JP2003515535A - 腫瘍関連抗原発現を調節するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍の治療のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、腫瘍抗原［また腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、リニージ特異性、分化または自己抗原として知られている］を発現する腫瘍の治療のための方法および剤、並びにさらに特に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原を発現するメラノーマ腫の治療のための方法および剤に関する。本発明はまた、腫瘍抗原の発現を調節する剤を同定するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、腫瘍を治療するための方法および組成物に関する。特に、本発明は
、腫瘍抗原［また、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、リニージ特異性、分化または自己
抗原としても知られている］を発現する腫瘍の治療のための方法および剤、並び
にさらに特に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原を発現するメラノーマ腫の治療の
ための方法および剤に関する。本発明はまた、腫瘍抗原の発現を調節する(regul
ate)剤を同定するための方法に関する。

【０００２】発明の背景 多くの固体腫瘍は、現在、自己由来リンパ球の浸潤を含むことが知られている
。業界において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）として知られている、これらの自己
由来リンパ球は、固体腫瘍の細胞により発現される特定の抗原を認識することが
示されている。このような腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の、適切な付随的シグナル(a
ccessory signal)と組み合わせた発現により、固体腫瘍に対するＴＩＬの特異的
細胞溶解（細胞毒性）反応性に至る。

【０００３】 数種の腫瘍抗原は、種々の腫瘍と関連して同定された(Boon T, et al., Ann R
ev Immunol, 1994, 12:337-65; Kawakami Y, et al., Proc Natl Acad Sci USA,
1994, 91:3515-9; Bakker A, et al., J Exp Med, 1994, 179:1005-9)。ＴＡＡ
の同定に加えて、ＴＩＬにより認識された免疫優性エピトープはまた、広範囲に
発現されたリニージ特異性抗原、例えばメラノーマ腫におけるＨＬＡ−Ａ２制限
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１に関して記載された(Sensi M, et al., Proc Natl Ac
ad Sci USA, 1995, 92:5674-8; Kawakami Y, et al., J Exp Med, 1994, 180:34
7-52)。

【０００４】 メラノーマ腫は、メラノサイトまたはメラノサイト関連母斑細胞のいずれかか
ら由来する、攻撃的な、しばしば転移性の腫瘍である(Cellular and Molecular
Immunology, 1991, (eds) Abbas A. K., Lechtman, A. H., Pober, J. S.; W. B
. Saunders Company, Philadelphia: 340-341頁)。数人のメラノーマ腫患者にお
いて、ＴＩＬは、しばしば、ＨＬＡ−Ａ２を発現する標的およびメラン−Ａ／Ｍ
ＡＲＴ−１の免疫優性ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１）に向けられ
た強力なインビトロ溶解活性を示す(Kawakami YおよびRosenberg SA, Int Rev I
mmunol, 1997, 14:173-92; Zhai, Y., et al., J. Immunol, 1996, 156:700-710
; Stevens, E., et al., J. Immunol, 1995, 154:762-71; Rivoltini, L., et a
l., J. Immunol, 1995, 154:2257-2265)。このような場合において、細胞溶解性
免疫応答を引き起こす腫瘍細胞はまた、免疫応答を回避する機構を実施すること
ができなければなれない。

【０００５】 しかし、他の報告されているメラノーマ腫の場合において、ＴＩＬは、腫瘍の
進行に至るメラノーマ腫細胞を認識することができなかった。これらの後者の場
合において、ＭＨＣＩ群重鎖、β２−ミクログロブリンまたはＴＡＰ遺伝子の欠
陥発現の結果のＭＨＣ表面分子の損失は、ホストの免疫防御からの逃避機構とし
て示唆されている(Maeurer MJ, et al., J Clin Invest, 1996, 98:1633-41; Ri
voltini, L., et al., Cancer Res, 1995, 55:3149-57; Ferrone, S. & Marinco
la. F., Immunol. Today, 1995, 16:487-94; Garrido, F., et al., Immunol. T
oday, 1997, 18:89-95)。最近、プロトオンコジーンＰＭＬ−１が、ＴＡＰおよ
びＬＭＰ遺伝子の制御によりＭＨＣ発現を変調させ、これにより、ＴＩＬ認識か
らの腫瘍逃避に関与していることが報告された(Zheng, P., et al., Nature, 19
98, 396:373-6)。さらに、名目上の抗原の選択的損失は、また、報告されている
所では、免疫逃避に至る(deVries T, et al., Cancer Res, 1997, 57: 3223-9;
Labarriere, N., et al., 1997, J. Immunol. 158:1238-45)。

【０００６】 ＴＩＬおよび免疫系の他の細胞による腫瘍認識逃避のための追加の機構を同定
する必要がある。 また、このような免疫系認識逃避を妨げる剤を同定する必要がある。

【０００７】発明の要約 本発明は、腫瘍細胞における腫瘍関連抗原の発現を変調させる(modulate)剤を
同定する方法を提供する。本発明はまた、腫瘍細胞における腫瘍関連抗原の発現
を変調させるこのような剤を含む剤および医薬組成物を提供する。従って、本発
明は、とりわけ、腫瘍関連抗原を発現するかまたはこの発現を誘発することがで
きる、自己由来の固体腫瘍を有する対象を治療するのに、特に有用である。

【０００８】 本発明の物質の１つのカテゴリーは、腫瘍抗原発現下方調節剤である。これら
の剤は、腫瘍細胞単離物および単離されたかまたは実質的に純粋な物質を含む。
本発明の物質の他のカテゴリーは、腫瘍抗原発現を下方調節するこのような剤の
阻害剤である。

【０００９】 本発明の１つの観点において、悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に、悪性
メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、悪性
メラノーマ腫細胞単離物を提供する。この細胞単離物は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１抗原発現および／または非発現悪性メラノーマ腫細胞から由来することがで
きる。好ましくは、悪性メラノーマ腫細胞は、低メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原
発現細胞である。ある態様において、細胞単離物は、ポリペプチドを含む。他の
態様において、細胞単離物は、実質的に純粋なポリペプチドである。重要な態様
において、実質的に純粋なポリペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシ
ンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されたポリペプチドである
。１つの態様において、細胞単離物は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現悪性
メラノーマ腫細胞の上清液またはこのフラクションである。いくつかの態様にお
いて、細胞単離物は、オンコスタチンＭ、スタニオカルシンおよび組織因子経路
阻害剤−２からなる群から選択された少なくとも１つのポリペプチドを含む。あ
る態様において、悪性メラノーマ腫細胞は、低レベルのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−
１抗原を発現する。尚他の態様において、悪性メラノーマ腫細胞は、高レベルの
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原を発現する。

【００１０】 本発明の他の観点において、有効濃度で悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン
−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、実質的に純粋な有機剤を提供する。こ
の剤は、標準的な条件（例えば平坦床(flatbed)、静的培養）の下で、少なくと
も１時間の間培養した、融合性悪性メラノーマ腫細胞の上清液中に、有効濃度で
存在する。ある態様において、培養条件は、５×１０^６細胞／ｍｌの培地の比率
を含み、剤は、８０℃において、熱感受性であり、プロテナーゼＫ感受性であり
、ブルーおよび／またはレッドセファロース（登録商標）(Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ)に結合し、溶離する。いくつかの態様において、有機剤
は、ポリペプチドである。重要な態様において、ポリペプチドは、オンコスタチ
ンＭ、スタニオカルシンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択され
ている。ある態様において、悪性メラノーマ腫細胞は、低レベルのメラン−Ａ／
ＭＡＲＴ−１抗原を発現する。他の態様において、悪性メラノーマ腫細胞は、高
レベルのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原を発現する。

【００１１】 本発明の他の観点において、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡ
ＲＴ−１発現を下方調節し、悪性メラノーマ種細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲ
Ｔ−１発現の下方調節を阻害する、悪性メラノーマ腫細胞単離物に選択的に結合
する、単離された有機剤を提供する。いくつかの態様において、悪性メラノーマ
腫細胞単離物は、少なくとも１種のポリペプチドを含む。ある態様において、悪
性メラノーマ腫細胞単離物は、実質的に純粋なポリペプチドである。重要な態様
において、実質的に純粋なポリペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシ
ンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されたポリペプチドである
。他の態様において、単離された結合有機剤は、ポリペプチドである。尚他の態
様において、単離された結合有機剤が、ポリペプチドである際には、ポリペプチ
ドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントまたはポリペプチドに関
して選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群から選択された抗体ま
たは抗体フラグメントであることができる。抗体またはこのフラグメントは、キ
メラの、またはヒト化されていることができる。他の重要な態様において、抗体
を、抗オンコスタチン−Ｍ抗体、抗スタニオカルシン抗体および抗組織因子経路
阻害剤−２抗体からなる群から選択することができる。

【００１２】 本発明の他の観点において、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡ
ＲＴ−１発現を下方調節し、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲ
Ｔ−１発現の下方調節を阻害する、実質的に純粋な有機剤に選択的に結合する、
単離された結合有機剤を提供する。いくつかの態様において、実質的に純粋な有
機剤は、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方調節
特性を有する少なくとも１種のポリペプチドを含む。ある態様において、実質的
に純粋な有機剤は、実質的に純粋なポリペプチドである。重要な態様において、
実質的に純粋なポリペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシンおよび組
織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されたポリペプチドである。他の態様
において、単離された結合有機剤は、ポリペプチドである。尚他の態様において
、単離された結合有機剤が、ポリペプチドである際には、ポリペプチドは、Ｆａ
ｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントまたはポリペプチドに関して選択的
なＣＤＲ３領域を含むフラグメントからなる群から選択された抗体または抗体フ
ラグメントであることができる。抗体またはこのフラグメントは、キメラの、ま
たはヒト化されていることができる。他の重要な態様において、抗体を、抗オン
コスタチン−Ｍ抗体、抗スタニオカルシン抗体および抗組織因子経路阻害剤−２
抗体からなる群から選択することができる。

【００１３】 本発明の他の観点において、医薬組成物を提供する。この組成物は、悪性メラ
ノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、実質的に
純粋な有機剤に選択的に結合する、単離された結合有機剤を含む。実質的に純粋
な有機剤に選択的に結合する、単離された結合有機剤は、このような下方調節を
阻害し、このような下方調節を阻害するのに有効な量で存在する。この組成物は
また、医薬的に許容し得る担体を含む。

【００１４】 本発明の他の観点において、医薬組成物を提供する。この組成物は、悪性メラ
ノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、悪性メラ
ノーマ腫細胞単離物に選択的に結合する、単離された結合有機剤を含む。悪性メ
ラノーマ腫細胞単離物に選択的に結合する、単離された結合有機剤は、このよう
な下方調節を阻害し、このような下方調節を阻害するのに有効な量で存在する。
この組成物はまた、医薬的に許容し得る担体を含む。

【００１５】 本発明は、他の観点において、腫瘍細胞由来腫瘍抗原発現下方調節剤を単離す
る方法を提供する。この方法は、（ａ）下方調節された腫瘍抗原発現を有する腫
瘍細胞の培養物を調製し、（ｂ）腫瘍抗原発現下方調節剤を含むことが疑われる
上清液または細胞単離物を、ステップ（ａ）の培養物から単離し、（ｃ）該上清
液または細胞単離物を複数のフラクションに分別し、（ｄ）複数のフラクション
からのフラクションを、腫瘍抗原発現腫瘍細胞と接触させ、（ｅ）腫瘍抗原発現
細胞における腫瘍抗原発現を測定し、および（ｆ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発
現が、このような接触の結果、例えば対照と比較することにより下方調節された
か否かを決定することを含む。

【００１６】 いくつかの態様において、腫瘍細胞の起源は、以下のものであることができる
：胆管癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌；乳癌；頸部癌腫；絨毛癌；結腸
癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ球性および骨髄性白血病を含む血液
学的新生物；多発性骨髄腫；白血病および成体Ｔ細胞白血病リンパ腫に関連する
ＡＩＤＳ；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮細胞間新生物；肝臓癌；肺
癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；鱗状細胞
癌腫を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるも
のを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉
腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ腫、カポジ肉腫、底細胞(bas
ocellular)癌および鱗状細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（セミノーマ、非セミノー
マ［奇形腫、絨毛癌］）、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺
癌および骨髄癌腫を含む甲状腺癌；並びに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓
癌。

【００１７】 ある態様において、腫瘍抗原は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペ
プチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤ
Ａｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ
／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびこの免疫原性エピトープＣＡＰ−
１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）および
この免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異
性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡ
ＧＥ族、ＧＡＧＥ−１，２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、Ｃ
ＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、
ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテ
ニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡ
ＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポシスタンパク質（ＡＰ
Ｃ）、フォドリン、腫瘍抗原のＳｍａｄ族、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード化核抗原
（ＥＢＮＡ）−１またはｃ−ｅｒｂＢ−２であることができる。前述の態様すべ
てにおいて、複数のフラクションからのフラクションは、希釈されていないかま
たは濃縮されていることができる。

【００１８】 重要な態様において、免疫認識から逃避する癌または腫瘍およびこのような腫
瘍と関連する腫瘍抗原には、急性リンパ芽球白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シク
ロフィリンｂ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ
−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆管癌（ｐ２１ｒａ
ｓ）、乳癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部癌腫（ｐ
５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌腫（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２；ＭＵＣ族）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７
−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリ
ンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質
）、肝臓癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮ
Ａ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球細胞由
来白血病（シクロフィリンｂ）、骨髄腫（ＭＵＣ族；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞
肺癌腫（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢ
ＮＡ−１）、卵巣癌癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前
立腺癌（前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびこの免疫原性エピトープＰＳＡ−１
、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−
２）、膵臓癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２
；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）
、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）およ
びメラノーマ腫（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２
１ｒａｓ；ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}）が含まれる（しかし限定的ではない）。

【００１９】 本発明は、他の観点において、腫瘍抗原発現変調剤をスクリーニングする方法
を提供する。この方法は、（ａ）腫瘍抗原発現変調剤であることが予測される剤
を、腫瘍抗原発現腫瘍細胞と接触させ、（ｂ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現を
測定し、（ｃ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現が、このような接触の結果、例え
ば対照と比較することにより変調したか否かを決定することを含む。上方変調お
よび下方変調剤の両方を、同定することができる。腫瘍細胞および腫瘍細胞によ
り発現される腫瘍抗原は、前記した通りである。いくつかの態様において、腫瘍
抗原発現変調剤であることが予測される剤は、腫瘍細胞培養上清液、腫瘍細胞溶
離液または腫瘍細胞溶解液中に存在する剤である。

【００２０】 本発明の他の観点において、腫瘍抗原発現を上方調節する剤を単離する方法を
提供する。この方法は、（ａ）本発明の前述の方法のいずれかにより単離するこ
とができる腫瘍抗原発現下方調節剤を提供し、（ｂ）腫瘍細胞の培養物を調製し
、ここで、腫瘍細胞は、（ａ）の腫瘍抗原発現下方調節剤の単離において用いる
ものと同一であることができ、（ｃ）（ａ）の単離された腫瘍抗原発現下方調節
剤および（ａ）の単離された腫瘍抗原発現下方調節剤の推定の阻害剤を、（ｂ）
の培養細胞と接触させ、（ｄ）培養細胞における腫瘍抗原発現を決定し、および
（ｅ）（ｄ）において決定した腫瘍抗原発現を、対照と比較することを含む。腫
瘍細胞および腫瘍細胞により発現される腫瘍抗原は、前記した通りである。好ま
しい態様において、腫瘍細胞は、メラノーマ腫細胞であり、腫瘍抗原は、メラン
−Ａ／ＭＡＲＴ−１である。いくつかの態様において、対照の腫瘍抗原発現を、
（ａ）の剤の存在下および（ａ）の推定の阻害剤の不存在下で決定する。

【００２１】 本発明の他の観点において、メラノーマ腫を有する対象におけるメラノーマ腫
特異性免疫応答を増強させる方法を提供する。この方法は、このような治療を必
要としている対象に、（ｉ）実質的に純粋な有機剤または（ｉｉ）悪性メラノー
マ腫細胞単離物（これらのいずれかは、悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に
、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する
）に選択的に結合する単離された結合有機剤を、悪性メラノーマ腫細胞における
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調節を阻害し、対象におけるメラノーマ腫
特異性免疫応答を増強させるのに有効な量で投与することを含む。いくつかの態
様において、単離された結合有機剤は、少なくとも１種のポリペプチドである。
重要な態様において、ポリペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシンお
よび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されている。ある態様において
、この方法はさらに、対象に、本発明の剤以外の抗腫瘍剤を同時投与することを
含む。

【００２２】 他の観点において、また、メラノーマ腫を有する対象におけるメラノーマ腫特
異性免疫応答を増強するのに有用な医薬を製造する方法を提供する。 本発明のこれらのおよび他の観点並びに種々の利点および利用は、好ましい態
様の詳細な記載を参照して、一層明らかである。

【００２３】配列の簡単な説明 配列番号１は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１ペプチドの免疫優性アミノ酸配列で
ある。 配列番号２は、チロシナーゼについてのメラノサイトリニージ由来ペプチドで
ある。 配列番号３は、チロシナーゼについてのメラノサイトリニージ由来ペプチドで
ある。 配列番号４は、ＭＡＧＥ−３についてのメラノサイトリニージ由来ペプチドで
ある。

【００２４】発明の詳細な説明 本発明者等は、ここで、腫瘍細胞における腫瘍関連抗原の発現を変調させる剤
を同定する方法を記載する。本発明者等はまた、ここで、腫瘍細胞における腫瘍
関連抗原の発現を変調させるこのような剤を含む剤および医薬組成物を記載する
。前述のものは、特に、インビボまたはインビトロで、腫瘍関連抗原を発現する
細胞を有する腫瘍の成長を阻害する目的で、および腫瘍細胞における腫瘍関連抗
原の発現を変調させる追加の剤を同定するための種々のスクリーニングアッセイ
において用いることができる。

【００２５】 本発明者等は、予期されなかったことであるが、ＴＡＡを（細胞内で、または
これらの表面において）正常に発現するかまたは提示する(present)腫瘍細胞が
、高密度で培養した際には、このようなＴＡＡ発現／提示を「失う」（または下
方変調させる）ことを見出した。本発明者等はまた、予期されないことに、この
ようなＴＡＡ下方変調は、腫瘍細胞により分泌された剤により媒介される（即ち
オートクライン分泌／下方変調）ことを見出した。用語「下方変調（down-modul
ation）」および「上方変調（up-modulation）」は、本出願を通して、それぞれ
用語「下方調節（down-regulation）」および「上方調節（up-regulation）」と
相互交換可能に用いられる。

【００２６】 本明細書中で用いる「下方変調」（下方調節）は、腫瘍抗原（またはＴＡＡ）
発現の阻害を意味する。腫瘍抗原発現の阻害は、細胞内で、および／または腫瘍
細胞の表面において特異的な抗原の発現／提示を阻害する（即ち、検出可能な程
度に減少させる）ことを意味する。腫瘍抗原発現のこのような阻害を、抗原をコ
ードする遺伝子についてのｍＲＮＡのレベルまたは腫瘍抗原のペプチド発現のレ
ベルの低下を、業界において知られているすべての好適な手段、例えばそれぞれ
核酸ハイブリッド形成または好ましくは抗体検出方法を用いて検出することによ
り、直接決定することができる（例参照）。腫瘍抗原発現の阻害はまた、間接的
に、例えば腫瘍抗原を特異的に認識するＴＩＬによる腫瘍細胞溶解能力の変化を
検出することにより、決定することができる。

【００２７】 本発明は、１つの観点において、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方調節活性
を有する悪性メラノーマ腫細胞単離物に関する。従って、１つの重要な態様にお
いて、悪性メラノーマ腫細胞単離物は、この活性を阻害する結合剤のスクリーニ
ングにおいて有用である。単離物の活性の阻害は、増殖している細胞が、単離物
を分泌し、メラン−Ａ／ＭＡ−１抗原の発現を下方変調させて、免疫認識を逃避
し、成長および膨張を継続する、メラノーマ腫において望ましい。

【００２８】 悪性メラノーマ腫細胞に関して本明細書中で用いる「単離物」は、細胞の環境
から分離されたもの、例えば上清液、溶解物、このフラクション等を意味する。
「単離された」は、この生来の環境から分離され、この同定を可能にするかまた
は本発明において用いるのに十分な量で存在することを意味する。タンパク質ま
たはポリペプチドを意味する際に、「単離された」は、例えば：（ｉ）発現クロ
ーニングにより選択的に生成したか、または（ｉｉ）クロマトグラフィーまたは
電気泳動により部分的に精製されたことを意味する。単離されたタンパク質また
はポリペプチドは、実質的に純粋であることができるが、この必要はない。単離
されたタンパク質を、医薬製剤において、医薬的に許容し得る担体と混合するこ
とができるため、タンパク質は、小さい重量パーセントの製剤のみを含むことが
できる。タンパク質は、生体系と関連する、即ちある他のタンパク質から単離す
ることができる多くの物質から分離されているため、なお単離される。

【００２９】 本発明の重要な態様において、悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に悪性メ
ラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する剤は、実
質的に純粋であり、生来の生物的な有機剤である。好ましくは、この剤は、８０
℃で熱感受性であり、プロテナーゼＫ感受性であり、ブルーおよび／またはレッ
ドセファロース（登録商標）に結合し、溶離する。好ましくは、実質的に純粋な
有機剤は、少なくとも１つのポリペプチドである。重要な態様において、悪性メ
ラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方調節特性を有する少
なくとも１つのポリペプチドは、約２０ｋＤ〜約３０ｋＤ、および好ましくは約
２５ｋＤの分子量を有する。他の重要な態様において、悪性メラノーマ腫細胞と
接触させた際に悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を
下方調節する剤は、少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つのポ
リペプチドであり、各々のポリペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシ
ンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されている。

【００３０】 オンコスタチンＭは、Shoyab et al.による米国特許第5,618,715号の主題であ
り、これを、特別に、本出願中に参照により組み込む。 スタニオカルシンは、米国特許第5,994,301号、同第5,877,290号および同第5,
837,498号並びにWO 9524411の主題であり、これらすべてを、特別に本出願中に
参照により組み込む。 組織因子経路阻害剤−２は、米国特許第5,849,875号、同第5,773,251号、同第
5,576,294号、同第5,466,783号、同第5,106,833号および同第4,966,852号の主題
であり、これらすべてを、特別に本出願中に参照により組み込む。

【００３１】 悪性メラノーマ腫細胞単離物を、非均一タンパク質性溶液、例えば細胞培養上
清液または細胞ホモジネートから得ることができる。悪性メラノーマ腫細胞を、
対象から、腫瘍生検を用いて、生検試料を分離し、細胞懸濁液を形成することに
より、単離することができる。これらの悪性メラノーマ腫細胞懸濁液を、標準的
な細胞培養手法により培養することができる。小規模において、培養物を、培養
プレート、フラスコおよび皿中に含有させることができる。重要な態様において
、標準的な培養条件下で（例えば、「静的な」代表的培養プレート、フラスコお
よび皿において、即ち灌流していない）、培養条件は、５×１０^６細胞／培地１
ｍｌの比率を含む。比較的大きい規模において、培養物を、ローラービン、回転
フラスコ（即ち「静的でない」）および他の大規模培養容器、例えば発酵槽中に
含有させることができる。三次元、多孔質、固体マトリックス、および培地条件
の定常的な灌流における培養もまた、用いることができる。

【００３２】 有利には、悪性メラノーマ腫細胞単離物を、前述の細胞培養物の上清液から得
ることができるが、培養物全体をホモジナイズし、これに、悪性メラノーマ腫細
胞と接触させた際に悪性メラノーマ腫におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を
下方調節する悪性メラノーマ腫細胞単離物の単離のために以下に記載するステッ
プを施すことができる。典型的に、上清液を、吸引により、または細胞培養物の
遠心分離により除去して、細胞を除去する。また、培養物を濾過して、細胞およ
び細胞砕片を除去することができる。重要な態様において、採集された上清液は
、（この全体において）悪性メラノーマ腫細胞単離物である。

【００３３】 悪性メラノーマ腫細胞上清液を、標準的なクロマトグラフィー手順により分別
して、所望の剤のさらなる単離を促進することができる。当業者は、サイズ排除
クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫アフィニティー(i
mmune-affinity)クロマトグラフィー、電気泳動等を含むが、これには限定され
ないこのような手順に精通している。

【００３４】 好ましい態様において、次に、悪性メラノーマ腫細胞単離物を含む上清液のフ
ラクションを用いて、悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に悪性メラノーマ腫
細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する。フラクションの下
方調節活性を、前述のようにして、または例に一層詳細に記載するアッセイによ
り測定することができる。他の好適な方法は、当業者に知られており、ルーチン
の実験を用いて適用することができる。

【００３５】 悪性メラノーマ腫細胞単離物について陽性のフラクションに、前述の方法論を
用いて、追加のラウンドのスクリーニングを施すことができる。フラクションの
純度を、各々のラウンドの培養物刺激の後に、フラクションのアリコートに、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥまたはフラクション中の構成成分の混合物を視覚化するための他
の分析方法を施すことにより、評価することができる。タンパク質、核酸、脂質
、炭水化物等としての悪性メラノーマ腫細胞単離物の性質を、すべての時点にお
いて、陽性のフラクションのアリコートを、前述の群の分子についての非特異性
分解酵素で処理し、処理したフラクションを前に詳細に記載したものと同一のア
ッセイにおいて試験することにより、確認することができる。

【００３６】 次に、悪性メラノーマ腫細胞単離物を、所望により、免疫学的および分子生物
学的方法を用いて、活性下方調節剤についてさらに精製することができる（例え
ば、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, J. Sambrook, et al.編、第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1
989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al.編
、John Wiley & Sons, Inc., New York参照）。例えば、十分に精製された１種
の活性な剤（例えば、８０℃で熱感受性であり、プロテナーゼＫ感受性であり、
ブルーセファロース（登録商標）に結合し、溶離し、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１
発現下方変調活性を有する剤）について陽性のフラクションに、標準的な方法に
よるタンパク質配列決定を施すことができる。

【００３７】 例えば、フラクションにＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、膜、例えばポリビニリデン
フルオリドにエレクトロブロッティング(electroblotting)により移送し、Ｎ末
端アミノ酸配列を、エドマン分解、質量分光等により決定することができる。す
べての配列情報を用いて、存在するタンパク質に対する相同性についてのデータ
ベースをスクリーニングし、また標準的な方法、例えばコロニーハイブリッド形
成またはポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
るのに有用な分解核酸を生じることができる。あるいはまた、陽性のフラクショ
ンを用いて、悪性メラノーマ腫細胞単離物を認識する抗体を生じることができる
。次に、このような抗体を、発現クローニングプロトコル、ウエスタンブロット
および悪性メラノーマ腫細胞単離物の単離に有用な他の手法において用いること
ができる。前述の方法において、すべてのｃＤＮＡライブラリー、発現ライブラ
リー等を、好ましくは悪性メラノーマ腫細胞から作成する。

【００３８】 重要な態様において、悪性メラノーマ腫細胞単離物は、少なくとも１つ、少な
くとも２つまたは少なくとも３つのポリペプチドを含み、各々のポリペプチドは
、オンコスタチンＭ、スタニオカルシンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる
群から選択されている。

【００３９】 本発明はまた、抗体および悪性メラノーマ腫細胞単離物の細胞結合パートナー
、例えばレセプターまたはリガンドを含む、本明細書中に開示する悪性メラノー
マ腫細胞単離物に結合する剤を単離することを可能にする。悪性メラノーマ腫細
胞単離物または下方調節活性を有する活性剤が、実質的に純粋である後に、これ
を用いて、例えば標準的な方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体を生成することができる（例えば、HarlowおよびLane編、Antibodies: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988
参照）。

【００４０】 悪性メラノーマ腫細胞単離物中の活性剤に結合する有機剤を、例えば、スクリ
ーニングアッセイにおいて用いて、悪性メラノーマ腫細胞単離物中の活性剤およ
び活性剤とこれらのそれぞれの結合パートナーとの複合体の存在または不存在を
検出し、精製プロトコルにおいて、悪性メラノーマ腫細胞単離物中の活性剤を単
離することができる。また、結合有機剤を用いて、悪性メラノーマ腫細胞におけ
るＴＡＡ発現を下方調節する剤の効果を遮断することができる。

【００４１】 従って、本発明は、例えば、悪性メラノーマ腫細胞単離物中の１または２以上
の活性剤に選択的に結合する能力を有する抗体または抗体のフラグメントであり
、単離物中の１または２以上の剤のメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調特性
を阻害することができる、有機結合剤を包含する。重要な態様において、有機結
合剤は、ペプチドである。他の重要な態様において、ペプチド結合剤は、メラン
−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調活性を有する〜２５ｋＤポリペプチドに選択的
に結合し、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方
調節を阻害し、これにより、ＴＩＬおよび免疫系の他の細胞が、悪性メラノーマ
腫細胞を異物として認識することを可能にし、これらの除去をもたらす。有機結
合ペプチドは、従来の方法論において製造される、ポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体を含む抗体であることができる。重要な態様において、有機結
合ペプチドは、１または２以上のポリペプチドに結合する抗体であり、各々のポ
リペプチドは、オンコスタチンＭ、スタニオカルシンおよび組織因子経路阻害剤
−２からなる群から選択される。

【００４２】 抗オンコスタチンＭ抗体は、業界において知られており、Research Diagnosti
cs, Flanders, NJからのマウスおよびヤギ抗ヒトオンコスタチンＭを含む。 抗スタニオカルシン抗体およびこのような抗体を製造する方法は、業界におい
て知られており、これらのいくつかは、Olsenによる米国特許第5,877,290号に詳
細に記載されている。 抗組織因子経路阻害剤抗体もまた、業界において知られており、Enzyme Resea
rch Laboratories, South Bend, INからのヒツジ抗ヒト組織因子経路阻害剤抗体
を含む。

【００４３】 業界に十分知られているように、小さい部分の抗体分子、パラトープのみが、
顕著に抗体のこのエピトープへの結合に関与する（一般的に、Clark, W.R. (198
6) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc.,
New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 第７版、Blackwell Scie
ntific Publications, Oxford参照）。例えば、ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補
体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が
酵素的に開裂したか、またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントを表すｐＦｃ’領域を
伴わずに生成した抗体は、原型を保った抗体の抗原結合部位の両方を保持する。
同様に、Ｆｃ領域が酵素的に開裂したか、またはＦａｂフラグメントを表すＦｃ
領域を伴わずに生成した抗体は、原型を保った抗体分子の抗原結合部位の１つを
保持する。さらに進めると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合抗体軽鎖およびＦ
ｄを示す抗体重鎖の部分からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決
定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに、１０種
までの異なる軽鎖に関連することができる）、Ｆｄフラグメントは、単離におけ
るエピトープ結合能力を保持する。

【００４４】 業界において十分知られているように、抗体の抗原結合部分内に、相補性決定
領域（ＣＤＲ）があり、これは、抗原のエピトープおよびフレームワーク領域（
ＦＲ）と直接相互作用し、これは、パラトープの三次構造を維持する（一般的に
、Clark, 1986; Roitt, 1991参照）。重鎖ＦｄフラグメントおよびＩｇＧ免疫グ
ロブリンの軽鎖の両方に、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３
）により分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）がある。ＣＤ
Ｒおよび特にＣＤＲ３領域およびさらに特に重鎖ＣＤＲ３は、大いに抗体特異性
の原因となる。

【００４５】 哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域が、同種特異性または異種特異性抗体の同様の領域
で置換され、一方最初の抗体のエピトープ特異性を維持することができることは
、現在では業界において十分に確立されている。このことは、「ヒト化された」
抗体の開発および使用において最も明白に明示されており、ここで、非ヒトＣＤ
Ｒは、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有的に接合されて、機能
的抗体が得られる。従って、例えば、ＰＣＴ国際公開第WO92/04381号には、ヒト
化されたマウスＲＳＶ抗体の生成および使用が教示されており、ここで、マウス
ＦＲ領域の少なくとも一部は、ヒト起源のＦＲ領域により置換されている。抗原
結合能力を有する原型を保った抗体のフラグメントを含む、このような抗体は、
しばしば「キメラの」抗体と呼ばれる。

【００４６】 従って、当業者には明らかなように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ
、ＦｖおよびＦｄフラグメント；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ
１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは
非ヒト配列で置換されたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／また
はＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列で置
換されたキメラＦ（ａｂ’）_２フラグメント抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１
および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは非
ヒト配列で置換されたキメラＦａｂフラグメント領域；並びにＦＲおよび／また
はＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列で置換さ
れたキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体
を含む。

【００４７】 従って、本発明は、悪性メラノーマ腫細胞単離物中の活性剤および悪性メラノ
ーマ腫細胞単離物中の活性剤とこの結合パートナーとの両方の複合体に特異的に
結合する、多種の大きさおよびタイプのポリペプチドを含む。これらの特異的に
結合するポリペプチドはまた、抗体技術以外の給源から由来することができる。
例えば、このようなポリペプチド結合剤を、溶液において、固定された形態で、
またはファージディスプレイライブラリーとして容易に調製することができる分
解ペプチドライブラリーにより、提供することができる。また、１種または２種
以上のアミノ酸を含むペプチドの組み合わせライブラリーを、合成することがで
きる。さらに、ペプチドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーを、合成する
ことができる。

【００４８】 本明細書中に詳細に記載したように、例えば、前述の抗体および他の結合分子
を用いて、タンパク質を発現する組織を同定するかまたはタンパク質を精製する
ことができる。また、抗体を、細胞を造形するための特定の診断標識剤および悪
性メラノーマ腫細胞単離物中の活性剤を発現する組織に結合させることができる
。

【００４９】 腫瘍抗原発現下方調節剤である剤は、腫瘍細胞培養上清液、腫瘍細胞溶離液お
よび／または腫瘍細胞溶解物中に存在する剤である。腫瘍細胞は、免疫認識を逃
避すると考えられる癌または腫瘍タイプであることができる。このような癌また
は腫瘍は、以下の起源であることができる：胆管癌；神経膠芽腫および髄芽腫を
含む脳癌；乳癌；頸部癌腫；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性
リンパ球および骨髄性白血病を含む血液学的新生物；多発性骨髄腫；白血病およ
び成体Ｔ細胞白血病リンパ腫に関連するＡＩＤＳ；ボーエン病およびパジェット
病を含む上皮細胞間新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ
腫を含むリンパ腫；神経芽腫；鱗状細胞癌腫を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞
、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直
腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；
メラノーマ腫、カポジ肉腫、底細胞癌および鱗状細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（
セミノーマ、非セミノーマ［奇形腫、絨毛癌］）、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍
を含む精巣癌；甲状腺腺癌および骨髄癌腫を含む甲状腺癌；並びに腺癌およびウ
ィルムス腫瘍を含む腎臓癌。

【００５０】 ある態様において、腫瘍抗原は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペ
プチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤ
Ａｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ
／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびこの免疫原性エピトープＣＡＰ−
１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）および
この免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異
性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡ
ＧＥ族、ＧＡＧＥ−１，２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、Ｃ
ＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、
ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテ
ニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡ
ＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポシスタンパク質（ＡＰ
Ｃ）、フォドリン、腫瘍抗原のＳｍａｄ族、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード化核抗原
（ＥＢＮＡ）−１またはｃ−ｅｒｂＢ−２であることができる。前述の態様すべ
てにおいて、複数のフラクションからのフラクションは、希釈されていないかま
たは濃縮されていることができる。

【００５１】 重要な態様において、免疫認識から逃避する癌または腫瘍およびこのような腫
瘍と関連する腫瘍抗原には、急性リンパ芽球白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シク
ロフィリンｂ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ
−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆管癌（ｐ２１ｒａ
ｓ）、乳癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部癌腫（ｐ
５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌腫（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２；ＭＵＣ族）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７
−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリ
ンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質
）、肝臓癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮ
Ａ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球細胞由
来白血病（シクロフィリンｂ）、骨髄腫（ＭＵＣ族；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞
肺癌腫（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢ
ＮＡ−１）、卵巣癌癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前
立腺癌（前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびこの免疫原性エピトープＰＳＡ−１
、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−
２）、膵臓癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２
；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）
、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）およ
びメラノーマ腫（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２
１ｒａｓ；ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}）が含まれる（しかし限定的ではない）。
本発明の教示が与えられると、当業者は、このような腫瘍抗原を容易に同定し、
本発明の方法を適用して、このような抗原の発現を変調させる剤を同定すること
ができる。

【００５２】 本明細書中で用いられる対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒ
ツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯目である。すべての態様において、ヒト対
象が、好ましい。

【００５３】 治療的に用いる際には、本発明の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下
方変調阻害剤を、治療的に有効な量で投与する。一般的に、治療的に有効な量は
、治療される特定の症状の開始を遅延させ、進行を阻害し、または全体的に停止
させるのに必要な量を意味する。一般的に、治療的に有効な量は、対象の年齢、
症状および性別並びに対象の疾患の性質および程度に伴って変化し、これらすべ
ては、当業者により決定することができる。投与量は、特にすべての合併症を考
慮して、個別の医師または獣医により調整することができる。治療的に有効な量
は、代表的に、１日または２日以上にわたり、毎日１または２以上の用量投与に
おいて、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ
／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ
／ｋｇで変化する。

【００５４】 本発明の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤の治療的に
有効な量は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現下方変調を阻害するのに有効な
量であり、例えば、業界において知られている標準的な試験を用いて決定するこ
とができる。例えば、腫瘍抗原（例えばメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１）発現腫瘍細
胞（例えばメラノーマ腫）を測定する直接的な方法は、腫瘍抗原に特異的な抗体
および多数の業界において十分知られている免疫細胞化学的および免疫組織化学
的プロトコルを用いることである。例えば、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原に特
異的な抗体は、Chen et al.による米国特許第5,674,749号、題名：「腫瘍拒絶抗
原前駆体メラン−Ａに結合するモノクローナル抗体およびこの使用」中に完全に
記載されている。

【００５５】 さらに、本発明の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤（
即ち、本発明の腫瘍抗原（ＴＡＡ）発現上方調節分子）を、腫瘍抗原を発現する
（および、オートクライン分泌下方変調により考えられる）癌を治療または防止
するための、本発明の剤と共同に、付加的にまたは相乗的に作用することができ
る、本発明の剤以外の抗癌剤（例えば、単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発
現下方変調阻害剤以外）と同時投与することができる。用語「同時投与」は、他
の剤（例えば、異なるかまたは同一の組成物／配合物）とほぼ同時に投与するこ
とを意味する。「ほぼ同時に」により、本発明のメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現
下方変調阻害剤を、対象に、他の剤（例えば抗癌剤）の投与と時間的に十分接近
させて投与して、これにより、２種の剤が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を上
方調節し、癌の成長および／または増殖を阻害する、付加的なまたはさらに相乗
的な効果を奏することができることを意味する。

【００５６】 本発明の剤以外の抗癌剤には、以下のものが含まれるが、これには限定されな
い： アシビチン；アクラルビチン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン
；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロンアセテ
ート；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシ
ン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシ
ン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナ
フィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシンサルフェート；ブレキナーナ
トリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；

【００５７】 カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カ
ルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマ
イシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホス
ファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸
塩；デシタビン；デキソーマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート
；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロ
ロキシフェン；ドロロキシフェンシトレート；ドロモスタノロンプロピオネート
；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトル
シン；エンロプラチン；

【００５８】 エンプロメート；エピプロピジン；エピルビチン塩酸塩；エルブロゾール；エソ
ルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンホスフェートナトリウム
；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドホスフェート；エトプリン；ファド
ロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルダラビ
ンホスフェート；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエ
シンナトリウム；ジェンシタビン；ジェンシタビン塩酸塩；オキシ尿素；イダル
ビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；イ
ンターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ
３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；
イリノテカン塩酸塩；ランレオチドアセテート；

【００５９】 レトロゾール；ロイプロリドアセテート；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソー
ルナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタ
ンシン；メクロレタミン塩酸塩；メジェストロールアセテート；メレンジェスト
ロールアセテート；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキ
セート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メチュレデパ；ミチンドマ
イド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイ
トマイシン；マイトスパー；マイトタン；マイトキサントロン塩酸塩；マイコフ
ェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オーマプラチン；オキシスラン；

【００６０】 パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロ
マイシンサルフェート；パーホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピ
ロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポドフィロックス；ポ
ーファイマーナトリウム；ポーフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバ
ジン塩酸塩；プロマイシン；プロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；
ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラ
ゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸
塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン
；スロフェヌル；

【００６１】 タリソマイシン；タキソテア；テコガランナトリウム；テガフル；テロキサント
ロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チ
アミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカ
ン塩酸塩；トレミフェンシトレート；トレストロンアセテート；トリシリビンホ
スフェート；トリメトレキセート；トリメトレキセートグルクロネート；トリプ
トレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド
；バーテポルフィン；ビンブラスチンサルフェート；ビンクリスチンサルフェー
ト；ビンデシン；ビンデシンサルフェート；ビネピジンサルフェート；ビングリ
シネートサルフェート；ビンリューロシンサルフェート；ビノレルビンタータレ
ート；ビンロシジンサルフェート；ビンゾリジンサルフェート；ボロゾール；ゼ
ニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。

【００６２】 前述の薬剤療法は、当業者に十分知られており、当業者に知られている方式に
より投与される。薬剤療法は、本発明の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発
現下方変調阻害剤と組み合わせて、生理学的目的を達成するのに有効である量で
投与する。

【００６３】 単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤（腫瘍抗原（ＴＡＡ
）発現上方調節分子）を、単独で、または医薬組成物の一部として前述の薬剤療
法と組み合わせて投与することができる。このような医薬組成物は、単離された
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤を、業界において知られているす
べての標準的な生理学的および／または医薬的に許容し得る担体と組み合わせて
含むことができる。この組成物は、無菌であり、患者に投与するのに好適な重量
または容量の単位で、治療的に有効な量の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１
発現下方変調阻害剤を含むことができる。本明細書中で用いる用語「医薬的に許
容し得る担体」は、ヒトまたは他の動物中に投与するのに適する、１種または２
種以上の適合性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。

【００６４】 用語「担体」は、活性成分を組み合わせて適用を容易にする、有機または無機
成分、天然物質または合成物質を示す。また、医薬組成物の成分は、所望の医薬
的効能を実質的に損なう相互作用がないように、本発明の分子とおよび互いに共
同混合することが可能である。「医薬的に許容し得る」は、さらに、生物学的系
、例えば細胞、細胞培養物、組織または有機体と適合性である無毒性物質を意味
する。担体の特性は、投与の経路に依存する。生理学的および医薬的に許容し得
る担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および業界において
十分知られている他の物質を含む。

【００６５】 種々の投与経路が有用である。選択された特定の方式は、当然、選択された特
定の薬剤、治療される症状の重篤度および治療効率に必要な投与量に依存する。
本発明の方法は、一般的に、医学的に許容し得るすべての投与の方式（臨床的に
許容し得ない悪影響を生じずに活性化合物の有効レベルをもたらすすべての方式
を意味する）を用いて実施することができる。このような投与の方式には、経口
、直腸内、局所的、鼻腔内、皮内または非経口経路が含まれる。用語「非経口」
には、皮下、静脈内、筋肉内または注入が含まれる。静脈内または筋肉内経路は
、長期間療法および予防には特に好適ではない。しかし、これらは、緊急の状態
においては好ましいことがあり得る。経口投与は、患者および投与スケジュール
に対する有利のために、予防治療に好適である。

【００６６】 非経口投与に好適な組成物は、有利には、好ましくは受容体の血液と等張であ
る、単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤の無菌の水性製剤
を含む。この水性製剤は、好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて、既知
の方法により処方することができる。無菌の注射可能な製剤はまた、例えば、１
，３−ブタンジオール中の溶液としての、無毒性の、非経口的に許容し得る希釈
剤または溶媒中への無菌の注射可能な溶液または懸濁液とすることができる。用
いることができる許容し得る賦形剤および溶媒の中には、水、リンガー溶液およ
び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁
媒体として有利に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリド
を含む、すべての無菌性の固定油を用いることができる。さらに、脂肪酸、例え
ばオレイン酸を、注射可能物質の製剤において用いることができる。経口、皮下
、静脈内、筋肉内等の投与に好適な担体配合物は、Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA中に見出すことができる。

【００６７】 医薬製剤は、有利には、単位投与形態で提供することができ、医薬の業界にお
いて十分知られているすべての方法により製造することができる。すべての方法
は、単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤を、１種または２
種以上の付属的成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般的に、組
成物を製造するには、単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻害剤
を、液体担体、微細に分割された固体担体またはこれらの両方と均一におよび密
に関連させ、次に、所要に応じて生成物を成形する。

【００６８】 経口投与に好適な組成物は、個別の単位、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジと
して提供することができ、各々は、所定量の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−
１発現下方変調阻害剤を含む。他の組成物は、水性液体または非水性液体、例え
ばシロップ、エリクシルまたは乳濁液中の懸濁液を含む。

【００６９】 他の送達系は、時間放出、遅延放出または持続放出送達系を含むことができる
。このような系は、前述の単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻
害剤の繰り返された投与を回避し、対象および医師に対する有利を増強すること
ができる。放出送達系の多くのタイプは、入手でき、当業者に知られている。こ
れらは、前述の重合体系および重合体ベース系、例えばポリ（ラクチド−グリコ
リド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリ
オルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物を含む。薬剤を含む前
述の重合体の微小カプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号に記載されてい
る。送達系はまた、非重合体系を含み、これは、以下のものである：ステロール
、例えばコレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪
、例えばモノ、ジおよびトリグリセリドを含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラス
ティック(sylastic)系；ペプチドに基づく系；ワックス被膜；従来の結合剤およ
び補形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に融解した移植片等。

【００７０】 具体的な例には：（ａ）単離されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調阻
害剤が、米国特許第4,452,775号、同第4,675,189号および同第5,736,152号に記
載されているマトリックス内にある形態で含有された腐食系および（ｂ）活性成
分が、例えば米国特許第3,854,480号、同第5,133,974号および同第5,407,686号
に記載されている重合体から制御された速度で浸透する拡散系が含まれるが、こ
れには限定されない。さらに、いくつかが移植に適合している、ポンプに基づく
ハードウエア送達系を用いることができる。

【００７１】 長期間持続放出移植片を用いることは、慢性症状の治療に得に好適であり得る
。長期間放出は、ここで用いられ、移植片を、治療的レベルの活性成分の少なく
とも３０日および好ましくは６０日にわたる送達のために構成し、配置すること
を意味する。長期間持続放出移植片は、当業者に十分知られており、前述の放出
系のいくつかを含む。

【００７２】 本発明はまた、腫瘍細胞由来腫瘍抗原発現下方調節剤を単離する方法を包含す
る。本発明のこの観点による方法は、代表的に：（ａ）下方調節された腫瘍抗原
発現を有する腫瘍細胞の培養物を調製し、（ｂ）腫瘍抗原発現下方調節剤を含む
ことが疑われる上清液または細胞単離物を、下方調節された腫瘍抗原発現を有す
る腫瘍細胞の培養物から単離し、（ｃ）該上清液または細胞単離物を複数のフラ
クションに分別し、（ｄ）複数のフラクションからのフラクションを、腫瘍抗原
発現腫瘍細胞と接触させ、（ｅ）腫瘍抗原発現細胞における腫瘍抗原発現を測定
し、および（ｆ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現が、このような接触の結果、例
えば対照と比較することにより下方調節されたか否かを決定することを含む。代
表的に、ステップ（ｄ）において、ステップ（ａ）の下方調節された腫瘍抗原発
現細胞を有する腫瘍細胞の培養物の上清液（細胞単離物またはこのフラクション
）と接触させた、腫瘍抗原発現細胞は、ステップ（ａ）の下方調節された腫瘍抗
原発現細胞を有する腫瘍細胞と同一の起源（即ち、患者／組織／細胞系供給源）
であり、唯一の差異は、腫瘍抗原発現細胞が、尚腫瘍抗原を発現することである
。

【００７３】 いくつかの態様において、腫瘍細胞の起源は、以下のものであることができる
：胆管癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌；乳癌；頸部癌腫；絨毛癌；結腸
癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ球性および骨髄性白血病を含む血液
学的新生物；多発性骨髄腫；白血病および成体Ｔ細胞白血病リンパ腫に関連する
ＡＩＤＳ；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮細胞間新生物；肝臓癌；肺
癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；鱗状細胞
癌腫を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるも
のを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉
腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ腫、カポージ肉腫、底細胞癌
および鱗状細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（セミノーマ、非セミノーマ［奇形腫、
絨毛癌］）、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌および骨髄
癌腫を含む甲状腺癌；並びに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。

【００７４】 ある態様において、腫瘍抗原は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペ
プチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤ
Ａｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ
／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびこの免疫原性エピトープＣＡＰ−
１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）および
この免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異
性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡ
ＧＥ族、ＧＡＧＥ−１，２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、Ｃ
ＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、
ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテ
ニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡ
ＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポシスタンパク質（ＡＰ
Ｃ）、フォドリン、腫瘍抗原のＳｍａｄ族、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード化核抗原
（ＥＢＮＡ）−１またはｃ−ｅｒｂＢ−２であることができる。前述の態様すべ
てにおいて、複数のフラクションからのフラクションは、希釈されていないかま
たは濃縮されていることができる。

【００７５】 重要な態様において、免疫認識から逃避する癌または腫瘍およびこのような腫
瘍と関連する腫瘍抗原には、急性リンパ芽球白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シク
ロフィリンｂ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ
−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆管癌（ｐ２１ｒａ
ｓ）、乳癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部癌腫（ｐ
５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌腫（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒ
ｂＢ−２；ＭＵＣ族）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７
−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリ
ンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質
）、肝臓癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮ
Ａ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球細胞由
来白血病（シクロフィリンｂ）、骨髄腫（ＭＵＣ族；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞
肺癌腫（ＨＥＲ２／ＮＥＵ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢ
ＮＡ−１）、卵巣癌癌（ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前
立腺癌（前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびこの免疫原性エピトープＰＳＡ−１
、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−
２）、膵臓癌（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣ族；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２
；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）
、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）およ
びメラノーマ腫（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２
１ｒａｓ；ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}）が含まれる（しかし限定的ではない）。
前述の態様すべてにおいて、複数のフラクションからのフラクションは、希釈さ
れていないかまたは濃縮されていることができる。

【００７６】 腫瘍細胞単離物を、非均一タンパク質性溶液、例えば細胞培養上清液または細
胞ホモジネートから得ることができる。腫瘍細胞を、対象から、腫瘍生検を用い
て、生検試料を分離し、細胞懸濁液を形成することにより、単離することができ
る。これらの腫瘍細胞懸濁液を、標準的な細胞培養手法により培養することがで
きる。小規模において、培養物を、培養プレート、フラスコおよび皿中に含有さ
せることができる。標準的な培養条件下で（例えば、「静的」である−即ち灌流
していない、および／または移動していない、代表的な培養プレート、フラスコ
および皿上で）、５×１０^６細胞／ｍｌの培地の比率が、代表的に、本発明の活
性剤を得るのに十分であり、この効果を例証することができるのに十分である。
前述の「代表的な」細胞／ｍｌの培地の比率は、当然、細胞のタイプ、腫瘍のス
テップ等により変化することができ、当業者は、ルーチンの実験を用いて、個別
の細胞タイプ基準あたりで最適な培養条件を容易に決定することができる。この
ような条件はまた、大規模細胞培養を用いる（例えば、ローラービン、回転フラ
スコ、発酵槽、三次元多孔質固体マトリックスおよび培地条件の定常的な灌流の
使用）際に変化する。

【００７７】 有利には、腫瘍細胞単離物を、前述の細胞培養物の上清液［即ち、ステップ（
ａ）の培養した細胞のもの］から得ることができるが、培養物全体を、ホモジナ
イズし、これに、以下に記載するステップを施して、腫瘍抗原を発現する腫瘍細
胞と接触させた際に、腫瘍抗原発現を下方調節する腫瘍細胞単離物を単離するこ
とができる。代表的に、上清液を、吸引により、または細胞培養の遠心分離によ
り除去して、細胞を除去する。また、培養物を濾過して、細胞および細胞砕片を
除去することができる。重要な態様において、採集された上清液は、（この全体
において）腫瘍細胞単離物である。

【００７８】 腫瘍細胞上清液を、標準的なクロマトグラフィー手順により分別して、所望の
剤のさらなる単離を促進することができる。当業者は、サイズ排除クロマトグラ
フィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフ
ィー等を含むが、これに限定されないこのような手順に精通している。

【００７９】 好ましい態様において、次に、腫瘍細胞単離物を含む上清液のフラクションを
用いて、腫瘍細胞と接触させた際に腫瘍細胞における腫瘍抗原発現を下方調節す
る。フラクションの下方調節活性を、本明細書中の他の箇所に記載するアッセイ
により測定することができる。他の好適な方法は、当業者に知られており、ルー
チンの実験を用いて適用することができる。このような接触の結果、腫瘍細胞に
おける腫瘍抗原発現が下方調節されたか否かを決定することは、対照との比較に
より促進される。代表的な対照は、同一に単離された、および培養された細胞を
含み、例外は、対照培養物中の上清液培地を、培養期間の間に、規則的な間隔で
（例えば２〜６時間おきに）取り出し、新たな培養基で置換することである。こ
の培地交換により、対照腫瘍細胞単離物が対照腫瘍細胞腫瘍抗原発現に対して発
揮し、楽にするすべての下方調節効果が効率的に消失。

【００８０】 腫瘍細胞単離物について陽性のフラクションに、前述の方法論を用いて、追加
のラウンドのスクリーニングを施すことができる。フラクションの純度を、各々
のラウンドの培養物刺激の後に、フラクションのアリコートに、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅまたはフラクション中の構成成分の混合物を視覚化するための他の分析方法を
施すことにより、評価することができる。タンパク質、核酸、脂質、炭水化物等
としての腫瘍細胞単離物の性質を、すべての時点において、陽性のフラクション
のアリコートを、前述の群の分子についての非特異性分解酵素で処理し、処理し
たフラクションを前に詳細に記載したものと同一のアッセイにおいて試験するこ
とにより、確認することができる。次に、腫瘍細胞単離物を、活性下方調節剤に
ついて、所要に応じて、免疫学的および分子生物学的方法を用いて、さらに精製
することができる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sam
brook, et al.編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.
M. Ausubel, et al.編、John Wiley & Sons, Inc., New York参照）。

【００８１】 本発明は、他の観点において、腫瘍抗原発現変調剤をスクリーニングする方法
を提供する。この方法は、（ａ）腫瘍抗原発現変調剤であることが予測される剤
を、腫瘍抗原発現腫瘍細胞と接触させ、（ｂ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現を
測定し、（ｃ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現が、このような接触の結果、例え
ば対照と比較することにより変調したか否かを決定することを含む。上方変調お
よび下方変調剤の両方を、このような方法を用いて同定することができる。腫瘍
細胞および腫瘍細胞により発現される腫瘍抗原は、前記した通りである。いくつ
かの態様において、腫瘍抗原発現変調剤であることが予測される剤は、腫瘍細胞
培養上清液、腫瘍細胞溶離液または腫瘍細胞溶解液中に存在する剤である。

【００８２】 本発明の他の観点において、腫瘍抗原発現を上方調節する剤を単離する方法を
提供する。この方法は、（ａ）本発明の前述の方法のいずれかにより単離するこ
とができる腫瘍抗原発現下方調節剤を提供し、（ｂ）腫瘍細胞の培養物を調製し
、ここで、腫瘍細胞は、本発明の前述の方法のすべてにより単離することができ
る腫瘍抗原発現下方調節剤の単離において用いるものと同一であることができ（
患者／組織／細胞系供給源について）、（ｃ）単離された腫瘍抗原発現下方調節
剤およびこの推定の阻害剤を、ステップ（ｂ）の培養細胞と接触させ、（ｄ）培
養細胞における腫瘍抗原発現を決定し、および（ｅ）（ｄ）において決定した腫
瘍抗原発現を、対照と比較することを含む。腫瘍細胞および腫瘍細胞により発現
される腫瘍抗原は、前記した通りである。好ましい態様において、腫瘍細胞は、
メラノーマ腫細胞であり、腫瘍抗原は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１である。いく
つかの態様において、対照の腫瘍抗原発現を、（ａ）の剤の存在下および（ａ）
の推定の阻害剤の不存在下で決定する。対照は、代表的には、前に記載した前述
の対照培養物に類似する培養物を含む。

【００８３】 前の段落に記載したように、この方法は、単離された腫瘍抗原発現下方調節剤
およびこの推定の阻害剤を、腫瘍細胞の培養物と接触させることを含み、ここで
、腫瘍細胞は、腫瘍抗原発現下方調節剤の単離において用いられるものと同一で
あることができる（患者／組織／細胞系供給源について）。代表的に、複数の培
養物を、平行して実施し、各々の培養物は、異なる濃度の推定の阻害剤を含んで
、異なるレベルの腫瘍抗原発現を得る。代表的に、これらの濃縮物の１つは、負
の対照として、即ち、剤の０の濃度において、またはアッセイ検出の限界よりも
低い剤の濃度において、作用する。推定の阻害剤は、多数の化学的群を含むが、
代表的には、これらは、有機化合物である。ある態様において、推定の阻害剤は
、小さい有機化合物、即ち、５０より大きいが約２５００より小さい、好ましく
は約１０００より小さい、およびさらに好ましくは約５００より小さい分子量を
有するものである。

【００８４】 推定の阻害剤は、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的相互作用に必要
な官能化学基を含み、代表的に、少なくともアミン、カルボニル、水酸またはカ
ルボキシル基、好ましくは官能化学基の少なくとも２つ、さらに好ましくは官能
化学基の少なくとも３つを含む。推定の阻害剤は、１つまたは２つの前に定義し
た官能基で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族または
ポリ芳香族構造を含むことができる。推定の阻害剤はまた、生体分子、例えばペ
プチド、サッカリド、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジ
ン、前述のものの誘導体または構造的類似体またはこの組み合わせ等であること
ができる。いくつかの態様において、推定の阻害剤は、単離された腫瘍抗原発現
下方調節剤（例えば抗体）に結合するポリペプチドである。剤が核酸である場合
において、剤は、代表的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、本明細書中に
定義された修飾された核酸もまた、予期される。

【００８５】 推定の阻害剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む種々の給源から
得られる。例えば、多数の手段が、広範囲の有機化合物および生体分子の無秩序
および方向づけられた合成に有用であり、これには、無秩序化されたオリゴヌク
レオチド、合成有機組み合わせライブラリー、無秩序ペプチドのファージディス
プレイライブラリー等の発現が含まれる。あるいはまた、細菌類、真菌類、植物
および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、入手できるかまたは容
易に生成される。さらに、天然の、および合成的に生成したライブラリーおよび
化合物を、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾すること
ができる。さらに、既知の医薬的剤に、方向づけられたかまたは無秩序の化学的
修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等を施して、剤の構
造的類似体を生成することができる。

【００８６】 種々の他の試薬もまた、培養基中に包含させることができる。これらは、試薬
、例えば中性タンパク質（例えばアルブミン）等を含み、これを用いて、最適な
タンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合を促進することが
できる。このような試薬はまた、反応成分の非特異的または背景相互作用を減少
することができる。試薬が、培養物中の細胞の成長に悪影響を与えない場合には
、培養アッセイの効率を改善する他の試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレ
アーゼ阻害剤、抗菌剤等もまた用いることができる。

【００８７】 成分を加える順序、インキュベーション温度、インキュベーションの時間およ
びアッセイの他のパラメーターを、容易に決定することができる。このような実
験は、単にアッセイパラメーターの最適化を含み、アッセイの基本的組成を含ま
ない。好ましくは、単離された腫瘍抗原発現下方調節剤およびこの推定の阻害剤
を、これらを細胞培養物に加える前に、一緒に接触させることができる。このよ
うな状況のしたで、インキュベーション温度は、代表的には４℃〜４０℃である
。インキュベーション時間を、好ましくは最小化して、迅速な高い処理量のスク
リーニングを促進し、これは、代表的には０．１〜１０時間である。インキュベ
ーションの後、単離された腫瘍抗原発現下方調節剤およびこの推定の阻害剤を、
腫瘍細胞培養物に加え、細胞培養条件においてさらにインキュベートした後（代
表的には１〜４８時間）、腫瘍抗原発現を、前記の使用者に有用なすべての有利
な方法により検出する。

【００８８】 本発明は、以下の例を参照することにより、一層完全に理解される。しかし、
これらの例は、単に本発明の態様を例示することを意図し、本発明の範囲を限定
するものと解釈するべきではない。

【００８９】例 実験手順 材料および方法 腫瘍および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ） メラノーマ腫組織からのメラノーマ腫および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、
承認されたMassachusetts General Hospitalガイドラインに従って得、前に記載
したようにインビトロで増殖させた(Hishii M, et al., Proc. Natl. Acad Sci
USA, 1997, 94:1378-1383)。要するに、腫瘍を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥ
Ｍ培地中で培養し、ＴＩＬを、１００ユニット／ｍｌで組み換えヒトＩＬ−２を
含む５％ヒト血清(Cetus, Emoryville, CA)を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増
殖させた。ＴＩＬクローンを、前に記載したように、限定希釈により単離した(H
ishii M, et al., 同上)。要するに、ＴＩＬを、照射した単核供給細胞を前に記
載したようにポリクローナル刺激としてＰＨＡと共に用いて、限定希釈によりク
ローン化した。限定希釈を、クローニングの２週間前に培養物中にあったＴＩＬ
に対して実施した。最小５×１０^７個の細胞を、機能的アッセイおよびＰＣＲ分
析に用いた。

【００９０】 腫瘍細胞系ＭＵ、ＭＯ、ＭＡおよびＥＷを、皮膚転移メラノーマ腫デポジット
から得、いくつか（ＭＵ、ＭＯおよびＭＡ）は、前に記載されている(Pandolfi
F, et al., Clin. Exp. Immunol, 1994, 95:141-7; Pandolfi F et al., Cancer
Res, 1991, 51:3164-3170)。メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１陰性変種ＭＵ−Ｘを、
抗メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１特異的ＴＩＬでの免疫選択の前に、数日間高密度（
＞５×１０^５細胞／ｍｌ）でＭＵ腫瘍細胞を培養することにより得た。組み換え
ヒトＩＬ−２の存在下での腫瘍およびリンパ球の１週間の同時培養の後に、増殖
した腫瘍細胞を採集し、Ｔ細胞の不存在下で培養物中に維持した。系のメラノー
マ腫起源を、メラノーマ腫関連抗原Ｓ−１００およびＨＭＢ−４５に対する抗体
を用いて確認した(Ordonez N, et al., Am J Clin Pathol, 1988, 90:385-90)。
ＭＵおよびＭＡ腫瘍は、共にＨＬＡ−Ａ２を発現し；ＭＵ腫瘍細胞はまた、ＨＬ
Ａ−Ａ１陽性であった。ＭＯ腫瘍は、白血球がＨＬＡ−Ａ２を発現した患者から
由来し、一方ＭＯ腫瘍細胞は、このＩ群ＭＨＣ抗原を発現しなかった。腫瘍細胞
を、１０％ヒト血清を補充したＤＭＥＭ（ＭＵ）または５％ヒト血清を補充した
ＲＰＭＩ１６４０（ＭＡおよびＭＯ）のいずれか中で培養した。

【００９１】 メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の腫瘍細胞による発現 メラノーマ腫腫瘍細胞系の細胞質におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原の発
現を評価するために、細胞を、先ず、１０分間、１％パラホルムアルデヒド中で
固定し、続いて５分間０．１％サポニン中で固定し、次にメラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１、Ａ−１０３に特異的なモノクローナル抗体(Castelli C, et al., J Exp M
ed, 1995, 181:363-8)（E. StockertおよびL. Old, Ludwig Institute, New Yor
k, NYの厚意の贈呈物）を４５分間２２℃で加えた。２回の洗浄後、細胞を、３
０分間ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体(DAKO, Carpenteria, CA)で染色し、
次に１％パラホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメトリーにより分析し
た(FACScan, Becton-Dickinson, Mt. View, CA)。蛍光染色のヒストグラムを、
種々の細胞集団の抗メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１染色の比較のために得た。平均の
チャネル蛍光を、製造者により供給されている「コンソート(Consort)３０」ソ
フトウエアを用いて計算した。

【００９２】 条件培地の生成 メラノーマ腫腫瘍系からの条件培地を、１〜１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥ
Ｍ培地中で、５×１０^５細胞／ｍｌの出発濃度で、細胞を培養することにより、
生成した。上清液を、７２時間後に、細胞培養物を遠心分離し、培地を０．２ミ
クロンのフィルター(Millipore, Bedford, MA)を通して濾過することにより、採
集した。１％ＦＢＳを含む条件培地を、リテンテート(retentate)を公称３０ｋ
ＤのＹＭ膜(Centriprep, Millipore, Bedford, MA)から採集することにより、１
０〜２０倍に濃縮した。

【００９３】 細胞毒性アッセイ ＴＩＬを、前に記載されているように(Hishii M, et al., Proc. Natl. Acad
Sci USA, 1997, 94:1378-1383)、４時間^５１Ｃｒ放出アッセイにおいてメラノー
マ腫標的細胞を溶解する能力についてアッセイした。メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１
の高い構成発現を有するメラノーマ腫標的細胞を、低密度培養（１〜２×１０^５ ／ｍｌ）により発生させ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１陰性変種であるＭＵ−Ｘか
らの条件培地の存在下で３〜６日間培養した同一の細胞との細胞溶解に対するこ
れらの感受性に関して比較して、低いメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を有する標
的細胞を由来させた。低いメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現細胞を、メラン−Ａ／
ＭＡＲＴ−１ペプチド２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１）(Boon T,
et al., Ann Rev Immunol, 1994, 12:337-65; Sensi M, et al., Proc Natl Ac
ad Sci USA, 1995, 92:5674-8; Mackensen A, et al., Cancer Res, 1993, 53:3
569-73; Peoples G, et al., J Immunol, 1993, 151:5472-80)で刺激した後、こ
れらの標的細胞を３７℃で２時間、５μｇのペプチドを含む培地１ｍｌ中で培養
し、次に細胞溶解アッセイにおいて用いるために^５１Ｃｒで標識することにより
、さらにアッセイして、特異的Ｔ細胞認識に対する再生した感受性を例証した（
本質的に、Kurnick J, et al., Clin Immunol Immunopathol. 1986, 38:367-380
に前に記載されているように）。

【００９４】 他の例において、原体(bulk)およびクローン化したＴＩＬ子孫を、また、自己
由来腫瘍（ＭＵ）、同種異系メラノーマ腫並びにＮＫ（Ｋ５６２）およびＬＡＫ
（ダウジ(Daudi)）およびＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球標的：ＥＢＶ−３（ＨＬＡ
−Ａ１、Ｂ８、ＤＲ３）、ＥＢＶ−１９（ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ１８、ＤＲ５）に対
して、前述の^５１Ｃｒ放出アッセイを用いてアッセイした。刺激は、以下のメラ
ノーマ腫リニージ由来ペプチドを含んでいた：チロシナーゼ(Rivoltini, L., et
al., J. Immunol, 1995, 154:2257-2265)：ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ（配列番号２）
またはＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号３）、ＭＡＧＥ−３(Gaugler B, et al.,
J Exp Med, 1994, 179:921-30)：ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号４）。クローン
を、細胞毒性活性について、５０：１またはこれ以下のエフェクター対標的比率
でスクリーニングした。

【００９５】例１ ：腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）によるメラノーマ腫抗原認識：メラン−Ａ
／ＭＡＲＴ−１の差異発現の効果結果 ＴＩＬ原体およびクローンの表現型および機能： 患者ＭＵから増殖したＩＬ−２応答ＴＩＬは、αβＴＣＲを発現する９８％を
超えるＣＤ３＋、ＣＤ８＋、（ＣＤ４−）Ｔ細胞であった。前に報告されている
ように(Pandolfi F, et al., Clin. Exp. Immunol, 1994, 95:141-7)、自己由来
ＭＵメラノーマ腫腫瘍細胞系に対する^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した際
に、強力な細胞毒性活性が記録された。この原体ＴＩＬ系列は、これが、Ｋ５６
２またはダウジ標的細胞に対して弱く溶解性であるのみであるため、最小のＮＫ
またはＬＡＫ活性を示した(18, Pandolfi F, et al., Clin. Exp. Immunol, 199
4, 95:141-7; Pandolfi F, et al., Cancer Res, 1991, 51:3164-3170)。原体Ｍ
Ｕ−ＴＩＬが自己由来腫瘍標的を溶解する能力は、ＨＬＡ−Ｉ群抗原（Ｗ６／３
２）に対する抗体により遮断された。さらに、ＴＩＬは、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞
系、ＥＢＶ−３またはＥＢＶ−１９を溶解しなかった。

【００９６】 原体培養物（ＭＵ−ＴＩＬ）の限定的希釈から、合計で１４５ＭＵ−ＴＩＬク
ローンを、前に記載されているように、単離した(Pandolfi F, et al., Clin. E
xp. Immunol, 1994, 95:141-7)。表１にまとめるように、さらなる分析のために
、本発明者等は、ＮＫ活性を有しない、整合した抗腫瘍細胞毒性（＜２５：１の
エフェクター対標的比率において）を示したクローンのうち８つを選択した。

【００９７】 表１ ＭＵ−ＴＩＬクローンによる機能的活性およびＴＣＲ使用の要約

【表１】

【００９８】 ＭＵ−ＴＩＬのペプチド特異性： 原体ＭＵ培養物およびクローンＭＵ−４５、ＭＵ−５７、ＭＵ−６３、ＭＵ−
７９およびＭＵ−１１５は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１ペプチド（ＡＡＧＩＧＩ
ＬＴＶ、配列番号１）で刺激したＥＢＶ−１９標的に対する強力な反応性を示し
た。２種の追加のクローン（ＭＵ−１０およびＭＵ−５８）は、メラン−Ａ／Ｍ
ＡＲＴ−１で刺激したこれらのＥＢＶ標的を溶解しなかった。Ｔ細胞のいずれも
、ＥＢＶ標的のみ、あるいはチロシナーゼまたはＭＡＧＥ３ペプチドで刺激され
たこれらの標的を溶解しなかった。自己由来メラノーマ腫標的を溶解したクロー
ンの１つであるＭＵ−９は、冷凍庫から回収して、メラノーマ腫ペプチドとの微
細な特異性を試験することができなかったが、このＴＣＲは、ＭＵ−１１５と同
一であり、このことは、ＭＵ−９がまた、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１ペプチド特
異性である傾向があったことを示す。記録したように、クローンＭＵ−４５、Ｍ
Ｕ−６３およびＭＵ−７９は、ＴＣＲ遺伝子配列決定により測定して、互いに同
一であった。

【００９９】 メラノーマ腫細胞系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の変調： 原体ＭＵ−ＴＩＬおよびＭＵ−ＴＩＬクローンが、ＭＵ腫瘍標的を溶解する能
力は、特に、腫瘍細胞を、同一の培養容器中で長期間、強力に接着性の細胞のト
リプシン化を伴わずに、成長させた際には、時間経過と共に顕著に変化した。Ｔ
ＩＬの、このような腫瘍標的を溶解する能力は、顕著に低下した。従って、本発
明者等は、腫瘍細胞を、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原（クローンのうちの６つ
についての標的抗原）およびペプチド抗原提示に必要なＨＬＡ−Ｉ群抗原の両方
の存在について試験した。

【０１００】 図１および２に示すように、腫瘍細胞中での細胞質内のメラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１抗原発現の強度は、インビトロ培養条件に依存して、広範囲に変化した。Ｔ
ＩＬが、腫瘍細胞を溶解する能力は、細胞質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の強
度に正比例して減少した（図２）。

【０１０１】 図１Ａに示すように、ＭＵ腫瘍細胞を、高密度（５×１０^５細胞／ｍｌ）で培
養した際には、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の蛍光の平均チャネルは、１×１０^５ 細胞／ｍｌで培養した同一の腫瘍細胞のものの、約半分であった。図２Ａに示す
ように、ＴＩＬによるＭＵ腫瘍細胞の溶解の感受性は、高エクスプレッサー(exp
ressor)（比較的低い細胞密度で培養した）と比較して、低エクスプレッサー（
比較的高い細胞密度で培養した）において約半分の幅で、同様に減少した。これ
らの高密度腫瘍細胞で記録された減少した細胞毒性が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−
１発現に関連するという、さらなる根拠は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１ペプチド
を低エクスプレッサー腫瘍標的、ＭＵ−ＬｏおよびＭＵ−Ｘに加えると、高レベ
ルの細胞毒性が回復するという発見であった（図２Ｂ）。このアッセイにおける
ＴＩＬの特異性は、これらをメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１ペプチドで刺激した後に
のみＨＬＡ−Ａ２発現ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を溶解するこれらの能力により、さ
らに例証された（図２Ｂ）。

【０１０２】 減少したメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現（図１Ｂ）は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１およびＨＬＡ−Ａ２を共に発現した第２の腫瘍細胞（ＭＡ）についての標的
細胞溶解を平行して減少した。第３のメラノーマ腫腫瘍細胞（ＭＯ）はまた、増
大する培養密度に伴って減少したメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を示した（図１
Ｃ）が、この腫瘍に対するＨＬＡ−Ａ２の不存在により、これが、ＴＩＬによる
溶解に対して非感受性になった。

【０１０３】 図１Ｄに示すように、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１が、高密度で培養された細胞
の中で減少した一方、ＨＬＡ−Ｉ群抗原の表面染色は、同一の条件下で顕著には
変化しなかった。ＨＬＡ−Ａ２染色は、広い特異性のＨＬＡ−Ｉ群抗体について
記録されたものより弱いが、培養条件を変化させず（図１Ｅ）、このことは、こ
の限定要素が、減少した溶解感受性における限定因子ではなかったことを示す。
変化していないＨＬＡ染色はまた、すべてではないタンパク質が、腫瘍細胞を一
層高い細胞密度で培養した際に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１と平行して減少した
ことを示す。さらに、ＨＬＡ−Ａ２の継続した存在および、細胞毒性Ｔ細胞認識
についての標的抗原として作用するこの能力は、ＨＬＡ−Ａ２特異性アロ反応性
Ｔ細胞の、低ＨＬＡ−Ａ２発現腫瘍細胞（図２Ｃ）およびＭＵ腫瘍のメラン−Ａ
／ＭＡＲＴ−１欠乏変種を溶解する能力により反映されたが、メラン−Ａ／ＭＡ
ＲＴ−１特異性Ｔ細胞は、減少したメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現に伴って減少
した標的認識を示した（図２Ａ参照）。

【０１０４】 一層高い密度で培養された細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１における減
少は、細胞を、一層低い密度で通過させた際には可逆的であった。高い密度で培
養された細胞は、減少したメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を示した（蛍光の平均
チャネル：４８．９）。これらの細胞を高い密度（５×１０^５細胞／ｍｌ）で通
過させた場合には、これらは、低いメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１を示し続けた（平
均チャネル：４０．９）一方、１×１０^５細胞／ｍｌで開始した同一細胞の７日
間の培養は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現のおよその倍増をもたらした（平均
チャネル：１０８．９）。１×１０^５細胞／ｍｌにおける細胞の連続的通過は、
一層高いレベルのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の維持（平均チャネル：１１２
．１）を可能にしたが、これらの細胞を放置して、その後の７日間の培養期間に
わたり高密度に成長させた際には、得られた培養物は、再び、減少したメラン−
Ａ／ＭＡＲＴ−１強度（平均チャネル：４６．９）を示した。これらの結果は、
培養における時間および細胞密度に関するメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現のサイ
クル形成を示す。図２に記録したように、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１強度におけ
る減少は、溶解の減少した感受性と平行した。

【０１０５】例２ ：腫瘍抗原認識のオートクライン下方変調結果 メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現メラノーマ癌腫(melanocarcinoma)細胞系は、
モノクローナル抗体で染色することにより例証されるように(Chen Y, et al., P
roc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:5915-5919)、細胞を高密度で（５×１０^５細
胞／ｍｌ）培養する際に、一層低い密度（１×１０^５細胞／ｍｌ）で培養した細
胞と比較して、この細胞質抗原の発現を自発的に下方変調させることができる。
同様に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の下方変調もまた、低い、または検出不能な
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を有するメラノーマ腫から採集した上清液を加え
ることにより、観察された。低レベルのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１を発現する、
高密度で培養した腫瘍細胞から得られた上清液の存在下で、低い細胞濃度（１×
１０^５細胞／ｍｌ）における腫瘍細胞の培養は、細胞質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−
１発現の下方変調されたレベルをもたらした。

【０１０６】 特定の注は、構成的に低い、または検出不能なレベルのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１分子の発現、例えばＭＵ−ＸおよびＥＷを有する腫瘍変種が、最高のレベル
の「抗原沈静化(silencing)」活性をもたらすことであった。この下方変調は、
メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の細胞質発現が、腫瘍細胞を低い細胞数において培養
物に戻す際に上方変調されるため、可逆的である。同時に、ＨＬＡＩ群発現は、
腫瘍細胞の高密度成長または後のメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１陰性腫瘍変種からの
上清液への暴露によっては、下方調節されなかった。

【０１０７】 顕著に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原の発現の減少は、標的細胞の、ＨＬＡ
−Ａ２制限メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１特異性ＣＴＬによる溶解に対する低下した
感受性に相関する。従って、ＨＬＡ−Ａ２細胞表面発現のレベルが減少しない一
方、腫瘍細胞によるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現のレベルが減少するのに
伴って、これらの標的のＴ細胞認識は減少した。しかし、標的細胞をメラン−Ａ
／ＭＡＲＴ−１ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号１）で刺激した際には
(Chen Y, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:5915-5919; Mattei, S.,
et al., Int. J. Cancer, 1994, 56:853-7; Paglia, D., et al., J. Interfer
on Cytokine Res, 1995, 15:455-60, Armstrong, C. et al., Exp. Dermatol. 1
992, 1:37-45; Bennicelli, J. L. & Guerry, D. Exp Dermatol. 1993, 2:186-9
0; Francis, G. M., et al., Melanoma Res. 1996, 6:191-201; Singh, R. K.,
et al., J. Interferon Cytokine Res. 1995, 15:81-7; Castelli C, et al., J
Exp Med, 1995, 181:363-8)、通常のレベルの細胞溶解が観察され、このことは
、腫瘍細胞が、細胞により媒介された溶解に対して耐性にはならなかったことを
示す。

【０１０８】 前に、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の欠乏が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１遺
伝子プロモーター活性の欠乏と関連することが示された(Butterfield, L. H., e
t al., Gene, 1997, 191:129-34)。この活性は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１遺伝
子の２３３ｂｐ最小プロモーターにより媒介されることが見出された。 メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１沈静化活性は、上清液を８０℃で６０分間処理する
ことにより、熱不活性化することができる。６０℃における同様の処理は、活性
に影響しなかった。

【０１０９】 この沈静化活性を一層詳細に定義するために、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１タン
パク質発現が欠乏した腫瘍細胞によるサイトカインおよびケモカイン生成の評価
を実施した。これらのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１沈静化上清液は、いくつかの既
知のサイトカインを含むことが見出されたが、これらは、ＴＮＦαを欠いており
、これは、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１プロモーターに向けられた部分的な下方調
節活性を有すると例証された(Butterfield, L. H., et al., Gene, 1997, 191:1
29-34)。さらに、同定された最も一般的なタンパク質である、ＩＬ−６、ＩＬ−
８およびＭＣＰ−１は、３対数投与量にわたり個別に、または活性上清液中で検
出されたレベルに近似する「カクテル」において、上清液全体の抗原沈静化を擬
性しなかった。

【０１１０】 全部で、本発明者等は、２０種を超えるタンパク質を、これらが抗原沈静化活
性を模擬する能力について評価し、これには、メラノーマ腫により分泌されるこ
とが知られている多くのものが含まれる(Mattei, S., et al., Int. J. Cancer,
1994, 56:853-7; Paglia, D., et al., J. Interferon Cytokine Res, 1995, 1
5:455-60, Armstrong, C. et al., Exp. Dermatol. 1992, 1:37-45; Bennicelli
, J. L. & Guerry, D. Exp Dermatol. 1993, 2:186-90; Francis, G. M., et al
., Melanoma Res. 1996, 6:191-201; Singh, R. K., et al., J. Interferon Cy
tokine Res. 1995, 15:81-7)。活性上清液中に存在しなかったＴＮＦα以外では
、以下のタンパク質のいずれも、細胞質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現に影響し
なかった：ＭＳＧ／ＧＲＯα、ＥＧＦ、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦｂ、ＴＧＦα、Ｔ
ＧＦβ、ＮＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ＰＦ−４、ＮＡＰ−２
。以下のサイトカインは、活性上清液中で検出されなかった：ＩＬ−１β、ＩＬ
−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ。さらに、いくつかの成長
因子に結合することが知られているヘパリンは、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現
に影響せず、活性上清液の沈静化活性に影響しなかった。

【０１１１】例３ ：メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現下方変調活性（ＭＡＳＡ）の特徴づけ 予備的なデータは、ＭＡＳＡが、低いｐＨ（３．０）に対して安定であったこ
とを示す。これは、繰り返された凍結乾燥および高温（６０℃）に対して耐性で
あったが、８０℃において不安定であった。膜濾過後の活性の回復はまた、可能
であった（１０ｋＤにより完全に保持されたが、５０ｋＤカットオフ膜によって
は部分的に保持されたに過ぎない）。これはまた、ブルーおよびレッドセファロ
ースに結合した（および１．５ＭのＫＣｌで溶離することができる）が、ヘパリ
ンには結合しなかった。活性の大部分は、コンカナバリンＡセファロース（Ｃｏ
ｎＡ）に結合し、糖および／または０．５Ｍのａ−メチルマンノシドで溶離する
ことができる。Ｃｏｎ−Ａ結合溶離物質を単離し、さらにこれを、ブルーおよび
／またはレッドセファロースから結合し、溶離することにより精製することによ
り、本発明者等は、９９％のタンパク質を除去し、一方初期の抗原沈静化活性の
約１０％を保持することができる。

【０１１２】 レッドセファロースからの結合および溶離、続いてＣｏｎ−Ａ−セファロース
への結合および溶離により精製された物質を、Ｇ−５０セファデックス上でサイ
ズ分別し、活性は約２５ｋＤにおいて集中することができる。「活性」は、Ｇ−
５０セファデックスにおいて分別された物質のポリアクリルアミドゲル電気泳動
における「バンド」の出現と平行する。

【０１１３】 ｐＨ８．０における高Ｑ陰イオン交換体(anion-exchanger)における細胞上清
液濃縮物の分別は、大部分のＭＡＳＡをもたらし、結合していないフラクション
をほとんど溶離した（ＱＵＢｐＨ８．０）。この活性は、全タンパク質の５０％
未満と関連した。少量のＭＡＳＡは、カラムに結合し、大部分のタンパク質と共
に、高塩分（１ＭのＮａＣｌ（ＱＢｐＨ８．０））において溶離した。これらの
予備的なデータは、ＭＡＳＡが、約８のｐＩを有することを示した。ＱＵＢｐＨ
８．０フラクションからのＭＡＳＡを、高Ｑカラムにおいて、ｐＨ９．５におい
て再分別し、未結合（ＱＵＢｐＨ９．５）および結合（ＱＢｐＨ９．５、１Ｍの
ＮａＣｌで溶離した）フラクションを採集し、活性についてアッセイした。活性
は、ｐＨ９．５において結合し、このことは、これが、７．５〜９．５のｐＩを
有することを示唆する。さらなる実験は、活性が、約２５ｋＤの分子量において
溶離することを確認した。逆相ＨＰＬＣ緩衝液、０．１％トリフルオロ酢酸およ
び０．１％トリフルオロ酢酸／３０％アセトニトリルにおけるＭＡＳＡの安定性
の予備的研究は、２５ｋＤ分子量フラクションが、これらの緩衝液においてこの
活性を保持し、従って逆相ＨＰＬＣ分離を、高度に精製されたＭＡＳＡを得る有
用な追加のステップとして考慮することを可能にすることを示す。

【０１１４】結果

【表２】 ^＊ サイズ排除カラムからのフラクション^＊＊ ７２時間のメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１染色アッセイにおいて最大の「抗原
沈静化」活性を提供する内部実験的「標準」活性上清液における合計タンパク質
の１ｍｇあたり１００ユニット

【０１１５】活性の特徴づけ（要約） ： 活性は： （ｉ）ブルーおよび／またはレッドセファロース染料樹脂に結合する（および１
．５ＭのＫＣｌで溶離することができる）が、ヘパリンに結合しない、 （ｉｉ）コンカナバリン−Ａ−セファロースに結合し、０．５Ｍのα−メチルマ
ンノシドで溶離することができる、 （ｉｉｉ）レッドセファロースから結合および溶離し、次にＣｏｎ−Ａ−セファ
ロースに結合および溶離することにより精製した際に、Ｇ−５０セファデックス
上でサイズ分別し、活性は約２５ｋＤに集中することができる、および （ｉｖ）プロテナーゼＫ消化に対して感受性である 剤（メラノーマ腫単離物）に関連することが見出された。

【０１１６】 さらに、トリプシン消化配列分析（Harvard MicroChemistry, Cambridge, MA
において実施した）は、少なくとも７種の異なるヒトタンパク質に相当する配列
の存在を示した。これらのタンパク質のいくつかは、オンコスタチン−Ｍ（ＯＳ
Ｍ）、スタニオカルシン（ＳＴＣ）および組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−
２）を含む。

【０１１７】 組み換えオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、ヒトメラノーマ腫細胞系である「Ｍ
Ｕ−８９」において試験した際に、「抗原沈静化」活性を示す(James T. Kurnic
k, Massachusetts General Hospital)。１００〜１０ｎｇ／ｍｌの用量において
、組み換えＯＳＭは、ヒトメラノーマ腫細胞系、例えばＥＷ腫瘍細胞系から単離
された「活性な」上清液のものに匹敵する、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下
方変調を生じる(James T. Kurnick, Massachusetts General Hospital)。２ｎｇ
／ｍｌより低い用量において、ＭＵ−８９細胞系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ
−１の下方変調は、最小ないし検出不能であった。（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１
のアッセイは、細胞あたりの蛍光強度についてのフローサイトメトリーにより分
析したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体と共にモノクローナル抗体Ａ−１０３(Llo
yd Old, Ludwig Institute, NY)を用いたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の細胞質染
色による。）

【０１１８】 ＯＳＭに対する市場で入手できるポリクローナル抗体(Research Diagnostics,
Flanders, NJ)は、組み換えＯＳＭの活性を遮断することができる。同一のポリ
クローナル抗体は、レッドセファロース結合および溶離、これに続くＣｏｎ−Ａ
−セファロースへの結合およびこれからの溶離並びにＧ−５０セファデックスに
より精製したＥＷ−上清液のほとんどの精製されたフラクションの活性を遮断し
て、約２５ｋＤの物質を単離することができる。しかし、組み換えＯＳＭおよび
ＥＷ−上清液からの「精製された」フラクションを遮断する同一のポリクローナ
ル抗ＯＳＭ抗体は、分別されていないＥＷ−上清液を部分的に（約５０％）遮断
することができるに過ぎない。

【０１１９】 さらに、ＯＳＭが欠乏したＥＷ−上清液流体（抗ＯＳＭ免疫アフィニティーカ
ラム上を通過させることにより得られた）は、ＭＵ−８９メラノーマ腫細胞によ
るメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方変調において尚活性である。ＯＳＭ欠乏
ＥＷ上清液は、残留ＭＡＳＡのほとんどが尚レッドセファロースに結合すること
を示す。ＥＷ上清液のＯＳＭ含量（定量的ＥＬＩＳＡにより決定した）は、約１
ｎｇ／ｍｌであるが、この物質の抗原沈静化活性は、１０〜２０ｎｇ／ｍｌの用
量において組み換えＯＳＭと同等である。抗原沈静化において活性である、他の
メラノーマ腫細胞系、例えばＭＵ−９６からの上清液は、検出可能なＯＳＭを有
しない。

【０１２０】 要するに、前述のデータは、十分に特徴づけられている構造およびいくつかの
既知の機能を有する既知のサイトカインであるオンコスタチンＭは、本発明者等
が試験したメラノーマ腫系における抗原沈静化を媒介することができるが、メラ
ノーマ腫細胞により生じた追加の１種または２種以上の分子はまた、抗原沈静化
を明示することができることを示す。

【０１２１】 他のアッセイ系においてＯＳＭ活性を中性化することが報告された、オンコス
タチンＭ(Research Diagnostics, Flanders, NJ)についてのレセプターに対する
抗体は、精製された組み換えＯＳＭまたはＥＷ−上清液のいずれの抗原沈静化活
性をも遮断しない。

【０１２２】 ｇｐ１３０分子は、ＯＳＭレセプター、ＬＩＦレセプターおよびＩＬ−６レセ
プターにおける共有された鎖であると報告されている。この分子に対する抗体（
またResearch Diagnostics, Flanders, NJから入手できる）は、精製された組み
換えＯＳＭまたはＥＷ−上清液の抗原沈静化活性を遮断しない。いくつかのアッ
セイ系においてＯＳＭについてのレセプターおよびシグナルトランスデューサー
として作用することができる、ＬＩＦレセプターに対する抗体（またResearch D
iagnostics, Flanders, NJから入手できる）は、精製された組み換えＯＳＭまた
はＥＷ−上清液の抗原沈静化活性を遮断しない。

【０１２３】 要するに、前述のデータは、オンコスタチンＭおよび抗原沈静化活性を明示す
ることができる他の分子は、オンコスタチンＭ結合レセプター分子を含むがこれ
には限定されない、追加のレセプターを通して作用することができることを示す
。 オンコスタチンＭは、少なくとも１つのメラノーマ腫細胞系（ＥＷ）により生
成され（検出可能なタンパク質は、ＥＬＩＳＡにより例証された）、ｍＲＮＡ転
写物は、いくつかのメラノーマ腫細胞系から単離することができる。メラノーマ
腫およびメラノサイトは、前には、オンコスタチンＭを発現することが知られて
いなかった。

【０１２４】 抗原沈静化活性は、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１陰性細胞系を含む多くの種々の
メラノーマ腫細胞系から、およびＰＭＡ刺激Ｕ９３７、即ちオンコスタチンＭを
生成することを示すことができるプロ単球白血病細胞系から例証することができ
る。オンコスタチンＭを、顕著な細胞毒性を生じずに、抗原沈静化を明示するの
に必要な用量の数倍（１００ｎｇ／ｍｌまで用いる）において用いることができ
るが、ＥＷ上清液は、部分的に精製されたフラクションにおいても顕著な毒性活
性を含み、これは、追加の因子が、細胞生存性および表現型に影響することを示
す。また、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方変調において活性であることを
示したすべての単離物は、メラノーマ腫細胞の形状および成長を、３日のアッセ
イにおいて変化させると考えられ、これは、細胞骨格変化を含む追加の表現型変
化が、ＭＡＳＡ含有物質により明示されることを示す。

【０１２５】 当業者は、ルーチンを超えない実験を用いて、本明細書中に記載した本発明の
特定の態様に対する多くの同等なものを認識するかまたは確認することができる
。このような同等なものは、特許請求の範囲に包含されることを意図する。 本明細書中に開示したすべての参考文献は、全体を本明細書中に参照により組
み込む。 請求の範囲が示されており、これに配列表が続く。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 種々のメラノーマ腫腫瘍系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現および差異を
示すグラフを示し、培養密度はこのような発現において有する。ＭＵ−腫瘍にお
けるＨＬＡ−Ａ２発現。

【図１Ｂ】 種々のメラノーマ腫腫瘍系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現および差異を
示すグラフを示し、培養密度はこのような発現において有する。ＭＡ腫瘍におけ
るＨＬＡ−Ａ２発現。

【図１Ｃ】 種々のメラノーマ腫腫瘍系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現および差異を
示すグラフを示し、培養密度はこのような発現において有する。ＭＯ腫瘍におけ
るＨＬＡ−Ａ２発現。

【図１Ｄ】 種々のメラノーマ腫腫瘍系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現および差異を
示すグラフを示し、培養密度はこのような発現において有する。対照、ＭＵ−腫
瘍におけるＨＬＡ−Ｉ発現。

【図１Ｅ】 種々のメラノーマ腫腫瘍系におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現および差異を
示すグラフを示し、培養密度はこのような発現において有する。対照、ＭＵ−腫
瘍におけるＨＬＡ−Ａ２発現。

【図２Ａ】 標的細胞認識およびＴＩＬによる溶解に対するＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ発現
の影響を示すグラフを示す。特に自己由来ＭＵ−腫瘍のＭＵ−ＴＩＬ溶解を示す
。

【図２Ｂ】 標的細胞認識およびＴＩＬによる溶解に対するＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ発現
の影響を示すグラフを示す。特にメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１陰性標的のＭＵ−Ｔ
ＩＬ溶解を示す。

【図２Ｃ】 標的細胞認識およびＴＩＬによる溶解に対するＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ発現
の影響を示すグラフを示す。特に標的の抗ＨＬＡ−Ａ２特異性溶解を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/02 ４Ｈ０４５ 35/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダーダ，ポール ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02492、ニードハム、ローレル ドライブ 149 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BB03 BB20 CB01 DA36 DA37 DA78 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ79 QQ89 QR48 QR55 QR77 QS33 QS36 QX02 QX10 4B064 AG01 CA10 CE06 CE07 CE11 CE12 DA05 DA14 4C084 AA02 AA03 AA17 BA44 CA17 CA23 MA17 MA22 MA23 MA35 MA37 MA52 MA55 MA59 MA60 MA66 NA14 ZB262 ZB272 4C085 AA13 AA14 BB01 CC22 CC23 GG02 GG03 GG04 GG05 GG08 GG10 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA75 EA28 EA51 FA72 GA10 GA22 GA23 GA25 GA26

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に悪性メラノーマ腫細
   胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、悪性メラノーマ腫細
   胞単離物。
2. 【請求項２】 メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現または非発現悪性メラノ
   ーマ腫細胞に由来する単離物である、請求項１に記載の悪性メラノーマ腫細胞単
   離物。
3. 【請求項３】 ポリペプチドを含み、ポリペプチドが、悪性メラノーマ腫細
   胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する単離物である、請求項
   １に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物。
4. 【請求項４】 実質的に純粋なポリペプチドである単離物である、請求項１
   に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物。
5. 【請求項５】 実質的に純粋なポリペプチドが、オンコスタチンＭ、スタニ
   オカルシンおよび組織因子経路阻害剤−２からなる群から選択されたポリペプチ
   ドである、請求項４に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物。
6. 【請求項６】 メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現悪性メラノーマ腫細胞の
   上清液またはそのフラクションである単離物である、請求項１に記載の悪性メラ
   ノーマ腫細胞単離物。
7. 【請求項７】 有効濃度で悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡ
   ＲＴ−１発現を下方調節する実質的に純粋な有機剤であって、該剤は、標準条件
   下で少なくとも１時間の時間培養した融合性メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１抗原発現
   悪性メラノーマ腫細胞の上清液中に、有効濃度で存在し、前記培養条件は、５×
   １０^６細胞／ｍｌの割合の培地を含み、さらに、該剤は８０℃において熱感受性
   であり、プロテイナーゼＫ感受性であり、そしてブルーセファロースに結合し、
   またそれを溶離せしめる、前記有機剤。
8. 【請求項８】 剤がポリペプチドである、請求項７に記載の有機剤。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物に選択的に結
   合し、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調節
   を阻害する、単離された結合有機剤。
10. 【請求項１０】 ポリペプチドである単離された結合有機剤である、請求項
    ９に記載の単離された結合有機剤。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物が、ポリペ
    プチドを含み、該ポリペプチドが、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／
    ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する、請求項９に記載の単離された結合有機剤。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の悪性メラノーマ腫細胞単離物が、実質的
    に純粋なポリペプチドである、請求項９に記載の単離された結合有機剤。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラ
    グメントまたはポリペプチドに関して選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメント
    からなる群から選択された抗体または抗体フラグメントである、請求項１０に記
    載のポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項７に記載の実質的に純粋な有機剤に選択的に結合し
    、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調節を阻
    害する、単離された結合有機剤。
15. 【請求項１５】 単離された結合有機剤が、ポリペプチドである、請求項１
    ４に記載の単離された結合有機剤。
16. 【請求項１６】 請求項７に記載の実質的に純粋な有機剤が、ポリペプチド
    を含み、該ポリペプチドが、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲ
    Ｔ−１発現を下方調節する、請求項１４に記載の単離された結合有機剤。
17. 【請求項１７】 請求項７に記載の実質的に純粋な有機剤が、実質的に純粋
    なポリペプチドである、請求項１４に記載の単離された結合有機剤。
18. 【請求項１８】 ポリペプチドが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラ
    グメントまたはポリペプチドに関して選択的なＣＤＲ３領域を含むフラグメント
    からなる群から選択された抗体または抗体フラグメントである、請求項１５に記
    載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 医薬組成物であって： 悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン
    −Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する悪性メラノーマ腫細胞単離物による、悪
    性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調節を阻害す
    るために、請求項９に記載の単離された結合有機剤を医薬的に有効な量で含む剤
    、および 医薬的に許容し得る担体 を含む、前記医薬組成物。
20. 【請求項２０】 医薬組成物であって： 悪性メラノーマ腫細胞と接触させた際に悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン
    −Ａ／ＭＡＲＴ−１発現を下方調節する実質的に純粋な有機剤による、悪性メラ
    ノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調節を阻害するため
    に、請求項１４に記載の単離された結合有機剤を医薬的に有効な量で含む剤、お
    よび 医薬的に許容し得る担体 を含む、前記医薬組成物。
21. 【請求項２１】 腫瘍細胞由来腫瘍抗原発現下方調節剤を単離する方法であ
    って： （ａ）腫瘍細胞の培養物の調製、 （ｂ）腫瘍抗原発現下方調節剤を含むことが予測される上清の、ステップ（ａ）
    の培養物からの単離、 （ｃ）該上清液の複数のフラクションへの分別、 （ｄ）複数のフラクションからのフラクションの、腫瘍抗原発現腫瘍細胞との接
    触、 （ｅ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現の測定、 （ｆ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現が、対照と比較して下方調節されたか否か
    の決定 を含む、前記方法。
22. 【請求項２２】 腫瘍細胞が、急性リンパ芽球白血病細胞、神経膠腫細胞、
    膀胱癌細胞、胆管癌細胞、乳癌細胞、頸部癌腫細胞、結腸癌腫細胞、結腸直腸癌
    細胞、絨毛癌細胞、上皮癌細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、ホジキンリンパ腫細胞
    、肺癌細胞、リンパ球細胞由来白血病細胞、骨髄腫細胞、非小細胞肺癌腫細胞、
    鼻咽頭癌細胞、卵巣癌癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、精巣癌
    細胞、Ｔ細胞白血病細胞およびメラノーマ腫細胞からなる群から選択され、腫瘍
    細胞抗原が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ
    ＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィ
    リンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児
    性抗原（ＣＥＡ）およびこの免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、
    ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびこの免疫原性エピトー
    プＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）
    、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ族、ＧＡＧＥ−１
    ，２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ
    、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェ
    トプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニ
    ン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−
    １、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、腫
    瘍抗原のＳｍａｄ族、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１また
    はｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 腫瘍細胞が、メラノーマ腫細胞であり、腫瘍抗原が、メラ
    ン−Ａ／ＭＡＲＴ−１である、請求項２１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 複数のフラクションからのフラクションが、希釈されてい
    ないかまたは濃縮されている、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 【請求項２５】 腫瘍抗原発現変調剤をスクリーニングする方法であって： （ａ）腫瘍抗原発現変調剤であることが予測される剤の、腫瘍抗原発現腫瘍細胞
    との接触、 （ｂ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現の測定、 （ｃ）腫瘍細胞における腫瘍抗原発現が、対照と比較して変調したか否かの決定
    を含む、前記方法。
26. 【請求項２６】 腫瘍細胞が、急性リンパ芽球白血病細胞、神経膠腫細胞、
    膀胱癌細胞、胆管癌細胞、乳癌細胞、頸部癌腫細胞、結腸癌腫細胞、結腸直腸癌
    細胞、絨毛癌細胞、上皮癌細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、ホジキンリンパ腫細胞
    、肺癌細胞、リンパ球細胞由来白血病細胞、骨髄腫細胞、非小細胞肺癌腫細胞、
    鼻咽頭癌細胞、卵巣癌癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、精巣癌
    細胞、Ｔ細胞白血病細胞およびメラノーマ腫細胞からなる群から選択され、腫瘍
    細胞抗原が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ
    ＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィ
    リンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児
    性抗原（ＣＥＡ）およびこの免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、
    ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）およびこの免疫原性エピトー
    プＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）
    、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ族、ＧＡＧＥ−１
    ，２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ
    、ｐ５３、ＭＵＣ族、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェ
    トプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニ
    ン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００^{Ｐｍｅｌ１１７}、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−
    １、ｃｄｃ２７、腺腫様結腸ポリポシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、腫
    瘍抗原のＳｍａｄ族、ｌｍｐ−１、ＥＢＶコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１また
    はｃ−ｅｒｂＢ−２からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 腫瘍抗原発現変調剤であることが予測される剤が、腫瘍細
    胞培養上清液、腫瘍細胞溶離液または腫瘍細胞溶解液中に存在する、請求項２５
    に記載の方法。
28. 【請求項２８】 腫瘍抗原発現を上方調節する剤を単離する方法であって： （ａ）請求項２１に記載の腫瘍抗原発現下方調節剤の単離、 （ｂ）腫瘍細胞は、（ａ）の腫瘍抗原発現下方調節剤の単離において用いるもの
    と同一である、腫瘍細胞の培養物の調製、 （ｃ）（ａ）の単離された腫瘍抗原発現下方調節剤および（ａ）の単離された腫
    瘍抗原発現下方調節剤の推定の阻害剤を、（ｂ）の培養細胞との接触、 （ｄ）培養細胞における腫瘍抗原発現の決定、および （ｅ）（ｄ）において決定した腫瘍抗原発現の、対照の腫瘍抗原発現との比較 を含む、前記方法。
29. 【請求項２９】 対照腫瘍抗原発現を、（ａ）の剤の存在下および（ａ）の
    推定の阻害剤の不存在下で決定する、請求項２８に記載の方法。
30. 【請求項３０】 （ａ）の腫瘍抗原発現下方調節剤の単離において用いる腫
    瘍細胞がメラノーマ腫細胞であり、腫瘍抗原が、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１であ
    る、請求項２８に記載の方法。
31. 【請求項３１】 メラノーマ腫を有する対象におけるメラノーマ腫特異性免
    疫応答を増強させる方法であって： このような治療を必要としている対象に、請求項９に記載の単離された結合有
    機剤を、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方調
    節を阻害し、対象におけるメラノーマ腫特異性免疫応答を増強させるために有効
    な量で投与する ことを含む、前記方法。
32. 【請求項３２】 請求項９に記載の単離された結合有機剤が、ポリペプチド
    である、請求項３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 さらに、請求項９に記載の単離された結合有機剤以外の抗
    腫瘍剤を同時投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
34. 【請求項３４】 メラノーマ腫を有する対象におけるメラノーマ腫特異性免
    疫応答を増強させる方法であって： このような治療を必要としている対象に、請求項１４に記載の単離された結合
    有機剤を、悪性メラノーマ腫細胞におけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１発現の下方
    調節を阻害し、対象におけるメラノーマ腫特異性免疫応答を増強させるために有
    効な量で投与すること を含む、前記方法。
35. 【請求項３５】 請求項１４に記載の単離された結合有機剤が、ポリペプチ
    ドである、請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 ポリペプチドが、抗オンコスタチン−Ｍ抗体、抗スタニオ
    カルシン抗体および抗組織因子経路阻害剤−２抗体からなる群から選択された抗
    体である、請求項３１または３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 さらに、請求項１４に記載の単離された結合有機剤以外の
    抗腫瘍剤を同時投与することを含む、請求項３４に記載の方法。
38. 【請求項３８】 ポリペプチドが、抗オンコスタチン−Ｍ抗体、抗スタニオ
    カルシン抗体および抗組織因子経路阻害剤−２抗体からなる群から選択された抗
    体である、請求項１５に記載の単離された結合有機剤。