JP2021072785A - 改変ヒトt細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年2月19日に出願された「改変ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第62/297,426号明細書、及び2015年10月5日に出願された「改変ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞」と題する米国特許仮出願第62/237,394号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願には、EFS−Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年10月3日に作成された前記ASCIIコピーの名称は2000706_00180WO1.txtであり、サイズは264,046バイトである。
じてすぐに患者に提供することができる。従って、GVHDの発生を防止するために内因性T細胞受容体を欠く同種異系CAR T細胞の開発が必要である。
ば、LAGLIDADG(配列番号7)ファミリーのメンバーは、保存されたLAGLIDADG(配列番号7)モチーフの1又は2つのいずれかのコピーを有することを特徴とする(非特許文献8を参照されたい)。LAGLIDADG(配列番号7)モチーフの単一のコピーを有するLAGLIDADG(配列番号7)ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、LAGLIDADG(配列番号7)モチーフの2つのコピーを有するメンバーは単量体として見出される。
非特許文献14)。従って、機能的「単鎖」メガヌクレアーゼを、単一の転写産物から発現させることができる。
、改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子は、配列番号121と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は最大100%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
mRNAを用いて細胞に導入される。いくつかの実施形態において、mRNAは、本明細書に記載の少なくとも1つの操作されたヌクレアーゼのコード配列及び少なくとも1つの更なるタンパク質(例えば、第2のヌクレアーゼ)のコード配列を含むポリシストロニックmRNAであり得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、同じ遺伝子(例えば、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子)内の異なる認識配列を標的とする、本明細書に記載の2つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードすることができる。他の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、及び同じ遺伝子(例えば、T細胞受容体アルファ定常領域遺伝子)内の異なる認識配列を認識及び切断するか、あるいは、ゲノム中の目的の別の遺伝子内の異なる認識配列を認識及び切断する第2のヌクレアーゼをコードすることができる。このような実施形態において、このようなポリシストロニックmRNAを使用して作製された遺伝子改変細胞は、同時にノックアウトされた複数の遺伝子を有することができる。更なる実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の少なくとも1つの操作されたヌクレアーゼ及び細胞に有益な1つの更なるタンパク質をコードし、切断部位への目的の外因性配列の挿入効率を改善し、且つ/又は疾患の治療に有益である。
用して細胞に導入される。
配列番号19〜27のいずれか1つの235位に対応する位置にSを含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号8〜18のいずれか1つの46位;又は(b)配列番号19〜27のいずれか1つの237位に対応する位置にF若しくはYを含む。別のこのような実施形態において、HVR2領域は、(a)配列番号8〜18のいずれか1つのそれぞれ26、28、38、44、及び46;又は(b)配列番号19〜27のいずれか1つのそれぞれ217、219、229、235、及び237位に対応する位置に、T、F又はY、F、S及びF又はY及びRの1又は複数を含む。
号30の残基198〜344又は配列番号31若しくは32の残基7〜153を含む。
配列番号1は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子(NCBI Gene ID番号28755)のヌクレオチド配列を示す。
62〜233を示す。
本明細書で言及する特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されるGenBankデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されると同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定する意図のものではない。
基対認識配列の塩基10〜13を含む。コンパクトTALENの場合、認識配列は、I−TevIドメインによって認識される第1のCNNNGN配列、続いて長さが4〜16塩基対である非特異的スペーサ、続いてTAL−エフェクタードメインによって認識される長さ16〜22bpの第2の配列である(この配列は、典型的には5’T塩基を有する)。コンパクトTALENによる切断は、2塩基対の3’オーバーハングを生じる。CRISPRの場合、認識配列は、典型的には16〜24塩基対の配列であり、これにガイドRNAが結合してCas9切断を誘導する。CRISPRによる切断は平滑末端を生成した。
。このようなCARは、キメラ自己抗体受容体(CAAR)と呼ばれ、その使用は本発明に包含される。
列の類似性パーセントは、BLASTnアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである:ワードサイズ=11;ギャップ開始ペナルティ=−5;ギャップ伸長ペナルティ=−2;マッチ報酬=1;ミスマッチペナルティ=−3。
る供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用してもよく、又はベクターと組み合わせて使用してもよい。
本発明は、切断部位におけるNHEJが、TCRアルファ鎖サブユニットの発現及び最終的に細胞表面でのT細胞受容体の発現を破壊するように、操作されたヌクレアーゼを、ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子(配列番号1)に見出される認識配列の認識及び切断に利用できるという発見に部分的に基づいている。更に、本発明によれば、外因性ポリヌクレオチド配列は、例えば相同組換えによって、目的の配列が細胞内で同時に発現されるようにヌクレアーゼ切断部位においてTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される。このような外因性配列は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性TCR受容体、又は任意の他の目的のポリペプチドをコードすることができる。
生存細胞のゲノム中でDNA切断を行うために部位特異的ヌクレアーゼを使用することが可能であり、このようなDNA切断は突然変異誘発性NHEJ修復を介して、又はトランスジェニックDNA配列との相同組換えを介してゲノムの永続的改変をもたらし得ることが、当技術分野では公知である。NHEJは切断部位で突然変異誘発を生じ、対立遺伝子の不活性化を引き起こす。NHEJ関連突然変異誘発は、初期停止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を生成するフレームシフト突然変異、を介して対立遺伝子を不活性化する可能性があり、あるいはナンセンス変異依存mRNA分解等の機序を引き起こす可能性がある。NHEJを介した突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子中に存在する配列を標的化するために使用することができる。標的遺伝子座における二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的と相同である配列に隣接するトランスジェニックDNA配列の相同組換えを刺激することが公知である。このようにして、外因性核酸配列を標的座に挿入することができる。このような外因性核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性TCR、又は目的の任意の配列若しくはポリペプチドをコードすることができる。
Nickaseを用いて実施することができる。所定のDNA部位を認識するCRISPR及びCRISPR Nickaseを生成するための方法予は、当技術分野で公知であり、例えば、Ran、ら、(2013)Nat Protoc.8:2281〜308を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、TALEN又はコンパクトTALENを使用して実施することができる。所定のDNA部位に結合するTALEドメインを作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Reyonら、(2012)Nat Biotechnol.30:460〜5を参照されたい。更なる実施形態において、本発明はメガTALを使用して実施することができる。
識配列の半分(即ち、認識半部位)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユニットの接合点付近の認識配列の中央にある。DNA鎖切断は、メガヌクレアーゼによるDNA切断が4塩基対の3’一本鎖オーバーハングの対を生成するように、4塩基対によって相殺される。
クレアーゼのTRC3結合及びTRC4結合サブユニット領域と、TRC3−4x.3メガヌクレアーゼのTRC3結合及びTRC4結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
本発明は、ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子(配列番号1)内に見出される認識配列を認識及び切断する操作されたヌクレアーゼを使用して、遺伝子改変細胞を作製する方法を提供する。このような認識配列における切断は、切断部位におけるNHEJを可能にし、ヒトT細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊し、細胞表面でのT細胞受容体の発現及び/又はまたは機能の低下をもたらす。更に、このような認識配列における切断は、外因性核酸配列のTCRアルファ定常領域遺伝子への直接相同組換えを更に可能にすることができる。
USA.81(3):659〜63)又はSV40初期プロモータ(Benoist及びChambon(1981)、Nature.290(5804):304〜10)等の構成的プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導性プロモータ(Dingermannら、(1992)、Mol Cell Biol.12(9):4038〜45)等の誘導性プロモータが挙げられる。
標的とする、本発明の2つ以上のヌクレアーゼをコードすることができる。あるいは、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の少なくとも1つのヌクレアーゼと、同じ遺伝子に位置する別個の認識配列を標的とするか、又は切断部位が両方の遺伝子において生成されるように第2の遺伝子に位置する第2の認識配列を標的とする少なくとも1つの更なるヌクレアーゼとをコードすることができる。ポリシストロニックmRNAは、限定するものではないが、IRES要素、T2A要素、P2A要素、E2A要素、及びF2A要素を含む、同じmRNA分子由来の2つ以上の遺伝子(即ち、シストロン)の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を含むことができる。
能性を高めるために、標的化分子に更に結合されることが有利であり得る。このような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に対する天然リガンド(又は天然リガンドの一部)が挙げられる。
スベクターを使用して細胞に導入される。このようなベクターは当技術分野で公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる(Vannucciら、(2013 New Microbiol.36:1〜22)に概説されている)。本発明に有用な組換えAAVベクターは、細胞へのウイルスの形質導入及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態において、組換えAAVベクターは、AAV2又はAAV6の血清型を有する。組換えAAVベクターはまた、それらが宿主細胞において第2鎖DNA合成を必要としないように自己相補的であり得る(McCartyら、(2001)Gene Ther.8:1248〜54)。
JeTプロモータ(国際公開第2002/012514号パンフレット)を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子改変細胞、又は本発明の遺伝子改変細胞の集団及び医薬担体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy(第21版、2005年)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、細胞は、典型的には、医薬として許容される担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。当然のことながら、担体は製剤中の他の成分と適合するという意味において許容可能でなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な1又は複数の更なる薬剤を更に含むことができる。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトT細胞(又はそれに由来する細胞)である更なる実施形態において、本発明の医薬組成物は、インビボでの細胞増殖及び生着を促進する、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−7、IL−15、及び/又はIL−21)等の生体分子を更に含むことができる。本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤又は生物学的分子と同じ組成物で投与することができ、あるいは、別々の組成物で同時投与することができる。
療に有用である。このような癌としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫が挙げられる。特定の実施形態において、B細胞起源の癌としては、限定するものではないが、B系列急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法において使用するための組換えAAVベクターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK−293のような哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスのcap遺伝子及びrep遺伝子は、その自己複製を防止して、治療遺伝子(例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達する余地を作り出すためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(例えば、アデノウイルス)成分を提供することが必要である(Cots D、Bosch
A、Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370〜81)。しばしば、組換えAAVベクターは、細胞株に、「ヘルパー」成分をコードする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在DNA配列含むウイルス性ITRを含む第3のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションを使用して作製される。カプシドに包まれたゲノム(目的のITR及び1又は複数の介在遺伝子)を含むウイルス粒子は、その後、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて、目的の(1又は複数の)遺伝子に、細胞、組織、又はヒト患者等の生物に送達する。
ds(28):267〜75)(Tong Yら、(2007)J Gene Med,9::956〜66)が挙げられる。これらのプロモータ又は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、HEK−293細胞において高度に活性ではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは期待されない。同様に、本発明のウイルスベクターは、他の細胞株の使用及び不適合性組織特異的プロモータの使用(即ち、周知のHeLa細胞株(ヒト上皮細胞)及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用)を企図している。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫PDZD4(小脳)、C6(肝臓)、ASB5(筋肉)、PPP1R12B(心臓)、SLC5A12(腎臓)、コレステロール調節APOM(肝臓)、ADPRHL1(心臓)、及び一遺伝子性奇形症候群TP73L(筋肉)が挙げられる。(Jacox Eら、(2010)PLoS One v.5(8):e12274)。
クレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつ、及びどの組織に送達されるかを選択することによって、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間−時間的様式で調節することができるので、有利である。しかし、担持能力が著しく制限されたウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、このアプローチに欠点を生じさせる。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、特に組換えメガヌクレアーゼ、及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。
90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと、わずか約1〜40個のアミノ酸残基、わずか約1〜20個、わずか約1〜10個、わずか約5個、わずか4、3、2個、又は更には1個のアミノ酸残基が異なり得る。
本明細書で「TRC1−2メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号8〜27)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC1−2認識配列(配列番号3)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC1−2組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC1−2メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号3のTRC1認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC2認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
EQ、TRC1−2x.87、及びTRC1−2x.163の330位(R残基を含む)(網掛けの灰色及び下線)を除いて、HVR2領域の外側で同一である。HVR1領域と同様に、HVR2領域も高度に保存されている。
本明細書で「TRC3−4メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号28及び29)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC3−4認識配列(配列番号4)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC3−4組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC3−4メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号4のTRC3認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC4認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
本明細書で「TRC7−8メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号30〜32)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC7−8認識配列(配列番号5)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC7−8組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC7−8メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号5のTRC7認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC8認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
TRC1−2、TRC3−4、及びTRC7−8メガヌクレアーゼがそれぞれの認識配列(それぞれ配列番号3、4、及び5)を認識及び切断することができるかどうかを決定するために、各組換えメガヌクレアーゼを、先に記載のCHO細胞レポーターアッセイ(国際公開第/2012/167192号パンフレット及び図8を参照されたい)を使用して評価した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを保有するCHO細胞レポーター株を作製した。各細胞株のGFP遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能性GFP遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によって分断された。
よって評価して、GFP陽性細胞のパーセンテージを決定した。図10に示すように、各TRC1−2メガヌクレアーゼはトランスフェクションの2日後に高効率を示し、50%を超えるGFP陽性細胞が観察された。この効果は12日間にわたって持続し、細胞毒性の証拠は観察されなかった。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼ、TRC3−4メガヌクレアーゼ、及びTRC7−8メガヌクレアーゼが、それらのそれぞれの認識配列を細胞内で効率的に標的とし、切断できることを実証した。
この研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、Jurkat細胞(不死化ヒトTリンパ球細胞株)においてTRC1−2認識配列を切断できることを実証した。1e6のJurkat細胞に1細胞あたり8e6の所与のTRC1−2メガヌクレアーゼmRNAコピーを、BioRad Gene Pulser Xcellを製造元の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクションの72時間後に、ゲノムDNA(gDNA)を細胞から採取し、T7エンドヌクレアーゼI(T7E)アッセイを実施して内因性TRC1−2認識配列(図11)における遺伝子改変を推定した。T7Eアッセイでは、TRC1−2認識部位に隣接するプライマーを使用してTRC1−2遺伝子座をPCRにより増幅する。TRC1−2遺伝子座内にインデル(ランダムな挿入又は欠失)がある場合、得られたPCR産物は、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混合物からなると思われる。PCR産物を変性させ、ゆっくりと再アニーリングする。ゆっくりとした再アニーリングは、野生型及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二重鎖の形成を可能にし、ミスマッチ塩基及び/又はバルジを生じる。T7E1酵素は、ミスマッチ部位で切断し、ゲル電気泳動によって可視化され得る切断産物を生じる。図11は、TRC1−2メガヌクレアーゼの13の異なるバージョンがT7E1アッセイにおいて陽性結果を生じ、内因性TRC1−2認識配列におけるインデルの効果的な生成を示していることを明確に実証した。
この研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、ドナーから得られたヒトT細胞においてTRC1−2認識配列を切断できることを実証した。CD3+T細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa4D−Nucleofector(Lonza)を製造元の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNAを電気穿孔した。トランスフェクションの3日後及び7日後、gDNAを回収し、T7E1アッセイを上記のように行った。図13Aは、TRC1−2x.87EEがヒトT細胞において内因性TRC1−2認識配列に突然変異を効果的に導入し、メガヌクレアーゼがTRC1−2認識配列を認識及び切断した
ことを示すことを実証している。切断産物の強度は、トランスフェクションの3日目後と7日目後との間で変化がないと思われ、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼによる毒性はほとんど又は全くないことを示唆している。内因性TRC1−2認識配列における突然変異がT細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するために、抗CD3抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。図13Bは、トランスフェクトされたT細胞の約50%がCD3に対して陰性に染色されことを示し、T細胞受容体のノックアウトを示している。CD3陰性集団は、トランスフェクション後3日目と7日目との間で有意に変化せず、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼに関連する毒性はほとんど若しくはまったくないか、又はT細胞受容体発現の喪失を更に示した。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、Jurkat細胞(不死化Tリンパ球細胞株)及びヒトドナーから得られたT細胞の両方において、TRC1−2認識配列を認識及び切断することができることを実証した。更に、これらの研究は、インデルの出現によって証明されるように、NHEJがメガヌクレアーゼ切断部位に生じることを実証した。更に、TRC1−2メガヌクレアーゼは、ドナーから得られた
ヒトT細胞上のT細胞受容体の細胞表面発現を低下させることが示された。
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV405及びAAV406と呼ばれる)を、EagI制限部位を含む外因性核酸配列を相同組換えによりTRC1−2認識配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えAAVベクターは、細胞株に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」成分(例えばアデノウイルス)をコードする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在DNA配列(例えば外因性核酸配列)を含むウイルス性逆位末端反復配列(ITR)を含む第3のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製される(Cots D、Bosch A、Chillon M(2013年)Curr.Gene Ther.13(5):370〜81頁を参照されたい)。図15は、外因性核酸配列をヌクレアーゼ切断部位で細胞ゲノムに導入するために組換えAAVベクターを使用するための一般的なアプローチを示す。
TRC1−2メガヌクレアーゼによる二本鎖切断の発生後にAAV鋳型が相同組換え修復(homology directed repair)(HDR)に適しているかどうかを試験するために、ヒトT細胞を使用して一連の実験を行った。第1の実験では、TRC1−2RNAの電気穿孔のタイミング及び組換えAAVベクターの形質導入を決定した。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、Amaxa 4D−Nucleofector(Lonza)を製造者の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を電気穿孔した。トランスフェクションの2、4、又は8時間後に、細胞にGFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。細胞を、形質導入の72時間後にGFP発現についてフローサイトメトリによって分析した。図18に示すように、トランスフェクションの2時間後に細胞を形質導入した場合、最も高い形質導入効率が観察された(GFP陽性細胞88%)。形質導入効率は、トランスフェクションと形質導入との間の時間が増加するにつれて有意に減少し、4時間でGFP陽性細胞78%及び8時間でGFP陽性細胞65%であった。
導入した。メガヌクレアーゼのみの対照のために、細胞にTRC1−2x.87EEをトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの2時間後に(水を)擬似形質導入した。
AAV形質導入をトランスフェクションの2時間後に実施した場合が、それより後に実施した場合よりも効率的であるという観察の観点から、トランスフェクションおよび形質導入のタイミングを最適化するための実験を行った。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa 4D−Nucleofector(Lonza)を製造者の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼ(1μg)を電気穿孔した。トランスフェクションの直後又はトランスフェクションの2時間後に、細胞にGFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。更に、未刺激細胞に、GFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。形質導入の72時間後に、細胞をGFP発現についてフローサイトメトリによ
って分析した。図23は、トランスフェクションの2時間後に行ったGFP−AAV形質導入が90%のGFP陽性細胞をもたらしたが、トランスフェクション直後の形質導入は98%のGFP陽性細胞を生じたことを示す。休止T細胞はAAV形質導入を受け入れないと思われ、GFP陽性細胞は約0%であった。非形質導入細胞はまた、約0%のGFP陽性細胞を示した。
これらの研究は、AAVベクターを組換えメガヌクレアーゼと併せて使用して、相同組換えを介して、外因性核酸配列をTCRアルファ定常領域の切断部位に組み込むことができることを実証する。
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV−CAR100及びAAV−CAR763と呼ばれる)を、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を相同組換えによりTRC1−2認識配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えAAVベクターは、先に記載した三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製した。
キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性TCR受容体の細胞表面発現をノックアウトするための組換えAAVベクターの使用効率を決定するための研究を行う。
型として使用される。ヒトCD3+T細胞を刺激し、上記のように1μgのTRC1−2x.87EEmRNAをトランスフェクトする。次いで、トランスフェクションの直後又はトランスフェクションの0〜8時間以内のいずれかに、細胞にAAV−CAR100(AAV408)又はAAV−CAR763(AAV412)(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入する。形質導入のみの対照として、細胞に(水を)擬似トランスフェクションし、AAV−CAR100(AAV408)又はAAV−CAR763(AAV412)(1e5のウイルスゲノム/細胞)のいずれかを形質導入した。メガヌクレアーゼのみの対照のために、細胞にTRC1−2x.87EEをコードするmRNAをトランスフェクションし、次いでトランスフェクションの直後に(水を)擬似形質導入する。
本研究では、AAVが、キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性TCR受容体の細胞表面発現をノックアウトするために使用できるHDR鋳型を提供できるかどうかを試験する。第1の実験では、上記のようにヒトCD3+T細胞(1e6細胞)を刺激し、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA(2μg)を電気穿孔し、次いでAAV412(1e5ウイルスゲノム/細胞)を直ちに形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次いでAAV412を形質導入するか、又はTRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞の更なる対照も含んでいた。
HDR鋳型のCAR領域内にアニーリングする1つのプライマー、AAV412 HDR鋳型の5’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリングする1つのプライマーを含み、CAR遺伝子がTRC1−2認識配列内にうまく挿入された場合にのみ、1872bpの断片を増幅する。第3のプライマーセット(表7において「外側3’相同アーム」と称される)は、AAV412 HDR鋳型のCAR領域内にアニーリングする1つのプライマー、及びAAV412 HDR鋳型の3’相同アームの外側のヒトゲノムにアニーリングする1つのプライマーを含む。第2のプライマーセットと同様に、第3のプライマーセットは、CAR遺伝子がTRC1−2認識配列にうまく挿入された場合にのみ1107bpの断片を増幅する。まとめると、3つ全てのプライマーセットによるPCR産物は、CAR配列が細胞内に存在するかどうか(プライマーセット1)、及びそれがTRC1−2認識配列に挿入されているかどうか(プライマーセット2及び3)を示す。
アガロースゲルにおいて分離した(レーンの説明は表7に示す)。レーン1〜3は、TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入したサンプル由来のPCR産物である。
87EEmRNAの不在下でTRC1−2認識配列にCAR遺伝子を挿入できないことを示している。レーン6は、TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入したサンプルを表す。PCR産物を見ることはできず、TRC1−2認識配列にCAR遺伝子が挿入されていないことを示している。レーン7〜10は、TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、漸増量のAAV408を形質導入したサンプルを表す。各PCRの適切なサイズのバンドが明らかであり、これは、AAV408がTRC1−2認識配列の修復のためのHDRドナーを産生でき、CAR遺伝子の挿入をもたらし得ることを示している。
CARの挿入が分子レベルで起こったかどうかを決定することに加えて、AAV408をHDR鋳型として使用してTRC1−2認識配列にCAR遺伝子を挿入した細胞における抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定しようと努めた。更に、CARのTRC1−2x.87EE認識配列への挿入がT細胞受容体のノックアウトをもたらす効率を調べた。上記並びに図27及び28で分析したサンプルも、フローサイトメトリによってCAR及びCD3の発現について分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR(抗Fab−Alexa647)又はCD3(CD3−BB515)を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図29Aは、Y軸に抗CAR標識を示し、X軸に抗CD3標識を示すフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.7%)。擬似電気穿孔し、次に漸増量のAAV408を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR−集団は98.8%、99、99%、及び99.1%であった。従って、本発明者らは、AAV408ウイルス単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論する。
EをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV408を形質導入したサンプルは、CD3−集団において2.09%〜5.9%の範囲のCAR標識を示した。また、CD3+集団におけるCAR標識のわずかな増加もあり、1.08%から1.91%に及ぶ。本発明者らは、CD3+集団におけるCAR+細胞の増加の原因を特定しなかったが、CARが非発現T細胞受容体対立遺伝子に挿入された可能性がある(T細胞受容体アルファ鎖の1つの対立遺伝子のみが発現され、T細胞受容体複合体へ組み込まれている)。
AAVベクターがCAR遺伝子をTRC1−2x.87EE認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型を提供できることを示したので、本発明者らはAAVベクターの構成を最適化しようと努めた。本発明者らは、TRC1−2認識配列座及びAAV ITRに対する短い相同領域に隣接する、JeTプロモータによって駆動されるCAR遺伝子発現カセットを含む自己相補的AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはAAV421(図30;配列番号123)と呼ばれる。自己相補的AAVのパッケージング能力が限られているため、短い相同アームが必要であった。更に、長い相同アーム及びAAV ITRに隣接する、CMVプロモータによって駆動されるCAR遺伝子発現カセットを含む一本鎖AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはAAV422(図31;配列番号124)と呼ばれる。一本鎖AAVゲノムはより大きなカーゴ容量を有するので、自己相補的ベクターよりも長い相同アームを利用することができた。
決定した。PCRを、図32A及び32Bに示されるアガロースゲルによって分離した(レーンの説明は、表9及び10に示す)。図32Aのサンプル1には擬似電気穿孔し、次いで擬似形質導入し、サンプル2〜5には擬似電気穿孔し、次いでAAV421を形質導入した。ゲルは、これらのサンプルが全てPCR産物を生成せず、TRC1−2x.87EEmRNAの不在下で、AAV421がCAR遺伝子のTRC1−2認識配列への挿入を駆動できないことを示している。更に、TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した対照サンプル(サンプル6)は、PCR産物を示さなかった。図32Aのサンプル7〜10には、TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次に漸増量のAAV421を形質導入した。ゲルは、5’及び3’相同アームの両方を越えて伸長した産物のPCRバンドを示し(各サンプル番号の下の2つのバンド)、CAR遺伝子のTRC1−2認識配列への組み込みを実証している。最後に、図32Aにおいて、レーン11及び12は、それぞれ1e6又は10e6細胞/サンプルのいずれかで開始した、TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次いでAAV422を形質導入されたサンプルを表す。両方のPCRバンド(相同アームが長いことを考慮して異なるプライマーが使用されたため、最初のセットのほうがより大きい)の存在は、CAR遺伝子のTRC1−2認識配列への挿入が成功したことを示す。
ここでは、AAV421を用いてCAR遺伝子をTRC1−2認識配列に挿入した細胞における、抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定するよう努めた。上記及び図32Aで分析したサンプルも、フローサイトメトリによってCAR及びCD3の発現について分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図33Aは、擬似電気穿孔し、AAV421を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気穿孔し、次に漸増量のAAV421を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思
われ、CD3+/CAR−集団は98.8%、98.6%、98.8%、及び97.9%であった。従って、本発明者らは、AAV421ウイルス単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論づける。
擬似形質導入した細胞においてわずかに高かった(1.24%)。TRC1−2x.87EE単独対照のCD3−/CAR+細胞の増加は、CAR核酸がシステムに導入されていないため、バックグラウンドと見なされる。TRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、42.5%のCD3−/CAR−集団を有し、増殖前(56.7%、図33)より有意に低く、CD+細胞がこのシステムにおいて増殖優位性を有し得ることを示唆している。しかし、TRC1−2x.87EEを電気穿孔し、AAVを形質導入した細胞は、49.9%のCD3−/CAR+細胞を示し、図33に示すこれらの細胞の元の標識(13.4%)と比較して劇的に増加し、IL−7及びIL−15の存在下におけるこのサンプルとIM−9細胞とのインキュベーションが、CD3−/CAR+集団を濃縮及び増殖させるのに非常に有効であることを実証している。CD3+/CAR+集団もまた同じ条件下で増殖させ、擬似電気穿孔/AAV形質導入サンプル及びTRC1−2x.87EE電気穿孔/AV形質導入サンプルは、それぞれ2.53%及び15.3%のCD3+/CAR+を示す。
本発明者らは、AAV422を使用してHDR鋳型を提供する細胞(上記、PCR結果は図32Bに示す)からの抗CD19CARの発現も調べた。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図35Aは、擬似電気穿孔し、漸増量のAAV422を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔および擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV422を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR−集団は98.6%、98.6%、98.9%、及び98.4%であった。従って、本発明者らは、AAV422ベクター単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T
細胞受容体の発現を破壊することもできない。
19CAR遺伝子を有していた細胞を、IL−7及びIL−15の存在下でIM−9細胞とインキュベーションすることによりうまく濃縮することができ、わずか12日の培養で90%超がCAR+であるCD3−集団をもたらし得ることを明確に実証している。
本研究では、一本鎖AAVベクターがTRC1−2x.87EEヌクレアーゼのノックアウト効率を増加させるという観察を追跡した。第1の実験では、細胞にTRC1−2x.87EE(2μg)を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のAAV412(6.25e4、1.25e4、2.5e4、又は5e4ウイルスゲノム/細胞)の形質導入のいずれかを行った。形質導入後4日目に、細胞をCD3に対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した(図37A)。擬似形質導入細胞では、20.7%がCD3−であり、これと比較して漸増AAV412を形質導入した細胞では21.6%、23.7%、25.5%、及び25%であり、TRC1−2x.87EEのノックアウト効率はAAV412の存在下で最大23%高い(25.5%を20.7%と比較)。
上記の実験は、細胞にTRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、直後に細胞にAAV421を形質導入することによるCAR T細胞の生成、及びCD19発現IM−9細胞と共培養することによって、これらの細胞をCD3−/CAR+集団に関して濃縮できることを明確に実証している。次に、これらのCAR T細胞の標的細胞に対する活性を調べた。第1の実験では、上記及び図34Cに示す細胞を、CD19+Raji細胞又はCD19−U937細胞のいずれかが標的集団であるIFN−γELISPOTアッセイに用いた。図38Aに示すように、抗CD19CAR T細胞をU937細胞と共にインキュベートした場合、それらは標的:エフェクター比にかかわらずIFN−γを分泌しなかった。しかし、CAR T細胞をRaji細胞と共にインキュベートすると、高レベルのIFN−γ分泌が用量依存的に起こり、IFN−γの分泌が抗原特異的であることが示された。
AAVによって生成されるHDR鋳型は線形DNA分子であるので、任意の供給源由来の線形DNAが、CAR遺伝子をTRC1−2認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型であり得ると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、TRC1−2認識配列座に相同である相同アームに隣接する抗CD19CAR遺伝子を含むいくつかのプラスミドを作製した。いくつかのプラスミドでは異なるプロモータが使用され、相同アームは、自己相補的なAAVベクターを模倣する「短い」(5’相同アームで200bp及び3’相同アームで180bp)又は一本鎖AAVベクターを模倣する「長い」(5’相同アームで985bp及び3’相同アームで763bp)のいずれかであった。短い相同アームを有するプラスミドは「pDS」と名付け、長い相同アームを有するものは「pDI」と名付けた。更にいくつかのプラスミドは、CAR遺伝子の上流にイントロンを含んでいた。
まとめると、上記のデータは、JeTプロモータを利用するベクターが、CARの高い一貫した発現を駆動し、相同アームが長いほど遺伝子挿入効率を上昇させ得ることを示す。本発明者らは、長い相同アーム及び抗CD19CARの発現を駆動するJeTプロモータを有する一本鎖AAV(本明細書ではAAV423)を作製するために使用される、図41に示すベクター(配列番号125)を設計し、作製した。ヒトCD3+T細胞にTRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、漸増量のAAV423を形質導入した。上記のデータが、MOIが高いほど挿入効率を上昇させ得ることを示唆したので、本発明者らは1.875e4から1.5e5の範囲の力価を使用した。対照として、細胞に、TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入するか、又は擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した。形質導入の約6日後、細胞をCD3又は抗CD19CARを認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図42に示されるように、擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した細胞は、圧倒的にCD3+/CAR−(96.6%〜98.5%の範囲)である。TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、CD3−が39%であり、T細胞受容体の効率的なノックアウトを示した。これらの細胞において、バックグラウンドCAR染色は非常に低かった(約2%)。TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のA
AV423を形質導入した細胞は、CD3のノックアウトと併せて劇的なCAR染色を示した。CD3−/CAR+集団は21.6%から22.7%の範囲であり、一方CD3+/CAR+集団は約2%であった。上記のように、一本鎖AAVの存在は、TRC1−2認識部位での全体の遺伝子改変効率を増加させ、総CD3−集団は、対照細胞における41.44%から電気穿孔し後、次いで漸増量のAV423を形質導入した細胞における57.6%、59.2%、58.7%、及び56.1%に増加した。CAR+であるCD3−細胞のパーセントは、37.5%から39.9%の範囲であり、上記のデータと比較して挿入効率の劇的な増加を示した。
遺伝子編集抗CD19CAR T細胞の有効性を、播種性B細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて評価した。上記のように活性化T細胞にTRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次にJeTプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗CD19CAR発現カセットを含むAAV6ベクターを形質導入した。IL−2(10ng/mL)と共に5日間培養した後、細胞表面のCD3及び抗CD19CAR発現について、細胞を、以前に記載したようにフローサイトメトリによって分析した(図44A)。CD3−細胞を、抗CD3磁気ビーズを使用してCD3+細胞を枯渇させることにより濃縮した。次いで枯渇した細胞をIL−15(10ng/mL)及びIL−21(10ng/mL)中で3日間培養し、CD3及び抗CD19CARの細胞表面発現について再分析した(図44B)。CD3−集団の単離は非常に効率的であり、CD3+細胞の枯渇後にフローサイトメトリによって測定して99.9%の純度を得た(図44B)。精製されたCD3−集団は、56%のCD4+及び44%のCD8+細胞を含み(図44C)、CD62L及びCD45ROに対する染色によって決定される、セントラルメモリー、移行性メモリーの表現型を主に有していた(図44D)。
図45に示すように、CD19+Raji細胞の成長は、8日目までに全てのマウスにおいて低レベルが明らかであり、11日目までに未処置及びTCR−対照群で有意に増加した。対照群では、有意な腫瘍成長が15日目まで観察され、18日目又は19日目までに全ての対照群を安楽死させた。対照的に、抗CD19CAR T細胞で処置したマウスの群は全て、11日目までに腫瘍成長の兆候を示さず、低用量群の単一のマウスを除いて、試験の29日まで依然として腫瘍が生じないままであった。腫瘍再成長は、36日目あたりで低用量コホートにおいて3匹のマウスで観察された。3匹のうちの1匹は42日目に死亡したが、画像化によりこの動物では低レベルの腫瘍しか認められなかったため、死亡が腫瘍関連であるとは考えにくい。
これらの結果は、遺伝子編集されたCD3−CAR T細胞によるCD19+腫瘍細胞のインビボクリアランスの明確な証拠を提供し、同種異系CAR T細胞療法のためのこのプラットフォームの更なる前臨床開発を支援する。
Claims (69)
- 改変ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子をそのゲノム中に含む遺伝子改変細胞であって、
前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が5’から3’に:
(a)前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の5’領域;
(b)外因性ポリヌクレオチド;及び
(c)前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子の3’領域;
を含み、
遺伝子改変ヒトT細胞であるか、又はヒトT細胞に由来する遺伝子改変細胞であり、非改変対照細胞と比較した場合、内因性TCRの細胞表面での発現が低下している、遺伝子改変細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、前記キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号112と少なくとも80%の配列同一性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含み、前記細胞外リガンド結合ドメインがCD19に結合する、請求項2に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号113と少なくとも80%の配列同一性を有する細胞内細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項2から3のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号114と少なくとも80%の配列同一性を有する細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項2から4のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体がシグナルペプチドをさらに含む、請求項2から5のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記シグナルペプチドが、配列番号115と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項6に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体がヒンジドメインをさらに含む、請求項2から7のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記ヒンジドメインが、配列番号116と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項8に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が膜貫通ドメインを更に含む、請求項2から9のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記膜貫通ドメインが、配列番号117と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項10に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が、配列番号111と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項2から11のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、前記外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモータ配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記プロモータ配列が、配列番号118と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項13に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号119と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号3を含む認識配列内の位置において前記TCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号120と少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項16に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号4を含む認識配列内の位置において前記TCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号121と少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項18に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号5を含む認識配列内の位置において前記TCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の遺伝子改変細胞。
- 前記改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子が、配列番号122と少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項21に記載の遺伝子改変細胞。
- 改変ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞の作製方法であって、
(a)細胞に
(i)操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;又は
(ii)操作されたヌクレアーゼタンパク質;
を導入する工程:
ここで、前記操作されたヌクレアーゼが、前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列に切断部位を生成し;並びに
(b)外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列を前記細胞に導入する工程;
を含み、
前記細胞がヒトT細胞であるか、又はヒトT細胞に由来する細胞であり;前記外因性ポリヌクレオチドの配列が前記切断部位において前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され;更に前記遺伝子改変細胞が、非改変対照細胞と比較した場合、内因性TCRの細胞表面発現が低下している、方法。 - 前記第2の核酸配列が、5’から3’に:
(a)前記切断部位に隣接する5’上流配列に相同である5’相同アーム;
(b)前記外因性ポリヌクレオチド;及び
(c)前記切断部位に隣接する3’下流配列に相同である3’相同アーム;
を含み、
前記外因性ポリヌクレオチドの配列が相同組換えにより前記切断部位において前記ヒト
TCRアルファ定常領域遺伝子に挿入される、請求項22に記載の方法。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、前記キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン及び1又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項22又は23に記載の方法。
- 前記外因性ポリヌクレオチドが、前記外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動する第1のプロモータ配列を含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも前記第2の核酸配列が、前記第2の核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターと前記細胞とを接触させることによって前記細胞に導入される、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の核酸が、前記5’相同アームの5’上流に位置するか、又は前記3’相同アームの3’下流に位置する第2のプロモータ配列を更に含む、請求項26に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、請求項26又は27に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターがAAV2又はAAV6の血清型を有する、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、組換えメガヌクレアーゼ、組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、組換え転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、又はメガTALヌクレアーゼである、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである、請求項22〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼが野生型ヒトTCRアルファ定常領域(配列番号1)の残基93〜208内の認識配列を認識及び切断し、前記組換えメガヌクレアーゼが第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、前記第1のサブユニットが前記認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、前記第2のサブユニットが前記認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号3を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号8〜18のいずれか1つの残基198〜344又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基7〜153と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号8〜18のいずれか1つの残基7〜153又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基198〜344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、
(a)配列番号8〜18のいずれか1つの215位;又は
(b)配列番号19〜27のいずれか1つの24位
に対応する位置にYを含む、請求項33又は34に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号8〜18のいずれか1つの残基215〜270又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基24〜79を含む、請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号8〜18のいずれか1つの残基24〜79又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基215〜270を含む、請求項33〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号8〜18のいずれか1つの残基198〜344又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基7〜153を含む、請求項33〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号8〜18のいずれか1つの残基7〜153又は配列番号19〜27のいずれか1つの残基198〜344を含む、請求項33〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リンカーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項33〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号8〜27のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項33〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号4を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号28又は29の残基7〜153と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号28又は29の残基198〜344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の24位に対応する位置にYを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の26位に対応する位置にTを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の46位に対応する位置にYを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号2又は29の215位に対応する位置にHを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の266位に対応する位置にTを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の268位に対応する位置にCを含む、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、配列番号28又は29の残基24〜79を含む、請求項42〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号28又は29の残基215〜270を含む、請求項42〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号28又は29の残基7〜153を含む、請求項42〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号28又は29の残基198〜344を含む、請求項42〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リンカーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項42〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号28又は29のアミノ酸配列を含む、請求項42から54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の前記認識配列が配列番号5を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号30の残基7〜153又は配列番号31若しくは32の残基198〜344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号30の残基198〜344又は配列番号31若しくは32の残基7〜153と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記HVR1領域が、
(a)配列番号30の24位、又は
(b)配列番号31若しくは32の215位、
に対応する位置にYを含む、請求項56又は57に記載の方法。 - 前記HVR1領域が、配列番号30の残基24〜79又は配列番号31若しくは32の残基215〜270を含む、請求項56〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HVR2領域が、配列番号30の残基215〜270又は配列番号31若しくは32の残基24〜79を含む、請求項56から59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号30の残基7〜153又は配列番号31若しくは32の残基198〜344を含む、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号30の残基198〜344又は配列番号31若しくは32の残基7〜153を含む、請求項56〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼがリンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、前記リンカーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットとを共有結合する、請求項56〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号30〜32のいずれか1つのアミノ酸配列を
含む、請求項56〜63のいずれか1項に記載の方法。 - それを必要とする対象において癌を治療するための免疫療法の方法であって、請求項1〜21のいずれか1項に記載の前記遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- それを必要とする対象において癌を治療するための免疫療法の方法であって、請求項22〜64のいずれか1項に記載の方法に従って作製された遺伝子改変細胞及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記癌が、癌腫の癌、リンパ腫、肉腫、芽腫、及び白血病からなる群から選択される、請求項65及び66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が、B細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、メラノーマ、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項65及び66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記B細胞起源の癌が、B系列急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ球性白血病、及びB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項68に記載の方法。
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