CN107072184A

CN107072184A - 嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN107072184A
Application number: CN201580050602.0A
Authority: CN
Inventors: G·瑟斯顿; A·J·莫菲; L·麦克唐纳; J·麦克韦尔特尔; N·屠; C·古尔; V·沃伦妮娜
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2017-08-18
Also published as: RU2017113134A; EP3193592A1; SG11201701040XA; BR112017005245A2; IL250536A0; KR20170083534A; US20160081314A1; WO2016044745A1; CA2959428A1; AU2015317370A1; MX2017003640A; JP2017529841A

Abstract

本文提供了与嵌合抗原受体(CAR)相关的方法和组合物，所述嵌合抗原受体具有来源于免疫球蛋白(Ig)的抗原结合结构域以及来源于T细胞受体(TCR)的恒定结构域。

Description

嵌合抗原受体

相关专利申请

本申请要求2015年5月28日提交的临时申请No.62/167,650、2014年12月19日提交的临时申请No.62/094,603、2014年11月7日提交的临时申请No.62/076,836、2014年9月19日提交的临时申请No.62/052,947以及2014年9月19日提交的临时申请No.62/052,901的优先权权益，这些临时申请均据此全文以引用方式并入。

序列表

本申请包含以ASCII格式通过电子方式提交的序列表，该序列表据此以引用方式全文并入本文。2015年9月16日创建的所述ASCII副本被命名为RPB-010.25_SL.txt，其大小为42,074字节。

背景技术

经遗传修饰的啮齿动物已被证明是对许多抗原具有特异性的治疗性抗体的重要来源，然而一些抗原已被证明难以靶向。因此，迫切需要一种新型治疗性抗原结合蛋白以及可用于生成此类抗原结合蛋白的方法和组合物。

发明内容

本文提供了与嵌合抗原受体(CAR)相关的方法和组合物。例如，本文提供了CAR和CAR多肽、表达CAR和CAR多肽的非人动物、编码CAR和CAR多肽的核酸、以及可用于制备和使用此类CAR、表达CAR的非人动物和编码CAR的核酸的组合物和方法。

如本文所述，CAR是这样的抗原结合蛋白，其具有来源于免疫球蛋白(Ig)可变结构域的抗原结合结构域以及来源于T细胞受体(TCR)的恒定结构域。一般来讲，本文所提供的CAR包含两条CAR多肽链，其中一条多肽链包含TCRα恒定结构域，另一条多肽链包含TCRβ恒定结构域。每条多肽链包含Ig可变结构域，其中一条多肽链包含重链Ig可变结构域，另一条链包含Ig轻链(κ或λ)可变结构域。在一些实施例中，本文所提供的CAR对主要组织相容性复合体(MHC)蛋白(例如，I类MHC蛋白或II类MHC蛋白)所递呈的肽具有结合特异性。

在某些方面，本文提供了表达CAR多肽的经遗传修饰的非人动物(例如，啮齿动物，如小鼠或大鼠)。在一些实施例中，非人动物的生殖系中包含CAR基因座，该CAR基因座包含具有非重排人Ig可变区基因区段(例如，非重排V、D和J重链基因区段、非重排Vκ和Jκ轻链基因区段或者非重排Vλ和Jλ轻链基因区段)的非重排可变区基因座以及TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因或TCRβ恒定区基因)。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，该CAR多肽包含由来源于非重排可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段为人Ig可变区基因区段。在一些实施例中，TCR恒定区基因为内源物种来源。在一些实施例中，TCR恒定结构域为人或啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。在一些实施例中，TCR恒定区基因为小鼠或大鼠TCR恒定区。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些方面，本文提供了表达CAR的经遗传修饰的非人动物(例如，啮齿动物，如小鼠或大鼠)。在一些实施例中，非人动物的生殖系中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有非重排人Ig V_H、D_H和J_H基因区段的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至TCRβ恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，该第一CAR多肽链包含由来源于非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段的重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有Ig重链可变区基因(通用重链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座，其中经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，该第一CAR多肽链包含由重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人Ig V_κ和J_κ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由来源于非重排Ig V_κ和J_κ基因区段的重排Igκ可变区基因编码的Igκ可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人Ig V_λ和J_λ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_λ和J_λ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因，使得经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由来源于非重排Ig V_λ和J_λ基因区段的重排Igλ可变区基因编码的Igλ可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有Ig轻链κ或λ可变区基因(通用轻链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源(例如，大鼠或小鼠源)的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，该第二CAR多肽链包含由重排轻链可变区基因编码的Ig轻链可变结构域以及由TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定区。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达包含第一CAR多肽链和第二CAR多肽链的CAR。在一些实施例中，非重排可变区基因座中的一个或两个包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，一个或两个非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物表达CAR。在一些实施例中，CAR在非人动物的T细胞(例如，CD4和/或CD8T细胞)上表达。在一些实施例中，表达CAR的T细胞在经遗传修饰的非人动物的胸腺中经历了阳性和/或阴性选择。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体(即，在MHC蛋白的沟槽中递呈的肽)具有结合特异性。在一些实施例中，CAR对I类MHC蛋白所递呈的肽具有结合特异性。在一些实施例中，CAR对II类MHC蛋白所递呈的肽具有结合特异性。

在本文所述经遗传修饰的非人动物的一些实施例中，CAR基因座位于内源TCR基因座(例如，内源TCRα基因座或内源TCRβ基因座)处。在一些实施例中，CAR基因座的TCR恒定区基因为内源TCR恒定区基因。在一些实施例中，内源TCRα基因座和/或TCRβ基因座的可变区中的全部或一部分被替换为Ig基因座的可变区的全部或一部分，从而形成CAR基因座。在一些实施例中，整个TCR可变区被替换为Ig可变区。在一些实施例中，TCR可变区基因区段被替换为Ig可变区基因区段。例如，在一些实施例中，内源TCRβ基因座的V、D和J基因区段被替换为Ig重链V、D和J基因区段。在一些实施例中，内源TCRα基因座的V和J基因区段被替换为Ig轻链(例如，κ或λ)V和J基因区段。在一些实施例中，CAR基因座位于内源TCR基因座的外部。

在本文所述经遗传修饰的非人动物的一些实施例中，CAR基因座的可变区基因座中的所有内源TCR可变区基因区段被替换为Ig可变区基因区段。在一些实施例中，CAR基因座的可变区基因座中的基本上所有TCR可变区基因区段被替换为Ig可变区基因区段。在一些实施例中，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个TCR可变区基因区段位于CAR基因座的可变区基因座中和/或有效连接至TCR恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座中没有功能性TCR可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座中没有TCR可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70或80个Ig可变区基因区段。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达功能性αβTCR。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRα链和/或功能性TCRβ链。在一些实施例中，内源TCRα可变区基因座和/或TCRβ可变区基因座在经遗传修饰的非人动物中是失活的。例如，在一些实施例中，通过使内源基因座的全部或一部分缺失，而使内源TCRα可变区基因座和/或TCRβ可变区基因座失活。在一些实施例中，通过破坏TCR可变区基因座与TCR恒定区基因座之间的有效连接(例如，通过使非编码调节元件缺失，通过颠倒TCR可变区基因座或其一部分、和/或通过将核酸序列诸如编码非重排Ig可变区或其一部分的核酸序列插入在TCR可变区基因座的可变区基因区段与TCR恒定区基因座的TCR恒定区基因之间)，而使TCRα可变区基因座和/或TCRβ可变区基因座失活。

在一些实施例中，非人动物不包含TCRδ基因座。TCRδ位于TCRα基因座的内部，并介于TCRαV与TCRαJ基因区段之间。因此，在一些实施例中，非人动物在TCRα基因座处包含Ig轻链的可变区，该Ig轻链的可变区包含有效连接至TCRα恒定区的Ig轻链V和J基因区段，并且TCRδ基因座被缺失或修饰，使得非人动物不表达功能性δ/γTCR。在一些实施例中，TCRδ基因座被保留，并且非人动物不表达功能性δ/γTCR。

在本文所提供的经遗传修饰的非人动物的一些实施例中，CAR基因座的非重排可变区包含一种或多种胰蛋白酶原(TRY)基因(例如，通常存在于TCRβ可变区基因座中的TRY基因和/或假基因)。在一些实施例中，TRY基因为内源物种来源。在一些实施例中，TRY基因为小鼠TRY基因。在一些实施例中，小鼠TRY基因选自Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19和Try20。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V区段的上游。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V区段的下游(例如，V区段的下游以及D和/或J区段的上游)。在一些实施例中，Try1-7位于非重排可变区的V区段的上游，并且Try8-20位于非重排可变区的V区段的下游(例如，V区段的下游以及D和/或J区段的上游)。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达一种或多种人源化MHC I类α链多肽。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽包含人胞外结构域(人α1、α2和α3结构域)和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化I类α链多肽为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K或HLA-L。在一些实施例中，非人动物表达人源化HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和/或HLA-L多肽。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化MHC I类α链基因座，该基因座包含编码人源化MHC I类α链多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化MHC I类α链基因座位于内源MHC I类α链基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源MHC I类α链基因座中的一个或多个(例如，全部)被替换为人源化MHC I类α链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的MHC I类α链多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达人源化β-2-微球蛋白多肽。在一些实施例中，人源化β-2-微球蛋白多肽为全人源的。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化β-2-微球蛋白基因座，该基因座包含编码人源化β-2-微球蛋白多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于内源β-2-微球蛋白基因座处。在一些实施例中，内源β-2-微球蛋白基因座被替换为人源化β-2-微球蛋白基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的β-2-微球蛋白多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达一种或多种人源化MHC II类α链多肽。在一些实施例中，人源化MHC II类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC II类α链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化II类α链多肽为HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA。在一些实施例中，非人动物表达人源化HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和/或HLA-DRA多肽。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化MHC II类α链基因座，该基因座包含编码人源化MHC II类α链多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化MHC II类α链基因座位于内源MHC II类α链基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源MHC II类α链基因座中的一个或多个(例如，全部)被替换为人源化MHC II类α链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的MHC II类α链多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达一种或多种人源化MHC II类β链多肽。在一些实施例中，人源化MHC II类β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC II类β链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化II类β链多肽为HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB。在一些实施例中，非人动物表达人源化HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和/或HLA-DRB多肽。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化MHC II类β链基因座，该基因座包含编码人源化MHC II类β链多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化MHC II类β链基因座位于内源MHC II类β链基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源MHC II类β链基因座中的一个或多个(例如，全部)被替换为人源化MHC II类β链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的MHC II类β链多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达人源化CD8α链多肽。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化CD8α链基因座，该基因座包含编码人源化CD8α链多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化CD8α链基因座位于内源CD8α链基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源CD8α链基因座被替换为人源化CD8α链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的CD8α链多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达人源化CD8β链多肽。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化CD8β链基因座，该基因座包含编码人源化CD8β链多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化CD8β链基因座位于内源CD8β链基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源CD8β链基因座被替换为人源化CD8β链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的CD8β链多肽。

在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达人源化CD4多肽。在一些实施例中，人源化CD4多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含至少一个人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含至少人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域和人D3免疫球蛋白结构域，以及内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域以及内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，非人动物的基因组中包含人源化CD4基因座，该基因座包含编码人源化CD4多肽的核酸序列。在一些实施例中，人源化CD4基因座位于内源CD4基因座处。在一些实施例中，非人动物的内源CD4基因座被替换为人源化CD4基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达完全内源物种来源的CD4多肽。

在某些方面，本文提供了用于制备表达CAR的T细胞的方法。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体和/或肽/II类MHC复合体)具有抗原特异性。在一些实施例中，该方法包括使本文所述经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的步骤。在一些实施例中，该方法包括从该经遗传修饰的非人动物获得表达对肽/MHC复合体具有特异性的CAR的T细胞的步骤。在一些实施例中，本文提供了根据本文所述方法制备的和/或由本文所述方法可获得的T细胞。

在某些方面，本文提供了制备表达CAR的T细胞杂交瘤的方法。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体和/或肽/II类MHC复合体)具有抗原特异性。在一些实施例中，该方法包括使本文所述经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的步骤。在一些实施例中，该方法包括从该经遗传修饰的非人动物获得表达对肽/MHC复合体具有特异性的CAR的T细胞的步骤。在一些实施例中，该方法包括由T细胞制备T细胞杂交瘤的步骤。在一些实施例中，本文提供了根据本文所提供的方法制备的和/或由本文所提供的方法可获得的T细胞杂交瘤。

在某些方面，本文提供了用于制备编码Ig可变结构域(例如，Ig重链可变结构域、Igκ可变结构域和/或Igλ可变结构域)的核酸的方法。在一些实施例中，Ig可变结构域在单独时或与另一个Ig可变结构域配对时，对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体和/或肽/II类MHC复合体)具有结合特异性。在一些实施例中，该方法包括使本文所述的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的步骤。在一些实施例中，该方法包括从该经遗传修饰的非人动物获得表达对肽/MHC复合体具有特异性的CAR的T细胞的步骤。在一些实施例中，该方法包括从T细胞分离编码CAR的Ig可变结构域的核酸。在一些实施例中，将编码CAR的每个可变结构域的核酸从T细胞分离。在一些实施例中，本文提供了根据本文所提供的方法制备的和/或由本文所提供的方法可获得的编码Ig可变结构域的核酸。

在某些方面，本文提供了用于制备抗体或抗体片段的方法。在一些实施例中，所述抗体或抗体片段对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体和/或肽/II类MHC复合体)具有结合特异性。在一些实施例中，该方法包括使本文所述的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的步骤。在一些实施例中，该方法包括从该经遗传修饰的非人动物获得表达对肽/MHC复合体具有特异性的CAR的T细胞。在一些实施例中，该方法包括从T细胞分离编码CAR的重链Ig可变结构域和/或轻链Ig可变结构域的核酸的步骤。在一些实施例中，该方法包括用一种或多种编码重链Ig可变结构域和轻链Ig可变结构域的载体转染宿主细胞，使得该宿主细胞表达包含该重链可变结构域和该轻链可变结构域的抗体或抗体片段的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该重链Ig可变结构域的核酸序列与编码重链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得该宿主细胞表达包含该Ig重链可变结构域和该Ig重链恒定结构域的Ig重链多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码轻链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得该宿主细胞表达包含该Ig轻链可变结构域和该Ig重链恒定结构域的Ig轻链多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该重链Ig可变结构域的核酸序列与编码重链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，并且将编码该轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码轻链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得该宿主细胞表达如下的抗体的步骤，该抗体具有包含该重链Ig可变结构域和该重链Ig恒定结构域的重链以及包含该轻链Ig可变结构域和该轻链Ig恒定结构域的轻链。在一些实施例中，该方法包括在使得宿主细胞表达抗体或抗体片段条件下培养该宿主细胞的步骤。在一些实施例中，Ig轻链和/或重链恒定结构域为人Ig恒定结构域。在一些实施例中，本文提供了根据本文所提供的方法制备的和/或由本文所提供的方法可获得的抗体或抗体片段。

在某些实施例中，本文提供了治疗受试者的癌的方法，该方法包括给受试者施用本文所述的抗体或抗体片段(例如，对肽/MHC复合体具有结合特异性的和/或根据本文所述方法生成的抗体)。在一些实施例中，本文所述方法可用于治疗任何癌性或癌前期肿瘤。可通过本文所述方法和组合物治疗的癌包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。此外，所述癌具体而言可以是以下组织学类型，但不限于此：瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；卵巢内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓性肉瘤；以及毛细胞白血病。

在某些实施例中，本文提供了治疗患有感染(包括病毒感染、细菌感染、蠕虫感染或原虫感染)的受试者的方法，该方法包括给受试者施用本文所述抗体或抗体片段(例如，对肽/MHC复合体具有结合特异性的和/或根据本文所述方法生成的抗体)。例如，在一些实施例中，本文提供了治疗病毒感染性疾病的方法，所述病毒感染性疾病包括HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2，以及流感病毒。在一些实施例中，所治疗的病原体是寄生虫，例如疟原虫。在一些实施例中，本文提供了对细菌性、真菌性和其他病原性疾病的治疗，例如曲霉(Aspergillus)、布鲁线虫(Brugia)、念珠菌(Candida)、衣原体(Chlamydia)、球虫(Coccidia)、隐球菌(Cryptococcus)、恶丝虫(Dirofilaria)、淋球菌(Gonococcus)、组织胞浆菌(Histoplasma)、利什曼原虫(Leishmania)、分枝杆菌(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、草履虫(Paramecium)、百日咳菌(Pertussis)、疟原虫(Plasmodium)、肺炎球菌(Pneumococcus)、肺囊虫(Pneumocystis)、立克次氏体(Rickettsia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、弓形虫(Toxoplasma)以及霍乱弧菌(Vibriocholerae)。示例性物种包括淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilusvaginalis)、B族链球菌(Group B Streptococcus sp.)、人型支原体(Microplasmahominis)、杜氏嗜血菌(Hemophilus ducreyi)、腹股沟肉芽肿(Granuloma inguinale)、性病性淋巴肉芽肿(Lymphopathia venereum)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、胎儿弯曲菌肠亚种(Campylobacter fetus intestinalis)、波蒙纳钩端螺旋体(Leptospirapomona)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绵羊布鲁氏菌(Brucellaovis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、胎儿三毛滴虫(Trichomonas foetus)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、马放线杆菌(Actinobacillus equuli)、绵羊流产沙门菌(Salmonella abortus ovis)、马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、马棒状杆菌(Corynebacterium equi)、化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)、精液放线杆菌(Actinobaccilus seminis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、分枝犁头霉(Absidia ramosa)、马媾疫锥虫(Trypanosomaequiperdum)、驽巴贝斯虫(Babesia caballi)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；或真菌，例如巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)；或其他病原体，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。

在一些方面，本文提供了用于制备表达CAR的细胞(例如，人细胞，如人T细胞)的方法。在一些实施例中，所述抗体或抗体片段对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体和/或肽/II类MHC复合体)具有结合特异性。在一些实施例中，该方法包括使本文所述的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的步骤。在一些实施例中，该方法包括从该经遗传修饰的非人动物获得表达对在MHC上递呈的该肽具有特异性的CAR的T细胞。在一些实施例中，该方法包括从T细胞分离编码CAR的重链Ig可变结构域和/或轻链Ig可变结构域的核酸的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该重链Ig可变结构域的核酸序列与编码TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)的核酸序列在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，使得该细胞表达包含该Ig重链可变结构域和该TCR恒定结构域的CAR多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)的核酸序列在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，使得该细胞表达包含该Ig轻链可变结构域和该TCR恒定结构域的CAR多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码该重链Ig可变结构域的核酸序列与第一TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，并且将编码该轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码第二TCR恒定结构域(例如，如果第一TCR恒定结构域为TCRα恒定结构域，则其为TCRβ恒定结构域，或者如果第一TCR恒定结构域为TCRβ恒定结构域，则其为TCRα恒定结构域)的核酸序列在该细胞中有效连接，使得该细胞表达如下的CAR的步骤，该CAR具有包含该重链Ig可变结构域和该第一TCR恒定结构域的第一CAR链多肽以及包含该轻链Ig可变结构域和该第二TCR恒定结构域的第二CAR多肽。在一些实施例中，TCR恒定结构域为人TCR恒定结构域。在一些实施例中，所述细胞为离体细胞(例如，离体人细胞，如离体人T细胞)。在一些实施例中，本文提供了根据本文所提供的方法制备的和/或由本文所提供的方法可获得的表达CAR的细胞。

在一些实施例中，任何使本文所述经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原而使得该肽递呈在该非人动物的MHC上的方法都可使用。在一些实施例中，通过用包含编码该抗原的核酸序列的病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或慢病毒)感染经遗传修饰的非人动物，而使该非人动物暴露于该抗原。在一些实施例中，通过给经遗传修饰的非人动物施用编码该肽的核酸，使得该肽在该非人动物中表达，而使该动物暴露于该抗原。在一些实施例中，给非人动物施用编码单链肽/MHC复合体的核酸。在一些实施例中，通过给经遗传修饰的非人动物施用肽/MHC复合体，而使经遗传修饰的非人动物暴露于该抗原。在一些实施例中，给非人动物施用单链肽/MHC复合体(例如，单链胞外MHC/β-2-微球蛋白/肽蛋白复合体)。在一些实施例中，肽/MHC复合体作为多聚体(例如，四聚体)施用。在一些实施例中，肽/MHC复合体存在于细胞(例如，抗原递呈细胞，如巨噬细胞或树突细胞)的表面上。在一些实施例中，B7.1、B7.2或ICOS-L存在于该细胞的表面上。在一些实施例中，细胞表达T细胞刺激细胞因子(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-13、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IFN-α和/或IFN-β)。

在本文所述方法的一些实施例中，可使用任何方法来分离编码Ig可变结构域的核酸。在一些实施例中，分离该核酸的步骤包括由T细胞制备T细胞杂交瘤并且从该T细胞杂交瘤分离该核酸。在一些实施例中，使用核酸扩增方法(例如，PCR)分离核酸。在一些实施例中，通过对T细胞或T细胞杂交瘤的CAR基因座中的重排Ig可变区基因进行测序并合成包含该重排Ig可变区基因的核酸序列来分离该核酸。

在某些方面，本文提供了由本文所述经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的表达CAR的细胞。在一些实施例中，该细胞为T细胞。在一些实施例中，该细胞为T细胞杂交瘤。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。

在某些方面，本文提供了由本文所述经遗传修饰的非人动物或细胞获得的或可获得的、包含重排Ig可变区基因(例如，重链Ig可变区基因或轻链重链可变区基因)的核酸。在一些实施例中，该核酸还包含TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因或TCRβ恒定区基因)。在一些实施例中，该核酸编码CAR多肽。在一些实施例中，Ig可变区基因编码对肽/MHC复合体具有结合特异性的Ig可变结构域。

在某些方面，本文提供了由本文所述经遗传修饰的非人动物或细胞获得的或可获得的CAR或CAR多肽。在一些实施例中，该CAR或CAR多肽对肽/MHC复合体具有结合特异性。

在某些方面，本文提供了在其基因组中包含CAR基因座的非人胚胎干(ES)细胞(例如，啮齿动物ES细胞，如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)。在一些实施例中，该CAR基因座包含具有非重排人Ig可变区基因区段(例如，非重排V、D和J重链基因区段、非重排Vκ和Jκ轻链基因区段、或者非重排Vλ和Jλ轻链基因区段)的非重排可变区基因座以及TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因或TCRβ恒定区基因)。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段为人Ig可变区基因区段。在一些实施例中，TCR恒定区基因为内源物种来源。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在一些方面，本文提供了在其基因组中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座的非人ES细胞(例如，啮齿动物ES细胞，如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有非重排人Ig V_H、D_H和J_H基因区段的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，第一CAR基因座包含具有Ig重链可变区基因(通用重链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源的TCRβ恒定区基因的恒定区基因座。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人Ig V_κ和J_κ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有非重排人Ig V_λ和J_λ的非重排可变区基因座以及具有内源物种来源的TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_λ和J_λ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因。在一些实施例中，第二CAR基因座包含具有Ig轻链κ或λ可变区基因(通用轻链可变区)的重排可变区基因座以及具有内源物种来源的TCRα恒定区基因的恒定区基因座。在一些实施例中，非重排可变区基因座中的一个或两个包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座中的一个或两个包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在本文所述非人动物ES细胞的一些实施例中，CAR基因座位于内源TCR基因座(例如，内源TCRα基因座或内源TCRβ基因座)处。在一些实施例中，CAR基因座的TCR恒定区基因为内源TCR恒定区基因。在一些实施例中，内源TCRα基因座和/或TCRβ基因座的可变区中的全部或一部分被替换为Ig基因座的可变区中的全部或一部分，从而形成CAR基因座。在一些实施例中，整个TCR可变区被替换为Ig可变区。在一些实施例中，TCR可变区基因区段被替换为Ig可变区基因区段。例如，在一些实施例中，内源TCRβ基因座的V、D和J基因区段被替换为Ig重链V、D和J基因区段。在一些实施例中，内源TCRα基因座的V和J基因区段被替换为Ig轻链(例如，κ或λ)V和J基因区段。

在一些实施例中，非人ES细胞不包含功能性TCR基因座。在一些实施例中，非人ES细胞不包含功能性TCRα链基因座和/或功能性TCRβ链基因座。在一些实施例中，内源TCRα基因座和/或TCRβ基因座在经遗传修饰的非人ES细胞中是失活的(例如，通过使内源基因座中的全部或一部分缺失而失活)。在一些实施例中，非人ES细胞不包含功能性TCRδ基因座。

在本文所述非人动物ES细胞的一些实施例中，CAR基因座的非重排可变区包含一种或多种胰蛋白酶原(TRY)基因(例如，通常存在于TCRβ可变区基因座中的TRY基因和/或假基因)。在一些实施例中，TRY基因为内源物种来源。在一些实施例中，TRY基因为小鼠TRY基因。在一些实施例中，小鼠TRY基因选自Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19和Try20。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V区段的上游。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V区段的下游(例如，V区段的下游以及D和/或J区段的上游)。在一些实施例中，Try1-7位于非重排可变区的V区段的上游，并且Try 8-20位于非重排可变区的V区段的下游(例如，V区段的下游以及D和/或J区段的上游)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化MHC I类α链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽包含人胞外结构域(人α1、α2和α3结构域)和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化I类α链多肽为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K或HLA-L。在一些实施例中，非人ES细胞包含编码人源化HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和/或HLA-L多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC I类α链基因座位于内源MHCI类α链基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源MHC I类α链基因座中的一个或多个(例如，全部)被全部或部分地替换为人源化MHC I类α链基因座。在一些实施例中，非人ES细胞不包含功能性内源MHC I类α链基因座(例如，编码完全内源物种来源的MHC I类α链的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座。在一些实施例中，人源化β-2-微球蛋白多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于内源β-2-微球蛋白基因座处。在一些实施例中，内源β-2-微球蛋白基因座被全部或部分地替换为人源化β-2-微球蛋白基因座。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源β-2-微球蛋白基因座(例如，编码完全内源物种来源的β-2-微球蛋白多肽的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化MHC II类α链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHCII类α链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化II类α链多肽为HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA。在一些实施例中，非人ES细胞包含编码人源化HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和/或HLA-DRA多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类α链基因座位于内源MHC II类α链基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源MHC II类α链基因座中的一个或多个(例如，全部)被全部或部分地替换为人源化MHC II类α链基因座。在一些实施例中，经遗传修饰的非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源MHC II类α链基因座(例如，编码完全内源物种来源的MHC II类α链的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化MHC II类β链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHCII类β链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化II类β链多肽为HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和/或HLA-DRB多肽的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类β链基因座位于内源MHC II类β链基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源MHC II类β链基因座中的一个或多个(例如，全部)被全部或部分地替换为人源化MHC II类β链基因座。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源MHC II类β链基因座(例如，编码完全内源物种来源的MHC II类β链的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化CD8α链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD8α链基因座位于内源CD8α链基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源CD8α链基因座被全部或部分地替换为人源化CD8α链基因座。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源CD8α链基因座(例如，编码完全内源物种来源的CD8α链的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化CD8β链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD8β链基因座位于内源CD8β链基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源CD8β链基因座被全部或部分地替换为人源化CD8β链基因座。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源CD8β链基因座(例如，编码完全内源物种来源的CD8β链的基因座)。

在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中包含编码人源化CD4多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD4多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含至少人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域和人D3免疫球蛋白结构域，以及内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域以及内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4基因座位于内源CD4基因座处。在一些实施例中，非人ES细胞的内源CD4基因座被全部或部分地替换为人源化CD4基因座。在一些实施例中，非人ES细胞的基因组中不包含功能性内源CD4链基因座(例如，编码完全内源物种来源的CD4链的基因座)。

在某些方面，本文提供了使用本文所述ES细胞生成的或由本文所述ES细胞可获得的经遗传修饰的非人动物。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物为啮齿动物。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物为小鼠或大鼠。在一些实施例中，本文提供了包含本文所述非人ES细胞的非人胚胎。

在某些方面，本文提供了用于制备表达CAR和/或CAR多肽的经遗传修饰的非人动物的方法。在某些实施例中，该方法包括使用本文所述非人ES细胞生成非人动物。在某些实施例中，非人ES细胞为小鼠非人ES细胞。在一些实施例中，该方法包括使用如美国专利No.7,294,754中所述的方法，该专利据此以引用方式并入。在某些实施例中，本文提供了使用本文所提供的方法生成的或由本文所提供的方法可获得的经遗传修饰的非人动物。

在某些方面，本文提供了CAR基因座，该CAR基因座包含具有非重排人Ig可变区基因区段的非重排可变区基因座；以及具有啮齿动物TCR恒定区基因(例如，小鼠TCR恒定区基因或大鼠TCR恒定区基因)的恒定区基因座，其中人非重排Ig可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段为人Ig重链(IgH)可变区基因区段。在一些实施例中，非重排Ig可变区基因区段为人Ig轻链(IgL)可变区基因区段(例如，Igκ基因区段或Igλ基因区段)。在一些实施例中，TCR恒定区基因为TCRα恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座位于内源TCRα基因座处。在一些实施例中，非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。在一些实施例中，TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。在一些实施例中，TCR恒定区基因为TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。在一些实施例中，非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。在一些实施例中，TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，非重排可变区基因座还包含一种或多种胰蛋白酶原基因。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了CAR基因座，该CAR基因座包含具有非重排人Ig V_H、D_H和J_H基因区段的非重排可变区基因座以及具有啮齿动物TCRβ恒定区基因(例如，大鼠TCRβ恒定区基因或小鼠TCRβ恒定区基因)的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至TCRβ恒定区基因。在某些实施例中，CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。在某些实施例中，非重排人Ig V_H、D_H和J_H基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。在一些实施例中，TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，非重排可变区基因座还包含一种或多种胰蛋白酶原基因。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了CAR基因座，该CAR基因座包含具有非重排人Ig V_κ和J_κ基因区段的非重排可变区基因座以及具有啮齿动物TCRα恒定区基因的恒定区基因座，其中人非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至TCRα恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座位于内源TCRα基因座处。在一些实施例中，非重排人Ig V_κ和J_κ基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。在一些实施例中，TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座不包含功能性TCRδ基因座；在一些实施例中，TCRδ基因座被缺失。

在某些方面，本文提供了在其生殖系中包含本文所述CAR基因座的啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)。在一些方面，本文提供了在其生殖系中包含本文所述CAR基因座的啮齿动物细胞(例如，大鼠细胞或小鼠细胞)。在一些实施例中，该细胞为ES细胞。在一些实施例中，本文提供了编码本文所述CAR基因座的核酸(例如，载体)。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含Ig可变区基因间序列(例如，重链基因间序列、κ基因间序列或λ基因间序列)。在一些实施例中，Ig可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。在一些实施例中，非重排可变区基因座包含TCR可变区基因间序列(例如，TCRβ基因间序列或TCRα基因间序列)。在一些实施例中，TCR可变区基因间序列为人序列、小鼠序列或大鼠序列。

在某些方面，本文提供了制备表达本文所述CAR的非人动物(例如，小鼠或大鼠)的方法。在某些实施例中，该方法包括对非人动物进行遗传修饰，使得其生殖系中包含本文所述的CAR基因座。在一些实施例中，该方法包括对非人ES细胞(例如，小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)进行遗传修饰，使得其包含本文所述的CAR基因座。在一些实施例中，该方法包括向非人ES细胞中引入包含有效连接至TCRα恒定区的非重排Ig轻链基因区段(轻链V和J区段)的CAR基因座，并且向非人ES细胞中引入包含有效连接至TCRβ恒定区的非重排Ig重链基因区段(重链V、D和J区段)的CAR基因座。在一些实施例中，该方法包括对非人动物ES细胞的TCRα基因座进行修饰，以包含有效连接至TCRα恒定区的非重排Ig轻链基因区段(轻链V和J区段)，并且对非人动物ES细胞的TCRβ基因座进行修饰，以包含有效连接至TCRβ恒定区的非重排Ig重链基因区段(重链V、D和J区段)。

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含具有Ig重链可变结构域和TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性(参见例如图1)。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。在一些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为啮齿动物恒定结构域(例如，大鼠或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为人恒定结构域。

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含具有Ig重链可变结构域和TCRα恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和TCRβ恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性(参见例如图2)。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。在一些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为啮齿动物恒定结构域(例如，大鼠或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为人恒定结构域。

在某些方面，本文提供了表达本文所述CAR的细胞或非人动物。在一些实施例中，该细胞为T细胞。在一些实施例中，该细胞或动物为人或啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)。在某些实施例中，本文提供了包含本文所述细胞的非人动物(例如，啮齿动物，如大鼠或小鼠)。

在一些方面，本文提供了在受试者中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用表达CAR的细胞(例如，人T细胞，如CD4T细胞或CD8T细胞)，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。

在一些方面，本文提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用表达CAR的细胞(例如，人T细胞，如CD4T细胞或CD8T细胞)，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRα恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRβ恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。

在某些方面，本文提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括从该受试者分离T细胞(例如，CD4T细胞或CD8T细胞)。在一些实施例中，该方法包括诱导T细胞表达CAR，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列的第一载体以及包含编码第二CAR多肽的核酸序列的第二载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列以及编码第二CAR多肽的核酸序列的载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括抑制T细胞表达内源TCRα和/或TCRβ的步骤。

在某些方面，本文提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括从该受试者分离T细胞(例如，CD4T细胞或CD8T细胞)。在一些实施例中，该方法包括诱导T细胞表达CAR，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRα恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRβ恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列的第一载体以及包含编码第二CAR多肽的核酸序列的第二载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列以及编码第二CAR多肽的核酸序列的载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括抑制T细胞表达内源TCRα和/或TCRβ的步骤。

在某些方面，本文提供了一种核酸组合物，该核酸组合物包含编码具有Ig重链可变结构域和TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽的第一核酸序列，以及编码具有Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和TCRα恒定结构域的第二CAR多肽的第二核酸序列，其中包含第一CAR多肽和第二CAR多肽的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在某些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为啮齿动物恒定结构域(例如，大鼠恒定结构域或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为人恒定结构域。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于单一核酸分子上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分别的核酸分子上。

在某些方面，本文提供了一种核酸组合物，该核酸组合物包含编码具有Ig重链可变结构域和TCRα恒定结构域的第一CAR多肽的第一核酸序列，以及编码具有Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和TCRβ恒定结构域的第二CAR多肽的第二核酸序列，其中包含第一CAR多肽和第二CAR多肽的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在某些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为啮齿动物恒定结构域(例如，大鼠恒定结构域或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为人恒定结构域。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于单一核酸分子上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分别的核酸分子上。

在某些方面，本文提供了制备表达CAR的细胞的方法，该方法包括用本文所述核酸组合物转染该细胞。在一些实施例中，该细胞为人细胞。在一些实施例中，该细胞为啮齿动物细胞(例如，大鼠细胞或小鼠细胞)。在一些实施例中，该细胞为T细胞。在一些实施例中，该细胞为离体T细胞。在一些实施例中，本文提供了根据本文所述方法制备的或由本文所述方法可获得的细胞。

在某些方面，本文提供了治疗受试者的疾病或障碍的方法，该方法包括给受试者施用表达本文所述CAR的T细胞。在一些实施例中，所述疾病或障碍为癌，并且CAR对MHC递呈的癌抗原具有结合特异性。在一些实施例中，所述疾病或障碍为传染病，并且CAR对病原体抗原(例如，病毒、细菌或寄生虫抗原)具有结合特异性。在一些实施例中，所述疾病或障碍为自身免疫性和/或炎性疾病，并且CAR对自身免疫性自体抗原具有特异性并由调节性T细胞表达。在一些实施例中，该T细胞为CD4⁺T细胞。在一些实施例中，该T细胞为CD8⁺T细胞。

附图说明

图1示出了本文所述示例性CAR与抗原递呈细胞上的肽/MHC复合体相互作用的示意图。

图2示出了本文所述示例性CAR与抗原递呈细胞上的肽/MHC复合体相互作用的示意图。

图3示出了使用慢病毒载体将人Ig可变区连接至小鼠TCR基因座的示例性方案。该图公开了作为SEQ ID NO:155的“SGSG”。

图4示出了表达CAR的细胞响应于抗原递呈而发生的细胞因子分泌。

图5示出了构建用于将Igκ可变区基因区段插入小鼠内源TCRα基因座中的大靶向载体(LTVEC)的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明(例如，选择盒等)，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。其中指示了某些用于克隆的限制性位点。

图6示出了将Igκ可变区基因区段插入小鼠内源TCRα基因座中的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。其中指示了TAQMAN探针杂交位置。

图7示出了将附加Igκ可变区基因区段插入小鼠内源TCRα基因座中的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。其中指示了TAQMAN探针杂交位置。

图8示出了将附加Igκ可变区基因区段插入小鼠内源TCRα基因座中的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。其中指示了TAQMAN探针杂交位置。

图9示出了将附加Igκ可变区基因区段插入小鼠内源TCRα基因座中的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。其中指示了TAQMAN探针杂交位置。

图10示出了构建用于将Ig重链可变区基因区段插入小鼠内源TCRβ基因座中的LTVEC的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。

图11示出了将Ig重链可变区基因区段插入小鼠内源TCRβ基因座中的示例性方案(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。

图12示出了可用于将Ig重链可变区基因区段插入小鼠内源TCRβ基因座中的示例性LTVEC(未按比例绘制)。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。

图13示出了将Ig重链可变区基因区段插入小鼠内源TCRβ基因座中的方案的示例性方案(未按比例绘制)。步骤4示出了使TCR Vβ31基因区段缺失的任选步骤。除非另外具体指明，否则小鼠序列由实心形状和单线示出，并且人序列由空心形状和双线示出。

图14示出了在转基因小鼠胸腺细胞和脾T细胞中的Igκ/TCRαCAR基因座重排期间的V_κ和J_κ利用率，其中内源TCRα可变区基因座已被替换为非重排Igκ可变区基因区段(4个功能性V_κ和5个功能性J_κ)。IGKV7-3为假基因。

图15示出了三只转基因小鼠的脾T细胞中Igκ/TCRαCAR基因座的有效重排与无效重排的比较，其中内源TCRα可变区基因座已被替换为非重排Igκ可变区基因区段(4个功能性V_κ和5个功能性J_κ)。本文的有效重排(“prod”)包括这样的重排，其中重排的核酸序列可被翻译成蛋白质，该蛋白质具有有效连接的V_κ序列、接着是J_κ序列、然后是TCRα恒定结构域序列。无效重排(“nonprod”)包括这样的重排，其中重排的VκJκ外显子与编码TCRα恒定结构域的核酸序列不同框，或与编码TCRα结构域的序列在同框，但包含终止密码子，因此它们无法被翻译成蛋白质。

图16示出了在转基因小鼠胸腺细胞和脾T细胞中的Igκ/TCRαCAR基因座重排期间的V_κ和J_κ利用率，其中内源TCRα可变区基因座已被替换为非重排Igκ可变区基因区段(16个功能性V_κ和5个功能性J_κ)。

图17示出了转基因小鼠胸腺细胞和脾T细胞中Igκ/TCRαCAR基因座的有效重排与无效重排的比较，其中内源TCRα可变区基因座已被替换为非重排Igκ可变区基因区段(16个功能性V_κ和5个功能性J_κ)。本文的有效重排(“prod”)包括这样的重排，其中重排的核酸序列可被翻译成蛋白质，该蛋白质具有有效连接的V_κ序列、接着是J_κ序列、然后是TCRα恒定结构域序列。无效重排(“nonprod”)包括这样的重排，其中重排的VκJκ外显子与编码TCRα恒定结构域的序列不同框，或与TCRα同框，但包含终止密码子，因此它们无法被翻译成蛋白质。

图18示出了在转基因小鼠胸腺细胞和脾T细胞中的IgH/TCRβCAR基因座重排期间的V_H和J_H利用率，其中内源TCRβ可变区基因座已被替换为非重排IgH可变区基因区段(3个功能性V_H以及所有功能性D和J_H)。

图19示出了转基因小鼠胸腺细胞和脾T细胞中IgH/TCRβCAR基因座的有效重排与无效重排的比较，其中内源TCRβ可变区基因座已被替换为非重排IgH可变区基因区段(3个功能性V_H以及所有功能性D和J_H)。本文的有效重排(“prod”)包括这样的重排，其中重排的核酸序列可被翻译成蛋白质，该蛋白质具有有效连接的V_H序列、接着是D序列、之后是J_H序列、然后是TCRβ恒定结构域序列。无效重排(“nonprod”)包括这样的重排，其中重排的VDJ外显子与编码TCRβ恒定结构域的序列不同框，或与TCRβ在同框，但包含终止密码子，因此它们无法被翻译成蛋白质。

具体实施方式

概述

本文提供了与嵌合抗原受体(CAR)相关的方法和组合物，所述嵌合抗原受体具有来源于免疫球蛋白(Ig)的抗原结合结构域以及来源于T细胞受体(TCR)的恒定结构域。在一些实施例中，CAR对主要组织相容性复合体(MHC)蛋白所递呈的肽具有结合特异性。

抗体已被证明是有价值的治疗剂，这是由于它们能够以高亲和力和特异性结合至靶抗原。现有抗体治疗技术的弱点之一在于难以靶向某些抗原，诸如细胞内抗原，原因在于递送抗体跨过细胞膜时面临挑战。因此，当前抗体治疗剂一般针对胞外抗原(例如，细胞表面蛋白)和可溶性因子(例如，细胞因子)。另一方面，细胞内靶标(包括许多肿瘤抗原和病毒抗原)仍然难以靶向。

可通过使用能够识别主要组织相容性复合体(MHC)蛋白上所递呈的肽抗原的抗体，避免递送抗体跨过细胞膜的挑战。所有有核哺乳动物细胞将内源细胞蛋白加工成肽，这些肽被装载到I类MHC蛋白上并递呈到细胞的表面上。类似地，专职抗原递呈细胞(APC)(例如，树突细胞或巨噬细胞)将外源性抗原加工成肽，这些肽被装载到II类MHC蛋白上并递呈到APC细胞表面上。在胸腺中的T细胞发育期间，T细胞经历阳性和阴性选择，这确保只有那些表达对MHC具有极弱的非肽依赖性亲和力的TCR的少数T细胞在胸腺中出现(阳性选择)，而表达对自体肽/MHC具有中等至高亲和力的TCR的T细胞发生细胞凋亡(阴性选择)。与TCR不同，抗体通常不经历基于MHC的阳性和阴性选择，已证实难以使用常规抗体生成技术来生成对肽/MHC复合体具有特异性的抗体。

如本文所述，在一些实施例中，可使用经遗传修饰的非人动物(例如，小鼠)来生成对肽/MHC复合体具有特异性的可溶性抗原结合分子诸如抗体，所述非人动物经改造而具有表达CAR的T细胞，所述CAR具有Ig可变结构域和TCR恒定结构域。此类非人动物具有来源于有效连接至TCRα和TCRβ恒定区的非重排Ig轻链和重链可变(V(D)J)基因区段的Ig可变结构域，并且在遇到抗原(例如，肽/MHC)时在CAR基因座处会经历V(D)J重排以生成重排的CAR分子，从而在T细胞上进行CAR表达。由于此类T细胞经历阳性和阴性选择，因此所表达的CAR对肽/MHC具有抗原特异性。此类小鼠因此可用于生成能够靶向肽/MHC复合体的抗原结合蛋白。例如，可以用肽/MHC抗原对小鼠进行免疫接种，使得生成抗原特异性T细胞。编码抗原特异性T细胞上所表达的CAR的Ig可变结构域的核酸可以在宿主细胞中有效连接至编码Ig恒定结构域的核酸，使得宿主细胞表达肽/MHC特异性抗体。

定义

词语“一个(种、条)”在本文中用来指一个(种、条)或一个(种、条)以上(即，至少一个(种、条))的该词语所修饰对象。例如，“一个要素”意指一个要素或一个以上要素。

术语“氨基酸”旨在包括所有这样的分子，无论是天然的还是合成的，所述分子同时包含氨基官能团和酸官能团两者并且能够被包含到天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同系物；具有变异侧链的氨基酸类似物；以及上述物质中任一种的全部立体异构体。

如本文所用，术语“抗体”可指完整抗体及其抗原结合片段两者。完整抗体是包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变结构域和重链恒定结构域。每条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域。重链可变结构域和轻链可变结构域可进一步细分为超变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布的更保守区域，称为骨架区(FR)。每个重链可变结构域和轻链可变结构域由三个CDR和四个FR构成，按下列顺序从氨基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变结构域包含会与抗原相互作用的结合结构域。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个保留结合至抗原的能力的片段。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、单链抗体、分离的CDRH3以及其他保留完整抗体的可变结构域的至少一部分的抗体片段。这些抗体片段可使用常规重组和/或酶法技术获得，并且可按与完整抗体相同的方式针对抗原结合进行筛选。

如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含免疫球蛋白抗原结合结构域(例如，免疫球蛋白可变结构域)和T细胞受体(TCR)恒定结构域的抗原结合蛋白。如本文所用，TCR多肽的“恒定结构域”包括近膜TCR恒定结构域，并且还可包括TCR跨膜结构域和/或TCR胞质尾。例如，在一些实施例中，该CAR为包含第一多肽和第二多肽的二聚体，该第一多肽包含连接至TCRβ恒定结构域的免疫球蛋白重链可变结构域，并且该第二多肽包含连接至TCRα恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域(例如，κ或λ可变结构域)。在一些实施例中，该CAR为包含第一多肽和第二多肽的二聚体，该第一多肽包含连接至TCRα恒定结构域的免疫球蛋白重链可变结构域，并且该第二多肽包含连接至TCRβ恒定结构域的免疫球蛋白轻链可变结构域(例如，κ或λ可变结构域)。

短语“来源于”当在“来源于”非重排可变区和/或非重排可变区基因区段的重排可变区基因方面使用时，是指能够将该重排可变区基因的序列追溯到一组非重排可变区基因区段，该组非重排可变区基因区段发生重排而形成表达该可变结构域的基因(在适用时，考虑到剪接差异和体细胞突变)。例如，已经历体细胞突变的重排可变区基因仍然来源于非重排可变区基因区段。在一些实施例中，在内源基因座被替换为通用轻链或重链基因座的情况下，术语“来源于”指示能够将该序列的来源追溯到所述重排基因座，即便该序列可能已经历体细胞突变。

如本文所用，术语“基因座”是指染色体上包含一组相关遗传元件(例如，基因、基因区段、调节元件)的位置。例如，非重排免疫球蛋白基因座可包含免疫球蛋白可变区基因区段、一种或多种免疫球蛋白恒定区基因以及引导V(D)J重组和免疫球蛋白表达的相关调节元件(例如，启动子、增强子、开关元件等)。类似地，非重排CAR基因座可包含免疫球蛋白可变区基因区段、TCR恒定区基因以及引导V(D)J重组和CAR表达的相关调节元件(例如，启动子、增强子等)。基因座可为内源或非内源的。术语“内源基因座”是指染色体上天然存在特定遗传元件的位置。例如，内源小鼠TCRα基因座是指小鼠染色体14上包含野生型小鼠TCRα可变区基因区段和恒定区基因的位置，而内源小鼠TCRβ基因座是指小鼠染色体6上包含野生型小鼠TCRβ可变区基因区段和恒定区基因的位置。

如果非重排可变区基因区段能够重排以形成重排可变区基因，该重排可变区基因与恒定区基因一起被表达为抗原结合蛋白的多肽链，则非重排可变区基因区段“有效连接”至相邻的恒定区基因。例如，在CAR基因座中，非重排免疫球蛋白可变区基因区段有效连接至TCR恒定区基因。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合物形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析界定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。多核苷酸可以被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合来修饰。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸可与T核苷酸互换。

如本文所用，“特异性结合”和“抗原特异性”是指抗原结合分子(例如，抗体或CAR)能够结合至预定靶标，例如预定肽/MHC复合体。通常，抗原结合分子以对应于约10^-7M或更小的K_D的亲和力特异性地结合至其预定靶标，并且以比其结合至非特异性和非相关靶标(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍的亲和力(如由K_D表示)结合至预定靶标。

术语“非重排”包括免疫球蛋白、TCR或CAR可变区基因座或可变区基因区段的状态，其中V基因区段和J基因区段(对于重链或TCRβ可变区、D基因区段也一样)被单独地保留，但能够接合以形成包含V(D)J组库(repertoire)的单个V,(D),J的重排V(D)J基因(“可变区基因”)。

嵌合抗原受体基因座

在某些方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)基因座。此类CAR基因座一般包含可变区基因座和恒定区基因座。可变区基因座包含非重排Ig可变区基因区段，而恒定区基因座包含TCR恒定区基因，其中Ig可变区基因区段有效连接至恒定区基因。在一些实施例中，可变区将为非重排可变区，并将因此包含非重排Ig可变区基因区段。在一些实施例中，可变区将为重排可变区，并将因此包含重排可变区基因。在某些实施例中，Ig可变区基因区段为人可变区基因区段，并且TCR恒定区基因为非人恒定区基因。例如，在一些实施例中，TCR恒定区基因为啮齿动物恒定区基因，诸如大鼠恒定区基因或小鼠恒定区基因。在某些实施例中，Ig可变区基因区段为人可变区基因区段，并且TCR恒定区基因为人恒定区基因。

在一些实施例中，本文所述CAR基因座位于内源TCR基因座处。例如，在一些实施例中，包含TCRα恒定区基因的CAR基因座位于内源TCRα恒定区基因座处。在一些实施例中，通过将TCRα非重排可变区的一些或全部替换为非重排Ig可变区来构建这种基因座。在一些实施例中，包含TCRβ恒定区基因的CAR基因座位于内源TCRβ恒定区基因座处。在一些实施例中，通过将TCRβ非重排可变区的一些或全部替换为非重排Ig可变区来构建这种基因座。用于构建示例性CAR基因座的方法在本文实例2中提供。

在某些实施例中，CAR可变区基因座将包含非重排人Ig可变区基因区段。本领域已描述了包含人可变区基因区段的示例性可变区基因座。例如，此类基因座在美国专利No.5,770,429、No.5,814,318、No.6,114,598、No.6,998,514、No.8,232,449、No.8,502,018和No.8,697,940中有描述，这些专利中的每一篇均据此以引用方式并入，并且此类基因座在美国专利公布No.2008/0098490、No.2012/0167237、No.2013/0145484、No.2013/0326647、No.2014/013275和No.2014/093908中有描述，这些专利公布中的每一篇均据此以引用方式并入。

在某些实施例中，CAR可变区基因座包含非重排人Ig重链可变区基因区段。在一些实施例中，非重排人Ig可变区基因区段包含多个人V_H区段、一个或多个人D_H区段以及一个或多个人J_H区段。在一些实施例中，非重排人Ig可变区基因区段包含至少3个V_H基因区段、至少18个V_H基因区段、至少20个V_H基因区段、至少30个V_H基因区段、至少40个V_H基因区段、至少50个V_H基因区段、至少60个V_H基因区段、至少70个V_H基因区段或至少80个V_H基因区段。在一些实施例中，非重排人Ig基因区段包含全部人D_H基因区段。在一些实施例中，CAR可变区还包含TCRβ可变区基因区段(例如，V、D和/或J基因区段)。在一个实施例中，CAR可变区还包含远侧TCR Vβ基因区段，例如TCR Vβ31基因区段。在另一个实施例中，远侧TCR Vβ基因区段(例如TCR Vβ31基因区段)已功能性地失活或缺失。在一些实施例中，非重排人Ig基因区段包含全部人J_H基因区段。包含Ig重链基因区段的示例性可变区例如在Macdonald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:5147-52(Macdonald等人，《美国国家科学院院刊》，第111卷，第5147-5152页)及补充信息中提供，该文献据此以引用方式并入。

在一些实施例中，包含非重排人Ig重链可变区基因区段的CAR可变基因座还包含人Ig重链可变区基因间序列。在一些实施例中，CAR可变基因座包含非人(例如，啮齿动物、大鼠、小鼠)Ig重链可变区基因间序列。在一些实施例中，CAR可变基因座包含人或非人(例如，啮齿动物、大鼠、小鼠)TCRβ可变区基因间序列。例如，在一些实施例中，CAR基因座的非重排可变区包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)胰蛋白酶原(TRY)基因(例如，通常存在于TCRβ可变区基因座中的TRY基因和/或假基因)。在一些实施例中，TRY基因为小鼠TRY基因。在一些实施例中，小鼠TRY基因选自Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19和Try20。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V_H区段的上游。在一些实施例中，一种或多种TRY基因位于非重排可变区的V_H区段的下游以及D_H区段的上游。在一些实施例中，Try1-7位于非重排可变区的V_H区段的上游，并且Try8-20位于非重排可变区的V_H区段的下游以及D_H区段的上游。有关位于人和/或小鼠TCRβ基因座中的TRY基因的另外信息在Glusman et al.,Immunity 15:337-349(2001)(Glusman等人，《免疫》，第15卷，第337-349页，2001年)和Skok et al.,Nature Immunology 8:378-387(2007)(Skok等人，《自然免疫学》，第8卷，第378-387页，2007年)中提供，所述文献中的每一篇均以引用方式并入。在一些实施例中，CAR基因座包含非人调节元件(例如，非人启动子和/或增强子)。在一些实施例中，非人调节元件为啮齿动物调节元件(例如，大鼠或小鼠启动子或增强子)。在一些实施例中，CAR基因座包含IgM增强子(Eμ)。在一些实施例中，IgM增强子为非人Eμ(例如，啮齿动物Eμ，如小鼠或大鼠Eμ)。

在某些实施例中，CAR可变区基因座包含非重排人Igκ可变区基因区段。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含多个人V_κ区段以及一个或多个人J_κ区段。在一些实施例中，免疫球蛋白可变区基因区段包含四个功能性V_κ区段和全部人J_κ区段。在一些实施例中，免疫球蛋白可变区基因区段包含16个功能性V_κ区段和全部人J_κ区段。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含全部人Vκ区段和全部人J_κ区段。包含Igκ基因区段的示例性可变区例如在Macdonald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA111:5147-52(Macdonald等人，《美国国家科学院院刊》，第111卷，第5147-5152页)及补充信息中提供，该文献据此以引用方式并入。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含全部人Jκ区段。在一些实施例中，CAR可变区还包含TCRα可变区基因区段(例如，V和/或J基因区段)。

在某些实施例中，CAR可变区基因座包含非重排人Igλ可变区基因区段。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含多个人V_λ区段以及一个或多个人J_λ区段。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含全部人V_λ区段。在一些实施例中，非重排人免疫球蛋白可变区基因区段包含全部人J_λ区段。在一些实施例中，CAR可变区还包含TCRα可变区基因区段(例如，V和/或J基因区段)。包含Igλ基因区段的示例性可变区例如在美国专利公布No.2012/0073004和No.2002/0088016中提供，这些专利公布中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，包含非重排人Ig轻链可变区基因区段的CAR可变基因座还包含人Ig轻链可变区基因间序列(例如，κ可变区基因间序列和/或λ可变区基因间序列)。在一些实施例中，CAR可变基因座包含非人(例如，啮齿动物、大鼠、小鼠)Ig轻链可变区基因间序列(例如，κ可变区基因间序列和/或λ可变区基因间序列)。在一些实施例中，CAR可变基因座包含人或非人(例如，啮齿动物、大鼠、小鼠)TCRα可变区基因间序列。在一些实施例中，CAR基因座包含非人调节元件(例如，非人启动子和/或增强子)。在一些实施例中，非人调节元件为啮齿动物调节元件(例如，大鼠或小鼠启动子或增强子)。

在一些实施例中，CAR可变区基因座为包含Ig重链可变区基因(通用重链可变区)的重排可变区基因座。在一些实施例中，重排Ig重链可变区基因为人重排Ig重链可变区基因。通用重链可变区的使用有利于双特异性抗体的生成，其中至少一个抗原结合结构域对肽/MHC复合体具有特异性。示例性重排Ig重链可变区在美国专利公布No.2014/0245468中提供，该专利公布据此以引用方式并入。

在一些实施例中，CAR可变区基因座为包含Ig轻链可变区基因(通用轻链可变区)的重排可变区基因座。在一些实施例中，重排Ig轻链可变区基因为人重排Ig轻链可变区基因。通用轻链可变区的使用有利于双特异性抗体的生成，其中至少一个抗原结合结构域对肽/MHC复合体具有结合特异性。示例性重排Ig重链可变区在美国专利公布No.2013/0185821中提供，该专利公布据此以引用方式并入。

在某些实施例中，CAR恒定区基因座包含TCRα或TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，CAR恒定区基因座还包含免疫球蛋白调节序列(例如，人或内源物种来源的调节序列)。在一些实施例中，CAR恒定区基因座包含位于TCRβC2上游的小鼠或大鼠IgM增强子(Eμ)。在一些实施例中，TCR恒定区基因还包含Ig恒定区序列。例如，在一些实施例中，CAR恒定区基因座包含TCRβ恒定区基因，该TCRβ恒定区基因包含编码Ig重链CH1结构域的核酸序列。在一些实施例中，CAR恒定区基因座包含TCRα恒定区基因，该TCRα恒定区基因包含编码Igλ或Igκ恒定区或其一部分的核酸序列。

人源化MHC

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化MHC I类α链多肽(例如，人源化HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和/或HLA-L)的基因座。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC I类α链多肽包含人胞外结构域(例如，人α1、α2和α3结构域)和内源物种来源的细胞质结构域。人源化MHC I类α链多肽、编码人源化MHC I类α链多肽的基因座以及表达人源化MHC I类α链多肽的非人动物在美国专利公布No.2013/0111617、No.2013/0185819和No.2014/0245467中有描述，这些专利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座。人源化β-2-微球蛋白多肽、编码人源化β-2-微球蛋白多肽的基因座以及表达人源化β-2-微球蛋白多肽的非人动物在美国专利公布No.2013/0111617和No.2013/0185819中有描述，这些专利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化MHC II类α链多肽(例如，人源化HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和/或HLA-DRA)的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC II类α链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。人源化MHC II类α链多肽、编码人源化MHC II类α链多肽的基因座以及表达人源化MHC II类α链多肽的非人动物在美国专利No.8,847,005和No.9,043,996以及美国专利公布No.2014/0245467中有描述，这些专利和专利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化MHC II类β链多肽(例如，人源化HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和/或HLA-DRB)的基因座。在一些实施例中，人源化MHC II类β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化MHC II类β链多肽包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。人源化MHC II类β链多肽、编码人源化MHC II类β链多肽的基因座以及表达人源化MHC II类β链多肽的非人动物在美国专利No.8,847,005和No.9,043,996以及美国专利公布No.2014/0245467中有描述，这些专利和专利公布中的每一篇均以引用方式并入本文。

包含CAR基因座和人源化MHC I和/或MHC II(MHC IIα/IIβ)基因座的经遗传修饰的非人动物可通过使用常规方法进行培育而生成；另选地，它们可通过以下方式生成：在已经包含一个或多个经基因工程改造的基因座(例如，CAR基因座)的ES细胞中进行同源重组，并且由所述ES细胞生成非人动物。

人源化CD4和CD8受体

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化CD8α链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8α链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。人源化CD8α链多肽、编码人源化CD8α链多肽的基因座以及表达人源化CD8α链多肽的非人动物在美国专利公布No.2014/0245466中有描述，该专利公布以引用方式并入本文。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化CD8β链多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD8β链多肽包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。人源化CD8β链多肽、编码人源化CD8β链多肽的基因座以及表达人源化CD8β链多肽的非人动物在美国专利公布No.2014/0245466中有描述，该专利公布以引用方式并入本文。

在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物和ES细胞表达和/或在其基因组中包含编码人源化CD4多肽的基因座。在一些实施例中，人源化CD4多肽为全人源的。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含至少一个人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含至少人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域和人D3免疫球蛋白结构域，以及内源物种来源的细胞质结构域。在一些实施例中，人源化CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域以及内源物种来源的细胞质结构域。人源化CD4多肽、编码人源化CD4多肽的基因座以及表达人源化CD4多肽的非人动物在美国专利公布No.2014/0245466中有描述，该专利公布以引用方式并入本文。

包含CAR基因座和人源化CD4和/或CD8(CD8α/CD8β)基因座的经遗传修饰的非人动物可通过使用常规方法进行培育而生成；另选地，它们可通过以下方式生成：在已经包含一个或多个经基因工程改造的基因座(例如，CAR基因座)的ES细胞中进行同源重组，并且由所述ES细胞生成非人动物。

经遗传修饰的非人动物和ES细胞

在某些方面，本文提供了表达CAR和/或CAR肽的经遗传修饰的非人动物，以及可用于制备此类非人动物的经遗传修饰的非人动物ES细胞。

在某些方面，本文提供了在其生殖系和/或基因组中包含本文所述CAR基因座的经遗传修饰的非人动物和非人动物ES细胞。在一些实施例中，非人动物或ES细胞在其生殖系和/或基因组中包含两个CAR基因座。在一些实施例中，一个基因座包含TCRα恒定区基因，另一个基因座包含TCRβ恒定区基因。在一些实施例中，CAR基因座位于内源TCR基因座处。

在一些实施例中，非人动物可为任何非人动物。在一些实施例中，非人动物为脊椎动物。在一些实施例中，非人动物为哺乳动物。在一些实施例中，本文所述经遗传修饰的非人动物可选自小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、美洲驼、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)。对于不易获得合适的可遗传修饰的ES细胞的非人动物而言，可采用其他方法制备包含本文所述遗传修饰的非人动物。此类方法包括例如对非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导多能细胞)进行修饰并采用核移植将经修饰的基因组转移到合适的细胞，例如卵母细胞，并且在合适的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。

在一些实施例中，非人动物为哺乳动物。在一些实施例中，非人动物为例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施例中，非人动物为啮齿动物。在某些实施例中，啮齿动物为小鼠、大鼠或仓鼠。在一些实施例中，啮齿动物选自鼠总科。在一些实施例中，非人动物来自选自下列的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(例如，真小鼠和大鼠(true mice and rats)、沙鼠、非洲刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(例如，攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马岛鼠(Malagasy rats and mice))、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)以及鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹形鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施例中，啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和冠鼠。在一些实施例中，小鼠来自鼠科的成员。在一些实施例中，非人动物为啮齿动物。在一些实施例中，啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施例中，非人动物为小鼠。

在一些实施例中，非人动物为C57BL品系的小鼠。在一些实施例中，C57BL品系选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在一些实施例中，非人动物为129品系的小鼠。在一些实施例中，129品系选自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2品系。在一些实施例中，经遗传修饰的小鼠为129品系与C57BL品系的混合型。在一些实施例中，小鼠为129品系的混合型和/或C57BL/6品系的混合型。在一些实施例中，该混合型的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施例中，小鼠为BALB品系(例如，BALB/c)。在一些实施例中，小鼠为BALB品系与另一品系(例如，C57BL品系和/或129品系)的混合型。在一些实施例中，本文所提供的非人动物可以是来源于上述品系的任何组合的小鼠。

在一些实施例中，本文所提供的非人动物为大鼠。在一些实施例中，大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一些实施例中，大鼠品系为选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti中的两种或更多种品系的混合型。

在某些实施例中，经遗传修饰的非人动物或ES细胞在其基因组和/或生殖系中包含CAR基因座、人源化MHC I类α链基因座、人源化β-2-微球蛋白基因座、人源化MHC II类α链基因座、人源化MHC II类β链基因座、人源化CD8α链基因座、人源化CD8β链基因座和/或人源化CD4基因座。在一些实施例中，人源化MHC I类α链基因座位于内源MHC I类α链基因座处。在某个实施例中，人源化β-2-微球蛋白基因座位于内源β-2-微球蛋白基因座处。在一些实施例中，人源化MHC II类α链基因座位于内源MHC II类α链基因座处。在一些实施例中，人源化MHC II类β链基因座位于内源MHC II类β链基因座处。在一些实施例中，人源化CD8α链基因座位于内源CD8α链基因座处。在一些实施例中，人源化CD8β链基因座位于内源CD8β链基因座处。在一些实施例中，人源化CD4基因座位于内源CD4基因座处。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物不表达内源MHC I类α链多肽、内源β-2-微球蛋白多肽、内源MHC II类α链多肽、内源MHC II类β链多肽、内源CD8α链多肽、内源CD8β链多肽和/或内源CD4多肽。此类动物在例如美国专利公布No.2013/0111617、No.2013/0185819、No.2014/0245466和No.2014/0245467以及美国专利No.8,847,005和No.9,043,996中有描述，这些专利公布和专利中的每一篇均以引用方式并入本文。

在某些方面，经遗传修饰的非人动物表达本文所述的CAR多肽。在一些实施例中，经遗传修饰的非人动物表达包含两种CAR多肽的CAR。在某些实施例中，CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，CAR在非人动物的T细胞(例如，CD4T细胞或CD8T细胞)上表达。在一些实施例中，非人动物不表达αβTCR。在一些实施例中，表达CAR的T细胞在T细胞发育期间经历阳性选择。在一些实施例中，表达CAR的T细胞在T细胞发育期间经历阴性选择。

经遗传修饰的非人动物和ES细胞可使用本领域已知的任何适当方法生成。例如，此类经遗传修饰的非人动物ES细胞可使用技术生成，该技术在美国专利No.6,586,251、No.6,596,541、No.7,105,348以及Valenzuela et al.(2003)“High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis”Nat.Biotech.21(6):652-659(Valenzuela等人，2003年，“与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造”，《自然生物技术》，第21卷，第6期，第652-659页)中有描述，这些专利和文献均据此以引用方式并入。还可使用基因组靶向核酸酶系统诸如CRISPR/Cas系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)系统或锌指核酸酶(ZFN)系统进行修饰。在一些实施例中，使用CRISPR/Cas系统进行修饰，如例如在美国专利申请No.14/314,866、No.14/515,503、No.14/747,461和No.14/731,914中所述，这些专利申请中的每一篇均以引用方式并入。在一些实施例中，通过一系列靶向事件将可变区基因区段连续添加到CAR基因座，其中将大靶向载体一个接一个地依次添加到扩展的CAR基因座。在一些实施例中，将多个大靶向载体(例如，两个或更多个)在单个靶向事件(例如，双重靶向事件)中同时并入到CAR基因座中。制备此类经遗传修饰的非人动物和ES细胞的示例性方法在本文实例2中提供。

本文所述ES细胞可然后用于利用本领域已知的方法来生成非人动物。例如，本文所述小鼠非人动物ES细胞可用于利用方法来生成经遗传修饰的小鼠，如美国专利No.7,294,754和Poueymirou et al.,Nature Biotech 25:91-99(2007)(Poueymirou等人，《自然生物技术》，第25卷，第91-99页，2007年)中所述，所述专利和文献中的每一篇均据此以引用方式并入。可将所得小鼠培育成纯合性。

使用经遗传修饰的非人动物的方法

可在任何可能用得上表达CAR的动物的方法中使用本文所述经遗传修饰的非人动物。例如，此类非人动物可用于制备CAR，制备表达CAR的T细胞，制备表达CAR的T细胞杂交瘤，制备编码重排Ig可变区的核酸，以及制备抗体或抗体片段。

在某些实施例中，本文所述方法包括对转基因非人动物进行免疫接种，以诱导对肽/MHC复合体的T细胞免疫应答。在一些实施例中，使本文所述经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原，使得该肽递呈在该非人动物的MHC上。

在一些实施例中，可以使用任何这样的方法：使本文所述经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原，使得该肽递呈在该非人动物的MHC上，从而在该动物中诱导对该肽的T细胞应答。

在一些实施例中，其上递呈肽的MHC为I类MHC。在一些实施例中，I类MHC为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施例中，该肽的长度为8-10个氨基酸。

在一些实施例中，其上递呈肽的MHC为II类MHC。在一些实施例中，II类MHC为HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。在一些实施例中，该肽的长度为10-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为13-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为15-18个氨基酸。

在一些实施例中，该肽包含癌相关抗原的表位。癌相关抗原的例子包括但不限于亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-联蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、肌球蛋白I类、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、生存素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施例中，该抗原为新抗原。

在某个实施例中，该肽包含由传染性病原体表达的抗原的表位。在一些实施例中，病原体为病毒、细菌、真菌、蠕虫或原虫。例如，在一些实施例中，病毒为HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2，以及流感病毒。在一些实施例中，寄生虫为疟原虫。在一些实施例中，病原体为曲霉、布鲁线虫、念珠菌、衣原体、球虫、隐球菌、恶丝虫、淋球菌、组织胞浆菌、利什曼原虫、分枝杆菌、支原体、草履虫、百日咳菌、疟原虫、肺炎球菌、肺囊虫、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、弓形虫和霍乱弧菌。示例性物种包括淋病奈瑟氏菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、热带念珠菌、阴道毛滴虫、阴道嗜血杆菌、B族链球菌、人型支原体、杜氏嗜血菌、腹股沟肉芽肿、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、流产布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、胎儿弯曲菌、胎儿弯曲菌肠亚种、波蒙纳钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、绵羊布鲁氏菌、鹦鹉热衣原体、胎儿三毛滴虫、刚地弓形虫、大肠杆菌、马放线杆菌、绵羊流产沙门菌、马流产沙门菌、铜绿假单胞菌、马棒状杆菌、化脓棒状杆菌、精液放线杆菌、牛生殖道支原体、烟曲霉、分枝犁头霉、马媾疫锥虫、驽巴贝斯虫、破伤风梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原体，例如恶性疟原虫。

在一些实施例中，所述肽包含这样的蛋白的表位，该蛋白是炎性疾病、皮肤或器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫疾病中的自身反应性T细胞的靶标。自身免疫疾病的例子包括例如肾小球肾炎、关节炎、扩张性心肌病样疾病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、克罗恩病、系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、变应性接触性皮炎、多肌炎、厚皮、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常性白斑、胰岛素依赖性糖尿病、白塞病、桥本病、爱迪生氏病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、不育症、慢性活动性肝炎、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血、活动性慢性肝炎、爱迪生氏病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状狼疮、红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、桥本甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖性糖尿病、兰伯特-伊顿综合征、类狼疮肝炎、淋巴细胞减少症的一些病例、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎、结节性多动脉炎、自身免疫性多腺体综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺氏综合征、复发性多软骨炎、施密特氏综合征、局限性硬皮病(或crest综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎和韦格纳氏肉芽肿。自身反应性T细胞所靶向的示例性蛋白质包括例如p205、胰岛素、促甲状腺激素、酪氨酸酶、TRP1和髓磷脂。

在一些实施例中，通过给非人动物施用包含编码该肽的核酸序列的病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒或慢病毒)，而使经遗传修饰的非人动物暴露于该肽。用于病毒疫苗接种的方法例如在美国专利No.6,001,349、No.8,663,622、No.8,691,502、No.8,377,688以及Precopio et al.,JEM 204:1405-1416(2007)(Precopio等人，《实验医学杂志》，第204卷，第1405-1416页，2007年)中提供，这些专利和文献中的每一篇均据此全文以引用方式并入。在一些实施例中，直接向非人动物施用病毒，使得非人动物加工抗原并将抗原递呈在其MHC上。在一些实施例中，以体外或离体方式用病毒感染细胞(例如，抗原递呈细胞，如树突细胞)，然后给非人动物施用该细胞。在一些实施例中，该病毒编码肽/MHC复合体(例如，单链肽/MHC复合体)。基于单链肽/MHC的疫苗的例子在Truscott et al.,J.Immunol.178:6280-6289(2007)(Truscott等人，《免疫学杂志》，第178卷，第6280-6289页，2007年)、EP1773383、Kim et al.,Vaccine30:2178-2186(2012)(Kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186页，2012年)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423-4430(2010)(Kim等人，《免疫学杂志》，第184卷，第4423-4430页，2010年)中提供，这些文献和专利中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，通过给经遗传修饰的非人动物施用编码该肽的核酸，使得该肽在该非人动物中表达，而使该动物暴露于该肽。在一些实施例中，给非人动物施用编码单链肽/MHC复合体的核酸。基于单链肽/MHC的疫苗的例子在Truscott et al.,J.Immunol.178:6280-6289(2007)(Truscott等人，《免疫学杂志》，第178卷，第6280-6289页，2007年)、EP1773383、Kim et al.,Vaccine 30:2178-2186(2012)(Kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186页，2012年)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423-4430(2010)(Kim等人，《免疫学杂志》，第184卷，第4423-4430页，2010年)中提供，这些文献和专利中的每一篇均据此以引用方式并入。在某些实施例中，该核酸为DNA载体。核酸的递送可采用本领域已知的任何技术，包括病毒介导的基因转移和脂质体介导的基因转移。目标多核苷酸与脂质体相结合而形成基因递送媒介，如在例如美国专利No.6,770,291、No.7,001,614、No.6,749,863、No.5,512,295和No.7,112,338中所述，这些专利中的每一篇均据此以引用方式并入。在一些实施例中，该核酸为mRNA载体。用于生成和施用mRNA载体的示例性方法在例如美国专利No.8,278,036和美国专利公布No.2013/151736和No.2012/135805中所述，这些专利公布中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，通过给经遗传修饰的非人动物施用肽/MHC复合体，而使经遗传修饰的非人动物暴露于该肽。在一些实施例中，给非人动物施用单链肽/MHC复合体(例如，单链胞外MHC/β-2-微球蛋白/肽蛋白复合体)。在一些实施例中，肽/MHC复合体作为多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体)施用。在一些实施例中，肽/MHC复合体存在于细胞的表面上。用于生成和施用肽/MHC复合体的示例性方法在美国专利No.6,045,796、No.5,869,270和No.7,141,656、Truscott et al.,J.Immunol.178:6280-6289(2007)(Truscott等人，《免疫学杂志》，第178卷，第6280-6289页，2007年)、EP1773383、Kim et al.,Vaccine 30:2178-2186(2012)(Kim等人，《疫苗》，第30卷，第2178-2186页，2012年)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423-4430(2010)(Kim等人，《免疫学杂志》，第184卷，第4423-4430页，2010年)以及Livingstone Methods:A Companion to Methods in Enzymology 9:422-429(1996)(Livingstone，《方法：酶学方法指南》，第9卷，第422-429页，1996年)中提供，这些专利和文献中的每一篇均据此以引用方式并入。

在本文所述方法的一些实施例中，该方法包括从经遗传修饰的非人动物获得表达对肽/MHC复合体具有特异性的CAR的T细胞的步骤。在某些实施例中，可使用本领域已知的任何方法来获得此类T细胞。例如，可从动物的脾、淋巴结和/或外周血获得此类T细胞。可使用本领域中可用的方法针对结合特异性来筛选此类T细胞。例如，可使用上样于固相载体(诸如管柱或微珠如磁珠)上的肽/MHC复合体，来纯化表达对特定肽/MHC复合体具有特异性的CAR的细胞，或者可使用标记的肽/MHC对此类T细胞进行染色，然后可使用荧光激活细胞分选(FACS)和/或磁激活细胞分选(MACS)进行纯化。

在一些实施例中，本文所述方法包括由T细胞制备T细胞杂交瘤的步骤。可用于制备T细胞杂交瘤的方法是本领域已知的，并且例如在Hedrick et al.,Cell 30:141-152(1982)(Hedrick等人，《细胞》，第30卷，第141-152页，1982年)和KruisbeekCurr.Protoc.Immunol.Chapter 3(2001)(Kruisbeek，《免疫学实验室指南》，第3章，2001年)以及White et al.,Methods in Molecular Biology 134:185-193(2000)(White等人，《分子生物学方法》，第134卷，第185-193页，2000年)中有描述，这些文献中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，本文所提供的方法包括从T细胞分离编码CAR的Ig可变结构域的核酸的步骤。在本文所述方法的一些实施例中，可使用任何方法来分离编码Ig可变结构域的核酸。

在一些实施例中，分离核酸的步骤包括由T细胞制备T细胞杂交瘤并且从该T细胞杂交瘤分离核酸。在一些实施例中，使用核酸扩增方法分离核酸。例如，在一些实施例中，核酸扩增方法为聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、基于Qβ复制酶的扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、修复链反应(RCR)、自返式DNA扩增(boomerang DNA amplification,BDA)或滚环扩增(RCA)。

在一些实施例中，通过对T细胞或T细胞杂交瘤的CAR基因座中的重排Ig可变区基因进行测序并合成包含该重排Ig可变区基因的核酸序列来分离核酸。示例性核酸测序方法包括但不限于链终止测序、连接测序、边合成边测序、焦磷酸测序、离子半导体测序、单分子实时测序、454测序和/或Dilute-‘N’-Go测序。

一旦获得编码重链和轻链Ig可变区区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术进一步对这些DNA片段进行操纵，例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因、转变为Fab片段基因或转变为scFv基因。在这些操纵中，编码可变结构域的DNA片段有效连接至编码另一种蛋白(例如，抗体恒定结构域或柔性接头)的另一DNA片段。如该语境中所用，术语“有效连接”旨在意指这两个DNA片段接合在一起，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。

可通过将编码重链可变结构域的分离DNA有效连接至编码重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子，而将编码重链可变结构域的分离DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A。等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定结构域可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定结构域，但最优选地为IgG1或IgG4恒定结构域。对于Fab片段重链基因而言，编码V_H的DNA可有效连接至仅编码重链CH1恒定结构域的另一DNA分子。

可通过将编码轻链Ig可变结构域的分离DNA有效连接至编码轻链恒定结构域(例如，κ或λ恒定结构域)的另一DNA分子，而将编码轻链Ig可变结构域的分离DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A.等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。

因此，在一些实施例中，本文所述方法包括将编码重链Ig可变结构域的核酸序列与编码重链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得宿主细胞表达包含Ig重链可变结构域和Ig重链恒定结构域的Ig重链多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码轻链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得宿主细胞表达包含Ig轻链可变结构域和Ig重链恒定结构域的Ig轻链多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码重链Ig可变结构域的核酸序列与编码重链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，并且将编码轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码轻链Ig恒定结构域的核酸序列在宿主细胞中有效连接，使得宿主细胞表达这样的抗体的步骤，该抗体具有包含重链Ig可变结构域和重链Ig恒定结构域的重链以及包含轻链Ig可变结构域和轻链Ig恒定结构域的轻链。可使用本领域熟知的标准分子生物技术使Ig可变区与Ig恒定区相连。在一些实施例中，可使用任何能够表达免疫球蛋白多肽的宿主细胞。在一些实施例中，该细胞为CHO细胞、HEK-293细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞或Vero细胞。

在一些实施例中，本文所提供的方法包括将编码重链Ig可变结构域的核酸序列与编码TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)的核酸序列在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，使得该细胞表达包含Ig重链可变结构域和TCR恒定结构域的CAR多肽的步骤。在一些实施例中，该方法包括将编码轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)的核酸序列在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，使得该细胞表达包含Ig轻链可变结构域和TCR恒定结构域的CAR多肽。在一些实施例中，该方法包括将编码重链Ig可变结构域的核酸序列与第一TCR恒定结构域(例如，TCRβ恒定结构域或TCRα恒定结构域)在细胞(例如，人细胞，如人T细胞)中有效连接，并且将编码轻链Ig可变结构域的核酸序列与编码第二TCR恒定结构域(例如，如果第一TCR恒定结构域为TCRα恒定结构域，则其为TCRβ恒定结构域，或者如果第一TCR恒定结构域为TCRβ恒定结构域，则其为TCRα恒定结构域)的核酸序列在该细胞中有效连接，使得该细胞表达这样的CAR，该CAR具有包含重链Ig可变结构域和第一TCR恒定结构域的第一CAR链多肽以及包含轻链Ig可变结构域和第二TCR恒定结构域的第二CAR多肽。在一些实施例中，TCR恒定结构域为人TCR恒定结构域。可使用本领域熟知的标准分子生物技术使Ig可变区与TCR恒定区相连。在一些实施例中，该细胞为从受试者分离的离体细胞(例如，离体人细胞，如离体人T细胞)。

抗体

在某些方面，本文提供了对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体或肽/II类MHC复合体)具有结合特异性的抗体。在一些实施例中，所述抗体为全人源的。在一些实施例中，根据本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的CAR基因座的非人动物)可获得和/或获得CAR。

在某些实施例中，本文所提供的抗体和抗体片段能够以不大于10^-6、10^-7、10^-8或10^-9M的解离常数特异性地结合肽/MHC复合体。在一些实施例中，抗体对肽/MHC复合体的结合亲和力(如由K_D表示)比在相同MHC蛋白递呈无关肽时抗体对肽的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。用于评价抗体的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹和RIA。也可通过本领域已知的标准测定法，诸如通过Biacore分析，评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。

在一些实施例中，抗体对肽/MHC I类复合体具有特异性。在一些实施例中，MHC I类为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施例中，肽的长度为8-10个氨基酸。

在一些实施例中，抗体对肽/MHC I类复合体具有特异性。在一些实施例中，MHC II类为HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。在一些实施例中，该肽的长度为10-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为13-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为15-18个氨基酸。

在一些实施例中，该肽包含这样的蛋白的表位，该蛋白是炎性疾病、皮肤或器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫疾病中的自身反应性T细胞的靶标。自身免疫疾病的例子包括例如肾小球肾炎、关节炎、扩张性心肌病样疾病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、克罗恩病、系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、变应性接触性皮炎、多肌炎、厚皮、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常性白斑、胰岛素依赖性糖尿病、白塞病、桥本病、爱迪生氏病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、不育症、慢性活动性肝炎、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血、活动性慢性肝炎、爱迪生氏病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状狼疮、红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、桥本甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖性糖尿病、兰伯特-伊顿综合征、类狼疮肝炎、淋巴细胞减少症的一些病例、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎、结节性多动脉炎、自身免疫性多腺体综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺氏综合征、复发性多软骨炎、施密特氏综合征、局限性硬皮病(或crest综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎和韦格纳氏肉芽肿。自身反应性T细胞所靶向的示例性蛋白质包括例如p205、胰岛素、促甲状腺激素、酪氨酸酶、TRP1和髓磷脂。

在一些实施例中，本文所提供的抗体包含人重链可变结构域。在一些实施例中，该抗体包含人重链恒定结构域。在一些实施例中，本文所提供的抗体包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定结构域。人重链恒定结构域的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A.等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))。在一些实施例中，本文所提供的抗体不含重链恒定结构域或其一部分。

在一些实施例中，本文所提供的抗体包含经修饰的Fc结构域(例如，改变Fc与Fc受体之间的相互作用的突变)。例如，在一些实施例中，本文所提供的抗体包含在位置235、236、237、239、265、267、268、269、270、298、326、327、330、332、350、351、366、392、394、405和/或407(使用EU编号系统)处对其Fc结构域的修饰。在一些实施例中，所述修饰选自L235A、G236E、G237F、S239E、S239D、D265E、D265S、S267E、S267D、S267G、H268E、H268D、E269L、D270N、D270E、S298A、K326A、K326D、A327H、A327V、A327L、A330I、A330S、I332E、T350V、L351Y、T366L、K392M、K392L、T394W、F405A和/或Y407V(使用EU编号系统)。在一些实施例中，所述抗体包含对其Fc结构域的多种修饰。在一些实施例中，所述多种修饰选自D270N/K326D、S239E/S298A/K326A/A327H、L235A/S239E/D265E/A327H、G236E/G237F/S239E、G237F/S239E/D265E、G327F/S239E/H268D、G236E/D270N/A327V/I332E、G237F/S239E/A327H、G237F/A327L/A330I、S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/D265S/H268D/I332E、S239E/D265S/I332E、S239E/S267E/H268D、S239E/A327L/A330I、D265E/S267D/A330S、S267G/H268E/D270E、H268D/E269L/S298A/K326A/A327H、H268D//K326A/A327H。附加的Fc修饰及Fc修饰的组合在美国专利No.5,624,821、No.5,648,260、No.6,528,624、No.6,737,056、No.7,122,637、No.7,183,387、No.7,297,775、No.7,317,091、No.7,332,581、No.7,632,497、No.7,662,925、No.7,695,936、No.8,093,359、No.8,216,805、No.8,218,805、No.8,388,955和No.8,937,158以及美国专利公布No.2005/0054832、No.2006/0222653、No.2006/0275282、No.2006/0275283、No.2007/0190063、No.2008/0154025、No.2009/0042291、No.2013/0108623和No.2013/0089541中提供，这些专利和专利公布中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，所述抗体为双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体的两个抗原结合结构域具有不同的重链可变结构域，但具有相同的轻链可变结构域。在一些实施例中，重链的Fc结构域包含有利于重链异二聚体形成和/或抑制重链同二聚体形成的修饰。此类修饰例如在美国专利No.5,731,168、No.5,807,706、No.5,821,333、No.7,642,228和No.8,679,785中以及在美国专利公布No.2013/0195849中提供，这些专利和专利公布中的每一篇均据此以引用方式并入。

在一些实施例中，本文所提供的抗体具有人轻链可变结构域。在一些实施例中，轻链可变结构域为λ轻链可变结构域。在一些实施例中，轻链可变结构域为κ轻链可变结构域。在一些实施例中，所述抗体具有人轻链恒定结构域。在一些实施例中，轻链恒定结构域为λ轻链恒定结构域。在一些实施例中，轻链恒定结构域为κ轻链恒定结构域。人轻链恒定结构域的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A.等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))。

在一些实施例中，本文所述抗体为完整抗体。在一些实施例中，本文所述抗体为保留抗原结合的抗体片段。在一些实施例中，所述抗体片段为Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、单链抗体、分离的CDRH3或另一个保留完整抗体的可变结构域的至少一部分的抗体片段。

嵌合抗原受体

在某些方面，本文提供了对肽/MHC复合体(例如，肽/I类MHC复合体或肽/II类MHC复合体)具有结合特异性的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述CAR为全人源的。在一些实施例中，根据本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的CAR基因座的非人动物)可获得和/或获得CAR。

在一些实施例中，CAR以对应于小于10^-7M、10^-8M或10^-9M的K_D的亲和力结合至肽/MHC复合体。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体的结合亲和力(如由K_D表示)比CAR对未由MHC递呈时的肽的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。在一些实施例中，CAR对肽/MHC复合体的结合亲和力(如由K_D表示)比在相同MHC蛋白递呈无关肽时CAR对肽的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。用于评价CAR的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹和RIA。也可通过本领域已知的标准测定法，诸如通过Biacore分析，评估CAR的结合动力学(例如，结合亲和力)。

在一些实施例中，CAR对肽/MHC I类复合体具有特异性。在一些实施例中，MHC I类为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G。在一些实施例中，肽的长度为8-10个氨基酸。

在一些实施例中，CAR对肽/MHC I类复合体具有特异性。在一些实施例中，MHC II类为HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。在一些实施例中，该肽的长度为10-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为13-25个氨基酸。在一些实施例中，该肽的长度为15-18个氨基酸。

在一些实施例中，此类CAR包含第一CAR多肽和第二CAR多肽，该第一CAR多肽包含Ig重链可变结构域和TCRβ恒定结构域，并且该第二CAR多肽包含Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和TCRα恒定结构域。在一些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为非人恒定结构域(例如，大鼠或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，TCRβ恒定结构域和/或TCRα恒定结构域为人恒定结构域。可使用本文所述方法或使用本领域已知的任何其他方法生成CAR的Ig可变结构域。例如，可使用本领域已知的方法(例如，使用噬菌体展示或酵母展示)生成抗肽/MHC抗体，然后可将编码该抗体的可变结构域的核酸序列连接至TCR恒定结构域基因。对肽/MHC复合体具有结合特异性的抗体及用于产生此类抗体的方法的例子例如在美国专利No.6,992,176、No.7,718,777和No.8,815,528中以及在Stewart-Jones et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106:5784-88(2009)(Stewart-Jones等人，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第5784-5788页，2009年)和Hulsmeyer et al.,J.Biol.Chem.280:2972-80(2005)(Hulsmeyer等人，《生物化学杂志》，第280卷，第2972-2980页，2005年)中提供，这些专利和文献中的每一篇均据此以引用方式并入。

药物组合物

在某些实施例中，本文提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的本文所述至少一种药剂(例如，本文所述抗体和/或本文所述CAR)的组合物，例如药物组合物。

本文所提供的药物组合物可被专门配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下施用方式的那些形式：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液剂或混悬剂)、片剂(例如那些供颊内、舌下和全身吸收的片剂)、大丸剂(bolus)、散剂、颗粒剂、供舌应用的糊剂；或(2)胃肠外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液剂或混悬剂或者缓释制剂。

适用于胃肠外施用的本文所提供的药物组合物包含本文所述一种或多种药剂以及与之结合的一或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液，或者可在临用前才重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末，其可包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。

本文所提供的药物组合物中可采用的合适的水性或非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如，橄榄油)以及注射用有机酯(例如，油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过在分散液的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。

在某些实施例中，该组合物包含一定浓度的本文所述抗体和/或CAR，从而得到适合所需剂量的重量/体积(w/v)。抗体和/或CAR可以至少1mg/mL、至少5mg/mL、至少10mg/mL、至少15mg/mL、至少20mg/mL、至少25mg/mL、至少30mg/mL、至少35mg/mL、至少40mg/mL、至少45mg/mL、至少50mg/mL、至少55mg/mL、至少60mg/mL、至少65mg/mL、至少70mg/mL、至少75mg/mL、至少80mg/mL、至少85mg/mL、至少90mg/mL、至少95mg/mL、至少100mg/mL、至少105mg/mL、至少110mg/mL、至少115mg/mL、至少120mg/mL、至少125mg/mL、至少130mg/mL、至少135mg/mL、至少140mg/mL、至少150mg/mL、至少200mg/mL、至少250mg/mL或至少300mg/mL的浓度存在于该组合物中。

在一些实施例中，该组合物包含待治疗的特定适应症所需的一种或多种活性化合物，通常为那些具有不会相互产生不利影响的互补活性的化合物。此类附加活性化合物适合以有效用于预期目的的含量适当地结合存在。

在一些实施例中，通过将本文所述抗体和/或CAR与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，而以所需的最终浓度制备呈冻干组合物或水溶液形式的组合物，所述载体、赋形剂或稳定剂包括但不限于缓冲剂、糖类、盐、表面活性剂、增溶剂、多元醇、稀释剂、粘结剂、稳定剂、盐、亲脂性溶剂、氨基酸、螯合剂、防腐剂等(Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,12th edition,L.Brunton,et al.(《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》，第12版，L.Brunton等人)以及Remington'sPharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1999)(《雷明顿药学大全》，第16版，Osol,A。编辑，1999年))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括：缓冲剂，例如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括海藻糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠离子；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、聚山梨醇酯80、或聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，缓冲剂为组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸或乙酸盐。糖类赋形剂可为海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖或棉子糖。表面活性剂可为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯80或Pluronic F68。盐可为NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2。

在一些实施例中，该组合物包含缓冲剂或pH调节剂以提供改善的pH控制。这种组合物可具有介于约3.0与约9.0之间、介于约4.0与约8.0之间、介于约5.0与约8.0之间、介于约5.0与约7.0之间、介于约5.0与约6.5之间、介于约5.5与约8.0之间、介于约5.5与约7.0之间、或介于约5.5与约6.5之间的pH。在另一个实施例中，这种组合物具有约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0的pH。在一个具体实施例中，组合物具有约6.0的pH。本领域的技术人员会理解，组合物的pH一般不应等于要在该组合物中使用的特定抗体或CAR的等电点。通常，该缓冲剂是由有机或无机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括但不限于有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲剂。另外，氨基酸组分也可在缓冲容量方面发挥作用。可在该组合物中用作缓冲剂的代表性氨基酸组分包括但不限于甘氨酸和组氨酸。在某些实施例中，缓冲剂选自组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸和乙酸盐。在一个具体实施例中，缓冲剂为组氨酸。在另一个具体实施例中，缓冲剂为柠檬酸盐。在又一个具体实施例中，缓冲剂为甘氨酸。缓冲剂的纯度应为至少98％、或至少99％、或至少99.5％。如本文所用，在组氨酸和甘氨酸语境中的术语“纯度”是指如本领域所了解的组氨酸或甘氨酸的化学纯度，例如在The Merck Index,13th ed.,O'Neil et al.ed.(Merck&Co.,2001)(《默克索引》，第13版，O'Neil等人编辑，默克公司，2001年)中所述。

在某些实施例中，该组合物包含作为缓冲剂的组氨酸。在某些实施例中，组氨酸以至少约1mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、至少约50mM、至少约75mM、至少约100mM、至少约150mM或至少约200mM组氨酸的浓度存在于该组合物中。在另一个实施例中，组合物包含介于约1mM与约200mM之间、介于约1mM与约150mM之间、介于约1mM与约100mM之间、介于约1mM与约75mM之间、介于约10mM与约200mM之间、介于约10mM与约150mM之间、介于约10mM与约100mM之间、介于约10mM与约75mM之间、介于约10mM与约50mM之间、介于约10mM与约40mM之间、介于约10mM与约30mM之间、介于约20mM与约75mM之间、介于约20mM与约50mM之间、介于约20mM与约40mM之间、或介于约20mM与约30mM之间的组氨酸。在另一个实施例中，该组合物包含约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约150mM或约200mM的组氨酸。在一个具体实施例中，组合物可包含约10mM、约25mM的组氨酸或不包含组氨酸。

在一些实施例中，该组合物包含碳水化合物赋形剂。碳水化合物赋形剂可充当例如增粘剂、稳定剂、增量剂、增溶剂和/或类似物。碳水化合物赋形剂一般的存在量为按重量或体积计介于约1％至约99％之间，例如，介于约0.1％至约20％之间、介于约0.1％至约15％之间、介于约0.1％至约5％之间、介于约1％至约20％之间、介于约5％至约15％之间、介于约8％至约10％之间、介于约10％与约15％之间、介于约15％与约20％之间、介于0.1％至20％之间、介于5％至15％之间、介于8％至10％之间、介于10％与15％之间、介于15％与20％之间、介于约0.1％至约5％之间、介于约5％至约10％之间、或介于约15％至约20％之间。在另外其他的具体实施例中，碳水化合物赋形剂以1％、或1.5％、或2％、或2.5％、或3％、或4％、或5％、或10％、或15％、或20％存在。

在一些实施例中，该组合物包含碳水化合物赋形剂。适用于该组合物的碳水化合物赋形剂包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)等。在某些实施例中，用于本文所提供的组合物中的碳水化合物赋形剂选自蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉子糖。在一个具体实施例中，碳水化合物赋形剂为海藻糖。在另一个具体实施例中，碳水化合物赋形剂为甘露醇。在又一个具体实施例中，碳水化合物赋形剂为蔗糖。在再一个具体实施例中，碳水化合物赋形剂为棉子糖。碳水化合物赋形剂的纯度应为至少98％、或至少99％、或至少99.5％。

在一些实施例中，该组合物包含海藻糖。在某些实施例中，组合物包含至少约1％、至少约2％、至少约4％、至少约8％、至少约20％、至少约30％或至少约40％的海藻糖。在另一个实施例中，组合物包含介于约1％与约40％之间、介于约1％与约30％之间、介于约1％与约20％之间、介于约2％与约40％之间、介于约2％与约30％之间、介于约2％与约20％之间、介于约4％与约40％之间、介于约4％与约30％之间、或介于约4％与约20％之间的海藻糖。在另一个实施例中，组合物包含约1％、约2％、约4％、约6％、约8％、约15％、约20％、约30％或约40％的海藻糖。在一个具体实施例中，组合物包含约4％、约6％或约15％的海藻糖。

在某些实施例中，该组合物包含赋形剂。在一个具体实施例中，组合物包含至少一种选自以下的赋形剂：糖、盐、表面活性剂、氨基酸、多元醇、螯合剂、乳化剂和防腐剂。在某些实施例中，组合物包含盐，例如选自以下的盐：NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2。在一个具体实施例中，该组合物包含NaCl。

在一些实施例中，该组合物包含氨基酸如赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸，或氨基酸盐。该组合物可包含至少约1mM、至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、至少约250mM、至少约300mM、至少约350mM或至少约400mM的氨基酸。在另一个实施例中，该组合物可包含介于约1mM与约100mM之间、介于约10mM与约150mM之间、介于约25mM与约250mM之间、介于约25mM与约300mM之间、介于约25mM与约350mM之间、介于约25mM与约400mM之间、介于约50mM与约250mM之间、介于约50mM与约300mM之间、介于约50mM与约350mM之间、介于约50mM与约400mM之间、介于约100mM与约250mM之间、介于约100mM与约300mM之间、介于约100mM与约400mM之间、介于约150mM与约250mM之间、介于约150mM与约300mM之间、或介于约150mM与约400mM之间的氨基酸。在另一个实施例中，组合物包含约1mM、1.6mM、25mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM或约400mM的氨基酸。

在一些实施例中，该组合物包含表面活性剂。如本文所用，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由具有相反溶解倾向的基团构成，通常由油溶性烃链和水溶性离子基团构成。表面活性剂可根据表面活性部分的电荷划分为阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂。表面活性剂通常用作各种药物组合物和生物材料制品的润湿剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。药学上可接受的表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；Triton；辛基配糖物钠盐；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蔻基磺基甜菜碱、亚油基磺基甜菜碱或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺基丙基甜菜碱、椰油酰胺基丙基甜菜碱、亚油酰胺基丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基甜菜碱、棕榈酰胺基丙基甜菜碱或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基二甲胺、棕榈酰胺基丙基二甲胺或异硬脂酰胺基丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；以及系列(美国新泽西州帕特森的摩那工业公司(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.))、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，PF68等)，可任选地添加到所述组合物中以减少聚集。在某些实施例中，组合物包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。如果使用泵或塑料容器施用该组合物，则表面活性剂特别有用。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。所述组合物可包含浓度在约0.001％至约1％、或约0.001％至约0.1％、或约0.01％至约0.1％之间的范围内的聚山梨醇酯。在其他具体实施例中，所述组合物包含浓度为0.001％、或0.002％、或0.003％、或0.004％、或0.005％、或0.006％、或0.007％、或0.008％、或0.009％、或0.01％、或0.015％、或0.02％的聚山梨醇酯。

在一些实施例中，该组合物包含其他赋形剂和/或添加剂，包括但不限于稀释剂、粘结剂、稳定剂、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。可在本文所提供的组合物中使用药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。可任选地将常用赋形剂/添加剂诸如药学上可接受的螯合剂(例如但不限于EDTA、DTPA或EGTA)添加到所述组合物中以减少聚集。如果使用泵或塑料容器施用该组合物，则这些添加剂特别有用。

在一些实施例中，该组合物包含防腐剂。可任选地以任何合适的浓度诸如介于约0.001％至约5％之间、或其中的任何范围或值，向所述组合物添加防腐剂，例如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化镁(例如但不限于六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或者它们的混合物。用于所述组合物中的防腐剂的浓度为足够产生抗微生物效应的浓度。这些浓度取决于所选的防腐剂并且可以由技术人员容易地确定。

在一些实施例中，该组合物与人血液等渗，其中所述组合物具有与人血液基本上相同的渗透压。此类等渗组合物一般将具有约250mOSm至约350mOSm的渗透压。可通过例如使用蒸汽压或冰冻型渗压计来测量等渗性。通过使用渗涨度调节剂来调节组合物的渗涨度。“渗涨度调节剂”是那些可添加到该组合物中而使该组合物等渗的药学上可接受的惰性物质。适用于本文所提供的组合物的渗涨度调节剂包括但不限于糖类、盐和氨基酸。

在某些实施例中，该组合物为不含热原的组合物，即基本上不含内毒素和/或相关的引起发热的物质。内毒素包括这样的毒素，这些毒素限制在微生物内，只有当此微生物被分解或死亡时才会释放。引起发热的物质包括来自细菌和其他微生物的外膜的引起发烧的热稳定性物质。如果给予人类，这两种物质会引起发烧、低血压和休克。由于存在潜在的有害效应，即使数量较低的内毒素也必须从静脉内施用的药物溶液中去除。美国食品药品管理局(Food&Drug Administration(“FDA”))设定了用于静脉内药物应用的一个小时内5个内毒素单位(EU)/剂量/千克体重的上限(The United States PharmacopeialConvention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000)(美国药典委员会，《药典论坛》，第26卷，第1期，第223页，2000年))。当以数百或数千毫克/千克体重的量施用治疗性蛋白时(目标蛋白(例如，抗体)即是这种情况)，即使有害且危险的内毒素为痕量，也必须去除。在一些实施例中，该组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。

当用于体内施用时，本文所述组合物应为无菌的。可通过各种灭菌方法(包括无菌过滤、辐射等)对该组合物进行灭菌。在某些实施例中，用预先灭菌的0.22微米滤膜对组合物进行过滤灭菌。注射用无菌组合物可以按照常规制药规范配制，如“Remington:TheScience&Practice of Pharmacy”，21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,(2005)(《雷明顿：药剂学科学与实践》，第21版，利平科特π威廉斯π威尔金斯出版公司，2005年)中所述。包含目标蛋白(例如，抗体或CAR)的组合物，诸如本文所公开的那些组合物，通常将以冻干形式或溶液形式保存。设想到，将包含目标蛋白(例如，抗体或CAR)的无菌组合物放入具有无菌进入孔的容器内，例如具有允许取出该组合物的适配器(诸如皮下注射针可刺穿的塞子)的静脉注射溶液袋或小瓶。在某些实施例中，组合物作为预装填注射器提供。

在某些实施例中，该组合物为冻干制剂。术语“冻干的”或“冷冻干燥的”包括经受了干燥程序(例如，冻干)的物质的状态，其中已去除至少50％的水分。

不论所选的施用途径如何，都可通过本领域技术人员已知的常规方法将本文所提供的药剂(可按合适的水合形式使用)和/或本文所提供的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。

治疗方法

在某些方面，本文提供了治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括给受试者施用本文所述抗体或CAR(例如，对肽/MHC复合体具有结合特异性的全人源抗体，或对肽/MHC具有结合特异性的全人源CAR)。在一些实施例中，抗体和/或CAR是使用本文所述方法(例如，使用包含如本文所述的CAR基因座的非人动物)获得或可获得的抗体和/或CAR。

在某些实施例中，本文提供了治疗受试者中的癌的方法，所述方法包括给受试者施用本文所述药物组合物(例如，包含本文所述抗体(例如对肽/MHC具有结合特异性的全人源抗体)的药物组合物)。在一些实施例中，本文所述方法可用于治疗任何癌性或癌前期肿瘤。可通过本文所述方法和组合物治疗的癌包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。此外，所述癌具体而言可以是以下组织学类型，但不限于此：瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；卵巢内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓性肉瘤；以及毛细胞白血病。

在某些实施例中，给受试者施用的药物组合物中的抗体和/或CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含癌相关抗原的表位(例如，由所治疗的癌表达的表位)。癌相关抗原的例子包括但不限于亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-联蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、肌球蛋白I类、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、生存素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施例中，该抗原为新抗原。

在某些实施例中，本文提供了治疗患有感染(包括病毒感染、真菌感染、细菌感染、蠕虫感染或原虫感染)的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用本文所述药物组合物(例如，包含本文所述抗体(例如对肽/MHC具有结合特异性的全人源抗体)的药物组合物)。在一些实施例中，该方法包括对病毒传染性疾病的治疗，所述病毒传染性疾病包括HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2，以及流感病毒。在一些实施例中，该方法包括对寄生虫(例如，疟原虫)的治疗。在一些实施例中，该方法包括对细菌性、真菌性和其他病原性疾病的治疗，例如曲霉、布鲁线虫、念珠菌、衣原体、球虫、隐球菌、恶丝虫、淋球菌、组织胞浆菌、利什曼原虫、分枝杆菌、支原体、草履虫、百日咳菌、疟原虫、肺炎球菌、肺囊虫、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、弓形虫和霍乱弧菌。示例性物种包括淋病奈瑟氏菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、热带念珠菌、阴道毛滴虫、阴道嗜血杆菌、B族链球菌、人型支原体、杜氏嗜血菌、腹股沟肉芽肿、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、流产布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、胎儿弯曲菌、胎儿弯曲菌肠亚种、波蒙纳钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、绵羊布鲁氏菌、鹦鹉热衣原体、胎儿三毛滴虫、刚地弓形虫、大肠杆菌、马放线杆菌、绵羊流产沙门菌、马流产沙门菌、铜绿假单胞菌、马棒状杆菌、化脓棒状杆菌、精液放线杆菌、牛生殖道支原体、烟曲霉、分枝犁头霉、马媾疫锥虫、驽巴贝斯虫、破伤风梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原体，例如恶性疟原虫。

在某些实施例中，给受试者施用的药物组合物中的抗体和/或CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含由传染性病原体表达的抗原的表位(例如，由所治疗的传染性病原体表达的表位)。

在一些实施例中，本文提供了治疗炎性疾病、皮肤或器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫疾病的方法，该方法包括给受试者施用本文所述药物组合物(例如，包含本文所述抗体(例如对肽/MHC具有结合特异性的全人源抗体)的药物组合物)。自身免疫疾病的例子包括例如肾小球肾炎、关节炎、扩张性心肌病样疾病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、克罗恩病、系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、变应性接触性皮炎、多肌炎、厚皮、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常性白斑、胰岛素依赖性糖尿病、白塞病、桥本病、爱迪生氏病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、不育症、慢性活动性肝炎、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血、活动性慢性肝炎、爱迪生氏病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状狼疮、红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、桥本甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖性糖尿病、兰伯特-伊顿综合征、类狼疮肝炎、淋巴细胞减少症的一些病例、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎、结节性多动脉炎、自身免疫性多腺体综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺氏综合征、复发性多软骨炎、施密特氏综合征、局限性硬皮病(或crest综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎和韦格纳氏肉芽肿。

在某些实施例中，给受试者施用的药物组合物中的抗体和/或CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含作为所治疗疾病中自身反应性T细胞的靶标的蛋白质的表位(例如，由自身免疫疾病中的自身反应性T细胞所靶向的表位)。自身反应性T细胞所靶向的示例性蛋白质包括例如p205、胰岛素、促甲状腺激素、酪氨酸酶、TRP1和髓磷脂。

本文所述药物组合物可通过任何合适的施用途径递送，包括经口、经鼻(如以例如气雾剂的形式)、经直肠、阴道内、胃肠外、脑池内和局部施用(如以散剂、软膏剂或滴剂的形式)，包括口颊和舌下施用。在某些实施例中，药物组合物以通常的方式递送(例如，经口或胃肠外施用)。

本文所述药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得能有效达到特定患者、组合物和施用方式所需的治疗响应且对患者无毒的活性成分的量。

所选的剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的特定药剂的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄或代谢速率、疗程、与所采用的特定化合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和既往用药史、以及医学领域熟知的类似因素。

具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定所需药物组合物的有效量并开具处方。例如，医师或兽医可以比达到所需疗效而要求的水平低的水平开具和/或施用药物组合物中所采用的抗体和/或CAR的剂量，然后逐渐增加剂量，直至达到所需的疗效。

在一些实施例中，本文所述CAR受体用于基于T细胞的疗法。例如，在某些实施例中，给受试者施用表达本文所述CAR的T细胞，以在受试者中诱导基于T细胞的免疫应答。可用于基于T细胞的疗法的方法例如在SchumacherNat.Rev.Immunol.2:512-519(2002)(Schumacher，《自然评论：免疫学》，第2卷，第512-519页，2002年)和Bitton et al.,Frontiers in Bioscience 4:d386-393(1999)(Bitton等人，《生物科学前沿》，第4卷，第d386-393页，1999年)中有描述，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。

在一些方面，本文提供了在受试者中诱导免疫应答(例如，基于T细胞的免疫应答)的方法。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用表达CAR的细胞(例如，人T细胞，如CD4T细胞或CD8T细胞)，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。

在一些实施例中，受试者为有需要的受试者。在一些实施例中，受试者为患有癌的受试者。在此类实施例中，CAR所识别的肽/MHC复合体中的肽为癌抗原的肽。

在某些实施例中，本文提供了治疗癌的方法，所述方法包括给受试者施用表达本文所述CAR的T细胞。在一些实施例中，本文所述方法可用于治疗任何癌性或癌前期肿瘤。可通过本文所述方法和组合物治疗的癌包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。此外，所述癌具体而言可以是以下组织学类型，但不限于此：瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包囊性硬化性癌；肾上腺皮质癌；卵巢内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓性肉瘤；以及毛细胞白血病。

在某些实施例中，给受试者施用的T细胞所表达的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含癌相关抗原的表位(例如，由所治疗的癌表达的表位)。癌相关抗原的例子包括但不限于亲脂素、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(“AFP”)、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-联蛋白、BING-4、CA-125、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CASP-5、CASP-8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白-A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FGF5、FLT3-ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也称为CCDC110)、LAGE-1、LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白、Lengsin、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、肌球蛋白I类、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、P多肽、p53、PAP、PAX5、PBF、pml-RARα融合蛋白、多形上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、生存素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TGF-βRII、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、VEGF、WT1、XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施例中，该抗原为新抗原。

在一些实施例中，受试者为已感染病原体的受试者。在此类实施例中，CAR所识别的肽/MHC复合体中的肽为病原性抗原的肽。

因此，在某些实施例中，本文提供了治疗患有感染(包括病毒感染、细菌感染、蠕虫感染或原虫感染)的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用表达本文所述CAR的T细胞。例如，在一些实施例中，本文提供了治疗病毒感染性疾病的方法，所述病毒感染性疾病包括HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、疱疹病毒如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2，以及流感病毒。在一些实施例中，所治疗的病原体是寄生虫，例如疟原虫。在一些实施例中，本文提供了对细菌性、真菌性和其他病原性疾病的治疗，例如曲霉、布鲁线虫、念珠菌、衣原体、球虫、隐球菌、恶丝虫、淋球菌、组织胞浆菌、利什曼原虫、分枝杆菌、支原体、草履虫、百日咳菌、疟原虫、肺炎球菌、肺囊虫、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、弓形虫以及霍乱弧菌。示例性物种包括淋病奈瑟氏菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、热带念珠菌、阴道毛滴虫、阴道嗜血杆菌、B族链球菌、人型支原体、杜氏嗜血菌、腹股沟肉芽肿、性病性淋巴肉芽肿、梅毒螺旋体、流产布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、胎儿弯曲菌、胎儿弯曲菌肠亚种、波蒙纳钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、绵羊布鲁氏菌、鹦鹉热衣原体、胎儿三毛滴虫、刚地弓形虫、大肠杆菌、马放线杆菌、绵羊流产沙门菌、马流产沙门菌、铜绿假单胞菌、马棒状杆菌、化脓棒状杆菌、精液放线杆菌、牛生殖道支原体、烟曲霉、分枝犁头霉、马媾疫锥虫、驽巴贝斯虫、破伤风梭菌、肉毒梭菌；或真菌，例如巴西副球孢子菌；或其他病原体，例如恶性疟原虫。

在某些实施例中，给受试者施用的T细胞所表达的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含由传染性病原体表达的抗原的表位(例如，由所治疗的传染性病原体表达的表位)。

在某些方面，本文提供了在受试者(例如，人受试者)中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括从该受试者分离T细胞(例如，CD4T细胞或CD8T细胞)。在一些实施例中，该方法包括诱导T细胞表达对肽/MHC复合体具有结合特异性的CAR。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列的第一载体以及包含编码第二CAR多肽的核酸序列的第二载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列以及编码第二CAR多肽的核酸序列的载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括抑制T细胞表达内源TCRα和/或TCRβ的步骤。

在一些实施例中，该受试者为患有自身免疫疾病的受试者。在此类实施例中，T细胞为调节性T细胞(即，抑制性T细胞)，并且CAR所识别的肽/MHC复合体中的肽为受试者对其产生自身免疫应答的自体抗原。

在一些方面，本文提供了在受试者中抑制免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用表达CAR的调节性T细胞(例如，CD4⁺、CD-25⁺和Foxp3⁺调节性T细胞或Treg17T细胞)，该CAR包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有人Ig轻链可变结构域(例如，Igκ可变结构域或Igλ可变结构域)和人TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中该CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/I类MHC复合体。在一些实施例中，肽/MHC复合体为肽/II类MHC复合体。

在某些方面，本文提供了在受试者(例如，人受试者)中抑制对肽/MHC复合体的免疫应答的方法。在一些实施例中，该方法包括从该受试者分离调节性T细胞(例如，CD4⁺、CD-25⁺和Foxp3⁺调节性T细胞或Treg17T细胞)。在一些实施例中，该方法包括诱导T细胞表达对肽/MHC复合体具有结合特异性的CAR。在一些实施例中，该方法包括给受试者施用T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列的第一载体以及包含编码第二CAR多肽的核酸序列的第二载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括用包含编码第一CAR多肽的核酸序列以及编码第二CAR多肽的核酸序列的载体转染T细胞。在一些实施例中，该方法包括抑制T细胞表达内源TCRα和/或TCRβ的步骤。

因此，在一些实施例中，本文所述方法可用于治疗与有害免疫应答相关的疾病或障碍，例如哮喘、炎性疾病、皮肤或器官移植、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫疾病。自身免疫疾病的例子包括例如肾小球肾炎、关节炎、扩张性心肌病样疾病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、克罗恩病、系统性红斑狼疮、慢性类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、变应性接触性皮炎、多肌炎、厚皮、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常性白斑、胰岛素依赖性糖尿病、白塞病、桥本病、爱迪生氏病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、肺出血肾炎综合征、不育症、慢性活动性肝炎、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血、活动性慢性肝炎、爱迪生氏病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状狼疮、红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、桥本甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖性糖尿病、兰伯特-伊顿综合征、类狼疮肝炎、淋巴细胞减少症的一些病例、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎、结节性多动脉炎、自身免疫性多腺体综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺氏综合征、复发性多软骨炎、施密特氏综合征、局限性硬皮病(或crest综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、溃疡性结肠炎和韦格纳氏肉芽肿。

在某些实施例中，给受试者施用的T细胞所表达的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性，其中该肽包含作为所治疗疾病中自身反应性T细胞的靶标的蛋白质的表位(例如，由自身免疫疾病中的自身反应性T细胞所靶向的表位)。自身反应性T细胞所靶向的示例性蛋白质包括例如p205、胰岛素、促甲状腺激素、酪氨酸酶、TRP1和髓磷脂。

核酸分子

本文提供了编码本文所述抗体、CAR及抗体和CAR的部分的核酸分子。在一些实施例中，该核酸编码本文所述抗体或CAR的可变结构域(例如，重链和/或轻链可变结构域)。所述核酸可存在于例如完整细胞中、细胞裂解液中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。

在某些方面，本文提供了编码本文所述抗体和/或CAR多肽或其一部分的核酸。所述核酸可存在于例如完整细胞中、细胞裂解液中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。本文所述核酸可使用标准分子生物技术获得。例如，本文所述核酸分子可使用标准PCR技术克隆或以化学方式合成。对于编码杂交瘤所表达的CAR或抗体的核酸而言，编码杂交瘤所制得的抗体或CAR的每条链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。

在某些方面，本文提供了一种核酸组合物，该核酸组合物包含编码本文所述抗体的重链的第一核酸序列以及编码本文所述抗体的轻链(例如，Igκ轻链或Igλ轻链)的第二核酸序列，其中包含所述重链和轻链的抗体对肽/MHC复合体具有结合特异性。在某些实施例中，Ig重链可变结构域和/或Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。在一些实施例中，Ig重链恒定结构域和/或Ig轻链恒定结构域为啮齿动物恒定结构域(例如，大鼠恒定结构域或小鼠恒定结构域)。在一些实施例中，Ig重链恒定结构域和/或Ig轻链恒定结构域为人恒定结构域。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于单一核酸分子上。在一些实施例中，第一核酸序列和第二核酸序列位于分别的核酸分子上。

在某些实施例中，本文提供了包含本文所述核酸分子的载体。如本文所用，术语“载体”是指能够转运与之相连的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可在其中连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可被连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后可整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。

在某些实施例中，本文提供了包含本文所述核酸(例如，编码本文所述抗体或CAR或其一部分的核酸)的细胞。该细胞可为例如原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、鼠细胞和/或人细胞。在某些实施例中，本文所述核酸有效连接至转录控制元件，例如启动子。在一些实施例中，所述细胞转录本文所述核酸，从而表达本文所述抗体、其抗原结合片段或多肽。该核酸分子可整合到细胞的基因组中，或其可在染色体外。

本文所提供的核酸分子可使用标准分子生物技术获得。例如，本文所述核酸分子可使用标准PCR技术克隆或以化学方式合成。

一旦获得编码V_H和V_L区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术进一步对这些DNA片段进行操纵，例如以将可变区基因转变为全长抗体链基因、转变为Fab片段基因或转变为scFv基因。在这些操纵中，编码V_L或V_H的DNA片段有效连接至编码另一种蛋白质(例如，抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段。如该语境中所用，术语“有效连接”旨在意指这两个DNA片段接合在一起，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。

可通过将编码重链可变区的分离DNA有效连接至编码重链恒定区(例如，CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子，而将该重链可变区DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A。等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选地为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，编码V_H的DNA可有效连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。

可通过将编码轻链可变区的分离DNA有效连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子，而将该轻链可变区编码DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242(Kabat,E.A。等人，1991年，《具有免疫学重要性的蛋白序列》，第五版，美国卫生和公众服务部，NIH出版物编号91-3242))，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。该轻链恒定区可为κ或λ恒定区，但最优选地为κ恒定区。

实例

实例1：携带嵌合抗原受体的T细胞的活化

将编码识别肽-MHC复合体(NY-ESO-1和MAGE-1肽，参见Stewart-Jones et al.(2009)Rational development of high-affinity T-cell receptor-like antibodies,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106:5784-88(Stewart-Jones等人，2009年，高亲和力T细胞受体样抗体的合理开发，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第5784-5788页)以及Hülsmeyeret al.(2005)A Major Histocompatibility Complex Peptide-restricted Antibodyand T Cell Receptor Molecules Recognize Their Target by Distinct BindingModes,J.Biol.Chem.280:2972-80(Hülsmeyer等人，2005年，主要组织相容性复合体肽限制性抗体和T细胞受体分子以不同结合模式识别它们的靶标，《生物化学杂志》，第280卷，第2972-2980页)，这两篇文献分别以引用方式并入本文)的抗体的VH和VL结构域的序列并入合成法产生的1.9kb核苷酸序列中，其中免疫球蛋白Vκ和V_H结构域序列分别布置在TCRA C和TCRB C序列的上游(图3)。Stewart-Jones等人描述了识别与HLA-A2复合的NY-ESO-1肽(SLLMWITQVNY，SEQ ID NO:1)的抗体；Hülsmeyer等人描述了识别与HLA-A1复合的MAGE-1肽(EADPTGHSY，SEQ ID NO:2)的抗体。

包含抗NY-ESO-1/A2和抗MAGE-1/A1VH和VL的合成序列还包含Vκ和V_H两者上游的ROR前导位点(美国专利No.7,534,604，该专利以引用方式并入本文)，且具有用于双顺反子表达的弗林蛋白酶切割位点和自我切割F2A肽(以引用方式并入的Yang et al.(2008)Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-levelTCR gene expression and tumor cell recognition,Gene Ther.15:1411-1423(Yang等人，2008年，最佳双顺反子慢病毒载体的开发有利于高水平TCR基因表达和肿瘤细胞识别，《基因疗法》，第15卷，第1411-1423页))。合成的DNA得自蓝鹭公司(Blue Heron)。作为阴性对照，将生殖系Vκ1-39Jκ5[ULC1-39]或Vκ3-20Jκ1[ULC3-20]和V_H3-23J_H4[UHC]分别并入慢病毒载体中TCRA C和TCRA B的上游(对于ULC1-39和ULC3-20而言，参见美国专利申请公布No.US 2011/0195454，并且对于UHC而言，参见No.US2014/0245468，这两份专利申请公布均以引用方式并入本文)。

将每个合成的1.9kb DNA序列(即，编码MAGE-1 CAR、NY-ESO-1 CAR、ULC1-39UHC和ULC3-20UHC CAR的序列)连接到pLVX EF1a IRES-PURO慢病毒载体(Clontech)的多克隆位点中。通过293T细胞的瞬时转染，用delta 8.9和PMDG包装构建体，并且制备病毒上清液，随后用于转导J.RT3-T3.5(T3)细胞，这些细胞来源于Jurkat T细胞，但无法产生TCRαβ异二聚体或在其细胞质膜上表达CD3。Jurkat(CD4+CD8-T)细胞用作对照。在转导之后，采用FACS分选方法，针对其表达细胞表面CD3的能力来筛选T3细胞，所有经CAR转导的T3细胞都表现出CD3的表达，表明细胞表面上表达了CAR分子。

通过检测人IL-2分泌的ELISPOT测定法，来确定用包含NY-ESO-1的VL和VH或者MAGE-1的VL和VH的CAR转导的T3细胞的T细胞活化(Czerkinsky et al.(1983)A solid-phase enzyme-linked immunospot(ELISPOT)assay for enumeration of specificantibody-secreting cells,J.Immunol.Methods 65:109-121(Czerkinsky等人，1983年，用于对分泌特异性抗体的细胞进行计数的固相酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法，《免疫学方法杂志》，第65卷，第109-121页)以及Miyahira et al.(1995)Quantification of antigenspecific CD8+T cells using an ELISPOT assay.J.Immunol.Methods,181:45-54(Miyahira等人，1995年，使用ELISPOT测定法对抗原特异性CD8+T细胞进行定量，《免疫学方法杂志》，第181卷，第45-54页)，这两篇文献以引用方式并入本文)。人IL-2ELISPOT试剂盒购自BD生物科学公司(BD Biosciences)(目录号551282)。

具体地讲，将单独的或表达MAGE-1 CAR(A1MAGECAR)、NY-ESO-1 CAR(A1NYESOCAR)或ULC1-39UHC CAR的T3细胞以5×10⁵个细胞/孔的浓度添加到ELISPOT板的孔中。以1×10⁵个细胞/孔(效应子与靶细胞之比为5:1)的浓度添加单独的或表达人HLA-A1(K562_A1)或人HLA-A2(K562_A2)的靶K562细胞(不含MHC的细胞系)。将适当的肽(MAGE-1、HLA-A1限制性或NY-ESO-1、HLA-A2限制性)以10μg/mL的浓度添加到孔中，将板在37℃下温育16至20小时，并根据制造商说明使之显色。

通过在细胞因子定位的位点处形成的蓝黑色沉淀物来检测分泌细胞因子的细胞的数量，以此为基础评估T细胞的活化。如图4所示，仅在存在表达HLA-A1的效应细胞(K562_A1)的情况下用MAGE-1HLA-A1限制性肽处理的表达A1MAGECAR的细胞(MAGE-A1)中出现活化，而在表达HLA-A2的效应细胞(K562_A2)或野生型K562细胞(K562WT)中未出现活化。此外，在存在无关肽的情况下，表达HLA-A1的K562细胞不会活化表达A1MAGECAR的T3细胞。类似地，只有在存在表达HLA-A2的效应细胞(K562_A2)的情况下用NY-ESO-1HLA-A2限制性肽(ESO-1)处理的表达A2NYESOCAR的T3细胞才被活化，如IL-2分泌所证实。任何肽-MHC复合体都不活化表达ULC1-39UHC CAR的T3细胞(阴性对照)。

实例2：表达嵌合抗原受体的经遗传修饰的小鼠的生成

实例2.1：嵌合人Igκ可变区–小鼠TCRA恒定区基因座的构建

通过细菌同源重组(BHR)来修饰包含所有人J_κ区段和4个功能性人V_κ区段的Igκ大靶向载体(LTVEC)(“VI-1”，参见Macdonald et al.(2014)Precise and in situ genetic humanization of 6 mB of mouse immunoglobulingenes,Proc.Natl Acad.Sci USA111:5147-52(Macdonald等人，2014年，6mB小鼠免疫球蛋白基因的精确原位遗传人源化，《美国国家科学院院刊》，第111卷，第5147-5152页)及补充信息)，以将5'小鼠κ臂和neo-tk-loxp盒替换为侧接独特I-CeuI和AsiSI位点的氯霉素(CM)抗性盒(图5，步骤1)。在步骤2中，通过BHR来进一步修饰步骤1中生成的构建体，以将3'小鼠κ臂和Spec盒替换为侧接独特NotI和PI-SceI位点的loxp-neo-loxp盒。随后(步骤3)，将包含16kb远侧小鼠Tcra臂和Frt-Hyg-Frt盒的I-CeuI-AsiSI核酸片段连接到步骤2的构建体中以替换CM盒。最后(步骤4)，将包含24kb近侧小鼠Tcra臂和Spec盒的NotI-PI-SceI核酸片段连接到步骤3的构建体的NotI和PI-SceI位点中，从而替换loxp-neo-loxp盒，形成被称为MAID 6548的最终的LTVEC。

最终的LTVEC从5'到3'包含：(1)用于在ES细胞中同源重组的16kb 5'小鼠Tcra臂(基因组位置14:52411629-52427793，所有坐标基于小鼠组装GRCm38)，(2)用于在大肠杆菌(E.coli)或ES细胞中选择的Frt-Hyg-Frt盒，(3)包含4个最近侧V_κ区段和所有5个J_κ区段(J1-J5)的111kb人κ基因座DNA，(4)用于在ES细胞中同源重组的24kb 3'小鼠TCRA臂，其包含TCRA恒定区基因(基因组位置14:54218920-54243117)，以及(5)用于在大肠杆菌中选择的Spec盒。

LTVEC(MAID6548)具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体(表1)。

表1：IgκV-Tcra C大靶向载体的接合序列(5'到3')

MAID6548用于以电穿孔方式导入MAID1540 het ES细胞中(参见美国专利No.9,113,616的图4A，该专利以引用方式并入本文)，其中所有小鼠TCRA V和J区段已被缺失并替换为Neo盒(图6)。所得基因座的接合序列与上表1中所述相同。使用测定法筛选Hyg抗性ES细胞，以鉴别正确靶向的克隆(参见例如Lie and Petropoulos,1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43-48(Lie和Petropoulos，1998年，《生物技术当前述评》，第9卷，第43-48页)，该文献以引用方式并入本文)(表2；LOA＝等位基因丢失；GOA＝等位基因获得，所识别的区域在图6中示出)。

表2：TAQMAN引物和探针

如果需要，可使用LTVEC将另外的人V_κ区段添加到TCR可变区基因座，这些LTVEC具有连接到与初始插入片段重叠的人Igκ序列的上述相同16kb 5'小鼠Tcra同源臂。

可利用不同策略来生成此类ES细胞。图7中总结的一种方法涉及两种不同大靶向载体向ES细胞中的双重靶向或共同电穿孔。在该方法中，第一大靶向载体(标记为MAID1710，来源于如美国专利申请公布No.2012/0096512A1(以引用方式并入本文)中所述构建的载体的限制性酶切)包含具有人Vκ1-5和Vκ1-6基因区段序列的3'30kb同源臂、具有人Vκ3-7至Vκ3-15基因区段的120kb序列、以及具有人Vκ1-16基因区段的5'20kb区域(“重叠区”)。第二大靶向载体(标记为MAID 6600，也来源于如美国专利申请公布No.2012/0096512A1中所述构建的载体)包含3'20kb重叠区(与第一载体中一样，具有人Vκ1-16基因区段的区域)、具有人Vκ1-17至Vκ2-30基因区段的140kb序列、FRT-Ub-Neo-FRT选择盒以及15.5kb 3'小鼠TCR A同源臂。图6中所生成的ES细胞(MAID 6548，对于所有人Jκ区段和四个功能性人Vκ基因区段为杂合的)使用上述两个大靶向载体以及编码经修饰的锌指核酸酶(ZFN)的核酸进行电穿孔，该经修饰的锌指核酸酶靶向潮霉素基因的核苷酸序列TGCGATCGCTGCGGCCGAtcttagCCAGACGAGCGGGTTCGG(其中切割位点采用小写字母；SEQ IDNO:24)并促进Hyg序列处的双链断裂。通过同源重组将这两个共同电穿孔的大靶向载体插入DNA序列中，从而替换包含和围绕Hyg选择盒的区域。所得的ES细胞在内源TCRα基因座处包含具有人Jκ1至Jκ5和Vκ4-1至Vκ2-30基因区段的人免疫球蛋白可变区。使用上述测定法(Lie和Petropoulos，出处同上)，利用图7中指示并在下表3中列出的探针和引物，确认这两个大靶向载体的成功并入(GOA＝等位基因获得；LOA＝等位基因丢失；拷贝数＝检查序列的拷贝数以跟踪转基因整合与靶向整合；hArm1＝第一大靶向载体(MAID1710)的30kb 3'同源臂；hArm2＝第一大靶向载体(MAID 1710)与第二大靶向载体(MAID6600)的20kb重叠区，mArm＝第二靶向载体(MAID 6600)的15.5kb5'同源臂，野生型小鼠对照–小鼠TCRα基因座处存在的序列)。

表3：TAQMAN引物和探针

ES细胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体(表4)。

表4：由双重ES细胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

用于生成包含另外的免疫球蛋白可变区基因区段的TCRα基因座的替代策略涉及使用包含另外的可变基因区段的大靶向载体进行连续靶向(参见例如图8)。使用大靶向载体对所有人Jκ基因区段和四个功能性人Vκ基因区段杂合的ES细胞(MAID 6548；参见图6)进行电穿孔，该大靶向载体从5'到3'包含：15.5kb 5'小鼠同源臂、Frt-Ub-Neo-Frt选择盒、具有Vκ3-7至Vκ3-15基因区段的120kb片段、以及具有Vκ1-5和Vκ1-6基因区段的30kb 3'人同源臂(也存在于MAID 6548序列中)。使用上述Taqman测定法，利用上表3中列出并在图8中指示的引物和探针确认成功并入：Hyg、hIgK5、hIgK6、hIgK12、Neo、亲本1540m3、亲本1540m1。还使用另外一组引物和探针hIgK10确认成功并入：正向引物–CGATTATGACTGGTTAGGTAGAAAGGTG(SEQ ID NO:71)；探针–GCCACTGGTTTCTCCAAATGTTTTCAATCCAT(SEQ ID NO:72)；反向引物–GGGAGTACTTGGAGATCCCTAAGC(SEQ ID NO:73)。

ES细胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体(表5)。

表5：由单ES细胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

在完成图8中所示的单靶向或图7中所示的双重靶向后，可使用包含另外的Vκ基因区段的大靶向载体相继地靶向ES细胞，以并入功能性人免疫球蛋白Vκ基因区段的完整组库(repertoire)，例如，近侧V聚簇(cluster)中的所有功能性人Vκ基因区段。作为图8和图7中所示的双重或相继单靶向方法的替代形式，可使用三重靶向方法生成ES细胞，这些ES细胞最多包含功能性人免疫球蛋白Vκ基因区段的整个组库，例如近侧V聚簇中的所有功能性人Vκ基因区段。在图9所示的该方法中，第一大靶向载体(用AscI和NotI限制性酶修剪的MAID1710，参见上文)包含具有人Vκ1-5和Vκ1-6基因区段序列的3'30kb同源臂、具有人Vκ3-7至Vκ3-15基因区段序列的120kb序列、以及具有人Vκ1-16基因区段的5'20kb区域(“重叠区”)。第二大靶向载体(用AscI和NotI限制性酶修剪的MAID 6600，参见上文)包含3'20kb重叠区(与第一载体中一样，具有人Vκ1-16基因区段的区域)、具有人Vκ1-17至Vκ2-24基因区段的80kb序列、以及具有人Vκ3-25至Vκ2-30基因区段的5'60kb区域(“重叠区”)。最后，第三大靶向载体(MAID6647，其也来源于如美国专利申请公布No.2012/0096512A1(以引用方式并入)中所述构建的载体)包含具有人Vκ3-25至Vκ2-30的5'60kb重叠区、具有Vκ3-31至Vκ2-40的90kb序列、和FRT-Ub-Neo-FRT选择盒、以及15.5kb 3'小鼠TCR A同源臂。图6中所生成的ES细胞(MAID 6548，对于所有人Jκ区段和四个功能性人Vκ基因区段为杂合的)使用上述三个大靶向载体以及编码经修饰的锌指核酸酶(ZFN)的核酸进行电穿孔，该经修饰的锌指核酸酶靶向潮霉素基因的核苷酸序列TGCGATCGCTGCGGCCGAtcttagCCAGACGAGCGGGTTCGG(其中切割位点采用小写字母；SEQ ID NO:76)并促进Hyg序列处的双链断裂。通过同源重组将这三个共同电穿孔的大靶向载体插入DNA序列中，从而替换包含和围绕Hyg选择盒的区域。所得的ES细胞在内源TCRα基因座处包含具有人Jκ1至Jκ5和Vκ4-1至Vκ2-40基因区段(即，近侧Vκ聚簇的所有功能性人Vκ基因区段)的人免疫球蛋白可变结构域。使用上述测定法(Lie和Petropoulos，出处同上)，利用图9中指示并在下表6中列出的探针和引物，确认这三个大靶向载体的成功并入(GOA＝等位基因获得；LOA＝等位基因丢失；拷贝数＝检查序列的拷贝数以跟踪转基因整合与靶向整合；hArm1＝第一大靶向载体(MAID 1710)的30kb 3'同源臂；hArm2＝第一大靶向载体(MAID 1710)与第二大靶向载体(MAID 6600)的20kb重叠区，mArm＝第二靶向载体(MAID 6600)的15.5kb 5'同源臂，hArm3＝第二靶向载体(MAID6600)与第三靶向载体(MAID6647)的60kb重叠区，野生型小鼠对照–小鼠TCRα基因座处存在的序列)。

表6：TAQMAN引物和探针

ES细胞中的所得被靶向基因座具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体(表7)。

表7：由三重ES细胞靶向得到的基因座的接合序列(5'到3')

在另外其他替代策略中，相继的另外人Ig Vκ基因区段向图6中所示的基因座中的三重靶向、双重靶向或单靶向可使用三重靶向方案(三个大靶向载体)、双重靶向方案(两个大靶向载体)或单靶向方案(一个大靶向载体)来完成，这些方案涉及锌指核酸酶或CRISPR介导的选择(例如，潮霉素)盒破坏。

上述的被靶向ES细胞用作供体ES细胞，并通过方法引入8细胞期的小鼠胚胎中(参见例如美国专利No.7,294,754以及Poueymirou et al.(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91-99(Poueymirou等人，2007年，基本完全来源于供体基因靶向的ES细胞并允许立即表型分析的F0代小鼠，《自然生物技术》，第25卷，第1期，第91-99页))。使用检测独特基因序列存在与否的改编的等位基因测定法，通过基因分型鉴别独立地携带嵌合人IgκV–小鼠Tcra C基因的(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。

实例2.2：嵌合人IgH可变区–小鼠TCRB恒定区基因座的构建

通过若干不同策略之一来构建嵌合人IgH可变区–小鼠TCRB恒定区基因座。

策略1示于图11中。为了获得用于该策略的大靶向载体(LTVEC A)，在如图10中所示的若干BHR和限制性酶切/连接步骤中修饰包含所有人免疫球蛋白重链J_H和D_H区段及一个近侧V_H区段的免疫球蛋白重链LTVEC(“VI-2”)，从而生成包含所有人免疫球蛋白J_H和D_H区段的构建体(LTVEC B[MAID 6555])。LTVEC B的5'小鼠臂包含胰蛋白酶原基因(Try15-Try20)，而3'臂包含小鼠TCRB C2和Vβ31基因。LTVEC B还包含用于增强CAR基因座处的免疫球蛋白重链可变区重组的小鼠IgM增强子(Eμ)。

在下一步中，通过BHR、限制性酶切/连接以及CRISPR/Cas9介导的等温BAC组装(2015年6月23日提交的美国专利申请No.14/747,461，以引用方式并入本文)的若干步骤进一步修饰LTVEC B，以生成大靶向载体(LTVEC A)，该大靶向载体从5'到3'包含：(1)用于在大肠杆菌中选择的Em7-Hyg盒；(2)用于在ES细胞中同源重组的包含胰蛋白酶原基因(Try20，基因组位置6:41504907-41525442)的20kb 5'小鼠臂；(3)用于在大肠杆菌或ES细胞中选择的Frt-Neo-loxP-Frt盒；(4)包含3最近侧VH区段及所有DH和JH区段的145kb人IgH基因座；(5)包含IgM增强子(Eμ)(基因组位置12:113427167-113428462)的1296bp小鼠IgH基因座(作为另一种选择，不包含该序列)；以及(6)用于在ES细胞中同源重组的包含Trbc2恒定区基因(基因组位置6:41543957-41584559)的40kb 3'小鼠臂(参见图10)。

LTVEC A具有下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体(表8)：

表8：IgH V-TCRB C大靶向载体(LTVEC A)的接合序列(5'到3')

在策略1中，在生成LTVEC A的克隆步骤后，在单靶向步骤中将嵌合基因座引入ES细胞中。如图11所示，将人IgH V、D和J区段插入在携带TCRB基因座的ES细胞中小鼠3'胰蛋白酶原(TRY)基因下游(小鼠TRY基因未按比例示出；TCR B基因座包含多个TRY基因)和小鼠TCRB C2上游，该TCRB基因座包含这两个胰蛋白酶原重复序列之间所有小鼠TCRB V区段的缺失(MAID 1545，参见美国专利No.9,113,616的图8A，该专利以引用方式并入本文)。因此，小鼠TCRB D1-J1-C1和D2-J2被替换为人V、D和J区段，而大部分小鼠V区段缺失。小鼠IgM增强子(Eμ)也插入在TCRB C2的5'，但其也可使用本领域已知的方法缺失(例如在用于电穿孔的靶向载体中)。任选地，小鼠TCR Vβ31基因也可缺失。

为了进行人IgH V_H区段的另外的插入，使MAID 1545中的Hyg基因失活(也参见图11)。这可在靶向之前或之后通过以下方式进行：(1)使用CRISPR/Cas9或锌指核酸酶(ZFH)向Hyg编码序列中引入小indel突变，使得无法再制得功能性Hyg蛋白(参见2015年6月5日提交的美国专利申请No.14/731,914，该专利申请以引用方式并入本文)；或(2)通过同源重组替换为Loxp-Neo-Loxp盒，随后用Cre去除该盒。

所得CAR基因座的接合序列与上表8中所列相同。通过测定法筛选Neo抗性ES细胞，以鉴别正确靶向的克隆。由于1545等位基因包含上游Hyg-Loxp盒，LTVEC A中的Loxp位点允许确定哪个TCRB等位基因在1545het ES细胞中被靶向；因此，这两个Loxp位点之间的区域的Cre缺失用于确定与野生型Tcrb等位基因相比哪些克隆被靶向至1545等位基因。

在策略2中，保留Tcrb基因座的基本组织(5'与3'Try基因簇之间的V区段，以及3'Try基因簇与Tcrb2恒定区之间的D和J区段)。具体地讲，通过以下方式修饰包含14个人TCRBV区段及所有人TCRB D和J区段的ES细胞(参见美国专利No.9,113,616(以引用方式并入本文)的图7)：首先利用大靶向载体(LTVEC B，参见图12)，将包含人TCRB D和J区段的区域替换为免疫球蛋白重链D和J区段，该大靶向载体从5’到3’包含：(1)包含小鼠Try基因的5’同源臂(小鼠Try基因未按比例示出；TCR B基因座包含多种Try基因)，(2)HYG选择盒和(3)所有人免疫球蛋白重链D和J区段，(4)小鼠Eμ基因序列，以及(5)包含小鼠TCR B恒定区、小鼠Eβ基因和小鼠TCR Vβ31基因区段的3’同源臂(图13的步骤1)。

在该修饰及该选择盒去除后，利用大靶向载体(LTVEC D，参见图12)，通过电穿孔对ES细胞进行进一步修饰，该大靶向载体从5’到3’包含：(1)包含小鼠Try基因(Try7)的5’同源臂，(2)NEO选择盒，(3)三个人免疫球蛋白重链可变基因区段，以及(4)包含小鼠Try基因(Try4)的3’同源臂(参见图13的步骤3)。

所得的ES细胞包含人免疫球蛋白重链V基因区段V_H1-3、V_H1-2和V_H6-1、所有人免疫球蛋白重链D和J基因区段、以及小鼠免疫球蛋白Eμ增强子、小鼠TCR B恒定区、小鼠TCR B增强子和远侧3’小鼠TCR Vβ31基因区段。在该策略中的每一步，使用如上所述测定法确认特定LTVEC的成功引入。

ES细胞中的最终TCR B基因座包含下列接合序列，其中小鼠序列位于括号中，人序列采用正常字体，多克隆位点采用粗体，并且Frt序列采用斜体：

表9：策略2的TCR B CAR基因座的接合序列(5'到3')

作为上述策略2的替代形式，并不引入LTVEC B，而是引入LTVEC C(参见图12)，后者不包含小鼠Eμ。用于生成嵌合TCR B CAR基因座的另外的策略在临时申请、美国专利申请No.62/052,947、No.62/076,836、No.62/094,603、No.62/167,650(以引用方式并入本文)中有描述。最后，如图13所示，可使用各种策略(包括使用CRISPR/Cas9技术)，使远侧3’TCR Vβ31缺失。

可使用Cre或Flpo酶去除留下的任何选择盒(参见例如图13)。如果策略1或策略2需要的话，使用LTVEC将另外的人V_H区段添加到TCR可变区基因座，这些LTVEC具有连接到与初始插入片段重叠的人IgH序列的上述5'小鼠Tcrb同源臂。

上述的被靶向ES细胞用作供体ES细胞，并通过方法引入8细胞期的小鼠胚胎中。使用检测独特基因序列存在与否的改编的等位基因测定法，通过基因分型鉴别独立地携带嵌合人IgH V–小鼠Tcrb C基因的(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。

实例2.3：嵌合抗原受体小鼠的构建

使携带嵌合人IgκV–小鼠Tcra C基因和嵌合人IgH V–小鼠Tcrb C基因的小鼠一起交配，从而生成包含这两个嵌合基因座的小鼠。包含这两个嵌合基因座的小鼠在其T细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含T细胞受体恒定结构域和免疫球蛋白可变结构域(小鼠T细胞受体恒定结构域和人免疫球蛋白可变结构域)。使子代交配至对于每个嵌合基因呈纯合性。

作为另一种选择，使用包含嵌合人Igκ–小鼠Tcra C基因或嵌合人IgH V–小鼠TcrbC基因的ES细胞来引入包含另一嵌合基因(分别为嵌合人IgH V–小鼠Tcrb C基因或嵌合人Igκ–小鼠Tcra C基因)的靶向载体，并且通过如上所述的方法，由这些ES细胞生成携带这两种嵌合基因的小鼠。

在细胞表面上检测嵌合人Igκ–小鼠Tcra C/嵌合人IgH V–小鼠Tcrb C抗原受体的表达。一种用于检测的方法将以下(1)、(2)和(3)进行组合：(1)使用标准技术检测TCR恒定区表达的FACS分析(抗TCRα抗体F1(3A8)#TCR1145，Thermo-Pierce；抗TCRβ抗体F1(8A3)#TCR1151，Thermo-Pierce；抗TCRα-β异二聚体抗体克隆T10B9.1A-31，BD-Pharmigen；抗TCRα-β异二聚体抗体克隆IP26；eBioscience)，(2)使用相同抗体确认嵌合蛋白大小的蛋白印迹，(3)RT-PCT，其使用与免疫球蛋白可变区段序列退火的正向引物组合和与TCR恒定区序列退火的引物来确认嵌合转录物的表达。另外，可使用抗CD3和抗TCRα-β抗体的组合来确认TCR/CD3复合体在细胞表面上的形成。还使用如上所述的下一代测序来确认嵌合转录物的表达。

实例3：人Igκ可变区区段在携带Igκ/TCRα嵌合抗原受体基因座的小鼠的T细胞中的应用

从三只小鼠收集胸腺细胞和脾细胞，这些细胞在其基因组中包含CAR基因座，其中TCRα可变区被替换为部分人Igκ可变区(图14和图15中的4个功能性V_κ和5个功能性J_κ–参见如图6所示生成的小鼠；图16和图17中的16个功能性V_κ和5个功能性J_κ–参见如图7所示生成的小鼠)。使用抗CD90.2磁珠和管柱(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))，通过磁性细胞分选从总脾细胞中正向富集T细胞。使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(凯杰公司(Qiagen))，根据制造商的说明从纯化的脾T细胞和胸腺细胞中分离总RNA。

使用SMARTer^TMRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)和TCRα特异性引物(5'–TCAAAGTCGGTGAACAGGCAGAG-3'；SEQ ID NO:143)进行逆转录，以生成包含TCRα恒定区序列的cDNA。在该过程中，DNA序列(PIIA：5'–CCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT-3'；SEQ IDNO:144)被附接到新合成的cDNA的3'端。使用凝胶和PCR纯化试剂盒(Clontech)纯化cDNA。

然后使用PIIA特异性引物(5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；SEQ ID NO:145)和TCRα特异性引物(5'–ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACAGCAGGTTCTGGGTTCTGGATG-3'；SEQ ID NO:146)，通过PCR扩增纯化的cDNA。在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并且使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))分离和纯化长度在400至700bp之间的片段。使用下列引物，通过PCR进一步扩增这些片段：5'–AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-3'和5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(分别为SEQID NO:147和SEQ ID NO:148；“XXXXXX”表示能实现多重样品测序的6bp索引序列)。在上样于Miseq测序仪(亿明达公司(Illumina))进行测序之前，使用KAPA文库定量试剂盒(卡帕生物系统公司(KAPA Biosystems))，通过qPCR对400bp至600bp之间的PCR产物进行分离、纯化和定量。

对于生物信息学分析而言，基于样品索引完全匹配来分选所得的Illumina序列，并为了质量而进行修剪。然后使用igblast(NCBI,v2.2.25+)的本地安装，基于重排Igκ序列与人生殖系V和J区段数据库及重排TCRα序列与小鼠生殖系V和J区段数据库的比对，对重叠配偶对进行组装和注释。当检测到得分相同的多个最佳匹配时，将序列标记为不明确并从分析中移除。开发了一组perl脚本，以分析结果并将数据存储在mysql数据库中。

对于包含4个功能性V_κ和5个功能性J_κ的小鼠而言，如图14所示，序列分析表明，CAR基因座中的Igκ可变结构域在CAR转基因小鼠的T细胞和胸腺细胞中经历了VJ重组，其中约80％读段包含最近侧Vκ基因区段(IGVK4-1)，该基因区段在脾和胸腺两者中与不同Jκ基因区段重排。如图15所示，从脾T细胞扩增的大部分重排人IgκVJ序列是有效的。

对于包含16个功能性V_κ和5个功能性J_κ的小鼠而言，如图16所示，序列分析表明，CAR基因座中的Igκ可变结构域在CAR转基因小鼠的脾T细胞和胸腺细胞中经历了VJ重组。这些重排涉及所有功能性人Vκ和Jκ区段，其中约40％读段包含最近侧Vκ基因区段(IGVK4-1)。如图17所示，从脾T细胞和胸腺扩增的约2/3重排人IgκVJ序列是有效的。

实例4：人IgH可变区区段在携带IgH/TCRβ嵌合抗原受体基因座的小鼠的T细胞中的应用

收集来自四只小鼠的胸腺细胞及来自三只小鼠的脾细胞，所述胸腺细胞在其基因组中包含CAR基因座，其中TCRβ可变区被替换为部分人IgH可变区(3个功能性人VH及所有功能性人D和JH基因区段，参见图13)，并且所述脾细胞在其基因组中包含相同CAR(IgH+TCRCβ)基因座。使用抗CD90.2磁珠和管柱(美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotech))，通过磁性细胞分选从总脾细胞中正向富集T细胞。使用RNeasy Plus RNA分离试剂盒(凯杰公司(Qiagen))，根据制造商的说明从纯化的脾T细胞和胸腺细胞中分离总RNA。

使用SMARTer^TMRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)和TCRβ特异性引物(5'–CGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGC-3'；SEQ ID NO:149)进行逆转录，以生成包含TCRβ恒定区序列的cDNA。在该过程中，DNA序列(5'–CCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT-3'；SEQ ID NO:150)被附接到新合成的cDNA的3'端。使用凝胶和PCR纯化试剂盒(Clontech)纯化cDNA。

然后使用引物5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACCTTGGGTGGAGTCACATTTCTC-3’和5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(分别为SEQ ID NO:151和152)通过PCR扩增纯化的cDNA。使用下列引物，通过PCR进一步扩增这些片段：5’–AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’和5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(“XXXXXX”为六核苷酸条形码序列；(分别为SEQ ID NO:153和154))。在上样于Miseq测序仪(亿明达公司(Illumina))进行测序之前，使用KAPA文库定量试剂盒(卡帕生物系统公司(KAPA Biosystems))，通过qPCR对490至710个碱基对之间的PCR产物进行分离、纯化和定量。

对于生物信息学分析而言，对所得的Illumina序列进行多重分解并为了质量而进行修剪。然后使用igblast(NCBI,v2.2.25+)的本地安装，基于重排IgH序列与人生殖系V、D和J区段数据库的比对，对重叠配对末端读段进行组装和注释。当检测到得分相同的多个最佳匹配时，将序列标记为不明确并从分析中移除。开发了一组PERL脚本，以分析结果并将数据存储在mysql数据库中。

对于包含3个功能性人V_H及所有功能性人D和J_H的小鼠而言，如图18所示，序列分析表明，CAR基因座中的IgH可变区在CAR转基因小鼠的脾和胸腺中经历了VDJ重组。示出了V_H和J_H区段的分析。如图19所示，从脾或胸腺扩增的大部分重排人IgH VDJ序列是有效的。

实例5：由携带嵌合抗原受体基因座的小鼠生成抗原结合蛋白

在使如上文在实例2中所述包含经改造的嵌合抗原受体基因座人Igκ–小鼠Tcra C和人IgH V–小鼠Tcrb C的小鼠交配之后，用目标抗原(例如，将在MHC上递呈的抗原，如病毒肽-MHC抗原、肿瘤肽-MHC抗原、自身免疫肽-MHC抗原)对所选择的小鼠进行免疫接种。在抗原激发后，使用经标记的四聚化形式免疫原进行分选，从而从动物回收抗原特异性T细胞。确定所分选的CAR T细胞的Igκ和IgH可变区的序列，并且以分别在人TCRα和TCRβ恒定区上游有效连接的方式克隆这些可变区序列。将嵌合核酸序列引入报告T细胞系中。在表达用于免疫接种的肽-MHC复合体的靶细胞上筛选报告T细胞系，并且选择对目标抗原具有所需特性(例如，亲和力、选择性、表位等)的CAR。确定所选择的CAR的Igκ和IgH可变区的序列，并且以分别在人Igκ和IgH恒定区上游有效连接的方式克隆这些可变区序列，以生成对所靶向的肽-MHC复合体具有特异性的人抗体。这些抗体可用于靶向表达目标肽-MHC的被感染细胞或肿瘤细胞，使之破坏。作为另一种选择，如果肽-MHC靶标参与诱导自身免疫性，则这些抗体可用于阻断自身免疫T细胞的激活，从而缓解疾病的症状。另外，从本文所述CAR小鼠的免疫接种获得的嵌合人CAR克隆可用于例如引入到从人患者获得的T细胞中，从而实现适应性T细胞转移。

参考引用

特此将本文提及的所有出版物、专利和专利申请以引用的方式全文并入，就如同明确且独立地指明将每篇单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入。在发生冲突的情况下，以本专利申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案

本领域技术人员将认识到或者仅仅利用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同方案。这些等同方案旨在包括在以下权利要求中。

序列表

<110> 雷杰纳荣制药公司(REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.)

<120> 嵌合抗原受体

<130> RPB-010.25

<140>

<141>

<150> 62/167,650

<151> 2015-05-28

<150> 62/094,603

<151> 2014-12-19

<150> 62/076,836

<151> 2014-11-07

<150> 62/052,947

<151> 2014-09-19

<150> 62/052,901

<151> 2014-09-19

<160> 155

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成肽”

<400> 1

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val Asn Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成肽”

<400> 2

Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr

1 5

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 3

atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg gggtaccggg 60

ccccccctcg agaagttcct attccgaagt tcctattctc 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 4

tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttccta gggcgatcgc gtgcatggca 60

ctgacatagg ccattgttaa cagggtccca gcagctggtc 100

<210> 5

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 5

gataaattat tttgtcagac aacaataaaa atcaatagca cgccctaaga gcggccgcca 60

ccgcggtgga gctcaggttt ccggtactta acaacagagc acagatttag tggtgaggga 120

ctct 124

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 6

ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 7

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 8

gaacacggcg gcatcag 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 9

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 10

acgagcgggt tcggcccatt c 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 11

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 12

gtcaagcact gctggcacac 20

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 13

aacccttgtg ctattgaatt gctatgctgt cag 33

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 14

tgttgtagac cctccgccac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 15

ccccgtcctc ctcctttttc 20

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 16

tcatgtccat taacccattt accttttgcc ca 32

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 17

tgcaagtgct gccagcaag 19

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 18

cagtaaggga agagactaca acagcat 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 19

tgcacactgc tcaccactgc aagctat 27

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 20

tgctggtggc cccatct 17

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 21

gaactcagct atgatagtgt cgaatgta 28

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 22

cagcccagca gctgtgggtt ctc 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 23

gctcagggag aacacagaac ttaga 25

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成寡核苷酸”

<400> 24

tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc gg 42

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 25

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 26

acgagcgggt tcggcccatt c 21

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 27

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 28

cgacgtctgt cgagaagttt ctg 23

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 29

agttcgacag cgtgtccgac ctga 24

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 30

cacgccctcc tacatcgaa 19

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 31

tgtcgggcgt acacaaatcg 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 32

ccgtctggac cgatggctgt gt 22

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 33

gggcgtcggt ttccactatc 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 34

caaatggaag tagcacgtct cact 24

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 35

ctcgtgcaga tggacagcac cgc 23

<210> 36

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 36

ccgctgcccc aaagg 15

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 37

gtcaagcact gctggcacac 20

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 38

aacccttgtg ctattgaatt gctatgctgt cag 33

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 39

tgttgtagac cctccgccac 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 40

ttgcctttct cacacctgca g 21

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 41

cagcccatcc tgtcacttcg ctgga 25

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 42

tggcccaaca gtacagctca g 21

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 43

tcagtcaatc acctttccca gc 22

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 44

tccccaggta gcctcatgaa ccaatgtt 28

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 45

cacattactg agtccccaca ggg 23

<210> 46

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 46

accattgcag tttacccacg gttaggattt tt 32

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 47

tcttgcaatg ggatcatcag atg 23

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 48

ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 49

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 50

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 50

gaacacggcg gcatcag 17

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 51

gttcaggccc cacagactct c 21

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 52

tcctctctgg agcaaccatg aagttccct 29

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 53

cctgaagcca tgagggcag 19

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 54

agggtaggct ctcctgaatc g 21

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 55

acaggcgccg gacctctggt 20

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 56

ccaaagaaac tgacgcctca c 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 57

gcgccacatg aatttgacca g 21

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 58

tgtacccaat cttccaaaga aagagctg 28

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 59

ggcatcctgt cctcccttc 19

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 60

cagtaaggga agagactaca acagcat 27

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 61

tgcacactgc tcaccactgc aagctat 27

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 62

tgctggtggc cccatct 17

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 63

gaactcagct atgatagtgt cgaatgta 28

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 64

cagcccagca gctgtgggtt ctc 23

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 65

gctcagggag aacacagaac ttaga 25

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 66

ccccgtcctc ctcctttttc 20

<210> 67

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 67

tcatgtccat taacccattt accttttgcc ca 32

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 68

tgcaagtgct gccagcaag 19

<210> 69

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 69

gtcttttttg ttcttcacag ttgagcttca tcaaagtcac atgggttaaa ctctatggag 60

tagtcagaac acactcttca gaagggactc ctgatttcaa agggtaccga agttcctatt 120

ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttc 156

<210> 70

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 70

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct agggtttcac 60

cggtggcgcg cctaacagag aggaaagtca aattataaag aatatgagat tcagaattct 120

gattaactgt gg 132

<210> 71

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 71

cgattatgac tggttaggta gaaaggtg 28

<210> 72

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 72

gccactggtt tctccaaatg ttttcaatcc at 32

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 73

gggagtactt ggagatccct aagc 24

<210> 74

<211> 136

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 74

ttgagcttca tcaaagtcac atgggttaaa ctctatggag tagtcagaac acactcttca 60

gaagggactc ctgatttcaa agggtaccga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag 120

aaagtatagg aacttc 136

<210> 75

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 75

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct agggtttcac 60

cggtggcgcg ccaggaccca ggctctgaca ctcaggctgc caatacaatt gccatgaaga 120

cagatgttga tg 132

<210> 76

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成寡核苷酸”

<400> 76

tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc gg 42

<210> 77

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 77

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 78

acgagcgggt tcggcccatt c 21

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 79

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 80

cgacgtctgt cgagaagttt ctg 23

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 81

agttcgacag cgtgtccgac ctga 24

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 82

cacgccctcc tacatcgaa 19

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 83

tgtcgggcgt acacaaatcg 20

<210> 84

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 84

ccgtctggac cgatggctgt gt 22

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 85

gggcgtcggt ttccactatc 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 86

gtcaagcact gctggcacac 20

<210> 87

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 87

aacccttgtg ctattgaatt gctatgctgt cag 33

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 88

tgttgtagac cctccgccac 20

<210> 89

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 89

ttgcctttct cacacctgca g 21

<210> 90

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 90

cagcccatcc tgtcacttcg ctgga 25

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 91

tggcccaaca gtacagctca g 21

<210> 92

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 92

tcagtcaatc acctttccca gc 22

<210> 93

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 93

tccccaggta gcctcatgaa ccaatgtt 28

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 94

cacattactg agtccccaca ggg 23

<210> 95

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 95

cattgtcaaa gaagcactgg aaatg 25

<210> 96

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 96

accattgcag tttacccacg gttaggattt tt 32

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 97

tcttgcaatg ggatcatcag atg 23

<210> 98

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 98

ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 99

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 100

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 100

gaacacggcg gcatcag 17

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 101

caggtgcaaa ggtgaccaca g 21

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 102

tgggtcctgc ccatccatgc a 21

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 103

ggcagcctga gtgtcagagc 20

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 104

gttcaggccc cacagactct c 21

<210> 105

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 105

tcctctctgg agcaaccatg aagttccct 29

<210> 106

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 106

cctgaagcca tgagggcag 19

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 107

gcgccacatg aatttgacca g 21

<210> 108

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 108

tgtacccaat cttccaaaga aagagctg 28

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 109

ggcatcctgt cctcccttc 19

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 110

cagtaaggga agagactaca acagcat 27

<210> 111

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 111

tgcacactgc tcaccactgc aagctat 27

<210> 112

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 112

tgctggtggc cccatct 17

<210> 113

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 113

gaactcagct atgatagtgt cgaatgta 28

<210> 114

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 114

cagcccagca gctgtgggtt ctc 23

<210> 115

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 115

gctcagggag aacacagaac ttaga 25

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 116

ccccgtcctc ctcctttttc 20

<210> 117

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 117

tcatgtccat taacccattt accttttgcc ca 32

<210> 118

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 118

tgcaagtgct gccagcaag 19

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 119

tggctccaag aacagtttgc c 21

<210> 120

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 120

ccctgacttt gctgctcaac tcacagcc 28

<210> 121

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 121

ggtccagtgg aatctgccat g 21

<210> 122

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 122

catttggcta catatcaaag ccg 23

<210> 123

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 123

cctgagccag ggaacagccc actgata 27

<210> 124

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 124

acatggctga ggcagacacc 20

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 125

tgggccgtta tgctagtacc a 21

<210> 126

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 126

tggctttacc ccttttgaag ggccc 25

<210> 127

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 127

cacagctgaa gcaggatgag c 21

<210> 128

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 128

tctctgagca gccatcccc 19

<210> 129

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成探针”

<400> 129

ttctcctttg gtgtagaggg caccagc 27

<210> 130

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 130

accaggcatg gcagaaagg 19

<210> 131

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 131

gtcttttttg ttcttcacag ttgagcttca tcaaagtcac atgggttaaa ctctatggag 60

tagtcagaac acactcttca gaagggactc ctgatttcaa agggtaccga agttcctatt 120

ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttc 156

<210> 132

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 132

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct agggtttcac 60

cggtggcgcg cctgagtagt gctttaggtg tgtaatcacc aaagatttag tgaagtccct 120

gtgcaaggag 130

<210> 133

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 133

ataataatta ataataataa atagtaaatt tctgtagaat cataatgagg tctagacccc 60

cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcggtaccg aagttcctat tccgaagtt 119

<210> 134

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 134

tctagaaagt ataggaactt cctagggttt caccggtggc gcgccgagct ttctggttca 60

gccagggaca cagaaccagg aagacatcgt ggcttttcta 100

<210> 135

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 135

ctttggaaaa tgggactcag gttgggtgcg tctgatggag taactgagcc tctagactga 60

gcattgcaga ctaatcttgg atatttgtcc ctgagggagc cggctg 106

<210> 136

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 136

aaacttctta aaattactct attattcttc cctctgatta ttggtctcca ctcgagtgcc 60

atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagataaagc ttggagacag ctctcaactt 120

caccctttct gggggagcgg gatgaaaagg ga 152

<210> 137

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 137

gggggggtgg ggtggaggag gagggtacag catctcctct ccttcctctc tggtaccgaa 60

gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 100

<210> 138

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 138

tattctctag aaagtatagg aacttcctag ggtttcaccg gtgcgatcgc atatccatgt 60

gtgtccattc tggttcagcc agggacacag aaccaggaag 100

<210> 139

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 139

caggcttgca gtcctgggca gactccgtca cctctctatg cctcagcctt ggcgcgcctt 60

tcaaattgtt gttgagttca aagtgggcaa cagaaaaggg ggtgtgag 108

<210> 140

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 140

aataattaat aataataaat agtaaatttc tgtagaatca taatgaggtc tagacccccg 60

ggctcgataa ctataacggt cctaaggtag cgaaccggta taacttcgta taaggtatcc 120

tatacgaagt tatctcgagg gggggcccgg taccgattca atgtccacac ccggggctgg 180

agcgtagcca tgagccacgc 200

<210> 141

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 141

ctttggaaaa tgggactcag gttgggtgcg tctgatggag taactgagcc tctagactga 60

gcattgcaga ctaatcttgg atatttgtcc ctgagggagc cggctg 106

<210> 142

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成多核苷酸”

<400> 142

aaacttctta aaattactct attattcttc cctctgatta ttggtctcca ctcgagtgcc 60

atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagataaagc ttggagacag ctctcaactt 120

caccctttct gggggagcgg gatgaaaagg ga 152

<210> 143

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 143

tcaaagtcgg tgaacaggca gag 23

<210> 144

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成寡核苷酸”

<400> 144

cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30

<210> 145

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 145

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57

<210> 146

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 146

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacagcag gttctgggtt ctggatg 57

<210> 147

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (30)..(35)

<223> a、c、t、g、未知或其他

<400> 147

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60

tccgatc 67

<210> 148

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (25)..(29)

<223> a、c、t、g、未知或其他

<400> 148

caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tgactggagt tcagacgtgt gctcttccga 60

tct 63

<210> 149

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 149

cgagggtagc cttttgtttg tttgc 25

<210> 150

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成寡核苷酸”

<400> 150

cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30

<210> 151

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 151

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaccttg ggtggagtca catttctc 58

<210> 152

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<400> 152

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57

<210> 153

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (30)..(35)

<223> a、c、t、g、未知或其他

<400> 153

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60

tccgatct 68

<210> 154

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成引物”

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (25)..(30)

<223> a、c、t、g、未知或其他

<400> 154

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

<210> 155

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释“人工序列的说明：合

成肽”

<400> 155

Ser Gly Ser Gly

1

Claims

1.一种在其生殖系中包含嵌合抗原受体(CAR)基因座的经遗传修饰的非人动物，所述CAR基因座包含：

具有非重排免疫球蛋白(Ig)可变区基因区段的非重排可变区基因座；以及

具有T细胞受体(TCR)恒定区的恒定区基因座；

其中人非重排Ig可变区基因区段有效连接至所述TCR恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，所述CAR多肽包含由来源于所述非重排Ig可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由所述TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。

2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人源的。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为内源物种来源的。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为小鼠TCR恒定区基因或大鼠TCR恒定区基因。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig重链(IgH)可变区基因区段。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig轻链(IgL)可变区基因区段。

7.根据权利要求6所述的经遗传修饰的非人动物，其中IgL可变区基因区段为人κ基因区段。

8.根据权利要求6所述的经遗传修饰的非人动物，其中IgL可变区基因区段为λ基因区段。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为TCRα恒定区基因。

10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRα链。

11.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR基因座位于内源TCRα基因座处。

12.根据权利要求9所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。

13.根据权利要求11所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。

14.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCR恒定区基因为TCRβ恒定区基因。

15.根据权利要求14所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRβ链。

16.根据权利要求14所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。

17.根据权利要求16所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。

18.根据权利要求16所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。

19.一种在其生殖系中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座的经遗传修饰的非人动物，

所述第一CAR基因座包含具有非重排免疫球蛋白(Ig)V_H、D_H和J_H基因区段的第一非重排可变区基因座以及具有T细胞受体β(TCRβ)恒定区基因的第一恒定区基因座，其中所述非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至所述TCRβ恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达第一CAR多肽链，所述第一CAR多肽链包含由来源于所述非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段的重排重链可变区基因编码的Ig重链可变结构域以及由所述TCRβ恒定区基因编码的TCRβ恒定结构域，并且

所述第二CAR基因座包含具有非重排Ig V_κ和J_κ基因区段的第二非重排可变区基因座以及具有T细胞受体α(TCRα)恒定区基因的第二恒定区基因座，其中所述非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至所述TCRα恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达第二CAR多肽链，所述第二CAR多肽链包含由来源于所述非重排Ig V_κ和J_κ基因区段的重排Igκ可变区基因编码的Igκ可变结构域以及由所述TCRα恒定区基因编码的TCRα恒定结构域，

其中所述经遗传修饰的非人动物表达包含所述第一CAR多肽链和所述第二CAR多肽链的CAR。

20.根据权利要求19所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述Ig V_H、D_H和J_H基因区段和/或所述Ig V_κ和J_κ基因区段为人源的。

21.根据权利要求19或20所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因和/或所述TCRα恒定区基因为内源物种来源的。

22.根据权利要求19或20所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因和/或所述TCRα恒定区基因为小鼠基因或大鼠基因。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物不表达功能性TCRα链和/或功能性TCRβ链。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述第二CAR基因座位于内源TCRα基因座处。

25.根据权利要求24所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig V_κ和J_κ基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。

26.根据权利要求24或25所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述第一CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。

28.根据权利要求27中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。

29.根据权利要求27或28所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCI类α链多肽。

31.根据权利要求30所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述一种或多种嵌合I类α链多肽选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和HLA-L。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达人β-2-微球蛋白多肽。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCII类α链多肽，和/或一种或多种包含人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHC II类β链多肽。

34.根据权利要求33所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述一种或多种嵌合MHC II类α链多肽选自HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和HLA-DRA，并且/或者所述一种或多种嵌合MHC II类β链多肽选自HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和HLA-DRB。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8α链多肽，和/或包含人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8β链多肽。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物表达嵌合CD4多肽，所述嵌合CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域和细胞质结构域。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述CAR在所述经遗传修饰的非人动物的T细胞上表达。

39.根据权利要求38所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述T细胞在所述经遗传修饰的非人动物的胸腺中经历阳性和阴性选择。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述经遗传修饰的非人动物为啮齿动物。

41.根据权利要求40所述的经遗传修饰的非人动物，其中所述啮齿动物为小鼠。

42.一种制备表达对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR的T细胞的方法，包括：

(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；以及

(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞。

43.一种根据权利要求42所述的方法制备的T细胞。

44.一种制备表达对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR的T细胞杂交瘤的方法，包括：

(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；

(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞；以及

(c)由步骤(b)的所述T细胞制备T细胞杂交瘤。

45.一种根据权利要求44所述的方法制备的T细胞杂交瘤。

46.一种用于制备编码对在MHC上递呈的肽具有特异性的Ig可变结构域的核酸的方法，包括：

(a)使根据权利要求1至41中任一项所述的非人动物暴露于包含肽的抗原或编码包含肽的抗原的核酸，使得所述肽被递呈在所述非人动物中的MHC上；

(c)从所述T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸。

47.一种根据权利要求46所述的方法制备的、编码对在MHC上递呈的肽具有特异性的Ig可变结构域的核酸。

48.一种用于制备对在MHC上递呈的肽具有特异性的抗体的方法，包括：

(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的T细胞；

(c)从所述T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸；

(d)将编码所述Ig可变结构域的所述核酸与Ig恒定结构域在宿主细胞中有效连接；以及

(e)在使得所述宿主细胞表达包含所述Ig可变结构域和所述Ig恒定结构域的抗体的条件下培养所述宿主细胞。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述Ig恒定结构域为人Ig恒定结构域。

50.一种根据权利要求48或49所述的方法制备的、对在MHC上递呈的肽具有特异性的抗体。

51.一种用于制备表达包含人Ig可变结构域和人TCR恒定结构域的CAR的人细胞的方法，包括：

(b)从(a)的所述经遗传修饰的非人动物获得表达对在所述MHC上递呈的所述肽具有特异性的CAR的非人动物T细胞；

(c)从所述非人动物T细胞分离编码所述CAR的Ig可变结构域的核酸；以及

(d)将编码所述Ig可变结构域的所述核酸与编码人TCR恒定结构域的核酸在人细胞中有效连接，使得所述人细胞表达包含所述Ig可变结构域和所述人TCR恒定结构域的CAR。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述人细胞为人T细胞。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述人T细胞为离体分离的人T细胞。

54.一种根据权利要求51至53中任一项所述的方法制备的、表达包含人Ig可变结构域和人TCR恒定结构域的CAR的人细胞。

55.一种从根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的、表达CAR的细胞。

56.根据权利要求55所述的细胞，其中所述细胞为T细胞。

57.根据权利要求55所述的细胞，其中所述细胞为T细胞杂交瘤。

58.一种从根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的、包含重排Ig可变区基因的核酸。

59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述核酸编码CAR。

60.一种从根据权利要求55至57中任一项所述的细胞获得的或可获得的、包含重排Ig可变区基因的核酸。

61.根据权利要求60所述的核酸，其中所述核酸编码CAR。

62.根据权利要求60至61中任一项所述的核酸，其中所述重排Ig可变区基因编码对在MHC上递呈的肽具有特异性的Ig可变结构域。

63.一种从根据权利要求1至41中任一项所述的经遗传修饰的非人动物获得的或可获得的、对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR。

64.一种从根据权利要求55至57中任一项所述的细胞获得的或可获得的、对在MHC上递呈的肽具有特异性的CAR。

65.一种在其基因组中包含嵌合抗原受体(CAR)基因座的非人胚胎干(ES)细胞，所述CAR基因座包含：

具有T细胞受体(TCR)恒定区基因的恒定区基因座；

其中所述非重排Ig可变区基因区段有效连接至所述TCR恒定区基因。

66.根据权利要求65所述的非人ES细胞，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人源的。

67.根据权利要求65或66所述的非人ES细胞，其中所述TCR恒定区基因为内源物种来源的。

68.根据权利要求65或66所述的非人ES细胞，其中所述TCR恒定区基因为小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。

69.根据权利要求65至68中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig重链(IgH)可变区基因区段。

70.根据权利要求65至68中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig轻链(IgL)可变区基因区段。

71.根据权利要求70所述的非人ES细胞，其中IgL可变区基因区段为人κ基因区段。

72.根据权利要求70所述的非人ES细胞，其中IgL可变区基因区段为λ基因区段。

73.根据权利要求65至72中任一项所述的非人ES细胞，其中所述TCR恒定区基因为TCRα恒定区基因。

74.根据权利要求73所述的非人ES细胞，其中所述CAR基因座位于内源TCRα基因座处。

75.根据权利要求74所述的非人ES细胞，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。

76.根据权利要求74或75所述的非人ES细胞，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。

77.根据权利要求68至72中任一项所述的非人ES细胞，其中所述TCR恒定区基因为TCRβ恒定区基因。

78.根据权利要求77所述的非人ES细胞，其中所述CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。

79.根据权利要求78所述的非人ES细胞，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。

80.根据权利要求78或79所述的非人ES细胞，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。

81.一种在其基因组中包含第一CAR基因座和第二CAR基因座的非人ES细胞，

所述第一CAR基因座包含具有非重排免疫球蛋白(Ig)V_H、D_H和J_H基因区段的第一非重排可变区基因座以及具有T细胞受体β(TCRβ)恒定区基因的第一恒定区基因座，其中所述非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至所述TCRβ恒定区基因，并且

所述第二CAR基因座包含具有非重排Ig V_κ和J_κ基因区段的第二非重排可变区基因座以及具有T细胞受体α(TCRα)恒定区基因的第二恒定区基因座，其中所述非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至所述TCRα恒定区基因。

82.根据权利要求65至81中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞在其基因组中包含一个或多个编码嵌合MHC I类α链多肽的核酸序列，所述嵌合MHC I类α链多肽具有人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域。

83.根据权利要求82所述的非人ES细胞，其中所述MHC I类α链多肽选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-g、HLA-K和HLA-L。

84.根据权利要求65至83中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞在其基因组中包含编码人β-2-微球蛋白多肽的核酸序列。

85.根据权利要求65至84中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞在其基因组中包含一个或多个编码具有人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHCII类α链多肽的核酸序列，和/或一个或多个编码具有人胞外结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合MHC II类β链多肽的核酸序列。

86.根据权利要求85所述的非人ES细胞，其中所述嵌合MHC II类α链多肽选自HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA和HLA-DRA，并且/或者所述MHC II类β链多肽选自HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB和HLA-DRB。

87.根据权利要求65至86中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞在其基因组中包含编码具有人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8α链多肽的核酸序列，和/或编码具有人胞外免疫球蛋白结构域和内源物种来源的细胞质结构域的嵌合CD8β链多肽的核酸序列。

88.根据权利要求65至87中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞在其基因组中包含编码嵌合CD4多肽的核酸序列，所述嵌合CD4多肽包含人D1免疫球蛋白结构域、人D2免疫球蛋白结构域、人D3免疫球蛋白结构域、内源物种来源的D4免疫球蛋白结构域和细胞质结构域。

89.根据权利要求65至88中任一项所述的非人ES细胞，其中所述非人ES细胞为啮齿动物ES细胞。

90.根据权利要求89所述的非人ES细胞，其中所述啮齿动物ES细胞为小鼠ES细胞。

91.一种制备表达CAR的经遗传修饰的非人动物的方法，所述方法包括使用根据权利要求65至90中任一项所述的非人ES细胞。

92.一种使用根据权利要求91所述的方法生成的或从根据权利要求91所述的方法可获得的经遗传修饰的非人动物。

93.一种非人胚胎，包含根据权利要求65至90中任一项所述的非人ES细胞。

94.一种嵌合抗原受体(CAR)基因座，包含：

具有T细胞受体(TCR)恒定区的恒定区基因座；

95.根据权利要求94所述的CAR基因座，其中所述Ig可变区基因区段为人源的。

96.根据权利要求94或权利要求95所述的CAR基因座，其中所述TCR恒定区基因为啮齿动物TCR恒定区基因。

97.根据权利要求96中任一项所述的CAR基因座，其中所述啮齿动物TCR恒定区为小鼠TCR恒定区。

98.一种CAR基因座，包含具有非重排免疫球蛋白(Ig)V_H、D_H和J_H基因区段的非重排可变区基因座以及具有T细胞受体β(TCRβ)恒定区基因的恒定区基因座，其中所述非重排Ig V_H、D_H和J_H基因区段有效连接至所述TCRβ恒定区基因。

99.根据权利要求98所述的CAR基因座，其中所述Ig V_H、D_H和J_H基因区段为人源的。

100.根据权利要求98或99所述的CAR基因座，其中所述TCRβ恒定区基因为小鼠TCRβ恒定区基因。

101.一种CAR基因座，包含具有非重排Ig V_κ和J_κ基因区段的非重排可变区基因座以及具有T细胞受体α(TCRα)恒定区基因的恒定区基因座，其中所述人非重排Ig V_κ和J_κ基因区段有效连接至所述TCRα恒定区基因。

102.根据权利要求101所述的CAR基因座，其中所述Ig V_κ和J_κ基因区段为人源的。

103.根据权利要求101或102所述的CAR基因座，其中所述TCRα恒定区基因为小鼠TCRα恒定区基因。

104.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含具有Ig重链可变结构域和TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有Ig轻链可变结构域和TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中所述CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。

105.根据权利要求104所述的CAR，其中所述Ig轻链可变结构域为Igκ可变结构域。

106.根据权利要求104所述的CAR，其中所述Ig轻链可变结构域为Igλ可变结构域。

107.根据权利要求104至105中任一项所述的CAR，其中所述Ig重链可变结构域和所述Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。

108.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含具有Ig重链可变结构域和TCRα恒定结构域的第一CAR多肽，以及具有Ig轻链可变结构域和TCRβ恒定结构域的第二CAR多肽，其中所述CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。

109.根据权利要求108所述的CAR，其中所述Ig轻链可变结构域为Igκ可变结构域。

110.根据权利要求108所述的CAR，其中所述Ig轻链可变结构域为Igλ可变结构域。

111.根据权利要求108至110中任一项所述的CAR，其中所述Ig重链可变结构域和所述Ig轻链可变结构域为人Ig可变结构域。

112.一种表达根据权利要求103至111中任一项所述的CAR的细胞。

113.根据权利要求112所述的细胞，其中所述细胞为T细胞。

114.一种在受试者中诱导对肽/MHC复合体的免疫应答的方法，包括给所述受试者施用表达嵌合抗原受体(CAR)的人T细胞，所述嵌合抗原受体包含具有人Ig重链可变结构域和人TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽以及具有人Ig轻链可变结构域和人TCRα恒定结构域的第二CAR多肽，其中所述CAR对所述肽/MHC复合体具有结合特异性。

115.一种核酸组合物，包含编码具有Ig重链可变结构域和TCRβ恒定结构域的第一CAR多肽的第一核酸序列，以及编码具有Ig轻链可变结构域和TCRα恒定结构域的第二CAR多肽的第二核酸序列，其中包含所述第一CAR多肽和所述第二CAR多肽的CAR对肽/MHC复合体具有结合特异性。

116.一种制备具有遗传修饰的非人动物的方法，包括对所述非人动物进行改造以在其生殖系中包含嵌合抗原受体(CAR)基因座，所述CAR基因座包含：

具有T细胞受体(TCR)恒定区的恒定区基因座；

其中所述人非重排Ig可变区基因区段有效连接至所述TCR恒定区基因，使得所述经遗传修饰的非人动物表达CAR多肽，所述CAR多肽包含由来源于所述非重排Ig可变区基因区段的重排Ig可变区基因编码的Ig可变结构域以及由所述TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人源的。

118.根据权利要求116或权利要求117所述的方法，其中所述TCR恒定区基因为内源物种来源的。

119.根据权利要求116或权利要求117所述的方法，其中所述TCR恒定区基因为小鼠TCR恒定区基因或大鼠TCR恒定区基因。

120.根据权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig重链(IgH)可变区基因区段。

121.根据权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述非重排Ig可变区基因区段为人Ig轻链(IgL)可变区基因区段。

122.根据权利要求121所述的方法，其中IgL可变区基因区段为人κ基因区段。

123.根据权利要求121所述的方法，其中IgL可变区基因区段为λ基因区段。

124.根据权利要求116至123中任一项所述的方法，其中所述TCR恒定区基因为TCRα恒定区基因。

125.根据权利要求124所述的方法，其中所述CAR基因座位于内源TCRα基因座处。

126.根据权利要求125所述的方法，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRα可变区基因区段。

127.根据权利要求125所述的方法，其中所述TCRα恒定区基因为内源TCRα恒定区基因。

128.根据权利要求116至123中任一项所述的方法，其中所述TCR恒定区基因为TCRβ恒定区基因。

129.根据权利要求128所述的方法，其中所述CAR基因座位于内源TCRβ基因座处。

130.根据权利要求129所述的方法，其中所述非重排人Ig可变区基因区段替换内源TCRβ可变区基因区段。

131.根据权利要求129所述的方法，其中所述TCRβ恒定区基因为内源TCRβ恒定区基因。

132.根据权利要求116至131中任一项所述的方法，其中所述非人动物为啮齿动物。

133.根据权利要求132所述的方法，其中所述啮齿动物为小鼠。