ES2841274T3

ES2841274T3 - Inmunoterapia con células T específica para WT-1

Info

Publication number: ES2841274T3
Application number: ES15753531T
Authority: ES
Inventors: Thomas Schmitt; Philip Greenberg; Hieu Nguyen
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2014-08-04
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2035-07-30
Also published as: JP2018183175A; JP6712261B2; WO2016022400A1; US20160083449A1; US10538572B2; CN107074970B; CA2956545A1; EP3177314B1; JP2017523784A; EP3177314A1; CN107074970A

Abstract

Polinucleótido aislado, estando el polinucleótido con codones optimizados, que codifica para una proteína de unión que comprende: (a) un dominio variable de cadena α (Vα) de receptor de células T (TCR) que tiene la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR1) de SEQ ID NO.:23, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:24 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cualquiera de las SEQ ID NO.:25 y 26; y (b) un dominio variable de cadena β (Vβ) de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de CDR1 de SEQ ID NO.:27, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:28 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de SEQ ID NO.:29, en el que la proteína de unión codificada es capaz de: (i) unirse específicamente a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):antígeno leucocitario humano (HLA) en una superficie celular independientemente o en ausencia de CD8; y/o (ii) unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia con células T específica para WT-1

Declaración de interés del gobierno

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención n.° P01 CA18029 concedida por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene determinados derechos sobre esta invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional estadounidense n.° 62/033.045 presentada el 4 de Agosto de 2014 y la solicitud provisional estadounidense n.° 62/164.783 presentada el 21 de mayo de 2015.

Declaración con respecto a la lista de secuencias

La lista de secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es 360056_427WO_SEQUENCE_LlSTING.txt. El archivo de texto pesa 138 KB, se creó el 29 de julio de 2015 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web.

Antecedentes

Campo técnico

La presente divulgación se refiere, en general, a receptores de células T (TCR) de alta afinidad o afinidad potenciada específicos para antígenos asociados con una enfermedad hiperproliferativa. Más específicamente, la presente divulgación se refiere a TCR con alta afinidad o afinidad potenciada contra un epítopo de proteína 1 de tumor de Wilms (WT-1) humana, a células T que expresan tales TCR específicos de WT-1, a ácidos nucleicos que codifican para los mismos y a composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos en los que las células sobreexpresan WT-1, tal como en cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

La terapia génica con receptores de células T (TCR) es un enfoque de tratamiento emergente diseñado para superar los obstáculos asociados con la inmunoterapia adoptiva de células T convencional, tales como el tiempo y la mano de obra extensos requeridos para aislar, caracterizar y expandir las células T específicas de antígeno tumoral (Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009). Otro obstáculo es que la mayoría de antígenos tumorales identificados que pueden seleccionarse como diana mediante inmunoterapia con células T convencional son autoproteínas sobreexpresadas, por lo que, en general, se eliminan células T de alta afinidad específicas para estos antígenos durante la selección tímica y son raras o inexistentes en el repertorio periférico.

Están desarrollándose estrategias para potenciar la afinidad de los TCR destinados para su uso en terapia génica con TCR (Udyavar et al., J. Immunol. 182:4439, 2009; Zhao et al., J. Immunol. 179:5845, 2007; Richman y Kranz, Biomol. Eng. 24:361,2007). Estos enfoques implican generalmente la generación de bibliotecas de genes de TCR mutados y la posterior selección de mutaciones que otorgan mayor afinidad para el complejo del péptido diana con el ligando del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Las mutaciones se dirigen habitualmente a las regiones determinantes de complementariedad (c Dr ) que se sabe que interaccionan con el péptido (CDR3) y/o CMH (CDR1/2) (Wucherpfennig et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140, 2010). No obstante, cambios a los residuos de contacto del CMH pueden crear un riesgo en el entorno clínico, ya que esto puede aumentar la afinidad por el CMH independientemente del péptido o aumentar la probabilidad de reactividad cruzada (efectos fuera de la diana). Se ha destacado este concepto por los resultados de un ensayo, en el que se infundieron células T que expresan un TCR que contiene mutaciones de CDR2 en pacientes y mediaron en una toxicidad rápida y mortal a partir de una reactividad cruzada impredecible con un autoantígeno distinto expresado en el corazón (Cameron et al., Sci. Transl. Med.

5:197ra103, 2013; Linette et al., Blood 122:863, 2013). Determinadas metodologías disponibles usadas para seleccionar como diana residuos de CDR específicos para la sustitución de aminoácidos limitan la diversidad de las bibliotecas generadas, ya que estas están limitadas generalmente por la longitud de la secuencia de CDR parental. En cambio, el proceso natural produce generalmente una mayor diversidad en el timo, en el que la maquinaria de recombinación V(D)J activa durante el desarrollo de células T da como resultados reordenamientos de los genes del TCR que generan CDR muy diversas, particularmente CDR3, que varían tanto en la longitud como en la composición de aminoácidos.

Una estrategia para la terapia dirigida con células T, que logra un efecto clínico máximo que se vería acompañado por una toxicidad inmunológica mínima, implica identificar antígenos asociados a la enfermedad con alta expresión en y presentación por, por ejemplo, un compartimento de células malignas, pero sin expresión significativa en tejido normal. Por ejemplo, se han descrito varios antígenos asociados a leucemia mielógena aguda (LMA), y se ha demostrado que la proteína 1 de tumor de Wilms (WT-1) se expresa en el compartimento de células madre de leucemia (LSC) de la mayoría de pacientes con LMA a niveles significativamente mayores que en células madre hematopoyéticas (HSC) fisiológicas. WT-1 está seleccionándose como diana en ensayos clínicos tanto con transferencia adoptiva de células T como con vacunación con péptidos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 7.342.092; 7.608.685; 7.622.119). Además, se ha notificado que la expresión de WT-1 es un marcador de enfermedad residual mínima porque los niveles de transcripción aumentados en pacientes con LMA en remisión morfológica era predictivo de recidiva clínica manifiesta (Inoue et al., Blood 84:3071, 1994; Ogawa et al., Blood 101:1698, 2003).

Dado que WT-1 es una proteína intracelular (habitualmente nuclear), las inmunoterapias que seleccionan como diana WT-1 usan generalmente enfoques celulares que tienen como objetivo generar respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ específicos de WT-1 que reconocen péptidos presentados en la superficie celular por moléculas de CMH de clase I. Para la inducción de una respuesta de CTL, las proteínas intracelulares se degradan habitualmente por el proteasoma o endo/lisosomas, uniéndose los fragmentos peptídicos resultantes a moléculas de CMH de clase I o clase II. Estos complejos de péptido-CMH se presentan en la superficie celular en la que se unen mediante células T por medio de la interacción péptido-CMH-TCR. Pueden usarse péptidos derivados de la proteína WT-1 en una vacuna en humanos para inducir células T CD8+ citotóxicas restringidas por antígeno leucocitario humano (HLA) que son capaces de destruir células tumorales. Sin embargo, dado que WT-1 es una autoproteína, tal inmunización sólo puede provocar respuestas por células T con TCR de baja afinidad. Además, los anticuerpos contra WT-1 son detectables en pacientes con neoplasias malignas hematopoyéticas y tumores sólidos, que demuestran que WT-1 puede ser un antígeno altamente inmunogénico (Gaiger et al., Clin. Cancer Res. 7 (supl. 3):761, 2001).

De manera clara, existe la necesidad de terapias génicas con TCR alternativas para su uso como inmunoterapias que seleccionan como diana WT-1 altamente específicas dirigidas contra diversos cánceres, tales como leucemia y tumores. Las realizaciones de la presente divulgación abordan esta necesidad y proporcionan otras ventajas relacionadas.

Breve sumario

La presente invención proporciona un polinucleótido aislado, estando el polinucleótido con codones optimizados, que codifica para una proteína de unión que comprende: (a) un dominio variable de cadena a (Va) de receptor de células T (TCR) que tiene la secuencia de región determinante de complementariedad (CDR1) de aminoácidos de SEQ ID NO.:23, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:24 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cualquiera de las SEQ ID NO.:25 y 26; y (b) un dominio variable de cadena p (Vp) de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de CDR1 de SEQ ID NO.:27, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:28 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de SEQ ID NO.:29, en el que la proteína de unión codificada es capaz de (i) unirse específicamente a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):antígeno leucocitario humano (HLA) en un superficie celular independientemente o en ausencia de CD8 y/o (ii) unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una secuencia de control de la expresión, en el que el vector es un vector viral.

La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante, que comprende un polinucleótido aislado según la presente invención o un vector de expresión según la presente invención, en la que la célula huésped expresa en su superficie celular la proteína de unión codificada por el polinucleótido.

La presente invención también proporciona la célula huésped recombinante de la presente invención para su uso en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo.

En las reivindicaciones se proporcionan realizaciones adicionales de la invención.

En el presente documento se divulga una proteína de unión (por ejemplo, una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas, un TCR o similares) que tiene (a) un dominio variable de cadena a (Va) que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 mostrada en SEQ ID NO.:23, una secuencia de aminoácidos de CDR2 mostrada en SEQ ID NO.:24 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO.:25, 26, 32, 38, 44, 50 y 51 y/o un dominio variable de cadena p (Vp); o (b) un dominio Va de (a) y un dominio Vp que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 mostrada en SEQ ID NO.:27, una secuencia de aminoácidos de CDR2 mostrada en SEQ ID NO.:28 y/o una secuencia de aminoácidos de CDR3 mostrada en SEQ ID NO.:29; en la que la proteína de unión es capaz de unirse a un complejo péptido derivado de WT-1:antígeno leucocitario humano (HLA) con alta afinidad, tal como un complejo RMFPNAPy L (SEQ ID NO.:16):antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.

En determinados casos, la proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas comprende (a) un dominio variable de cadena a (Va) que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO.:1 ó 2 y/o un dominio variable de cadena p (Vp); o (b) un dominio Va y un dominio Vp que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9; o (c) un dominio Va de (a) y/o un dominio Vp de (b); en la que la proteína de unión es capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID n O.:16):HLA con una K ^d menor de o igual a aproximadamente 5 nM.

En otro aspecto, se proporciona un receptor de células T (TCR) recombinante de alta afinidad, que comprende una cadena a y una cadena p, en el que la cadena a comprende un dominio Va que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2, en el que el TCR se une a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 independientemente o en ausencia de CD8.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para tratar un trastorno hiperproliferativo, que comprende administrar a un sujeto humano que lo necesita una composición que comprende una cualquiera de las proteínas de unión o los TCR recombinantes de alta afinidad mencionados anteriormente específicos para la proteína 1 de tumor de Wilms (WT-1) humana. En aún otro aspecto, se proporciona un método de inmunoterapia adoptiva para tratar un estado caracterizado por la sobreexpresión de WT-1 en células de un sujeto que tiene un trastorno hiperproliferativo, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula huésped recombinante que expresa cualquiera de las proteínas de unión o los TCR recombinantes de alta afinidad mencionados anteriormente.

En determinados casos, los métodos proporcionados son para tratar un trastorno hiperproliferativo que es una neoplasia maligna hemática o un cáncer sólido. Por ejemplo, la neoplasia maligna hemática que va a tratarse puede ser leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia eosinofílica crónica (LEC), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o mieloma múltiple (MM). El cáncer sólido a modo de ejemplo que va a tratarse puede ser cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, carcinoma de huesos y tejidos blandos, tumor de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer colorrectal, tumor desmoide, cáncer embrionario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma maligno, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal de páncreas, tumor astrocítico primario, cáncer de tiroides primario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, rabdomiosarcoma, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, tumor de células germinativas de testículo, cáncer urotelial, sarcoma uterino o cáncer de útero.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra curvas de unión en equilibrio de una titulación de TCR específicos de WT-1 que se unen a tetrámeros de péptido de WT-1:HLA-A. Se generaron clones de células T específicos para WT-1126'134 (que tiene la secuencia de aminoácidos RMFPNAPYL, tal como se expone en SEQ ID NO.:16) a partir del repertorio periférico de más de 50 donantes y se analizaron varios clones de células T de alta afinidad candidatos para determinar su afinidad relativa. Se tiñó cada clon de células T específico de WT-1 con tetrámeros de péptido de w T-1126'134/CMH (“tetrámeros de WT-1”) y se analizaron mediante citometría de flujo, y se determinó la intensidad de fluorescencia media de la tinción con tetrámero usando el software FlowJo (Treestar). Se realizaron mediciones de Kd usando diluciones al 50% de tetrámeros conjugados con PE a un intervalo de concentraciones (1-33 nM). Se determinaron los valores de Kd aparente a partir de las curvas de unión mediante regresión no lineal como la concentración de ligando que produjo una unión semimáxima (B ^máx ).

Las figuras 2A y 2B muestran que los clones de TCR de alta afinidad evaluados pudieron competir eficazmente con las cadenas de TCR endógenas y unir tetrámeros de WT-1126’134 independientemente de CD8. Se generaron constructos TCRa-P2A-p con codones optimizados que contenían las cadenas TCRa y TCRp de los tres TCR generados a partir de los repertorios periféricos que tienen la mayor afinidad por este epítopo de WT-1 (C4, P1, P22). (A) Se transdujeron estos constructos en PBMC y se evaluó el porcentaje de células teñidas con tetrámeros de WT-1126-134 dentro de la población transducida de células mediante citometría de flujo, representándose la tinción con tetrámero en el eje Y y representándose la tinción de la cadena p transgénica respectiva en el eje X. Se calculó la población transducida como el porcentaje total de células que expresan la cadena TCRp transgénica menos el porcentaje de células T que expresan de manera endógena esa cadena TCRp en un cultivo sin transducir de las mismas PBMC. (B) Se evaluó la unión de tetrámeros por los diferentes TCR en ausencia de CD8 midiendo la tinción con tetrámero de WT-1 en células CD4 ⁺ (negativas para CD8, CD8 ^‘ ) transducidas frente a células CD8 ⁺ dentro de la población transducida de PBMC. Uno de los clones de TCR, C4, mostró el mayor grado de unión de tetrámeros en células CD4 ⁺ CD8-.

Las figuras 3A-3C muestran una comparación de la expresión en superficie de TCR para diversos constructos de TCR derivados de C4 diferentes. Tres constructos de TCR derivados de C4 diferentes, cada uno con un elemento 2A del teschovirus porcino (P2A) que se une a las cadenas a y p, tienen las siguientes características: (1) C4a-P2A-p (C4apWT), (2) una versión optimizada por codón de C4a-P2A-p (C4ap CO) y (3) una variante del TCR con codones optimizados en la que C4p, en lugar de C4a , precede al elemento P2A (C4pa CO). (A) Se detectó la expresión en superficie como una medición de la unión de tetrámeros de WT-1:HLA-A. (B) Se examinaron las diferencias en la expresión de TCR entre los constructos C4a-P2A-p CO y C4p-P2A-a CO a lo largo del tiempo y se observó que eran más evidentes hacia el final del ciclo de células T, cuando se expresaron los TCR endógenos a mayores niveles. (C) Se muestra un dibujo esquemático de un constructo TCRpa de C4.

Las figuras 4A-4C muestran la detección y el análisis de una variante de afinidad potenciada del TCR C4 identificada mediante mutagénesis por saturación. (A) Se transdujeron PBMC para expresar o bien el constructo C4a-P2A-C4p de tipo natural o bien el constructo de afinidad potenciada C4a-P2A-C4-P(DLT); se aislaron las células transducidas mediante clasificación celular, se expandieron y se analizaron para determinar la tinción relativa con tetrámeros de WT-1126-134 en células que expresan niveles equivalentes del TCR introducido (tal como se mide mediante tinción con Vp17). (B) Se tiñeron PBMC clasificadas que expresan o bien el constructo C4a-P2A-C4p de tipo natural o bien C4a-P2A-C4-P(DLT) de afinidad potenciada con tetrámero de péptido de WT-1/CMH, se analizaron mediante citometría de flujo y se determinó la intensidad de fluorescencia media de la tinción con tetrámero usando el software FlowJo (Treestar). Se realizaron mediciones de Kd usando diluciones al 50% de tetrámeros conjugados con PE a un intervalo de concentraciones. Se determinaron los valores de Kd aparente a partir de las curvas de unión mediante regresión no lineal como la concentración de ligando que produjo una unión semimáxima. (C) Se incubaron PBMC clasificadas que expresan o bien el constructo C4a-P2A-C4p de tipo natural o bien C4a-P2A-C4-P(DLT) de afinidad potenciada con células diana cargadas con 51Cr con pulsos de concentraciones decrecientes de péptido de WT-1126-134 tal como se indica, y se midió la destrucción específica mediada por células T como el porcentaje de liberación máxima de cromo.

La figura 5 muestra que las PBMC transducidas con el TCR de C4ap(DLT) muestran una destrucción potenciada de células tumorales que presentan de manera natural el antígeno de WT-1. Se usaron la líneas de células tumorales K562 negativas para HLA-A2 o células K562 transducidas para expresar HLA-A2 como células diana para PBMC que expresan o bien el constructo C4a-P2A-C4p de tipo natural o bien el TCR de C4a-P2AC4-p(DLT) de afinidad potenciada. Se determinó la destrucción del tumor midiendo la caspasa-3 escindida en células tumorales mediante citometría de flujo.

Las figuras 6A-6C muestran los resultados de la generación y selección de bibliotecas de TCRp seleccionadas por agonistas humanas. Se purificaron HPC CD34+ a partir de sangre de cordón umbilical, se transdujeron de manera lentiviral con o bien C4a-IRES-GFP o bien C4ap y se cultivaron conjuntamente con la línea de células OP9-A2-DL1 en presencia de péptido de WT-1 1 |i g/ml. (A) Se analizaron los cultivos el día 31 para determinar la expresión de CD3 y CD27. (B) El día 34, se analizaron los cultivos para determinar la expresión de CD27 y Vp17, y se clasificaron aproximadamente 2,5 x 105 células Vp17+CD27+ para la generación de bibliotecas de TCRp. (C) Se generaron bibliotecas de Vp17-Cp1 y Vp17-Cp2, se transdujeron en la línea de células H9.CD8-C4a , seguido por la clasificación para células C4a-GFP+ Vp17+ transducidas. Luego se clasificaron las células dos veces con tetrámero de WT-1 y se analizaron para determinar la tinción con tetrámero y Vp17 mediante citometría de flujo.

La figura 7 muestra la persistencia en 9 pacientes con leucemia de células T CD8 específicas de virus derivadas de los donantes transducidas para expresar el constructo de TCR de C4pa. Se estimularon las células T de los donantes con un péptido o bien de VEB o bien de CMV para activar específicamente una población de células T específicas de virus con un fenotipo de memoria central y para dirigir la transducción lentiviral preferentemente a estas células activadas y, por tanto, que se dividen rápidamente. Se transdujeron las células con el constructo de TCR de C4pa y se clasificaron en células T con tinción positiva tanto para HLA-A2/WT-1 como para tetrámeros específicos de HLA-A2/péptido viral mediante clasificación celular por citometría de flujo. Se expandieron las células clasificadas y se infundieron en pacientes con leucemia en los puntos de tiempo indicados con una flecha en sentido descendente.

Las figuras 8A-8C muestran resultados que demuestran la estabilidad en la superficie celular de TCR específico de WT-1 funcional. (A) Se estimularon PBMC de donantes con células dendríticas (DC) que presentan péptido de VEB GLCTLVAML (s Eq ID NO.:127), transducidas con el constructo de TCR de C424 horas después, y se clasificaron en poblaciones WT_1 tetrámero+, VEB tetrámero+ o doble positivas el día 12 tal como se indica. (B) Se analizaron las poblaciones clasificadas inmediatamente después de la clasificación, otras 12 días de cultivo in vitro adicional. (C) Se estimularon PBMC de donantes con DC que presentan péptido de VEB GLCTLVAML (SEQ ID NO.:127) y luego se clasificaron para células T VEB tetrámero+ después de 12 días de cultivo. Luego volvieron a reestimularse las células clasificadas con o sin transducción de TCR de C4 el día 1 después de la estimulación y se analizaron mediante citometría de flujo el día 6.

Descripción detallada

En un aspecto, la presente divulgación proporciona receptores de células T (TCR) que tienen alta afinidad por el antígeno peptídico de WT-1 asociado con un complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) (por ejemplo, antígeno leucocitario humano, HLA) para su uso en, por ejemplo, inmunoterapia adoptiva para tratar cáncer. Por medio de antecedentes, la mayoría de dianas tumorales para inmunoterapias basadas en células T son autoantígenos, ya que los tumores surgen a partir de tejido previamente normal. Por ejemplo, tales antígenos asociados a tumor (AAT) pueden expresarse a altos niveles en una célula cancerosa, pero no pueden expresarse o pueden expresarse mínimamente en otras células. Durante el desarrollo de células T en el timo, se permite que las células T que se unen débilmente a autoantígenos sobrevivan en el timo, que pueden experimentar un desarrollo adicional para aumentar la especificidad contra invasores extraños, mientras que las células T que se unen fuertemente a autoantígenos se eliminan por el sistema inmunitario, ya que tales células aumentarían una respuesta autoinmunitaria no deseable. Así, las células T se clasifican por su capacidad relativa de unirse a antígenos para preparar el sistema inmunitario para responder contra un invasor extraño (es decir, reconocimiento de no autoantígeno) mientras que, al mismo tiempo, previenen una respuesta autoinmunitaria (es decir, reconocimiento de autoantígeno). Este mecanismo de tolerancia limita a las células T que se producen de manera natural que pueden reconocer (auto)antígenos tumorales con alta afinidad y, por tanto, elimina las células T que eliminarían eficazmente células tumorales. Por consiguiente, el aislamiento de células T que tienen TCR de alta afinidad específicos para antígenos tumorales es difícil porque tales células se eliminan esencialmente por el sistema inmunitario.

Una ventaja de la presente divulgación es que proporciona un TCR de alta afinidad o afinidad potenciada específico para un péptido de WT-1, en el que una célula que expresa un TCR de este tipo es capaz de unirse a un complejo de WT-1:HLA independientemente o en ausencia de CD8, es capaz de asociarse más eficazmente con una proteína CD3 en comparación con un TCR endógeno, o ambos. En determinados casos, un TCR de afinidad potenciada específico para un péptido de WT-1 comprende una cadena a de receptor de células T (TCR) tal como se expone en SEQ ID NO.:7 u 8 y un dominio variable de cadena p (Vp) de TCR tal como se expone en SEQ ID NO.:12 ó 13, en el que el TCR de afinidad potenciada es capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 3 nM, o en el que el t Cr de afinidad potenciada se disocia de un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA a una tasa koff reducida en comparación con un TCR que se compone de una cadena a de SEQ ID NO.:5 ó 6 y una cadena p de SEQ ID NO.:12 ó 13.

Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento tendrán, en determinados casos, utilidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades y estados asociados con la sobreexpression de WT-1 (por ejemplo, expresión de WT-1 detectable a un nivel que es mayor en magnitud, de manera estadísticamente significativa, que el nivel de expresión de WT-1 que es detectable en una célula normal o libre de enfermedad). Tales enfermedades incluyen diversas formas de trastornos hiperproliferativos, tales como neoplasias malignas hemáticas y cánceres sólidos. Los ejemplos no limitativos de estos y usos relacionados se describen en el presente documento, e incluyen estimulación in vitro, ex vivo e in vivo de respuestas específicas de antígeno WT-1 de células T, tales como mediante el uso de células T recombinantes que expresan un TCR de afinidad potenciada específico para un péptido de WT-1 (por ejemplo, RMFPNAPYL, SEQ ID NO.:16).

Antes de exponer esta divulgación con más detalle, puede ser útil para comprender la misma proporcionar definiciones de determinados términos que van a usarse en el presente documento. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de esta divulgación.

En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de razones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo enumerado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como la décima parte y la centésima parte de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Además, debe entenderse que cualquier intervalo numérico enumerado en el presente documento en relación con cualquier característica física, tal como subunidades de polímero, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo enumerado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa ± 20% del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos “un” y “una”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) significa o bien uno, ambos o bien cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Tal como se usa en el presente documento, los términos “incluir”, “tener” y “comprender” se usan como sinónimos, cuyos términos y variantes de los mismos deben interpretarse como no limitativos.

Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y los sustituyentes descritos en el presente documento se divulgan por la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera individualmente.

El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o las etapas especificados, o a aquellos que no afectan de manera material a las características básicas de una invención reivindicada. Por ejemplo, un dominio, una región o un módulo de proteína (por ejemplo, un dominio de unión, región bisagra, módulo de ligador) o una proteína (que puede tener uno o más dominios, regiones o módulos) “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos particular cuando la secuencia de aminoácidos de un dominio, una región, un módulo o una proteína incluye extensiones, deleciones, mutaciones o una combinación de las mismas (por ejemplo, aminoácidos en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal o entre dominios) que, en combinación, contribuyen a, como máximo, el 20% (por ejemplo, como máximo, el 15%, el 10%, el 8%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1%) de la longitud de un dominio, una región, un módulo o una proteína y no afectan sustancialmente (es decir, no reducen la actividad en más del 50%, tal como no más del 40%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 5% o el 1%) a la actividad del/de los dominio(s), región/regiones, módulo(s) o proteína (por ejemplo, la afinidad de unión a diana de una proteína de unión).

Tal como se usa en el presente documento, una “célula del sistema inmunitario” significa cualquier célula del sistema inmunitario que se origina a partir de una célula madre hematopoyética en la médula ósea, que da lugar a dos linajes principales, una célula progenitora mieloide (que da lugar a células mieloides tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas, megacariocitos y granulocitos) y una célula progenitora linfoide (que da lugar a células linfoides tales como células T, células B y linfocitos citolíticos naturales (células NK)). Las células del sistema inmunitario a modo de ejemplo incluyen una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T doble negativa CD4- CD8-, una célula T y8, una célula T reguladora, un linfocito citolítico natural y una célula dendrítica. Los macrófagos y las células dendríticas pueden denominarse “células presentadoras de antígeno” o “APC”, que son células especializadas que pueden activar las células T cuando un receptor del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie de la APC forma un complejo con un péptido que interacciona con un TCR en la superficie de una célula T.

“Complejo mayor de histocompatibilidad” (CMH) se refiere a glicoproteínas que administran antígenos peptídicos a una superficie celular. Las moléculas de CMH de clase I son heterodímeros que tienen una cadena a que atraviesa la membrana (con tres dominios a) y una microglobulina p2 asociada de manera no covalente. Las moléculas de CMH de clase II se componen de dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de las cuales atraviesan la membrana. Cada cadena tiene dos dominios. Las moléculas de CMH de clase I administran péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde el complejo péptido:CMH se reconoce por células T CD8+. Las moléculas de CMH de clase II administran péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde se reconocen por células T CD4+. El CMH humano se denomina antígeno leucocitario humano (HLA).

Una “célula T” es una célula del sistema inmunitario que madura en el timo y produce receptores de células T (TCR). Las células T pueden ser indiferenciadas (no expuestas a antígeno; expresión aumentada de CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 y CD45RA y expresión disminuida de CD45RO en comparación con Tcm), células T de memoria (Tm) (experimentadas por antígeno y de vida larga) y células efectoras (experimentadas por antígeno, citotóxicas). Las Tm pueden dividirse adicionalmente en los subconjuntos de células T de memoria central (Tcm, expresión aumentada de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO y CD95 y expresión disminuida de CD54RA en comparación con células T indiferenciadas) y células T de memoria efectora (Tem, expresión disminuida de CD62L, CCR7, CD28, CD45RA y expresión aumentada de CD127 en comparación con células T indiferenciadas o Tcm). Las células T efectoras (Te) se refieren a linfocitos T citotóxicos CD8+ experimentados por antígeno que tienen expresión disminuida de CD62L, CCR7, CD28 y son positivos para granzima y perforina en comparación con Tcm. Otras células T a modo de ejemplo incluyen células T reguladoras, tales como células T reguladoras CD4+ CD25+ (Foxp3+) y células Treg17, así como células T restringidas por Tr1, Th3, CD8+CD28- y Qa-1.

“Receptor de células T” (TCR) se refiere a un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (que tiene un dominio de unión variable, un dominio constante, una región transmembrana y una cola citoplásmica corta; véase, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a ed., Current Biology Publications, pág.

4:33, 1997) capaz de unirse específicamente a un péptido antigénico unido a un receptor de c Mh . Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble y generalmente se compone de un heterodímero que tiene cadenas a y p (también denominadas TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas y y 8 (también denominadas TCRy y TCR8, respectivamente). Como las inmunoglobulinas, la porción extracelular de las cadenas de TCR (por ejemplo, cadena a , cadena p) contiene dos dominios de inmunoglobulina, un dominio variable (por ejemplo, dominio variable de cadena a o Va, dominio variable de cadena p o Vp; normalmente los aminoácidos 1 a 116 basándose en la numeración de Kabat; Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, Dept. de Salud y Servicios Sociales estadounidense, Institutos Nacionales de Salud del Servicio de Salud Pública, 1991, 5a ed.) en el extremo N-terminal y un dominio constante (por ejemplo, dominio constante de cadena a o Ca, normalmente los aminoácidos 117 a 259 basándose en Kabat, dominio constante de cadena p o Cp, normalmente los aminoácidos 117 a 295 basándose en Kabat) adyacente a la membrana celular. Además, como las inmunoglobulinas, los dominios variables contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) separadas por regiones de entramado (FR) (véanse, por ejemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; véase también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En determinados casos, un TCR se encuentra en la superficie de células T (o linfocitos T) y se asocia con el complejo CD3. La fuente de un TCR, tal como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies de animales, tales como un humano, un ratón, una rata, un conejo u otro mamífero.

“CD3” se conoce en la técnica como un complejo multiproteico de seis cadenas (véanse, Abbas y Lichtman, 2003; Janeway et al., pág. 172 y 178, 1999). En mamíferos, el complejo comprende una cadena CD3y, una cadena CD38, dos cadenas CD3e y un homodímero de cadenas CD3^. Las cadenas CD3y, CD38 y CD3e son proteínas de superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un solo dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de las cadenas CD3y, CD38 y CD3e están cargadas negativamente, que es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas de receptores de células T cargadas positivamente. Cada una de las colas intracelulares de las cadenas CD3y, CD38 y CD3e contienen un solo motivo conservado conocido como motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM, mientras que cada cadena CD3 ^tiene tres. Sin desear estar unidos por la teoría, se cree que los ITAM son importantes para la capacidad de señalización de un complejo de TCR. CD3, tal como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies de animales, incluyendo humano, ratón, rata u otros mamíferos.

Tal como se usa en el presente documento, “complejo de TCR” se refiere a un complejo formado mediante la asociación de CD3 con TCR. Por ejemplo, un complejo de TCR puede componerse de una cadena CD3y, una cadena CD38, dos cadenas CD3g, un homodímero de cadenas CD3^, una cadena TCRa y una cadena TCRp. Alternativamente, un complejo de TCR puede componerse de una cadena CD3y, una cadena CD38, dos cadenas CD3g, un homodímero de cadenas CD3^, una cadena TCRy y una cadena TCR8.

Un “componente de un complejo de TCR”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de TCR (es decir, TCRa , TCRp, TCRy o TCR8), una cadena de CD3 (es decir, CD3y, CD38, CD3g o CD3Q o un complejo formado por dos o más cadenas de TCR o cadenas de CD3 (por ejemplo, un complejo de TCRa y TCRp, un complejo de TCRy y TCR8, un complejo de CD3g y CD38, un complejo de CD3y y CD3g o un subcomplejo de TCR de TCRa , TCRp, CD3y, CD38 y dos cadenas CD3g).

Un “dominio de unión” (también denominado “región de unión” o “resto de unión”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o porción de la misma (por ejemplo, péptido, oligopéptido, polipéptido, proteína) que posee la capacidad de asociarse, unirse o combinarse específicamente y de manera no covalente con una diana (por ejemplo, WT-1 o complejo péptido de WT-1:CMH). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión que se produce de manera natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante para una molécula biológica, un complejo molecular (es decir, complejo que comprende dos o más moléculas biológicas) u otra diana de interés. Los dominios de unión a modo de ejemplo incluyen regiones variables de inmunoglobulina de cadena sencilla (por ejemplo, scTCR, scFv), ectodominios de receptor, ligandos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas) o polipéptidos sintéticos seleccionados por su capacidad específica de unirse a una molécula biológica, un complejo molecular u otra diana de interés.

Tal como se usa en el presente documento, “se une específicamente” o “específico para” se refiere a una asociación o unión de una proteína de unión (por ejemplo, receptor TCR) o un dominio de unión (o proteína de fusión del mismo) a una molécula diana con una afinidad o K ^a (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual a o mayor de 105 M-1 (que equivale a la razón de la tasa de asociación [k ^on ] con respecto a la tasa de disociación [k ^off ] para esta reacción de asociación), mientras que no se asocia ni une significativamente con ninguna otra molécula u otro componente en una muestra. Las proteínas de unión o los dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como proteínas de unión o dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “alta afinidad” o como proteínas de unión o dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “baja afinidad”. Las proteínas de unión o los dominios de unión de “alta afinidad” se refieren a aquellas proteínas de unión o aquellos dominios de unión que tienen una K ^a de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o al menos 1013 M-1. Las proteínas de unión o los dominios de unión de “baja afinidad” se refieren a aquellas proteínas de unión o aquellos dominios de unión que tienen una K ^a de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (K ^d ) de un interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10-13 M).

En determinados casos, un receptor o dominio de unión puede tener “afinidad potenciada”, que se refiere a receptores o dominios de unión seleccionados o modificados por ingeniería genética con una unión más fuerte a un antígeno diana que un dominio de unión de tipo natural (o parental). Por ejemplo, la afinidad potenciada puede deberse a una K ^a (constante de asociación en equilibrio) para el antígeno diana que es mayor que la del dominio de unión de tipo natural, deberse a una K ^d (constante de disociación) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural, deberse a una tasa de disociación (k ^off ) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural, o una combinación de los mismos. En determinados casos, los TCR de afinidad potenciada pueden estar con codones optimizados para potenciar la expresión en una célula huésped particular, tal como células T (Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006).

Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, así como determinar afinidades de dominios de unión o proteínas de fusión, tales como inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, ultracentrifugación analítica, espectroscopía y análisis mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore®) (véanse, por ejemplo, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.

51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; y las patentes estadounidenses n. ^os 5.283.173, 5.468.614 o equivalentes).

El término “proteína de unión específica de WT-1” se refiere a una proteína o un polipéptido que se une específicamente a WT-1 o un péptido de la misma. En algunos casos, una proteína o un polipéptido se une a WT-1 o un péptido de la misma, tal como un péptido de WT-1 en forma de complejo con una molécula de CMH o HLA, por ejemplo, en una superficie celular, con al menos aproximadamente una afinidad particular. En determinados casos, una proteína de unión específica de WT-1 se une a un complejo péptido derivado de WT-1:HLA (o complejo péptido derivado de WT-1:CMH) con una K ^d menor de aproximadamente 10'8 M, menor de aproximadamente 10'9 M, menor de aproximadamente 10'10 M, menor de aproximadamente 10'11 M, menor de aproximadamente 10'12 M o menor de aproximadamente 10'13 M, o con una afinidad que es aproximadamente la misma que, al menos aproximadamente la misma que o mayor que aproximadamente la afinidad mostrada por una proteína de unión específica de WT-1 a modo de ejemplo proporcionada en el presente documento, tal como cualquiera de los TCR de específicos WT-1 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, tal como se mide mediante el mismo ensayo. Se conocen ensayos para evaluar la afinidad o afinidad aparente o afinidad relativa. En determinados ejemplos, la afinidad aparente por un TCR se mide evaluando la unión a diversas concentraciones de tetrámeros, por ejemplo, mediante citometría de flujo usando tetrámeros marcados. En algunos ejemplos, la Kd aparente de un TCR se mide mediante el uso de diluciones al 50% de tetrámeros marcados a un intervalo de concentraciones, seguido por la determinación de las curvas de unión mediante regresión no lineal, determinándose la Kd aparente como la concentración de ligando que produjo una unión semimáxima. En determinados casos, una proteína de unión específica de WT-1 comprende una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas específica de WT-1 o una porción de unión de la misma.

El término “dominio de unión de WT-1” o “fragmento de unión de WT-1” se refiere a un dominio o una porción de una proteína de unión específica de WT-1 responsable de la unión a WT-1 específica. Un dominio de unión específico de WT-1 solo (es decir, sin ninguna otra porción de una proteína de unión específica de WT-1) puede ser soluble y puede unirse a WT-1 con una Kd menor de aproximadamente 1°'8 M, menor de aproximadamente 1°'9 M, menor de aproximadamente 10'1°M, menor de aproximadamente 1°'11 M, menor de aproximadamente 1°'12M o menor de aproximadamente 1°'13 M. Los dominios de unión específicos de WT-1 a modo de ejemplo incluyen scTCR específico de WT-1 (por ejemplo, proteínas apTCR de cadena sencilla tales como Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Va o Va-L-Vp-Cp, en las que Va y Vp son dominios variables de TCRa y p respectivamente, Ca y Cp son dominios constantes de TCRa y p, respectivamente, y L es un ligador) y fragmentos scFv, tal como se describen en el presente documento, que pueden derivarse de un anticuerpo o TCR anti-WT-1.

“Antígeno WT-1” o “antígeno peptídico de WT-1” se refiere a una porción producida de manera natural o sintética de una proteína WT-1 que oscila en longitud desde aproximadamente 7 aminoácidos hasta aproximadamente 15 aminoácidos, que puede formar un complejo con una molécula de CMH (por ejemplo, HLA), y un complejo de este tipo puede unirse con un TCR específico para un complejo péptido de WT-1:CMH (por ejemplo, HLA). Los principios de procesamiento de antígenos mediante células presentadoras de antígeno (APC) (tales como células dendríticas, macrófagos, linfocitos u otros tipos de células) y de presentación de antígenos mediante APC a células T, incluyendo la presentación restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) entre APC y células T inmunocompatibles (por ejemplo, que comparten al menos una forma alélica de un gen de CMH que es relevante para la presentación de antígenos) están bien establecidos (véase, por ejemplo, Murphy, Janeway's Immunobiology (8a ed.) 2011 Garland Science, NY; capítulos 6, 9 y 16). Por ejemplo, los péptidos antigénicos procesados que se originan en el citosol (por ejemplo, antígeno tumoral, patógeno intrcelular) son generalmente de desde aproximadamente 7 aminoácidos hasta aproximadamente 11 aminoácidos de longitud y se asociarán con moléculas de CMH de clase I, mientras que los péptidos procesados en el sistema vesicular (por ejemplo, bacterianos, virales) variarán en longitud desde aproximadamente 1° aminoácidos hasta aproximadamente 25 aminoácidos y se asociarán con moléculas de CMH de clase II. Dado que WT-1 es una proteína huésped interna, los péptidos antigénicos de WT-1 se presentarán en el contexto de CMH de clase I. En casos particulares, un péptido de WT-1 es RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16), que se sabe que se asocia con HLA de clase I humano (y, más específicamente, se asocia con el alelo HLA-A*201).

Un “ligador” se refiere a una secuencia de aminoácidos que conecta dos proteínas, polipéptidos, péptidos, dominios, regiones o motivos y que puede proporcionar una función espaciadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión, de modo que el polipéptido resultante conserva una afinidad de unión específica (por ejemplo, scTCR) con una molécula diana o conserva la actividad de señalización (por ejemplo, complejo de TCR). En determinados casos, un ligador se compone de aproximadamente dos a aproximadamente 35 aminoácidos, por ejemplo, o de aproximadamente cuatro a aproximadamente 2° aminoácidos, o de aproximadamente ocho a aproximadamente 15 aminoácidos, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos.

“Aminoácidos de unión” o “residuos de aminoácido de unión” se refiere a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-1°) residuos de aminoácido entre dos motivos, regiones o dominios adyacentes de un polipéptido, tal como entre un dominio de unión y un dominio constante adyacente o entre una cadena de TCR y un péptido autoescindible adyacente. Los aminoácidos de unión pueden resultar del diseño de constructos de una proteína de fusión (por ejemplo, residuos de aminoácido que resultan del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión).

Un “dominio alterado” o “proteína alterada” se refiere a un motivo, una región, un dominio, un péptido, un polipéptido o una proteína con una identidad de secuencia no idéntica con respecto a un motivo, una región, un dominio, un péptido, un polipéptido o una proteína de tipo natural (por ejemplo, una cadena TCRa , una cadena TCRp, un dominio constante de TCRa , un dominio constante de TCRp de tipo natural) de al menos el 85% (por ejemplo, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, el 99,1%, el 99,2%, el 99,3%, el 99,4%, el 99,5%, el 99,6%, el 99,7%, el 99,8%, el 99,9%).

Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a cualquiera de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante traducción in vitro, y fragmentos generados mediante cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasas o acción de exonucleasas. En determinados casos, los ácidos nucleicos de la presente divulgación se producen mediante PCR. Los ácidos nucleicos pueden componerse de monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos), análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones en o reemplazo de restos de azúcares o restos de base de pirimidina o purina. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser o bien monocatenarias o bien bicatenarias.

El término “aislado” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es que se produce de manera natural). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que se produce de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de algunos o todos de los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal ácido nucleico podría formar parte de un vector y/o tal ácido nucleico o polipéptido podría formar parte de una composición (por ejemplo, un lisado celular) y todavía estar aislado en tal vector o composición que no forma parte del entorno natural para el ácido nucleico o polipéptido. El término “gen” significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante “líder y trasera” así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a una célula, un microorganismo, una molécula de ácido nucleico o un vector que se ha modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, o se refiere a una célula o un microorganismo que se ha alterado de tal manera que la expresión de una molécula de ácido nucleico o un gen endógenos está controlada, desregulada o es constitutiva, en los que tales alteraciones o modificaciones pueden introducirse mediante ingeniería genética. Las alteraciones genéticas pueden incluir, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico (que pueden incluir un elemento de control de la expresión, tal como un promotor) que codifican para una o más proteínas o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones u otra perturbación funcional de moléculas de ácido nucleico de o además del material genético de una célula. Las modificaciones a modo de ejemplo incluyen aquellas en regiones codificantes o fragmentos funcionales de las mismas de polipéptidos heterólogos u homólogos de una molécula de referencia o parental.

Tal como se usa en el presente documento, “mutación” se refiere a un cambio en la secuencia de una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido en comparación con una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido de referencia o de tipo natural, respectivamente. Una mutación puede dar como resultado varios tipos diferentes de cambios en la secuencia, incluyendo sustitución, inserción o deleción de nucleótido(s) o aminoácido(s). En determinados casos, una mutación es una sustitución de uno o tres codones o aminoácidos, una deleción de uno a aproximadamente 5 codones o aminoácidos, o una combinación de los mismos.

Una “sustitución conservadora” se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. En la técnica se conocen bien sustituciones conservadoras a modo de ejemplo (véanse, por ejemplo, la página 10 del documento WO 97/09433; Lehninger, Biochemistry, 2a edición; Worth Publishers, Inc. NY, NY, págs. 71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY y Cell Press, Cambridge, MA, pág. 8, 1990).

El término “constructo” se refiere a cualquier polinucleótido que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante. Un constructo puede estar presente en un vector (por ejemplo, un vector bacteriano, un vector viral) o puede integrarse en el genoma. Un “vector” es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede incluir moléculas de ácido nucleico cromosómicas, no cromosómicas, semisintéticas o sintéticas. Los vectores a modo de ejemplo son aquellos capaces de la replicación autónoma (vector episómico) o la expresión de moléculas de ácido nucleico a las que se unen (vectores de expresión).

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple de tipo 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, Vaccinia, viruela aviar y viruela de los canarios). Otros virus incluyen, por ejemplo, virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis. Los ejemplos de retrovirus incluyen leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, de tipo B, de tipo D de mamífero, grupo de VLTH-VLB, lentivirus, spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Campos et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

“Vector lentiviral”, tal como se usa en el presente documento, significa vectores lentivirales basados en VIH para la administración génica, que pueden ser integradores o no integradores, tener una capacidad de empaquetamiento relativamente grande y pueden transducir una gama de tipos de células diferentes. Los vector lentivirales se generan habitualmente tras la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de superficie virales con receptores en la superficie celular. En la entrada, el ARN viral experimenta transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de células infectadas.

El término “unido operativamente” se refiere a la asociación de dos o más moléculas de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico, de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). “No unido” significa que los elementos genéticos asociados no están estrechamente asociados entre sí y la función de uno no afecta al otro.

Tal como se usa en el presente documento, “vector de expresión” se refiere a un constructo de ADN que contiene una molécula de ácido nucleico que está unida operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de la molécula de ácido nucleico en un huésped adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica para sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, un virus o simplemente un inserto genómico a potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse, en algunos casos, en el propio genoma. En la presente memoria descriptiva, “plásmido”, “plásmido de expresión”, “virus” y “vector” se usan a menudo de manera intercambiable.

El término “expresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico, tal como un gen. El proceso puede incluir transcripción, control postranscripcional, modificación postranscripcional, traducción, control postraduccional, modificación postraduccional o cualquier combinación de los mismos.

El término “introducido” en el contexto de insertar una molécula de ácido nucleico en una célula, significa “transfección” o 'transformación” o “transducción”, e incluye la referencia a la incorporación de una molécula de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en la que la molécula de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de una célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

Tal como se usa en el presente documento, molécula de ácido nucleico, constructo o secuencia “heterólogos” o “exógenos” se refiere a una molécula de ácido nucleico o porción de una molécula de ácido nucleico que no es nativa de una célula huésped, pero puede ser homóloga a una molécula de ácido nucleico o porción de una molécula de ácido nucleico de la célula huésped. La fuente de la molécula de ácido nucleico, el constructo o la secuencia heterólogos o exógenos puede ser de un género o una especie diferentes. En determinados casos, una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena se añade (es decir, no endógena ni nativa) a una célula huésped o un genoma huésped mediante, por ejemplo, conjugación, transformación, transfección, electroporación o similares, en la que la molécula añadida puede integrarse en el genoma del huésped o existir como material genético extracromosómico (por ejemplo, como un plásmido u otra forma de vector autorreplicante), y puede estar presente en múltiples copias. Además, “heteróloga” se refiere a una enzima, una proteína u otra actividad no nativa codificada por una molécula de ácido nucleico exógena introducida en la célula huésped, incluso si la célula huésped codifica para una proteína o actividad homóloga.

Tal como se describe en el presente documento, puede introducirse más de una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena en una célula huésped como moléculas de ácido nucleico independientes, como una pluralidad de genes controlados individualmente, como una molécula de ácido nucleico policistrónica, como una sola molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, tal como se divulga en el presente documento, una célula huésped puede modificarse para expresar dos o más moléculas de ácido nucleico heterólogas o exógenas que codifican para un TCR deseado específico para un péptido antigénico de WT-1 (por ejemplo, TCRa y TCRp). Cuando se introducen dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas en una célula huésped, se entiende que las dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas pueden introducirse como una sola molécula de ácido nucleico (por ejemplo, en un único vector), en vectores independientes, integrarse en el cromosoma del huésped en un solo sitio o en múltiples sitios, o cualquier combinación de los mismos. El número de moléculas de ácido nucleico o actividades de proteína heterólogas referenciadas se refiere al número de moléculas de ácido nucleico codificantes o al número de actividades de proteína, no al número de moléculas de ácido nucleico independientes introducidas en una célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” o “nativo” se refiere a un gen, una proteína o una actividad que está normalmente presente en una célula huésped. Además, un gen, una proteína o una actividad que están mutados, sobreexpresados, permutados al azar, duplicados o alterados de otro modo en comparación con un gen, una proteína o una actividad parentales todavía se considera que son endógenos o nativos de esa célula huésped particular. Por ejemplo, una secuencia de control endógena de un primer gen (por ejemplo, secuencias de atenuación traduccional promotoras) puede usarse para alterar o regular la expresión de un segundo gen o una segunda molécula de ácido nucleico nativos, en la que la expresión o regulación del segundo gen o la segunda molécula de ácido nucleico nativos difiera de la expresión o regulación normal en una célula parental.

El término “homólogo” se refiere a una molécula o actividad encontrada en o derivada de una célula huésped, especie o cepa. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena puede ser homóloga de un gen de célula huésped nativo, y puede tener opcionalmente un nivel de expresión alterado, una secuencia diferente, una actividad alterada, o cualquier combinación de los mismos.

“ Identidad de secuencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia que son idénticos con los residuos de aminoácido en otra secuencia de polipéptido de referencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los valores de porcentaje de identidad de secuencia pueden generarse usando el software BLAST2.0 de NCBI tal como se define por Altschul et al. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, con los parámetros ajustados a los valores por defecto.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula progenitora hematopoyética” es una célula que puede derivarse de células madre hematopoyéticas o tejido fetal y que es capaz de diferenciarse adicionalmente en tipos de células maduras (por ejemplo, células del sistema inmunitario). Las células progenitoras hematopoyéticas a modo de ejemplo incluyen aquellas con un fenotipo CD24Lo Lin- CD117+ o aquellas encontradas en el timo (denominadas timocitos progenitores).

Tal como se usa en el presente documento, el término “huésped” se refiere a una célula (por ejemplo, célula T) o un microorganismo seleccionado como diana para la modificación genética con una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena para producir un polipéptido de interés (por ejemplo, TCR anti-WT-1 de alta afinidad o afinidad potenciada). En determinados casos, una célula huésped ya puede poseer o estar modificada opcionalmente para incluir otras modificaciones genéticas que otorgan propiedades deseadas relacionadas o no relacionadas con la biosíntesis de la proteína heteróloga o exógena (por ejemplo, inclusión de un marcador detectable; TCR endógeno delecionado, alterado o truncado; expresión aumentada de factor coestimulador). En determinados casos, una célula huésped es una célula progenitora hematopoyética humana transducida con una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena que codifica para una cadena TCRa específica para un péptido antigénico de WT-1.

Tal como se usa en el presente documento, “trastorno hiperproliferativo” se refiere al exceso de crecimiento o proliferación en comparación con una célula normal o no enferma. Los trastornos hiperproliferativos a modo de ejemplo incluyen tumores, cánceres, tejido neoplásico, carcinoma, sarcoma, células malignas, células premalignas, así como trastornos hiperproliferativos no neoplásicos o no malignos (por ejemplo, adenoma, fibroma, lipoma, leiomioma, hemangioma, fibrosis, reestenosis, así como enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, osteoartritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal o similares).

Proteínas de unión específicas para péptidos antigénicos de WT-1

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona una proteína de unión (por ejemplo, una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o porción de la misma), que comprende (a) un dominio de cadena variable a (Va) de receptor de células T (TCR) que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 mostrada en SEQ ID NO.:23, una secuencia de aminoácidos de c DR2 mostrada en SEQ ID NO.:24 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NO.:25, 26, 32, 38, 44, 50 y 51, y un dominio variable de cadena p (Vp) de TCR; o (b) un dominio Va de (a) y un dominio Vp que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 mostrada en SEQ ID NO.:27, una secuencia de aminoácidos de CDR2 mostrada en SEQ ID NO.:28 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 mostrada en SEQ ID NO.:29. Una proteína de unión de este tipo es capaz de unirse con una alta afinidad a un complejo péptido derivado de WT-1:antígeno leucocitario humano (HLA). En casos particulares, la proteína de unión se une a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):antígeno leucocitario humano (HLA) con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.

En determinados casos, una proteína de unión (por ejemplo, una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o porción de la misma) o un receptor de células T (TCR) recombinante de alta afinidad específicos para WT-1, tal como se describe en el presente documento, incluye especies de polipéptidos variantes que tienen una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos en relación con las secuencias de las SEQ ID NO:1-15, 21 y 22, tal como se presenta en el presente documento, siempre que la proteína de unión conserve o conserve sustancialmente su función de unión específica. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se conocen bien, y pueden producirse de manera natural o pueden introducirse cuando la proteína de unión o el TCR se produce de manera recombinante. Las sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos pueden introducirse en una proteína usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001). Pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específicos de sitio (o específicos de segmento) dirigidos por oligonucleótidos para proporcionar un polinucleótido alterado que tiene codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción deseada. Alternativamente, pueden usarse técnicas de mutagénesis al azar o por saturación, tales como mutagénesis de exploración con alanina, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores y mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para preparar variantes de polipéptidos inmunógenos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente).

La especies (o variantes) de una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o un receptor de células T (TCR) recombinante de alta afinidad específico para WT-1 particulares pueden incluir una proteína que tiene al menos el 85%, el 90%, el 95% o el 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo divulgadas en el presente documento (por ejemplo, las SEQ ID NO:1-15, 21 y 22), siempre que (a) al menos tres o cuatro de las CDR no tengan mutaciones, (b) las CDR que sí tienen mutaciones sólo tengan hasta dos sustituciones de aminoácidos, hasta una deleción de cinco aminoácidos contiguos o una combinación de las mismas y (c) la proteína de unión conserve su capacidad de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.

En otros aspectos, la presente divulgación proporciona una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas, que comprende (a) un dominio variable de cadena a (Va) de receptor de células T (TCR) que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2 y un dominio variable de cadena p (Vp) de TCR; o (b) un dominio Va y un dominio Vp que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9; o (c) un dominio Va de (a) y un dominio Vp de (b); en la que la proteína de unión es capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM. En determinados casos, el dominio Va comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2, el dominio Vp comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9, o una combinación de los mismos.

En aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona un receptor de células T (TCR) recombinante de alta afinidad, que comprende una cadena a y una cadena p, en el que la cadena a comprende un dominio Va que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2, en el que el TCR se une a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 en una superficie celular independientemente o en ausencia de CD8. En determinados casos, el dominio Va comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2, el dominio Vp comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9, o una combinación de los mismos. En determinados casos, una cadena Vp es un alelo Vp17.

Una variedad de criterios conocidos por los expertos en la técnica indican si un aminoácido que está sustituido en una posición particular en un péptido o polipéptido es conservadora (o similar). Por ejemplo, un aminoácido similar o una sustitución conservadora de aminoácido es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Los aminoácidos similares pueden incluirse en las siguientes categorías: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina); aminoácidos con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico); aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, histidina); aminoácidos con cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); aminoácidos con cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). La prolina, que se considera más difícil de clasificar, comparte propiedades con aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, leucina, valina, isoleucina y alanina). En determinadas circunstancias, la sustitución de glutamina por ácido glutámico o asparagina por ácido aspártico puede considerarse una sustitución similar en que la glutamina y la asparagina son derivados amídicos de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Tal como se entiende en la técnica, la “similitud” entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de la misma del polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido (por ejemplo, usando GENEWORKS, Align, el algoritmo BLASt u otros algoritmos descritos en el presente documento y practicados en la técnica).

En determinados casos, una proteína de unión o un TCR específicos de WT-1 comprende un dominio Va que es al menos aproximadamente el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID No .:21 ó 22 y comprende un dominio Vp que es al menos aproximadamente el 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:9, siempre que (a) al menos tres o cuatro de las CDR no tengan mutaciones y (b) las CDR que sí tienen mutaciones sólo tengan hasta dos sustituciones de aminoácidos, una deleción de hasta cinco aminoácidos contiguos o una combinación de las mismas. En casos adicionales, una proteína de unión o un TCR específicos de WT-1 comprende un dominio Va que es al menos aproximadamente el 95% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2 y comprende un dominio Vp que es al menos aproximadamente el 95% idéntico a la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9, siempre que la proteína de unión sea capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM.

En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, una proteína de unión o un TCR específicos de WT-1 es capaz de (a) unirse específicamente a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA en una superficie celular independientemente o en ausencia de CD8, (b) unirse específicamente a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201, (c) unirse al complejo RMFp Na PYL (Se Q ID NO.:16):HLA-A*201 con una Kd menor de o igual a aproximadamente 3 nM o (d) cualquier combinación de los mismos.

En determinados casos, el dominio Va de una proteína de unión o un TCR específicos de WT-1 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:1 ó 2. En otros casos, el dominio Vp comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9.

En todavía casos adicionales, una proteína de unión o un TCR específicos de WT-1 comprende un dominio constante de cadena a que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:3 ó 4, comprende un dominio constante de cadena p que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:10 u 11o cualquier combinación de los mismos. En determinados casos, una cadena Vp es un alelo Vp17.

En determinados casos, una proteína de unión específica de WT-1 es un receptor de células T (TCR), un receptor de antígeno quimérico o un fragmento de unión a antígeno de un TCR, pudiendo ser cualquiera de los cuales quimérico, humanizado o humano. En casos adicionales, un fragmento de unión a antígeno del TCR comprende un TCR de cadena sencilla (scTCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). En determinados casos, una proteína de unión específica de WT-1 es un TCR. En casos relacionados, una proteína de unión específica de WT-1 (a) comprende una cadena a de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una cualquiera de las SEQ ID NO.:5-8 y comprende una cadena p de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:12 ó 13; (b) tiene una cadena a de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:5 y la cadena p de TCR comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:12; (c) tiene una cadena a de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:7 y la cadena p de TCR comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:12; (d) tiene una cadena a de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:6 y la cadena p de TCR comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:13; o (e) tiene una cadena a de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:8 y la cadena p de TCR comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:13.

En determinados casos, se proporciona una composición que comprende un proteína de unión específica de WT o un TCR recombinante de alta afinidad según uno cualquiera de los casos mencionados anteriormente y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los métodos útiles para aislar y purificar TCR soluble producido de manera recombinante, a modo de ejemplo, pueden incluir obtención de sobrenadantes a partir de sistemas de célula huésped/vector adecuados que secretan el TCR soluble recombinante en medios de cultivo y luego concentración de los medios usando un filtro disponible comercialmente. Tras la concentración, el concentrado puede aplicarse a una sola matriz de purificación adecuada o a una serie de matrices adecuadas, tales como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Pueden emplearse una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Estos métodos de purificación también pueden emplearse cuando se aísla un inmunógeno a partir de su entorno natural. Los métodos para la producción a gran escala de uno o más de los TCR solubles aislados/recombinantes descritos en el presente documento incluyen cultivo celular discontinuo, que se monitoriza y controla para mantener unas condiciones de cultivo apropiadas. La purificación del TCR soluble puede realizarse según los métodos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica y que se ajustan a las leyes y directrices de las agencias reguladoras nacionales e internacionales.

En determinados casos, se usan moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o un TCR de afinidad potenciada específicos para WT-1 para transfectar/transducir una célula huésped (por ejemplo, células T) para su uso en terapia de transferencia adoptiva. Se han descrito avances en la secuenciación de t Cr (por ejemplo, Robins et al., 2009 Blood 114:4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med.

2:47ra64, PMID: 20811043; Robins et al. 2011 (Sept. 10) J. Imm. Met. Publicación electrónica previa a la impresión, PMID: 21945395; Warren et al., 2011 Genome Res. 21:790) y pueden emplearse en el transcurso de la práctica de los aspectos según la presente divulgación. De manera similar, se han descrito métodos para transfectar/transducir células T con ácidos nucleicos deseados (por ejemplo, el documento US 2004/0087025) al igual que procedimientos de transferencia adoptiva usando células T de especificidad de antígeno deseada (por ejemplo, Schmitt et al., Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261,2008; Wang et al., Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; el documento US 2011/0243972; el documento US2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007), de tal manera que se contempla la adaptación de estas metodologías a los aspectos divulgados en el presente documento, basándose en las enseñanzas en el presente documento, incluyendo aquellas dirigidas a TCR de afinidad potenciada específicos para antígeno peptídico de WT-1 RMFPNAPYL (s Eq ID n O.:16) que forma un complejo con un receptor de HLA.

Las proteínas o los dominios de unión específicos de WT-1, tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, las SEQ ID NO:1-15 y 21-31 y variantes de las mismas), pueden caracterizarse funcionalmente según cualquiera de un gran número de metodologías aceptadas en la técnica para someter a ensayo la actividad de células T, incluyendo la determinación de la unión, activación o inducción de células T, y también incluyendo la determinación de respuestas de células T que son específicas de antígeno. Los ejemplos incluyen la determinación de la proliferación de células T, la liberación de citocinas de células T, la estimulación de células T específicas de antígeno, la estimulación de células T restringidas por CMH, la actividad de CTL (por ejemplo, mediante la detección de la liberación de 51Cr a partir de células diana cargadas previamente), cambios en la expresión de marcadores fenotípicos de células T y otras mediciones de funciones de células T. Los procedimientos para realizar estos ensayos y ensayos similares pueden encontrarse, por ejemplo, en Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998). Véanse también Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell y Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green y Reed, Science 281:1309 (1998) y las referencias citadas en los mismos).

“Tinción con tetrámero de CMH-péptido” se refiere a un ensayo usado para detectar células T específicas de antígeno, que presenta un tetrámero de moléculas de CMH, comprendiendo cada una un péptido idéntico que tiene una secuencia de aminoácidos que es relacionada (por ejemplo, idéntica o relacionada con) de al menos un antígeno (por ejemplo, WT-1), en el que el complejo es capaz de unirse a receptores de células T específicos para el antígeno relacionado. Cada una de las moléculas de CMH puede etiquetarse con una molécula de biotina. Los CMH/péptidos biotinilados se tetramerizan mediante la adición de estreptavidina, que pueden marcarse de manera fluorescente. El tetrámero puede detectarse mediante citometría de flujo a través de un marcador fluorescente. En determinados casos, un ensayo de tetrámero de CMH-péptido se usa para detectar o seleccionar TCR de afinidad potenciada de la presente divulgación.

Los niveles de citocinas pueden determinarse según los métodos descritos en el presente documento y practicarse en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, ELISPOT, tinción intracelular de citocinas y citometría de flujo, y combinaciones de los mismos (por ejemplo, tinción intracelular de citocinas y citometría de flujo). La proliferación de células inmunitarias y la expansión clonal que resultan de una provocación o estimulación específica de antígeno de una respuesta inmunitaria pueden determinarse mediante el aislamiento de linfocitos, tales como linfocitos circulantes en muestras de células de sangre periférica o células de los ganglios linfáticos, la estimulación de las células con antígeno y la medición de la producción de citocinas, la proliferación celular y/o la viabilidad celular, tal como mediante la incorporación de timidina tritiada o ensayos no radiactivos, tales como ensayos con MTT y similares. El efecto de un inmunógeno descrito en el presente documento sobre el equilibrio entre una respuesta inmunitaria Th1 y una respuesta inmunitaria Th2 puede examinarse, por ejemplo, mediante la determinación de los niveles de citocinas Th1, tales como IFN-y, IL-12, IL-2 y TNF-p, y citocinas de tipo 2, tales como IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13.

Polinucleótidos que codifican para proteínas de unión específicas para péptidos antigénicos de WT-1

Pueden producirse y prepararse moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican para una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o un receptor de células T (TCR) recombinante de alta afinidad específicos para WT-1, tal como se describen en el presente documento, según diversos métodos y técnicas de las técnicas de biología molecular o purificación de polipéptidos. La construcción de un vector de expresión que se usa para producir de manera recombinante una proteína de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o un TCR recombinante de alta afinidad específicos para WT-1 de interés puede lograrse usando cualquier técnica de modificación por ingeniería genética de biología molecular adecuada conocida en la técnica, incluyendo el uso de digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación de ADN, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook et al. (ediciones de 1989 y 2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (2003)). Para obtener una transcripción y una traducción eficientes, un polinucleótido en cada constructo de expresión recombinante incluye al menos una secuencia de control de la expresión apropiada (también denominada secuencia reguladora), tal como una secuencia líder y, particularmente, un promotor unido de manera operable (es decir, operativamente) a la secuencia de nucleótidos que codifica para el inmunogén. En determinados casos, un polinucleótido que tiene codones optimizados para la expresión eficiente en una célula huésped diana.

Determinados aspectos se refieren a ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos contemplados en el presente documento, por ejemplo, proteínas de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o TCR recombinantes de alta afinidad específicos para WT-1. Tal como reconocerá un experto en la técnica, un ácido nucleico puede hacer referencia a ADN, ADNc o ARN monocatenarios o bicatenarios en cualquier forma, y puede incluir una cadena positiva y una negativa del ácido nucleico con el que se complementa, incluyendo ADN, ADNc y ARN antisentido. También se incluyen ARNip, microARN, híbridos de ARN-ADN, ribozimas y otras diversas formas que se producen de manera natural o sintéticas de ADN o ARN.

Pueden usarse técnicas convencionales para la síntesis de ADN recombinante, péptidos y oligonucleótidos, inmunoensayos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o tal como se logra comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Estas técnicas y procedimientos y relacionados pueden realizarse generalmente según métodos convencional bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas en técnicas de microbiología, biología molecular, bioquímica, genética molecular, biología celular, virología e inmunología que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley y Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford Univ. Press EE.UU., 1985); Current Protocols in Immunology (editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Etan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, editado porJulie Logan, Kirstin Edwards y Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, RU; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, Nueva York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985) ; Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986) ; Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3a edición, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walquer, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6a edición, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney y Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, y Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008).

Determinados aspectos incluyen ácidos nucleicos contenidos en un vector. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente vectores adecuados para su uso con determinados aspectos divulgados en el presente documento. Un vector típico puede comprender una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido, o que es capaz de replicarse en un organismo huésped. Algunos ejemplos de vectores incluyen plásmidos, vectores virales, cósmidos y otros. Algunos vectores pueden ser capaces de la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos), mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y replicarse de ese modo junto con el genoma huésped. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente (estos vectores pueden denominarse “vectores de expresión”). Según aspectos relacionados, se entiende además que, si uno o más agentes (por ejemplo, polinucleótidos que codifican para proteínas de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o TCR recombinantes de alta afinidad específicos para WT-1 o variantes de los mismos, tal como se describen en el presente documento) se administran conjuntamente a un sujeto, cada agente puede residir en el mismo vector o en vectores independientes, y pueden introducirse múltiples vectores (conteniendo cada uno un agente diferente el mismo agente) en una célula o población de células o administrarse a un sujeto.

En determinados casos, el ácido nucleico que codifica para proteínas de unión de la superfamilia de inmunoglobulinas o TCR recombinantes de alta afinidad específicos para WT-1 puede unirse operativamente a determinados elementos de un vector. Por ejemplo, pueden unirse operativamente secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que se ligan. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir secuencias de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y posiblemente secuencias que potencian la secreción de proteínas. Las secuencias de control de la expresión pueden unirse operativamente si son contiguas con el gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.

En casos particulares, el vector de expresión recombinante se administra a una célula apropiada, por ejemplo, una célula T o una célula presentadora de antígeno, es decir, una célula que presenta un complejo péptido/CMH en su superficie celular (por ejemplo, una célula dendrítica) y carece de CD8. Por tanto, los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir, por ejemplo, elementos reguladores de la transcripción (TRE) específicos de tejido linfático, tales como TRE específicos de linfocitos B, linfocitos T o células dendríticas. En la técnica se conocen t Re específicos de tejido linfático (véanse, por ejemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043, 1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663, 1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483, 1993).

Además de vectores, determinados aspectos se refieren a células huésped que comprenden los vectores que se divulgan en el presente documento. Un experto en la técnica entiende fácilmente que en la técnica hay disponibles muchas células huésped adecuadas. Una célula huésped puede incluir cualquier célula individual o cultivo celular que puede recibir un vector o la incorporación de ácidos nucleicos y/o proteínas, así como cualquier células de progenie. El término también abarca progenie de la célula huésped, ya sea genética o fenotípicamente la misma o diferente. Las células huésped adecuadas pueden depender del vector y pueden incluir células de mamífero, células animales, células humanas, células de simio, células de insecto, células de levadura y células bacterianas. Estas células pueden inducirse para incorporar el vector u otro material mediante el uso de un viral vector, transformación a través de precipitación con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, microinyección u otros métodos. Por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Métodos de tratamiento

En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a métodos para tratar un trastorno o estado hiperproliferativo caracterizado por la sobreexpresión de WT-1 mediante la administración a un sujeto humano que lo necesita de una composición que comprende una proteína de unión o TCR recombinante de alta afinidad específicos para la proteína 1 de tumor de Wilms (WT-1) humana según cualquiera de las proteínas de unión o los TCR mencionados anteriormente.

La presencia de un trastorno hiperproliferativo o estado maligno en un sujeto se refiere a la presencia de células displásicas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, incluyendo, por ejemplo células neoplásicas, tumorales, inhibidas sin contacto o transformadas de manera oncogénica, o similares (por ejemplo, cánceres sólidos; cánceres hemáticos incluyendo linfomas y leucemias, tales como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, etc.), que se conocen en la técnica y para los que se establecen criterios de diagnóstico y clasificación (por ejemplo, Hanahan y Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan y Weinberg 2000 Cell 100:57; Cavallo et al., 2011 Canc. Immunol. Immunother. 60:319; Kyrigideis et al., 2010 J. Carcinog. 9:3). En determinados casos, tales células cancerosas pueden ser células de leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica de células B, leucemia linfoblástica de células T o mieloma, incluyendo células madre cancerosas que son capaces de iniciar y trasplantar en serie cualquiera de estos tipos de cáncer (véase, por ejemplo, Park et al. 2009 Molec. Therap. 17:219).

En determinados casos, se proporcionan métodos para tratar un trastorno hiperproliferativo, tal como una neoplasia maligna hemática o un cáncer sólido. Las neoplasias malignas hemáticas a modo de ejemplo incluyen leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia eosinofílica crónica (LEC), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o mieloma múltiple (MM).

En casos adicionales, se proporcionan métodos para tratar un trastorno hiperproliferativo, tal como un cáncer sólido que se selecciona de cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, carcinoma de huesos y tejidos blandos, tumor de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer colorrectal, tumor desmoide, cáncer embrionario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma maligno, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal de páncreas, tumor astrocítico primario, cáncer de tiroides primario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, rabdomiosarcoma, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, tumor de células germinativas de testículo, cáncer urotelial, sarcoma uterino o cáncer de útero.

Tal como entiende un experto en la técnica médica, los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren a la gestión médica de una enfermedad, un trastorno o un estado de un sujeto (es decir, paciente, huésped, que puede ser un humano o un animal no humano) (véase, por ejemplo, Stedman's Medical Dictionary). En general, una dosis y un régimen de tratamiento adecuados proporcionan uno o más de una proteína de unión o un TCR recombinante de alta afinidad específicos para WT-1 humana (por ejemplo, las SEQ ID NO:1-15 y 21-31, y variantes de las mismas) o una célula huésped que expresa los mismos, y opcionalmente una terapia complementaria (por ejemplo, una citocina tal como IL-2, IL-15, IL-21 o cualquier combinación de las mismas), en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico. El beneficio terapéutico o profiláctico que resulta de los métodos preventivos o profilácticos o de tratamiento terapéutico incluyen, por ejemplo, un desenlace clínico mejorado, en los que el objetivo es prevenir o retardar o reducir de otro modo (por ejemplo, disminuir de manera estadísticamente significativa en relación con un control sin tratar) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, o prevenir, retardar o reducir de otro modo la expansión o gravedad de una enfermedad o un trastorno de este tipo. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados a partir del tratamiento de un sujeto incluyen abatimiento, reducción o alivio de los síntomas que resultan de o están asociados con la enfermedad o el trastorno que va a tratarse; apariencia disminuida de síntomas; calidad de vida mejorada; estado libre de enfermedad más largo (es decir, disminución de la probabilidad o propensión de que el sujeto presente síntomas a partir de los cuales se realiza el diagnóstico de una enfermedad); disminución de la extensión de la enfermedad; estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento); retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad; mejora o paliación del estado de la enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable; o supervivencia global.

“Tratamiento” también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no estuviera recibiendo tratamiento. Los sujetos que necesitan los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen aquellos que ya tienen la enfermedad o el trastorno, así como sujetos propensos a tener o en riesgo de desarrollar la enfermedad o el trastorno. Los sujetos que necesitan tratamiento profiláctico incluyen sujetos en los que va a prevenirse la enfermedad, el estado o el trastorno (es decir, disminuir la probabilidad de aparición o recidiva de la enfermedad o el trastorno). El beneficio clínico proporcionado por las composiciones (y las preparaciones que comprenden las composiciones) y los métodos descritos en el presente documento pueden evaluarse mediante el diseño y la ejecución de ensayos in vitro, estudios preclínicos y estudios clínicos en sujetos a quienes se pretende beneficiar con la administración de las composiciones, tal como se describe en los ejemplos.

Las células que expresan la proteína de unión o el TCR recombinante de alta afinidad específicos para WT-1 humana, tal como se describen en el presente documento, pueden administrarse a un sujeto en un excipiente o portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable o adecuado. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles, por ejemplo, solución salina fisiológica, que se describen con más detalle en el presente documento, que son adecuados para la administración a un sujeto humano u otro mamífero no humano.

Una dosis terapéuticamente eficaz es una cantidad de células huésped (que expresan una proteína de unión o un TCR recombinante de alta afinidad específicos para WT-1 humana) usada en transferencia adoptiva que es capaz de producir un resultado clínicamente deseable (es decir, una cantidad suficiente para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria de células T específica contra células que sobreexpresan WT-1 (por ejemplo, una respuesta de células T citotóxicas) de manera estadísticamente significativa) en un humano o mamífero no humano tratado. Tal como se conoce bien en las técnicas médicas, la dosificación para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el peso, el área de superficie corporal, la edad, la terapia particular que va a administrarse, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que están administrándose de manera concurrente. Las dosis variarán, pero una dosis preferida para la administración de una célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento es de aproximadamente 107 células/m2, aproximadamente 5 x 107 células/m2, aproximadamente 108 células/m2, aproximadamente 5 x 108 células/m2, aproximadamente 109 células/m2, aproximadamente 5 x 109 células/m2, aproximadamente 1010 células/m2, aproximadamente 5 x 1010 células/m2 o aproximadamente 1011 células/m2.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera apropiada para la enfermedad o el estado que va a tratarse (o prevenirse) tal como determinan los expertos en la técnica médica. Una dosis apropiada y una duración y frecuencia de administración adecuadas de las composiciones se determinarán por factores tales como el estado de salud del paciente, el tamaño del paciente (es decir, el peso, la masa o el área corporal), el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, la forma particular del principio activo y el método de administración. En general, una dosis y un régimen de tratamiento apropiados proporcionan las composiciones en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico (tal como se describe en el presente documento, incluyendo un desenlace clínico mejorado, tal como remisiones completas o parciales más frecuentes, o supervivencia global y/o libre de enfermedad más larga, o una reducción de la intensidad de los síntomas). Para el uso profiláctico, una dosis debe ser suficiente para prevenir, retrasar la aparición de o disminuir la gravedad de una enfermedad asociada con enfermedad o trastorno. El beneficio profiláctico de las composiciones inmunogénicas administradas según los métodos descritos en el presente documento puede determinarse realizando estudios preclínicos (incluyendo estudios in vitro e in vivo en animales) y clínicos y analizando los datos obtenidos a partir de los mismos mediante técnicas y métodos estadísticos, biológicos y clínicos apropiadas, todos ellos pudiéndose practicar fácilmente por un experto en la técnica.

Un estado asociado con la sobreexpresión de WT-1 incluye cualquier trastorno o estado en el que la hipoactividad, hiperactividad o actividad inadecuada de un acontecimiento celular o molecular de WT-1 está presente, y normalmente resulta de niveles inusualmente altos (con significación estadística) de expresión de WT-1 en células afectadas (por ejemplo, células leucémicas), en relación con células normales. Un sujeto que tiene un trastorno o estado de este tipo se beneficiaría del tratamiento con una composición o un método de los aspectos descritos en el presente documento. Por tanto, algunos estados asociados con la sobreexpresión de WT-1 pueden incluir trastornos y enfermedades tanto agudos como crónicos, tales como aquellas patologías que predisponen al sujeto a un trastorno particular.

Algunos ejemplos de estados asociados con la sobreexpresión de WT-1 incluyen trastornos hiperproliferativos, que se refieren a estados de células activadas y/o en proliferación (que también pueden ser hiperactivas de manera transcripcional) en un sujeto, incluyendo tumores, neoplasias, cáncer, neoplasias malignas, etc. Además de células activadas o en proliferación, el trastorno hiperproliferativo también puede incluir una aberración o desregulación de los procesos de muerte celular, ya sean mediante necrosis o apoptosis. Tal aberración de los procesos de muerte celular puede estar asociada con una variedad de estados, incluyendo cáncer (incluyendo neoplasias malignas primarias, secundarias así como metástasis) u otros estados.

Según determinados aspectos, prácticamente cualquier tipo de cáncer que se caracteriza por la sobreexpresión de WT-1 puede tratarse mediante el uso de las composiciones y los métodos divulgados en el presente documento, incluyendo cánceres hemáticos (por ejemplo, leucemia incluyendo leucemia mielógena aguda (LMA), linfomas de células T o B, mieloma y otros). Además, “cáncer” puede referirse a cualquier proliferación acelerada de células, incluyendo tumores sólidos, tumores ascíticos, neoplasias malignas hemáticas o linfáticas u otras; neoplasias malignas de tejido conjuntivo; enfermedad metastásica; enfermedad residual mínima después de un trasplante de órganos o célula madres; cánceres resistentes a múltiples fármacos, neoplasias malignas primarias o secundarias, angiogénesis relacionada con una neoplasia maligna u otras formas de cáncer. También se contemplan dentro de los aspectos divulgados en el presente documento casos específicos en los que sólo se incluye uno de los tipos de enfermedad anteriores, o en los que pueden excluirse estados específicos independientemente de si están caracterizados o no por la sobreexpresión de w T-1.

Determinados métodos de tratamiento o prevención contemplados en el presente documento incluyen la administración de una célula huésped (que puede ser autóloga, alogénica o singénica) que comprende una molécula de ácido nucleico deseada tal como se describe en el presente documento que se integra de manera estable en el cromosoma de la célula. Por ejemplo, una composición celular de este tipo puede generarse ex vivo usando células del sistema inmunitario autólogas, alogénicas o singénicas (por ejemplo, células T, células presentadoras de antígeno, linfocitos citolíticos naturales) con el fin de administrar una composición de células T que seleccionan como diana WT-1 deseada a un sujeto como inmunoterapia adoptiva.

Tal como se usa en el presente documento, la administración de una composición o terapia se refiere a la administración de la misma a un sujeto, independientemente de la vía o el modo de administración. La administración puede efectuarse de manera continua o intermitente, y por vía parenteral. La administración puede ser para tratar un sujeto que ya se ha confirmado que tiene un estado, una enfermedad o un estado patológico reconocido, o para tratar un sujeto susceptible o en riesgo de desarrollar un estado, una enfermedad o un estado patológico de este tipo. La administración conjunta con una terapia complementaria puede incluir la administración simultánea y/o secuencial de múltiples agentes en cualquier orden y en cualquier pauta posológica (por ejemplo, células huésped recombinantes específicas de WT-1 con una o más citocinas; terapia inmunosupresora tal como inhibidores de calcineurina, corticosteroides, inhibidores de microtúbulos, baja dosis de un profármaco de ácido micofenólico o cualquier combinación de los mismos).

En determinados casos, se administra una pluralidad de dosis de una célula huésped recombinante tal como se describe en el presente documento al sujeto, que pueden administrarse en intervalos entre administraciones de aproximadamente dos a aproximadamente cuatro semanas. En casos adicionales, una citocina se administra secuencialmente, siempre que se le administrara al sujeto la célula huésped recombinante al menos tres o cuatro veces antes de la administración de la citocina. En determinados casos, la citocina se administra por vía subcutánea (por ejemplo, IL-2, IL-15, IL-21). En todavía casos adicionales, el sujeto que está tratándose recibe además terapia inmunosupresora, tal como inhibidores de calcineurina, corticosteroides, inhibidores de microtúbulos, baja dosis de un profármaco de ácido micofenólico o cualquier combinación de los mismos. En aún casos adicionales, el sujeto que está tratándose ha recibido un trasplante de células hematopoyéticas no mieloablativas o mieloablativas, en el que el tratamiento puede administrarse de al menos dos a al menos tres meses después del trasplante de células hematopoyéticas no mieloablativas.

Una cantidad eficaz de una composición terapéutica o farmacéutica se refiere a una cantidad suficiente, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr los resultados clínicos deseados o un tratamiento beneficioso, tal como se describe en el presente documento. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Si la administración es a un sujeto que ya se sabe o conoce que tiene una enfermedad o un estado patológico, el término “cantidad terapéutica” puede usarse en referencia a tratamiento, mientras que “cantidad profilácticamente eficaz” puede usarse para describir la administración de una cantidad eficaz a un sujeto que es susceptible o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un estado patológico (por ejemplo, recidiva) como transcurso preventivo.

El nivel de una respuesta inmunitaria de CTL puede determinarse mediante uno cualquiera de numerosos métodos inmunológicos descritos en el presente documento y practicados de manera rutinaria en la técnica. El nivel de una respuesta inmunitaria de CTL puede determinarse antes y después de la administración de una cualquiera de las proteínas de unión específicas de WT-1 descritas en el presente documento expresadas por, por ejemplo, una célula T. Los ensayos de citotoxicidad para la determinación de la actividad de CTL pueden realizarse usando una cualquiera de varias técnicas y varios métodos practicados de manera rutinaria en la técnica (véase, por ejemplo, Henkart et al., “Cytotoxic T-Lymphocytes” en Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA), páginas 1127-50 y las referencias citadas en el mismo).

Las respuestas de células T específicas de antígeno se determinan normalmente mediante comparaciones de las respuestas de células T observadas según uno cualquiera de los parámetros funcionales de células T descritos en el presente documento (por ejemplo, proliferación, liberación de citocinas, actividad de CTL, fenotipo de marcador de superficie celular alterado, etc.) que pueden realizarse entre células T que se exponen a un antígeno relacionado en un contexto apropiado (por ejemplo, el antígeno usado para cebar o activar las células T, cuando se presentan por células presentadoras de antígeno inmunocompatibles) y células T de la misma población fuente que se exponen en su lugar a un antígeno de control estructuralmente distinto o irrelevante. Una respuesta al antígeno relacionado que es mayor, con significación estadística, que la respuesta al antígeno de control significa especificidad de antígeno.

Una muestra biológica puede obtenerse de un sujeto para determinar la presencia y el nivel de una respuesta inmunitaria a un péptido antigénico derivado de WT-1 tal como se describe en el presente documento. Una “muestra biológica”, tal como se usa en el presente documento, puede ser una muestra de sangre (a partir de la cual puede prepararse suero o plasma), muestra de biopsia, líquidos corporales (por ejemplo, lavado pulmonar, ascitis, lavados mucosos, líquidos sinoviales), médula ósea, ganglios linfáticos, explanto de tejido, cultivo de órgano o cualquier otra preparación de tejido o celular del sujeto o una fuente biológica. Las muestras biológicas también pueden obtenerse del sujeto antes de recibir cualquier composición inmunogénica, cuya muestra biológica es útil como control para establecer los datos del nivel inicial (es decir, antes de la inmunización).

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden presentarse en recipientes de una sola dosis o de múltiples dosis, tales como ampollas o viales sellados. Tales recipientes pueden congelarse para preservar la estabilidad de la formulación hasta. En determinados casos, una dosis unitaria comprende una célula huésped recombinante tal como se describe en el presente documento a una dosis de aproximadamente 107 células/m2 a aproximadamente 1011 células/m2. El desarrollo de pautas posológicas y regímenes de tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración o formulación parenteral o intravenosa.

Si la composición objeto se administra por vía parenteral, la composición también puede incluir una disolución o suspensión acuosa u oleaginosa estéril. Los diluyentes o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos adecuados incluyen agua, disolución de Ringer, solución salina isotónica, 1,3-butanodiol, etanol, propilenglicol o polietilenglicoles en mezclas con agua. Las disoluciones o suspensiones acuosas pueden comprender además uno o más agentes tamponantes, tales como acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio o tartrato de sodio. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier formulación unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. La forma unitaria de dosificación, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; cada unidad puede contener un cantidad predeterminada de células recombinante o compuesto active calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un portador farmacéutico apropiado.

En general, una pauta posológica y un régimen de tratamiento apropiados proporcionan las moléculas activas o células en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico. Una respuesta de este tipo puede monitorizarse estableciendo un desenlace clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes, o supervivencia libre de enfermedad más larga) en sujetos tratados en comparación con sujetos sin tratar. Los aumentos en las respuestas inmunitarias preexistentes con respecto a una proteína tumoral se correlacionan generalmente con un desenlace clínico mejorado. Tales respuestas inmunitarias pueden evaluarse generalmente usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citocinas convencionales, que son rutinarios en la técnica y pueden realizarse usando muestras obtenidas de un sujeto antes y después del tratamiento.

Ejemplos

EJEMPLO 1

MÉTODOS

Constructos lentivirales

Se generaron diversos constructos de expresión de TCR que contenían genes de TCRa y TCRp con codones optimizados, derivados de un clon de células T CD8+ restringido por HLA-A2 (C4), que codifica para un TCR de alta afinidad específico para un péptido de WT-1 RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16) que forma un complejo con un receptor de HLA. Se unieron las moléculas de ácido nucleico que codifican para TCRa y TCRp mediante un elemento 2A del teschovirus porcino (P2A) para garantizar la expresión coordinada bajo el control de un promotor del virus de células madre murinas (MSCV) u 3. En determinados casos, se modificaron las porciones de las moléculas de ácido nucleico que codifican para los dominios constantes de TCRa y TCRp de C4 para expresar residuos de cisteína complementarios en las posiciones 48 (Thr por Cys) y 57 (Ser por Cys), respectivamente, para fomentar el apareamiento entre cadenas de las cadenas del TCR de C4 y para minimizar el apareamiento erróneo de las cadenas de TCR de C4 exógenas con cadenas de TCR endógenas.

El vector pRRLSIN-C4a-P2A-C4p contenía el constructo de expresión de TCR ligado en el vector lentiviral pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE entre los sitios de endonucleasa de restricción ^scI y SalI, reemplazando a GFP. El plásmido pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE es un vector lentiviral autoinactivante de tercera generación (véase Yang et al., J. Immunother. 31:830, 2008).

Bibliotecas de mutagénesis por saturación

Se construyeron dos bibliotecas de mutagénesis por saturación para generar e identificar mutaciones dentro de las regiones CDR de C4a (particularmente la CDR3) que dieron como resultado una mayor afinidad o afinidad potenciada por el complejo de HLA-A2/WT-1. La región CDR3 de C4a se compone de los siguientes aminoácidos: CAATEDYQLIW (SEQ ID NO.:25). Se construyeron dos bibliotecas aleatorizadas que abarcaban los residuos ATE y DYQ usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange II (Agilent), usando el vector lentiviral pRRLSIN-C4a-P2A-P como molde. Se diseñaron cebadores de mutagénesis según el protocolo de Quikchange modificado descrito por Zheng et al. (Nucleic Acids Res. 32:e115, 2004) y se incorporaron nucleótidos NNK aleatorizados (en los que N = A, C, G o T y K = G o T) para cada posición de aminoácido que va a aleatorizarse. Esto produjo 32 codones diferentes, que codifican para los 20 aminoácidos, y un codón de parada. Se transformaron células T1 Electromax DH10B de eficiencia de alta transformación (mayor de 1 x 10¹⁰) con la composición de reacción de mutagénesis y se determinó el número de clones independientes titulando y cultivando una fracción de la reacción de transformación en placas de LB-ampicilina. Después de determinar el número total de clones, se sembró en placa la mezcla de transformación en placas de LB-ampicilina a aproximadamente 5.000 clones por placa. Después de 18 horas de cultivo a 37°C, se añadieron 0,5-1 ml de LB a las placas con bibliotecas y se recogieron juntas todas las colonias, se centrifugaron y se aisló ADN de biblioteca de plásmidos de alta calidad usando el kit Endofree plasmid Maxi (Qiagen).

Se estimó que el tamaño de la biblioteca incluía aproximadamente 100.000 clones independientes, lo que se estimó que daba como resultado una biblioteca que estaba completa en aproximadamente el 95%. Para medir la eficiencia de la de reacción mutagénesis y la diversidad de la biblioteca, se secuenció el ADN plasmídica de la biblioteca combinada y se determinó que la proporción de cada nucleótido en cada una de las posiciones aleatorizadas era equivalente comparando la señal relativa para cada nucleótido en un cromatograma de secuenciación (datos no mostrados).

Selección de bibliotecas de mutagénesis por saturación

Para cada biblioteca, se generó lentivirus transduciendo tres placas de células 293T (aproximadamente 7 x 10⁶células/placa) con la biblioteca de plásmidos de alta calidad, simultáneamente con los tres vectores de empaquetamiento pMDLg/pRRE, pMD2-G y pRSV-REV. Después de 2 días, se combinaron los sobrenadantes de las tres placas y se congelaron alícuotas para uso futuro.

Se tituló el sobrenadante lentiviral para determinar la concentración óptima para su utilización para las transducciones con el fin de minimizar la probabilidad de que las células diana se transduzcan con más de un TCR derivado de las bibliotecas. Se determinó la eficiencia de transducción total analizando el porcentaje de células que expresan la cadena beta transgénica (Vp17). Se eligió una dilución que produjo una tasa de transducción de aproximadamente el 20% y se usó para transducir aproximadamente 2-5 x 10⁷células J.RT3. Se clasificaron las células transducidas de las bibliotecas mediante citometría de flujo para determinar altos niveles de tinción con tetrámero deWT-1 en presencia o ausencia de 1 |i g/ml de anticuerpo anti-CMH de clase I competidor y se expandieron en cultivo múltiples veces. Se lisaron las poblaciones clasificadas que se unieron al tetrámero de WT-1 a mayores niveles que las células J.RT3 transducidas con el constructo C4a-P2A-C4p parental y se aisló el ADN genómico usando un kit DNeasy (Qiagen). Se usó el ADN aislado para la amplificación por PCR del inserto lentiviral usando cebadores que flanquean el constructo de expresión de TCR y que produjeron una sola banda del tamaño correspondiente. Se clonó el producto de PCR en pENTR-D-Topo (Invitrogen) y se caracterizaron los clones mediante análisis de secuencias de a Dn .

Tras el análisis de secuencias de los clones aislados, se escindió un fragmento AscI-BamHI de 750 pb que contenía la región CDR3 de C4a a partir de los clones candidatos y se ligó en el vector pRRLSIN-C4a-P2A-C4p parental. Luego se transdujeron los mutantes candidatos en células J.RT3 y PBMC junto con el constructo C4 parental y se evaluaron los mutantes para determinar la afinidad de unión a HLA-A2/WT-1^{126’ 134}(RMFPNAPYL, SEQ ID NO.:16).

Afinidad relativa mediante titulación con tetrámeros

Se tiñeron los clones de células T con diluciones en serie al 50% de tetrámero de WT-1 y se analizaron mediante citometría de flujo. Se realizó el análisis estadístico en Graphpad Prism. Se extrapolaron los valores de Kd usando un algoritmo de regresión no lineal a una curva de unión de saturación con la fórmula Y=Bmáx *X/[Kd+X].

EJEMPLO 2

IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE TCR ESPECÍFICOS DE WT-1 DE ALTA AFINIDAD

Con el fin de identificar clones de células T específicos de WT-1^{126' 134}restringidos por HLA-A2 de alta afinidad, se generaron clones de células T a partir del repertorio periférico de más de 50 donantes. Se evaluaron adicionalmente los diez mejores clones que mostraron la mayor afinidad aparente mediante tinción con tetrámero tiñendo cada con concentraciones tituladas de tetrámero de WT-1 y ajustando los datos de intensidad de fluorescencia media resultantes a una curva de unión de saturación (figura 1). Se identificaron las secuencias de los genes de TCRa y TCRp mediante RACE PCR y se realizó la secuenciación de los cuatro clones con la mayor afinidad relativa (C4, P1, P20 y P22).

Para caracterizar adicionalmente los TCR específicos de WT-1126-134 a partir de estos clones de células T candidatos, se generaron constructos de expresión con codones optimizados para cada par de cadenas TCRa y TCRp. Para cada constructo, se separaron las cadenas a y p por un elemento P2A para fomentar la expresión coordinadas de las cadenas TCRa y TCRp (véanse, por ejemplo, Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 22:589, 2004; Dossett et al., Mol. Ther.

17:742,2009). Además, se introdujeron mutaciones puntuales para crear un segundo par de residuos de cisteína en las regiones proximales a la membrana externa de los dominios constantes de TCRa y TCRp para fomentar el apareamiento preferencial de las cadenas de TCR introducidas (Kuball et al., Blood 109:2331, 2007). Finalmente, se clonaron estos constructos modificados con cisteína con codones optimizados en el vector lentiviral pRRLSIN.cPPT-MSCV.WPRE (véase la figura 3C).

A continuación, se examinó la capacidad de cada uno de los pares de TCRap introducidas competir con las cadenas de TCR endógenas para la asociación con componentes de CD3 y la expresión en la superficie de células T (véase, por ejemplo, Heemskerk et al., Blood 109:235, 2007). Se transdujeron TCRc 4, TCRp20 y TCRp22 modificados con cisteína con codones optimizados en PBMC y se determinó el porcentaje de células positivas para tetrámero dentro de la población de células T CD8+ transducida (figura 2A). Se determinó la población transducida total restando el porcentaje de expresión de cadenas Vp endógenas en el control sin transducir del porcentaje de células T específicas de Vp de TCR en las poblaciones transducidas (figura 2A).

Para determinar la capacidad de cada TCR para unirse a tetrámero independientemente de CD8, que está asociado con alta afinidad por el péptido/CMH, se seleccionaron PBMC transducidas en células T CD4+ y se evaluó la tinción con tetrámero de WT-1 (figura 2B). Ambos clones, TCRc 4 y TCRp-i , se unieron al tetrámero independientemente de CD8. Además, TCRc 4 mostró los mayores niveles de tinción con tetrámero independientemente de CD8 y las PBMC transducidas con el constructo TCRc 4 mostraron el mayor porcentaje de células T positivas para tetrámero de WT-1. Se seleccionó el clon TCRc 4 modificado con cisteína con codones optimizados, que también mostró la mayor afinidad relativa de entre todos los clones estudiados, para los estudios de modificación y funcionales.

EJEMPLO 3

MEJORA DEL CONSTRUCTO TCRc ⁴ESPECÍFICO DE WT-1 DE ALTA AFINIDAD

Tal como se describe en el ejemplo 2, se generó el constructo de expresión TCR^c4 de tipo natural (WT) (C4ap WT) a partir de TCRa y TCRp de cadena completa producidas mediante PCR 5'-RACE a partir del clon TCR^c4. Este constructo incluía el ácido nucleico que codifica para la cadena TCRa de C4 en la posición 5', seguido por un elemento P2A, y luego el ácido nucleico que codifica para la cadena TCR p de C4. Aunque las células T que expresan este constructo expresaron niveles similares de cadena Vp17 transgénica en la superficie celular, la tinción con tetrámero de WT-1 fue esencialmente indetectable, lo que indica que, a pesar de la modificación con cisteína, este constructo no dio como resultado una expresión génica de TCR suficiente para competir con el TCR endógeno. Tal como se describe en el ejemplo 2, la siguiente etapa fue generar un constructo TCRc 4 con codones optimizados (véase Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006), que mostró un aumento sustancial en la tinción con tetrámero (véanse las figuras 2A y 3A).

Se examinaron los constructos de C4ap y C4pa para determinar si un efecto posicional de las cadenas variables podría influir en la expresión en superficie de TCRc 4 (véase Leisegang et al., J. Mol. Med. 86:573, 2008). Las figuras 3A y 3B muestran un claro aumento de la tinción con tetrámero cuando se posicionó la cadena TCRp de C4 en 5' del elemento P2A, y este efecto fue más pronunciado después de la estimulación en puntos de tiempo tardíos, lo que indica que el constructo de TCR de C4ap fue relativamente menos eficiente que el constructo de TCR de C4pa en la competición por la expresión en superficie con el TCR endógeno, que se regula por disminución tras la estimulación de células T inicial, y aumenta gradualmente con el tiempo.

Estos datos indican que (1) el constructo de TCR de C4pa fue más eficiente en la competición por la expresión en superficie con el TCR endógeno que el constructo de TCR de C4ap, y (2) el P2A 21 de aminoácidos afectó a la función de la proteína TCRa más que la proteína TCRp cuando se ubicó en posición 5' del constructo TCR^c4 unido a P2A.

EJEMPLO 4

ESTABILIDAD EN LA SUPERFICIE DE CÉLULAS DE TCRc⁴ESPECÍFICO DE WT-1 FUNCIONAL

Con el fin de estudiar la estabilidad de la expresión de TCRc 4 funcional en la superficie de células T transducidas, se estimularon células T CD8+ de un donante A2+ con péptido de VEB GLCTLVAm L (SEQ ID NO.:127) para generar una población de células T específicas de VEB para la que pudo monitorizarse la expresión de TCR endógeno mediante tinción con tetrámero de VEB. Se transdujeron las células T con el constructo de expresión TCRc 424 horas después de la estimulación con péptido de VEB, dando como resultado la transducción preferencial de células T específicas de VEB. Este enfoque dio como resultado una población de células T VEB+, una población fácilmente detectable de células T doblemente positivas (DP) tetrámero de WT-1+/tetrámero de VEB+ transducidas con TCRc4, y una población de células T tetrámero de WT-1+ y tetrámero de VEB- transducidas con TCRc4 que o bien no fueron reactivas para VEB o bien que habían perdido la expresión en superficie de TCR de VEB debido a la competición con TCRc4 (figura 8A).

Luego se clasificó y expandió cada una de estas poblaciones para evaluar directamente la estabilidad de la expresión de TCRc4 funcional en células que expresan conjuntamente un TCR reactivo para VEB (figura 8B). Después de 12 días, se analizaron los cultivos para determinar la tinción con tetrámero de WT-1 y VEB. Las poblaciones de células T que se unieron inicialmente sólo a uno de los tetrámeros permanecieron casi exclusivamente positivas únicas (SP). Sin embargo, las células T que fueron uniformemente DP para ambos tetrámeros tras la clasificación celular se convirtieron preferencialmente en positivas únicas para la expresión de tetrámero de WT-1 tras 12 días de cultivo in vitro, mientras que muy pocas células fallaron en la tinción con tetrámero de WT-1 en convertirse en SP de VEB (figura 8B). Estos resultados indican que TCRc4 puede competir fácilmente con TCR endógenos para la expresión en superficie.

Para determinar si la población SP de tetrámero de WT-1 contiene principalmente células que habían competido con el TCR endógeno por la expresión en superficie, se clasificaron células T tetrámero de v Eb+, y luego se transdujo esta población purificada con el constructo TCRc4 tras la reestimulación con anticuerpo anti-CD3/CD28 o se reestimuló sin manipulación adicional (figura 8C). Las células T específicas de VEB que se transdujeron con el constructo TCRc4 se unieron casi exclusivamente al tetrámero de WT-1, lo que indica que Tc Rc4 es capaz de competir con la mayoría de TCR endógenos para la expresión en la superficie de células T.

EJEMPLO 5

GENERACIÓN DE TCR ESPECÍFICOS DE WT-1 DE ALTA AFINIDAD VARIANTES

Incluso los clones de células T específicos de WT-1 de la mayor afinidad identificados a partir del repertorio periférico de células T tendrán generalmente una afinidad atenuada en comparación con células T específicas para no autoantígenos (por ejemplo, antígenos virales), debido a la influencia de la selección negativa durante el desarrollo de células T, que fomenta la autotolerancia y protege contra la autoinmunidad. Por consiguiente, se usaron técnicas de mutagénesis por saturación para generar e identificar TCR de alta afinidad que tienen afinidad potenciada in vitro. Se generaron dos bibliotecas de mutagénesis por saturación que atraviesan la región CDR3 de la cadena C4a de TCR (CAATEDYQLIW, SEQ ID NO.:25), tal como se describe en el ejemplo 1. Se examinaron ambas bibliotecas en busca de variantes que tenían una afinidad potenciada por el epítopo de WT-1 tras la transducción en células J.RT3 seguido por clasificación celular basándose en un alto nivel de unión de tetrámero de HLA-A2/WT-1.

Se aislaron variantes de unión a tetrámero de HLA-A2/WT-1 candidatas de ambas bibliotecas, y una variante que tenía una mutación DYQ por DLT (C4-DLT) mostró niveles mayores de unión a de tetrámeros HLA-A2/WT-1 en comparación con el TCR de C4 sin mutar (C4-WT), y se encontró que tenía una cinética de unión en equilibrio potenciada al tetrámero de HLA-A2/WT-1 (figura 4A). Cabe destacar que estos experimentos se realizaron en presencia de CD8, que contribuye significativamente a interacciones TCR-péptido/CMH que, por tanto, pueden disminuir las diferencias aparentes en la afinidad relativa entre TCR.

Cuando se transfirió en células T CD8+ y se evaluó para determinar la capacidad de destruir células diana pulsadas con concentraciones decrecientes de péptido, C4-DLT mostró un aumento de 5-10 veces en la sensibilidad al antígeno en comparación con C4-WT (figura 4B), y se observó un aumento similar en la sensibilidad al antígeno cuando se sometió a ensayo la producción de citocinas (IFNy) en respuesta a concentraciones limitantes de péptido (figura 4C). Del mismo modo, las células T que expresan C4-DlT mostraron una destrucción potenciada (a través de la activación de caspasa-3) en comparación con células T que expresan C4-WT cuando se selecciona como diana HLA-2 que expresa una versión de la línea de células de leucemia K562, que expresa WT-1, y pueden procesar y presentar el epítopo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16) del péptido de WT-1 a C4-WT y C4-DLT cuando se transducen con HLA-A2 (figura 5).

EJEMPLO 6

ACTIVIDAD CINÉTICA Y CITOLÍTICA DE MUTANTES C4a DE TCR EN COMPARACIÓN CON TCR DE C4 DE TIPO NATURAL

Se transdujeron HPC CD34+ derivadas de sangre de cordón umbilical para expresar la cadena TCRa de un TCR específico de WT-1 restringido por HLA-A2 de alta afinidad (TCRc4) estudiado en los ensayos clínicos tal como se describe en el ejemplo 7. Se cultivaron células transducidas en células OP9-DL1 que expresan HLA-A2 (OP9-A2-DL1) en presencia de péptido de WT-1. Como control positivo, también se transdujeron HSC de sangre de cordón umbilical con las cadenas tanto TCRa como TCRp de TCR^c4(C4aP). La mayoría de progenitores de células T yS humanas expresan CD4 y CD8 durante el desarrollo en OP9-DL1 (Van Coppernolle et al., Leukemia 26:127, 2011), sin embargo, dado que las células T y8 fenotípicamente maduras (similares a células CD24‘ de ND murina) expresan altos niveles de CD27 (Van Coppernolle et al., J. Immunol. 183:4859, 2009), se usaron la expresión de CD27 y la cadena TCRp de Vp17 parental para enriquecer las células T seleccionadas por agonistas. Se analizó la proporción relativa de células CD3+CD27+ para células sin transducir, transducidas con C4a y transducidas con C4ap después de 31 días de cultivo in vitro. La mayoría de las células en los cultivos transducidos con C4ap fueron CD3+CD27+. Los cultivos transducidos con C4a tuvieron un porcentaje aumentado de células CD3+CD27+ en comparación con controles sin transducir y un aumento de 5 veces en el porcentaje de células CD3+ que expresan Vp17 parental (figura 6A). Se recogieron sólo células Vp17+CD27+ para la construcción de bibliotecas de TCRp el día 34 de cultivo (figura 6B).

Se transdujeron las bibliotecas de Vp17-Cp1 y Vp17-Cp2 en células H9.CD8-C4a y se clasificaron para determinar las células tetrámero de WT-1+ dentro de la población transducida. Después de una sola clasificación con tetrámero de WT-1-CMH, las células transducidas con la biblioteca de Vp17-Cp1 mostraron un intervalo de reactividad de tetrámeros, lo que indica que las múltiples cadenas TCRp presentes en la población clasificada con Vp17 pudieron otorgar especificidad de antígeno WT-1. Se aislaron las células que mostraron el mayor nivel de tinción con tetrámero de WT-1-CMH mediante una segunda clasificación con tetrámero de WT-1-CMH, y se compararon con células H9.CD8-C4a que expresan la cadena C4p parental. Si bien ambas poblaciones de células transducidas expresaron niveles similares de Vp17, se observó una tinción con tetrámero sustancialmente mayor para las células tetrámerohi enriquecidas a partir de la biblioteca de Vp17-Cp1 (figura 6C). En algún caso, estas cadenas TCRp derivadas de la biblioteca de Cp1 de alta afinidad pueden tener utilidad como receptores específicos de WT-1 de segunda generación en ensayos de terapia génica con TCR.

Se obtuvo la línea de empaquetamiento retroviral PlatE de Cell Biolabs (San Diego, CA). Se generó la línea de células OP9-KbDbDL1 mediante la transducción de la línea de células OP9 (Riken, Japón) con un constructo retroviral que contenía el gen Dll-1 seguido por IRES y H-2Db (para generar células OP9-KbDL1) y se transdujo por separado con H-2Kb. Se transdujo adicionalmente la línea de células OP9-KbDbDL1-WT-1 para expresar WT-1 murina. Se generó la línea de células OP9-A2-DL1 mediante la transducción de células OP9-KbDL1 con un constructo retroviral que codifica para HLA-A2-IRES-p2M humano. Se obtuvieron células OP9 y un constructo retroviral que contenía el gen Dll-1 seguido por IRES-GFP del laboratorio de Juan Carlos Zúñiga-Pflücker. Se generó la línea de células 58‘/‘3D-PYYa mediante transducción retroviral de la línea de células 58-/' deficiente en TCRa/TCRp con Mig2-3D-PYYa . Se generó la línea de células H9.CD8-C4a mediante transducción lentiviral de la línea de células T H9 humana con un constructo CD8a-P2A-p seguido por transducción lentiviral para expresar C4a-IRES-GFP.

EJEMPLO 7

LAS CÉLULAS T CD8+ ESPECÍFICAS DE VIRUS DERIVADAS DE DONANTE QUE EXPRESAN UN RECEPTOR DE CÉLULAS T ESPECÍFICO DE WT-1 PROPORCIONAN ACTIVIDAD DE RECIDIVA ANTILEUCÉMICA EN PACIENTES CON LMA

La recidiva es la causa principal de muerte tras el trasplante de células hematopoyéticas (TCH) alogénico para las neoplasias malignas hemáticas. Aunque las evidencias sugieren que el efecto beneficioso del injerto contra leucemia (ICL) mediado por células T de donante puede reducir las tasas de recidiva tras TCH, a menudo este efecto se ve mitigado por la morbilidad y mortalidad asociadas con la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) acompañante. Por tanto, proporcionar células T específicas de antígeno que seleccionan como diana selectivamente antígeno asociado a leucemia (AAL) puede proporcionar una oportunidad distinta para fomentar la actividad de GVL sin inducir EICH. La proteína 1 de tumor de Wilms (WT-1) es un factor de transcripción de dedos de zinc no polimórfico que desempeña un papel clave en el crecimiento y la diferenciación celular. WT-1 tiene una expresión muy limitada en tejidos adultos normales, se expresa 10-1000 veces más en células de leucemia en comparación con células CD34+ normales, y se ha demostrado que contribuye a la leucemogénesis. Además, la magnitud de expresión de WT-1 en células leucémicas se correlaciona con el pronóstico y la agresividad clínica. WT-1 es inmunogénica y, por tanto, constituye una diana inmunoterapéutica candidata atractiva para respuestas de células T citotóxicas (CTL) CD8+ inducidas (Cheever et al., Clin. Cancer Res. 15:5323, 2009). Los clones de CTL CD8+ reactivos para WT-1 derivados de donante transferidos pueden persistir en pacientes después del trasplante y mediar en la actividad antileucémica (Chapuis et al., Sci. Transl. Med. 5:174ra27, 2013).

En este estudio, se administraron dosis crecientes de células T CD8+ específicas de virus derivadas de donante que se habían transfectado para expresar un receptor de células T de alta afinidad específico para el epítopo WT-1126'134 restringido por HLA A*02:01 (RMFPNAPYL, Se Q ID NO.:16) a pacientes con leucemia mielógena aguda (LMA) de alto riesgo después de TCH alogénico, con dosis crecientes retenidas si persistió una dosis previa a una frecuencia de >3% de células T CD8+ de sangre periférica. En un punto de observación, en el que nueve pacientes se habían tratado en el estudio y recibieron un total de 22 infusiones, tres (3) pacientes habían completado las cuatro infusiones de células T, con la última infusión seguida por un transcurso de dos semanas de IL-2. Los acontecimientos adversos de grado > 3 de CTC habían sido hipotensión transitoria y una reacción febril, y leucopenia, linfopenia y trombocitopenia transitorias. No se habían observado toxicidades orgánicas específicas atribuidas a las células T infundidas. Un paciente había experimentado exacerbación de EICH aguda después de la infusión de células T y un paciente desarrolló EICH crónica, aunque no hubo evidencias de que la EICH en ningunos de los pacientes reflejara actividad de las células T infundidas.

Tres pacientes que se trataron con células T después de un segundo TCH alogénico para LMA recidivante (dos de los cuales tenían enfermedad persistente/recidivante después de un segundo trasplante) estaban vivos sin evidencias de enfermedad 14, 8 y 7 meses después del inicio de la infusión de células T (por consiguiente, 16, 26 y 9 meses después del segundo trasplante) sin terapia antileucémica adicional después de completar el tratamiento de estudio. Un paciente con LMA de alto riesgo que se trató de manera profiláctica después del TCH alogénico para LMA en segunda remisión completa (CR2) estaba vivo y sin evidencias de enfermedad 13 meses después del inicio del tratamiento de estudio (15 meses después del trasplante) (tabla 1).

Se observó que la persistencia de los CTL transducidos in vivo era variable, con CTL transferidos detectables entre 4 y al menos 290 días después de las infusiones de células T (tabla 1, figura 7).

Tabla 1. Desenlaces clínicos

Claims

REIVINDICACIONESPolinucleótido aislado, estando el polinucleótido con codones optimizados, que codifica para una proteína de unión que comprende:(a) un dominio variable de cadena a (Va) de receptor de células T (TCR) que tiene la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR1) de SEQ ID NO.:23, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:24 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de una cualquiera de las SEQ ID NO.:25 y 26; y(b) un dominio variable de cadena p (Vp) de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de CDR1 de SEQ ID NO.:27, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de SEQ ID NO.:28 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de SEQ ID NO.:29,en el que la proteína de unión codificada es capaz de:(i) unirse específicamente a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):antígeno leucocitario humano (HLA) en una superficie celular independientemente o en ausencia de CD8; y/o(ii) unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 con una Kd menor de o igual a aproximadamente 8 nM.Polinucleótido aislado según la reivindicación 1, en el que(a) la proteína de unión codificada comprende un dominio Va que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:1 ó 2 y comprende un dominio Vp que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9, siempre que la proteína de unión sea capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM; o (b) la proteína de unión codificada comprende un dominio Va que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:1 ó 2 y el dominio Vp codificado que tiene al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:9, siempre que la proteína de unión sea capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM; o (c) el dominio Va codificado tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:1 ó 2, siempre que la proteína de unión sea capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM; y/o(d) el dominio Va codificado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:1 ó 2; y/o (e) el dominio Vp codificado tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:9, siempre que la proteína de unión sea capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM; y/o(f) el dominio Vp codificado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO.:9; y/o(g) la proteína de unión codificada comprende el dominio Va codificado de (c) o (d) en combinación con el dominio Vp codificado de (e) o (f).Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, en el que(a) el dominio Va codificado comprende un dominio constante de cadena a que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:3 ó 4; y/o(b) el dominio Vp codificado comprende un dominio constante de cadena p que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO.:10 u 11; y/o(c) la proteína de unión codificada comprende una cadena a de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO.:5-8 y una cadena p de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:12 ó 13, en la que preferiblemente

(c1) la proteína de unión codificada comprende una cadena a de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:5 y una cadena p de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:12;
(c2) la proteína de unión codificada comprende una cadena a de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:7 y una cadena p de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:12;
(c3) la proteína de unión codificada comprende una cadena a de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:6 y una cadena p de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:13;

o

(c4) la proteína de unión codificada comprende una cadena a de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:8 y una cadena p de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.:13.
4. Polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proteína de unión codificada es capaz de unirse a un complejo RMFPNAPYL (SEQ ID NO.:16):HLA-A*201 con una Kd menor de o igual a aproximadamente 5 nM, preferiblemente menor de o igual a aproximadamente 3 nM.
5. Vector de expresión, que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unido operativamente a una secuencia de control de la expresión, en el que el vector es un vector viral opcionalmente seleccionado de un vector lentiviral o un vector y-retroviral.
6. Vector de expresión según la reivindicación 5, en el que el vector es capaz de administrar el polinucleótido a una célula huésped, en el que la célula huésped es una célula progenitora hematopoyética o una célula del sistema inmunitario humana, en el que la célula del sistema inmunitario humana es una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T doble negativa CD4- CD8-, una célula Ty8, un linfocito citolítico natural, una célula dendrítica o cualquier combinación de los mismos.
7. Vector de expresión según la reivindicación 6, en el que la célula T es una célula T indiferenciada, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora o cualquier combinación de las mismas.
8. Célula huésped recombinante, que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la célula huésped expresa en su superficie celular la proteína de unión codificada por el polinucleótido.
9. Célula huésped recombinante según la reivindicación 8, en la que el polinucleótido

(a) codifica para el dominio Va y tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:78 u 80 y codifica para el dominio Vp y tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:89; y/o

(b) codifica para el dominio Va y comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:78 u 80; y/o

(c) codifica para el dominio Vp y comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:89.
10. Célula huésped recombinante según las reivindicaciones 8 ó 9, en la que:

(a) el dominio Va que codifica para el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio constante de cadena a que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:82 u 84; y/o

(b) el dominio Vp que codifica para el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio constante de cadena p que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:92 ó 93.
11. Célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que el polinucleótido comprende:

(a) una cadena a de TCR que codifica para el polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:86 y una cadena p de TCR que codifica para el polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:95; o

(b) una cadena a de TCR que codifica para el polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:87 y una cadena p de TCR que codifica para el polinucleótido que comprende o que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:95.
12. Célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que el polinucleótido codifica para un péptido autoescindible dispuesto entre una cadena a de TCR que codifica para el polinucleótido y una cadena p de TCR que codifica para el polinucleótido, opcionalmente en la que el polinucleótido que codifica para la cadena a de TCR, el péptido autoescindible y la cadena p de TCR comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.:96 ó 97.
13. Célula huésped recombinante según la reivindicación 12, en la que

(a) el polinucleótido que codifica para el péptido autoescindible comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO.:98-101, o

(b) el polinucleótido codifica para un péptido autoescindible que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO.:17-20.
14. Célula huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, para su uso en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo.
15. Célula huésped recombinante para su uso según la reivindicación 14, en la que la célula huésped es una célula progenitora hematopoyética o una célula del sistema inmunitario humana, en la que la célula del sistema inmunitario es una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T doble negativa CD4' CD8', una célula T y8, un linfocito citolítico natural, una célula dendrítica o cualquier combinación de los mismos.
16. Célula huésped recombinante para su uso según la reivindicación 15, en la que la célula T es una célula T indiferenciada, una célula T de memoria central, una célula T de memoria efectora o cualquier combinación de las mismas.
17. Célula huésped recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que el trastorno hiperproliferativo es una neoplasia maligna hemática seleccionada de leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia eosinofílica crónica (LEC), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma no Hodgkin (LNH) o mieloma múltiple (MM); o un cáncer sólido seleccionado de cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, carcinoma de huesos y tejidos blandos, tumor de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer colorrectal, tumor desmoide, cáncer embrionario, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, adenocarcinoma gástrico, glioblastoma multiforme, tumor ginecológico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma maligno, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal de páncreas, tumor astrocítico primario, cáncer de tiroides primario, cáncer de próstata, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, rabdomiosarcoma, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, tumor de células germinativas de testículo, cáncer urotelial, sarcoma uterino o cáncer de útero.