JP2023106422A - 改変ヒトt細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
Description
本出願は、2016年2月19日に出願された「改変ヒトT細胞受容体アルファ定常領
域遺伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第62/297,426号明細
書、及び2015年10月5日に出願された「改変ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺
伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第62/237,394号明細書に
対する優先権を主張するものであり、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組
み込まれる。
に、本発明は、改変ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子をそのゲノムに含む、内因
性T細胞受容体の細胞表面発現が低下している遺伝子改変細胞に関する。本発明は更に、
このような遺伝子改変細胞を作製するための方法、及びこのような細胞を対象において癌
を含む疾患を治療するために使用する方法に関する。
本出願には、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表が含
まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年10月3日に作
成された前記ASCIIコピーの名称は2000706_00180WO1.txtであ
り、サイズは264,046バイトである。
腫瘍関連抗原に対するそれらの特異性を高めるように遺伝子改変された、単離ヒトT細胞
を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をT細胞に移植するためのキメラ抗原受容体又は
外因性T細胞受容体の発現を含み得る。外因性T細胞受容体とは対照的に、キメラ抗原受
容体は、モノクローナル抗体の可変ドメインからその特異性に由来する。従って、キメラ
抗原受容体を発現するT細胞(CAR T細胞)は、主要組織適合性複合体において腫瘍
の免疫反応性を非限定的に誘導する。今日まで、T細胞養子免疫療法は、B細胞悪性腫瘍
(例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、
及び慢性リンパ球性白血病)、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、グリア芽腫、進行した神経
膠腫、卵巣癌、中皮腫、メラノーマ、及び膵臓癌を含む多数の癌の臨床療法として利用さ
れてきている。
ある程度、細胞表面上の内因性T細胞受容体の発現によって制限されていた。内因性T細
胞受容体を発現するCAR T細胞は、同種異系患者への投与後に、主要及び副組織適合
抗原を認識し、移植片対宿主病(GVHD)の発症をもたらし得る。結果として、臨床試
験は、患者のT細胞を単離し、キメラ抗原受容体を取り込むように遺伝子改変して、次い
で同じ患者に再注入する、自己CAR T細胞の使用に大きく焦点を当てている。自己由
来のアプローチは、投与されたCART細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは
、患者の癌が診断された後に患者特異的CART細胞を作製するのに必要な時間と費用の
両方によって制約される。
三者ドナー由来のT細胞を用いて調製された「既製の」CART細胞を開発することが有
利であると思われる。このような製品は、診断に先立って作製および検証され、必要に応
じてすぐに患者に提供することができる。従って、GVHDの発生を防止するために内因
性T細胞受容体を欠く同種異系CAR T細胞の開発が必要である。
作された、部位特異的で、レアカッティングなエンドヌクレアーゼを使用して行うことが
できる。操作された部位特異的ヌクレアーゼを生成するための方法は、当技術分野で公知
である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ゲノム中の所定の部位を
認識及び切断するように操作することができる。ZFNは、FokI制限酵素のヌクレア
ーゼドメインに融合されたジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質
である。ジンクフィンガードメインは、長さが約18塩基対の所定のDNA配列に結合す
るタンパク質を生成するための合理的又は実験的手段によって再設計することができる。
この操作されたタンパク質ドメインをFokIヌクレアーゼに融合することにより、ゲノ
ムレベルの特異性でDNA切断を標的とすることが可能にする。ZFNは、広範囲の真核
生物における遺伝子の付加、除去、及び置換を標的とするために広範に使用されている(
非特許文献1に概説されている)。同様に、TAL-エフェクターヌクレアーゼ(TAL
EN)を生成して、ゲノムDNA中の特定の部位を切断することができる。ZFNと同様
に、TALENは、FokIヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的
DNA結合ドメインを含む(非特許文献2に概説されている)。しかし、この場合、DN
A結合ドメインは、それぞれが単一のDNA塩基対を特異的に認識するTAL-エフェク
タードメインのタンデム配列を含む。本発明の実施にZFN及びTALENが有する限界
は、それらがヘテロ二量体であることであり、その結果、細胞内の単一機能性ヌクレアー
ゼの産生が2つのタンパク質単量体の同時発現を必要とすることである。
造を有する(非特許文献3)。コンパクトTALENは、I-TevIホーミングエンド
ヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに融合された、操作された部位特異的TAL-
エフェクターDNA結合ドメインを含む。FokIとは異なり、I-TevIは二本鎖D
NA切断を行うために二量体化する必要がないため、コンパクトTALENは単量体とし
て機能する。
れている(非特許文献4;非特許文献5)。CRISPRエンドヌクレアーゼは、2つの
成分:(1)カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的には微生物Cas9;及び(
2)ヌクレアーゼをゲノムの目的の位置に誘導する、約20ヌクレオチドの標的化配列を
含む短い「ガイドRNA」、を含む。それぞれが異なる標的化配列を有する複数のガイド
RNAを同じ細胞において発現させることにより、ゲノム中の複数の部位に対するDNA
切断を同時に標的化することが可能である。従って、CRISPR/Cas9ヌクレアー
ゼは本発明に適している。CRISPR/Cas9系の主要な欠点は、報告されている高
頻度のオフターゲットDNA切断であり、このことがヒト患者を治療するための系の有用
性を制限し得る(非特許文献6)。
~40塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼのグループである。それ
らは、寄生虫DNA因子、例えばグループ1自己スプライシングイントロン及びインテイ
ン等と頻繁に関連している。それらは、細胞のDNA修復機構を動員する、染色体におけ
る二本鎖切断を生じさせることによって、宿主ゲノムの特定の位置で相同組換え又は遺伝
子挿入を自然に促進する(非特許文献1)。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、L
AGLIDADG(配列番号7)ファミリー、GIY-YIGファミリー、His-Cy
sボックスファミリーおよびHNHファミリーの4つのファミリーに分類される。これら
のファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例え
ば、LAGLIDADG(配列番号7)ファミリーのメンバーは、保存されたLAGLI
DADG(配列番号7)モチーフの1又は2つのいずれかのコピーを有することを特徴と
する(非特許文献8を参照されたい)。LAGLIDADG(配列番号7)モチーフの単
一のコピーを有するLAGLIDADG(配列番号7)ホーミングエンドヌクレアーゼは
ホモ二量体を形成するが、LAGLIDADG(配列番号7)モチーフの2つのコピーを
有するメンバーは単量体として見出される。
domonas reinhardtii)の葉緑体染色体中の22塩基対の認識配列を
認識及び切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADG(配列番号7)
ファミリーのメンバーである。野生型I-CreI切断部位の優先性を改変するために、
遺伝子選択技術が用いられている(非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許
文献6)。より最近では、I-CreI及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを、哺乳
動物、酵母植物、細菌、及びウイルスのゲノム中の部位を含む、多岐にわたるDNA部位
を標的とするように包括的に再設計可能なモノ-LAGLIDADG(配列番号7)ホー
ミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている、(特許文献1)。
通常二量体であるが、第1のサブユニットのC末端を第2のN末端に結合する短いペプチ
ドリンカーを使用して、単一のポリペプチドに融合することができる(非特許文献13;
非特許文献14)。従って、機能的「単鎖」メガヌクレアーゼを、単一の転写産物から
発現させることができる。
クレアーゼの使用は、特許文献3に以前に開示されている。特許文献3は、TCRアルフ
ァ定常領域遺伝子のエクソン1内の認識配列(特許文献3の配列番号3)を標的とするよ
うに操作された、I-OnuIメガヌクレアーゼの変異体を開示している。特許文献3は
、キメラ抗原受容体がTCRノックアウト細胞において発現され得ることを論じているが
、著者らは、TCRアルファ定常領域遺伝子中のメガヌクレアーゼ切断部位への、キメラ
抗原受容体コード配列の挿入を開示していない。
る。例えば、ヒトT細胞におけるTCR遺伝子を破壊するためのジンクフィンガーヌクレ
アーゼの使用は、特許文献4及び5に記載されている。特許文献6は、ジンクフィンガー
ヌクレアーゼ及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、並びに単
離されたT細胞中のTCR遺伝子を標的とするために操作された単鎖ガイドRNAを有す
るCRISPR/Casシステムの使用を記載する。特許文献7は、T細胞における特異
的TCR及び/又はCD3鎖をコードする核酸を標的とする、小型ヘアピンRNAの使用
を開示している。
常領域遺伝子に挿入された外因性ポリヌクレオチド配列(例えば、キメラ抗原受容体又は
外因性TCRコード配列)を含み、同時に細胞表面における内因性T細胞受容体の発現を
破壊する遺伝子改変細胞を最初に教示している。更に、先行技術は、本明細書に記載のメ
ガヌクレアーゼ若しくは認識配列、又はこのような遺伝子改変細胞を作製するためのそれ
らの使用を教示していない。
遺伝子改変細胞を提供する。このような細胞は、遺伝子改変ヒトT細胞、又はヒトT細胞
に由来する遺伝子改変細胞である。更に、このような細胞は、非改変対照細胞と比較した
場合、内因性TCRの細胞表面発現が低下している。本発明はまた、遺伝子改変細胞の作
製方法を提供する。本発明は更に、遺伝子改変細胞を投与することによって癌を治療する
ための免疫療法の方法を提供する。
遺伝子を含む遺伝子改変細胞を提供し、該改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子は、5
’から3’に:(a)ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の5’領域;(b)外因性ポリ
ヌクレオチド;及び(c)ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の3’領域を含む。遺伝子
改変細胞は、遺伝子改変ヒトT細胞であるか、又はヒトT細胞に由来する遺伝子改変細胞
である。更に、遺伝子改変細胞は、非改変対照細胞と比較した場合、内因性TCRの細胞
表面発現が低下している。
配列を含み、このキメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細
胞内シグナル伝達ドメインを含む。
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配
列同一性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含み、この細胞外リガンド結合ドメイン
はCD19に結合する。
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の
配列同一性を有する細胞内細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の
配列同一性を有する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号115と少なくとも80%
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同
一性を有し得る。
くつかの実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号116と少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性
を有する。
くつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号117と少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性
を有する。
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の
配列同一性を有する。
駆動するプロモータ配列を含む。このような一実施形態において、プロモータ配列は、配
列番号118と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも9
5%、又は最大100%の配列同一性を有する。
くとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大10
0%の配列同一性を有する。
置においてTCR遺伝子に挿入される。このような一実施形態において、改変ヒトTCR
アルファ定常領域遺伝子は、配列番号120と少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性を有する核酸配列を
含む。
置においてTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような一実施形態において
、改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子は、配列番号121と少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性を
有する核酸配列を含む。
置においてTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような一実施形態において
、改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子は、配列番号122と少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性を
有する核酸配列を含む。
れる担体を含む医薬組成物を提供する。
改変細胞を提供する。本発明は更に、それを必要とする対象において疾患を治療するため
の医薬品の製造における、本明細書に記載の遺伝子改変細胞の使用を提供する。このよう
な一態様において、この医薬品は癌の治療に有用である。いくつかの実施形態において、
癌の治療は免疫療法である。
変細胞の作製方法であって、(a)細胞に、(i)操作されたヌクレアーゼをコードする
第1の核酸配列;又は(ii)操作されたヌクレアーゼタンパク質を導入し、前記操作さ
れたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列に切断部位を生成す
る工程、及び(b)外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列を細胞に導入する工程
、を含む方法を提供する。このような方法において、細胞はヒトT細胞であるか、又はヒ
トT細胞に由来する。更に、外因性ポリヌクレオチド配列は、切断部位においてヒトTC
Rアルファ定常領域遺伝子に挿入される。更に、遺伝子改変細胞は、非改変対照細胞と比
較した場合、内因性TCRの細胞表面発現が低下している。
ク質は、第2の核酸を導入する前に、又は第2の核酸を導入した後に細胞に導入すること
ができる。
隣接する5’上流配列に相同な5’相同アーム;(b)外因性ポリヌクレオチド;及び(
c)切断部位に隣接する3’下流配列に相同な3’相同アーム、を含む。このような実施
形態において、外因性ポリヌクレオチドの配列は、相同組換えによって切断部位において
ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される。
、外因性ポリヌクレオチドの配列は、非相同末端結合によってヒトTCRアルファ定常領
域遺伝子に挿入される。
ドする核酸配列を含む。
の発現を駆動する第1のプロモータ配列を含む。
mRNAを用いて細胞に導入される。いくつかの実施形態において、mRNAは、本明細
書に記載の少なくとも1つの操作されたヌクレアーゼのコード配列及び少なくとも1つの
更なるタンパク質(例えば、第2のヌクレアーゼ)のコード配列を含むポリシストロニッ
クmRNAであり得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、同じ
遺伝子(例えば、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子)内の異なる認識配列を標的とす
る、本明細書に記載の2つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードすることができる。他
の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の操作されたヌク
レアーゼ、及び同じ遺伝子(例えば、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子)内の異なる
認識配列を認識及び切断するか、あるいは、ゲノム中の目的の別の遺伝子内の異なる認識
配列を認識及び切断する第2のヌクレアーゼをコードすることができる。このような実施
形態において、このようなポリシストロニックmRNAを使用して作製された遺伝子改変
細胞は、同時にノックアウトされた複数の遺伝子を有することができる。更なる実施形態
において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の少なくとも1つの操作され
たヌクレアーゼ及び細胞に有益な1つの更なるタンパク質をコードし、切断部位への目的
の外因性配列の挿入効率を改善し、且つ/又は疾患の治療に有益である。
ウイルスベクターと細胞とを接触させることによって細胞に導入される。いくつかの実施
形態において、第1の核酸配列及び第2の核酸配列の両方が、第1の核酸配列及び第2の
核酸配列の両方を含む単一のウイルスベクターと細胞とを接触させることによって導入さ
れる。あるいは、細胞は、第1の核酸配列を含む第1のウイルスベクター及び第2の核酸
配列を含む第2のウイルスベクターと接触させることができる。
いて、第2の核酸は、5’相同アームの5’上流に位置する、又は3’相同アームの3’
下流に位置する第2のプロモータ配列を更に含むことができる。第2のプロモータが3’
相同アームの3’下流に位置する実施形態において、プロモータは逆位であってよい。
を含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターと細胞とを接触させることによって
細胞に導入される。いくつかの実施形態において、第1の核酸配列及び第2の核酸配列の
両方が、第1の核酸配列及び第2の核酸配列の両方を含む単一の組換えAAVと細胞とを
接触させることによって導入される。あるいは、細胞は、第1の核酸配列を含む第1の組
換えAAV及び第2の核酸配列を含む第2の組換えAAVと接触させることができる。
において、第2の核酸は、5’相同アームの5’上流に位置する、又は3’相同アームの
3’下流に位置する第2のプロモータ配列を更に含むことができる。第2のプロモータが
3’相同アームの3’下流に位置する実施形態において、プロモータは逆位であってよい
。
Vベクターである。
有することができる。本方法の特定の実施形態において、組換えAAVベクターは、AA
V2の血清型を有する。本方法の別の特定の実施形態において、組換えAAVベクターは
、AAV6の血清型を有する。
用して細胞に導入される。
する第1の核酸配列はmRNAにより細胞に導入され、外因性ポリヌクレオチドを含む第
2の核酸配列はウイルスベクター、好ましくは組換えAAVベクターを使用して細胞に導
入され、細胞はヒトT細胞であり、目的の配列はキメラ抗原受容体をコードする。このよ
うな実施形態において、この方法は、キメラ抗原受容体を含み、対照細胞と比較したとき
に内因性T細胞受容体の細胞表面発現が低下している遺伝子改変T細胞を作製する。
、組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、組換え転写活性化因子様エフェクタ
ーヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、又はメガTALヌ
クレアーゼである。本方法の特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは組換え
メガヌクレアーゼである。
アルファ定常領域(配列番号1)の残基93~208内の認識配列を認識及び切断する。
このような組換えメガヌクレアーゼは、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含
み、第1のサブユニットは、認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HV
R1)領域を含み、第2のサブユニットは、認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2
の超可変(HVR2)領域を含む。
認識配列)を含む。
配列番号:8~18のいずれか1つの残基198~344又は配列番号19~27のいず
れか1つの残基7~153と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガヌクレアー
ゼサブユニットは、配列番号8~18のいずれか1つの残基7~153又は配列番号19
~27のいずれか1つの残基198~344と少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
のいずれか1つの215位;又は(b)配列番号19~27のいずれか1つの24位に対
応する位置にYを含む。別のこのような実施形態において、HVR1領域は、(a)配列
番号8~18のいずれか1つの233位;又は(b)配列番号19~27のいずれか1つ
の42位に対応する位置にGを含む。別のこのような実施形態において、HVR1領域は
、(a)配列番号8~18のいずれか1つのそれぞれ215位及び233位;又は(b)
配列番号19~27のいずれか1つのそれぞれ24位及び42位に対応する位置に、Y及
びGの1又は複数を含む。
のいずれか1つの26位;又は(b)配列番号19~27のいずれか1つの217位に対
応する位置にTを含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列
番号8~18のいずれか1つの28位;又は(b)配列番号19~27のいずれか1つの
219位に対応する位置にF若しくはYを含む。別のこのような実施形態において、HV
R2領域は、(a)配列番号8~18のいずれか1つの38位;又は(b)配列番号19
~27のいずれか1つの229位に対応する位置にFを含む。別のこのような実施形態に
おいて、HVR2領域は、(a)配列番号8~18のいずれか1つの44位;又は(b)
配列番号19~27のいずれか1つの235位に対応する位置にSを含む。別のこのよう
な実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号8~18のいずれか1つの46位
;又は(b)配列番号19~27のいずれか1つの237位に対応する位置にF若しくは
Yを含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号8~18
のいずれか1つのそれぞれ26、28、38、44、及び46;又は(b)配列番号19
~27のいずれか1つのそれぞれ217、219、229、235、及び237位に対応
する位置に、T、F又はY、F、S及びF又はY及びRの1又は複数を含む。
ずれか1つの残基215~270又は配列番号19~27のいずれか1つの残基24~7
9を含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、配列番号8~18のいず
れか1つの残基24~79又は配列番号19~27のいずれか1つの残基215~270
を含む。
配列番号8~18のいずれか1つの残基198~344又は配列番号19~27のいずれ
か1つの残基7~153を含む。別のこのような実施形態において、第2のメガヌクレア
ーゼサブユニットは、配列番号8~18のいずれか1つの残基7~153又は配列番号1
9~27のいずれか1つの残基198~344を含む。
む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第1のサブユニットと第2のサブユニット
とを共有結合する。
27のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
列)を含む。
列番号28又は29の残基7~153と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくと
も90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガ
ヌクレアーゼサブユニットは、配列番号28又は29の残基198~344と少なくとも
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含む。
24位に対応する位置にYを含む。別のこのような実施形態において、HVR1領域は、
配列番号30又は31の26位に対応する位置にTを含む。別のこのような実施形態にお
いて、HVR1領域は、配列番号28又は29の46位に対応する位置にYを含む。別の
このような実施形態において、HVR1領域は、配列番号28又は29のそれぞれ位置2
4、26、及び46に対応する位置にY、T、及びYの1又は複数を含む。
215位に対応する位置にHを含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は
、配列番号28又は29の266位に対応する位置にTを含む。別のこのような実施形態
において、HVR2領域は、配列番号28又は29の268位に対応する位置にCを含む
。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、配列番号28又は29の215、
266、及び268位に対応する位置にH、T、及びCの1又は複数を含む。
残基24~79を含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、配列番号2
8又は29の残基215~270を含む。
配列番号28又は29の残基7~153を含む。別のこのような実施形態において、第2
のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号28又は29の残基198~344を含む
。
む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第1のサブユニットと第2のサブユニット
とを共有結合する。
又は29のアミノ酸配列を含む。
列)を含む。
列番号30の残基7~153又は配列番号31若しくは32の残基198~344と少な
くとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含み、第2のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番号30
の残基198~344又は配列番号31若しくは32の残基7~153と少なくとも80
%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含む。
4位;又は(b)配列番号31若しくは32の215位に対応する位置にYを含む。
15位;又は(b)配列番号31若しくは32の24位に対応する位置にY若しくはWを
含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号30の231
位;又は(b)配列番号31若しくは32の40位に対応する位置にM、L、若しくはW
を含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号30の23
7位;又は(b)配列番号31若しくは32の46位に対応する位置にYを含む。別のこ
のような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号30のそれぞれ215位、
231位及び237位;又は(b)配列番号31若しくは32のそれぞれ24位、40位
、及び46位に対応する位置に、Y若しくはW、M、L若しくはW及びYの1又は複数を
含む。
~79又は配列番号31若しくは32の残基215~270を含む。別のこのような実施
形態において、HVR2領域は、配列番号30の残基215~270又は配列番号31若
しくは32の残基24~79を含む。
配列番号30の残基7~153又は配列番号31若しくは32の残基198~344を含
む。別のこのような実施形態において、第2のメガヌクレアーゼサブユニットは、配列番
号30の残基198~344又は配列番号31若しくは32の残基7~153を含む。
む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第1のサブユニットと第2のサブユニット
とを共有結合する。
~32のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
療法の方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の遺伝
子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む
。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載の方法に従って作製された遺
伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含
む。
芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、
白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される
。
実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モノクローナル抗体由来の
単鎖可変断片(scFv)の形態であってよく、これらは、特定のエピトープ又は抗原(
例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子等の細胞の表面に優先的存在する
にエピトープ又は抗原)に対する特異性を提供する。scFvはリンカー配列を介して結
合することができる。細胞外リガンド結合ドメインは、任意の目的の抗原又はエピトープ
に特異的であり得る。いくつかの実施形態において、scFvはヒト化することができる
。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Bリンパ球上の自己抗原特異的B細胞受容
体によって認識され得る、従って、抗体媒介性自己免疫疾患において自己反応性Bリンパ
球を特異的に標的として、殺傷するようにT細胞を導く自己抗原を含む(Payneら、
(2016)、Science353(6295):179~184を参照されたい)。
このようなCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と呼ばれ、その使用は本発明に
包含される。
照することにより、より完全に理解することができる。明確にするために、別個の実施形
態の文脈で説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供
されてもよい。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさ
に各組み合わせが個々に且つ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は
、別々に又は任意の適切な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態に列挙された
特徴の全ての部分的組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、まさにこのよ
うな各部分的組み合わせが個々に且つ明示的に本明細書に開示されているかのように本明
細書に開示される。本明細書で開示される本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加
えて本発明の互いの態様に適用される。
配列番号1は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子(NCBI Gene ID
番号28755)のヌクレオチド配列を示す。
を示す。
。
。
。
示す。
示す。
示す。
。
。
。
。
す。
す。
を示す。
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。
。
。
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を示す。
を示す。
。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
62~233を示す。
162~233を示す。
162~233を示す。
162~233を示す。
162~233を示す。
162~233を示す。
ヌクレオチド181~214を示す。
クレオチド配列を示す。
クレオチド配列を示す。
使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。
使用されるプラスミドのヌクレオチド配列を示す。
列を示す。
。
CRアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
CRアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
CRアルファ定常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
酸配列を示す。
酸配列を示す。
酸配列を示す。
本明細書で言及する特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細
書に引用されるGenBankデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可され
た出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的かつ個々に参照により
組み込まれると示されると同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
るものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧且つ完全であ
り、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関し
て図示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して図示
された特徴は、その実施形態から削除することができる。更に、本明細書に示唆された実
施形態に対する多くの変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、こ
れらは本発明から逸脱するものではない。
が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書
における本発明の説明に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのも
のであり、本発明を限定する意図のものではない。
参照により本明細書に組み込まれる。
he)」は、1つ又は複数を意味することができる。例えば、「1つの(a)」細胞は単
一の細胞又は多数の細胞を意味することができる。
「及び/又は」の包括的な意味で使用され、「どちらか/又は」の排他的な意味で使用さ
れるものではない。
本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発明のメガヌクレアー
ゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-CreIに由来するエンド
ヌクレアーゼであり得、例えばDNA結合特異性、DNA切断活性、DNA結合親和性、
又は二量体化特性に関して天然I-CreIと比較して改変されたI-CreIの操作さ
れた変異体を指すことができる。I-CreIのこのような改変された変異体を作製する
ための方法は、当技術分野において公知である(例えば、国際公開第2007/0478
59号パンフレット)。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として
、又は一対のDNA結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単一のポリペプチドに連結
された「単鎖メガヌクレアーゼ」として二本鎖DNAに結合する。用語「ホーミングエン
ドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。本発明のメガヌクレアー
ゼは、細胞、特にヒトT細胞において発現した場合実質的に非毒性であり、従って、本明
細書に記載の方法を用いて測定した場合に、細胞生存率に対する有害効果またはメガヌク
レアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく、細胞にトランスフェクトし、37℃
において維持することができる。
された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアー
ゼは、N末端サブユニット-リンカー-C-末端サブユニットという構成を有する。2つ
のメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではな
いDNA配列を認識する。従って、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、偽パリンドロ
ーム又は非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量
体ではないが、「単鎖ヘテロ二量体」又は「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ば
れることがある。明確にするために、他に特定しない限り、「メガヌクレアーゼ」という
用語は、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは
、天然タンパク質に見出される配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見出されな
い人工配列であってもよい。リンカーは可撓性で二次構造が欠如していてもよく、又は生
理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーとしては
、限定するものではないが、米国特許第8,445,251号に包含されるものを挙げる
ことができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号8~32のいずれか
1つの残基154~195を含むアミノ酸配列を有することができる。
任意の部分に融合された16~22個のTALドメイン反復配列を含むDNA結合ドメイ
ンを含むエンドヌクレアーゼを指す。
ーミングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの任意の触媒活性部分に任意の向き
で融合された16~22個のTALドメイン反復配列を有するDNA結合ドメインを含む
エンドヌクレアーゼを指す。
ノムDNA中の認識部位にハイブリダイズすることによって、カスパーゼのDNA切断を
誘導するガイドRNAとを含む、カスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。
エンドヌクレアーゼを有する活性化因子様エフェクター(TALE)DNA結合ドメイン
を含む単鎖ヌクレアーゼを指す。
ドする核酸及び該タンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子操作技術を適用した結果と
して改変されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、用語「組換え」は
、遺伝子操作技術を適用した結果として改変された核酸配列を有することを意味する。遺
伝子操作技術としては、限定するものではないが、PCR及びDNAクローニング技術;
トランスフェクション、形質転換、及び他の遺伝子移入技術;相同組換え;部位特異的突
然変異誘発;並びに遺伝子融合が挙げられる。この定義に従って、天然に存在するタンパ
ク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現によって産生
されるタンパク質は、組換え体とはみなされない。
る最も一般的な天然に存在する対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド配列)を指し、野生
型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する。用語「野生型
」は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生型対立遺伝子(
即ち、ポリヌクレオチド)及びポリペプチドは、野生型配列に対して1又は複数の突然変
異及び/又は置換を含む突然変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリペプチドとは区別さ
れる。野生型の対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与するこ
とができるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては
、変化した表現型を付与し得る。野生型ヌクレアーゼは、組換え体又は非天然のヌクレア
ーゼとは区別される。
えば、野生型又は天然の配列)と比較した組換え配列におけるアミノ酸残基の任意の挿入
、欠失、又は置換を意味する。
び切断されるDNA配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4つの塩基対に
よって分離された1対の逆位9塩基対「半部位」を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、
タンパク質のN末端ドメインは第1の半部位に接触し、タンパク質のC末端ドメインは第
2の半部位に接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、4塩基対の3’「オーバーハン
グ」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二本鎖DNA配列のエンドヌク
レアーゼ切断によって生成され得る短い一本鎖DNAセグメントである。I-CreIに
由来するメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、22塩
基対認識配列の塩基10~13を含む。コンパクトTALENの場合、認識配列は、I-
TevIドメインによって認識される第1のCNNNGN配列、続いて長さが4~16塩
基対である非特異的スペーサ、続いてTAL-エフェクタードメインによって認識される
長さ16~22bpの第2の配列である(この配列は、典型的には5’T塩基を有する)
。コンパクトTALENによる切断は、2塩基対の3’オーバーハングを生じる。CRI
SPRの場合、認識配列は、典型的には16~24塩基対の配列であり、これにガイドR
NAが結合してCas9切断を誘導する。CRISPRによる切断は平滑末端を生成した
。
識配列を含む、細胞の染色体DNAの領域を指す。
クレアーゼが参照DNA分子(例えば、認識配列又は任意の配列)と非共有結合する傾向
を意味する。結合親和性は、解離定数Kdによって測定される。本明細書中で使用される
場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのKdが、基準ヌクレアーゼと比較して統計的
に有意なパーセント変化で増加または減少される場合、ヌクレアーゼは結合親和性を「変
化」させている。
NA配列を使用して二本鎖DNA切断を修復する天然の細胞プロセスを指す(例えば、C
ahillら、(2006)、Front.Biosci.11:1958~1976)
。相同なDNA配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は外因性核酸であり得る。
NA切断が、2つの非相同DNAセグメントの直接接合によって修復される天然の細胞プ
ロセスを指す(例えば、Cahillら、(2006)、Front.Biosci.1
1:1958~1976を参照されたい)。非相同末端結合によるDNA修復は誤りを起
こしやすく、修復部位でのDNA配列の非鋳型付加又は欠失が頻繁に起こる。いくつかの
例では、標的認識配列における切断は、標的認識部位においてNHEJを生じる。遺伝子
のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断、続いてNHEJによるDNA修復は
、フレームシフト突然変異等の遺伝子機能を破壊する突然変異をコード配列に導入する可
能性がある。従って、細胞集団において遺伝子を効果的にノックアウトするために、操作
されたヌクレアーゼを使用することができる。
細胞(例えば、ヒトT細胞)上に抗原に対する特異性を付与又は移植する操作された受容
体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分、及
びT細胞活性化に必要なシグナルを伝達する1又は複数の刺激ドメインを含む細胞内ドメ
インを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分は、モ
ノクローナル抗体由来の単鎖可変断片(scFv)の形態であってよく、これらは、特定
のエピトープ又は抗原(例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒子の表面に
優先的存在するにエピトープ又は抗原)に対する特異性を提供する。細胞外リガンド結合
ドメインは、任意の目的の抗原又はエピトープに特異的であり得る。特定の実施形態にお
いて、リガンド結合ドメインはCD19に特異的である。
体によって認識され得る、従って、抗体媒介性自己免疫疾患において自己反応性Bリンパ
球を特異的に標的として、殺傷するようにT細胞を導く自己抗原を含む(Payneら、
(2016)、Science 353(6295):179~184を参照されたい)
。このようなCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と呼ばれ、その使用は本発明
に包含される。
原結合後に免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達する1又は複数の細胞質シグナ
ル伝達ドメインを含み得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインは、限定するもので
はないが、CD3-ゼータを含む。細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖性
及び/又は細胞生存シグナルを伝達する1又は複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。
このような細胞内共刺激ドメインとしては、限定するものではないが、CD28ドメイン
、4-1BBドメイン、OX40ドメイン、又はこれらの組み合わせを挙げることができ
る。キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメイン
に結合した膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含むことができる。
を内因性に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトT細胞)のゲ
ノムにその配列が導入されるTCRを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性TCRの発
現は、特定のエピトープ又は抗原(例えば、癌細胞又は他の疾患を引き起こす細胞又は粒
子の表面に優先的に存在するエピトープ又は抗原)に対する特異性を付与することができ
る。このような外因性T細胞受容体は、アルファ及びベータ鎖を含むことができ、又はガ
ンマ及びデルタ鎖を含むことができる。本発明において有用な外因性TCRは、任意の抗
原又は目的のエピトープに対して特異性を有し得る。
変細胞の細胞表面における内因性T細胞受容体の発現の任意の低下を指す。低下という用
語はまた、対照細胞の集団と比較した場合、細胞表面で内因性ポリペプチド(即ち、内因
性T細胞受容体)を発現する、細胞集団中の細胞のパーセンテージの低下を指すことがで
きる。このような低下は、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、7
0%、80%、90%、95%まで、又は最大100%であり得る。従って、用語「低下
」は、内因性T細胞受容体の部分ノックダウン及び完全ノックダウンの両方を包含する。
ーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセンテージ」、「配列類似性」等は、アライ
メントしたアミノ酸残基又はヌクレオチドの間の類似性を最大にする、同一又は類似の残
基又はヌクレオチドの数、総残基又はヌクレオチドの数及び配列アライメント中のギャッ
プの存在及び長さの関数である、配列のアライメントに基づく2つの配列の類似性の程度
の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴ
リズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書中で使用される場合、配
列類似性は、アミノ酸配列についてはBLASTpプログラム及び核酸配列についてはB
LASTnプログラムを使用して測定され、これらは両方ともNational Cen
ter for Biotechnology Information(www.nc
bi.nlm.nih.gov/)を介して利用可能であり、例えば、Altschul
ら、(1990)、J.Mol.Biol.215:403~410;Gish及びSt
ates(1993)、Nature Genet.3:266~272;Madden
ら、(1996)、Meth.Enzymol.266:131~141;Altsch
ulら、(1997)、Nucleic Acids Res.25:3389~340
2);Zhangら、(2000)、J.Comput.Biol.7(1-2):20
3~14に記載されている。本明細書中で使用される場合、2つのアミノ酸配列の類似性
パーセントは、BLASTpアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアで
ある:ワードサイズ=3;ギャップ開始ペナルティ=-11;ギャップ伸長ペナルティ=
-1;及びスコア行列=BLOSUM62。本明細書中で使用される場合、2つの核酸配
列の類似性パーセントは、BLASTnアルゴリズムについての以下のパラメータに基づ
くスコアである:ワードサイズ=11;ギャップ開始ペナルティ=-5;ギャップ伸長ペ
ナルティ=-2;マッチ報酬=1;ミスマッチペナルティ=-3。
タンパク質における特定の改変が第2のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置
換であり、2つのタンパク質が標準配列アラインメント(例えば、BLASTpプログラ
ムを用いて)に供される場合に、第1のタンパク質における改変のアミノ酸位が、第2の
タンパク質における改変のアミノ酸位に対応するか、又は整列することを示すために「対
応する」という用語が使用される。従って、残基X及びYが配列アライメントにおいて互
いに対応する場合、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、
第2のタンパク質における残基「Y」のアミノ酸「A」への改変に対応し、X及びYが実
際には異なる数であってもよい。
部位」は、ホモ二量体又はヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって、あるいは単
鎖メガヌクレアーゼの1つのサブユニットによって認識される、二本鎖DNA分子中の核
酸配列を意味する。
ノ酸を含むメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニット内の局在化配列を指す。超可変領域
は、約50~60個の連続残基、約53~57個の連続残基、又は好ましくは約56個の
残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、超可変領域の残基は、配列番号
8~32のいずれか1つの24~79位又は215~270位に対応し得る。超可変領域
は、認識配列中のDNA塩基と接触する1又は複数の残基を含むことができ、単量体又は
サブユニットの塩基選択を変更するように改変することができる。超可変領域はまた、メ
ガヌクレアーゼが二本鎖DNA認識配列と結合する場合、DNA骨格に結合する1又は複
数の残基を含むことができる。このような残基は、DNA骨格及び標的認識配列に対する
メガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本発明の異な
る実施形態において、超可変領域は、可変性を示す1~20の間の残基を含むことができ
、塩基選択及び/又はDNA結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。特
定の実施形態において、超可変領域は、可変性を示す約15~18の間の残基を含み、塩
基選択及び/又はDNA結合親和性に影響を及ぼすように修飾することができる。いくつ
かの実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号8~32のいずれか1つの
24、26、28、29、30、32、33、38、40、42、44、46、66、6
8、70、72、73、75、及び77位の1又は複数に対応する。他の実施形態におい
て、超可変領域内の可変残基は、配列番号8~32のいずれか1つの215、217、2
19、221、223、224、229、231、233、235、237、248、2
57、259、261、263、264、266、及び268位の1又は複数に対応する
。
Rアルファ定常領域遺伝子」は互換的に使用され、NCBI GenID NO.287
55(配列番号1)によって同定されるヒト遺伝子を指す。
、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えDNA断片」は、本明細書において互換
的に使用され、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、限定するも
のではないが、天然に一緒には見出されない調節及びコード配列を含む、一本鎖又は二本
鎖ポリヌクレオチドの人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えDNA構築物は、異な
る供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見出され
るものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。このような構築
物は、単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用してもよい。
宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列
を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知
の宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、限定す
るものではないが、プラスミドベクター及び組換えAAVベクター、又は本発明のメガヌ
クレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するために適切な当技術分野で公知の任
意の他のベクターを挙げることができる。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又
は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために
、ベクター上に存在しなければならない遺伝的要素を十分に認識している。
。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、レン
チウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AA
V)を挙げることができる。
(即ち、シストロン)を含み、2つ以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジャー
RNAを指す。ポリシストロニックmRNAは、限定するものではないが、IRES要素
、T2A要素、P2A要素、E2A要素、及びF2A要素を含む、同じmRNA分子由来
の2つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含むこ
とができる。
されたT細胞を指す。ヒトT細胞及びそれに由来する細胞には、継代培養されていない単
離されたT細胞、不死化のない細胞培養条件下で継代及び維持されたT細胞、並びに不死
化され、細胞培養下で無期限に維持され得るT細胞が含まれる。
は表現型における変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例え
ば:(a)野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じた遺伝子改変のための出発物質と同
じ遺伝子型の細胞;(b)遺伝子改変された細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構
築物で形質転換された(即ち、目的の形質に対して公知の効果を有さない構築物を有する
)細胞;(c)遺伝子改変された細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表
現型の発現を誘導する条件又は刺激、あるいは更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含む
ことができる。
ずれかに等しい変数で実施され得ることを伝える意図のものである。従って、本質的に離
散的な変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくな
り得る。同様に、本質的に連続する変数の場合、この変数は、範囲の終点を含む数値範囲
内の任意の実数値と等しくなり得る。一例として、限定するものではないが、0から2の
間の値を有すると記載された変数は、変数が本質的に離散的である場合、0、1、又は2
の値を取ることができ、変数が本質的に連続的である場合、0.0、0.1、0.01、
0.001、又はであれば、≧0且つ≦2の任意の他の実数値を取ることができる。
本発明は、切断部位におけるNHEJが、TCRアルファ鎖サブユニットの発現及び最
終的に細胞表面でのT細胞受容体の発現を破壊するように、操作されたヌクレアーゼを、
ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子(配列番号1)に見出される認識配列の認識及び切断
に利用できるという発見に部分的に基づいている。更に、本発明によれば、外因性ポリヌ
クレオチド配列は、例えば相同組換えによって、目的の配列が細胞内で同時に発現される
ようにヌクレアーゼ切断部位においてTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される。この
ような外因性配列は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性TCR受容体、又は任意の他の
目的のポリペプチドをコードすることができる。
により、内因性T細胞受容体のノックアウトと外因性核酸配列(例えば、キメラ抗原受容
体又は外因性TCR)の発現との両方を可能にする。キメラ抗原受容体をコードする配列
がTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される特定の実施形態において、本発明は、抗原
特異的CARを発現し、内因性TCRの発現を低下又は完全にノックアウトさせる同種異
系T細胞を作製する単純化された方法を提供する。このような細胞は、同種異系の対象に
投与された場合、移植片対宿主病(GVHD)の誘導の減少を示し得るか、又は誘導し得
ない。
クレアーゼ
生存細胞のゲノム中でDNA切断を行うために部位特異的ヌクレアーゼを使用すること
が可能であり、このようなDNA切断は突然変異誘発性NHEJ修復を介して、又はトラ
ンスジェニックDNA配列との相同組換えを介してゲノムの永続的改変をもたらし得るこ
とが、当技術分野では公知である。NHEJは切断部位で突然変異誘発を生じ、対立遺伝
子の不活性化を引き起こす。NHEJ関連突然変異誘発は、初期停止コドンの生成、異常
な非機能性タンパク質を生成するフレームシフト突然変異、を介して対立遺伝子を不活性
化する可能性があり、あるいはナンセンス変異依存mRNA分解等の機序を引き起こす可
能性がある。NHEJを介した突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、特定の突
然変異又は野生型対立遺伝子中に存在する配列を標的化するために使用することができる
。標的遺伝子座における二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム
標的と相同である配列に隣接するトランスジェニックDNA配列の相同組換えを刺激する
ことが公知である。このようにして、外因性核酸配列を標的座に挿入することができる。
このような外因性核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性TCR、又は目的の任意の
配列若しくはポリペプチドをコードすることができる。
ある。一実施形態において、本発明は組換えメガヌクレアーゼを使用して実施することが
できる。別の実施形態において、本発明は、CRISPRヌクレアーゼ又はCRISPR
Nickaseを用いて実施することができる。所定のDNA部位を認識するCRIS
PR及びCRISPR Nickaseを生成するための方法予は、当技術分野で公知で
あり、例えば、Ran、ら、(2013)Nat Protoc.8:2281~308
を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、TALEN又はコンパクトTALE
Nを使用して実施することができる。所定のDNA部位に結合するTALEドメインを作
製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Reyonら、(2012)N
at Biotechnol.30:460~5を参照されたい。更なる実施形態におい
て、本発明はメガTALを使用して実施することができる。
メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、N末端サブユニット及びリンカーペ
プチドによって連結されたC末端サブユニットを含む。2つのドメインのそれぞれは、認
識配列の半分(即ち、認識半部位)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユニット
の接合点付近の認識配列の中央にある。DNA鎖切断は、メガヌクレアーゼによるDNA
切断が4塩基対の3’一本鎖オーバーハングの対を生成するように、4塩基対によって相
殺される。
列(配列番号3)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌク
レアーゼは、本明細書では総称して「TRC1-2メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示
的なTRC1-2メガヌクレアーゼは、配列番号8~27で提供される。
配列番号4)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレア
ーゼは、本明細書では総称して「TRC3-4メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的な
TRC3-4メガヌクレアーゼは、配列番号28及び29で提供される。
配列番号5)を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレア
ーゼは、本明細書では総称して「TRC7-8メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的な
TRC7-8メガヌクレアーゼは、配列番号30~32で提供される。
サブユニットと、第2の超可変領域(HVR2)を含む第2のサブユニットとを含む。更
に、第1のサブユニットは、認識配列の第1の認識半部位(例えばTRC1、TRC3、
又はTRC7半部位)に結合し、第2のサブユニットは、認識配列の第2の認識半部位(
例えば、TRC2、TRC4、又はTRC8半部位)に結合する。組換えメガヌクレアー
ゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、HVR1領域を含み、第1の半部位
に結合する第1のサブユニットがN末端サブユニットとして配置され、HVR2領域を含
み、第2の半分部位に結合する第2のサブユニットがC末端サブユニットとして配置され
るように第1及び第2のサブユニットを配向させることができる。別の実施形態において
、HVR1領域を含み、第1の半部位に結合する第1のサブユニットがC末端サブユニッ
トとして配置され、HVR2領域を含み、第2の半分部位に結合する第2のサブユニット
がN末端サブユニットとして配置されるように第1及び第2のサブユニットを配向させる
ことができる。本発明の例示的なTRC1-2メガヌクレアーゼを表1に示す。本発明の
例示的なTRC3-4メガヌクレアーゼを表2に示す。本発明の例示的なTRC7-8メ
ガヌクレアーゼを表3に示す。
クレアーゼのTRC1結合及びTRC2結合サブユニット領域と、TRC1-2x.87
EEメガヌクレアーゼのTRC1結合及びTRC2結合サブユニット領域との間のアミノ
酸配列同一性を表す。
クレアーゼのTRC3結合及びTRC4結合サブユニット領域と、TRC3-4x.3メ
ガヌクレアーゼのTRC3結合及びTRC4結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列
同一性を表す。
クレアーゼのTRC7結合及びTRC8結合サブユニット領域と、TRC7-8x.7メ
ガヌクレアーゼのTRC7結合及びTRC8結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列
同一性を表す。
本発明は、ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子(配列番号1)内に見
出される認識配列を認識及び切断する操作されたヌクレアーゼを使用して、遺伝子改変細
胞を作製する方法を提供する。このような認識配列における切断は、切断部位におけるN
HEJを可能にし、ヒトT細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊し、細胞表面
でのT細胞受容体の発現及び/又はまたは機能の低下をもたらす。更に、このような認識
配列における切断は、外因性核酸配列のTCRアルファ定常領域遺伝子への直接相同組換
えを更に可能にすることができる。
たヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。このような核酸は、DNA
(例えば、環状または線形化プラスミドDNA又はPCR産物)又はRNAであり得る。
操作されたヌクレアーゼコード配列がDNA形態で送達される実施形態に関しては、メガ
ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに動作可能に連結されなければな
らない。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期(CMV)
プロモータ(Thomsenら、(1984)、Proc Natl Acad Sci
USA.81(3):659~63)又はSV40初期プロモータ(Benoist及
びChambon(1981)、Nature.290(5804):304~10)等
の構成的プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導性プロモータ(Dingermann
ら、(1992)、Mol Cell Biol.12(9):4038~45)等の誘
導性プロモータが挙げられる。
されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低減する
ため、細胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするこのようなmRNAは、
インビトロ転写のような当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。いく
つかの実施形態において、mRNAは、7-メチル-グアノシンを用いてキャップされる
。いくつかの実施形態において、mRNAはポリアデニル化されていてもよい。
細胞内で同時に発現される2つ以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmR
NAであり得る。ポリシストロニックmRNAは、同じ標的遺伝子中の異なる認識配列を
標的とする、本発明の2つ以上のヌクレアーゼをコードすることができる。あるいは、ポ
リシストロニックmRNAは、本明細書に記載の少なくとも1つのヌクレアーゼと、同じ
遺伝子に位置する別個の認識配列を標的とするか、又は切断部位が両方の遺伝子において
生成されるように第2の遺伝子に位置する第2の認識配列を標的とする少なくとも1つの
更なるヌクレアーゼとをコードすることができる。ポリシストロニックmRNAは、限定
するものではないが、IRES要素、T2A要素、P2A要素、E2A要素、及びF2A
要素を含む、同じmRNA分子由来の2つ以上の遺伝子(即ち、シストロン)の翻訳を可
能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含むことができる。
き、このことにより、当技術分野で公知の様々な異なる機序によって、目的の配列を有す
る切断部位での相同組換え又は非相同末端結合が可能になる。
レアーゼをコードするDNA/mRNAは、細胞透過性ペプチド又は標的リガンドに結合
され、細胞取り込みを促進する。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、
ポリ-アルギニン(Jearawiriyapaisarnら、(2008)Mol T
her.16:1624~9)、HIVウイルス由来のTATペプチド(Hudeczら
、(2005)、Med.Res.Rev.25:679~736)、MPG(Sime
oniら、(2003)Nucleic Acids Res.31:2717~272
4)、Pep-1(Deshayesら、(2004)Biochemistry43:
7698~7706)、及びHSV-1 VP-22(Deshayesら、(2005
)Cell Mol Life Sci.62:1839~49)が挙げられる。別の実
施形態において、操作されたヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼをコードするD
NA/mRNAは、該ヌクレアーゼタンパク質/DNA/mRNAが標的細胞に結合し、
それによって内在化されるように、標的細胞上に発現される特異的細胞表面受容体を認識
する抗体に共有結合又は非共有結合される。あるいは、操作されたヌクレアーゼタンパク
質/DNA/mRNAは、このような細胞表面受容体に対する天然リガンド(又は天然リ
ガンドの一部)に共有結合又は非共有結合され得る。(McCallら、(2014)T
issue Barriers.2(4):e944449;Dindaら、(2013
)Curr Pharm Biotechnol.14:1264~74;Kangら、
(2014)Curr Pharm Biotechnol.15(3):220~30
;Qianら、(2014)Expert Opin Drug Metab Toxi
col.10(11):1491~508)。
レアーゼをコードするDNA/mRNAは、当技術分野で公知の方法を使用して、ナノ粒
子に共有結合、若しくは好ましくは非共有結合されるか、又はこのようなナノ粒子内に封
入される(Sharmaら(2014)Biomed Res Int.2014)。ナ
ノ粒子は、その長さスケールが<1μm、好ましくは<100nmであるナノスケール送
達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子から
なるコアを使用して設計することができ、組換えメガヌクレアーゼタンパク質、mRNA
又はDNAの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これは、各
細胞に送達されるタンパク質/mRNA/DNAのコピー数を増加させ、従って、個々の
操作されたヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を
最大にする。このようなナノ粒子の表面を、ポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチ
オン性ポリマー、又はカチオン性脂質)で更に改変して、その表面が追加の官能性を付与
するコア-シェルナノ粒子を形成し、細胞送達及びペイロードの取り込みを増強すること
ができる(Jianら、(2012)Biomaterials.33(30):762
1~30)。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に導き、及び/又は細胞取り込みの可
能性を高めるために、標的化分子に更に結合されることが有利であり得る。このような標
的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に対する天然
リガンド(又は天然リガンドの一部)が挙げられる。
レアーゼをコードするDNA/mRNAは、カチオン性脂質を使用してリポソーム内に封
入又は複合体化される(例えば、Lipofectamine(商標)、Life Te
chnologies Corp.、Carlsbad、CA;Zurisら、(201
5)Nat Biotechnol. 33:73~80;Mishraら、(2011
)J Drug Deliv.2011:863734を参照されたい)。リポソーム及
びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び/又
は破壊によって細胞の取り込みおよび送達効率を促進することができる。
レアーゼをコードするDNA/mRNAは、ポリマー足場(例えばPLGA)内に封入さ
れるか、又はカチオン性ポリマー(例えばPEI、PLL)を使用して複合体化される(
Tamboliら、(2011)Ther Deliv.2(4):523~536)。
クレアーゼをコードするDNA/mRNAは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み
合わされる(Tongら、(2007).J Gene Med。9(11):956~
66)。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的
相互作用を減少させることができる親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)
で形成されたミセルシェルを含み得る。
クレアーゼをコードするDNA/mRNAは、細胞への送達のために、エマルジョン又は
ナノエマルジョン(即ち、平均粒径<1nmを有する)内に製剤化される。用語「エマル
ジョン」は、限定するものではないが、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は
油中水中油型の分散液又は液滴を指し、水不混和相が水相と混合されると、無極性残基(
例えば、長い炭化水素鎖)を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として
形成され得る脂質構造を含む。これらの他の脂質構造としては、限定するものではないが
、単層、少重層、及び多重層の脂質小胞、ミセル並びにラメラ相が挙げられる。エマルジ
ョンは、水相及び親油性相(典型的には油及び有機溶媒を含む)からなる。エマルジョン
はまた、しばしば、1又は複数の界面活性剤を含有する。ナノエマルジョン製剤は周知で
あり、例えば、米国特許出願第2002/0045667号及び第2004/00430
41号、並びに米国特許第6,015,832号、第6,506,803号、第6,63
5,676号、及び第6,559,189号の明細書に記載されており、これらはそれぞ
れ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
クレアーゼをコードするDNA/mRNAは、多官能性ポリマーコンジュゲート、DNA
デンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合又は非共有結合される(Masto
rakosら、(2015)Nanoscale.7(9):3845~56;Chen
gら、(2008)J Pharm Sci.97(1):123~43)。デンドリマ
ーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量を
提供することができる。更に、複数の表面基の表示を活用して、安定性を改善し、非特異
的な相互作用を低減することができる。
スベクターを使用して細胞に導入される。このようなベクターは当技術分野で公知であり
、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV
)ベクターが挙げられる(Vannucciら、(2013 New Microbio
l.36:1~22)に概説されている)。本発明に有用な組換えAAVベクターは、細
胞へのウイルスの形質導入及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任
意の血清型を有することができる。特定の実施形態において、組換えAAVベクターは、
AAV2又はAAV6の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、それらが宿主細
胞において第2鎖DNA合成を必要としないように自己相補的であり得る(McCart
yら、(2001)Gene Ther.8:1248~54)。
ルスベクター(例えばAAV)を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能
に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター
(例えば、レンチウイルスベクターのLTR)由来の内因性プロモータ又は周知のサイト
メガロウイルス若しくはSV40ウイルスの初期プロモータ等のウイルスプロモータであ
り得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞(例えば、ヒトT
細胞)において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに動作可能に連結される。
子に挿入されるように、外因性核酸の細胞への導入を提供する。いくつかの実施形態にお
いて、外因性核酸は、5’相同アーム及び3’相同アームを含み、ヌクレアーゼ切断部位
における核酸配列の細胞ゲノムへの組換えを促進する。
きる。特定の実施形態において、外因性核酸は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデ
ノウイルス等のウイルスベクター、又は好ましくは組換えAAVベクターを用いて導入さ
れる。外因性核酸を導入するために有用な組換えAAVベクターは、細胞へのウイルスの
形質導入及び外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有するこ
とができる。特定の実施形態において、組換えAAVベクターは、AAV2又はAAV6
の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、それらが宿主細胞において第2鎖DN
A合成を必要としないように自己相補的であり得る。
入することができる。一本鎖DNAは、外因性核酸を含むことができ、好ましい実施形態
において、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するため
に5’及び3’相同アームを含むことができる。一本鎖DNAは、5’相同アームの5’
上流に5’AAV逆位末端反復(ITR)配列を、3’相同アームの3’下流に3’AA
V ITR配列を更に含むことができる。
核酸配列をコードする遺伝子は、線形化DNA鋳型のトランスフェクションによって細胞
に導入することができる。いくつかの実施例において、エンドヌクレアーゼ及び/又は外
因性核酸配列をコードするプラスミドDNAは、環状プラスミドDNAが細胞へのトラン
スフェクションの前に線形化されるように、1又は複数種の制限酵素によって消化するこ
とができる。
ドの発現に適した、先に述べた哺乳動物プロモータ及び誘導性プロモータを含む任意のプ
ロモータに動作可能に連結することができる。本発明の外因性核酸は、合成プロモータに
動作可能に連結されていてもよい。合成プロモータとしては、限定するものではないが、
JeTプロモータ(国際公開第2002/012514号パンフレット)を挙げることが
できる。
このような細胞は、メガヌクレアーゼ及び/又は外因性核酸配列の導入前に活性化を必要
とし得る。例えば、T細胞は、可溶性の、又は支持体(即ち、ビーズ)とコンジュゲート
した抗CD3及び抗CD28抗体と、細胞を活性化するのに十分な時間接触させることが
できる。
改変することができ、その誘導により細胞死を引き起こし、インビトロ又はインビボの細
胞の選択的破壊を可能にする。いくつかの例では、自殺遺伝子は、細胞傷害性ポリペプチ
ド、非毒性プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する能力を有するポリペプチド、及び/
又は細胞内の細胞傷害性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードすることができる
。即ち、自殺遺伝子は、単独又は他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす生成物をコー
ドする核酸である。このような自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジン
キナーゼをコードするものである。更なる例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナー
ゼをコードする遺伝子及び5-フルオロシトシンを毒性の高い化合物5-フルオロウラシ
ルに変換することができるシトシンデアミナーゼの細菌遺伝子である。自殺遺伝子として
は更に、非限定的な例として、カスパーゼ-9、カスパーゼ-8、又はシトシンデアミナ
ーゼをコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの例において、カスパーゼ-9は、二量
化(CID)の特定の化学誘導剤を用いて活性化することができる。自殺遺伝子はまた、
細胞を治療用及び/又は細胞傷害性のモノクローナル抗体に感受性にする、細胞の表面で
発現されるポリペプチドをコードすることもできる。更なる例において、自殺遺伝子は、
抗CD20 mAbであるリツキシマブによって認識される抗原性モチーフ及び自殺遺伝
子を発現する細胞の選択を可能にするエピトープを含む組換え抗原性ポリペプチドをコー
ドすることができる。例えば、2つのリツキシマブ結合エピトープ及びQBEnd10結
合エピトープを含む、国際公開第2013153391号パンフレットに記載のRQR8
ポリペプチドを参照されたい。このような遺伝子について、リツキシマブを必要に応じて
対象に投与して、細胞枯渇を誘導することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子改変細胞、又は本発明の遺伝
子改変細胞の集団及び医薬担体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、
公知の技術に従って調製することができる。例えば、Remington、The Sc
ience and Practice of Pharmacy(第21版、2005
年)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、細胞は、典型的には、医薬
として許容される担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。当然のことなが
ら、担体は製剤中の他の成分と適合するという意味において許容可能でなければならず、
対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、
対象の疾患の治療に有用な1又は複数の更なる薬剤を更に含むことができる。遺伝子改変
細胞が遺伝子改変ヒトT細胞(又はそれに由来する細胞)である更なる実施形態において
、本発明の医薬組成物は、インビボでの細胞増殖及び生着を促進する、サイトカイン(例
えば、IL-2、IL-7、IL-15、及び/又はIL-21)等の生体分子を更に含
むことができる。本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤又は生物学的
分子と同じ組成物で投与することができ、あるいは、別々の組成物で同時投与することが
できる。
治療するために有用であり得る。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は癌の治
療に有用である。このような癌としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、肉
腫、芽腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ
、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫が
挙げられる。特定の実施形態において、B細胞起源の癌としては、限定するものではない
が、B系列急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキ
ンリンパ腫が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法において使用するための組換え
AAVベクターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293のよ
うな哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスのcap遺伝子及びrep遺伝子は、
その自己複製を防止して、治療遺伝子(例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達する
余地を作り出すためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にト
ランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(
例えば、アデノウイルス)成分を提供することが必要である(Cots D、Bosch
A、Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):3
70~81)。しばしば、組換えAAVベクターは、細胞株に、「ヘルパー」成分をコー
ドする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイ
ルスにパッケージングされる介在DNA配列含むウイルス性ITRを含む第3のプラスミ
ドをトランスフェクトする三重トランスフェクションを使用して作製される。カプシドに
包まれたゲノム(目的のITR及び1又は複数の介在遺伝子)を含むウイルス粒子は、そ
の後、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段に
よって細胞から単離される。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニ
ティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて、目的の(1又は複数の)遺伝子に
、細胞、組織、又はヒト患者等の生物に送達する。
エンドヌクレアーゼがパッケージング細胞中で確実に発現されないようにするために、本
発明の実施において予防措置を講じる必要がある。本発明のウイルスゲノムは、エンドヌ
クレアーゼに対する認識配列を含むので、パッケージング細胞株において発現される任意
のエンドヌクレアーゼは、ウイルスゲノムがウイルス粒子にパッケージングされる前にこ
れを切断することができる。これは、パッケージング効率の低下及び/又は断片化したゲ
ノムのパッケージングを生じる。以下を含むいくつかのアプローチを使用して、パッケー
ジング細胞におけるエンドヌクレアーゼ発現を防止することができる:
モータの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織への(1又は複数の)エンドヌク
レアーゼ遺伝子の送達のためにウイルスベクターが開発された場合、筋肉特異的プロモー
タを使用することができる。筋特異的プロモータの例としては、C5-12(Liuら、
(2004)Hum Gene Ther.15:783~92)、筋特異的クレアチン
キナーゼ(MCK)プロモータ(Yuasaら、(2002)Gene Ther.9:
1576~88)、又は平滑筋22(SM22)プロモータ(Haaseら、(2013
)BMC Biotechnol.13:49~54)が挙げられる。CNS(ニューロ
ン)特異的プロモータの例としては、NSE、シナプシン、及びMeCP2プロモータ(
Lentzら、(2012)Neurobiol Dis.48:179~88)が挙げ
られる。肝特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ(Palb等)、ヒト
α1-抗トリプシン(Pa1AT等)、及びヘモペキシン(Phpx等)(Kramer
、MGら、(2003)Mol.Therapy 7:375~85)が挙げられる。眼
特異的プロモータの例としては、オプシン、及び角膜上皮特異的K12プロモータ(Ma
rtin KRG、Klein RL及びQuigley HA(2002)Metho
ds(28):267~75)(Tong Yら、(2007)J Gene Med,
9::956~66)が挙げられる。これらのプロモータ又は当技術分野で公知の他の組
織特異的プロモータは、HEK-293細胞において高度に活性ではなく、従って、本発
明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意なレベルの
エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは期待されない。同様に、本発明のウイルス
ベクターは、他の細胞株の使用及び不適合性組織特異的プロモータの使用(即ち、周知の
HeLa細胞株(ヒト上皮細胞)及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用)を企図
している。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫PDZD4(小脳)、C6
(肝臓)、ASB5(筋肉)、PPP1R12B(心臓)、SLC5A12(腎臓)、コ
レステロール調節APOM(肝臓)、ADPRHL1(心臓)、及び一遺伝子性奇形症候
群TP73L(筋肉)が挙げられる。(Jacox Eら、(2010)PLoS On
e v.5(8):e12274)。
にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳類パッケージング
細胞において活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はSV40ウイルスの初期プ
ロモータ等の哺乳動物プロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞中で産生され得
る。好ましい実施形態において、ウイルス粒子は、Gaoらが記載したバキュロウイルス
系を使用して昆虫細胞中で産生される(Gao,H.ら、(2007)J.Biotec
hnol.131(2):138~43)。哺乳動物プロモータの制御下にあるエンドヌ
クレアーゼは、これらの細胞で発現する可能性は低い(Airenne,KJら、(20
13)Mol.Ther.21(4):739~49)。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細
胞とは異なるmRNAスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン(
HGH)イントロン又はSV40ラージT抗原イントロン等の哺乳動物イントロンを、エ
ンドヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫
細胞のプレmRNA転写産物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能
的エンドヌクレアーゼを発現せず、完全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得ら
れた組換えAAV粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレmRNAを適切にスプライシン
グし、機能的エンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Haifeng Chenは、
昆虫パッケージング細胞中における毒性タンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素断片A
の発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を有する組換えAAVベクターの産生を可能にす
るためのHGH及びSV40ラージT抗原イントロンの使用を報告している(Chen,
H(2012)Mol Ther Nucleic Acids.1(11):e57)
。
必要とされるように、誘導プロモータに動作可能に連結することができる。誘導性プロモ
ータの例としては、Tet-Onシステム(Clontech;Chen H.ら、(2
015)BMC Biotechnol.15(1):4))及びRheoSwitch
システム(Intrexon;Sowa G.ら、(2011)Spine、36(10
):E623~8)が挙げられる。両方のシステム並びに当技術分野で公知の類似のシス
テムは、小分子活性化因子(それぞれドキシサイクリン又はエクジソン)に応答して転写
を活性化するリガンド誘導性転写因子(それぞれTetリプレッサー及びエクジソン受容
体の変種)に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を使用する本発明の実
施は、1)転写因子に対する(1又は複数の)結合部位を有するエンドヌクレアーゼ遺伝
子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くこと、並びに2)パッケー
ジングされたウイルスゲノム中の転写因子をコードする遺伝子を含むこと、を含む。後者
の工程は、転写活性化因子が同じ細胞に供給されない場合、組換えAAV送達後に標的の
細胞又は組織においてエンドヌクレアーゼが発現されないので、必要である。次いで、転
写活性因子は、同族小分子活性化因子で処理された細胞又は組織においてのみ、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつ、及びどの
組織に送達されるかを選択することによって、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間-時
間的様式で調節することができるので、有利である。しかし、担持能力が著しく制限され
たウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、このアプローチに欠点を生じさせる。
を妨げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株において産生される。転写リプレッ
サーは当技術分野において公知であり、Tet-リプレッサー、Lac-リプレッサー、
Croリプレッサー、及びLambdaリプレッサーが挙げられる。エクジソン受容体等
の多くの核内ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの不在下で転写リプレッ
サーとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッ
サーをコードするベクターをトランスフェクト/形質導入され、ウイルスゲノム中のエン
ドヌクレアーゼ遺伝子(パッケージングベクター)は、リプレッサーがプロモータをサイ
レンシングするように、リプレッサーに対する結合部位を含むように改変されたプロモー
タに動作可能に連結される。転写リプレッサーをコードする遺伝子は、種々の位置に置く
ことができる。前記遺伝子は、別のベクターにコード化することができ、ITR配列の外
側のパッケージングベクターに組み込むことができ、cap/repベクター又はアデノ
ウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ、又は最も好ましくは、それが構成的に
発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。転写リプ
レッサー部位を取り込むために一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分
野で公知である。例えばChangおよびRoninsonは強力な構成的CMV及びR
SVプロモータを、Lacリプレッサーのオペレーターを含むように改変し、改変プロモ
ータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞において大きく減弱したことを示し
た(Chang BD及びRoninson IB(1996)Gene 183:13
7~42)。非ヒト転写リプレッサーの使用は、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リ
プレッサーを発現するパッケージング細胞でのみ抑制され、得られる組換えAAVベクタ
ーを形質導入された標的の細胞又は組織では抑制されないことを確実にする。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、特に組換えメガヌク
レアーゼ、及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載の組
換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド及びこのような
ポリヌクレオチドの改変体を包含する。
である。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の1又は複数の内部部位における1
又は複数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び/又は天然ポリペプチドの1又は複数の
部位における1又は複数個のアミノ酸の置換により、「天然の」ポリペプチドから導かれ
たポリペプチドを意味する意図のものである。本明細書で使用される場合、「天然の」ポ
リヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によって
包含される変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、それらは天然タンパク質
の所望の生物学的活性;即ち、例えばTRC1-2認識配列(配列番号3)、TRC3-
4認識(配列番号4)、及びTRC7-8認識配列(配列番号5)を含むヒトT細胞受容
体アルファ定常領域(配列番号1)に見出される認識配列を認識及び切断する能力を保有
し続けている。このような変異体は、例えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然ポ
リペプチド(例えば、配列番号8~32)の生物学的に活性な変異体、又は本明細書に記
載の認識半部位結合サブユニット(例えば、配列番号33~82)の生物学的に活性な変
異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメ
ータによる決定で、天然ポリペプチドまたは天然サブユニットと約40%、約45%、約
50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約
90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約
98%、又は約99%の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニット
の生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと、わずか約1~40
個のアミノ酸残基、わずか約1~20個、わずか約1~10個、わずか約5個、わずか4
、3、2個、又は更には1個のアミノ酸残基が異なり得る。
で改変することができる。このような操作のための方法は、当技術分野において一般的に
知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、DNA中の突然変異によって調製するこ
とができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野におい
て周知である。例えば、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 82:488~492;Kunkelら、(1987)Methods i
n Enzymol.154:367~382;米国特許第4,873,192号明細書
;Walker及びGaastra編、(1983)Techniques in Mo
lecular Biology(MacMillan Publishing Com
pany、New York)及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的
のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンス
は、Dayhoffら、(1978)Atlas of Protein Sequen
ce and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.、
Washington,D.C.)のモデルに見出すことができ、当該文献は参照により
本明細書に組み込まれる。1つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と交換する
等の保存的置換が最適であり得る。
質的な数が以前に同定されており(例えば、米国特許第8,021,867号明細書)、
これを、単独で又は組み合わせることにより、得られた合理的に設計されたメガヌクレア
ーゼが、野生型酵素とは異なる半部位特異性を有するように、DNA認識配列半部位内の
個別の塩基において特異性が改変された組換えメガヌクレアーゼがもたらされる。表4は
、認識半部位の各半部位位置(-1から-9)に存在する塩基に基づいて特異性を高める
ために組換えメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニットにおいてなされ得る有望な置換を
提供する。
位に1又は複数のヌクレオチドの欠失及び/又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸
の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識す
るであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重のために、
実施形態のポリペプチドの1つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリ
ヌクレオチドは、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、
実施形態の組換えメガヌクレアーゼを依然としてコードするような、合成的に誘導された
ポリヌクレオチドを含む。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明
細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによる決
定で、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約40%、約45%、約50%、約55
%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91
%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99
%、又はそれ以上の配列同一性を有すると思われる。実施形態の特定のポリヌクレオチド
(即ち、参照ポリヌクレオチド)の変異体は、変異ポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列
同一性のパーセントを比較することによって評価することもできる。
において根本的な変化を生じることは期待されない。しかし、その実施に先立って、置換
、欠失、又は挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者は、ヒトT細胞
受容体アルファ定常領域遺伝子(配列番号1)内に見出される認識配列を選択的に認識及
び切断するその能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって、その効果
が評価されることを理解するであろう。
ものとして解釈すべきではない。当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細
書に記載の特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識し、又は確認することができ
るであろう。このような等価物は、以下の実施例に従った特許請求の範囲に包含されるこ
とが意図される。
本明細書で「TRC1-2メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(
配列番号8~27)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC1-2認
識配列(配列番号3)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC1-2組換え
メガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌク
レアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む
。各TRC1-2メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号3のTRC1認識
半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC2認識半部位に結合する(図1Aを参照さ
れたい)。
は各々、それぞれHVR1及びHVR2と呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。TR
C1結合サブユニットは、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1
領域の外側で同一であり、HVR1領域内では高度に保存されている。同様に、TRC2
結合サブユニットもまた、80位又は271位(Q又はE残基を含む)、並びにメガヌク
レアーゼTRC1-2x.87EE、TRC1-2x.87QE、TRC1-2x.87
EQ、TRC1-2x.87、及びTRC1-2x.163の330位(R残基を含む)
(網掛けの灰色及び下線)を除いて、HVR2領域の外側で同一である。HVR1領域と
同様に、HVR2領域も高度に保存されている。
て提供する。配列番号33~52はそれぞれ、メガヌクレアーゼTRC1-2x.87E
E(配列番号8)のTRC1結合領域である配列番号33と少なくとも90%の配列同一
性を共有する。配列番号8~27のTRC2結合領域を図3に示し、それぞれ配列番号5
8~77として提供する。配列番号58~77はそれぞれ、メガヌクレアーゼTRC1-
2x.87EE(配列番号8)のTRC2結合領域である配列番号58と少なくとも90
%の配列同一性を共有する。
本明細書で「TRC3-4メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(
配列番号28及び29)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC3-
4認識配列(配列番号4)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC3-4組
換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガ
ヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを
含む。各TRC3-4メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号4のTRC3
認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC4認識半部位に結合する(図1Aを参
照されたい)。
は各々、それぞれHVR1及びHVR2と呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。TR
C3結合サブユニットは、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1
領域の外側で同一であり、HVR1領域内では高度に保存されている。同様に、TRC4
結合サブユニットもまた、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR2
領域の外側で同一であり、HVR2領域内では高度に保存されている。
4として提供する。配列番号53及び54は、96.6%の配列同一性を共有する。配列
番号28及び29のTRC4結合領域を図5に示し、それぞれ配列番号78及び79とし
て示す。配列番号78及び79もまた、96.6%の配列同一性を共有する。
本明細書で「TRC7-8メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(
配列番号30~32)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC7-8
認識配列(配列番号5)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC7-8組換
えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌ
クレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含
む。各TRC7-8メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号5のTRC7認
識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC8認識半部位に結合する(図1Aを参照
されたい)。
は各々、それぞれHVR1及びHVR2と呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。TR
C7結合サブユニットは、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR1
領域の外側で同一であり、HVR1領域内では高度に保存されている。同様に、TRC8
結合サブユニットもまた、80位又は271位(Q又はE残基を含む)を除いてHVR2
領域の外側で同一であり、HVR2領域内では高度に保存されている。
して提供する。配列番号55~57はそれぞれ、メガヌクレアーゼTRC7-8x.7(
配列番号30)のTRC7結合領域である配列番号55と少なくとも90%の配列同一性
を共有する。配列番号30~32のTRC8結合領域を図7に示し、それぞれ配列番号8
0~82として提供する。配列番号80-82はそれぞれ、メガヌクレアーゼTRC7-
8x.7(配列番号30)のTRC8結合領域である配列番号80と少なくとも90%の
配列同一性を共有する。
の切断
TRC1-2、TRC3-4、及びTRC7-8メガヌクレアーゼがそれぞれの認識配
列(それぞれ配列番号3、4、及び5)を認識及び切断することができるかどうかを決定
するために、各組換えメガヌクレアーゼを、先に記載のCHO細胞レポーターアッセイ(
国際公開第/2012/167192号パンフレット及び図8を参照されたい)を使用し
て評価した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光
タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを保有するCHO細胞レポーター株を作製した
。各細胞株のGFP遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断
が機能性GFP遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によ
って分断された。
れた1つの認識配列は、TRC1-2認識配列(配列番号3)、TRC3-4認識配列(
配列番号4)、又はTRC7-8認識配列(配列番号5)であった。GFP遺伝子に挿入
された第2の認識配列は、「CHO-23/24」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによ
って認識及び切断されるCHO-23/24認識配列であった。TRC1-2認識配列及
びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明細書では「TRC1
-2細胞」と呼ばれる。TRC3-4認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むC
HOレポーター細胞は、本明細書では「TRC3-4細胞」と呼ばれる。TRC7-8認
識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明細書では「
TRC7-8細胞」と呼ばれる。
スミドDNAをトランスフェクトし(例えば、TRC1-2細胞にはTRC1-2メガヌ
クレアーゼをコードするプラスミドDNAをトランスフェクトした)、又はCHO-23
/34メガヌクレアーゼをコードするプラスミドDNAをトランスフェクトした。各アッ
セイにおいて、製造者の指示に従ってLipofectamine2000(Therm
oFisher)を使用して、96ウェルプレートにおいて、4e5のCHOレポーター
細胞に50ngのプラスミドDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの4
8時間後、細胞をフローサイトメトリにより評価して、トランスフェクトされていない陰
性対照(TRC1-2bs)と比較したGFP陽性細胞のパーセンテージを決定した。図
9に示すように、TRC1-2、TRC3-4、及びTRC7-8メガヌクレアーゼは全
て、対応する認識配列を含む細胞株において、陰性対照を有意に超える頻度でGFP陽性
細胞を産生することが見出された。
Eメガヌクレアーゼの効力も、時間依存的様式で決定した。この研究では、TRC1-2
細胞(1e6)に1細胞あたり1e6のメガヌクレアーゼmRNAコピーを、製造元の指
示に従ってBioRad Gene Pulser Xcellを使用して電気穿孔した
。トランスフェクションの1、4、6、8、及び12日後、細胞をフローサイトメトリに
よって評価して、GFP陽性細胞のパーセンテージを決定した。図10に示すように、各
TRC1-2メガヌクレアーゼはトランスフェクションの2日後に高効率を示し、50%
を超えるGFP陽性細胞が観察された。この効果は12日間にわたって持続し、細胞毒性
の証拠は観察されなかった。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1-2メガヌクレアーゼ、TRC3-4メ
ガヌクレアーゼ、及びTRC7-8メガヌクレアーゼが、それらのそれぞれの認識配列を
細胞内で効率的に標的とし、切断できることを実証した。
この研究は、本発明に包含されるTRC1-2メガヌクレアーゼが、Jurkat細胞
(不死化ヒトTリンパ球細胞株)においてTRC1-2認識配列を切断できることを実証
した。1e6のJurkat細胞に1細胞あたり8e6の所与のTRC1-2メガヌクレ
アーゼmRNAコピーを、BioRad Gene Pulser Xcellを製造元
の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクションの72時間後に、ゲノムD
NA(gDNA)を細胞から採取し、T7エンドヌクレアーゼI(T7E)アッセイを実
施して内因性TRC1-2認識配列(図11)における遺伝子改変を推定した。T7Eア
ッセイでは、TRC1-2認識部位に隣接するプライマーを使用してTRC1-2遺伝子
座をPCRにより増幅する。TRC1-2遺伝子座内にインデル(ランダムな挿入又は欠
失)がある場合、得られたPCR産物は、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混
合物からなると思われる。PCR産物を変性させ、ゆっくりと再アニーリングする。ゆっ
くりとした再アニーリングは、野生型及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二重鎖の形
成を可能にし、ミスマッチ塩基及び/又はバルジを生じる。T7E1酵素は、ミスマッチ
部位で切断し、ゲル電気泳動によって可視化され得る切断産物を生じる。図11は、TR
C1-2メガヌクレアーゼの13の異なるバージョンがT7E1アッセイにおいて陽性結
果を生じ、内因性TRC1-2認識配列におけるインデルの効果的な生成を示しているこ
とを明確に実証した。
kat細胞で行った。1e6のJurkat細胞に1細胞あたり3μg又は1μgの所与
のTRC1-2メガヌクレアーゼmRNAコピーを、BioRad Gene Puls
er Xcellを製造元の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクション
の96時間後、gDNAを回収し、T7E1アッセイを上記のように行った。図12に見
られるように、TRC1-2x.87メガヌクレアーゼの3つの異なるバージョンを含む
15種類の異なるTRC1-2メガヌクレアーゼは、内因性TRC1-2認識部位での切
断を示した。TRC1-2x.87EEは特にうまく機能し、T7E1アッセイにおいて
強いシグナルを生成し、Jurkat細胞で毒性がほとんど又は全くなかった。
この研究は、本発明に包含されるTRC1-2メガヌクレアーゼが、ドナーから得られ
たヒトT細胞においてTRC1-2認識配列を切断できることを実証した。CD3+T細
胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa4D-Nucl
eofector(Lonza)を製造元の指示に従って使用して、TRC1-2x.8
7EEメガヌクレアーゼをコードするmRNAを電気穿孔した。トランスフェクションの
3日後及び7日後、gDNAを回収し、T7E1アッセイを上記のように行った。図13
Aは、TRC1-2x.87EEがヒトT細胞において内因性TRC1-2認識配列に突
然変異を効果的に導入し、メガヌクレアーゼがTRC1-2認識配列を認識及び切断した
ことを示すことを実証している。切断産物の強度は、トランスフェクションの3日目後と
7日目後との間で変化がないと思われ、TRC1-2x.87EEメガヌクレアーゼによ
る毒性はほとんど又は全くないことを示唆している。内因性TRC1-2認識配列におけ
る突然変異がT細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するため
に、抗CD3抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。図13Bは、
トランスフェクトされたT細胞の約50%がCD3に対して陰性に染色されことを示し、
T細胞受容体のノックアウトを示している。CD3陰性集団は、トランスフェクション後
3日目と7日目との間で有意に変化せず、TRC1-2x.87EEメガヌクレアーゼに
関連する毒性はほとんど若しくはまったくないか、又はT細胞受容体発現の喪失を更に示
した。
ために、トランスフェクトされたT細胞からgDNAを回収し、TRC1-2認識部位遺
伝子座をPCRにより増幅した。PCR産物を、Zero Blunt PCRクローニ
ングキット(Thermo Fisher)を製造者の指示に従って使用して、pCR-
平滑末端ベクターにクローニングした。個々のコロニーを拾い、ミニプレッププラスミド
を配列決定した。図14は、TRC1-2認識配列で観察された、いくつかの代表的な欠
失の配列を示す。観察された配列は、エンドヌクレアーゼによって生成されたDNA二本
鎖切断の非相同末端結合修復から生じる欠失の典型的なものである。
2を含む他のTRC1-2メガヌクレアーゼは、ヒトT細胞においてT細胞受容体をノッ
クアウトすることができたが、TRC1-2x.87EEについて以前に観察されたノッ
クアウトよりも程度は低かった(表5及び6)。TRC1-2x.72Q47Eは、メガ
ヌクレアーゼの活性部位(アミノ酸47)に突然変異を有し、陰性対照として機能する。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1-2メガヌクレアーゼが、Jurkat
細胞(不死化Tリンパ球細胞株)及びヒトドナーから得られたT細胞の両方において、T
RC1-2認識配列を認識及び切断することができることを実証した。更に、これらの研
究は、インデルの出現によって証明されるように、NHEJがメガヌクレアーゼ切断部位
に生じることを実証した。更に、TRC1-2メガヌクレアーゼは、ドナーから得られた
ヒトT細胞上のT細胞受容体の細胞表面発現を低下させることが示された。
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV405及びAAV406と呼ば
れる)を、EagI制限部位を含む外因性核酸配列を相同組換えによりTRC1-2認識
配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えAAVベクターは
、細胞株に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」成分(例えばアデノウイルス)をコ
ードする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウ
イルスにパッケージングされる介在DNA配列(例えば外因性核酸配列)を含むウイルス
性逆位末端反復配列(ITR)を含む第3のプラスミドをトランスフェクトする三重トラ
ンスフェクションプロトコルを使用して調製される(Cots D、Bosch A、C
hillon M(2013年)Curr.Gene Ther.13(5):370~
81頁を参照されたい)。図15は、外因性核酸配列をヌクレアーゼ切断部位で細胞ゲノ
ムに導入するために組換えAAVベクターを使用するための一般的なアプローチを示す。
されるように、AAV405プラスミドは、一般に、5’ITR、CMVエンハンサー及
びプロモータ配列、5’相同アーム、EagI制限部位を含む核酸配列、SV40ポリ(
A)シグナル配列、3’相同アーム、及び3’ITRを含む。図17に示すプラスミドを
使用して、AAV406(配列番号108)を調製した。示されるように、AAV406
プラスミドは、AAV405と同様の配列を含むが、5’相同アームの上流のCMVエン
ハンサー及びプロモータ配列を欠く。本AAV研究は、AAV形質導入効率の陽性対照と
して組み込まれた、GFPをコードするAAVベクター(GFP-AAV)の使用をさら
に含んでいた。
TRC1-2メガヌクレアーゼによる二本鎖切断の発生後にAAV鋳型が相同組換え修
復(homology directed repair)(HDR)に適しているかど
うかを試験するために、ヒトT細胞を使用して一連の実験を行った。第1の実験では、T
RC1-2RNAの電気穿孔のタイミング及び組換えAAVベクターの形質導入を決定し
た。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、
Amaxa 4D-Nucleofector(Lonza)を製造者の指示に従って使
用して、TRC1-2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を
電気穿孔した。トランスフェクションの2、4、又は8時間後に、細胞にGFP-AAV
(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。細胞を、形質導入の72時間後にG
FP発現についてフローサイトメトリによって分析した。図18に示すように、トランス
フェクションの2時間後に細胞を形質導入した場合、最も高い形質導入効率が観察された
(GFP陽性細胞88%)。形質導入効率は、トランスフェクションと形質導入との間の
時間が増加するにつれて有意に減少し、4時間でGFP陽性細胞78%及び8時間でGF
P陽性細胞65%であった。
入が起こったと判断したので、AAV405及びAAV406ベクターをヒトT細胞にお
いてHDR鋳型として使用した。CD3+T細胞を刺激し、上記のように1μgのTRC
1-2x.87EEmRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの2時間後
に、細胞にAAV405又はAAV406(1e5のウイルスゲノム/細胞)のいずれか
を形質導入した。形質導入のみの対照として、細胞に(水を)擬似トランスフェクション
し、AAV405又はAAV406(1e5のウイルスゲノム/細胞)のいずれかを形質
導入した。メガヌクレアーゼのみの対照のために、細胞にTRC1-2x.87EEをト
ランスフェクションし、次いでトランスフェクションの2時間後に(水を)擬似形質導入
した。
胞から回収し、AAVベクター中の相同領域を超える配列を認識するプライマーを使用し
て、PCRによりTRC1-2遺伝子座を増幅させた。相同領域の外側のPCRプライマ
ーは、AAVベクターからではなく、T細胞ゲノムの増幅のみを可能にした。PCR産物
を精製し、EagIで消化した。図19は、TRC1-2x.87EEをトランスフェク
トされ、いずれかのAAVベクターを形質導入された細胞から増幅されたPCR産物の切
断を示し(矢印を参照されたい)、TRC1-2認識配列へのEagI部位の挿入を示し
ている。全ての対照細胞集団由来のPCR産物はEagIによって切断されず、EagI
部位の挿入がTRC1-2メガヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断の生成を必要とする
ことを実証している。
個々の産物を調べた。上記実験から生成された未消化PCR産物を、Zero Blun
t PCRクローニングキット(Thermo Fisher)を製造者の指示に従って
使用してpCR-平滑ベクターにクローニングした。コロニーPCRを、M13フォワー
ド及びリバースプライマーを使用して実施し(pCR平滑末端はインサートに隣接するM
13フォワード及びリバースプライミング部位を含む)、TRC1-2x.87EE及び
AAV405又はAAV406をトランスフェクトされた細胞由来のPCR産物の一部を
ゲル電気泳動により分析した(それぞれ図20A及び21A)。どちらの場合も、完全長
PCR産物(約1600bp)、より小さいインサート、及びいくつかの空のプラスミド
(約300bp)が混在している。このアッセイでは、完全長よりも小さいが空のプラス
ミドよりも大きいバンドは、しばしば、TRC1-2認識配列内に大きな欠失を含む配列
である。平行して、PCR産物の別の部分をEagIで消化して、TRC1-2認識配列
に挿入されたEagI認識部位を含むクローンのパーセントを決定した。図20B及び2
1Bは、いくつかのPCR産物がEagIで切断され(例えば、図20B、第2列、左か
ら6レーン)、約700及び800bpの予想される断片を生成することを示す。これら
のゲルから、EagI挿入が、AAV405及びAAV406についてそれぞれ約25%
及び6%(空のベクターに対して調整)であると推定することができる。
ために、各PCR産物の残りの部分を配列決定した。図22Aは、TRC1-2認識配列
で観察されたいくつかの代表的な欠失及び挿入の配列を示す。これらの配列は、エンドヌ
クレアーゼによって生成されたDNA二本鎖切断の非相同末端結合修復から生じる配列に
典型的なものである。EagIで切断されたPCR産物は全て、TRC1-2認識配列に
挿入されたEagI部位を含んでいた(図22B)。
AAV形質導入をトランスフェクションの2時間後に実施した場合が、それより後に実
施した場合よりも効率的であるという観察の観点から、トランスフェクションおよび形質
導入のタイミングを最適化するための実験を行った。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗
体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa 4D-Nucleofect
or(Lonza)を製造者の指示に従って使用して、TRC1-2x.87EEメガヌ
クレアーゼ(1μg)を電気穿孔した。トランスフェクションの直後又はトランスフェク
ションの2時間後に、細胞にGFP-AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導
入した。更に、未刺激細胞に、GFP-AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質
導入した。形質導入の72時間後に、細胞をGFP発現についてフローサイトメトリによ
って分析した。図23は、トランスフェクションの2時間後に行ったGFP-AAV形質
導入が90%のGFP陽性細胞をもたらしたが、トランスフェクション直後の形質導入は
98%のGFP陽性細胞を生じたことを示す。休止T細胞はAAV形質導入を受け入れな
いと思われ、GFP陽性細胞は約0%であった。非形質導入細胞はまた、約0%のGFP
陽性細胞を示した。
これらの研究は、AAVベクターを組換えメガヌクレアーゼと併せて使用して、相同組
換えを介して、外因性核酸配列をTCRアルファ定常領域の切断部位に組み込むことがで
きることを実証する。
の組換えAAVベクター
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV-CAR100及びAAV-C
AR763と呼ばれる)を、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を相同組換え
によりTRC1-2認識配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各
組換えAAVベクターは、先に記載した三重トランスフェクションプロトコルを使用して
調製した。
ミド(配列番号109)を使用して調製した。示されるように、AAV-CAR100(
AAV408)は、自己相補的なAAVベクターを作製するために設計され、一般に、5
’ITR、5’相同アーム、抗CD19キメラ抗原受容体をコードする核酸配列、SV4
0ポリ(A)シグナル配列、3’相同アーム、及び3’ITRを含む。図25(配列番号
110)に示すプラスミドを使用してAAV-CAR763(本明細書ではAAV412
とも呼ぶ)を調製した。示されるように、AAV-CAR763(AAV412)プラス
ミドは、一般に、AAV-CAR100(AAV408)と同じ配列を含むが、一本鎖A
AVベクターを作製するために設計される。一本鎖AAVベクターはより大きなペイロー
ドを収容することができるので、5’相同アーム及び3’相同アームは、AAV-CAR
763(AAV412)においてAAV-CAR100(AAV408)よりも長い。本
AAV研究は、AAV形質導入効率の陽性対照として組み込まれた、GFPをコードする
AAVベクター(GFP-AAV)の使用を更に含む。
キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性TCR
受容体の細胞表面発現をノックアウトするための組換えAAVベクターの使用効率を決定
するための研究を行う。
抗体で3日間刺激し、次いで、Amaxa 4D-Nucleofector(Lonz
a)を製造者の指示に従って使用して、TRC1-2x.87EEメガヌクレアーゼをコ
ードするmRNA(1μg)を電気穿孔した。細胞に、上記のようにトランスフェクショ
ンの直後にGFP-AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入する。細胞を、
形質導入の72時間後に、GFP発現についてフローサイトメトリによって分析し、形質
導入効率を決定する。
クターは、抗CD19キメラ抗原受容体配列の挿入のためにヒトT細胞においてHDR鋳
型として使用される。ヒトCD3+T細胞を刺激し、上記のように1μgのTRC1-2
x.87EEmRNAをトランスフェクトする。次いで、トランスフェクションの直後又
はトランスフェクションの0~8時間以内のいずれかに、細胞にAAV-CAR100(
AAV408)又はAAV-CAR763(AAV412)(1e5のウイルスゲノム/
細胞)を形質導入する。形質導入のみの対照として、細胞に(水を)擬似トランスフェク
ションし、AAV-CAR100(AAV408)又はAAV-CAR763(AAV4
12)(1e5のウイルスゲノム/細胞)のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼ
のみの対照のために、細胞にTRC1-2x.87EEをコードするmRNAをトランス
フェクションし、次いでトランスフェクションの直後に(水を)擬似形質導入する。
定によって確認する。キメラ抗原受容体の細胞表面発現は、抗Fab又は抗CD19抗体
を使用して、フローサイトメトリによって確認する。内因性T細胞受容体の細胞表面での
ノックアウトは、前述のフローサイトメトリによって決定される。
本研究では、AAVが、キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入
し、同時に内因性TCR受容体の細胞表面発現をノックアウトするために使用できるHD
R鋳型を提供できるかどうかを試験する。第1の実験では、上記のようにヒトCD3+T
細胞(1e6細胞)を刺激し、TRC1-2x.87EEメガヌクレアーゼをコードする
mRNA(2μg)を電気穿孔し、次いでAAV412(1e5ウイルスゲノム/細胞)
を直ちに形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次いでAAV412を形質
導入するか、又はTRC1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで
擬似形質導入した。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞の更なる対照も含んでいた。
どうかを決定するための、PCRに基づくアッセイを開発した。3組のプライマー対をP
CR分析に使用した。第1のセットは、AAV412の相同アームを有する領域を増幅す
るように設計された。この第1プライマーセット(表7において「内部ホモログアーム/
CAR領域」と称される)は相同領域内にあるので、ゲノムの非改変TRC1-2認識配
列座(349bp)、AAV412ベクターインプット(2603bp)、又はCAR遺
伝子が挿入されたTRC1-2認識配列(2603bp)のいずれかを増幅する。第2の
プライマーセット(表7において「外側5’相同アーム」と称される)は、AAV412
HDR鋳型のCAR領域内にアニーリングする1つのプライマー、AAV412 HD
R鋳型の5’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリングする1つのプライマーを含み
、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列内にうまく挿入された場合にのみ、1872bp
の断片を増幅する。第3のプライマーセット(表7において「外側3’相同アーム」と称
される)は、AAV412 HDR鋳型のCAR領域内にアニーリングする1つのプライ
マー、及びAAV412 HDR鋳型の3’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリン
グする1つのプライマーを含む。第2のプライマーセットと同様に、第3のプライマーセ
ットは、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列にうまく挿入された場合にのみ1107b
pの断片を増幅する。まとめると、3つ全てのプライマーセットによるPCR産物は、C
AR配列が細胞内に存在するかどうか(プライマーセット1)、及びそれがTRC1-2
認識配列に挿入されているかどうか(プライマーセット2及び3)を示す。
、約3000個の細胞を回収し、ペレット化し、溶解し、PCRを行って、CAR遺伝子
がTRC1-2認識配列に挿入されたかどうかを決定した。PCR産物を、図26に示す
アガロースゲルにおいて分離した(レーンの説明は表7に示す)。レーン1~3は、TR
C1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入したサンプル由
来のPCR産物である。
RC1-2認識配列座を増幅し、レーン1に示される349bpのバンドを生成した。レ
ーン2及び3は、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列に挿入されている場合にのみ産物
を生成するプライマー対に対応し、産物は示されていない。レーン7~9は、擬似電気穿
孔、及び擬似形質導入されたサンプルを表し、上述のTRC1~2x.87EEmRNA
のみの対照と同じバンドを示す。レーン4~6は、TRC1-2x.87EEmRNAを
電気穿孔し、AAV412を形質導入されたサンプル由来のPCR産物を示す。レーン4
は、第1のプライマー対(「内部ホモログ/CAR領域」)により生成された2つのバン
ドを示し、ゲノムの非改変TRC1-2認識配列座(349bp)及びAAV412ベク
ターインプット(2603bp)、又はCAR遺伝子が挿入されたTRC1-2認識配列
(2603bp)の増幅を示す。レーン5及び6は、CAR核酸配列がTRC1-2x.
87EE認識部位に挿入されている場合にのみ、産物を増幅するプライマー対によって生
成される産物を示す。両方のバンドは予測されるサイズ(それぞれ1872及び1107
bp)である。レーン10~12は、擬似電気穿孔し、AAV412を形質導入したサン
プルを表す。レーン10は、第1プライマー対(「内部ホモログ/CAR領域」)によっ
て生成された2つのバンドを示し、ゲノムの非改変TRC1-2認識配列座(349bp
)及びAAV412ベクターインプット(2603bp)の増幅を示す。レーン11及び
12は、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列に挿入されている場合にのみ産物を生成す
るプライマー対に対応し、産物は示されていない。レーン11及び12(相同アームの外
側のプライマーを含む)にバンドが存在しないことは、レーン10の2603bpバンド
がAAV412インプットの増幅から生成されたことを示す。
方が細胞中に存在する場合、CAR遺伝子がTRC1-2x.87EE認識部位に導入さ
れることを明らかに実証している。従って、本発明者らは、AAV412がTRC1-2
x.87EE認識配列にCAR遺伝子を挿入するのに使用できる適切なHDR鋳型を産生
するのに役立つと結論する。
EメガヌクレアーゼをコードするmRNAを電気穿孔した後、直ちに漸増量のAAV40
8(0μL、3.125μL、6.25μL、12.5μL、又は約25μL、これは約
0、3.125e3、6.250e3、1.25e4、及び2.5e4ウイルスゲノム/
細胞に対応する)を形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次に漸増量のA
AV408を形質導入した。更なる対照には、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞、
並びにTRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次に擬似形質導入した細胞が含
まれた。形質導入後4日目に、細胞を回収し、上記のように分析したが、CAR遺伝子が
TRC1-2認識配列に挿入されている場合にのみ産物を増幅するプライマー対のみを使
用した。図27に示すように、PCR産物をアガロースゲルにおいて分離した。図27A
は、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列座に挿入されている場合にのみ、その遺伝子座
の5’末端に産物を増幅する上記のプライマー対(「外側5’相同アーム」)を使用して
生成されたPCR産物を示す。図27Bは、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列座に挿
入されている場合にのみ、その遺伝子座の3’末端に産物を増幅する上記のプライマー対
(「外側3’相同アーム」)を使用して生成されたPCR産物を示す。レーンの説明は表
8に示す。図27A及び27Bの両方のレーン1~5は、擬似電気穿孔又は擬似電気穿孔
し、次いで擬似形質導入したサンプルを表す。擬似電気穿孔した細胞においてPCR産物
を見ることはできず、AAV408によって生成されたHDR鋳型が、TRC1-2x.
87EEmRNAの不在下でTRC1-2認識配列にCAR遺伝子を挿入できないことを
示している。レーン6は、TRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔し、擬似形質導
入したサンプルを表す。PCR産物を見ることはできず、TRC1-2認識配列にCAR
遺伝子が挿入されていないことを示している。レーン7~10は、TRC1-2x.87
EEmRNAを電気穿孔し、漸増量のAAV408を形質導入したサンプルを表す。各P
CRの適切なサイズのバンドが明らかであり、これは、AAV408がTRC1-2認識
配列の修復のためのHDRドナーを産生でき、CAR遺伝子の挿入をもたらし得ることを
示している。
かどうかを決定するのに有用であるが、効率に関する情報を与えない。CAR挿入の効率
を決定するために、本発明者らは、デジタルPCRベースのアッセイを開発した(図28
Aに概略を示す)。このアッセイでは、2つのプライマーセットを使用する。第1のセッ
トは、無関係の遺伝子配列を増幅し、鋳型数を制御する参照配列を供給する。第2のセッ
トは、CAR遺伝子がTRC1-2認識配列に挿入されている場合にのみ産物が増幅され
るように、CAR遺伝子内にアニーリングする1つのプライマーと3’相同アームの外側
にアニーリングする1つのプライマーからなる。VIC標識プローブは、第1のプライマ
ーセットから生成されたアンプリコン内にアニーリングし、FAM標識プローブは、第2
のプライマーセットによって生成されたアンプリコン内にアニーリングする。FAM標識
プローブによって検出されたアンプリコンの数を、VIC標識プローブによって検出され
た参照配列アンプリコンの数で割ることにより、CAR遺伝子の挿入によって改変された
TRC1-2認識配列座のパーセントを正確に定量することが可能となる。
EmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入したサンプル、又はTRC1-2x.87
EEmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV408を形質導入したサンプルのいず
れかについてのデジタルPCRの結果を示す。デジタルPCRは、形質導入の約1週間後
に細胞から単離したゲノムDNAを用いて行った。図27に記載されたPCRからの観察
と一致して、両方の対照サンプル(形質導入のみ、又は電気穿孔のみ)は、TRC1-2
x.87EE認識配列に挿入されたCAR遺伝子が0%であったことが判明した。TRC
1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV408を
形質導入したサンプルは、約1.5%~7%を有することが判明した。アッセイは2つの
異なる機器(商標QX200及びQS3D)で実施され、このデジタルPCRベースのア
ッセイの感度及び精度を実証する顕著な一致を示した。
CARの挿入が分子レベルで起こったかどうかを決定することに加えて、AAV408
をHDR鋳型として使用してTRC1-2認識配列にCAR遺伝子を挿入した細胞におけ
る抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定しようと努めた。更に、CARのTR
C1-2x.87EE認識配列への挿入がT細胞受容体のノックアウトをもたらす効率を
調べた。上記並びに図27及び28で分析したサンプルも、フローサイトメトリによって
CAR及びCD3の発現について分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CA
R(抗Fab-Alexa647)又はCD3(CD3-BB515)を認識する抗体で
標識し、フローサイトメトリによって分析した。図29Aは、Y軸に抗CAR標識を示し
、X軸に抗CD3標識を示すフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似
形質導入した細胞(MOI-0)は、圧倒的にCD3+/CAR-であった(右下の象限
、98.7%)。擬似電気穿孔し、次に漸増量のAAV408を形質導入した細胞は、対
照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR-集団は98.8%、99、99%、
及び99.1%であった。従って、本発明者らは、AAV408ウイルス単独では検出可
能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできな
いと結論する。
形質導入したサンプル、又はTRC1-2x.87EEを電気穿孔した後、漸増量のAA
V408を形質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで
擬似形質導入した細胞は、47.1%のCD3-細胞を示し、T細胞受容体複合体の効率
的なノックアウトを示す。抗CD19CARで標識したバックグラウンドは非常に低く、
CD3-集団で0.6%、CD3+集団で0.78%であった。TRC1-2x.87E
EをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV408を形質導入したサン
プルは、CD3-集団において2.09%~5.9%の範囲のCAR標識を示した。また
、CD3+集団におけるCAR標識のわずかな増加もあり、1.08%から1.91%に
及ぶ。本発明者らは、CD3+集団におけるCAR+細胞の増加の原因を特定しなかった
が、CARが非発現T細胞受容体対立遺伝子に挿入された可能性がある(T細胞受容体ア
ルファ鎖の1つの対立遺伝子のみが発現され、T細胞受容体複合体へ組み込まれている)
。
。例えば、AAV408の最高MOI(2.5e4ウイルスゲノム/細胞)において、デ
ジタルPCRアッセイは約6%のCAR挿入を示し、フローサイトメトリアッセイは5.
9%のCAR+/CD3-細胞を示した。CAR+/CD3+集団を考慮に入れると、こ
のデータは、フローサイトメトリアッセイが示す約7.8%CAR+はデジタルPCRに
よる6%と比較していまだ全く同等である。
AAVベクターがCAR遺伝子をTRC1-2x.87EE認識配列に挿入するのに適
したHDR鋳型を提供できることを示したので、本発明者らはAAVベクターの構成を最
適化しようと努めた。本発明者らは、TRC1-2認識配列座及びAAV ITRに対す
る短い相同領域に隣接する、JeTプロモータによって駆動されるCAR遺伝子発現カセ
ットを含む自己相補的AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。こ
のベクターはAAV421(図30;配列番号123)と呼ばれる。自己相補的AAVの
パッケージング能力が限られているため、短い相同アームが必要であった。更に、長い相
同アーム及びAAV ITRに隣接する、CMVプロモータによって駆動されるCAR遺
伝子発現カセットを含む一本鎖AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製
した。このベクターはAAV422(図31;配列番号124)と呼ばれる。一本鎖AA
Vゲノムはより大きなカーゴ容量を有するので、自己相補的ベクターよりも長い相同アー
ムを利用することができた。
とするのに有用であるかどうかを試験するために、上記と同様のいくつかの実験をヒトC
D3+T細胞で行った。第1の実験では、ヒトCD3+T細胞(1e6細胞)に擬似電気
穿孔し、次いで漸増量のAAV421若しくは422を形質導入するか、又はTRC1-
2x.87EEmRNA(2μg)を電気穿孔し、次いで漸増量のAAV421又はAA
V422を形質導入するかのいずれかを行った。前述のAAV408による実験は、MO
Iが高いほどより効率的なCAR挿入をもたらすことを示唆したので、AAV422 M
OIは、上記の実験よりこの実験においてAAV421より有意に高かった(およそMO
Iは1.25e4、2.5e4、5e4、及び1e5ウイルスゲノム/細胞であった)。
AAV421ウイルスストックは、前述の実験より有意に高い力価を可能にするほど十分
に濃縮されていなかった。対照として、細胞を電気穿孔(擬似又はTRC1~2x.87
EEmRNAで)し、次いで擬似形質導入した。この実験の追加成分として、「大規模」
条件を実施し、10e6細胞(典型的な実験よりも10倍多い)にTRC1-2x.87
EEmRNAを電気穿孔し、次いでAAV422(2.5e4ウイルスゲノム/細胞)を
形質導入した)。最後に、本発明者らはまた、第1のウイルスストックと比較するために
、AAV421の第2のウイルスストックを試験した。
ている場合にのみ産物を増幅するプライマー対を使用して、上記のようにPCRによって
決定した。PCRを、図32A及び32Bに示されるアガロースゲルによって分離した(
レーンの説明は、表9及び10に示す)。図32Aのサンプル1には擬似電気穿孔し、次
いで擬似形質導入し、サンプル2~5には擬似電気穿孔し、次いでAAV421を形質導
入した。ゲルは、これらのサンプルが全てPCR産物を生成せず、TRC1-2x.87
EEmRNAの不在下で、AAV421がCAR遺伝子のTRC1-2認識配列への挿入
を駆動できないことを示している。更に、TRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔
し、次いで擬似形質導入した対照サンプル(サンプル6)は、PCR産物を示さなかった
。図32Aのサンプル7~10には、TRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔し、
次に漸増量のAAV421を形質導入した。ゲルは、5’及び3’相同アームの両方を越
えて伸長した産物のPCRバンドを示し(各サンプル番号の下の2つのバンド)、CAR
遺伝子のTRC1-2認識配列への組み込みを実証している。最後に、図32Aにおいて
、レーン11及び12は、それぞれ1e6又は10e6細胞/サンプルのいずれかで開始
した、TRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次いでAAV422を形質導入
されたサンプルを表す。両方のPCRバンド(相同アームが長いことを考慮して異なるプ
ライマーが使用されたため、最初のセットのほうがより大きい)の存在は、CAR遺伝子
のTRC1-2認識配列への挿入が成功したことを示す。
は擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV422を形質導入した。(表10)。ゲルは、
これらのサンプルが全てPCR産物を生成せず、TRC1-2x.87EEmRNAの不
在下で、AAV422がCAR遺伝子のTRC1-2認識配列への挿入を駆動できないこ
とを示している。図32Bのサンプル7~10には、TRC1-2x.87EEmRNA
を電気穿孔し、次に漸増量のAAV422を形質導入した。ゲルは、5’及び3’相同ア
ームの両方を越えて伸長した産物のPCRバンドを示し、CAR遺伝子のTRC1-2認
識配列への組み込みを実証している。最後に、サンプル11は、TRC1-2x.87E
EmRNAを電気穿孔し、次いで図32Aに示されるサンプルとは異なるウイルスストッ
ク由来のAAV421を形質導入したサンプルを表す。バンドの存在は、CAR遺伝子の
TRC1-2認識配列への挿入を示し、異なるウイルスストック間の再現性を裏付けてい
る。まとめると、図32は、AAV421及びAAV422の両方が、CAR遺伝子をT
RC1-2認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型を生成できることを明確に実証して
いる。
ここでは、AAV421を用いてCAR遺伝子をTRC1-2認識配列に挿入した細胞
における、抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定するよう努めた。上記及び図
32Aで分析したサンプルも、フローサイトメトリによってCAR及びCD3の発現につ
いて分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体
で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図33Aは、擬似電気穿孔し、AAV
421を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについての
フローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞(MOI
-0)は、圧倒的にCD3+/CAR-であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気
穿孔し、次に漸増量のAAV421を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思
われ、CD3+/CAR-集団は98.8%、98.6%、98.8%、及び97.9%
であった。従って、本発明者らは、AAV421ウイルス単独では検出可能なレベルのC
AR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論づける
。
サンプル、又はTRC1-2x.87EEを電気穿孔した後、漸増量のAAV421を形
質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで擬似形質導入
した細胞は、56.7%のCD3-細胞を示し、T細胞受容体複合体の効率的なノックア
ウトを示す。抗CD19CARで標識したバックグラウンドは非常に低く、CD3-集団
で0.48%、CD3+集団で0.36%であった。TRC1-2x.87EEをコード
するmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV412を形質導入したサンプルは、C
D3-集団において4.99%~13.4%の範囲の有意な量のCAR標識を示した。ま
た、CD3+集団におけるCAR標識のわずかな増加もあり、1.27%から3.95%
に及ぶ。上記のように、CAR遺伝子が非発現T細胞受容体対立遺伝子に挿入されている
可能性がある。また、AAV408を用いた実験とは対照的に、CAR+集団はより高い
平均蛍光強度で、より良好に定義され、JeFプロモータがeF1αコアプロモータより
も高い発現を駆動することが示唆された。
る一方で、本発明者らはCD3-/CAR+集団を優先的に増殖及び濃縮させる方法を決
定しようと努めた。上記及び図33に示す実験から、本発明者らは、TRC1-2x.8
7EEmRNA(2μg)を電気穿孔し、次いでAAV421(3.13e4ウイルスゲ
ノム/細胞)を形質導入した細胞を使用した。対照試料は、上記及び図33に示す実験か
ら採取した、擬似電気穿孔及び擬似形質導入、擬似電気穿孔及びAAV421の形質導入
、又はTRC1-2x.87EEの電気穿孔及び擬似形質導入を行ったものであった。対
照の濃縮及び増殖プロセスとして、これらの細胞を、IL-7及びIL-15(いずれも
10ng/mL)を補充した完全成長培地において6日間インキュベートした。次いで、
細胞を抗CD19CAR及びCD3に対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって
分析した(図34A)。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、CD3-/CAR+
象限において低レベルのバックグラウンド染色を示した(0.13%)。CD3-/CA
R+集団は、擬似電気穿孔し、次いでAAVを形質導入したサンプル、又はTRC1-2
x.87EEmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入したサンプルにおいて本質的に
同じであった(それぞれ0.16%及び0.55%)。TRC1-2x.87EEmRN
Aを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は53.2%のCD3-/CAR-集団を有し、
図33Bに示されたこの実験の最初の部分で染色された量に非常に近い(56.7%)。
TRC1-2x.87EEを電気穿孔し、AAVを形質導入した細胞は12.6%のCD
3-/CAR+細胞を示し、図33に示されるこれらの細胞の元の標識とほぼ同一であり
(13.4%)、IL-7とIL-15の混合物が、特異的CD3-/CAR+細胞集団
を濃縮又は増殖させるには不十分であることを実証した。
インキュベートすることにより、抗原特異的様式でCD3-/CAR+集団を濃縮しよう
と努めた。IM-9細胞をマイトマイシンCで前処理することによって不活性化し、1:
1の比でサンプルと共に、IL-7及びIL-15(10ng/mL)の存在下で6日間
インキュベートした。次いで、細胞を、CD3及び抗CD19CARに対する抗体で標識
し、フローサイトメトリによって分析した(図34B)。擬似電気穿孔し、擬似形質導入
した細胞は、CD3-/CAR+象限において低レベルのバックグラウンド染色を示した
(0.2%)。CD3-/CAR+集団は、擬似電気穿孔し、次いでAAVを形質導入し
たサンプルにおいて同じであり(0.2%)、TRC1-2x.87EEを電気穿孔し、
擬似形質導入した細胞においてわずかに高かった(1.24%)。TRC1-2x.87
EE単独対照のCD3-/CAR+細胞の増加は、CAR核酸がシステムに導入されてい
ないため、バックグラウンドと見なされる。TRC1-2x.87EEmRNAを電気穿
孔し、擬似形質導入した細胞は、42.5%のCD3-/CAR-集団を有し、増殖前(
56.7%、図33)より有意に低く、CD+細胞がこのシステムにおいて増殖優位性を
有し得ることを示唆している。しかし、TRC1-2x.87EEを電気穿孔し、AAV
を形質導入した細胞は、49.9%のCD3-/CAR+細胞を示し、図33に示すこれ
らの細胞の元の標識(13.4%)と比較して劇的に増加し、IL-7及びIL-15の
存在下におけるこのサンプルとIM-9細胞とのインキュベーションが、CD3-/CA
R+集団を濃縮及び増殖させるのに非常に有効であることを実証している。CD3+/C
AR+集団もまた同じ条件下で増殖させ、擬似電気穿孔/AAV形質導入サンプル及びT
RC1-2x.87EE電気穿孔/AV形質導入サンプルは、それぞれ2.53%及び1
5.3%のCD3+/CAR+を示す。
、CD3-集団の24.2%が増殖前にCAR+であった(図33B)。IL-7及びI
L-15を補充した培地中でのインキュベーション後、CD3-細胞の25.3%がCA
R+であり(図34A)、遺伝子ノックイン対遺伝子ノックアウトの比率は変化しなかっ
たことが示された。しかし、IL-7及びIL-15に加えてIM-9細胞と共にインキ
ュベートした後、CD3-細胞の80%以上(80.35%、図34B)がCAR+であ
り、IM-9細胞とのインキュベーションが抗原特異的濃縮をもたらすことを実証してい
る。
胞は混合培養物中で長く生き残れないので、IM-9細胞の2回目の注入は更にCD3-
/CAR+細胞の濃縮を増加させる可能性があると推論した。上記及び図34Bに示す細
胞のいくつかを、IL-7及びIL-15を含有する培地において新鮮なIM-9細胞(
マイトマイシン(mitocmycin)Cで前処理)と混合し、更に6日間インキュベ
ートした。次いで、細胞をCD3及び抗CD19CARについて染色し、フローサイトメ
トリによって分析した(図34C)。対照サンプルのいずれかにおけるCD3-/CAR
+細胞のパーセンテージは、IM-9細胞についての第1ラウンドの濃縮と比較して本質
的に変わらなかった。
、CD3-/CAR+細胞の有意な濃縮を示し、49.9%(IM-9細胞とのインキュ
ベーションの第1ラウンド後、図34B)から65.7%であった(図34C)に増加し
た。重要なことに、CD3-集団の93.75%はCAR+であり、更なる抗原特異的増
殖を示している。
本発明者らは、AAV422を使用してHDR鋳型を提供する細胞(上記、PCR結果
は図32Bに示す)からの抗CD19CARの発現も調べた。形質導入の約4日後、細胞
を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分
析した。図35Aは、擬似電気穿孔し、漸増量のAAV422を形質導入した細胞と、擬
似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示
す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞(MOI-0)は、圧倒的にCD3+/C
AR-であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV4
22を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR-集団
は98.6%、98.6%、98.9%、及び98.4%であった。従って、本発明者ら
は、AAV422ベクター単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T
細胞受容体の発現を破壊することもできない。
サンプル、又はTRC1-2x.87EEを電気穿孔した後、漸増量のAAV422を形
質導入した細胞のフローサイトメトリプロットを示す。電気穿孔し、次いで擬似形質導入
した細胞は、59.3%のCD3-細胞を示し、T細胞受容体複合体の効率的なノックア
ウトを示す。抗CD19CARで標識したバックグラウンドは非常に低く、CD3-集団
で1.47%、CD3+集団で0.52%であった。TRC1-2x.87EEをコード
するmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV422を形質導入したサンプルは、C
D3-集団において14.7%~20.3%の範囲の有意な量のCAR標識を示した。ま
た、CD3+集団におけるCAR標識のわずかな増加もあり、2.3%から2.7%に及
ぶ。
の顕著な増加を観察した。漸増AAV422による全体のCD3ノックアウト効率は、T
RC1-2x.87EEの電気穿孔単独では59.3%であったのに対し、71.6%、
74.9%、77.8%、及び74.4%であった。対照的に、漸増AAV421による
全体のCD3ノックアウト効率は、TRC1-2x.87EEの電気穿孔単独では57.
18%であったのに対し、56.99%、56.62%、57.4%、及び55.4%で
あった(図33B)。従って、一本鎖AAVゲノムの存在下でのTRC1-2x.87E
Eの電気穿孔は、TRC1-2x.87EEヌクレアーゼの全体的なノックアウト効率の
増加をもたらすが、自己相補的AAVゲノムの存在下ではもたらさないと思われる。この
増加のために、CAR+であるCD3-細胞のパーセントは、CD3-/CAR+細胞の
数がより多いにもかかわらず、AAV421及びAAV422で形質導入された細胞間で
有意に異ならない。AAV421を使用したCAR+のCD3-細胞の最も高いパーセン
トは24.18%であり、(MOI=3.13e4ウイルスゲノム/細胞)、これと比較
してAAV422によるものは26.48%(MOI=1e5ウイルスゲノム/細胞)で
あった。この観察は、AAV421とAAV422との間のMOIの大きな差を考慮する
と特に興味深い。
的に濃縮する構想を試験した。この場合もまた、パネル全体を試験するのではなく、本発
明者らは、擬似電気穿孔し、次いでAAV422を形質導入した細胞、又はTRC1-2
x.87EEを電気穿孔し、次いでAAV422(2.5e4ウイルスゲノム細胞)を形
質導入した細胞のいずれかの濃縮のみを、新しい実験において試みた。図36Aは、形質
導入後およそ4日目のフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔/形質導入細胞
は、0.13%のCD3-/CAR+細胞のバックグラウンド染色を示した。これと比較
して、TRC1-2x.87EEを電気穿孔し、AAV422を形質導入した細胞は、4
.44%のCD3-/CAR+細胞を示した。細胞を、上記のようにIL-7及びIL-
15の存在下でIM-9細胞(マイトマイシンで前処理)と6日間インキュベートし、次
いでフローサイトメトリによって分析した。図36Bは、IM-9細胞とのインキュベー
ションが、AAV422形質導入細胞中のCD3-/CAR+集団を35.8%まで劇的
に増加したことを示す。CAR+細胞は、濃縮前の6.69%と比較して、全CD3-集
団の45.2%を構成する(図36A)。上記のように、本発明者らはまた、IM-9細
胞の第2の添加により更に濃縮した(図36C)。IM-9細胞を用いた2回のインキュ
ベーションの結果、65.1%のCD3-/CAR+細胞が得られた。CAR+細胞は全
CD3-集団の78.25%を構成し、CD3-/CAR+細胞の有意な抗原依存性濃縮
を示している。
19CAR遺伝子を有していた細胞を、IL-7及びIL-15の存在下でIM-9細胞
とインキュベーションすることによりうまく濃縮することができ、わずか12日の培養で
90%超がCAR+であるCD3-集団をもたらし得ることを明確に実証している。
本研究では、一本鎖AAVベクターがTRC1-2x.87EEヌクレアーゼのノック
アウト効率を増加させるという観察を追跡した。第1の実験では、細胞にTRC1-2x
.87EE(2μg)を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のAAV412(6.25
e4、1.25e4、2.5e4、又は5e4ウイルスゲノム/細胞)の形質導入のいず
れかを行った。形質導入後4日目に、細胞をCD3に対する抗体で標識し、フローサイト
メトリによって分析した(図37A)。擬似形質導入細胞では、20.7%がCD3-で
あり、これと比較して漸増AAV412を形質導入した細胞では21.6%、23.7%
、25.5%、及び25%であり、TRC1-2x.87EEのノックアウト効率はAA
V412の存在下で最大23%高い(25.5%を20.7%と比較)。
更なる実験において、細胞に、β2-ミクログロブリン遺伝子を標的とするヌクレアーゼ
をコードするmRNA(2μg)を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のAAV412
の形質導入のいずれかを行った。形質導入後4日目に、細胞をβ2-ミクログロブリンに
ついて染色し、フローサイトメトリによって分析した(図37B)。擬似形質導入細胞で
は、β2-ミクログロブリンノックアウト効率は64.5%であり、漸増量のAAV41
2を形質導入した細胞では68.6%、70.7%、77.2%、及び82.5%に増加
し、ノックアウト効率は最大27.9%上昇した(82.5%を64.5%と比較)。
導入又はAAV422(AAV412と同じMOIを使用)を形質導入のいずれかを行っ
た。細胞をCD3に対する抗体で標識し、細胞をフローサイトメトリによって分析した(
図37C)。擬似形質導入細胞は62.2%のT細胞受容体ノックアウトを示し、漸増量
のAAVによるものは、T細胞受容体ノックアウト頻度は72.6%、75.5%、78
.3%、及び75.1%に増加した。ここで、AAV422の存在は、TRC1-2x.
87EEのノックアウト効率を25.8%増加させている(78.3%を62.2%と比
較)。2つの異なるヌクレアーゼおよび2つの異なるAAVベクターを使用して、これら
の3つの実験の間で、ノックアウト効率のパーセント増加がほぼ同一であることは特筆す
べきである。まとめると、これらのデータは、一本鎖AAVベクターによる細胞の形質導
入が、ヌクレアーゼ又はAAVカーゴとは無関係に、本発明者らのヌクレアーゼのノック
アウト効率を増加させることを強く示している。
上記の実験は、細胞にTRC1-2x.87EEmRNAを電気穿孔し、直後に細胞に
AAV421を形質導入することによるCAR T細胞の生成、及びCD19発現IM-
9細胞と共培養することによって、これらの細胞をCD3-/CAR+集団に関して濃縮
できることを明確に実証している。次に、これらのCAR T細胞の標的細胞に対する活
性を調べた。第1の実験では、上記及び図34Cに示す細胞を、CD19+Raji細胞
又はCD19-U937細胞のいずれかが標的集団であるIFN-γELISPOTアッ
セイに用いた。図38Aに示すように、抗CD19CAR T細胞をU937細胞と共に
インキュベートした場合、それらは標的:エフェクター比にかかわらずIFN-γを分泌
しなかった。しかし、CAR T細胞をRaji細胞と共にインキュベートすると、高レ
ベルのIFN-γ分泌が用量依存的に起こり、IFN-γの分泌が抗原特異的であること
が示された。
ッセイにも使用した。簡潔には、CAR T細胞をルシフェラーゼ標識Raji細胞と共
に10:1の比でインキュベートした。いくつかの時点で、細胞を洗浄し、溶解して、何
個の細胞が残っているかの尺度としてルシフェラーゼ活性を測定した。対照細胞は、55
00任意単位を超えるルシフェラーゼ活性を示した(図38B)。2時間、3時間、4時
間、及び5時間の共インキュベーションにより、ルシフェラーゼ活性はそれぞれ4598
、3292、2750、及び1932任意単位まで減少した。従って、共インキュベーシ
ョンの5時間以内に、ルシフェラーゼ活性は約65%低下し、CAR T細胞の強力な細
胞溶解活性を示した。
AR T細胞がCD19+細胞を死滅させるために有効であることを実証している。
AAVによって生成されるHDR鋳型は線形DNA分子であるので、任意の供給源由来
の線形DNAが、CAR遺伝子をTRC1-2認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型
であり得ると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、TRC1-2認識配列座
に相同である相同アームに隣接する抗CD19CAR遺伝子を含むいくつかのプラスミド
を作製した。いくつかのプラスミドでは異なるプロモータが使用され、相同アームは、自
己相補的なAAVベクターを模倣する「短い」(5’相同アームで200bp及び3’相
同アームで180bp)又は一本鎖AAVベクターを模倣する「長い」(5’相同アーム
で985bp及び3’相同アームで763bp)のいずれかであった。短い相同アームを
有するプラスミドは「pDS」と名付け、長い相同アームを有するものは「pDI」と名
付けた。更にいくつかのプラスミドは、CAR遺伝子の上流にイントロンを含んでいた。
ヒトCD3+T細胞に、線形化されたCARドナープラスミド単独(精製された線状化プ
ラスミドの濃度に応じて500ng~1000ngの量が変化する)を電気穿孔するか、
又はTRC 1-2.87EEmRNA(2μg)と共電気穿孔した。対照として、細胞
に擬似電気穿孔又はTRC1-2x.87EE単独の電気穿孔を行った。図39のグラフ
には、全ての電気穿孔ンの説明を表示している。電気穿孔の約4日後、細胞を、CD3及
び抗CD19CARに対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した(図3
9)。図39Aは、0.15%のバックグラウンドCD3-/CAR+染色を示す。バッ
クグラウンドCD3+/CAR+染色は4.31%で異常に高かったことに留意すべきで
ある。図39Bは、TRC1-2x.87EEmRNA単独を電気穿孔した細胞を示し、
60.8%のCD3ノックアウトを実証している。図39C及び39Dは、TRC1-2
x.87EEmRNAと、EF1αコアプロモータ及びHTLVエンハンサーを有する長
い相同アームベクター又はEF1αコアプロモータを有する短い相同アームベクター(エ
ンハンサーを有さない)のいずれかとを、共電気穿孔したサンプルを示す。興味深いこと
に、EF1αコアプロモータのみを有する線形化CARドナーは、2.38%のCD3-
/CAR+集団を生成したが、EF1αコアプロモータ及びHTLVエンハンサーを有す
るベクターは、有意なパーセンテージのCD3-/CAR+細胞を生成しなかった。TR
C1-2x.87EEmRNAの不在下でこれらの2つのベクターを電気穿孔した細胞は
、CD3-/CAR+集団の有意な増加を示さなかった(図39E及び39F)。TRC
1-2x.87EEの存在下でのEF1αコアプロモータベクターによるCD3-/CA
R+集団の増加は、線形化プラスミドがTRC1-2認識配列における二本鎖切断を修復
するためのHDR鋳型として機能できることを示唆した。
の長い相同アーム構築物を示す。図39Gに示すこれらの構築物の1つは、CAR遺伝子
の5’末端にイントロンも含む。驚くべきことに、MNDプロモータ及びイントロンを有
する長い相同アームプラスミドは、有意なCAR発現を示したが(図39G、4.14%
のCD3-/CAR+)、一方、イントロンレス構築物(図39H)は、TRC1-2x
.87EEmRNAを共電気穿孔した場合に検出可能なCAR発現を示さなかった。MN
Dプロモータを有するが、イントロンを有さない短い相同アームプラスミドもTRC1-
2x.87EEmRNAを用いて試験して、CAR発現は実証されなかった(図39I)
。MNDプロモータ含有構築物はいずれもTRC1-2x.87EEmRNAの不在下で
はいずれのCAR+細胞も生成しなかった(図39J、39K、及び39L)。
ム構築物及びCARの発現を駆動するCMVプロモータを有する「長い」相同性アーム構
築物を試験した。単独では、これらの線形化プラスミドのいずれも有意なCAR+細胞を
もたらさなかった(図39O及び39P)。細胞にTRC1-2x.87EEmRNAを
共電気穿孔した場合、JeT含有構築物は2.69%のCD3-/CAR+細胞を示し、
CMV含有構築物は2.7%のCD3-/CAR+細胞を生じた。
ラスミドDNAが、TRC1-2x.87EEによって引き起こされるDNA切断を修復
するためのHDR鋳型として機能し、CAR核酸の挿入をもたらすことを明確に実証して
いる。プロモータ強度がCARの発現において重要な役割を果たし、遺伝子中にイントロ
ンが存在する場合、いくつかのプロモータがより効率的な発現を駆動することは明らかで
ある。
ことを確認するために、本発明者らはCAR内および相同アームの外側に位置するプライ
マーを使用して上記のように細胞を分析した(図40、表11)。サンプル1及び2は、
擬似電気穿孔又はTRC1-2x.87EEをコードするmRNAのみの電気穿孔のいず
れかを行った細胞由来のPCR産物である。上記の結果と一致して、PCRバンドは存在
せず、TRC1-2認識部位におけるCAR遺伝子の欠落を示す。サンプル3、4、及び
5は、TRC1-2x.87EE及び線形化CAR相同プラスミドを共電気穿孔した細胞
に由来する(サンプル名は図40のものである)。各サンプルは、CAR遺伝子発現カセ
ットのTRC1-2認識部位への挿入を示す予測サイズの2つのPCRバンドを示す。サ
ンプル6、7、及び8は、サンプル3、4、及び5と同じ線形化CAR相同プラスミドを
電気穿孔したが、TRC1-2x.87EEmRNAは含まない細胞に由来する。予想ど
おり、PCRバンドは存在しない。サンプル9及び10は、擬似電気穿孔又はTRC1-
2x.87EEをコードするmRNAのみの電気穿孔のいずれかを行った細胞由来のPC
R産物であり、PCRバンドは示していない。サンプル11、12、13、及び14は、
TRC1-2x.87EE及び線形化CAR相同プラスミドを共電気穿孔した細胞に由来
する(サンプル名は図40のものである)。各サンプルは、CAR遺伝子のTRC1-2
認識部位への挿入を示す予測サイズの2つのPCRバンドを示す。試料15、16、17
、及び18は、サンプル11、12、13、及び14と同じ線形化CAR相同プラスミド
を電気穿孔したが、TRC1-2x.87EEmRNAは含まない細胞に由来する。予想
どおり、PCRバンドは存在しない。
相同プラスミドをヒトCD3+T細胞に共電気穿孔することが、CAR遺伝子をTRC1
-2認識配列に挿入する有効な方法であることを明確に実証している。
まとめると、上記のデータは、JeTプロモータを利用するベクターが、CARの高い
一貫した発現を駆動し、相同アームが長いほど遺伝子挿入効率を上昇させ得ることを示す
。本発明者らは、長い相同アーム及び抗CD19CARの発現を駆動するJeTプロモー
タを有する一本鎖AAV(本明細書ではAAV423)を作製するために使用される、図
41に示すベクター(配列番号125)を設計し、作製した。ヒトCD3+T細胞にTR
C1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、漸増量のAAV423を形質
導入した。上記のデータが、MOIが高いほど挿入効率を上昇させ得ることを示唆したの
で、本発明者らは1.875e4から1.5e5の範囲の力価を使用した。対照として、
細胞に、TRC1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質
導入するか、又は擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した。形質導
入の約6日後、細胞をCD3又は抗CD19CARを認識する抗体で標識し、フローサイ
トメトリによって分析した。図42に示されるように、擬似電気穿孔し、次いで漸増量の
AAV423を形質導入した細胞は、圧倒的にCD3+/CAR-(96.6%~98.
5%の範囲)である。TRC1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、擬
似形質導入した細胞は、CD3-が39%であり、T細胞受容体の効率的なノックアウト
を示した。これらの細胞において、バックグラウンドCAR染色は非常に低かった(約2
%)。TRC1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のA
AV423を形質導入した細胞は、CD3のノックアウトと併せて劇的なCAR染色を示
した。CD3-/CAR+集団は21.6%から22.7%の範囲であり、一方CD3+
/CAR+集団は約2%であった。上記のように、一本鎖AAVの存在は、TRC1-2
認識部位での全体の遺伝子改変効率を増加させ、総CD3-集団は、対照細胞における4
1.44%から電気穿孔し後、次いで漸増量のAV423を形質導入した細胞における5
7.6%、59.2%、58.7%、及び56.1%に増加した。CAR+であるCD3
-細胞のパーセントは、37.5%から39.9%の範囲であり、上記のデータと比較し
て挿入効率の劇的な増加を示した。
確認するために、本発明者らはCAR内及び相同アームの外側に位置するプライマーを使
用して上記のように細胞を分析した(図43、表12)。
致して、PCRバンドは存在せず、TRC1-2認識部位におけるCAR遺伝子の欠落を
示す。サンプル3~6は、擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した
細胞に由来する。上記の結果と一致して、PCRバンドは存在していない。サンプル7は
、TRC1-2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入し
た細胞に由来し、PCRバンドを示さない。サンプル8~11は、TRC1-2x.87
EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した細
胞に由来し、CARがTRC1-2認識配列に挿入された場合に予想されるPCRバンド
を示している。
、ATRC1-2認識部位に組み込まれて、抗CD19CARをコードすることができる
線形化DNA鋳型をT細胞にトランスフェクトすることができるように、AV423プラ
スミド(図41)が1種の制限酵素による消化で線形化され、1又は複数の制限酵素によ
る消化で細胞に送達され得ることがさらに想定される。
遺伝子編集抗CD19CAR T細胞の有効性を、播種性B細胞リンパ腫のマウスモデ
ルにおいて評価した。上記のように活性化T細胞にTRC1-2x.87EEmRNAを
電気穿孔し、次にJeTプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗CD19C
AR発現カセットを含むAAV6ベクターを形質導入した。IL-2(10ng/mL)
と共に5日間培養した後、細胞表面のCD3及び抗CD19CAR発現について、細胞を
、以前に記載したようにフローサイトメトリによって分析した(図44A)。CD3-細
胞を、抗CD3磁気ビーズを使用してCD3+細胞を枯渇させることにより濃縮した。次
いで枯渇した細胞をIL-15(10ng/mL)及びIL-21(10ng/mL)中
で3日間培養し、CD3及び抗CD19CARの細胞表面発現について再分析した(図4
4B)。CD3-集団の単離は非常に効率的であり、CD3+細胞の枯渇後にフローサイ
トメトリによって測定して99.9%の純度を得た(図44B)。精製されたCD3-集
団は、56%のCD4+及び44%のCD8+細胞を含み(図44C)、CD62L及び
CD45ROに対する染色によって決定される、セントラルメモリー、移行性メモリーの
表現型を主に有していた(図44D)。
boratories International Inc.(Morrisvill
e、NC、USA)によって実施された。ホタルルシフェラーゼ(ffLuc)44を安
定に発現するCD19+Raji細胞を、2.0×105細胞/マウスの用量で、1日目
に5~6週齢の雌NSGマウスに静脈注射した。4日目に、PBS、又は同じ健康なドナ
ーPBMCから調製された遺伝子編集された対照TCR KO T細胞を含有するPBS
、又は同じドナーから調製されたCAR T細胞の表示の用量を含有するPBSを、マウ
スに静脈注射した。表示の日に、生存マウスにルシフェリン基質(150mg/kg生理
食塩水)を腹腔内注射し、麻酔し、7分後にIVIS SpectrumCT(Perk
in Elmer、Waltham、MA)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。
Living Imageソフトウェア4.5.1(Perkin Elmer、Wal
tham、MA)を使用してデータを分析し、エクスポートした。発光信号強度は、p/
秒/cm2/srの輝度で表される。
図45に示すように、CD19+Raji細胞の成長は、8日目までに全てのマウスに
おいて低レベルが明らかであり、11日目までに未処置及びTCR-対照群で有意に増加
した。対照群では、有意な腫瘍成長が15日目まで観察され、18日目又は19日目まで
に全ての対照群を安楽死させた。対照的に、抗CD19CAR T細胞で処置したマウス
の群は全て、11日目までに腫瘍成長の兆候を示さず、低用量群の単一のマウスを除いて
、試験の29日まで依然として腫瘍が生じないままであった。腫瘍再成長は、36日目あ
たりで低用量コホートにおいて3匹のマウスで観察された。3匹のうちの1匹は42日目
に死亡したが、画像化によりこの動物では低レベルの腫瘍しか認められなかったため、死
亡が腫瘍関連であるとは考えにくい。
これらの結果は、遺伝子編集されたCD3-CAR T細胞によるCD19+腫瘍細胞
のインビボクリアランスの明確な証拠を提供し、同種異系CAR T細胞療法のためのこ
のプラットフォームの更なる前臨床開発を支援する。
Claims (69)
- 改変ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子をそのゲノム中に含む遺伝子
改変細胞であって、
前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が5’から3’に:
(a)前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の5’領域;
(b)外因性ポリヌクレオチド;及び
(c)前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の3’領域;
を含み、
遺伝子改変ヒトT細胞であるか、又はヒトT細胞に由来する遺伝子改変細胞であり、非
改変対照細胞と比較した場合、内因性TCRの細胞表面での発現が低下している、遺伝子
改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、前記
キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細胞内シグナル伝達
ドメインを含む、請求項1に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号112と少なくとも80%の配列同一性を有する細
胞外リガンド結合ドメインを含み、前記細胞外リガンド結合ドメインがCD19に結合す
る、請求項2に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号113と少なくとも80%の配列同一性を有する細
胞内細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項2から3のいずれか1項に記載の遺伝子
改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号114と少なくとも80%の配列同一性を有する細
胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項2から4のいずれか1項に記載の遺伝子
改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体がシグナルペプチドをさらに含む、請求項2から5のいずれか1
項に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記シグナルペプチドが、配列番号115と少なくとも80%の配列同一性を有する、
請求項6に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体がヒンジドメインをさらに含む、請求項2から7のいずれか1項
に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記ヒンジドメインが、配列番号116と少なくとも80%の配列同一性を有する、請
求項8に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体が膜貫通ドメインを更に含む、請求項2から9のいずれか1項に
記載の遺伝子改変細胞。 - 前記膜貫通ドメインが、配列番号117と少なくとも80%の配列同一性を有する、請
求項10に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記キメラ抗原受容体が、配列番号111と少なくとも80%の配列同一性を有する、
請求項2から11のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、前記外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモ
ータ配列を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記プロモータ配列が、配列番号118と少なくとも80%の配列同一性を有する、請
求項13に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号119と少なくとも80%の配列同一性を有
する、請求項1~14のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号3を含む認識配列内の位置において前記TC
Rアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1~15のいずれか1項に記載の遺伝子
改変細胞。 - 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号120と少なくとも80%の
配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項16に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号4を含む認識配列内の位置において前記TC
Rアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1~15のいずれか1項に記載の遺伝子
改変細胞。 - 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号121と少なくとも80%の
配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項18に記載の遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号5を含む認識配列内の位置において前記TC
Rアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1~15のいずれか1項に記載の遺伝子
改変細胞。 - 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号122と少なくとも80%の
配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項21に記載の遺伝子改変細胞。 - 改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞の作製方法であって、
(a)細胞に
(i)操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;又は
(ii)操作されたヌクレアーゼタンパク質;
を導入する工程:
ここで、前記操作されたヌクレアーゼが、前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の
認識配列に切断部位を生成し;並びに
(b)外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列を前記細胞に導入する工程;
を含み、
前記細胞がヒトT細胞であるか、又はヒトT細胞に由来する細胞であり;前記外因性ポ
リヌクレオチドの配列が前記切断部位において前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子に
挿入され;更に前記遺伝子改変細胞が、非改変対照細胞と比較した場合、内因性TCRの
細胞表面発現が低下している、方法。 - 前記第2の核酸配列が、5’から3’に:
(a)前記切断部位に隣接する5’上流配列に相同である5’相同アーム;
(b)前記外因性ポリヌクレオチド;及び
(c)前記切断部位に隣接する3’下流配列に相同である3’相同アーム;
を含み、
前記外因性ポリヌクレオチドの配列が相同組換えにより前記切断部位において前記ヒト
TCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項22に記載の方法。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、前記
キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細胞内シグナル伝達
ドメインを含む、請求項22又は23に記載の方法。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、前記外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動する第1の
プロモータ配列を含む、請求項22~24のいずれか1項に記載の方法。 - 少なくとも前記第2の核酸配列が、前記第2の核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイル
ス(AAV)ベクターと前記細胞とを接触させることによって前記細胞に導入される、請
求項22~25のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第2の核酸が、前記5’相同アームの5’上流に位置するか、又は前記3’相同ア
ームの3’下流に位置する第2のプロモータ配列を更に含む、請求項26に記載の方法。 - 前記組換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、請求項26又は27に
記載の方法。 - 前記組換えAAVベクターがAAV2又はAAV6の血清型を有する、請求項26~2
8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記操作されたヌクレアーゼが、組換えメガヌクレアーゼ、組換えジンクフィンガーヌ
クレアーゼ(ZFN)、組換え転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN
)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、又はメガTALヌクレアーゼである、請求項2
2~29のいずれか1項に記載の方法。 - 前記操作されたヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである、請求項22~30のい
ずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼが野生型ヒトTCRアルファ定常領域(配列番号1)の残
基93~208内の認識配列を認識及び切断し、前記組換えメガヌクレアーゼが第1のサ
ブユニット及び第2のサブユニットを含み、前記第1のサブユニットが前記認識配列の第
1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、前記第2のサブユニッ
トが前記認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含む、
請求項31に記載の方法。 - 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号3を含む、請求項
32に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号8~18のいずれか1つの残基198~344又
は配列番号19~27のいずれか1つの残基7~153と少なくとも80%の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号8~18のいずれか
1つの残基7~153又は配列番号19~27のいずれか1つの残基198~344と少
なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、
(a)配列番号8~18のいずれか1つの215位;又は
(b)配列番号19~27のいずれか1つの24位
に対応する位置にYを含む、請求項33又は34に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号8~18のいずれか1つの残基215~270又は配列
番号19~27のいずれか1つの残基24~79を含む、請求項33~35のいずれか1
項に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号8~18のいずれか1つの残基24~79又は配列番号
19~27のいずれか1つの残基215~270を含む、請求項33~36のいずれか1
項に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号8~18のいずれか1つの残基198~344又
は配列番号19~27のいずれか1つの残基7~153を含む、請求項33~37のいず
れか1項に記載の方法。 - 前記第2のサブユニットが、配列番号8~18のいずれか1つの残基7~153又は配
列番号19~27のいずれか1つの残基198~344を含む、請求項33~38のいず
れか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リン
カーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項33
~39のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号8~27のいずれか1つのアミノ酸配列を含
む、請求項33~40のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号4を含む、請求項
32に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号28又は29の残基7~153と少なくとも80
%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号28
又は29の残基198~344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含む、請求項42に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の24位に対応する位置にYを含む、請求
項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の26位に対応する位置にTを含む、請求
項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の46位に対応する位置にYを含む、請求
項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号2又は29の215位に対応する位置にHを含む、請求
項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の266位に対応する位置にTを含む、請
求項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の268位に対応する位置にCを含む、請
求項42又は43に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の残基24~79を含む、請求項42~4
9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の残基215~270を含む、請求項42
~50のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号28又は29の残基7~153を含む、請求項4
2~51のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第2のサブユニットが、配列番号28又は29の残基198~344を含む、請求
項42~52のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リン
カーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項42
~53のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号28又は29のアミノ酸配列を含む、請求項
42から54のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号5を含む、請求項
32に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号30の残基7~153又は配列番号31若しくは
32の残基198~344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み
、前記第2のサブユニットが、配列番号30の残基198~344又は配列番号31若し
くは32の残基7~153と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
、請求項56に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、
(a)配列番号30の24位、又は
(b)配列番号31若しくは32の215位、
に対応する位置にYを含む、請求項56又は57に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号30の残基24~79又は配列番号31若しくは32の
残基215~270を含む、請求項56~58のいずれか1項に記載の方法。 - 前記HVR2領域が、配列番号30の残基215~270又は配列番号31若しくは3
2の残基24~79を含む、請求項56から59のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号30の残基7~153又は配列番号31若しくは
32の残基198~344を含む、請求項56~60のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第2のサブユニットが、配列番号30の残基198~344又は配列番号31若し
くは32の残基7~153を含む、請求項56~61のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リン
カーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項56
~62のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号30~32のいずれか1つのアミノ酸配列を
含む、請求項56~63のいずれか1項に記載の方法。 - それを必要とする対象において癌を治療するための免疫療法の方法であって、請求項1
~21のいずれか1項に記載の前記遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む
医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - それを必要とする対象において癌を治療するための免疫療法の方法であって、請求項2
2~64のいずれか1項に記載の方法に従って作製された遺伝子改変細胞及び医薬として
許容される担体を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 前記癌が、癌腫の癌、リンパ腫、肉腫、芽腫、及び白血病からなる群から選択される、
請求項65及び66のいずれか1項に記載の方法。 - 前記癌が、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立
腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる
群から選択される、請求項65及び66のいずれか1項に記載の方法。 - 前記B細胞起源の癌が、B系列急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病
、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項68に記載の方法。
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