+ y por lo tanto la provisión de ayuda de CD4 en el sitio de tumor local es muy limitada. En consecuencia, existe una necesidad continua y no satisfecha de proporcionar nuevas composiciones y procedimientos, de manera que se pueda lograr la activación de células T CD4+ y por lo tanto la disposición de ayuda de CD4.
[0003] El documento WO 2012/038055 da a conocer receptores de células T y epítopos de células T específicas de antígeno y su uso en inmunoterapia.
CARACTERÍSTICAS
[0004] La presente invención proporciona células T humanas modificadas y la materia relacionada, tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.
[0005] De manera más general, la presente descripción proporciona composiciones y procedimientos para la profilaxis y/o terapia de una variedad de cánceres. En general, los tipos de cáncer son los que expresan el bien conocido antígeno NY-ESO-1. En realizaciones, la descripción incluye receptores de células T recombinantes (TCR), polinucleótidos que los codifican, vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, células en las que se han introducido los polinucleótidos, que incluyen pero no necesariamente limitados a, células T CD4+, células T CD8+, células T asesinas naturales, células T y8 y células progenitoras, tales como células madre hematopoyéticas. En realizaciones, las células en las que se introducen los polinucleótidos son células progenitoras linfoides, células de timocitos inmaduros (CD4-CD8- doble negativas) o timocitos doble positivos (CD4+ CD8+). En realizaciones, las células progenitoras comprenden marcadores, tales como CD34, CD117 (c-kit) y CD90 (Thy-1).
[0006] En un aspecto, la descripción incluye una célula T humana modificada que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un TCR, en la que la célula T es capaz de un reconocimiento directo de una célula de cáncer que expresa un antígeno NY-ESO-1, en la que el reconocimiento directo de la célula de cáncer comprende la unión del TCR restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II al antígeno NY-ESO-1 expresado por la célula de cáncer. En realizaciones particulares, el TCR codificado por el polinucleótido y expresado por la célula tiene una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena beta del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y una cadena beta del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8, o una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una cadena beta del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12. Todas las combinaciones de tales cadenas alfa y beta están incluidas en la descripción. En una realización, la célula modificada de la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica la cadena alfa y/o la cadena beta no comprende intrones. En realizaciones, los TCR de la presente descripción incluyen secuencias de aminoácidos que son idénticas en un 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en la secuencia de aminoácidos 99% identificar a lo largo de la longitud de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento.
[0007] En otro aspecto, la descripción incluye un procedimiento para la profilaxis y/o terapia de un individuo diagnosticado con, que se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar o de recurrencia de un cáncer, en el que el cáncer comprende células de cáncer que expresan el antígeno NY-ESO-1. Este enfoque comprende administrar al individuo células T humanas modificadas que comprenden un polinucleótido recombinante que codifica un TCR, en el que las células T son capaces de reconocimiento directo de las células de cáncer que expresan el antígeno NY-ESO-1, y en el que el reconocimiento directo de las células de cáncer comprende la unión del TCR restringida por e1HLA de clase II al antígeno NY-ESO-1 expresado por las células de cáncer. En realizaciones, las células que comprenden el TCR recombinante son células T CD4+ humanas. En realizaciones, las células que comprenden el TCR recombinante que se administra al individuo son alogénicas, singénicas o células autólogas. De este modo, en una realización, las células se obtienen de un primer individuo, se modifican y se administran a un segundo individuo que está en necesidad de las mismas. En otra realización, las células se extraen del individuo antes, se modifican para
expresar el TCR recombinante, y se administran de nuevo al mismo individuo.
[0008] En realizaciones, el cáncer que expresa el antígeno NY-ESO-1 se selecciona de células de cáncer de vejiga, células de cáncer de cerebro, células de cáncer de mama, células de cáncer gástrico, células de cáncer de esófago, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer hepatobiliar, células de cáncer de riñón, células de cáncer de ovario, células de cáncer de pulmón de célula no pequeña, de mieloma, células de cáncer de próstata, células de sarcoma, células de cáncer de testículo, células de melanoma, y combinaciones de las mismas.
[0009] En otro aspecto, la descripción incluye uno o más vectores de expresión. El vector o vectores de expresión codifican un TCR que es capaz de impartir a una célula que lo expresa la capacidad de reconocer directamente una célula de cáncer que expresa un antígeno NY-ESO-1, en el que el reconocimiento directo de la célula de cáncer comprende la unión del TCR restringida por el HLA de clase Ii al antígeno NY-ESO-1 expresado por la célula de cáncer.
[0010] En otro enfoque, procedimientos para fabricar vectores de expresión y/o células que expresan un TCR recombinante. El procedimiento implica obtener una pluralidad de células T de un individuo, identificar las células T que son capaces de reconocimiento directo de una célula de cáncer que expresa un antígeno NY-ESO-1 de una manera restringida por HLA de clase II sin células presentadoras de antígeno que presentan el antígeno NY-ESO-1 a las células T, determinar la secuencia de la cadena alfa del TCR y la secuencia de la cadena beta del TCR, e introducir en un vector de expresión una secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena alfa del TCR y la cadena beta del TCR. En una realización, este procedimiento comprende introducir el vector de expresión en una célula, de manera que se expresa el TCR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0011] Figura 1. (A) Reconocimiento directo de células de cáncer por clon de células T CD4+ JM. Se investigó la expresión de interferón (IFN)-y y CD107 del clon de células T CD4+ que reconoce el tumor específico del péptido NY-ESO-1157-170 (Clon: JM) (TR-CD4) y clon de células T CD4+ que no reconoce tumores (NTR-CD4) después del cocultivo con SK-MEL-37 que expresa NY-Es O-1 (SK37) y SK-MEL-29 negativa de NY-ESO-1 (SK29) con o sin pulsado con el péptido NY-ESO-1157-170 afín (ESO157-170), mediante tinción intracelular de citoquinas. (B) Las diferencias en el reconocimiento de NY-ESO-1 intracelular y extracelular por clones de células T CD4+ y CD8+ específicas de NY-ESO-1. SK-MEL-29 negativa de NY-ESO-1 era no pulsada (no pulsada) o pulsada con péptido NY-ESO-1157-170 (péptido) o proteína NY-ESO-1 recombinante (proteína), o se infectó con el vector de adenovirus que induce la expresión intracelular de NY-ESO-1. El reconocimiento por TR-CD4, NTR-CD4 y el clon de células T CD8+ específico de NY-ESO-1 se evaluó mediante el ensayo de IFN-gELISPOT.
Figura 2. (A) Se cocultivaron TR-CD4 (Clon: JM) con SK-MEL-37. El sobrenadante del cultivo se recogió después de 1-4 días de cultivo. Los niveles de las citocinas indicadas y moléculas líticas en el sobrenadante se midieron mediante ELISA. (B) TR-CD4 y NTR-CD4 se cocultivaron con SK-MEL-37 y la expresión del marcador de apoptosis temprana, Anexina-V, en SK-MEL-37 (SK37) se midió mediante citometría de flujo.
Figura 3. (A) El clon de células T CD8+ específicas de NY-ESO-1 (ESO-CD8) se cocultivó con SK-MEL-37 en una proporción de 1:2 en presencia o ausencia de las relaciones indicadas de TR-CD4 (Clone : JM). La actividad citotóxica por ESO-CD8 en SK-MEL-37 se evaluó mediante el ensayo de citotoxicidad basado en CFSE.
Figura 4. (A) Se estimuló un clon de células T CD8+ específico de NY-ESO-1 (ESO-CD8) con o sin SK-MEL-37 (SK37) en presencia o ausencia de TR-CD4 (clon: JM). Después de 4 días, se enumeró el número de células T CD8+ mediante ensayo de exclusión con azul de tripano combinado con tinción de CD8 por citometría de flujo. (B) ESO-CD8 se estimuló con SK37 en presencia o ausencia de TR-CD4. Antes (día 0) y después (día 1 y día 2) de la estimulación, la expresión de marcadores de activación (CD25, CD69 y CD122) o marcadores de diferenciación de células T centrales (CD62L, CCR7 y CD127) en ESO-CD8 se midió mediante citometría de flujo.
Figura 5. (A) SK-MEL-37 se inoculó en ratones SCID (6 ratones/grupo) con o sin clon de células T CD4+ que reconocen tumores (JM: TR-CD4), clon de células T CD4+ que no reconocen tumores (NTR-CD4) y/o clon de células T CD8+ específico de NY-ESO-1 (ESO-CD8). El crecimiento del tumor se midió cada 2-3 días. (B) El tumor se extirpó y se pesó en el día 45 después de la inoculación.
Figura 6. (A) Vector de retrovirus utilizado en los experimentos. LTR: repetición terminal larga; ^: señal de empaquetamiento; MCS: sitio de clonación múltiple; IRES: sitio de entrada de ribosomas interno; eGFP: proteína verde fluorescente potenciada. (B) Cassette que expresa TCR. (I) Secuencias de ADNc que codifican las cadenas b y a de TCR están conectadas por un enlazador GSG (Gly-Ser-Gly) y una secuencia de eliminación ribosomal P2A. (II) Secuencias de ADNc que codifican las cadenas b y a de TCR están conectadas por un sitio de reconocimiento de proteasa furina (RAKR (Arg-Ala-Lys-Arg)), un enlazador SGSG (Ser-Gly-Ser-Gly), un epítopo de V5 y una secuencia de eliminación ribosomal P2A.
Figura 7. PBMC policlonalmente activadas se transdujeron con el vector retroviral (A: JM-TCR; B: SB95-TCR).Se cocultivaron con células HLA-DRB1*01+DPB1*04+ pulsadas (pulsadas) o no pulsadas (no pulsadas) de péptido durante 20 horas. El nivel de IFN-g en el sobrenadante se midió mediante ELISA. Los péptidos NY-ESO-1157-170 y NY-ESO-191-110 se utilizaron como los péptidos afines para JM-TCR y SB95-TCR, respectivamente.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
[0012] La presente descripción se refiere a células inmunes, incluyendo, pero no necesariamente limitado a, células T, que han sido diseñadas para ser capaces de reconocimiento directo de antígeno tumoral y células de cáncer que expresan MHC de clase II. En realizaciones, las células inmunes son células T CD4+ , células T CD8+, células T asesinas naturales, células T y8 o sus células progenitoras, tales células madre/progenitoras hematopoyéticas. En realizaciones, las células hematopoyéticas/progenitoras se caracterizan por uno o más marcadores seleccionados de CD34, CD117 (c-kit) y CD90 (Thy-1).
[0013] Es bien conocido que las células T CD4+ reconocen típicamente fragmentos de péptidos presentados en MHC de clase II (HLA de clase II en los seres humanos) por las células presentadoras de antígeno, tales como macrófagos y células dendríticas. Además de las células presentadoras de antígeno, también se conoce que muchas células de cáncer humanas expresan MHC de clase II constitutivamente o de manera inducible por IFN-g, pero el papel de la expresión de MHC de clase II en células de cáncer humano sigue siendo ampliamente desconocido.
[0014] Se han descubierto ahora que hay dos tipos distintos de células T CD4+ específicas de antígenos tumorales. Un tipo de células T CD4+ específicas de antígenos tumorales se denomina aquí como células T CD4+ que reconocen tumores (TR-CD4). Este tipo de células T CD4+ reconoce directamente células de cáncer que expresan MHC (HLA en seres humanos) de clase II de una manera específica de antígeno y restringida por MHC de clase II. En cambio, otro tipo de células T CD4+ específicas de antígenos previamente conocidas se denomina aquí como células T CD4+ que no reconocen tumores (NTR-CD4). Este tipo de célula T sólo reconoce péptidos antigénicos tumorales exógenos después del procesamiento por células presentadoras de antígeno. Las figuras 1A y 1B representan datos que demuestran estas funciones distintas y revelan el reconocimiento directo de las células de cáncer por TR-CD4.
[0015] Debido a sus diferentes capacidades en el reconocimiento directo de las células de cáncer, estos dos tipos de células T CD4+ (TR-CD4 y NTR-CD4) se cree que juegan diferentes papeles en el sitio del tumor local. Sin pretender estar limitado por ninguna teoría particular, se cree que las células TR-CD4 proporcionan ayuda de CD4 mediante el reconocimiento directo de las células de cáncer. La presente descripción se aprovecha de esta función para proporcionar polipéptidos de TCR y polinucleótidos recombinantes que los codifican para su uso en nuevas modalidades de tratamiento profiláctico y/o terapéutico y composiciones. Mediante el diseño de células T para expresar los TCR descritos adicionalmente en este documento, podemos dotar cualquier célula CD4+ con la capacidad de reconocer directamente células de cáncer que expresan el antígeno tumoral, sin requerir la presentación del antígeno por una célula presentadora de antígenos. Por lo tanto, la presente descripción incluye composiciones y procedimientos que son útiles para la creación y uso de células TR-CD4 para mejorar la atención de los pacientes con cáncer.
[0016] Se han realizado intentos anteriores para fabricar y usar TCR recombinantes. Por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 8.008.438 (la patente '438) da a conocer TCR recombinantes que se unen a la secuencia del péptido SLLMWITQC de la proteína NY-ESO-1 (NY-ESO-1: 157-165). Sin embargo, y de manera importante, la descripción de la patente '438 se refiere a los TCR clásicos de CD8+, que sólo reconocen el péptido nY-ESO-1:157-165 en el contexto del elemento de restricción HLA-A*0201 de clase I. Esto constituye una disimilitud significativa de la presente descripción, ya que, como se describió anteriormente, los TCR recombinantes de la presente descripción son limitados de clase II. Además, y como también se ha descrito anteriormente, a diferencia de la restricción de clase II canónica, las células diseñadas para expresar un TCR recombinante de la descripción sorprendentemente no requieren la ayuda de células presentadoras de antígeno para reconocer los antígenos a los que son específicos. En cambio, pueden reconocer los antígenos tal como existen in vivo como un péptido expresado por las células tumorales. Además, los TCR de la presente descripción reconocen péptidos por los descritos en la patente '438. Por consiguiente, la presente descripción es una desviación significativa e inesperada de la técnica anterior. En una realización, un TR-CD4 es una célula CD4+ que exhibe la secreción de citoquinas (tal como la producción de IFN-gamma) cuando el TR-CD4 está expuesto directamente a las células que expresan un antígeno para el que el TCR es específico en un contexto de HLA-II. La capacidad para conferir capacidad de reconocimiento directo de tumores que expresan NY-ESO-1 por células T CD4+ mediante la introducción de un TCR de una célula de origen natural que tiene esta capacidad fue inesperada.
[0017] En una realización, la descripción incluye transformar cualquier célula T CD4+ en un TR-CD4 mediante la introducción de un polinucleótido que codifica un TCR recombinante de la descripción en células T CD4+ policlonalmente expandidas y que permite la expresión de la región o regiones codificantes del polipéptido TCR del polinucleótido.
[0018] En diversas realizaciones, la presente descripción proporciona polinucleótidos aislados y/o recombinantes que
codifican polipéptidos de TCR particular, células manipuladas para expresar los polipéptidos de TCR, formulaciones farmacéuticas que comprenden células que expresan los polipéptidos de TCR, y procedimientos de uso de las formulaciones farmacéuticas para lograr una efecto profiláctico y/o terapéutico contra el cáncer en un sujeto. En ciertas realizaciones, la descripción proporciona mezclas de células que expresan TCR, o células que expresan más de un TCR que se describe en el presente documento, que son específicss para antígenos de cáncer distintos, presentando así las poblaciones de células que pueden ser consideradas polivalentes con respecto a los TCR. Tal como se utiliza en esta descripción, un "TCR recombinante" significa un TCR que se expresa a partir de un polinucleótido que se introdujo en la célula, lo que significa que antes de la introducción del polinucleótido, el TCR no estaba codificado por una secuencia cromosómica en la célula.
[0019] Los TCR proporcionados por la descripción son capaces de reconocer NY-ESO-1; 157-170 que es un antígeno que consiste en la secuencia de aminoácidos SLLMWITQCFLPVF, o son capaces de reconocer NY-ESO-1; 95-106, que es un antígeno que consiste en la secuencia de aminoácidos PFATPMEAELAR. Tal como se ha descrito anteriormente, en ciertas realizaciones, las células proporcionadas por la descripción son células T CD4+ manipuladas que son capaces de reconocer estos antígenos a través de los TCR que interaccionan con el antígeno en asociación con moléculas de HLA de clase II, en el que las moléculas de HLA de clase II y el antígeno son expresados por células tumorales.
[0020] La descripción incluye todas y cada una de las secuencias de polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos de TCR de la descripción y que se decriben en este documento, incluyendo secuencias de ADN y ARN, y que incluye polinucleótidos aislados y/o recombinantes que comprenden y/o consisten en tales secuencias. La descripción también incluye células que comprenden los polinucleótidos recombinantes. Las células pueden ser células aisladas, células cultivadas y/o expandidas y/o mantenidas en cultivo, y pueden ser células procariotas o eucariotas. Se pueden utilizar cultivos de células procariotas y eucariotas, por ejemplo, para propagar o amplificar los vectores de expresión de TCR de la descripción. En realizaciones, las células pueden comprender plásmidos de empaquetación, que, por ejemplo, proporcionan algunas o todas las proteínas utilizadas para la transcripción y empaquetación de una copia de ARN del constructo de expresión en partículas virales recombinantes, tales como partículas pseudovirales. En realizaciones, los vectores de expresión se introducen de forma transitoria o estable en las células. En las realizaciones, los vectores de expresión se integran en el cromosoma de células utilizadas para su producción. En las realizaciones, los polinucleótidos que codifican los TCR que se introducen en las células por medio de un vector de expresión, tal como una partícula viral, se integran en uno o más cromosomas de las células. Tales células se pueden usar para la propagación o pueden ser células que se utilizan para enfoques terapéuticos y/o profilácticos. Las células eucariotas incluyen células T CD4+, células T CD8+, células T asesinas naturales, células T y8 y sus células progenitoras en las que se ha introducido un constructo de expresión de TCR de la descripción. Las células T CD4+ pueden ser de cualquier fuente, incluyendo, pero no limitado a, un sujeto humano que puede ser o no el receptor final de las células T c D4+ una vez que han sido diseñadas para expresar un TCR de acuerdo con la descri pción.
[0021] Los vectores de expresión para su uso con realizaciones de la presente descripción pueden ser cualquier vector de expresión adecuado. En realizaciones, el vector de expresión comprende un polinucleótido viral modificado, tal como de un adenovirus, un virus del herpes o un retrovirus, tal como un vector lentiviral. El vector de expresión no se limita a virus recombinantes e incluye vectores no virales, tales como plásmidos de ADN y ARNm transcrito in vitro.
[0022] Con respecto a los polipéptidos que son codificados por los polinucleótidos descritos anteriormente, en ciertos aspectos, la descripción proporciona TCR funcionales que comprenden una cadna a de TCR y una cadena p de TCR, en los que las dos cadenas están presentes en una asociación física entre sí ( por ejemplo, en un complejo) y están unidas de forma no covalente entre sí, o en los que las dos cadenas son polipéptidos distintos, pero se unen covalentemente entre sí, tal como mediante un enlace disulfuro u otro enlace covalente que no es un enlace peptídico. Otros enlaces adecuados pueden comprender, por ejemplo, polialquilenglicol sustituido o no sustituido, y combinaciones de etilenglicol y propilenglicol en forma de, por ejemplo, copolímeros. En otras realizaciones, dos polipéptidos que constituyen la cadena a de TCR y la cadena p de TCR pueden estar incluidos en un único polipéptido, tal como una proteína de fusión. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena a de TCR y una secuencia de aminoácidos de la cadena p de t Cr que han sido traducidas a partir del mismo marco de lectura abierto (ORF), o ORFs distintos, o un ORF que contienen una señal que da lugar a una traducción no continua. En una realización, el ORF comprende un sitio de eliminación de traducción mediada por P2A situado entre la cadena a de TCR y la cadena p de TCR. Los constructos para producir proteínas que contienen P2A (también denominados como vectores multicistrónicos unidos a péptido 2A) son conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Gene Transfer: Delivery and Expressión of DNA and RNA, A Laboratory Manual, (2007), Friedman et al, International Standard Book Number (ISBN) 978-087969765-5. Brevemente, las secuencias de péptidos 2A, cuando se incluyen entre las regiones de codificación, permiten la producción estequiométrica de productos de proteína discretos dentro de un solo vector a través de un evento de escisión nuevo que se produce en la secuencia del péptido 2A. Las secuencias de péptidos 2A son secuencias generalmente cortas que comprenden 18-22 aminoácidos y pueden comprender secuencias amino-terminal distintas. De este modo, en una realización, una proteína de fusión de la descripción incluye una secuencia de aminoácidos de P2A. En realizaciones, una proteína de fusión de la descripción puede comprender una secuencia enlazadora entre las cadenas a de TCR y b de TCR. En
ciertas realizaciones, la secuencia enlazadora puede comprender un enlazador GSG (Gly-Ser-Gly) enlazador o un enlazador SGSG (Ser-Gly-Ser-Gly). En ciertas realizaciones, las cadenas a de TCR y b de TCR están conectadas una a otra por una secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa furina, tal como un sitio RAKR (Arg-Ala-Lys-Arg).
[0023] En una realización, el constructo de expresión que codifica el TCR puede también codificar polinucleótidos adicionales. El polinucleótido adicional puede ser tal que permite la identificación de células que expresan TCR, tal como mediante la codificación de un marcador detectable, tal como una proteína fluorescente o luminiscente. El polinucleótido adicional puede ser tal que codifica un elemento que permite la eliminación selectiva de células que expresan TCR, tal como gen de la timidina quinasa. En realizaciones, los polinucleótidos adicionales pueden ser tales que facilitan la inhibición de la expresión de TCR endógenamente codificados. En una realización, el constructo de expresión que codifica el TCR también codifica un polinucleótido que puede facilitar la regulación por disminución mediada por ARNi de uno o más TCR endógenos por ejemplo, véase Okamoto S, et al. (2009) Cancer Research, 69: 9.003-9011, y Okamoto S, et al. (2012). Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1, e63. En una realización, el constructo de expresión que codifica el TCR puede codificar un ARNsh o un ARNsi dirigidos a un TCR endógenamente codificado. En una realización alternativa, puede utilizarse un segundo constructo de expresión distinto que codifica el polinucleótido para su uso en la regulación por disminución de la producción de TCR endógeno.
[0024] La Figura 6 proporciona configuraciones representativas de los polipéptidos de TCR de la descripción y polinucleótidos/vectores de expresión que los codifican. En una realización, como se indica en la Figura 6, se elimina una secuencia de aminoácidos que es C-terminal a la proteína de la cadena p de TCR por escisión mediada por la proteasa furina, dando lugar a proteínas de cadena a y p de TCR. Se reconocera también á partir de la Figura 6 que las cadenas de TCR pueden expresarse a partir de un constructo de expresión tal que la cadena p está orientada N-terminal en relación con la cadena a, y por lo tanto los TCR de la descripción también pueden comprender esta orientación de cadenas u otras orientaciones. En realizaciones alternativas, las proteínas de cadena a y p de TCR se pueden expresar a partir de vectores de expresión distintos introducidos en la misma célula.
[0025] En relación con la presente descripción, también hemos realizado los siguientes descubrimientos: en ciertos casos, el antígeno tumoral intracelular se carga en HLA de clase II a través del reciclaje de HLA de clase II en los tumores; el reconocimiento tumoral directo por células T CD4+ que reconocen tumores conduce a la inhibición del crecimiento tumoral in vivo; las células T CD4+ aumentan de manera eficiente la citotoxicidad de células T CD8+ a través del reconocimiento directo de tumores; las células T CD4+ apoyan la proliferación, supervivencia y diferenciación de memoria de células T CD8+ específicas de antígenos afines a través del reconocimiento directo de tumores sin células presentadoras de antígeno. Se espera que la práctica de la presente descripción en un entorno clínico también dará lugar al reconocimiento tumoral directo por células T CD4+ que reconocen tumores modificadas y conducen a la inhibición del crecimiento tumoral in vivo en sujeto humano, y también dará lugar al aumento eficaz de la citotoxicidad de las células T CD8+ por las células T CD4+ modificadas, y que las células T CD4+ modificadas apoyarán la proliferación, supervivencia y diferenciación de memoria de células T CD8+ específicas de antígenos afines en sujetos humanos que reciben células T CD4+ modificadas de acuerdo a la descripción.
[0026] Con respecto a la utilización de las células T CD4+ modificadas de la presente descripción, el procedimiento generalmente comprende la administración de una cantidad eficaz (típicamente 1010 células mediante inyecciones intravenosas o intraperitoneales) de una composición que comprende las células T CD4+ a un individuo en necesidad de la misma. Un individuo en necesidad de la misma, en diversas realizaciones, es un individuo que tiene o se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar un cáncer que se caracteriza por células malignas que expresan NY-ESO-I. Como es bien conocido en la técnica, NY-ESO-I es expresado por una variedad de células de cáncer y tipos de tumores. En ejemplos particulares y no limitativos, dichos cánceres incluyen cánceres de la vejiga, cerebro, mama, ovario, cáncer de pulmón de células no pequeñas, mieloma, próstata, sarcoma y melanoma. Las realizaciones específicas incluyen, pero no se limitan a, liposarcomas y colagiocarcinoma intrahepática. El individuo puede tener formas en estadio temprano o avanzadas de cualquiera de estos tipos de cáncer, o puede estar en remisión de cualquiera de estos tipos de cáncer. En una realización, la persona a la que se administra una composición de la descripción está en riesgo de recurrencia para cualquier tipo de cáncer que expresa NY-ESO-1. En ciertas realizaciones, el individuo tiene o se sospecha que tiene, o está en riesgo de desarrollar o de recurrencia de un tumor que comprende células que expresan una proteína que comprende las secuencias de aminoácidos definidas por NY-ESO-1:157-170 y/o NY-ESO-1:95-106. En realizaciones, la descripción incluye TCR recombinantes que son específicos para los fragmentos peptídicos de NY-ESO-1 que tienen entre 15 y 24 residuos de aminoácidos de largo, en los que dichos péptidos se presentan en un complejo con HLA-II. En realizaciones, la descripción incluye TCR recombinantes que son específicos para los péptidos que se encuentran en un complejo con HLA-II, en los que los péptidos comprenden o consisten en las secuencias de aminoácidos de NY-ESO-1:157-170 y/o NY-ESO-1:95-106.
[0027] La presente descripción incluye TCR recombinantes, células que los expresan, y procedimientos terapéuticos/profilácticos que implican la presentación de antígenos NY-ESO-1 en conjunción con cualquier complejo de HLA de clase II que serán reconocidos por los TCR. En realizaciones, e1HLA-II se selecciona de HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. En realizaciones, el antígeno NY-ESO-1 es reconocido por el TCR en conjunción con HLA-DRB1*01 o HLA-DPB1*04.
[0028] Se demuestra en este documento que las TR-CD4 creadas producen múltiples moléculas a través del reconocimiento directo de las células de cáncer, que inducían la apoptosis en las células de cáncer (Fig. 2A y 2B). Es importante destacar que se encontró que TR-CD4 mejoraran eficazmente la actividad citotóxica de células T CD8+ específicas de antígeno tumorales a través del reconocimiento directo de células de cáncer en ausencia de células presentadoras de antígeno (Fig. 3). Además, las células T CD8+ coestimuladas con TR-CD4 por las células de cáncer proliferaron activamente y regularon por incremento marcadores de células T de memoria central (Fig. 4A y 4B).
[0029] TR-CD4 mostró una actividad antitumoral in vivo significativa para inhibir el crecimiento de células de cáncer humanas en ratones inmunodeficientes (Fig. 5). Además, TR-CD4 y las células T CD8+ específicas de antígenos tumorales inhibieron cooperativamente el crecimiento tumoral in vivo (Fig. 5). Por lo tanto, los datos presentados en este documento sugieren fuertemente que el reclutamiento de TR-CD4 en el sitio local del tumor potencian las respuestas inmunes antitumorales y por consiguiente probablemente proporcionarán un enfoque terapéutico eficaz y hasta ahora no disponible para su uso generalizado en la clínica.
[0030] La siguiente descripción proporciona ejemplos ilustrativos de materiales y procedimientos utilizados para realizar y utilizar diversas realizaciones de la descripción.
[0031] Para desarrollar un procedimiento para generar eficientemente un gran número de TR-CD4 mediante manipulación genética con gen de receptores de células T (TCR) que reconocen tumores, el gen de TCR de longitud completa de tres clones de TR-CD4 fue clonado y secuenciado mediante el uso de la técnica de 5'-RACE-PCR. Se crearon los siguientes TCR:
1. TR-CD4 específico de NY-ESO-1:96-106 restringida por HLA-DRB1*01 (denominado en este documento Clon: "SB95")
2. TR-CD4 específico de NY-ESO-1:157-170 restringida por HLA-DRB1*01 (denominado en este documento Clon: "5B8")
3. TR-CD4 específico de NY-ESO-1:157-170 restringida por HLA-DRB1*01 (denominado en este documento Clon: "JM")
[0032] Los genes de TCR de SB95 y JM se insertaron en vectores de expresión retrovirales (tales como vectores pMIG-II o pMIG-W derivados de MSCV). Se fabrica un vector 5B8 que expresa TCR de la misma manera.
[0033] La transducción retroviral de estos genes de TCR transfirió eficientemente la reactividad contra péptidos afines a células T expandidas policlonalmente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos sanos. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se presentan a continuación representan las utilizadas para demostrar la descripción. La descripción incluye cualquiera y todas las secuencias de polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de los constructos de t Cr descritos en el presente documento. Además, se contemplan variaciones en las secuencias de aminoácidos en los TCR, siempre que no afecten negativamente a la función del TCR. En diversas realizaciones, un TCR que comprende uno o más cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias presentadas en el presente documento comprenderá sustituciones conservadoras de aminoácidos u otras sustituciones, adiciones o deleciones, siempre que las células que expresan los TCR recombinantes de la descripción pueden directa y específicamente reconocer las células tumorales que expresan NY-ESO-1, en el que que el reconocimiento depende de la expresión de NY-ESO-1 y la presentación de péptidos procesados de la misma en una manera restringida por HLA de clase II por las células tumorales. En realizaciones, un TCR de la presente descripción comprende cualquier secuencia de aminoácidos que facilita el reconocimiento directo del antígeno tumoral en las células tumorales, sin la participación de células presentadoras de antígeno. En realizaciones, la secuencia de aminoácidos de un TCR proporcionada por esta descripción es al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% similar a una secuencia de aminoácidos proporcionada en la lista de secuencias que es parte de esta descripción. En diversas realizaciones, cualquier TCR de la descripción puede tener un valor Koff para su epítopo afín, tal como se define en el persente documento, que es esencialmente el mismo que el de Koff para el epítopo afín mostrado por un TCR de un TR-CD4 de origen natural para el mismo epítopo. En realizaciones, las secuencias de aminoácidos de TCR pueden comprender cambios en su región constante. A este respecto, se sabe en la técnica que, en general, la región constante de un TCR no contribuye sustancialmente al reconocimiento de antígeno. Por ejemplo, es posible sustituir una parte de la región constante humana de un TCR por una secuencia murina y mantener la función del TCR. (Ver, por ejemplo, Goff SL et al (2010) Cancer Immunology, Immunotherapy, 59: 1551-1560). Por lo tanto, se contemplan diversas modificaciones a las secuencias de TCR descritas en este documento, y pueden incluir, pero no se limitan a, cambios que mejoran el emparejamiento de cadena específico, o facilitan la asociación más fuerte con las proteínas de señalización de células T del complejo CD3, o inhiben la formación de dímeros entre los TCR endógenos e introducidos. En realizaciones, los cambios de aminoácidos pueden estar presentes en la región de CDR, tal como la región CDR3, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, sustituciones de uno, dos, tres, o más aminoácidos en la secuencia de CDR3. En realizaciones, los cambios de aminoácidos
ATGAAGTTGGTGACAAGCATTACTGTACTCCTATCTTTGGGTATTATGGGTGATGCTAAGAC CACACAGCCAAATTCAATGGAGAGTAACGAAGAAGAGCCTGTTCACTTGCCTTGTAACCAC TCCACAATCAGTGGAACTGATTACATACATTGGTATCGACAGCTTCCCTCCCAGGGTCCAGA GTACGTGATTCATGGTCTTACAAGCAATGTGAACAACAGAATGGCCTCTCTGGCAATCGCTG AAGACAGAAAGTCCAGTACCTTGATCCTGCACCGTGCTACCTTGAGAGATGCTGCTGTGTAC T ACTGCAT CCCT A AT A AC A ATG AC AT GCGCTTTGG AGC AGGG ACC AG ACTG AC AGT AA AAC C A A AT ATCCAGA ACCCTG ACCCTGCCGTGT ACCAGCT G AG AG ACTCTA AATCC AGT G AC A A GTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTG ATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAG TGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTA TTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAA AGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCT CCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA (SEQ ID NO:l)
no tienen ningún efecto sobre la función del TCR.
[0034] En realizaciones específicas e ilustrativas, las secuencias de polinucleótidos que codifican los TCR de la descripción, y las secuencias de aminoácidos de las cadenas a y b de TCR codificadas por los polinucleótidos son los siguientes, en donde los codones de iniciación de la traducción y codones de parada en las secuencias de polinucleótidos están en negrita:
Clon de células T CD4+ que reconocen tumores específicos de NY-ESO-1157-170 restringidos por HLA-DPB1*0401/0402 “JM”
(a) Secuencias de nucleótidos de ADNc de cadenas a y 13 de TCR
Cadena a deTCR
ATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTTGGGTGCTGCTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTAAAGGC TGGAGTCACTCAAACTCCAAGATATCTGATCAAAACGAGAGGACAGCAAGTGACACTGAGC TGCTCCCCTATCTCTGGGC AT AGG AGTGT ATCCT GGT ACC A AC AG ACCCC AGG AC AGGGCCT TCAGTTCCTCTTTGAATACTTCAGTGAGACACAGAGAAACAAAGGAAACTTCCCTGGTCGAT TCTCAGGGCGCCAGTTCTCTAACTCTCGCTCTGAGATGAATGTGAGCACCTTGGAGCTGGGG GACTCGGCCCTTTATCTTTGCGCCAGCAGCTTCCCCAGGGAACCTAACTATGGCTACACCTT CGGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTC GCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCC TGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGT GCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCC AGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACC ACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAG GGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTT ACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGG GAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAA AGGATTTCTGA (SEQ ID NO:2)
Cadena p de TCR
(b) secuencias de aminoácidos de cadenas a y b de TCR (regiones variables de TCR están en cursiva, regiones CDR3 están en negrita)
Cadena a de TCR
MKLVTSfTVLLSLGIMGDAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYI50 HWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRA TLRDA 100
A VYYCIPNNNDMRFCi A CTRL 7VÁ7WIQNPDPA V YQLRDS KS S DKS V CLFT 150 DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANA 200 FNNS1IPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRIEEEK 250 VAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO:3)
Cadena (3 de TCR
MGSRI.LCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYI.IKTRGQQVTLSCSPISGHRS 50 VSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTL 100 ELGDSALYLCASSFPREPNYGYTFGSGTRLTWEDLNK'VFPPEVAVFEPS 150
EAIvISI ITQKATI .VC'I -ATGFFPDIIVEI .SWWVNGKEVI I S( í VSTDPQPLKEQP 200 ALNDSRYCLSSRERVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV 250
TQIVS AEAWGRADCGFTSVS YQQC»VLS ATILYEILLGKATLY AVLVSALV 300 LMAMVKRKDF (SEQ ID NO:4)
Clon de células T CD4+ que reconocen tumores específicos de NY-ESO-I157-170 restringidos por HLA-DPB1*0401/0402 “J5B8”
(a) secuencias de nucleótidos de ADNc de cadenas a y 13 de TCR
Cadena a de TCR
ATGGCCCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACTGTGA CCCTGAGTTGCACAT ATG ACACC AGTGAGA ATAATT ATTATTTGTTCTGGT AC AAGC AGCCT CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACGG AGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGAC TCACAGCTGGGGGACACTGCGATGTATTTCTGTGCTTTCTCGAGAGGGAGTGGAGGTAGCA ACTATAAACTGACATTTGGAAAAGGAACTCTCTTAACCGTGAATCCAAATATCCAGAACCCT GACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCAC CGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACA AAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGGTGTGGCCTGGAGCAA CAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCT TCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATAC GAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCG GGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA (SEQ ID NO:5)
Cadena p de TCR
ATGCiCiCACCAGGCTCCTCTTCTC.C.GTGGCCTTCTGTCTCCTGGC.C.GCAC.ATCACACA(rCrAC.C TGGAGTCTCCCAGTCCCCCAGTAACAAGGTCACAGAGAAGGGAAAGGATGTAGAGCTCAGG TGTGATCCAATTTCAGGTCATACTGCCCTTTACTGGTACCGACAGAGCCTGGGGCAGGGCCT GGAC.TTTTTAATTTACTTCCAAGGCAACAGTGCACCAGACAAATCAGGGCTGCCCAGTGATC GCTTCTCTGCAGAGAGGACTGGGGGATCCGTCTCCACTCTGAGGATGCAGCGCACACAGCA GC.AC.GACTCGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGCTTAC.TCCCCGACAGTGCCTACC.AGCAGT ACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGA GGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTA TGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGG AGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGA CTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCA ACCACTTCCC.CTGTCAAGTCCAC.TTCTACGGGCTCTCGGAGAATC.ACGAGTGGACCCAGGAT AGGC.CCAAACCTC.TCACCCAGATCC.TCAGCGCCGAGGCCTC.GGC.TAGAGCAGACTGTGGCT TCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTA GGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAG AAAC.GATTCCAGAC.GCTAG (SEQ ID NO:6)
(b) secuencias de aminoácidos de cadenas a y b de TCR (regiones variables de TCR están en cursiva, regiones CDR3 están en negrita)
Cadena a de TCR
MAQTVl'QSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSENNYYU WYKQPPSRQMILVI 50
RQEA YKQQNA TENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFSRGSG 100 GSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFYDFDSQT 150 NVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII 200 PEDTFFPSPESSCDVKEVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL 250 LMTLRLWSS (SEQ ID NO:7)
Cadena p de TCR
M GTRLLFWVAFCLLGADHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTA 50
L YWYRQSLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGFPSDRFSAERTGGSVSTLTIQR 1 (X)
TQQEF)SAVYFCASSLVPDSAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVA\FEP 150
SEAEISH'TQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVÍ1SGV STDPQPLKEQ 200
PALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP 250
VTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSAL 300
VLMAMVKRKDSRG OSEQ ID NO:8)
Clon de células T CD4+ que reconocen tumores específicos de NY-ESO-W106 restringidos por HLA-DRB1*0101 “SB95”
(a) secuencias de nucleótidos de ADNc de cadenas a y 13 de TCR
TCR alfa
ATGCTCCTGCTGCTCGTCCCAGTGCTCGAGGTGATTTTTACCCTGGGAGGAACCAGAGCCCA GTCGGTGACCCAGCTTGGCAGCCACGTCTCTGTCTCTGAGGGAGCCCTGGTTCTGCTGAGGT GCAACTACTCATCGTCTGTTCCACCATATCTCTTCTGGTATGTGCAATACCCCAACCAAGGA CTCCAGCTTCTCCTGAAGCACACAACAGGGGCCACCCTGGTTAAAGGCATCAACGGTTTTGA g g c t g a a t t t a a g a a g a g t g a a a c c t c c t t c c a c c t g a c g a a a c c c t c a g c c c a t a t g a g c GACGCGGCTGAGTACTTCTGTGCTGTGAGTGATTCTAGGGCTGCAGGCAACAAGCTAACTTT TGGAGGAGGAACCAGGGTGCTAGTTAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTAC CAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCA AACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGAC ATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTG CATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAA AGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCA AAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCCíAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCA TGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA (SEQ ID NO:9)
TCR beta
ATGGGAATCAGGGTCCTCTGTCGTGTGGCCTTTTGTTTCCTGGCTGTAGGGCTCGTAGATGT GAAAGTAACCCAGAGCTCGAGATATCTAGTCAAAAGGACGGGAGAGAAAGTTTTTCTGGAA TGTGTCCAGGATATGGACCATGAAAATATGTTCTGGTATCGACAAGACCCAGGTCTGGGGGT ACGGCTGATCTATTTCTCATATGATGTTAAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAGGGG TACAGTGTCTCTAGAGAGAAGAAGGAGCGCTTCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCAGCACCA ACCAG AC ATCT ATGT ACCTCTGTGCC AGC AGATTCCCCGGG AC AGCCT AT AATTC ACCCCTC CACTTTGGGAATGGGACCAGGCTCACTGTGACAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCG ACÍGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGT GTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAG GAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATG ACTCC AG AT ACTGCCTGAGC AGCCGCCTGAGGGTCTCGGCC ACCTTCTGGC AGA ACCCCCGC AACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGG ATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGG CTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCT
AGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGGCCTTGTGTTGATGGGCATGGTCAAGA GAAAGGA ITI'CTGA (SEQ ID NO: 10)
(b) secuencia de aminoácidos de las cadenas a y b de TCR (regiones variables de TCR están en cursiva, regiones CDR3 están en negrita)
Cadena a de TCR
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVIQLGSHVSVSEGALVUJiCNYSSSVPP 50 YLFWYVQYPNQGLQLLLKHFFGATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSA 100 HMSDAAEYFCA VSDSRAA GNKLTFGGGTRVL VK/WIQNPDPA V YQI ,R DS K 150 SSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWS 200 NKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLS 250 VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO: 11)
Cadena p de TCR
MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHEN 50 MFWYRQDPGLGl.RUYFSYD VKMKEKGDIPEG YSVSREKKERFSLILESA 100 STNQTSMYLCASRFPGTA YNSPLBFGNGTRLTVrEDLNKVFPPEVAVFEP 150 vSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKRVHSGVSTDPQPLKRQ 200 PALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKP 250 VTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQC'VLSATILYEILLGKATLYAVLVSAL 300 VLMAMVKRKDF (SEQ ID NO: 12)
[0035] Descripción de vector de expresión de TCR. La transducción viral se realizó utilizando un plásmido derivado del vector de virus de células madre murinas pMSCV, tal como pMIG-II y pMIG-w (Fig. 6A). Los constructos que expresan TCR se insertaron en un sitio de clonación múltiple (MCS) del plásmido pMIG. Los plásmidos pMIG tienen IRES-GFP después de múltiples sitios de clonación de modo que la eficacia de transducción se controla mediante la expresión de GFP.
[0036] Para inducir la expresión equimolar de las proteínas de cadena a y p de TCR, los ADNc que codifican las cadenas a y p de TCR se conectaron mediante una secuencia de enlace que incluía el sitio de eliminación de traducción P2A (Fig. 6B (I)). Usando esta secuencia, el ARNm se transcribe como una secuencia. Debido a la eliminación ribosomal por la secuencia de P2A, se tradujeron dos proteínas a partir del ARNm, para producir la proteína de fusión TCR-P2A y la proteína P(Pro)-cadena a de TCR.
[0037] Para evitar la posible inhibición funcional por péptidos P2A añadidos después de la proteína de la cadena p de TCR en el casete que expresa TCR (I), se construyó otro casete que expresa TCR que introduce el sitio de reconocimiento por la proteasa furina (RAKR) después del gen de la cadena p de TCR (Fig 6b (II). En este casete de expresión, el péptido adicional después de la proteína de la cadena p de TCR se elimina mediante la escisión mediada por la proteasa furina, lo que resulta en la expresión de las proteínas de cadena a y p de TCR con modificaciones mínimas. En particular, en casetes de expresión con o sin secuencias RAKR, ningún aminoácido se elimina con relación a las secuencias presentadas en este documento. Sin embargo, para un casete sin RAKR (Fig 6B (I)), las secuencias del enlazador GSG y de P2A están unidas al extremo C-terminal de la cadena beta, y una prolina (de P2A) está unida al extremo N-terminal de la cadena alfa. Para un casete con RAKR (Fig. 6B (II)), una arginina (de RAKR) está unida al extremo C-terminal de la cadena beta y la prolina (de P2A) está unida al extremo N-teminal de la cadena alfa. Por lo tanto, en realizaciones, el vector de expresión codifica una proteína de fusión que comprende secuencias de aminoácidos de TCR. En realizaciones, la única secuencia de aminoácidos de TCR se selecciona de entre las secuencias de aminoácidos de TCR presentadas en este documento.
[0038] Las secuencias que expresan TCR fueron clonadas en el sitio de clonación múltiple del plásmido pMIG. El retrovirus fue producido de forma transitoria o estable utilizando líneas celulares de empaquetamiento GP2-293 y PT67 adquiridas de Clontech. Brevemente, GP2-293 expresa de forma estable el gen gag-pol viral y producen transitoriamente después de la cotransfección con pMIG y pVSV-G plásmidos que expresan la envoltura viral de VSV-G. PT67 expresa de forma estable genes de gag-pol viral y de la envoltura viral de 10A1. Después de la infección con retrovirus producidos a partir de GP2-293, PT67 se integra con el constructo de expresión de pMIG, y por lo tanto produce de forma estable (de forma continua) retrovirus. En una realización, la actividad del promotor de 5'-LTR (repetición terminal larga) se utiliza para conducir la expresión del transgén. Sin embargo, se pueden introducir otros promotores, tales como el promotor EF-1a, para la mejora de la expresión del transgén.
[0039] Infección de retrovirus a células T derivadas de PBMC. Las PBMC de sangre completa se obtuvieron mediante un procedimiento de separación en gradiente de densidad y se almacenaron en un tanque de nitrógeno líquido en 90% de suero de bovino fetal (FBS) y 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta su uso. Se activaron policlonalmente PBMC (3-4 x 106 células/pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos) por fitohemaglutinina (PHA) 10 mg/ml durante 2 días en medio de cultivo (medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina, estreptomicina, penicilina y IL-2 recombinante humana). 1 x 105 de PBMC preactivadas en 100 ml de medio de cultivo se añadieron a los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos prerecubierta con retronectina 20-25 mg/ml en PBS y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS. En algunos experimentos, se recubrió anticuerpo monoclonal anti-CD3 5 mg/ml (Clon: OKT3) junto con retronectina. Se añadieron 100 ml de sobrenadante que contenía retrovirus a PBMC y se incubaron durante 24 horas. La infección por retrovirus se realizó 2-3 veces cada 24 horas. Después de la infección, se expandieron las células durante 10-14 días y se utilizaron para los ensayos funcionales.
Resultados
[0040] Se establecieron clones PT67 que producían retrovirus con alta titulación. Se establecieron los siguientes clones productores de retrovirus.
(1) pMIG-II/JM-TCR (II)
Claims (7)
1. Célula T humana modificada que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un receptor de células T (TCR), en la que la célula T es capaz de reconocimiento directo de una célula de cáncer que expresa un antígeno NY-ESO-1, en la que el reconocimiento directo de la célula de cáncer comprende la unión del TCR restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II al antígeno NY-ESO-1 expresado por la célula de cáncer; y en la que el polinucleótido recombinante codifica una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena beta del TCR tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una cadena beta del TCR tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
2. Célula modificada, según la reivindicación 1, en la que la secuencia que codifica la cadena alfa y/o la cadena beta no comprende intrones.
3. Células T humanas modificadas para su uso en un procedimiento para la profilaxis y/o terapia de un individuo diagnosticado con, que se sospecha que tiene o está en riesgo de desarrollar o recurrencia de un cáncer, en las que el cáncer comprende células de cáncer que expresan el antígeno NY-ESO-1, en las que las células T humanas modificadas comprenden un polinucleótido recombinante que codifica un receptor de células T (TCR), en las que las células T son capaces de reconocimiento directo de las células de cáncer que expresan el antígeno NY-ESO-1, en las que el reconocimiento directo de las células de cáncer comprende la unión del TCR restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II al antígeno NY-ESO-1 expresado por las células de cáncer; y en las que el polinucleótido recombinante codifica una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena beta del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una cadena alfa del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una cadena beta del TCR que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
4. Células T humanas modificadas para su uso, según la reivindicación 3, en las que las células T humanas modificadas son células T CD4+.
5. Células T humanas modificadas para su uso, según la reivindicación 4, en las que las células de cáncer se seleccionan de células de cáncer de vejiga, células de cáncer de cerebro, células de cáncer de mama, células de cáncer gástrico, células de cáncer de esófago, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer hepatobiliar, células de cáncer de riñón, células de cáncer de ovario, células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, mieloma, células de cáncer de próstata, células de sarcoma, células de cáncer de testículo, células de melanoma o combinaciones de los mismos.
6. Células T humanas modificadas para su uso, según la reivindicación 4, en las que el procedimiento comprende extraer células T CD4+ del individuo antes de la administración de las células T humanas modificadas, y modificar las células T CD4+ mediante la introducción en las células T CD4+ del polinucleótido que codifica el TCR recombinante.
7. Vector de expresión que codifica un receptor de células T (TCR), en el que el TCR comprende una cadena alfa que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena beta que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una cadena alfa que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una cadena beta que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
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