JP6929837B2 - ヒトt細胞受容体アルファ定常領域遺伝子中に見出される認識配列に対して操作されたメガヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2016年2月19日に出願された「ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に見出される認識配列に対して操作されたメガヌクレアーゼ」と題する米国仮特許出願第62/297,445号及び2015年10月5日に出願された、「ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に見出される認識配列に対して操作されたメガヌクレアーゼ」と題する米国仮特許出願第62/237,382号に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願には、EFS−Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年10月3日に作成された前記ASCIIコピーの名称は2000706_00179WO1.txtであり、サイズは264,046バイトである。
配列番号1は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域遺伝子(NCBI Gene ID番号28755)のヌクレオチド配列を示す。
本明細書で言及する特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されるGenBankデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されると同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、組換えメガヌクレアーゼが、ヒトTCRアルファ定常領域遺伝子(配列番号1)、特に残基93〜208内に見出される認識配列を認識及び切断するように操作することができるという発見に部分的に基づいている。このような認識配列における切断は、切断部位におけるNHEJを可能にし、ヒトT細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊し、細胞表面でのT細胞受容体の発現及び/又は機能の低下をもたらす。
本発明は、ヒトT細胞受容体(TCR)アルファ定常領域遺伝子(配列番号1)内に見出される認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼを使用して、遺伝子改変細胞を作製する方法を提供する。このような認識配列における切断は、切断部位におけるNHEJを可能にし、ヒトT細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊し、細胞表面でのT細胞受容体の発現及び/又は機能の低下をもたらす。更に、このような認識配列における切断は、外因性核酸配列のTCRアルファ定常領域遺伝子への直接相同組換えを更に可能にすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子改変細胞、又は本発明の遺伝子改変細胞の集団及び医薬担体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy(第21版、2005年)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、細胞は、典型的には、医薬として許容される担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。当然のことながら、担体は製剤中の他の成分と適合するという意味において許容可能でなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な1又は複数の更なる薬剤を更に含むことができる。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトT細胞(又はそれに由来する細胞)である更なる実施形態において、本発明の医薬組成物は、インビボでの細胞増殖及び生着を促進する、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−7、IL−15、及び/又はIL−21)等の生体分子を更に含むことができる。本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、追加の薬剤又は生物学的分子と同じ組成物で投与することができ、又は、別々の組成物で同時投与することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法において使用するための組換えAAVベクターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK−293のような哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスのcap遺伝子及びrep遺伝子は、その自己複製を防止して、治療遺伝子(例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達する余地を作り出すためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」(例えば、アデノウイルス)成分を提供することが必要である(Cots D、Bosch A、Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370〜81)。しばしば、組換えAAVベクターは、細胞株に、「ヘルパー」成分をコードする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在DNA配列含むウイルス性ITRを含む第3のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションを使用して作製される。カプシドに包まれたゲノム(目的のITR及び(1又は複数の)介在遺伝子)を含むウイルス粒子は、その後、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて、目的の(1又は複数の)遺伝子に、細胞、組織、又はヒト患者などの生物に送達する。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。
本明細書で「TRC1−2メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号8〜27)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC1−2認識配列(配列番号3)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC1−2組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC1−2メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号3のTRC1認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC2認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
本明細書で「TRC3−4メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号28及び29)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC3−4認識配列(配列番号4)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC3−4組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC3−4メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号4のTRC3認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC4認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
本明細書で「TRC7−8メガヌクレアーゼ」と総称される組換えメガヌクレアーゼ(配列番号30〜32)は、ヒトT細胞受容体アルファ定常領域中に存在するTRC7−8認識配列(配列番号5)を認識及び切断するように操作されていた。各TRC7−8組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来N末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各TRC7−8メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号5のTRC7認識半部位に結合し、第2のサブユニットはTRC8認識半部位に結合する(図1Aを参照されたい)。
TRC1−2、TRC3−4、及びTRC7−8メガヌクレアーゼがそれぞれの認識配列(それぞれ配列番号3、4、及び5)を認識及び切断することができるかどうかを決定するために、各組換えメガヌクレアーゼを、先に記載のCHO細胞レポーターアッセイ(国際公開第/2012/167192号パンフレット及び図8を参照されたい)を使用して評価した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを保有するCHO細胞レポーター株を作製した。各細胞株のGFP遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能性GFP遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によって分断された。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼ、TRC3−4メガヌクレアーゼ、及びTRC7−8メガヌクレアーゼがそれらのそれぞれの認識配列を細胞内で効率的に標的とし、切断できることを実証した。
この研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、Jurkat細胞(不死化ヒトTリンパ球細胞株)においてTRC1−2認識配列を切断できることを実証した。1e6のJurkat細胞に1細胞あたり8e6の所与のTRC1−2メガヌクレアーゼmRNAコピーを、BioRad Gene Pulser Xcellを製造元の指示に従って使用して電気穿孔した。トランスフェクションの72時間後に、ゲノムDNA(gDNA)を細胞から採取し、T7エンドヌクレアーゼI(T7E)アッセイを実施して内因性TRC1−2認識配列(図11)における遺伝子改変を推定した。T7Eアッセイでは、TRC1−2認識部位に隣接するプライマーを使用してTRC1−2遺伝子座をPCRにより増幅する。TRC1−2遺伝子座内にインデル(ランダムな挿入又は欠失)がある場合、得られたPCR産物は、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子の混合物からなると思われる。PCR産物を変性させ、ゆっくりと再アニーリングする。ゆっくりとした再アニーリングは、野生型及び突然変異対立遺伝子からなるヘテロ二重鎖の形成を可能にし、ミスマッチ塩基及び/又はバルジを生じる。T7E1酵素は、ミスマッチ部位で切断し、ゲル電気泳動によって可視化され得る切断産物を生じる。図11は、TRC1−2メガヌクレアーゼの13の異なるバージョンがT7E1アッセイにおいて陽性結果を生じ、内因性TRC1−2認識配列におけるインデルの効果的な生成を示していることを明確に実証した。
この研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、ドナーから得られたヒトT細胞においてTRC1−2認識配列を切断できることを実証した。CD3+T細胞を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa4D−Nucleofector(Lonza)を製造元の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNAを電気穿孔した。トランスフェクションの3日後及び7日後、gDNAを回収し、T7E1アッセイを上記のように行った。図13Aは、TRC1−2x.87EEがヒトT細胞において内因性TRC1−2認識配列に突然変異を効果的に導入し、メガヌクレアーゼがTRC1−2認識配列を認識及び切断したことを示すことを実証している。切断産物の強度は、トランスフェクションの3日目後と7日目後との間で変化がないと思われ、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼによる毒性はほとんど又は全くないことを示唆している。内因性TRC1−2認識配列における突然変異がT細胞受容体の表面発現を排除するのに十分であるかどうかを決定するために、抗CD3抗体を使用したフローサイトメトリによって細胞を分析した。図13Bは、トランスフェクトされたT細胞の約50%がCD3に対して陰性に染色されことを示し、T細胞受容体のノックアウトを示している。CD3陰性集団は、トランスフェクション後3日目と7日目との間で有意に変化せず、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼに関連する毒性はほとんど若しくはまったくないか、又はT細胞受容体発現の喪失をさらに示した。
これらの研究は、本発明に包含されるTRC1−2メガヌクレアーゼが、Jurkat細胞(不死化Tリンパ球細胞株)及びヒトドナーから得られたT細胞の両方において、TRC1−2認識配列を認識及び切断することができることを実証した。更に、これらの研究は、インデルの出現によって証明されるように、NHEJがメガヌクレアーゼ切断部位に生じることを実証した。更に、TRC1−2メガヌクレアーゼは、ドナーから得られたヒトT細胞上のT細胞受容体の細胞表面発現を低下させることが示された。
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV405及びAAV406と呼ばれる)を、EagI制限部位を含む外因性核酸配列を相同組換えによりTRC1−2認識配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えAAVベクターは、細胞株に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」成分(例えばアデノウイルス)をコードする第1のプラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在DNA配列(例えば外因性核酸配列)を含むウイルス性逆位末端反復配列(ITR)を含む第3のプラスミドをトランスフェクトする三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製される。(Cots D、Bosch A、Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370〜81を参照されたい)。図15は、外因性核酸配列をヌクレアーゼ切断部位で細胞ゲノムに導入するために組換えAAVベクターを使用するための一般的なアプローチを示す。
TRC1−2メガヌクレアーゼによる二本鎖切断の発生後にAAV鋳型が相同組換え修復(homology directed repair)(HDR)に適しているかどうかを試験するために、ヒトT細胞を使用して一連の実験を行った。第1の実験では、TRC1−2RNAの電気穿孔のタイミング及び組換えAAVベクターの形質導入を決定した。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いで、Amaxa4D−Nucleofector(Lonza)を製造者の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA(1μg)を電気穿孔した。トランスフェクションの2、4、又は8時間後に、細胞にGFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。細胞を、形質導入の72時間後にGFP発現についてフローサイトメトリによって分析した。図18に示すように、トランスフェクションの2時間後に細胞を形質導入した場合、最も高い形質導入効率が観察された(GFP陽性細胞88%)。形質導入効率は、トランスフェクションと形質導入との間の時間が増加するにつれて有意に減少し、4時間でGFP陽性細胞78%及び8時間でGFP陽性細胞65%であった。
AAV形質導入をトランスフェクションの2時間後に実施した場合が、それより後に実施した場合よりも効率的であるという観察の観点から、トランスフェクション及び形質導入のタイミングを最適化するための実験を行った。ヒトCD3+T細胞を、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で3日間刺激し、次いでAmaxa4D−Nucleofector(Lonza)を製造者の指示に従って使用して、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼ(1μg)を電気穿孔した。トランスフェクションの直後又はトランスフェクションの2時間後に、細胞にGFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。更に、未刺激細胞に、GFP−AAV(1e5のウイルスゲノム/細胞)を形質導入した。形質導入の72時間後に、細胞をGFP発現についてフローサイトメトリによって分析した。図23は、トランスフェクションの2時間後に行ったGFP−AAV形質導入が90%のGFP陽性細胞をもたらしたが、トランスフェクション直後の形質導入は98%のGFP陽性細胞を生じたことを示す。休止T細胞はAAV形質導入を受け入れないと思われ、GFP陽性細胞は約0%であった非形質導入細胞はまた、約0%のGFP陽性細胞を示した。
これらの研究は、AAVベクターを組換えメガヌクレアーゼと併せて使用して、相同組換えを介してTCRアルファ定常領域の切断部位に外因性核酸配列を組み込むことができることを実証する。
本研究において、2つの組換えAAVベクター(AAV−CAR100及びAAV−CAR763と呼ばれる)を、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を相同組換えによりTRC1−2認識配列においてヒトT細胞のゲノムに導入するように設計した。各組換えAAVベクターは、先に記載した三重トランスフェクションプロトコルを使用して調製した。
キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性TCR受容体の細胞表面発現をノックアウトするための組換えAAVベクターの使用効率を決定するための研究を行う。
本研究では、AAVが、キメラ抗原受容体配列をTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入し、同時に内因性TCR受容体の細胞表面発現をノックアウトするために使用できるHDR鋳型を提供できるかどうかを試験する。第1の実験では、上記のようにヒトCD3+T細胞(1e6細胞)を刺激し、TRC1−2x.87EEメガヌクレアーゼをコードするmRNA(2μg)を電気穿孔し、次いでAAV412(1e5ウイルスゲノム/細胞)を直ちに形質導入した。対照として、細胞に擬似電気穿孔し、次いでAAV412を形質導入するか、又はTRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入した。擬似電気穿孔し、擬似形質導入した細胞の更なる対照も含んでいた。
CARの挿入が分子レベルで起こったかどうかを決定することに加えて、AAV408をHDR鋳型として使用してTRC1−2認識配列にCAR遺伝子を挿入した細胞における抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定しようと努めた。更に、CARのTRC1−2x.87EE認識配列への挿入がT細胞受容体のノックアウトをもたらす効率を調べた。上記並びに図27及び図28で分析したサンプルも、フローサイトメトリによってCAR及びCD3の発現について分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR(抗Fab−Alexa647)又はCD3(CD3−BB515)を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図29Aは、Y軸に抗CAR標識を示し、X軸に抗CD3標識を示すフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.7%)。擬似電気穿孔し、次に漸増量のAAV408を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR−集団は98.8%、99、99%、及び99.1%であった。従って、本発明者らは、AAV408ウイルス単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論する。
AAVベクターがCAR遺伝子をTRC1−2x.87EE認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型を提供できることを示したので、本発明者らはAAVベクターの構成を最適化しようと努めた。本発明者らは、TRC1−2認識配列座及びAAV ITRに対する短い相同領域に隣接する、JeTプロモータによって駆動されるCAR遺伝子発現カセットを含む自己相補的AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはAAV421(図30;配列番号123)と呼ばれる。自己相補的AAVのパッケージング能力が限られているため、短い相同アームが必要であった。更に、長い相同アーム及びAAV ITRに隣接する、CMVプロモータによって駆動されるCAR遺伝子発現カセットを含む一本鎖AAVゲノムを作製するために使用できるベクターを作製した。このベクターはAAV422(図31;配列番号124)と呼ばれる。一本鎖AAVゲノムはより大きなカーゴ容量を有するので、自己相補的ベクターよりも長い相同アームを利用することができた。
ここでは、AAV421を用いてCAR遺伝子をTRC1−2認識配列に挿入した細胞における、抗CD19キメラ抗原受容体の発現レベルを決定するよう努めた。上記及び図32Aで分析したサンプルも、フローサイトメトリによってCAR及びCD3の発現について分析した。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図33Aは、擬似電気穿孔し、AAV421を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気穿孔し、次に漸増量のAAV421を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR−集団は98.8%、98.6%、98.8%、及び97.9%であった。従って、本発明者らは、AAV421ウイルス単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできないと結論づける。
本発明者らは、AAV422を使用してHDR鋳型を提供する細胞(上記、PCR結果は図32Bに示す)からの抗CD19CARの発現も調べた。形質導入の約4日後、細胞を抗CD19CAR又はCD3を認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図35Aは、擬似電気穿孔し、漸増量のAAV422を形質導入した細胞と、擬似電気穿孔し、擬似形質導入した対照細胞とについてのフローサイトメトリプロットを示す。擬似電気穿孔及び擬似形質導入した細胞(MOI−0)は、圧倒的にCD3+/CAR−であった(右下の象限、98.8%)。擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV422を形質導入した細胞は、対照細胞と本質的に同一と思われ、CD3+/CAR−集団は98.6%、98.6%、98.9%、及び98.4%であった。従って、本発明者らは、AAV422ベクター単独では検出可能なレベルのCAR発現を駆動しておらず、T細胞受容体の発現を破壊することもできない。
本研究では、一本鎖AAVベクターがTRC1−2x.87EEヌクレアーゼのノックアウト効率を増加させるという観察を追跡した。第1の実験では、細胞にTRC1−2x.87EE(2μg)を電気穿孔し、擬似形質導入又は漸増量のAAV412(6.25e4、1.25e4、2.5e4、又は5e4ウイルスゲノム/細胞)の形質導入のいずれかを行った。形質導入後4日目に、細胞をCD3に対する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した(図37A)。擬似形質導入細胞では、20.7%がCD3−であり、これと比較して漸増AAV412を形質導入した細胞では21.6%、23.7%、25.5%、及び25%であり、TRC1−2x.87EEのノックアウト効率はAAV412の存在下で最大23%高い(25.5%を20.7%と比較)。
上記の実験は、細胞にTRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、直後に細胞にAAV421を形質導入することによるCAR T細胞の生成、及びCD19発現IM−9細胞と共培養することによって、これらの細胞をCD3−/CAR+集団に関して濃縮できることを明確に実証している。次に、これらのCAR T細胞の標的細胞に対する活性を調べた。第1の実験では、上記及び図34Cに示す細胞を、CD19+Raji細胞又はCD19−U937細胞のいずれかが標的集団であるIFN−γELISPOTアッセイに用いた。図38Aに示すように、抗CD19CAR T細胞をU937細胞と共にインキュベートした場合、それらは標的:エフェクター比にかかわらずIFN−γを分泌しなかった。しかし、CAR T細胞をRaji細胞と共にインキュベートすると、高レベルのIFN−γ分泌が用量依存的に起こり、IFN−γの分泌が抗原特異的であることが示された。
AAVによって生成されるHDR鋳型は線形DNA分子であるので、任意の供給源由来の線形DNAが、CAR遺伝子をTRC1−2認識配列に挿入するのに適したHDR鋳型であり得ると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、TRC1−2認識配列座に相同である相同アームに隣接する抗CD19CAR遺伝子を含むいくつかのプラスミドを作製した。いくつかのプラスミドでは異なるプロモータが使用され、相同アームは、自己相補的なAAVベクターを模倣する「短い」(5’相同アームで200bp及び3’相同アームで180bp)、又は一本鎖AAVベクターを模倣する「長い」(5’相同アームで985bp及び3’相同アームで763bp)のいずれかであった。短い相同アームを有するプラスミドは「pDS」と名付け、長い相同アームを有するものは「pDI」と名付けた。更に、いくつかのプラスミドは、CAR遺伝子の上流にイントロンを含んでいた。
まとめると、上記のデータは、JeTプロモータを利用するベクターが、CARの高い一貫した発現を駆動し、相同アームが長いほど遺伝子挿入効率を上昇させ得ることを示す。本発明者らは、長い相同アーム及び抗CD19CARの発現を駆動するJeTプロモータを有する一本鎖AAV(本明細書ではAAV423)を作製するために使用される、図41に示すベクター(配列番号125)を設計し、作製した。ヒトCD3+T細胞にTRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、漸増量のAAV423を形質導入した。上記のデータが、MOIが高いほど挿入効率を上昇させ得ることを示唆したので、本発明者らは1.875e4から1.5e5の範囲の力価を使用した。対照として、細胞に、TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで擬似形質導入するか、又は擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した。形質導入の約6日後、細胞をCD3又は抗CD19CARを認識する抗体で標識し、フローサイトメトリによって分析した。図42に示されるように、擬似電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した細胞は、圧倒的にCD3+/CAR−(96.6%〜98.5%の範囲)である。TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、擬似形質導入した細胞は、CD3−が39%であり、T細胞受容体の効率的なノックアウトを示した。これらの細胞において、バックグラウンドCAR染色は非常に低かった(約2%)。TRC1−2x.87EEをコードするmRNAを電気穿孔し、次いで漸増量のAAV423を形質導入した細胞は、CD3のノックアウトと併せて劇的なCAR染色を示した。CD3−/CAR+集団は21.6%から22.7%の範囲であり、一方CD3+/CAR+集団は約2%であった。上記のように、一本鎖AAVの存在は、TRC1−2認識部位での全体の遺伝子改変効率を増加させ、総CD3−集団は、対照細胞における41.44%から電気穿孔し後、次いで漸増量のAV423を形質導入した細胞における57.6%、59.2%、58.7%、及び56.1%に増加した。CAR+であるCD3−細胞のパーセントは、37.5%から39.9%の範囲であり、上記のデータと比較して挿入効率の劇的な増加を示した。
遺伝子編集抗CD19CAR T細胞の有効性を、播種性B細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて評価した。上記のように活性化T細胞にTRC1−2x.87EEmRNAを電気穿孔し、次にJeTプロモータにより駆動され、相同アームに隣接する抗CD19CAR発現カセットを含むAAV6ベクターを形質導入した。IL−2(10ng/mL)と共に5日間培養した後、細胞表面のCD3及び抗CD19CAR発現について、細胞を、以前に記載したようにフローサイトメトリによって分析した(図44A)。CD3−細胞を、抗CD3磁気ビーズを使用してCD3+細胞を枯渇させることにより濃縮した。次いで枯渇した細胞をIL−15(10ng/mL)及びIL−21(10ng/mL)中で3日間培養し、CD3及び抗CD19CARの細胞表面発現について再分析した(図44B)。CD3−集団の単離は非常に効率的であり、CD3+細胞の枯渇後にフローサイトメトリによって測定して99.9%の純度を得た(図44B)。精製されたCD3−集団は、56%のCD4+及び44%のCD8+細胞を含み(図44C)、CD62L及びCD45ROに対する染色によって決定される、セントラルメモリー、移行性メモリーの表現型を主に有していた(図44D)。
図45に示すように、CD19+Raji細胞の成長は、8日目までに全てのマウスにおいて低レベルが明らかであり、11日目までに未処置及びTCR−対照群で有意に増加した。対照群では、有意な腫瘍成長が15日目まで観察され、18日目又は19日目までに全ての対照群を安楽死させた。対照的に、抗CD19CAR T細胞で処置したマウスの群は全て、11日目までに腫瘍成長の兆候を示さず、低用量群の単一のマウスを除いて、試験の29日まで依然として腫瘍が生じないままであった。腫瘍再成長は、36日目あたりで低用量コホートにおいて3匹のマウスで観察された。3匹のうちの1匹は42日目に死亡したが、画像化によりこの動物では低レベルの腫瘍しか認められなかったため、死亡が腫瘍関連であるとは考えにくい。
これらの結果は、遺伝子編集されたCD3−CAR T細胞によるCD19+腫瘍細胞のインビボクリアランスの明確な証拠を提供し、同種異系CAR T細胞療法のためのこのプラットフォームの更なる前臨床開発を支援する。
Claims (27)
- 配列番号3からなる認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼであって、
第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、
前記第1のサブユニットが前記認識配列の第1の認識半部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、
前記第2のサブユニットが前記認識配列の第2の認識半部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含み、並びに
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号8の残基198〜344と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記第2のサブユニットが、配列番号8の残基7〜153と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組換えメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号8の残基198〜344を含む、請求項1又は2に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号8の残基7〜153を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
- 配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA構築物。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをコードする、請求項7に記載の組換えDNA構築物。
- 請求項6に記載の前記単離ポリヌクレオチドを含む、組換えAAVベクター。
- 真核細胞(但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。)の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製するための方法であって、真核細胞に、
(a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列、及び
(b)前記目的の外因性配列を含む第2の核酸、
を含む1又は複数の核酸をトランスフェクトする工程を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号3からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記目的の配列が前記切断部位において前記染色体に挿入される、方法。 - 前記第2の核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、前記目的の外因性配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入される、請求項10に記載の方法。
- 前記真核細胞が、ヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記目的の外因性配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも前記第2の核酸が、組換えAAVベクターによって前記真核細胞に導入される、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 真核細胞(但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。)の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製するための方法であって、
(a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入する工程;及び
(b)前記真核細胞に、前記目的の外因性配列を含む核酸をトランスフェクトする工程;
を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号3からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記目的の配列が前記切断部位において前記染色体に挿入される方法。 - 前記核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、前記目的の外因性配列が相同組換えによって前記切断部位に挿入される、請求項15に記載の方法。
- 前記真核細胞が、ヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項15又は16に記載の方法。
- 前記目的の外因性配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸が、組換えAAVベクターによって前記真核細胞に導入される、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 真核細胞(但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。)の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製する方法であって、真核細胞に、請求項1〜5のいずれか1項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトする工程を含み、
前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号3からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位において非相同末端結合により破壊される方法。 - 前記真核細胞が、ヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記真核細胞に、目的の外因性配列を含む第2の核酸をトランスフェクトする工程をさらに含む、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記目的の外因性配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項22に記載の方法。
- 真核細胞(但し、ヒト配偶子及びヒト接合子を除く。)の染色体中の標的配列を破壊することにより遺伝子改変真核細胞をインビトロで作製する方法であって、請求項1〜5のいずれか1項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入する工程を含み、
前記メガヌクレアーゼが配列番号3からなる認識配列において前記染色体に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位において非相同末端結合により破壊される方法。 - 前記真核細胞が、ヒトT細胞又はそれに由来する細胞である、請求項24に記載の方法。
- 前記真核細胞に、目的の外因性配列を含む核酸をトランスフェクトする工程を更に含む、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記目的の外因性配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項26に記載の方法。
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