ES2883116T3 - Meganucleasas diseñadas con secuencias de reconocimiento encontradas en el gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas - Google Patents

Meganucleasas diseñadas con secuencias de reconocimiento encontradas en el gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas Download PDF

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Abstract

Una meganucleasa modificada genéticamente que reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende una primera subunidad y una segunda subunidad, en la que dicha primera subunidad se une a un primer semi-sitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una primera región hipervariable (HVR1), y en la que dicha segunda subunidad se une a un segundo semi-sitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una segunda región hipervariable (HVR2), y en la que dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 96 % de identidad con la SEQ ID NO:

Description

DESCRIPCIÓN
Meganucleasas diseñadas con secuencias de reconocimiento encontradas en el gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas
Campo de la invención
La invención se refiere a los campos de la oncología, la inmunoterapia contra el cáncer, la biología molecular y la tecnología recombinante de ácidos nucleicos. En particular, la invención se refiere a meganucleasas recombinantes diseñadas para reconocer y escindir una secuencia de reconocimiento que se encuentra en el gen de la región constante alfa del receptor de células T humanas. La invención se refiere además al uso de tales meganucleasas recombinantes en métodos para producir células eucariotas modificadas genéticamente.
Referencia a una lista de secuencias enviada como un archivo de texto a través de EFS-Web
La presente aplicación contiene un listado de secuencias que se ha enviado en formato ASCII a través de EFS-Web y es parte de la descripción. Dicha copia ASCII, creada el 3 de octubre de 2016, se denomina 2000706_00179WO1.txt y tiene un tamaño de 264.046 bytes.
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia adoptiva con células T es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. Esta estrategia utiliza células T humanas aisladas que han sido modificadas genéticamente para mejorar su especificidad para antígenos asociados a un tumor específico. La modificación genética puede implicar la expresión de un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor exógeno de células T para injertar especificidad del antígeno en la célula T. A diferencia de los receptores de células T exógenas, los receptores de antígeno quimérico derivan su especificidad de los dominios variables de anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, las células T que expresan receptores de antígeno quimérico (células T CAR) inducen la inmunorreactividad tumoral de una manera no restringida al complejo de histocompatibilidad principal. Hasta la fecha, la inmunoterapia adoptiva de células T se ha utilizado como terapia clínica para una serie de cánceres, incluyendo neoplasias malignas de células B (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma no Hodgkin de células B (NHL), y leucemia linfocítica crónica), mieloma múltiple, neuroblastoma, glioblastoma, gliomas avanzados, cáncer de ovario, mesotelioma, melanoma y cáncer pancreático.
A pesar de su utilidad potencial como tratamiento oncológico, la inmunoterapia adoptiva con células T CAR ha sido limitada, en parte, por la expresión del receptor endógeno de células T en la superficie celular. Las células T CAR que expresan un receptor endógeno de células T pueden reconocer antígenos de histocompatibilidad mayores y menores después de la administración a un paciente alogénico, lo que puede conducir al desarrollo de la enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD). Como resultado, los ensayos clínicos se han centrado en gran medida en el uso de células T CAR autólogas, en las que las células T de un paciente se aíslan, se modifican genéticamente para incorporar un receptor de antígeno quimérico, y luego se refunden en el mismo paciente. Un enfoque autólogo proporciona tolerancia inmune a las células T CAR administradas; sin embargo, este enfoque está limitado tanto por el tiempo como por los gastos necesarios para producir células T CAR específicas del paciente después de que se le haya diagnosticado el cáncer a un paciente.
Por lo tanto, sería ventajoso desarrollar células T CAR "fuera de la plataforma", preparadas utilizando células T de otro donante con una menor expresión del receptor endógeno de células T y que no inicie la EICH tras la administración. Estos productos podrían generarse y validarse antes del diagnóstico, y podrían ponerse a disposición de los pacientes tan pronto como fuera necesario. Por lo tanto, existe una necesidad para el desarrollo de células T CAR alogénicas sin receptores endógenos de células T para prevenir la aparición de la EICH.
La modificación genética del ADN genómico se puede realizar utilizando endonucleasas guiadas y específicas del sitio de corte raro (también llamadas "meganucleasas") que están diseñadas para reconocer secuencias de ADN específicas en un locus de interés. Las endonucleasas guiadas son un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases comúnmente encontrados en los genomas de plantas y hongos. Con frecuencia se asocian con elementos de ADN parásitos, como intrones e inteínas autoempalmes del grupo 1. Promueven naturalmente la recombinación homóloga o la inserción de genes en lugares específicos del genoma del huésped mediante la producción de una rotura de la doble cadena en el cromosoma, que recluta la maquinaria celular de reparación del a Dn (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38:49-95). Las endonucleasas guiadas se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO:7), la familia GIY-YIG, la familia de cajas His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales que afectan a la actividad catalítica y a la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) se caracterizan por tener una o dos copias del motivo LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) conservado (Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las endonucleasas guiadas LAGLIDa Dg (SEQ ID No :7) con una sola copia del motivo LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) se encuentran como monómeros.
Los métodos para producir meganucleasas recombinantes modificadas específicas del sitio se conocen en la técnica. I-CreI (SEQ ID n O:6) es un miembro de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) de endonucleasas guiadas que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares base en el cromosoma de cloroplastos de las algas Chlamydomonas reinhardtii. Se han utilizado técnicas de selección genética para modificar la preferencia del sitio de escisión I-CreI natural (Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames et al. (2005), Nucleic Acids Res.
33:e178; Seligman et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould et al. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). Más recientemente, se describió un método de diseño racional de endonucleasas guiadas mono-LAGLIDADG (SEQ ID NO:7) capaz de rediseñar completamente I-CreI y otras endonucleasas guiadas para dirigirse a sitios de ADN ampliamente divergentes, incluyendo sitios en genomas de mamíferos, levaduras, plantas, bacterianos y virales (documento WO 2007/047859).
Como se describe en el documento WO 2009/059195, I-CreI y sus derivados modificados son normalmente diméricos, pero se pueden fusionar en un solo polipéptido utilizando un enlazador de péptidos corto que se une al extremo C-terminal de una primera subunidad al extremo N-terminal de una segunda subunidad (Li et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:1650-62; Grizot et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:5405-19). Por lo tanto, una meganucleasa funcional de "cadena única" se puede expresar a partir de una sola transcripción. Estas meganucleasas modificadas presentan una frecuencia extremadamente baja de corte fuera del objetivo. Al entregar un gen que codifica una meganucleasa de una sola cadena a una célula, es posible reconocer, escindir y alterar el gen de la región constante alfa TCR.
El uso de meganucleasas modificadas para cortar objetivos de ADN en la región constante alfa del receptor de células T humanas se describió previamente en la Publicación Internacional No. WO 2014/191527. La publicación del 527 describe variantes de la meganucleasa I-OnuI que están diseñadas para reconocer a una secuencia de reconocimiento (SEQ ID NO:3 de la publicación '527) dentro del exón 1 del gen de la región constante alfa TCR. Aunque la publicación del '527 analiza que un receptor de antígeno quimérico puede expresarse en células noqueantes TCR, los autores no describen la inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico en el sitio de escisión de meganucleasa en el gen de la región constante TCR alfa.
También se ha descrito el uso de otras nucleasas y mecanismos para interrumpir la expresión del TCR endógeno. Por ejemplo, el uso de nucleasas de dedos de zinc para bloquear los genes TCR en células T humanas fue descrito por la patente de los Estados Unidos No 8.95.828 y por la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US2014/034902. La Publicación de Solicitud de Patente de los EE. UU. No. US2014/0301990 describe el uso de nucleasas de dedos de zinc y nucleasas efectoras tipo activadoras de la transcripción (TALEN), y un sistema CRISPR/Cas con un ARN guía único diseñado para reconocer a genes TCR en una célula T aislada. Publicación de Solicitud de Patente de los EE. UU. No. US2012/0321667 describe el uso de ARN de horquilla pequeña que reconoce a ácidos nucleicos que codifican TCR específicas y/o cadenas CD3 en células T.
Sin embargo, la presente invención mejora las enseñanzas del estado de la técnica. Los actuales inventores son los primeros en enseñar células modificadas genéticamente que comprenden una secuencia de polinucleótidos exógena (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico o una secuencia de codificación TCR exógena) insertada en el gen humano de la región constante TCR alfa, que bloquea simultáneamente la expresión del receptor endógeno de células T en la superficie celular. Además, el estado de la técnica no muestra ni las meganucleasas ni las secuencias de reconocimiento descritas en el presente documento, ni su uso para la producción de dichas células modificadas genéticamente.
Compendio de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones anexas.
La presente invención proporciona meganucleasas recombinantes que están diseñadas para reconocer y escindir secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro de los restos 93-208 del gen de la región constante del receptor alfa de células T humanas (TCR) (SEQ ID NO:1). Estas meganucleasas son útiles para bloquear el gen de la región constante de TCR alfa y, en consecuencia, para bloquear también la expresión y/o función del TCR en la superficie celular. Por lo tanto, las meganucleasas de la invención tienen utilidad en inmunoterapia, incluida la inmunoterapia contra el cáncer. La escisión de meganucleasas puede alterar la función génica ya sea por la acción mutagénica de la unión final no homóloga o promoviendo la introducción de un polinucleótido exógeno en el gen mediante la recombinación homóloga. En algunas realizaciones, el polinucleótido exógeno introducido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígenos quimérico, de tal manera que la meganucleasa sea útil para generar una célula T CAR alogénica que carezca de un TCR endógeno.
La presente invención proporciona además métodos que comprenden la entrega de una proteína meganucleasa recombinante, o genes que codifican una meganucleasa recombinante, a una célula eucariota con el fin de producir una célula eucariota modificada genéticamente.
Así, en un aspecto, la invención proporciona una meganucleasa recombinante que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento dentro de los restos 93-208 del gen de la región constante del receptor alfa de células T humanas (SEQ ID NO:1). Dicha meganucleasa recombinante comprende una primera subunidad y una segunda subunidad, en la que la primera subunidad se une a un primer semi-sitio de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento y comprende una primera región hipervariable (HVR1), y en la que la segunda subunidad se une a una segundo semisitio de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento y comprende una segunda región hipervariable (HVR2).
La secuencia de reconocimiento comprende SEQ ID NO:3 (es decir, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2).
La primera subunidad de meganucleasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad de secuencia con respecto a los restos 198-344 de cualquiera de las SEQ ID NO:8-18 o los restos 7-153 de cualquiera de las SEQ ID NO:19-27, y la segunda subunidad de meganucleasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad de secuencia con respecto a los restos 7-153 de cualquiera de las SEQ ID NO:8-18 o restos 198-344 de cualquiera de las SEQ ID NO:19-27.
En una de esas realizaciones, la meganucleasa recombinante es una meganucleasa de una sola cadena que comprende un enlazante, en la que el enlazante se une covalentemente a la primera subunidad y a la segunda subunidad.
En otra realización de este tipo, la meganucleasa recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:8-27.
En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en este documento.
En los diversos aspectos de la invención, el polinucleótido aislado puede ser un ARNm. En una realización, el ARNm puede codificar una sola meganucleasa recombinante descrita en este documento. En otras realizaciones, el ARNm puede ser un ARNm policistrónico (por ejemplo, bicistrónico, tricistrónico, etc.) que comprende una secuencia de codificación para al menos una meganucleasa descrita en el presente documento y una secuencia de codificación para al menos una proteína adicional (por ejemplo, una segunda nucleasa). En realizaciones particulares, un ARNm policistrónico puede codificar dos o más meganucleasas descritas en el presente documento que se dirijan a diferentes secuencias de reconocimiento dentro del mismo gen (por ejemplo, el gen de la región constante del receptor alfa de células T). En otras realizaciones, un ARNm policistrónico puede codificar una meganucleasa descrita en el presente documento y una segunda nucleasa que reconozca y corte una secuencia de reconocimiento diferente dentro del mismo gen (por ejemplo, el gen de la región constante del receptor alfa de células T) o, alternativamente, que reconozca y corta una secuencia de reconocimiento diferente dentro de otro gen de interés en el genoma. En tales realizaciones, las células modificadas genéticamente producidas con este ARNm policistrónico pueden tener múltiples genes silenciados simultáneamente. Además, las células modificadas genéticamente producidas con dicho ARNm policistrónico pueden tener una secuencia exógena de interés insertada en el genoma en uno o más de los sitios de escisión producidos por las nucleasas codificadas. En realizaciones adicionales, un ARNm policistrónico puede codificar al menos una meganucleasa descrita en el presente documento y una proteína adicional que sea beneficiosa para la célula, mejore la eficiencia de inserción de una secuencia exógena de interés en un sitio de escisión y/o sea beneficiosa en el tratamiento de una enfermedad.
En otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN recombinante que comprende un polinucleótido aislado, en el que el polinucleótido aislado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en este documento. En una realización, la construcción de a Dn recombinante codifica un vector viral. En una realización, la construcción de ADN recombinante codifica un vector AAV recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector AAV recombinante que comprende un polinucleótido aislado, en el que el polinucleótido aislado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de la célula eucariota, comprendiendo el método transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos incluyendo: (a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en este documento; y (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluya la secuencia de interés; donde la meganucleasa recombinante produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende SEQ ID NO:3, y en la que la secuencia de interés se inserta en el cromosoma en el sitio de escisión, en el que dicho método no constituye un método de tratamiento del cuerpo humano o animal realizado mediante cirugía o terapia.
En una realización del método, el segundo ácido nucleico comprende además secuencias homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga.
En otra realización del método, el segundo ácido nucleico carece de homología sustancial en el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el cromosoma por una unión final no homóloga.
En otra realización del método, la célula eucariota es una célula T humana o una célula derivada de ella.
En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de células T exógeno.
En otra realización del método, al menos la primera secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula por un ARNm. En algunas de estas realizaciones, el ARNm puede ser un ARNm policistrónico que codifica al menos una meganucleasa recombinante descrita en este documento y al menos una proteína adicional (por ejemplo, una segunda nucleasa).
En otra realización del método, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector viral. En otra realización del método, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se introducen en la célula eucariota por el mismo vector viral o, alternativamente, por vectores virales separados.
En otra realización del método, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector AAV recombinante. En otra realización del método, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se introducen en la célula eucariota por el mismo vector AAV recombinante o, alternativamente, por vectores AAV recombinantes separados.
En otra realización del método, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota utilizando una plantilla de ADN de una sola cadena.
En una realización particular del método, la primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en el presente documento se introduce en la célula por un ARNm, y la segunda secuencia de ácido nucleico incluyendo la secuencia exógena de interés se introduce en la célula usando un vector viral, preferiblemente un vector AAV recombinante, en el que la célula es una célula T humana, y en la que la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En tal realización, el método produce una célula T modificada genéticamente que comprende un receptor de antígeno quimérico y que ha reducido la expresión de la superficie celular del receptor endógeno de células T en comparación con una célula de control.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de la célula eucariota, comprendiendo el método: a) introducir una meganucleasa recombinante descrita en este documento en una célula eucariota; y b) transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que incluya la secuencia de interés; donde la meganucleasa recombinante produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende SEQ ID NO:3, y en la que la secuencia de interés se inserta en el cromosoma en el sitio de escisión, en el que dicho método no constituye un método de tratamiento del cuerpo humano o animal realizado mediante cirugía o terapia.
En una realización del método, el ácido nucleico comprende además secuencias homólogas con respecto a secuencias que flanquean el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante una recombinación homóloga.
En otra realización del método, el ácido nucleico carece de homología sustancial en el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el cromosoma por unión final no homóloga.
En otra realización del método, la célula eucariota es una célula T humana o una célula derivada de ella.
En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de células T exógeno.
En otra realización del método, la secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector viral.
En otra realización del método, la secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector AAV recombinante.
En otra realización del método, la secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota utilizando una plantilla de ADN de una sola cadena.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente mediante la alteración de una secuencia diana en un cromosoma de la célula eucariota, comprendiendo el método: transfectar una célula eucariota con un ácido nucleico que codifica un meganucleasa recombinante descrita en el presente documento; donde la meganucleasa recombinante produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende SEQ ID NO:3, y en la que la secuencia diana se ve modificada por la unión final no homóloga en el sitio de escisión, en la que dicho método no constituye un método de tratamiento del cuerpo humano o animal realizado mediante cirugía o terapia.
En una realización del método, la célula eucariota es una célula T humana o una célula derivada de ella.
En otra realización del método, el ácido nucleico que codifica la meganucleasa recombinante es un ARNm. En algunas de estas realizaciones, el ARNm puede ser un ARNm policistrónico que codifica al menos una meganucleasa recombinante descrita en este documento y al menos una proteína adicional (por ejemplo, una segunda nucleasa).
En otra realización, el método comprende además transfectar la célula eucariota con un segundo ácido nucleico que incluye una secuencia exógena de interés. En una de esas realizaciones del método, el segundo ácido nucleico comprende además secuencias homólogas con respecto a secuencias que flanquean el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga.
En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de células T exógeno.
En otra realización del método, al menos el segundo ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector viral.
En otra realización del método, al menos el segundo ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector AAV recombinante.
En otra realización del método, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota utilizando una plantilla de ADN de una sola cadena.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente mediante la alteración de una secuencia diana en un cromosoma de la célula eucariota, comprendiendo el método: introducir una meganucleasa recombinante descrita en este documento en un célula eucariota; donde la meganucleasa produce un sitio de escisión en el cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende SEQ ID NO:3, y la secuencia diana se ve modificada por la unión final no homóloga en el sitio de escisión, en el que dicho método no constituye un método de tratamiento del cuerpo humano o animal realizado mediante cirugía o terapia.
En una realización del método, la célula eucariota es una célula T humana o una célula derivada de ella.
En otra realización, el método comprende además transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que incluya una secuencia exógena de interés.
En una de esas realizaciones del método, el ácido nucleico comprende además secuencias homólogas con respecto a secuencias que flanquean el sitio de escisión, y la secuencia de interés se inserta en el sitio de escisión mediante recombinación homóloga.
En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En otra realización del método, la secuencia de interés codifica un receptor de células T exógeno.
En otra realización del método, el ácido nucleico es introducido en la célula eucariota por un vector viral.
En otra realización del método, el ácido nucleico se introduce en la célula eucariota por un vector AAV recombinante.
En otra realización del método, la secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula eucariota utilizando una plantilla de ADN de una sola cadena.
También se describe un método de producción de un organismo no humano modificado genéticamente que comprende: producir una célula eucariota no humana modificada genéticamente de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento; y hacer crecer la célula eucariota no humana modificada genéticamente para producir el organismo no humano modificado genéticamente.
La célula eucariota no humana se puede seleccionar del grupo que consiste en un gameto, un cigoto, un blastocisto, una célula madre embrionaria y un protoplasto.
También se describe una célula eucariota modificada genéticamente descrita en este documento para su uso como medicamento. También se describe el uso de una célula eucariota modificada genéticamente descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto necesitado de la misma. El medicamento puede ser útil en el tratamiento del cáncer.
CAR puede comprender un dominio extracelular de unión de antígenos. El dominio o resto de unión al ligando extracelular puede estar en forma de un fragmento variable de cadena única (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal, que proporciona especificidad para un epítopo o antígeno particular (por ejemplo, un epítopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula, como una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de enfermedades). El scFv se puede unir a través de una secuencia enlazante. El dominio de unión del ligando extracelular puede ser específico para cualquier antígeno o epítopo de interés. El scFv puede ser humanizado. El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un autoantígeno (véase, Payne et al. (2016), Science 353 (6295): 179-184), que puede ser reconocido por receptores de células B específicos de autoantígenos en linfocitos B, dirigiendo así a las células T a atacar y matar específicamente linfocitos B autorreactivos en enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos. Tales CAR pueden denominarse receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAAR), y su uso está abarcado en la invención.
También se describe un método inmunoterapéutico para el tratamiento del cáncer en un sujeto necesitado del mismo que comprende administrar al sujeto de una composición farmacéutica que comprende una célula modificada genéticamente producida por los métodos descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en un carcinoma, linfoma, sarcoma, blastoma y leucemia.
El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en un cáncer de origen celular B, cáncer de mama, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, sarcoma de rabdomio, leucemia y linfoma de Hodgkin. El cáncer de origen de células B se puede seleccionar del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de células B y linfoma no Hodgkin de células B.
Los aspectos y realizaciones anteriores y otros de la presente invención pueden entenderse más ampliamente por referencia a la siguiente descripción detallada y a las reivindicaciones. Ciertas características de la invención, que, a lo cálmeca, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Todas las combinaciones de las realizaciones son específicamente aceptadas por la presente invención y se describen en este documento como si todas y cada una de las combinaciones se describieran individual y explícitamente. Por el contrario, varias características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las subcombinaciones de características enumeradas en las realizaciones también son específicamente aceptadas por la presente invención y se describen en este documento como si todas y cada una de esas subcombinaciones se describirán individual y explícitamente en este documento. Las realizaciones de cada aspecto de la presente invención descrita en este documento aplican entre sí aspectos de la invención mutatis mutandis.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Secuencias de reconocimiento TRC en el gen humano de la región constante alfa TRC. A) Cada secuencia de reconocimiento dirigida por una meganucleasa recombinante de la invención comprende dos semisitios de reconocimiento. Cada semi-sitio de reconocimiento consta de 9 pares de bases, separados por una secuencia central de 4 pares de bases. La secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3) abarca los nucleótidos 187-208 de la región constante alfa de células T humanas (SEQ ID NO:1), y comprende dos semi­ sitios de reconocimiento denominados TRC1 y TRC2. La secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4) abarca los nucleótidos 93-114 de la región constante alfa de células T humanas (SEQ ID NO:1), y comprende dos semi-sitios de reconocimiento denominados TRC3 y TRC4. La secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5) abarca los nucleótidos 118-139 de la región constante alfa de células T humanas (SEQ ID NO:1), y comprende dos semi-sitios de reconocimiento denominados TRC7 y TRC8. B) Las meganucleasas recombinantes de la invención comprenden dos subunidades, en las que la primera subunidad que comprende la región HVR1 se une a un primer semi-sitio de reconocimiento (por ejemplo, TRC1, TRC3 o TRC7) y la segunda subunidad que comprende la región HVR2 se une a un segundo semi-sitio de reconocimiento (por ejemplo, TRC2, TRC4 o TRC8). En las realizaciones en las que la meganucleasa recombinante es una meganucleasa de una sola cadena, la primera subunidad que comprende la región HVR1 puede posicionarse como la subunidad N-terminal o C-terminal. Del mismo modo, la segunda subunidad que comprende la región HVR2 se puede posicionar como la subunidad N-terminal o C-terminal.
Figura 2A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC1. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC1 de SEQ ID NO:3. Se proporcionan alineaciones de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión de TRC1 (SEQ ID NOs:33-52) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-27. Como se muestra, la subunidad de unión TRC1 de las SEQ ID NO:8-18 comprende los restos 198-344, mientras que la subunidad de unión TRC1 de las SEQ ID NO:19-27 comprende los restos 7-153. Cada subunidad de unión de TRC1 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean, estando los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes están en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o en la posición 271 (véase la patente estadounidense No 8.021.867). Todas las subunidades de unión TRC1 proporcionadas en la Figura 2 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en la subunidad de unión t Rc 1 (restos 198-344) de la meganucleasa del TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:33). Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:8-27.
Figura 3A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC2. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC2 de SEQ ID NO:3. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión de TRC2 (SEQ ID NOs: 58-77) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-27. Como se muestra, la subunidad de unión de TRC2 de las SEQ ID NO:8-18 comprende los restos 7-153, mientras que la subunidad de unión de TRC2 de las SEQ ID NO:19-27 comprende los restos 198­ 344. Cada subunidad de unión de TRC2 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean, estando los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 o posición 271 (véase la patente estadounidense No 8.021.867), y un resto R en la posición 139 de la meganucleasas TRC 1-2x.87 EE, TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ, TRC 1-2x.87, y TRC 1-2x.163 (gris sombreado y subrayado). Todas las subunidades de unión TRC2 proporcionadas en la Figura 3 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en la subunidad de unión TRC2 (restos 7­ 153) de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:58). Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:8-27.
Figura 4. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC3. Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC3 de SEQ ID NO:4. Se proporcionan alineaciones de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión de TRC3 (SEQ ID NOs:53 y 54) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:28 y 29. Como se muestra, la subunidad de unión TRC3 de las SEQ ID NO:28 y 29 comprende los restos 7-153. Cada subunidad de unión TRC3 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 (véase la patente estadounidense No 8.021.867). Las subunidades de unión TRC3 de las meganucleasas TRC 3-4x.3 y TRC 3-4x.19 comparten una identidad de secuencia del 97%. Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:28 y 29.
Figura 5. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC4. Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC4 de SEQ ID NO:4. Se proporcionan alineaciones de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión de TRC4 (SEQ ID NOs:78 y 79) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:28 y 29. Como se muestra, la subunidad de unión TRC4 de las SEQ ID NO:28 y 29 comprende los restos 198-344. Cada subunidad de unión TRC4 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 (véase la patente estadounidense No 8.021.867). Las subunidades de unión TRC4 de las meganucleasas 3-4x.3 y TRC 3-4x.19 comparten una identidad de secuencia del 97%. Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:28 y 29.
Figura 6A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC7. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC7 de SEQ ID NO:5. Se proporcionan alineaciones de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión TRC7 (SEQ ID NOs:55-57) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:30-32. Como se muestra, la subunidad de unión TRC7 de SEQ ID NO:30 comprende los restos 7-153, mientras que la subunidad de unión TRC7 de las SEQ ID NO:31 y 32 comprende los restos 198-344. Cada subunidad de unión TRC7 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean, estando los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o en la posición 271 (véase la patente estadounidense No 8.021.867). Todas las subunidades de unión TRC7 proporcionadas en la Figura 6 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en la subunidad de unión TRC7 (restos 7-153) de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:55). Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:30-32.
Figura 7A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión TRC8. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes englobadas por la invención comprenden una subunidad que une el semi-sitio de reconocimiento de 9 pares de bases de TRC8 de SEQ ID NO:5. Se proporcionan alineaciones de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión TRC8 (SEQ ID NOs:80-82) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:30-32. Como se muestra, la subunidad de unión TRC8 de SEQ ID NO:30 comprende los restos 198­ 344, mientras que la subunidad de unión TRC8 de las SEQ ID NO:31 y 32 comprende los restos 7-153. Cada subunidad de unión TRC8 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable se sombrean, estando los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o en la posición 271 (véase la patente estadounidense No 8.021.867). Todas las subunidades de unión TRC8 proporcionadas en la Figura 7 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en la subunidad de unión Tr C8 (restos 198-344) de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:80). Los números de restos mostrados son los de las SEQ ID NO:30-32.
Figura 8. Esquema del ensayo indicador en células CHO para evaluar meganucleasas recombinantes dirigidas a secuencias de reconocimiento encontradas en la región constante del receptor alfa de células T (SEQ ID NO:1). Para las meganucleasas recombinantes descritas en este documento, se produjo una línea celular CHO en la que un casete indicador se integró establemente en el genoma de la célula. El casete indicador comprendía, en orden de 5' a 3': un Promotor Temprano SV40; el 5' 2/3 del gen GFP; la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa modificada de la invención (por ejemplo, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8); la secuencia de reconocimiento para la meganucleasa CHO-23/24 (documento WO/2012/167192); y la secuencia de reconocimiento 3' 2/3 del gen GFP. Las células establemente transfectadas con este casete no expresaron GFP en ausencia de un agente inductor de ruptura de ADN. Las meganucleasas se introdujeron por transducción de ADN plasmídico o ARNm que codificaba cada meganucleasa. Cuando se indujo una ruptura del ADN en cualquiera de las secuencias de reconocimiento de las meganucleasas, las regiones duplicadas del gen GFP se recombinaron entre sí para producir un gen GFP funcional. El porcentaje de células que expresaban GFP pudo determinarse mediante citometría de flujo como una medida indirecta de la frecuencia de la escisión del genoma por las meganucleasas.
Figura 9. Eficiencia de meganucleasas recombinantes para reconocer y cortar secuencias de reconocimiento en la región constante del receptor alfa de células T humanas (SEQ ID NO:1) en un ensayo indicador de células CHO. Cada una de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-32 fueron diseñadas para reconocer a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3), la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4), o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5), y se examinaron para determinar su eficacia en el ensayo indicador de células CHO. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células de expresión de g Fp observadas en cada ensayo, lo que indica la eficacia de cada meganucleasa para cortar una secuencia de reconocimiento diana TRC o la secuencia de reconocimiento CHO-23/24. En cada ensayo se incluyó además un control negativo (1-2 bs RHO). A)-C) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. D) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 3-4. E)-F) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 7-8. G) Variantes de la meganucleasa TRC 1-2x.87, donde la Q en la posición 271 se sustituye por E (TRC 1-2x.87 QE), la Q en la posición 80 se sustituye por E (TRC 1-2x.87 EQ), o la Q en la posición 80 y la Q en la posición 271 se sustituyen por E (TRC 1-2x.87 EE).
Figura 10. Curso de tiempo de eficacia de meganucleasa recombinante en el ensayo indicador de células CHO. Las meganucleasas TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ y TRC 1-2x.87 EE fueron evaluadas en el ensayo indicador de CHO, con el porcentaje de células de expresión de GFP determinado 1, 4, 6, 8 y 12 días después de la introducción del ARNm de codificación de meganucleasa en las células indicadoras CHO.
Figura 11. Análisis del ADN genómico de células Jurkat después de la transfección con meganucleasas TRC 1-2. A las 72 horas después de la transfección con ARNm codificando meganucleasas TRC 1-2, se extrajo ADN genómico y se realizó un ensayo con endonucleasa T7 para estimar la modificación genética en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2.
Figura 12. Dosis-respuesta de la expresión de meganucleasa TRC 1-2 en células Jurkat bajo modificación genética en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2. Las células de Jurkat se transfectaron con un ARNm de meganucleasa de 3 |jg o 1 |jg de TRC 1-2. A las 96 horas, se analizó el ADN genómico utilizando un ensayo de endonucleasa T7.
Figura 13. Escisión de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas. A) Las células T CD3+ se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se sometieron electroporación con ARNm que codificaba la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE. El ADN genómico se extrajo a los 3 días y 7 días después de la transfección, y se analizó utilizando un ensayo de endonucleasa T7. B) Para determinar si las mutaciones en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2 eran suficientes para eliminar la expresión superficial del receptor de células T, las células fueron analizadas por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD3. Las células de control (transfectadas con agua) y las células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE se analizaron en el día 3 y el día 7 después de la transfección, y se determinó el porcentaje de células T CD3 positivas y CD3 negativas.
Figura 14. Secuencias de ácido nucleico de eliminaciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas tras la expresión de meganucleasas TRC 1-2.
Figura 15. Diagrama que ilustra los elementos de secuencia de vectores AAV recombinantes y su uso en combinación con una nucleasa diseñada para insertar una secuencia de ácido nucleico exógena en el gen endógeno de la región constante TCR alfa.
Figura 16. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV405.
Figura 17. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV406.
Figura 18. Determinación del momento de la transfección de ARNm meganucleasa y la transducción AAV recombinante para mejorar la eficiencia de la transducción AAV. Las células T CD3+ humanas se sometieron a electroporación con ARNm que codificaba la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE y a las 2, 4 u 8 horas después de la transfección, las células fueron transducidas con un vector AAV recombinante que codificaba GFP (GFP-AAV). Las células T fueron analizadas por citometría de flujo para determinar la expresión de GFP a las 72 horas posteriores a la transducción para determinar la eficiencia de la transducción.
Figura 19. Análisis de las células T humanas para la inserción de una secuencia de ácido nucleico exógena utilizando vectores AAV recombinantes. Células T CD3+ transfectadas con ARNm TRC 1-2x.87 EE y posteriormente transducidas (2 horas después de la transfección) con AAV405 o AAV406. Los controles de transducción solo se simulaban (con agua) y se transdujeron con AAV405 o AAV406. Los controles solo de meganucleasa se transfectaron con TRC 1-2x.87 EE y luego se simularon transducidos (con agua) a las 2 horas después de la transfección. El ADN genómico fue recuperado de las células T y el locus TRC 1-2 fue amplificado por PCR usando cebadores que reconocían secuencias más allá de la región de homología en los vectores AAV. Los cebadores PCR fuera de las regiones de homología solo permitían la amplificación del genoma de las células T, no de los vectores AAV. Los productos de la PCR fueron purificados y digeridos con EagI. A continuación, se analizaron los productos de PCR para su escisión.
Figura 20. Caracterización de la inserción de Eagl en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 de células T humanas utilizando AAV405. A) El producto PCR no digerido generado a partir de experimentos anteriores se clonó en un vector PCR-romo. La PCR de colonia se realizó utilizando cebadores directos e inversos de M13 y una porción de productos de PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV405 fue analizada por electroforesis de gel. El análisis muestra una mezcla de productos de PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 bp), insertos más pequeños y plásmidos vacíos (aproximadamente 300 bp). B) Paralelamente, otra porción de productos de PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contenían el sitio de reconocimiento EagI insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de PCR se cortados con EagI generaron los fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 bp.
Figura 21. Caracterización de la inserción de EagI en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 de células T humanas utilizando AAV406. A) El producto PCR no digerido generado a partir de experimentos anteriores se clonó en un vector PCR-romo. La PCR de colonia se realizó utilizando cebadores directos e inversos de M13 y una porción de productos de la PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV406 fue analizada por electroforesis de gel. El análisis muestra una mezcla de productos de PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 bp), insertos más pequeños y plásmidos vacíos (aproximadamente 300 bp). B) Paralelamente, otra porción de productos de PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contenía el sitio de reconocimiento EagI insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de PCR cortados con EagI generaron los fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 bp.
Figura 22. A) Secuencias de ácido nucleico de eliminaciones e inserciones representativas (es decir, indels) que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas tras la expresión de meganucleasas TRC 1-2. B) Secuencia de ácido nucleico de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 que confirma la inserción de la secuencia de ácido nucleico exógeno que comprende el sitio de restricción de EagI.
Figura 23. Mejora de la eficiencia de transducción AAV recombinante. La eficiencia de la transducción se analizó más a fondo optimizando el momento de la transfección de ARNm meganucleasa y la posterior transducción de AAV. Las células T CD3+ humanas se sometieron a electroporación con ARNm que codificaba la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE y posteriormente se transdujo con GFP-AAV inmediatamente después de la transfección o 2 horas después de la transfección. Además, las células T en reposo no estimuladas fueron transducidas con GFP-AAV. También se analizaron células transducidas simuladas. A las 72 horas posteriores a la transducción, las células fueron analizadas por citometría de flujo para la expresión de GFP para determinar la eficiencia de la transducción AAV.
Figura 24. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV-CAR100 (AAV408).
Figura 25. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV-CAR763 (AAV412).
Figura 26. Inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas. Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si la plantilla AAV412 HDR se utilizaba para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Figura 27. Inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas. Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si la plantilla AAV408 HDR se utilizaba para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. A) Productos PCR generados utilizando un par de imprimación que solo amplificaba un producto en el extremo de 5' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se había insertado en ese locus. B) Productos PCR generados utilizando un par de imprimación que solo amplificaba un producto en el extremo 3' del locus de secuencia de reconocimiento t Rc 1-2 si el gen CAR se había insertado en ese locus.
Figura 28. PCR digital. A) Esquema de un ensayo digital de PCR desarrollado para determinar cuantitativamente la eficiencia de inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas. B) Resultados de la PCR digital en ADN genómico de células T humanas electroporadas con un ARNm de meganucleasa TRC 1-2x.87EE y/o cantidades crecientes de AAV408. Figura 29. Expresión de la superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en células T humanas. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 utilizando AAV408 como plantilla HDR. La expresión de superficie celular se analizó mediante citometría de flujo. A) Células que fueron simuladas electroporadas y simuladas transducidas (MOI - 0), y células que fueron simuladas electroporadas y transducidas con cantidades crecientes de AAV408. B) Células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas (MOI - 0), y células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV408.
Figura 30. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV421.
Figura 31. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV422.
Figura 32. Inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico. Se utilizaron métodos de PCR para determinar si la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico introducida por AAV421 o AAV422 insertado en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 eran escindidos por la meganucleasa TRC 1-2x.87EE. A) Análisis de inserción tras la transducción con AAV421. B) Análisis de inserción tras la transducción con AAV422. Figura 33. Expresión de superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en células T humanas. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 utilizando AAV421 como plantilla HDR. La expresión en la superficie celular se analizó mediante citometría de flujo. A) Células que fueron simuladas electroporadas y simuladas transducidas (MOI - 0), y células que fueron simuladas electroporadas y transducidas con cantidades crecientes de AAV421. B) Células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas (MOI - 0), y células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV421.
Figura 34. Expansión de células T humanas que expresan un receptor de antígeno quimérico de superficie celular. Se determinaron métodos para ampliar y enriquecer preferentemente una población de células CD3VCAR+ T después de la electroporación con ARNm para la meganucleasa TRC 1-2x.87EE y la transducción con AAV421. A) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL). B) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL), e incubación con células IM-9 inactivadas por mitomicina C) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL), y dos incubaciones con células IM-9 inactivadas por mitomicina C.
Figura 35. Expresión en la superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en células T humanas. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 utilizando AAV422 como plantilla h Dr . La expresión en la superficie celular se analizó mediante citometría de flujo. A) Células que fueron simuladas electroporadas y simuladas transducidas (MOI - 0), y células que fueron simuladas electroporadas y transducidas con cantidades crecientes de AAV422. B) Células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas (MOI - 0), y células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV422.
Figura 36. Expansión de células T humanas que expresan un receptor de antígeno quimérico de superficie celular. Se determinaron métodos para ampliar y enriquecer preferentemente una población de células CD3VCAR+ T después de la electroporación con ARNm para la meganucleasa TRC 1-2x.87EE y la transducción con AAV422. A) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL). B) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL), e incubación con células IM-9 inactivadas por mitomicina C. C) Suplementación con IL-7 (10 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL), y dos incubaciones con células IM-9 inactivadas con mitomicina C.
Figura 37. Eficiencia de eliminación de meganucleasas utilizando AAV de una sola cadena. Se llevaron a cabo experimentos para examinar la eficiencia de nocaut de dos meganucleasas en células T humanas cuando se transdujeron simultáneamente con un vector AAV de una sola cadena. A) Células electroporadas con ARNm para TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes del AAV412 de una sola cadena. B) Células electroporadas con ARNm para una meganucleasa dirigida al gen de la microglobulina beta-2 y transducidas con cantidades cada vez mayores del AAV412 de una sola cadena. C) Células electroporadas con ARNm para TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes del AAV422 de una sola cadena.
Figura 38. Actividad funcional de las células T anti-CD19 CAR. A) Ensayo IFN-gamma ELISPOT, en el que las células CD19+ Raji o células CD19' U937 eran la población objetivo. B) Ensayo de eliminación de células en el que las células CD19+ Raji marcadas con luciferasa eran el objetivo.
Figura 39. Expresión de receptores de antígeno quimérico tras la transducción con plantillas de donantes de ADN linealizado. Estos experimentos generaron plásmidos que contenían un gen CAR anti-CD19 flanqueado por brazos homólogos que eran homólogos con el locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Diferentes promotores fueron utilizados en algunos plásmidos, y los brazos de homología eran o bien "cortos" (200 bp en el brazo de homología de 5' y 180 bp en el brazo de homología de 3') o "largo" (985 bp en el brazo de homología de 5' y 763 bp en el brazo de homología 3'). Los plásmidos de los donantes CAR se linealizaron en un sitio de restricción en la estructura vectorial y se purificaron con gel. A) Tinción de fondo de CD3VCAR+. B) Células electroporadas con ARNm TRC 1-2x.87EE solo. C) Células electroporadas conjuntamente con ARNm TRC 1-2x.87EE y un largo vector de brazo homológico con un promotor de núcleo EF1a con un potenciador HTLV. D) Células electroporadas conjuntamente con ARNm TRC 1-2x.87EE y un vector de brazo de homología corto con el promotor del núcleo EF1a (sin potenciador). E) Células electroporadas con un largo vector de brazo homológico con un promotor de núcleo EF1a con un potenciador HTLV en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE. F) Células electroporadas con un vector de brazo de homología corta con el promotor de núcleo EF1a (sin potenciador) en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE. G) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contiene una expresión de conducción promotora MND de CAR y un intrón en el extremo 5' del gen CAR, así como el ARNm TRC 1-2x.87EE. H) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contiene una expresión de conducción promotora MND de CAR y ningún intrón, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. I) Células electroporadas con un plásmido de brazo corto de homología con el promotor MND y sin intrón, así como el ARNm TRC 1-2x.87EE. J) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contiene una expresión de conducción promotora MND de CAR y un intrón en el extremo 5' del gen CAR, pero no un ARNm TRC 1-2x.87EE. K) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contiene una expresión de conducción promotora MND de CAR y ningún intrón, pero no un ARNm TRC 1-2x.87EE. L) Células electroporadas con un plásmido de brazo corto homología con el promotor MND y sin intrón, pero sin ARNm TRC 1-2x.87EE. M) Células electroporadas con una construcción de brazo corto de homología que contenía un promotor de JeT, así como el ARNm TRC 1-2x.87EE. N) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contenía un promotor de CMV, así como el ARNm TRC 1-2x.87EE. O) Células electroporadas con una construcción de brazo corto de homología que contenía un promotor de JeT, pero no ARNm TRC 1-2x.87EE. P) Células electroporadas con una construcción de brazo largo de homología que contenía un promotor de CMV, pero no ARNm t Rc 1-2x.87EE.
Figura 40. El análisis de PCR para determinar si la región de codificación del receptor de antígeno quimérico suministrada por construcciones de ADN linealizado se insertaba en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas.
Figura 41. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV423.
Figura 42. Expresión de la superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en células T humanas. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 utilizando AAV423 como plantilla h Dr . La expresión en la superficie celular se analizó mediante citometría de flujo. A) Células que fueron simuladas electroporadas y simuladas transducidas (MOI - 0), y células que fueron simuladas electroporadas y transducidas con cantidades crecientes de AAV423. B) Células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas (MOI - 0), y células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV423.
Figura 43. Inserción de la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico. Se utilizaron métodos de PCR para determinar si la secuencia de codificación del receptor de antígeno quimérico introducida por AAV423 insertada en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 era cortada por la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
Figura 44. Análisis de fenotipo de células T anti-CD19 CAR. A) Las células T activadas fueron electroporadas con el ARNm TRC 1-2x.87 EE, luego transducidas con un vector AAV6 que comprendía un casete de expresión CAR anti-CD19 impulsado por un promotor de JeT y flanqueado por brazos de homología. Después de 5 días de cultivo con IL-2 (10 ng/mL), se analizaron las células para determinar la expresión de CD3 de superficie celular y anti-CD19 CAR por citometría de flujo. B) las células CD3' se enriquecieron agotando células CD3+ usando cuentas magnéticas anti-CD3. Las células agotadas se cultivaron durante 3 días en IL-15 (10 ng/mL) e IL-21 (10 ng/mL) y se volvieron a analizar para determinar la expresión de la superficie celular de CD3 y anti-CD19 CAR. C) La población purificada de células T CD3' CD19-CAR fue analizada por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células que fueron CD4+ y CD8+. D) La población purificada de células T c D3‘ CD19-CAR fue analizada más a fondo por citometría de flujo para determinar si eran células T de memoria central, células T de memoria de transición o células T de memoria de efector mediante la tinción para CD62L y CD45RO.
Figura 45. Modelo de linfoma diseminado de Raji. Las células Raji que expresaban establemente luciferasa de luciérnaga (ffLuc)44 se inyectaron i.v. en ratones NSG hembra de 5-6 semanas de edad el día 1 a una dosis de 2.0 x 105 células por ratón. El día 4 se inyectaron a los ratones i.v. PBS o PBS con células TCR KO T de control editadas genéticamente y preparadas a partir del mismo donante sano PBMC o PBS con las dosis indicadas de células T CAR preparadas a partir del mismo donante. En los días indicados, a los ratones vivos les fue inyectado i.p. sustrato de Luciferina (150 mg/kg en solución salina), anestesiados, y la actividad de Luciferasa fue medida después de 7 minutos usando IVIS SpectrumCT® (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los datos se analizaron y exportaron utilizando el software Living Image 4.5.1 (Perkin Elmer, Waltham, MA). La intensidad de la señal de luminiscencia se representa por la radiancia en p/s/cm2/sr.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de nucleótidos del gen de la región constante del receptor alfa de células T humana (NCBI Gene ID NO. 28755).
SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos codificada por la región constante del receptor alfa de células T humanas.
SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento TRC 3-4.
SEQ ID NO: 5 establece la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento TRC 7-8.
SEQ ID NO: 6 establece la secuencia de aminoácidos de I-CreI.
SEQ ID NO: 7 establece la secuencia de aminoácidos del motivo LAGLIDADG.
SEQ ID NO: 8 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE.
SEQ ID NO: 9 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87 QE.
SEQ ID NO 10 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EQ
SEQ ID NO 11 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
SEQ ID NO 12 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.6.
SEQ ID NO 13 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.20.
SEQ ID NO 14 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.55.
SEQ ID NO 15 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.60.
SEQ ID NO 16 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.105.
SEQ ID NO 17 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.163.
SEQ ID NO 18 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.113_ 3.
SEQ ID NO 19 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.5.
SEQ ID NO: 20 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.8.
SEQ ID NO: 21 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.25.
SEQ ID NO: 22 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.72.
SEQ ID NO: 23 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.80.
SEQ ID NO: 24 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.84.
SEQ ID NO: 25 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.120.
SEQ ID NO: 26 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.113_ 1.
SEQ ID NO: 27 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.113_ 2.
SEQ ID NO: 28 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 3-4x.3.
SEQ ID NO: 29 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 3-4x.19.
SEQ ID NO 30 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.7.
SEQ ID NO 31 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.9.
SEQ ID NO 32 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.14.
SEQ ID NO 33 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE.
SEQ ID NO 34 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 QE.
SEQ ID NO 35 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EQ.
SEQ ID NO 36 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
SEQ ID NO 37 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.6.
SEQ ID NO 38 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.20.
SEQ ID NO 39 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.55.
SEQ ID NO: 40 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.60.
SEQ ID NO: 41 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.105.
SEQ ID NO: 42 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.163.
SEQ ID NO: 43 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.113_3.
SEQ ID NO: 44 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.5.
SEQ ID NO: 45 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.8.
SEQ ID NO: 46 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.25.
SEQ ID NO: 47 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.72.
SEQ ID NO: 48 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.80.
SEQ ID NO: 49 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.84.
SEQ ID NO: 50 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.120.
SEQ ID NO: 51 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.113_1.
SEQ ID NO: 52 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 12x.113_2.
SEQ ID NO: 53 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 34x.3.
SEQ ID NO: 54 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 34x.19.
SEQ ID NO: 55 establece los restos 153 de la meganucleasa TRC 7 8x.7.
SEQ ID NO: 56 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 7-8x.9.
SEQ ID NO: 57 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 7-8x.14.
SEQ ID NO: 58 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.87 EE.
SEQ ID NO: 59 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.87 QE.
SEQ ID NO: 60 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.87 EQ.
SEQ ID NO: 61 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.87.
SEQ ID NO: 62 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.6.
SEQ ID NO: 63 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.20.
SEQ ID NO: 64 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.55.
SEQ ID NO: 65 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.60.
SEQ ID NO: 66 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.105.
SEQ ID NO: 67 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.163.
SEQ ID NO: 68 establece los restos -153 de la meganucleasa TRC 12x.113_3.
SEQ ID NO: 69 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.5.
SEQ ID NO: 70 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.8.
SEQ ID NO: 71 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.25.
SEQ ID NO: 72 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.72.
SEQ ID NO: 73 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.80.
SEQ ID NO: 74 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.84.
SEQ ID NO: 75 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.120.
SEQ ID NO: 76 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1 -2x.113_1.
SEQ ID NO: 77 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.113_2.
SEQ ID NO: 78 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 3-4x.3.
SEQ ID NO: 79 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 3-4x.19.
SEQ ID NO: 80 establece los restos 198-344 de la meganucleasa TRC 7-8x.7.
SEQ ID NO: 81 establece los restos 7-153 de la meganucleasa TRC 7 8x.9.
SEQ ID NO: 82 establece los restos 7-153 de la meganucleasa TRC 7 8x.14.
SEQ ID NO: 83 establece la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
SEQ ID NO: 84 establece la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento TRC 3-4.
SEQ ID NO: 85 establece la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento TRC 7-8.
SEQ ID NO: 86 establece nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO: 87 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 88 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 89 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 90 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 91 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 92 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 93 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 94 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una inserción resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 95 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una inserción resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 96 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 97 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 98 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 99 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 100 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 101 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 102 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 103 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 104 establece los nucleótidos 162-233 de SEQ ID NO:1 que comprende una eliminación resultante de escisión y NHEJ.
SEQ ID NO: 105 establece los nucleótidos 181-214 de SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO: 106 establece los nucleótidos 181-214 de SEQ ID NO:1 que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada a través de una recombinación homóloga.
SEQ ID NO: 107 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido utilizado para generar el vector AAV405. SEQ ID NO: 108 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido utilizado para generar el vector AAV406. SEQ ID NO: 109 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido utilizado para generar el vector AAV-CAR100 (AAV408).
SEQ ID NO: 110 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido utilizado para generar el vector AAV-CAR763 (AAV412).
SEQ ID NO: 111 establece la secuencia de aminoácidos de un receptor de antígeno quimérico anti-CD19.
SEQ ID NO: 112 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión de ligandos extracelulares anti-CD19.
SEQ ID NO: 113 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de señalización citoplasmática intracelular del receptor de antígeno quimérico.
SEQ ID NO: 114 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio coestimulante intracelular del receptor de antígeno quimérico.
SEQ ID NO: 115 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de péptido de señal del receptor de antígeno quimérico.
SEQ ID NO: 116 establece la secuencia de aminoácidos de una región de bisagra del receptor de antígeno quimérico.
SEQ ID NO: 117 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio transmembrana del receptor de antígeno quimérico.
SEQ ID NO: 118 establece la secuencia de nucleótidos de un promotor de núcleo alfa EF-1.
SEQ ID NO: 119 establece la secuencia de nucleótidos de un inserto de polinucleótidos exógenos.
SEQ ID NO: 120 establece la secuencia de nucleótidos del gen humano de la región constante TCR alfa, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 1­ 2.
SEQ ID NO: 121 establece la secuencia de nucleótidos del gen humano de la región constante TCR alfa, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 3­ 4.
SEQ ID NO: 122 establece la secuencia de nucleótidos del gen humano de la región constante TCR alfa, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 7­ 8.
SEQ ID NO: 123 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido utilizado para generar el vector AAV421. SEQ ID NO: 124 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido utilizado para generar el vector AAV422. SEQ ID NO: 125 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido utilizado para generar el vector AAV423.
Descripción detallada de la invención
1.1 Referencias y definiciones
La patente y la bibliografía científica a la que se hace referencia en el presente documento establecen conocimientos que están a disposición de los que tienen ciertas habilidades en la técnica.
La presente invención puede ser realizada en diferentes formas y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones establecidas en el presente documento. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y completa, y transmitirán plenamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una realización se pueden incorporar en otras realizaciones, y las características ilustradas con respecto a una realización determinada se pueden eliminar de esa realización.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por los expertos ordinarios en la técnica al que pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención en este documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitar la invención.
Como se usa en el presente documento, "una", "uno" o "el/la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una sola célula o una multiplicidad de células.
Tal como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique específicamente lo contrario, la palabra "o" se utiliza en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "o."
Como se utiliza en el presente documento, el término "meganucleasa" se refiere a una endonucleasa que une ADN de doble cadena en una secuencia de reconocimiento que es mayor que 12 pares de bases. Preferiblemente, la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa de la invención es de 22 pares de bases. Una meganucleasa puede ser una endonucleasa que se derive de I-CreI, y puede referirse a una variante modificada de I-CreI que se ha modificado en relación con I-CreI natural con respecto, por ejemplo, a la especificidad de unión al ADN, la actividad de la escisión del ADN, la afinidad de unión al ADN o las propiedades de dimerización. Los métodos para producir tales variantes modificadas de I-CreI se conocen en la materia (por ejemplo, el documento WO 2007/047859). Una meganucleasa, tal como se utiliza en el presente documento, se une al ADN de doble cadena como heterodímero o como una "meganucleasa de una sola cadena" en la que un par de dominios de unión al ADN se unen en un solo polipéptido utilizando un enlazante de péptidos. La expresión "endonucleasa guiada" es sinónimo del término "meganucleasa". Las meganucleasas de la invención son sustancialmente no tóxicas cuando se expresan en células, particularmente en células T humanas, de modo que las células pueden ser transfectadas y mantenidas a 37°C sin observar efectos nocivos sobre la viabilidad celular o reducciones significativas en la actividad de escisión de la meganucleasa cuando se miden utilizando los métodos descritos en este documento.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "meganucleasa de una sola cadena" se refiere a un polipéptido que comprende un par de subunidades de meganucleasa unidas por un enlazante. Una meganucleasa de una sola cadena tiene la organización: Subunidad N-terminal - Enlazante - Subunidad C-terminal. Las dos subunidades de meganucleasa generalmente no serán idénticas en la secuencia de aminoácidos y reconocerán secuencias de ADN no idénticas. Por lo tanto, las meganucleasas de una sola cadena suelen dejar secuencias de reconocimiento pseudopalindrómicas o no palindrómicas. Una meganucleasa de una sola cadena puede denominarse "heterodimérica de una sola cadena" o "meganucleasa heterodimérica de una sola cadena", aunque no sea, de hecho, dimérica. Para mayor claridad, a menos que se especifique lo contrario, el término "meganucleasa" puede referirse a una meganucleasa dimérica o de cadena única.
Como se utiliza en el presente documento, el término "enlazante" se refiere a una secuencia de péptidos exógenos que se utiliza para unir dos subunidades de meganucleasa en un solo polipéptido. Un enlazante puede tener una secuencia que se encuentre en proteínas naturales, o puede ser una secuencia artificial que no se encuentre en ninguna proteína natural. Un enlazante puede ser flexible y carecer de estructura secundaria o puede tener una propensión a formar una estructura tridimensional específica en condiciones fisiológicas. Un enlazante puede incluir, sin limitación, los incluidos en la patente estadounidense No 8.445.251. En algunas realizaciones, un enlazante puede tener una secuencia de aminoácidos que comprenda los restos 154-195 de cualquiera de los SEQ ID NO:8-32.
Tal como se utiliza en el presente documento, con respecto a una proteína, el término "recombinante" significa tener una secuencia de aminoácidos modificada como resultado de la aplicación de técnicas de modificación genética para los ácidos nucleicos que codifican la proteína, y las células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término "recombinante" significa tener una secuencia de ácido nucleico modificada como resultado de la aplicación de técnicas de modificación genética. Las técnicas de modificación genética incluyen, pero no se limitan a, tecnologías de clonación de PCR y ADN; transfección, transformación y otras tecnologías de transferencia de genes; recombinación homóloga; mutagénesis dirigida al sitio; y la fusión genética. De acuerdo con esta definición, una proteína con una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína natural, pero producida por clonación y expresión en un huésped heterólogo, no se considera recombinante.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "natural" se refiere al alelo natural más común (es decir, secuencia de polinucleótidos) en la población de alelo del mismo tipo de gen, en el que un polipéptido codificado por el alelo natural tiene sus funciones originales. El término "natural" también se refiere a un polipéptido codificado por un alelo natural. Los alelos naturales (es decir, los polinucleótidos) y los polipéptidos se distinguen de los alelos y polipéptidos mutantes o variantes, que comprenden una o más mutaciones y/o sustituciones en relación con la(s) secuencia(s) natural(es). Mientras que un alelo o polipéptido natural puede conferir un fenotipo normal en un organismo, un alelo o polipéptido mutante o variante puede, en algunos casos, conferir un fenotipo modificado. Las endonucleasas naturales se distinguen de las meganucleasas recombinantes o no naturales.
Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a las proteínas recombinantes, el término "modificación" significa cualquier inserción, eliminación o sustitución de un resto de aminoácidos en la secuencia recombinante en relación con una secuencia de referencia (por ejemplo, un tipo salvaje o una secuencia nativa).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de reconocimiento" se refiere a una secuencia de ADN que es unida y cortada por una meganucleasa. En el caso de una meganucleasa recombinante de la invención, una secuencia de reconocimiento comprende un par de "semi-sitios" o "semi-sitios de reconocimiento" invertidos de 9 pares de bases que están separados por cuatro pares de bases. En el caso de una meganucleasa de cadena única, la subunidad N-terminal de la proteína entra en contacto con un primer semi-sitio y la subunidad C-terminal de la proteína entra en contacto con un segundo semi-sitio. La división por una meganucleasa produce cuatro pares de bases 3' "salientes". Los "salientes" o "extremos pegajosos" son segmentos de ADN cortos de una sola cadena que se pueden producir mediante la escisión de meganucleasa de una secuencia de ADN de doble cadena. En el caso de las meganucleasas de la presente invención, el saliente comprende las bases 10-13 de la secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "sitio diana" o "secuencia diana" se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia de reconocimiento para una meganucleasa.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "afinidad de unión al ADN" o "afinidad de unión" significa la tendencia de una meganucleasa a asociarse no covalentemente con una molécula de ADN de referencia (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento o una secuencia arbitraria). La afinidad de enlace se mide mediante una constante de disociación, Kd. Tal como se utiliza en el presente documento, una meganucleasa tiene "modificada" la afinidad de unión si la Kd de la meganucleasa recombinante para una secuencia de reconocimiento de referencia incrementa o disminuye en un cambio de porcentaje estadísticamente significativo en relación con una meganucleasa de referencia.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "recombinación homóloga" o "HR" se refiere al proceso natural y celular en el que se repara una ruptura de ADN de doble cadena utilizando una secuencia de ADN homóloga como plantilla de reparación (véase, por ejemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La secuencia de ADN homólogo puede ser una secuencia cromosómica endógena o un ácido nucleico exógeno que se entregó a la célula.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "unión final no homóloga" o "NHEJ" se refiere al proceso celular natural en el que una ruptura del ADN de doble cadena se repara mediante la unión directa de dos segmentos de ADN no homólogos (véase, por ejemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La reparación del ADN por unión final no homóloga es propensa a errores y con frecuencia resulta en la adición o eliminación no contemplada de secuencias de ADN en el lugar de reparación. En algunos casos, la escisión en una secuencia de reconocimiento diana da como resultado NHEJ en un sitio de reconocimiento diana. La escisión inducida por nucleasas de un sitio diana en la secuencia de codificación de un gen seguida de una reparación del ADN por NHEJ puede introducir mutaciones en la secuencia de codificación, como mutaciones de marco, que bloquean la función génica. Por lo tanto, las nucleasas diseñadas, como las meganucleasas, se pueden utilizar para eliminar eficazmente un gen en una población de células.
Como se utiliza en el presente documento, un "receptor de antígeno quimérico" o "CAR" se refiere a un receptor diseñado que confiere o injerta especificidad de un antígeno en una célula efectora inmune (por ejemplo, una célula T humana). Un receptor de antígeno quimérico comprende típicamente un dominio de unión de ligando extracelular o resto y un dominio intracelular que comprende uno o más dominios estimulantes que transducen las señales necesarias para la activación de células T. En algunas realizaciones, el dominio o el resto de los ligandos extracelulares pueden estar en forma de fragmentos variables de cadena única (scFvs) derivados de un anticuerpo monoclonal, que proporcionan especificidad para un epítopo o antígeno en particular (por ejemplo, un epítopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de enfermedades). El dominio de unión de ligando extracelular puede ser específico para cualquier antígeno o epítopo de interés. En una realización particular, el dominio de unión de ligandos es específico para CD19. En otras realizaciones, el scFv puede ser humanizado.
El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un autoantígeno (véase, Payne et al. (2016), Science 353(6295):179-184), que puede ser reconocido por receptores de células B específicos de autoantígenos en linfocitos B, dirigiendo así a las células T a específicamente reconocer y matar linfocitos B autorreactivos en enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos. Tales CARs pueden ser denominados receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAARs), y su uso está abarcado por la invención.
El scFvs se puede adjuntar a través de una secuencia de enlazante. El dominio estimulador intracelular puede incluir uno o más dominios de señalización citoplasmática que transmiten una señal de activación a la célula del efector inmune después de la unión de antígenos. Tales dominios de señalización citoplasmática pueden incluir, sin limitación, CD3-zeta. El dominio estimulativo intracelular también puede incluir uno o más dominios coestimuladores intracelulares que transmiten una señal proliferativa y/o de supervivencia celular después de la unión de ligandos. Tales dominios coestimuladores intracelulares pueden incluir, sin limitación, un dominio CD28, un dominio 4-1BB, un dominio OX40 o una combinación de los mismos. Un receptor de antígeno quimérico puede incluir además elementos estructurales adicionales, incluyendo un dominio transmembrana que se une al dominio de unión del ligando extracelular a través de una secuencia de bisagra o espaciador.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "receptor exógeno de células T" o "TCR exógeno" se refiere a un TCR cuya secuencia se introduce en el genoma de una célula efectora inmune (por ejemplo, una célula T humana) que puede o no expresar endógenamente el TCR. La expresión de un TCR exógeno en una célula efectora inmune puede conferir especificidad para un epítopo o antígeno específico (por ejemplo, un epítopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de la enfermedad). Tales receptores de células T exógenas pueden comprender cadenas alfa y beta o, alternativamente, pueden comprender cadenas gamma y delta. Los TCR exógenos útiles en la invención pueden tener especificidad en cualquier antígeno o epítopo de interés.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "expresión reducida" se refiere a cualquier reducción en la expresión del receptor endógeno de células T en la superficie celular de una célula modificada genéticamente en comparación con una célula de control. El término reducido también puede referirse a una reducción en el porcentaje de células en una población de células que expresan un polipéptido endógeno (es decir, un receptor endógeno de células T) en la superficie celular en comparación con una población de células de control. Dicha reducción puede ser de hasta 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o hasta 100%. En consecuencia, el término "reducido" abarca tanto una eliminación parcial como una eliminación completa del receptor endógeno de células T.
Como se utiliza en el presente documento con respecto a las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácido nucleico, las expresiones "identidad porcentual", "identidad de secuencia", "similitud porcentual", "similitud de secuencia" y similares se refieren a una medida del grado de similitud de dos secuencias basada en una alineación de las secuencias que maximiza la similitud entre restos de aminoácidos alineados o nucleótidos, y que es una función del número de restos o nucleótidos idénticos o similares, el número de restos o nucleótidos totales, y la presencia y longitud de huecos en la alineación de la secuencia. Una variedad de algoritmos y programas informáticos están disponibles para determinar la similitud de secuencia utilizando parámetros estándar. Tal como se utiliza en el presente documento, la similitud de secuencias se mide utilizando el programa BLASTp para secuencias de aminoácidos y el programa BLASTn para secuencias de ácido nucleico, ambos disponibles a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/), y se describen, por ejemplo, en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish and States (1993), Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266:131-141; (1997), Nucleic Acids Res. 25:33 89-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14. Tal como se utiliza en el presente documento, el porcentaje de similitud de dos secuencias de aminoácidos es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTp: tamaño de palabra 3; penalización de apertura de huecos=-11; penalización por la extensión del hueco=-1; y matriz de puntuación=BLOSUM62. Tal como se utiliza en el presente documento, el porcentaje de similitud de dos secuencias de ácido nucleico es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de palabra 11; penalización de apertura de huecos=-5; penalización por la extensión del hueco=-2; recompensa de apareamiento=1; y la penalización por desapareamiento=-3.
Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a las modificaciones de dos proteínas o secuencias de aminoácidos, la expresión "correspondiente a" se utiliza para indicar que una modificación especificada en la primera proteína es una sustitución del mismo resto de aminoácidos que en la modificación en la segunda proteína, y que la posición de aminoácidos de la modificación en las primeras proteínas corresponde o se alinea con la posición del aminoácido de la modificación en la segunda proteína cuando las dos proteínas están sujetas a alineaciones de secuencia estándar (por ejemplo, utilizando el programa BLASTp). Por lo tanto, la modificación del resto "X" al aminoácido "A" en la primera proteína corresponderá a la modificación del resto "Y" con respecto al aminoácido "A" en la segunda proteína si los restos X e Y se corresponden entre sí en una alineación de secuencia y, a pesar del hecho de que X e Y puedan ser números diferentes.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "semi-sitio de reconocimiento", "semi-sitio de secuencia de reconocimiento", o simplemente "semi-sitio" significa una secuencia de ácido nucleico en una molécula de ADN de doble cadena que es reconocida por un monómero de una meganucleasa homodimérica o heterodimérica, o por una subunidad de una meganucleasa de una sola cadena.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a una secuencia localizada dentro de un monómero o subunidad de meganucleasa que comprende aminoácidos con una variabilidad relativamente alta.
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "gen de la región constante del receptor alfa de células T" y "gen de la región constante de TCR alfa" se utilizan indistintamente y se refieren al gen humano identificado por NCBI Gen ID NO. 28755 (SEQ ID NO:1).
Las expresiones "construcción de ADN recombinante", "construcción recombinante", "casete de expresión", "construcción de expresión", "construcción quimérica", "construcción" y "fragmento de ADN recombinante" se utilizan indistintamente en este documento y son polinucleótidos mono o bicatenarios. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de polinucleótidos mono o bicatenarios, incluyendo, sin limitación, secuencias regulatorias y de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción de ADN recombinante puede comprender secuencias reglamentarias y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reglamentarias y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente y dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Dicha construcción puede ser utilizada por sí misma o puede utilizarse junto con un vector.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "vector" o "vector de ADN recombinante" puede ser una construcción que incluya un sistema de replicación y secuencias que sean capaces de la transcripción y la traducción de una secuencia de codificación de polipéptidos en una célula huésped determinada. Si se utiliza un vector, la elección del vector depende del método que se utilice para transformar las celdas huésped, como es bien conocido por los expertos en la técnica. Los vectores pueden incluir, sin limitación, vectores plásmidos y vectores AAV recombinantes, o cualquier otro vector conocido en esa técnica adecuado para entregar un gen que codifica una meganucleasa de la invención a una célula diana. El experto en la técnica es muy consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células huésped que comprenden cualquiera de los nucleótidos aislados o secuencias de ácido nucleico de la invención.
Como se utiliza en el presente documento, un "vector" también puede referirse a un vector viral. Los vectores virales pueden incluir, sin limitación, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales y vectores virales asociados adeno-asociados (AAV).
Tal como se utiliza en el presente documento, un ARNm "policistrónico" se refiere a un único ARN mensajero que comprende dos o más secuencias de codificación (es decir, cistrones) y codifica más de una proteína. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica para permitir la traducción de dos o más genes de la misma molécula de ARNm, incluyendo, entre otros, un elemento IREs , un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A.
Como se utiliza en el presente documento, una "célula T humana" o "célula T" se refiere a una célula T aislada de un donante humano. Las células T humanas, y las células derivadas de ellas, incluyen células T aisladas que no han sido pasadas al cultivo, células T que han sido pasadas y mantenidas bajo condiciones de cultivo celular sin inmortalización, y células T que han sido inmortalizadas y pueden ser mantenidas en condiciones de cultivo celular indefinidamente.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "control" o "célula de control" se refiere a una célula que proporciona un punto de referencia para medir los cambios en el genotipo o fenotipo de una célula modificada genéticamente. Una célula de control puede comprender, por ejemplo: a) una célula natural, es decir, del mismo genotipo que el material de partida para la modificación genética que dio lugar a la célula modificada genéticamente; (b) una célula del mismo genotipo que la célula modificada genéticamente pero que se haya transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tenga ningún efecto conocido sobre el rasgo de interés); o, c) una célula genéticamente idéntica a la célula modificada genéticamente pero que no esté expuesta a condiciones o estímulos o modificaciones genéticas adicionales que induzcan la expresión de genotipo o fenotipo modificados.
Tal como se utiliza en el presente documento, la recitación de un intervalo numérico para una variable está destinada a transmitir que la invención puede ser puesta en práctica con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que sea inherentemente discreta, la variable puede ser igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico, incluidos los puntos finales del intervalo. Del mismo modo, para una variable que sea inherentemente continua, la variable puede ser igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluidos los puntos finales del intervalo. Por ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe como que tiene valores entre 0 y 2 puede tomar los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreta, y puede tomar los valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, o cualesquiera otros valores reales >0 y >2, si la variable es inherentemente continua.
2.1 Principio de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las meganucleasas recombinantes pueden diseñarse para reconocer y escindir las secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro del gen humano de la región constante TCR alfa (SEQ ID NO:1), particularmente dentro de los restos 93-208. La escisión en tales secuencias de reconocimiento puede permitir al NHEJ en el sitio de escisión y la expresión modificada de la subunidad de cadena del receptor alfa de células T humanas, lo que conduce a una expresión y/o función reducida del receptor de células T en la superficie celular.
Además, la escisión en tales secuencias de reconocimiento puede permitir aún más la recombinación homóloga de secuencias de ácido nucleico exógeno directamente en el gen de la región constante TCR alfa. Tales secuencias de ácido nucleico exógeno pueden comprender una secuencia de interés, como, p. ej., una secuencia que codifica un receptor de antígeno quimérico, un receptor de TCR exógeno o cualquier otro polipéptido de interés. Por lo tanto, la presente invención permite tanto la eliminación del receptor endógeno de células T como la expresión de una secuencia de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico o TCR exógeno) que reconoce un único sitio de reconocimiento con una sola nucleasa modificada. Estas células pueden presentar o no una menor inducción o ninguna con respecto a la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH) cuando se administran a un sujeto alogénico.
2.2 Meganucleasas para reconocer y cortar secuencias de reconocimiento dentro del gen de la región alfa constante del receptor de células T
Se sabe en la técnica que es posible utilizar una nucleasa específica del sitio para provocar una ruptura del ADN en el genoma de una célula viva, y que tal rotura del ADN pueda resultar en una modificación permanente del genoma a través de la reparación mutagénica de NHEJ o a través de una recombinación homóloga con una secuencia de ADN transgénica. NHEJ puede producir mutagénesis en el sitio de escisión, lo que resulta en la inactivación del alelo. La mutagénesis asociada a NHEJ puede inactivar un alelo a través de la generación de codones de parada temprana, mutaciones marco que producen proteínas no funcionales aberrantes, o que podrían desencadenar mecanismos como la descomposición del ARNm sin sentido. El uso de meganucleasas para inducir mutagénesis a través de NHEJ se puede utilizar para reconocer a una mutación específica o una secuencia presente en un alelo natural. Se sabe que el uso de meganucleasas para inducir una rotura de doble cadena en un locus objetivo estimula la recombinación homóloga, en particular de secuencias de ADN transgénicas flanqueadas por secuencias que son homólogas para el objetivo genómico. De esta manera, las secuencias de ácido nucleico exógeno se pueden insertar en un locus objetivo. Tales ácidos nucleicos exógenos pueden codificar, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico, un TCR exógeno, o cualquier secuencia o polipéptido de interés.
En las realizaciones preferidas, las nucleasas utilizadas para poner en práctica la invención son meganucleasas de una sola cadena. Una meganucleasa de una sola cadena comprende una subunidad N-terminal y una subunidad C-terminal unida por un péptido enlazante. Cada uno de los dos dominios reconoce el resto de la secuencia de reconocimiento (es decir, un semi-sitio de reconocimiento) y el sitio de la escisión de ADN está en el medio de la secuencia de reconocimiento cerca de la interfaz de las dos subunidades. Las roturas de hebras de ADN se compensan con cuatro pares de bases, de modo que la escisión de ADN mediante una meganucleasa genera un par de cuatro pares de bases, salientes de una sola cadena de 3'.
Las meganucleasas recombinantes de la invención han sido diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3). Estas meganucleasas recombinantes se conocen colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 1-2". Se proporcionan meganucleasas ejemplares TRC 1-2 en las SEQ ID NO: 8-27.
Se han diseñado meganucleasas recombinantes adicionales para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4). Estas meganucleasas recombinantes se conocen colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 3-4". Se proporcionan meganucleasas ejemplares TRC 3-4 en las SEQ ID NO:28 y 29.
Se han diseñado meganucleasas recombinantes adicionales para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5). Estas meganucleasas recombinantes se conocen colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 7-8". Se proporcionan meganucleasas ejemplares TRC 7-8 en las SEQ ID NO:30-32.
Las meganucleasas recombinantes descritas en este documento comprenden una primera subunidad que comprende una primera región hipervariable (HVR1), y una segunda subunidad que comprende una segunda región hipervariable (HVR2). Además, la primera subunidad se une a un primer semi-sitio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (por ejemplo, el semi-sitio TRC1, TRC3 o TRC7), y la segunda subunidad se une a un segundo semisitio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (por ejemplo, el semi-sitio TRC2, TRC4 o TRC8). Cuando la meganucleasa recombinante es una meganucleasa de cadena única, la primera y la segunda subunidad pueden orientarse de tal forma que la primera subunidad, que comprende la región HVR1 y une el primer semi-sitio, se posicione como la subunidad N-terminal, y la segunda subunidad, que comprende la región HVR2 y une el segundo semi-sitio, se posiciona como la subunidad C-terminal. Alternativamente, la primera y la segunda subunidad pueden orientarse de tal manera que la primera subunidad, que comprende la región HVR1 y une el primer semi-sitio, se posicione como la subunidad C-terminal, y la segunda subunidad, que comprende la región HVR2 y enlaza el segundo semisitio, se posicione como la subunidad N-terminal. Las meganucleasas ejemplares de la invención de la TRC 1-2 se proporcionan en la Tabla 1. Las meganucleasas ejemplares de la TRC 3-4 se proporcionan en la Tabla 2. Las meganucleasas ejemplares de la TRC 7-8 se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 1. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3)
Figure imgf000019_0001
continuación
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Tabla 2. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4)
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Tabla 3. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5)
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2.3 Métodos para la producción de células modificadas genéticamente
La invención proporciona métodos para producir células modificadas genéticamente utilizando meganucleasas recombinantes que reconocen y cortan secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro del gen humano de la región constante TCR alfa (SEQ ID NO:1). El escisión de tales secuencias de reconocimiento puede dar lugar a NHEJ en el sitio de escisión y la expresión modificada de la subunidad de cadena del receptor alfa de células T humanas, lo que conduce a una expresión y/o función reducida del receptor de células T en la superficie celular. Además, la escisión en tales secuencias de reconocimiento puede permitir aún más la recombinación homóloga de secuencias de ácido nucleico exógeno directamente en el gen de la región constante TCR alfa.
Las meganucleasas recombinantes de la invención pueden ser entregadas en una célula en forma de proteína o, preferiblemente, como un ácido nucleico que codifica la meganucleasa recombinante. Dicho ácido nucleico puede ser ADN (por ejemplo, ADN de plásmido circular o linealizado o productos PCR) o ARN.
Para las realizaciones en las que la secuencia de codificación de meganucleasa recombinante se entrega en forma de ADN, debe unirse operativamente a un promotor para facilitar la transcripción del gen de la meganucleasa. Los promotores mamíferos adecuados para la invención incluyen promotores constitutivos como el promotor temprano del citomegalovirus (CMV) (Thomsen et al. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) o el promotor temprano SV40 (Benoist y Chambon (1981), Nature, 290(5804 ):304-10) así como promotores inducibles como el promotor inducible en tetraciclina (Dingermann et al. (1992), Mol Cell Biol. 12(9):4038-45).
En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la nucleasa modificada se entrega a la célula porque esto reduce la probabilidad de que el gen que codifica la nucleasa modificada se integre en el genoma de la célula. Dicho ARNm que codifica una nucleasa modificada se puede producir utilizando métodos conocidos en la técnica, como la transcripción in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm se termina con 7-metil-guanosina. En algunas realizaciones, el ARNm puede ser poliadenilado.
En realizaciones particulares, el ARNm que codifica una nucleasa modificada de la invención puede ser un ARNm policistrónico que codifica dos o más nucleasas que se expresan simultáneamente en la célula. Un ARNm policistrónico puede codificar dos o más nucleasas de la invención que se dirigen a diferentes secuencias de reconocimiento en el mismo gen objetivo. Alternativamente, un ARNm policistrónico puede codificar al menos una nucleasa descrita en el presente documento y al menos una nucleasa adicional dirigida a una secuencia de reconocimiento separada colocada en el mismo gen, o dirigida a una segunda secuencia de reconocimiento posicionada en un segundo gen de modo que los sitios de escisión se produzcan en ambos genes. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica para permitir la traducción de dos o más genes (es decir, cistrones) de la misma molécula de ARNm incluyendo, entre otros, un elemento IRES, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A, y un elemento F2A.
Las proteínas meganucleasas recombinantes purificadas se pueden entregar en las células para escindir el ADN genómico, lo que permite una recombinación homóloga o unión final no homóloga en el sitio de escisión con una secuencia de interés, por una variedad de mecanismos diferentes conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, las proteínas de meganucleasa recombinante, o las meganucleasas recombinantes de codificación de ADN/ARNm se acoplan a un péptido penetrante celular o ligando dirigido para facilitar la captación celular. Ejemplos de péptidos penetrantes celulares conocidos en la técnica incluyen poli-arginina (Jearawiriyapaisarn, et al. (2008) Mol Ther. 16:1624-9), péptido TAT del virus del VIH (Hudecz et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736), MPG (Simeoni, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2717-2724), Pep-1 (Deshayes et al. (2004) Biochemistry 43: 7698­ 7706), y HSV-1 VP-22 (Deshayes et al. (2005) Cell Mol Life Sci. 62:1839-49). En una realización alternativa, las meganucleasas recombinantes, o las meganucleasas recombinantes de codificación de ADN/ARNm se acoplan de forma covalente o no covalente a un anticuerpo que reconoce un receptor específico de la superficie celular expresado en las células diana de modo que la proteína de meganucleasa/ADN/ARNm se une y es internalizada por las células diana. Alternativamente, la proteína meganucleasa recombinante/ADN/ARNm se puede acoplar covalente o no covalentemente al ligando natural (o una porción del ligando natural) para dicho receptor de superficie celular. (McCall, et al. (2014) Tissue Barriers. 2(4):e944449; Dinda, et al. (2013) Curr Pharm Biotechnol. 14:1264-74; Kang, et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol. 15(3):220-30; Qian et al. (2014) Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10(11):1491-508).
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o las meganucleasas recombinantes de codificación de ADN/ARNm, se acoplan covalentemente o, preferiblemente, no covalentemente a una nanopartícula o se encapsulan dentro de una nanopartícula utilizando métodos conocidos en la técnica (Sharma, et al. (2014) Biomed Res Int. 2014). Una nanopartícula es un sistema de entrega a nanoescala cuya escala de longitud es <1 pm, preferiblemente <100 nm. Estas nanopartículas pueden diseñarse utilizando un núcleo compuesto de macromoléculas metálicas, lipídicas, polímeros o biológicas, y se pueden conectar o encapsular múltiples copias de las proteínas de meganucleasa recombinante, ARNm o ADN con el núcleo de las nanopartículas. Esto aumenta el número de copias de la proteína/ARNm/ADN que se entrega a cada célula y, por lo tanto, aumenta la expresión intracelular de cada meganucleasa recombinante para maximizar la probabilidad de que se corten las secuencias de reconocimiento objetivo. La superficie de dichas nanopartículas puede modificarse aún más con polímeros o lípidos (por ejemplo, quitosano, polímeros catiónicos o lípidos catiónicos) para formar una nanopartícula de capa central cuya superficie confiera funcionalidades adicionales para mejorar la entrega celular y la absorción de la carga útil (Jian et al. (2012) Biomateriales. 33(30): 7621-30). Además, las nanopartículas pueden acoplarse ventajosamente a moléculas dirigidas para dirigir la nanopartícula al tipo de célula adecuado y/o aumentar la probabilidad de absorción celular. Ejemplos de tales moléculas de reconocimiento incluyen anticuerpos específicos para los receptores de la superficie celular y los ligandos naturales (o porciones de los ligandos naturales) para los receptores de superficie celular.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas o ADN/ARNm que codifican las meganucleasas se encapsulan dentro de liposomas o se complejan utilizando lípidos catiónicos (ver, por ejemplo, Lipofectamine™, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA; Zuris et al. (2015) Nat Biotechnol. 33: 73-80; Mishra et al. (2011) J Drug Deliv. 2011:863734). Las formulaciones con liposomas y lipoplex pueden proteger la carga útil de la degradación, y facilitar la absorción celular y la eficiencia de la entrega a través de la fusión y / o modificación de las membranas celulares de las células.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o las meganucleasas recombinantes de codificación de ADN/ARNm, están encapsuladas en estructuras poliméricas (p. ej., PLGA) o complejados utilizando polímeros catiónicos (por ejemplo, PEI, Pl L) (Tamboli et al. (2011) Ther Deliv. 2(4): 523-536).
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o las meganucleasas recombinantes de codificación de ADN/ARNm, se combinan con moléculas anfifílicas que se autoensamblan en micelas (Tong et al. (2007) J Gene Med. 9(11): 956-66). Las micelas poliméricas pueden incluir una cáscara micelar formada con un polímero hidrófilo (por ejemplo, polietilenglicol) que puede prevenir la agregación, enmascarar las interacciones de carga y reducir las interacciones inespecíficas fuera de la célula.
En algunas realizaciones, las proteínas de meganucleasa recombinante, o los ADN/ARNm que codifican las meganucleasas recombinantes, se formulan en una emulsión o una nanoemulsión (es decir, con un diámetro medio de partícula de < 1nm) para su entrega a la célula. El término "emulsión" se refiere, sin limitación, a cualquier emulsión de aceite en agua, agua en aceite, dispersiones o gotas de aceite en agua en aceite, incluidas las estructuras lipídicas que pueden formarse como resultado de fuerzas hidrofóbicas que impulsan los restos apolares (por ejemplo, cadenas de hidrocarburos largos) lejos del agua y los grupos de cabeza polar hacia el agua, cuando se mezcla una fase inmiscible con una fase acuosa. Estas otras estructuras lipídicas incluyen, entre otras, fases unilamelares, paucilamelares, y vesículas de lípidos multilamelares, micelas, y lamelares. Las emulsiones se componen de una fase acuosa y una fase lipofílica (normalmente contiene un aceite y un disolvente orgánico). Las emulsiones también contienen con frecuencia uno o más tensioactivos. Las formulaciones de nanoemulsión son muy habituales, por ejemplo, como se describe en los números de solicitud de patente de los Estados Unidos 2002/0045667 y 2004/0043041, y las Pat. US 6.015.832, 6.506.803, 6.635.676 y 6.559.189.
En algunas realizaciones, las proteínas de meganucleasas recombinantes, o los ADN/ARNm que codifican las meganucleasas recombinantes, están unidas covalentemente o no a conjugados de polímeros multifuncionales, dendrímeros de ADN o dendrímeros poliméricos (Mastorakos et al. (2015) Nanoscale, 7(9): 3845-56; Cheng et al. (2008) J Pharm Sci. 97(1): 123-43). La generación de dendrímeros puede controlar la capacidad de carga útil y el tamaño, y puede proporcionar una alta capacidad de carga útil. Además, la visualización de varios grupos de superficies se puede aprovechar para mejorar la estabilidad y reducir las interacciones no específicas.
En algunas realizaciones, los genes que codifican una meganucleasa recombinante se introducen en una célula utilizando un vector viral. Tales vectores son conocidos en la técnica e incluyen vectores lentivirales, vectores adenovirales y vectores de virus adeno-asociados (AAV) (revisados en Vannucci, et al. (2013 New Microbiol. 36:1-22). Los vectores AAV recombinantes útiles en la invención pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción del gen de la meganucleasa en el genoma celular. En realizaciones particulares, los vectores AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores AAV recombinantes también pueden ser autocomplementarios de tal manera que no requieran la síntesis de ADN bicatenario en la célula huésped (McCarty, et al. (2001) Gene Ther. 8:1248-54).
Si los genes de la meganucleasa recombinante se entregan en forma de ADN (por ejemplo, un plásmido) y/o a través de un vector viral (por ejemplo, AAV), deben estar unidos operativamente a un promotor. En algunas realizaciones, puede ser un promotor viral como los promotores endógenos del vector viral (por ejemplo, el LTR de un vector lentiviral) o los conocidos promotores citomegalovirus o tempranos de virus SV40. En una realización preferida, los genes de las meganucleasas están estrechamente unidos a un promotor que impulsa la expresión génica preferentemente en la célula diana (por ejemplo, una célula T humana).
La invención prevé además la introducción de un ácido nucleico exógeno en la célula, de modo que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserte en el gen de la región constante alfa TRC en un sitio de escisión de la nucleasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno comprende un brazo homólogo de 5' y un brazo homólogo de 3' para promover la recombinación de la secuencia de ácido nucleico en el genoma celular en el sitio de escisión de la nucleasa.
Los ácidos nucleicos exógenos de la invención pueden introducirse en la célula por cualquiera de los medios discutidos anteriormente. En una realización particular, los ácidos nucleicos exógenos se introducen a través de un vector viral, como un lentivirus, retrovirus, adenovirus o, preferiblemente, un vector AAV recombinante. Los vectores AAV recombinantes útiles para introducir un ácido nucleico exógeno pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción de la secuencia de ácido nucleico exógeno en el genoma celular. En realizaciones particulares, los vectores AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores AAV recombinantes también pueden ser autocomplementarios de tal manera que no requieran ninguna síntesis de ADN bicatenario en la célula huésped.
En otra realización particular, un ácido nucleico exógeno se puede introducir en la célula utilizando una plantilla de ADN monocatenario. El ADN monocatenario puede comprender el ácido nucleico exógeno y, en realizaciones preferidas, puede comprender brazos homólogos de 5' y 3' para promover la inserción de la secuencia de ácido nucleico en el sitio de escisión de la nucleasa por recombinación homóloga. El ADN monocatenario puede comprender además una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5' AAV de 5' arriba del brazo de homología de 5', y una secuencia 3' AVV ITR de 3' abajo del brazo de homología de 3'.
En otra realización particular, los genes que codifican una meganucleasa recombinante de la invención y/o una secuencia de ácido nucleico exógeno de la invención pueden introducirse en la célula mediante la transfección con una plantilla de ADN linealizado. En algunos ejemplos, un ADN plasmídico que codifica una meganucleasa recombinante y/o una secuencia de ácido nucleico exógeno puede ser digerido por una o más enzimas de restricción, de modo que el ADN plasmídico circular se linealiza antes de la transfección en la célula.
Cuando se entrega a una célula, un ácido nucleico exógeno de la invención puede unirse operativamente a cualquier promotor adecuado para la expresión del polipéptido codificado en la célula, incluidos los promotores de mamíferos y promotores inducibles discutidos anteriormente. Un ácido nucleico exógeno de la invención también puede estar unido operativamente a un promotor sintético. Los promotores sintéticos pueden incluir, entre otros, el promotor JeT (documento WO 2002/012514).
En los ejemplos en los que las células modificadas genéticamente sean células T humanas, o células derivadas de las mismas, tales células pueden requerir la activación antes de la introducción de una meganucleasa y/o una secuencia de ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, las células T pueden ser puestas en contacto con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que sean solubles o estén conjugados con un soporte (es decir, cuentas) durante un período de tiempo suficiente para activar las células.
Las células modificadas genéticamente se pueden modificar aún más para expresar uno o más genes suicidas inducibles, cuya inducción provoca la muerte celular y permite la destrucción selectiva de las células in vitro o in vivo. En algunos ejemplos, un gen suicida puede codificar un polipéptido citotóxico, un polipéptido con la capacidad de convertir un pro-fármaco no tóxico en un fármaco citotóxico, y/o un polipéptido que active una vía genética citotóxica dentro de la célula. Es decir, un gen suicida es un ácido nucleico que codifica un producto que causa la muerte celular por sí mismo o en presencia de otros compuestos. Un ejemplo representativo de tal gen suicida es aquel que codifica la timidina quinasa del virus del herpes simple. Ejemplos adicionales son los genes que codifican la timidina quinasa del virus de la varicela zóster y el gen bacteriano de la citosina desaminasa que puede convertir 5-fluorocitosina en el compuesto altamente tóxico 5-fluorouracilo. Los genes suicidas también incluyen como genes no limitantes los genes que codifican la caspasa-9, la caspasa-8 o la citosina desaminasa. En algunos ejemplos, la caspasa-9 se puede activar utilizando un inductor químico específico de la dimerización (CID). Un gen suicida también puede codificar un polipéptido que se expresa en la superficie de la célula que hace que las células sean sensibles a anticuerpos monoclonales terapéuticos y/o citotóxicos. En otros ejemplos, un gen suicida puede codificar un polipéptido antigénico recombinante que comprenda un motivo antigénico reconocido por el mAb rituximab anti-CD20 y un epítopo que permita la selección de células que expresan el gen suicida. Véase, por ejemplo, el polipéptido RQR8 descrito en el documento WO2013153391, que comprende dos epítopos de unión de Rituximab y un epítopo de unión de QBEnd10. Para tal gen, el Rituximab se puede administrar a un sujeto para inducir el agotamiento celular cuando sea necesario.
2.4 Composiciones farmacéuticas
Se describe una composición farmacéutica que comprende una célula modificada genéticamente como se describe en el presente documento, o una población de células modificadas genéticamente como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacéutico. Tales composiciones farmacéuticas se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a ed. 2005). En la fabricación de una formulación farmacéutica, las células se mezclan típicamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable y la composición resultante se administra a un sujeto. El vehículo debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe ser perjudicial para el sujeto. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes adicionales útiles en el tratamiento de una enfermedad en el sujeto. Cuando la célula modificada genéticamente sea una célula T humana modificada genéticamente (o una célula derivada de ella), las composiciones farmacéuticas pueden incluir además moléculas biológicas, como las citoquinas (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21), que promueven la proliferación y el injerto celular in vivo. Las composiciones farmacéuticas que comprenden células modificadas genéticamente como se describe en el presente documento pueden administrarse en la misma composición que un agente adicional o molécula biológica o, alternativamente, pueden administrarse conjuntamente en composiciones separadas.
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden ser útiles para el tratamiento de cualquier estado de la enfermedad que pueda ser dirigido por la inmunoterapia adoptiva de células T. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer. Tales tipos de cáncer pueden incluir, sin limitación, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastemas, leucemia, cáncer de células B, cáncer de mama, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, sarcoma de rabdomio, leucemia y linfoma de Hodgkin. Los cánceres de origen celular B pueden incluir, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de células B y linfoma no Hodgkin de células B.
2.5 Métodos para la producción de vectores AAV recombinantes
En algunas realizaciones, la invención proporciona vectores AAV recombinantes para su uso en los métodos de la invención. Los vectores AAV recombinantes se producen típicamente en líneas celulares de mamíferos como HEK-293. Debido a que los genes cap y rep virales se eliminan del vector para evitar su autorreplicación para hacer espacio para que los genes terapéuticos se entreguen (por ejemplo, el gen de la endonucleasa), es necesario proporcionarlos in trans en la línea celular del envase. Además, es necesario proporcionar los componentes "ayudantes" (por ejemplo, adenovirales) necesarios para ayudar a la replicación (Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370­ 81). Con frecuencia, los vectores AAV recombinantes se producen utilizando una triple transfección en la que una línea celular se transfecta con un primer plásmido que codifica los componentes "ayudantes", un segundo plásmido que comprende los genes cap y rep, y un tercer plásmido que comprende ITR virales que contienen la secuencia de ADN que interviene a ser empaquetada en el virus. Las partículas virales que comprenden un genoma (ITR y genes intermedios de interés) encerrados en una cápside se aíslan entonces de las células mediante ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, con detergentes u otros medios conocidos en la técnica. Las partículas se purifican después mediante centrifugación con gradiente de densidades de cloruro de cesio o cromatografía de afinidad y, posteriormente, se entregan a los genes de interés para células, tejidos o un organismo como un paciente humano.
Debido a que las partículas AAV recombinantes se producen típicamente (son preparadas) en las células, se deben tomar precauciones en la práctica de la invención actual para asegurarse de que la endonucleasa específica del sitio NO se expresa en las células de empaquetado. Debido a que los genomas virales de la invención comprenden una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa, cualquier endonucleasa expresada en la línea celular de empaquetado será capaz de cortar el genoma viral antes de que pueda ser empaquetado en partículas virales. Esto redundará en una menor eficiencia del empaquetado y/o en el empaquetado de genomas fragmentados. Se pueden utilizar varios enfoques para evitar la expresión de endonucleasa en las células de empaquetado, incluyendo:
1. La endonucleasa se puede colocar bajo el control de un promotor específico de tejidos que no esté activo en las células de empaquetado. Por ejemplo, si se desarrolla un vector viral para la administración de un gen de endonucleasa o varios al tejido muscular, se puede utilizar un promotor específico del músculo. Ejemplos de promotores específicos del músculo incluyen C5-12 (Liu, et al. (2004) Hum Gene Ther. 15:783-92) el promotor de la creatina quinasa específica del músculo (MCK) (Yuasa, et al. (2002) Gene Ther. 9:1576-88), o el promotor del músculo liso 22 (SM22) (Haase, et al. (2013) BMC Biotechnol. 13:49-54). Ejemplos de promotores específicos del SNC (neurona) incluyen los promotores Ns E, Synapsin y MeCP2 (Lentz, et al. (2012) Neurobiol Dis. 48:179-88). Ejemplos de promotores específicos del hígado incluyen promotores de albúmina (como Palb), humano a1-antitripsina (como Pa1AT), y hemopexina (como Phpx) (Kramer, MG et al., (2003) Mol. Therapy 7:375-85). Ejemplos de promotores específicos de los ojos incluyen opsin, y promotores K12 específicos del epitelio corneal (Martin KRG, Klein RL, y Quigley HA (2002) Methods (28): 267-75) (Tong Y, et al., (2007) J Gene Med, 9:956-66). Estos promotores, u otros promotores específicos de tejidos conocidos en la técnica, no son altamente activos en las células HEK-293 y, por lo tanto, no se espera que produzcan niveles significativos de expresión génica de endonucleasa en células de empaquetado cuando se incorporen a los vectores virales de la presente invención. Del mismo modo, los vectores virales de la presente invención contemplan el uso de otras líneas celulares con el uso de promotores específicos de tejido incompatibles (es decir, la conocida línea celular HeLa (célula epitelial humana) y utilizando el promotor de hemopexina específico del hígado). Otros ejemplos de promotores específicos de tejidos incluyen: sarcomas sinoviales PDZD4 (cerebelo), C6 (hígado), ASB5 (músculo), PPP1R12B (corazón), SLC5A12 (riñón), regulación del colesterol APOM (hígado), ADPRHL1 (corazón), y síndromes de malformación monogénica Tp 73L (músculo). (Jacox E, et al., (2010) PLoS One v.5(8):e12274).
2. Alternativamente, el vector se puede empaquetar en células de una especie diferente en la que no sea probable que se exprese la endonucleasa. Por ejemplo, las partículas virales se pueden producir en células microbianas, de insectos o vegetales utilizando promotores de mamíferos, como los conocidos promotores de citomegalovirus o virus tempranos SV40, que no están activos en las células de empaquetado de no mamíferos. En una realización preferida, las partículas virales se producen en células de insectos utilizando el sistema de baculovirus descrito por Gao, et al. (Gao, H., et al. (2007) J. Biotechnol. 131(2):138-43). Es poco probable que se exprese una endonucleasa bajo el control de un promotor de mamíferos en estas células (Airenne, KJ, et al. (2013) Mol. Ther.
21(4):739-49). Además, las células de insectos utilizan diferentes motivos de empalme de ARNm que las células de mamíferos. Por lo tanto, es posible incorporar un intrón de mamífero, como el intrón de la hormona del crecimiento humano (HGH) o el intrón del antígeno T grande SV40, en la secuencia de codificación de una endonucleasa. Debido a que estos intrones no se empalman eficientemente a partir de las transcripciones previas al ARNm en células de insectos, las células de insectos no expresarán una endonucleasa funcional y empaquetarán el genoma de longitud completa. Por el contrario, las células de mamíferos a las que se suministran las partículas AAV recombinantes resultantes emplearán correctamente el pre-ARNm y expresarán la proteína endonucleasa funcional. Haifeng Chen ha mostrado del uso de los intrones antigénicos T grandes de HGH y SV40 para atenuar la expresión de las proteínas tóxicas barnase y el fragmento de toxina difteria A en las células de empaquetado de insectos, lo que permite la producción de vectores AAV recombinantes que transportan estos genes de toxinas (Chen, H (2012) Mol Ther Nucleic Acids. 1(11): e57).
3. El gen de la endonucleasa puede estar unido operativamente a un promotor inducible de tal manera que se requiera un inductor de moléculas pequeñas para la expresión de la endonucleasa. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el sistema Tet-On (Clontech; Chen H., et al., (2015) BMC Biotechnol. 15(1):4)) y el sistema RheoSwitch (Intrexon; Sowa G., et al., (2011) Spine, 36(10): E623-8). Ambos sistemas, así como sistemas similares conocidos en la técnica, se basan en factores de transcripción inducibles de ligandos (variantes del receptor Tet Represor y Ecdysone, respectivamente) que activan la transcripción en respuesta a un activador de moléculas pequeñas (Doxyciclina o Ecdysone, respectivamente). La práctica de la invención actual utilizando tales activadores de transcripción inducibles de ligandos incluye: 1) poner el gen de la endonucleasa bajo el control de un promotor que responda al factor de transcripción correspondiente, teniendo el gen de la endonucleasa (a) sitio(s) de unión para el factor de transcripción; y 2) incluyendo el gen que codifica el factor de transcripción en el genoma viral empaquetado. El último paso es necesario porque la endonucleasa no se expresará en las células o tejidos diana después de la administración recombinante del AAV si el activador de la transcripción no se proporciona también a las mismas células. El activador de la transcripción entonces induce la expresión génica de la endonucleasa solo en células o tejidos que se tratan con el activador de molécula pequeña cognado. Este enfoque es ventajoso porque permite regular la expresión génica de endonucleasa de manera espacio-temporal seleccionando cuándo y a qué tejidos se entregará el inductor de molécula pequeña. Sin embargo, el requisito de incluir al inductor en el genoma viral, que tiene una capacidad de carga significativamente limitada, crea un inconveniente para este enfoque.
4. En otra realización preferida, las partículas AAV recombinantes se producen en una línea celular de mamíferos que expresa un represor de la transcripción que impide la expresión de la endonucleasa. Los represores de la transcripción son conocidos en la técnica e incluyen el repressor Tet, el repressor Lac, el repressor Cro y el repressor Lambda. Muchos receptores de hormonas nucleares como el receptor de ecdisona también actúan como represores de la transcripción en ausencia de su ligando hormonal cognado. Para poner en práctica la invención actual, las células de empaquetado son transfectadas/transducidas con un vector que codifica un represor de la transcripción y el gen de la endonucleasa en el genoma viral (vector de empaquetado) se une operativamente a un promotor que se modifica para comprender sitios de unión para el represor de modo que el represor silencia al promotor. El gen que codifica el represor de la transcripción se puede colocar en una variedad de posiciones. Se puede codificar en un vector separado; puede incorporarse al vector de empaquetado fuera de las secuencias ITR; se puede incorporar al vector cap/rep o al vector auxiliar adenoviral; o, lo más preferible, puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula de empaquetado de forma que se exprese de forma constitutiva. Los métodos para modificar los promotores comunes de mamíferos para incorporar sitios represores de la transcripción son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Chang y Roninson modificaron los promotores fuertes y constitutivos de CMV y RSV para comprender a los operadores del represor Lac y mostraron que la expresión génica de los promotores modificados se atenuó en gran medida en las células que expresaban el represor (Chang BD, y Roninson IB (1996) Gene 183:137-42). El uso de un represor de la transcripción no humano garantiza que la transcripción del gen de la endonucleasa se reprimirá solo en las células de empaquetado que expresen el represor y no en las células o tejidos diana transducidos con el vector AAV recombinante resultante.
2.6 Variantes de meganucleasa recombinante
Las realizaciones de la invención abarcan las meganucleasas recombinantes descritas en este documento, y sus variantes. Otras realizaciones de la invención abarcan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica las meganucleasas recombinantes descritas en el presente documento, y variantes de dichos polinucleótidos.
Como se utiliza en el presente documento, las "variantes" pretenden significar secuencias sustancialmente similares. Un polipéptido "variante" está destinado a significar un polipéptido derivado del polipéptido "nativo" por eliminación o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa y / o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en el polipéptido nativo. Tal como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia parental de la que se derivan las variantes. Los polipéptidos variantes abarcados por las realizaciones son biológicamente activos. Es decir, siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa; es decir, la capacidad de reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3). Tales variantes pueden resultar, por ejemplo, de la manipulación humana. Variantes biológicamente activas de un polipéptido nativo de las realizaciones (por ejemplo, SEQ ID NO:8-27), o variantes biológicamente activas de las subunidades de unión del semi-sitio de reconocimiento descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NOs:33-82) tendrán al menos 85%, alrededor del 90%, alrededor del 91%, alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, o alrededor del 99% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido nativo o la subunidad nativa, según lo determinado por los programas de alineación de la secuencia y los parámetros descritos en otras partes del presente documento. Una variante biológicamente activa de un polipéptido o subunidad de las realizaciones puede diferir de ese polipéptido o subunidad por tan solo 1-40 restos de aminoácidos, tan pocos como 1-20, tan pocos como alrededor de 1-10, tan pocos como aproximadamente 5, tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 resto de aminoácidos.
Los polipéptidos de las realizaciones pueden ser modificados de varias maneras, incluyendo sustituciones de aminoácidos, eliminaciones, truncamientos e inserciones. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Pat. No. U.S. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en ella. Las orientaciones sobre las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed., Res. Found., Washington, D.C.). Las sustituciones conservadoras, como el intercambio de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.
Se ha identificado previamente un número sustancial de modificaciones de aminoácidos en el dominio de reconocimiento de a Dn de la meganucleasa i-CreI natural (por ejemplo, documento U.S. 8.021.867) que, por separado o en combinación, dan lugar a meganucleasas recombinantes con especificidades modificadas en las bases individuales dentro del semi-sitio de la secuencia de reconocimiento de ADN, de modo que las meganucleasas resultantes diseñadas racionalmente tienen especificidades de semi-sitio diferentes de la enzima natural. La Tabla 4 proporciona posibles sustituciones que se pueden realizar en un monómero o subunidad de meganucleasa recombinante para mejorar la especificidad en función de la base presente en cada posición de semi-sitio (-1 a -9) de un semi-sitio de reconocimiento.
Tabla 4.
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continuación
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En el caso de los polinucleótidos, la "variante" comprende una eliminación y/o adición de uno o más nucleótidos en
uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo. Cualquier experto en la técnica reconocerá que las variantes de los
ácidos nucleicos de las realizaciones se construirán de tal manera que se mantenga el marco de lectura abierto. Para
los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del
código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de las realizaciones. Los
polinucleótidos variantes incluyen polinucleótidos derivados sintéticamente, como los generados, por ejemplo,
mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifican una meganucleasa recombinante de las
realizaciones. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de las realizaciones tendrán al menos
alrededor del 40%, alrededor del 45%, alrededor del 50%, alrededor del 55%, alrededor del 60%, alrededor del alrededor del 70%, alrededor del 75%, alrededor del 80%, alrededor del 85%, alrededor del 90%, alrededor del alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del alrededor del 98%, alrededor del 99% o más de identidad de secuencia con ese polinucleótido en particular, según lo
determinado por los programas de alineación de secuencia y parámetros descritos en otra parte. Las variantes de un
polinucleótido particular de las realizaciones (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar
comparando la identidad de secuencia porcentual entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y
el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia.
No se espera que las deleciones, inserciones y sustituciones de las secuencias proteicas en este documento
contenidas produzcan cambios radicales en las características del polipéptido. Sin embargo, cuando es difícil predecir
el efecto exacto de la sustitución, eliminación o inserción antes de hacerlo, el experto en la materia apreciará que el
efecto será evaluado mediante la detección del polipéptido por su capacidad de preferentemente reconocer y separar
las secuencias de reconocimiento encontradas dentro del gen de la región constante del receptor alfa de células T
humanos (SEQ ID NO:1).
Ejemplos
Esta invención se ilustra además con los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes. Los
expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar, utilizando no más que la experimentación rutinaria,
numerosos equivalentes a las sustancias y procedimientos específicos descritos en este documento. Los ejemplos
que no están comprendidos en el ámbito de las reivindicaciones tienen únicamente fines ilustrativos.
Ejemplo 1
Caracterización de Meganucleasas que reconocen y escinden secuencias de reconocimiento TRC
1. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NOs:8-27), denominadas colectivamente en el presente documento como "Meganucleasas TRC 1-2", fueron diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3), que está presente en la región constante del receptor alfa de células T humanas. Cada meganucleasa recombinante TRC 1-2 comprende una señal de localización de nucleasas N-terminal derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 1-2 se une al semi-sitio de reconocimiento TRC1 de SEQ ID NO:3, mientras que una segunda subunidad se une al semi-sitio de reconocimiento TRC2 (véase la figura 1A).
Como se ilustra en las figuras 2 y 3, las subunidades de unión de TRC1 y las subunidades de unión de TRC2 comprenden cada una de ellas una región hipervariable de 56 pares de bases, denominadas HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión de TRC1 son idénticas fuera de la región HVR1, excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. Del mismo modo, las subunidades de unión de TRC2 también son idénticas fuera de la región de HVR2, excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y en la posición 139 de las meganucleasas TRC 1-2x.87 EE, TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ, TRC 1-2x.87 y TRC 1-2x.163, que comprenden un resto R (gris sombreado y subrayado). Al igual que la región HVR1, la región HVR2 también está muy conservada.
Las regiones de unión de TRC1 de las SEQ ID NO: 8-27 se ilustran en la Figura 2 y se proporcionan como las SEQ ID NO:33-52, respectivamente. Cada uno de las SEQ ID NO: 33-52 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en SEQ ID NO:33, que es la región de unión de TRC1 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:8). Las regiones de unión de TRC2 de las SEQ ID NO:8-27 se ilustran en la Figura 3 y se proporcionan como las SEQ ID NO:58-77, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO: 58-77 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en SEQ ID NO:58, que es la región de unión TRC2 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:8).
2. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 3-4
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NOs:28 y 29), denominadas colectivamente en el presente documento como "Meganucleasas TRC 3-4", fueron diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 3­ 4 (SEQ ID NO:4), que está presente en la región constante alfa del receptor alfa de células T humanas. Cada meganucleasa recombinante TRC 3-4 comprende una señal de localización de nucleasas N-terminal derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 3-4 se une al semi-sitio de reconocimiento TRC3 de SEQ ID NO:4, mientras que una segunda subunidad se une al semi-sitio de reconocimiento TRC4 (véase la figura 1A).
Como se ilustra en las figuras 4 y 5, las subunidades de unión TRC3 y las subunidades de unión TRC4 comprenden cada una de ellas una región hipervariable de 56 pares de bases, denominada HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión TRC3 son idénticas fuera de la región HVR1 excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. Del mismo modo, las subunidades de unión TRC4 también son idénticas fuera de la región HVR2, excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR2.
Las regiones de unión TRC3 de las SEQ ID NO:28 y 29 se ilustran en la Figura 4 y se proporcionan como las SEQ ID NOs:53 y 54, respectivamente. Las SEQ ID NO:53 y 54 comparten la identidad de secuencia del 96,6%. Las regiones de unión de TRC4 de las SEQ ID NO:28 y 29 se ilustran en la Figura 5 y se proporcionan como las SEQ ID NO:78 y 79, respectivamente. Las SEQ ID NO:78 y 79 también comparten la identidad de secuencia del 96,6%.
3. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 7-8
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NOs:30-32), denominadas colectivamente en el presente documento como "Meganucleasas TRC 7-8", fueron diseñadas para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 7­ 8 (SEQ ID NO:5), que está presente en la región constante del receptor alfa de células T humanas. Cada meganucleasa recombinante TRC 7-8 comprende una señal de localización de nucleasas N-terminales derivada de SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia enlazante y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 7-8 se une al semi-sitio de reconocimiento TRC7 de SEQ ID NO:5, mientras que una segunda subunidad se une al semi-sitio de reconocimiento TRC8 (véase la figura 1A).
Como se ilustra en las figuras 6 y 7, las subunidades de unión TRC7 y las subunidades de unión TRC8 comprenden cada una de ellas una región hipervariable de 56 pares de bases, denominada HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión TRC7 son idénticas fuera de la región HVR1 excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. Del mismo modo, las subunidades de unión TRC8 también son idénticas fuera de la región HVR2, excepto en la posición 80 o en la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR2.
Las regiones de unión TRC7 de las SEQ ID NO:30-32 se ilustran en la Figura 6 y se proporcionan como SEQ ID NO:55-57, respectivamente. Cada uno de los SEQ ID NO: 55-57 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% con SEQ ID NO:55, que es la región de unión de TRC7 de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:30). Las regiones de unión TRC8 de las SEQ ID NO:30-32 se ilustran en la Figura 7 y se proporcionan como las SEQ ID NO:80-82, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO: 80-82 comparten al menos una identidad de secuencia del 90% en Se Q ID NO:80, que es la región de unión TRC8 de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:30).
4. Escisión de secuencias de reconocim iento de la región constante del receptor alfa de células T humanas en un ensayo indicador de células CHO
Para determinar si las meganucleasas TRC 1-2, TRC 3-4 y TRC 7-8 podían reconocer y escindir sus respectivas secuencias de reconocimiento (las SEQ ID NO:3, 4 y 5, respectivamente), cada meganucleasa recombinante fue evaluada utilizando el ensayo indicador de células CHO descrito anteriormente (véase el documento WO/2012/167192 y la Figura 8). Para realizar los ensayos, se produjeron líneas indicadoras de células CHO que llevaban un casete de expresión génica de proteína fluorescente verde (GFP) no funcional integrado en el genoma de las células. El gen GFP en cada línea celular fue interrumpido por un par de secuencias de reconocimiento de tal manera que la escisión intracelular de cualquiera de las secuencias de reconocimiento por una meganucleasa estimularía un evento de recombinación homóloga que resultaría en un gen GFP funcional.
En las líneas celulares indicadoras CHO desarrolladas para este estudio, una secuencia de reconocimiento insertada en el gen GFP fue la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3), la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4) o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5). La segunda secuencia de reconocimiento insertada en el gen GFP fue una secuencia de reconocimiento CHO-23/24, que es reconocida y dividida por una meganucleasa de control llamada "CHO-23/24". Las células indicadoras CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y la secuencia de reconocimiento CHO-23/24 se conocen en este documento como "células TRC 1-2". Las células indicadoras CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 y la secuencia de reconocimiento CHO-23/24 se conocen en este documento como "células TRC 3-4". Las células indicadoras CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 y la secuencia de reconocimiento CHO-23/24 se conocen en este documento como "células TRC 7-8".
Las células indicadoras CHO fueron transfectadas con ADN plasmídico que codificaba sus correspondientes meganucleasas recombinantes (por ejemplo, las células TRC 1-2 fueron infectadas con ADN plasmídico que codificaba meganucleasas TRC 1-2) o que codificaba la meganucleasina CHO-23/34. En cada ensayo, 4e5 células indicadoras CHO fueron transfectadas con 50 ng de ADN plasmídico en una placa de 96 pocillos usando Lipofectamine 2000 (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas posteriores a la transfección, las células fueron evaluadas por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas con GFP en comparación con un control negativo no transfectado (TRC 1-2bs). Como se muestra en la Figura 9, se encontró que todas las meganucleasas TRC 1-2, TRC 3-4 y TRC 7-8 producían células GFP positivas en líneas celulares que comprendían su secuencia de reconocimiento correspondiente con frecuencias que superaban significativamente el control negativo.
La eficacia de las meganucleasas TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ y TRC 1-2x.87 EE también se determinó de manera dependiente del tiempo. En este estudio, las células TRC 1-2 (1e6) fueron sometidas a electroporación con 1e6 copias de ARNm de meganucleasa por célula utilizando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A los 1, 4, 6, 8 y 12 días después de la transfección, las células fueron evaluadas por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células GFP positivas. Como se muestra en la Figura 10, cada meganucleasa Tr C 1-2 exhibía una alta eficiencia a los 2 días posteriores a la transfección, con más del 50% de células positivas de GFP observadas. Este efecto persistió durante el período de 12 días, sin que hubiera ninguna evidencia de toxicidad celular observada.
5. Conclusiones
Estos estudios demostraron que las meganucleasas TRC 1-2, las meganucleasas TRC 3-4 y las meganucleasas TRC 7-8 abarcadas por la invención pueden reconocer y escindir eficientemente sus respectivas secuencias de reconocimiento en las células.
Ejemplo 2
Escisión de secuencias de reconocimiento TRC en células T y supresión de la expresión del receptor de células T de la superficie celular
1. Escisión de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células Jurkat
Este estudio demostró que las meganucleasas TRC 1-2 englobadas por la invención podrían escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células Jurkat (una línea celular de linfocitos T humanos inmortalizada). 1e6 células Jurkat fueron sometidas a electroporación con 8e6 copias de un ARNm de meganucleasa TRC 1-2 dado por célula utilizando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 72 horas posteriores a la transfección, se extrajo el ADN genómico (ADNg) de las células y se realizó un ensayo de endonucleasa I (T7E) T7 para estimar la modificación genética en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2 (Figura 11). En el ensayo T7E, el locus TRC 1-2 es amplificado por PCR usando cebadores que flanqueaban la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Si hubiera indels (inserciones aleatorias o eliminaciones) dentro del locus TRC 1-2, el producto PCR resultante consistiría en una mezcla de alelos naturales y alelos mutantes. El producto PCR se desnaturaliza y se permite recocer lentamente. El recocido lento permite la formación de heterodúples que consisten en alelos naturales y mutantes, lo que da como resultado bases y/o protuberancias no coincidentes. La enzima T7E1 se corta en sitios de discordancia, lo que resulta en productos de escisión que pueden ser visualizados por electroforesis de gel. La Figura 11 demuestra claramente que trece versiones diferentes de las meganucleasas del TRC 1-2 generaron resultados positivos en el ensayo T7E1, lo que indica la generación efectiva de indels en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2.
Para examinar más a fondo las propiedades de escisión de las meganucleasas TRC 1-2, se realizó un experimento dosis-respuesta en células de Jurkat. 1e6 células de Jurkat fueron sometidas a electroporación con 3 |jg o 1 |jg de un ARNm de meganucleasas TRC 1-2 determinado por célula utilizando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 96 horas después de la transfección, se extrajo el ADNg y se realizó el ensayo T7E1 como se describió anteriormente. Como se ve en la Figura 12, quince meganucleasas diferentes de TRC 1-2 mostraron una escisión en el sitio de reconocimiento endógeno TRC 1-2, incluyendo tres versiones diferentes de la meganucleasa TRC 1-2x.87. TRC 1-2x.87 EE funcionó especialmente bien, generando una señal fuerte en el ensayo T7E1 con poca o ninguna toxicidad en las células de Jurkat.
2. Escisión de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas
Este estudio demostró que las meganucleasas TRC 1-2 englobadas por la invención podían escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células T humanas obtenidas de un donante. Las células T CD3+ fueron estimuladas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego fueron sometidas a electroporación con ARNm que codificaba la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE utilizando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A los 3 días y 7 días después de la transfección, se extrajo el ADNg y se realizó el ensayo T7E1 como se describe anteriormente. La Figura 13A demuestra que TRC 1-2x.87 EE introdujo de forma efectiva mutaciones en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2 en células T humanas, lo que indica que la meganucleasa reconocía y escindía la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. La intensidad de los productos de escisión no parece cambiar entre el día 3 y el día 7 después de la transfección, lo que sugiere poca o ninguna toxicidad debido a la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE. Para determinar si las mutaciones en la secuencia de reconocimiento endógena TRC 1-2 eran suficientes para eliminar la expresión superficial del receptor de células T, las células fueron analizadas por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD3. La Figura 13B muestra que aproximadamente un 50% de células T transfectadas teñidas negativamente para CD3, lo que indica la eliminación del receptor de células T. La población negativa de CD3 no cambió significativamente entre el día 3 y el día 7 después de la transfección, lo que indica además poca o ninguna toxicidad asociada con la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE, o la pérdida de la expresión del receptor de células T.
Para verificar que la pérdida de la expresión CD3 se debía a mutaciones en el sitio de reconocimiento de TRC 1-2, el ADNg se extrajo de las células T transfectadas y el locus del sitio de reconocimiento TRC 1-2 fue amplificado por PCR. Los productos PCR se clonaron en el vector pCR-romo utilizando el kit de clonación Zero Blunt PCR (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron colonias individuales y se secuenciaron plásmidos mini­ preparados. La Figura 14 muestra secuencias de varias eliminaciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Las secuencias observadas son típicas de las deleciones resultantes de la reparación de unión final no homóloga de roturas de la doble cadena del ADN generadas por endonucleasas.
Además de TRC 1-2x.87 EE, otras meganucleasas TRC 1-2 fueron capaces de eliminar el receptor de células T en células T humanas, incluyendo TRC 1-2x.55, y TRC 1-2x.72, aunque en menor medida que la eliminación observada previamente para TRC 1-2x.87 EE (Tablas 5 y 6). TRC 1-2x.72 Q47E lleva una mutación en el sitio activo de la meganucleasa (aminoácido 47) y sirve como un control negativo.
Tabla 5.
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Tabla 6.
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3. Conclusiones
Estos estudios demostraron que las meganucleasas TRC 1-2 englobadas por la invención pueden reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 tanto en células Jurkat (una línea celular de linfocitos T inmortalizada) como en células T obtenidas de un donante humano. Además, estos estudios demostraron que NHEJ se produce en el sitio de la escisión de la meganucleasa, como lo demuestra la aparición de indels. Además, se demostró que las meganucleasas TRC 1-2 reducen la expresión de la superficie celular del receptor de células T en las células T humanas obtenidas de un donante.
Ejemplo 3
Vectores AAV recombinantes para introducir ácidos nucleicos exógenos en células T humanas
1. Vectores AAV recombinantes
En el presente estudio, dos vectores AAV recombinantes (denominados AAV405 y AAV406) fueron diseñados para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena, que comprende un sitio de restricción EagI, en el genoma de las células T humanas en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 a través de una recombinación homóloga. Cada vector AAV recombinante se preparó utilizando un protocolo de transfección triple, en el que una línea celular se transfectó con un primer plásmido que codifica componentes "ayudantes" (por ejemplo, adenovirales) necesarios para apoyar la replicación, un segundo plásmido que comprende los genes cap y rep, y un tercer plásmido que comprende las repeticiones terminales invertidas virales (ITR) que contiene la secuencia de ADN que interviene que se va a empaquetar en el virus (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico exógeno) (ver Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370-81). La Figura 15 ilustra el enfoque general para utilizar vectores AAV recombinantes para introducir una secuencia de ácido nucleico exógeno en el genoma celular en el sitio de escisión de nucleasa.
AAV405 se preparó utilizando el plásmido ilustrado en la Figura 16 (SEQ ID NO:107). Como se muestra, el plásmido AAV405 generalmente comprende secuencias para un ITR de 5', una secuencia potenciadora y promotora de CMV, un brazo de homología 5', una secuencia de ácido nucleico que comprende el sitio de restricción EagI, una secuencia de señal de poli(A) SV40, un brazo de homología de 3' y un ITR de 3'. AAV406 se preparó utilizando el plásmido ilustrado en la Figura 17 (SEQ ID NO:108). Como se muestra, el plásmido AAV406 comprende secuencias similares a las de AAV405, pero carece del potenciador y promotor del CMV en sentido ascendente del brazo de homología de 5'. Los actuales estudios de AAV incluyeron además el uso de un vector AAV que codificaba GFP (GFP-AAV), que se incorporó como un control positivo para la eficiencia de la transducción de AAV.
2. Introducción de secuencias de ácido nucleico exógenas en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Para probar si las plantillas AAV serían adecuadas para la reparación dirigida por homología (HDR) después de la generación de una rotura de la doble cadena con meganucleasas TRC 1-2, se realizaron una serie de experimentos utilizando células T humanas. En el primer experimento, se determinó el momento de la electroporación con el ARN TRC 1-2 y la transducción con vectores AAV recombinantes. Las células T CD3+ humanas fueron estimuladas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego fueron sometidas a electroporación con ARNm codificando la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 |jg) utilizando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 2, 4 u 8 horas después de la transfección, las células fueron transducidas con GFP-AAV (1e5 genomas virales por célula). Las células fueron analizadas por citometría de flujo para la expresión de GFP a las 72 horas después de la transducción. Como se muestra en la Figura 18, se observó la mayor eficiencia de transducción cuando las células fueron transducidas a las 2 horas después de la transfección (88% de células positivas de GFP). La eficiencia de transducción disminuyó significativamente a medida que aumentaba el tiempo entre la transfección y la transducción, con un 78% de células positivas en GFP a las 4 horas y un 65% de células positivas en GFP a las 8 horas.
Después de haber determinado que la transducción viral eficiente se producía cuando las células eran transducidas 2 horas después de la transfección, los vectores AAV405 y AAV406 se utilizaron como plantillas HDR en células T humanas. Las células T CD3+ fueron estimuladas y transfectadas con 1 jg de ARNm de TRC 1-2x.87 EE como se describió anteriormente. A las 2 horas posteriores a la transfección, las células fueron transducidas con AAV405 o AAV406 (1e5 genomas virales por célula). Como únicos controles de la transducción, las células se simulaban transfectadas (con agua) y se transducían con AAV405 o AAV406 (1e5 genomas virales por célula). Para un control solo de meganucleasa, las células fueron transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y luego se simulaban transducidas (con agua) a las 2 horas después de la transfección.
Para determinar si los vectores AAV servían como plantillas HDR, el ADNg fue recuperado de las células y el locus TRC 1-2 fue amplificado por PCR usando cebadores que reconocían secuencias más allá de la región de homología en los vectores AAV. Los cebadores PCR fuera de las regiones de homología solo permitían la amplificación del genoma de las células T, no de los vectores AAV. Los productos de la PCR fueron purificados y digeridos con EagI. La Figura 19 muestra la escisión de los productos PCR amplificados a partir de células que fueron transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y transducidas con cualquier vector AAV (ver flechas), lo que indica la inserción del sitio EagI en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos PCR de todas las poblaciones de células de control no son divididos por EagI, lo que demuestra que la inserción del sitio EagI requiere la creación de una rotura de doble cadena de ADN por una meganucleasa TRC 1-2.
Para definir aún más la inserción del sitio EagI en las células T humanas, se examinaron productos individuales del producto PCR a granel. El producto PCR no digerido generado a partir del experimento anterior fue clonado en el vector pCR-romo usando el kit de clonación Zero Blunt PCR (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR de colonia se realizó utilizando cebadores M13 directos e inversos (pCR romo contiene sitios de cebado de M13 directos e inversos que flanquean el inserto) y una porción de productos de la PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV405 o AAV406 fueron analizados por gel electroforesis (Figuras 20A y 21A, respectivamente). En ambos casos, hubo una mezcla de productos de la PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 bp), insertos más pequeños y algunos plásmidos vacíos (aproximadamente 300 bp). En este ensayo, las bandas más pequeñas que la longitud completa pero más grandes que los plásmidos vacíos son a menudo secuencias que contienen eliminaciones grandes dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Paralelamente, otra porción de productos de la PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contiene el sitio de reconocimiento EagI insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Las figuras 20B y 21B muestran que varios productos de la PCR fueron divididos con EagI (por ejemplo, figura 20B, segunda fila, 6 carriles desde la izquierda), generando los fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 bp. Estos geles permiten que la estimación de la inserción EagI sea aproximadamente 25% y 6% para AAV405 y AAV406, respectivamente (ajustado para vectores vacíos).
Para confirmar las observaciones de la electroforesis en gel de los productos de PCR sin cortar y digerir con EagI, la parte restante de cada producto de la PCR fue secuenciada. La Figura 22A muestra secuencias de varias eliminaciones e inserciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Estas secuencias son típicas de secuencias resultantes de la reparación no homóloga de unión final de roturas de doble cadena de ADN generadas por endonucleasas. Todos los productos de la PCR que fueron escindidos con EagI contenían un sitio EagI insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (Figura 22B).
3. Eficiencia mejorada de la transducción de AAV
A la luz de la observación de que la transducción de AAV era más eficiente cuando se llevaba a cabo 2 horas después de la transfección que cuando se llevaba a cabo más tarde, se realizó un experimento para optimizar el tiempo de transfección y transducción. Las células T CD3+ humanas fueron estimuladas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego fueron sometidas a electroporación con la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 |jg) utilizando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inmediatamente después de la transfección o 2 horas después de la transfección, las células fueron transducidas con GFP-AAV (1e5 genomas virales por célula). Además, las células no estimuladas fueron transducidas con GFP-AAV (1e5 genomas virales por célula). A las 72 horas después de la transducción, las células fueron analizadas por citometría de flujo para determinar la expresión de GFP. La Figura 23 muestra que la transducción GFP-AAV realizada 2 horas después de la transfección dio lugar a células 90% positivas de GFP, pero esa transducción inmediatamente después de la transfección dio lugar a un 98% de células positivas de GFP. Las células T en reposo aparecieron refractivas a la transducción de AAV, con aproximadamente 0% de células positivas de GFP. Las células no transducidas también mostraron aproximadamente 0% de células positivas en GFP.
4. Resumen
Estos estudios demuestran que los vectores AAV se pueden utilizar junto con meganucleasas recombinantes para incorporar una secuencia de ácido nucleico exógena en un sitio de escisión en la región constante TCR alfa a través de una recombinación homóloga.
Ejemplo 4
Vectores AAV recombinantes para introducir ácidos nucleicos exógenos que codifican un receptor de antígeno quimérico en células T humanas
1. Vectores AAV recombinantes
En el presente estudio, dos vectores AAV recombinantes (denominados AAV-CAR100 y AAV-CAR763) fueron diseñados para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena, codificando un receptor de antígeno quimérico, en el genoma de las células T humanas en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 a través de recombinación homóloga. Cada vector AAV recombinante se preparó utilizando el protocolo de triple de transfección descrito anteriormente.
AAV-CAR100 (también conocido como AAV408) se preparó utilizando el plásmido ilustrado en la Figura 24 (SEQ ID NO:109). Como se muestra, el AAV-CAR100 (AAV408) está diseñado para producir un vector AAV autocomplementario, y generalmente comprende secuencias para un ITR de 5', un brazo homólogo de 5', una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico anti-CD19, una secuencia de señal SV40 poli(A), un brazo de homología de 3' y un ITR de 3'. AAV-CAR763 (también conocido como AAV412) se preparó utilizando el plásmido ilustrado en la Figura 25 (SEQ ID NO:110). Como se muestra, el plásmido Aa V-Ca R763 (AAV412) generalmente comprende las mismas secuencias que AAV-CAR100 (AAV408), pero está diseñado para producir un vector AAV monocatenario. Debido a que un vector AAV monocatenario puede acomodar una carga útil más grande, el brazo de homología de 5' y el brazo de homología de 3' son más largos en AAV-CAR763 (AAV412) que en AAV-CAR100 (AAV408). Los presentes estudios de AAV incluirán además el uso de un vector de AAV que codifica GFP (GFP-AAV), que se incorporará como control positivo para la eficiencia de la transducción de AAV.
2. Introducción de una secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Se llevarán a cabo estudios para determinar la eficiencia del uso de vectores AAV recombinantes para insertar una secuencia de receptores de antígeno quimérico en el gen de la región constante TCR alfa mientras, simultáneamente, se elimina la expresión en la superficie celular del receptor TCR endógeno.
Para confirmar la eficiencia de la transducción, las células T CD3+ humanas se obtendrán y estimularán con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego serán sometidas a electroporación con ARNm codificando la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 |jg) utilizando el nucleador Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células serán transducidas con GFP-AAV (1e5 genomas virales por célula) inmediatamente después de la transfección como se describió anteriormente. Las células serán analizadas por citometría de flujo para determinar la expresión de GFP a las 72 horas después de la transducción para determinar la eficiencia de la transducción.
Los vectores AAV-CAR100 (AAV408) y AAV-CAR763 (AAV412) se utilizarán como plantillas HDR en células T humanas para la inserción de la secuencia del receptor de antígeno quimérico antiCD19. Las células T CD3+ humanas serán estimuladas y transfectadas con 1 jg de ARNm TRC 1-2x.87 EE como se ha descrito anteriormente. Las células serán transducidas con AAV-CAR100 (AAV408) o AAV-CAR763 (AAV412) (1e5 genomas virales por célula) inmediatamente después de la transfección o con entre 0 y 8 horas de transfección. Como controles de transducción solamente, las células serán simuladas ser transfectadas (con agua) y transducidas con AAV-CAR100 (AAV408) o AAV-CAR763 (AAV412) (1e5 genomas virales por célula). Para un control solo de meganucleasa, las células serán transfectadas con ARNm codificando TRC 1-2x.87 EE y luego serán simuladas ser transducidas (con agua) inmediatamente después de la transfección.
La inserción de la secuencia del receptor del antígeno quimérico se confirmará mediante la secuenciación del sitio de escisión en el gen de la región constante TCR alfa. La expresión de la superficie celular del receptor de antígeno quimérico se confirmará mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-Fab o anti-CD19. La eliminación del receptor endógeno de células T en la superficie celular se determinará mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.
Ejemplo 5
Inserción y expresión del receptor de antígeno quimérico
1. Inserción de la secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
En el presente estudio, se probó si AAV podía proporcionar plantillas HDR que se pudieran utilizar para insertar una secuencia de receptores de antígenos quiméricos en el gen de la región constante TCR alfa y, simultáneamente, eliminar la expresión de la superficie celular del receptor TCR endógeno. En el primer experimento, las células T CD3+ humanas (1e6 células) fueron estimuladas y electroporadas con ARNm que codificaba la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (2 jg ) como se describió anteriormente, luego se transdujeron inmediatamente con AAV412 (1e5 genomas virales/células). Como controles, las células fueron simuladas ser sometidas a electroporación, luego fueron transducidas con AAV412 o electroporadas con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE, y luego se simuló que fueron transducidas. Se incluyó un control adicional de células transducidas simuladas electroporadas.
Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si la plantilla AAV HDR se utilizaba para reparar roturas de la doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Se utilizaron tres conjuntos de pares de imprimación para el análisis de la PCR. El primer conjunto fue diseñado para amplificar una región con los brazos homólogos de AAV412. Dado que este primer conjunto de imprimación (denominado "dentro de los brazos homólogos/región CAR" en el Cuadro 7) se encuentra dentro de la región de homología, amplificará el locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado del genoma (349 bp), la entrada vectorial AAV412 (2603 bp), o la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en la que se ha insertado el gen CAR (2603 bp). El segundo conjunto de imprimación (denominado "Fuera del brazo de homología de 5'" en la Tabla 7) incluye una imprimación que se recuece dentro de la región CAR de la plantilla AAV412 HDR, una imprimación que se ha recocido en el genoma humano, fuera del brazo homológico de 5' de la plantilla AAV412 HDR y que amplificará un fragmento de 1872 bp solo si el gen CAR se inserta con éxito en la secuencia TRC 1-2. El tercer conjunto de imprimación (denominado "Fuera del brazo de homología de 3'" en la Tabla 7) incluye una imprimación que se recuece dentro de la región CAR de la plantilla AAV412 HDR, y un cebador que es recocido en el genoma humano, fuera del brazo de homología 3' de la plantilla AAV412 HDR. De forma similar al segundo conjunto de imprimación, el tercer conjunto de imprimación amplificará un fragmento de 1107 bp solo si el gen CAR se inserta con éxito en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. En conjunto, los productos PCR de los tres conjuntos de imprimación indicarán si la secuencia CAR está presente en las células (conjunto de imprimación 1) y si se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (conjuntos de imprimación 2 y 3).
En el día 4 las células posteriores a la transducción se analizaron utilizando los pares de imprimación PCR descritos anteriormente. En resumen, se recuperaron, peletizaron y lisaron 3000 células y se realizó la PCR para determinar si el gen CAR se insertaba en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa, que se muestra en la Figura 26 (las descripciones de los carriles se pueden encontrar en la Tabla 7). Los carriles 1-3 son productos PCR de la muestra que fue electroporada con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y simulada transducida.
Como era de esperar, el primer par de imprimación ("Dentro de brazos homólogos/región CAR") amplificó el locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado, generando una banda de 349 bp que se muestra en el carril 1. Los carriles 2 y 3 corresponden a pares de imprimación que solo generan un producto si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y no muestran productos. Los carriles 7-9 representan muestras que fueron simuladas ser electroporadas y simuladas ser transducidas y se muestran las mismas bandas que el control ARNm TRC 1-2x.87EE descrito anteriormente. Los carriles 4-6 muestran productos de la PCR de la muestra que fue electroporada con ARNm de TRC 1-2x.87EE y transducidos con AAV412. El carril 4 muestra dos bandas generadas por el primer par de imprimación ("Dentro de los brazos homólogos/región CAR"), que indicaba la amplificación del locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado del genoma (349 bp) y la entrada del vector AAV412 (2603 bp) o la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en la que se ha insertado el gen CAR (2603 bp). Los carriles 5 y 6 muestran productos generados por los pares de imprimación que solo amplifican los productos si la secuencia de ácido nucleico CAR se ha insertado en el sitio de reconocimiento TRC 1-2x.87EE. Ambas bandas son del tamaño pronosticado (1872 y 1107 bp, respectivamente). Los carriles 10-12 representan la muestra que se simuló electroporada y transducida con AAV412. El carril 10 muestra dos bandas generadas por el primer par de imprimación ("Dentro de los brazos homólogos/región CAR"), que indican la amplificación del locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado del genoma (349 bp) y la entrada del vector AAV412 (2603 bp). Los carriles 11 y 12 corresponden a pares de imprimación que solo generan un producto si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y no muestran productos. La ausencia de bandas en los carriles 11 y 12 (que incluyen cebadores fuera del brazo de homología) indica que la banda de 2603 bp en el carril 10 se generó a partir de la amplificación de la entrada AAV412.
En conjunto, el análisis de la PCR muestra claramente que los genes CAR se introducen en el sitio de reconocimiento TRC 1-2x.87EE cuando ambos el ARNm de TRC 1-2x.87EE y AAV412 están presentes en las células. Por lo tanto, la conclusión es que AAV412 sirve para producir plantillas HDR adecuadas que se pueden utilizar para insertar un gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE.
En un segundo experimento, las células T CD3+ humanas fueron estimuladas y sometidas a electroporación con ARNm codificando la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE como se describió anteriormente, luego ser transducido inmediatamente con cantidades crecientes de AAV408 (0 pl, 3,125 pl, 6,25 pl, 12,5 pl o 25 pl, lo que corresponde aproximadamente a 0, 3,125e3, 6,250e3, 1,25e4 y 2,5e4 genomas virales/célula). Como controles, las células fueron sometidas a electroporación simuladas, luego transducidas con cantidades crecientes de AAV408. Otros controles incluyeron células que simulaban ser sometidas a electroporación y simuladas ser transducidas, así como células que fueron sometidas a electroporación con ARNm TRC 1-2x.87EE y luego se simulaban ser transducidas. El día 4 después de la transducción, las células fueron recuperadas y analizadas como se describió anteriormente, pero solo utilizando los pares de imprimación que amplificaron un producto solo si el gen CAR se había insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de la PCR se resolvieron con geles de agarosa, que se muestran en la Figura 27. La Figura 27A muestra los productos PCR generados utilizando el par de imprimación descrito anteriormente ("Fuera de brazo de homología 5'") que solo amplifica un producto en el extremo 5' del locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se había insertado en ese locus. La Figura 27B muestra los productos PCR generados utilizando el par de imprimación descrito anteriormente ("Fuera del brazo de homología 3'") que solo amplifica un producto en el extremo 3' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se había insertado en ese locus. Las descripciones de los carriles se pueden encontrar en la Tabla 8. Los carriles 1-5 de las figuras 27A y 27B representan las muestras que simularon ser electroporadas o sometidas a electroporación simuladas y luego simuladas transducidas. Ningún producto PCR es visible en células sometidas a electroporación simuladas, lo que indica que las plantillas HDR producidas por AAV408 no pueden insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE. El carril 6 representa la muestra que fue electroporada con ARNm TRC 1-2x.87EE y simulada transducida. No hay productos de la PCR visibles, lo que indica que el gen CAR no se había insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los carriles 7-10 representan muestras sometidas a electroporación con ARNm TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV408. Las bandas de tamaño adecuado para cada PCR son evidentes, lo que indica que AAV408 puede producir donantes HDR para la reparación de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, lo que da como resultado la inserción del gen CAR.
Tabla 7.
Figure imgf000034_0001
continuación
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Tabla 8.
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Los ensayos basados en la PCR descritos anteriormente son útiles para determinar si el gen CAR se había insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, pero no proporcionan información sobre la eficiencia. Para determinar la eficiencia de la inserción de CAR, se desarrolló un ensayo digital basado en la PCR (esquema que se muestra en la Figura 28A). En este ensayo, se utilizan dos conjuntos de imprimación. El primer conjunto amplifica una secuencia genética irrelevante y sirve una secuencia de referencia para controlar el número de plantilla. El segundo conjunto consiste en una imprimación que es recocida dentro del gen CAR y un cebador que es recocido fuera del brazo de homología de 3', de modo que un producto solo se amplifica si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Una sonda marcada con VIC se hibrida dentro del amplicón generado a partir del primer conjunto de imprimación y la sonda marcada es recocida dentro del amplicon generado por el segundo conjunto de cebadores. Al dividir el número de amplicones detectados por la sonda marcada por FAM con el número de amplicones de secuencia de referencia detectados por la sonda marcada con VIC es posible cuantificar con precisión el porcentaje de loci de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 que fueron modificados por la inserción del gen CAR.
La Figura 28B muestra los resultados del ensayo digital de PCR para muestras que fueron simuladas ser sometidas a electroporación y luego transducidas, sometidas a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE, luego simuladas ser transducidas, o sometidas a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV408. La PCR digital se realizó utilizando ADN genómico aislado de células aproximadamente 1 semana después de la transducción. De conformidad con las observaciones de la PCR descritas en la Figura 27, se encontró que ambas muestras de control (solo transducción o solo electroporación) tenían un gen CAR al 0% insertado en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2x.87EE. Se encontró que las muestras sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV408 tenían entre aproximadamente 1,5% y 7%. El ensayo se realizó en dos instrumentos diferentes (QX200 y QS3D marcados) y mostraron un acuerdo notable, demostrando la sensibilidad y precisión de este ensayo digital basado en PCR.
2. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 en las células T
Además de determinar si la inserción de CAR se producía a nivel molecular, se buscó determinar el nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 utilizando AAV408 como plantilla HDR. Además, se examinó la eficiencia en la que la inserción de CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE daba lugar a la eliminación del receptor de células T. Las muestras descritas anteriormente y analizadas en las figuras 27 y 28 también se analizaron para determinar la expresión de CAR y CD3 por citometría de flujo. Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células fueron marcadas con anticuerpos que reconocían el CAR anti-CD19 (anti-Fab-Alexa647) o CD3 (CD3-BB515) y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 29A muestra las gráficas de citometría de flujo, con el marcado anti-CAR mostrado en el eje Y y el marcado anti-CD3 que se muestra en el eje X. Las células que fueron simuladas ser sometidas a electroporación y simuladas transducidas (MOI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,7%). Las células que fueron sometidas a electroporación simuladas luego transducidas con cantidades crecientes de AAV408 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con poblaciones CD3+/CAR' de 98,8%, 99, 99% y 99,1%. Por lo tanto, se llega a la conclusión de que el virus AAV408 por sí solo no estaba impulsando niveles detectables de la expresión CAR, ni era capaz de bloquear la expresión del receptor de células T.
La Figura 29B muestra las gráficas de citometría de flujo para muestras sometidas a electroporación con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego simuladas transducidas o células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV408. Las células sometidas a electroporación entonces simuladas muestran 47,1% de células C D 3', lo que indica una eliminación eficiente del complejo receptor de células T. El marcado de fondo con el CAR anti-CD19 fue muy bajo, con 0,6% en la población de CD3' y 0,78% en la población de CD3+. Las muestras sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE que luego fueron transducidas con cantidades crecientes de AAV408 mostraron un marcado de CAR en la población de CD3' , que oscilaba entre 2,09% y 5,9%. También hubo un ligero aumento en el marcado de CAR en la población de CD3+, que iba desde 1,08% a 1,91%. No se determinó la causa del aumento de las células CAR+ en la población CD3+, aunque es posible que CAR se insertó en el alelo receptor de células T no expresado (solo un alelo de la cadena del receptor alfa de células T se expresa e incorpora en el complejo del receptor de células T).
Estos datos se correlacionan bien con el ensayo digital cuantitativo basado en PCR descrito anteriormente. Por ejemplo, en el MOI más alto de AAV408 (2,5e4 genomas/células virales), el ensayo digital de PCR mostraba aproximadamente un 6% de inserción de CAR, y el ensayo de citometría de flujo mostraba un 5,9% de células CAR+/CD3'. Si se tiene en cuenta que la población CAR+/CD3+, los datos siguen siendo bastante comparables, con el ensayo de citometría de flujo que muestra aproximadamente un 7,8% de CAR+ en comparación con un 6% por PCR digital.
Ejemplo 6
Caracterización de otros vectores AAV
1. Inserción de una secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Habiendo demostrado que los vectores AAV podían proporcionar plantillas HDR adecuadas para insertar genes CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE, se buscó optimizar la configuración del vector AAV. Se generó un vector que podía utilizarse para producir genomas AAV autocomplementarios que incluían el casete de expresión génica CAR impulsado por un promotor JeT, flanqueado por regiones cortas de homología al locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y a los ITR AAV. Este vector se conoce como AAV421 (Figura 30; SEQ ID NO:123). Los brazos de homología cortos eran necesarios debido a la limitada capacidad de empaquetado de AAV autocomplementario. Además, se generó un vector que podía utilizarse para producir genomas AAV monocatenario que incluían el casete de expresión génica CAR impulsado por un promotor de CMV, flanqueado por largos brazos de homología y ITR AAV. Este vector se conoce como AAV422 (Figura 31; SEQ ID NO:124). Dado que los genomas AAV monocatenario tienen una mayor capacidad de carga, se pudo utilizar brazos de homología más largos que en el vector autocomplementario.
Para probar si AAV421 y AAV422 eran útiles para reconocer a la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, se llevaron a cabo varios experimentos similares a los descritos anteriormente en células CD3+ T humanas. En un primer experimento, las células CD3+ T humanas (1e6 células) fueron sometidas a electroporación simuladas y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV421 o 422, o sometidas a electroporación con ARNm TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV421 o AAV422. Los MOI AAV422 fueron significativamente más altos que AAV421 en este experimento que en los experimentos descritos anteriormente (los MOI aproximados fueron 1,25e4, 2,5e4, 5e4 y 1e5 genomas virales/célula) porque los experimentos anteriores con AAV408 sugirieron que los MOI más altos darían lugar a una inserción más eficiente de CAR. El stock de virus AAV421 no se concentró lo suficiente como para permitir títulos significativamente más altos que en los experimentos descritos anteriormente. Como controles, las células fueron sometidas a electroporación (simulada o con ARNm de TRC 1-2x.87EE) y luego se simularon transducidas. Como componente adicional a este experimento, se realizó una condición a "gran escala", en la que 10e6 células (10 veces más que un experimento típico) fueron sometidas a electroporación con el ARNm TRC 1-2x.87EE y entonces fueron transducidos con AAV422 (2,5e4 genomas virales/células). Por último, también se probó un segundo stock de virus de AAV421 para compararlo con el stock de los virus primarios.
La inserción de CAR fue determinada por PCR como se describe anteriormente, utilizando pares de imprimación que solo amplificaban los productos si el gen CAR se insertaba en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE. La PCR se resolvió mediante gel de agarosa y se muestra en las figuras 32A y 32B (las descripciones de los carriles se pueden encontrar en las Tablas 9 y 10). La muestra 1 de la Figura 32A sometió a electroporación y luego se transdujo de forma simulada, y las muestras 2-5 se simularon ser sometidas a electroporación y luego se transdujeron con AAV421. El gel muestra que ninguna de estas muestras generó productos de la PCR, lo que indica que AAV421, en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE, no puede impulsar la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Además, la muestra de control que se sometió a electroporación con el ARNm TRC 1-2x.87EE y se luego se indujo su transducción (muestra 6), no mostró ningún producto de la PCR. Las muestras 7-10 de la Figura 32A sometieron a electroporación con el ARNm de TRC 1-2x.87EE, luego fueron transducidas con cantidades crecientes de AAV421. El gel muestra bandas de PCR para productos que se extienden más allá del brazo de homología de 5' y 3' (las dos bandas debajo de cada número de muestra), lo que demuestra la integración del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Por último, en la Figura 32A, los carriles 11 y 12 representan muestras sometidas a electroporación con ARNm TRC 1-2x.87EE que luego fueron transducidas con AAV422, ya sea a partir de 1e6 o de 10e6 células/muestra, respectivamente. La presencia de ambas bandas PCR (más grande en el primer conjunto, porque se utilizó una imprimación diferente para dar cuenta de un brazo de homología más largo) indicó la inserción exitosa del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
La muestra 1 en la Figura 32B fue simulada electroporada y luego transducida por simulación, y las muestras 2-5 fueron simuladas ser sometidas a electroporación y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV422 (Tabla 10). El gel muestra que ninguna de estas muestras generó productos de la PCR, lo que indica que AAV422, en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE, no podía impulsar la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 7-10 de la Figura 32B se sometieron a electroporación con el ARNm de TRC 1-2x.87EE, luego fueron transducidas con cantidades crecientes de AAV422. El gel muestra bandas de PCR para productos que se extienden más allá del brazo de homología de 5' y 3', demostrando la integración del gen c A r en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Por último, la muestra 11 representa la muestra que se sometió a electroporación con el ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujo con un AAV421 de un stock de virus diferente al de las muestras mostradas en la Figura 32A. La presencia de bandas indica la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y confirma la reproducibilidad entre diferentes poblaciones de virus. En conjunto, la Figura 32 demuestra claramente que tanto AAV421 como AAV422 son capaces de generar plantillas HDR adecuadas para insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Tabla 9.
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Tabla 10.
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2. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 en células T usando AAV421
En este documento, se buscó determinar el nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento t Rc 1-2 usando AAV421. Las muestras descritas anteriormente y analizadas en las figuras 32A también se analizaron para determinar la expresión de CAR y CD3 por citometría de flujo. Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células fueron marcadas con anticuerpos que reconocían el CAR anti-CD19 o CD3 y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 33A muestra las gráficas de citometría de flujo para células que simularon ser sometidas a electroporación y transducidas con AAV421, junto con células de control que se simulaban estar sometidas a electroporación y transducidas. Las células que fueron simuladas estar sometidas a electroporación y simuladas transducidas (MOI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,8%). Las células que fueron sometidas a electroporación simuladas y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV421 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con las poblaciones CD3+/CAR' al 98,8%, 98,6%, 98,8% y 97,9%. Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que el virus AAV421 por sí solo no estaba impulsando niveles detectables de la expresión de CAR, ni era capaz de bloquear la expresión del receptor de células T.
La Figura 33B muestra las gráficas de citometría de flujo para muestras sometidas a electroporación con el ARNm TRC 1-2x.87EE y luego simuladas transducidas o las células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV421. Las células sometidas a electroporación y luego simuladas transducidas muestran 56,7% de células CD3', lo que indica una eliminación eficiente del complejo receptor de células T. El marcado de fondo con el CAR anti-CD19 fue muy bajo, con 0,48% en la población de CD3' y 0,36% en la población de CD3+. Las muestras sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE luego fueron transducidas con cantidades crecientes de AAV412 y mostraron cantidades significativas de CAR marcado en la población de CD3' que oscilaban entre 4,99% y 13,4%. También hubo un ligero aumento en el marcado de CAR la población de CD3+, que iba desde 1,27% a 3,95%. Como se mencionó anteriormente, es posible que el gen CAR fuera insertado en el alelo receptor de células T no expresado. También, en contraste con los experimentos con AAV408, la población CAR+ estaba mucho mejor definida, con una mayor intensidad media de fluorescencia, lo que sugiere que el promotor JeT impulsaba una expresión más alta que el promotor del núcleo eF1a.
Al evaluar la inserción del gen CAR utilizando AAV421 en combinación con TRC 1-x.87EE, se buscó determinar un método que permitiera expandir y enriquecer preferentemente la población de CD3VCAR+. Del experimento descrito anteriormente y mostrado en la Figura 33, se utilizaron células sometidas a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y luego fueron transducidas con AAV421 (3,13e4 genomas virales/células). Las muestras de control fueron simuladas ser sometidas a electroporación y simuladas transducidas, simuladas sometidas a electroporación y transducidas con AAV421, o sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas tomadas del experimento descrito anteriormente y mostrado en la Figura 33. Como un proceso de enriquecimiento y expansión de control, estas células fueron incubadas durante 6 días en medio de crecimiento completo complementado con IL-7 e IL-15 (ambos a 10 ng/ml). Las células fueron marcadas con anticuerpos contra el anti-CD19 c A r y CD3 y analizadas por citometría de flujo (Figura 34A). Las células que fueron simuladas ser sometidas a electroporación y transducidas simuladas mostraron bajos niveles de tinción de fondo en el cuadrante CD3VCAR+ (0,13%). La población CD3VCAR+ fue esencialmente la misma en muestras que fueron simuladas ser sometidas a electroporación y luego transducidas con AAV o sometidas a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego simuladas transducidas (0,16% y 0,55%, respectivamente). Las células sometidas a electroporación con ARNm TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas tenían una población CD3YCAR' del 53,2%, muy cerca de la cantidad teñida en la primera parte de este experimento que se muestra en la Figura 33B (56,7%). Las células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y transducidas con AAV mostraron 12,6% de células CD3YCAR+, casi idénticas al marcado original de estas células que se muestra en la Figura 33 (13,4%), demostrando que la mezcla de IL-7 e IL-15 es insuficiente para enriquecer o ampliar la población específica de células CD3VCAR+.
A continuación se buscó enriquecer la población CD3VCAR+ de una manera específica del antígeno incubando las 4 muestras descritas anteriormente con células IM-9, que presentan CD19 en la superficie celular. Las células IM-9 fueron inactivadas por pretratamiento con mitomicina C e incubadas con muestras en una proporción de 1:1 durante 6 días en presencia de IL-7 e IL-15 (10 ng/ml). Las células fueron marcadas después con anticuerpos contra CD3 y CAR anti-CD19 y analizadas por citometría de flujo (Figura 34B). Las células que fueron simuladas ser sometidas a electroporación y simuladas transducidas mostraron bajos niveles de tinción de fondo en el cuadrante CD3YCAR+ (0,2%). La población CD3YCAR+ era la misma en las muestras que simulaban estar sometidas a electroporación y luego ser transducidas con AAV (0,2%) y ligeramente más alta en las células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas (1,24%). El aumento en células CD3YCAR+, el control TRC 1-2x.87EE solo, se considera la línea de fondo ya que nunca se introdujo ningún ácido nucleico CAR en el sistema. Las células sometidas a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas tenían una población de CD3YCAR' de 42,5%, que es significativamente menor que antes de la expansión (56,7%, Figura 33) lo que sugiere que las células CD+ pueden tener una ventaja de crecimiento en este sistema. Sin embargo, las células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y transducidas con AAV mostraron un 49,9% de células CD3YCAR+, un aumento drástico en comparación con el marcado original de estas células que se muestra en la Figura 33 (13,4%), lo que demuestra que la incubación de esta muestra con células IM-9 en presencia de IL-7 e IL-15 es bastante eficaz para enriquecer y expandir la población CD3YCAR+. La población CD3+/CAR+ también se amplió en estas condiciones, con la muestra ficticia electroporada/AAV transducida y la muestra electroporada/AV transducida TRC 1-2x.87EE mostrando un 2,53% y 15,3% de CD3+/CAR+, respectivamente.
En las células que fueron sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con AAV421, el 24,2% de la población CD3' eran CAR+ antes de la expansión (Figura 33B). Después de la incubación en medio complementado con IL-7 e IL-15, el 25,3% de las células CD3' fueron CAR+ (Figura 34A), lo que indica que la relación entre el gen knock-in y el gen-knockout no había cambiado. Sin embargo, después de la incubación con células IM-9 además de IL-7 e IL-15, más del 80% (80,35%, Figura 34B) de las células CD3' fueron CAR+, lo que demuestra que la incubación con células IM-9 daba lugar a un enriquecimiento específico de antígenos.
Dado que las células inactivas de mitomicina C, muy potentemente, y las células IM-9 no persistían mucho tiempo en el cultivo mixto, se pensó que una segunda perfusión de células IM-9 podría aumentar aún más el enriquecimiento de las células CD3YCAR+. Algunas de las células descritas anteriormente y mostradas en la Figura 34B se mezclaron con células nuevas IM-9 (pretratadas con mitomicina C) en un medio con IL-7 e IL-15 y se incubaron otros 6 días. Las células se tiñeron para detectar CD3 y anti-CD19 CAR y se analizaron por citometría de flujo (Figura 34C). El porcentaje de células CD3YCAR+ en cualquiera de las muestras de control se modificaron esencialmente en comparación con la primera ronda de enriquecimiento en células IM-9.
Sin embargo, las células que fueron sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y transducidas con AAV421 mostraron un enriquecimiento significativo de la población CD3YCAR+, aumentando de 49,9% (después de la primera ronda si había incubación con células IM-9, Figura 34B) a 65,7% (Figura 34C). Es importante destacar que el 93,75% de la población de CD3 era CAR+, lo que indica una mayor expansión específica del antígeno.
3. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD19 en las células T usando AAV422
También se examinó la expresión del CAR anti-CD19 de las células en las cuales AAV422 se utilizaba para proporcionar la plantilla HDR (descrita arriba, los resultados de la PCR se muestran en la Figura 32B). Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células fueron marcadas con anticuerpos que reconocían el anti-CD19 CAR o CD3 y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 35A muestra las gráficas de citometría de flujo para células que fueron sometidas a electroporación y transducidas simuladas con cantidades crecientes de AAV422, junto con células de control que fueron sometidas a electroporación simuladas y transducidas. Las células que fueron simuladas sometidas a electroporación y simuladas transducidas (MOI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,8%). Las células que fueron sometidas a electroporación simuladas y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV422 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con las poblaciones CD3+/CAR' en un 98,6%, 98,6%, 98,9% y 98,4%. Por lo tanto, el vector AAV422 por sí solo no estaba impulsando niveles detectables de la expresión de CAR, ni era capaz de bloquear la expresión del receptor de células T.
La Figura 35B muestra las gráficas de citometría de flujo para muestras sometidas a electroporación con el ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego simuladas transducidas o células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV422. Las células sometidas a electroporación y luego simuladas transducidas mostraron un 59,3% de células CD3', lo que indica una eliminación eficiente del complejo receptor de células T. El marcado de fondo con anti-CD19 CAR fue muy bajo, con un 1,47% en la población c D3‘ y 0,52% en la población CD3+. Las muestras sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV422 mostraron cantidades significativas del marcado de CAR en la población CD3- que oscilaban entre el 14,7% y el 20,3%. También hubo un ligero aumento en el marcado de CAR en la población CD3+, que oscilaba entre el 2,3% y el 2,7%.
Sorprendentemente, se observó un aumento notable en la eficiencia de eliminación del receptor de células T en presencia de AAV422. La eficiencia global de eliminación de CD3 con el aumento de AAV422 fue del 71,6%, 74,9%, 77,8% y 74,4% en comparación con el 59,3% solo en la electroporación TRC 1-2x.87EE. Por el contrario, la eficiencia global de eliminación de CD3 con el aumento de AAV421 fue del 56,99%, 56,62%, 57,4% y 55,4% en comparación con el 57,18% en la electroporación TRC 1-2x.87EE sola (Figura 33B). Por lo tanto, parece que la electroporación con TRC 1-2x.87EE en presencia de genomas AAV monocatenario, pero no genomas AAV autocomplementarios, daba lugar a un aumento de la eficiencia global de eliminación de las nucleasas del TRC 1-2x.87EE. Debido a este aumento, el porcentaje de células CD3- que eran CAR+ no era significativamente diferente entre las células transducidas con AAV421 y AAV422 a pesar de los números más altos de células CD3VCAR+. El porcentaje más alto de células CD3-que fueron CAR+ usando AAV421 fue del 24,18% (MOI = 3,13e4 genomas virales/célula) en comparación con 26,48% con AAV422 (MOI = 1e5 genomas virales/célula). Esta observación es particularmente interesante teniendo en cuenta la gran diferencia en MOI entre AAV421 y AAV422.
El concepto de utilizar células IM-9 para enriquecer específicamente las células CD3VCAR+ se probó utilizando células de este experimento. Una vez más, en lugar de probar todo el panel, solo se intentó el enriquecimiento de o bien las células simuladas sometidas a electroporación y luego transducidas con AAV422 o bien las sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con AAV422 (2.5e4 genomas virales/célula) en un nuevo experimento. La Figura 36A muestra las gráficas de citometría de flujo aproximadamente en el día 4 después de la transducción. Las células sometidas a electroporación/transducidas simuladas mostraron una tinción de fondo de células CD3VCAR+ al 0,13%. En comparación, las células sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE transducidas con AAV422 mostraron un 4,44% de células CD3VCAR+. Las células fueron incubadas con células IM-9 (pretratadas con mitomicina) en presencia de IL-7 e IL-15 durante 6 días como se describió anteriormente, luego fueron analizadas por citometría de flujo. La Figura 36B muestra que la incubación con células IM-9 aumentaba drásticamente la población de CD3YCAR+ en células transducidas con a Av 422 al 35,8%. Las células CAR+ conforman el 45,2% del total de la población CD3', en comparación con un 6,69% antes del enriquecimiento (Figura 36A). Como se mencionó anteriormente, también se enriqueció con una segunda adición de células IM-9 (Figura 36C). Dos rondas de incubación con células IM-9 dieron como resultado un 65,1% de células CD3VCAR+. Las células CAR+ conforman el 78,25% del total de la población CD3', lo que indica un enriquecimiento significativo, dependiente del antígeno de las células CD3' /CAR+.
Estos datos, junto con los datos presentados anteriormente, demuestran claramente que las células que han tenido un gen anti-CD19 CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 pueden enriquecerse con éxito mediante la incubación con células IM-9 en presencia de IL-7 e IL-15, y pueden dar lugar a una población de CD3' que es superior al 90% de CAR+ en tan solo 12 días de cultivo.
4. Aumento de la eficiencia de eliminación observada cuando se utilizaban vectores AAV de una sola hebra
En el presente estudio, se realizó un seguimiento de la observación de que los vectores AAV monocatenarios aumentaban la eficiencia de eliminación de la nucleasa TRC 1-2x.87EE. En un primer experimento, las células fueron sometidas a electroporación con TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y también fueron simuladas ser transducidas o transducidas con cantidades crecientes de AAV412 (6,25e4, 1,25e4, 2,5e4 o 5e4 genomas virales/células). En el día 4 posterior a la transducción, las células fueron marcadas con un anticuerpo contra CD3 y analizadas por citometría de flujo (Figura 37A). En las células transducidas simuladas, el 20,7% son CD3' en comparación con 21,6%, 23,7%, 25,5% y 25% con aumento de AAV412, lo que indica que la eficiencia de eliminación de TRC 1-2x.87EE es hasta un 23% mayor en presencia de AAV412 (25,5% frente a 20,7%).
Para determinar si este aumento en la eficiencia de eliminación era específico de la nucleasa, en un experimento adicional, las células fueron sometidas a electroporación con ARNm (2 jg ) codificando una nucleasa dirigida al gen de la p2-microglobulina y simulada transducida o transducida con cantidades crecientes de AAV412. Las células se tiñeron para detectar la p2-microglobulina el día 4 después de la transducción y se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 37B). En las células transducidas simuladas, la eficiencia de eliminación de la p2-microglobulina fue del 64,5% y aumentó en las células transducidas al 68,6%, 70,7%, 77,2% y 82,5%, con cantidades crecientes de AAV412, lo que demuestra un aumento de la eficiencia eliminatoria de hasta el 27,9% (82,5% frente al 64,5%).
En un experimento paralelo, las células fueron sometidas a electroporación con el ARNm TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas o transducidas con AAV422 (usando los mismos MOI que AAV412). Las células fueron marcadas con un anticuerpo contra CD3 y fueron analizadas por citometría de flujo (Figura 37C). Las células transducidas simuladas mostraron un 62,2% de eliminación del receptor de células T, y con cantidades crecientes de AAV, la frecuencia de eliminación del receptor de células T aumentaba a 72,6%, 75,5%, 78,3% y 75,1%. En este documento, la presencia de AAV422 aumentaba la eficiencia de eliminación de TRC 1-2x.87EE hasta en un 25,8% (78,3% frente al 62,2%). Es sorprendente que el aumento en la eficiencia de eliminación porcentual fuera casi idéntico entre estos tres experimentos, utilizando dos nucleasas diferentes y dos vectores AAV diferentes. En conjunto, estos datos indican firmemente que la transducción de células con vectores AAV de una sola hebra aumentaba la eficiencia de eliminación de las nucleasas de los inventores, independientemente de la carga de nucleasa o AAV.
5. Actividad de las células T que expresan el receptor de antígeno quimérico anti-CD19
Los experimentos anteriores demuestran claramente la generación de células T CAR mediante el sometimiento a la electroporación de células con MRNA TRC 1-2x.87EE, luego transduciendo inmediatamente las células con AAV421, y que estas células se puedan enriquecer para una población CD3VCAR+ mediante un cultivo conjunto con CD19 que expresa células IM-9. A continuación se examinó la actividad de estas células T CAR frente a las células diana. En el primer experimento, las células descritas anteriormente y mostradas en la Figura 34C se utilizaron en un ensayo ELISPOT de IFN-gamma, en el que las células CD19+ Raji o las células CD19- U937 eran la población objetivo. Como se muestra en la Figura 38A, cuando las células T de CAR anti-CD19 eran incubadas con células U937, éstas no secretaban IFN-gamma independientemente de la relación diana:efector. La incubación de células T CAR con células Raji, sin embargo, daba lugar a altos niveles de secreción de IFN-gamma, de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que la secreción de IFN-gamma era específica del antígeno.
Estas células T CAR también se utilizaron en un ensayo de eliminación de células en el que las células Raji marcadas con luciferasa eran el objetivo. Brevemente, fueron incubadas células T CAR con células Raji marcadas con luciferasa en una proporción de 10:1. En varios momentos, las células fueron lavadas y lisadas para medir la actividad de luciferasa como una medida de cuántas células permanecían. Las células de control mostraron una actividad de luciferasa superior a 5500 unidades arbitrarias (Figura 38B). La incubación conjunta durante 2, 3, 4 y 5 horas dio lugar a una disminución de la actividad de luciferasa de 4598, 3292, 2750 y 1932 unidades arbitrarias, respectivamente. Por lo tanto, a las 5 horas de la incubación conjunta, la actividad de la luciferasa se reducía aproximadamente un 65%, lo que indica una fuerte actividad citolítica de las células T CAR.
En conjunto, estos datos demuestran que las células T anti-CD19 CAR generadas de acuerdo con los métodos descritos en este documento son eficaces para eliminar células CD19+.
Ejemplo 7
ADN de plásmido linealizado
1. Expresión del receptor de antígeno quimérico del ADN del plásmido linealizado
Dado que las plantillas HDR, producidas por AAV, son moléculas de ADN lineales, se planteó la hipótesis de que el ADN lineal de cualquier fuente podía ser una plantilla HDR adecuada para insertar un gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Para probar esto, se generaron varios plásmidos que contenían un gen anti-CD19 CAR flanqueado por brazos homólogos que eran además homólogos con el locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Diferentes promotores fueron utilizados en algunos plásmidos, y los brazos de homología eran o bien "cortos" (200 bp en el brazo de homología de 5' y 180 bp en el brazo de homología de 3') para imitar a los vectores AAV autocomplementarios, o "largos" (985 bp en el brazo de homología de 5' y 763 bp en el brazo homólogo de 3') para imitar a los vectores de AAV de una sola hebra. Los plásmidos con brazos de homología cortos estaban marcados como "pDS" y aquellos con brazos de homología largos estaban marcados como "pDI". Además, algún plásmido contenía un intrón por encima del gen CAR.
Los plásmidos de los donantes CAR fueron linealizados en un sitio de restricción en la estructura vectorial y purificados con gel. Las células CD3+ T humanas fueron o bien sometidas a electroporación con el plásmido del donante CAR linealizado solo (cantidades variables entre 500 ng y 1000 ng, dependiendo de la concentración del plásmido linealizado purificado), o bien electroporadas conjuntamente con ARNm de TRC 1-2.87EE (2 |jg). Como controles, las células se simulaban ser electroporadas o eran electroporadas con TRC 1-2x.87EE solo. Los gráficos de la Figura 39 están marcados con descripciones para todas las electroporaciones. Aproximadamente 4 días después de la electroporación, las células fueron marcadas con anticuerpos contra CD3 y el anti-CD19 CAR y analizadas por citometría de flujo (Figura 39). La Figura 39A muestra la tinción de CD3VCAR+ de fondo de 0,15%. Cabe señalar que la tinción de CD3VCAR+ de fondo era inusualmente alta, 4,31%. La Figura 39B muestra las células sometidas a electroporación con el ARNm TRC 1-2x.87EE solo, lo que demuestra un nocaut de CD3 del 60,8%. Las figuras 39C y 39D representan muestras que fueron sometidas a electroporación conjunta con el ARNm de TRC 1-2x.87EE ya sea con el vector de brazo de homología largo con un promotor de núcleo EF1a y un potenciador HTLV o con el vector del brazo de homología corto y el promotor del núcleo EF1a (sin potenciador). Curiosamente, el donante CAR linealizado con el promotor de núcleo EF1a solo generaba una población CD3VCAR+ de 2,38%, mientras que el vector que albergaba el promotor de núcleo EF1a con el potenciador HTLV no generó un porcentaje significativo de células c D3‘ /CAR+. Las células sometidas a electroporación con estos dos vectores en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE no mostraron ningún aumento significativo en la población de CD3VCAR+ (Figura 39E y 39F). El aumento de la población CD3VCAR+ con el vector promotor de núcleo EF1a en presencia de TRC 1-2x.87EE sugirió que un plásmido linealizado podía servir como plantilla HDR para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2.
Las figuras 39G y 39H muestran dos largas construcciones de brazos de homología que contienen una expresión de dirección promotora MND de CAR. Una de estas construcciones, que se muestra en la Figura 39G, también contiene un intrón en el extremo de 5' del gen CAR. Sorprendentemente, el largo plásmido del brazo homología con un promotor de MND e intrón mostró una expresión significativa de CAR (Figura 39G, 4,14% CD3VCAR+) mientras que la construcción sin intrón (Figura 39H) no mostró ninguna expresión CAR detectable cuando se sometió a la electroporación conjunta con ARNm de TRC 1-2x.87EE. Un breve plásmido del brazo de homología con el promotor MND, pero sin intrón, también fue probado con el ARNm TRC 1-2x.87EE y no mostró ninguna expresión CAR (Figura 39I). Ninguna de las construcciones que contienen el promotor MND generó ninguna célula CAR+ en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE (Figuras 39J, 39K, y 39L).
Por último, en este experimento, se probó una construcción de brazo de homología corto que contenía una expresión de dirección promotora de JeT de CAR y un brazo de homología "largo" construido con un promotor de c Mv que dirigía la expresión de CAR. Solo, ninguno de estos plásmidos linealizados resultó en células CAR+ significativas (Figura 39O y 39P). Cuando las células fueron sometidas a electroporación conjunta con ARNm de TRC 1-2x.87EE, la construcción que contenía JeT mostró 2,69% células CD3'CAR+ y el CMV que contenía la construcción produjo 2,7% de células CD3VCAR+.
Los diagramas de flujo mostrados en la Figura 39 muestran claramente que el ADN de plásmido linealizado que codificaba CAR, flanqueado por brazos de homología, podía servir como plantillas HDR para reparar roturas de ADN causadas por TRC 1-2x.87EE, lo que resulta en la inserción del ácido nucleico de c Ar . Está claro que la fuerza promotora desempeña un papel importante en la expresión de CAR, y algunos promotores impulsan una expresión más eficiente cuando hay un intrón en el gen.
Para confirmar que la inserción de CAR utilizando construcciones de ADN linealizadas era específica del locus de secuencia de reconocimiento de TRC 1-2, se analizaron las células como se describió anteriormente utilizando cebadores que se asentaban dentro de CAR y fuera de los brazos de homología (Figura 40, Tabla 11). Las muestras 1 y 2 son productos PCR de células que fueron sometidas a electroporación simuladas o sometidas a electroporación con solo ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE. De acuerdo con los resultados mostrados anteriormente, no hubo bandas de PCR presentes que indicaran la falta del gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 3, 4 y 5 provienen de células que eran sometidas a electroporación conjuntamente con TRC 1-2x.87EE y un plásmido de homología CAR linealizado (nombres de muestras en la Figura 40). Cada muestra muestra dos bandas PCR del tamaño pronosticado, lo que indicaba la inserción del casete de expresión génica CAR en el sitio de reconocimiento de TRC 1-2. Las muestras 6, 7 y 8 provienen de células sometidas a electroporación con los mismos plásmidos de homología CAR linealizados que las muestras 3, 4 y 5, pero sin ARNm de TRC 1-2x.87EE. Como era de esperar, no hubo bandas de PCR presentes. Las muestras 9 y 10 son productos PCR de células que eran sometidas a electroporación simuladas o sometidas a electroporación con solo ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y sin mostrar bandas de PCR. Las muestras 11, 12, 13 y 14 provienen de células que eran sometidas a electroporación conjuntamente con TRC 1-2x.87EE y un plásmido de homología CAR linealizado (nombres de muestras en la Figura 40). Cada muestra muestra dos bandas de PCR del tamaño pronosticado que indican la inserción del gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 15, 16, 17 y 18 provienen de células sometidas a electroporación con los mismos plásmidos de homología CAR linealizados que las muestras 11, 12, 13 y 14, pero sin ARNm de TRC 1-2x.87EE. Como era de esperar, no había bandas de PCR presentes.
Las figuras 39 y 40 demuestran claramente que la electroporación de células CD3+ T humanas conjunta con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y un plásmido homológico CAR linealizado es un método eficaz para insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Tabla 11.
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continuación
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Ejemplo 8
Caracterización de vectores AAV adicionales
1. Uso de AAV con el promotor JeT y brazos de homología largos
Colectivamente, los datos mostrados anteriormente indican que los vectores que utilizan el promotor JeT impulsan una expresión alta y consistente de CAR y que los brazos de homología más largos pueden aumentar la eficiencia de inserción de genes. Se diseñó y generó el vector mostrado en la Figura 41 (SEQ ID NO: 125), que se utilizó para hacer el AAV monocatenario con brazos de homología largos, y un promotor de JeT que dirigía la expresión de CAR anti-CD19 (denominado en este documento aAV423). Las células CD3+ T humanas fueron sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV423. Dado que los datos mostrados anteriormente sugirieron que un mayor número de MOI puede dar lugar a una mayor eficiencia de inserción, se utilizaron tituladores que iban desde 1,875e4 a 1,5e5. Como controles, las células fueron sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego fueron simuladas ser transducidas o simuladas sometidas a electroporación y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423. El día 6 después de la transducción, las células fueron marcadas con anticuerpos que reconocían CD3 o anti-CD19 CAR y analizadas por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 42, las células que fueron sometidas a electroporación simuladas y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423 eran abrumadoramente CD3+/CAR- (que van desde 96,6% a 98,5%). Las células sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y simuladas transducidas fueron un 39% de CD3- lo que indica una eliminación eficiente del receptor de células T. En estas células, la tinción CAR de fondo fue muy baja (alrededor del 2%). Las células sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423 mostraron una tinción CAR drástica en conjunto con la eliminación de CD3. Las poblaciones de CD3YCAR+ oscilaron entre el 21,6% y el 22,7%, mientras que las poblaciones CD3+/CAR+ eran alrededor del 2%. Como se describió anteriormente, la presencia de a Av monocatenario aumentaba la eficiencia general de modificación genética en el sitio de reconocimiento TRC 1-2, con poblaciones de CD3'totales que aumentaron desde un 41,44% en las células de control a un 57,6%, 59,2%, 58,7% y 56,1% en las células sometidas a electroporación entonces transducidas con cantidades crecientes de AV423. El porcentaje de células CD3' que fueron CAR+ oscilaba entre 37,5% y 39,9% lo que indicaba un aumento drástico en la eficiencia de inserción en comparación con los datos descritos anteriormente.
Para confirmar que la inserción de CAR usando AAV423 era específica del locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2, se analizaron las células como se describió anteriormente usando cebadores que se asentaron dentro de CAR y fuera de los brazos de homología (Figura 43, Tabla 12).
Tabla 12.
Figure imgf000043_0001
continuación
Figure imgf000044_0001
Las muestras 1 y 2 son productos PCR de células que fueron sometidas a electroporación simuladas. De acuerdo con los resultados mostrados anteriormente, no había bandas de PCR presentes que indicaran la falta del gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 3-6 provenían de células que eran sometidas a electroporación simuladas y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423. De acuerdo con los resultados anteriores, no había bandas de PCR presentes. La muestra 7 provenía de células sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego simuladas transducidas, y no muestra bandas de PCR. Las muestras 8-11 provienen de células sometidas a electroporación con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423, y muestran las bandas p Cr esperadas si CAR se insertaba en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Dada la capacidad de AAV423 para insertar la secuencia CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 después de la escisión, se prevé además que el plásmido AAV423 (Figura 41) pueda linealizarse mediante digestión y entregarse a la célula por digestión con una o más enzimas de restricción, de modo que las células T puedan ser transfectadas con una plantilla de ADN linealizado que pueda integrarse en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 y codificar un CAR anti-CD19.
Ejemplo 9
Eficacia in vivo de células T CAR TCR-negativas anti-CD19
1. Modelo murino de linfoma diseminado de células B
La eficacia de las células T CAR anti-CD19 editadas por genes se evaluó en un modelo murino de linfoma de células B diseminadas. Las células T activadas fueron sometidas a electroporación con el ARNm de TRC 1-2x.87 EE como se describió anteriormente y luego fueron transducidas con un vector AAV6 que comprendía un casete de expresión de CAR anti-CD19 dirigido por un promotor JeT y flanqueado por brazos de homología. Después de 5 días de cultivo con IL-2 (10 ng/mL), se analizaron las células para determinar la expresión de CD3 de la superficie celular y CAR anti-CD19 por citometría de flujo como se describió anteriormente (Figura 44A). Las células CD3' se enriquecieron agotando las células CD3+ y usando cuentas magnéticas anti-CD3. Las células agotadas se cultivaron después durante 3 días en IL-15 (10 ng/mL) e IL-21 (10 ng/mL) y se analizaron de nuevo para detectar la expresión en la superficie celular de CD3 y CAR anti-CD19 (Figura 44B). El aislamiento de la población CD3' fue bastante eficiente, produciendo un 99,9% de pureza medida por citometría de flujo después del agotamiento de las células CD3+ (Figura 44B). La población de CD3' purificadas comprendía un 56% de células CD4+ y un 44% de células CD8+ (Figura 44C), y tuvo principalmente fenotipos de memoria central/memoria de transición, determinados por la tinción de CD62L y CD45RO (Figura 44D).
Los estudios que utilizaron el modelo de linfoma diseminado de Raji fueron realizados por Charles River Laboratories International Inc. (Morrisville, NC, USA). Las células Raji CD19+ que expresaban establemente la luciferasa de luciérnaga (ffLuc)44 se inyectaron i.v. en ratones NSG hembra de 5-6 semanas de edad el día 1 a una dosis de 2,0 x 105 células por ratón. El día 4 se inyectaron a los ratones i.v. PBS o PBS con células TCR KO T de control editadas genéticamente y preparadas a partir del mismo donante sano PBMC o PBS con las dosis indicadas de células T CAR preparadas a partir del mismo donante. En los días indicados, a los ratones vivos les fue inyectado i.p. sustrato de Luciferina (150mg/kg en solución salina), anestesiado, y la actividad de Luciferasa fue medida después de 7 minutos usando IVIS SpectrumCT (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los datos se analizaron y exportaron utilizando el software Living Image 4.5.1 (Perkin Elmer, Waltham, MA). La intensidad de la señal de luminiscencia se representa por la radiancia en p/s/cm2/sr.
2. Resultados
Como se muestra en la Figura 45, el crecimiento de las células CD19+ Raji fue evidente en todos los ratones a niveles bajos para el día 8, y aumentó significativamente en los grupos de control no tratados y TCR el día 11. En los grupos de control, se observó un crecimiento significativo del tumor el día 15, y para los días 18 o 19 todos los grupos de control fueron sacrificados. Por el contrario, todos los grupos de ratones tratados con células T CAR anti-CD19 no mostraron ninguna evidencia de crecimiento tumoral el día 11 y, con la excepción de un solo ratón en el grupo de dosis bajas, se mostraron sin tumores para el día 29 del estudio. Se observó un rebrote tumoral en tres ratones de la cohorte de dosis bajas alrededor del día 36. Uno de los tres murió el día 42, aunque las imágenes describieron solo niveles bajos de tumor en ese animal, por lo que es poco probable que la muerte estuviera relacionada con el tumor.
3. Conclusiones
Estos resultados proporcionan una clara evidencia para el aclaramiento in vivo de células CD19+tumorales por células T CAR CD3' editadas por genes y apoyan un mayor desarrollo preclínico de esta plataforma para la terapia alogénica

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una meganucleasa modificada genéticamente que reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende una primera subunidad y una segunda subunidad, en la que dicha primera subunidad se une a un primer semi-sitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una primera región hipervariable (HVR1), y en la que dicha segunda subunidad se une a un segundo semi-sitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una segunda región hipervariable (HVR2), y en la que dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 96 % de identidad con la SEQ ID NO: 8.
2. La meganucleasa modificada genéticamente de la reivindicación 1, en la que dicha primera subunidad comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 96 % de identidad de secuencia con los restos 198-344 de la SEQ ID NO: 8, y en la que dicha segunda subunidad comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 96 % de identidad de secuencia con los restos 7-153 de la SEQ ID NO: 8.
3. La meganucleasa modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicha primera subunidad comprende los restos 198-344 de la SEQ ID NO: 8.
4. La meganucleasa modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha segunda subunidad comprende los restos 7-153 de la SEQ ID NO: 8.
5. La meganucleasa modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha meganucleasa modificada genéticamente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha meganucleasa modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Polinucleótido aislado según la reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido aislado es un ARNm.
8. Una construcción de ADN recombinante que comprende dicho polinucleótido aislado de la reivindicación 6, en la que opcionalmente dicha construcción de ADN recombinante codifica un vector de virus adenoasociado recombinante (AAV).
9. Un vector de AAV recombinante que comprende dicho polinucleótido aislado de la reivindicación 6.
10. Un procedimiento para producir una célula eucariota modificada genéticamente que comprende una secuencia exógena de interés insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota modificada genéticamente, comprendiendo dicho procedimiento introducir en una célula eucariota uno o más ácidos nucleicos que incluyen:
(a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la meganucleasa modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y
(b) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia de interés;
en el que dicha meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en dicho cromosoma en una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NO: 3, y en el que dicha secuencia de interés se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión; y
en el que dicho procedimiento no es un procedimiento de tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico se introduce en dicha célula eucariota usando un ARNm, y en el que dicha segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en dicha célula eucariota usando un vector de AAV recombinante, preferiblemente en el que dicho vector de AAV recombinante tiene un serotipo AAV6.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T exógeno.
13. Un procedimiento para producir una célula eucariota modificada genéticamente alterando una secuencia diana en un cromosoma de dicha célula eucariota modificada genéticamente, comprendiendo dicho procedimiento:
transfectar una célula eucariota con un ácido nucleico que codifica dicha meganucleasa modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
en el que dicha meganucleasa modificada genéticamente produce un sitio de escisión en dicho cromosoma en una secuencia de reconocimiento que comprende la SEQ ID NO: 3, y en el que dicha secuencia diana se altera por la unión de extremos no homólogos en dicho sitio de escisión; y
en el que dicho procedimiento no es un procedimiento de tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho ácido nucleico que codifica dicha meganucleasa modificada es un ARNm.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en el que dicha célula eucariota es una célula T humana.
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