CN114980918A - T细胞疗法与(s)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合 - Google Patents

T细胞疗法与(s)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合 Download PDF

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Abstract

提供组合疗法的方法、组合物、用途和制品，所述组合疗法涉及免疫疗法，如过继细胞疗法，例如，T细胞疗法，以及(S)‑3‑[4‑(4‑吗啉‑4‑基甲基‑苄氧基)‑1‑氧代‑1,3‑二氢‑异吲哚‑2‑基]‑哌啶‑2,6‑二酮、或者其对映异构体或对映异构体的混合物、或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物的使用，所述组合疗法用于治疗患有疾病和病症如某些B细胞恶性肿瘤的受试者；以及相关的方法、组合物、用途和制品。所述细胞通常表达重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。

Description

T细胞疗法与(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代- 1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年11月7日提交的标题为“T细胞疗法与(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合(COMBINATION OFA T CELL THERAPY AND(S)-3-[4-(4-MORPHOLIN-4-YLMETHYL-BENZYLOXY)-1-O XO-1,3-DIHYDRO-ISOINDOL-2-YL]-PIPERIDINE-2,6-DIONE)”的美国临时申请号62/932,500和2020年4月28日提交的标题为“T细胞疗法与(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合(COMBINATION OF A T CELL T HERAPY AND(S)-3-[4-(4-MORPHOLIN-4-YLMETHYL-BENZYLOXY)-1-OXO-1,3-DI HYDRO-ISOINDOL-2-YL]-PIPERIDINE-2,6-DIONE)”的美国临时申请号63/016,977的优先权，所述申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表以2020年11月2日创建的名为735042022440SeqList.txt的文件提供，其大小为35,330字节。将所述序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
在一些方面，本公开文本涉及组合疗法的方法、组合物、用途和制品，所述组合疗法包括免疫疗法，如过继细胞疗法，例如，T细胞疗法，以及(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮、或者其对映异构体或对映异构体的混合物、或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物的使用，所述组合疗法用于治疗患有疾病和病症如某些B细胞恶性肿瘤的受试者；以及相关的方法、组合物、用途和制品。所述T细胞疗法包括表达重组受体如嵌合抗原受体(CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。
背景技术
多种策略可用于免疫疗法，例如施用工程化T细胞用于过继疗法。例如，策略可用于工程化表达基因工程化抗原受体(如CAR)的T细胞，以及向受试者施用含有这样的细胞的组合物。需要改进的策略来改善细胞的功效，例如，改善向受试者施用后细胞的持久性、活性和/或增殖。提供满足这样的需求的方法、组合物、试剂盒和系统。
发明内容
本文提供涉及组合疗法的方法、组合物、用途和制品，所述组合疗法涉及将包括细胞疗法如T细胞疗法的免疫疗法施用至患有癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)的受试者，以及向所述受试者施用如本文所述的化合物A。在一些方面，所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，如复发性或难治性NHL或特定NHL亚型。在一些方面，所提供的方法、用途和制品包括施用T细胞疗法，如包含与B细胞上表达的抗原结合的抗原结合结构域的CAR表达T细胞。在一些方面，所述抗原是CD19。
本文提供治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法涉及：(a)将T细胞疗法施用至患有B细胞恶性肿瘤的受试者，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞；以及(b)随后向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000021
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：(i)第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，(ii)在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及(iii)包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000022
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，所述受试者在所述化合物的施用之前已经被施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：(i)第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，(ii)在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及(iii)包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在每个四周循环期间，在连续三周中每天施用所述化合物之后，一周不施用所述化合物。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在所述第一施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在所述第二施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约或大于三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长直至、直至约或直至约大于所述T细胞疗法的施用起始后三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长直至或直至约所述T细胞疗法的施用起始后三个月。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在所述T细胞疗法在所述受试者中的峰值扩增时或之前，起始所述化合物的施用。在一些实施方案中，所述T细胞疗法的峰值扩增是在施用所述T细胞疗法之后为或约11天与为或约15天之间。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第一施用期在所述T细胞疗法的施用起始的同一天开始。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约15天之间开始，包含端值。在一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约11天之间开始，包含端值。在一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天与为或约15天之间开始，包含端值。在一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天开始。在本文提供的任一种方法的其他实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约7天开始。在本文提供的任一种方法的其他实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天开始。在某些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约14天开始。在某些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约15天开始。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述暂停期在施用所述T细胞疗法之后为或约第21天开始。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述暂停期在施用所述T细胞疗法之后第21天开始。在一些实施方案中，所述暂停期持续直至所述受试者的B细胞血液计数水平恢复至与在所述第一施用期之前测量的水平相同或大致相同的水平。在一些实施方案中，所述暂停期为或为约一周。在一些实施方案中，所述暂停期为约一周。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约28天开始。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约29天开始。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后29天开始。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第二施用期中施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期延长从或从为或约三个月至为或六个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长约三个月或至约六个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长三个月至六个月。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长直至或直至约所述T细胞疗法的施用起始后三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长至少直至或直至所述T细胞疗法的施用起始后约三个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长至少直至或直至所述T细胞疗法的施用起始后约三个月且直至所述受试者展现疾病进展。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约3个月。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。在一些实施方案中，如果在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后，所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在3个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约3个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在3个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约六个月。在一些实施方案中，所述第二施用期延长或延长直至所述T细胞疗法的施用起始后约六个月。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约6个月。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约6个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果在为或约6个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后，所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在6个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约6个月。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在6个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现部分反应(PR)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现疾病稳定(SD)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或为约12个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约12个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现部分反应(PR)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约12个月结束。在一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现疾病稳定(SD)，则所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后为或约12个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则所述第二施用期延长至少直至或直至所述T细胞疗法的施用起始后约三个月并且在所述B细胞恶性肿瘤已经进展或复发时结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述第二施用在所述T细胞疗法的施用起始后不超过或不超过约12个月结束。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述受试者在所述第二施用期期间且在所述第二施用期结束之前实现完全反应(CR)。在一些实施方案中，即使所述受试者已经在所述第二施用期结束之前的时间点实现完全反应(CR)，仍继续进行所述第二施用期。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在所述化合物的施用起始时，所述受试者在所述T细胞疗法的施用后未展现严重毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是严重细胞因子释放综合征(CRS)，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级CRS；和/或所述严重毒性是严重神经毒性，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级神经毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是严重CRS。在一些实施方案中，所述严重毒性是3级或更高级CRS。在一些实施方案中，所述严重毒性是延长的3级或更高级CRS。在一些实施方案中，所述严重毒性是4级CRS。在一些实施方案中，所述严重毒性是5级CRS。在一些实施方案中，所述严重毒性是严重神经毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是3级或更高级神经毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是延长的3级或更高级神经毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是4级神经毒性。在一些实施方案中，所述严重毒性是5级神经毒性。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，如果所述受试者在所述化合物的施用后展现毒性，任选地血液毒性，则暂停所述化合物的施用和/或修改所述循环方案。在一些实施方案中，如果所述受试者在所述化合物的施用后展现毒性，则暂停所述化合物的施用。在一些实施方案中，如果所述受试者在所述化合物的施用后展现毒性，则修改所述循环方案。在一些实施方案中，所述毒性是血液毒性。在一些实施方案中，所述毒性选自严重中性粒细胞减少症，任选地发热性中性粒细胞减少症、延长的3级或更高级中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，所述毒性是发热性中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，所述毒性是延长的3级或更高级中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，在所述受试者不再展现所述毒性后，重新开始所述化合物的施用。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施方案中，所述NHL包括侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS，任选地转化的惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排和DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。在一些实施方案中，在所述剂量的细胞施用时或紧临在施用之前，在用针对NHL的一种或多种先前疗法、任选地除了另一剂量的表达CAR的细胞以外的一种、两种或三种先前疗法治疗后，所述受试者已经在缓解后复发，或者变得是所述先前疗法难治的。在一些实施方案中，在所述剂量的细胞施用时或施用之前，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有化学难治性淋巴瘤、任选地化学难治性DLBCL；和/或所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全缓解(CR)。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的水合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的溶剂化物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述化合物是口服施用的。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述CD19是人CD19。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)包含与CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人CD3-ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含人4-1BB的信号传导结构域。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述CAR包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB，任选地人4-1BB；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子；所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括4-1BB信号传导结构域，任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域；或者所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含间隔子并且所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含免疫球蛋白铰链或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成，或者包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域，(b)包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4铰链，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28细胞外区域或CD8细胞外区域，或者(c)长度是为或约12个氨基酸和/或包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成；或者(d)具有以下或由其组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34的序列，由SEQ ID NO:2编码的序列，或前述任一项的变体，所述变体具有与前述任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，或者(e)包含式X1PPX2P(SEQID NO:58)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸；和/或源自共刺激分子的胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或其变体，所述变体具有与SEQ ID NO:12的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性；和/或源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域包含具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的SEQ ID NO:13或14或15；和/或所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列或者与前述任一项结合相同表位或与前述任一项竞争结合，并且任选地其中所述scFv按顺序包含VH、任选地包含SEQ ID NO:41的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述CAR包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB，任选地人4-1BB；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括4-1BB信号传导结构域，任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含免疫球蛋白铰链或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成，或者包含约15个或更少的氨基酸。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述间隔子包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4铰链，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成和/或包含约15个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸和/或包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述间隔子具有以下或由其组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34，或前述任一项的变体，所述变体具有与前述任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，源自共刺激分子的胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或其变体，所述变体具有与SEQ ID NO:12的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域包含具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的SEQ ID NO:13或14或15。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ IDNO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，并且任选地其中所述scFv包含含有SEQ ID NO:41的VH和含有如SEQID NO:42所示的氨基酸序列的VL。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述scFv具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞或5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或者至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约1x108个CAR表达细胞。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述剂量的细胞是肠胃外施用，任选地静脉内施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述剂量的细胞是静脉内施用。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述T细胞对于所述受试者是自体的。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞并且所述剂量的施用包括施用多种单独组合物，所述多种单独组合物包括包含所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及包含所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。在一些实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或所述第一组合物的施用的起始和所述第二组合物的施用的起始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。在一些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。在一些实施方案中，所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物是在所述第二组合物之前施用的。
在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且将第一组合物和第二组合物相隔从为或约0至为或约12小时、相隔从为或约0至为或约6小时或相隔从为或约0至为或约2小时施用。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔不超过为或约2小时、不超过为或约1小时或者不超过为或约30分钟，相隔不超过为或约15分钟、不超过为或约10分钟或者不超过为或约5分钟进行的。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始和/或完成与所述第二组合物的施用的完成和/或起始是相隔不超过为或约2小时、不超过为或约1小时或者不超过为或约30分钟，相隔不超过为或约15分钟、不超过为或约10分钟或者不超过为或约5分钟进行的。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，在所述T细胞疗法的施用之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，还包括紧临在所述T细胞疗法的施用之前，将淋巴细胞清除疗法施用至所述受试者，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2，且包含端值的环磷酰胺；和/或为约20-40mg/m2，任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨持续3天；和/或所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨持续3天。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，所述受试者是人。
在本文提供的任一种方法的一些实施方案中，至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)，所述完全反应是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述CR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者截至六个月时保持反应，保持CR，和/或存活或无进展存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为大于九个月；和/或至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述OR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者截至六个月时保持反应或存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物的施用：逆转所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型；预防、抑制或延迟所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的发作；或者降低所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的水平或程度；或者减少所述受试者中具有耗竭表型的CAR表达T细胞的总数量的百分比。在一些任何这样的实施方案中，所述化合物的施用的起始是在所述T细胞疗法的施用之后进行的，并且在所述化合物的施用或其起始之后，所述受试者展现所述受试者中CAR表达T细胞的抗原或肿瘤特异性活性或功能的恢复或拯救，任选地其中所述恢复、拯救和/或所述化合物的施用的起始是在所述受试者中或所述受试者的血液中的CAR表达T细胞已经展现耗竭的表型之后的时间点。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和/或持续时间来施用：在使T细胞暴露于抗原(例如CD19)或暴露于抗原受体特异性因子之后，如与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，实现所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞的抗原特异性(例如CD19抗原)或抗原受体驱动的活性的增加，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者在使T细胞暴露于抗原(例如CD19)或暴露于抗原受体特异性因子之后，如与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，预防、抑制或延迟所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞中的耗竭表型的发作，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者如与不存在对所述受试者的所述施用的情况相比，逆转所述受试者中耗竭的T细胞中的耗竭表型，任选地所述T细胞包括表达所述CAR的T细胞。在一些任何实施方案中，所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和持续时间来施用：实现所述活性增加，以及预防、抑制或延迟所述耗竭表型的所述发作，和/或逆转所述耗竭表型。在一些任何实施方案中，所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率或持续时间来施用：实现所述活性增加，以及预防、抑制或延迟所述耗竭表型的所述发作，和/或逆转所述耗竭表型。在一些任何实施方案中，所述受试者中的T细胞包括表达所述CAR的T细胞，并且所述抗原是CD19靶抗原。在一些任何实施方案中，所述受试者中的T细胞包括表达所述CAR的T细胞，或者所述抗原是CD19抗原。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，关于T细胞或T细胞群的耗竭表型包括与相同条件下的参考T细胞群相比，一种或多种耗竭标记(任选地2、3、4、5或6种耗竭标记)在一个或多个T细胞上的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述耗竭标记的表面表达的T细胞的T所述群体的百分比的增加。在一些任何实施方案中，关于T细胞或T细胞群的耗竭表型包括与相同条件下的参考T细胞群相比，在暴露于抗原或抗原受体特异性因子时，由所述T细胞或T细胞群展现的活性的水平或程度的降低。在一些任何实施方案中，所述水平、程度或百分比的增加是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。在一些任何实施方案中，所述水平、程度或百分比的降低是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。
在一些任何实施方案中，所述参考T细胞群是已知具有未耗竭表型的T细胞群，是幼稚T细胞群，是中枢记忆T细胞群，或者是干细胞中枢记忆T细胞(stem central memory Tcell)群，任选地来自与衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者相同的受试者或者与所述受试者物种相同。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述参考T细胞群是受试者匹配的群体，其包含从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者的血液分离的大量(bulk)T细胞，任选地其中所述大量T细胞不表达所述CAR，并且所述参考T细胞群是在接受一定剂量的表达所述CAR的T细胞的施用之前，从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者获得的。在一些任何实施方案中，所述参考T细胞群是受试者匹配的群体，其包含从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者的血液分离的大量T细胞，任选地其中所述大量T细胞不表达所述CAR，或者所述参考T细胞群是在接受一定剂量的表达所述CAR的T细胞的施用之前，从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者获得的。在一些任何实施方案中，所述参考T细胞群在其施用至所述受试者之前是包含所述T细胞疗法的样品的组合物，或者包含表达所述CAR的T细胞的药物组合物，任选地其中所述组合物是冷冻保存的样品。在一些任何实施方案中，所述一种或多种耗竭标记是抑制性受体。在一些任何实施方案中，所述一种或多种耗竭标记选自PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、2B4、CD160、CD39、VISTA和TIGIT。
在本文提供的任何方法的一些任何实施方案中，所述活性或为一种炎性细胞因子或炎性细胞因子组合的增殖、细胞毒性或产生中的一种或多种，任选地其中所述一种细胞因子或细胞因子组合选自IL-2、IFN-γ和TNF-α。在一些任何实施方案中，暴露于所述抗原或抗原受体特异性因子包括通过与所述抗原或抗原受体特异性因子、任选地结合所述CAR的因子一起孵育来暴露所述T细胞，其中所述抗原任选地为CD19抗原。在一些任何实施方案中，暴露所述抗原或抗原受体特异性因子包括将所述T细胞与表达CD19抗原的靶细胞、任选地疾病、障碍或病症的细胞(如癌症例如B细胞恶性肿瘤的细胞)一起孵育。
在一些实施方案中，本文还提供包含T细胞疗法和化合物的组合疗法在治疗B细胞恶性肿瘤的方法中的用途，所述方法包括：(a)将T细胞疗法施用至患有B细胞恶性肿瘤的受试者，所述T细胞疗法包含一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞；以及(b)随后向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000111
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
在一些实施方案中，本文还提供化合物在治疗B细胞恶性肿瘤的方法中的用途，所述方法包括：向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000112
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，所述受试者在所述化合物的施用之前已经被施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
在一些实施方案中，本文还提供包含T细胞疗法和化合物的组合疗法在用于B细胞恶性肿瘤治疗的药物的制造中的用途，其中(a)所述T细胞疗法要被施用至患有B细胞恶性肿瘤的受试者，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞；并且(b)所述受试者随后要被施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000121
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，其中所述化合物的施用要在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且要按循环方案来进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
本文还提供化合物在用于B细胞恶性肿瘤治疗的药物的制造中的用途，其中所述受试者要被施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000122
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，所述受试者在所述化合物的施用之前已经被施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞，其中所述化合物的施用要在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且要按循环方案来进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
在本文提供的一些任何用途中，所述组合疗法根据本文提供的方法的任何上文实施方案来使用。
在本文提供的一些任何用途中，所述化合物根据本文提供的方法的任何上文实施方案来使用。
在本文提供的用途的一些实施方案中，在所述第一施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
在本文提供的用途的一些实施方案中，在所述第二施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约或大于三个月。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第二施用期延长直至或直至约所述T细胞疗法的施用起始后三个月。
在本文提供的用途的一些实施方案中，在所述T细胞疗法在所述受试者中的峰值扩增时或之前，起始所述化合物的施用。在一些实施方案中，所述T细胞疗法的峰值扩增是在施用所述T细胞疗法之后为或约11天与为或约15天之间。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在所述T细胞疗法的施用起始的同一天开始。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约15天之间开始，包含端值。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约11天之间开始，包含端值。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天与为或约15天之间开始，包含端值。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约7天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约14天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约15天开始。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述暂停期在施用所述T细胞疗法之后为或约第21天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述暂停期持续直至所述受试者的B细胞血液计数水平恢复至与在所述第一施用期之前测量的水平相同或大致相同的水平。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述暂停期为约一周。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约28天开始。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约29天开始。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的水合物。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的溶剂化物。在本文提供的用途的一些实施方案中，所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，任选地其中所述NHL包括侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS，任选地转化的惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排和DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述CD19是人CD19。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)包含与CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
在本文提供的用途的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含人4-1BB的信号传导结构域。
在本文提供的用途的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞或者5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。在本文提供的用途的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或者至少或至少约5x108个CAR表达细胞。在本文提供的用途的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。在本文提供的用途的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约1x108个CAR表达细胞。
在本文提供的用途的一些实施方案中，基因工程化的T细胞的所述剂量包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞并且所述剂量的施用包括施用多种单独组合物，所述多种单独组合物包括包含所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及包含所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。在一些实施方案中，所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
附图说明
图1显示在与不同浓度的化合物A(正方形)或化合物B(圆形)一起孵育后，抗CD19刺激的CAR表达T细胞中的细胞内Ikaros和Aiolos表达。
图2A描绘通过与K562.CD19靶细胞一起培养5天，已经新鲜解冻的或已经慢性刺激的(例如，展示耗竭表型)的抗CD19 CAR T细胞的细胞因子产物。
图2B描绘通过与K562.CD19靶细胞一起培养5天，已经新鲜解冻且没有慢性刺激的(例如，展示幼稚表型)或者已经慢性刺激的(例如，展示耗竭表型)的抗CD19 CAR T细胞的细胞裂解活性。
图2C显示在不同浓度的化合物A(三角形)或化合物B(圆形)的存在下，三名抗体的抗CD19 CAR T细胞的增殖(平均值±SEM)。图2D显示在用3μg/mL抗ID(左小图)或30μg/mL抗ID(右小图)进行对CAR T细胞的刺激时，不同浓度的化合物A(正方形)或化合物B(圆形)对细胞活力的作用。图2E显示在用1000nM化合物B或100nM化合物A处理后，对抗CD19 CAR T细胞的细胞周期分析。图2F显示在暴露于不同浓度的化合物A(正方形)或化合物B(圆形)时，处于细胞周期的G1期中的抗CD19 CAR T细胞的百分比。使CAR T细胞暴露于3μg/mL抗ID(左小图)或30μg/mL抗ID(右小图)。图2G显示已经用30μg/mL抗ID刺激24小时(左小图)或72小时(右小图)且暴露于化合物A或化合物B的抗CD19 CAR T细胞中IFNγ、穿孔素、颗粒酶B和IL-2的细胞内细胞因子表达水平。
图3A显示已经在化合物A(10nM或100nM)的存在下经历慢性刺激的抗CD19CAR T细胞中Ikaros的表达。图3B显示在用表达CD19的靶细胞再激发之前，与不存在化合物的情况(对照)相比，已经在化合物A(0.001μM或0.01μM)的存在下同时孵育的慢性刺激的细胞的细胞裂解活性，如通过随时间变化的肿瘤细胞数量所测量。图3C显示在与1μM化合物B(左小图)或者0.001μM或0.01μM化合物A(右小图)共培养后的不同时间，Granta-519肿瘤球状体的大小。图3D显示在化合物A的存在下9天后，Granta-519肿瘤球状体的平均肿瘤体积。图3E描绘在用化合物A慢性刺激且同时孵育后，在与抗CD19 CAR T细胞共培养时的第9天，作为三维球状体生长的Granta-519肿瘤细胞的代表性图像。图3F显示从已经与CD19肿瘤球状体共培养5天并用化合物A或化合物B处理的慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞的上清液测量的IFNγ、IL-2和TNFα的细胞因子水平。图3G显示来自上清液的平均化的IFNγ浓度，其是在共培养5天后测量如从来自3名供体和2次独立实验的合并数据所确定(每次处理之间的统计学上显著的差异指示为：*P<.05，***P<.001，且****P<.0001)。图3H描绘火山图，其显示在慢性刺激期间通过使用1nM或10nM化合物A的每种同时处理诱导的差异性表达的基因。图3I描绘在慢性刺激期间通过慢性刺激和通过10nM化合物A诱导的对基因表达谱的作用(log2倍变化)的比较。图3J描绘对差异性表达的基因的KEGG途径富集分析。
图4A显示化合物A(0.001μM或0.01μM)对靶向用CD19转导的K562细胞(K562.CD19)、Raji细胞或Granta-519细胞的抗CD19 CAR T细胞的细胞裂解活性的作用。图4B显示在与CAR-T细胞共培养后第9天，Granta-519肿瘤球状体的大小的平均化的测量值。图4C显示从已经与CD19肿瘤球状体共培养5天且用化合物A或化合物B处理的慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞的上清液测量的IFNγ、IL-2和TNFα的细胞因子水平。
图5A显示在化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，在与CAR-T细胞共培养后第9天，A549.CD19肿瘤球状体的大小的平均化的测量值。图5B显示在用化合物A(0.01μM或0.1μM)处理的情况下，在第5天测量的与A549.CD19肿瘤球状体的共培养物中CAR T细胞的数量的倍数变化。图5C显示在与慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞共培养9天以及化合物A拯救孵育后，Granta-519球状体和A549.CD19球状体的代表性图像。图5D显示在与抗CD19 CART细胞和化合物A共培养后，随时间变化的肿瘤球状体大小的平均化的测量值。
图5E显示从已经与CD19肿瘤球状体共培养5天且用化合物A处理的慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞的上清液测量的IFNγ、IL-2和TNFα的细胞因子水平。图5F显示从3名供体和2次独立实验的数据合并的得自第5天的共培养上清液的平均IFNγ浓度(每次处理之间的统计学上显著的差异指示为*P<.05且****P<.0001)。
图5G描绘火山图，其显示通过与慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞共培养9天之后用化合物A拯救处理后诱导的差异性表达的基因。图5H显示通过对已经慢性刺激的抗CD19CAR T细胞的10nM化合物A拯救处理诱导的对基因表达谱的作用(log2倍变化)的比较。图5I显示在用化合物A进行拯救处理后，对慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞中的差异性表达的基因的KEGG途径富集分析。
图6A显示在化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，与RL CD19+肿瘤细胞共培养的抗CD19 CAR T细胞的细胞裂解活性，如通过肿瘤细胞数量所测量。图6B和图6C显示在化合物B(1μM)或化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，与抗CD19 CAR T细胞共培养的RL肿瘤球状体的肿瘤大小(图6B)和肿瘤细胞数量(图6C)。
图7A是在用化合物A处理抗CD19 CAR T细胞3天后，细胞内细胞因子的热图。所述图描绘相对于培养中的媒介物对照，细胞因子的平均荧光(MFI)的log2倍变化。
图7B描绘在将用化合物A处理3天的抗CD19 CAR T细胞与Raji或Granta-519淋巴瘤靶细胞共培养后的细胞裂解活性，基于肿瘤细胞的数量来描绘。
图7C描绘在用化合物A处理3天后，抗CD19 CAR T细胞的增殖。
图7D描绘在用化合物A处理3天后，处于G1期中的抗CD19 CAR T细胞的百分比的图(平均值±SEM，来自从3名供体和2次独立实验合并的数据)。
具体实施方式
提供工程化的细胞如T细胞(例如，CAR-T细胞)和(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮
Figure BDA0003727106220000161
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物(化合物A)及其组合物用于治疗患有癌症或增殖性疾病的受试者的方法和用途。在一些方面，所述T细胞疗法是包含特异性识别和/或靶向与癌症或增殖性疾病相关的抗原(如与B细胞恶性肿瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤或其亚型)相关的抗原)的T细胞的过继T细胞疗法。在一些方面，所述T细胞疗法包含用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞，所述嵌合抗原受体包含与抗原结合(如特异性结合)的抗原结合结构域。在一些情形中，所述T细胞疗法靶向的抗原是CD19。还提供组合和制品，如试剂盒，其含有包含T细胞疗法的组合物和/或包含化合物A的组合物，以及这样的组合物和组合用于治疗或预防疾病、病症和障碍(包括癌症，如B细胞恶性肿瘤)的用途。
(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)是一种赛拉隆蛋白(cereblon)E3连接酶调节化合物(CELMoD)。化合物A调节CRBN，其诱导转录因子Aiolos和Ikaros的泛素化，增加其蛋白酶体依赖性降解并增强T细胞功能。化合物A更强效地与CRBN结合，在降解Aiolos和Ikaros方面比来那度胺和泊马度胺更有效，并且具有对淋巴瘤细胞的强效直接抗增殖作用。相对于化合物B，化合物A在降解Ikaros和Aiolos方面也更强效10-20倍。化合物A具有对淋巴瘤细胞的直接抗增殖作用。如本文所示，化合物A还增强T细胞功能。
细胞疗法，如基于T细胞的疗法，例如，过继T细胞疗法(包括涉及施用表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体)的细胞的那些，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)，可以在疾病和障碍如B细胞恶性肿瘤的治疗中有效。重组受体如嵌合抗原受体(CAR)在T细胞表面上的工程化的表达使得能够重定向T细胞特异性。在临床研究中，CAR-T细胞(例如抗CD19 CAR-T细胞)已经在白血病和淋巴瘤的两类患者中产生持久的完全反应(Porter等人(2015)Sci Transl Med.,7:303ra139；Kochenderfer(2015)J.Clin.Oncol.,33:540-9；Lee等人(2015)Lancet,385:517-28；Maude等人(2014)N Engl J Med,371:1507-17)。
在某些情况下，过继细胞疗法的可行方法可能并不始终完全令人满意。例如，尽管在许多患有淋巴瘤的受试者中可以检测到CAR T细胞持久性，但是与患有ALL的受试者相比，在患有NHL的受试者中观察到较少的完全反应(CR)。更具体地，尽管已报告在CAR T细胞输注之后高达80％(CR率47％至60％)的较高总反应率，但在一些人中反应是短暂的，并且受试者已显示出在存在持久性CAR T细胞的情况下复发(Neelapu,58th Annual Meetingof the American Society of Hematology(ASH):2016；美国加利福尼亚州圣地亚哥文献号LBA-6.2016；Abramson,Blood.2016年12月1日；128(22):4192)。另一项研究报告长期CR率为40％(Schuster,Ann Hematol.2016年10月；95(11):1805-10)。
在一些方面，对此的解释是循环CAR表达T细胞的免疫耗竭和/或T淋巴细胞群的变化。这是因为，在一些情况下，最佳功效可能取决于所施用细胞具有以下性能的能力：被激活，扩增，发挥各种效应子功能(包括细胞毒性杀伤和分泌各种因子，如细胞因子)，持续存在(包括长期)，分化、转换或参与重编程为某些表型状态(如长期记忆、较低分化和效应子状态)，避免或减少疾病局部微环境中的免疫抑制条件，在清除并重新暴露于靶配体或靶抗原后提供有效且稳健的回忆反应，以及避免或减少衰竭、无反应性、外周耐受、终末分化和/或分化为抑制状态。
在一些实施方案中，在施用至受试者之后，工程化的细胞的暴露、持久性和功能降低或下降。然而，观察表明，在一些情形中，所施用的表达重组受体的细胞可以在体内再扩增和/或被再激活(例如，显示随时间增加的细胞数量或持续时间)，以改进过继细胞疗法的功效和治疗结局。
在一些实施方案中，在长期刺激或暴露于抗原和/或在肿瘤微环境中的条件下暴露之后，T细胞可以随着时间变得功能减退和/或展现与耗竭状态相关的特征。在一些方面，这降低了T细胞针对抗原的持久性和功效，并限制了它们有效的能力。存在对改进CAR T细胞的功效和功能，特别是最小化、减少、阻止或逆转功能减退或耗竭状态的方法的需要。
所提供的方法是基于如下观察：某些免疫调节化合物(例如化合物A)改进T细胞功能，包括与T细胞的产生一种或多种细胞因子的能力、细胞毒性、扩增、增殖和持久性相关的功能。在一些方面，所提供的方法增强或调节与T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)的施用相关的T细胞活性的增殖和/或活性。发现这样的方法和用途提供或实现改进的或更大的T细胞功能，从而改进抗肿瘤功效。
本文中还发现，除了加强T细胞功能外，这样的免疫调节化合物(例如化合物A)还展现逆转、延迟或预防T细胞耗竭的作用，包括通过增加T细胞信号传导和/或改变在慢性刺激后差异性调节的一个或多个基因。因此，尽管在一些情形中，增加或加强T细胞活性的药剂可能将细胞驱动至耗竭状态，但在本文中发现，这样的免疫调节化合物(例如化合物A)发挥对T细胞活性的加强作用的活性与T细胞耗竭解耦。此外，本文的观察显示，免疫调节化合物(例如化合物A)展现拯救T细胞免于T细胞耗竭的活性，如通过在细胞已经显示耗竭的特征后恢复或部分恢复一种或多种T细胞活性。值得注意的是，本文的结果显示，使已经进行慢性刺激并展现耗竭的T细胞的特征的T细胞暴露于本文所述的免疫调节化合物(如化合物A)能够恢复活性或者使其活性恢复或部分恢复。本文的观察结果支持，如与某些替代性方法相比，所提供的方法还可以实现改进的或更持久的反应，如在所治疗的受试者的特定组中。
本文的观察显示在化合物A对急性刺激的抗CD19 CAR T细胞和已经在慢性刺激测定中发生功能减退的抗CD19 CAR T细胞的处理效果后改进的T细胞功能。显示化合物A处理在24小时处理后，完全降解激活的抗CD19 CAR T细胞的Ikaros和Aiolos表达二者。显示化合物A增加抗CD19 CAR T细胞的效应细胞因子(例如，IFN-γ)产生，同时减慢其增殖速率。在所测试的所有浓度(1至100nM)下都观察到这种对于增殖的作用，并且所述作用是由于处于G1期中的抗CD19 CAR T细胞的积累所致。这种效应细胞因子产生与增殖速率的解耦在临床上可能是有益的。显示同时慢性刺激和用化合物A(1和10nM)处理限制抗CD19 CAR T细胞功能减退性耗竭的发作，如通过针对CD19+淋巴瘤细胞系和CD19+淋巴瘤球状体的细胞裂解所评估，并且改进效应细胞因子分泌和表达。在被添加至耗竭的抗CD19 CAR T细胞时，化合物A(1和10nM)恢复针对CD19+球状体的细胞裂解活性，并改进效应细胞因子表达。综上所述，化合物A与抗CD19 CAR T细胞的组合可以提供用于通过调节肿瘤微环境，通过改进CART细胞的持续性抗肿瘤功能，以及潜在地通过对淋巴瘤细胞的直接抗肿瘤作用来增强和延长抗CD19 CAR T细胞在B细胞恶性肿瘤中的活性的有用治疗方法(Lonial,2019J ClinOncol.,37:8006)。
这些观察是使用慢性刺激测定以使CAR T细胞功能减退(例如减少的细胞裂解和IL-2分泌)进行的。使用该模型，检查CAR T细胞以评估当化合物A在暴露于导致功能减退性耗竭状态的条件期间(同时)或之后(拯救)存在时，对CAR T细胞功能的影响。在用抗原再激发时，本文提供的发现证实，在这样的条件期间对CAR T细胞的同时处理逆转与CAR T细胞功能减退相关的活性和表型(包括基因标签)，并且保留更多的效应子功能。同样，结果显示，化合物A可以拯救或恢复耗竭的T细胞的T细胞功能，包括细胞因子产生和细胞裂解活性。
本文提供的观察还证实，化合物A增加CAR T细胞的效应细胞因子产生，同时减慢其增殖速率。这个结果并非由于所述化合物对T细胞活力的作用所致。在不同浓度下观察到这种对增殖的作用，并且发现所述作用是由于处于G1期中的T细胞的积累所致。这种效应细胞因子产生与增殖速率的解耦在临床上可能是有益的，如通过限制体内T细胞的可能限制功效的分化。
所提供的方法显示，化合物A改进工程化的T细胞疗法的T细胞功能，包括与T细胞的扩增、增殖和持久性有关的功能。在一些实施方案中，所述方法由于与化合物A组合施用T细胞疗法而是有利的，所述T细胞疗法如包括用于过继细胞疗法(例如，如T细胞疗法)的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物。在一些方面，如与某些替代性方法相比，所提供的方法和用途提供或实现改进的或更持久的反应或功效。在一些方面，所提供的方法增强或调节与T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)的施用相关的T细胞活性的增殖和/或活性。在特定实施方案中，使用化合物A的组合疗法可以提供用于通过调节肿瘤微环境，通过改进CAR T细胞的持续性抗肿瘤功能来增强和延长CAR T细胞在B细胞恶性肿瘤中的活性的有用治疗方法。在一些情形中，所述化合物还可以具有对淋巴瘤细胞的直接抗肿瘤作用。
化合物A是作为多效小分子的免疫调节药物，其可以直接削弱原发性肿瘤生长，调节免疫抑制性肿瘤微环境，并促进更稳健的抗肿瘤炎性反应。化合物A发挥针对B细胞的抗增殖活性，并且正在作为用于靶向B细胞淋巴恶性肿瘤中的肿瘤的单一药剂治疗加以评价。已经显示化合物A和其他免疫调节药物如来那度胺通过Ikaros家族转录因子的降解而直接影响恶性淋巴细胞存活。已经将化合物A的分子靶标鉴定为蛋白质赛拉隆蛋白(CRBN)，它是Cullin 4RING E3泛素连接酶复合物的底物受体。化合物A与CRBN内的疏水性三色氨酸口袋的结合促进几种蛋白质底物(包括Aiolos(IKZF3)和Ikaros(IKZF1))的募集、泛素化和随后的蛋白酶体降解。
在本文所述的研究中，1和10nM的化合物A浓度延迟CD19 CAR T细胞耗竭的发作并拯救抗CD19 CAR T细胞免于耗竭。健康受试者中0.3mg和1.0mg的化合物A的剂量显示在2.41nM与11.79nM之间的Cmax。在一些方面，所述剂量是介导所述化合物的免疫调节作用的有效剂量。在一些方面，所述剂量是预期不会引起严重毒性(如3级中性粒细胞减少症和皮炎)的剂量。在一些方面，所提供的方法最小化或避免将T细胞疗法和/或化合物A施用至受试者之后的毒性。在一些方面，本文提供的方法涉及施用显著低于在现有的单一疗法方法中可以用于化合物A的直接肿瘤作用的剂量的剂量。
在一些实施方案中，化合物A是以在为或约0.1mg与为或约1mg之间的量来施用。所述剂量可以按循环方案每天施用。在一些方面，所提供的方法是通过施用如下量的化合物来进行：为或小于1mg/天，如为或为约0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg或0.1mg，或者前述任何值之间的任何值。在一些实施方案中，化合物A是以为或为约0.3mg/天来施用。在一些实施方案中，化合物A是以为或为约0.45mg/天来施用。在一些实施方案中，化合物A是以为或约0.6mg/天来施用。
在一些实施方案中，在接受淋巴细胞清除疗法之后足够时间将化合物A施用至受试者，使得化合物A和淋巴细胞清除疗法的骨髓抑制效应降至最低。
在一些实施方案中，所提供的方法是在T细胞疗法(例如CAR T细胞)可以展现或者可能展现耗竭特征时使用。在一些实施方案中，在已经达到峰值扩增的T细胞在受试者血液中的数量开始下降之后，耗竭表型是明显的。在一些实施方案中，与紧临在T细胞暴露于抗原之前时(基线)或者与细胞已经暴露于抗原但是继续增殖并且尚未达到峰值扩增的时间点相比，使T细胞疗法的T细胞(CAR T细胞)暴露于或接触化合物A的方法是在所述T细胞展现功能减退或耗竭状态的增加时进行的。在一些实施方案中，功能减退或耗竭状态的增加可以通过与先前更早的时间点相比增加的耗竭标记的表达来确定。在一些实施方案中，功能减退或耗竭状态的增加(如耗竭标记的表达的增加)是在将T细胞疗法(例如CAR T细胞)施用至患有与T细胞疗法所靶向抗原相关的疾病或病症的受试者之后的时间发生的。可以在施用至受试者之后，针对T细胞激活或耗竭的标记(如PD-1、TIM-3和LAG-3)监测T细胞，如外周血中的T细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法要求施用T细胞疗法，例如CAR T细胞，并且在CAR T细胞展现或可能展现耗竭表型之前的时间起始化合物A的施用。在一些实施方案中，化合物A的施用是在CAR T细胞仍在扩增或者仍然能够扩增的时间点起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在受试者的血液中存在峰值CAR T细胞数量之前或怀疑在此之前的时间点起始的。在一些方面，在这个时间点起始化合物A施用加强CAR T细胞功能。在一些方面，在这个时间点起始化合物A施用还延迟或预防CAR T细胞耗竭。
在一些实施方案中，化合物A的施用是在为或者怀疑或可能为在受试者的血液中存在峰值CAR-T细胞的时间之前或大致为所述时间(例如在T细胞的施用起始之后21天内)的时间起始。在一些情形中，在CAR T细胞的施用之后11-15天内存在峰值CAR-T细胞。在一些实施方案中，化合物A的施用是在细胞疗法的施用起始之后1至15天(例如为或约1天或8天或15天)的时间起始。在一些实施方案中，化合物A是当受试者在细胞疗法的施用后未展现严重毒性时的时间施用的。
在一些方面，在任何所提供的方法中，所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在四周时间段中持续连续三周。在一些实施方案中，在所述第一施用期和所述第二施用期期间以约0.30mg、0.45mg或0.60mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在一个或多个四周循环期间，在连续三周后一周不施用所述化合物。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法或免疫调节药物方案相比，所提供的方法不会导致毒性或毒性结局的高比率或可能性,或者降低毒性或毒性结局的比率或可能性，所述毒性或毒性结局如神经毒性(NT)、细胞因子释放综合征(CRS)或血液毒性，如中性粒细胞减少症。
在一些实施方案中，所述方法不会导致某些血液毒性，如中性粒细胞减少症或血小板减少症，或者不会增加其风险。在一些实施方案中，不超过50％的受试者展现高于3级的中性粒细胞减少症，如延长的3级中性粒细胞减少症或4级中性粒细胞减少症，和/或高于3级的血小板减少症，如3级或4级血小板减少症。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)不展现3级或高于3级的严重中性粒细胞减少症或严重血小板减少症。
在一些实施方案中，所述方法不会导致严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度的发热持续三天或更多天以及至少或至少约20mg/dL的CRP的血浆水平，或者不会增加其风险。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供的方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)不展现严重毒性结局(例如严重CRS或严重神经毒性)，例如不展现3级或更高级神经毒性和/或不展现严重CRS，或者在所述治疗后的某个时间段内，如在所述细胞施用的一周、两周或一个月内，无所述展现。
在一些情形中，化合物A是在其可以高效地/有效地加强或引发所述细胞的时间施用的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在受试者的血液中可检测到细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时或之前起始。在一些实施方案中，所提供的方法可以加强T细胞疗法，例如CAR-T细胞疗法，这在一些方面可以改进治疗结局。在一些实施方案中，在其中T细胞疗法的细胞在受试者中展现弱扩增，已经变得耗竭，展现降低或减小的持久性的受试者中，和/或在患有对其他疗法具有耐药性或是其他疗法难治的癌症和/或作为侵袭性或高风险癌症的癌症的受试者中，所述方法是特别有利的。
在一些实施方案中，针对所述疗法中的T细胞在受试者中(如在受试者的生物样品中，例如在受试者的血液中)的存在、不存在或水平，监测已经接受T细胞疗法(例如CAR-T细胞)的施用的受试者。在一些实施方案中，所提供的方法得到基因工程化的细胞，所述细胞在要被施用其的受试者中具有增加的持久性和/或更高效力。在一些实施方案中，如与通过替代性方法(如涉及T细胞疗法的施用但是不存在化合物A的施用的那些)可实现的持久性相比，基因工程化的细胞如CAR表达T细胞在受试者中的持久性更高。在一些实施方案中，持久性增加了至少或约至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
在一些实施方案中，可以在施用至受试者之后检测或定量所施用的细胞的持久性的程度或范围。例如，在一些方面，使用定量PCR(qPCR)来评估受试者的血液或血清或器官或组织(例如，患病部位)中表达重组受体的细胞(例如，CAR表达细胞)的量。在一些方面，持久性被定量为每微克的DNA中编码受体(例如CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者定量为每微升的样品(例如血液或血清)中表达受体的(例如表达CAR的)细胞的数量，或者每微升的样品中外周血单个核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数量。在一些实施方案中，还可以进行检测表达受体的细胞的流式细胞术测定，其通常使用对受体具有特异性的抗体。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞如能够结合至和/或中和疾病或病症细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的细胞，和/或能够诱导针对疾病或病症细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。在任何这样的实施方案中，与重组受体相关的另一种标记(例如表达CAR的细胞)的表达范围或水平可以用于区分所施用细胞与受试者中的内源细胞。
在一些实施方案中，施用化合物A持续一定时间段以增强增加或优化反应的持久性。在一些方面，所提供的方法是基于如下观察：在3个月(如通常在6个月)实现或处于完全缓解(CR)的受试者更有可能更长期地维持反应，如在治疗结束后或在组合疗法的施用后首次实现完全反应(CR)后，存活或无进展存活大于或大于约三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月。在一些方面，进行所述方法以在所述T细胞疗法的施用起始后施用化合物A，如按如所述的特定循环方案来施用，持续至少3个月，如至少四个月、至少五个月或至少六个月的时间段。在一些实施方案中，在所述T细胞疗法的施用起始后施用化合物A，如按如所述的特定循环方案来施用，持续至少六个月或至少180天。在一些实施方案中，在所述时间段结束时，如果受试者展现CR或者如果受试者中疾病或病症已经在接受治疗(组合疗法)后进展或缓解后复发，则结束或停止化合物A的施用。在一些方面，可以在如下受试者中进行化合物A的持续施用，所述受试者在所述时间段(例如为或约3个月或6个月)结束时展现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)。在其他方面，所述时间段是固定的持续时间，并且不再进行化合物A的施用。
在一些方面，如与某些替代性方法相比，所提供的方法和用途提供或实现改进的或更持久的反应或功效，所述替代性方法例如包括T细胞疗法或化合物A作为单一疗法的施用或者没有它们如本文所述作为组合疗法一起施用的方法，如在所治疗受试者的特定组中。在一些实施方案中，所述方法由于施用T细胞疗法和化合物A而是有利的，所述T细胞疗法如包括用于过继细胞疗法(例如，如T细胞疗法)的细胞(例如CAR表达T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在预后不良的高风险患者(如患有高风险疾病、例如高风险NHL的那些)中观察到这样的反应。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的侵袭性和/或预后不良B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)的或具有不良预后的NHL)的受试者。在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或滤泡性淋巴瘤。
在一些实施方案中，至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％或更多的根据所提供的方法和/或用所提供的制品、试剂盒或组合物治疗的受试者实现完全反应(CR)。在一些实施方案中，所述受试者处于CR中并且展现微量残留病(MRD)。在一些实施方案中，所述受试者处于CR中并且是MRD-。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的根据所提供的方法和/或用所提供的制品、试剂盒或组合物治疗的受试者实现部分反应(PR)的客观反应。在一些实施方案中，在细胞疗法的施用起始之后，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的根据所提供的方法和/或用所提供的制品、试剂盒或组合物治疗的受试者在六个月、在七个月、在八个月、在九个月、在十个月、在十一个月或一年实现CR或PR。
在一些实施方案中，截至细胞疗法的施用起始之后三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月或更长时间，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的根据所提供的方法和/或用所提供的制品、试剂盒或组合物治疗的受试者保持反应，如保持CR或客观反应(OR)。在一些实施方案中，这样的反应如CR或OR可持续至少三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间，如在至少或约至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的根据所提供的方法治疗的受试者中或在截至三个月、四个月、五个月或六个月实现CR的这样的受试者中。在一些实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的根据所提供的方法和/或用所提供的制品、试剂盒或组合物治疗的受试者或者截至三个月、四个月、五个月或六个月实现CR的这样的受试者存活或无进展存活大于或大于约六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月或更长时间。
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本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.组合疗法
提供工程化的细胞如T细胞(例如，CAR-T细胞)和(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或式I化合物
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或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、互变异构体或外消旋混合物(化合物A)(包括其组合物)用于治疗患有癌症的受试者的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有B细胞恶性肿瘤的受试者。在一些方面，所述方法用于治疗白血病或淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些方面，如与某些替代性方法相比，所述方法和用途提供或实现改进的反应和/或更持久的反应或功效，例如，在所治疗受试者的特定组中。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括1)向所述受试者施用T细胞疗法，所述T细胞疗法涉及表达基因工程化的细胞表面受体(例如，重组抗原受体)的T细胞，所述受体通常是嵌合受体，如嵌合抗原受体(CAR)，所述受体识别B细胞恶性肿瘤(如白血病或淋巴瘤(例如NHL)和/或衍生出其的细胞类型)表达的、与其相关的和/或为其所特有的抗原，以及2)向所述受试者施用化合物A。在一些实施方案中，化合物A的施用是在施用所述T细胞疗法之后(以后)或在起始所述T细胞疗法的施用之后(以后)起始。在一些情形中，将化合物A施用至已经接受T细胞疗法的施用的受试者。所述方法通常涉及将一个或多个剂量的所述细胞和超过一个剂量的化合物A施用至受试者。
本文所述的组合疗法(例如，包括表达重组受体如嵌合抗原受体(CAR)的工程化的细胞和化合物A)或包含所述工程化的细胞和/或化合物A的组合可用于多种治疗、诊断和预防适应症中。例如，所述组合可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。这样的方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其涉及将工程化的细胞、化合物A和/或含有一者或两者的组合物施用至患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者。在一些实施方案中，工程化的细胞、化合物A和/或含有一者或两者的组合物是以有效量来施用以实现疾病或障碍的治疗。用途包括工程化的细胞、化合物A和/或含有一者或两者的组合物在这样的方法和治疗中以及在用于进行这样的治疗性方法的药物的制备中的用途。在一些实施方案中，所述方法是通过将工程化的细胞、化合物A和/或含有一者或两者的组合物施用至患有或怀疑患有疾病或病症的受试者来进行的。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。在一些实施方案中，工程化的细胞是如章节II中所述的任一种。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至患有特定B细胞恶性肿瘤的受试者。所治疗的B细胞恶性肿瘤可以是其中抗原的表达与所述B细胞恶性肿瘤的病因相关和/或参与所述B细胞恶性肿瘤的病因(例如引起、加重或以其他方式参与所述B细胞恶性肿瘤)的任何一种。示例性B细胞恶性肿瘤可以包括与恶性肿瘤或细胞的转化相关的疾病或病症(例如癌症)。本文描述了示例性抗原，其包括与可进行治疗的各种B细胞恶性肿瘤相关的抗原。在特定实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合至与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知的B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原由B细胞(包括人B细胞)表达或在B细胞上表达。在一些实施方案中，由所述受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是CD19并且所述嵌合抗原受体特异性结合CD19。在一些实施方案中，所述CD19抗原是人CD19。应理解，其中CAR表达T细胞对CD19具有特异性的本文提供的任何方法的描述还可以通过靶向另一种B细胞抗原或者与T细胞恶性肿瘤相关或在T细胞恶性肿瘤的细胞上表达的抗原(如上述任一种)来进行。
在一些实施方案中，要治疗的B细胞恶性肿瘤包括白血病和淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。
在一些实施方案中，所述方法涉及通过施用抗原受体表达细胞(例如CAR表达细胞)和化合物A来治疗患有淋巴瘤或白血病如非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者。在一些实施方案中，化合物A是在施用重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)之后或以后，如在起始重组受体表达细胞(例如CAR表达细胞)的施用之后或以后施用的。
在一些实施方案中，NHL可以基于卢加诺(Lugano)分类进行分期(参见例如，Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。在一些情况下，所述分期通过罗马数字I至IV(1-4)来描述，并且影响淋巴系统外器官(结节外器官)的局限期(I或II)淋巴瘤指示为E。I期表示在一个结节或一组相邻结节中受累，或者不具有结节受累的单一结节外病灶(IE)。2期表示在膈同侧的两个或更多个结节组中受累，或者依据结节程度具有有限的连续结节外受累的I期或II期(IIE)。III期表示涉及膈两侧的结节或膈上方的结节且脾脏受累。IV期表示另外的非连续淋巴外受累的受累。另外，“巨大肿块(bulky disease)”可以用于描述胸腔中的大型肿瘤，特别是对于II期肿瘤。疾病的程度通过正电子发射断层扫描(PET)-计算机断层扫描(CT，用于亲嗜性(avid)淋巴瘤)和CT(用于非亲嗜性淋巴瘤)确定。
在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。在一些实施方案中，所述受试者的ECOG状态小于或等于1。ECOG体能状态量表根据患者的自理能力、日常活动和身体能力(例如步行、工作等)来描述其机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0表明，受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现身体活动的一些限制，但是所述受试者是完全可自由走动的。在一些方面中，ECOG体能状态为2的患者能大于50％走动。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如，
Figure BDA0003727106220000232
等人,(1993)Br J Cancer67(4)773-775。反映ECOG体能状态的标准描述于下表1中：
Figure BDA0003727106220000231
在一些实施方案中，受试者患有或已被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤或双/三打击分子亚型的淋巴瘤。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是双打击淋巴瘤，其特征为存在MYC(髓细胞瘤病致癌基因)、BCL2(B细胞淋巴瘤2)和/或BCL6(B细胞淋巴瘤6)基因重排(例如，易位)。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是三打击淋巴瘤，其特征为存在MYC、BCL2和BCL6基因重排；参见例如，Aukema等人,(2011)Blood 117:2319-2331。在这样的实施方案的一些方面，受试者是ECOG 0-1。在多个方面，所述疗法被指示用于这样的受试者，和/或说明书指示施用至这个群体内的受试者。在一些实施方案中，基于2016WHO标准(Swerdlow等人,(2016)Blood 127(20):2375-2390)，可以将双/三打击淋巴瘤视为具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者对于使用细胞疗法(例如CAR+T细胞)的治疗是或可能是或被预测为是较差反应者，和/或所述受试者不反应，可能不反应和/或被预测为不反应或在某一时间内和/或在某一程度上不反应。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者如在开始施用所述细胞疗法后1个月内、在两个月内或在三个月内不展现或不可能展现或被预测为不展现完全反应或总体反应。在一些实施方案中，将所述组合疗法施用至受试者，所述受试者如在施用所述细胞疗法后1个月、两个月或三个月内展现或可能展现或被预测为展现疾病进展(PD)。在一些实施方案中，基于如此治疗或先前用所述细胞疗法治疗的多名类似情况的受试者，受试者可能或被预测为不展现反应或某一反应。
在一些实施方案中，所提供的方法包括治疗受试者的特定组或子集，例如，被鉴定为患有高风险疾病(例如，高风险NHL)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的侵袭性和/或预后较差B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)具有较差预后的NHL)的受试者。在一些情况下，对于所述疗法所指示的疾病和/或患者群体，对可用疗法、对护理标准、或对参考疗法的总反应率(ORR)小于40％和/或完全反应(CR)小于20％。在一些实施方案中，在化学难治性DLBCL中，对参考或可用治疗或护理标准疗法的ORR为约26％，并且CR为约8％(Crump等人.Outomes in refractory aggressivediffuse large B-cell lymphoma(DLBCL):Results from the international SCHOLARstudy.ASCO 2016[摘要7516])。在一些方面，所提供的方法、组合物、用途和制品实现改进的且更好的对可用疗法的反应。
在一些实施方案中，用于治疗本文所述受试者的方法和用途涉及例如基于特定疾病类型、诊断标准、先前治疗和/或对先前治疗的反应，选择或鉴定受试者的特定组或子集。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗在用一种或多种先前疗法治疗后在缓解后复发或变得所述一种或多种先前疗法难治的受试者；或对一种或多种先前疗法(例如，一个或多个标准治疗线，包括如本文所述的那些)是复发性或难治性(R/R)的受试者。
在一些实施方案中，受试者已经经历超过一种、两种、三种、四种、五种或六种先前疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历一种先前疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历约二至四种先前疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历约五至六种先前疗法。在一些实施方案中，受试者已经经历超过六种先前疗法。
在一些实施方案中，在表达重组受体的细胞的施用之前，受试者先前已经用靶向B细胞恶性肿瘤(例如，NHL)的疗法或治疗剂进行治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用细胞疗法(例如，CAR+T细胞)进行治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)进行治疗。在一些实施方案中，受试者在用标准疗法治疗之后具有不良预后和/或对一个或多个线的先前疗法已经无效。在一些实施方案中，受试者已经用除了淋巴细胞清除疗法以外的用于治疗NHL的至少或约至少或约1、2、3、4、5、6或7种其他疗法进行治疗或者先前已经接受所述其他疗法。在一些实施方案中，受试者先前已经用化学疗法或放射疗法进行治疗。在一些方面，受试者对于其他疗法或治疗剂是难治的或无反应的。在一些实施方案中，受试者患有持续性或复发性疾病，例如，在用另一种疗法或治疗性干预(包括化学疗法或辐射)治疗后。
在一些实施方案中，将组合疗法施用至在先前治疗时已经进展的受试者。在一些实施方案中，将组合疗法施用至已经对先前疗法停止反应的受试者。在一些实施方案中，将组合疗法施用至在先前治疗后已经在缓解后复发的受试者。在一些实施方案中，将组合疗法施用至先前治疗难治的受试者。在一些实施方案中，将组合疗法施用至对先前疗法具有小于最佳反应(例如，完全反应、部分反应或疾病稳定)的受试者。
在一些实施方案中，受试者是最后的先前疗法难治的。在一些实施方案中，受试者已经对最后的先前疗法复发。如果受试者对最后的先前疗法实现小于部分反应，则状态是难治的。在一些实施方案中，受试者进行先前化学疗法。在一些实施方案中，受试者是先前化学疗法化学难治的。在一些实施方案中，受试者对先前疗法是化学敏感的。如果受试者对最后的含有化学疗法的方案实现疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)或者在自体干细胞移植后小于12个月复发，则状态是化学难治的。否则，状态是化学敏感的。
在一些实施方案中，先前治疗或疗法包括靶向CD20的药剂。在一些实施方案中，先前治疗或疗法包括蒽环素。在一些实施方案中，先前治疗或疗法包括细胞疗法(例如，T细胞疗法，例如CAR T细胞疗法)。
在一些实施方案中，所述方法、用途和制品涉及或用于治疗受试者，所述方法、用途和制品涉及例如基于特定疾病类型、诊断标准、先前治疗和/或对先前治疗的反应来选择或鉴定受试者的特定组或子集，例如如所述的任何受试者组。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗在用一种或多种先前疗法治疗后在缓解后复发或变得所述一种或多种先前疗法难治的受试者；或者对一种或多种先前疗法(例如，一个或多个标准治疗线，例如细胞疗法(例如CAR+T细胞))是复发性或难治性(R/R)的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗患有以下疾病的受试者：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型(NOS：从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)或3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)、EBV阳性DLBCL或EBV阳性NOS。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗具有小于1(如0-1)的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)的受试者。在一些实施方案中，所述方法治疗通常对疗法或特定参考疗法反应差的DLBCL患者或其受试者的预后不良群体，如具有一种或多种(如两种或三种)染色体易位(如所谓的“双打击”或“三打击”淋巴瘤，其是具有MYC和BCL2和/或BCL6重排与DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤；具有易位MYC/8q24基因座，通常与t(14；18)(q32；q21)bcl-2基因或/和BCL6/3q27染色体易位组合；参见例如，Xu等人(2013)Int J Clin ExpPathol.6(4):788-794)的预后不良群体，和/或已经复发、任选地在12个月内复发的预后不良群体，和/或已被认为是化学难治性的预后不良群体。
在一些实施方案中，受试者患有作为生发中心样(GCB)DLBCL的DLBCL。在一些实施方案中，受试者患有非生发中心样(非GCB)DLBCL。在一些实施方案中，受试者患有双打击淋巴瘤(DHL)。在一些实施方案中，受试者患有三打击淋巴瘤(THL)。在一些实施方案中，受试者对指示使用化合物A的治疗的反应性的基因的表达呈阳性。在一些实施方案中，受试者对所述基因的表达呈阴性。参见Blood 2017 130:4118。
在一些实施方案中，抗原受体(例如CAR)特异性结合至与疾病或病症相关(如与NHL相关)的靶抗原。在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是CD19。在一些实施方案中，所述CD19抗原是人CD19。
在一些实施方案中，所述方法包括将细胞疗法和化合物A施用至受试者，所述受试者具有患上B细胞恶性肿瘤的风险或怀疑患有B细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述方法包括将细胞施用至被选择或被鉴定为具有NHL的某一预后或风险的受试者。非霍奇金淋巴瘤(NHL)可以是多变的疾病。一些患有NHL的受试者可以在不进行治疗的情况下存活，而其他受试者可能需要立即干预。在一些情况下，可以将患有NHL的受试者分类为可以告知疾病预后和/或推荐的治疗策略的组。在一些情况下，这些组可能是“低风险”、“中度风险”、“高风险”和/或“极高风险”，并且可以根据多种因素将患者如此分类，所述因素包括但不限于遗传异常和/或形态或身体特征。在一些实施方案中，基于NHL的风险对根据所述方法和/或用所述制品或组合物治疗的受试者进行分类或鉴定。在一些实施方案中，受试者是具有高风险NHL的受试者。
在一些实施方案中，要治疗的受试者包括患有以下疾病的受试者组：侵袭性NHL，特别是患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型(NOS：从头的和从惰性转化的)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)、EBV阳性DLBCL、EBV阳性NOS或者具有MYC和BCL2和/或BCL6重排和DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(“双打击”或“三打击”淋巴瘤)。在一些实施方案中，受试者的疾病对于至少两个先前治疗线已经复发或者是难治的。在一些实施方案中，先前疗法包括靶向CD20的药剂和/或蒽环素。在一些实施方案中，受试者在筛选时的ECOG得分为0-1。在一些实施方案中，根据卢加诺分类(Cheson,2014)，受试者患有正电子发射断层扫描(PET)阳性疾病。在一些实施方案中，受试者可以任选地先前已经用同种异体干细胞移植(SCT)治疗。
在一些实施方案中，受试者是成人。在一些实施方案中，受试者是男性。在一些实施方案中，受试者是女性。在一些实施方案中，受试者在他们被施用组合疗法时(例如，在他们被施用细胞疗法时)为至少40岁。在一些实施方案中，受试者在他们被施用组合疗法时(例如，在他们被施用细胞疗法时)小于40岁。在一些实施方案中，受试者在他们被施用组合疗法时(例如，在他们被施用细胞疗法时)为约40-65岁。在一些实施方案中，受试者在他们被施用组合疗法时(例如，在他们被施用细胞疗法时)为至少65岁。
A.细胞疗法的施用
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法、组合物和制品以及试剂盒组合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，用于所提供的方法中或与所提供的方法结合施用的细胞含有或被工程化以含有工程化的受体，例如工程化的抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR))或T细胞受体(TCR)。所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。还提供用于根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物向受试者(例如患者)施用所述细胞和组合物的治疗方法。
所述细胞通常表达重组受体如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体如转基因T细胞受体(TCR)。所述受体还包括其他嵌合受体。在所提供的方法中作为细胞疗法施用的示例性工程化的细胞描述于章节II中。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受所述细胞疗法的受试者或从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备所述细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和加工后向同一受试者施用所述细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备所述细胞。在这样的实施方案中，然后向相同物种的不同受试者(例如第二受试者)施用所述细胞。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者与第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。
T细胞疗法的细胞可以在配制用于施用的组合物中施用，或可替代地在配制用于单独施用的多于一种组合物(例如两种组合物)中施用。一个或多个剂量的细胞可以包括特定数量或相对数量的细胞或工程化的细胞，和/或所述组合物内两种或更多种亚型(如CD4与CD8 T细胞)的限定比率或组合物。
所述细胞可以通过任何合适的方式来施用，例如通过推注输注，通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射、结膜下注射、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过例如在不超过3天的时间段内细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用来施用。在一些实施方案中，细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是经由门诊递送进行的。
对于疾病的治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或在一系列治疗中施用至受试者。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在细胞疗法起始之前向受试者使用预调理剂，如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在细胞疗法起始之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在细胞疗法起始之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天一次施用环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，按以下剂量向受试者施用环磷酰胺：在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或者250mg/m2与350mg/m2之间，包含端值。在一些情况下，向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些情况下，向受试者施用约500mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在细胞疗法起始之前，每天向受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。在一些情况下，在细胞疗法起始之前，每天向受试者施用约500mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，按以下剂量向受试者施用氟达拉滨：在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间，包含端值。在一些情况下，向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在细胞疗法起始之前，每天向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括按任何剂量或施用时间表(如上述那些)的环磷酰胺以及按任何剂量或施用时间表(如上述那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5剂的25mg/m2氟达拉滨。在一些实施方案中，在细胞疗法起始之前，每天向受试者施用300mg/m2的环磷酰胺和30mg/m2的氟达拉滨二者，持续3天。在一些实施方案中，在细胞疗法起始之前，每天向受试者施用约500mg/m2的环磷酰胺和30mg/m2的氟达拉滨二者，持续3天。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化的细胞群的生物学活性。要评估的参数包括工程化的或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或者离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化的细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，如例如以下文献中描述的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，通过评估临床结局(如肿瘤负荷或负担的降低)来测量生物活性。
1.组合物和配制品
在一些实施方案中，细胞疗法(如T细胞疗法，其包含用重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化的细胞)的细胞的剂量是作为组合物或配制品(如药物组合物或配制品)来提供。这样的组合物可以根据所提供的方法使用和/或与所提供的制品或组合物一起使用，如用于B细胞恶性肿瘤的治疗中。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些实施方案中，细胞疗法(如工程化T细胞(例如CAR T细胞))是用药学上可接受的载体来配制。在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞或药剂和/或取决于施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如以下文献中：Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如以下文献中：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可以含有可用于用细胞或药剂治疗的特定适应症、疾病或病症的超过一种活性成分，其中各自的活性彼此没有不利影响。这样的活性成分以对于既定目的有效的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗功效。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他给药方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。
可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用细胞。提供用于组合物的储存和施用的配制品和装置，如注射器和小瓶。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫反应细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并且将其施用至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫反应细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。在施用治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫反应细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用所述药剂或细胞群。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，在一些方面可以将其缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。另外，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过在溶剂中掺入细胞来制备，所述溶剂如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
2.给药
在一些实施方案中，根据所提供的方法和/或用所提供的制品或组合物向受试者施用一定剂量的细胞。在一些实施方案中，根据受试者的特定疾病或病症(例如癌症，例如B细胞恶性肿瘤)确定剂量的大小或时间安排。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，细胞的剂量包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或者不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，细胞或细胞的亚型的单独群体是以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重该细胞量的范围施用至受试者，如例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，细胞的剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量无关于或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)，例如，在约1x106至5x108个这样的细胞的范围内，如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、2x108、3x108或4x108个总此类细胞，或者任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，在受试者是人的情况下，所述剂量包括约1x106与3x108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如，在约1x107至2x108个此类细胞的范围内，如1x107、5x107、1x108或1.5x108个总此类细胞，或者任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x105至5x108个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、1x105至1x108个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从或从约5x105至1x107个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞或者从或从约1x106至1x107个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+T细胞的剂量中)的CD8+T细胞包括约1x106与1x108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在约5x106至1x108个此类细胞的范围内，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107或1x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞、1x107至2.5x107个总重组受体表达CD8+T细胞、从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107或1x108个总重组受体表达CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+T细胞的剂量中)的CD4+T细胞包括约1x106与1x108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD4+细胞，例如在约5x106至1x108个此类细胞的范围内，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107或1x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD4+T细胞、1x107至2.5x107个总重组受体表达CD4+T细胞、从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD4+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107或1x108个总重组受体表达CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量作为单一剂量施用至受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在过继细胞疗法的情况下，给定“剂量”的施用涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单一时间点给予或起始。然而，在一些情况下，所述剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指如下剂量，其被分割使得在超过一天的时间内施用所述剂量。这种类型的给药涵盖在本发明方法中并且被认为是单一剂量。
因此，细胞的剂量可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，可以在2天中或在3天中向受试者施用所述剂量。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量持续不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多种组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包括富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞；以及施用第二组合物，其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，组合物或剂量的施用(例如，多种细胞组合物的施用)涉及分开施用细胞组合物。在一些方面，分开施用是同时或按任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包括第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和所述第二组合物的施用相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行的。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始和/或完成与所述第二组合物的施用的完成和/或起始是相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行的。
在一些实施方案中，在向所述受试者施用之前将所述第一组合物与所述第二组合物混合。在一些实施方案中，在所述施用之前不久(例如，在6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1.5小时、1小时或0.5小时内)将所述第一组合物与所述第二组合物混合，在一些实施方案中，紧临在所述施用之前将所述第一组合物与所述第二组合物混合。
在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述第一组合物是在所述第二组合物之前施用的。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有一种群体的细胞组合物，然后施用包含另一种群体的单独细胞组合物，其中施用是以或大致以目标或所需比率来进行。在一些方面，以限定比率施用细胞的剂量或组合物导致改进的T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，将两个剂量施用至受试者。在一些实施方案中，在第一剂量之后大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，受试者接受连续剂量(例如第二剂量)。在一些实施方案中，在第一剂量之后施用多个连续剂量，使得在施用连续剂量后施用另外的一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量向受试者施用的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外的一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者出现毒性结局(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫反应)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，连续剂量的施用是在施用第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外的一个或多个剂量(例如，连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用另外的一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后少于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后少于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双倍剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中的一个或两个包括T细胞的分割剂量的施用。
在一些实施方案中，细胞的剂量通常足够大以有效降低疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量是基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量是基于所需的单独群体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，所述剂量是基于此类特征的组合，此类特征如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的容忍差异或在所述容忍差异之内施用细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于细胞的最小数量或每单位体重细胞的最小数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来施用，或在所述容忍差异内施用。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被施用细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于群体或亚型的细胞的最小数量或每单位体重群体或亚型的细胞的最小数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或基于一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的所需固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量基于T细胞的所需固定剂量或最小剂量以及CD4+与CD8+细胞的所需比率，和/或基于CD4+和/或CD8+细胞的所需固定剂量或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的容忍范围来施用，或在所述容忍范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率，或者可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约5:1与为或约5:1之间(或者大于约1:5且小于约5:1)，或者在为或约1:3与为或约3:1之间(或者大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或者大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、或1:5。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者出现毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫反应)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如比初始剂量高，如高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者比初始剂量低，如低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
B.化合物A的施用
在本文提供的方法、组合物、组合、试剂盒或制品的一些实施方案中，组合疗法包括施用具有化学名称(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮和/或具有式I的结构的化合物A：
Figure BDA0003727106220000341
或其对映异构体或对映异构体混合物、或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物。
在一些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的对映异构体或对映异构体混合物，或者(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物。在一些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的溶剂化物。在一些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的水合物。在一些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐。在一些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。在一些实施方案中，化合物A具有式I的结构。
在一些实施方案中，化合物A可以根据美国专利号9,221,788和WO 2011/100380中所述的方法来制备，所述专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。化合物A还可以基于本文的传授根据其他可用方法来合成。在一些实施方案中，化合物A的药物组合物和单位剂型是根据美国专利号10,080,801中描述的那些来使用。在其他实施方案中，化合物A可以根据美国专利公开号2014/0045843来制备或使用。
在某些实施方案中，化合物A是固体。在某些实施方案中，化合物A是水合的。在某些实施方案中，化合物A是溶剂化的。在某些实施方案中，化合物A是无水的。在某些实施方案中，化合物A是不吸湿的。
在某些实施方案中，化合物A是无定形的。在某些实施方案中，化合物A是结晶的。在某些实施方案中，固体化合物A呈美国专利号9,221,788中所述的结晶型，所述专利通过引用以其整体并入本文。
化合物A的固体形式可以根据美国专利号9,221,788的公开内容中所述的方法或者任一种或组合的可用方法来制备。
在某些实施方案中，化合物A是(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的盐酸盐，或其对映异构体或对映异构体混合物；或者其药学上可接受的溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物。在某些实施方案中，所述盐酸盐是固体。在某些实施方案中，所述盐酸盐是无水的。在某些实施方案中，所述盐酸盐是不吸湿的。在某些实施方案中，所述盐酸盐是无定形的。在某些实施方案中，所述盐酸盐是结晶的。
化合物A的盐酸盐及其固体形式可以根据美国专利号9,221,788的公开内容中所述的方法或者任一种或组合的可用方法来制备。
在一些实施方案中，本文提供的化合物A含有一个手性中心，并且可以作为对映异构体的混合物(例如，外消旋混合物)存在。本公开文本涵盖这样的化合物的立体异构纯形式的用途，以及那些形式的混合物的用途。例如，包含本文提供的化合物A的等量或不等量的对映异构体的混合物可以用于本文公开的方法和组合物中。这些异构体可以不对称地合成或使用标准技术如手性柱或手性拆分剂拆分。参见例如，Jacques,J.等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley-Interscience,纽约,1981)；Wilen,S.H.等人,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.,Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,纽约,1962)；和Wilen,S.H.,Tables of Resolving Agents and OpticalResolutions第268页(E L.Eliel编辑,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,印第安那州,1972)。
应当注意，如果所描绘的结构与给予该结构的名称之间存在差异，则以所描绘的结构为主。另外，如果未用例如粗线或虚线指示结构或结构的一部分的立体化学，则所述结构或所述结构的一部分应解释为包括所述结构的所有立体异构体。
1.组合物和配制品
在本文提供的组合疗法方法、组合物、组合、试剂盒和用途的一些实施方案中，组合疗法可以以一种或多种组合物(例如，含有化合物A的药物组合物)来施用。
在一些实施方案中，所述组合物(例如，含有化合物A的药物组合物)可以包括与化合物A和/或细胞一起施用的载体，如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这样的组合物将含有治疗有效量的化合物A(通常呈纯化的形式)以及合适的量的载体，以提供用于适当地施用至患者的形式。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药物组合物可以含有以下中的任何一种或多种：一种或多种稀释剂、一种或多种辅助剂、一种或多种抗粘附剂、一种或多种粘合剂、一种或多种涂层、一种或多种填充剂、一种或多种调味剂、一种或多种颜料、一种或多种润滑剂、一种或多种助流剂、一种或多种防腐剂、一种或多种洗涤剂、一种或多种吸附剂、一种或多种乳化剂、一种或多种药物赋形剂、一种或多种pH缓冲剂或者一种或多种甜味剂及其组合。在一些实施方案中，药物组合物可以是液体、固体、冻干粉末、呈凝胶形式和/或其组合。在一些方面，载体的选择部分取决于特定抑制剂和/或施用方法。
药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)；稳定剂和/或防腐剂。含有化合物A的组合物还可以是冻干的。
在一些实施方案中，可以将药物组合物配制成用于通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌内、静脉内、真皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、肿瘤内、硬膜外、经鼻、口服、经阴道、经直肠、外用(topical)、局部(local)、经耳、吸入、经颊(例如，舌下)以及透皮施用或任何途径。在一些实施方案中，也考虑其他施用方式。在一些实施方案中，施用是通过推注输注，通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，施用是通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果局部治疗需要，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过多次推注施用例如经不超过3天的时间段来施用，或通过连续输注施用来施用。
在一些实施方案中，施用可以是局部的、外用的或全身的，这取决于治疗位点。在一些实施方案中，局部施用至需要治疗的区域可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、外用施用(例如，与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物来实现。在一些实施方案中，组合物还可以与其他生物活性剂一起施用，依次地、间歇地或在同一组合物中。在一些实施方案中，施用还可以包括控释系统，包括控释配制品和装置控释，如借助泵。在一些实施方案中，施用是口服的。
在一些实施方案中，化合物A通常以单位剂型或多剂型来配制和施用。每个单位剂量含有足以产生所需治疗效果的预定量的治疗活性化合物A，与所需的药物载体、媒介物或稀释剂结合。在一些实施方案中，单位剂型包括但不限于含有合适的量的化合物A的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液剂或混悬剂、和口服溶液剂或混悬剂，以及油水乳剂。单位剂型可以含于安瓿和注射器或者单独包装的片剂或胶囊剂中。单位剂型可以按其分数或倍数施用。在一些实施方案中，多剂量形式是要以分离的单位剂型施用的包装在单个容器中的多个相同的单位剂型。多剂型的例子包括小瓶、片剂或胶囊剂瓶或者品脱或加仑瓶。
2.给药
在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法涉及在细胞疗法如T细胞疗法(例如，CAR表达T细胞)的起始之前、之后、期间、其过程期间、与其同时、几乎同时、依序、并行和/或间歇地起始化合物A的施用。在一些实施方案中，所提供的组合疗法方法中化合物A的施用的起始是在T细胞疗法的施用起始之后或以后施用的。
在一些实施方案中，化合物A的施用是在细胞疗法如T细胞疗法(例如，CAR表达T细胞)的起始之后(以后)起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平时或之前起始的。
在一些情形中，化合物A的施用的起始在以下时间之前一周时或一周内(如1、2或3天内)进行：(i)在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平的时间；(ii)血液中可检测的T细胞疗法的细胞的数量在已经在血液中可检测到之后无法检测或降低，任选地与施用所述T细胞疗法后的在先时间点相比有所降低；(iii)与在所述T细胞疗法的施用起始后受试者的血液中可检测的T细胞疗法的细胞的峰值或最大数量相比，血液中可检测的T细胞疗法的细胞的数量减少或减少超过1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；(iv)在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最大水平之后，属于或源自受试者的血液中可检测的细胞的细胞的数量是受试者血液中总外周血单个核细胞(PBMC)的小于10％、小于5％、小于1％或小于0.1％的时间；(v)受试者在用T细胞疗法治疗后展现疾病进展和/或已经在缓解后复发；和/或(iv)如与在施用所述细胞之前或之后且在化合物A的施用起始之前的时间的肿瘤负荷相比，受试者展现增加的肿瘤负荷。在某些方面，进行所提供的方法以增强、增加或加强受试者中的T细胞疗法，以改进对T细胞疗法的反应，例如T细胞的存在和/或肿瘤负荷的降低。
在一些实施方案中，化合物A的施用是在细胞疗法如T细胞疗法(例如，CAR表达T细胞)的起始之后(以后)起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的起始之后(以后)以及早在T细胞疗法的起始的同一天(即，早在T细胞疗法的起始后0天)起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约0天至为或约21天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后约7至约14天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约0天至为或约14天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后0天起始的(即，化合物A的施用是与T细胞疗法的起始在同一天起始的)。
在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约1至约21天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后约1至约15天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后约8至约15天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约1天、为或约2天、为或约3天、为或约4天、为或约5天、为或约6天、为或约7天、为或约8天、为或约9天、为或约10天、为或约11天、为或约12天、为或约13天、为或约14天、为或约15天、为或约16天、为或约17天、为或约18天、为或约19天或者为或约20天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约15天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约14天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约8天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约7天起始的。在其他实施方案中，化合物A的施用是在T细胞疗法的施用起始后为或约1天起始的。
因此，关于其中在组合疗法的第1天施用T细胞疗法的组合疗法，在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第2天至在或在约第22天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第2天至在或在约第16天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第9天至在或在约第16天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第8天至在或在约第15天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第2天、在或在约第3天、在或在约第4天、在或在约第5天、在或在约第6天、在或在约第7天、在或在约第8天、在或在约第9天、在或在约第10天、在或在约第11天、在或在约第12天、在或在约第13天、在或在约第14天、在或在约第15天、在或在约第16天、在或在约第17天、在或在约第18天、在或在约第19天、在或在约第20天或者在或在约第21天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第16天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第15天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第9天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第8天起始的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第2天起始的。
在其他实施方案中，化合物A的施用是在或在约组合疗法的第1天起始的。
在一些实施方案中，在第一次向受试者施用化合物A的时间，和/或在所述施用起始之后的任何随后的时间，所述受试者未展现严重毒性(如严重的细胞因子释放综合征(CRS)或严重毒性)的体征或症状。在一些实施方案中，化合物A的施用是在受试者不展现严重CRS的体征或症状和/或不展现3级或更高级CRS(如延长的3级CRS或者4级或5级CRS)的时间进行的。在一些实施方案中，化合物A的施用是在受试者不展现严重神经毒性的体征或症状和/或不展现3级或更高级神经毒性(如延长的3级神经毒性或者4级或5级神经毒性)的时间进行的。在一些方面，在T细胞疗法的施用起始的时间与化合物A的施用时间之间，受试者未展现严重CRS和/或未展现3级或更高级CRS，如延长的3级CRS或者4级或5级CRS。在一些情况下，在T细胞疗法的施用起始的时间与化合物A的施用时间之间，受试者未展现严重神经毒性和/或不展现3级或更高级神经毒性，如延长的3级神经毒性或者4级或5级神经毒性。
在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以从或从约0.1mg至1.0mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以以下量来施用：约0.1mg至约1.0mg、约0.2mg至约1.0mg、约0.3mg至约1.0mg、约0.4mg至约1.0mg、约0.5mg至约1.0mg、约0.6mg至约1.0mg、约0.7mg至约1.0mg、约0.8mg至约1.0mg、约0.9mg至约1.0mg、约0.1mg至约0.80mg、约0.2mg至约0.80mg、约0.3mg至约0.80mg、约0.4mg至约0.80mg、约0.5mg至约0.80mg、约0.6mg至约0.80mg、约0.7mg至约0.80mg、约0.1mg至约0.60mg、约0.2mg至约0.60mg、约0.3mg至约0.60mg、约0.4mg至约0.60mg、约0.5mg至约0.60mg、约0.1mg至约0.40mg、约0.2mg至约0.40mg、约0.3mg至约0.40mg、约0.1mg至约0.20mg或约0.1mg至约0.3mg。在一些实施方案中，化合物A是以约0.3mg至约0.6mg/天的量来施用。
在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以约或至少约或者为或至少为0.1mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以约或至少约或者为或至少为0.2mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以约或至少约或者为或至少为0.3mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以约或至少约或者为或至少为0.4mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以约或至少约或者为或至少为0.5mg的量来施用。在一些任何这样的实施方案中，每天施用的化合物A是以不超过约5.0mg的量来施用。在一些任何这样的实施方案中，每天施用的化合物A是以不超过约1.0mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以不超过约0.8mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以不超过约0.6mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以不超过约0.5mg的量来施用。
在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以为或约0.5mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以为或约0.45mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以为或约0.30mg的量来施用。在一些实施方案中，每天施用的化合物A是以为或约0.60mg的量来施用。
在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：如对于循环方案的每周或对于循环方案的至少一周，实现在以下范围内的血液中化合物A的最大浓度(Cmax)：在为或约1nM至约为或约20nM之间、在为或约1nM与为或约15nM之间、在为或约1nM与为或约12nM之间、在为或约1nM与为或约10nM之间、在为或约1nM与为或约5nM之间、在为或约1nM与为或约2.5nM之间、在为或约2.5nM与为或约20nM之间、在为或约2.5nM与为或约15nM之间、在为或约2.5nM与为或约12nM之间、在为或约2.5nM与为或约10nM之间、在为或约2.5nM与为或约5nM之间、在为或约5nM与为或约20nM之间、在为或约5nM与为或约15nM之间、在为或约5nM与为或约12nM之间、在为或约5nM与为或约10nM之间、在为或约10nM与为或约20nM之间、在为或约10nM与为或约15nM之间以及在为或约15nM与为或约20nM之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：在至少约30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时或24小时的范围内维持Cmax。
在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：如对于循环方案的每周或对于循环方案的至少一周，实现为约或至少约1nM的血液中化合物A的Cmax。在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：如对于循环方案的每周或对于循环方案的至少一周，实现为约或至少约10nM的血液中化合物A的Cmax。在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：如对于循环方案的每周或对于循环方案的至少一周，实现为约或至少约5nM的血液中化合物A的Cmax。在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：如对于循环方案的每周或对于循环方案的至少一周，实现为约或至少约2.5nM的血液中化合物A的Cmax。在一些实施方案中，化合物A是以如下量来施用：维持Cmax至少约30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时或24小时。
在一些实施方案中，化合物A是按循环方案(本文中也称为循环疗法)来施用，所述循环方案涉及所述化合物在指定时间段或持续时间中的重复给药。在一些实施方案中，所施用的每次施用或每天的化合物A的量是不超过1.0mg(例如，不超过1.0mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg)。在一些实施方案中，所施用的每次施用或每天的化合物A的量是为或约0.6mg、为或约0.5mg、为或约0.45mg、为或约0.40mg、为或约0.30mg、为或约0.2mg。在一些实施方案中，所施用的每次施用或每天的化合物A的量为约0.30mg至约0.60mg(例如，为或约0.30mg、为或约0.45mg或者为或约0.60mg)。
在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后21天、或20天、或19天、或18天、或17天、或16天、或15天、或14天、或13天、或12天、或11天、或10天、或9天、或8天、或7天、或6天、或5天、或4天、或3天、或2天、或1天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后15天±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后14天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后8天±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后7天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在施用T细胞疗法之后1或2天开始(或被起始)。
因此，关于其中在组合疗法的第1天施用T细胞疗法的组合疗法，在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第22天或之前开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第22天、或在第21天、或在第20天、或在第19天、或在第18天、或在第17天、或在第16天、或在第15天、或在第14天、或在第13天、或在第12天、或在第11天、或在第10天、或在第9天、或在第8天、或在第7天、或在第6天、或在第5天、或在第4天、或在第3天、或在第2天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第16±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第15天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第9±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第8天开始(或被起始)。在一些实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第2天或在第3天开始(或被起始)。
在其他实施方案中，化合物A按照循环方案的施用在组合疗法的第1天开始(或被起始)。
在一些实施方案中，用于化合物A的施用的循环方案包括：第一施用期，在此期间每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间每天施用所述化合物，在四周时间段中持续连续三周。
在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后21天、或20天、或19天、或18天、或17天、或16天、或15天、或14天、或13天、或12天、或11天、或10天、或9天、或8天、或7天、或6天、或5天、或4天、或3天、或2天、或1天开始。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后15天±3天开始。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后14天开始。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后8天±3天开始。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后7天开始。在一些实施方案中，第一施用期在施用T细胞疗法之后1或2天开始。在一些实施方案中，在第一施用期期间以约0.1mg/天至约1.0mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第一施用期期间以约0.45mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第一施用期期间以约0.3mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第一施用期期间以约0.60mg/天施用所述化合物。
因此，关于其中在组合疗法的第1天施用T细胞疗法的组合疗法，在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第22天或之前开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第22天、或在第21天、或在第20天、或在第19天、或在第18天、或在第17天、或在第16天、或在第15天、或在第14天、或在第13天、或在第12天、或在第11天、或在第10天、或在第9天、或在第8天、或在第7天、或在第6天、或在第5天、或在第4天、或在第3天、或在第2天开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第16±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第15天开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第9±3天开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第8天开始(或被起始)。在一些实施方案中，第一施用期在组合疗法的第2天或在第3天开始(或被起始)。
在其他实施方案中，第一施用期在组合疗法的第1天开始。
在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续在或在约1与21天之间、1与19天之间、1与17天之间、1与15天之间、1与13天之间、1与11天之间、1与9天之间、1与7天之间、1与5天之间或1与3天之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续在或在约1与21天之间，包含端值。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续在或在约1与14天之间，包含端值。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续在或在约7与21天之间，包含端值。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续或持续约21天。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续或持续约14天。在一些实施方案中，在第一施用期期间，每天施用化合物A持续或持续约7天。
应理解，第一施用在暂停期开始时结束。在一些实施方案中，暂停期在施用T细胞疗法之后约22天开始。在一些实施方案中，暂停期在施用T细胞疗法之后约19天、或20天、或21天、或22天、或23天、或24天开始。在一些实施方案中，暂停期在施用T细胞疗法之后第22天开始。在一些实施方案中，暂停期在施用T细胞疗法之后21天开始。在一些实施方案中，暂停期为约一周。在一些实施方案中，暂停期为5天或6天或7天或8天或9天。在一些实施方案中，暂停期为7天。在一些实施方案中，暂停期持续直至绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)与施用T细胞疗法之前测量的水平相等或大致相等。在一些实施方案中，暂停期为7天。在一些实施方案中，暂停期持续直至绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)与第一施用期之前测量的水平相等或大致相等。在一些实施方案中，暂停期持续直至受试者的B细胞血液计数水平恢复至与施用T细胞疗法之前测量的水平相等或大致相等的水平。在一些实施方案中，所述暂停期持续直至所述受试者的B细胞血液计数水平恢复至与在所述第一施用期之前测量的水平相同或大致相同的水平。
应理解，暂停期在第二施用期开始时结束。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法之后约29天开始。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法之后27天、或28天、或29天、或30天、或31天开始。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法之后29天开始。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法之后28天开始。在一些实施方案中，在第二施用期期间，以约0.1mg/天至约1.0mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第二施用期期间，以约0.45mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第二施用期期间，以约0.3mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，在第二施用期期间，以约0.60mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，第二施用期包括四周循环，在此期间每天施用所述化合物，在四周时间段中持续连续三周。在一些实施方案中，在每个四周循环中，在连续三周中每天施用所述化合物之后，一周不施用所述化合物。在一些实施方案中，第二施用期含有超过一个四周循环。在一些实施方案中，第二施用期含有2个四周循环、或3个四周循环、或4个四周循环、5个四周循环、或6个四周循环、或7个四周循环、8个四周循环、或9个四周循环、或10个四周循环、11个四周循环、或12个四周循环、或13个四周循环、14个四周循环、或15个四周循环、或16个四周循环。在一些实施方案中，第二施用含有在或在约2与11个四周循环之间、2与9个四周循环之间、2与7个四周循环之间、2与5个四周循环之间或2与4个四周循环之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，第二施用含有在或在约2与11个四周循环之间，包含端值。在一些实施方案中，第二施用期含有2个四周循环。在一些实施方案中，第二施用期含有5个四周循环。在一些实施方案中，第二施用期含有11个四周循环。在一些实施方案中，第二施用期由2个四周循环组成。在一些实施方案中，化合物A的施用在施用T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按照循环方案进行，所述循环方案包括：第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周；在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物；以及包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在四周时间段中持续连续三周。在一些实施方案中，在所述第一施用期和所述第二施用期期间以约0.30mg、0.45mg或0.60mg/天施用所述化合物。在一些实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第15天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期。在一些实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第8天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期。在一些实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第1天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期。在一些实施方案中，暂停期在施用T细胞疗法后第22天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第28天后结束。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始。在一些实施方案中，第二施用期在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第180天或之后结束。在某些实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第15天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期、在施用T细胞疗法后第22天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第28天后结束的暂停期以及在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始的第二施用期。在一些实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第8天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期、在施用T细胞疗法后第22天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第28天后结束的暂停期以及在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始的第二施用期。在其他实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第8天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期、在施用T细胞疗法后第22天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第28天后结束的暂停期以及在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始的第二施用期。在其他实施方案中，化合物A的施用涉及在施用T细胞疗法后第1天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第21天后结束的第一施用期、在施用T细胞疗法后第22天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始且在第28天后结束的暂停期以及在施用T细胞疗法后第29天(相对于在第1天施用的T细胞疗法)开始的第二施用期。
在一些实施方案中，用于施用化合物A的循环方案在T细胞疗法的施用起始之后进行一定时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长超过一周的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约一个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约两个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约三个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约四个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约五个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约六个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约八个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约10个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长约或至少约12个月的时间段。
在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)延长至少三个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后延长为或约90天、为或约100天、为或约105天、为或约110天、为或约115天、为或约120天、为或约125天、为或约130天、为或约135天、为或约140天、为或约145天、为或约150天、为或约155天、为或约160天、为或约165天、为或约170天、为或约175天、为或约180天、为或约185天、为或约190天、为或约195天、为或约200天或更长时间的时间段。
在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后延长为或约90天或者为或约三个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后延长为或约120天或四个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后延长为或约150天或五个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后延长为或约180天或六个月的时间段。
在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约三个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约四个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约五个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约六个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约八个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约10个月结束。在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约12个月结束。
在一些实施方案中，循环方案在T细胞疗法的施用起始后为或为约84天结束。在一些实施方案中，第二施用期在T细胞疗法的施用起始后为或为约84天结束。因此，关于其中在组合疗法的第1天施用T细胞疗法的组合疗法，第二施用期在组合疗法的第85天结束。
在一些实施方案中，循环方案涉及在施用T细胞疗法之后14天开始且在施用T细胞疗法之后20天结束的第一施用期、在施用T细胞疗法之后21天开始且在施用T细胞疗法之后27天结束的暂停期以及在施用T细胞疗法之后28天开始且在施用T细胞疗法之后84天结束的第二施用期。在一些实施方案中，循环方案涉及在施用T细胞疗法之后7天开始且在施用T细胞疗法之后20天结束的第一施用期、在施用T细胞疗法之后21天开始且在施用T细胞疗法之后27天结束的暂停期以及在施用T细胞疗法之后28天开始且在施用T细胞疗法之后84天结束的第二施用期。在一些实施方案中，循环方案涉及与施用T细胞疗法在同一天开始且在施用T细胞疗法之后20天结束的第一施用期、在施用T细胞疗法之后21天开始且在施用T细胞疗法之后27天结束的暂停期以及在施用T细胞疗法之后28天开始且在施用T细胞疗法之后84天结束的第二施用期。
因此，关于其中在组合疗法的第1天施用T细胞疗法的组合疗法，在一些实施方案中，循环方案涉及在组合疗法的第15天开始且在第21天结束的第一施用期、在组合疗法的第22天开始的暂停期以及在组合疗法的第29天开始且在第85天结束的第二施用期。在一些实施方案中，循环方案涉及在组合疗法的第8天开始且在第21天结束的第一施用期、在组合疗法的第22天开始的暂停期以及在组合疗法的第29天开始且在第85天结束的第二施用期。在一些实施方案中，循环方案涉及在组合疗法的第1天开始且在第21天结束的第一施用期、在组合疗法的第22天开始的暂停期以及在组合疗法的第29天开始且在第85天结束的第二施用期。
在一些实施方案中，如果受试者已经在6个月之前或者在为或约6个月在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后的所述时间段(例如为或约3、4、5或6个月)结束时，结束或停止化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)。在一些实施方案中，如果受试者已经在T细胞疗法的施用起始之前或者在T细胞疗法的施用起始后为或约3个月在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后3个月，结束或停止化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)。在一些实施方案中，所述时间段是固定持续时间，使得即使受试者已经在所述时间段结束之前的时间点实现完全反应(CR)，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)也继续进行所述时间段。在一些实施方案中，受试者具有伴随微量残留病(MRD)的CR。在一些实施方案中，受试者具有呈MRD-的CR。
在一些实施方案中，如果受试者在所述治疗后展现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在所述时间段结束后继续进行，例如在T细胞疗法(例如CAR T细胞)的施用起始后继续进行长于或长于约3、4、5或6个月。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后继续进行大于3个月。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后继续进行大于6个月。在一些实施方案中，对于在初始时间段结束时展现PR或SD的受试者，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)继续进行直至受试者已经在所述治疗后实现完全反应(CR)或者直至癌症(例如B细胞恶性肿瘤，如NHL，例如DLBCL)已经在所述治疗后进展或缓解后复发。
在一些实施方案中，化合物A的施用按照循环方案来进行，所述循环方案包括以不超过约1.0mg(例如，0.1至1.0mg、0.30mg、0.45mg或0.60mg)/天的量施用化合物A。在一些实施方案中，在施用化合物A的时间，受试者在T细胞疗法(例如CAR T细胞)的施用后不展现严重毒性。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，细胞疗法如CAR表达T细胞包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些实施方案中，化合物A的施用按照循环方案来进行，所述循环方案包括施用有效量的所述化合物，所述施用在细胞疗法(例如，T细胞疗法)的施用起始之后延长为或约或大于3个月、为或约或大于4个月、为或约或大于5个月或者为或约或大于6个月。在一些实施方案中，所述时间段延长为或约3个月、为或约4个月、为或约5个月或者为或约6个月。在一些实施方案中，在施用化合物A时，受试者在细胞疗法的施用后不展现严重毒性。在一些实施方案中，如果受试者已经在为或约所述时间段的结束之前在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则结束或停止化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)。在一些实施方案中，即使受试者已经在所述时间段结束之前的时间点实现完全反应(CR)，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)也继续进行所述时间段。在一些实施方案中，如果在T细胞疗法的施用起始后受试者在所述治疗后展现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在初始时间段结束之后继续进行。在一些实施方案中，重复化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)直至受试者已经在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者直至癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，T细胞疗法如CAR表达T细胞包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些实施方案中，化合物A的施用按照循环方案来进行，所述循环方案包括在T细胞疗法(例如，CAR T细胞疗法)的施用起始后在每周不超过5天(例如，3天、4天或5天)中的每一天以不超过约3mg(例如，1至3mg、1mg、2mg或3mg)/天的量施用化合物A，持续约或大于三个月的时间段(例如，持续为或约三个月、四个月、五个月或六个月的时间段)。在一些实施方案中，在施用化合物A时，受试者在细胞疗法的施用后不展现严重毒性。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，如果受试者已经在为或约6个月之前在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则在T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束或停止化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)。在一些实施方案中，即使受试者在所述时间段结束之前的时间点已经实现完全反应(CR)，循环方案也继续进行整个时间段。在一些实施方案中，如果在为或约六个月受试者在所述治疗后展现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在所述时间段结束后进一步继续进行，如在细胞疗法的施用起始之后继续进行大于6个月。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)继续进行直至受试者已经在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者直至癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发。在一些实施方案中，细胞疗法如CAR表达T细胞包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些实施方案中，化合物A的施用按照循环方案来进行，所述循环方案包括在细胞疗法(例如，T细胞疗法)起始后以约1mg至约3mg(例如，1mg、2mg或3mg)/天的量施用化合物A，持续为或约或大于六个月的时间段。在一些实施方案中，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)是在细胞疗法的施用起始后大于约14至约35天(例如，约21至约35天，例如为或约28天)起始的。在一些实施方案中，在施用化合物A时，受试者在细胞疗法的施用后不展现严重毒性。在一些实施方案中，如果受试者已经在为或约6个月在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者癌症(例如B细胞恶性肿瘤)已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则在细胞疗法的施用起始之后为或约6个月停止化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)。在一些实施方案中，即使受试者在为或约6个月之前的时间点已经实现完全反应(CR)，化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)也继续进行所述时间段。在一些实施方案中，如果在为或约六个月受试者在所述治疗后展现部分反应(PR)或疾病稳定(SD)，则化合物A的施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)在T细胞疗法的施用起始后进一步施用大于6个月。在一些实施方案中，所述施用(例如，化合物A按照循环方案的施用)继续进行直至受试者已经在所述治疗后实现完全反应(CR)，或者直至所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是NHL，如复发性/难治性侵袭性NHL或DLBCL。在一些实施方案中，细胞疗法如CAR表达T细胞包含与B细胞抗原特异性结合的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述B细胞抗原是CD19。
在一些情形中，循环方案可以在任何时间中断，和/或中断一次或多次。在一些情况下，如果受试者发生一个或多个不良事件、剂量限制性毒性(DLT)、中性粒细胞减少症或发热性中性粒细胞减少症、血小板减少症、细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)(如章节IV中所述的那些)，则中断或修改循环方案。在一些实施方案中，在受试者发生一个或多个不良事件、剂量限制性毒性(DLT)、中性粒细胞减少症或发热性中性粒细胞减少症、血小板减少症、细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)(如章节IV中所述的那些)之后，改变一周的某些天中每次施用或每天的化合物A的量。
II.细胞疗法和工程化细胞
在一些实施方案中，用于根据所提供的组合疗法方法施用的细胞疗法(例如，T细胞疗法)包括施用表达重组受体的工程化的细胞，所述重组受体设计为识别和/或特异性结合至与疾病或病症(如癌症，例如，B细胞恶性肿瘤)相关的抗原。在一些实施方案中，与所述抗原的结合导致反应，如针对这样的抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞含有或被工程化而含有工程化的受体或重组受体，例如，工程化的抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。重组受体如CAR通常包括与一个或多个细胞内信号传导组分连接(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)的细胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些方面，工程化的细胞作为适合于施用至受试者、如适合于过继细胞疗法的药物组合物和配制品来提供。还提供用于将细胞和组合物施用至受试者例如患者的治疗方法。在一些实施方案中，所述方法是如章节I中所述的任一种。
在一些实施方案中，所述细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达这样的核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，基因转移通过以下方式来完成：首先刺激细胞，如通过将细胞与诱导反应如增殖、存活和/或激活(例如，如通过细胞因子或激活标记的表达所测量)的刺激物组合，之后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以进行临床应用的数量。
A.嵌合抗原受体
在所提供的方法和用途(例如，如章节I中所述的任一种)的一些实施方案中，工程化的细胞如T细胞表达嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，所述嵌合受体含有一个或多个结构域，所述结构域组合提供针对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是激活细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，其提供初级激活信号。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在与分子(例如，抗原)的特异性结合后，所述受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送至细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化的细胞，如用于过继细胞疗法方法中。
示例性抗原受体(包括CAR)和用于将此类受体工程化和引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061；美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337；美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592,、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；和欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如前述出版物中任一项中披露的CAR，所述出版物如WO 2014031687、US8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，工程化的细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，所述抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，所述抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，由所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，由所述受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在特定方面，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，任何这样的抗原是在人B细胞上表达的抗原。
嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，其是抗体分子的一个或多个抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)，如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头接合的抗体可变区。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性识别抗原如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或者是其变体。
在一些实施方案中，抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括源自FMC63的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。FMC63通常是指针对表达人源CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.,等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:38和39分别所示的CDR-H1和CDR-H2，以及SEQ ID NO:40或54所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:35所示的CDR-L1、SEQ ID NO:36或55所示的CDR-L2和SEQ IDNO:37或56所示的CDR-L3序列。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR-L1序列、SEQ ID NO:36的CDR-L2序列和SEQ ID NO:37的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR-H1序列、SEQ ID NO:39的CDR-H2序列和SEQ ID NO:40的CDR-H3序列的可变重链，或具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63可变轻链区，或具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头示于SEQ ID NO:59中。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ IDNO:57所示的核苷酸序列或展现与SEQ ID NO:57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:43至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括源自SJ25C1的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别在SEQID NO:44-46所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:44的CDR-L1序列、SEQ ID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDR-H1序列、SEQ ID NO:48的CDR-H2序列和SEQ ID NO:49的CDR-H3序列的可变重链，或具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1可变轻链区，或具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头示于SEQ ID NO:52中。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:53至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是已知的，在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用多种熟知方案中的任一种容易地确定，所述方案包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulinvariable domains:an automatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001Jun8；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；和Martin等人,“Modeling antibody hypervariableloops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272,(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
下表2列出了如分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表2.根据各种编号方案的CDR边界。
Figure BDA0003727106220000481
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情况下，指定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。)单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原如癌症标记或要靶向的细胞或疾病(如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
在一些方面，重组受体(例如嵌合抗原受体)包括细胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些方面，重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如抗原)结合结构域的细胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，例如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有以下氨基酸的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸、或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135；或者国际专利申请公开号WO 2014031687。
在一些实施方案中，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQID NO:1所示且由SEQ ID NO:2所示的序列编码的仅铰链间隔子。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的恒定区或部分。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ IDNO:5所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:1、3-5、27-34或58所示的氨基酸序列或前述任一项的具有与前述任一项的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，或(e)包含式X1PPX2P(其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸)或由其组成。
在一些实施方案中，抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如在CAR的情况下模拟经由抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，嵌合受体包含在细胞外结构域(例如scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与受体(例如CAR)中的结构域之一天然地缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域(例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域)或其变体，或是包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或具有与其至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区或结构域。在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。细胞内信号传导区包括模拟或类似以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且所述接头在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞裂解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，细胞内(或胞质)信号传导区包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:13、14或15至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些实施方案中，CAR包括CD28或4-1BB(如人CD28或人4-1BB)的共刺激区域或结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:10或11至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42氨基酸胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:12至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，同一CAR包括初级(或激活)胞质信号传导区和共刺激信号传导组分二者。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括均在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活性CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症所特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，抗原受体还包括标记，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记，如细胞表面标记，所述替代标记可以用于确认细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，所述标记包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR或表皮生长因子受体，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸可操作地连接编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQID NO:6或17所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如，非自身蛋白，即不被宿主的免疫系统识别为“自身”的分子，将向所述宿主中过继转移细胞。
在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞反应的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ链是人CD3-ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域还包含与CD3ζ细胞内结构域连接的CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28是人CD28。在一些实施方案中，4-1BB是人4-1BB。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28来源的跨膜结构域的全部或一部分的跨膜结构域、CD28来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些这样的实施方案中，受体还包括间隔子，其含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分，如Ig铰链，例如IgG4铰链，如仅铰链间隔子。在一些实施方案中，CAR包括例如对CD19具有特异性的抗体或片段(如scFv，如上述任一种)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。
B.用于基因工程化的核酸、载体和方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。
在一些情况下，编码重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:25中所示的并且由SEQ ID NO:24中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。ORF由此编码单一多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或在翻译后被加工为单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可以引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，从而导致2A序列末端与下游的下一个肽之间隔开(参见例如，de Felipe,GeneticVaccines and Ther.2:13(2004)以及de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ IDNO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
在一些实施方案中，载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可以用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经被修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是在编码重组受体的相同多核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短的形式，如以下截短的形式，其是非功能性的，并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，和/或不内化或不能内化。示例性截短型细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短型人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短型表皮生长因子受体(tEGFR，如SEQ IDNO:7或16所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗
Figure BDA0003727106220000551
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和所编码的外源蛋白质工程化细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予针对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博来霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如，非自身蛋白，即不被宿主的免疫系统识别为“自身”的分子，将向所述宿主中过继转移细胞。
在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞反应的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予针对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博来霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)。
在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干个物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入并表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如以下文献中所述：Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,纽约州纽约市)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的该转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cellbased therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在所述培养的至少一部分的同时或期间将所述细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，例如通过促进转移细胞的活力和/或功能；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记的基因，例如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如LuptonS.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了使用源自将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
C.用于基因工程化的细胞和细胞的制备
在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下项所定义的那些：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于要治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，细胞是多能和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、将其制备、加工、培养和/或工程化，并在低温保存之前或之后将它们重新引入同一受试者体内。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达这样的核酸的重组或基因工程化的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、体液和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自其的处理样品。
在一些方面，细胞从其中来源或分离的样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，细胞基于一个或多个特性来分离，所述特性如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或耐药性。
在一些例子中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞单采术获得。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，洗涤步骤是根据制造商的说明书通过切向流过滤(TFF)完成的。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(如例如，不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性地结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时对多个细胞类型进行阳性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0003727106220000591
M-450CD3/CD28T细胞扩增器)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过以下方式完成阳性或阴性选择：将细胞与特异性结合至一种或多种表面标记的一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育，所述一种或多种表面标记分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高的水平表达(标记高)。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood,1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富集TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽，如使用抗CD8和抗CD62L抗体。
在一些实施方案中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富集TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。此类选择在一些方面是同时进行的，而在其他方面按任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性两种级分。然后阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中按任何顺序进行阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-且CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0003727106220000601
Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，如Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday的美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(如在Owen美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经历另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着于细胞以向患者施用。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用如下系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或制备步骤中的一个或多个。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以使错误、用户操作和/或污染降至最低。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、结局评估和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统按标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌无热原溶液中供应的、抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，再将所述管组连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，系统将细胞样品自动上样到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并被收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，其允许自动洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中流体流中携载针对多种细胞表面标记染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统组合来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10:1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许同时基于多种标记进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或结合基因工程化来孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或者用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活或刺激TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，所述技术如以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞，如非分裂外周血单个核细胞(PBMC)(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，将PBMC用范围为约3000至3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
III.示例性治疗结局及其评估方法
在本文所提供的方法、组合物、组合、用途、试剂盒和制品的一些实施方案中，所提供的组合疗法产生一种或多种治疗结局，如与任何一种或多种与疗法或治疗相关的参数相关的特征，如下文所述。在一些实施方案中，所述方法是如章节I中所述的任一种。在一些实施方案中，所述方法还包括对T细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖的评估。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，细胞(例如，免疫疗法(例如T细胞疗法)所施用的细胞)的暴露、或延长的扩增和/或持久性，和/或所述细胞的细胞表型或功能活性的变化可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量。在一些实施方案中，此类测定可以用于确定或确认在施用本文所提供的组合疗法之前、期间或之后，T细胞(例如T细胞疗法)的功能。
在一些实施方案中，所述组合疗法还可以包括用以鉴定受试者用于用所述组合疗法治疗和/或继续所述组合疗法的一个或多个筛选步骤，和/或用于评估治疗结局和/或监测治疗结局的步骤。在一些实施方案中，用于评估治疗结局的步骤可以包括用以评价和/或监测治疗和/或用以鉴定受试者用于施用所述疗法的进一步或剩余步骤和/或用于重复疗法的步骤。在一些实施方案中，所述筛选步骤和/或治疗结局的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时间安排和/或顺序。
在一些实施方案中，本文所述的任何筛选步骤和/或治疗结局的评估可以在所提供的组合疗法的一个或多个步骤的施用(例如，T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用)之前、期间、过程期间或之后使用。在一些实施方案中，在进行本文提供的任何方法之前、期间、过程期间或之后进行评估。在一些实施方案中，在进行本文提供的方法之前进行评估。在一些实施方案中，在进行本文提供的方法的一个或多个步骤之后进行评估。在一些实施方案中，在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤之前进行所述评估，例如以筛选和鉴定适合于和/或易于接受所述组合疗法的患者。在一些实施方案中，在施用所提供的组合疗法的一个或多个步骤期间、在所述施用的过程期间或在所述施用之后进行所述评估，例如以评估中间或最终治疗结局，例如，以确定治疗功效和/或确定是否要继续或重复所述治疗和/或确定是否要施用所述组合疗法的剩余步骤。
在一些实施方案中，治疗结局包括改进的免疫功能，例如基于细胞的疗法所施用的T细胞和/或体内内源T细胞的免疫功能。在一些实施方案中，示例性治疗结局包括但不限于增强的T细胞增殖、增强的T细胞功能活性、免疫细胞表型标记表达的变化，如与施用至所述受试者的工程化T细胞(例如CAR-T细胞)相关的此类特征。在一些实施方案中，示例性治疗结局包括降低的疾病负荷(例如肿瘤负荷)、改进的临床结局和/或增强的疗法功效。
在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估基于细胞的疗法施用的T细胞的存活和/或功能。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估细胞因子或生长因子的水平。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估包括评估疾病负荷和/或改进，例如，评估肿瘤负荷和/或临床结局。在一些实施方案中，筛选步骤和/或治疗结局的评估中的任一者可以包括本文所述和/或本领域中已知的任何评估方法和/或测定，并且可以进行一次或多次，例如，在施用所述组合疗法的一个或多个步骤之前、在所述施用期间、在所述施用的过程期间或在所述施用之后进行。可以在本文所提供的方法的一些实施方案中评估的与治疗结局相关的示例性参数集包括外周血免疫细胞群谱和/或肿瘤负荷。
在一些实施方案中，所述方法影响细胞疗法在受试者体内的功效。在一些实施方案中，如与通过不施用化合物A的方法所实现的相比，在施用所述方法中的细胞剂量与化合物A后，受试者中表达重组受体(例如，表达CAR)的细胞的持久性、扩增和/或存在更大。在一些实施方案中，如与其中在不存在化合物A的情况下将T细胞疗法施用至受试者的方法相比，评估施用T细胞疗法(例如，CAR表达T细胞)的受试者中的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，如与其中在不存在化合物A的情况下将T细胞疗法施用至受试者的方法相比，所述方法导致施用的T细胞在受试者中展现增加的或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，如与其中在不存在化合物A的情况下将表达重组受体的细胞的剂量施用至受试者的方法相比，化合物A的施用减小受试者的疾病负荷(例如，肿瘤负荷)。在一些实施方案中，如与其中在不存在化合物A的情况下将表达重组受体的细胞的剂量施用至受试者的方法相比，化合物A的施用减少受试者中的胚髓。在一些实施方案中，与其中在不存在化合物A的情况下将表达重组受体的细胞的剂量施用至受试者的方法相比，化合物A的施用导致改进的临床结局，例如，客观反应率(ORR)、无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个或多个步骤之前筛选受试者。例如，可以在施用组合疗法之前针对疾病和/或疾病负荷(例如，肿瘤负荷)的特征筛选受试者，以确定施用所述组合疗法的适合性、反应性和/或易感性。在一些实施方案中，所述筛选步骤和/或治疗结局的评估可以用于确定本文所提供的组合疗法的剂量、频率、持续时间、时间安排和/或顺序。
在一些实施方案中，可以在施用组合疗法的一个步骤之后筛选受试者，以确定和鉴定受试者用于接受所述组合疗法的剩余步骤，和/或以监测所述疗法的功效。在一些实施方案中，在化合物A的施用之前和/或在化合物A的施用之后评估所施用的T细胞的数量、水平或量和/或所施用的T细胞的增殖和/或活性。
在一些实施方案中，确定或评估与不同的评估时间点、不同条件、参考点和/或不同受试者的相同参数或结局的水平、值或测量相比，参数或结局的水平、值或测量的变化和/或改变(例如，增加、升高、降低或减少)。例如，在一些实施方案中，可以确定与不同条件(例如，在化合物A的施用之前)中的相同参数相比，特定参数(例如，样品中工程化的T细胞的数量)的倍数变化(例如，增加或降低)。在一些实施方案中，确定两个或更多个参数的水平、值或测量值，并且比较相对水平。在一些实施方案中，将确定的参数的水平、值或测量值与对照样品或未处理样品的所述水平、值或测量值进行比较。在一些实施方案中，将确定的参数的水平、值或测量值与在不同时间点来自同一受试者的样品的所述水平进行比较。可以将在单独参数的定量中获得的值组合用于疾病评估的目的，例如通过使用多参数分析对参数的水平、值或测量值形成算术或逻辑运算。在一些实施方案中，可以计算两个或更多个特定参数的比率。
A.T细胞暴露、持久性和增殖
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或治疗结局的评估和/或监测治疗结局的参数)是或包括对T细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的T细胞)的暴露、持久性和增殖的评估。在一些实施方案中，所述细胞(例如，本文提供的方法中的免疫疗法例如T细胞疗法施用的细胞)的增加的暴露或延长的扩增和/或持久性和/或所述细胞的细胞表型或功能活性的变化可以通过在体外或离体评估T细胞的特征来测量。在一些实施方案中，可以在施用本文所提供的组合疗法的一个或多个步骤之前或之后，使用此类测定来确定或确认用于免疫疗法(例如，T细胞疗法)的T细胞的功能。
在一些实施方案中，化合物A的施用设计为促进受试者暴露于细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的T细胞)，如通过促进其随时间变化的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，如与其中在不存在化合物A的情况下将T细胞疗法施用至受试者的方法相比，T细胞疗法在受试者中展现增加的或延长的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，所提供的方法增加受试者对所施用的细胞的暴露(例如，随时间增加的细胞数量或持续时间)和/或改善免疫疗法(例如，T细胞疗法)的功效和治疗结局。在一些方面，与其他方法相比，所述方法的有利之处在于，对表达重组受体的细胞(例如，表达CAR的细胞)的更大和/或更长程度的暴露改善治疗结局。这样的结局可以包括患者存活和缓解，即使在具有严重肿瘤负荷的个体中。
在一些实施方案中，如与在不存在化合物A的情况下仅T细胞的施用相比，化合物A的施用可以增加受试者中对所述细胞(例如基于T细胞的疗法施用的T细胞)的暴露的最大值、总量和/或持续时间。在一些方面，在高疾病负荷(由此更高量的抗原)和/或侵袭性或耐药性更强的B细胞恶性肿瘤的情况下，如与相同情况下在不存在化合物A的情况下仅T细胞的施用相比，化合物A的施用增强功效，这可能导致免疫抑制、失能和/或耗竭，从而可能阻止所述细胞的扩增和/或持久性。
在一些实施方案中，在T细胞的施用之后且在化合物A的施用之前、期间和/或之后，检测受试者中表达重组受体的细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的CAR表达细胞)的存在和/或量。在一些方面，使用定量PCR(qPCR)评估表达重组受体的细胞(例如，基于T细胞的疗法施用的CAR表达细胞)在受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，患病部位，例如肿瘤样品)中的量。在一些方面，持久性被定量为每微克DNA(例如从样品获得的总DNA)中编码受体(例如，CAR)的DNA或质粒的拷贝，或者被定量为每微升样品(例如，血液或血清)中受体表达细胞(例如，CAR表达细胞)的数量或每微升样品中外周血单个核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。
在一些实施方案中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用之后为或至少为4、7、10、14、18、21、24、27或28天，在受试者中检测细胞。在一些方面，在T细胞的施用之后为或至少为2、4或6周，或者3、6、或12、18、或24、或30或36个月，或者1、2、3、4、5年或更多年，检测所述细胞。
在一些实施方案中，如与通过替代性方法所实现的相比，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用后，通过所述方法在受试者中的受体表达细胞(例如CAR表达细胞)的持久性更大，所述替代性方法如涉及在不存在化合物A的情况下仅免疫疗法的施用(例如，T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用)的那些。
指示扩增和/或持久性的细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的暴露(例如，数量)可以根据以下方面来陈述：暴露至受试者的细胞的最大数量、可检测细胞或高于某一数量或百分比的细胞的持续时间、细胞数量相对于时间的曲线下面积和/或其组合和其指示物。此类结局可以使用已知方法来评估，例如使用qPCR来检测与特定样品(例如，血液、血清、血浆或组织，如肿瘤样品)中核酸或DNA的总量相比，编码重组受体的核酸的拷贝数；和/或使用流式细胞术测定，通常使用对受体具特异性的抗体来检测表达受体的细胞。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，所述功能细胞如能够结合至和/或中和疾病或病症细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的细胞，和/或能够诱导针对疾病或病症细胞或表达由所述受体所识别抗原的细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞。
在一些方面，增加的受试者对细胞的暴露包括增加的细胞扩增。在一些实施方案中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用之后和/或在化合物A的施用之后，受体表达细胞(例如CAR表达细胞)在受试者中扩增。在一些方面，与其他方法相比，所述方法导致所述细胞更大的扩增，所述其他方法如涉及在不存在施用化合物A的情况下T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用的那些。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，检测到细胞的高峰值比例。例如，在一些实施方案中，在受试者的血液或患病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用之后的峰值或最大水平下，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的所述细胞表达重组受体(例如，CAR)。
在一些实施方案中，所述方法导致受试者的血液或血清或其他体液或器官或组织中的浓度最大值为至少100、500、1000、1500、2000、5000、10,000或15,000个拷贝的编码受体(例如，CAR)的核酸/微克DNA，或为每个外周血单个核细胞(PBMC)总数、单核细胞总数、T细胞总数或微升总数至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9个表达受体(例如，表达CAR)的细胞。在一些实施方案中，表达受体的细胞被检测为受试者的血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A之后在这个水平下持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或52周，或在这样的施用后持续1、2、3、4或5年或更多年。
在一些方面，所述方法导致例如受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中，每微克DNA中编码重组受体(例如CAR)的核酸的拷贝数增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。
在一些实施方案中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用之后或在化合物A的施用之后至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天或更多天，表达受体的细胞在受试者的血清、血浆、血液或组织(例如，肿瘤样品)中是可检测的(例如，通过指定方法如qPCR或基于流式细胞术的检测方法)，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用之后持续至少或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周或更多周。
在一些方面，在受试者或其体液、血浆、血清、组织或隔室中，例如在其血液(例如外周血)或患病部位(例如肿瘤)中，可检测到或存在至少约1x102、至少约1x103、至少约1x104、至少约1x105、或至少约1x106、或至少约5x106、或至少约1x107、或至少约5x107、或至少约1x108个表达重组受体(例如表达CAR)的细胞，和/或每微升至少10个、25个、50个、100个、200个、300个、400个或500或1000个表达受体的细胞(例如每微升至少10个细胞)。在一些实施方案中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用之后和/或在化合物A的施用之后，在受试者中可检测到这样的数量或浓度的细胞，持续至少约20天、至少约40天或至少约60天，或者至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或者至少2或3年。这样的细胞数量可以如通过基于流式细胞术或基于定量PCR的方法所检测，并且使用已知的方法外推至总细胞数量。参见例如，Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)；Park等人,Molecular Therapy 15(4):825–833(2007)；Savoldo等人,JCI 121(5):1822-1826(2011)；Davila等人,(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Davila等人,Oncoimmunology 1(9):1577-1583(2012)；Lamers,Blood 2011 117:72-82；Jensen等人,Biol Blood Marrow Transplant 2010年9月；16(9):1245-1256；Brentjens等人,Blood 2011118(18):4817-4828。
在一些方面，在细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用之后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周或至少约6周，或者至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或者至少2或3年，如通过免疫组织化学、PCR和/或流式细胞术所测量，例如在外周血或骨髓或其他隔室中，每100个细胞的编码重组受体的核酸的拷贝数(例如，载体拷贝数)为至少0.01、至少0.1、至少1或至少10。在一些实施方案中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)或化合物A的施用之后约1周、约2周、约3周或至少约4周，或者在这样的施用之后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或者至少2或3年的时间，每微克基因组DNA的表达受体(例如CAR)的载体的拷贝数为至少100、至少1000、至少5000、或至少10,000、或至少15,000、或至少20,000。
在一些方面，在细胞的施用之后(例如，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)的施用起始之后)和/或化合物A的施用之后至少约3个月、至少约6个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年或超过3年的时间，在受试者、其血浆、血清、血液、组织和/或患病部位(例如，肿瘤部位)中，由所述细胞表达的受体(例如CAR)是通过定量PCR(qPCR)或通过流式细胞术可检测的。
在一些实施方案中，如与通过替代性给药方案所实现的相比，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用之后随时间变化的表达受体(例如，CAR)的细胞在受试者的体液、血浆、血清、血液、组织、器官和/或患病部位(例如，肿瘤部位)中的浓度的曲线下面积(AUC)更大，在所述替代性给药方案中在不存在施用化合物A的情况下向受试者施用T细胞(例如，CAR表达T细胞)。
在一些方面，所述方法导致所施用的细胞的高体内增殖，例如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，检测到细胞的高峰值比例。例如，在一些实施方案中，在受试者的血液、血浆、血清、组织或患病部位或其白细胞级分(例如，PBMC级分或T细胞级分)中，在T细胞(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A之后的峰值或最大水平下，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的所述细胞表达重组受体(例如，CAR)。
在一些方面，所述剂量的细胞在施用化合物A的受试者中增加的或延长的扩增和/或持久性与所述受试者中肿瘤相关结局的益处相关。在一些实施方案中，肿瘤相关结局包括受试者中肿瘤负荷的降低或胚髓的减少。在一些实施方案中，在所述方法的施用后，肿瘤负荷降低或降低至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与已经用不涉及化合物A的施用的方法治疗的受试者相比，在所述细胞剂量后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积降低至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多。
B.T细胞功能活性
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或评估治疗结局和/或监测治疗结局的参数)包括T细胞的活性、表型、增殖或功能中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用本领域中用于评估T细胞(例如，T细胞疗法施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的任何已知测定。在所述细胞和/或化合物A的施用之前和/或之后，在一些实施方案中测量工程化的细胞群的生物活性，例如通过多种已知方法中的任一种来测量。要评估的参数包括工程化的或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或者离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，可以使用已知的任何合适的方法测量工程化的细胞破坏靶细胞的能力，所述方法如例如以下文献中所述的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。
在一些实施方案中，可以在所述细胞和/或化合物A的施用之前和/或之后评估T细胞如重组表达(例如CAR)T细胞，以评估或确定所述T细胞是否展现耗竭的特征。在一些情况下，可以通过监测T细胞功能的丧失来评估耗竭，所述T细胞功能的丧失为例如减少或降低的抗原特异性或抗原受体驱动活性，例如减少或降低的产生细胞因子或驱动针对靶抗原的细胞裂解活性的能力。在一些情况下，还可以通过监测在T细胞(例如CD4和/或CD4 T细胞)上与耗竭表型相关的表面标记的表达来评估耗竭。耗竭标记包括抑制性受体，如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3。
在一些实施方案中，在施用至受试者后和/或在长期暴露于抗原后随时间推移观察到这种减少或降低的活性。
在特定实施方案中，所提供的方法(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作和/或逆转所述耗竭表型。在一些实施方案中，所述量、持续时间和/或频率有效于(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作。在其他实施方案中，所述量、持续时间和/或频率有效于(i)实现抗原特异性或抗原受体驱动活性的所述增加，并且(ii)预防、抑制或延迟耗竭表型的所述发作以及逆转所述耗竭表型。
在一些实施方案中，关于T细胞或T细胞群的耗竭表型包括：在相同条件下与参考T细胞群相比，所述T细胞或多个T细胞上一种或多种耗竭标记任选地2、3、4、5或6种耗竭标记的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述表面表达的所述T细胞群的百分比的增加；或在相同条件下与参考T细胞群相比，在暴露于抗原或抗原受体特异性药剂时，由所述T细胞或T细胞群展现出的活性水平或程度的降低；在相同条件下与参考T细胞群相比，所述T细胞或多个T细胞上一种或多种耗竭标记任选地2、3、4、5或6种耗竭标记的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述表面表达的所述T细胞群的百分比的增加；或在相同条件下与参考T细胞群相比，在暴露于抗原或抗原受体特异性药剂时，由所述T细胞或T细胞群展现出的活性水平或程度的降低。
在某些实施方案中，通过评估一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2、GM-CSF和TNFα)的表达和/或分泌和/或通过评估细胞裂解活性来测量细胞的生物活性。
在一些实施方案中，对T细胞(例如，T细胞疗法所给予的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能的测定包括但不限于ELISPOT、ELISA、细胞增殖、细胞毒性淋巴细胞(CTL)测定、与T细胞表位、抗原或配体的结合、或细胞内细胞因子染色、增殖测定、淋巴因子分泌测定、直接细胞毒性测定和有限稀释测定。在一些实施方案中，可以测量T细胞的增殖反应，例如，通过将3H-胸苷、BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)或2'-脱氧-5-乙炔基尿苷(EdU)掺入T细胞的DNA或染料稀释测定中，使用诸如羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)、CellTrace Violet或膜染料PKH26等染料来测量。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括测量T细胞的细胞因子产生，和/或测量来自受试者的生物样品(例如血浆、血清、血液和/或组织样品，例如肿瘤样品)中的细胞因子产生。在一些情况下，此类所测量的细胞因子可以包括但不限于白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。测量细胞因子的测定是众所周知的，并且包括但不限于ELISA、细胞内细胞因子染色、流式微珠阵列、RT-PCR、ELISPOT、流式细胞术和在存在测试样品的情况下测试对相关细胞因子有反应的细胞的反应性(例如，增殖)的生物测定。
在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)的活性、表型、增殖和/或功能包括评估细胞表型，例如特定细胞表面标记的表达。在一些实施方案中，评估T细胞(例如，T细胞疗法所施用的T细胞)中T细胞激活标记、T细胞耗竭标记和/或T细胞分化标记的表达。在一些实施方案中，在施用之前评估细胞表型。在一些实施方案中，在细胞疗法和/或化合物A的施用期间或之后评估细胞表型。用于评估的T细胞激活标记、T细胞耗竭标记和/或T细胞分化标记包括已知用于T细胞的特定子集的任何标记，例如CD25、CD38、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、CD69、CD44、CD137、KLRG1、CD62L低、CCR7低、CD71、CD2、CD54、CD58、CD244、CD160、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)和/或基于T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)(参见例如，Liu等人,Cell Death and Disease(2015)6,e1792)。在一些实施方案中，耗竭标记是以下中的任何一种或多种：PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、2B4、CD160、CD39、VISTA和TIGIT。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25、PD-1和/或TIM-3。在一些实施方案中，所评估的细胞表面标记是CD25。
在一些方面，检测表达水平包括进行体外测定。在一些实施方案中，体外测定是免疫测定、基于适体的测定、组织学或细胞学测定或mRNA表达水平测定。在一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、抑制测定或亲合力测定来检测一种或多种因子、效应子、酶和/或表面标记各自的一种或多种的一个或多个参数。在一些实施方案中，细胞因子和/或表面标记的检测是使用与至少一种生物标记特异性结合的结合试剂来确定。在一些情况下，结合试剂是抗体或其抗原结合片段、适体或核酸探针。
在一些实施方案中，化合物A的施用增加循环CAR T细胞的水平。
C.反应、功效和存活
在一些实施方案中，与疗法或治疗结局相关的参数(其包括可以评估用于筛选步骤和/或治疗结局评估和/或监测治疗结局的参数)包括肿瘤或疾病负荷。免疫疗法如T细胞疗法(例如，CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用可以降低或预防受试者中疾病或病症的扩大或负荷。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改进预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些方面，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物的施用通常降低或预防受试者的疾病或病症的扩大或负荷。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的B细胞恶性肿瘤，和/或改进预后或存活或与肿瘤负荷相关的其他症状。
在一些实施方案中，与替代性方法相比，所提供的方法导致所治疗受试者中降低的肿瘤负荷，在所述替代性方法中，免疫疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)是在不施用化合物A的情况下给予的。肿瘤负荷不一定在接受组合疗法的所有受试者中都实际上降低，但是如基于临床数据，肿瘤负荷在所治疗受试者中平均地降低，其中用这种组合疗法治疗的大多数受试者展现出降低的肿瘤负荷，如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的用所述组合疗法治疗的受试者展现出降低的肿瘤负荷。
疾病负荷可以涵盖受试者体内或受试者的器官、组织或体液(如肿瘤的器官或组织或例如可指示转移的另一位置)中疾病细胞的总数。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液、淋巴或骨髓中对肿瘤细胞进行检测和/或定量。在一些实施方案中，疾病负荷可以包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。
在一些实施方案中，受试者患有淋巴瘤或白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残留白血病来确定。在一些实施方案中，受试者患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，受试者患有MM或DBCBL。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。在一些方面，反应评估利用临床、血液学和/或分子方法中的任一种。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应涉及视情况使用正电子发射断层摄影术(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可以包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，如果将使用PET-CT来评估嗜FDG组织学中的反应，则可以使用5分量表。在一些方面，5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应涉及在不同可测量部位的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的韦氏环(Waldeyer's ring)或结节外部位中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累部位的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外部位，并且靶淋巴结/淋巴结肿块的病灶的最长横径(LDi)必须复原至≤1.5cm。其他评估部位包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，如果不确定则应是IHC阴性。其他部位可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面中，评估未测量的病灶和新病灶，其在CR的情况下应该不存在(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.4(1):5)。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的部分反应(PR)包括在不同可测量位点的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，其具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残留肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残留病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外部位的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估部位包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残留摄取，所述残留摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情境下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他部位可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常，已复原但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO.,32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin.Clin.Oncol.,4(1):5)。
在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如B细胞恶性肿瘤)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总体存活期(OS)被描述为从诊断或开始治疗疾病(如B细胞恶性肿瘤)的日期到被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活时的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在B细胞恶性肿瘤治疗结束后，所述受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括B细胞恶性肿瘤的复发或某些症状的发作，所述症状如已经扩散到骨骼的B细胞恶性肿瘤引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始疗法起一段时间之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始疗法之后大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应是持久的，持续超过3个月或超过6个月。
在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应。(Eisenhauer等人,EuropeanJournal of Cancer 45(2009)228-247。)在一些方面，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减小至<10mm。在其他方面，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线直径总和为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面中，疾病进展(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面中，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
在MM的情况下，评估疾病负担程度的示例性参数包括诸如以下等参数：克隆血浆细胞数量(例如，在骨髓活检中>10％或在来自其他组织的活检中的任何量；浆细胞瘤)、单克隆蛋白(副蛋白)在血清或尿液中的存在、感觉与血浆细胞障碍相关的终末器官损害的证据(例如，高钙血症(校正钙>2.75mmol/l)；骨髓瘤引起的肾功能不全；贫血(血红蛋白<10g/dl)；和/或骨病灶(溶解性病灶或具有压缩性骨折的骨质疏松症))。
在DLBCL的情况下，评估疾病负担程度的示例性参数包括诸如以下等参数：细胞形态(例如，中心母细胞、免疫母细胞和间变细胞)、基因表达、miRNA表达和蛋白质表达(例如，BCL2、BCL6、MUM1、LMO2、MYC和p21的表达)。
在一些方面，受试者(如患有CLL的受试者)的反应率基于国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(IWCLL)反应标准(Hallek等人,Blood 2008年6月15日；111(12):5446-5456)。在一些方面，这些标准描述如下：完全缓解(CR)，其在一些方面要求依据免疫表型分析不存在外周血克隆淋巴细胞、不存在淋巴结病、不存在肝肿大或脾肿大、不存在全身症状和令人满意的血细胞计数；完全缓解伴随不完全骨髓恢复(CRi)，其在一些方面被描述为上述CR，但没有正常的血细胞计数；部分缓解(PR)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数下降≥50％、淋巴结病减少≥50％或肝或脾减小≥50％，以及外周血细胞计数改善；疾病进展(PD)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数增加≥50％至>5x109/L、淋巴结病增加≥50％、肝或脾大小增加≥50％、里希特转化或由于CLL所致的新的血细胞减少；以及疾病稳定，其在一些方面被描述为不符合CR、CRi、PR或PD的标准。
在一些实施方案中，如果在施用细胞剂量的1个月内，受试者的淋巴结大小小于或小于约20mm、大小小于或小于约10mm或大小小于或小于约10mm，则所述受试者表现出CR或OR。
在一些实施方案中，在受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到CLL的指标克隆。在一些实施方案中，通过IgH深度测序评估CLL的指标克隆。在一些实施方案中，在施用细胞之后为或约或者至少为或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间未检测到指标克隆。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微镜检查检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者表现出形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者表现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者可以表现出完全缓解，但存在小部分形态学上(通过光学显微镜检查技术)不可检测的残留白血病细胞。如果受试者表现出在骨髓中小于5％原始细胞并且表现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者表现出微量残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定由染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者表现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术不能检测到受试者体内的白血病细胞。
在白血病的情况下，可以通过评估血液或骨髓中残留的白血病来确定疾病负荷程度。在一些实施方案中，如果骨髓中存在大于或等于5％的原始细胞(例如，如通过光学显微镜检查检测)，则受试者表现出形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者表现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，对于白血病，受试者可表现出完全缓解，但是存在小部分形态上不可检测(通过光学显微镜检查技术)的残留白血病细胞。如果受试者表现出在骨髓中小于5％原始细胞并且表现出可分子检测的B细胞恶性肿瘤，则称所述受试者表现出微量残留病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的B细胞恶性肿瘤可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任何一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定由染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定B细胞恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤的分子检测可以检测100,000个正常细胞中的少至1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中的至少或大于1个白血病细胞，则受试者表现出可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术不能检测到受试者体内的白血病细胞。
在一些实施方案中，如与紧临在免疫疗法例如T细胞疗法和/或化合物A的施用之前的时间的疾病负荷相比，所述方法和/或细胞疗法如T细胞疗法(例如CAR表达T细胞)和/或化合物A的施用降低疾病负荷。
在一些方面，免疫疗法例如T细胞疗法和/或化合物A的施用可以防止疾病负荷的增加，并且这可以通过疾病负荷无变化来证实。
在一些实施方案中，如与使用可比较的方法会观察到的降低相比，所述方法降低疾病或病症的负荷(例如，肿瘤细胞的数量、肿瘤的大小、患者存活或无事件存活的持续时间)的程度更大和/或持续更长的时间段，所述可比较的方法使用替代性疗法，如其中受试者在不存在化合物A的施用的情况下接受仅免疫疗法例如T细胞疗法的替代性疗法。在一些实施方案中，与通过施用单独的每种药剂(例如，将化合物A施用至尚未接受免疫疗法例如T细胞疗法的受试者；或者将免疫疗法例如T细胞疗法施用至尚未接受化合物A的受试者)会实现的降低相比，在施用免疫疗法例如T细胞疗法和化合物A的组合疗法之后，疾病负荷被降低的程度更大或持续更长的持续时间。
在一些实施方案中，检测、评估或测量受试者中疾病或病症的负荷。在一些方面，可以通过检测疾病细胞或疾病相关细胞(例如，肿瘤细胞)在受试者体内或在受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中的总数来检测疾病负荷。在一些实施方案中，通过测量转移的数量或程度来评估疾病负荷(例如肿瘤负荷)。在一些方面，评估受试者的存活、在某个时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，指定疾病或病症负荷的量度。在一些实施方案中，用于确定的示例性参数包括指示疾病或病症(例如肿瘤)的改善或改进的特定临床结果。此类参数包括：疾病控制的持续时间，所述疾病控制包括完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)(参见例如，实体瘤中的反应评价标准(ResponseEvaluation Criteria In Solid Tumors，RECIST)指南)；客观反应率(ORR)、无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)。可以设定参数的具体阈值以确定本文所提供的组合疗法方法的功效。
在一些方面，在免疫疗法例如T细胞疗法的施用之前，在免疫疗法例如T细胞疗法的施用之后但在化合物A的施用之前，和/或在免疫疗法例如T细胞疗法和化合物A二者的施用之后，测量或检测疾病负荷。在组合疗法的一个或多个步骤的多次施用的情况下，在一些实施方案中可以在任何施用步骤、剂量和/或循环的施用之前或之后，或者在任何施用步骤、剂量和/或循环的施用之间的时间，测量疾病负荷。在一些实施方案中，化合物A的施用进行至少两个循环(例如，28天循环)，并且在每个循环之前、期间和/或之后测量或检测疾病负荷。
在一些实施方案中，与紧临在化合物A和免疫疗法例如T细胞疗法的施用之前相比，通过所提供的方法将负荷降低或降低至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，与紧临在免疫疗法例如T细胞疗法和/或化合物A的施用之前相比，在免疫疗法例如T细胞疗法和化合物A的施用之后，疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负担或体积降低至少或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，通过所述方法降低疾病负荷包括诱导形态学完全缓解，例如如在施用(例如，开始)所述组合疗法后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、或多于6个月时所评估的。
在一些方面，例如如通过多参数流式细胞术测量的，对微量残留病的测定是阴性的，或微量残留病的水平小于约0.3％、小于约0.2％、小于约0.1％或小于约0.05％。
在一些实施方案中，如与其他方法相比，所述方法提高受试者的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方案中，在本文所提供的组合疗法方法后6个月时，通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总体存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者表现出无事件存活、无复发存活或存活到至少6个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年。在一些实施方案中，至进展时间得以改进，如至进展时间大于或大于约6个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年。
在一些实施方案中，如与其他方法相比，在通过所述方法治疗之后，复发概率降低。例如，在一些实施方案中，在所述组合疗法的方法后6个月时，复发概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
在一些情况下，确定所施用细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所施用细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)、蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)、表位标记(如Strep-Tag序列，将其直接引入CAR中的特定位点，借此使用Strep-Tag的结合试剂直接评估CAR)(Liu等人(2016)NatureBiotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)和与CAR多肽特异性结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(例如CAR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有由抗体西妥昔单抗
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或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434。
在一些实施方案中，可以在施用细胞疗法之后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR+T细胞的数量，例如，以确定所述细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在所述受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数受试者中可检测的CAR+T细胞(任选CAR+CD8+T细胞和/或CAR+CD4+T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。
IV.毒性和不良结局
在所提供的方法的实施方案中，在被施用包括细胞疗法(例如，T细胞疗法)和化合物A的所提供的组合疗法的受试者中，监测受试者的毒性或其他不良结局，包括治疗相关结局，例如，中性粒细胞减少症、细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)的发展。在一些实施方案中，进行所提供的方法以降低毒性结局或症状、促进毒性的概况、因子或特性(如与严重中性粒细胞减少症、严重细胞因子释放综合征(CRS)或严重神经毒性相关或指示严重中性粒细胞减少症、严重细胞因子释放综合征(CRS)或严重神经毒性的症状或结局)的风险。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不会导致毒性或毒性结局(如严重神经毒性(NT)或严重细胞因子释放综合征(CRS))的高比率或可能性，或者降低毒性或毒性结局的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不会导致严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度的发热持续三天或更多天以及至少或至少约20mg/dL的CRP的血浆水平，或者不会增加其风险。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供的方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出严重毒性结局(例如严重CRS或严重神经毒性)，如未展现出3级或更高级的神经毒性和/或未展现出严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不会导致毒性或毒性结局(如严重神经毒性(NT)或严重细胞因子释放综合征(CRS))的高比率或可能性，或者降低毒性或毒性结局的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不会导致严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度的发热持续三天或更多天以及至少或至少约20mg/dL的CRP的血浆水平，或者不会增加其风险。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供的方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出严重毒性结局(例如严重CRS或严重神经毒性)，如未展现出3级或更高级的神经毒性和/或未展现出严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。
D.细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性
在一些方面，毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)。在一些情形中，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物产品后可能发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；以及Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。
通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。严重的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他严重的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如抗IL-6抗体，例如托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。
CRS的结局、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或施用实现或不实现给定的CRS相关结局、体征或症状的情况下，可以指定特定结局、体征和症状和/或其量或程度。
在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结局包括发热、僵直、寒战、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫发作样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。
在一些实施方案中，与CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如在指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如与至少两种细胞因子(例如，由以下各项组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比，例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。
示例性CRS相关结局包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结局还包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。
在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结果包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。
在一些实施方案中，在CAR治疗和/或化合物A治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面中，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。
已经研发CRS标准，其似乎与CRS的发作相关，以预测哪些患者更可能具有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95)。在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表3中详述的那些。
Figure BDA0003727106220000771
在一些实施方案中，认为受试者响应或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“严重CRS”(“sCRS”)，条件是在施用后所述受试者展示：(1)在至少38摄氏度发热至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5，和/或(b)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5；和(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一种静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO2<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和/或癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括3级或更高级CRS，如表4中所示。
在一些实施方案中，与严重CRS或3级或更高级，如4级或更高级CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如在指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如与至少两种细胞因子(例如，由以下各项组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比，例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如严重CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)CRP的血清水平为至少或至少约20mg/dL。在一些实施方案中，所述CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，严重CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、寒战、发热性中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。
可以指定测量或检测各种结局的方法。
在一些方面，疗法(如细胞疗法)的毒性结局是神经毒性或严重的神经毒性或与神经毒性或严重的神经毒性相关或指示神经毒性或严重的神经毒性。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫(任选地如通过脑电图[EEG]确认)、β淀粉样蛋白(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高和氧自由基水平升高。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如，Guido Cavaletti&Paola MarmiroliNature Reviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。
在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“严重神经毒性”，条件是在施用后所述受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(如沿神经或神经组的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，严重神经毒性包括3级或更高级神经毒性，如表4所示。在一些实施方案中，如果症状或3级神经毒性持续10天或更长时间，则认为严重的神经毒性为延长的3级。
Figure BDA0003727106220000781
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结局或因素，包括与严重CRS或3级或更高级的CRS相关的症状、结局或因素。例如，根据本方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如，严重CRS或3级或更高级的CRS)的症状、结局或因素和/或具有减少的所述症状、结局或因素，如所述的(例如表3中所示的)任何症状、结局或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。
在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结局，包括对神经系统和/或脑的损伤，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。
在一些实施方案中，毒性结局是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，毒性结局是剂量限制性毒性的不存在。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高级的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南所描述或评估，如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CommonTerminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)4.0版。在一些实施方案中，当在施用所述细胞疗法(例如，T细胞疗法)和/或化合物A后发生以下讨论的任何事件时，定义了剂量限制性毒性(DLT)，所述事件包括a)发热性中性粒细胞减少症；b)4级中性粒细胞减少症持续约或超过约7天；c)3级或4级血小板减少症伴有临床上显著的出血；和d)4级血小板减少症持续超过24小时。
在一些实施方案中，所提供的实施方案导致毒性(例如CRS或神经毒性或严重CRS或神经毒性，例如3级或更高级的CRS或神经毒性)的发生率或发生风险低，如通过根据所提供的组合疗法施用一定剂量的T细胞观察到的和/或通过所提供的制品或组合物观察到的。在一些情形中，这允许在门诊基础上施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使所述受试者住院，如需要过夜停留的住院。
在一些方面，在施用所述细胞剂量之前或与其同时没有向根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)施用用于治疗任何毒性的干预，除非或直至所述受试者展现毒性(如神经毒性或CRS)的体征或症状。
在一些实施方案中，如果施用所述细胞疗法(例如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现发热，则给予所述受试者治疗或指示所述受试者接受或施用治疗，以减轻发热。在一些实施方案中，将所述受试者的发热表征为所述受试者的体温等于或高于某一阈值温度或水平(或在所述阈值温度或水平下测量)。在一些方面，所述阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，所述阈值温度是特定的温度或范围。例如，所述阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是为或约38摄氏度至为或约39摄氏度的范围、为或约39摄氏度至为或约40摄氏度的范围、为或约40摄氏度至为或约41度的范围、或为或约41摄氏度至为或约42摄氏度的范围。
在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。退热药可以包括降低发热的任何药剂、组合物或成分，如已知具有退热作用的许多药剂中的一种，如NSAID(如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、对乙酰氨基酚、安乃近、萘丁美酮、Phenaxone、安替比林、解热药。在一些实施方案中，所述退热药是对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，可以长达每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内施用对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，所述退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。
在一些实施方案中，如果所述发热是持续发热，则向所述受试者施用用于治疗毒性的替代性治疗。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果所述受试者已经和/或被确定为患有或患有持续发热，则指示所述受试者返回医院。在一些实施方案中，如果受试者展现出等于或高于相关阈值温度的发热，并且在指定治疗(如被设计为减轻发热的治疗，如使用退热药(例如，NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、醋氨酚或阿司匹林)的治疗)后，受试者的发热或体温没有下降，或者没有下降指定量或超过指定量(例如，超过1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者已经和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果所述受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如对乙酰氨基酚的退热药治疗后，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，没有降低或没有降低超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低或降低约1％、2％、3％、4％或5％，则受试者被认为患有持续发热。在一些实施方案中，所述退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，所述特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。
在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相关阈值温度的发热，并且在受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者已经患有和/或被确定为或认为患有持续发热。通常，高于或等于某一量的变动的这种不存在是在给定的时间段内测量(如，在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时的时间段内，其可以从发烧的最初体征或最初高于所指示阈值的温度起测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少为或约38或39摄氏度的发热，所述发热的温度在6小时时段内、8小时时段内、或12小时时段内、或24小时时段内没有变动超过或超约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则所述受试者被认为或被确定为展现持续发热。
在一些实施方案中，所述发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(如所述细胞疗法，如T细胞(例如CAR+T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者患有持续发热时，如在这种确定或首次这种确定的1、2、3、4、5、6小时或更短时间内，治疗所述受试者。
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。
E.血液毒性
在一些方面，毒性结局是血液毒性(如血小板减少症和/或中性粒细胞减少症)，或与所述血液毒性相关，或指示所述血液毒性。在一些情况下，根据不良事件通用术语标准(4.03版；美国国家癌症研究所，美国马里兰州贝塞斯达)对血液毒性(包括血小板减少症和中性粒细胞减少症)进行分级。在一些情形中，在化合物A的一次或多次施用之前、期间和之后，监测血液毒性(如血小板减少症和/或中性粒细胞减少症)。在一些情形中，在化合物A的每次施用之前，监测血液毒性(如血小板减少症和/或中性粒细胞减少症)。在一些情形中，在化合物A的施用之后至少每1、2、3、4、5、6或7天，监测血液毒性(如血小板减少症和/或中性粒细胞减少症)。
在一些实施方案中，进行全血细胞计数以监测受试者中白细胞(白血细胞)(包括嗜中性粒细胞和血小板)的水平。可以使用多种方法进行全血细胞(CBC)计数和/或白细胞分类计数。在一些实施方案中，使用血液分析仪。
中性粒细胞减少症的特征在于血液嗜中性粒细胞计数减少，通常导致对细菌和真菌感染的易感性增加。患者中性粒细胞减少症的常见症状包括例如发热、口疮和耳部感染。患有严重中性粒细胞减少症的患者通常患有化脓性感染如败血症、皮肤蜂窝织炎、肝脓肿、疖病、肺炎、口腔炎、牙龈炎、直肠周炎症、结肠炎、鼻窦炎和中耳炎。
在一些实施方案中，绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)用于定义中性粒细胞减少症的水平。可以从全血细胞计数的组分计算ANC。在一些实施方案中，中性粒细胞减少症的严重程度基于每微升血液中测量的细胞中的绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)进行分类:a)轻度中性粒细胞减少症(1000至1500个细胞/mL)；b)中度中性粒细胞减少症(3级；500至1000个细胞/mL)；c)严重中性粒细胞减少症(4级；<500个细胞/mL)。在一些实施方案中，中性粒细胞减少症可根据表5中所列的标准进行分级。患有严重中性粒细胞减少症的受试者通常具有严重的感染风险。
Figure BDA0003727106220000811
在一些情况下，中性粒细胞减少症是发热性中性粒细胞减少症(也称为嗜中性粒细胞减少性发热或嗜中性粒细胞减少性脓毒症)。当患者的体温高于38℃且嗜中性粒细胞水平较低或患有中性粒细胞减少症时，就会发生发热性中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，发热性中性粒细胞减少症可根据表6中所列的标准进行分级。
Figure BDA0003727106220000812
在一些实施方案中，监测受试者的血小板减少症。血小板减少症的特征在于血小板计数少于150,000个细胞/微升(μL)。血小板减少症的表现，特别是在具有更严重等级的患者中，可包括出血、瘀斑、瘀点、紫癜和脾功能亢进。血小板减少症可表征为1级血小板减少症(即血小板计数为75,000至150,000/μL)、2级(即血小板计数为50,000至<75,000/μL)、3级(血小板计数为25,000至<50,000/μL)、或4级(即血小板计数低于25,000/μL)。
在所提供的方法的一些实施方案中，如果确定受试者展现血液毒性，如血小板减少症和/或中性粒细胞减少症或其特定等级，则可以改变使用化合物A的循环疗法。在一些方面，如果在化合物A的施用后，受试者具有3级或更高级的血小板减少症；3级中性粒细胞减少症；持续的3级中性粒细胞减少症(例如至少超过3、5、或7天)；4级中性粒细胞减少症；3级或更高级的发热性中性粒细胞减少症，则改变循环疗法。在一些实施方案中，化合物A的施用被永久停止，或者暂停直至毒性的体征或症状得到缓解、减少或降低。可以对所述受试者进行持续监测以评估毒性的一种或多种体征或症状，例如通过CBC或白细胞分类分析。在一些情况下，如果毒性消退或降低，则可以在暂停循环疗法之前以相同剂量或给药方案，以较低或降低的剂量和/或按包括较不频繁的给药的给药方案重新开始化合物A的施用。在一些实施方案中，在重新开始循环疗法的情况下，将所述剂量减少或降低至少或至少约或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或60％。在一些实施方案中，如果在暂停所述细胞疗法之前的剂量是2mg(例如给予5/7天)，则将所述剂量降低至1mg(给予5/7天)。在一些方面，如果血液毒性的严重程度使得循环疗法的暂停大于4周，则可以永久中止循环疗法。
在一些实施方案中，可以向所述受试者施用一种或多种药剂以治疗、改善或减轻与血液毒性相关的一种或多种症状。在一些情况下，向所述受试者施用髓样生长因子(例如G-CSF或GM-CSF)，直到血液毒性改善为止。此类疗法的例子包括非格司亭或培非格司亭。在一些方面，向经历严重中性粒细胞减少症或发热性中性粒细胞减少症(包括任何持续时间的任何3级或更高级的中性粒细胞减少症)的受试者施用此类药剂。
F.非血液毒性
在一些方面，毒性结局是化合物A的施用后的一种或多种非血液毒性，或者与所述非血液毒性相关，或者指示所述非血液毒性。非血液毒性的例子包括但不限于燃瘤反应、感染、肿瘤溶解综合征、心脏实验室异常、一个或多个血栓栓塞事件(如深静脉血栓形成和肺栓塞)和/或肺炎。
在一些方面，非血液毒性是燃瘤反应(TFR)(有时也称为假性进展)。TFR是携带疾病部位(包括淋巴结、脾和/或肝)的大小突然增加，通常伴有低烧、压痛和肿胀、弥散性皮疹以及在一些情况下外周血淋巴细胞计数的增加。在一些实施方案中，根据不良事件通用术语标准(3.0版；美国国家癌症研究所，美国马里兰州贝塞斯达)对TFR进行分级。在一些实施方案中，TFR分级如下：1级，轻度疼痛，不妨碍功能；2级，中度疼痛，疼痛或镇痛药，妨碍功能但不妨碍日常生活活动(ADL)；3级，重度疼痛，疼痛或镇痛药，妨碍功能并且妨碍ADL；4级，残疾；5级，死亡。在一些实施方案中，可以向所述受试者施用一种或多种药剂(如皮质类固醇、NSAID和/或麻醉性镇痛药)以治疗、改善或减轻与TFR相关的一种或多种症状。
在一些方面，非血液毒性是肿瘤溶解综合征(TLS)。在一些实施方案中，可以根据由Cairo-Bishop分级系统(Cairo和Bishop(2004)Br J Haematol,127:3-11)规定的标准对TLS进行分级。在一些实施方案中，可以向受试者给予静脉补液(hydration)以减少高尿酸血症。
在一些实施方案中，可以例如通过监测ECGS、LVEF以及监测肌钙蛋白-T和BNP的水平来监测受试者的心脏毒性。在一些实施方案中，如果观察到在一种或多种心脏症状的情况下肌钙蛋白-T和/或BNP水平升高，则可能发生潜在地可能需要控制或暂停化合物A的心脏毒性。
在所提供的方法的一些实施方案中，如果确定受试者展现出非血液毒性(如TFR或其他非血液毒性或其特定等级)，则可以改变使用化合物A的循环治疗。在一些方面，如果在化合物A的施用后所述受试者具有3级或更高级的非血液毒性(如3级或更高级TFR)，则改变所述循环疗法。在一些实施方案中，化合物A的施用被永久停止，或者暂停直至毒性的体征或症状得到缓解、减少或降低。可以对所述受试者进行持续监测以评估毒性的一种或多种体征或症状。在一些情况下，如果毒性消退或降低，则可以在暂停循环疗法之前以相同剂量或给药方案，以较低或降低的剂量和/或按包括较不频繁的给药的给药方案重新开始化合物A的施用。在一些实施方案中，在重新开始循环疗法的情况下，将所述剂量减少或降低至少或至少约或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或60％。在一些实施方案中，如果在暂停所述细胞疗法之前的剂量是2mg(例如给予5/7天)，则将所述剂量降低至1mg(给予5/7天)。在一些实施方案中，如果即使在降低剂量后仍再次发生3级毒性，则可以进一步降低剂量。在一些实施方案中，如果即使在降低剂量后仍再次发生4级毒性，则可以永久中止循环疗法。在一些方面，如果血液毒性的严重程度使得循环疗法的暂停大于4周，则可以永久中止循环疗法。
V.制品和试剂盒
还提供制品，其含有化合物A以及用于免疫疗法的组分(例如，抗体或其抗原结合片段或T细胞疗法，例如工程化的细胞)和/或其组合物。所述制品可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物，所述组合物自身或与另一种组合物组合地有效治疗、预防和/或诊断病症。在一些实施方案中，所述容器具有无菌接入端口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶(包括具有可被注射针刺穿的塞子的那些)或用于口服施用剂的瓶子或小瓶。标签或包装说明书可以指示，将组合物用于治疗疾病或病症。
所述制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括用于免疫疗法(例如T细胞疗法)的工程化的细胞；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括化合物A。
在一些实施方案中，所述第一容器包含第一组合物和第二组合物，其中所述第一组合物包含用于免疫疗法的工程化细胞的第一群体(例如CD4+T细胞疗法)，并且所述第二组合物包含工程化细胞的第二群体，其中所述第二群体可以与所述第一群体分开进行工程化(例如CD8+T细胞疗法)。在一些实施方案中，所述第一和第二细胞组合物含有确定比率的工程化细胞(例如CD4+和CD8+细胞)(例如，1:1比率的CD4+:CD8+CAR+T细胞)。
所述制品还可以包括包装说明书，其指示组合物可以用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可以包括另一种或相同的容器，所述另一种或相同的容器包含药学上可接受的缓冲剂。所述容器还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
VI.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号以及其他技术和科学术语或用辞意图具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情形中，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，向其施用化合物A、工程化的细胞或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疾病或病症或障碍或者与之相关的症状、不利影响或结果或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不意味着完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如B细胞恶性肿瘤)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。明显的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可以延迟晚期B细胞恶性肿瘤，如转移的发生。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进展。
如本文所用，当与除了目的条件或参数以外其他都相同的条件相比时，或者可替代地，如与另一种条件相比，“抑制”功能或活性是降低功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低肿瘤的生长速率。
在施用的情况下，药剂(例如，工程化细胞或抗PD-L1或抗原结合片段或其药物配制品或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，工程化细胞或抗PD-L1或抗原结合片段或其药物配制品或组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下等因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、以及所施用的免疫调节多肽或工程化细胞。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用化合物A、工程化的细胞(例如细胞疗法)或组合物。
“预防有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中，有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或在疾病较早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的不能转变的限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括所述限值中的之一或两者的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(如序列表所示)是指，在使用标准比对算法(例如，GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导，鉴定相应的残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已将其引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群体针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如抗体)和针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能包括将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指靶向赛拉隆蛋白的两种或更多种产物、物质或化合物的任何混合物，其包括细胞。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)将T细胞疗法施用至患有B细胞恶性肿瘤的受试者，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞；以及
(b)随后向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000861
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：
第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及
包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
2.一种治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0003727106220000862
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，所述受试者在所述化合物的施用之前已经被施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按照循环方案进行，所述循环方案包括：
第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及
包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中在所述第一施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中在所述第二施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约或大于三个月。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约三个月。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用在所述T细胞疗法在所述受试者中的峰值扩增时或之前起始。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述T细胞疗法的峰值扩增是在施用所述T细胞疗法之后为或约11天与为或约15天之间。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约15天之间开始，包含端值。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约11天之间开始，包含端值。
11.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天与为或约15天之间开始，包含端值。
12.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天开始。
13.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天开始。
14.根据实施方案1-9和11中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约15天开始。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述暂停期在施用所述T细胞疗法之后第21天开始。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述暂停期持续直至所述受试者的B细胞血液计数水平恢复至与在所述第一施用期之前测量的水平相同或大致相同的水平。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述暂停期为约一周。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后29天开始。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
20.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
21.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
22.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
23.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
24.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐。
26根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的水合物。
27.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的溶剂化物。
28.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
29.根据实施方案1-5和7-28中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述癌症已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约3个月。
30.根据实施方案29所述的方法，其中如果所述受试者已经在3个月实现完全反应(CR)，则所述时间段在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约3个月。
31.根据实施方案1-5和7-28中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约六个月。
32.根据实施方案1-5和7-28中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约6个月之前在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述癌症已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约6个月。
33.根据实施方案32所述的方法，其中如果所述受试者已经在6个月时实现完全反应(CR)，则所述时间段在开始施用所述T细胞疗法之后延长为或约6个月。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中即使所述受试者在所述时间段结束之前的时间点已经实现完全反应(CR)，所述第二施用也继续进行。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中在所述化合物的施用起始时，所述受试者在所述T细胞疗法的施用后未展现严重毒性。
36.根据实施方案35所述的方法，其中：
所述严重毒性是严重细胞因子释放综合征(CRS)，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级CRS；和/或
所述严重毒性是严重神经毒性，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级神经毒性。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中如果所述受试者在所述化合物的施用后展现毒性，任选地血液毒性，则暂停所述化合物的施用和/或修改所述循环方案。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述毒性选自严重中性粒细胞减少症，任选地发热性中性粒细胞减少症、延长的3级或更高级中性粒细胞减少症。
39.根据实施方案37或38所述的方法，其中在所述受试者不再展现所述毒性后，重新开始所述化合物的施用。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述NHL包括侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、DLBCL-NOS，任选地转化的惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排和DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有小于或等于1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG)状态。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述化合物是口服施用的。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所述CD19是人CD19。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含与CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
48.根据实施方案47所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
49.根据实施方案47或实施方案48所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区。
50.根据实施方案49所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。
51.根据实施方案49或实施方案50所述的方法，其中所述共刺激结构域是或包含人4-1BB的信号传导结构域。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中：
所述CAR包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域,；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB，任选地人4-1BB；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中：
所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括4-1BB信号传导结构域，任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。
55.根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含免疫球蛋白铰链或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成，或者包含约15个或更少的氨基酸。
56.根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4铰链，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成和/或包含约15个或更少的氨基酸。
57.根据实施方案55或实施方案56所述的方法，其中所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸和/或包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成。
58.根据实施方案52-57中任一项所述的方法，其中所述间隔子具有以下或由其组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或前述任一项的变体，所述变体具有与前述任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
59.根据实施方案52-58中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含SEQ IDNO:12或其变体，所述变体具有与SEQ ID NO:12的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
60.根据实施方案52-59中任一项所述的方法，其中所述初级信号传导结构域包含具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的SEQ ID NO:13或14或15。
61.根据实施方案52-60中任一项所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和/或GNTLPYTFG(SEQID NO:37)的CDRL3序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQID NO:39)的CDRH2序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。
62.根据实施方案52-61中任一项所述的方法，其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，并且任选地其中所述scFv包含含有SEQ ID NO:41的VH和含有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的VL。
63.根据实施方案52-61中任一项所述的方法，其中所述scFv具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞或5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或者至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
67.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约1x108个CAR表达细胞。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是肠胃外施用，任选地静脉内施用。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞并且所述剂量的施用包括施用多种单独组合物，所述多种单独组合物包括包含所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及包含所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
73.根据实施方案72所述的方法，其中：
将所述第一组合物和所述第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
74.根据实施方案72或实施方案73所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
75.根据实施方案72-74中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
76.根据实施方案72-74中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
77.根据实施方案72-76中任一项所述的方法，其中所述第一组合物是在所述第二组合物之前施用。
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中，在所述施用之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
79.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，所述方法还包括，紧临在所述施用之前，将淋巴细胞清除疗法施用至所述受试者，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
80.根据实施方案78或实施方案79所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2，且包含端值的环磷酰胺，和/或为约20-40mg/m2，任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。
81.根据实施方案78-80中任一项所述的方法，其中：
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
82.根据实施方案1-81中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
83.根据实施方案1-82中任一项所述的方法，其中：
至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)，所述完全反应是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述CR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者截至六个月时保持反应，保持CR，和/或存活或无进展存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为大于九个月；和/或
至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述OR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者截至六个月时保持反应或存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月。
84.根据实施方案42-83中任一项所述的方法，其中，在所述剂量的细胞施用时或紧临在施用之前，在用针对NHL的一种或多种先前疗法、任选地除了另一剂量的表达CAR的细胞以外的一种、两种或三种先前疗法治疗后，所述受试者已经在缓解后复发，或者变得是所述先前疗法难治的。
85.根据实施方案42-84中任一项所述的方法，其中，在所述剂量的细胞施用时或施用之前：
所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；
所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有化学难治性淋巴瘤、任选地化学难治性DLBCL；
和/或
所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全缓解(CR)。
86.根据实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用：
逆转所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型；
预防、抑制或延迟所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的发作；
降低所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的水平或程度；或者
减少所述受试者中具有耗竭表型的CAR表达T细胞的总数量的百分比。
87.根据实施方案1-86中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用的起始是在所述T细胞疗法的施用之后进行的，并且在所述化合物的施用或其起始之后，所述受试者展现所述受试者中所述CAR表达T细胞的抗原或肿瘤特异性活性或功能的恢复或拯救，任选地其中所述恢复、拯救和/或所述化合物的施用的起始是在所述受试者中或所述受试者的血液中的CAR表达T细胞已经展现耗竭的表型之后的时间点。
88.根据实施方案1-87中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和/或持续时间来施用：
(a)在使所述T细胞暴露于CD19抗原或暴露于抗原受体特异性因子之后，与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，实现所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞的抗原特异性或抗原受体驱动的活性的增加，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者
(b)在使所述T细胞暴露于CD19抗原或暴露于抗原受体特异性因子之后，如与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，预防、抑制或延迟所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞中的耗竭表型的发作，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者
(c)如与不存在对所述受试者的所述施用的情况相比，逆转所述受试者中耗竭的T细胞中的耗竭表型，任选地所述T细胞包括表达所述CAR的T细胞。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和/或持续时间来施用：(i)实现所述活性增加，以及(ii)预防、抑制或延迟所述耗竭表型的所述发作和/或逆转所述耗竭表型。
90.根据实施方案88或89所述的方法，其中所述受试者中的T细胞包括表达所述CAR的T细胞，和/或所述抗原是CD19。
91.根据实施方案86-90中任一项所述的方法，其中关于T细胞或T细胞群，所述耗竭表型包括：
与相同条件下的参考T细胞群相比，一种或多种耗竭标记、任选地2、3、4、5或6种耗竭标记在所述一个或多个T细胞上的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述耗竭标记的表面表达的T细胞的T所述群体的百分比的增加；或者
与相同条件下的参考T细胞群相比，在暴露于CD19抗原或抗原受体特异性因子时，由所述T细胞或T细胞群展现的活性的水平或程度的降低。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述水平、程度或百分比的增加是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。
93.根据实施方案91所述的方法，其中所述水平、程度或百分比的降低是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。
94.根据实施方案91-93中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群是已知具有未耗竭表型的T细胞群，是幼稚T细胞群，是中枢记忆T细胞群，或者是干细胞中枢记忆T细胞群，任选地来自与衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者相同的受试者或者与所述受试者物种相同。
95.根据实施方案91-94中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群(a)是受试者匹配的群体，其包含从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者的血液分离的大量T细胞，任选地其中所述大量T细胞不表达所述CAR，和/或(b)是在接受一定剂量的表达所述CAR的T细胞的施用之前，从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者获得的。
96.根据实施方案91-95中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群在其施用至所述受试者之前是包含所述T细胞疗法的样品的组合物，或者包含表达所述CAR的T细胞的药物组合物，任选地其中所述组合物是冷冻保存的样品。
97.根据实施方案91-96中任一项所述的方法，其中所述一种或多种耗竭标记是抑制性受体。
98.根据实施方案91-97中任一项所述的方法，其中所述一种或多种耗竭标记选自PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、2B4、CD160、CD39、VISTA和TIGIT。
99.根据实施方案91-98中任一项所述的方法，其中所述活性或为一种炎性细胞因子或炎性细胞因子组合的增殖、细胞毒性或产生中的一种或多种，任选地其中所述一种细胞因子或细胞因子组合选自IL-2、IFN-γ和TNF-α。
100.根据实施方案91-99中任一项所述的方法，
其中暴露于所述CD19抗原或抗原受体特异性因子包括与所述CD19抗原或抗原受体特异性因子、任选地结合所述CAR的抗原结合结构域的药剂一起孵育。
101.根据实施方案100所述的方法，其中暴露于所述CD19抗原或抗原受体特异性因子包括使所述T细胞暴露于表达CD19抗原的靶细胞，任选地所述癌症的细胞。
VIII.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1：在化合物B和化合物A的存在下对抗CD19 CAR表达T细胞中的Aiolos和 Ikaros转录因子的药效学反应的评估
含有抗CD19 CAR表达T细胞的T细胞组合物是通过如下过程从来自三名健康人成年供体的白细胞单采术样品产生的，所述过程包括从样品中基于免疫亲和力选择T细胞(包括CD4+和CD8+细胞)，从而产生两种组合物，分别富集CD8+和CD4+细胞。在(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)或3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮(化合物B)的存在下孵育所述细胞，并且评估转录因子Ikaros和Aiolos的表达。
将富集CD4+和CD8+组合物的细胞用抗CD3/抗CD28珠单独激活，并用编码抗CD19CAR的载体进行慢病毒转导。抗CD19 CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区)、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体中的表达构建体还含有编码截短的受体的序列，所述序列用作CAR表达的替代标记，其通过T2A核糖体跳跃序列与CAR序列分开。然后在刺激试剂的存在下单独孵育转导的群体用于细胞扩增。将扩增的CD8+细胞和CD4+细胞分别配制并冷冻保存，并且储存。在使用之前将来自每名供体的冷冻保存的CD4+和CD8+抗CD19 CAR表达细胞解冻，并以大约1:1的CAR+CD4+:CD8+比率合并。
在浓度范围为10至10000nM的3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮(化合物B)或(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)或者媒介物对照的存在下，将生成的CAR+T细胞组合物的大约2.5×105个细胞用1μg/ml CAR特异性抗独特型抗体在37℃、5％CO2下刺激过夜。过夜孵育后，将抗CD19 CAR表达T细胞用抗体染色，并通过流式细胞术分析，以评估CD4+CAR+或CD8+CAR+细胞中Ikaros和Aiolos的细胞内水平，如通过中值荧光强度(MFI)所测量。将Ikaros和Aiolos的中值荧光强度(MFI)值归一化并计算为相对于媒介物对照的百分比。
在与化合物B或化合物A一起孵育之后，在抗CD19刺激的CAR表达T细胞中观察到细胞内Ikaros和Aiolos表达的浓度依赖性降低(图1)。如根据将Aiolos或Ikaros MFI降低至其在不存在抑制剂的情况下的最大MFI的50％的抑制剂浓度确定的，计算降低Aiolos和Ikaros表达的EC50。表E1中示出化合物B和化合物A的EC50值，作为5名供体的平均值(示出供体中的范围，基于95％置信区间)。结果显示，在化合物介导的Ikaros和Aiolos在表达CAR的T细胞中的降解方面，化合物A的效力是化合物B的大约10-20倍。
表E1.CAR+T细胞中的Aiolos和Ikaros EC50(nM)。
化合物B 化合物A
Aiolos 52.7(41.7-66.5) 2.5(1.6-3.96)
Ikaros 59.3(47.6-74.1) 4.0(3.0-5.4)
实施例2：在长期刺激后对免疫调节化合物对CAR T功能的影响的评估
基本上如实施例1所述从三名不同的健康供体产生抗CD19 CAR表达T细胞组合物(含有以1:1比率合并的CD4+和CD8+T细胞)。
为了评估慢性刺激的作用，在6天时间段中通过与30μg/mL板结合的抗独特型(抗ID)抗体一起孵育来刺激抗CD19 CAR表达T细胞，参见例如WO 2018/023100。将从第6天培养物收获的细胞或者来自同一供体的尚未进行慢性刺激的新鲜解冻的抗CD19CAR表达细胞与K562.CD19靶细胞共培养5天，并且评估细胞裂解活性和产生细胞因子的能力。如图2A中所示，如与来自同一供体的新鲜解冻的抗CD19 CAR表达T细胞的细胞因子产生相比，在慢性刺激的细胞(例如，展示耗竭表型)中IFN-γ和IL-2分泌的水平有所降低。与新鲜解冻的细胞相比，慢性刺激的抗CD19 CAR表达细胞的细胞裂解活性也有所降低，如通过减少的肿瘤细胞数量所证实(图2B)。结果与以下结论一致：6天的培养使CAR-T细胞经历了慢性刺激条件，导致T细胞处于耗竭状态。为了使细胞经历慢性刺激条件，将CAR+T细胞与30μg/mL板结合的抗独特型(抗ID)抗体一起孵育(参见例如WO2018/023100)，并在滴定量的3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代-4H-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮(化合物B)或(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)的存在下在37℃孵育6天的时间段。
对于三名供体，评估培养期间T细胞的增殖，并示于图2C中(平均值±SEM)。如图所示，免疫调节化合物的存在降低了CAR T细胞计数。在处理的第6天，通过使用live/dead染料的流式细胞术评估活力。如图2D中所示(平均值±SEM)，当用3μg/mL抗ID(左小图)或30μg/mL抗ID(右小图)进行刺激时，免疫调节化合物对细胞活力没有影响。总之，结果展现出免疫调节化合物对细胞倍增的作用，并不影响细胞活力。
为了阐明对细胞周期的可能影响，在刺激和用免疫调节化合物处理3天之后，使用EDU掺入2小时来确定细胞周期。图2E中的结果显示，用免疫调节化合物处理增加了细胞周期G1期CAR T细胞的百分比。在渐增浓度的免疫调节化合物的情况下，细胞周期G1期的细胞百分比示于图2F中(左小图3μg/mL抗ID，右小图30μg/mL抗ID)。不希望受到理论的束缚，当用免疫调节化合物处理时，CAR T细胞在细胞周期的G1期的积累可能是免疫调节化合物限制慢性刺激期间耗竭发作的机制之一。
确定了已用30μg/mL抗ID刺激24小时或72小时的CAR T细胞中的细胞内细胞因子水平。在高尔基体抑制剂的存在下，将T细胞与抗ID缀合的珠培养4小时。通过流式细胞术确定IFNγ、穿孔素、颗粒酶B和IL-2的细胞内细胞因子水平。如图2G中所示，用免疫调节化合物处理细胞可增加效应细胞因子(IFNγ、穿孔素、颗粒酶B)的细胞内表达，如通过平均荧光强度确定的，但IL-2产生没有显著变化。当测量呈细胞因子阳性的细胞的百分比时，观察到类似的结果。
实施例3：在长期刺激期间在同时处理后免疫调节化合物对CAR T功能的作用
基本上如实施例1中所述产生抗CD19 CAR表达T细胞。为了使细胞经历慢性刺激条件，将CAR+T细胞在(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)或媒介物对照的存在下用30μg/mL板结合的抗独特型(抗ID)抗体(参见例如WO2018/023100)刺激6天，以诱导慢性刺激。在6天的培养时间段后，将抗CD19 CAR表达T细胞从培养物取出，并在浓度范围为0.001μM至10μM的化合物A或媒介物对照的存在下与用CD19转导的K562细胞(K562.CD19)、Raji肿瘤细胞和Granta-519肿瘤细胞(以再激发CAR-T细胞)以2.5:1的效应子与靶标比率(除非另有指示)一起孵育长达10天。将K562.CD19、Raji和Granta-519肿瘤细胞用染料标记以允许在测定期间通过显微镜检查监测肿瘤细胞裂解。平行地，将尚未经历慢性刺激条件的新鲜解冻的抗CD19 CAR表达T细胞与球状体一起孵育，作为对照。在不同时间评估细胞的细胞裂解功能、CAR T细胞数量和细胞因子产生。
在伴随用化合物A同时处理的长期慢性刺激之后，在用表达CD19的靶细胞再激发后评估CAR T细胞的Ikaros表达或CAR T功能。
A.Ikaros表达
通过使用针对Ikaros的抗体的细胞内流式细胞术分析，测量已经在化合物A(1nM、10nM或100nM)的存在下经历慢性刺激的CAR T细胞中Ikaros的表达。如图3A中所示，在用100nM而不是10nM化合物A处理的慢性刺激的细胞中维持Ikaros表达的降低。
B.细胞裂解活性
将已经在化合物A(0.001μM或0.01μM)的存在下同时用抗ID刺激6天的CAR T细胞洗去化合物，并在不存在化合物A的情况下与CD19+肿瘤细胞以1:1的效应子与靶标(E:T)比率共培养。所评估的CD19+肿瘤细胞包括用CD19转导的K562细胞(K562.CD19)、Raji细胞或Granta-519细胞。如图3B中所示，在用表达CD19的靶细胞再激发之前与不存在化合物的情况(对照)相比，已经在化合物A的存在下同时孵育的慢性刺激的细胞的细胞裂解活性有所改进，如通过随时间变化的肿瘤细胞数量所测量。这些结果与以下发现一致：免疫调节化合物可以减少或预防响应于慢性刺激的耗竭表型的发展。
C.球状体肿瘤生长测定
将在化合物A(0.001μM或0.01μM)的存在下同时用抗ID刺激6天的CAR T细胞通过与Granta-519肿瘤球状体一起孵育来共培养，并在不同时间点评估CAR T细胞的细胞裂解功能和细胞因子功能。对于比较，还评估已经在1μM或0.1μM化合物B的存在下以类似方式用抗ID慢性刺激的细胞的细胞裂解活性。监测在与CAR-T细胞共培养后的不同时间的肿瘤球状体大小的平均测量值。如图3C中所示，在用抗ID的慢性刺激期间同时用化合物A处理产生了具有改善的细胞裂解功能的CAR T细胞，以减少Granta-519球状体的生长。9天之后的平均肿瘤体积示于图3D中，其证实，化合物A显著增加了CAR-T细胞针对Granta-519肿瘤球状体的细胞裂解功能。图3E显示在慢性刺激且同时与化合物A一起孵育后在与抗CD19 CAR T细胞共培养时的第9天，作为三维球状体生长的Granta-519肿瘤细胞的代表性图像。在用化合物A同时处理的情况下，细胞裂解功能的改进大于化合物B(图3C)。
从上文已经与CD19肿瘤球状体共培养5天的慢性刺激的CAR T细胞的上清液测量细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)。与对照细胞(尚未用化合物A免疫调节化合物同时处理的慢性刺激的细胞)相比的log2倍数变化示于图3F中。图3G显示来自上清液的平均化的IFNγ浓度，其是在共培养5天后测量，如从来自3名供体和2次独立实验的合并数据所确定(每次处理之间的统计学上显著的差异指示为：*P<.05，***P<.001，并且****P<.0001)。如图所示，在与用化合物A同时处理的慢性刺激的细胞一起孵育的培养物中，存在统计学上显著的IFNγ增加。
结果进一步支持，在可以促进耗竭的条件期间(如在慢性刺激期间)免疫调节化合物的存在可以改善或保留CAR T细胞功能，并限制、减少或预防CAR T细胞耗竭。综上所述，上述结果支持使用免疫调节化合物(像化合物A)来改善CAR T细胞功能，包括在可能潜在地引起耗竭的条件下，如响应于CAR抗原。化合物A的这种作用可能优于其他免疫调节化合物，并且由于化合物A对Ikaros降解的10-20倍效力，这种作用也可以以较低剂量来实现。
D.基因表达
在如上所述的共培养之后5天从肿瘤球状体分选的抗CD19 CAR T细胞的基因表达分析是通过对从长期刺激的CAR表达T细胞分离的RNA制备的互补DNA(cDNA)样品或对尚未经历长期刺激的CAR表达T细胞进行的RNA测序(RNA-seq)来分析的。在Illumina NextSeq系统上对RNA-seq的文库进行测序。将读数映射至人参考基因组GRCh38，并且在Array Studio中对基因表达水平进行定量。使用DESeq2进行差异性表达(DE，对于RNA-seq)分析。
图3H中的火山图显示相比于进行慢性刺激并且与长期刺激测定中尚未刺激的那些相比较的抗CD19 CAR+T细胞中的基因表达(x轴)，在长期刺激和随后与化合物A一起孵育二者后相对于慢性刺激对照(y轴)的抗CD19 CAR-T细胞中的基因表达的log2倍数变化(log2FC)。图3I显示在慢性刺激期间通过慢性刺激和通过10nM化合物A诱导的对基因表达谱(log2倍变化)的作用的比较。左上象限中的点表示通过慢性刺激诱导的基因，并且右下象限中的点表示通过化合物A逆转的基因。
使用clusterProfiler对差异性表达的基因进行途径富集分析。图3J显示京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)途径富集分析，其中与T细胞功能相关的途径被突出显示。使用KEGG对抗CD19 CAR T细胞RNA-seq数据的途径分析揭示，T细胞功能中涉及的途径被富集。这些结果与如下发现一致：在慢性刺激后，T细胞功能中涉及的途径中涉及的基因的表达变化可以通过与化合物A同时处理而被化合物A逆转。
实施例4：在长期刺激后免疫调节化合物拯救CAR T功能的作用
将如实施例1中所述产生的来自三名供体的抗CD19 CAR表达T细胞在诱导慢性刺激的条件下进行刺激(以产生功能减退性耗竭的T细胞)，然后随后用(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)或媒介物对照处理(拯救)。基本上如实施例3中所述但是在不存在化合物A的情况下，通过将CAR T细胞用30μg/mL板结合的抗独特型(抗ID)抗体刺激6天来进行长期慢性刺激。在慢性刺激后，将CAR-T细胞在化合物A的存在下用表达CD19的靶细胞再激发，并且评估细胞裂解活性或细胞因子产生。
A.细胞裂解活性
将用抗ID刺激6天的CAR T细胞与CD19+肿瘤细胞以1:1的效应子与靶标(E:T)的比率在化合物A(0.001μM或0.01μM)的存在下进行共培养。评估的CD19+肿瘤细胞包括用CD19转导的K562细胞(K562.CD19)、Raji细胞或Granta-519细胞。如图4A中所示，与不存在化合物的情况(对照)相比，当在化合物A的存在下用表达CD19的细胞对慢性刺激的细胞进行再激发时，存在细胞裂解活性的统计学上显著的改善，如通过随时间变化的肿瘤细胞数量所测量。这些结果与如下发现一致：免疫调节化合物可以拯救由慢性刺激引起的耗竭的表型。
B.球状体肿瘤生长测定
将已经用抗ID刺激6天的CAR T细胞通过在存在或不存在化合物A(0.001μM或0.01μM)的情况下与Granta-519肿瘤球状体一起孵育来进行共培养。在不同时间点评估细胞的细胞裂解功能和细胞因子功能。对于比较，还评估已经以类似方式用抗ID进行慢性刺激，之后在1μM或0.1μM化合物B的存在下进行共培养的细胞的细胞裂解活性。评估在与CAR-T细胞共培养之后第9天的肿瘤球状体大小的平均化的测量值。如图4B中所示，使用化合物A的拯救处理改进CAR T细胞的细胞裂解，以减少Granta-519球状体生长。在用化合物A进行拯救处理后，对细胞裂解功能的改进比用化合物B更大。从上文已经与CD19肿瘤球状体共培养5天的慢性刺激的CAR T细胞的上清液测量细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)。与对照细胞(尚未用免疫调节化合物处理的慢性刺激的细胞)相比的log2倍数变化示于图4C中。如图所示，在用表达CD19的肿瘤球状体再激发期间，在与随后用化合物A处理的慢性刺激细胞一起孵育的培养物中，存在IFNγ的统计学上显著的增加。
进一步使用A549.CD19肿瘤球状体模型来阐明化合物的T细胞调节活性。A549.CD19肿瘤球状体生长对用免疫调节化合物的单一疗法处理不敏感。在存在化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，将已经用抗ID刺激6天的CAR T细胞通过与A549.CD19肿瘤球状体一起孵育来进行共培养。评估在与CAR-T细胞共培养后第9天，肿瘤球状体的大小的平均化的测量值。如图5A中所示，使用化合物A的拯救处理改善了CAR T细胞的细胞裂解，以减少A549.CD19球状体生长。在第5天测量的与肿瘤球状体的共培养物中CAR T细胞的数量通过用化合物A处理而增加(图5B)。图5C显示在与慢性刺激的抗CD19 CAR T细胞共培养9天以及化合物A拯救孵育后，Granta-519球状体和A549.CD19球状体的代表性图像。图5D显示在与抗CD19 CAR T细胞和化合物A共培养后，随时间变化的肿瘤球状体大小的平均化的测量值。
从上文已经与CD19肿瘤球状体共培养5天的慢性刺激的CAR T细胞的上清液测量细胞因子(IFNγ、IL-2和TNFα)。与对照细胞(尚未用免疫调节化合物同时处理的慢性刺激的细胞)相比的log2倍数变化示于图5E中。如图所示，在用表达CD19的肿瘤球状体再激发期间，在与随后用化合物A处理的慢性刺激细胞一起孵育的培养物中，存在IFNγ的统计学上显著的增加。图5F显示从3名供体和2次独立实验的数据合并的得自第5天的共培养上清液的平均IFNγ浓度(每次处理之间的统计学上显著的差异指示为*P<.05且****P<.0001)。
这些结果进一步支持，免疫调节化合物(例如化合物A)可以拯救或逆转已变得耗竭的CAR T细胞。在涉及已知对免疫调节化合物敏感的Granta球状体以及对免疫调节化合物具有抗性的A549.CD19球状体二者的生理相关3D球状体肿瘤培养模型中观察到此结果。尽管所有评估的免疫调节化合物都展现拯救CAR T细胞功能的能力，但是化合物A展现与化合物B相比更好的拯救抗肿瘤功能的能力，并且由于在低得多的剂量下观察到所述作用而是更强效的。
C.基因表达
基本上如实施例3中所述，通过RNA-seq进行基因表达分析。图5G的火山图显示在慢性刺激期间通过每种拯救孵育诱导的差异性表达的基因。图5H显示通过10nM化合物A拯救处理诱导的对基因表达谱的作用(log2倍变化)的比较。左上象限中的点表示通过慢性刺激诱导的基因，并且右下象限中的点表示通过化合物A逆转的基因。图5I显示KEGG途径富集分析，其中与T细胞功能和细胞周期相关的途径被突出显示。
这些结果与如下发现一致：在慢性刺激后，T细胞功能中涉及的途径中涉及的基因的表达变化也可以通过化合物A用拯救处理被逆转，与如实施例3中所述的用化合物A同时处理后的结果类似。有趣的是，对拯救实验的KEGG分析发现，在慢性刺激诱导的基因集合中富集的特定细胞增殖途径中的变化可以被化合物A逆转。
实施例5：在CAR T细胞抗性系中免疫调节化合物对抗CD19 CAR T细胞功能的作用
在(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮(化合物A)(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，将抗CD19 CAR T细胞与RLCD19+肿瘤细胞以1:1的效应子与靶标(E:T)的比率共培养。通过随时间变化的肿瘤细胞数量测量急性细胞裂解活性。如图6A中所示，RL肿瘤细胞系对在0.01μM或0.1μM剂量下的化合物A单一疗法敏感。在化合物A的存在下，CAR T细胞与RL抗性肿瘤细胞的共培养改善了CART细胞的细胞裂解功能。
还在球状体模型中评估细胞裂解活性。在添加5,000个抗CD19 CAR T细胞之前48小时，将约5,000个RL细胞(1:1的E:T比)铺板。在化合物B(1μM)或化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)的存在下，将抗CD19 CAR T细胞与RL肿瘤球状体共培养。在与CAR T细胞一起孵育后第4天评估肿瘤大小。图6B显示，RL肿瘤球状体对免疫调节化合物，特别是1μM剂量的化合物B或者0.01μM或0.1μM剂量的化合物A是敏感的。在所有所测试的剂量下，使用抗CD19 CART细胞与免疫调节化合物的组合观察到肿瘤大小的减小。
进一步使用RL细胞评估免疫调节化合物拯救或逆转抗CD19 CAR T细胞免于耗竭的能力。将抗CD19 CAR表达T细胞在诱导慢性刺激的条件下刺激，然后用化合物B(1μM)或化合物A(0.001μM、0.01μM或0.1μM)或媒介物对照处理(拯救)。基本上如实施例3所述，通过用30μg/mL板结合的抗独特型(抗ID)抗体刺激CAR T细胞6天来进行长期慢性刺激。在慢性刺激后，将CAR-T细胞与RL细胞在化合物B或化合物A的存在下共培养。通过测量培养物中的肿瘤细胞数量来随时间评估细胞裂解活性。如图6C中所示，使用化合物B或化合物A的拯救处理实质性地改进CAR T细胞的细胞裂解活性，以减少RL细胞生长。这些结果证实，所评估的免疫调节化合物可以拯救慢性刺激的抗CD19CAR T细胞，以允许RL抗性系的清除。
实施例6：细胞免疫调节化合物对急性CAR T细胞功能的作用
在不存在化合物A的存在下孵育后，评估抗CD19 CAR T细胞的效应子和增殖活性。如实施例1中所述生成抗CD19 CAR+T细胞。
A.细胞因子产生
将抗CD19 CAR T细胞用针对CAR的激动性抗体(30μg/mL；WO2018/023100)刺激同时用媒介物对照(ctrl)或化合物A处理。在处理3天后使用细胞内细胞因子染色(ICS)来测量细胞内细胞因子。图7A显示细胞因子表达的热图，如基于细胞因子的平均荧光强度(MFI)相对于培养中的媒介物对照的log2倍变化所描绘。结果证实，化合物A加强抗CD19 CAR T细胞的效应细胞因子产生。
B.细胞裂解活性
在用化合物A处理3天后，使用细胞裂解测定将抗CD19 CAR T细胞与Raji或Granta-519淋巴瘤细胞共培养。为了评估细胞裂解活性，将靶细胞用NucLight Red(NLR)标记，以允许通过荧光显微镜检查来追踪。如通过动力学荧光显微镜检查(使用
Figure BDA0003727106220000981
活细胞分析系统，Essen Bioscience)随时间变化的荧光信号损失所确定，通过测量200小时内活靶细胞的损失来评估杀伤活性。将肿瘤细胞数量针对零时刻归一化，并随时间进行测量(平均值±SEM)。
图7B描绘如与媒介物对照(无化合物A)和仅肿瘤相比，用1nM、10nM或100nM化合物A处理的抗CD19 CAR T细胞的肿瘤细胞数量。结果显示，在此测定中将抗CD19CAR T细胞与化合物A一起孵育改进它们针对靶细胞的细胞裂解活性。
C.增殖
通过使用Click-iTTM EdU细胞增殖试剂盒标记细胞，之后通过流式细胞术分析所制备细胞的DNA含量，来测量抗CD19 CAR T细胞的细胞周期和增殖。使用
Figure BDA0003727106220000982
活细胞分析系统随时间测量抗CD19 CAR T细胞的数量。
基于对细胞数量的分析，图7C显示如与媒介物对照(无化合物A)相比，在与1nM、10nM或100nM化合物A一起孵育后，抗CD19 CAR T细胞的倍数变化。如图所示，用化合物A处理减少抗CD19 CAR T细胞的增殖。为了进一步评估对减少增殖的作用，通过流式细胞术通过分析DNA含量来测量细胞周期。图7D绘处于G1期的细胞的百分比(平均值±SEM，来自从3名供体和2次独立实验合并的数据)的图。数据显示，在已经用化合物A处理的CAR T细胞中，存在处于G1期的细胞的百分比的统计学上显著的增加(每次处理之间的统计学上显著的差异指示为***P<.001且****P<.0001)。
D.结论
此实施例中的结果显示，在急性激活期间以临床相关浓度用化合物A处理增加抗CD19 CAR T细胞的效应细胞因子产生和细胞裂解功能，但是减慢增殖速率。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0003727106220000991
Figure BDA0003727106220001001
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> T细胞疗法与(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的组合
<130> 735042022440
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/932,500
<151> 2019-11-07
<150> US 63/016,977
<151> 2020-04-28
<160> 59
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (101)

1.一种治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)将T细胞疗法施用至患有B细胞恶性肿瘤的受试者，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞；以及
(b)随后向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003727106210000011
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：
第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，
在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及
包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
2.一种治疗B细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括：向所述受试者施用作为(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的化合物，所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003727106210000012
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、笼形包合物或多晶型物，所述受试者在所述化合物的施用之前已经被施用T细胞疗法，所述T细胞疗法包括一定剂量的表达与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化的T细胞，其中所述化合物的施用在施用所述T细胞疗法之后21天内开始(或被起始)并且按循环方案来进行，所述循环方案包括：
第一施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物持续长达连续三周，
在所述第一施用期结束时开始持续至少一周的暂停期，在此期间不施用所述化合物，以及
包含四周循环的第二施用期，在此期间以约0.1mg至约1.0mg/天每天施用所述化合物，在每个四周循环中持续连续三周。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在所述第一施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述第二施用期中以为或约0.3mg至约0.6mg的量施用所述化合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后延长为或约或大于三个月。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二施用期延长直至或直至约所述T细胞疗法的施用起始后三个月。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在所述T细胞疗法在所述受试者中的峰值扩增时或之前，起始所述化合物的施用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述T细胞疗法的峰值扩增是在施用所述T细胞疗法之后为或约11天与为或约15天之间。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在所述T细胞疗法的施用起始的同一天开始。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约15天之间开始，包含端值。
11.根据权利要求1-8和10中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天与为或约11天之间开始，包含端值。
12.根据权利要求1-8和10中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天与为或约15天之间开始，包含端值。
13.根据权利要求1-8、10和11中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约1天开始。
14.根据权利要求1-8、10和11中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约7天开始。
15.根据权利要求1-8和10-12中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约8天开始。
16.根据权利要求1-8、10和12中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约14天开始。
17.根据权利要求1-8、10和12中任一项所述的方法，其中所述第一施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约15天开始。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述暂停期在施用所述T细胞疗法之后为或约第21天开始。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述暂停期持续直至所述受试者的B细胞血液计数水平恢复至与在所述第一施用期之前测量的水平相同或大致相同的水平。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述暂停期为约一周。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约28天开始。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在施用所述T细胞疗法之后为或约29天开始。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.3mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
26.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.45mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
27.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用和/或在所述第二施用期中施用。
28.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述化合物以为或约0.6mg的量在所述第一施用期中施用且在所述第二施用期中施用。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的药学上可接受的盐。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的水合物。
31.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮的溶剂化物。
32.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述化合物是或包含(S)-3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。
33.根据权利要求1-4和7-32中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约3个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。
34.根据权利要求33所述的方法，其中如果所述受试者已经在3个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约3个月结束。
35.根据权利要求1-4和7-32中任一项所述的方法，其中所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约六个月结束。
36.根据权利要求1-4和7-32中任一项所述的方法，其中如果所述受试者已经在为或约6个月之前在所述T细胞疗法的施用起始后在所述治疗后实现完全反应(CR)或者所述B细胞恶性肿瘤已经在所述治疗后进展或缓解后复发，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。
37.根据权利要求36所述的方法，其中如果所述受试者已经在6个月实现完全反应(CR)，则所述第二施用期在所述T细胞疗法的施用起始后为或约6个月结束。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中即使所述受试者已经在所述第二施用期结束之前的时间点实现完全反应(CR)，仍继续进行所述第二施用期。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中在所述化合物的施用起始时，所述受试者在所述T细胞疗法的施用后未展现严重毒性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中：
所述严重毒性是严重细胞因子释放综合征(CRS)，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级CRS；和/或
所述严重毒性是严重神经毒性，任选地3级或更高级、延长的3级或更高级或者4级或5级神经毒性。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中如果所述受试者在所述化合物的施用后展现毒性，任选地血液毒性，则暂停所述化合物的施用和/或修改所述循环方案。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述毒性选自严重中性粒细胞减少症，任选地发热性中性粒细胞减少症、延长的3级或更高级中性粒细胞减少症。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中在所述受试者不再展现所述毒性后，重新开始所述化合物的施用。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是淋巴瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，任选地其中所述NHL包括侵袭性NHL；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；DLBCL-NOS，任选地转化的惰性的；EBV阳性DLBCL-NOS；富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)；和/或具有MYC和BCL2和/或BCL6重排和DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述CD19是人CD19。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含与CD19特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含ITAM的细胞内信号传导结构域。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链、任选地人CD3-ζ链的信号传导结构域。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)还包含共刺激信号传导区。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28或4-1BB、任选地人CD28或人4-1BB的信号传导结构域。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含人4-1BB的信号传导结构域。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中：
所述CAR包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述共刺激分子任选地是或包括4-1BB，任选地人4-1BB；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域；并且任选地其中所述CAR还包含所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子。
53.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中：
所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括4-1BB信号传导结构域，任选地人4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是CD3ζ信号传导结构域，任选地人CD3ζ信号传导结构域。
54.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的scFv；间隔子；跨膜结构域；源自共刺激分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是4-1BB信号传导结构域；以及源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域任选地是或包括CD3ζ信号传导结构域。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中
所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含免疫球蛋白铰链或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成，或者包含约15个或更少的氨基酸。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4铰链，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成和/或包含约15个或更少的氨基酸。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸和/或包含免疫球蛋白铰链，任选地IgG4，或其修饰的形式的全部或一部分或由其组成。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述间隔子具有以下或由其组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或前述任一项的变体，所述变体具有与前述任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
59.根据权利要求52-58中任一项所述的方法，其中源自共刺激分子的胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或其变体，所述变体具有与SEQ ID NO:12的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的方法，其中源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域包含具有与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的SEQ ID NO:13或14或15。
61.根据权利要求52-60中任一项所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ IDNO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。
62.根据权利要求52-61中任一项所述的方法，其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，并且任选地其中所述scFv包含含有SEQ ID NO:41的VH和含有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的VL。
63.根据权利要求52-61中任一项所述的方法，其中所述scFv具有SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞或5x107至1x108个总CAR表达T细胞，每个都包含端值。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或者至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约5x107个总CAR表达T细胞。
67.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含为或约1x108个CAR表达细胞。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述剂量的细胞是肠胃外施用，任选地静脉内施用。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从所述受试者获得的原代T细胞。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
71.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中基因工程化的T细胞的所述剂量包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞并且所述剂量的施用包括施用多种单独组合物，所述多种单独组合物包括包含所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞中的一种的第一组合物以及包含所述CD4+T细胞或所述CD8+T细胞中的另一种的第二组合物。
73.根据权利要求72所述的方法，其中：
将所述第一组合物和所述第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
74.根据权利要求72或权利要求73所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD4+T细胞。
76.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含所述CD8+T细胞。
77.根据权利要求72-76中任一项所述的方法，其中所述第一组合物是在所述第二组合物之前施用。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中，在所述T细胞疗法的施用之前，已经用淋巴细胞清除疗法对所述受试者进行预调理，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
79.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，所述方法还包括，紧临在所述T细胞疗法的施用之前，将淋巴细胞清除疗法施用至所述受试者，所述淋巴细胞清除疗法包括氟达拉滨和/或环磷酰胺的施用。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2，且包含端值的环磷酰胺，和/或为约20-40mg/m2，任选地30mg/m2的氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天，或者其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用为约500mg/m2的环磷酰胺。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中：
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天；和/或
所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约500mg/m2的环磷酰胺和为约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中：
至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)，所述完全反应是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述CR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者截至六个月时保持反应，保持CR，和/或存活或无进展存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月和/或为大于九个月；和/或
至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)，任选地其中所述OR是持久的，或者在至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述OR的受试者中是持久的，持续为或大于6个月或者为或大于9个月；和/或
其中至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者截至六个月时保持反应或存活，持续大于为或大于3个月和/或为或大于6个月。
84.根据权利要求45-83中任一项所述的方法，其中，在所述剂量的细胞施用时或紧临在施用之前,在用针对NHL的一种或多种先前疗法、任选地除了另一剂量的表达CAR的细胞以外的一种、两种或三种先前疗法治疗后，所述受试者已经在缓解后复发，或者变得是所述先前疗法难治的。
85.根据权利要求45-84中任一项所述的方法，其中，在所述剂量的细胞施用时或施用之前：
所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有双/三打击淋巴瘤；
所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为患有化学难治性淋巴瘤、任选地化学难治性DLBCL；和/或
所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全缓解(CR)。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用：
逆转所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型；
预防、抑制或延迟所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的发作；
降低所述受试者中CAR表达T细胞中的耗竭表型的水平或程度；或者
减少所述受试者中具有耗竭表型的CAR表达T细胞的总数量的百分比。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用的起始是在所述T细胞疗法的施用之后进行的，并且在所述化合物的施用或其起始之后，所述受试者展现所述受试者中所述CAR表达T细胞的抗原或肿瘤特异性活性或功能的恢复或拯救，任选地其中所述恢复、拯救和/或所述化合物的施用的起始是在所述受试者中或所述受试者的血液中的CAR表达T细胞已经展现耗竭的表型之后的时间点。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和/或持续时间来施用：
(a)在使所述T细胞暴露于CD19抗原或暴露于抗原受体特异性因子之后，与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，实现所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞的抗原特异性或抗原受体驱动的活性的增加，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者
(b)在使所述T细胞暴露于CD19抗原或暴露于抗原受体特异性因子之后，如与不存在所述化合物的所述施用的情况相比，预防、抑制或延迟所述受试者中幼稚或未耗竭T细胞中的耗竭表型的发作，所述T细胞任选地包括表达所述CAR的T细胞；或者
(c)如与不存在对所述受试者的所述施用的情况相比，逆转所述受试者中耗竭的T细胞中的耗竭表型，任选地所述T细胞包括表达所述CAR的T细胞。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物的施用包括以有效于以下的量、频率和/或持续时间来施用：(i)实现所述活性增加，以及(ii)预防、抑制或延迟所述耗竭表型的所述发作和/或逆转所述耗竭表型。
90.根据权利要求88或89所述的方法，其中所述受试者中的T细胞包括表达所述CAR的T细胞，和/或所述抗原是CD19。
91.根据权利要求86-90中任一项所述的方法，其中关于T细胞或T细胞群，所述耗竭表型包括：
与相同条件下的参考T细胞群相比，一种或多种耗竭标记、任选地2、3、4、5或6种耗竭标记在所述一个或多个T细胞上的表面表达的水平或程度的增加，或者展现所述耗竭标记的表面表达的T细胞的T所述群体的百分比的增加；或者
与相同条件下的参考T细胞群相比，在暴露于CD19抗原或抗原受体特异性因子时，由所述T细胞或T细胞群展现的活性的水平或程度的降低。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述水平、程度或百分比的增加是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。
93.根据权利要求91所述的方法，其中所述水平、程度或百分比的降低是大于为或约1.2倍、为或约1.5倍、为或约2.0倍、为或约3倍、为或约4倍、为或约5倍、为或约6倍、为或约7倍、为或约8倍、为或约9倍、为或约10倍或更多。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群是已知具有未耗竭表型的T细胞群，是幼稚T细胞群，是中枢记忆T细胞群，或者是干细胞中枢记忆T细胞群，任选地来自与衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者相同的受试者或者与所述受试者物种相同。
95.根据权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群(a)是受试者匹配的群体，其包含从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者的血液分离的大量T细胞，任选地其中所述大量T细胞不表达所述CAR，和/或(b)是在接受一定剂量的表达所述CAR的T细胞的施用之前，从衍生出具有所述耗竭表型的一个或多个T细胞的受试者获得。
96.根据权利要求91-95中任一项所述的方法，其中所述参考T细胞群在其施用至所述受试者之前是包含所述T细胞疗法的样品的组合物，或者包含表达所述CAR的T细胞的药物组合物，任选地其中所述组合物是冷冻保存的样品。
97.根据权利要求91-96中任一项所述的方法，其中所述一种或多种耗竭标记是抑制性受体。
98.根据权利要求91-97中任一项所述的方法，其中所述一种或多种耗竭标记选自PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、2B4、CD160、CD39、VISTA和TIGIT。
99.根据权利要求91-98中任一项所述的方法，其中所述活性或为一种炎性细胞因子或炎性细胞因子组合的增殖、细胞毒性或产生中的一种或多种，任选地其中所述一种细胞因子或细胞因子组合选自IL-2、IFN-γ和TNF-α。
100.根据权利要求91-99中任一项所述的方法，
其中暴露于所述CD19抗原或抗原受体特异性因子包括与所述CD19抗原或抗原受体特异性因子、任选地结合所述CAR的抗原结合结构域的药剂一起孵育。
101.根据权利要求100所述的方法，其中暴露于所述CD19抗原或抗原受体特异性因子包括使所述T细胞暴露于表达CD19抗原的靶细胞，任选地所述B细胞恶性肿瘤的细胞。
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