CN108601821B - 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 - Google Patents
包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108601821B CN108601821B CN201680069576.0A CN201680069576A CN108601821B CN 108601821 B CN108601821 B CN 108601821B CN 201680069576 A CN201680069576 A CN 201680069576A CN 108601821 B CN108601821 B CN 108601821B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- cells
- cell
- trc
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 549
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 149
- 101000634853 Homo sapiens T cell receptor alpha chain constant Proteins 0.000 title abstract description 22
- 102100029452 T cell receptor alpha chain constant Human genes 0.000 title abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 110
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 136
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 114
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 96
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 88
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 71
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 62
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 56
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 55
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 45
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 45
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 14
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 14
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 136
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 103
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 78
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 78
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 69
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 53
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 52
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 52
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 50
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 49
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 45
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 44
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 44
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 41
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 37
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 34
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 31
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 26
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 25
- 102100038388 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Human genes 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 23
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 22
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 20
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 18
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 17
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 17
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 16
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 16
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 16
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 16
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 15
- 102100021765 E3 ubiquitin-protein ligase RNF139 Human genes 0.000 description 14
- 101001106970 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF139 Proteins 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 12
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 11
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 10
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 10
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 9
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 8
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 description 7
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 7
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 7
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 6
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 5
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 4
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 4
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 4
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 4
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 102220556549 Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor_Q47M_mutation Human genes 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- -1 cationic lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 3
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 2
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 2
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101001040800 Homo sapiens Integral membrane protein GPR180 Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- 101150072844 APOM gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 1
- 102100021619 Ankyrin repeat and SOCS box protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100037324 Apolipoprotein M Human genes 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101800000585 Diphtheria toxin fragment A Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 1
- 101710191797 Gamma-enolase Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000754309 Homo sapiens Ankyrin repeat and SOCS box protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000731738 Homo sapiens Inactive ADP-ribosyltransferase ARH2 Proteins 0.000 description 1
- 101000693234 Homo sapiens PDZ domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001000069 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12B Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000987003 Homo sapiens Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100032448 Inactive ADP-ribosyltransferase ARH2 Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102100025653 PDZ domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100036545 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12B Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000011259 co-electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012246 gene addition Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 102000028546 heme binding Human genes 0.000 description 1
- 108091022907 heme binding Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/001112—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/804—Blood cells [leukemia, lymphoma]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
本文中公开了其基因组中包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞,其中所述细胞具有降低的内源性T细胞受体的细胞表面表达。本公开内容还涉及用于产生这样的经遗传修饰的细胞的方法,以及使用这样的细胞来治疗对象中的疾病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月19日提交的题为“Genetically-Modified CellsComprising a Modified Human T Cell Receptor Alpha Constant Region Gene”的美国临时申请第62/297,426号和2015年10月5日提交的题为“Genetically-Modified CellsComprising a Modified Human T Cell Receptor Alpha Constant Region Gene”的美国临时申请第62/237,394号的优先权,其公开内容在此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及肿瘤学、癌症免疫治疗、分子生物学和重组核酸技术领域。具体地,本发明涉及其基因组中包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞,其中所述细胞具有降低的内源性T细胞受体的细胞表面表达。本发明还涉及用于产生这样的经遗传修饰的细胞的方法,以及使用这样的细胞来治疗对象中的疾病(包括癌症)的方法。
引用通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表
本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交且在此通过引用整体并入的序列表。在2016年10月3日创建的所述ASCII副本被命名为2000706_00180WO1.txt,并且大小为264,046字节。
背景技术
T细胞过继免疫治疗是用于癌症治疗的有前景的方法。该策略利用经遗传修饰的分离的人T细胞来增强其对特定肿瘤相关抗原的特异性。遗传修饰可涉及嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的表达以将抗原特异性移植到T细胞上。与外源性T细胞受体相比,嵌合抗原受体从单克隆抗体的可变结构域获得它们的特异性。因此,表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以主要组织相容性复合体非限制的方式诱导肿瘤免疫反应性。迄今为止,T细胞过继免疫疗法已被用作许多癌症的临床疗法,包括B细胞恶性肿瘤(例如,急性成淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL)和慢性淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、晚期神经胶质瘤、卵巢癌、间皮瘤、黑素瘤和胰腺癌。
尽管其具有作为癌症治疗的潜在有用性,但是用CAR T细胞的过继免疫疗法部分受到细胞表面上内源性T细胞受体的表达的限制。表达内源性T细胞受体的CAR T细胞在施用于同种异体患者后可识别主要和次要组织相容性抗原,这可以导致移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease,GVHD)的发展。因此,临床试验已主要集中在使用自体CAR T细胞,其中分离患者的T细胞,进行遗传修饰以并入嵌合抗原受体,然后重新输注至同一患者体内。自体方法提供对施用的CAR T细胞的免疫耐受性;然而,这种方法受到在患者已诊断为癌症之后产生患者特异性CAR T细胞所需的时间和费用两者的限制。
因此,开发使用来自第三方供体的T细胞制备的具有降低的内源性T细胞受体表达且在施用后不引发GVHD的“现成的(offthe shelf)”CART细胞将是有利的。这样的产品可以在诊断之前产生和验证,并且可以在一旦必要时可用于患者。因此,需要开发缺乏内源性T细胞受体以防止GVHD的发生的同种异体CAR T细胞。
基因组DNA的遗传修饰可以使用位点特异性的稀有切割内切核酸酶进行,所述内切核酸酶经改造以识别目的基因座中的DNA序列。用于产生经改造的位点特异性内切核酸酶的方法在本领域中是已知的。例如,锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)可以被改造以识别和切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白,其包含与FokI限制酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。锌指结构域可以通过合理手段或实验手段重新设计,以产生与长度为18个碱基对的预定DNA序列结合的蛋白质。通过将该经改造的蛋白质结构域与FokI核酸酶融合,可以以基因组水平特异性靶向DNA断裂。ZFN已被广泛用于靶向广泛的真核生物体中的基因添加、去除和替换(综述于Durai等(2005),Nucleic Acids Res 33,5978中)。同样地,可以产生TAL效应物核酸酶(TAL-effector nuclease,TALEN)以切割基因组DNA中的特定位点。像ZFN一样,TALEN包含与FokI核酸酶结构域融合的经改造的位点特异性DNA结合结构域(综述于Mak等(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93-9中)。然而,在这种情况下,DNA结合结构域包含TAL效应子结构域的串联阵列,每个效应子结构域均特异性识别单个DNA碱基对。ZFN和TALEN对于实施本发明的限制zaiyu它们是异二聚体的,因此在细胞中产生单一功能性核酸酶需要两种蛋白质单体的共表达。
Compact TALEN具有避免需要二聚化的替代内切核酸酶结构(Beurdeley等(2013),Nat Commun.4:1762)。Compact TALEN包含与来自I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合的经改造的位点特异性TAL效应子DNA结合结构域。与Fokl不同,I-TevI不需要二聚化以产生双链DNA断裂,因此Compact TALEN作为单体发挥功能。
基于CRISPR/Cas9系统的经改造的内切核酸酶在本领域中也是已知的(Ran等(2013),Nat Protoc.8:2281-2308;Mali等(2013),Nat Methods 10:957-63)。CRISPR内切核酸酶包含两个组分:(1)胱天蛋白酶效应物核酸酶,通常是微生物Cas9;和(2)包含约20个核苷酸靶向序列的短“指导RNA”,其将核酸酶引导至基因组中的目的位置。通过在相同细胞中表达多个指导RNA,每个指导RNA具有不同的靶向序列,可以将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点。因此,CRISPR/Cas9核酸酶适用于本发明。CRISPR/Cas9系统的主要缺点是其报道的高频率的脱靶DNA断裂,这可能限制该系统用于治疗人患者的效用(Fu等(2013),NatBiotechnol.31:822-6)。
归巢内切核酸酶是一组天然存在的核酸酶,其识别通常存在于植物和真菌的基因组中的15至40个碱基对切割位点。它们经常与寄生性(parasitic)DNA元件有关,如1类自我剪接内含子和内含肽。它们通过在染色体中产生双链断裂而自然地促进了宿主基因组中特定位置处的同源重组或基因插入,这募集了细胞DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95)。归巢内切核酸酶通常分为四个家族:LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)家族、GIY-YIG家族、His-Cys盒家族和HNH家族。这些家族的特征在于结构基序,其影响催化活性和识别序列。例如,LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)家族的成员的特征在于具有保守LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)基序的一个或两个拷贝(参见Chevalier等(2001),NucleicAcids Res.29(18):3757-3774)。具有LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)基序的单拷贝的LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)归巢内切核酸酶形成同二聚体,而具有LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)基序的两个拷贝的成员被发现为单体。
I-CreI(SEQ ID NO:6)是归巢内切核酸酶的LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)家族的成员,其识别并切割藻类莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体染色体中的22个碱基对识别序列。已经使用遗传选择技术来修饰野生型I-CreI切割位点偏好(Sussman等(2004),J.Mol.Biol.342:31-41;Chames等(2005),Nucleic Acids Res.33:el78;Seligman等(2002),Nucleic Acids Res.30:3870-9;Arnould等(2006),J.Mol.Biol.355:443-58)。最近,描述了合理设计单LAGLIDADG(SEQ ID NO:7)归巢内切核酸酶的方法,其能够全面重新设计I-CreI和其他归巢内切核酸酶以靶向广泛相异的DNA位点,包括哺乳动物、酵母、植物、细菌和病毒基因组中的位点(WO 2007/047859)。
如WO2009/059195中首先描述的,I-CreI及其经改造的衍生物通常是二聚的,但可以使用将第一亚基的C末端连接至第二亚基的N末端的短肽接头融合为单个多肽(Li等(2009),Nucleic Acids Res.37:1650-62;Grizot等(2009),Nucleic Acids Res.37:5405-19)。因此,功能性“单链”大范围核酸酶(meganuclease)可以由单个转录物表达。
国际公开文本WO2014/191527中先前公开了使用经改造的大范围核酸酶来切割人T细胞受体α恒定区中的DNA靶标。’527公开文本公开了经改造以靶向TCR α恒定区基因的外显子1内的识别序列(’527公开文本的SEQ ID NO:3)的I-OnuI大范围核酸酶的变体。尽管’527公开文本讨论了嵌合抗原受体可以在TCR敲除细胞中表达,但作者并未公开将嵌合抗原受体编码序列插入到TCR α恒定区基因中的大范围核酸酶切割位点中。
还公开了使用其他核酸酶和机制来破坏内源性TCR的表达。例如,美国专利第8,95,828号和美国专利申请公开第US2014/034902号描述了使用锌指核酸酶来破坏人T细胞中的TCR基因。美国公开第US2014/0301990号描述了使用锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以及具有经改造的单一指导RNA的CRISPR/Cas系统来靶向分离的T细胞中的TCR基因。美国专利申请公开第US2012/0321667号公开了使用靶向T细胞中编码特定TCR和/或CD3链的核酸的小发夹RNA。
然而,本发明在现有技术的教导上进行了改进。本发明人首次教导了包含插入到人TCR α恒定区基因中的外源多核苷酸序列(例如,嵌合抗原受体或外源TCR编码序列)的经遗传修饰的细胞,其同时破坏内源性T细胞受体在细胞表面处的表达。此外,现有技术未教导本文中所述的大范围核酸酶或识别序列,或其用于产生这样的经遗传修饰的细胞的用途。
发明内容
本发明提供了在其基因组中包含经修饰的T细胞受体(TCR)α恒定区基因的经遗传修饰的细胞。这样的细胞是经遗传修饰的人T细胞或经遗传修饰的来源于人T细胞的细胞。此外,当与未经修饰的对照细胞相比时,这样的细胞具有降低的内源性TCR的细胞表面表达。本发明还提供了用于产生所述经遗传修饰的细胞的方法。本发明进一步提供了通过施用经遗传修饰的细胞来治疗癌症的免疫治疗方法。
因此,在一方面,本发明提供了在其基因组中包含经修饰的人TCR α恒定区基因的经遗传修饰的细胞,其中经修饰的人TCR α恒定区基因从5’至3’包含:(a)人TCR α恒定区基因的5’区;(b)外源多核苷酸;和(c)人TCR α恒定区基因的3’区。经遗传修饰的细胞是经遗传修饰的人T细胞或经遗传修饰的来源于人T细胞的细胞。此外,当与未经修饰的对照细胞相比时,经遗传修饰的细胞具有降低的内源性TCR的细胞表面表达。
在一个实施方案中,外源多核苷酸包含编码嵌合抗原受体的核酸序列,其中所述嵌合抗原受体包含细胞外配体结合结构域和一个或更多个细胞内信号转导结构域。
在一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:112具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的细胞外配体结合结构域,其中所述细胞外配体结合结构域与CD19结合。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:113具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的细胞内细胞质信号转导结构域。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:114具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的细胞内共刺激信号转导结构域。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体还包含信号肽。在一些实施方案中,信号肽可以与SEQ ID NO:115具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体还包含铰链结构域。在一些实施方案中,铰链结构域与SEQ ID NO:116具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。在一些实施方案中,跨膜结构域与SEQ ID NO:117具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个这样的实施方案中,嵌合抗原受体与SEQ ID NO:111具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个实施方案中,外源多核苷酸包含驱动外源多核苷酸表达的启动子序列。在一个这样的实施方案中,启动子序列与SEQ ID NO:118具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个实施方案中,外源多核苷酸的核酸序列与SEQ ID NO:119具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%的序列同一性。
在另一个实施方案中,在包含SEQ ID NO:3的识别序列内的位置处将外源多核苷酸插入到TCR基因中。在一个这样的实施方案中,经修饰的人TCR α恒定区基因包含与SEQID NO:120具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的核酸序列。
在另一个实施方案中,在包含SEQ ID NO:4的识别序列内的位置处将外源多核苷酸插入到TCR α恒定区基因中。在一个这样的实施方案中,经修饰的人TCR α恒定区基因包含与SEQ ID NO:121具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的核酸序列。
在另一个实施方案中,在包含SEQ ID NO:5的识别序列内的位置处将外源多核苷酸插入到TCR α恒定区基因中。在一个这样的实施方案中,经修饰的人TCR α恒定区基因包含与SEQ ID NO:122具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或多至100%序列同一性的核酸序列。
在另一方面,本发明提供了包含如本文中所述的经遗传修饰的细胞和可药用载体的药物组合物。
在另一方面,本发明提供了如本文中所述的用作药物的经遗传修饰的细胞。本发明还提供了如本文中所述的经遗传修饰的细胞在制造用于治疗有此需要的对象中的疾病的药物中的用途。在一个这样的方面,所述药物可用于治疗癌症。在一些实施方案中,癌症的治疗是免疫治疗。
在另一方面,本发明提供了用于产生包含经修饰的人TCR α恒定区基因的经遗传修饰的细胞的方法,所述方法包括:(a)向细胞中引入:(i)编码经改造核酸酶的第一核酸序列;或(ii)经改造核酸酶蛋白;其中所述经改造核酸酶在人TCR α恒定区基因内的识别序列处产生切割位点;以及(b)将包含外源多核苷酸的第二核酸序列引入到细胞中。在这样的方法中,细胞是人T细胞或来源于人T细胞。此外,在切割位点处将外源多核苷酸的序列插入到人TCR α恒定区基因中。此外,当与未经修饰的对照细胞相比时,经遗传修饰的细胞具有降低的内源性TCR的细胞表面表达。
在所述方法的多个实施方案中,可以在引入第二核酸之前或在引入第二核酸之后将第一核酸序列或经改造核酸酶蛋白引入到细胞中。
在所述方法的一个实施方案中,第二核酸序列从5’至3’包含:(a)与切割位点侧翼的5’上游序列同源的5’同源臂;(b)外源多核苷酸;和(c)与切割位点侧翼的3’下游序列同源的3’同源臂。在这样的实施方案中,通过同源重组在切割位点处将外源多核苷酸的序列插入到人TCR α恒定区基因中。
在所述方法的另一个实施方案中,第二核酸与切割位点缺乏实质同源性,并且通过非同源末端连接将外源多核苷酸的序列插入到人TCR α恒定区基因中。
在所述方法的另一个实施方案中,外源多核苷酸包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中,外源多核苷酸包含驱动外源多核苷酸表达的第一启动子序列。
在所述方法的另一个实施方案中,使用mRNA将编码经改造核酸酶的第一核酸引入到细胞中。在一些实施方案中,mRNA可以是多顺反子mRNA,其包含本文中所述的至少一种经改造核酸酶的编码序列和至少一种另外的蛋白质(例如第二核酸酶)的编码序列。在具体的实施方案中,多顺反子mRNA可以编码本文中所述的靶向相同基因(例如,T细胞受体α恒定区基因)内的不同识别序列的两种或更多种经改造核酸酶。在另一些实施方案中,多顺反子mRNA可以编码本文中所述的经改造核酸酶和第二核酸酶,所述第二核酸酶识别并切割相同基因(例如,T细胞受体α恒定区基因)内的不同识别序列,或者可替选地识别并切割基因组中的另一个目的基因内的不同识别序列。在这样的实施方案中,使用这样的多顺反子mRNA产生的经遗传修饰的细胞可以同时敲除多个基因。在另外的实施方案中,多顺反子mRNA可以编码本文中所述的至少一种经改造核酸酶和一种另外的蛋白质,所述蛋白质对细胞有益,提高将外源目的序列插入到切割位点中的效率,和/或在治疗疾病方面有益。
在所述方法的另一个实施方案中,通过使细胞与包含第二核酸序列的病毒载体接触,将至少第二核酸序列引入到细胞中。在一些实施方案中,通过使细胞与包含第一核酸序列和第二核酸序列两者的单一病毒载体接触来引入第一核酸序列和第二核酸序列两者。或者,可以使细胞与包含第一核酸序列的第一病毒载体和包含第二核酸序列的第二病毒载体接触。
在所述方法的这样的一个实施方案中,其中第二核酸序列通过病毒载体引入,第二核酸还可以包含位于5’同源臂的5’上游或可替选地位于3’同源臂的3’下游的第二启动子序列。在第二启动子位于3’同源臂的3’下游的实施方案中,启动子可反向。
在所述方法的另一个具体实施方案中,通过使细胞与包含第二核酸序列的重组腺相关病毒(AAV)载体接触,将至少第二核酸序列引入到细胞中。在一些实施方案中,通过使细胞与包含第一核酸序列和第二核酸序列两者的单一重组AAV接触来引入第一核酸序列和第二核酸序列两者。或者,可以使细胞与包含第一核酸序列的第一重组AAV和包含第二核酸序列的第二重组AAV接触。
在所述方法的这样的实施方案中,其中第二核酸序列通过重组AAV载体引入,第二核酸还可以包含位于5’同源臂的5’上游或可替选地位于3’同源臂的3’下游的第二启动子序列。在第二启动子位于3’同源臂的3’下游的实施方案中,启动子可反向。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组AAV载体是自身互补的AAV载体。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组AAV载体可以具有任何血清型。在所述方法的一个具体实施方案中,重组AAV载体具有AAV2的血清型。在所述方法的另一个具体实施方案中,重组AAV载体具有AAV6的血清型。
在所述方法的另一个实施方案中,使用单链DNA模板将至少第二核酸序列引入到细胞中。
在所述方法的一个具体实施方案中,通过mRNA将编码本文中所述的经改造核酸酶的第一核酸序列引入到细胞中,并且使用病毒载体(优选重组AAV载体)将包含外源多核苷酸的第二核酸序列引入到细胞中,其中所述细胞是人T细胞,并且其中目的序列编码嵌合抗原受体。在这样的实施方案中,当与对照细胞相比时,所述方法产生包含嵌合抗原受体和降低的内源性T细胞受体的细胞表面表达的经遗传修饰的T细胞。
在所述方法的另一个实施方案中,经改造核酸酶是重组大范围核酸酶、重组锌指核酸酶(ZFN)、重组转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶或megaTAL核酸酶。在所述方法的一个具体实施方案中,经改造核酸酶是重组大范围核酸酶。
在所述方法的这样的实施方案中,重组大范围核酸酶识别并切割人T细胞受体α恒定区(SEQ ID NO:1)的第93至208位残基内的识别序列。这样的重组大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基,其中所述第一亚基与识别序列的第一识别半位点结合并且包含第一高变(HVR1)区,并且其中所述第二亚基与识别序列的第二识别半位点结合并包含第二高变(HVR2)区。
在所述方法的一个这样的实施方案中,识别序列包含SEQ ID NO:3(即,TRC 1-2识别序列)。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含与SEQ IDNO:8至18中的任一个的第198至344位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第7至153位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列,并且第二大范围核酸酶亚基包含与SEQ ID NO:8至18中的任一个的第7至153位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第198至344位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于如下的位置处包含Y:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第215位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第24位。在另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于如下的位置处包含G:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第233位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第42位。在另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于如下的位置处包含Y和G中的一者或更多者:(a)分别为SEQ IDNO:8至18中的任一个的第215和233位;或(b)分别为SEQ ID NO:19至27中的任一个的第24和42位。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含T:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第26位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第217位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含F或Y:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第28位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第219位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含F:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第38位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第229位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含S:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第44位;或(b)SEQ IDNO:19至27中的任一个的第235位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含F或Y:(a)SEQ ID NO:8至18中的任一个的第46位;或(b)SEQ ID NO:19至27中的任一个的第237位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含T、F或Y、F、S和F或Y和R中的一者或更多者:(a)分别为SEQ ID NO:8至18中的任一个的第26、28、38、44和46位;或(b)分别为SEQ ID NO:19至27中的任一个的第217、219、229、235和237位。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区包含SEQ ID NO:8至18中的任一个的第215至270位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第24至79位残基。在另一个这样的实施方案中,HVR2区包含SEQ ID NO:8至18中的任一个的第24至79位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第215至270位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含SEQ ID NO:8至18中的任一个的第198至344位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第7至153位残基。在另一个这样的实施方案中,第二大范围核酸酶亚基包含SEQ ID NO:8至18中的任一个的第7至153位残基或SEQ ID NO:19至27中的任一个的第198至344位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶,其中所述接头共价连接第一亚基和第二亚基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶包含SEQ ID NO:8至27中的任一个的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中,识别序列包含SEQ ID NO:4(即TRC 3-4识别序列)。
在所述方法的一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含与SEQ ID NO:28或29的第7至153位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列,并且第二大范围核酸酶亚基包含与SEQ ID NO:28或29的第198至344位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于SEQ ID NO:28或29的第24位的位置处包含Y。在另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于SEQ ID NO:30或31的第26位的位置处包含T。在另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于SEQ ID NO:28或29的第46位的位置处包含Y。在另一个这样的实施方案中,HVR1区在分别对应于SEQ ID NO:28或29的第24、26和46位的位置处包含Y、T和Y中的一者或更多者。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于SEQ ID NO:28或29的第215位的位置处包含H。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于SEQ ID NO:28或29的第266位的位置处包含T。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于SEQ ID NO:28或29的第268位的位置处包含C。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于SEQ ID NO:28或29的第215、266和268位的位置处包含H、T和C中的一者或更多者。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区包含SEQ ID NO:28或29的第24至79位残基。在另一个这样的实施方案中,HVR2区包含SEQ ID NO:28或29的第215至270位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含SEQ ID NO:28或29的第7至153位残基。在另一个这样的实施方案中,第二大范围核酸酶亚基包含SEQID NO:28或29的第198至344位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶,其中所述接头共价连接第一亚基和第二亚基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列。
在所述方法的另一个实施方案中,识别序列包含SEQ ID NO:5(即,TRC 7-8识别序列)。
在所述方法的一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含与SEQ ID NO:30的第7至153位残基或者SEQ ID NO:31或32的第198至344位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列,并且第二大范围核酸酶亚基包含与SEQ ID NO:30的第198至344位残基或者SEQ ID NO:31或32的第7至153位残基具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区在对应于如下的位置处包含Y:(a)SEQ ID NO:30的第24位;或(b)SEQ ID NO:31或32的第215位。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含Y或W:(a)SEQ ID NO:30的第215位;或(b)SEQ ID NO:31或32的第24位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含M、L或W:(a)SEQ ID NO:30的第231位;或(b)SEQID NO:31或32的第40位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含Y:(a)SEQ ID NO:30的第237位;或(b)SEQ ID NO:31或32的第46位。在另一个这样的实施方案中,HVR2区在对应于如下的位置处包含Y或W、M、L或W和Y中的一者或更多者:(a)分别为SEQ ID NO:30的第215、231和237位;或者(b)分别为SEQ ID NO:31或32的第24、40和46位。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,HVR1区域包含SEQ ID NO:30的第24至79位残基或者SEQ ID NO:31或32的第215至270位残基。在另一个这样的实施方案中,HVR2区域包含SEQ ID NO:30的第215至270位残基或SEQ ID NO:31或32的第24至79位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,第一大范围核酸酶亚基包含SEQ ID NO:30的第7至153位残基或者SEQ ID NO:31或32的第198至344位残基。在另一个这样的实施方案中,第二大范围核酸酶亚基包含SEQ ID NO:30的第198至344位残基或SEQ ID NO:31或32的第7至153位残基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶,其中所述接头共价连接第一亚基和第二亚基。
在所述方法的另一个这样的实施方案中,重组大范围核酸酶包含SEQ ID NO:30至32中的任一个的氨基酸序列。
在另一方面,本发明提供了用于治疗有此需要的对象中的癌症的免疫治疗方法。在一些实施方案中,所述方法包括向所述对象施用包含如本文中所述的经遗传修饰的细胞和可药用载体的药物组合物。在一些实施方案中,所述方法包括向所述对象施用包含根据本文中所述的方法产生的经遗传修饰的细胞和可药用载体的药物组合物。
在所述方法的另一个实施方案中,待治疗的癌症选自B细胞来源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。
在所述方法的另一个实施方案中,B细胞来源的癌症选自B系急性成淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中,CAR包含细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中,细胞外配体结合结构域或一部分可以是来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的形式,其针对特定表位或抗原(例如优先存在于细胞例如癌细胞或其他致病细胞或颗粒表面上的表位或抗原)提供特异性。scFv可以通过接头序列连接。细胞外配体结合结构域可以针对任何目的抗原或表位特异。在一些实施方案中,scFv可以是人源化的。嵌合抗原受体的细胞外结构域还可以包含自身抗原(参见Payne等(2016),Science 353(6295):179-184),其可以被B淋巴细胞上的自身抗原特异性B细胞受体识别,从而指导T细胞特异性靶向并杀死抗体介导的自身免疫病中的自身反应性B淋巴细胞。这样的CAR可以被称为嵌合自身抗体受体(chimericautoantibody receptor,CAAR),并且其用途涵盖在本发明中。
通过参考以下的详细描述和权利要求,可以更全面地理解本发明的前述和其他方面和实施方案。为清楚起见,在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。实施方案的所有组合都明确包括在本发明中并且在本文中公开,就如同各个和每个组合被单独且明确地公开一样。相反地,为简洁起见,在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多个特征也可单独或以任何合适的子组合提供。实施方案中列出的特征的所有子组合也明确包括在本发明中并且在本文中公开,就如同各个和每个这样的子组合在本文中被单独且明确地公开一样。本文中公开的本发明的每个方面的实施方案加以必要的变通适用于本发明的每个其他方面。
附图说明
图1.人TRC α恒定区基因中的TRC识别序列。A)本发明的重组大范围核酸酶靶向的每个识别序列包含两个识别半位点。每个识别半位点包含通过4个碱基对中心序列分开的9个碱基对。TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)跨越人T细胞α恒定区(SEQ ID NO:1)的第187至208位核苷酸,并且包含称为TRC1和TRC2的两个识别半位点。TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)跨越人T细胞α恒定区(SEQ ID NO:1)的第93至114位核苷酸,并且包含称为TRC3和TRC4的两个识别半位点。TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5)跨越人T细胞α恒定区(SEQ ID NO:1)的第118至139位核苷酸,并且包含称为TRC7和TRC8的两个识别半位点。B)本发明的重组大范围核酸酶包含两个亚基,其中包含HVR1区的第一亚基与第一识别半位点(例如,TRC1、TRC3或TRC7)结合,并且包含HVR2区的第二亚基与第二识别半位点(例如,TRC2、TRC4或TRC8)结合。在重组大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施方案中,包含HVR1区的第一亚基可以定位为N末端或C末端亚基。同样地,包含HVR2区的第二亚基可以定位为N末端或C末端亚基。
图2A-B.TRCl结合亚基的氨基酸比对。A-B)本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:3的9个碱基对TRC1识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:8至27中所示的重组大范围核酸酶的TRC1结合亚基(SEQ ID NO:33至52)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:8至18的TRC1结合亚基包含第198至344位残基,而SEQ ID NO:19至27的TRC1结合亚基包含第7至153位残基。如所显示的,每个TRC1结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区中的可变残基用阴影表示,其中每个位置处的最常见的氨基酸被进一步突出显示;最普遍的残基用粗体表示,而第二普遍的残基用粗体及斜体表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了第80位或第271位处的Q或E残基(参见美国专利第8,021,867号)以外。图2中提供的所有TRC1结合亚基与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶(SEQ ID NO:33)的TRC1结合亚基(第198至344位残基)共有至少90%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQID NO:8至27的残基编号。
图3A-B.TRC2结合亚基的氨基酸比对。A-B)本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:3的9个碱基对TRC2识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:8至27中所示的重组大范围核酸酶的TRC2结合亚基(SEQ ID NO:58至77)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:8至18的TRC2结合亚基包含第7至153位残基,而SEQ ID NO:19至27的TRC2结合亚基包含第198至344位残基。如所显示的,每个TRC2结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区内的可变残基用阴影表示,其中每个位置处的最常见的氨基酸被进一步突出显示;最普遍的残基用粗体表示,而第二普遍的残基用粗体及斜体表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了大范围核酸酶TRC 1-2x.87 EE、TRC 1-2x.87 QE、TRC 1-2x.87 EQ、TRC 1-2x.87和TRC 1-2x.163(以灰色加阴影和加下划线)的第80位或第271位处的O或E残基(参见美国专利第8,021,867号)和第139位处的R残基以外。图3中提供的所有TRC2结合亚基与TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶(SEQ ID NO:58)的TRC2结合亚基(第7至153位残基)共有至少90%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQ ID NO:8至27的残基编号。
图4.TRC3结合亚基的氨基酸比对。本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:4的9个碱基对TRC3识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:28和29中所示的重组大范围核酸酶的TRC3结合亚基(SEQ ID NO:53和54)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:28和29的TRC3结合亚基包含第7至153位残基。如所显示的,每个TRC3结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区内的可变残基用阴影表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了第80位处的Q或E残基(参见美国专利第8,021,867号)以外。TRC 3-4x.3和TRC 3-4x.19大范围核酸酶的TRC3结合亚基共有97%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQ ID NO:28和29的残基编号。
图5.TRC4结合亚基的氨基酸比对。本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:4的9个碱基对TRC4识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:28和29中所示的重组大范围核酸酶的TRC4结合亚基(SEQ ID NO:78和79)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:28和29的TRC4结合亚基包含第198至344位残基。如所显示的,每个TRC4结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区内的可变残基用阴影表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了第80位处的Q或E残基(参见美国专利第8,021,867号)以外。TRC 3-4x.3和TRC 3-4x.19大范围核酸酶的TRC4结合亚基共有97%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQ ID NO:28和29的残基编号。
图6A-B.TRC7结合亚基的氨基酸比对。A-B)本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:5的9个碱基对TRC7识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:30至32中所示的重组大范围核酸酶的TRC7结合亚基(SEQ ID NO:55至57)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:30的TRC7结合亚基包含第7至153位残基,而SEQ ID NO:31和32的TRC7结合亚基包含第198至344位残基。如所显示的,每个TRC7结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区内的可变残基用阴影表示,其中每个位置处的最常见的氨基酸被进一步突出显示;最普遍的残基用粗体表示,而第二普遍的残基用粗体及斜体表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了第80位或第271位处的Q或E残基(参见美国专利第8,021,867号)以外。图6中提供的所有TRC7结合亚基与TRC 7-8x.7大范围核酸酶(SEQ ID NO:55)的TRC7结合亚基(第7至153位残基)共有至少90%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQ ID NO:30至32的残基编号。
图7A-B.TRC8结合亚基的氨基酸比对。A-B)本发明涵盖的一些重组大范围核酸酶包含一个结合SEQ ID NO:5的9个碱基对TRC8识别半位点的亚基。提供了SEQ ID NO:30至32中所示的重组大范围核酸酶的TRC8结合亚基(SEQ ID NO:80至82)的氨基酸序列比对。如所示出的,SEQ ID NO:30的TRC8结合亚基包含第198至344位残基,而SEQ ID NO:31和32的TRC8结合亚基包含第7至153位残基。如所显示的,每个TRC8结合亚基包含56个氨基酸的高变区。高变区内的可变残基用阴影表示,其中每个位置处的最常见的氨基酸被进一步突出显示;最普遍的残基用粗体表示,而第二普遍的残基用粗体及斜体表示。高变区外的残基在每个亚基中是相同的,除了第80位或第271位处的Q或E残基(参见美国专利第8,021,867号)以外。图7中提供的所有TRC8结合亚基与TRC 7-8x.7大范围核酸酶(SEQ ID NO:80)的TRC8结合亚基(第198至344位残基)共有至少90%的序列同一性。所显示的残基编号是SEQ IDNO:30至32的残基编号。
图8.用于评估靶向存在于T细胞受体α恒定区(SEQ ID NO:1)中的识别序列的重组大范围核酸酶的CHO细胞中报道子测定的示意图。对于本文中所述的重组大范围核酸酶,产生了其中报道子盒被稳定整合到细胞基因组中的CHO细胞系。报告子盒以5’至3’顺序包含:SV40早期启动子;GFP基因的5’2/3;本发明的经改造的大范围核酸酶的识别序列(例如,TRC1-2识别序列、TRC 3-4识别序列或TRC 7-8识别序列);CHO-23/24大范围核酸酶的识别序列(WO/2012/167192);和GFP基因的3’2/3。用该盒稳定转染的细胞在不存在DNA断裂诱导剂的情况下不表达GFP。通过转导编码每种大范围核酸酶的质粒DNA或mRNA来引入大范围核酸酶。当在任一大范围核酸酶识别序列上诱导DNA断裂时,GFP基因的重复区域彼此重组以产生功能GFP基因。然后可以通过流式细胞术确定表达GFP的细胞的百分比作为大范围核酸酶对基因组切割频率的间接度量。
图9.重组大范围核酸酶在CHO细胞报道子测定中识别和切割人T细胞受体α恒定区(SEQ ID NO:1)中的识别序列的效率。SEQ ID NO:8至32中所示的每种重组大范围核酸酶被改造以靶向TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)、TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)或TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5),并在CHO细胞报道子测定中针对效力进行筛选。所显示的结果提供了在每个测定中观察到的表达GFP的细胞的百分比,这表明每种大范围核酸酶用于切割TRC靶识别序列或CHO-23/24识别序列的效力。每个测定中还包括阴性对照(RHO1-2bs)。A)-C)靶向TRC 1-2识别序列的大范围核酸酶。D)靶向TRC 3-4识别序列的大范围核酸酶。E)-F)靶向TRC 7-8识别序列的大范围核酸酶。G)TRC 1-2x.87大范围核酸酶的变体,其中第271位处的Q被E替换(TRC 1-2x.87QE),第80位处的Q被E替换(TRC 1-2x.87 EQ),或者第80位处的Q和第271位处的Q均被E(TRC 1-2x.87 EE)替换。
图10.CHO细胞报道子测定中重组大范围核酸酶效力的时程。在CHO报道子测定中评估TRC 1-2x.87 QE、TRC 1-2x.87 EQ和TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶,其中在将编码大范围核酸酶的mRNA引入到CHO报道细胞后1、4、6、8和12天测定表达GFP的细胞的百分比。
图11.在用TRC 1-2大范围核酸酶转染后Jurkat细胞基因组DNA的分析。在用编码TRC 1-2大范围核酸酶的mRNA转染后72小时,收获基因组DNA并进行T7内切核酸酶测定以估计内源性TRC 1-2识别序列上的遗传修饰。
图12.Jurkat细胞中的TRC 1-2大范围核酸酶表达对内源性TRC 1-2识别序列上的遗传修饰的剂量反应。Jurkat细胞用3μg或1μg给定的TRC 1-2大范围核酸酶mRNA转染。在96小时,使用T7内切核酸酶测定分析基因组DNA。
图13.人T细胞中TRC 1-2识别序列的切割。A)用抗CD3和抗CD28抗体刺激CD3+ T细胞3天,然后用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔。在转染后3天和7天收获基因组DNA,并使用T7内切核酸酶测定进行分析。B)为了确定内源性TRC 1-2识别序列上的突变是否足以消除T细胞受体的表面表达,使用抗CD3抗体通过流式细胞术分析细胞。在转染后第3天和第7天分析对照细胞(用水转染)和TRC 1-2x.87EE转染的细胞,并确定CD3阳性和CD3阴性T细胞的百分比。
图14.在表达TRC 1-2大范围核酸酶后在人T细胞中的TRC 1-2识别序列上观察到的代表性缺失的核酸序列。
图15.示出了重组AAV载体的序列元件及其与经改造核酸酶组合用于将外源核酸序列插入到内源性TCR α恒定区基因中的图。
图16.用于产生AAV405载体的质粒的图。
图17.用于产生AAV406载体的质粒的图。
图18.确定大范围核酸酶mRNA转染和重组AAV转导以提高AAV转导效率的时序。将人CD3+ T细胞用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔,并且在转染后2、4或8小时,用编码GFP的重组AAV载体(GFP-AAV)转导细胞。通过流式细胞术分析T细胞在转导后72小时的GFP表达以确定转导效率。
图19.使用重组AAV载体分析人T细胞的外源核酸序列插入。用TRC 1-2x.87 EEmRNA转染CD3+ T细胞,随后用AAV405或AAV406转导(转染后2小时)。仅转导的对照被模拟转染(用水)并用AAV405或AAV406转导。仅大范围核酸酶的对照用TRC 1-2x.87 EE转染,然后在转染后2小时模拟转导(用水)。从T细胞收获基因组DNA,并使用识别AAV载体中超出同源区域的序列的引物通过PCR扩增TRC 1-2基因座。同源区域以外的PCR引物仅允许扩增T细胞基因组,而不是从AAV载体扩增。将PCR产物纯化并用EagI消化。然后分析PCR产物的切割。
图20.使用AAV405表征EagI插入到人T细胞的TRC 1-2识别序列中。A)将由先前实验产生的未消化的PCR产物克隆到pCR平端载体中。使用M13正向和反向引物进行菌落PCR,并且通过凝胶电泳分析来自用TRC 1-2x.87 EE和AAV405转染的细胞的PCR产物的一部分。分析显示了全长PCR产物(约1600bp)、较小的插入物和空质粒(约300bp)的混合物。B)平行地,用EagI消化PCR产物的另一部分以确定包含插入TRC 1-2识别序列中的EagI识别位点的克隆的百分比。用Eag1切割的PCR产物产生约700bp和800bp的预期片段。
图21.使用AAV406表征Eag1插入到人T细胞的TRC 1-2识别序列中。A)将由先前实验产生的未消化的PCR产物克隆到pCR平端载体中。使用M13正向和反向引物进行菌落PCR,并且通过凝胶电泳分析来自用TRC1-2x.87 EE和AAV406转染的细胞的PCR产物的一部分。分析显示了全长PCR产物(约1600bp)、较小的插入物和空质粒(约300bp)的混合物。B)平行地,用EagI消化PCR产物的另一部分以确定包含插入TRC1-2识别序列中的EagI识别位点的克隆的百分比。用Eag1切割的PCR产物产生约700bp和800bp的预期片段。
图22.A)在TRC 1-2大范围核酸酶表达后在人T细胞中的TRC 1-2识别序列上观察到的代表性缺失和插入(即插入缺失(indel))的核酸序列。B)TRC 1-2识别序列的核酸序列证实插入了包含EagI限制位点的外源核酸序列。
图23.重组AAV转导效率的提高。通过优化大范围核酸酶mRNA转染和随后的AAV转导的时序来进一步分析转导效率。将人CD3+ T细胞用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔,随后在转染后或转染后2小时立即用GFP-AAV转导。此外,用GFP-AAV转导未受刺激的静息T细胞。还分析模拟转导的细胞。在转导后72小时,通过流式细胞术分析细胞的GFP表达以确定AAV转导效率。
图24.用于产生AAV-CAR100(AAV408)载体的质粒的图。
图25.用于产生AAV-CAR763(AAV412)载体的质粒的图。
图26.在人T细胞中的TRC 1-2识别位点处插入嵌合抗原受体编码序列。开发基于PCR的测定以确定AAV412 HDR模板是否用于修复TRC 1-2识别序列处的双链断裂。
图27.在人T细胞中的TRC 1-2识别位点处插入嵌合抗原受体编码序列。开发基于PCR的测定以确定是否利用AAV408HDR模板修复TRC 1-2识别序列处的双链断裂。A)使用仅在如果CAR基因已被插入到TRC 1-2识别序列基因座中,才在所述基因座的5’端上扩增产物的引物对所产生的PCR产物。B)使用仅在如果CAR基因已被插入到TRC 1-2识别序列基因座中,才在所述基因座的3’端上扩增产物的引物对所产生的PCR产物。
图28.数字PCR。A)开发以定量确定嵌合抗原受体编码序列在人T细胞中的TRC 1-2识别位点中的插入效率的数字PCR测定的示意图。B)对来自用TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶mRNA和/或增加量的AAV408电穿孔的人T细胞的基因组DNA进行数字PCR的结果。
图29.人T细胞上CD19嵌合抗原受体的细胞表面表达。使用AAV408作为HDR模板,在将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中的细胞中测定抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。通过流式细胞术分析细胞表面表达。A)模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及模拟电穿孔并用增加量的AAV408转导的细胞。B)用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用增加量的AAV408转导的细胞。
图30.用于产生AAV421载体的质粒的图。
图31.用于产生AAV422载体的质粒的图。
图32.嵌合抗原受体编码序列的插入。使用PCR方法来确定在TRC 1-2识别位点处插入的通过AAV421或AAV422引入的嵌合抗原受体编码序列是否被TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶切割。A)用AAV421转导后的插入分析。B)用AAV422转导后的插入分析。
图33.人T细胞上CD19嵌合抗原受体的细胞表面表达。使用AAV421作为HDR模板,在将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中的细胞中确定抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。通过流式细胞术分析细胞表面表达。A)模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及模拟电穿孔并用增加量的AAV421转导的细胞。B)用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用增加量的AAV421转导的细胞。
图34.表达细胞表面嵌合抗原受体的人T细胞的扩增。在用TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔并用AAV421转导后确定优先扩增和富集CD3-/CAR+T细胞群的方法。A)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)。B)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL),并与丝裂霉素C灭活的IM-9细胞一起温育。C)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL),并与丝裂霉素C灭活的IM-9细胞一起进行两次温育。
图35.人T细胞上CD19嵌合抗原受体的细胞表面表达。使用AAV422作为HDR模板,在将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中的细胞中确定抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。通过流式细胞术分析细胞表面表达。A)模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及模拟电穿孔并用增加量的AAV422转导的细胞。B)用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用增加量的AAV422转导的细胞。
图36.表达细胞表面嵌合抗原受体的人T细胞的扩增。在用TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔并用AAV422转导后确定优先扩增和富集CD3-/CAR+T细胞群的方法。A)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)。B)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL),并与丝裂霉素C灭活的IM-9细胞一起温育。C)补充IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL),并与丝裂霉素C灭活的IM-9细胞一起进行两次温育。
图37.使用单链AAV的大范围核酸酶敲除效率。当同时用单链AAV载体转导时,进行实验来检查人T细胞中两种大范围核酸酶的敲除效率。A)用TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔并用增加量的单链AAV412转导的细胞。B)用靶向β-2微球蛋白基因的大范围核酸酶的mRNA电穿孔并用增加量的单链AAV412转导的细胞。C)用TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔并用增加量的单链AAV422转导的细胞。
图38.抗CD19CAR T细胞的功能活性。A)IFN-γELISPOT测定,其中CD19+Raji细胞或CD19-U937细胞是靶标群;B)细胞杀伤测定,其中萤光素酶标记的CD19+Raji细胞是靶标。
图39.在用线性化DNA供体模板转导后嵌合抗原受体的表达。这些实验产生包含TRC 1-2识别序列基因座同源的同源臂侧翼的抗CD19 CAR基因的质粒。在一些质粒中使用不同的启动子,并且同源臂是“短的”(在5’同源臂上200bp和在3’同源臂上180bp)或者“长的”(在5’同源臂上985bp和在3’同源臂上763bp)。将CAR供体质粒在载体骨架中的限制位点处线性化并凝胶纯化。A)背景CD3-/CAR+染色。B)仅用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。C)用TRC 1-2x.87EE mRNA和具有EF1α核心启动子(具有HTLV增强子)的长的同源臂载体共同电穿孔的细胞。D)用TRC1-2x.87EE mRNA和具有EF1α核心启动子(不含增强子)的短的同源臂载体共同电穿孔的细胞。E)在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用具有EF1α核心启动子(具有HTLV增强子)的长的同源臂载体电穿孔的细胞。F)在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用具有EF1α核心启动子(不含增强子)的短的同源臂载体电穿孔的细胞。G)用长的同源臂构建体以及TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞,所述构建体包含驱动CAR表达的MND启动子和CAR基因5’端中的内含子。H)用长的同源臂构建体以及TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞,所述构建体包含驱动CAR表达的MND启动子但不含内含子。I)用具有MND启动子但不含内含子的短的同源臂质粒以及TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。J)在没有TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用长的同源臂构建体电穿孔的细胞,所述构建体包含驱动CAR表达的MND启动子和CAR基因5’端中的内含子。K)在没有TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用长的同源臂构建体电穿孔的细胞,所述构建体包含驱动CAR表达的MND启动子但不含内含子。L)在没有TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用具有MND启动子但不含内含子的短的同源臂质粒电穿孔的细胞。M)用包含JeT启动子的短的同源臂构建体以及TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。N)用包含CMV启动子的长的同源臂构建体以及TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。O)在没有TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用包含JeT启动子的短的同源臂构建体电穿孔的细胞。P)在没有TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用包含CMV启动子的长的同源臂构建体电穿孔的细胞。
图40.确定由线性化DNA构建体递送的嵌合抗原受体编码区是否插入到人T细胞中的TRC 1-2识别序列中的PCR分析。
图41.用于产生AAV423载体的质粒的图。
图42.人T细胞上CD19嵌合抗原受体的细胞表面表达。使用AAV423作为HDR模板,在将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中的细胞中确定抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。通过流式细胞术分析细胞表面表达。A)模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及模拟电穿孔并用增加量的AAV423转导的细胞。B)用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞,以及用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用增加量的AAV423转导的细胞。
图43.嵌合抗原受体编码序列的插入。使用PCR方法来确定在TRC 1-2识别位点处插入的通过AAV423引入的嵌合抗原受体编码序列是否被TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶切割。
图44.抗CD19 CAR T细胞的表型分析。A)将活化的T细胞用TRC 1-2x.87 EE mRNA电穿孔,然后用包含由JeT启动子驱动且在同源臂侧翼的抗CD19 CAR表达盒的AAV6载体转导。在用IL-2(10ng/mL)培养5天后,通过流式细胞术分析细胞的细胞表面CD3和抗CD19 CAR表达。B)通过使用抗CD3磁珠耗尽CD3+细胞来富集CD3-细胞。然后将耗尽的细胞在IL-15(10ng/mL)和IL-21(10ng/mL)中培养3天并重新分析CD3和抗CD19 CAR的细胞表面表达。C)通过流式细胞术分析纯化的CD3-CD19-CAR T细胞群以确定为CD4+和CD8+的细胞的百分比。D)通过流式细胞术进一步分析纯化的CD3-CD19-CAR T细胞群,以通过CD62L和CD45RO的染色来确定它们是中央记忆T细胞、过渡记忆T细胞还是效应记忆T细胞。
图45.Raji弥散性淋巴瘤模型。在第1天,以每只小鼠2.0×105个细胞的剂量,向5至6周龄雌性NSG小鼠中静脉内(i.v.)注射稳定表达萤火虫萤光素酶(ffLuc)44的Raji细胞。在第4天,向小鼠静脉内注射PBS或含有由同一健康供体PBMC制备的基因编辑的对照TCR KOT细胞的PBS,或含有指定剂量的由同一供体制备的CAR T细胞的PBS。在指定日,向活的小鼠腹膜内(i.p.)注射萤光素底物(在盐水中150mg/kg),使其麻醉,并且7分钟后使用IVIS(Perkin Elmer,Waltham,MA)测量萤光素酶活性。使用Living Image软件4.5.1(Perkin Elmer,Waltham,MA)分析和输出数据。发光信号强度由以p/sec/cm2/sr为单位的辐射率表示。
序列简述
SEQ ID NO:1列出人T细胞受体α恒定区基因的核苷酸序列(NCBI基因IDNO.28755)。
SEQ ID NO:2列出人T细胞受体α恒定区编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3列出TRC 1-2识别序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4列出TRC 3-4识别序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5列出TRC 7-8识别序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6列出I-CreI的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7列出LAGLIDADG基序的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8列出TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9列出TRC 1-2x.87 QE大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10列出TRC 1-2x.87 EQ大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11列出TRC 1-2x.87大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12列出TRC 1-2x.6大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13列出TRC 1-2x.20大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14列出TRC 1-2x.55大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15列出TRC 1-2x.60大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16列出TRC 1-2x.105大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17列出TRC 1-2x.163大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18列出TRC 1-2x.113_3大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19列出TRC 1-2x.5大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20列出TRC 1-2x.8大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21列出TRC 1-2x.25大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22列出TRC 1-2x.72大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23列出TRC 1-2x.80大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24列出TRC 1-2x.84大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25列出TRC 1-2x.120大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26列出TRC 1-2x.113_1大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27列出TRC 1-2x.113_2大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28列出TRC 3-4x.3大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29列出TRC 3-4x.19大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30列出TRC 7-8x.7大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31列出TRC 7-8x.9大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32列出TRC 7-8x.14大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33列出TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:34列出TRC 1-2x.87 QE大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:35列出TRC 1-2x.87 EQ大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:36列出TRC 1-2x.87大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:37列出TRC 1-2x.6大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:38列出TRC 1-2x.20大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:39列出TRC 1-2x.55大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:40列出TRC 1-2x.60大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:41列出TRC 1-2x.105大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:42列出TRC 1-2x.163大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:43列出TRC 1-2x.113_3大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:44列出TRC 1-2x.5大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:45列出TRC 1-2x.8大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:46列出TRC 1-2x.25大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:47列出TRC 1-2x.72大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:48列出TRC 1-2x.80大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:49列出TRC 1-2x.84大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:50列出TRC 1-2x.120大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:51列出TRC 1-2x.113_1大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:52列出TRC 1-2x.113_2大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:53列出TRC 3-4x.3大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:54列出TRC 3-4x.19大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:55列出TRC 7-8x.7大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:56列出TRC 7-8x.9大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:57列出TRC 7-8x.14大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:58列出TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:59列出TRC 1-2x.87 QE大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:60列出TRC 1-2x.87 EQ大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:61列出TRC 1-2x.87大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:62列出TRC 1-2x.6大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:63列出TRC 1-2x.20大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:64列出TRC 1-2x.55大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:65列出TRC 1-2x.60大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:66列出TRC 1-2x.105大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:67列出TRC 1-2x.163大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:68列出TRC 1-2x.113_3大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:69列出TRC 1-2x.5大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:70列出TRC 1-2x.8大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:71列出TRC 1-2x.25大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:72列出TRC 1-2x.72大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:73列出TRC 1-2x.80大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:74列出TRC 1-2x.84大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:75列出TRC 1-2x.120大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:76列出TRC 1-2x.113_1大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:77列出TRC 1-2x.113_2大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:78列出TRC 3-4x.3大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:79列出TRC 3-4x.19大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:80列出TRC 7-8x.7大范围核酸酶的残基198至344。
SEQ ID NO:81列出TRC 7-8x.9大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:82列出TRC 7-8x.14大范围核酸酶的残基7至153。
SEQ ID NO:83列出TRC 1-2识别序列的反义链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:84列出TRC 3-4识别序列的反义链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:85列出TRC 7-8识别序列的反义链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:86列出SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:87列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:88列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:89列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:90列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:91列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:92列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:93列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:94列出包含由切割和NHEJ造成的插入的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:95列出包含由切割和NHEJ造成的插入的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:96列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:97列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:98列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:99列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:100列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:101列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:102列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:103列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:104列出包含由切割和NHEJ造成的缺失的SEQ ID NO:1的核苷酸162至233。
SEQ ID NO:105列出SEQ ID NO:1的核苷酸181至214。
SEQ ID NO:106列出包含通过同源重组插入的外源核酸序列的SEQ ID NO:1的核苷酸181至214。
SEQ ID NO:107列出用于形成AAV405载体的质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO:108列出用于形成AAV406载体的质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO:109列出用于形成AAV-CAR100(AAV408)载体的质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO:110列出用于形成AAV-CAR763(AAV412)载体的质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO:111列出抗CD19嵌合抗原受体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:112列出抗CD19细胞外配体结合结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:113列出嵌合抗原受体细胞内细胞质信号转导结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:114列出嵌合抗原受体细胞内共刺激结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:115列出嵌合抗原受体信号肽结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116列出嵌合抗原受体铰链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:117列出嵌合抗原受体跨膜结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118列出EF-1α核心启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:119列出外源多核苷酸插入的核苷酸序列。
SEQ ID NO:120列出包含插入到TRC 1-2识别序列内的外源核酸序列的人TCR α恒定区基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:121列出包含插入到TRC 3-4识别序列内的外源核酸序列的人TCR α恒定区基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:122列出包含插入到TRC 7-8识别序列内的外源核酸序列的人TCR α恒定区基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:123列出用于形成AAV421载体的质粒的核酸序列。
SEQ ID NO:124列出用于形成AAV422载体的质粒的核酸序列。
SEQ ID NO:125列出用于形成AAV423载体的质粒的核酸序列。
发明详述
1.1引用和定义
本文引用的专利和科学文献建立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的授权美国专利、授权申请、公开的外国申请和包括GenBank数据库序列的参考文献通过引用并入本文,引用程度如同每一个被具体和单独地指出以通过引用并入。
本发明可以以不同的形式实施,并且不应该被解释为限于本文列出的实施方案。相反,提供这些实施方案以使本公开内容详细和完整,并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。例如,关于一个实施方案示出的特征可以被并入其他实施方案中,并且关于特定实施方案示出的特征可以从该实施方案中删除。此外,根据本公开内容,对本文提出的实施方案的许多变化和添加对于本领域技术人员将是明显的,其不脱离本发明。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明的说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而不旨在限制本发明。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
如本文所使用的,无数量词修饰的名词可以表示一个/种或多个/种。例如,细胞可以表示单个/种细胞或多个/种细胞。
如本文所使用的,除非另外特别指出,否则词语“或”以“和/或”的包含性含义使用,而不是“任一/或”的排他性含义。
如本文所使用的,术语“大范围核酸酶”是指在多于12个碱基对的识别序列上结合双链DNA的内切核酸酶。优选地,用于本发明的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是来源于I-CreI的内切核酸酶,并且可以指相对于天然I-CreI已经针对例如DNA结合特异性、DNA切割活性、DNA结合亲和力或二聚化特性被修饰的I-CreI的经改造的变体。用于产生这种I-CreI修饰变体的方法是本领域已知的(例如WO 2007/047859)。如本文所使用的大范围核酸酶结合至作为异二聚体的或作为“单链大范围核酸酶”的双链DNA,其中使用肽接头将一对DNA结合结构域连接成单个多肽。术语“归巢内切核酸酶”与术语“大范围核酸酶”同义。当在细胞中特别是在人T细胞中表达时,本发明的大范围核酸酶基本上是无毒的,使得细胞可以被转染并保持在37℃,而在使用本文所述的方法测量时没有观察到对细胞生存力的有害影响或显著降低大范围核酸酶的切割活性。
如本文所使用的,术语“单链大范围核酸酶”是指包含通过接头连接的一对核酸酶亚基的多肽。单链大范围核酸酶具有以下组构:N末端亚基-接头-C末端亚基。两个大范围核酸酶亚基在氨基酸序列方面通常是不相同的,并且将识别不相同的DNA序列。因此,单链大范围核酸酶通常会切割伪回文或非回文的识别序列。尽管实际上不是二聚体,但是单链大范围核酸酶可被称为“单链异二聚体”或“单链异二聚体大范围核酸酶”。为了清楚起见,除非另有说明,否则术语“大范围核酸酶”可以指二聚或单链的大范围核酸酶。
如本文所使用的,术语“接头”是指用于将两个大范围核酸酶亚基连接成单个多肽的外源肽序列。接头可具有在天然蛋白质中发现的序列,或者可以是在任何天然蛋白质中未发现的人工序列。接头可以是柔性的并且缺乏二级结构或者可能具有在生理条件下形成特定三维结构的倾向。接头可以无限制地包括涵盖在美国专利第8,445,251号种的那些。在一些实施方案中,接头可具有包含SEQ ID NO:8至32中任一者的残基154至195的氨基酸序列。
如本文所使用的,术语“TALEN”是指包含以下的内切核酸酶:与FokI核酸酶结构域的任何部分融合的包含16至22个TAL结构域重复的DNA结合结构域。
如本文所使用的,术语“Compact TALEN”是指包含以下的内切核酸酶:在任何方向融合至I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域的任何催化活性部分的具有16至22个TAL结构域重复的DNA结合结构域。
如本文所使用的,术语“CRISPR”是指包含胱天蛋白酶如Cas9的基于胱天蛋白酶的内切核酸酶,以及通过与基因组DNA中的识别位点杂交来指导胱天蛋白酶的DNA切割的指导RNA。
如本文所使用的,术语“megaTAL”是指包含与经改造的序列特异性归巢内切核酸酶的转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域的单链核酸酶。
如本文所使用的,关于蛋白质,术语“重组”意指由于将基因工程技术应用于编码蛋白质的核酸以及表达蛋白质的细胞或生物体而具有改变的氨基酸序列。关于核酸,术语“重组”是指由于应用基因工程技术而具有改变的核酸序列。基因工程技术包括但不限于PCR和DNA克隆技术;转染、转化和其他基因转移技术;同源重组;定点诱变;和基因融合。根据该定义,具有与天然存在的蛋白质相同的氨基酸序列但通过在异源宿主中克隆和表达产生的蛋白质并不被认为是重组的。
如本文所使用的,术语“野生型”是指相同类型基因的等位基因群中最常见的天然存在的等位基因(即多核苷酸序列),其中由野生型等位基因编码的多肽具有其原始功能。术语“野生型”还指由野生型等位基因编码的多肽。野生型等位基因(即多核苷酸)和多肽可与相对于野生型序列包含一个或更多个突变和/或替换的突变体或变体等位基因和多肽区分开来。鉴于野生型等位基因或多肽可以赋予生物体正常表型,因此在一些情况下,突变体或变体等位基因或多肽可赋予改变的表型。野生型核酸酶与重组或非天然存在的核酸酶是可区分的。
如本文关于重组蛋白所使用的,术语“修饰”是指相对于参考序列(例如野生型或天然序列)重组序列中的氨基酸残基的任何插入、缺失或替换。
如本文所使用的,术语“识别序列”是指被内切核酸酶结合并切割的DNA序列。在大范围核酸酶的情况下,识别序列包含一对被4个碱基对分开的反向的9个碱基对的“半位点”。在单链大范围核酸酶的情况下,蛋白质的N末端结构域接触第一个半位点,并且蛋白质的C末端结构域接触第二个半位点。大范围核酸酶的切割产生4个碱基对的3’“单链突出端”。“单链突出端”或“黏端”是可以通过内切核酸酶切割双链DNA序列产生的短的单链DNA区段。在源于I-CreI的大范围核酸酶和单链大范围核酸酶的情况下,单链突出端包含22个碱基对识别序列的碱基10至13。在Compact TALEN的情况下,识别序列包含被I-TevI结构域识别的第一CNNNGN序列,其后是长度为4至16个碱基对的非特异性间隔区,其后是被TAL效应物结构域(该序列通常具有5’T碱基)识别的长度为16至22bp的第二序列。Compact TALEN的切割产生两个碱基对的3’单链突出端。在CRISPR的情况下,识别序列是指导RNA结合以指导Cas9切割的通常为16至24个碱基对的序列。CRISPR的切割产生了平末端。
如本文所使用的,术语“靶位点”或“靶序列”是指包含核酸酶识别序列的细胞的染色体DNA区域。
如本文所使用的,术语“DNA结合亲和力”或“结合亲和力”是指大范围核酸酶与参考DNA分子(例如,识别序列或任意序列)非共价缔合的倾向。结合亲和力由解离常数Kd度量。如本文所使用的,如果核酸酶对参照识别序列的Kd相对于参照核酸酶增加或减少统计学上显著的百分比变化,则核酸酶具有“改变”的结合亲和力。
如本文所使用的,术语“同源重组”或“HR”是指其中使用同源DNA序列作为修复模板修复双链DNA断裂的天然细胞过程(参见,例如Cahill等(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。同源DNA序列可以是内源染色体序列或递送至细胞的外源核酸。
如本文所使用的,术语“非同源末端连接”或“NHEJ”是指其中通过直接连接两个非同源DNA区段来修复双链DNA断裂的天然细胞过程(参见,例如Cahill等(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。通过非同源末端连接进行的DNA修复容易出错并且经常导致在修复位点处DNA序列的非模板(untemplated)添加或缺失。在一些情况下,靶识别序列处的切割导致靶识别位点的NHEJ。核酸酶诱导的基因编码序列中靶位点的切割然后通过NHEJ进行DNA修复可将突变引入编码序列中,例如破坏基因功能的移码突变。因此,经改造的核酸酶可以用于有效敲除细胞群体中的基因。
如本文所使用的,“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将抗原特异性赋予或转移至免疫效应物细胞(例如人类T细胞)的经改造的受体。嵌合抗原受体通常包含细胞外配体结合结构域或部分以及包含一个或更多个转导T细胞活化所需的信号的刺激结构域的细胞内结构域。在一些实施方案中,细胞外配体结合结构域或部分可以是源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的形式,其提供对特定表位或抗原(例如优先存在于癌细胞或其他致病细胞或颗粒的表面上的表位或抗原)的特异性。细胞外配体结合结构域可以对任何目标抗原或表位具有特异性。在一个具体的实施方案中,配体结合结构域对CD19是特异性的。
嵌合抗原受体的细胞外结构域也可包含自身抗原(参见Payne等(2016),Science353(6295):179-184),其可被B淋巴细胞上的自身抗原特异性B细胞受体识别,从而指导T细胞特异性靶向并杀死抗体介导的自身免疫性疾病中的自体反应性B淋巴细胞。这样的CAR可以被称为嵌合自身抗体受体(CAAR),并且其用途涵盖在本发明中。
scFv可以通过接头序列连接。细胞内刺激结构域可以包括一个或更多个细胞质信号转导结构域,其在抗原结合后将激活信号向免疫效应物细胞的传递。这样的细胞质信号转导结构域可以无限制地包含CD3-ζ。细胞内刺激结构域还可以包含在配体结合后传递增殖性和/或细胞存活信号的一个或更多个细胞内共刺激结构域。这样的细胞内共刺激结构域可无限制地包含CD28结构域、4-1BB结构域、OX40结构域或其组合。嵌合抗原受体还可以包含另外的结构元件,包括通过铰链或间隔序列连接到细胞外配体结合结构域的跨膜结构域。
如本文所使用的,“外源T细胞受体”或“外源TCR”是指其序列被引入可以或可以不内源表达TCR的免疫效应物细胞(例如人T细胞)的基因组中的TCR。外源TCR在免疫效应物细胞上的表达可赋予对特定表位或抗原(例如,优先存在于癌细胞或其他致病细胞或颗粒表面上的表位或抗原)的特异性。这种外源T细胞受体可以包含α链和β链,或者可包含γ链和δ链。可用于本发明的外源性TCR可对任何目标抗原或表位具有特异性。
如本文所使用的,术语“降低的表达”是指当与对照细胞相比时,基因修饰的细胞的细胞表面处的内源T细胞受体的表达的任何降低。术语降低还可以指当与对照细胞群相比时细胞群中细胞表面表达内源多肽(即,内源T细胞受体)的细胞的百分比降低。这种降低可以高达5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%,或高达100%。因此,术语“降低的”涵盖内源性T细胞受体的部分敲减和完全敲减两者。
如本文关于氨基酸序列和核酸序列两者所使用的,术语“百分比同一性”、“序列同一性”、“百分比相似性”、“序列相似性”等是指基于使比对的氨基酸残基或核苷酸之间的相似性最大化的序列比对的两个序列的相似性程度的度量,并且其为相同或相似残基或核苷酸的数目、总残基或核苷酸的数目、以及序列比对中缺口的存在和长度的函数。多种算法和计算机程序可用于使用标准参数确定序列相似性。如本文所使用的,序列相似性是使用用于氨基酸序列的BLASTp程序和用于核酸序列的BLASTn程序测量的,两者均可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得,并且在例如在以下中描述:Altschul等(1990),J.Mol.Biol.215:403-410;Gish和States(1993),Nature Genet.3:266-272;Madden等(1996),Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul等(1997),Nucleic AcidsRes.25:3389-3402);Zhang等(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14。如本文所使用的,两个氨基酸序列的百分比相似性是基于BLASTp算法的以下参数的得分:字长=3;缺口空位罚分=-11;缺口延伸罚分=-1;和评分矩阵=BLOSUM62。如本文所用的,两个核酸序列的百分比相似性是基于BLASTn算法的以下参数的得分:字长=11;缺口空位罚分=-5;缺口延伸罚分=-2;匹配奖励=1;和错配罚分=-3。
如本文关于两个蛋白质或氨基酸序列的修饰所使用的,术语“对应于”用于表示第一蛋白质中的指定修饰是与第二蛋白质的修饰中相同氨基酸残基的替换,并且当两种蛋白质进行标准序列比对(例如使用BLASTp程序)时,第一蛋白质中的修饰氨基酸位置与第二蛋白质中的修饰氨基酸位置对应或对齐。因此,如果在序列比对中残基X和Y彼此对应,则尽管X和Y可能是不同的数字,但第一蛋白质中残基“X”修饰成氨基酸“A”将对应于在第二蛋白质中残基“Y”修饰成氨基酸“A”。
如本文所使用的,术语“识别半位点”,“识别序列半位点”或简化的“半位点”是指被同二聚或异二聚大范围核酸酶或被单链大范围核酸酶的一个亚基识别的双链DNA分子中的核酸序列。
如本文所使用的,术语“高变区”是指包含具有相对高可变性的氨基酸的大范围核酸酶单体或亚基内的局部序列。高变区可以包含约50至60个连续残基,约53至57个连续残基,或优选约56个残基。在一些实施方案中,高变区的残基可对应于SEQ ID NO:8至32中任一者的位置24至79或位置215至270。高变区可以包含与识别序列中的DNA碱基接触的一个或更多个残基,并且可被修饰以改变单体或亚基的碱基偏好。当大范围核酸酶与双链DNA识别序列缔合时,高变区还可以包含一个或更多个与DNA骨架结合的残基。可以修饰这样的残基以改变大范围核酸酶对DNA骨架和目标识别序列的结合亲和力。在本发明的不同实施方案中,高变区可包含1至20个表现出可变性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和力的残基。在具体实施方案中,高变区包含约15至18个表现出可变性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和力的残基。在一些实施方案中,高变区内的可变残基对应于以下位置中的一个或更多个:SEQ ID NO:8至32中任一者的位置24、26、28、29、30、32、33、38、40、42、44、46、66、68、70、72、73、75和77。在另一些实施方案中,高变区内的可变残基对应于以下位置中的一个或更多个:SEQ ID NO:8至32中任一者的位置215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、248、257、259、261、263、264、266和268。
如本文所使用的,术语“T细胞受体α恒定区基因”和“TCRα恒定区基因”可互换地使用,是指由NCBI Gen ID NO.28755(SEQ ID NO:1)鉴定的人基因。
术语“重组DNA构建体”、“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换地使用,并且是单链或双链多核苷酸。重组构建体包含单链或双链多核苷酸的人工组合,无限制地包括没有在自然界中发现的调控序列和编码序列。例如,重组DNA构建体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列,或源自相同来源并以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。这样的构建体可以单独使用或者可以与载体一起使用。
如本文所使用的,“载体”或“重组DNA载体”可以是包含能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的复制系统和序列的构建体。如果使用载体,则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法,这是本领域技术人员公知的。载体可以无限制地包括质粒载体和重组AAV载体,或本领域已知的适合将编码本发明的大范围核酸酶的基因递送至靶细胞的任何其他载体。本领域技术人员熟知载体上必须存在以便成功转化、选择和繁殖包含本发明的任何分离的核苷酸或核酸序列的宿主细胞的遗传元件。
如本文所使用的,“载体”也可以指病毒载体。病毒载体可以无限制地包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector,AAV)。
如本文所使用的,“多顺反子”mRNA是指包含两个或更多个编码序列(即顺反子)并编码多于一种蛋白质的单一信使RNA。多顺反子mRNA可以包含本领域已知的允许来自相同mRNA分子的两个或更多个基因翻译的任何元件,包括但不限于IRES元件、T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。
如本文所使用的,“人T细胞”或“T细胞”是指从人供体分离的T细胞。人T细胞和由其衍生的细胞包括未在培养中传代的分离的T细胞、已经在细胞培养条件下传代并维持而没有永生化的T细胞、以及已被永生化且可在细胞培养条件下无限维持的T细胞。
如本文所使用的,“对照”或“对照细胞”是指为测量遗传修饰细胞的基因型或表型变化提供参考点的细胞。对照细胞可包括,例如:(a)野生型细胞,即与导致遗传修饰细胞的基因改变的起始材料相同的基因型;(b)与遗传修饰细胞具有相同基因型但已用无效构建体(即,具有对目标性状没有已知影响的构建体)转化的细胞;或(c)基因上与遗传修饰细胞相同但未暴露于会诱导表达改变的基因型或表型的条件或刺激或进一步基因修饰的细胞。
如本文所使用的,对变量的数值范围的叙述旨在传达可以用等于该范围内的任何值的变量来实践本发明。因此,对于固有离散的变量,变量可以等于该数值范围内的任何整数值,包括范围的终点。类似地,对于固有连续的变量,变量可以等于数值范围内的任何实数值,包括范围的终点。作为示例而非限制,如果变量是固有离散的,则被描述为具有在0和2之间的值的变量可以取值0、1或2;而如果变量固有连续,则可以取值0.0、0.1、0.01、0.001或≥0且≤2的任何其他实数值。
2.1本发明的原理
本发明部分基于以下发现:经改造核酸酶可以用于识别和切割存在于人TCR α恒定区基因(SEQ ID NO:1)内的识别序列,使得切割位点处的NHEJ破坏TCR α链亚基的表达并且最终破坏T细胞受体在细胞表面上的表达。此外,根据本发明,在核酸酶切割位点处,例如通过同源重组将外源多核苷酸序列插入到TCR α恒定区基因中,使得在细胞中同时表达目的序列。这样的外源序列可以编码例如嵌合抗原受体、外源TCR受体或任何其他目的多肽。
因此,本发明允许通过用单个经改造核酸酶靶向单个识别位点来敲除内源性T细胞受体和表达外源核酸序列(例如,嵌合抗原受体或外源性TCR)两者。在将编码嵌合抗原受体的序列插入到TCR α恒定区基因中的特定实施方案中,本发明提供了用于产生表达抗原特异性CAR且具有降低的表达或完全敲除内源性TCR的同种异体T细胞的简化方法。当施用于同种异体对象时,这样的细胞可以表现出降低的移植物抗宿主病(GVHD)或不诱导移植物抗宿主病。
2.2用于识别和切割T细胞受体α恒定区基因内的识别序列的核酸酶
本领域已知,可以使用位点特异性核酸酶以在活细胞的基因组中产生DNA断裂,并且这样的DNA断裂可以通过诱变NHEJ修复或通过与转基因DNA序列同源重组而导致基因组的永久修饰。NHEJ可以在切割位点处产生诱变,导致等位基因失活。NHEJ相关的诱变可通过产生早期终止密码子、产生异常非功能性蛋白质的移码突变而使等位基因失活,或者可引发诸如无义介导的mRNA衰变的机制。使用核酸酶通过NHEJ诱导诱变可以用于靶向存在于野生型等位基因中的特定突变或序列。已知使用核酸酶诱导靶基因座中的双链断裂刺激同源重组,特别是与基因组靶标同源的序列侧翼的转基因DNA序列的同源重组。以这种方式,可以将外源核酸序列插入到靶基因座中。这样的外源核酸可编码例如嵌合抗原受体、外源TCR或任何目的序列或多肽。
在不同的实施方案中,多种不同类型的核酸酶可用于实施本发明。在一个实施方案中,可以使用重组大范围核酸酶来实施本发明。在另一个实施方案中,可以使用CRISPR核酸酶或CRISPR切口酶来实施本发明。用于制备识别预定DNA位点的CRISPR和CRISPR切口酶的方法在本领域中是已知的,例如Ran等(2013)Nat Protoc.8:2281-308。在另一个实施方案中,可以使用TALEN或Compact TALEN来实施本发明。用于制备与预定DNA位点结合的TALE结构域的方法是本领域已知的,例如Reyon等(2012)Nat Biotechnol.30:460-5。在另一个实施方案中,可以使用megaTAL来实施本发明。
在优选的实施方案中,用于实施本发明的核酸酶是单链大范围核酸酶。单链大范围核酸酶包含通过接头肽连接的N末端亚基和C末端亚基。两个结构域中的每一个识别识别序列的一半(即识别半位点)并且DNA切割位点位于两个亚基界面附近的识别序列的中间。DNA链断裂被四个碱基对抵消,使得通过大范围核酸酶的DNA切割产生一对四个碱基对的3’单链突出端。
在一些实例中,本发明的重组大范围核酸酶已被改造以识别和切割TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)。这样的重组大范围核酸酶在本文中统称为“TRC 1-2大范围核酸酶”。示例性TRC 1-2大范围核酸酶在SEQ ID NO:8至27中提供。
在另外的实例中,本发明的重组大范围核酸酶已被改造以识别和切割TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)。这样的重组大范围核酸酶在本文中统称为“TRC 3-4大范围核酸酶”。示例性TRC 3-4大范围核酸酶在SEQ ID NO:28和29中提供。
在另外的实例中,本发明的重组大范围核酸酶已被改造以识别和切割TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5)。这样的重组大范围核酸酶在本文中统称为“TRC 7-8大范围核酸酶”。示例性TRC 7-8大范围核酸酶在SEQ ID NO:30至32中提供。
本发明的重组大范围核酸酶包含含有第一高变(HVR1)区的第一亚基和含有第二高变(HVR2)区的第二亚基。此外,第一亚基与识别序列中的第一识别半位点(例如,TRC1、TRC3或TRC7半位点)结合,而第二亚基与识别序列中的第二识别半位点(例如,TRC2、TRC4或TRC8半位点)结合。在其中重组大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施方案中,第一和第二亚基可以被定向为使得包含HVR1区并结合第一半位点的第一亚基被定位为N末端亚基,并且包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为C末端亚基。在替代实施方案中,第一和第二亚基可以被定向为使得包含HVR1区并结合第一半位点的第一亚基被定位为C末端亚基,并且包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为N末端亚基。表1中提供了本发明的示例性TRC 1-2大范围核酸酶。表2中提供了本发明的示例性TRC 3-4大范围核酸酶。表3中提供了本发明的示例性TRC 7-8大范围核酸酶。
表1.经改造以识别和切割TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)的示例性重组大范围核酸酶
*“TRC1亚基%”和“TRC2亚基%”分别表示每种大范围核酸酶的TRC1结合和TRC2结合亚基区域与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的TRC1结合和TRC2结合亚基区域之间的氨基酸序列同一性。
表2.经改造以识别和切割TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)的示例性重组大范围核酸酶
*“TRC3亚基%”和“TRC4亚基%”分别表示每种大范围核酸酶的TRC3结合和TRC4结合亚基区域与TRC 3-4x.3大范围核酸酶的TRC3结合和TRC4结合亚基区域之间的氨基酸序列同一性。
表3.经改造以识别和切割TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5)的示例性重组大范围核酸酶
*“TRC7亚基%”和“TRC8亚基%”分别表示每种大范围核酸酶的TRC7结合和TRC8结合亚基区域与TRC 7-8x.7大范围核酸酶的TRC7结合和TRC8结合亚基区域之间的氨基酸序列同一性。
2.3用于产生经遗传修饰的细胞的方法
本发明提供了使用经改造核酸酶来产生经遗传修饰的细胞的方法,所述经改造核酸酶识别和切割存在于人TCR α恒定区基因(SEQ ID NO:1)内的识别序列。在这样的识别序列处的切割可以允许切割位点处的NHEJ并破坏人T细胞受体α链亚基的表达,导致T细胞受体在细胞表面处表达和/或功能降低。此外,在这样的识别序列处的切割可以进一步允许将外源核酸序列直接同源重组到TCR α恒定区基因中。
本发明的经改造核酸酶可以以蛋白质的形式或者优选作为编码经改造核酸酶的核酸递送到细胞中。这样的核酸可以是DNA(例如,环状或线性化的质粒DNA或PCR产物)或RNA。对于其中经改造核酸酶编码序列以DNA形式递送的实施方案,其应当与启动子可操作地连接以促进大范围核酸酶基因的转录。适用于本发明的哺乳动物启动子包括组成型启动子例如巨细胞病毒早期(CMV)启动子(Thomsen等(1984),Proc Natl Acad Sci USA.81(3):659-63)或SV40早期启动子(Benoist和Chambon(1981),Nature.290(5804):304-10)以及诱导型启动子例如四环素诱导型启动子(Dingermann等(1992),Mol Cell Biol.12(9):4038-45)。
在一些实施方案中,将编码经改造核酸酶的mRNA递送至细胞,因为这降低了编码经改造核酸酶的基因将整合到细胞基因组中的可能性。这样的编码经改造核酸酶的mRNA可以使用本领域已知的方法例如体外转录产生。在一些实施方案中,使用7-甲基-鸟苷将mRNA加帽。在一些实施方案中,mRNA可为聚腺苷酸化的。
在具体的实施方案中,编码本发明的经改造核酸酶的mRNA可以是编码在细胞中同时表达的两种或更多种核酸酶的多顺反子mRNA。多顺反子mRNA可以编码靶向相同靶基因中的不同识别序列的本发明的两种或更多种核酸酶。或者,多顺反子mRNA可以编码本文中所述的至少一种核酸酶和至少一种另外的核酸酶,所述另外的核酸酶靶向位于相同基因中的单独的识别序列,或者靶向位于第二基因中的第二识别序列,使得在两种基因中产生切割位点。多顺反子mRNA可以包含本领域已知的允许来自相同mRNA分子的两种或更多种基因(即,顺反子)翻译的任何元件,所述元件包括但不限于IRES元件、T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。
可以将纯化的核酸酶蛋白递送到细胞中以切割基因组DNA,这允许通过本领域已知的多种不同机制在切割位点处与目的序列同源重组或非同源末端连接。
在一些实施方案中,经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA与细胞穿透肽或靶向配体偶联以促进细胞摄取。本领域已知的细胞穿透肽的实例包括聚精氨酸(Jearawiriyapaisarn等(2008)Mol Ther.16:1624-9)、来自HIV病毒的TAT肽(Hudecz等(2005),Med.Res.Rev.25:679-736)、MPG(Simeoni等(2003)Nucleic Acids Res.31:2717-2724)、Pep-1(Deshayes等(2004)Biochemistry 43:7698-7706)和HSV-1VP-22(Deshayes等(2005)Cell Mol Life Sci.62:1839-49)。在一个替代实施方案中,经改造核酸酶或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA与识别在靶细胞上表达的特定细胞表面受体的抗体共价或非共价偶联,使得核酸酶蛋白/DNA/mRNA与靶细胞结合并被靶细胞内化。或者,经改造核酸酶蛋白/DNA/mRNA可以与天然配体(或天然配体的一部分)共价或非共价偶联以获得这样的细胞表面受体。(McCall等(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449;Dinda等(2013)Curr PharmBiotechnol.14:1264-74;Kang等(2014)Curr Pharm Biotechnol.15(3):220-30;Qian等(2014)Expert Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-508)。
在一些实施方案中,经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA与纳米颗粒共价或优选非共价偶联,或者使用本领域已知的方法(Sharma等(2014)BiomedResInt.2014)包封在这样的纳米颗粒内。纳米颗粒是纳米级递送系统,其长度尺度<1μm,优选<100nm。这样的纳米颗粒可使用由金属、脂质、聚合物或生物大分子构成的芯来设计,并且可以将重组大范围核酸酶蛋白、mRNA或DNA的多个拷贝与纳米颗粒芯连接或包封。这增加了递送至每个细胞的蛋白质/mRNA/DNA的拷贝数,并因此增加了每个经改造核酸酶的细胞内表达,以使靶识别序列将被切割的可能性最大化。这样的纳米颗粒的表面可用聚合物或脂质(例如,壳聚糖、阳离子聚合物或阳离子脂质)进一步修饰以形成芯-壳纳米颗粒,其表面赋予额外的功能性以增强细胞递送并摄取有效载荷(Jian等(2012)Biomaterials.33(30):7621-30)。纳米颗粒可另外有利地与靶向分子偶联以将纳米颗粒引导至合适的细胞类型和/或增加细胞摄取的可能性。这样的靶向分子的实例包括对细胞表面受体和细胞表面受体的天然配体(或天然配体的一部分)具有特异性的抗体。
在一些实施方案中,将经改造核酸酶或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA包封在脂质体内或使用阳离子脂质复合(参见例如LipofectamineTM,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA;Zuris等(2015)Nat Biotechnol.33:73-80;Mishra等(2011)J DrugDeliv.2011:863734)。脂质体和脂质体-DNA复合体制剂(1ipoplex)可以保护有效载荷免受降解,并且通过与细胞的细胞膜融合和/或破坏细胞的细胞膜而促进细胞摄取和递送效率。
在一些实施方案中,经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA被包封在聚合物支架(例如PLGA)内或者使用阳离子聚合物(例如,PEI、PLL)复合(Tamboli等(2011)Ther Deliv.2(4):523-536)。
在一些实施方案中,经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA与自组装成胶束的两亲性分子组合(Tong等(2007)J Gene Med.9(11):956-66)。聚合物胶束可包括由亲水性聚合物(例如聚乙二醇)形成的胶束壳,其可以防止聚集,掩蔽电荷相互作用并减少细胞外的非特异性相互作用。
在一些实施方案中,将经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA配制成乳液或纳米乳液(即,具有<1nm的平均粒径)用于递送至细胞。术语“乳液”是指但不限于任何水包油、油包水、水包油包水或油包水包油分散体或液滴,包括当与水不混溶相与水相混合时,可以由于疏水力形成的脂质结构,所述疏水力驱使非极性残基(例如,长烃链)远离水和极性头部基团朝向水。这些其他脂质结构包括但不限于单层、少层和多层脂质囊泡、胶束和层状相。乳液由水相和亲脂相(通常含有油和有机溶剂)组成。乳液还经常含有一种或更多种表面活性剂。纳米乳液制剂是公知的,例如,如美国专利申请第2002/0045667和2004/0043041号以及美国专利第6,015,832、6,506,803、6,635,676和6,559,189号中所述的,其中每一个通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中,经改造核酸酶蛋白或编码经改造核酸酶的DNA/mRNA与多官能聚合物缀合物、DNA树状大分子和聚合物树状大分子共价连接或非共价缔合(Mastorakos等(2015)Nanoscale.7(9):3845-56;Cheng等(2008)J Pharm Sci.97(1):123-43)。树状大分子的产生可以控制有效载荷容量和尺寸,并且可以提供高的有效载荷容量。此外,多个表面基团的展示可以用于提高稳定性并减少非特异性相互作用。
在一些实施方案中,使用病毒载体将编码经改造核酸酶的基因引入到细胞中。这样的载体在本领域中是已知的,并且包括慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体(综述于Vannucci等(2013New Microbiol.36:1-22中)。可用于本发明的重组AAV载体可以具有允许将病毒转导入细胞并将核酸酶基因插入到细胞基因组中的任何血清型。在具体的实施方案中,重组AAV载体具有AAV2或AAV6的血清型。重组AAV载体也可以是自身互补的,使得它们在宿主细胞中不需要第二链DNA合成(McCarty等(2001)Gene Ther.8:1248-54)。
如果经改造核酸酶基因以DNA形式(例如质粒)和/或通过病毒载体(例如AAV)递送,则它们必须与启动子可操作地连接。在一些实施方案中,这可以是病毒启动子,例如来自病毒载体(例如慢病毒载体的LTR)的内源性启动子或公知的巨细胞病毒或SV40病毒早期启动子。在一个优选的实施方案中,核酸酶基因与优先在靶细胞(例如人T细胞)中驱动基因表达的启动子可操作地连接。
本发明还提供了将外源核酸引入细胞中,使得在核酸酶切割位点处将外源核酸序列插入到TRC α恒定区基因中。在一些实施方案中,外源核酸包含5’同源臂和3’同源臂以促进在核酸酶切割位点处将核酸序列重组到细胞基因组中。
本发明的外源核酸可通过先前讨论的任何方式引入细胞中。在一个具体的实施方案中,外源核酸通过病毒载体例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或优选重组AAV载体引入。可用于引入外源核酸的重组AAV载体可以具有允许将病毒转导入细胞并将外源核酸序列插入到细胞基因组中的任何血清型。在具体的实施方案中,重组AAV载体具有AAV2或AAV6的血清型。重组AAV载体也可以是自身互补的,使得它们在宿主细胞中不需要第二链DNA合成。
在另一个具体的实施方案中,可以使用单链DNA模板将外源核酸引入细胞中。单链DNA可以包含外源核酸,并且在优选的实施方案中,可以包含5’和3’同源臂以促进通过同源重组将核酸序列插入到核酸酶切割位点中。单链DNA还可以包含5’同源臂5’上游的5’AAV反向末端重复(ITR)序列和3’同源臂3’下游的3’AAV ITR序列。
在另一个具体的实施方案中,可以通过用线性化DNA模板转染将编码本发明的内切核酸酶的基因和/或本发明的外源核酸序列引入到细胞中。在一些实例中,编码内切核酸酶的质粒DNA和/或外源核酸序列可以被一种或更多种限制酶消化,使得环形质粒DNA在转染到细胞中之前被线性化。
当递送至细胞时,本发明的外源核酸可以与适用于在细胞中表达编码的多肽的任何启动子可操作地连接,所述启动子包括先前讨论的那些哺乳动物启动子和诱导型启动子。本发明的外源核酸也可以与合成启动子可操作地连接。合成启动子可以包括但不限于JeT启动子(WO 2002/012514)。
在本发明的经遗传修饰的细胞是人T细胞或来源于其的细胞的实例中,这样的细胞在引入大范围核酸酶和/或外源核酸序列之前可能需要活化。例如,可以使T细胞与可溶的或与载体(即珠)缀合的抗CD3和抗CD28抗体接触足以激活细胞的时间段。
本发明的经遗传修饰的细胞可以被进一步修饰以表达一种或更多种可诱导的自杀基因,其诱导引起细胞死亡并允许在体外或体内选择性破坏细胞。在一些实例中,自杀基因可以编码细胞毒性多肽、具有将无毒前药转化为细胞毒性药物的能力的多肽、和/或激活细胞内的细胞毒性基因途径的多肽。换言之,自杀基因是编码独自或在其他化合物的存在下引起细胞死亡的产物的核酸。这样的自杀基因的代表性实例是编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶的基因。另外的实例是编码水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶的基因和可以将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶的细菌基因胞嘧啶脱氨酶。自杀基因还包括作为非限制性实例的编码胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶的基因。在一些实例中,可以使用特定的二聚化化学诱导物(CID)激活胱天蛋白酶-9。自杀基因还可以编码在细胞表面处表达使得细胞对治疗性和/或细胞毒性单克隆抗体敏感的多肽。在另外的实例中,自杀基因可以编码包含由抗CD20 mAb利妥昔单抗识别的抗原基序和允许选择表达自杀基因的细胞的表位的重组抗原多肽。参见例如WO2013153391中所述的RQR8多肽,其包含两个利妥昔单抗结合表位和QBEnd10结合表位。对于这样的基因,当需要时,可以将利妥昔单抗施用于对象以诱导细胞耗竭。
2.4药物组合物
在一些实施方案中,本发明提供了包含本发明的遗传修饰细胞或本发明的遗传修饰细胞群和药物载体的药物组合物。这样的药物组合物可以按照已知技术制备。参见例如Remington,The Science And Practice of Pharmacy(第21版.2005)。在根据本发明药物制剂中的制备中,通常将细胞与可药用载体混合,并向对象施用所得组合物。当然,在与制剂中的任何其他成分相容的意义上,载体必须是可接受的,并且不得对对象有害。在一些实施方案中,本发明的药物组合物可以进一步包含可用于治疗对象中的疾病的一种或更多种另外的药剂。在另一些实施方案中,其中遗传修饰细胞是遗传修饰的人T细胞(或由其衍生的细胞),本发明的药物组合物可以进一步包含促进体内细胞增殖和植入的生物分子,例如细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)。包含本发明的遗传修饰细胞的药物组合物可以与另外的药剂或生物分子在相同的组合物中施用,或者可以在分开的组合物中共同施用。
本发明的药物组合物可用于治疗可被T细胞过继免疫疗法靶向的任何疾病状态。在一个具体的实施方案中,本发明的药物组合物可用于治疗癌症。这样的癌症可以包括但不限于癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤、白血病、B细胞来源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。在某些实施方案中,B细胞来源的癌症包括但不限于B谱系急性淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
2.5产生重组AAV载体的方法
在一些实施方案中,本发明提供用于本发明方法中的重组AAV载体。重组AAV载体通常在哺乳动物细胞系例如HEK-293中产生。因为从载体除去了cap和rep基因以防止其自我复制以便为待递送的治疗性基因(例如内切核酸酶基因)留出空间,所以有必要在包装细胞系中反式提供这些。此外,有必要提供支持复制所必需的“辅助”(例如腺病毒)组分(CotsD,Bosch A,Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。通常,使用三重转染产生重组AAV载体,其中将细胞系用编码“辅助”组分的第一质粒,包含cap和rep基因的第二质粒和包含病毒ITR的第三质粒转染,所述病毒ITR包含待包装到病毒中的插入DNA序列。然后通过冷冻-解冻循环、超声处理、去污剂或本领域已知的其他方法从细胞中分离包含包装在衣壳中的基因组(ITR和目的插入基因)的病毒颗粒。然后使用氯化铯密度梯度离心或亲和层析纯化颗粒,随后将目的基因递送至细胞、组织或生物体如人患者。
由于重组AAV颗粒通常在细胞中产生(制备),所以在实施本发明时必须采取预防措施以确保位点特异性内切核酸酶不在包装细胞中表达。由于本发明的病毒基因组包含内切核酸酶的识别序列,所以包装细胞系中表达的任何内切核酸酶都将能够在病毒基因组可被包装入病毒颗粒之前切割病毒基因组。这将导致包装效率降低和/或包装片段化基因组。可以使用数种方法来防止包装细胞中的内切核酸酶表达,包括:
1.可以将内切核酸酶置于在包装细胞中不具有活性的组织特异性启动子的控制之下。例如,如果开发病毒载体用于将内切核酸酶基因递送至肌肉组织,则可以使用肌肉特异性启动子。肌肉特异性启动子的实例包括C5-12(Liu等.(2004)Hum Gene Ther.15:783-92)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子(Yuasa等.(2002)Gene Ther.9:1576-88)或平滑肌22(SM22)启动子(Haase等.(2013)BMC Biotechnol.13:49-54)。CNS(神经元)特异性启动子的实例包括NSE、Synapsin和MeCP2启动子(Lentz,gt al.(2012)Neurobiol Dis.48:179-88)。肝特异性启动子的实例包括白蛋白启动子(例如Palb)、人α1-抗胰蛋白酶(例如PalAT)和血红素结合蛋白(例如Phpx)(Kramer,MG等,(2003)Mol.Therapy 7:375-85)。眼特异性启动子的实例包括视蛋白和角膜上皮特异性K12启动子(Martin KRG,Klein RL,和QuigleyHA(2002)Methods(28):267-75)(TongY,等,(2007)J Gene Med,9:956-66)。这些启动子或本领域已知的其他组织特异性启动子在HEK-293细胞中不具有高度活性,并且因此当并入本发明的病毒载体中时预期不会在包装细胞中产生显著水平的内切核酸酶基因表达。类似地,本发明的病毒载体考虑了使用其他细胞系并使用不相容的组织特异性启动子(即,公知的HeLa细胞系(人上皮细胞)并使用肝特异性血红素启动子)。组织特异性启动子的其他实例包括:滑膜肉瘤PDZD4(小脑)、C6(肝脏)、ASB5(肌肉)、PPP1R12B(心脏)、SLC5A12(肾脏)、胆固醇调节APOM(肝脏)、ADPRHL1(心脏)和单基因畸形综合征TP73L(肌肉)。(Jacox E等,(2010)PLoS One v.5(8):e12274)。
2.或者,载体可以包装在来自不大可能表达内切核酸酶的不同物种的细胞中。例如,可以使用哺乳动物启动子例如公知的巨细胞病毒或SV40病毒早期启动子在微生物、昆虫或植物细胞中产生病毒颗粒,所述哺乳动物启动子在非哺乳动物包装细胞中不具有活性。在优选的实施方案中,使用如Gao等所述的杆状病毒系统在昆虫细胞中产生病毒颗粒。(Gao,H.,等.(2007)J.Biotechnol.131(2):138-43)。受哺乳动物启动子控制的内切核酸酶不太可能在这些细胞中表达(Airenne,KJ等.(2013)Mol.Ther.21(4):739-49)。而且,昆虫细胞利用不同于哺乳动物细胞的mRNA剪接基序。因此,可以将哺乳动物内含子例如人生长激素(HGH)内含子或SV40大T抗原内含子引入到内切核酸酶的编码序列中。由于在昆虫细胞中这些内含子不能从前mRNA转录物有效剪接,所以昆虫细胞将不会表达功能性内切核酸酶并将包装全长基因组。相反,递送了所得重组AAV颗粒的哺乳动物细胞将正确剪接前mRNA并将表达功能性内切核酸酶蛋白。陈海峰曾报道使用HGH和SV40大T抗原内含子减弱昆虫包装细胞中毒性蛋白质barnase和白喉毒素片段A的表达,从而产生携带这些毒素基因的重组AAV载体(Chen,H(2012)Mol Ther NucleicAcids.1(11):e57)。
3.内切核酸酶基因可以可操作地连接至诱导型启动子,使得内切核酸酶表达需要小分子诱导剂。诱导型启动子的实例包括Tet-On系统(Clontech;Chen H.,等,(2015)和RheoSwitch系统(Intrexon;Sowa G.,等,(2011)Spine,36(10):E623-8)。这两种系统以及本领域已知的类似系统依赖于配体诱导型转录因子(分别为Tet阻遏物和蜕皮激素受体的变体),其响应于小分子激活剂(分别为多西环素或蜕皮激素)而激活转录。使用这样的配体诱导型转录激活剂实施本发明包括:1)将内切核酸酶基因置于响应相应转录因子的启动子的控制下,所述内切核酸酶基因具有转录因子的结合位点;以及2)在包装的病毒基因组包含编码转录因子的基因。后一步骤是必需的,因为如果不将转录激活剂提供给相同的细胞,内切核酸酶将不会在重组AAV递送后在靶细胞或组织中表达。然后转录激活因子仅在用同源小分子激活剂处理的细胞或组织中诱导内切核酸酶基因表达。这种方法是有利的,因为其可以通过选择何时以及向哪些组织递送小分子诱导剂来以时空方式调节内切核酸酶基因表达。然而,在携带能力显著受限的病毒基因组中包含诱导剂的要求为这种方法带来了缺点。
4.在另一个优选的实施方案中,在表达阻止内切核酸酶表达的转录阻遏物的哺乳动物细胞系中产生重组AAV颗粒。转录阻遏物在本领域中是已知的,包括Tet阻遏物、Lac阻遏物、Cro阻遏物和λ阻遏物。许多核激素受体如蜕皮激素受体在没有其同源激素配体的情况下也可作为转录阻遏物。为了实施本发明,用编码转录阻遏物的载体转染/转导包装细胞,并将病毒基因组(包装载体)中的内切核酸酶基因可操作地连接至经修饰以包含阻遏物结合位点的启动子,使得阻遏物沉默启动子。编码转录阻遏物的基因可以放置在多种位置。其可以编码在单独的载体上;其可以引入到包装载体中ITR序列外部;其可以引入到cap/rep载体或腺病毒辅助载体中;或者,最优选地,其可以稳定地整合到包装细胞的基因组中,从而使其组成型表达。修饰常见哺乳动物启动子以引入转录阻遏物位点的方法在本领域中是已知的。例如,Chang和Roninson修饰强的组成型CMV和RSV启动子以包含Lac阻遏物的操纵子,并且显示在表达阻遏物的细胞中阻遏物了来自经修饰启动子的基因表达大幅减弱(Chang BD,and Roninson IB(1996)Gene 183:137-42)。使用非人转录阻遏物确保内切核酸酶基因的转录仅在表达阻遏物的包装细胞中被抑制,而在用所得重组AAV载体转导的靶细胞或组织中不被抑制。
2.6经改造核酸酶变体
本发明的实施方案包括本文所述的经改造核酸酶,特别是重组大范围核酸酶,及其变体。本发明另一些实施方案涵盖含有编码本文所述的重组大范围核酸酶的核酸序列的分离的多核苷酸,以及此类多核苷酸的变体。
如本文所用,“变体”意指基本上相似的序列。“变体”多肽意指通过在天然蛋白质中一个或更多个内部位点处缺失或添加一个或更多个氨基酸和/或替换天然多肽中一个或更多个位点处的一个或更多个氨基酸而从“天然”多肽衍生的多肽。如本文所用,“天然”多核苷酸或多肽包含衍生变体的亲本序列。实施方案中涵盖的变体多肽是生物活性的。也就是说,他们继续拥有天然蛋白质的期望生物活性;即能够识别和切割在人T细胞受体α恒定区(SEQ ID NO:1)中发现的识别序列,包括例如TRC1-2识别序列(SEQ ID NO:3),TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)和TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5)。例如,这样的变体可来自例如人为操纵。实施方案的天然多肽(例如,SEQ ID NO:8至32)的生物活性变体或本文所述的识别半位点结合亚基(例如,SEQ ID NO:33至82)的生物活性变体与天然多肽或天然亚基的氨基酸序列具有至少约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%的序列同一性,如通过本文别处描述的序列比对程序和参数确定的。实施方案的多肽或亚基的生物活性变体可以与该多肽或亚基相差少至约1至40个氨基酸残基、少至约1至20、少至约1至10、少至约5、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
实施方案的多肽可以以多种方式改变,包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。用于这样的操作的方法在本领域中通常是已知的。例如,可以通过DNA中的突变来制备氨基酸序列变体。用于诱变和多核苷酸改变的方法在本领域中是公知的。例如参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492;Kunkel等.(1987)Methods in Enzymol.154:367-382;U.S.Pat.No.4,873,192;Walker和Gaastra编.(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物学活性的适当氨基酸替换的指导可以在Dayhoff等的模型中找到,Dayhoff等.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),通过引用并入本文。可能最佳的是保守替换,例如将氨基酸用具有相似性质的另一个氨基酸交换。
之前已经鉴定了野生型I-CreI大范围核酸酶的DNA识别结构域的大量氨基酸修饰(例如,US 8,021,867),其单独或组合地导致重组大范围核酸酶在DNA识别序列半位点内的个别碱基处具有改变的特异性,使得所得合理设计的大范围核酸酶具有不同于野生型酶的半位点特异性。表4提供了可以在重组大范围核酸酶单体或亚基中进行的潜在替换,以增强基于存在于识别半位点的每个半位点位置(-1至-9)处碱基的特异性。
表4.
/>
对于多核苷酸,“变体”包含在天然多核苷酸内的一个或更多个位点处一个或更多个核苷酸的缺失和/或添加。本领域技术人员将认识到,将构建实施方案的核酸的变体使得维持开放阅读框。对于多核苷酸,保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码实施方案的多肽之一的氨基酸序列的那些序列。变体多核苷酸包括合成得到的多核苷酸,例如通过使用定点诱变产生但仍然编码实施方案的重组大范围核酸酶的多核苷酸。通常,实施方案中的特定多核苷酸的变体将与特定多核苷酸具有至少约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%或更高的序列同一性,如通过本文别处所述的序列比对程序和参数确定的。也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估实施方案的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体。
本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和替换预期不会引起多肽特征的根本改变。然而,当在这样做之前难以预测替换、缺失或插入的确切效果时,本领域技术人员将会理解,将通过筛选多肽在优先识别和切割在人T细胞受体α恒定区基因(SEQ ID NO:1)内可见的识别序列方面的能力来评估该效果。
实施例
下面的实施例进一步说明了本发明,这些实施例不应被解释为限制性的。本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验就能够确定本文所述的特定物质和程序的许多等同物。这样的等同物旨在涵盖在所附权利要求的范围内。
实施例1识别和切割TRC识别序列的大范围核酸酶的表征
1.识别和切割TRC 1-2识别序列的大范围核酸酶
改造本文统称为“TRC 1-2大范围核酸酶”的重组大范围核酸酶(SEQ ID NO:8至27)以识别和切割存在于人T细胞受体α恒定区的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)。每个TRC1-2重组大范围核酸酶包含衍生自SV40的N末端核酸酶定位信号、第一大范围核酸酶亚基、接头序列和第二大范围核酸酶亚基。每个TRC 1-2大范围核酸酶中的第一亚基与SEQ IDNO:3的TRC1识别半位点结合,而第二亚基与TRC2识别半位点结合(参见图1A)。
如图2和3所示,TRC1结合亚基和TRC2结合亚基各自包含分别称为HVR1和HVR2的56个碱基对的高变区。TRC1结合亚基在HVR1区域外部是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),并且在HVR1区域内高度保守。类似地,TRC2结合亚单位在HVR2区域外部是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),以及大范围核酸酶TRC 1-2x.87 EE、TRC 1-2x.87 QE、TRC 1-2x.87 EQ、TRC 1-2x.87和TRC 1-2x.163的位置139,其包含R残基(灰色阴影和下划线)。与HVR1区域一样,HVR2区域也高度保守。
SEQ ID NO:8至27的TRC1结合区域在图2中示出并分别作为SEQ ID NO:33至52提供。SEQ ID NO:33至52中的每一个与大范围核酸酶TRC 1-2x.87 EE(SEQ ID NO:8)的TRC1结合区域SEQ ID NO:33具有至少90%的序列同一性。SEQ ID NO:8至27的TRC2结合区域在图3中示出并分别作为SEQ ID NO:58至77提供。SEQ ID NO:58至77中的每一个与大范围核酸酶TRC 1-2x.87 EE(SEQ ID NO:8)的TRC2结合区域SEQ ID NO:58具有至少90%的序列同一性。
2.识别和切割TRC 3-4识别序列的大范围核酸酶
改造本文统称为“TRC 3-4大范围核酸酶”的重组大范围核酸酶(SEQ ID NO:28和29)以识别和切割存在于人T细胞受体α恒定区的TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)。每个TRC3-4重组大范围核酸酶包含衍生自SV40的N末端核酸酶定位信号、第一大范围核酸酶亚基、接头序列和第二大范围核酸酶亚基。每个TRC 3-4大范围核酸酶中的第一亚基与SEQ IDNO:4的TRC3识别半位点结合,而第二亚基与TRC4识别半位点结合(参见图1A)。
如图4和5所示,TRC3结合亚基和TRC4结合亚基各自包含分别称为HVR1和HVR2的56个碱基对的高变区。TRC3结合亚基在HVR1区域外部是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),并且在HVR1区域内高度保守。类似地,TRC4结合亚基在HVR2区域外部也是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),并且在HVR2区域内高度保守。
SEQ ID NO:28和29的TRC3结合区域在图4中示出并分别作为SEQ ID NO:53和54提供。SEQ ID NO:53和54具有96.6%的序列同一性。SEQ ID NO:28和29的TRC4结合区域在图5中示出并分别作为SEQ ID NO:78和79提供。SEQ ID NO:78和79也具有96.6%的序列同一性。
3.识别和切割TRC 7-8识别序列的大范围核酸酶
改造本文统称为“TRC 7-8大范围核酸酶”的重组大范围核酸酶(SEQ ID NO:30至32)以识别和切割存在于人T细胞受体α恒定区的TRC 7-8识别序列(SEQ ID NO:5)。每个TRC7-8重组大范围核酸酶包含衍生自SV40的N末端核酸酶定位信号、第一大范围核酸酶亚基、接头序列和第二大范围核酸酶亚基。每个TRC 7-8大范围核酸酶中的第一亚基与SEQ IDNO:5的TRC7识别半位点结合,而第二亚基与TRC8识别半位点结合(参见图1A)。
如图6和图7所示,TRC7结合亚基和TRC8结合亚基各自包含分别称为HVR1和HVR2的56个碱基对的高变区。TRC7结合亚基在HVR1区域外部是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),并且在HVR1区域内高度保守。类似地,TRC8结合亚基在HVR2区域外部也是相同的,除了位置80或位置271(包含Q或E残基),并且在HVR2区域内高度保守。
SEQ ID NO:30至32的TRC7结合区域在图6中示出并分别作为SEQ ID NO:55至57提供。SEQ ID NO:55至57中的每一个与大范围核酸酶TRC 7-8x.7(SEQ ID NO:30)的TRC7结合区域SEQ ID NO:55具有至少90%的序列同一性。SEQ ID NO:30至32的TRC8结合区域在图7中示出并分别作为SEQ ID NO:80至82提供。SEQ ID NO:80至82中的每一个与大范围核酸酶TRC 7-8x.7(SEQ ID NO:30)的TRC8结合区域SEQ ID NO:80具有至少90%的序列同一性。
4.在CHO细胞报道测定中切割人T细胞受体α恒定区识别序列
为了确定TRC 1-2、TRC 3-4和TRC 7-8大范围核酸酶是否可以识别和切割它们各自的识别序列(分别为SEQ ID NO:3、4和5),使用先前描述的CHO细胞报道测定(参见WO/2012/167192和图8)评估每种重组大范围核酸酶。为了进行测定,产生携带整合在细胞基因组中的无功能绿色萤光蛋白(GFP)基因表达盒的CHO细胞报道系。每个细胞系中的GFP基因被一对识别序列中断,使得大范围核酸酶对任一识别序列的细胞内切割将刺激同源重组事件,产生功能性GFP基因。
在为本研究开发的CHO报道细胞系中,插入在GFP基因中的一个识别序列是TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:3)、TRC 3-4识别序列(SEQ ID NO:4)或TRC 7-8识别序列(SEQ IDNO:5)。插入在GFP基因中的第二识别序列是CHO-23/24识别序列,其被称为“CHO-23/24”的对照大范围核酸酶识别和切割。包含TRC 1-2识别序列和CHO-23/24识别序列的CHO报道细胞在本文中称为“TRC 1-2细胞”。包含TRC 3-4识别序列和CHO-23/24识别序列的CHO报道细胞在本文中称为“TRC 3-4细胞”。包含TRC 7-8识别序列和CHO-23/24识别序列的CHO报道细胞在本文中称为“TRC 7-8细胞”。
将CHO报道细胞用编码其相应的重组大范围核酸酶(例如TRC1-2细胞用编码TRC1-2大范围核酸酶的质粒DNA转染)或编码CHO-23/34大范围核酸酶的质粒DNA转染。在每个测定中,使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher)根据制造商的说明书在96孔板中用50ng质粒DNA转染4e5CHO报道细胞。在转染后48小时,通过流式细胞术评估细胞以确定与未转染的阴性对照(TRC1-2bs)相比较GFP阳性细胞的百分比。如图9所示,发现所有TRC 1-2、TRC 3-4和TRC 7-8大范围核酸酶在包含其相应识别序列的细胞系中产生GFP阳性细胞,其频率显著超过阴性对照。
还以时间依赖性方式确定了TRC 1-2x.87 QE、TRC 1-2x.87 EQ和TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的效力。在该研究中,使用BioRad Gene Pulser Xcell根据制造商的说明书用每个细胞1e6拷贝的大范围核酸酶mRNA对TRC1-2细胞(1e6)电穿孔。在转染后1、4、6、8和12天,通过流式细胞术评估细胞以确定GFP阳性细胞的百分比。如图10所示,每种TRC 1-2大范围核酸酶在转染后2天表现出高效率,观察到大于50%的GFP阳性细胞。这种效果持续超过12天,没有观察到细胞毒性的证据。
5.结论
这些研究表明,本发明所涵盖的TRC 1-2大范围核酸酶、TRC 3-4大范围核酸酶和TRC 7-8大范围核酸酶可以有效地靶向和切割细胞中其各自的识别序列。
实施例2切割T细胞中的TRC识别序列和抑制细胞表面T细胞受体表达
1.切割Jurkat细胞中的TRC 1-2识别序列
本研究证明了本发明所涵盖的TRC1-2大范围核酸酶可切割Jurkat细胞(一种永生化人T淋巴细胞系)中的TRC1-2识别序列。使用BioRad Gene Pulser Xcell根据制造商的说明书用每个细胞8e6拷贝的给定TRC 1-2大范围核酸酶mRNA对1e6个Jurkat细胞电穿孔。在转染后72小时,从细胞收集基因组DNA(gDNA)并进行T7内切核酸酶I(T7E)测定以估计内源TRC1-2识别序列的遗传修饰(图11)。在T7E测定中,使用TRC1-2识别序列侧翼的引物通过PCR扩增TRC1-2基因座。如果在TRC1-2基因座内存在插入缺失(随机插入或缺失),则所得PCR产物将由野生型等位基因和突变等位基因的混合物组成。将PCR产物变性并允许缓慢退火。缓慢退火允许形成由野生型和突变等位基因组成的异源双链体,导致错配的碱基和/或突起。T7E1酶在错配位点切割,产生可通过凝胶电泳显现的切割产物。图11清楚地表明十三种不同形式的TRC 1-2大范围核酸酶在T7E1测定中产生阳性结果,表明在内源TRC1-2识别序列上有效产生了插入缺失。
为了进一步检查TRC 1-2大范围核酸酶的切割性质,在Jurkat细胞中进行剂量响应实验。使用BioRad Gene Pulser Xcell根据制造商的说明书用每个细胞3μg或1μg的给定TRC 1-2大范围核酸酶mRNA对1e6个Jurkat细胞电穿孔。在转染后96小时,收获gDNA并如上所述进行T7E1测定。如图12所示,十五种不同的TRC1-2大范围核酸酶(包括三种不同形式的TRC1-2x.87大范围核酸酶),在内源TRC1-2识别位点处显示出切割。TRC 1-2x.87 EE工作得特别好,在T7E1测定中产生强信号,并且在Jurkat细胞中几乎没有毒性。
2.切割人T细胞中的TRC 1-2识别序列
本研究证明了本发明所涵盖的TRC1-2大范围核酸酶可切割从供体获得的人T细胞中的TRC1-2识别序列。用抗CD3和抗CD28抗体刺激CD3+ T细胞3天,然后使用Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)根据制造商的说明书用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔。在转染后3天和7天,收获gDNA并如上所述进行T7E1测定。图13A证明TRC 1-2x.87 EE在人T细胞的内源TRC1-2识别序列中有效地引入了突变,表明大范围核酸酶识别并切割TRC1-2识别序列。切割产物的强度在转染后第3天和第7天之间似乎没有变化,表明几乎没有或没有因TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶导致的毒性。为了确定内源TRC1-2识别序列处的突变是否足以消除T细胞受体的表面表达,使用抗CD3抗体通过流式细胞术对细胞进行分析。图13B显示约50%的经转染T细胞对于CD3染色呈阴性,表明敲除了T细胞受体。CD3阴性群体在转染后第3天和第7天之间没有显著改变,进一步表明几乎没有或没有与TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶相关的毒性或T细胞受体表达的损失。
为了证实CD3表达的损失是由于TRC1-2识别位点的突变造成的,从经转染T细胞中收获gDNA,并通过PCR扩增TRC1-2识别位点基因座。使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher)根据制造商的说明将PCR产物克隆到pCR平末端载体中。挑选单个菌落并对微型制备的质粒进行测序。图14示出了在TRC 1-2识别序列处观察到的多个代表性缺失的序列。观察到的序列代表由内切核酸酶产生的DNA双链断裂的非同源末端连接修复导致的缺失。
除了TRC 1.2x.87 EE之外,其他TRC 1-2大范围核酸酶也能够敲除人T细胞中的T细胞受体,包括TRC 1-2x.55和TRC 1-2x.72,虽然程度低于之前对于TRC 1-2x.87 EE观察到的敲除(表5和表6)。TRC 1-2x.72 Q47E在大范围核酸酶的活性位点(氨基酸47)中携带突变,并作为阴性对照。
表5 %CD3-细胞
大范围核酸酶 | 第3天 | 第6天 |
TRC 1-2x.72 Q47E | 0.38 | 1.1 |
TRC 1-2x.55 | 3.11 | 10.84 |
表6 %CD3-细胞
大范围核酸酶 | 第3天 | 第5天 |
TRC 1-2x.72 Q47E | 0.29 | 0.4 |
TRC 1-2x.72 | 2.09 | 4.19 |
3.结论
这些研究证明本发明所涵盖的TRC 1-2大范围核酸酶可识别和切割Jurkat细胞(一种永生化T淋巴细胞系)和从人供体获得的T细胞中的TRC 1-2识别序列。此外,这些研究证明NHEJ发生在大范围核酸酶切割位点处,如通过插入缺失的出现所证明的。此外,TRC 1-2大范围核酸酶显示出减少从供体获得的人T细胞上的T细胞受体的细胞表面表达。
实施例3用于将外源核酸引入人T细胞的重组AAV载体
1.重组AAV载体
在本研究中,设计了两种重组AAV载体(称为AAV405和AAV406)以通过同源重组将包含EagI限制性位点的外源核酸序列在TRC1-2识别序列处引入到人T细胞的基因组中。使用三重转染方案制备每种重组AAV载体,其中将细胞系用编码支持复制所必需的“辅助”组分(例如腺病毒)的第一质粒、包含cap和rep基因的第二质粒以及包含病毒反向末端重复(ITR)的第三质粒转染,所述病毒反向末端重复(ITR)包含待包装到病毒中的插入DNA序列(例如外源核酸序列)(参见,Cots D,Bosch A,Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。图15说明了使用重组AAV载体将外源核酸序列在核酸酶切割位点处引入细胞基因组的一般方法。
使用图16中所示的质粒(SEQ ID NO:107)制备AAV405。如所示,AAV405质粒通常包含5′ITR的序列、CMV增强子和启动子序列、5′同源臂、包含EagI限制性位点的核酸序列、SV40聚(A)信号序列、3′同源臂和3′ITR。使用图17中所示的质粒(SEQ ID NO:108)制备AAV406。如所示,AAV406质粒包含与AAV405相似的序列,但缺少5′同源臂上游的CMV增强子和启动子序列。目前的AAV研究还包括使用编码GFP的AAV载体(GFP-AAV),将其引入用于AAV转导效率的阳性对照。
2.将外源核酸序列引入TRC 1-2识别序列
为了测试在用TRC 1-2大范围核酸酶产生双链断裂之后,AAV模板是否适合同源定向修复(homology directed repair,HDR),使用人T细胞进行了一系列实验。在第一个实验中,测定了用TRC 1-2 RNA电穿孔以及用重组AAV载体转导的时序。用抗CD3和抗CD28抗体刺激人CD3+ T细胞3天,然后使用Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)根据制造商的说明书用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA(1μg)电穿孔。在转染后2、4或8小时,用GFP-AAV(1e5病毒基因组/细胞)转导细胞。在转导后72小时,通过流式细胞术分析细胞的GFP表达。如图18所示,当在转染后2小时转导细胞时,观察到最高的转导效率(88%GFP阳性细胞)。当转染和转导之间的时间延长时,转导效率显著降低,在4小时时为78%GFP阳性细胞,在8小时时为65%GFP阳性细胞。
已经确定了当转染2小时后转导细胞时发生有效的病毒转导,将AAV405和AAV406载体用作人T细胞中的HDR模板。如上所述刺激CD3+ T细胞并用1μg TRC 1-2x.87 EE mRNA转染。在转染后2小时,用AAV405或AAV406转导细胞(1e5病毒基因组/细胞)。作为仅转导的对照,将细胞模拟转染(用水)并用AAV405或AAV406转导(1e5病毒基因组/细胞)。对于仅大范围核酸酶的对照,将细胞用TRC 1-2x.87 EE转染细胞,然后在转染后2小时模拟转导(用水)。
为了确定AAV载体是否充当了HDR模板,从细胞收获gDNA,并使用识别AAV载体中同源区域以外的序列的引物通过PCR扩增TRC 1-2基因座。在同源区域以外的PCR引物仅允许扩增T细胞基因组,而不是来自AAV载体。纯化PCR产物并用EagI消化。图19示出了从用TRC1-2x.87 EE转染并用AAV载体转导的细胞扩增的PCR产物的切割(见箭头),表明EagI位点插入到了TRC1-2识别序列中。来自所有对照细胞群的PCR产物不能被EagI切割,证明EagI位点的插入需要通过TRC 1-2大范围核酸酶产生DNA双链断裂。
为了进一步确定EagI位点插入到了人T细胞中,检测了来自大量PCR产物的单个产物。使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher)根据制造商的说明书将上述实验产生的未消化的PCR产物克隆到pCR平末端载体中。使用M13正向和反向引物(pCR平末端含有位于插入片段侧翼的M13正向和反向引发位点)进行菌落PCR,并且将来自用TRC 1-2x.87EE和AAV405或AAV406转染的细胞的一部分PCR产物通过凝胶电泳进行分析(分别为图20A和21A)。在两种情况下,存在全长PCR产物(约1600bp)、较小插入片段和一些空质粒(约300bp)的混合物。在该测定中,全长小但比空质粒大的带很多时候是在TRC 1-2识别序列内包含大缺失的序列。平行地,将另一部分PCR产物用EagI消化以确定包含插入到TRC1-2识别序列中的EagI识别位点的克隆的百分比。图20B和21B显示用EagI切割多种PCR产物(例如图20B,第二行,左起6个泳道),产生约700和800bp的预期片段。对于AAV405和AAV406,这些凝胶允许估计EagI插入分别为约25%和6%(针对空载体进行调整)。
为了确认未切割PCR产物和用EagI的消化物的凝胶电泳观察结果,对每种PCR产物的剩余部分进行测序。图22A示出了在TRC1-2识别序列处观察到的多个代表性缺失和插入的序列。这些序列代表由内切核酸酶产生的DNA双链断裂的非同源末端连接修复产生的序列。EagI切割的所有PCR产物都含有插入到TRC1-2识别序列中的EagI位点(图22B)。
3.增强的AAV转导效率
鉴于观察到转染后2小时进行AAV转导比后来进行时更有效,进行实验以优化转染和转导的时序。将人CD3+ T细胞用抗CD3和抗CD28抗体刺激3天,然后使用Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)根据制造商的说明书用TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶(1μg)电穿孔。转染后立即或转染后2小时,用GFP-AAV转导细胞(1e5病毒基因组/细胞)。另外,用GFP-AAV转导未刺激的细胞(1e5病毒基因组/细胞)。在转导后72小时,通过流式细胞术分析细胞的GFP表达。图23显示转染2小时后进行的GFP-AAV转导导致90%的GFP阳性细胞,但转染后立即转导导致98%的GFP阳性细胞。静息T细胞似乎折射AAV转导,具有约0%的GFP阳性细胞。未转导的细胞也显示出约0%的GFP阳性细胞。
4.总结
这些研究表明AAV载体可以与重组大范围核酸酶结合使用,以通过同源重组将外源核酸序列整合到TCRα恒定区的切割位点中。
实施例4用于将编码嵌合抗原受体的外源核酸引入人T细胞的重组AAV载体
1.重组AAV载体
在本研究中,设计了两种重组AAV载体(称为AAV-CAR100和AAV-CAR763),以通过同源重组将编码嵌合抗原受体的外源核酸序列在TRC1-2识别序列处引入到人T细胞的基因组中。使用之前描述的三重转染方案制备每种重组AAV载体。
使用图24中所示的质粒(SEQ ID NO:109)制备AAV-CAR100(在本文中也称为AAV408)。如所示,AAV-CAR100(AAV408)被设计用于产生自身互补的AAV载体,并且通常包含5′ITR序列、5′同源臂、编码抗CD19嵌合抗原受体的核酸序列、SV40聚(A)信号序列、3′同源臂和3′ITR。使用图25中所示的质粒(SEQ ID NO:110)制备AAV-CAR763(在本文中也称为AAV412)。如所示,AAV-CAR763(AAV412)质粒通常包含与AAV-CAR100(AAV408)相同的序列,但被设计用于产生单链AAV载体。由于单链AAV载体可以容纳更大的有效载荷,所以AAV-CAR763(AAV412)中的5′同源臂和3′同源臂比AAV-CAR100(AAV408)中的更长。目前的AAV研究还包括使用编码GFP的AAV载体(GFP-AAV),将其引入用于AAV转导效率的阳性对照。
2.将嵌合抗原受体序列引入TRC 1-2识别序列
进行研究以确定使用重组AAV载体将嵌合抗原受体序列插入到TCRα恒定区基因中同时敲除内源TCR受体的细胞表面表达的效率。
为了证实转导效率,获得人CD3+ T细胞并用抗CD3和抗CD28抗体刺激3天,然后使用Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)根据制造商的说明书用编码TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的mRNA(1μg)电穿孔。如上所述,转染后立即用GFP-AAV转导细胞(1e5病毒基因组/细胞)。在转导后72小时通过流式细胞术分析细胞的GFP表达以确定转导效率。
然后将AAV-CAR100(AAV408)和AAV-CAR763(AAV412)载体在入T细胞中用作HDR模板以插入抗CD19嵌合抗原受体序列。如上所述,刺激并用1μg TRC 1-2x.87 EE mRNA转染人CD3+ T细胞。然后在转染后立即或者转染的0至8小时内用AAV-CAR100(AAV408)或AAV-CAR763(AAV412)转导细胞(1e5病毒基因组/细胞)。作为仅转导的对照,将细胞模拟转染(用水)并用AAV-CAR100(AAV408)或AAV-CAR763(AAV412)转导(1e5病毒基因组/细胞)。对于仅大范围核酸酶的对照,将细胞用编码TRC 1-2x.87 EE的mRNA转染,然后在转染后立即进行模拟转导(用水)。
通过TCRα恒定区基因中的切割位点的测序来确认嵌合抗原受体序列的插入。使用抗Fab或抗CD19抗体,通过流式细胞术确认嵌合抗原受体的细胞表面表达。如前所述,通过流式细胞术确定细胞表面内源T细胞受体的敲除。
实施例5嵌合抗原受体的插入和表达
1.将嵌合抗原受体序列插入TRC1-2识别序列
在本研究中,我们测试AAV是否可以提供可用于将嵌合抗原受体序列插入到TCRα恒定区基因中并同时敲除内源TCR受体的细胞表面表达的HDR模板。在第一个实验中,如上所述刺激人CD3+ T细胞(1e6细胞)并用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA(2μg)电穿孔,然后立即用AAV412转导(1e5病毒基因组/细胞)。作为对照,将细胞模拟电穿孔,然后用AAV412转导或用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔,然后模拟转导。包括模拟电穿孔、模拟转导细胞的额外对照。
开发基于PCR的测定以确定AAV HDR模板是否被用于修复TRC 1-2识别序列处的双链断裂。使用三组引物对进行PCR分析。第一组被设计用于扩增具有AAV412同源臂的区域。由于该第一引物组(在表7中称为“同源臂内部/CAR区”)位于同源区内,其将扩增基因组的未经修饰的TRC1-2识别序列基因座(349bp)、AAV412载体输入(2603bp)或已插入了CAR基因的TRC1-2识别序列(2603bp)。第二引物组(在表7中称为“5′同源臂外部”)包括在AAV412HDR模板的CAR区域内退火的一个引物,在AAV412HDR模板的5′同源臂外部人基因组中退火的一个引物,并且只有在CAR基因成功插入到了TRC 1-2识别序列中时才扩增1872bp片段。第三个引物组(在表7中称为“3′同源臂外部”)包括在AAV412 HDR模板的CAR区域内退火的一个引物,以及在AAV412 HDR模板的3′同源臂外部人基因组中退火的一个引物。与第二引物组类似,第三引物组只有在CAR基因成功插入到TRC1-2识别序列中时才扩增1107bp片段。总之,来自所有三个引物组的PCR产物将指示CAR序列是否存在于细胞中(引物组1),以及其是否已经插入到TRC 1-2识别序列(引物组2和3)中。
在转导后第4天,使用上述PCR引物对分析细胞。简言之,收获约3,000个细胞,沉淀并裂解,并进行PCR以确定CAR基因是否插入到了TRC1-2识别序列中。PCR产物还在琼脂糖凝胶上解析,如图26所示(泳道描述可在表7中找到)。泳道1至3是来自用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔并模拟转导的样品的PCR产物。
如预期,第一引物对(“同源臂内部/CAR区”)扩增未经修饰的TRC1-2识别序列基因座,产生显示在泳道1中的349bp带。泳道2和3对应于仅在CAR基因已经插入到了TRC 1-2识别序列中才产生产物的引物对,并且未示出产物。泳道7至9代表模拟电穿孔并模拟转导的样品,并显示出与上述仅TRC 1-2x.87EE mRNA对照相同的带。泳道4至6示出来自用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔并用AAV412转导的样品的PCR产物。泳道4显示由第一引物对(“同源臂内部/CAR区”)产生的两个带,指示基因组的未经修饰的TRC1-2识别序列基因座(349bp)和AAV412载体输入(2603bp)或已经插入了CAR基因的TRC1-2识别序列(2603bp)的扩增。泳道5和6示出了只有在CAR核酸序列已经插入到TRC 1-2x.87EE识别位点中时才扩增产物的引物对产生的产物。两个带均是预测的大小(分别为1872和1107bp)。泳道10至12代表模拟电穿孔并用AAV412转导的样品。泳道10示出了由第一引物对产生的两个带(“同源臂内部/CAR区”),指示基因组的未经修饰的TRC1-2识别序列基因座(349bp)和AAV412载体输入(2603bp)的扩增。泳道11和12对应于只有在CAR基因已经插入到TRC 1-2识别序列中才产生产物的引物对,并且未示出产物。泳道11和12(其包含同源臂外部的引物)中不存在带表明泳道10中的2603bp带是由AAV412输入的扩增产生的。
总之,PCR分析清楚地表明,当TRC 1-2x.87EE mRNA和AAV412都存在于细胞中时,CAR基因被引入了TRC 1-2x.87EE识别位点中。因此,我们得出这样的结论:AAV412用于产生可用于将CAR基因插入到TRC 1-2x.87EE识别序列中的合适的HDR模板。
在第二个实验中,如上所述刺激人CD3+ T细胞并用编码TRC 1-2x.87 EE大范围核酸酶的mRNA电穿孔,然后立即用递增量的AAV408(0μL、3.125μ、6.25μL、12.5μL或25μL,其对应于约0、3.125e3、6.250e3、1.25e4和2.5e4病毒基因组/细胞)转导。作为对照,将细胞模拟电穿孔,然后用递增量的AAV408转导。其他对照包括模拟电穿孔并模拟转导的细胞,以及用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导的细胞。在转导后第4天,收获细胞并如上所述进行分析,但仅使用只有在CAR基因已插入到TRC1-2识别序列中时才扩增产物的引物对。将PCR产物在琼脂糖凝胶上解析,如图27所示。图27A示出了使用上述引物对(“5同源臂外部”)产生的PCR产物,所述引物对只有在CAR基因已插入到基因座之后才扩增TRC 1-2识别序列基因座5′端的产物。图27B示出了使用上述引物对(“3′同源臂外部”)产生的PCR产物,所述引物对只有在CAR基因已插入到基因座之后才扩增TRC 1-2识别序列基因座3′端的产物。泳道描述可以在表8中找到。图27A和27B两者中的泳道1至5表示模拟电穿孔或模拟电穿孔然后模拟转导的样品。在模拟电穿孔的细胞中没有可见的PCR产物,表明在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA时,由AAV408产生的HDR模板不能将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中。泳道6代表用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔并模拟转导的样品。没有可见的PCR产物,表明CAR基因未插入到TRC 1-2识别序列中。泳道7至10代表用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔并用递增量的AAV408转导的样品。每种PCR的适当大小的带是明显的,表明AAV408可产生HDR供体以修复TRC 1-2识别序列,导致CAR基因的插入。
表7
表8
上述基于PCR的测定可用于确定CAR基因是否已插入TRC 1-2识别序列中,但不能提供效率信息。为了确定CAR插入的效率,我们开发了基于数字PCR的测定(示意图见图28A)。在该测定中,使用两个引物组。第一组扩增不相关的基因序列并用作参考序列来控制模板数目。第二组由在CAR基因内退火的一个引物和在3′同源臂外部退火的一个引物组成,使得仅在CAR基因已插入TRC 1-2识别序列时才扩增产物。VIC标记的探针在第一引物组产生的扩增子内退火,FAM标记的探针在第二组引物产生的扩增子内退火。通过将由FAM标记的探针检测的扩增子的数目除以由VIC标记的探针检测的参考序列扩增子的数目,可以精确定量通过插入CAR基因修饰的TRC1-2识别序列基因座的百分比。
图28B示出了模拟电穿孔然后转导、用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导、或用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后用递增量的AAV408转导的样品的数字PCR测定的结果。使用从转导后约1周的细胞分离的基因组DNA进行数字PCR。与图27中描述的PCR观察结果一致,发现两种对照样品(仅转导或仅电穿孔)具有0%的CAR基因插入到TRC 1-2x.87EE识别序列中。发现用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV408转导的样品具有约1.5%至7%。该测定在两种不同的仪器(标记为QX200和QS3D)上进行,并且显示出高度一致性,证明了这种基于数字PCR的测定的灵敏度和精确度。
2.T细胞上表达抗CD19嵌合抗原受体
除了确定是否在分子水平发生了CAR插入之外,我们试图确定使用AAV408作为HDR模板将CAR基因插入到TRC1-2识别序列中的细胞中抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。此外,我们检查了将CAR插入到TRC 1-2x.87EE识别序列中导致T细胞受体敲除的效率。还通过流式细胞术分析了如上所述并在图27和28中分析的样品的CAR和CD3表达。转导后约4天,用识别抗CD19 CAR(抗Fab-Alexa647)或CD3(CD3-BB515)的抗体标记细胞并通过流式细胞术分析。图29A显示流式细胞术图,其中Y轴显示抗CAR标记,X轴显示抗CD3标记。模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞绝大多数为CD3+/CAR-(右下象限,98.7%)。模拟电穿孔然后用递增量的AAV408转导的细胞看起来与对照细胞基本上相同,其中CD3+/CAR-群为98.8%、99.99%和99.1%。因此,我们得出结论:单独的AAV408病毒不能驱动可检测水平的CAR表达,也不能破坏T细胞受体的表达。
图29B示出了用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后模拟转导的样品或用TRC1-2x.87EE电穿孔然后用递增量的AAV408转导的细胞的流式细胞术图。电穿孔然后模拟转导的细胞显示47.1%的CD3-细胞,表明有效敲除T细胞受体复合物。使用抗CD19 CAR的背景标记非常低,在CD3-群中为0.6%,在CD3+群体中为0.78%。用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV408转导的样品显示出CD3-群中的CAR标记,为2.09%至5.9%。在CD3+群中也有稍微增加的CAR标记,为1.08%至1.91%。我们并没有确定CD3+群中CAR+细胞增加的原因,尽管可能是CAR插入到了非表达性T细胞受体等位基因中(T细胞受体α链的仅一个等位基因被表达并被并入T细胞受体复合物中)。
这些数据与上述定量的基于数字PCR的测定方法良好相关。例如,在AAV408的最高MOI(2.5e4病毒基因组/细胞)下,数字PCR测定显示约6%CAR插入,而流式细胞术测定显示5.9%CAR+/CD3-细胞。如果考虑到CAR+/CD3+群,数据仍然具有相当可比性,流式细胞术测定显示约7.8%CAR+,相比于数字PCR的6%。
实施例6.额外AAV载体的表征
1.将嵌合抗原受体序列插入到TRC 1-2识别序列中
已经证明AAV载体可以提供合适的HDR模板以将CAR基因插入到TRC 1-2x.87EE识别序列中,我们试图优化AAV载体的构型。我们产生了可用于产生自我互补的AAV基因组的载体,其包含由JeT启动子驱动的CAR基因表达盒,侧接与TRC 1-2识别序列基因座同源的短区域和AAV ITR。该载体被称为AAV421(图30;SEQ ID NO:123)。由于自身互补AAV有限的包装能力,短同源臂是必要的。此外,我们产生了可用于产生单链AAV基因组的载体,其包含由CMV启动子驱动的CAR基因表达盒,侧翼为长同源性臂和AAV ITR。该载体被称为AAV422(图31;SEQ ID NO:124)。由于单链AAV基因组具有更大的装载能力,因此我们能够使用比自身互补载体更长的同源臂。
为了测试AAV421和AAV422是否可用于将CAR基因靶向插入到TRC1-2识别序列中,在人CD3+ T细胞中进行了与上述类似的几个实验。在第一个实验中,将人CD3+ T细胞(1e6细胞)模拟电穿孔,然后用递增量的AAV421或422转导,或者用TRC 1-2x.87EE mRNA(2μg)电穿孔,然后用递增量的AAV421或AAV422转导。与上述实验相比,本实验中AAV422 MOI显著高于AAV421(近似MOI为1.25e4、2.5e4、5e4和1e5病毒基因组/细胞),因为早期的AAV408实验表明较高的MOI会导致更有效的CAR插入。AAV421病毒储液未充分浓缩以使滴度显著高于前述实验。作为对照,将细胞电穿孔(模拟或用TRC 1-2x.87EE mRNA),然后模拟转导。作为该实验的额外组分,进行“大规模”条件,其中将10e6细胞(为典型实验的10倍)用TRC 1-2x.87EEmRNA电穿孔,然后用AAV422转导(2.5e4病毒基因组/细胞)。最后,我们还测试了第二AAV421病毒储液与原始病毒储液进行比较。
使用仅在CAR基因已插入到TRC 1-2x.87EE识别序列中时才扩增产物的引物对,如上所述通过PCR确定CAR的插入。通过琼脂糖凝胶解析PCR,示出在图32A和32B中(泳道描述可在表9和10中找到)。图32A中的样品1被模拟电穿孔然后模拟转导,样品2至5被模拟电穿孔然后用AAV421转导。凝胶显示这些样品均没有产生PCR产物,表明在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下,AAV421不能驱动将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中。此外,用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导的对照样品(样品6)未显示任何PCR产物。图32A中的样品7至10用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后用递增量的AAV421转导。凝胶显示出延伸超出5′和3′同源臂的产物的PCR带(每个样品编号下的两个带),证明CAR基因整合到TRC1-2识别序列中。最后在图32A中,泳道11和12代表分别以1e6或10e6细胞/样品开始的用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后用AAV422转导的样品。两个PCR带的存在(第一组较大,因为使用不同的引物来负责较长的同源臂)表明CAR基因成功插入到TRCI-2识别序列中。
图32B中的样品1被模拟电穿孔然后模拟转导,样品2至5被模拟电穿孔然后用递增量的AAV422转导(表10)。凝胶显示这些样品均没有产生PCR产物,表明在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下,AAV422不能驱动将CAR基因插入到TRC 1-2识别序列中。图32B中的样品7至10用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后用递增量的AAV422转导。凝胶显示出延伸超出5′和3′同源臂的产物的PCR带,证明CAR基因整合到TRC1-2识别序列中。最后,样品11代表用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后用AAV421转导的样品,所述AAV421来自与图32A中所示样品不同的病毒储液。带的存在表明CAR基因插入到了TRC 1-2识别序列中并确认不同病毒储液之间的重现性。总之,图32清楚地表明,AAV421和AAV422都能够产生适合将CAR基因插入到TRC1-2识别序列中的HDR模板。
表9
表10
2.使用AAV421在T细胞上表达抗CD19嵌合抗原受体
在此,我们试图确定使用AAV421将CAR基因插入到TRC1-2识别序列的细胞中抗CD19嵌合抗原受体的表达水平。还通过流式细胞术分析了上述并在图32A中分析的样品的CAR和CD3表达。转导约4天后,将细胞用识别抗CD19 CAR或CD3的抗体标记并通过流式细胞术进行分析。图33A示出了模拟电穿孔并用AAV421转导的细胞以及模拟电穿孔并模拟转导的对照细胞的流式细胞术图。模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞绝大多数为CD3+/CAR-(右下象限,98.8%)。模拟电穿孔然后用递增量的AAV421转导的细胞看起来与对照细胞基本上相同,其中CD3+/CAR-群为98.8%、98.6%、98.8%和97.9%。因此,我们得出结论:单独的AAV421病毒不能驱动可检测水平的CAR表达,也不能破坏T细胞受体的表达。
图33B示出了用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导的样品或用TRC 1-2x.87EE电穿孔然后用递增量的AAV421转导的细胞的流式细胞术图。电穿孔然后模拟转导的细胞显示56.7%的CD3-细胞,表明有效敲除T细胞受体复合物。使用抗CD19 CAR的背景标记非常低,在CD3-群中为0.48%,在CD3+群中为0.36%。用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV412转导的样品显示出CD3-群中的显著量的CAR标记,为4.99%至13.4%。在CD3+群中也有稍微增加的CAR标记,为1.27%至3.95%。如上所述,可以将CAR基因插入到非表达性T细胞受体等位基因中。同样,与使用AAV408的实验相反,CAR+群体更好定义,平均萤光强度更高,表明与eF1α核心启动子相比JeT启动子驱动更高的表达。
在评估使用AAV421与TRC1-x87EE的结合的CAR基因的插入时,我们试图确定能够允许我们优先扩增和富集CD3-/CAR+群的方法。从上述以及图33所示的实验中,我们使用了用TRC 1-2x.87EE mRNA(2μg)电穿孔然后用AAV421(3.13e4病毒基因组/细胞)转导的细胞。来自上述以及图33所示的实验,对照样品模拟电穿孔并模拟转导,模拟电穿孔并用AAV421转导,或者用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导。作为对照富集和扩增过程,这些细胞在补充有IL-7和IL-15(均为10ng/mL)的完全生长培养基中孵育6天。然后用针对抗CD19 CAR和CD3的抗体标记细胞并通过流式细胞术进行分析(图34A)。模拟电穿孔并模拟转导的细胞在CD3-/CAR+象限中显示低水平的背景染色(0.13%)。在模拟电穿孔然后用AAV转导或用TRC1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导的样品中CD3-/CAR+群基本相同(分别为0.16%和0.55%)。用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔并模拟转导的细胞具有53.2%的CD3-/CAR-群,非常接近图33B所示的该实验的第一部分中染色的量(56.7%)。用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用AAV转导的细胞显示12.6%的CD3-/CAR+细胞,与图33中所示的这些细胞的原始标记(13.4%)几乎相同,表明IL-7和IL-15的混合物不足以富集或扩增特异性CD3-/CAR+细胞群。
我们接下来试图通过将上述4个样品与在细胞表面上呈递CD19的IM-9细胞一起孵育来以抗原特异性方式富集CD3-/CAR+群。通过用丝裂霉素C预处理使IM-9细胞失活,并在IL-7和IL-15(10ng/mL)的存在下与样品以1∶1的比例孵育6天。然后用针对CD3和抗CD19CAR的抗体标记细胞并通过流式细胞术进行分析(图34B)。模拟电穿孔并模拟转导的细胞在CD3-/CAR+象限中显示低水平的背景染色(0.2%)。在模拟电穿孔然后用AAV转导的样品中CD3-/CAR+群相同(0.2%),并且在用TRC 1-2x.87EE电穿孔并模拟转导的细胞中略高(1.24%)。单独TRC 1-2x.87EE的对照中CD3-/CAR+细胞的增加被认为是背景,因为没有CAR核酸被引入到系统中。用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔并模拟转导的细胞具有42.5%的CD3-/CAR-群,其显著低于它们扩增前(56.7%,图33),表明在该系统中CD+细胞可能具有生长优势。然而,用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用AAV转导的细胞显示出49.9%的CD3-/CAR+细胞,与图33中所示的这些细胞的原始标记(13.4%)相比显著增加,表明在IL-7和IL-15的存在下用IM-9细胞孵育该样品在富集和扩增CD3-/CAR+群方面非常有效。在这些条件下CD3+/CAR+群也被扩增,模拟电穿孔/AAV转导样品和TRC 1-2x.87EE电穿孔/AV转导样品分别显示2.53%和15.3%的CD3+/CAR+。
在用TRC 1-2x.87EE电穿孔并随后用AAV421转导的细胞中,扩增前24.2%的CD3-群是CAR+(图33B)。在补充有IL-7和IL-15的培养基中孵育后,25.3%的CD3-细胞是CAR+(图34A),表明基因敲入与基因敲除的比率没有变化。然而,除了IL-7和IL-15之外,在与IM-9细胞一起孵育后,超过80%(80.35%,图34B)的CD3-细胞是CAR+,表明与IM-9细胞孵育导致抗原特异性富集。
由于丝裂霉素C非常有效地使细胞失活且IM-9细胞在混合培养中不持久,我们推断第二次输入IM-9细胞可能进一步增加CD3-/CAR+细胞的富集。将上述和图34B所示的一些细胞与含有IL-7和IL-15的培养基中的新鲜IM-9细胞(用丝裂霉素C预处理)混合并再孵育6天。然后对细胞的CD3和抗CD19 CAR染色并通过流式细胞术进行分析(图34C)。与IM-9细胞的第一轮富集相比,任何对照样品中的CD3-/CAR+细胞的百分比基本没有变化。
然而,用TRC 1-2x.87EE电穿孔并用AAV421转导的细胞显示CD3-/CAR+群的显著富集,从49.9%(如果与IM-9细胞一起孵育则在第一轮后,图34B)增加到65.7%(图34C)。重要的是,93.75%的CD3-群是CAR+,表明进一步的抗原特异性扩增。
3.使用AAV422在T细胞上表达抗CD19嵌合抗原受体
我们还检查了来自使用AAV422提供HDR模板的细胞的抗CD19 CAR的表达(如上所述,PCR结果示出在图32B中)。转导约4天后,将细胞用识别抗CD19CAR或CD3的抗体标记并通过流式细胞术进行分析。图35A示出了模拟电穿孔并用递增量的AAV422转导的细胞以及模拟电穿孔并模拟转导的对照细胞的流式细胞术图。模拟电穿孔并模拟转导(MOI-0)的细胞绝大多数为CD3+/CAR-(右下象限,98.8%)。模拟电穿孔然后用递增量的AAV422转导的细胞看起来与对照细胞基本上相同,其中CD3+/CAR-群为98.6%、98.6%、98.9%和98.4%。因此,单独的AAV422载体不能驱动可检测水平的CAR表达,也不能破坏T细胞受体的表达。
图35B示出了用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔然后模拟转导的样品或用TRC 1-2x.87EE电穿孔然后用递增量的AAV422转导的细胞的流式细胞术图。电穿孔然后模拟转导的细胞显示59.3%的CD3-细胞,表明有效敲除T细胞受体复合物。使用抗CD19 CAR的背景标记非常低,在CD3-群中为1.47%,在CD3+群中为0.52%。用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV422转导的样品显示出CD3-群中的显著量的CAR标记,为14.7%至20.3%。在CD3+群中也有稍微增加的CAR标记,为2.3%至2.7%。
出人意料地,我们在AAV422的存在下观察到T细胞受体敲除效率的显著增加。利用递增的AAV422,整体CD3敲除效率为71.6%、74.9%、77.8%和74.4%,而单独TRC 1-2x.87EE电穿孔的效率为59.3%。相比之下,利用递增的AAV421,整体CD3敲除效率为56.99%、56.62%、57.4%和55.4%,而单独TRC 1-2x.87EE电穿孔的效率为57.18%(图33B)。因此,似乎是在单链AAV基因组而不是自身互补AAV基因组的存在下,用TRC 1-2x.87EE的电穿孔导致TRC 1-2x.87EE核酸酶的整体敲除效率增加。由于这种增加,用AAV421和AAV422转导的细胞之间CAR+的CD3-细胞的百分比没有显著差异,尽管CD3-/CAR+细胞数目更高。与AAV422(MOI=1e5病毒基因组/细胞)的26.48%相比,使用AAV421的为CAR+的CD3-细胞的最高百分比为24.18%(MOI=3.13e4病毒基因组/细胞)。考虑到AAV421和AAV422之间的MOI差异很大,这一观察结果特别有趣。
使用来自该实验的细胞测试了利用IM-9细胞来特异性富集CD3-/CAR+细胞的概念。同样,不是测试整个组,我们仅试图在新实验中富集模拟电穿孔然后用AAV422转导的细胞或者用TRC 1-2x.87EE电穿孔然后用AAV422(2.5e4病毒基因组/细胞)转导的细胞。图36A示出了转导后约4天的流式细胞术图。模拟电穿孔/转导细胞显示0.13%的CD3-/CAR+细胞的背景染色。相比之下,用TRC 1-2x.87EE电穿孔然后用AAV422转导的细胞显示4.44%的CD3-/CAR+细胞。如上所述,在IL-7和IL-15存在下将细胞与IM-9细胞(用丝裂霉素预处理)一起孵育6天,然后通过流式细胞术进行分析。图36B显示用IM-9细胞孵育使AAV422转导细胞中的CD3-/CAR+群显著增加到了35.8%。CAR+细胞占总CD3-群的45.2%,而富集前为6.69%(图36A)。如上所述,我们还通过第二次添加IM-9细胞进一步富集(图36C)。两轮与IM-9细胞的孵育产生65.1%的CD3-/CAR+细胞。CAR+细胞占总CD3-群的78.25%,表明CD3-/CAR+细胞显著的抗原依赖性富集。
这些数据连同上面提供的数据清楚地表明,具有抗CD19 CAR基因插入到TRC1-2识别序列中的细胞可以通过在IL-7和IL-15的存在下与IM-9细胞一起孵育而成功富集,并且可以在仅12天的培养中产生超过90%CAR+的CD3-群。
4.使用单链AAV载体时观察到提高的敲除效率
在本研究中,我们继续观察单链AAV载体提高TRC 1-2x.87EE核酸酶的敲除效率。在第一个实验中,将细胞用TRC 1-2x.87EE(2μg)电穿孔,并模拟转导或用递增量的AAV412(6.25e4、1.25e4、2.5e4或5e4病毒基因组/细胞)转导。在转导后第4天,用抗CD3抗体标记细胞并通过流式细胞术进行分析(图37A)。在模拟转导的细胞中,20.7%为CD3-,而利用递增的AAV412为21.6%、23.7%、25.5%和25%,表明在AAV412的存在下TRC 1-2x.87EE的敲除效率高达23%(25.5%相比于20.7%)。
为了确定敲除效率的这种提高是否是核酸酶特异性的,在另外的实验中,将细胞用编码靶向β2-微球蛋白基因的核酸酶的mRNA(2μg)电穿孔,并模拟转导或用递增量的AAV412转导。在转导后第4天对细胞的β2-微球蛋白进行染色并通过流式细胞术进行分析(图37B)。在模拟转导的细胞中,β2-微球蛋白敲除效率为64.5%,在利用递增量的AAV412的转导细胞中提高至68.6%、70.7%、77.2%和82.5%,表明敲除效率提高高达27.9%(82.5%相比于64.5%)。
在平行实验中,将细胞用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔,并模拟转导或用AAV422(使用与AAV412相同的MOI)转导。用抗CD3抗体标记细胞,并通过流式细胞术分析细胞(图37C)。模拟转导的细胞显示出62.2%的T细胞受体敲除,并且利用递增量的AAV,T细胞受体敲除频率提高至72.6%、75.5%、78.3%和75.1%。此,AAV422的存在使TRC 1-2x.87EE的敲除效率提高高达25.8%(78.3%相比于62.2%)。出人意料地,使用两种不同的核酸酶和两种不同的AAV载体,三个实验之间的敲除效率的百分比提高几乎相同。总之,这些数据强烈表明,用单链AAV载体转导细胞提高了核酸酶的敲除效率,而不论是核酸酶还是AAV载物。
5.表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的活性
上述实验清楚地证明了通过用TRC 1-2x.87EE mRNA对细胞电穿孔然后立即用AAV421转导细胞产生了CAR T细胞,并且这些细胞可以通过与CD19表达性IM-9细胞共培养而富集CD3-/CAR+群。接下来我们检测了这些CAR T细胞对靶细胞的活性。在第一个实验中,将上述和图34C所示的细胞用于IFN-γELISPOT测定,其中CD19+Raji细胞或CD19-U937细胞是靶标群。如图38A所示,当抗CD19 CAR T细胞与U937细胞一起孵育时,无论靶标:效应子比例如何,它们都不分泌IFN-γ。然而,将CAR T细胞与Raji细胞一起孵育则以剂量依赖性方式导致高水平的IFN-γ分泌,表明IFN-γ的分泌是抗原特异性的。
这些CAR T细胞也用在细胞杀伤测定中,其中萤光素酶标记的Raji细胞是靶标。简言之,将CAR T细胞与萤光素酶标记的Raji细胞以10∶1的比例一起孵育。在多个时间点,将细胞洗涤并裂解以测量萤光素酶活性,作为剩余多少细胞的量度。对照细胞显示萤光素酶活性大于5500任意单位(图38B)。共孵育2、3、4和5小时导致萤光素酶活性分别降至4598、3292、2750和1932任意单位。因此,在共孵育5小时内,萤光素酶活性降低约65%,表明CAR T细胞的强溶细胞活性。
总之,这些数据表明,根据本文所述方法产生的抗CD19 CAR T细胞在杀死CD19+细胞方面有效。
实施例7.线性化的质粒DNA
1.来自线性化质粒DNA的嵌合抗原受体的表达
由于AAV产生的HDR模板是线性DNA分子,我们假设来自任何来源的线性DNA都可能是将CAR基因插入TRC 1-2识别序列的合适HDR模板。为了测试这一点,我们产生了多种质粒,其含有侧翼为与TRC1-2识别序列基因座同源的同源臂的抗CD19 CAR基因。在一些质粒中使用不同的启动子,并且同源臂是“短的”(5′同源臂上200bp和3′同源臂上180bp)以模拟自我互补的AAV载体或者“长的”(5′同源臂上985bp和3′同源臂上763bp)以模拟单链AAV载体。具有短同源臂的质粒标记为“pDS”,具有长同源臂的质粒标记为“pDI”。此外,一些质粒在CAR基因的上游含有内含子。
将CAR供体质粒在载体骨架中的限制性位点处线性化并凝胶纯化。将入CD3+T细胞用单独的线性化CAR供体质粒(取决于纯化的线性化质粒的浓度,量为500ng至1000ng)电穿孔或者还与TRC 1-2.87EE mRNA(2μg)共同电穿孔。作为对照,将细胞模拟电穿孔或用单独TRC 1-2x.87EE电穿孔。图39中的图标记出了所有电穿孔的说明。电穿孔后约4天,将细胞用针对CD3和抗CD19 CAR的抗体标记并通过流式细胞术进行分析(图39)。图39A显示了0.15%的背景CD3-/CAR+染色。应该指出,背景CD3-/CAR+染色异常高,为4.31%。图39B示出了用单独TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞,显示出60.8%的CD3敲除。图39C和39D代表用TRC 1-2x.87EE mRNA和具有EF1α核心启动子和HTLV增强子的长同源臂载体或者具有EF1α核心启动子(没有增强子)的短同源臂载体共电穿孔的样品。有趣的是,具有单独EF1α核心启动子的线性化CAR供体产生2.38%的CD3-/CAR+群,而具有EF1α核心启动子和HTLV增强子的载体不产生显著百分比的CD3-/CAR+细胞。在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下用这两种载体电穿孔的细胞显示CD3-/CAR+群没有显著增加(图39E和39F)。在TRC 1-2x.87EE的存在下用EF1α核心启动子载体使CD3-/CAR+群增加表明线性化的质粒可以充当HDR模板以修复TRC1-2识别序列处的双链断裂。
图39G和39H示出了两个长同源臂构建体,其均含有驱动CAR表达的MND启动子。图39G中示出的这些构建体中的一个在CAR基因的5′末端还含有内含子。出人意料地,当与TRC1-2x.87EE mRNA共电穿孔时,具有MND启动子和内含子的长同源臂质粒显示出显著的CAR表达(图39G,4.14%CD3-/CAR+),而无内含子的构建体(图39H)未显示可检测的CAR表达。具有MND启动子但没有内含子的短同源臂质粒还用TRC 1-2x.87EE mRNA进行了测试,并且未显示任何CAR表达(图39I)。在不存在TRC 1-2x.87EE mRNA的情况下,没有任何含MND启动子的构建体产生任何CAR+细胞(图39J、39K和39L)。
最后在这个实验中,我们测试了包含驱动CAR表达的JeT启动子的短同源臂构建体和具有驱动CAR表达的CMV启动子的“长”同源臂构建体。单独时,这些线性化质粒均不导致显著的CAR+细胞(图39O和39P)。当将细胞用TRC1 2x.87EE mRNA共电穿孔时,含有JeT的构建体显示2.69%的CD3-CAR+细胞,而含有CMV的构建体产生2.7%的CD3-/CAR+细胞。
图39所示的流程图清楚地表明,编码侧翼为同源臂的CAR的线性化质粒DNA可用作HDR模板以修复由TRC 1-2x.87EE引起的DNA断裂,导致CAR核酸的插入。很明显,启动子强度在CAR的表达中起重要作用,并且当基因中存在内含子时,一些启动子驱动更有效的表达。
为了证实使用线性化DNA构建体的CAR插入是TRC1-2识别序列基因座特异性的,我们使用位于CAR内和同源臂外部的引物(图40,表11)如上所述分析细胞。样品1和2是来自模拟电穿孔或仅用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔的细胞的PCR产物。与上面显示的结果一致,不存在PCR带,表明TRC1-2识别位点中缺少CAR基因。样品3、4和5来自用TRC 1-2x.87EE和线性化CAR同源质粒共电穿孔的细胞(图40中样品名称)。每个样品显示预测大小的两个PCR带,表明CAR基因表达盒插入到了TRC1-2识别位点中。样品6、7和8来自用与样品3、4和5相同的线性化CAR同源质粒但不用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。如预期,不存在PCR带。样品9和10是来自模拟电穿孔或仅用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔的细胞的PCR产物,并且未显示PCR带。样品11、12、13和14来自用TRC 1-2x.87EE和线性化CAR同源质粒(图40中样品名称)共电穿孔的细胞。每个样品显示预测大小的两个PCR带,表明CAR基因插入到了TRC 1-2识别位点中。样品15、16、17和18来自用与样品11、12、13和14相同的线性化CAR同源质粒但不用TRC 1-2x.87EE mRNA电穿孔的细胞。如预期的,不存在PCR带。
图39和40清楚地表明,将人CD3+T细胞用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA和线性化CAR同源质粒共电穿孔是将CAR基因插入TRC1-2识别序列的有效方法。
表11
实施例8.另外的AAV载体的表征
1.使用具有JeT启动子和长同源臂的AAV
上述数据共同表明,使用JeT启动子的载体驱动CAR的高的一致的表达,并且更长的同源臂可以提高基因插入效率。我们设计并产生了图41(SEQ ID NO:125)所示的载体,其用于制备具有长同源臂和驱动抗CD19 CAR表达的JeT启动子的单链AAV(本文称为AAV423)。将人CD3+T细胞用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔并用递增量的AAV423转导。由于上文所示数据表明较高的MOI可能导致插入效率的提高,因此我们使用1.875e4至1.5e5的滴度。作为对照,将细胞用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后模拟转导,或者模拟电穿孔然后用递增量的AAV423转导。在转导后第6天,用识别CD3或抗CD19 CAR的抗体标记细胞并通过流式细胞术进行分析。如图42所示,模拟电穿孔然后用递增量的AAV423转导的细胞绝大多数为CD3+/CAR-(96.6%至98.5%)。用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔并模拟转导的细胞是39%CD3-,表明有效敲除T细胞受体。在这些细胞中,背景CAR染色非常低(约2%)。用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV423转导的细胞显示了显著的CAR染色以及CD3敲除。CD3-/CAR+群为21.6%到22.7%,而CD3+/CAR+群为约2%。如上所述,单链AAV的存在提高了TRC1-2识别位点处的整体基因修饰效率,总CD3-群从对照细胞中的41.44%增加至电穿孔然后用递增量的AV423转导的细胞中的57.6%、59.2%、58.7%和56.1%。为CAR+的CD3-细胞的百分比为37.5%至39.9%,表明与上述数据相比插入效率显著提高。
为了证实使用AAV423的CAR插入是TRC1-2识别序列基因座特异性的,我们使用位于CAR内和同源臂外部的引物(图43,表12)如上所述分析细胞。
表12
样品 | 核转染 | AAV(μl) | MOI |
1 | 模拟(水) | --- | --- |
2 | 模拟(水) | --- | --- |
3 | 模拟(水) | pDI JET Prep A(3.125) | 18750 |
4 | 模拟(水) | pDI JETPrep A(6.25) | 37500 |
5 | 模拟(水) | pDI JETPrep A(12.5) | 7500 |
6 | 模拟(水) | pDI JETPrep A(25) | 150000 |
7 | TRC1-2x87EE | --- | --- |
8 | TRC1-2x87EE | pDI JET Prep A(3.125) | 18750 |
9 | TRC1-2x87EE | pDI JET Prep A(6.25) | 37500 |
10 | TRC1-2x87EE | pDI JET Prep A(12.5) | 7500 |
11 | TRC1-2x87EE | pDI JETPrep A(25) | 150000 |
样品1和2是来自模拟电穿孔的细胞的PCR产物。与上面显示的结果一致,不存在PCR带,表明TRC1-2识别位点中缺少CAR基因。样品3-6来自模拟电穿孔然后用递增量的AAV423转导的细胞。与上述结果一致,不存在PCR带。样品7来自用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后模拟转导的细胞,并且没有显示出PCR带。样品8-11来自用编码TRC 1-2x.87EE的mRNA电穿孔然后用递增量的AAV423转导的细胞,并且如果CAR插入到了TRC1-2识别序列中,显示预期的PCR带。
鉴于AAV423在切割后将CAR序列插入到TRC1-2识别位点中的能力,进一步设想AAV423质粒(图41)可以通过消化而被线性化并通过用一种或更多种限制酶消化而递送至细胞,使得可以用可整合到TRC1-2识别位点中并编码抗CD19 CAR的线性化的DNA模板转染T细胞。
实施例9.抗CD19 TCR阴性CAR T细胞的体内效力
1.播散性B细胞淋巴瘤的鼠模型
在播散性B细胞淋巴瘤的鼠模型中评估基因编辑的抗CD19 CAR T细胞的效力。如上所述将活化的T细胞用TRC 1-2x.87 EE mRNA电穿孔,然后用包含由JeT启动子驱动并且侧翼为同源臂的抗CD19 CAR表达盒的AAV6载体转导。在用IL-2(10ng/mL)培养5天后,如前所述通过流式细胞术分析细胞的细胞表面CD3和抗CD19 CAR表达(图44A)。使用抗CD3磁珠通过消耗CD3+细胞富集CD3-细胞。然后在IL-15(10ng/mL)和IL-21(10ng/mL)中培养经消耗细胞3天,并重新分析CD3和抗CD19 CAR的细胞表面表达(图44B)。在消耗CD3+细胞后,CD3-群的分离非常有效,产生99.9%的纯度,如通过流式细胞术测量的(图44B)。经纯化CD3-群包含56%的CD4+和44%的CD8+细胞(图44C),并且主要具有中心记忆/过渡记忆表型,如通过染色CD62L和CD45RO确定的(图44D)。
利用Raji播散性淋巴瘤模型的研究由Charles River LaboratoriesInternational Inc.(Morrisville,NC,USA)进行。在第一天以每只小鼠2.0x105细胞的剂量将稳定表达萤火虫萤光素酶(ffLuc)44的CD19+Raji细胞静脉内注射到5-6周龄的雌性NSG小鼠中。在第4天,向小鼠静脉内注射PBS或含有由相同健康供体PBMC制备的基因编辑的对照TCR KO T细胞的PBS或者含有指定剂量的由相同供体制备的CAR T细胞的PBS。在指定的日子里,向活的小鼠腹膜内注射萤光素底物(盐水中150mg/kg),麻醉,7分钟后使用IVISSpectrumCT(Perkin Elmer,Waltham,MA)测量萤光素酶活性。使用Living Image软件4.5.1(Perkin Elmer,Waltham,MA)分析和输出数据。发光信号强度以单位为p/sec/cm2/sr的辐射度表示。
2.结果
如图45所示,到第8天,所有小鼠的CD19+Raji细胞的生长在低水平是明显的,而到第11天未处理和TCR-对照组中显著增加。在对照组中,到15天观察到显著的肿瘤生长,而到第18或19天,所有对照组都被安乐死。相反,用抗CD19 CAR T细胞处理的所有小鼠组到第11天没有显示肿瘤生长的证据,并且除了低剂量组中的单个小鼠之外,到研究的第29天仍保持无肿瘤。在第36天左右,在低剂量组中的三只小鼠中观察到肿瘤再生长。三只中的一只在第42天死亡,然而成像显示该动物中只有低水平的肿瘤,所以死亡不太可能与肿瘤有关。
3.结论
这些结果为通过基因编辑的CD3-CAR T细胞体内清除CD19+肿瘤细胞提供了明确的证据,并且支持该用于同种异体CAR T细胞治疗的平台的进一步临床前开发。
Claims (19)
1.经遗传修饰的人T细胞,其基因组中包含经修饰的人T细胞受体(TCR)α恒定区基因,其中所述经修饰的人TCR α恒定区基因从5’至3’包含:
(a) 所述人TCR α恒定区基因的5’区;
(b) 编码嵌合抗原受体的外源多核苷酸;和
(c) 所述人TCR α恒定区基因的3’区;
其中在SEQ ID NO: 3的第13和14位之间将所述外源多核苷酸插入到所述TCR α恒定区基因中,并且其中所述嵌合抗原受体在所述经遗传修饰的人T细胞的细胞表面表达,并且其中所述嵌合抗原受体包含细胞外配体结合结构域和一个或更多个细胞内信号转导结构域,并且其中所述经遗传修饰的人T细胞在细胞表面上不表达内源性TCR。
2.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述细胞外配体结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 112所示,其中所述细胞外配体结合结构域与CD19结合。
3.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 113所示的细胞内细胞质信号转导结构域。
4.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 114所示的细胞内共刺激信号转导结构域。
5.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 113所示的细胞内细胞质信号转导结构域和氨基酸序列如SEQ ID NO: 114所示的细胞内共刺激信号转导结构域。
6.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 115所示的信号肽。
7.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 116所示的铰链结构域。
8.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 117所示的跨膜结构域。
9.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 116所示的铰链结构域和氨基酸序列如SEQ ID NO: 117所示的跨膜结构域。
10.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 113所示的细胞内细胞质信号转导结构域、氨基酸序列如SEQ ID NO: 114所示的细胞内共刺激信号转导结构域、氨基酸序列如SEQ ID NO: 116所示的氨基酸序列的铰链结构域和氨基酸序列如SEQ ID NO: 117所示的氨基酸序列的跨膜结构域。
11.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 111所示。
12.权利要求1所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述外源多核苷酸包含驱动所述嵌合抗原受体表达的启动子序列。
13.权利要求12所述的经遗传修饰的人T细胞,其中所述启动子序列的核酸序列如SEQID NO: 118所示。
14.用于产生包含经修饰的人TCR α恒定区基因的经遗传修饰的人T细胞的方法,所述方法包括:
(a) 向人T细胞中引入:
(i) 编码重组大范围核酸酶的第一核酸序列,其中所述重组大范围核酸酶在所述人T细胞中表达;或
(ii) 重组大范围核酸酶蛋白;
其中所述重组大范围核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8至27中任一个所示,并且对所述人TCR α恒定区基因内的识别序列具有特异性,其中所述识别序列由SEQ ID NO: 3组成,并且其中所述重组大范围核酸酶在所述识别序列处产生切割位点;以及
(b) 将包含编码嵌合抗原受体的外源多核苷酸的第二核酸序列引入到所述人T细胞中;
其中在所述切割位点处将所述外源多核苷酸插入到所述人TCR α恒定区基因中,并且其中所述嵌合抗原受体在所述经遗传修饰的人T细胞的细胞表面表达,并且其中所述嵌合抗原受体包含细胞外配体结合结构域和一个或更多个细胞内信号转导结构域,并且其中所述经遗传修饰的人T细胞在细胞表面上不表达内源性TCR。
15.权利要求14所述的方法,其中所述第二核酸序列从5’至3’包含:
(a) 与所述切割位点侧翼的5’上游序列同源的5’同源臂;
(b) 编码所述嵌合抗原受体的所述外源多核苷酸;和
(c) 与所述切割位点侧翼的3’下游序列同源的3’同源臂;
其中通过同源重组在所述切割位点处将所述外源多核苷酸插入到所述人TCR α恒定区基因中。
16.权利要求14或权利要求15所述的方法,其中所述外源多核苷酸包含驱动所述嵌合抗原受体表达的启动子序列。
17.权利要求14或权利要求15所述的方法,其中通过使所述人T细胞与包含所述第二核酸序列的重组腺相关病毒(AAV)载体接触,将至少所述第二核酸序列引入到所述人T细胞中。
18.权利要求17所述的方法,其中所述重组AAV载体是单链重组AAV载体或自身互补重组AAV载体。
19.权利要求17所述的方法,其中所述重组AAV载体具有AAV2或AAV6的血清型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311072847.6A CN117070468A (zh) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562237394P | 2015-10-05 | 2015-10-05 | |
US62/237,394 | 2015-10-05 | ||
US201662297426P | 2016-02-19 | 2016-02-19 | |
US62/297,426 | 2016-02-19 | ||
PCT/US2016/055492 WO2017062451A1 (en) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311072847.6A Division CN117070468A (zh) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108601821A CN108601821A (zh) | 2018-09-28 |
CN108601821B true CN108601821B (zh) | 2023-09-19 |
Family
ID=57145061
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680069576.0A Active CN108601821B (zh) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 |
CN202311072847.6A Pending CN117070468A (zh) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311072847.6A Pending CN117070468A (zh) | 2015-10-05 | 2016-10-05 | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (14) | US9889161B2 (zh) |
EP (3) | EP3756682B8 (zh) |
JP (5) | JP6816133B2 (zh) |
KR (1) | KR20180054886A (zh) |
CN (2) | CN108601821B (zh) |
AU (2) | AU2016333898B2 (zh) |
CA (1) | CA3001011A1 (zh) |
DK (2) | DK3756682T3 (zh) |
ES (2) | ES2803728T3 (zh) |
IL (4) | IL296340A (zh) |
MX (2) | MX2018004146A (zh) |
WO (1) | WO2017062451A1 (zh) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102437522B1 (ko) | 2012-05-25 | 2022-08-26 | 셀렉티스 | 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 t 세포의 조작 방법 |
CA2974381A1 (en) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
PT3298033T (pt) | 2015-05-18 | 2020-09-22 | Tcr2 Therapeutics Inc | Composições e utilizações médicas para reprogramação de tcr utilizando proteínas de fusão |
EP3322297A4 (en) * | 2015-07-13 | 2019-04-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | RELEASE METHOD AND COMPOSITIONS FOR NUCLEASE-DERIVED GENOMINE ENGINEERING |
CA3001008A1 (en) | 2015-10-05 | 2017-04-13 | Precision Biosciences, Inc. | Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene |
AU2016333898B2 (en) | 2015-10-05 | 2020-11-12 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified cells comprising a modified human T cell receptor alpha constant region gene |
JP6928604B2 (ja) * | 2015-11-04 | 2021-09-01 | フェイト セラピューティクス,インコーポレイテッド | 万能性細胞のゲノム改変 |
WO2017078807A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
JP2019510503A (ja) * | 2016-04-07 | 2019-04-18 | ブルーバード バイオ, インコーポレイテッド | キメラ抗原受容体t細胞組成物 |
KR20240000616A (ko) * | 2016-04-15 | 2024-01-02 | 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 | 유전자이식 t 세포 및 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 관련 방법 |
US11242376B2 (en) | 2016-08-02 | 2022-02-08 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins |
PL3445787T3 (pl) | 2016-10-07 | 2021-05-31 | TCR2 Therapeutics Inc. | Kompozycje i sposoby reprogramowania receptorów limfocytów t przy użyciu białek fuzyjnych |
WO2018073393A2 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Cellectis | Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy |
JP7291396B2 (ja) | 2016-11-22 | 2023-06-15 | ティーシーアール2 セラピューティクス インク. | 融合タンパク質を用いたtcrの再プログラミングのための組成物及び方法 |
AU2018219226A1 (en) | 2017-02-07 | 2019-08-15 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents |
CN110582288A (zh) | 2017-02-28 | 2019-12-17 | 恩多塞特公司 | 用于car t细胞疗法的组合物和方法 |
CN110753555A (zh) | 2017-04-19 | 2020-02-04 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 表达工程化抗原受体的免疫细胞 |
ES2953153T3 (es) * | 2017-04-21 | 2023-11-08 | Prec Biosciences Inc | Meganucleasas diseñadas específicas para secuencias de reconocimiento en el gen pcsk9 |
WO2018201144A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for reducing dna-induced cytotoxicity and enhancing gene editing in primary cells |
JP7170666B2 (ja) * | 2017-05-08 | 2022-11-14 | プレシジョン バイオサイエンシズ,インク. | 操作された抗原受容体をコードする核酸分子及び阻害性核酸分子、並びにそれらの使用方法 |
US11166985B2 (en) | 2017-05-12 | 2021-11-09 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology |
US11622977B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-04-11 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology |
KR20200018645A (ko) | 2017-06-15 | 2020-02-19 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 표적화된 비-바이러스 dna 삽입 |
US11053484B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-07-06 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified T cells comprising a modified intron in the T cell receptor alpha gene |
JP2021520184A (ja) * | 2017-09-29 | 2021-08-19 | ナントセル,インコーポレイテッド | Cd1d及びtcr−nkt細胞 |
JP2020537515A (ja) | 2017-10-03 | 2020-12-24 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | Hpv特異的結合分子 |
CN109628493B (zh) * | 2017-10-09 | 2021-12-07 | 广东赤萌医疗科技有限公司 | 一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统 |
BR112020008201A2 (pt) * | 2017-10-27 | 2020-10-06 | The Regents Of The University Of California | substituição-alvo de receptores de células t endógenos |
CN111918659B (zh) * | 2017-10-30 | 2024-01-30 | 派克特制药公司 | 原代细胞基因编辑 |
WO2019106163A1 (en) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Cellectis | Reprogramming of genetically engineered primary immune cells |
US11738047B2 (en) | 2017-12-12 | 2023-08-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Genetically modified immune cells targeting NY-ESO-1 and methods of use thereof |
BR112020014913A2 (pt) | 2018-01-22 | 2020-12-08 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Métodos para uso de células t car |
MX2020008390A (es) * | 2018-02-11 | 2020-12-07 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Receptores de linfocitos t no restringidos a antígenos leucocitarios humanos (hla) y usos de los mismos. |
CA3095741A1 (en) | 2018-04-02 | 2019-10-10 | Pact Pharma, Inc. | Peptide-mhc compacts |
EP3775238A1 (en) * | 2018-04-05 | 2021-02-17 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions |
ES2955408T3 (es) | 2018-04-12 | 2023-11-30 | Prec Biosciences Inc | Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos |
KR20210008502A (ko) | 2018-05-11 | 2021-01-22 | 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 | 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
US11513113B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-11-29 | Pact Pharma, Inc. | Compositions and methods for identification of antigen specific T cells |
CN113766956A (zh) | 2019-03-05 | 2021-12-07 | 恩卡尔塔公司 | Cd19定向性嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途 |
EP3947432A4 (en) | 2019-03-29 | 2023-01-18 | Trustees of Boston University | CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) MODULATION |
MX2021012110A (es) | 2019-04-03 | 2022-01-06 | Prec Biosciences Inc | Celulas inmunitarias geneticamente modificadas que comprenden un arnhc adaptado a microarn (arnhcmir). |
WO2020222176A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Crispr Therapeutics Ag | Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19 |
EP3966322A1 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-16 | Precision BioSciences, Inc. | Optimization of engineered meganucleases for recognition sequences |
KR20220042161A (ko) | 2019-07-23 | 2022-04-04 | 엥스띠뛰 퀴리 | Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포 |
US20220273715A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-09-01 | Precision Biosciences, Inc. | Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus |
EP4017526A1 (en) | 2019-08-20 | 2022-06-29 | Precision BioSciences, Inc. | Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies |
WO2021087305A1 (en) | 2019-10-30 | 2021-05-06 | Precision Biosciences, Inc. | Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy |
CA3160096A1 (en) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | Bruce J. Mccreedy Jr. | Methods for cancer immunotherapy |
US20230183664A1 (en) | 2020-05-11 | 2023-06-15 | Precision Biosciences, Inc. | Self-limiting viral vectors encoding nucleases |
AU2021316727A1 (en) | 2020-07-30 | 2023-03-02 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Immune cells defective for SOCS1 |
WO2022035793A1 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Precision Biosciences, Inc. | Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof |
WO2022165111A1 (en) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | Precision Biosciences, Inc. | Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells |
WO2022189620A1 (en) | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Institut Curie | Transmembrane neoantigenic peptides |
IL305809A (en) | 2021-03-11 | 2023-11-01 | Mnemo Therapeutics | Cancer neoantigenic peptides and their use |
AU2022233019A1 (en) | 2021-03-11 | 2023-09-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Tumor neoantigenic peptides |
WO2023064872A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | Precision Biosciences, Inc. | Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors |
WO2023081767A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for immunotherapy |
WO2023126458A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-07-06 | Mnemo Therapeutics | Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr |
WO2023133525A1 (en) | 2022-01-07 | 2023-07-13 | Precision Biosciences, Inc. | Optimized polynucleotides for protein expression |
WO2023139269A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | Mnemo Therapeutics | Modulation of suv39h1 expression by rnas |
EP4279085A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-22 | Mnemo Therapeutics | Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease |
WO2024059704A1 (en) * | 2022-09-14 | 2024-03-21 | The Johns Hopkins University | Compositions of chimeric autoantigen-t cell receptor (catcr)-t cells and methods of making and using the same |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013176915A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Roman Galetto | Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy |
WO2014153470A2 (en) * | 2013-03-21 | 2014-09-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
WO2014191527A1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Cellectis | A laglidadg homing endonuclease cleaving the t cell receptor alpha gene and uses thereof |
WO2015057980A1 (en) * | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
Family Cites Families (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US895828A (en) | 1907-11-08 | 1908-08-11 | J G Brill Co | Sand-box for cars. |
US4873192A (en) | 1987-02-17 | 1989-10-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection |
US6015832A (en) | 1997-12-31 | 2000-01-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of inactivating bacteria including bacterial spores |
US6635676B2 (en) | 1999-04-28 | 2003-10-21 | Regents Of The University Of Michigan | Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use |
US6559189B2 (en) | 1999-04-28 | 2003-05-06 | Regents Of The University Of Michigan | Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use |
US7767216B2 (en) | 1999-04-28 | 2010-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Antimicrobial compositions and methods of use |
US6506803B1 (en) | 1999-04-28 | 2003-01-14 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of preventing and treating microbial infections |
US6555674B2 (en) | 2000-08-09 | 2003-04-29 | Nsgene A/S | JeT promoter |
US20100151556A1 (en) | 2002-03-15 | 2010-06-17 | Cellectis | Hybrid and single chain meganucleases and use thereof |
US20070036773A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | City Of Hope | Generation and application of universal T cells for B-ALL |
ES2384440T3 (es) | 2005-10-18 | 2012-07-04 | Precision Biosciences | Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas |
WO2008102199A1 (en) | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the beta-2-microglobulin gene and uses thereof |
WO2010015899A2 (en) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Cellectis | Novel method to generate meganucleases with altered characteristics |
EP2215223B1 (en) | 2007-10-31 | 2013-05-01 | Precision Biosciences, Inc. | Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences |
PL3006459T3 (pl) * | 2008-08-26 | 2022-01-17 | City Of Hope | Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu |
US9181527B2 (en) | 2009-10-29 | 2015-11-10 | The Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient T cell compositions |
US8956828B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
CA2993567C (en) | 2010-07-21 | 2022-06-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modification of a t-cell receptor gene |
EP3489366B1 (en) | 2011-06-01 | 2019-12-25 | Precision Biosciences, Inc. | Methods for producing engineered mammalian cell lines with amplified transgenes |
US10391126B2 (en) * | 2011-11-18 | 2019-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA |
GB201206559D0 (en) | 2012-04-13 | 2012-05-30 | Ucl Business Plc | Polypeptide |
KR20140019635A (ko) | 2012-08-06 | 2014-02-17 | 엘지이노텍 주식회사 | 발광 소자 및 발광 소자 패키지 |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
AU2014248119B2 (en) | 2013-04-03 | 2019-06-20 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Effective generation of tumor-targeted T-cells derived from pluripotent stem cells |
US11311575B2 (en) * | 2013-05-13 | 2022-04-26 | Cellectis | Methods for engineering highly active T cell for immunotherapy |
WO2014191128A1 (en) * | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Cellectis | Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system |
AU2014273089B2 (en) | 2013-05-31 | 2018-02-22 | Cellectis | A LAGLIDADG homing endonuclease cleaving the C-C Chemokine Receptor Type-5 (CCR5) gene and uses thereof |
MX2016010345A (es) | 2014-02-14 | 2017-01-23 | Cellectis | Celulas para inmunoterapia diseñadas para dirigir antigeno presente tanto en celulas inmunes y celulas patologicas. |
CA2942113C (en) | 2014-03-11 | 2021-04-13 | Cellectis | Method for generating t-cells compatible for allogenic transplantation |
CA2942268A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Precision Biosciences, Inc. | Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases |
GB2540694A (en) | 2014-04-29 | 2017-01-25 | Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) | CCR5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies |
US10106820B2 (en) * | 2014-06-06 | 2018-10-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for modifying a targeted locus |
US20160081314A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric Antigen Receptors |
WO2016069283A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Altering gene expression in cart cells and uses thereof |
KR20180020125A (ko) | 2015-03-27 | 2018-02-27 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 변형된 t 세포 및 이의 제조 및 사용 방법 |
US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
EP3322297A4 (en) | 2015-07-13 | 2019-04-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | RELEASE METHOD AND COMPOSITIONS FOR NUCLEASE-DERIVED GENOMINE ENGINEERING |
CN108472314A (zh) | 2015-07-31 | 2018-08-31 | 明尼苏达大学董事会 | 修饰的细胞和治疗方法 |
CA3001008A1 (en) * | 2015-10-05 | 2017-04-13 | Precision Biosciences, Inc. | Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene |
AU2016333898B2 (en) * | 2015-10-05 | 2020-11-12 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified cells comprising a modified human T cell receptor alpha constant region gene |
WO2017070429A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods involving editing polynucleotides that encode t cell receptor |
JP6846429B2 (ja) | 2015-12-23 | 2021-03-24 | プレシジョン バイオサイエンシズ,インク. | ヒトβ−2ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ |
KR20220047898A (ko) * | 2016-03-11 | 2022-04-19 | 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 | 게놈 편집 면역 효과기 세포 |
KR20240000616A (ko) * | 2016-04-15 | 2024-01-02 | 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 | 유전자이식 t 세포 및 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 관련 방법 |
US11053484B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-07-06 | Precision Biosciences, Inc. | Genetically-modified T cells comprising a modified intron in the T cell receptor alpha gene |
ES2955408T3 (es) | 2018-04-12 | 2023-11-30 | Prec Biosciences Inc | Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos |
-
2016
- 2016-10-05 AU AU2016333898A patent/AU2016333898B2/en active Active
- 2016-10-05 ES ES16782371T patent/ES2803728T3/es active Active
- 2016-10-05 IL IL296340A patent/IL296340A/en unknown
- 2016-10-05 CN CN201680069576.0A patent/CN108601821B/zh active Active
- 2016-10-05 DK DK20172471.3T patent/DK3756682T3/da active
- 2016-10-05 EP EP20172471.3A patent/EP3756682B8/en active Active
- 2016-10-05 CA CA3001011A patent/CA3001011A1/en active Pending
- 2016-10-05 WO PCT/US2016/055492 patent/WO2017062451A1/en active Application Filing
- 2016-10-05 EP EP16782371.5A patent/EP3359184B1/en active Active
- 2016-10-05 KR KR1020187012975A patent/KR20180054886A/ko unknown
- 2016-10-05 CN CN202311072847.6A patent/CN117070468A/zh active Pending
- 2016-10-05 IL IL287319A patent/IL287319B2/en unknown
- 2016-10-05 ES ES20172471T patent/ES2920525T3/es active Active
- 2016-10-05 MX MX2018004146A patent/MX2018004146A/es unknown
- 2016-10-05 DK DK16782371.5T patent/DK3359184T3/da active
- 2016-10-05 EP EP22163286.2A patent/EP4108255A1/en active Pending
- 2016-10-05 JP JP2018517380A patent/JP6816133B2/ja active Active
-
2017
- 2017-05-26 US US15/607,059 patent/US9889161B2/en active Active
- 2017-05-26 US US15/606,995 patent/US9889160B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-08 US US15/865,055 patent/US9993502B1/en active Active
- 2018-01-08 US US15/865,089 patent/US9969975B1/en active Active
- 2018-01-08 US US15/864,984 patent/US9950010B1/en active Active
- 2018-01-08 US US15/865,075 patent/US9950011B1/en active Active
- 2018-01-08 US US15/864,947 patent/US9993501B2/en active Active
- 2018-04-04 MX MX2023001878A patent/MX2023001878A/es unknown
- 2018-04-04 IL IL258503A patent/IL258503B/en active IP Right Grant
- 2018-04-27 US US15/964,446 patent/US10093900B2/en active Active
- 2018-04-27 US US15/964,423 patent/US10093899B1/en active Active
- 2018-10-02 US US16/150,179 patent/US20190194616A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-12-23 JP JP2020213180A patent/JP2021072785A/ja active Pending
-
2021
- 2021-01-10 IL IL280073A patent/IL280073B/en unknown
- 2021-02-11 AU AU2021200863A patent/AU2021200863A1/en active Pending
- 2021-03-01 US US17/189,243 patent/US11268065B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-19 US US17/579,451 patent/US20220145251A1/en not_active Abandoned
- 2022-01-19 US US17/579,502 patent/US20220135945A1/en not_active Abandoned
- 2022-08-30 JP JP2022136683A patent/JP2022180388A/ja active Pending
-
2023
- 2023-01-17 US US18/155,615 patent/US20240002796A1/en active Pending
- 2023-04-28 JP JP2023074010A patent/JP2023106422A/ja active Pending
- 2023-12-28 JP JP2023222699A patent/JP2024045153A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013176915A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Roman Galetto | Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy |
WO2014153470A2 (en) * | 2013-03-21 | 2014-09-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
WO2014191527A1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Cellectis | A laglidadg homing endonuclease cleaving the t cell receptor alpha gene and uses thereof |
WO2015057980A1 (en) * | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for "Off-the-Shelf" Adoptive T-cell Immunotherapies;Laurent Poirot等;《Cancer Res》;20150716;第75卷(第18期);第3853-3864页 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108601821B (zh) | 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞 | |
EP3359660B1 (en) | Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |