CN113272319A - T细胞受体的变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供T细胞受体的变体，其由2条多肽组合而成，所述多肽包含选自由α链、β链、γ链和δ链组成的组中的T细胞受体链的恒定区，所述变体的特征在于，该多肽不包含该T细胞受体链的互补决定区(CDR)、α链的互补决定区(CDR)和β链的互补决定区(CDR)。
Description
技术领域
本发明涉及T细胞受体的变体以及表达该变体的细胞等。
背景技术
T细胞在针对细菌、病毒等外来的病原体、癌细胞等异常的细胞的免疫系统中发挥核心的作用。其中，细胞毒性T细胞(CTL)介由存在于其细胞表面上的T细胞受体(TCR)识别被与抗原呈递细胞的I型主要组织相容性抗原一同呈递的来自病毒、肿瘤等的抗原肽，针对呈递作为异物的该抗原肽的细胞特异性地发挥细胞杀伤活性。
如此，T细胞在免疫系统中发挥核心的作用，因此，正在开发T细胞疗法，所述方法将识别来自病毒、肿瘤等的抗原肽的TCR基因、嵌合抗原受体(CAR)等导入至来自患者的细胞、或者HLA基因型相同或实质上相同的同种细胞中，在体外(in vitro)人为地制备大量的癌抗原特异性T细胞，输注至生物体内。然而，接受基因导入的T细胞中存在有内源性TCR，内源性TCR与导入的TCR进行竞争，与TCR在细胞表面的表达所必需的CD3分子结合，产生了阻碍导入的TCR表达这样的问题。另外，也指出了经基因导入的TCR链有与内源性TCR链错配的问题。此外，在使用同种细胞的情况下，还存在内源性TCR识别受体的抗原，引起移植物抗宿主病(GvHD)的可能性。
作为解决上述问题的方法，已报道了将α链的可变区(Vα)和β链的可变区(Vβ)融合至TCRβ链的恒定区(Cβ)而成的单链嵌合TCR、和TCRα链的恒定区(Cα)导入至细胞中的方法，并报道了认为利用该方法能抑制与内源性TCRα链的错配，从而抑制不期望的体内(invivo)作用(非专利文献1)。另外，还报道了通过向所导入的TCR的α链和β链的恒定区中导入半胱氨酸，可抑制被导入的TCR链与内源性TCR链的错配(非专利文献2)。然而，上述文献主要聚焦于防止在导入的TCR链与内源性TCR链之间发生错配，而并未针对内源性TCR链的同种异体反应性(Alloreactivity)进行验证，另外，也并未公开或教导不具有对于抗原-HLA复合体的识别而言重要的TCRα链和β链中任何互补决定区(CDR)的TCR变体。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Knies D.等，Oncotarget,7(16):21199-21221(2016)
非专利文献2：Kuball J.等，blood,109(6):2331-2338(2007)
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的课题为提供不具有T细胞受体(TCR)α链和β链中任何的互补决定区(CDR)的新型T细胞受体的变体。另外，以提供表达该变体的、同种异体反应性(Alloreactivity)被抑制的T细胞为课题。
用于解决课题的手段
本申请的发明人对能够解决上述课题的、同种异体反应性被抑制的T细胞进行了研发，意外地发现在导入了不包含TCRα链和β链的CDR的T细胞受体的变体的细胞中，被认为是由内源性TCR导致的同种异体反应性得到了抑制。另外，发现将TCR链的不同链组合、即具有αβTCR的恒定区和γδTCR的CDR的修饰TCR同样也能够抑制T细胞的同种异体反应性。基于上述发现而进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明提供了以下内容。
[1]变体，其是由2条多肽组合而成的T细胞受体的变体，所述多肽包含选自由α链、β链、γ链和δ链组成的组中的T细胞受体链的恒定区，所述变体的特征在于，该多肽不包含该T细胞受体链的互补决定区(CDR)、α链的互补决定区(CDR)和β链的互补决定区(CDR)。
[2][1]所述的变体，其中，所述多肽中的一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区，另一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区。
[2a][2]所述的变体，其中，所述多肽中的至少一者包含T细胞受体γ链的互补决定区(CDR)、及/或T细胞受体δ链的互补决定区(CDR)。
[2b][2a]所述的变体，其中，所述多肽中的至少一者所包含的恒定区为α链的恒定区，互补决定区(CDR)为γ链的互补决定区(CDR)。
[2c][2a]或[2b]所述的变体，其中，所述多肽中的至少一者所包含的恒定区为β链的恒定区，互补决定区(CDR)为δ链的互补决定区(CDR)。
[3][1]～[2c]中任一项所述的变体，其中，两条多肽通过1个以上的二硫键而键合。
[3a][1]～[3]中任一项所述的变体，所述多肽还包含1个以上信号肽。
[3b][3a]所述的变体，所述信号肽结合于T细胞受体链的恒定区的N末端。
[3c][3a]所述的变体，所述信号肽为CD8及/或IGH的信号肽。
[4]核酸分子，其编码[1]～[3c]中任一项所述的变体。
[5]载体，其含有[4]所述的核酸分子。
[6]细胞的制造方法，其包括将[5]所述的载体导入的步骤。
[6a]多能干细胞，其含有编码[1]～[3c]中任一项所述的变体的核酸。
[6b][6a]所述的多能干细胞，所述多能干细胞为人工多能干细胞(iPS细胞)。
[7]细胞，其表达[1]～[3c]中任一项所述的变体。
发明的效果
本发明的T细胞受体的变体在导入至细胞后，能够抑制该细胞的同种异体反应性，因此能够降低同种移植中的移植物抗宿主病(GvHD)的风险。
附图简介
[图1]图1示出了针对表达不包含TCR链的可变区、包含C区的TCR的变体的T细胞，利用流式细胞术对细胞膜表面上的CD3分子的表达进行检测的结果。横轴表示CD3分子的细胞膜表面表达，纵轴表示细胞数量。
[图2]图2示出了通过流式细胞术对在使利用慢病毒载体导入了AB6基因的iPS细胞分化而得的细胞膜上进行表达的CD3、CD5、CD7和αβTCR的表达进行测定的结果。
具体实施方式
(发明的详细说明)
1、T细胞受体的变体
本发明提供T细胞受体的变体(以下，有时称为“本发明的变体”)，其由2条多肽组合而成，所述多肽包含选自由α链、β链、γ链和δ链组成的组中的T细胞受体链(TCR)的恒定区。本发明的变体的特征是，不包含TCRα链和β链的互补决定区(CDR)、或同一种类的链的互补决定区(CDR)(优选为含有该CDR的可变区的部分或全部)；以及，不包含作为恒定区来源的T细胞受体链的互补决定区(CDR)、或同一种类的链的互补决定区(CDR)(优选为含有该CDR的可变区的部分或全部)。因此，本发明的变体不包括天然型或人工型(例如，作为恒定区和可变区的来源的动物种不同)的αβTCR、γδTCR、或者向这些TCR中进一步添加氨基酸而得的TCR变体。例如，相当于本发明的变体的至少一条链的多肽包含T细胞受体α链的恒定区的情况下，该多肽不包含T细胞受体α链的CDR，优选不包含含有该CDR的可变区的部分或全部，但可以包含α链和β链以外的、不同的TCR链(例如γ链、δ链)的CDR、可变区。同样地，相当于本发明的变体的至少一条链的多肽包含T细胞受体β链的恒定区的情况下，该多肽不包含T细胞受体β链的CDR，优选不包含含有该CDR的可变区的部分或全部，但可以包含α链和β链以外的、不同的TCR链(例如γ链、δ链)的CDR、可变区。对于γ链和δ链也是同样。在本发明的一个方式中，T细胞受体β链包含T细胞受体β1链(序列号2)或T细胞受体β2链(序列号3)。在本发明的一个方式中，T细胞受体β链包含T细胞受体β1链(序列号2)和T细胞受体β2链(序列号3)。
另外，本发明的多肽可还附加有膜转移信号肽(以下，称为“信号肽”)。作为信号肽，除CD8、免疫球蛋白-H(IGH)、CD4以外，可使用来源于编码具有跨膜结构域的各种肽的基因的膜转移信号肽、及/或、包含在所述信号肽的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸而得的氨基酸序列、或与所述信号肽的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列的信号肽。附加信号肽时的结合位置和信号肽的数量没有特别的限定。
本说明书中，“T细胞受体(TCR)”意指由TCR链(α链、β链、γ链、δ链)的二聚体构成、识别抗原或该抗原-HLA(人白细胞抗原)(MHC；主要组织相容性基因复合体)复合体、向T细胞传递刺激信号的受体。各个TCR链由可变区和恒定区构成，可变区中存在3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)。TCR的变体意指各多肽至少包含所述TCR链的恒定区的、该TCR链的二聚体。
在本发明的一个方式中，提供了构成本发明的变体的多肽中的一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区(也称为C区)、另一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区的变体。对该变体而言，一条多肽优选包含：TCRγ链的CDR、优选含有该CDR的TCRγ链的可变区的部分或全部；及/或TCRδ链的CDR、优选含有该CDR的TCRδ链的可变区的部分或全部。包含所述可变区的至少一部分的情况下，优选的是，构成本发明的变体的多肽中的至少一者的恒定区为TCRα链或β链的恒定区，且CDR为γ链或δ链的CDR。更优选的是，构成本发明的变体的多肽中的一者的恒定区为TCRα链的恒定区、CDR为γ链的CDR，且多肽中的另一者的恒定区为TCRβ链的恒定区、CDR为δ链的CDR。
作为本发明的一个方式，提供了不包含含有TCR链的CDR的可变区的部分或全部、而包含C区的变体。该变体可以为例如一条多肽包含T细胞受体α链或β链的恒定区，另一条包含T细胞受体α链或β链的恒定区。另外，该变体可以为例如一条多肽包含T细胞受体γ链或δ链的恒定区，另一条包含T细胞受体γ链或δ链的恒定区。另外，该变体可以为例如一条多肽包含T细胞受体α链或β链的恒定区，另一条包含T细胞受体γ链或δ链的恒定区。
作为构成本发明的变体的多肽，可举出例如包含如下TCRα链的恒定区的多肽(以下称为“多肽1”)，所述恒定区包含序列号1所示的氨基酸序列、在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸而得的氨基酸序列、或与序列号1所示的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列。另外，作为构成本发明的变体的多肽，可举出例如包含如下TCRβ链的恒定区的多肽(以下分别称为“多肽2”和“多肽3”)，所述恒定区由序列号2或3所示的氨基酸序列、在序列号2或3所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸而得的氨基酸序列、或与序列号2或3所示的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方式中，本发明的变体包含所述多肽1(TCRα链的恒定区)和多肽2(TCRβ1链的恒定区)、或所述多肽1(TCRα链的恒定区)和多肽3(TCRβ2链的恒定区)。
作为本发明的一个实施方式，为了使不包含含有TCR链的CDR的可变区的部分或全部、而包含C区的变体(例如，由前述多肽1和多肽2、或前述多肽1和多肽3组成的变体)在细胞膜表面上更高效地表达，优选对至少任一条多肽进一步附加信号肽。作为信号肽，CD8、IGH是优选的。附加信号肽时的结合位置没有特别的限定，优选附加至包含TCR的C区的多肽的C末端或N末端，更优选附加至N末端。附加信号肽时的信号肽的数量没有特别的限定，优选相对于各多肽添加1个以上，优选添加1个。
作为信号肽，可举出例如由序列号4(CD8)或5(IGH)所示的氨基酸序列、在序列号4或5所示的氨基酸序列中分别缺失、取代、插入及/或添加1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸而得的氨基酸序列、或与序列号4或5所示的氨基酸序列分别具有同一性的氨基酸序列组成的信号肽(以下分别称为“信号肽4”和“信号肽5”)。
在本发明的优选的实施方式中，本发明的变体包含所述信号肽5添加至多肽1的N末端而得的序列号8或11所示的多肽(以下，称为“多肽8”和“多肽11”)、和所述信号肽4添加至多肽2的N末端而得的序列号7或10所示的多肽(以下，称为“多肽7”和“多肽10”)。
另外，在本发明的其他的优选实施方式中，包含多肽8或多肽11、和所述信号肽4添加至多肽3的N末端而得的序列号13或15所示的多肽(以下，称为“多肽13”和“多肽15”)。
另外，作为构成本发明的变体的多肽，可举出包含TCRγ链的可变区的多肽。另外，作为构成本发明的变体的多肽，可举出包含TCRδ链的可变区的多肽。
本说明书中，“同一性”意指90％以上的(例如：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者更高)同一性。氨基酸序列的同一性可以在以下条件下(期待值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)，利用同源性计算算法的NCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行计算。为了确定同一性，理解为将全长的本发明的序列与其他序列进行比较。换言之，本发明中的同一性排除了将本发明的序列的短片段(例如1～3个氨基酸)与其他序列进行比较、或反过来的情况。
本发明的变体所包含的TCR链的恒定区、可变区和CDR的来源没有特别限制，优选来自哺乳动物(例如：小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴、人)，其中更优选人源。
另外，对于本发明的变体所包含的TCR链的恒定区而言，优选在天然型TCR链的恒定区中施以规定的修饰。作为该修饰，例如，可举出将天然型TCR的恒定区的特定氨基酸残基取代为半胱氨酸残基(例如：将由序列号1所示的氨基酸序列组成的恒定区的第48位的苏氨酸(Threonine)取代为半胱氨酸，将由序列号2或序列号3所示的氨基酸序列组成的恒定区的第56位或第55位的丝氨酸取代为半胱氨酸)，从而使基于α链和β链间的二硫键的二聚体表达效率亢进等，但不限于这些。在优选的实施方式中，2条多肽通过1个以上、优选2个以上的二硫键而键合是优选的，该二硫键是在变体的各多肽所包含的半胱氨酸残基(可以是天然型中包含的，也可以是如上所述地人为导入的半胱氨酸残基)之间，通过氧化或翻译后修饰而形成的。
本发明的变体可使用下文所述的本发明的核酸或载体，以基因工程的方式进行制备。例如，可以通过如下方法制备：将编码构成本发明的变体的一条多肽的核酸和编码另一条多肽的核酸均导入至细胞，使各多肽表达并形成二聚体，利用自身已知的方法分离该二聚体。
2.编码本发明的变体的核酸或含有该核酸的载体
本发明提供编码上述本发明的TCR的核酸(以下，有时称为“本发明的核酸”。作为本发明的核酸，编码构成本发明的变体的一条多肽的核酸和编码另一条多肽的核酸可以包含于不同的分子中，编码这两条多肽的核酸也可以包含于同一分子中。
本发明的核酸可以是DNA，也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合体，优选为DNA。另外，该核酸可以是双链，也可以是单链。双链的情况下，可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA的杂合体。核酸为RNA的情况下，关于RNA的序列，将序列表中的T替换记载为U。另外，本发明的核酸只要能在体外或细胞中表达多肽，则可含有天然核苷酸、修饰核苷酸、核苷酸类似物、或它们的混合物。
本发明的核酸可通过自身已知的方法制备。例如，可以基于TCR链的已知的DNA序列信息，以涵盖该序列的期望部分的方式合成寡聚DNA引物，使用利用具有该序列的细胞制得的总RNA或者mRNA级分作为模板，通过RT-PCR法扩增，从而进行克隆。或者，可以通过以化学方式合成DNA链，或者将合成的部分重叠(overlap)的寡聚DNA短链利用PCR法(重叠PCR法)、Gibson组装法进行连接，从而构建编码其全长或一部分的DNA。
本发明的核酸可组入表达载体。因此，本发明提供含有上述本发明的核酸的表达载体(以下，有时称为“本发明的载体”)。
作为本发明的载体中使用的启动子，例如，可使用泛素启动子、EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(Moloney小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等。其中，优选泛素启动子、EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLVLTR、CMV启动子、SRα启动子等。
对于本发明的载体而言，除了上述启动子以外，可根据期望而含有转录及翻译调节序列、核糖体结合位点、增强子、复制起点、多聚A附加信号、筛选标记基因等。作为筛选标记基因，例如，可举出二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。
在本发明的一个方式中，可将含有编码构成上述本发明的变体的一条多肽的核酸和编码另一条多肽的核酸的表达载体导入靶细胞内，在细胞内、细胞表面构成两条多肽的异源二聚体。这种情况下，编码构成本发明的变体的一条多肽的核酸和编码另一条多肽的核酸可组入不同的表达载体，也可组入1个表达载体。组入1个表达载体时，这2种核酸优选介由能实现多顺反子表达的序列而组入。通过使用能实现多顺反子表达的序列，能够使组入1种表达载体中的多个基因更高效地表达。作为能实现多顺反子表达的序列，例如，可举出2A序列(例：来源于口蹄疫病毒(FMDV)的2A序列(F2A)、来源于马鼻炎A病毒(ERAV)的2A序列(E2A)、来源于猪捷申病毒(PTV-1)的2A序列(P2A)、来源于东亚细亚病毒(Thosea asignavirus)(TaV)的2A序列(T2A序列)(PLoS ONE 3,e2532,2008、Stem Cells 25,1707,2007等)、内部核糖体进入位点(IRES)(U.S.Patent No.4,937,190)等，从表达量均一的观点考虑，优选2A序列。另外，2A序列中，优选P2A序列及T2A序列。
作为可用于本发明的表达载体，可举出病毒载体、质粒载体等。作为病毒载体，可举出逆转录病毒载体(包括慢病毒载体、假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒、附加型载体(episomal vector)等。另外，可使用转座子表达体系(PiggyBac体系)。作为质粒载体，可举出动物细胞表达质粒(例如，pa1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。
3.表达本发明的变体的T细胞
本发明提供了导入有本发明的核酸或载体的细胞(以下，有时称为“本发明的细胞”)。本发明的细胞优选表达本发明的变体。
作为导入本发明的核酸或表达载体的细胞，例如，可举出淋巴细胞、淋巴细胞的祖细胞(progenitor cell)、多能干细胞。在本发明中，“淋巴细胞”意指脊椎动物的免疫系统中的白细胞的亚型之一，作为淋巴细胞，可举出T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)。作为导入本发明的核酸或载体的细胞，优选多能干细胞。
在本发明中，“T细胞”意指CD3阳性细胞。作为表达本发明的变体的T细胞，例如，可举出作为CD8阳性细胞的细胞毒性T细胞(CTL)、作为CD4阳性细胞的辅助T细胞、控制性T细胞、效应T细胞等，优选为细胞毒性T细胞。表达本发明的变体的T细胞可以通过将本发明的核酸或载体导入至自生物体采集的T细胞来获得。或者，可以通过从导入了本发明的核酸或载体的多能干细胞或淋巴细胞的祖细胞诱导分化成T细胞来获得表达本发明的TCR的T细胞(即，来源于该具有多能性的细胞或祖细胞的T细胞)。
在本发明的一个方案中，除CD3外，T细胞有时还表达CD5及/或CD7。CD5及/或CD7有时也在生物体内的T细胞中于其细胞表面表达。T细胞表达CD5及/或CD7的情况下，CD3在T细胞中通过与TCR形成复合体而表达于细胞表面，与之相对，CD5和CD7在不与TCR分子形成复合体的情况下进行表达。
本发明的细胞(例：细胞毒性T细胞)除了该细胞原本具有的TCR基因外，还具有来自本发明的核酸或载体的外源性TCR基因。本发明的细胞与从生物体采集而得的细胞在这一点上有所区别。除本发明的变体外，本发明的细胞还可表达嵌合抗原受体(CAR)。
前述淋巴细胞可以从人或非人哺乳动物的诸如末梢血、骨髓和脐带血采集。在将表达本发明的变体的细胞用于癌等疾病的治疗时，该细胞群优选从治疗对象本人、或与治疗对象的HLA型一致的供体采集。
作为淋巴细胞的祖细胞，例如，可举出造血干细胞、失去了自复制能力的多能祖细胞(multipotent progenitor：MMP)、骨髓淋巴共同祖细胞(myelo-lymphoid progenitor)(MLP)、髓系祖细胞(myeloid progenitor)(MP)、粒细胞单核祖细胞(granulo-monocyteprogenitor)(GMP)、巨噬细胞-树突状细胞祖细胞(macrophage-dendritic cellprogenitor)(MDP)、树突状细胞祖细胞(dendritic cell precursor)(DCP)等。作为多能干细胞，例如，可举出胚胎干细胞(embryonic stem cell：ES细胞)、人工多能干细胞(inducedpluripotent stem cell：iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)等。上述多能干细胞为ES细胞或来自人胚胎的任意细胞的情况下，该细胞可以是破坏胚胎而制得的细胞，也可以是不破坏胚胎而制得的细胞，优选为不破坏胚胎而制得的细胞。
本说明书中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指，胚胎干细胞(ES细胞)和潜在地具有与其同样的分化多能性、即分化为生物体的各种组织(全部内胚层、中胚层、外胚层)的能力的细胞。作为具有与ES细胞同样的分化多能性的细胞，可举出“人工多能干细胞”(本说明书中，也被称为“iPS细胞”)。
作为“ES细胞”，为小鼠ES细胞时，可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ES细胞株，为人ES细胞时，可利用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如，作为人ES细胞株，可利用NIH的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research的H1株、H9株、理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
本说明书中，“人工多能干细胞(iPS细胞)”是指，通过向哺乳动物体细胞或未分化干细胞导入特定的因子(核重编程因子)进行重编程而得到的细胞。目前，“人工多能干细胞”存在各种细胞，除了由山中等人通过向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc这4种因子而建立的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，也可使用将同样的4种因子导入人成纤维细胞而建立的来源于人细胞的iPS细胞(Takahashi K,Yamanaka S.等，Cell,(2007)131:861-872.)、导入上述4种因子之后以Nanog的表达作为指标分选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,andYamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、通过不含c-Myc的方法制备的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.等，Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、通过无病毒方法导入6种因子而建立的iPS细胞(Okita K等，Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,OkitaK等，Stem Cells.31(3):458-66.)。另外，也可使用由Thomson等制备的导入OCT3/、SOX2、NANOG、LIN28这4种因子而建立的人工多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.等，Science(2007)318:1917-1920.)、由Daley等制备的人工多能干细胞(Park IH,Daley GQ.等，Nature(2007)451:141-146)、由樱田等制备的人工多能干细胞(日本特开2008-307007号)等。
此外，也可使用已公开的全部论文(例如，Shi Y.,Ding S.等，Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.等，Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.等，Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或者专利(例如，日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的该领域中已知的人工多能干细胞中的任何。
作为人工多能性细胞株，可利用NIH、理研、京都大学等建立的各种iPS细胞株。例如，为人iPS细胞株时，可举出理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等。
在本发明中，“造血祖细胞”是指能分化为血细胞类细胞的多能干细胞(multipotent stem cell)。就人而言，其主要存在于骨髓，分化为白细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)、红细胞、血小板、肥大细胞、树突状细胞。另外在本发明中，“造血祖细胞”意指CD34阳性细胞，优选为CD34/CD43双阳性(DP)细胞。用于本发明的造血祖细胞的来源没有限制，例如，可以是通过下述方法，对多能干细胞进行分化诱导而得的造血祖细胞，还可以是从生物体组织中通过已知的手段分离而得的造血祖细胞。
向多能干细胞或淋巴细胞的祖细胞导入本发明的核酸或表达载体的情况下，优选使该细胞通过自身已知的方法分化为淋巴细胞、优选T细胞。作为使多能干细胞分化为T细胞的方法，例如，可举出包括(1)使导入有本发明的核酸或载体的多能干细胞分化为造血祖细胞的步骤、和(2)使该造血祖细胞分化为T细胞的步骤的方法。就前述步骤(1)而言，可举出如国际公开第2013/075222号、国际公开第2016/076415号及Liu S.等，Cytotherapy,17(2015)；344-358等中所记载的那样在向造血祖细胞诱导的培养基中培养多能干细胞的方法。另外，就前述步骤(2)而言，可举出如国际公开第2016/076415号等中所记载的那样、包括(2-1)从造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤及(2-2)从CD4CD8双阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞的步骤的方法。
将本发明的核酸或载体导入细胞的方法没有特别限定，可以利用已知的方法。导入核酸、质粒载体的情况下，可通过例如磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、显微注射法、脂质体转染法等来进行。例如，可使用例如下述文献中记载的方法：细胞工学别册8新细胞工学实验方案，263-267(1995)(秀润社发行)；病毒学(Virology)，第52卷，456(1973)；日本药理学杂志(Folia Pharmacol.Jpn.),第119卷(第6号),345-351(2002)等。使用病毒载体的情况下，可以将本发明的核酸导入至合适的包装细胞(例如Plat-E细胞)、互补细胞株(例如293细胞)，回收培养上清液中产生的病毒载体，利用与各病毒载体相对应的合适的方法使该载体感染细胞，从而导入细胞中。例如，使用逆转录病毒载体作为载体的具体手段已公开于国际公开第2007/69666号、Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等中。另外，使用慢病毒作为载体的具体手段已公开于Zufferey R.等，Nat Biotechnol,15(9):871-895(1997)等中。尤其在使用逆转录病毒载体时，通过使用作为重组纤连蛋白片段的CH-296(Takara Bio公司制)，能够向各种细胞中高效地导入基因。或者，也可利用基因组编辑(例如，CRISPR体系、TALEN、ZFN等)将本发明的核酸或载体导入细胞的基因组。
本发明的核酸还可以作为RNA的形态直接导入细胞，用于在细胞内表达本发明的变体。作为RNA的导入方法，可使用已知的方法，例如，可优选使用脂质体转染法、电穿孔法等。
本发明的变体的表达可以例如使用识别本发明的变体的一部分(例：TCR链的恒定区等)的抗体，通过免疫学手段进行检测或测定。作为免疫学的手段，例如，可举出抗体阵列、流式细胞术分析、放射性同位元素免疫测定法(RIA法)、ELISA、Western印迹、免疫组织染色、酶免疫测定法(EIA法)、荧光免疫测定法(FIA)、免疫层析法等。
可以通过自身已知的方法，确认细胞的同种异体反应性被本发明的变体抑制。例如，用表达本发明的变体的细胞、和未表达该变体的对象的细胞进行混合白细胞反应(MLR)、Elispot试验、有限稀释试验(Limitting dilution assay)等，在表达该变体的细胞中于至少任一项试验中得到同种异体反应性低的结果的情况下，可以评价为本发明的变体使同种异体反应性得到抑制。
4.本发明的细胞的制造方法
本发明提供细胞的制造方法(以下，有时称为“本发明的制法”)，其包括将本发明的核酸或载体导入至细胞的步骤。导入了本发明的核酸或载体的细胞、导入方法等如前文3.中所述。前述细胞优选表达本发明的变体。本发明的变体的表达可以通过前文3.中记载的方法进行检测或测定。
在本发明的制法的一个方式中，提供了T细胞的制法，包括(1)使导入有本发明的核酸或载体的多能干细胞分化为造血祖细胞的步骤、和(2)使该造血祖细胞分化为T细胞的步骤。
(1)使多能干细胞分化为造血祖细胞的步骤(步骤(1))
作为从多能干细胞向造血祖细胞分化的方法，只要能向造血祖细胞分化则没有特殊限制，例如，可举出如国际公开第2013/075222号、国际公开第2016/076415号及Liu S.等，Cytotherapy,17(2015)；344-358等中所记载的那样在向造血祖细胞诱导的培养基中培养多能干细胞的方法。
在本发明中，向造血祖细胞诱导的培养基没有特别限定，可以将可用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基进行配制。作为基础培养基，例如，可举出Iscove'sModified Dulbecco's Medium(IMDM)培养基、Medium 199培养基、Eagle's MinimumEssential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、NeurobasalMedium(Life Technologies)、它们的混合培养基等。培养基中可含有血清，或者也可在不含血清的情况下使用。根据需要，基础培养基中可含有例如维生素C类(例：抗坏血酸)、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
本发明中，所谓维生素C类，是指L-抗坏血酸及其衍生物，所谓L-抗坏血酸衍生物，是指在生物体内经酶反应而成为维生素C的物质。作为用于本发明中的抗坏血酸的衍生物，可示例磷酸维生素C、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸乙醚、维生素C酯、四己基癸醇抗坏血酸酯(ascorbyl tetrahexyldecanoate)、抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸酯(ascorbyl 2-phosphate 6-palmitate)。优选为磷酸维生素C，例如，可举出磷酸-L-抗坏血酸Na或磷酸-L-抗坏血酸Mg等磷酸-L-抗坏血酸盐。
步骤(1)中使用的优选的基础培养基为含有血清、胰岛素、转铁蛋白、丝氨酸、硫代甘油、L-谷氨酰胺、抗坏血酸的IMDM培养基。
步骤(1)中使用的培养基可进一步添加选自由BMP4(骨形态发生蛋白4，Bonemorphogenetic protein 4)、VEGF(血管内皮生长因子，vascular endothelial growthfactor)、SCF(干细胞因子，Stem cell factor)和FLT-3L(Flt3配体)组成的组中的至少1种细胞因子。更优选为添加了VEGF、SCF及FLT-3L的培养基。
步骤(1)中使用维生素C类的情况下，优选每4天、每3天、每2天、或每1天另行添加(补充)维生素C类，优选每天添加。该维生素C类在培养液中的浓度没有特别限制，优选相当于5ng/ml～500ng/ml的量(例：相当于5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml的量)。
步骤(1)中使用BMP4的情况下，培养基中的BMP4的浓度没有特别限制，优选为10ng/ml～100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)，更优选为20ng/ml～40ng/ml。
步骤(1)中使用VEGF的情况下，培养基中的VEGF的浓度没有特别限制，优选为10ng/ml～100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)，其中，优选为20ng/ml。
步骤(1)中使用SCF的情况下，培养基中的SCF的浓度没有特别限制，优选为10ng/ml～100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)，其中，优选为30ng/ml。
步骤(1)中使用FLT-3L的情况下，培养基中的FLT-3L的浓度没有特别限制，优选为1ng/ml～100ng/ml(例：1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)，其中，优选为10ng/ml。
步骤(1)中，多能干细胞的培养可以是贴壁培养或悬浮培养。贴壁培养的情况下，可使用包被有包被剂的培养容器进行，也可与其他细胞进行共培养。作为进行共培养的其他细胞，可示例C3H10T1/2(Takayama N.等，J Exp Med.2817-2830,2010)、来自异种的基质细胞(Niwa A等，J Cell Physiol.2009Nov；221(2):367-77.)。作为包被剂，可示例基质胶(Niwa A等，PLoS One.6(7):e22261,2011)。悬浮培养中，可示例Chadwick等，Blood 2003,102:906-15、Vijayaragavan等，Cell Stem Cell 2009,4:248-62、及Saeki等，Stem Cells2009,27:59-67中记载的方法。
步骤(1)中，培养温度的条件没有特别限制，例如，优选为37℃～42℃左右、37℃～39℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可一边监测造血祖细胞的数量，一边适当确定。只要能得到造血祖细胞，则天数没有特别限定，例如为至少6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、14天以上，优选为14天。在造血祖细胞的制造中，培养时间长的情况通常不会成为问题，但优选为例如35天以下，更优选为21天以下。另外，可在低氧条件下培养，本发明中，所谓低氧条件，可示例15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或它们以下的氧浓度。
(2)使造血祖细胞分化为T细胞的步骤(步骤(2))
作为从造血祖细胞向T细胞分化的方法，只要能使造血祖细胞向T细胞分化则没有特殊限制，例如，可举出如国际公开第2016/076415号等中记载的那样、包括(2-1)从造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤、和(2-2)从CD4CD8双阳性T细胞诱导CD8阳性T细胞的步骤的方法。造血前体优选是从通过步骤(1)得到的细胞群中、利用造血祖细胞的标志物预先分离的。作为该标志物，可举出选自由CD43、CD34、CD31和CD144组成的组中的至少一者。
(2-1)从造血祖细胞诱导CD4CD8双阳性T细胞的步骤(步骤(2-1))
在本发明中，作为向CD4CD8双阳性T细胞分化的方法，例如，可举出在向CD4CD8双阳性T细胞诱导的培养基中培养造血祖细胞的方法。
在本发明中，作为向CD4CD8双阳性T细胞分化诱导的培养基没有特别限制，可以将可用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基进行配制。基础培养基可举出与上述步骤(1)中使用的相同的培养基。培养基中可含有血清，或者也可在无血清的情况下使用。根据需要，基础培养基中可含有例如维生素C类、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子等。
步骤(2-1)中使用的优选的基础培养基为含有血清、转铁蛋白、丝氨酸、和L-谷氨酰胺的αMEM培养基。向基础培养基添加维生素C类的情况下，维生素C类与步骤(1)的情况相同。
步骤(2-1)中使用的培养基可还含有作为细胞因子的FLT-3L及/或IL-7，更优选为添加有FLT-3L和IL-7的培养基。
步骤(2-1)中使用IL-7的情况下，培养基中的IL-7的浓度优选为1ng/ml～50ng/ml(例：1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml)，其中，优选为5ng/ml。
步骤(2-1)中使用FLT-3L的情况下，FLT-3L与上述步骤(1)同样地使用。
步骤(2-1)中，造血祖细胞可以贴壁培养或悬浮培养，贴壁培养的情况下，可将培养容器包被进行使用，也可与饲养细胞等进行共培养。作为进行共培养的饲养细胞，可示例骨髓基质细胞株OP9细胞(可自理研BioResource Center获得)。该OP9细胞优选为恒定地表达DLL4或DLL1的OP9-DL4细胞或OP9-DL1细胞(例如，Holmes R1和Zuniga-PfluckerJC.Cold Spring Harb Protoc.2009)。在本发明中，使用OP9细胞作为饲养细胞的情况下，可通过将另外准备的DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1与Fc等的融合蛋白适宜添加至培养基来进行。使用饲养细胞的情况下，优选适宜地更换该饲养细胞来进行培养。饲养细胞的更换可通过将培养中的对象细胞移至预先接种的饲养细胞上来进行。该更换可基于每5天、每4天、每3天、或每2天来进行。另外，悬浮培养类胚体而得到造血祖细胞的情况下，优选在使其解离为单细胞后进行贴壁培养。虽然也可与饲养细胞进行共培养，但优选不使用饲养细胞而进行培养。
作为贴壁培养、且包被培养容器的情况下的包被剂，例如，可举出基质胶(Niwa A等，PLos One,6(7):e22261,2011))、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、RetroNectin、DLL4或DLL1、或者DLL4或DLL1与抗体的Fc区等的融合蛋白(例：DLL4/Fcchimera)、巢蛋白(entactin)、及/或它们的组合，优选RetroNectin、及DLL4与Fc等的融合蛋白的组合。
步骤(2-1)中，培养温度的条件没有特别限制，例如，优选为37℃～42℃左右、37℃～39℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可一边监测CD4CD8双阳性T细胞的数量等，一边适当确定。只要能得到造血祖细胞，则天数没有特别限定，例如为至少10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、18天以上、20天以上、22天以上、23天以上，优选为23天。另外，优选为90天以下，更优选为42天以下。
(2-2)从CD4CD8双阳性(DP)T细胞诱导CD8阳性T细胞(CD3单阳性T细胞)的步骤(步骤(2-2))
将通过步骤(2-1)得到的CD4/CD8DPT细胞供于诱导分化为CD8阳性T细胞的步骤，由此可以诱导向CD8阳性T细胞分化。
作为步骤(2-2)中使用的基础培养基和培养基，可举出与步骤(1)中记载的基础培养基和培养基同样的培养基。
所述培养基可包含肾上腺皮质激素剂。作为肾上腺皮质激素剂，可举出糖皮质激素及其衍生物，作为该糖皮质激素，例如，可举出乙酸可的松、氢化可的松、乙酸氟氢可的松、泼尼松龙、去炎松、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松。优选地塞米松。
使用地塞米松作为肾上腺皮质激素剂的情况下，培养基中的地塞米松的浓度优选为1nM～100nM(例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM)，其中，优选为10nM。
前述培养基可含有抗体(例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体)、细胞因子(例：IL-7、IL-2、IL-15)等。
步骤(2-2)中使用抗CD3抗体的情况下，作为该抗CD3抗体，只要是特异性识别CD3的抗体即可，没有特别限定，例如，可举出由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体可以是结合有磁珠等的抗体，还可以替代向培养基中添加所述抗CD3抗体的方式而通过将该T淋巴细胞在表面结合有抗CD3抗体的培养容器上培养一定时间来给予刺激。抗CD3抗体的培养基中的浓度优选为10ng/ml～1000ng/ml(例：10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml)，其中，优选为500ng/ml。对于其他抗体的浓度，本领域技术人员可以基于培养条件等适当确定。
步骤(2-2)中使用IL-2的情况下，培养基中的IL-2的浓度优选为10U/ml～1000U/ml(例：10U/ml、20U/ml、30U/ml、40U/ml、50U/ml、60U/ml、70U/ml、80U/ml、90U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml)，其中，优选为100U/ml。步骤(2-2)中使用的IL-7或IL15的培养基中的浓度优选为1ng/ml～100ng/ml(例：1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)，其中，优选为10ng/ml。
步骤(2-2)中，培养温度的条件没有特殊限制，优选为37℃～42℃左右，更优选为37℃～39℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可一边监测CD8阳性T细胞的数量等，一边适当确定。只要能得到CD8阳性T细胞，则天数没有特别限定，优选为1天以上、3天以上、7天以上，优选为60天以下，更优选为35天以下。
另外，在其他方式中，本发明提供减少细胞的同种异体反应性的方法，其包括将本发明的核酸或载体导入至该细胞的步骤。
以下，列举实施例来更具体地说明本发明，但这些不过是例示，本发明不限于这些实施例。
实施例
[实施例1]含有编码具有αβTCR的恒定区、且不具有互补决定区(CDR)的TCR的变体
的核酸的LentiV载体的制备
设计将在N末端附加有CD8分子的膜转移信号肽的各α链(TRAC)与在N末端附加有IGH分子的膜转移信号肽的各β链(TRBC1或者TRBC2)的氨基酸通过P2A序列连接而成的多肽链(表1AB5-AB8)。人工合成编码所设计的多肽链的寡聚DNA(GenScript)，并插入至慢病毒载体质粒的多克隆位点中。慢病毒载体质粒使用将pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro(SystemBioscience)的CMV启动子置换为人泛素启动子而得的质粒。病毒载体制备委托SIRION公司。
[表1]
TRAC：序列号1
TRAC T48C：将序列号1的第48位的苏氨酸取代为半胱氨酸
TRAC1：序列号2
TRAC1 S56C：将序列号2的第56位的丝氨酸取代为半胱氨酸
TRAC2：序列号3
TRAC2 S55C：将序列号3的第55位的丝氨酸取代为半胱氨酸
CD8：序列号4
IGH：序列号5
[实施例2]表达TCR的变体的T细胞的制造
利用以RetroNectin(Takara Bio公司)包被的24孔板，使担载有编码表1所示的各变体的基因的慢病毒载体感染强制表达4种CD3基因(γ、δ、ε和ζ)的K562细胞(K562-CD3细胞，国立癌研究中心植村博士提供)，转导编码各变体的基因。使细胞感染慢病毒载体后，在37℃、5％CO2条件下培养3天。
[试验例1]表达上述TCR的变体的T细胞的细胞膜表面分子表达的评价
对于[实施例2]中得到的表达表1所示的各变体的T细胞，用抗CD3抗体(APC/Cy7,UCHT1,BioLegend)染色后，使用LSR FortessaTMX-20(BD Bioscience公司)流式细胞仪，利用流式细胞术检测细胞膜表面上的CD3分子的表达(图1)。在利用AB5得到的细胞和利用AB7得到的细胞中，在细胞膜表面上确认到CD3的表达。另外，在利用AB6得到的细胞和利用AB8得到的细胞中，在细胞膜表面上确认到CD3的更强的表达。
[实施例3]来源于表达TCR的变体的iPS细胞的T细胞的制造
1.iPS细胞的准备
iPS细胞使用由京都大学iPS细胞研究所(CiRA)提供的iPS细胞(Ff-I01s04株：来源于健康人末梢血单核细胞)。iPS细胞培养按照CiRA所发布的实验方案“人iPS细胞的无饲养层培养(フィーダーフリーでのヒトiPS細胞の培養)”实施。
2.含有编码具有αβTCR的恒定区、且不具有互补决定区(CDR)的TCR的变体的核酸
的Lenti
V载体的制备
从pLVSIN-CMV Neo(Clontech Laboratories,Inc.)中除去编码新霉素抗性基因的序列，将CMV启动子置换为人泛素启动子，使用得到的pLVSIN-Ub制备慢病毒载体。将上述中合成的编码AB6的人工寡聚DNA组入pLVSIN-Ub慢病毒载体的多克隆位点。使用该质粒、和Clontech Laboratories,Inc.的Lenti-XTM293T细胞株、Lenti-XTMPackaging SingleShots(VSV-G)制备慢病毒载体。
3.向iPS细胞导入修饰型T细胞受体基因
使[实施例1]中制成的组入了AB6的慢病毒载体感染iPS细胞，向该细胞中导入修饰型T细胞受体基因。
通过使制得的慢病毒载体感染[实施例3]1.中准备的iPS细胞，将修饰TCR基因导入至iPS细胞。以下，有时将导入了修饰TCR基因的iPS细胞称为“tTCR-iPSC”。
4.iPS细胞向造血祖细胞(HPC)的分化
iPS细胞向造血祖细胞(HPC)的分化按照已知的方法(例如，Cell Reports 2(2012)1722-1735、国际公开第2017/221975号中记载的方法)来实施。具体而言，将[实施例3]3.中得到的tTCR-iPSC分别以3×105个细胞/孔接种于经超低粘附处理的6孔板，向EB培养基(在StemPro34中添加有10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、2mML-谷氨酰胺、45mMα-单硫代甘油、和50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯)中加入10ng/ml BMP4、50ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，在低氧条件下(5％O2)培养5天。然后，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，进一步培养5～9天，得到悬浮细胞群。需要说明的是，在培养期间每2天或3天更换培养基。将含有HPC的上述悬浮细胞群使用表2的抗体组染色。将经上述染色的细胞群供于基于FACSAria的分选。
[表2]
| 抗CD34抗体 | Abcam PE/Cy7 |
| 抗CD43抗体 | BD APC |
| 抗CD45抗体 | BioLegend BV510 |
| 抗CD14抗体 | BioLegend APC/eFluor780 |
| 抗CD235a抗体 | BD FITC |
5.HPC向T细胞的分化
按照已知的方法(例如，Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175、国际公开第2017/221975号中记载的方法)，使[实施例3]4.中得到的细胞组分向淋巴细胞系细胞分化。具体而言，将造血祖细胞群以2000个细胞/孔接种于包被有Recombinant h-DLL4/Fc chimera(SinoBiological)和Retronectin(Takara Bio)的48孔板，在5％CO2、37℃条件下培养。在培养期间每2天或3天更换培养基。需要说明的是，培养基使用了添加有15％FBS和2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、55μΜ2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、50ng/mlSCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30ng/ml SDF-1α的αMEM培养基。在自培养开始起第7天及第14天传代至进行了同样的包被的48孔板。在培养开始第21天回收全部细胞。经回收的细胞利用表3的抗体组进行染色。
[表3]
| CD3抗体 | Biolegend APC/Cy7 |
| CD5抗体 | BIolegend BV510 |
| CD7抗体 | Biolegend APC |
| TCRαβ抗体 | eBIoscience FITC |
[试验例2]表达上述TCR的变体的T细胞的细胞膜表面分子表达的评价
针对[实施例3]5.中得到的细胞，使用流式细胞仪测定细胞膜表面上的CD3、CD5、CD7和αβTCR的表达(图2)。
本说明书中，“包含了(comprising)”或“包含(comprise)”这样的各术语可以任选地替换为“由……组成的(consisting of)”或“由……组成(consists of)”。
产业上的可利用性
本发明的变体在细胞中进行表达后，能够抑制该细胞的同种异体反应性，因此能够减少同种移植中的移植物抗宿主病(GvHD)的风险。即，本发明的变体的导入可以成为T细胞疗法中控制同种异体反应性的一种选择。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2018-245253(申请日：2018年12月27日)为基础，其内容通过在此明示而全部包括在本说明书中。
Claims (7)
1.变体，其是由2条多肽组合而成的T细胞受体的变体，所述多肽包含选自由α链、β链、γ链和δ链组成的组中的T细胞受体链的恒定区，所述变体的特征在于，所述多肽不包含所述T细胞受体链的互补决定区(CDR)、α链的互补决定区(CDR)和β链的互补决定区(CDR)。
2.如权利要求1所述的变体，其中，所述多肽中的一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区，另一者包含T细胞受体α链或β链的恒定区。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中，两条多肽通过1个以上的二硫键而键合。
4.核酸分子，其编码权利要求1～3中任一项所述的变体。
5.载体，其含有权利要求4所述的核酸分子。
6.细胞的制造方法，其包括将权利要求5所述的载体导入的步骤。
7.细胞，其表达权利要求1～3中任一项所述的变体。
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