KR20220042161A - Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포 - Google Patents

Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20220042161A
KR20220042161A KR1020227006067A KR20227006067A KR20220042161A KR 20220042161 A KR20220042161 A KR 20220042161A KR 1020227006067 A KR1020227006067 A KR 1020227006067A KR 20227006067 A KR20227006067 A KR 20227006067A KR 20220042161 A KR20220042161 A KR 20220042161A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
cells
cell
receptor
car
Prior art date
Application number
KR1020227006067A
Other languages
English (en)
Inventor
세바스찬 아미고레나
미카엘 세이타키스
쉐일라 로페즈-코보
제이미 로드리고 퓨엔테알바
Original Assignee
엥스띠뛰 퀴리
엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔 (인쎄름)
므네모 테라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엥스띠뛰 퀴리, 엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔 (인쎄름), 므네모 테라퓨틱스 filed Critical 엥스띠뛰 퀴리
Publication of KR20220042161A publication Critical patent/KR20220042161A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01043—Histone-lysine N-methyltransferase (2.1.1.43)

Abstract

본 발명은 SUV39H1이 불활성화되고, 임의로 TRAC 유전자좌의 파괴 및/또는 하나 이상의 ITAM의 결실과 조합된, CAR 또는 TCR과 같은 항원-특이적 수용체를 발현하는 개선된 면역 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 세포를 포함하는 조성물, 이러한 세포를 생산하는 방법, 및 입양 세포 치료법, 예를 들어, 암이나 염증성 질환에서 이러한 세포의 용도를 제공한다.

Description

SUV39H1에 결함이 있는 면역 세포
본 발명은 입양 세포 치료법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 강화된 특성을 갖는 Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포를 제공한다.
재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 키메릭 항원 수용체(CAR) 기술로 무장한 T 세포를 이용한 입양 T 세포 치료법(ATCT)은 강력한 암 치료 대안으로 떠오르고 있다(Lim WA & June CH. 2018. Cell 168(4): 724-740). 치료적 T 세포의 효율적인 생착, 장기간 지속성 및 감소된 소진은 긍정적인 치료 결과와 상관관계가 있다. 또한, 입양 전달된 세포의 증가된 지속성은 중심 기억 T 세포(TCM) 집단의 획득에 달려있는 것으로 보인다(Powell DJ et al., Blood. 2005; 105(1):241-50; Huang J, Khong HT et al. J Immunother. 2005; 28:258-267).
활성화 시, T 세포는 이펙터(TE) 표현형을 향해 비가역적인 직진 방식으로 진행된다(Mahnke YD et al., Eur J Immunol. 2013; 43:2797-2809; Farber DL. Semin Immunol. 2009; 21:84-91). 그러므로, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 위한 분열촉진 활성화는 나이브에서 TE 표현형쪽으로 T 세포의 분화를 유도한다. 형질도입된 T 세포 수를 임상 적용(약 109-1011)에 필요한 것으로 확장하기 위해 엑스-비보 배양 프로토콜과 조합하여, T 세포는 보다 분화된 표현형을 향해 구동되며, 이는 전신 지속성을 위한 차선책이다.
고형 종양의 성공적인 세포 기반 치료에 대한 주요 장애물은 활성화된 T 세포의 고갈이며, 이는 표적 세포의 증식 및 파괴 능력을 감소시킨다. PD-1 차단은 초기 단계에서 T 세포 기능을 회복할 수 있지만 구조는 불완전하거나 일시적일 수 있다(Sen DR, et al. 2016. Science 354(6316):1165-1169; Pauken KE, et al. 2016. Science 354 (6316):1160-1165). 더욱이, 종양의 면역억제성 미세환경은 T 세포 고갈을 매개한다(Joyce JA, Fearon DT. 2015. Science 348(6230):74-80).
입양 세포 치료법을 위한 개선된 특성을 갖는 변형 또는 조작된 T 세포에 대한 요구가 당업계에 남아 있다.
발명의 요약
면역 세포, 특히 SUV39H1이 불활성화되거나 억제된 T 세포는 강화된 중추 기억 표현형, 입양 전이 후 강화된 생존 및 지속성, 감소된 피로를 나타낸다. 특히, 그러한 세포는 수명이 긴 중앙 기억 T 세포로 증가된 효율성으로 축적되고 재-프로그래밍된다. 이러한 세포는 종양 세포 거부를 유도하는데 더 효율적이며 암 치료에 대한 향상된 효능을 나타낸다.
일 양태에서, 본 개시내용은 SUV39H1 유전자가 불활성화되거나 억제되는 변형된 면역 세포를 제공하며, 상기 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 삽입에 의해 불활성화된 TCR 알파 불변 영역 유전자를 포함한다. 핵산 서열의 삽입은 내인성 TCR 발현을 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%까지 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산은 면역 세포에 대해 이종성일 수 있고 이의 발현이 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록 T-세포 수용체의 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 항원-특이적 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이종성 TCR일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 내인성 TRAC 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 항원-특이적 수용체가 바람직하게 10-7 M 또는 10-8 M 이하의 결합 친화도 Kd로 결합하는 항원의 예로는 희귀 티로신 키나제 수용체(orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 SUV39H1 유전자가 불활성화되거나 억제되는 변형된 면역 세포를 제공하고, 여기서 상기 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 발현한다. 항원-특이적 수용체는 a) 세포외 항원-결합 도메인, b) 막횡단 도메인, c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 d) 단일 활성 ITAM 도메인을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, ITAM2 및 ITAM3이 불활성화된 변형된 CD3제타 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 이는 당업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들어 ITAM2 및 ITAM3이 불활성화되었거나 ITAM1 및 ITAM2가 불활성화되어 달성될 수 있다. 예를 들어, 변형된 CD3 제타 폴리펩타이드는 ITAM1만 보유하고 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90-164). 다른 예로서 ITAM1은 ITAM3의 아미노산 서열로 치환되고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90-164). 항원-특이적 수용체는 기재된 바와 같은 단일 활성 ITAM 도메인을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 TCR일 수 있다. 이러한 CAR 또는 TCR이 바람직하게 10-7M 또는 10-8M 이하의 결합 친화성 KD로 결합하는 항원의 예는 희귀 티로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에피린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 양태에서, 변형된 면역 세포는 T 세포, T 세포 전구체, 조혈 줄기 세포, iPSC, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 또는 NK 세포, 또는 TN 세포일 수 있고, TSCM, TCM 또는 TEM 세포일 수 있다. 변형된 면역 세포는 T 조절 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 양태에서, SUV39H1 활성 유전자는 면역 세포의 SUV39H1 유전자의 불활성화 또는 파괴에 의해 억제될 수 있거나, SUV39H1 억제제의 발현 또는 전달에 의해 억제될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 이의 야생형 유전자를 보유하지만, SUV39H1 억제제, 임의로 우성 음성 SUV39H1 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하도록 변형된다.
본원에 기재된 임의의 양태에서, 항원-특이적 수용체는 (a) 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막횡단 도메인, (c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 (d) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, 임의로 본원에 개시된 바와 같은 암 항원에 특이적으로 결합하는 scFv일 수 있다. 막관통 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타에서 유래할 수 있다. 하나 이상의 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, ICOS, OX40 및/또는 DAP10일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 단편, 임의로 CD3-제타 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 2(ITAM2) 및 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 3(ITAM3)가 불활성화된다.
이들 구현예 중 임의의 것에서, 항원 특이적 수용체는 (a) 제1 항원(예, 암 항원) 및 (b) T 세포 활성화 항원, 예, CD3 입실론 또는 TCR의 불변 사슬(알파 또는 베타) 모두에 결합하는 이중 특이적 항원 특이적 수용체일 수 있다.
이들 구현예 중 임의의 것에서, 면역 세포는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-특이적 수용체, 임의로 TCR 또는 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 2개의 CAR, 제1 항원에 결합하는 제1 CAR 및 제2 항원에 결합하는 제2 CAR을 포함할 수 있다.
이들 구현예 중 임의의 것에서, SUV39H1의 불활성화는 SUV39H1 발현을 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 감소시킨다.
이들 구현예 중 임의의 것에서, 면역 세포는 자가 유래 또는 동종이계일 수 있다. 이들 구현예 중 임의의 것에서, 면역 세포는 HLA-A 유전자좌가 불활성화되도록 변형된다. 일부 구현예에서, HLA 클래스 I 발현은 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 감소된다.
본 개시내용은 또한, 또 다른 양태에서, 임의의 상기 변형된 면역 세포를 포함하는 멸균 약학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 임의의 전술한 변형된 면역 세포 및 전달 장치 또는 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 치료학적 유효량의 상기 면역 세포 약학적 조성물을 환자에게 투여함으로써 항원, 임의로 암과 관련된 질병으로 고통받거나 그 위험이 있는 환자를 치료하기 위해 전술한 변형된 면역 세포 또는 약학적 조성물 또는 키트를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR T-세포이고 약 5 x 107 세포 미만, 임의로 약 105 내지 약 107 세포의 용량이 환자에게 투여된다. 상기 방법은 환자에게 제2 치료제, 임의로 하나 이상의 암 화학요법제, 세포독성제, 호르몬, 항-혈관형성제, 방사성표지된 화합물, 면역요법, 수술, 냉동요법, 및/또는 방사선요법을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제2 치료제는 면역 체크포인트 조절제일 수 있다. 면역 체크포인트 조절제의 예로는 PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, EP2/4 아데노신 수용체, 또는 A2AR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 억제제를 포함한다.
정의
본 명세서에서 용어 "항체"는 광의의 의미로 사용되며, 온전한 항체, 및 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rlgG) 단편, 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄(VH) 영역, 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한 단쇄 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한 기능적인(항원-결합) 항체 단편을 포함하여, 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 이 용어는 면역글로불린의 유전자 조작된 및/또는 다른 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대, 인트라바디, 펩티바디, 키메릭 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적인, 예를 들어, 이중특이적인 항체, 2가 항체, 3가 항체 및 4가 항체, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 이의 기능적인 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 용어는 IgG 및 이의 아종, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하여 임의의 종 또는 아종의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다. 일부 구현예에서 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예시는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 2가 항체; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단쇄 항체 분자 및 단쇄 VH 1가 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적인 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대, scFv를 포함하는 단일-쇄 항체 단편이다.
"단일-도메인 항체"는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다.
유전자의 "불활성화" 또는 "파괴"는 유전자의 발현이 감소 또는 제거되도록 하거나 비-기능적 유전자 생성물이 발현되게 하는 게놈 DNA 서열의 변화를 지칭한다. 예시적인 방법은 유전자 침묵, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예를 들어 절단 유도 및/또는 상동 재조합을 통한 유전자 편집을 포함한다. 이러한 유전자 파괴의 예시로, 전체 유전자의 결실을 포함하여 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임시프트 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹-인 및 녹-아웃이 있다. 이러한 파괴는 코딩 영역, 예를 들어, 하나 이상의 엑손에서 일어날 수 있어, 예를 들어 종결 코돈의 삽입에 의해 전장의 산물, 기능적인 산물 또는 임의의 산물을 생산할 수 없게 한다. 이러한 파괴는 또한 유전자의 전사를 방해하기 위해 프로모터 또는 인핸서 또는 전사의 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있다. 유전자 파괴는 상동 재조합에 의한 표적 유전자의 불활성화를 포함하여 유전자 표적화를 포함한다.
유전자 산물의 "억제"는 억제되거나 억제되지 않은 야생형의 활성 또는 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상 의 활성 및/또는 유전자 발현의 감소를 지칭한다.
"비-기능적"은 야생형 단백질과 비교하여 감소된 활성 또는 검출가능한 활성의 결여를 갖는 단백질을 지칭한다.
"우성 음성" 유전자 산물은 동일한 세포 내에서 야생형 산물의 기능을 방해하거나 악영향을 미치는 돌연변이된 비-기능적 유전자 산물을 지칭한다. 일반적으로 돌연변이된 유전자 산물이 야생형 산물과 동일한 요소와 상호작용하는 능력은 남아 있지만 일부 기능적 측면은 차단된다.
본 발명의 세포
면역 세포
본 발명에 따른 면역 세포는 전형적으로 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다.
보다 상세하게, 본 발명의 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관(특히 흉선)에서 유래하며, 면역계의 세포(즉, 면역 세포), 예컨대 선천성 또는 입양 면역의 세포, 예를 들어, 골수 세포 또는 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 림프구 세포이다. 바람직하게, 본 발명에 따르면 세포는 특히 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함하는 림프구이다.
본 발명에 따른 세포는 또한 면역 세포 전구체, 예를 들어, 림프구 전구체 및 보다 바람직하게 T 세포 전구체일 수 있다. T 세포 전구체의 예로는 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 조혈 줄기 세포(HSC), 다분화능 전구(MPP), 림프관 프라이밍 다능 전구(LMPP); 일반 림프구 전구 세포(CLP); 림프구 전구세포(LP); 흉선 침강 전구체(TSP); 초기 흉선 전구체(ETP)를 포함한다. 조혈 줄기 및 전구 세포는 예를 들어 제대혈 또는 말초 혈액, 예를 들어 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)로 동원 치료 후 말초 혈액 유래 CD34+ 세포로부터 얻을 수 있다.
T 세포 전구체는 전형적으로 CD44, CD117, CD135 및 Sca-1를 포함하는 컨센셔스 마커 세트를 발현하지만 또한 Petrie HT, Kincade PW, Many roads, one destination for T cell progenitors. The Journal of Experimental Medicine. 2005;202(1):11-13를 참조한다.
세포는 전형적으로 프라이머리 세포, 예컨대 대상체로부터 직접적으로 분리 및/또는 동결된 대상체로부터 분리된 것이다.
치료될 대상체와 관련하여, 본 발명의 세포는 동종 및/또는 자가일 수 있다.
자가 면역 세포 치료법에서, 면역 세포는 환자로부터 수집되고, 본원에 기재된 바와 같이 변형되고, 환자에게 반환된다. 동종이계 면역 세포 요법에서, 면역 세포는 환자가 아닌 건강한 도너로부터 수집되고, 본원에 기재된 바와 같이 변형되고, 환자에게 투여된다. 일반적으로 숙주가 거부할 가능성을 줄이기 위해 HLA가 일치한다. 면역 세포는 또한 HLA 클래스 I 분자의 파괴 또는 제거와 같은 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, Torikai et al., Blood. 2013;122:1341-1349는 ZFN을 사용하여 HLA-A 유전자좌를 녹아웃한 반면 Ren et al., Clin. Cancer Res. 2017; 23:2255-2266에서는 HLA 클래스 I 발현에 필요한 베타-2 마이크로글로불린(B2M)을 녹아웃하였다.
또한, 보편적인 '기성품' 제품 면역 세포는 TCRαβ 수용체의 불활성화(예: 파괴 또는 결실)와 같은 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 설계된 변형을 포함해야 한다; 생성된 세포는 내인성 TCR의 현저하게 감소되거나 거의 제거된 발현을 나타낸다. 리뷰를 위해 Graham et al., Cells. 2018 Oct; 7(10): 155를 참조. 단일 유전자는 베타 사슬을 암호화하는 두 개의 유전자가 아니라 알파 사슬(TRAC)을 암호화하기 때문에 TCRαβ 유전자좌가 대안적으로 파괴될 수 있지만 TRAC 유전자좌는 TCRαβ 수용체 발현을 제거하거나 방해하기 위한 전형적인 표적이다. 또는 TCRαβ 신호전달의 억제제가 발현될 수 있다. 예를 들면, 잘린 형태의 CD3ζ는 TCR 억제 분자로 작용할 수 있다. Ren et al.은 TCRαβ, B2M 및 면역 관문 PD1을 동시에 녹아웃시켰다.
일부 구현예에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브세트 또는 다른 세포 유형, 예컨대, 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 서브집단, 예컨대, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화력, 확장, 재순환, 국소화, 및/또는 유지능, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화도에 의해 정의된 것들을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 아형 및 서브집단 중에는 나이브 T(TN) 세포, 이펙터 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이의 아형, 예컨대, 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM), 또는 최종적으로 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, MAIT(mucosa-associated invariant T) 세포, 자연적으로 발생하는 적응 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 세포는 SUV39H1의 억제로 인한 줄기/기억 특성 및 더 높은 재구성 능력을 갖는 TEFF 세포, 그리고, TN 세포, TSCM, TCM, TEM 세포 및 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 T 세포 집단은 표면 마커와 같은 하나 이상의 특이 마커들에 대해 양성 또는 높은 수준을 발현하는 세포, 또는 하나 이상의 마커들에 대해 음성 또는 상대적으로 낮은 수준을 발현하는 세포를 강화하거나 고갈시킨다. 일부 경우에서, 이러한 마커는 T 세포의 특정 집단에는 부재 또는 상대적으로 낮은 수준에서 발현되지만(예컨대, 비-기억 세포), T 세포의 다른 특정 집단에는 존재 또는 상대적으로 높은 수준에서 발현된다(예컨대, 기억 세포). 일 구현예에서, 세포(예컨대, CD8+ 세포 또는 T 세포, 예를 들어, CD3+ 세포)는 CD117, CD135, CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 및/또는 CD62L에 대해 양성 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포를 강화하거나(즉, 양성으로 선택됨), CD45RA에 대해 양성 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포를 고갈시킨다(예, 음성으로 선택됨). 일부 구현예에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27 및/또는 IL7-Ra(CD127)에 대해 양성 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포를 강화하거나 고갈시킨다. 일부 예시에서, CD8+ T 세포는 CD45RO 및 CD62L에 대해 양성(또는 CD45RA에 대해 음성)인 세포를 강화시킨다. CCR7+, CD45RO+, CD27+, CD62L+ 세포인 세포의 서브세트는 중앙 기억 세포 서브세트를 구성한다.
예를 들어, 본 발명에 따르면, 세포는 CD4+ T 세포 집단 및/또는 CD8+ T 세포 서브-집단, 예를 들어, 중심 기억(TCM) 세포를 위해 강화된 서브-집단을 포함할 수 있다. 또는, 세포는 자연 살해(NK) 세포, MAIT 세포, 선천성 림프 세포(ILC) 및 B 세포를 포함하여 다른 유형의 림프구일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 및 조작을 위한 세포를 포함하는 조성물은 샘플, 특히 예를 들어, 대상체로부터 얻거나 유래된 생물학적 샘플로부터 분리된다. 전형적으로 대상체는 세포 치료법(입양 세포 치료법)을 필요로 하고, 및/또는 세포 치료법을 받을 존재이다. 대상체는 바람직하게 포유동물, 특히 인간이다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상체는 암을 가지고 있다.
샘플은 조직, 체액 및 대상체에서 직접적으로 채취한 다른 샘플, 그리고 분리, 원심분리, 유전공학(예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 인큐베이션과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생성된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접적으로 수득한 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 이로부터 유래된 가공된 샘플을 포함하여, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 기관 샘플을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게 세포가 유래되거나 분리된 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 혈액성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis) 산물이거나 이로부터 유래된다. 예시 샘플로 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 내장 연관 림프 조직, 점막 연관 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직 및/또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 세포 치료법(전형적으로 입양 세포 치료법)의 맥락에서, 샘플은 자가 및 동종의 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어, T 세포주로부터 유래된다. 세포는 또한 마우스, 랫트, 비-인간 영장류 또는 돼지와 같은 이종 개체의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 세포는 인간 세포이다.
SUV39H1 인간 SUV39H1 메틸트랜스퍼레이즈는 UNIPROT에서 O43463으로 언급되고 염색체 x(NCBI에서 유전자 ID: 6839)에 위치한 유전자 SUV39H1에 의해 암호화된다. 하나의 예시적인 인간 유전자 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 하나의 예시적인 인간 단백질 서열은 SEQ ID NO: 2이지만, 상이한 서열을 갖는 다형성 또는 변이체가 다양한 대상체의 게놈에 존재하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명에 따른 용어 SUV39H1은 SUV39H1의 모든 포유동물 변이체, 및 SUV39H1 활성을 갖는 SEQ ID NO: 2와 적어도 75%, 80%, 또는 전형적으로 85%, 90%, 또는 95% 동일한 단백질을 암호화하는 유전자를 포괄한다 (즉, H3K9-히스톤 메틸트랜스퍼레이즈에 의한 히스톤 H3의 Lys-9의 메틸화).
본 발명에 따른 "SUV39H1의 감소된 발현"은 정상 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 SUV39H1 발현의 감소를 지칭한다.
"비-기능적" SUV39H1 단백질은 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같이 감소된 활성 또는 검출 가능한 활성이 결여된 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 2개의 서열 사이의 표현 "동일성 비율"은 비교될 2개의 서열 사이의 동일한 염기 또는 아미노산의 비율을 의미하고, 상기 서열의 최상의 정렬로 수득되며, 이 비율은 순전히 통계적이며, 이들 두 서열 사이의 차이는 두 서열에 무작위로 퍼져있다. 본 명세서에서 사용된, "최상의 정렬" 또는 "최적의 정렬"은 결정된 동일성 비율(하기 참조)이 가장 높은 정렬을 의미한다. 2개의 핵산 서열 사이의 서열 비교는 보통 최상의 정렬에 따라 미리 정렬된 이들 서열을 비교함으로써 실현된다; 이 비교는 유사성이 있는 국소 영역을 식별 및 비교하기 위해 비교 세그먼트에서 실현된다. 비교를 수행하기 위한 최상의 서열 정렬은 수동 외에도, SMITH 및 WATERMAN에 의해 개발된 글로벌 호몰로지 알고리즘(Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), NEDDLEMAN 및 WUNSCH에 의해 개발된 로컬 호몰로지 알고리즘(J. Mol. Biol, vol.48, p:443, 1970), PEARSON 및 LIPMAN에 의해 개발된 유사성 방법(Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), 그러한 알고리즘을 이용한 컴퓨터 소프트웨어(GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), MUSCLE 다중 정렬 알고리즘(Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p: 1792, 2004)을 이용하여 실현될 수 있다. 최상의 국소 정렬을 얻기 위해, 바람직하게 BLAST 소프트웨어를 사용할 수 있다. 핵산의 2개의 서열 사이의 동일성 비율은 최적으로 정렬된 이들 2개의 서열을 비교하여 결정되며, 핵산 서열은 이들 2개의 서열 사이의 최적의 정렬을 얻기 위해 레퍼런스 서열과 관련하여 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 동일성 비율은 이들 2개의 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 비교되는 위치의 총 수로 이 수를 나누고 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 2개의 서열 사이의 동일성 비율을 얻음으로써 계산된다.
항원-특이적 수용체
일부 구현예에서, 면역 세포는 표면 상에 항원-특이적 수용체를 발현한다. 따라서, 세포는 임의로 이종 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 항원-특이적 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 전형적으로 이러한 항원-특이적 수용체는 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하 또는 10-11 M 이하의 Kd 결합 친화도로 표적 항원에 결합한다(더 낮은 숫자는 더 큰 결합 친화도를 나타냄).
전형적으로, 핵산은 이종성(즉, 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 이러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않음)이다. 일부 구현예에서, 핵산은 다수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하여 자연 발생적이지 않다. 핵산 및 이의 조절 제어 서열은 일반적으로 이종성이다. 예를 들어, 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산은 면역 세포에 대해 이종성일 수 있고 그의 발현이 내인성 프로모터의 제어 하에 있도록 T-세포 수용체의 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 내인성 TRAC 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 따른 항원-특이적 수용체 중에는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 성분, 뿐만 아니라 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능적 비-TCR 항원-특이적 수용체가 있다.
면역 세포, 특히 동종이계인 경우, 세포가 불활성화된(예, 파괴된 또는 결실된) TCRαβ 수용체를 포함하도록 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 설계될 수 있다. 단일 유전자가 베타 사슬을 암호화하는 두 개의 유전자가 아니라 알파 사슬(TRAC)을 암호화하기 때문에 TRAC 유전자좌는 TCRαβ 수용체 발현을 감소시키는 전형적인 표적이다. 따라서, 항원-특이적 수용체(예, CAR 또는 TCR)를 암호화하는 핵산은 기능적 TCR 알파 사슬의 발현을 유의하게 감소시키는 위치, 바람직하게 제1 엑손(SEQ ID NO: 3)의 5' 영역에서 TRAC 유전자좌 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, Jantz et al., WO 2017/062451; Sadelain et al., WO 2017/180989; Torikai et al,. Blood, 119(2): 5697-705 (2012); Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117를 참조. 내인성 TCR 알파의 발현은 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%까지 감소될 수 있다. 이러한 구현예에서, 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산의 발현은 임의로 내인성 TCR-알파 프로모터의 제어 하에 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 조작된 항원-특이적 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 공동자극 CAR(WO2014/055668 참조) 및/또는 억제성 CAR(iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013) 참조)를 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함한다.
키메릭 항원 수용체(CAR)(키메릭 면역수용체, 키메릭 T 세포 수용체, 인공 T 세포 수용체로도 알려짐)는 조작된 항원-특이적 수용체이며, 면역 이펙터 세포(T 세포)에 임의의 특이성을 이식한다. 전형적으로, 이들 수용체는 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진된 그들의 코딩 서열의 전달과 함께, T 세포에 단클론 항체의 특이성을 이식하는데 사용된다.
CAR은 일반적으로 일부 양태에서 링커 및/또는 막관통(transmembrane) 도메인(들)에 의해 하나 이상의 세포내 신호전달 성분에 연결된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 이러한 분자들은 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동자극 수용체와 조합된 그러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 흉내낸다.
CAR은
(a) 세포외 항원-결합 도메인,
(b) 막횡단 도메인,
(c) 임의로 공동-자극 도메인, 및
(d) 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 특정 항원(또는 마커 또는 리간드), 예를 들어, 암 마커와 같이 입양 치료법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원에 대해 특이성을 갖도록 구축된다. CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에서 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인, 또는 항체의 부분, 전형적으로 하나 이상의 항체 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 세포외 항원 결합 도메인은 전형적으로 scFv로서 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.
항원에 결합하는데 사용되는 모이어티는 항체로부터 유래된 단일-쇄 항체 단편(scFv), 라이브러리로부터 선택된 Fab' 또는 그들의 동족 수용체(1세대 CAR)와 결합하는 천연 리간드의 세 가지 일반적인 카테고리에 속한다. 이들 각각의 카테고리에서 성공적인 예시들은 특히 Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery. 2013; 3(4):388-398(특히 표 1 참조)에 보고되며, 본 출원에 포함된다.
항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하고, 추가로 친화도 성숙화되고 상기 기재된 바와 같이 선택될 수 있다. 설치류 면역글로불린(예, 마우스, 래트)에서 파생된 키메라 또는 인간화된 scFv는 잘 특성화된 단클론 항체에서 쉽게 파생되기 때문에 일반적으로 사용된다. 인간화 항체는 설치류 서열 유래 CDR 영역을 함유하고; 일반적으로 설치류 CDR은 인간 프레임워크에 접목되고 인간 프레임워크 잔기의 일부는 원래 설치류 프레임워크 잔기로 역-돌연변이되어 친화도를 보존할 수 있고, 및/또는 CDR 잔기 중 하나 또는 몇 개는 친화도를 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 완전한 인간 항체는 뮤린 서열이 없고 일반적으로 인간 항체 라이브러리의 파지 디스플레이 기술 또는 천연 면역글로빈 유전자좌가 인간 면역글로불린 유전자좌의 단편으로 대체된 형질전환 마우스의 면역화를 통해 생산된다. 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 항체의 변이체가 생성될 수 있으며, 여기서 항체는 그의 특이적 결합 기능을 유지하거나 실질적으로 유지한다. 아미노산의 보존적 치환은 잘 알려져 있고 위에 기술되어 있다. 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 추가 변이체가 또한 생성될 수 있다.
전형적으로, CAR은 단클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일-쇄 항체 단편(scFv)과 같은 항원-결합 부분 또는 항체 분자의 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 항원, 예컨대, 종양 세포 또는 암 세포와 같이 표적화되는 세포 또는 질환의 암 마커 또는 세포 표면 항원, 예컨대, 본 명세서에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 표적 항원과 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포의 표면에서 발현되는 온전한 항원과 같은 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편(예, scFv)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 항체, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시되는 종양-관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항원-특이적 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포 상에 발현될 수 있다. 항원-특이적 수용체 중에는 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메릭 항원 수용체(CAR)가 있다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대해 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR은 TCR-유사 CAR로도 지칭될 수 있다.
일부 양태에서, 항원-특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 결합되는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 예시에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 같거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대해 그러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환을 통해 선별되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막과 결합되거나 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS 또는 GITR의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된 것들을 포함한다(즉, 이들의 적어도 하나의 막관통 영역(들)을 포함한다). 막관통 도메인은 또한 합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어, 2 내지 10개의 아미노산 길이의 링커가 존재하고, 막관통 도메인과 CAR의 세포질성 신호전달 도메인 사이의 결합을 형성한다.
CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 1세대 CAR은 전형적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 1차 송신기인 CD3 ζ-사슬로부터의 세포내 도메인을 가지고 있다. 2세대 CAR은 전형적으로 CAR의 세포질성 꼬리에 다양한 공동자극 단백질 수용체(예, CD28, 41BB(CD28), ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함하여 T 세포에 부가적인 신호를 제공한다. 공동-자극 도메인에는 인간 CD28, 4-1BB(CD137), ICOS-1, CD27, OX 40(CD137), DAP10 및 GITR(AITR)로부터 유래된 도메인이 포함된다. 2개의 공동-자극 도메인의 조합은 예를 들면, CD28 및 4-1BB 또는 CD28 및 OX40로 고려된다. 3세대 CAR은 CD3z-CD28-4-1BB 또는 CD3z-CD28-OX40과 같은 여러 신호전달 도메인을 결합하여 효능을 높인다.
세포내 신호전달 도메인은 T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3+ 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분으로부터 유래될 수 있다. 대체 세포내 신호전달 도메인에는 FcεRIγ가 포함된다. 세포내 신호전달 도메인은 3개의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 중 1개 또는 2개가 결핍된 변형된 CD3 제타 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 ITAM은 ITAM1, ITAM2 및 ITAM3(N-말단에서 C-말단까지 번호가 매겨짐)이다. CD3-제타의 세포내 신호전달 영역은 SEQ ID NO: 4의 잔기 22-164이다. ITAM1은 아미노산 잔기 61-89 주위에, ITAM2는 아미노산 잔기 100-128 주위에, ITAM3은 잔기 131-159 주위에 위치한다. 따라서, 변형된 CD3 제타 폴리펩타이드는 ITAM1, ITAM2 또는 ITAM3 중 어느 하나가 불활성화될 수 있다. 또는, 변형된 CD3 제타 폴리펩타이드는 불활성화된 임의의 2개의 ITAM, 예, ITAM2 및 ITAM3, 또는 ITAM1 및 ITAM2을 가질 수 있다. 바람직하게 ITAM3은 불활성화되며, 예를 들면 결실된다. 보다 바람직하게 ITAM2 및 ITAM3이 불활성화되며, 예를 들면 ITAM1을(를) 남기고 결실된다. 예를 들어, 하나의 변형된 CD3 제타 폴리펩타이드는 ITAM1만 보유하고 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90-164). 다른 예로서 ITAM1은 ITAM3의 아미노산 서열로 치환되고, 나머지 CD3ζ 도메인은 결실된다(잔기 90-164). 예를 들어, Bridgeman et al., Clin. Exp. Immunol. 175(2): 258?67 (2014); Zhao et al., J. Immunol. 183(9): 5563?74 (2009); Maus et al., WO 2018/132506; Sadelain et al., WO/2019/133969, Feucht et al., Nat Med. 25(1):82-88 (2019)를 참조.
따라서, 일부 양태에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막횡단 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 다른 CD 막횡단 도메인을 포함한다. CAR은 또한 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR의 연결 시, CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 상응하는 비-조작된 면역 세포(전형적으로 T 세포)의 정상 이펙터 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 예를 들어, CAR은 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 사이토카인의 분비 또는 기타 인자와 같은 T 세포의 기능을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인(들)은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열, 및 일부 양태에서 또한 자연적 맥락에서 항원-특이적 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동-수용체 및/또는 이러한 분자의 변이체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서 2가지 부류의 세포질 신호전달 서열: TCR(1차 세포질 신호전달 서열)을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들, 및 2차 또는 공동자극 신호(2차 세포질 신호전달 서열)를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것들에 의해 매개되는 것으로 기술된다. 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호전달 성분 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내의 세포질 신호전달 분자(들)는 세포질 신호전달 도메인, 이의 일부, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
CAR은 또한 신호 전달 도메인 및/또는 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 막횡단 부분을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공동자극 성분 둘 다를 포함하고; 또는, 활성화 도메인은 하나의 CAR에 의해 제공되는 반면, 공동자극 성분은 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다.
CAR 또는 다른 항원-특이적 수용체는 또한 억제성 CAR(예, iCAR)일 수 있고 면역 반응과 같은 반응을 약화시키거나 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 이러한 세포내 신호전달 성분의 예는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함하는 EP2/4 아데노신 수용체를 포함하는 면역 체크포인트 분자에서 발견되는 것들이다. 일부 양태에서, 조작된 세포는 세포의 반응을 약화시키는 역할을 하도록 이러한 억제 분자의 신호전달 도메인을 포함하거나 이러한 억제 분자로부터 유래된 억제 CAR을 포함한다. 이러한 CAR은 예를 들어 활성화 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 항원이 정상 세포의 표면에서 또한 발현되거나 또는 또한 발현될 수 있는 경우 표적을 벗어난 효과의 가능성을 감소시키기 위해 사용된다.
TCR
일부 구현예에서, 항원-특이적 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 자연 발생 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. TCR을 암호화하는 핵산은 자연 발생 TCR DNA 서열의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 후, 항체 가변 영역의 발현, 항원에 대한 특이적 결합에 대한 선택과 같은 다양한 소스로부터 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 환자로부터 단리된 T-세포, 또는 배양된 T-세포 하이브리도마로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자(예, 인간 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 조작된 트랜스제닉 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원 참조(예, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808 참조. 일부 구현예에서, 파지 디스플레이 TCR을 표적 항원에 대해 분리하는 데 사용된다(예, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 및 Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354 참조).
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변성 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변성 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐)을 포함하는 분자를 지칭하고, MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태로 있다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하나, 그들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면상에서 발견되며, 여기서 일반적으로 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다. 일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질성 꼬리를 포함할 수 있다(예를 들어, Janeway et ah, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3 rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997를 참조). 예를 들어, 일부 양태에서, TCR의 각 사슬은 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단의 짧은 세포질성 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변성 단백질과 관련이 있다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "TCR"은 이의 기능적 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하여 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본 명세서의 목적상, TCR에 대한 언급은 MHC 분자, 즉 MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특이적인 항원성 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원-결합 부분과 같은 임의의 TCR 또는 기능적 단편을 포함한다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 TCR의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 TCR의 구조 도메인의 일부를 포함하나, 전체 TCR이 결합하는 항원(예, MHC-펩타이드 복합체)과 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에서, 항원-결합 부분은 일반적으로 각 사슬이 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경우와 같이 특이적인 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대, TCR의 가변성 α 사슬 및 가변성 β 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬의 가변 도메인은 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 형성하도록 결합하며, 이는 항원 인식을 부여하고 TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 펩타이드 특이성을 결정한다. 전형적으로, 면역글로불린처럼, CDR은 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된다(예, Jores et al., Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구현예에서, 알파 사슬의 CDR1은 또한 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용하는 반면, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용하는 것으로 나타났음에도 불구하고, CDR3이 가공된 항원을 인식하는데 책임이 있는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가의 초가변성(HV4) 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린처럼, TCR 사슬의 세포외 부분(예, α-사슬, β-사슬)은 2개의 면역글로불린 도메인, N-말단의 가변 도메인(예, Vα 또는 Vβ; 전형적으로 카바트 넘버링(Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)에 기초한 아미노산 1 내지 116, 및 세포막에 인접한 불변 도메인(예, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 117 내지 259, β-사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 117 내지 295)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인 및 CDR을 포함하는 2개의 막-말단 가변 도메인을 포함한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 두 사슬 사이를 연결하는 짧은 연결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR은 TCR이 불변 도메인에서 2개의 이황화 결합을 포함하도록 α 및 β 사슬 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에서, TCR 사슬은 세포질성 꼬리를 포함한다. 일부 경우에서, 이 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 결합하도록 한다. 예를 들어, 막관통 영역과 함께 불변 도메인을 포함하는 TCR은 세포막에서 단백질을 고정하고, CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변성 서브유닛과 결합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유동물에서 3개의 별개의 사슬(γ, δ 및 ε) 및 ζ-사슬을 가질 수 있는 다중-단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유동물에서 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬 및 CD3ζ 사슬의 호모다이머를 포함할 수 있다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 세포 표면 단백질과 매우 관련된다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 막관통 영역은 음으로 하전되며, 이는 이들 사슬을 양으로 하전된 T 세포 수용체 사슬과 결합하도록 하는 특징이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 단일 보존 모티프를 포함하는 반면, 각 CD3ζ 사슬은 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력과 연관된다. 이들 부속 분자는 음으로 하전된 막관통 영역을 가지며, TCR로부터 세포로 신호를 전달하는 역할을 한다. CD3 γ-, δ-, ε- 및 ζ-사슬은 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로 알려진 것을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개의 사슬 α 및 β(또는 임의로 γ 및 δ)의 헤테로다이머이거나, 단일쇄 TCR 구조물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해서와 같이 연결된 2개의 별개의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 포함하는 헤테로다이머이다.
CAR 및 재조합 TCR을 포함하여, 예시적인 항원-특이적 수용체, 그리고 수용체를 조작 및 세포로 도입하는 방법은 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118, 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에 기술된 것, 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 의해 기술된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 항원-특이적 수용체는 미국 특허 번호 7,446,190 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 Al에 기술된 바와 같은 CAR을 포함한다.
항원
항원-특이적 수용체에 의해 표적화된 항원 중에는 입양 세포 치료법을 통해 표적화될 질병, 상태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것이 있다. 질병 및 상태 중에는 증식성, 종양 및 악성 질병 및 장애, 특히 암이 있다. 감염성 질환 및 자가면역, 염증성 또는 알레르기성 질환이 또한 고려된다.
암은 고형암 또는 예컨대 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 암, 또한 조혈 및 림프 조직의 종양으로 알려져 있으며, 특히 백혈병 및 림프종을 포함하는 "액체 종양"일 수 있다. 액체 종양은 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프성 백혈병(ALL) 및 만성 림프성 백혈병(CLL)을 포함한다(맨틀 세포 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL)과 같은 림프종, 선종, 편평상피세포 암종, 후두 암종, 담낭 및 담관암, 망막모세포종과 같은 망막의 암을 포함함).
고형암은 특히 대장, 직장, 피부, 자궁내막, 폐(비-소세포성 폐 암종을 포함), 자궁, 뼈(예컨대, 골육종, 연골육종, 유잉육종, 섬유육종, 거대세포 종양, 법랑질종(Adamantinomas) 및 척색종(Chordomas)), 간, 신장, 식도, 위, 방광, 췌장, 자궁경부, 뇌(예컨대, 수막종, 교모세포종(Glioblastomas), 저-급성 성상세포종(Astrocytomas), 회돌기교세포종(Oligodendrocytomas), 뇌하수체 종양, 신경초종(Schwannomas) 및 전이성 뇌암), 난소, 유방, 두경부, 정소, 전립선 및 갑상선으로 구성된 군에서 선택된 기관 중 하나에 영향을 미치는 암을 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 암은 상기 기술된 바와 같이 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종이거나 이와 관련된다.
본 발명에 따른 질환은 또한 감염성 질환 또는 질병, 예컨대, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생성 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 질환은 또한 자가면역 또는 염증성 질환 또는 질병, 예컨대, 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브스병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 상황에서 T-조절 세포는 SUV39H1이 녹아웃된 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 질환 또는 질병의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 정상 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여 임의로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고/거나 조작된 세포에서 발현된다. 일부 그러한 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 다중-표적화 및/또는 유전자 파괴 접근법은 특이성 및/또는 효능을 개선하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 항원은 공통 종양 항원이다. 용어 "공통 종양 항원(universal tumor antigen)"은 단백질과 같은 면역원성 분자를 지칭하며, 즉, 일반적으로 비-종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되고, 또한 상이한 기원의 종양에서 발현된다. 일부 구현예에서, 공통 종양 항원은 인간 암의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상에서 발현된다. 일부 구현예에서, 공통 종양 항원은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8 이상의 상이한 유형의 종양에서 발현된다. 일부 경우에서, 공통 종양 항원은 비-종양 세포, 예컨대 정상 세포에서 발현될 수 있으나, 종양 세포에서 발현되는 것 보다 더 낮은 수준으로 발현된다. 일부 경우에서, 공통 종양 항원은 정상 세포에서 발현되지 않는 것처럼, 비-종양 세포에서 전혀 발현되지 않는다. 예시적인 공통 종양 항원은 예를 들어 인간 텔로머레이즈 리버스 트랜스크립테이즈(hTERT), 서바이빈, 마우스 더블 미닛 2 호몰로그(MDM2), 사이토크롬 P450 1B1(CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1(WT1), 리빈(livin), 알파페토프로테인(AFP), 암종배아항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 뮤신 16(MUC16), MUC1, 전립선-특이 멤브레인 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA), p53 또는 사이클린(Dl)을 포함한다. 공통 종양 항원을 포함하는 종양 항원의 펩타이드 에피토프는 당업계에 공지되어 있으며, 일부 양태에서, MHC-제한된 항원-특이적 수용체, 예를 들어, TCR 또는 TCR-유사 CAR을 생성하는데 사용될 수 있다(예, 공개된 PCT 출원번호 WO2011009173 또는 WO2012135854 및 공개된 미국 출원 번호 US20140065708 참조).
일부 양태에서, 항원은 다발성 골수종, 예컨대 CD38, CD138 및/또는 CS-1에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123 및/또는 CD44를 포함한다. 그러한 항원에 대한 항체 또는 항원-결합 단편은 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 출원 번호 US20120189622; 및 공개된 국제 PCT 출원 번호 WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612에 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)은 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원은 암 또는 종양 세포에서 발현되거나 상향조절되지만, 면역 세포, 예컨대 휴지기 또는 활성화 T 세포에서도 발현될 수 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, hTERT, 서바이빈 및 다른 공통 종양 항원의 발현은 활성화 T 림프구를 포함하여 림프구에서 나타나는 것으로 보고된다(예, Weng et al. (1996) J Exp. Med., 183:2471-2479; Hathcock et al. (1998) J Immunol, 160:5702-5706; Liu et al. (1999) Proc. Natl Acad Sci., 96:5147-5152; Turksma et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11: 152 참조). 마찬가지로, 일부 경우에서, CD38 및 다른 종양 항원들은 또한 면역 세포, 예컨대 T 세포에서 발현될 수 있으며, 예컨대 활성화된 T 세포에서 상향조절된다. 예를 들어, 일부 양태에서, CD38은 공지된 T 세포 활성화 마커이다.
일부 구현예에서, 암은 HER2 또는 p95HER2의 과발현이거나 또는 이와 연관된다. p95HER2는 전장 HER2 수용체를 암호화하는 전사체의 메티오닌 611에서 번역의 대체 개시에 의해 생성되는 HER2의 구성적으로 활성인 C-말단 단편이다. p95HER2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시되며, 세포외 도메인의 아미노산 서열은 MPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDKDDKGCPAEQRASPLT(SEQ ID NO: 6)이다.
HER2 또는 p95HER2는 유방암 뿐만 아니라 위암, 위식도암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장암, 방광암, 폐암, 및 두경부암에서 발현되는 것으로 보고되었다. p95HER2 단편을 발현하는 암 환자는 주로 완전한 형태의 HER2를 발현하는 환자보다 전이가 발생할 확률이 더 높고 예후가 더 좋지 않다. Saez et al., Clinical Cancer Research, 12:424-431 (2006).
HER2와 비교하여 p95HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(즉, p95HER2에 결합하지만 전장 HER2 수용체에는 유의하게 결합하지 않음)은 Sperinde et al., Clin. Cancer Res. 16, 4226?4235 (2010) and U.S. Patent Pub. No. 2013/0316380에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. HER2와 비교하여 p95HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 갖는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마는 국제 특허 공개 No. WO/2010/000565, 및 Parra-Palau et al., Cancer Res. 70, 8537-8546 (2010)에 개시되어 있다. 예시적인 CAR은 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하의 결합 친화성 KD로 p95HER2의 에피토프 PIWKFPD에 결합한다. p95HER2 및 이의 CDR에 특이적으로 결합하는 예시적인 항원-결합 도메인은 U.S. 공개 특허 제2018/0118849호 (본원에서 SEQ ID NO: 7-12)에 개시되며, 바람직하게 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하의 p95HER2에 대한 결합 친화도 KD를 갖는다. 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 Rius Ruiz et al., Sci. Transl. Med. 10, eaat1445 (2018) 및 U.S. 공개 특허 번호 제2018/0118849호는 p95HER2의 에피토프 PIWKFPD 및 TCR의 CD3 입실론 사슬에 특이적으로 결합하는 T-세포 이중특이성 항체를 기재하고 있다. p95HER2-TCB로 설계된 항체는 CD3입실론에 1가 결합하고 p95HER2에 2가 결합하는 비대칭 2-팔(armed) 면역글로불린 G1(IgG1)으로 구성된다. 이중특이적 항체는 비특이적 활성화의 기회를 감소시키는 약 70 내지 100 nM의 CD3입실론에 대한 1가의 낮은 친화도 및 약 9 nM의 p95HER2에 대한 보다 높은 2가 친화도를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 면역 세포, 예컨대 T 세포는 발현된 유전자 조작된 항원-특이적 수용체가 면역 세포 자체에서 이의 발현의 맥락에서 항원과 특이적으로 결합하지 않도록 면역 세포에서 항원을 암호화하는 유전자를 억제하거나 파괴하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 이는 표적-외 효과, 예컨대, 조작된 면역 세포의 그들 자신과의 결합을 피할 수 있으며, 이는 예를 들어 입양 세포 치료법과 관련하여 면역 세포에서 조작된 효능을 줄일 수 있다.
일부 구현예에서, 억제성 CAR의 경우에서와 같이, 표적은 표적-외 마커, 예컨대 질환 세포 또는 표적화된 세포에서는 발현되지 않으나, 정상 또는 동일한 조작된 세포에서 활성화 또는 자극 수용체에 의해 표적화되는 질환-특이적인 표적을 또한 발현하는 비-질환 세포에서는 발현되는 이다. 예시적인 이러한 항원은 MHC 분자, 예컨대, 질환 또는 질병의 치료와 관련하여, 그러한 분자가 비-표적화된 세포에서 하향조절되지만 발현된 상태로 유지되는 MHC 클래스 I 분자이다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 하나 이상의 다른 항원을 표적으로 하는 항원-특이적 수용체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 항원은 종양 항원 또는 암 마커이다. 제공된 면역 세포 상에서 항원-특이적 수용체에 의해 표적화된 다른 항원은 일부 구현예에서 희귀(orphan) 티로신 키네이즈 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린(mesothelin), CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체(fetal acethycholine e receptor), GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alpha, IL-13R-alpha2, kdr, 카파 경쇄, Lewis Y, Ll-세포 점착 분자, MAGE-A1, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gplOO, 종양태아항원(oncofetal antigen), ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암종배아항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린 A1(CCNA1)과 같은 사이클린, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원균에 의해 발현된 분자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 병원균-특이적 항원과 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 바이러스 항원(예컨대, HIV, HCV, HBV 등), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원에 특이적이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 각각이 상이한 항원을 인식하고 전형적으로 각각 상이한 세포내 신호전달 성분을 포함하면서 세포 상에 둘 이상의 유전자 조작된 항원-특이적 수용체를 발현하도록 유전자 조작된다. 이러한 다중-표적화 전략은 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호: WO 2014055668 Al(활성화 및 공동자극 CAR의 조합, 예를 들어, 표적-외, 예, 정상 세포에서는 개별적으로 존재하지만 치료되는 질환 또는 질병의 세포에서는 함께 존재하는 2개의 상이한 항원의 표적화를 기술함) 및 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013)에 기술된다(활성화 및 억제성 CAR를 발현하는 세포, 예컨대, 활성화 CAR은 정상 또는 비-질환 세포 및 치료되는 질환 또는 질병의 세포 둘 다에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제성 CAR은 정상 세포 또는 치료가 바람직하지 않는 세포에서만 발현되는 또 다른 항원에 결합하는 것을 기술함).
항원-결합 수용체의 예로는 원하는 항원뿐만 아니라 CD3 입실론과 같은 활성화 T 세포 항원에도 결합하는 T-세포 활성화 항체인 이중특이성 항체를 포함한다.
일부 맥락에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현은 대상체에게 독이 될 수 있다. 따라서, 일부 맥락에서, 조작된 세포는 예를 들어, 입양 면역치료법에서의 투여 때와 같이, 세포가 인 비보에서 음성의 선별에 민감하도록 유도하는 유전자 세그먼트를 포함한다. 예를 들어 일부 양태에서, 세포는 그것들이 투여되는 환자의 인 비보 조건에서의 변화의 결과로 제거될 수 있도록 조작된다. 음성으로 선별가능한 표현형은 투여된 약제, 예를 들어, 화합물에 대해 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로 인해 발생할 수 있다. 음성으로 선별가능한 유전자는 겐싸이클로비르(ganciclovir) 민감성을 부여하는 허피스 심플렉스 바이러스 유형 I 티미딘 키네이즈(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al., Cell II :223, 1977); 세포성 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼레이즈(hypoxanthine phosphribosyltransferase, HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼레이즈(adenine phosphoribosyltransferase, APRT) 유전자, 박테리아 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase)(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 재조합 항원-특이적 수용체를 발현하도록 조작되지 않지만, 특정 항원 특이성을 갖는 세포의 확장을 촉진하기 위해 오히려 원하는 항원에 대해 자연적으로 발생하는 항원-특이적 수용체, 예컨대 인 비트로 또는 엑스 비보에서, 예를 들어, 인큐베이션 단계(들) 동안 배양된 종양-침윤 림프구 및/또는 T 세포를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 종양-특이적 T 세포, 예를 들어, 자가 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리에 의한 입양 세포 치료법으로 생산된다. 자가 종양 침윤 림프구를 이용한 인간 종양의 직접적인 표적화는 일부 경우에서 종양 퇴행을 매개할 수 있다(Rosenberg SA, et al.(1988) N Engl J Med. 319: 1676-1680 참조). 일부 구현예에서, 림프구는 절제된 종양으로부터 추출된다. 일부 구현예에서, 그러한 림프구는 인 비트로에서 확장된다. 일부 구현예에서, 그러한 림프구는 림포카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 그러한 림프구는 자가 종양 세포의 특정 용해를 매개하지만 동종 종양 또는 자가 정상 세포에서는 그렇지 않다.
추가적인 핵산, 예를 들어 도입을 위한 유전자 중에는 예컨대 전달된 세포의 생존능 및/또는 기능을 촉진하여 치료의 효능을 개선하는 것; 세포의 선별 및/또는 평가, 예를 들어, 인 비보 생존 또는 위치화를 평가하기 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)에 의해 기술된 바와 같이 예를 들어 인 비보에서 세포가 음성 선별에 민감하게 함으로써 안전성을 개선하는 유전자;가 있다. 또한 음성 선별 마커를 우세한 양성 선별 마커와 융합함으로써 유래된 이중기능성의 선별 융합 유전자의 사용을 기술하는 Lupton et al.의 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공개를 참조. 예를 들어, Riddell et al., US 특허 번호 6,040,177, 14-17 면을 참조.
본 발명에 따른 세포를 수득하는 방법
본원에 사용된 "SUV39H1 활성의 억제"는 억제되지 않은 SUV39H1 단백질의 활성 또는 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 감소를 지칭한다. 우선적으로, SUV39H1 활성의 억제는 세포에서 SUV39H1의 실질적인 검출가능한 활성의 부재로 이어진다.
SUV39H1 활성의 억제는 SUV39H1 유전자 발현의 억제를 통해, 또는 세포의 SUV39H1 유전자의 불활성화를 통해, 또는 외인성 억제제의 발현을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 억제는 억제의 부재 하에 방법에 의해 생성된 동일한 세포에 대해 세포에서 SUV39H1의 발현을 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95%까지 감소시킬 수 있다. 유전자 파괴는 또한 SUV39H1 단백질의 감소된 발현 또는 비-기능성 SUV39H1 단백질의 발현으로 이어질 수 있다. 본 발명에 따른 면역 세포에서 SUV39H1의 억제는 영구적이고 비가역적이거나 일시적이거나 가역적일 수 있다. 바람직하게, SUV39H1 억제는 영구적이고 비가역적이다. 세포에서 SUV39H1의 억제는 하기에 기술된 바와 같이 타겟화된 환자에서 세포의 주사 전 또는 후에 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조작된 면역 세포에서 SUV39H1 활성의 억제는 SUV39H1의 발현 및/또는 활성을 억제하거나 차단하는 적어도 하나의 제제(agent), 즉 "SUV39H1 억제제"를 전달하거나 발현함으로써 달성된다. 적합한 SUV39H1 억제제는 예를 들어, SUV39H1 발현 또는 활성을 차단하거나 억제하는 압타머와 같은 SUV39H1 유전자 또는 이의 조절 요소에 혼성화하거나 결합하는 제제; SUV39H1에 상보적인 안티센스 분자와 같이 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자; RNA 간섭 약제(예컨대, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 piwiRNA(piRNA)); 리보자임; 이들의 조합을 포함한다.
적합한 SUV39H1 억제제는 또한 a) SUV39H1 게놈 핵산 서열과 혼성화하는 조작된, 비-자연적으로 발생하는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 가이드 RNA 및/또는 b) CRISPR 단백질(전형적으로, Type-II Cas9 단백질)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외인성 핵산을 포함할 수 있으며, 임의로, 상기 세포는 Cas9 단백질을 발현하도록 형질전환된다. 상기 제제는 또한 징크 핑거 단백질(ZFN) 또는 TAL 단백질일 수 있다. Cas9 단백질, TAL 단백질 및/또는 ZNF 단백질은 억제인자 및/또는 억제제에 직접 또는 간접적으로 연결된다.
적합한 SUV39H1 억제제는 또한 비-기능성 SUV39H1을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 SUV39H1 유전자는 불활성화되지 않고 오히려 SUV39H1 억제제가 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서 억제제는 야생형 SUV39H1의 활성을 억제하는 수준에서 비-기능성 유전자 생성물을 발현하는 우성 음성 SUV39H1 유전자이다. 이는 우성 음성 SUV39H1 유전자의 과발현을 포함할 수 있다.
면역 세포에서 SUV39H1의 불활성화 및 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체의 도입은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 세포에서 SUV39H1의 불활성화는 또한 SUV39H1 유전자의 억제 또는 파괴, 예를 들어 전체 유전자, 엑손 또는 영역의 결실, 및/또는 외인성 서열로의 대체, 및/또는 및/또는 유전자 내, 전형적으로 유전자의 엑손 내 돌연변이, 예를 들어 프레임시프트 또는 미스센스 돌연변이에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 SUV39H1 단백질이 발현되지 않거나 비-기능성 유전자에 포함되는 조기 종결 코돈을 초래한다. 파괴는 일반적으로 DNA 수준에서 시행된다. 파괴는 일반적으로 영구적, 비가역적 또는 일시적이지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 유전자 불활성화는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는, DNA-표적화 분자, 예컨대 DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산, 또는 복합체, 화합물 또는 이를 함유하는 조성물과 같은 유전자 편집 제제를 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 징크 핑거 단백질(ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성제-유사 단백질(TAL) 또는 TAL 이펙터(TALE) DNA-결합 도메인, CRISPR DNA 결합 도메인 또는 메가뉴클레이즈의 DNA 결합 도메인을 포함한다.
징크 핑거, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자, 복합체, 또는 조합은 DNA-결합 분자 및 유전자의 억제 또는 파괴를 용이하게 하는 이펙터 도메인과 같은 하나 이상의 추가 도메인을 함유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 DNA-결합 단백질 및 이종 조절 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다.
전형적으로, 추가 도메인은 뉴클레이즈 도메인이다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 뉴클레이즈와 같은 비-특이적인 DNA-절단 분자에 융합되거나 복합체화되는 서열-특이적인 DNA-결합 도메인으로 구성된 조작된 단백질, 예컨대, 뉴클레이즈 및 뉴클레이즈-함유 복합체 또는 융합 단백질을 이용하여 유전자 또는 게놈 편집에 의해 촉진된다.
이들 표적화된 키메릭 뉴클레이즈 또는 뉴클레이즈-함유 복합체는 표적화된 이중가닥 브레이크 또는 단일가닥 브레이크를 유도하고, 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 말단 결합(error-prone nonhomologous end joining, NHEJ) 및 상동-직접 수복(homology-directed repair, HDR)을 포함하는 세포성 DNA-수복 메커니즘을 자극하여 정확한 유전자 변형을 시행한다. 일부 구현예에서, 뉴클레이즈는 엔도뉴클레이즈, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레이즈(ZFN), TALE 뉴클레이즈(TALEN), CRISPR-연관(Cas) 단백질과 같은 RGEN(RNA-guided endonuclease) 또는 메가뉴클레이즈이다. 그러한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 8,697,359; Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7; 미국 특허 공개 번호 2014/0087426 및 2012/0178169; Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29: 135-136; Boch et al. (2009) Science 326: 1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326: 1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:el9722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (201 1) Nat. Biotech. 29: 149-153; Miller et a/. (2011) Nat. Biotech. 29: 143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47 참조). 그러한 유전자 전략은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 구성적 발현 시스템 또는 유도성 발현 시스템을 이용할 수 있다.
ZFP 및 ZFN; TAL, TALE 및 TALEN
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 엔도뉴클레이즈와 같은 이펙터 단백질에 융합된 하나 이상의 징크 피거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화제-유사 단백질(TAL)과 같은 DNA-결합 단백질을 포함한다. 예를 들어, ZFN, TALE 및 TALEN를 포함한다. Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013)를 참조.
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 서열-특이적인 방식으로 DNA에 결합하는 하나 이상의 징크-핑거 단백질(ZFP) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 더 큰 단백질 내 단백질 또는 도메인으로, 그것의 구조가 징크 이온의 배위결합을 통해 안정화된 결합 도메인 내 아미노산 서열의 하나 이상의 징크 핑거 영역을 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치(-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 만듦으로써 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-자연적으로 발생하며, 예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다. 예를 들어, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416 참조.
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합된 징크-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함하여 징크-핑거 뉴클레이즈(ZFN)을 형성한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 Type IIS 제한 효소로부터 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이는 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 도메인은 Type IIS 제한 엔도뉴클레이즈 Fok I으로부터 유래된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 및 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조.
일부 양태에서, ZFN은 예를 들어 표적화된 유전자(즉, SUV39H1)의 코딩 영역의 미리 결정된 부위에서 이중가닥 브레이크(DSB)를 효율적으로 생산한다. 전형적인 표적 유전자 영역은 엑손, N-말단 영역을 암호화하는 영역, 제1 엑손, 제2 엑손 및 프로모터 또는 인핸서 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, ZFN의 일시적인 발현은 조작된 세포에서 표적 유전자의 매우 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진한다. 특히, 일부 구현예에서, ZFN의 전달은 50%를 초과하는 효율로 유전자의 영구적인 파괴를 초래한다. 많은 유전자-특이적인 조작된 징크 핑거들을 상업적으로 이용할 수 있다. 예를 들어, Sangamo Biosciences(Richmond, CA, USA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 제휴하여 징크-핑거 구조물을 위한 플랫폼(CompoZr)을 개발하여 연구자들이 징크-핑거 구조물 및 검증을 모두 우회할 수 있게 하며, 수천 개의 단백질에 대해 특별하게 표적화된 징크 핑거를 제공한다. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. 일부 구현예에서, 상업적으로 이용할 수 있는 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다(예를 들어, Sigma-Aldrich 카달로그 번호 CSTZFND, CSTZFN, CTI1-1KT 및 PZD0020 참조).
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 자연적으로 발생하거나 조작된(비-자연적으로 발생하는) 전사 활성화제-유사 단백질(TAL) DNA 결합 도메인, 예컨대, 전사 활성화제-유사 단백질 이펙터(TALE) 단백질을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073 참조. 일부 구현예에서, 분자는 DNA 결합 엔도뉴클레이즈, 예컨대, TALE-뉴클레이즈(TALEN)이다. 일부 양태에서, TALEN은 TALE로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 뉴클레이즈 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, TALE DNA-결합 도메인은 표적 항원 및/또는 면역억제 분자를 암호화하는 유전자 내 표적 서열과 결합하도록 조작되었다. 예를 들어, 일부 양태에서, TALE DNA-결합 도메인은 CD38 및/또는 아데노신 수용체, 예컨대 A2AR을 표적으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, TALEN은 유전자에서 표적 서열을 인식하고 절단한다. 일부 양태에서, DNA의 절단은 이중-가닥 브레이크를 초래한다. 일부 양태에서, 브레이크는 상동 재조합 또는 비-상동 말단 접합(NHEJ) 비율을 촉진한다. 일반적으로, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열을 변화시키는 불완전한 수복 과정이다. 일부 양태에서, 수복 메카니즘은 직접 재-연결(Critchlow and Jackson, Trends Biochem Sci. 1998 Oct;23(10):394-8) 또는 소위 마이크로호몰로지-매개 말단 접합을 통해 2개의 DNA 말단에 남아있는 것의 재접합을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ에 의한 수복은 작은 삽입 또는 결실을 초래하며, 유전자를 파괴하여 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 일부 양태에서, 절단-유도된 돌연변이유발 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연속적인 돌연변이유발 이벤트가 발생한 세포는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 확인 및/또는 선별될 수 있다.
TALE 리피트(repeat)는 SUV39H1 유전자를 특이적으로 표적화하기 위해 조립될 수 있다(Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 18,740개의 인간 단백질-코딩 유전자를 표적으로 하는 TALEN 라이브러리가 구축되었다(Kim et al., Nature Biotechnology. 31, 251-258 (2013)). 고객-맞춤으로 설계된 TALE 어레이는 Cellectis Bioresearch(Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington, KY, USA) 및 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)를 통해 상업적으로 이용할 수 있다. 상세하게는, CD38을 표적으로 하는 TALEN을 상업적으로 이용할 수 있다(Gencopoeia, 카달로그 번호 HTN222870-1, HTN222870-2 및 HTN222870-3, www.genecopoeia.com/product/search/detail.php ?pr
t=26&cid=&key=HTN222870의 월드와이드웹에서 이용할 수 있음). 예시 분자는 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2014/0120622 및 2013/0315884에서 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된 트랜스유전자로서 소개된다. 일부 양태에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용하는 세포의 확인 및/또는 선별을 위해 제공된 선별 마커를 포함할 수 있다.
RGEN(CRISPR/Cas 시스템)
유전자 억제는 하나 이상의 DNA-결합 핵산, 예컨대 RNA-가이드 엔도뉴클레이즈(RGEN)를 통한 파괴, 또는 다른 RNA-유도된 이펙터 분자에 의한 억제의 다른 형태를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 억제는 CRISPR 및 CRISPR-연관 단백질을 이용하여 수행될 수 있다. Sander and Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355 참조.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 전반적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(trans-activating CRISPR) 서열(예, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락 상 "디렉트 리피트(direct repeat)" 및 tracrRNA-가공된 부분 직접 리피트 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락 상 "스페이서"로도 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터 다른 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 것과 연관된 전사체 및 다른 요소들을 지칭한다.
전형적으로, CRISPR/Cas 뉴클레이즈 또는 CRISPR/Cas 뉴클레이즈 시스템은 서열-특이적으로 DNA에 결합하는 암호화되지 않은 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레이즈 기능성을 갖는 CRISPR 단백질(예, 2개의 뉴클레이즈 도메인)을 포함한다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 유형 I, 유형 II 또는 유형 III CRISPR 시스템, 예컨대, Cas 뉴클레이즈로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, CRISPR 단백질은 Cas9과 같은 cas 효소이다. Cas 효소는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 SwissProt 데이터베이스 수탁번호 Q99ZW2에서 볼 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레이즈 및 gRNA가 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 본 명세서에서 토론된 바와 같이, 표적 부위에 DSB에 이어서 파괴를 유도한다. 다른 구현예에서, "닉케이즈(nickases)"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일가닥에 닉(nick)을 만드는데 사용될 수 있다. 쌍으로 된 닉케이즈는 또한 예를 들어 특이성을 개선하기 위해 사용될 수 있고, 각각은 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 또 다른 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9은 이종의 이펙터 도메인, 예컨대 전사 억제자에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소들에 의해 특징화된다. 전형적으로, CRISPR 복합체 형성의 맥락 상, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 지칭하며, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형으로 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 재조합은 상동 재조합이다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들의 발현을 추진하는 하나 이상의 벡터가 세포에 도입되어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시한다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 개별 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 또는, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 둘 이상의 요소들은 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분들을 제공하는 하나 이상의 추가적인 벡터들과 함께 단일 벡터 내에 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 벡터 내에 조합된 CRISPR 시스템 요소들은 임의의 적당한 방향으로 배열될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr-메이트 서열 및 tracr 서열은 같은 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 발현된다. 일부 구현예에서, 벡터는 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 암호화하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 서열과의 조합(및 임의로 복합체화)된 CRISPR 효소가 세포에 전달된다. 전형적으로, CRISPR/Cas9 기술은 조작된 세포에서 SUV39H1의 유전자 발현을 녹다운하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, SUV39H1에 특이적인 Cas9 뉴클레이즈 및 가이드 RNA는 예를 들어, 렌티바이러스 전달 벡터 또는 세포에 전달하기 위한 임의의 많은 공지의 전달 방법 또는 비히클, 예컨대 Cas9 분자 및 가이드 RNA를 전달하기 위한 임의의 다수의 공지의 방법 또는 비히클을 이용하여 세포에 도입될 수 있다(아래 참조).
유전자 파괴 분자 및 복합체를 암호화하는 핵산의 전달
일부 구현예에서, DNA-표적화 분자를 암호화하는 핵산, 복합체 또는 조합은 세포에 투여되거나 도입된다. 전형적으로, 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법은 배양 중인 세포에 CRISPR, ZFP, ZFN, TALE 및/또는 TALEN 시스템의 성분을 암호화하는 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 도입 결과로 세포 인 시츄에서 합성된다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 세포 외부에서 생산되고 나서 그것에 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 구조물을 동물 세포에 도입하는 방법은 공지되어 있으며, 비-제한적 예시로서, 폴리뉴클레오타이드 구조물이 세포의 게놈에 포함되는 안정한 형질전환 방법, 폴리뉴클레오타이드 구조물이 세포의 게놈에 포함되지 않는 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스 매개된 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등에 의해 세포에 도입될 수 있다. 일시적인 형질전환 방법은 미세주입, 전기천공 또는 입자 분사(particle bombardment)를 포함한다. 핵산은 발현 벡터의 형태로 투여된다. 바람직하게, 발현 벡터는 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, DNA 플라스미드 발현 벡터 또는 AAV 발현 벡터이다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 바이로좀, 리포좀, 이뮤노리포좀, 양이온성 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA의 제제-강화된 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적당한 양이온성 및 중성 지질은 Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포(예를 들어, 인 비트로 또는 엑스 비보 투여) 또는 표적 조직(예, 인 비보 투여)으로 될 수 있다.
RNA 또는 DNA 바이러스-기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 허피스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함한다.
유전자 치료 절차의 개요에 대해서는 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994)를 참조.
글루타티온-5-트랜스퍼레이즈(GST), 호스래디쉬 페록시데이즈(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(CAT) 베타-갈락토시데이즈, 베타-글루큐로니데이즈, 루시퍼레이즈, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자기형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 리포터 유전자는 세포에 도입되어 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하는 마커로 제공하는 유전자 산물을 암호화할 수 있다.
세포 제조
세포의 분리는 당해 기술분야에서 공지된 기술에 따른 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 세포를 세척, 원심분리 및/또는 하나 이상의 시약 존재 시 인큐베이션하여 예를 들어, 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분에 대해서는 강화하며, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거한다. 일부 예시에서, 세포는 하나 이상의 특징, 예컨대, 밀도, 접착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감성 및/또는 내성에 기초하여 분리된다.
일부 구현예에서, 세포 제조는 분리, 인큐베이션 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어, 저온보존하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서 임의의 다양한 공지의 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다.
인큐베이션 단계는 배양, 인큐베이션, 자극, 활성화, 확장 및/또는 증식을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극 제제의 존재에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 항원 특이적 수용체의 도입과 같은 유전 공학을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다.
인큐베이션 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어, 영양분, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화도록 설계된 임의의 다른 제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 작동하거나 개시한다. 이러한 제제로 항체, 예컨대 TCR 성분 및/또는 공동자극 수용체, 예컨대 비드와 같은 고상 담체에 결합된 항-CD3, 항-CD28에 특이적인 것들 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 임의로, 확장 방법은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가(예, 적어도 약 0.5 ng/mL의 농도로)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 제제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어, 적어도 약 10 units/mL의 IL-2 농도를 포함한다.
일부 양태에서, 인큐베이션은 미국 특허 번호 6,040,177에서 Riddell et al., Klebanoff et al., J Immunother. 2012; 35(9): 651-660, Terakura et al., Blood. 2012; 1:72-82, 및/또는 Wang et al. J Immunother. 2012,35(9):689-701까지 기술된 것들과 같은 기술에 따라 시행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 배양-개시 조성 피더 세포, 예컨대 분열하지 않는 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 세포의 최종 집단은 확장되는 초기 집단에서 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 피더 세포를 포함함); 및 배양물을 (예, T 세포의 수를 확장하기 위한 충분한 시간 동안) 인큐베이션하여 확장된다. 일부 양태에서, 미-분열 피더 세포는 감마선-조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 막기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 양태에서, 피더 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적당한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30℃, 및 일반적으로 또는 약 37℃를 포함한다. 임의로, 인큐베이션은 피더 세포로서 미-분열 EBV-형질전환된 림프아구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 일부 양태에서 임의의 적당한 함량, 예컨대, 적어도 약 10:1의 초기 T 림프구에 대해 LCL 피더 세포의 비율로 제공된다.
구현예에서, 항원-특이 T 세포, 예컨대 항원-특이 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 항원으로 나이브 또는 항원 특이 T 림프구를 자극하여 얻는다. 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 항원에 대해 항원-특이 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 분리하고 같은 항원으로 인 비트로에서 세포를 자극하여 생산될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 조작된 세포 또는 조작되는 세포의 표면 상에서 하나 이상의 마커의 발현을 평가하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 입양 세포 치료법에 의해 표적화되도록 고려된 하나 이상의 표적 항원(예, 유전자 조작된 항원 수용체)의 표면 발현을 예를 들어, 유세포 분석법과 같은 친화성-기반 검출 방법에 의해 평가하는 것을 포함한다.
세포 유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
일부 양태에서, 유전자 조작은 유전자 조작된 성분 또는 세포로의 도입을 위한 다른 성분, 예컨대, 유전자-파괴 단백질 또는 핵산을 암호화하는 성분을 암호화하는 핵산의 도입을 포함한다.
일반적으로, CAR의 면역 세포(예, T 세포)로의 조작은 형질도입 및 확장이 가능토록 세포가 배양될 것을 요구한다. 형질도입은 다양한 방법들을 이용할 수 있지만, 클론으로 확장 및 지속되는 조작된 세포에서 지속적인 CAR 발현을 가능하게 하기 위해서는 안정한 유전자 전달이 필요하다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 세포 성장, 예를 들어, T 세포 성장, 증식 및/또는 활성화를 1차 자극하고, 이어서 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수까지 배양으로 확장함으로써 달성된다.
유전자 조작된 성분들, 예를 들어, 항원-특이적 수용체, 예를 들어, CAR의 도입을 위한 다양한 방법들은 널리 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법으로 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통한 도입, 트랜스포존 및 전기천공을 통해 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다(예를 들어, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3.; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November; 29(11): 550-557 참조).
일부 구현예에서, 예를 들어, 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(MoMLV), 골수증식성 사르코마 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 포커스 포밍 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 리피트 서열(long terminal repeat, LTR)을 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양쪽성이며, 이는 그들이 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, 발현되는 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되었다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 참조).
렌티바이러스 형질도입 방법 또한 알려져 있다. 예시적인 방법은 예를 들어, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기천공에 의해 T 세포로 전달된다(예를 들어, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 and Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437) 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포지션에 의해 T 세포로 전달된다(예를 들어, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입 및 발현하는 다른 방법으로 칼슘 포스페이트 형질감염(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기술된 바와 같이), 원형질체 융합, 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 텅스텐 입자-촉진 미세입자 분사(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동-침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
유전자 조작된 산물을 암호화하는 유전자 조작된 핵산의 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190에 기술된 것들이다.
본 발명의 조성물
본 발명은 또한 본원에서 기술되고 및/또는 제공된 방법에 의해 생산된 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 전형적으로, 상기 조성물은 입양 세포 치료법과 같은 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형, 바람직하게 멸균 조성물 및 제형이다.
본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 본 발명의 적어도 하나의 조작된 면역 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본원에 사용된 언어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적 투여에 적합한 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 조성물에 추가로 통합될 수 있다. 일부 양태에서, 약학적 조성물에서 담체의 선택은 특정의 조작된 CAR 또는 TCR, 벡터 또는 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포, 그리고 CAR을 발현하는 벡터 또는 숙주 세포를 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 일부로 결정된다. 따라서, 다양한 적당한 제형들이 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적당한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트 및 벤즈알코니움 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 둘 이상의 보존제의 혼합이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물의 중량 대비 약 0.0001 내지 약 2%의 함량으로 존재한다.
약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다.
치료 방법
본 발명은 또한 입양 치료법(특히 입양 T 세포 치료법), 전형적으로 이를 필요로 하는 대상체의 암 치료, 뿐만 아니라 감염성 질환 및 자가면역, 염증성 또는 알레르기성 질환의 치료에 사용하기 위한 앞서 정의된 세포에 관한 것이다. 위의 "항원" 섹션에서 나열된 질병 중 하나의 치료가 고려된다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는 것"은 암과 같은 질환 또는 질환(예를 들어, 암)의 임의의 증상을 치료, 치유, 경감, 변경, 구제, 호전, 개선 또는 영향을 줄 목적으로 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 세포 또는 세포를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다. 특히, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 암과 같은 질환과 연관된 적어도 하나의 부정적인 임상적 증상, 예를 들어, 통증, 붓기, 저혈구 수 등을 감소 또는 완화시키는 것을 지칭한다.
암 치료와 관련하여, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 또한 진행성 신생물의 통제되지 않은 세포 증식을 늦추거나 역전시키는 것, 즉, 기존 종양을 축소 및/또는 종양 성장을 정지시키는 것을 지칭한다. 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 또한 대상체에서 암 또는 종양 세포에서의 세포사멸을 유도하는 것을 지칭한다.
SUV39H1이 불활성화된 면역 세포, 특히 T-세포는 강화된 중추 기억 표현형, 입양 전이 후 강화된 생존 및 지속성, 및 감소된 피로를 나타낸다. 그들의 증가된 효율 및 효능은 본원에 기술된 개선되지 않은 T-세포에 비해 더 낮은 수준으로 투여되도록 할 수 있다. 따라서, 임의로 본원에 기재된 임의의 다른 특징을 갖는 (예를 들어 CAR을 발현하고/거나 T 세포 수용체(TCR) 알파 불변 영역 유전자가 CAR 또는 TCR을 암호화하는 핵산 서열의 삽입에 의해 불활성화되고/거나, 여기서 CAR은 a) 세포외 항원-결합 도메인, b) 막관통 도메인, c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 d) ITAM2 및 ITAM3이 불활성화 또는 결실된 및/또는 HLA-A 유전자가 불활성화되거나 결실된 변형된 CD3제타 도메인 세포내 신호전달 도메인 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는) SUV39H1이 불활성화된 T-세포는 특정 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, SUV39H1이 불활성화된 면역 세포(예, T 세포)는 약 108개 세포 미만, 약 5 x 107 세포 미만, 약 107 세포 미만, 약 5 x 106 세포 미만, 약 106 세포 미만, 약 5 x 105 세포 미만 또는 약 105 세포 미만의 용량으로 성인에게 투여될 수 있다. 소아 환자의 용량은 약 100배 더 낮을 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 면역 세포(예, T-세포)는 105 내지 109개 세포, 또는 105 내지 108개 세포, 또는 106 내지 108개 세포 범위의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 대상체(즉, 환자)는 포유동물, 전형적으로 영장류, 예컨대 인간이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있으며, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적당한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-영장류 포유동물, 예를 들어, 설치류이다. 일부 예시에서, 환자 또는 대상체는 질환, 입양 세포 치료법 및/또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)과 같은 독성 결과를 평가하기 위한 검증된 동물 모델이다. 본 발명의 일부 구현예에서 상기 대상체는 암을 앓고 있거나, 암에 걸릴 위험이 있거나, 암이 완화된 상태에 있다.
암은 고형암 또는 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 주는 암, 또한 조혈 및 림프 조직의 종양으로도 알려져 있으며, 특히 백혈병 및 림프종을 포함하는 "액체 종양"일 수 있다. 액체 종양은 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)(맨틀 세포 림프종, 비호지킨 림프종(NHL)과 같은 다양한 림프종 포함), 선종, 편평 세포 암종, 후두 암종, 담낭 및 담관암, 망막의 암, 예컨대 망막 모세포종을 포함한다.
고형암은 특히 대장, 직장, 피부, 자궁내막, 폐(비소세포 폐 암종 포함), 자궁, 뼈(예컨대, 골육종, 연골육종, 유잉육종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 법랑질종 및 척삭종), 간, 신장, 식도, 위, 방광, 췌장, 자궁경부, 뇌(예컨대, 수막종, 교모세포종, 하급 성상세포종, 회돌기교세포종, 뇌하수체 종양, 신경초종 및 전이성 뇌암), 난소, 유방, 두경부 부위, 고환, 전립선 및 갑상선으로 구성된 군에서 선택된 기관 중 하나에 영향을 미치는 암을 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 암은 상기 기술된 바와 같은 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 주는 암이다. 전형적으로, 암은 다발성 골수종이거나 이와 연관된다.
일부 구현예에서, 대상체는 감염성 질환 또는 질병, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원충성 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스를 앓고 있거나, 발병할 위험이 있다.
일부 구현예에서, 질환 또는 질병은 자가면역 또는 염증성 질환 또는 질병, 예컨대, 관절염, 예를 들어, 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 공피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 연관된 질환 또는 질병이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 앞서 기술된 조성물의 투여를 포함하는 치료방법 및 특히 입양 세포 치료법, 바람직하게 입양 T 세포 치료법에 관한 것이다.
일부 구현에에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대, 암 또는 상기 언급된 바와 같은 질환 중 어느 하나를 앓고 있거나 걸릴 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 이로 인해 방법은 조작된 세포에 의해 인식된 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써 질환 또는 질병, 예컨대 암과 관련하여 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 호전시킨다.
입양 세포 치료법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 연계하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 치료 방법은 예를 들어 Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 번호 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 기술되어 있다. 예를 들어, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338를 참조.
일부 구현예에서, 세포 치료법, 예를 들어, 입양 세포 치료법, 예컨대 입양 T 세포 치료법은 자가 전달에 의해 시행되며, 여기서, 세포는 세포 치료법을 받는 대상체 또는 그러한 대상체에서 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 다르게 제조된다. 따라서, 일부 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 환자 유래의 세포는 분리 및 가공 후 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 치료법, 예를 들어, 입양 세포 치료법, 예컨대 입양 T 세포 치료법은 동종 전달에 의해 수행되며, 여기서, 세포는 세포 치료법을 받거나 궁극적으로 받는 대상체, 예를 들어, 제1 대상체 이외의 다른 대상체로부터 분리 및/또는 다르게 제조된다. 그러한 구현예에서, 세포는 그리고 나서 동일한 종의 다른 대상체, 예를 들어, 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체로서 동일한 HLA 클래스 또는 상위유형을 발현한다. 일부 구현예에서, HLA 매칭은 면역 세포가 내인성 TCR 및 HLA 클래스 I 분자의 발현을 감소시키도록 변형된 경우 덜 중요하다.
본 발명에 따른 적어도 하나의 세포의 이를 필요로 하는 대상체로의 투여는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 또는 또 다른 치료적 개입과 연계하여, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 이루어질 수 있다. 일부 문맥 상, 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록 시간이 충분히 근접한 다른 요법과 함께 세포를 공동 투여하거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 하나 이상의 추가적인 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 하나 이상의 추가적인 치료제 이후에 투여된다.
암 치료와 관련하여, 조합된 암 치료는 화학요법제, 호르몬, 항-혈관형성제, 방사성표지된 화합물, 면역치료제, 수술, 냉동치료법 및/또는 방사선치료법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
통상적인 암 화학요법제는 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 토포이소머레이즈 억제제, 미세소관 억제제 및 B-raf 효소 억제제를 포함한다.
알킬화제는 질소 머스타드(예컨대, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실), 에틸렌아민 및 메틸렌아민 유도체(예컨대, 알트레타민, 티오테파), 알킬 설포네이트(예컨대, 부설판), 니트로소우레아(예컨대, 카르무스틴, 로무스틴, 트리아제라무스틴), 트리아젠(예컨대, 다카바진, 프로카바진, 테모졸로미드) 및 백금 함유 항종양제(예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴 등)을 포함한다.
항대사물질로는 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈(Xeloda®), 시타라빈(Ara-C®), 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈(Gemzar®), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드(알림타®)을 포함한다.
안트라사이클린로는 다우노루비신, 독소루비신(Adriamycin®), 에피루비신, 이다루비신을 포함한다. 다른 항종양 항생제로는 악티노마이신-D, 블레오마이신, 미토마이신-C, 미톡산트론을 포함한다.
토포이소머레이즈 억제제로는 토포테칸, 이리노테칸(CPT-11), 에토포사이드(VP-16), 테니포사이드 또는 미톡산트론을 포함한다.
미세소관 억제제로는 에스트라무스틴, 익사베필론, 탁산(예컨대, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 카바지탁셀), 및 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 빈데신 및 빈플루닌)를 포함한다.
B-raf 효소 억제제로는 베무라페닙(Zelboraf), 다브라페닙(Tafinlar) 및 엔코라페닙(Braftovi)을 포함한다.
면역요법은 면역 체크포인트 조절제(즉, 억제제 및/또는 효능제), 사이토카인, 면역조절 단클론항체, 암 백신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 입양 T 세포 요법에서 세포의 투여는 면역 체크포인트 조절제의 투여와 조합된다. 예로는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, 및/또는 A2AR을 포함하는 EP2/4 아데노신 수용체의 억제제(예, 이에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체)가 포함된다. . 바람직하게, 면역 체크포인트 조절제로는 항-PD-1 및/또는 항-PDL-1 억제제(예, 항-PD-1 및/또는 항-PDL-1 항체)를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체의 암, 감염성 질환 또는 질병, 자가면역 질환 또는 질병, 또는 염증성 질환 또는 질병을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 SUV39H1이 녹아웃된 CD8+ T 세포에서 RT-qPCR에 의한 SUV39H1 발현 수준을 보여준다.
도 2A-2C는 유세포 분석에 의한 Mock과 비교하여 기하 평균 형광 강도(MFI)의 배수 변화를 나타내며, 이는 SUV39H1 녹아웃 세포에서 중심 기억 T 세포 표면 마커 CCR7, CD27 및 CD62L의 증가된 발현 수준을 나타낸다.
도 3A는 SUV39H1 녹아웃 세포에서 유세포 분석에 의한 중심 기억 T 세포 표면 마커 CCR7, CD45RO, CD27, 및 CD62L의 발현 수준을 나타내는 대표적인 FACS 플롯을 보여준다. 도 3B는 CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+ 세포의 중앙 기억 세포 서브세트의 빈도 배수 변화를 보여준다.
도 4A는 (a) TIM-3 양성, PD-1 음성, (b) TIM-3 양성, PD-1 양성, (c) TIM-3 음성, PD-1 양성, (d) TIM-3 음성, PD-1 음성인 세포 서브세트의 빈도 배수 변화를 나타낸다. 도 4B는 TIM-3의 발현 수준을 보여준다(평균 형광 강도의 배수 변화).
도 5A는 T-bet의 발현 수준을 나타낸다(평균 형광 강도의 배수 변화). 도 5B는 EOMES 및 T-bet의 발현 수준을 나타내는 대표적인 FACS 플롯을 보여준다. 도 5C는 유세포 분석에 의한 (a) EOMES 양성, Tbet 음성, (b) EOMES 양성, Tbet 양성, (c) EOMES 음성, Tbet 양성, (d) EOMES 음성, Tbet 음성인 세포 서브세트의 빈도 배구 변화를 보여준다. 도 5D는 TCF-1 및 T-bet의 발현 수준을 나타내는 대표적인 FACS 플롯을 보여준다. 도 5E는 (a) TCF1 양성, Tbet 음성, (b) TCF1 양성, Tbet 양성, (c) TCF1 음성, Tbet 양성, (d) TCF1 음성, Tbet 음성인 세포 서브세트의 빈도 배수 변화를 보여준다. T 세포 마스터 전사 인자, T-bet, EOMES 및 TCF-1의 이러한 발현 패턴은 SUV39H1 녹아웃 세포에 대한 감소된 이펙터 유사 표현형을 나타낸다.
도 6은 연속 자극 후 SUV39H1 녹아웃 세포에 대한 증가된 증식을 매주 CD8+ T-세포 수의 배수 변화로 보여준다.
도 7A는 2세대 항-CD19 CAR의 렌티바이러스 형질도입 후 CAR을 발현하는 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7B는 xCelligence 장치에 의한 세포 임피던스(Cell Index)의 변화로 측정된 항-CD19 CAR T 세포에 의한 CD19-양성 Raji 세포의 특이적 사멸을 보여준다. 도 7C는 생물발광의 변화로서 측정된 루시퍼레이즈-발현 CD19-양성 NALM-6 세포가 주사된 NSG 마우스에서 항-CD19 CAR-T 세포의 특정한 인 비보 항종양 활성을 나타낸다.
도 8A 및 8B는 SUV39-표적화 gRNA를 함유하는 Cas9 RNP를 사용한 전기천공에 의한 SUV39H1의 녹아웃 후 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 백분율을 나타내고 RT-qPCR에 의한 이러한 세포에서 SUV39H1의 감소된 발현 수준을 나타낸다. 도 8C는 전체 CD3+ Mock 및 SUV39H1KO T 세포 및 또한 CD4+ 및 CD8+ 서브세트 내에서 CAR의 발현을 나타낸다. 도 8D에서, 히스톤 3(H3K9me3)의 트리메틸화된 라이신 9의 양은 유세포 분석에 의해 정량화된다. 이것은 SUV39H1의 불활성화가 기질인 H3K9me3의 수준에 직접적인 영향을 미친다는 것을 확인시켜 준다.
도 9A는 유세포 분석에 의해 중앙 기억 세포 서브세트 CCR7+ CD45RO+ CD27+ CD62L+의 마커를 나타내는 SUV39H1 녹아웃을 갖는 항-CD19 CAR-T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 9B는 중앙 기억 세포 서브세트 빈도의 배수 변화를 보여준다.
도 10A는 TIM-3의 발현 수준(평균 형광 강도의 배수 변화)을 나타내고, 도 10Β는 Mock과 비교하여 SUV39H1이 녹아웃된 항-CD19 CAR-T 세포에서 T-bet의 발현 수준(평균 형광 강도의 배수 변화)을 보여준다. 도 10C는 유세포 분석에 의한 (a) EOMES 양성, Tbet 음성, (b) EOMES 양성, Tbet 양성, (c) EOMES 음성, Tbet 양성 및 (d) EOMES 음성, Tbet 음성인 SUV39H1KO CAR T 세포의 서브세트의 빈도 배수 변화를 보여준다.
도 11은 SUV39H1KO CAR T 세포에 대한 증가된 증식을 나타내는, 2명의 대표적 도너에 대한 연속 자극 후 매주 SUV39H1KO CD8+ CAR T 세포 수의 배수 변화를 나타낸다.
도 12는 SUV39H1KO CD3+ CAR T 세포 수의 배수 변화를 보여준다. SUV39H1을 불활성화하면 Mock에 비해 증식이 증가한다.
도 13은 CD8+ CAR T 세포(Mock) 및 SUV39H1KO CAR T 세포의 사이토카인 신호전달 및 줄기/기억 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 14A 및 14B는 1주일의 자극 후 CD8+ CAR T 세포(Mock) 및 SUV39H1KO CAR T 세포에서 해당작용 및 이펙터 사이토카인 유전자의 발현 수준을 각각 나타낸다. SUV39H1이 녹아웃된 항-CD19 CAR-T 세포는 감소된 이펙터 분화를 보여준다. 도 14C는 기억/줄기능(stemness)와 관련된 유전자의 발현 수준을 보여준다. SUV39H1KO CAR T 세포는 기억/줄기 유전자의 증가된 발현 수준을 보여준다.
도 15A는 추가적인 줄기/기억 유전자의 발현 수준을 보여준다. 도 15B는 말단 이펙터 분화(이펙터 사이토카인 및 자연 살해(NK) 세포 수용체)와 관련된 유전자의 발현 수준을 보여준다. 도 15C는 피로 관련 유전자의 발현 수준을 나타낸다. SUV39H1KO CAR T 세포는 줄기/기억 유전자의 발현 증가와 말단 이펙터 및 피로 유전자의 감소된 발현을 나타내며, 이는 SUV39H1 불활성화가 말단 분화를 억제하는 효과와 일치한다.
도 16은 2:1 이펙터 : 표적 비율에서 생물발광에 의해 측정된, 항-CD19 CAR T 세포(Mock 또는 SUV39H1KO)에 의한 CD19-양성 NALM-6 세포의 특정한 인 비트로 사멸을 보여준다.
도 17A는 세포외 플럭스 분석기 세파로스(Agilent)에 의해 세포외 산성화 속도(ECAR)의 변화로서 측정된 Mock 또는 SUV39H1KO인 CAR T 세포의 호기성 해당작용을 나타낸다. 도 17B는 Mock 또는 SUV39H1KO인 CAR T 세포의 해당 리저브를 보여준다. SUV39H1의 불활성화는 CAR T 세포의 해당 리저브를 약간 증가시킨다.
도 18A는 세포외 플럭스 분석기 세파로스(Agilent)에 의해 산소 소비율(OCR)의 변화로 측정된 Mock 또는 SUV39H1KO인 CAR T 세포의 미토콘드리아 호흡을 보여준다. 도 18B는 Mock 또는 SUV39H1KO인 CAR T 세포의 ATP 생성을 보여준다. SUV39H1의 불활성화는 글루코오스와 피루브산이 없고 전체 ATP 생성이 없는 상태에서 미토콘드리아 호흡을 증가시킨다.
도 19A는 급성 림프모구성 백혈병에 대한 이종 종양 모델에 대한 실험 절차를 보여준다. 간단히 말해서, 루시퍼레이즈를 발현하는 2.5x105 NALM-6 세포를 NSG 마우스의 꼬리에 정맥내 주사하고 인 비보 성장에 따라 세로 방향으로 생물발광(IVIS, Perkin Elmer)을 수행하였다. 종양 주입 후 3일째에 우리는 Mock 또는 SUV39H1KO 중 하나인 106개의 CAR T 세포를 주입하였다. 도 19B는 Mock 또는 SUV39H1KO CAR T 세포로 처리된 NSG 마우스의 NALM-6 세포의 성장 및 Kaplan-Meyer 생존 그래프를 보여준다. SUV39H1KO CAR T 세포는 더 강한 항종양 반응을 보였고 NSG 마우스의 생존을 향상시켰다.
도 20A는 Mock 또는 SUV39H1KO인 2x106 CAR T 세포로 처리된 NSG 마우스에서 NALM-6 세포의 성장을 보여준다. 도 20B는 2x106 CAR T 세포(Mock 또는 SUV39H1KO)로 처리된 NSG 마우스의 Kaplan-Meyer 생존 그래프를 보여준다. SUV39H1 CAR T 세포는 더 강한 항종양 반응을 보였고 NSG 마우스의 생존을 향상시켰다(10마리 중 9마리).
도 21A는 TRAC 유전자좌 내의 CAR 삽입 및 SUV39H1의 병렬 녹-아웃을 위한 프레임 내 녹-인/녹-아웃을 조합한 실험 절차를 나타낸다. 도 21B는 CD4+ 및 CD8+ 서브세트에서 CAR 발현 세포의 백분율 및 CAR+ 세포의 평균 형광 강도(세포 표면에서 CAR 분자의 수를 정량화함)를 보여준다. 도 21C는 TRAC 단독(only) 또는 TRAC 및 SUV39H1에 대한 gRNA로 처리된 CAR T 세포에서 SUV39H1의 발현 수준을 나타낸다(도면에서 "SUV"로 나타냄).
실시예
실시예 1 - 인간 CD8+ T 세포에서 SUV39H1 불활성화(SUV39H1 녹아웃 T 세포)
활성화된 인간 CD8+ T 세포를 결실을 위해 SUV39H1 유전자의 엑손을 표적으로 하는 gRNA를 함유하는 Cas9 리보핵단백질 입자(RNP)로 전기천공하였다. SUV39H1 발현의 일관된 감소는 전기천공 4일 후 RT-qPCR에 의해 관찰되었으며, 이는 녹아웃이 성공적임을 나타낸다(도 1).
실시예 2 - 인간 SUV39H1KO T 세포의 기억 표현형
CD8+ T 세포의 기억 표현형에 중요한 중심 기억 T 세포 표면 마커의 발현을 관찰하기 위해, 실시예 1의 SUV39H1KO T 세포를 1주일 동안 aCD3+aCD28 비드로 자극한 다음, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 중앙 기억 T 세포 마커 CCR7, CD27 및 CD62L은 SUV39H1KO 세포에서 증가된 발현 수준을 나타냈다. 결과는 도너당 Mock과 비교하여 각각 CCR7, CD27 및 CD62L에 대한 기하학적 MFI의 배수 변화로 도 2A-2C에 표시된다. 또한, 중앙 기억 세포 서브세트를 구성하는 CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+ 세포의 분율은 SUV39H1 KO 세포에서 증가하였다. 결과는 대표적인 FACS 플롯으로 도 3A에 표시되고 도너당 Mock과 비교하여 CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+ 세포 빈도 배수 변화로 도 3B에 표시된다. SUV39H1 녹-아웃은 중앙 기억 세포의 분율을 증가시켰다.
실시예 3 - 인간 SUV39H1KO T 세포에 대한 면역 체크포인트 수용체의 발현
2개의 중요한 면역 체크포인트 수용체인 PD-1 및 TIM-3의 발현을 실시예 2의 세포에 대해 평가하였다. PD-1의 전체 발현 수준은 변하지 않았고 TIM-3의 발현 수준은 감소하였다. SUV39H1KO에서는 피로하지 않는(non-exhausted) 활성화 세포로 간주되는 TIM3-PD1+의 분율이 증가하고 TIM3+PD1- 세포의 분율이 감소하는 것으로 관찰되었다. 도 4A는 PD-1 및 TIM-3을 발현하는 세포 서브세트의 빈도의 결과를 나타내고((a) TIM-3 pos, PD-1 neg, (b) TIM-3 pos, PD-1 pos, (c) TIM-3 neg, PD-1 pos, (d) TIM-3 neg, PD-1 neg), 도 4B는 도너 당 Mock과 비교하여 기하학적 MFI로서 TIM-3의 배수 변화를 나타낸다. 따라서 SUV39H1을 녹아웃하면 T 세포 피로가 감소되었다.
실시예 4 - 인간 SUV39H1KO T 세포에서 마스터 전사 인자, T-bet, EOMES 및 TCF-1의 발현
마스터 전사 인자, T-bet, EOMES 및 TCF-1의 발현을 실시예 2의 세포에 대해 평가하였다. T-bet 발현은 증가된 이펙터 투입 및 기능을 조정하고, EOMES 발현은 증가된 이펙터 기능을 정의하고 TCF-1 발현은 자가-재생을 제어한다. EOMES 및 TCF-1과 T-bet의 밸런스는 T 세포 분화를 결정한다. SUV39H1KO는 도너 당 Mock에 비해 기하학적 MFI의 배수 변화로 도 5A에 나타낸 바와 같이 T-bet의 발현 수준을 감소시켰다. EOMES 및 TCF-1의 발현 수준은 변하지 않았다. EOMES 또는 TCF-1을 사용한 T-bet의 균형도 분석되었다. EOMES-양성/T-bet-음성 및 TCF-1-양성/T-bet-음성 분획은 SUV39H1KO에서 증가하였다(도 5B-5E). 결과는 도 5C 및 5E에 도너 당 Mock과 비교하여 세포의 다양한 서브세트의 빈도로 표시되며 SUV39H1KO의 이펙터 유사 표현형의 감소를 시사한다. 대표적인 FACS 플롯은 도 5B 및 5D에 나와 있다.
실시예 5 - 연속 자극 후 인간 SUV39H1KO T 세포의 증식
SUV39H1이 녹아웃된 CD8+ T 세포를 4주의 기간 동안 일주일에 한 번 aCD3+aCD28 비드로 자극하였다. SUV39H1KO CD8+ T 세포의 세포 수 및 동역학은 도 6에 도시되어 있으며 SUV39H1KO 세포가 연속 자극 후 증가된 증식을 나타냄을 보여준다. 결과는 1주차에 접종한 것과 비교하여 세포 수의 배수 변화로 3개의 상이한 도너에 대해 표시된다. 증식 가능성은 기억 세포의 주요 특징이며 항종양 효능의 중요한 예측 인자이다.
요약하면, 실시예 1-5의 결과는 CD8+ T 세포에서 SUV39H1 녹아웃이 a) 중앙 기억 마커인 CCR7, CD27 및 CD62L의 전반적인 증가된 발현 수준, 및 중앙 기억 세포 서브세트인 CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+ 세포의 증가된 분율; b) TIM-3의 감소된 발현 수준, c) 이펙터 기능 조절자, T-bet의 감소된 발현 수준, 및 전사 인자의 균형을 덜 이펙터-유사 표현형 쪽으로 기울이는 T-bet 음성 세포의 증가된 분율, 및 d) 연속 자극 후 증가된 증식을 초래함을 보여준다.
실시예 6 - CAR T 세포의 생성
인간 CD8+ T 세포를 2세대 항-CD19 CAR을 암호화하는 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 도 7A는 10개의 도너에 대한 CAR-발현 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7B는 대표적인 도너에 대한 2:1 이펙터:표적 비율에서 xCelligence 장치로 CD19 양성 Raji 세포의 사멸을 보여준다. 도 7C는 대표적인 도너 유래 6x106 CAR T 세포 주입 후(4일째), NSG 마우스에 5x105 세포를 주입한 후 종양 세포 생물발광 강도로 표시된 NALM-6 세포의 성장을 보여준다. 결과는 CAR T 세포가 인 비트로에서 CD19-양성 Raji 세포에 대해 세포독성 활성을 나타내고 NSG 마우스에서 CD19-양성 NALM-6 세포도 근절함을 보여주었다.
실시예 7 - CAR T-세포(SUV39H1KO CAR T 세포)에서 SUV39H1 불활성화
전체 CD3+ 또는 CD8+ T 세포를 PBMC로부터 정제하고, CAR 도입유전자로 렌티바이러스 형질도입된 실시예 6에 기재된 바와 같이 CAR 도입유전자로 렌티바이러스 형질도입하였다. 그런 다음 결실을 위해 SUV39H1 유전자의 엑손을 표적으로 하는 SUV39H1 표적화 gRNA를 함유하는 Cas9 RNP로 세포를 전기천공하였다. 녹아웃 세포(SUV39H1KO T 세포)는 강력한 CAR 발현을 유지하고 나타내었고 전기천공 4일 후 RT-qPCR에 의해 검출된 바와 같이 SUV39H1 발현의 일관된 감소를 나타냈다(도 8A-8B). 구체적으로, 도 8A 및 8C는 각각 CD8+ 및 CD3+ T 세포의 CAR 발현을 도시하는 반면, 도 8B는 SUV39H1 발현의 결실을 도시한다. 웨스턴 블로팅은 도 8B에서 SUV39H1 단백질의 고갈을 추가로 확인하고, SUV39H1 활성에 의존하는 H3K9me3의 수준이 SUV39H1KO T 세포에서 전체적으로 감소한다는 것을 확인하였다(도 8D).
실시예 8 - SUV39H1KO CAR T 세포의 기억 표현형, 마스터 전사 인자 발현, 유전자 발현 프로파일, 및 증식
CD8+ T 세포의 기억 표현형에 중요한 중심 기억 T 세포 표면 마커의 발현을 관찰하기 위해, 실시예 7의 SUV39H1KO CAR T 세포를 1주일 동안 aCD3+aCD28 비드로 자극한 다음, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 이는 CAR T 세포의 증식에 대한 SUV39H1 결실의 효과의 특정 관찰을 가능하게 하였다. 그 후 매주 SUV39H1 KO CAR T 세포의 기억 표현형, 유전자 발현 프로필 및 세포 수를 분석하였다. 매주 1라운드 자극 후, 중앙 기억 세포 서브세트를 구성하는 CCR7+ CD45RO+ CD27+ CD62L+ 세포의 분율이 SUV39H1 KO CAR T 세포에서 증가하였다. 결과는 도너 당 Mock에 비해 중앙 기억 세포 표현형을 나타내는 세포의 비율로 도 9A에 표시된다. 도 9B는 Mock과 비교하여 중앙 기억 세포 서브세트 배수 변화를 보여준다. 또한, CAR T 세포에서 SUV39H1을 녹아웃시키면 TIM-3의 발현 수준이 감소하고(도 10A), T-bet의 발현 수준이 감소하고(도 10B), T-bet-음성 세포의 빈도가 증가하였다(도 10C). 총 CD3+ 세포를 사용하여 제조된 SUV39H1KO CAR T 세포에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다.
세포를 4주의 기간 동안 일주일에 한 번 aCD3+aCD28 비드로 자극하였다. SUV39H1KO CD8+ CAR T 세포의 매주 자극 동안 세포 수 및 동역학의 배수 변화는 도 11 및 12에 도시되어 있으며 이러한 SUV39H1KO CAR T 세포가 인 비보 항종양 효능의 주요 예측 인자인 직렬 자극 후 증가된 인 비트로 증식 및 지속성을 나타냈다는 것을 보여준다.
생성 직후 및 첫 번째 자극 전에, CAR T 세포 전사체의 나노스트링 분석(mRNA 수준을 정량화함)을 4명의 상이한 도너에서 수행하였다. 도 13은 SUV39H1KO CAR T 세포가 전사 인자 STAT3, STAT5A 및 STAT5B의 증가된 발현 수준을 나타내었음을 예시한다. 이들 전사 인자는 사이토카인 수용체, 줄기와 기억 형성을 촉진하는 전사 인자 TCF7, 그리고 중심 기억 마커 CD27 및 SELL(CD62L을 암호화함)의 다운스트림에서 작동한다. 이러한 결과는 SUV39H1KO CAR T 세포가 줄기 세포와 같은 표현형을 갖고 사이토카인 신호 전달을 더 잘 수용한다는 것을 확인시켜 준다.
매주 1 라운드 자극 후 CAR T 세포의 나노스트링 분석은 SUV39H1KO CAR T 세포가 더 낮은 수준의 해당 효소(도 14A) 및 이펙터 사이토카인(도 14B)을 발현함을 나타내었다. 대조적으로, 도 14C는 CAR T 세포가 기억 기능 및 줄기성 관련 전사 인자, 특히 LEF1과 관련된 사이토카인 수용체 유전자 IL7R, IL21R 및 IL6ST의 수준이 증가되었음을 보여준다. 이러한 결과는 SUV39H1KO CAR T 세포가 Mock에 비해 매주 1 라운드 자극 후에 덜 분화됨을 시사한다.
매주 3 라운드 자극 후, SUV39H1KO CAR T 세포는 줄기 및 기억 관련 유전자의 발현 수준을 증가시켰고(도 15A), 이펙터 사이토카인 및 억제성 자연 살해 세포 수용체의 발현 수준을 감소시켰으며(도 15B), 이는 감소된 말단 이펙터 분화를 시사한다. 마지막으로, SUV39H1KO 및 Mock CAR T 세포는 피로 마커 HAVCR2(TIM-3에 대한 암호화) 및 LAG3의 발현 수준에서 유의미한 차이가 없지만 CD274(PD-L1에 대한 암호화) 및 EOMES(도 15C)에 대한 발현 수준에는 유의한 차이가 없다. 이러한 결과는 SUV39H1KO CAR T 세포가 Mock CAR T 세포보다 말단 분화에 더 내성이 있고 줄기 세포 및 기억 특성을 유지한다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 9 - SUV39H1KO CAR T 세포의 세포독성 기능
CAR T 세포의 세포독성에 대한 SUV39H1 결실의 효과를 루시페레이즈를 발현하는 NALM-6 세포에 대한 인 비트로 사멸 검정에 의해 평가하였다. 간략하게, 5x104 NALM-6 세포를 U-바닥 플레이트에 첨가한 다음 이펙터 세포를 2:1 이펙터:표적 비율로 첨가하였다. 플레이트를 밤새 배양하고, 루시페린을 첨가한 후, 생존한 NALM-6 세포의 생물발광을 플레이트 리더로 정량화하였다. SUV39H1KO의 세포독성 기능과 총 CD3+ 또는 정제된 CD8+로부터의 Mock CAR T 세포 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다(도 16).
실시예 10 - SUV39H1KO CAR T 세포의 대사 적합성
SUV39H1KO CAR T 세포의 대사 특성은 상업적인 세포외 플럭스 분석기(Seahorse, Agilent)를 사용하여 매주 자극 동안 상이한 시점에서 조사되었다. 호기성 해당 과정의 척도인 세포외 산성화율과 미토콘드리아 호흡의 척도인 산소 소모율을 정량화하였다. 간단히 말해서, 웰당 1.5x105개 세포를 추가하고 분석기에서 두 가지 다른 분석을 수행하였다.
하나의 분석은 각각 해당과정과 미토콘드리아 호흡의 초기 기질인 글루코오스와 피루베이트의 부재 하에, 다른 하나는 존재하지 않는 상태에서 수행되었다. 글루코오스 및 피루베이트의 존재 하에, SUV39H1KO CAR T 세포가 Mock과 유사한 정도로 호기성 해당작용에 관여하지만 (도 17A) 약간 증가된 해당작용 리저브를 나타내는 것으로 결정되었다 (미토콘드리아 호흡 억제제 올리고마이신의 첨가 후 및 세포외 산성화 속도의 이러한 특정 증가에 상응하여 계산됨) (도 17B). 유사하게, 글루코오스 및 피루베이트의 존재 하에, SUV39H1KO 및 Mock CAR T 세포도 유사하게 효율적인 미토콘드리아 호흡에 관여하였다(도 18A). 그러나, 글루코오스 및 피루베이트의 부재 하에, SUV39H1KO CAR T 세포는 미토콘드리아 호흡을 증가시켰다(도 18A). 마지막으로, 미토콘드리아 ATP 생산의 정량화(호흡 억제제 올리고마이신을 첨가한 후 글루코오스 및 피루베이트의 존재 하에 계산되고 산소 소비율의 이러한 특이적 감소에 상응함)는 매주 3회 이상의 자극 후에 SUV39H1KO CAR T 이 경로로 더 많은 ATP를 계속 생산할 수 있다(도 18B). 이러한 결과는 다음과 같은 생각과 일치한다. SUV39H1KO CAR T 세포는 Mock CAR T 세포 보다 대사 면에서 더 적합하고 불리한 조건에서 에너지 소스를 전환하는데 더 유연하다. 즉, 미토콘드리아 호흡 억제 또는 글루코오스와 피루브산 결핍 상태에서 미토콘드리아 호흡 증가 후 더 많은 해당 작용으로 전환한다.
실시예 11 - 인간 SUV39H1 CAR T 세포의 인 비보 항종양 효능
급성 림프모구성 백혈병의 이종 모델을 사용하여 인간 CAR T 세포의 항종양 효능에 대한 SUV39H1의 효과를 연구하였다(도 19A). 간단히 말해서, 루시퍼레이즈를 발현하는 2.5x105 NALM-6 세포를 NSG 마우스의 꼬리에 정맥내 주사하고 인 비보 성장에 따라 세로 방향으로 생물발광(IVIS, Perkin Elmer)을 수행하였다. 종양 주입 후 3일째에 Mock 또는 SUV39H1KO인 106개의 CAR T 세포가 주입되었다. 2개의 상이한 도너에 대해, SUV39H1KO CAR T 세포는 더 강한 항종양 반응을 나타내었고 NSG 마우스의 생존을 향상시켰다(도 19B). CAR T 세포의 용량을 2x106으로 증가시키면 완전한 종양 거부(도 20A) 및 10마리 마우스 중 9마리의 생존(도 20B)이 나타났다.
실시예 12 - 불활성화된 내인성 TCR 및 불활성화된 SUV39H1을 갖는 CAR T 세포의 생성
Eyquem et al. , Nature 543: 113-117(2017)에 나타난 바와 같이. CRISPR-Cas9 RNP를 사용하여 CAR 유전자를 T-세포 수용체 α 불변(TRAC) 유전자좌에 도입하여 내인성 TCR의 발현을 상당히 감소시키거나 거의 제거한 T 세포를 생성하였다. 절차는 도 21A에 나와 있다. 인간 T 세포는 (1) TRAC 유전자좌의 첫 번째 엑손, 바람직하게 5' 말단 근처(gRNA 서열의 예: 5′C*A*G*GGUUCUGGAUAUCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U3′, 여기서 별표는 2'-O-메틸 3' 포스포로티오에이트)(SEQ ID NO: 16)를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는 Cas9 RNP, 및 (b) 항-CD19 CAR을 암호화하는 도너 AAV로 전기천공되었다. 생성된 T 세포는 내인성 TRAC 프로모터의 제어 하에 CAR을 발현한다. T 세포는 또한 결실을 위해 SUV39H1 유전자의 엑손을 표적으로 하는 SUV39H1 표적화 gRNA를 함유하는 Cas9 RNP와 병행하여 전기천공되었다. 항-CD19 CAR을 발현하는 세포를 선택하고 확장시켰다. 도 21B-C는 그러한 세포가 SUV39H1의 감소된 발현 및 내인성 TCR의 감소된 발현을 나타냄을 보여준다.
도 21b는 다양한 적정량의 AAV에서 CAR 양성인 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율, 및 CAR+ 세포에서 CAR 발현의 기하 평균 형광 강도를 보여준다. 후자는 AAV에 의한 감염의 다중성과 독립적으로 안정적인 CAR 발현을 보여 TRAC 유전자좌로의 성공적인 통합 및 내인성 TRAC 프로모터에 의한 CAR 발현의 제어를 확인시켜 주었다. 도 21C는 RT-qPCR에 의해 측정된 SUV39H1의 발현을 보여준다. 결과는 TRAC gRNA의 존재 및 AAV 형질도입과 무관한 SUV39H1의 성공적이고 효율적인 결실을 보여준다. 따라서, 이 프로토콜로 생성된 T 세포는 TRAC 유전자좌에서 CAR의 녹-인 및 SUV39H1의 특이적 결실을 모두 입증하였다.
실시예 13 - 불활성화된 SUV39H1 및 감소된 ITAM 활성을 갖는 CAR T-세포의 생성
ITAM2 및 ITAM3이 불활성화되거나 CD3 제타의 세포내 신호전달 영역으로부터 결실된 항-CD19 CAR(ITAM-감소된 CAR)을 암호화하는 핵산이 생성된다. CAR은 하나 이상의 공동-자극 도메인(예, CD28), 또는 2개 이상의 공동-자극 도메인(CD27, CD28, 4-1BB, 및/또는 OX40)을 가지고 있다. CAR-암호화 핵산은 실시예 7 또는 실시예 9에 따라 인간 T-세포 내로 도입되고, SUV39H1은 녹아웃된다. 이 항-CD19 ITAM-감소된 CAR을 발현하고 SUV39H1의 감소된 발현을 나타내는 세포는 따라서 실시예 7의 방법을 사용하여 생성된다. 항-CD19 ITAM-감소된 CAR을 발현하고 SUV39H1의 감소된 발현 및 내인성 TCR의 감소된 발현을 나타내는 세포를 실시예 9의 방법을 사용하여 생성하였다. 생성된 세포는 그들의 중앙 기억 세포 표현형(CCR7+CD45RO+CD27+CD62L+), 연속 자극 후 증식 및 피로 특성(TIM-3, PD-1, LAG-3 발현)에 대해 평가된다.
SEQUENCE LISTING <110> AMIGORENA, et al. <120> IMMUNE CELLS DEFECTIVE FOR SUV39H1 <130> 40020/20010P3 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2733 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank / AF019968.1 <309> 1999-04-16 <313> (1)..(2733) <400> 1 ctcgcgaggc cggctaggcc cgaatgtcgt tagccgtggg gaaagatggc ggaaaattta 60 aaaggctgca gcgtgtgttg caagtcttct tggaatcagc tgcaggacct gtgccgcctg 120 gccaagctct cctgccctgc cctcggtatc tctaagagga acctctatga ctttgaagtc 180 gagtacctgt gcgattacaa gaagatccgc gaacaggaat attacctggt gaaatggcgt 240 ggatatccag actcagagag cacctgggag ccacggcaga atctcaagtg tgtgcgtatc 300 ctcaagcagt tccacaagga cttagaaagg gagctgctcc ggcggcacca ccggtcaaag 360 accccccggc acctggaccc aagcttggcc aactacctgg tgcagaaggc caagcagagg 420 cgggcgctcc gtcgctggga gcaggagctc aatgccaagc gcagccatct gggacgcatc 480 actgtagaga atgaggtgga cctggacggc cctccgcggg ccttcgtgta catcaatgag 540 taccgtgttg gtgagggcat caccctcaac caggtggctg tgggctgcga gtgccaggac 600 tgtctgtggg cacccactgg aggctgctgc ccgggggcgt cactgcacaa gtttgcctac 660 aatgaccagg gccaggtgcg gcttcgagcc gggctgccca tctacgagtg caactcccgc 720 tgccgctgcg gctatgactg cccaaatcgt gtggtacaga agggtatccg atatgacctc 780 tgcatcttcc ggacggatga tgggcgtggc tggggcgtcc gcaccctgga gaagattcgc 840 aagaacagct tcgtcatgga gtacgtggga gagatcatta cctcagagga ggcagagcgg 900 cggggccaga tctacgaccg tcagggcgcc acctacctct ttgacctgga ctacgtggag 960 gacgtgtaca ccgtggatgc cgcctactat ggcaacatct cccactttgt caaccacagt 1020 tgtgacccca acctgcaggt gtacaacgtc ttcatagaca accttgacga gcggctgccc 1080 cgcatcgctt tctttgccac aagaaccatc cgggcaggcg aggagctcac ctttgattac 1140 aacatgcaag tggaccccgt ggacatggag agcacccgca tggactccaa ctttggcctg 1200 gctgggctcc ctggctcccc taagaagcgg gtccgtattg aatgcaagtg tgggactgag 1260 tcctgccgca aatacctctt ctagccctta gaagtctgag gccagactga ctgagggggc 1320 ctgaagctac atgcacctcc cccactgctg ccctcctgtc gagaatgact gccagggcct 1380 cgcctgcctc cacctgcccc cacctgctcc tacctgctct acgttcaggg ctgtggccgt 1440 ggtgaggacc gactccagga gtcccctttc cctgtcccag ccccatctgt gggttgcact 1500 tacaaacccc cacccacctt cagaaatagt ttttcaacat caagactctc tgtcgttggg 1560 attcatggcc tattaaggag gtccaagggg tgagtcccaa cccagcccca gaatatattt 1620 gtttttgcac ctgcttctgc ctggagattg aggggtctgc tgcaggcctc ctccctgctg 1680 ccccaaaggt atggggaagc aaccccagag caggcagaca tcagaggcca gagtgcctag 1740 cccgacatga agctggttcc ccaaccacag aaactttgta ctagtgaaag aaaggggtcc 1800 ctggcctacg ggctgaggct ggtttctgct cgtgcttaca gtgctgggta gtgttggccc 1860 taagagctgt agggtctctt cttcagggct gcatatctga gaagtggatg cccacatgcc 1920 actggaaggg aagtgggtgt ccatgggcca ctgagcagtg agaggaaggc agtgcagagc 1980 tggccagccc tggaggtagg ctgggaccaa gctctgcctt cacagtgcag tgaaggtacc 2040 tagggctctt gggagctctg cggttgctag gggccctgac ctggggtgtc atgaccgctg 2100 acaccactca gagctggaac caagatctag atagtccgta gatagcactt aggacaagaa 2160 tgtgcattga tggggtggtg atgaggtgcc aggcactagg tagagcacct ggtccacgtg 2220 gattgtctca gggaagcctt gaaaaccacg gaggtggatg ccaggaaagg gcccatgtgg 2280 cagaaggcaa agtacaggcc aagaattggg ggtgggggag atggcttccc cactatggga 2340 tgacgaggcg agagggaagc ccttgctgcc tgccattccc agaccccagc cctttgtgct 2400 caccctggtt ccactggtct caaaagtcac ctgcctacaa atgtacaaaa ggcgaaggtt 2460 ctgatggctg ccttgctcct tgctccccca ccccctgtga ggacttctct aggaagtcct 2520 tcctgactac ctgtgcccag agtgccccta catgagactg tatgccctgc tatcagatgc 2580 cagatctatg tgtctgtctg tgtgtccatc ccgccggccc cccagactaa cctccaggca 2640 tggactgaat ctggttctcc tcttgtacac ccctcaaccc tatgcagcct ggagtgggca 2700 tcaataaaat gaactgtcga ctgaaaaaaa aaa 2733 <210> 2 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank / AAB92224.1 <309> 1999-04-16 <313> (1)..(412) <400> 2 Met Ala Glu Asn Leu Lys Gly Cys Ser Val Cys Cys Lys Ser Ser Trp 1 5 10 15 Asn Gln Leu Gln Asp Leu Cys Arg Leu Ala Lys Leu Ser Cys Pro Ala 20 25 30 Leu Gly Ile Ser Lys Arg Asn Leu Tyr Asp Phe Glu Val Glu Tyr Leu 35 40 45 Cys Asp Tyr Lys Lys Ile Arg Glu Gln Glu Tyr Tyr Leu Val Lys Trp 50 55 60 Arg Gly Tyr Pro Asp Ser Glu Ser Thr Trp Glu Pro Arg Gln Asn Leu 65 70 75 80 Lys Cys Val Arg Ile Leu Lys Gln Phe His Lys Asp Leu Glu Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Arg Arg His His Arg Ser Lys Thr Pro Arg His Leu Asp Pro 100 105 110 Ser Leu Ala Asn Tyr Leu Val Gln Lys Ala Lys Gln Arg Arg Ala Leu 115 120 125 Arg Arg Trp Glu Gln Glu Leu Asn Ala Lys Arg Ser His Leu Gly Arg 130 135 140 Ile Thr Val Glu Asn Glu Val Asp Leu Asp Gly Pro Pro Arg Ala Phe 145 150 155 160 Val Tyr Ile Asn Glu Tyr Arg Val Gly Glu Gly Ile Thr Leu Asn Gln 165 170 175 Val Ala Val Gly Cys Glu Cys Gln Asp Cys Leu Trp Ala Pro Thr Gly 180 185 190 Gly Cys Cys Pro Gly Ala Ser Leu His Lys Phe Ala Tyr Asn Asp Gln 195 200 205 Gly Gln Val Arg Leu Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Glu Cys Asn Ser 210 215 220 Arg Cys Arg Cys Gly Tyr Asp Cys Pro Asn Arg Val Val Gln Lys Gly 225 230 235 240 Ile Arg Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Arg Thr Asp Asp Gly Arg Gly Trp 245 250 255 Gly Val Arg Thr Leu Glu Lys Ile Arg Lys Asn Ser Phe Val Met Glu 260 265 270 Tyr Val Gly Glu Ile Ile Thr Ser Glu Glu Ala Glu Arg Arg Gly Gln 275 280 285 Ile Tyr Asp Arg Gln Gly Ala Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Asp Tyr Val 290 295 300 Glu Asp Val Tyr Thr Val Asp Ala Ala Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser His 305 310 315 320 Phe Val Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Leu Gln Val Tyr Asn Val Phe 325 330 335 Ile Asp Asn Leu Asp Glu Arg Leu Pro Arg Ile Ala Phe Phe Ala Thr 340 345 350 Arg Thr Ile Arg Ala Gly Glu Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Asn Met Gln 355 360 365 Val Asp Pro Val Asp Met Glu Ser Thr Arg Met Asp Ser Asn Phe Gly 370 375 380 Leu Ala Gly Leu Pro Gly Ser Pro Lys Lys Arg Val Arg Ile Glu Cys 385 390 395 400 Lys Cys Gly Thr Glu Ser Cys Arg Lys Tyr Leu Phe 405 410 <210> 3 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 20 25 30 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 35 40 45 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 50 55 60 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 65 70 75 80 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 85 90 <210> 4 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (61)..(89) <223> ITAM1 <220> <221> SITE <222> (100)..(128) <223> ITAM2 <220> <221> SITE <222> (131)..(159) <223> ITAM3 <300> <308> UniProt / P20963.2 <309> 2019-07-03 <313> (1)..(164) <400> 4 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 100 105 110 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 115 120 125 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 130 135 140 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 145 150 155 160 Leu Pro Pro Arg <210> 5 <211> 645 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(42) <223> Extracellular domain <400> 5 Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys 20 25 30 Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val 35 40 45 Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu 50 55 60 Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu 65 70 75 80 Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met 85 90 95 Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys 100 105 110 Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile 115 120 125 Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val 130 135 140 Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu 165 170 175 Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro 180 185 190 Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly 195 200 205 Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser 210 215 220 Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 225 230 235 240 Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu 245 250 255 Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly 260 265 270 Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg 275 280 285 Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu 290 295 300 Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu 305 310 315 320 Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile 325 330 335 Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp 340 345 350 Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg 355 360 365 Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu 370 375 380 Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu 385 390 395 400 Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro 405 410 415 Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met 420 425 430 Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp 435 440 445 Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro 450 455 460 Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu 465 470 475 480 Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro 485 490 495 Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser 500 505 510 Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu 515 520 525 Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu 530 535 540 Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Ala 545 550 555 560 Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala 565 570 575 Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly 580 585 590 Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp 595 600 605 Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro 610 615 620 Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly 625 630 635 640 Leu Asp Val Pro Val 645 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys 20 25 30 Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr 35 40 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 HCDR1 <400> 7 Asp Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 HCDR2 <400> 8 Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 HCDR3 <400> 9 Glu Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 LCDR1 <400> 10 Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 LCDR2 <400> 11 Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 LCDR3 <400> 12 Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu Ala 1 5 <210> 13 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 VH <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ile Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Thr Asn Gly Gly Thr Thr His Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Phe Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p95HER2 VL <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp 1 5 <210> 16 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synethic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> n is 2'-O-methyl 3'phosphorothioate <400> 16 cnangngguu cuggauaucu guguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60 uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcun ununu 105

Claims (26)

  1. SUV39H1 유전자가 불활성화된 변형된 면역 세포로서,
    상기 세포는 항원, 임의로 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이종성 T 세포 수용체(TCR)에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 삽입에 의해 불활성화된 T 세포 수용체(TCR) 알파 불변 영역 유전자를 포함하고,
    여기서 임의로 상기 항원은 희귀 티로신 키네이즈 수용체(orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)인, 변형된 면역 세포.
  2. SUV39H1 억제제, 임의로 우성 음성 SUV39H1 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 면역 세포로서,
    상기 세포는 항원, 임의로 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이종성 TCR에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 삽입에 의해 불활성화된 TCR 알파 불변 영역 유전자를 포함하며,
    여기서 임의로 상기 항원은 희귀 티로신 키네이즈 수용체(orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)인, 변형된 면역 세포.
  3. SUV39H1 유전자가 불활성화된 변형된 면역세포로서,
    a) 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인,
    b) 막횡단 도메인,
    c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인
    d) ITAM2 및 ITAM3이 불활성화된 변형된 CD3제타 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인,
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고,
    여기서 임의로 상기 항원은 희귀 티로신 키네이즈 수용체(orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)인, 변형된 면역 세포.
  4. SUV39H1 억제제, 임의로 우성 음성 SUV39H1 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 면역세포로서,
    a) 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인,
    b) 막횡단 도메인,
    c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인
    d) ITAM2 및 ITAM3이 불활성화된 변형된 CD3제타 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인,
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고,
    여기서 임의로 상기 항원은 희귀 티로신 키네이즈 수용체(orphan tyrosine kinase receptor) ROR1, tEGFR, Her2, p95HER2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, BCMA, 루이스 Y, MAGE-A1, 메조텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSMA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD 123, CS-1 , c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 또는 빌름스 종양 1(WT-1)인, 변형된 면역 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포, T 세포 전구체, 조혈 줄기 세포, iPSC, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 또는 NK 세포, 또는 TN 세포, TSCM, TCM 또는 TEM 세포인, 변형된 면역 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 조절 세포인 변형된 면역 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 (a) 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막횡단 도메인, (c) 임의로 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 (d) 세포내 신호전달 도메인를 포함하는 변형된 면역 세포.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, 임의로 암 항원에 특이적으로 결합하는 scFv인 변형된 면역 세포.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은 CD28, CD8 또는 CD3-제타 유래인 변형된 면역 세포.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, ICOS, OX40 및 DAP10으로 이루어진 군에서 선택되는, 변형된 면역 세포.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 단편, 임의로 CD3-제타 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 2(ITAM2) 및 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 3(ITAM3)이 불활성화되는, 변형된 면역 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원-특이적 수용체, 임의로 TCR 또는 CAR을 추가로 포함하는, 변형된 면역 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SUV39H1 발현은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 감소되는, 변형된 면역 세포.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내인성 TCR 발현은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 감소되는, 변형된 면역 세포.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 자가 유래인, 변형된 면역 세포.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 동종이계인, 변형된 면역 세포.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HLA-A 유전자좌는 불활성화된, 변형된 면역 세포.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 HLA 클래스 I 발현은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 감소되는, 변형된 면역 세포.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개의 CAR, 즉 제1 항원에 결합하는 제1 CAR 및 제2 항원에 결합하는 제2 CAR을 발현하는, 변형된 면역 세포.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포를 포함하는 멸균 약학적 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포, 및 전달 장치 또는 용기를 포함하는 키트.
  22. 상기 면역 세포 또는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 환자에 투여하여, 항원과 관련된 질병, 임의로 암으로 고통받거나 위험에 처한 환자를 치료하기 위한, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포 또는 약학적 조성물 또는 키트를 사용하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 CAR T-세포이고 약 5 x 107 세포 미만, 임의로 약 105 내지 약 107 세포의 용량으로 환자에 투여되는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    제2 치료제, 임의로 하나 이상의 암 화학요법제, 세포독성제, 호르몬, 항-혈관형성제, 방사성표지된 화합물, 면역요법, 수술, 냉동요법, 및/또는 방사선요법이 환자에 투여되는 방법.
  25. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 조절제가 환자에 투여되는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 조절제는 PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, EP2/4 아데노신 수용체, 또는 A2AR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 PD1의 다른 억제제인 방법.
KR1020227006067A 2019-07-23 2020-07-23 Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포 KR20220042161A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962877789P 2019-07-23 2019-07-23
US62/877,789 2019-07-23
US202062978936P 2020-02-20 2020-02-20
US62/978,936 2020-02-20
US202063048328P 2020-07-06 2020-07-06
US63/048,328 2020-07-06
PCT/EP2020/070845 WO2021013950A1 (en) 2019-07-23 2020-07-23 Immune cells defective for suv39h1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220042161A true KR20220042161A (ko) 2022-04-04

Family

ID=71784065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227006067A KR20220042161A (ko) 2019-07-23 2020-07-23 Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220251572A1 (ko)
EP (1) EP4003407A1 (ko)
JP (1) JP2022542102A (ko)
KR (1) KR20220042161A (ko)
CN (1) CN114222815A (ko)
AU (1) AU2020318781A1 (ko)
BR (1) BR112022001148A2 (ko)
CA (1) CA3146895A1 (ko)
IL (1) IL290020A (ko)
MX (1) MX2022000922A (ko)
WO (1) WO2021013950A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
CA3212964A1 (en) * 2021-03-11 2022-09-15 Mnemo Therapeutics Tumor neoantigenic peptides
WO2023126458A1 (en) * 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2023139269A1 (en) * 2022-01-21 2023-07-27 Mnemo Therapeutics Modulation of suv39h1 expression by rnas
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2024062138A1 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1990A (en) 1841-02-20 Head-block of sawmills for sawing without stub-shot and gaging the
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
WO2000014257A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US20020131960A1 (en) 2000-06-02 2002-09-19 Michel Sadelain Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US20050025763A1 (en) 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
SI2511297T1 (sl) 2004-02-06 2015-07-31 Morphosys Ag Proti -CD38 humana protitelesa in njihova uporaba
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
ME03528B (me) 2005-03-23 2020-04-20 Genmab As Antitijela protiv cd38 za liječenje multiplog mijeloma
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
HUE038506T2 (hu) 2007-03-30 2018-10-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Kostimuláló ligand konstitutív expressziója adoptív módon átvitt T-limfocitákon
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
BRPI0821447A2 (pt) 2007-12-26 2015-06-16 Biotest Ag Anticorpo de alvejamento engenheirado, composição farmacêutica, hibridoma, ensaio com base em anticorpo, polipeptídeo isolado, e, método para ligação homogênea
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
KR20110096536A (ko) 2008-10-31 2011-08-30 애보트 바이오테라퓨틱스 코포레이션 희귀 림프종의 치료를 위한 항ｃｓ1 항체의 용도
CA2764386C (en) 2008-12-01 2018-05-01 Laboratory Corporation Of America Holdings P95-her2 antibodies and uses thereof
WO2011009173A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Mater Medical Research Institute Cancer immunotherapy
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
JP5947311B2 (ja) 2010-12-09 2016-07-06 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
MX359513B (es) 2011-03-23 2018-10-01 Hutchinson Fred Cancer Res Metodo y composiciones para inmunoterapia celular.
SG193956A1 (en) 2011-04-01 2013-11-29 Sloan Kettering Inst Cancer T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
CN107011426B (zh) 2011-11-11 2021-05-14 弗雷德哈钦森癌症研究中心 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
NZ702108A (en) 2012-05-03 2016-09-30 Hutchinson Fred Cancer Res Enhanced affinity t cell receptors and methods for making the same
PL2855667T3 (pl) 2012-05-25 2024-03-25 Cellectis Sposoby uzyskiwania metodami inżynierii allogenicznych i opornych na immunosupresję limfocytów t do immunoterapii
RU2700765C2 (ru) 2012-08-20 2019-09-19 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
US9181535B2 (en) 2012-09-24 2015-11-10 The Chinese University Of Hong Kong Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
EP3597215A1 (en) 2012-10-02 2020-01-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DE112012007250T5 (de) 2012-12-20 2015-10-08 Mitsubishi Electric Corp. Fahrzeuginterne Vorrichtung und Programm
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP3331913A1 (en) * 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108601821B (zh) 2015-10-05 2023-09-19 精密生物科学公司 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞
EP4180519A1 (en) 2016-04-15 2023-05-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
JP7022123B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-17 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に対する二重特異性抗体
WO2018132506A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains
MX2019015841A (es) * 2017-06-20 2020-08-03 Inst Curie Celulas inmunes defectuosas para suv39h1.
KR20200106051A (ko) 2017-12-29 2020-09-10 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 향상된 키메라 항원 수용체 및 그의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022000922A (es) 2022-05-03
JP2022542102A (ja) 2022-09-29
AU2020318781A1 (en) 2022-02-10
WO2021013950A1 (en) 2021-01-28
US20220251572A1 (en) 2022-08-11
EP4003407A1 (en) 2022-06-01
CN114222815A (zh) 2022-03-22
CA3146895A1 (en) 2021-01-28
BR112022001148A2 (pt) 2022-03-15
IL290020A (en) 2022-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2959683T3 (es) Células manipuladas para terapia celular adoptiva
US20220251572A1 (en) Immune cells defective for suv39h1
JP2019536452A (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US11285176B2 (en) Immune cells defective for Suv39h1
WO2020068702A1 (en) Chimeric receptor proteins and uses thereof
WO2019109047A1 (en) Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
US20230303974A1 (en) Immune Cells Defective for SOCS1
CN113286815B (zh) 间皮素特异性t细胞受体及其在免疫治疗中的应用
RU2784531C2 (ru) ИММУННЫЕ КЛЕТКИ, ДЕФЕКТНЫЕ ПО Suv39h1
WO2023126458A1 (en) Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2024062138A1 (en) Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2023222928A2 (en) Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2023230014A1 (en) Binding proteins and engineered cells specific for neoantigens and uses thereof
WO2019140278A1 (en) Immunotherapy targeting core binding factor antigens