KR20210109000A - T-세포 수용체 개변체 - Google Patents

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KR20210109000A
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
다케다 야쿠힝 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 α 쇄, β 쇄, γ 쇄 및 δ 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 쇄의 불변 영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드를 조합함으로써 형성된 T-세포 수용체의 개변체로서, 폴리펩티드가 T 세포 수용체 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), α 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 개변체를 제공한다.

Description

T-세포 수용체 개변체
본 발명은 T-세포 수용체의 변이체(variant), 상기 변이체를 발현하는 세포 등에 관한 것이다.
T 세포는 박테리아, 바이러스 등과 같은 외래 병원체와 암세포와 같은 비정상 세포에 대한 면역계에서 중심적인 역할을 한다. 특히, 세포독성 T 림프구 (CTL)는 그의 세포 표면에 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해, 항원-제시 세포의 클래스 1 주요 조직적합성 항원과 함께 제시된, 바이러스 또는 종양 등으로부터 유래된 항원 펩티드를 인식하고, 상기 항원 펩티드를 이물질로서 제시하는 세포에 대해 특이적으로 세포독성 활성을 발휘한다.
상기에 기재된 바와 같이, T 세포는 면역계에서 중심적인 역할을 하므로, 환자로부터 유래된 세포, 또는 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유전자형을 가진 동종(allogeneic) 세포에, 바이러스, 종양 등으로부터 유래된 항원 펩티드를 인식하는 TCR 유전자, 키메라(chimeric) 항원 수용체 (CAR) 등을 도입하여, 인위적으로 대량의 암 항원-특이적 T 세포를 시험관내에서 제조하고, 이를 생체내에 주입하는 것을 포함하는, 접근법인 T 세포 요법이 개발되었다. 그러나, 유전자가 전달되는 T 세포에는, 내재성 TCR이 존재하고, 내재성 TCR은 도입된 TCR과 경쟁하여 세포 표면에서 TCR 발현에 필요한 CD3 분자와 결합하게 되며, 이는 결국 도입된 TCR의 발현이 억제된다는 문제점을 유발한다. 게다가, 형질전환 TCR 쇄가 내재성 TCR 쇄와 잘못 쌍을 형성하는(mispairing) 문제가 지적되었다. 더욱이, 동종 세포를 사용하는 경우에, 내재성 TCR이 수령자의 항원을 인식하여 이식편-대-숙주 질환(graft-versus-host disease) (GvHD)을 유발할 가능성이 또한 있다.
이들 문제점을 해결하기 위한 방법으로서, TCRβ 쇄의 불변 영역(constant region) (Cβ)에, α 쇄의 가변 영역 (Vα)과 β 쇄의 가변 영역 (Vβ)을 융합시킨 단일-가닥 키메라 TCR과, TCRα 쇄의 불변 영역 (Cα)을 세포에 도입하는 방법이 보고 되어 있다. 이 방법을 사용하면, 내재성 TCRα 쇄와의 미스매치가 억제될 것이고, 이에 따라 예상치 못한 생체내 작용을 억제할 수 있을 것으로 간주된다는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1). 또한, 도입되는 TCR의 α쇄와 β쇄의 불변 영역에 시스테인을 도입함으로써 도입된 TCR 쇄와 내재성 TCR 쇄 사이의 미스매치를 억제할 수 있다는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2). 그러나, 이들 문헌은 주로 도입된 TCR 쇄와 내재성 TCR 쇄 간의 미스매치를 방지하는 데 중점을 두고 있으며, 내재성 TCR 쇄의 동종반응성(alloreactivity)을 검증하지 않았으며, 항원-HLA 복합체의 인식에 중요한 TCRα 쇄 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)이 전혀 없는 TCR의 변이체를 개시하거나 제안조차 하지 않는다.
비특허문헌 1: Knies D. et al., Oncotarget, 7(16):21199-21221 (2016) 비특허문헌 2: Kuball J. et al., blood, 109(6):2331-2338 (2007)
따라서, 본 발명의 과제는 T 세포 수용체 (TCR) α 쇄 및 β 쇄의 어떤 상보성 결정 영역 (CDR)도 함유하지 않는 신규한 T-세포 수용체 (TCR) 변이체를 제공하는 것이다. 게다가, 상기 과제는 변이체를 발현하고 억제된 동종반응성을 나타내는 T 세포의 제공을 포함한다.
본 발명자들은 상기-언급한 과제를 해결할 수 있는, 동종반응성이 억제된 T 세포 수용체 (TCR)를 개발하는 과정에서, TCRα 쇄 또는 β 쇄의 CDR을 함유하지 않는 T 세포 수용체 변이체가 도입된 세포에서는, 놀랍게도, 내재성 TCR에 기인하는 것으로 간주되는 동종반응성이 억제된다는 것을 밝혀냈다. 게다가, 이들은 TCR 쇄의 상이한 쇄, 즉 αβTCR의 불변 영역과 γδTCR의 CDR을 조합하는 변형된 TCR이, 유사하게 T 세포의 동종반응성을 억제할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이들은 이들 조사결과를 바탕으로 예의 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다.
[1] α 쇄, β 쇄, γ 쇄 및 δ 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 쇄의 불변 영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드의 조합을 포함하는 T-세포 수용체의 변이체이며, 여기서 폴리펩티드가 T 세포 수용체 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), α 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는 것인 변이체.
[2] [1]에 있어서, 전술한 폴리펩티드 중 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 포함하고, 다른 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 포함하는 것인 변이체.
[2a] [2]에 있어서, 전술한 폴리펩티드 중 적어도 하나가 T 세포 수용체 γ 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), 및/또는 T 세포 수용체 δ 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 변이체.
[2b] [2a]에 있어서, 전술한 폴리펩티드 중 적어도 하나의 불변 영역이 α 쇄의 불변 영역이고, 상보성 결정 영역 (CDR)이 γ 쇄의 상보성 결정 영역인 변이체.
[2c] [2a] 또는 [2b]에 있어서, 전술한 폴리펩티드 중 적어도 하나의 불변 영역이 β 쇄의 불변 영역이고, 상보성 결정 영역 (CDR)이 δ 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)인 변이체.
[3] [1] 내지 [2c] 중 어느 하나에 있어서, 2개의 폴리펩티드가 1개 이상의 디설파이드 결합(disulfide bond)에 의해 결합되는 것인 변이체.
[3a] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 전술한 폴리펩티드가 1개 이상의 신호 펩티드(signal peptide)를 추가로 포함하는 것인 변이체.
[3b] [3a]에 있어서, 전술한 신호 펩티드가 T 세포 수용체 쇄의 불변 영역의 N-말단에 결합하는 것인 변이체.
[3c] [3a]에 있어서, 전술한 신호 펩티드가 CD8 및/또는 IGH의 신호 펩티드인 변이체.
[4] [1] 내지 [3c] 중 어느 하나에 따른 변이체를 코딩하는(encoding) 핵산 분자.
[5] [4]의 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
[6] [5]의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 세포의 제조 방법.
[6a] [1] 내지 [3c] 중 어느 하나의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 다능성 줄기 세포.
[6b] [6a]에 있어서, 전술한 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)인 세포.
[7] [1] 내지 [3c] 중 어느 하나의 변이체를 발현하는 세포.
본 발명의 T-세포 수용체의 변이체는, 세포에 도입되는 경우, 상기 세포의 동종반응성을 억제할 수 있어, 동종 이식에서 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)의 위험을 감소시킬 수 있다.
도 1은 TCR 쇄의 가변 영역을 함유하는 것이 아니라 C 영역을 함유하는 TCR 변이체를 발현하는 T 세포의 세포막 표면 상의 CD3 분자의 발현의 유세포 분석에 의한 검출 결과를 나타낸다. 가로축은 세포막 표면에서 CD3 분자의 발현을 나타내고, 세로축은 세포의 수를 나타낸다.
도 2는 렌티바이러스 벡터를 이용함으로써 AB6으로 형질감염된 iPS 세포로부터 분화된 세포막 상에서 CD3, CD5, CD7 및 αβ TCR의 발현을 유세포분석을 통해 측정한 결과이다.
(발명의 상세한 설명)
1. T-세포 수용체의 변이체
본 발명은 α 쇄, β 쇄, γ 쇄 및 δ 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 쇄의 불변 영역을 포함하는 2개의 폴리펩티드의 조합을 포함하는 T-세포 수용체의 변이체를 제공한다 (이하, 때때로 "본 발명의 변이체"로 지칭됨). 본 발명의 변이체는 TCRα 쇄 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 동일한 종류의 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는 것 (바람직하게는 CDR을 포함하는 가변 영역의 일부 또는 전부) 그리고 불변 영역이 유래한 T 세포 수용체 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 동일한 종류의 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)은 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 변이체는 천연형 또는 인공형 (예를 들어, 불변 영역이 유래된 동물 종과 가변 영역이 유래된 동물 종이 상이하다)의 αβTCR, γδTCR, 또는 이들의 TCR에 아미노산이 추가로 부가된 TCR 변이체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 변이체의 쇄 중 적어도 하나에 상응하는 폴리펩티드가 T 세포 수용체 α 쇄의 불변 영역을 함유하는 경우, 폴리펩티드는 T 세포 수용체 α 쇄의 CDR, 바람직하게는 CDR을 함유하는 가변 영역의 일부 또는 전부를 함유하지 않는다. 그러나, 이는 α 쇄 및 β 쇄 이외의 TCR 쇄, 예를 들어, γ 쇄 또는 δ 쇄의 CDR 또는 가변 영역을 함유할 수 있다. 유사하게, 상기-언급한 변이체의 쇄 중 적어도 하나에 상응하는 폴리펩티드가 T 세포 수용체 β 쇄의 불변 영역을 함유하는 경우, 폴리펩티드는 T 세포 수용체 β 쇄의 CDR, 바람직하게는 CDR을 함유하는 가변 영역의 일부 또는 전부를 함유하지 않는다. 그러나, 이는 α 쇄 및 β 쇄 이외의 TCR 쇄, 예를 들어, γ 쇄 또는 δ 쇄의 CDR 또는 가변 영역을 함유할 수 있다. γ 쇄 및 δ 쇄에도 동일하게 적용된다. 본 발명의 한 실시양태에서, T 세포 수용체 β 쇄는 T 세포 수용체 β1 쇄 (서열번호: 2) 또는 T 세포 수용체 β2 쇄 (서열번호: 3)를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, T 세포 수용체 β 쇄는 T 세포 수용체 β1 쇄 (서열번호: 2) 및 T 세포 수용체 β2 쇄 (서열번호: 3)를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 막 이행 신호 펩티드 (이하 "신호 펩티드"로 지칭됨)가 추가로 부가될 수 있다. 신호 펩티드로서, CD8, IGH (면역글로불린-H), CD4, 막관통 도메인을 갖는 다양한 펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유래된 막 국소화 신호 펩티드, 및/또는 상기 신호 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드 1개 또는 수개 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열, 또는 상기 신호 펩티드의 아미노산 서열과 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 신호 펩티드를 부가하는 경우, 결합 위치 및 신호 펩티드의 수는 특히 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "T 세포 수용체 (TCR)"는 TCR 쇄 (α 쇄, β 쇄, γ 쇄, δ 쇄)의 이량체로 구성된 수용체를 의미하며, 항원 또는 항원-HLA (인간 백혈구 항원) (MHC; 주요 조직적합성 복합체) 복합체를 인식하고 자극 신호를 T 세포에 전달한다. 각각의 TCR 쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 구성되며, 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2, CDR3)을 함유한다. TCR의 변이체는 각각의 폴리펩티드가 상기-언급한 TCR 쇄의 적어도 불변 영역을 함유하는 TCR 쇄의 이량체를 의미한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역 (C 영역으로도 칭해질 것임)을 함유하고, 다른 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 함유하는 것인 변이체가 제공된다. 상기 변이체에서, 폴리펩티드 중 하나는 바람직하게는 TCR γ 쇄의 CDR, 바람직하게는 CDR을 함유하는 TCR γ 쇄의 가변 영역의 일부 또는 전부, 및/또는 TCR δ 쇄의 CDR, 바람직하게는 CDR을 함유하는 TCR δ 쇄의 가변 영역의 일부 전부를 함유한다. 이러한 가변 영역의 적어도 일부가 함유되는 경우, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 불변 영역이 TCR α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역이고, CDR이 γ 쇄 또는 δ 쇄의 CDR인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나의 불변 영역은 TCR α 쇄의 불변 영역이고, CDR은 δ 쇄의 CDR이다.
본 발명의 한 실시양태에서, TCR 쇄의 CDR을 함유하나 C 영역을 함유하는 가변 영역의 일부 또는 전부를 함유하지 않는 변이체가 제공된다. 상기 변이체에서, 예를 들어, 폴리펩티드 중 하나는 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있고, 다른 하나는 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있다. 상기 변이체에서, 예를 들어, 폴리펩티드 중 하나는 T 세포 수용체 γ 쇄 또는 δ 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있고, 다른 하나는 T 세포 수용체 γ 쇄 또는 δ 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있다. 또한, 상기 변이체에서, 예를 들어, 폴리펩티드 중 하나는 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있고, 다른 하나는 T 세포 수용체 γ 쇄 또는 δ 쇄의 불변 영역을 함유할 수 있다.
본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드로서, 예를 들어, 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열, 1개 또는 수개 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열과 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 TCRα 쇄의 불변 영역을 함유하는 폴리펩티드 (이하 "폴리펩티드 1"로 지칭됨)가 언급될 수 있다. 게다가, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드로서, 예를 들어, 서열번호: 2 또는 3에 나타낸 아미노산 서열, 1개 또는 수개 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 2 또는 3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 2 또는 3에 나타낸 아미노산 서열과 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 TCRβ 쇄의 불변 영역을 함유하는 폴리펩티드 (이하 각각 "폴리펩티드 2" 및 "폴리펩티드 3"로 지칭됨)가 언급될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 변이체는 전술한 폴리펩티드 1 (TCR α 쇄의 불변 영역) 및 폴리펩티드 2 (TCRβ1 쇄의 불변 영역), 또는 전술한 폴리펩티드 1 (TCR α 쇄의 불변 영역) 및 폴리펩티드 3 (TCRβ2 쇄의 불변 영역)으로 이루어진다.
본 발명의 한 실시양태에서, TCR 쇄의 CDR을 함유하는 가변 영역의 일부 또는 전부를 함유하지 않으나 C 영역을 함유하는 폴리펩티드 (예를 들어, 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 2, 또는 전술한 폴리펩티드 1 및 폴리펩티드 3으로 구성된 전술한 변이체)를 보다 효율적으로 세포막 표면 상에서, 발현시키기 위해, 적어도 어느 하나의 폴리펩티드에 신호 펩티드를 추가로 부가하는 것이 바람직하다. 신호 펩티드로서 CD8 또는 IGH가 바람직하다. 신호 펩티드를 부가하는 경우, 결합 위치는 특별히 제한되지는 않으나, TCR의 C 영역을 포함하는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 부가하는 것이 바람직하고, N-말단에 부가하는 것이 보다 바람직하다. 신호 펩티드를 부가하는 경우 신호 펩티드의 수는 특별히 제한되지는 않으며, 1개 이상의 신호 펩티드를 부가하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 1개의 신호 펩티드를 부가하는 것이 바람직하다.
신호 펩티드의 예는 서열번호: 4 (CD8) 또는 5 (IGH)에 나타낸 아미노산 서열, 1개 또는 수개 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열번호: 4 또는 5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호: 4 또는 5에 나타낸 아미노산 서열과 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩티드 (이하 각각 "신호 펩티드 4" 및 "신호 펩티드 5"로 지칭됨)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 변이체는 전술한 신호 펩티드 5가 폴리펩티드 1의 N-말단에 부가된 서열번호: 8 또는 11에 나타낸 폴리펩티드 (이하 "폴리펩티드 8" 또는 "폴리펩티드 11"로 지칭됨), 및 전술한 신호 펩티드 4가 폴리펩티드 2의 N-말단에 부가된 서열번호: 7 또는 10에 나타낸 폴리펩티드 (이하 "폴리펩티드 7" 또는 "폴리펩티드 10"으로 지칭됨)로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 이는 폴리펩티드 8 또는 폴리펩티드 11, 전술한 신호 펩티드 4가 폴리펩티드 3의 N-말단에 부가된 서열번호: 13 또는 15에 나타낸 전술한 폴리펩티드 (이하 "폴리펩티드 13" 또는 "폴리펩티드 15"로 지칭됨)로 이루어진다.
본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드로서, TCR γ 쇄의 가변 영역을 함유하는 폴리펩티드가 언급될 수 있다. 게다가, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드로서, TCR δ 쇄의 가변 영역을 함유하는 폴리펩티드가 언급될 수 있다.
본 명세서에서, "동일성"은 90% 이상 (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 초과)을 의미한다. 아미노산 서열의 동일성은 하기 조건 (기대값=10; 허용되는 간격; 행렬=BLOSUM62, 필터링=OFF) 하에 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (국립 생명공학정보센터 기본 지역 정렬 검색 도구(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하여 계산할 수 있다. 동일성을 결정하기 위해, 본 발명의 전장 서열을 다른 서열과 비교되는 것으로 이해된다. 환언하면, 본 발명에 있어서의 동일성은 본 발명의 서열의 짧은 단편 (예를 들어, 1-3개 아미노산)을 다른 서열과 비교하거나, 그 반대의 경우를 제외한다.
본 발명의 변이체에 함유된 TCR 쇄의 불변 영역, 가변 영역 및 CDR의 유래는 특히 제한되지는 않으며, 바람직하게는 동물 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개 , 소, 양, 원숭이, 인간), 보다 바람직하게는 인간이다.
게다가, 본 발명의 변이체에 함유된 TCR 쇄의 불변 영역은 바람직하게는 천연 TCR 쇄의 불변 영역에서 특정된 변형을 받게 된다. 이 변형의 예는 천연 TCR의 불변 영역에 있는 특정한 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환함으로써 α 쇄와 β 쇄 사이의 디설파이드 결합으로 인한 이량체 발현 효율의 향상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 서열번호: 1로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 불변 영역에서 48번째 트레오닌을 시스테인으로 치환, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3으로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 불변 영역에서 56번째 또는 55번째 세린을 시스테인으로 치환). 바람직한 실시양태에서, 2개의 폴리펩티드는 바람직하게는 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 디설파이드 결합에 의해 결합된다. 디설파이드 결합은 변이체의 각각의 폴리펩티드에 함유된 시스테인 잔기 (천연 유형에 함유될 수 있거나 상기에 기재된 바와 같이 인공적으로 도입될 수 있다) 사이의 산화 또는 번역후 변형에 의해 형성된다.
본 발명의 변이체는 후술하는 본 발명의 핵산 또는 벡터를 사용하여 유전자공학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산과 다른 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 둘 다 세포에 도입하여 각각의 폴리펩티드를 발현하고 이량체를 형성하고, 그 자체로 공지된방법에 의해 이량체를 단리함으로써 제조될 수 있다.
2. 본 발명의 변이체를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 함유하는 벡터
본 발명은 전술한 본 발명의 TCR을 코딩하는 핵산 (이하, 때때로 "본 발명의 핵산"으로 지칭됨)을 제공한다. 본 발명의 핵산으로서, 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산과 다른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 상이한 분자에 함유될 수 있거나, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 둘 다가 단일 분자에 함유될 수 있다.
본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있으며, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 게다가, 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 이중 가닥의 경우에, 이중-가닥 DNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA:RNA 혼성체가 사용될 수 있다. 핵산이 RNA일 경우, 서열 목록에서의 T는 RNA 서열과 관련하여 U로서 읽혀진다. 게다가, 본 발명의 핵산은 시험관내 또는 세포내에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 한, 천연 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명에서 핵산은 그 자체로 공지된 방법에 의해 생성될 수 있으며, 예를 들어, 올리고 DNA 프라이머는 TCR 쇄의 공지된 DNA 서열 정보를 기초로 하여, 서열의 원하는 부분을 커버하도록 합성되고, 상기 서열을 갖는 세포로부터 제조된 총 RNA 또는 mRNA 분획을 주형으로서 사용하여, 상기 핵산은 RT-PCR 방법에 의한 증폭에 의해 클로닝될 수 있다. 대안적으로, DNA 가닥을 화학적으로 합성하거나, 부분적으로 중첩되는 올리고 DNA 단쇄를 PCR법 (중첩(overlap) PCR법) 또는 깁슨 어섬블리(Gibson Assembly)법을 이용하여 연결함으로써, 핵산의 전장 또는 일부를 코딩하는 DNA를 구축할 수 있다.
본 발명의 핵산은 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산을 함유하는 발현 벡터 (이하, 때때로 "본 발명의 벡터"로 지칭됨)를 제공한다.
본 발명의 벡터에 사용되는 프로모터의 예는 유비퀴틴 프로모터, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)) 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney mouse leukemia virus)) LTR, HSV-TK (단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등을 포함한다. 이 중에서, 유비퀴틴 프로모터, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 바람직하다.
본 발명의 벡터는 상기-언급한 프로모터 외에 소망에 따라 전사 및 번역 조절 서열, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 복제 기점, 폴리A 부가 신호, 선택 마커 유전자 등을 함유할 수 있다. 선택 마커 유전자의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드 둘 다의 이종이량체는 본 발명의 전술한 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산 및 다른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 표적 세포에 도입함으로써 세포내 또는 세포 표면 상에 구축될 수 있다. 이 경우에, 전술한 본 발명의 변이체를 구성하는 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산 및 다른 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 별도의 발현 벡터 또는 단일 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 단일 발현 벡터에 혼입되는 경우, 이들 2 종류의 핵산은 폴리시스트로닉(polycistronic) 발현을 가능하게 하는 서열을 통해 혼입되는 것이 바람직하다. 폴리시스트로닉 발현을 가능하게 하는 서열을 사용하여, 1 종류의 발현 벡터에 혼입된 복수개의 유전자를 보다 효율적으로 발현시킬 수 있다. 폴리시스트로닉 발현을 가능하게 하는 서열의 예는 2A 서열 (예를 들어, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) (FMDV) 유래의 2A 서열 (F2A), 말 비염 A바이러스(horse rhinitis Avirus) (ERAV) 유래의 2A 서열 (E2A), 돼지테스코바이러스(Porcineteschovirus) 유래의 2A 서열 (PTV-1) (P2A), 테사 아시그나 바이러스(Thesa asigna virus) (TaV) (T2A) 유래 2A 서열) (PLoS ONE, 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007 등), 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (미국 특허 번호 4,937,190) 등을 포함한다. 균일한 발현 수준의 관점에서, 2A 서열이 바람직하다. 2A 서열 중에서 P2A 서열 및 T2A 서열이 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터 등을 포함한다. 바이러스 벡터로서, 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스 벡터 및 유사형 벡터를 포함), 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 센다이바이러스, 에피솜 벡터 등이 언급될 수 있다. 트랜스포존 발현 시스템 (예를 들어, 피기백(PiggyBac) 시스템)이 또한 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터로서, 동물 세포 발현 플라스미드 (예를 들어, pa1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등이 언급될 수 있다.
3. 본 발명의 변이체를 발현하는 T 세포
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터가 도입된 세포 (이하, 때때로 "본 발명의 세포"로 지칭됨)를 제공한다. 본 발명의 세포는 바람직하게는 본 발명의 변이체를 발현한다.
본 발명의 핵산 또는 발현 벡터가 도입되는 세포로서는, 예를 들어 림프구 및 림프구의 전구 세포, 다능성 줄기 세포가 언급될 수 있다. 본 발명에서, "림프구"는 척추동물의 면역계에서 백혈구의 아형 중 하나를 의미한다. 림프구로서는, T-세포, B-세포, 자연 살해 세포 등이 언급될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 벡터가 도입되는 세포로서는, 다능성 줄기 세포가 바람직하다.
본 발명에서, "T 세포"는 CD3 양성 세포를 의미한다. 본 발명의 변이체를 발현하는 T 세포의 예는 CD8 양성 세포인 세포독성 T 림프구(CTL), CD4 양성 세포인 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포, 이펙터 T 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 세포독성 T 림프구이다. 본 발명의 변이체를 발현하는 T 세포는 생체로부터 수집된 T 세포에 본 발명의 핵산 또는 벡터를 도입함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포는 다능성 줄기 세포 또는 림프구 전구 세포로부터 본 발명의 핵산 또는 벡터가 도입된 T 세포로 분화를 유도함으로써 수득될 수 있다 (즉, 다능성 세포 또는 전구 세포로부터 유래한 T 세포).
본 발명의 한 실시양태에서, T 세포는 때때로 CD5 및/또는 CD7뿐만 아니라 CD3을 발현한다. CD5 및/또는 CD7은 또한 생체내 T 세포의 세포 표면 상에서 발현될 수 있다. T 세포가 CD5 및/또는 CD7을 발현하는 경우, CD5 및 CD7은 TCR 분자와 복합체를 형성하지 않고 발현되며, 한편 CD3은 T 세포에서 TCR과 복합체를 형성함으로써 세포 표면 상에서 발현된다.
본 발명의 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포)는 또한, 세포에 본질적으로 존재하는 TCR 유전자에 더하여, 본 발명의 핵산 또는 벡터로부터 유래된 외인성 TCR 유전자를 갖는다. 이 점에서, 본 발명의 세포는 생체로부터 채취한 세포와 상이하다. 본 발명의 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 뿐만 아니라 본 발명의 변이체를 발현할 수 있다.
전술한 림프구는, 예를 들어, 인간 또는 인간 이외의 포유동물의 말초혈액, 골수 및 제대혈로부터 수집할 수 있다. 본 발명의 변이체를 발현하는 세포가 암과 같은 질환의 치료에 사용되는 경우, 세포 집단은 바람직하게는 치료될 대상체로부터 또는 치료 대상의 HLA 유형과 일치하는 공여자로부터 수집된다.
림프구의 전구 세포의 예는 조혈 줄기 세포, 자기 복제 능력이 없는 다능성 전구 세포(multipotent progenitor) (MMP), 골수-림프양 전구세포(myelo-lymphoid progenitor) (MLP) 세포, 골수양 전구세포(myeloid progenitor) (MP) 세포, 과립-단핵구 전구세포 (GMP) 세포, 대식세포-수지상 세포 전구세포 (MDP) 세포, 수지상 세포 전구세포 (DCP) 세포 등을 포함한다. 다능성 줄기 세포의 예는 배아성 줄기 세포(embryonic stem cell) (ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell) (iPS 세포), 배아성 암종 세포(embryonal carcinoma cell) (EC 세포), 배아성 생식 세포 (EG 세포) 등이 언급될 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포가 ES 세포 또는 인간 배아 유래 임의의 세포인 경우, 세포는 배아를 파괴하여 생성된 세포이거나 배아를 파괴하지 않고 생성된 세포일 수 있다. 배아를 파괴하지 않고 생성된 세포가 바람직하다.
본 명세서에서, "다능성 줄기 세포"라 함은 배아성 줄기 세포 (ES 세포) 및 이와 유사한 분화 다능성, 즉 다양한 조직 (내배엽, 중배엽, 외배엽 모두)으로 분화할 수 있는 능력을 내재적으로 갖는 세포를 지칭한다. ES 세포와 유사한 분화 만능성을 갖는 세포로서, "인공 다능성 줄기 세포" (본 명세서에서 때때로 "iPS 세포"로 지칭됨)를 언급할 수 있다.
"ES 세포"로서는, 마우스 ES 세포로서 인제니우수 타게팅 래보러토리(inGenious targeting laboratory), RIKEN (이화학연구소(Inst. of Physical and Chemical Research)) 등에 의해 확립된 다양한 마우스 ES 세포주를 사용할 수 있으며, NIH, RIKEN, 쿄토 대학(Kyoto University), 셀라르티스(Cellartis)에 의해 확립된 다양한 인간 ES 세포주를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 ES 세포주로서, NIH의 CHB-1 - CHB-12 균주, RUES1 균주, RUES2 균주, HUES1 - HUES28 균주 등, 위스셀 리서치(WisCell Research)의 H1 균주, H9 균주 등, RIKEN의 KhES-1 균주, KhES-2 균주, KhES-3 균주, KhES-4 균주, KhES-5 균주, SSES1 균주, SSES2 균주, SSES3 균주를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)"는 포유동물의 체세포 또는 미분화 줄기 세포에 특정의 인자 (핵 초기화 인자(nuclear reprogramming factor))를 도입하여 이들을 재프로그래밍한 세포를 의미한다. 현재 다양한 종류의 "인공 다능성 줄기 세포"가 있으며, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc의 4가지 인자를 마우스 섬유모세포에 도입하여 야마나카(Yamanaka) 등에 의해 확립된 iPS 세포 (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), 유사한 4가지 인자를 인간 섬유모세포에 도입하여 구축한 인간 세포 유래 iPS 세포(Takahashi K, Yamanaka S., et al., Cell, (2007) 131: 861-872.), 상기-언급한 4가지 인자 도입 후 Nanog의 발현을 지표로서 선택함으로써 확립된 Nanog-iPS 세포 (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), c-Myc가 없는 방법으로 생산한 Nanog-iPS 세포 (Nakagawa M, Yamanaka S., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), 및 6가지 인자를 바이러스-프리법(virus-free method)으로 도입하여 확립한 iPS 세포 (Okita K et al., Nat. Methods 2011 May; 8(5):409-12, Okita K et al., Stem Cells. 31(3):458-66.)를 또한 사용할 수 있다. 게다가, OCT3/4, SOX2, NANOG, 및 LIN28의 4 가지 인자를 도입하여 톰슨(Thomson) 등에 의해 확립된 인공 다능성 줄기 세포 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), 데일리(Daley) 등에 의해 생성된 인공 다능성 줄기 세포 (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), 등에 의해 생성된 인공 다능성 줄기 세포 (JP-A-2008-307007) 등을 또한 사용할 수 있다.
게다가, 공개되어 있는 임의의 논문 (예를 들어, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797), 또는 특허 (예를 들어, JP-A-2008-307007, JP-A-2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007/069666, WO2008/118220, WO2008/124133, WO2008/151058, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852)에 기재된 관련 기술분야에 공지된 인공 다능성 줄기 세포 중 어느 것이든 사용할 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포주로서는, NIH, RIKEN, 교토 대학 등에서 확립한 각종 iPS 세포주를 사용할 수 있다. 인간 iPS 세포주의 예는 RIKEN의 HiPS-RIKEN-1A 균주, HiPS-RIKEN-2A 균주, HiPS-RIKEN-12A 균주, Nips-B2 균주, 253G1 균주, 201B7 균주, 409B2 균주, 454E2 균주, 606A1 균주, 610B1 균주, 648A1 균주, 1231A3 균주, Ff-I01s04 균주 등을 포함한다.
본 발명에서, "조혈 전구 세포"는 조혈 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포 (multipotent stem cell)이다. 인간에서는 주로 골수에 존재하며 백혈구 (호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구, 대식세포), 적혈구, 혈소판, 비만 세포 및 수지상 세포로 분화한다. 본 발명에서 "조혈 전구 세포"는 CD34 양성 세포, 바람직하게는 CD34/CD43 이중 양성(DP) 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용하는 조혈 전구 세포의 유래는 특히 제한되지는 않으며, 예를 들어, 하기에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하거나, 공지의 방법에 의해 생체 조직으로부터 단리함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 발현 벡터가 다능성 줄기 세포 또는 림프구의 전구 세포에 도입될 때, 세포는 바람직하게는 자체 공지된 방법에 의해 림프구, 바람직하게는 T 세포로 분화된다. 다능성 줄기 세포를 T세포로 분화시키는 방법으로서는, 예를 들어 (1) 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 다능성 줄기 세포를 조혈전구세포로 분화시키는 단계, 및 (2) 조혈 전구 세포를 T 세포로 분화시키는 단계를 언급할 수 있다. 전술한 단계 (1)로서, 예를 들어, WO 2013/075222, WO 2016/076415 및 [Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358] 등에 기재된 바와 같이, 조혈 전구 세포 유도용 배지에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 언급될 수 있다. 전술한 단계 (2)로서, 예를 들어 WO 2016/076415 등에 기재된 바와 같이, (2-1) 조혈 전구 세포로부터 CD4CD8 이중 양성 T 세포를 유도하는 단계 및 (2-2) CD4CD8 이중 양성 T 세포로부터 CD8 양성 T 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법 세포, 예를 들어 WO 2016/076415 등이 언급될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 벡터를 세포에 도입하는 방법에는 특별히 제한은 없고, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 핵산 또는 플라스미드 벡터를 도입하는 경우에는, 예를 들어 인산칼슘 공침전법, PEG법, 전기천공법(electroporation method), 미세주입법(microinjection method), 리포펙션법(lipofection method) 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cell Engineering additional volume 8, New Cell Engineering experiment protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, vol. 52, 456 (1973), Folia Pharmacol. Jpn., vol. 119 (No. 6), 345-351 (2002)] 등에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 본 발명의 핵산을 적합한 패키징 세포 (예를 들어 Plat-E 세포) 및 상보성 세포주 (예를 들어, 293 세포)에 도입하고, 배양 상청액에서 생성된 바이러스 벡터는 회수하고, 각각의 바이러스 벡터에 적합한 방법으로 벡터를 감염시켜 벡터를 세포에 도입한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 벡터로 사용하는 경우, WO 2007/69666, 문헌 [Cell, 126, 663-676 (2006)] 및 [Cell, 131, 861-872 (2007)] 등에 구체적인 수단이 개시되어 있다. 게다가, 렌티바이러스를 벡터로 사용하기 위한 구체적인 수단은 문헌 [Zufferey R. et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-895 (1997)] 등에 개시되어 있다. 특히, 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우, 재조합 피브로넥틴 단편 CH-296 (타카라 바이오 인크.(Takara Bio Inc.) 제조)을 사용하여 다양한 세포에 고효율로 형질감염이 가능하다. 대안적으로, 세포내의 본 발명의 HLA 유전자, B2M 유전자, 및/또는 CIITA 유전자의 핵산 또는 벡터는 게놈 편집 (예를 들어, CRISPR 시스템, TALEN, ZFN 등)에 의해 세포 게놈 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 세포에서 본 발명의 변이체를 발현시키기 위한 RNA 형태로 세포내로 직접 도입될 수 있다. RNA를 도입하는 방법으로서, 공지의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 리포펙션법, 전기천공법 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 변이체의 발현은, 예를 들어, 본 발명의 변이체의 일부 (예를 들어, TCR 쇄의 불변 영역 등)를 인식할 수 있는 항체를 사용한 면역학적 방법에 의해 검출 또는 측정할 수 있다. 면역학적 방법의 예는 항체 어레이, 유세포 분석법, 방사성 동위원소 면역검정법(radioisotopic immunoassay method) (RIA법), ELISA, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 면역조직염색(immunohistostaining), 효소 면역검정(enzyme immunoassay) (EIA법), 형광 면역검정(fluorescent immunoassay)(FIA), 면역크로마토그래피법 등을 포함한다.
본 발명의 변이체가 세포의 동종반응성을 억제하는 것은 그 자체로 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이체를 발현하는 세포와 변이체를 발현하지 않는 표적 세포는 혼합 백혈구 반응(MLR), 엘리스폿 검정(Elispot assay), 제한 희석 검정(limiting dilution assay) 등에 적용되고, 검정 중 적어도 하나가 낮은 동종반응성을 결과한 경우, 본 발명의 변이체에 의해 동종반응성이 억제된 것으로 평가될 수 있다.
4. 본 발명의 세포의 제조 방법
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 세포에 도입하는 단계 (이하, 때때로, "본 발명의 제조 방법"로 지칭됨)을 포함하는 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산 또는 벡터가 도입되는 세포, 도입 방법 등은 상기-언급한 3에 기재된 바와 같다. 상기 세포는, 본 발명의 변이체를 발현하는 것이 바람직하다. 본 발명의 변이체의 발현은 상기-언급한 3에 기재된 방법으로 검출 또는 측정할 수 있다.
본 발명의 제조 방법의 일 실시양태에서, (1) 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 다능성 줄기 세포를 조혈 전구 세포로 분화시키는 단계, 및 (2) 조혈 전구 세포를 T 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 T 세포의 제조 방법이 제공된다.
(1) 다능성 줄기 세포를 조혈전구세포로 분화시키는 단계 (단계 (1))
다능성 줄기 세포를 조혈 전구 세포로 분화시키는 방법은 조혈 전구 세포로 분화할 수 있는 한 특히 제한되지는 않는다. 이의 예로는, 예를 들어, WO 2013/075222, WO 2016/076415 및 문헌 [Liu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015); 344-358] 등에 기재된 바와 같이, 조혈 전구 세포의 유도를 위한 배지에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명에서, 조혈 전구 세포로의 유도에 사용되는 배지는 특히 제한되지는 않는다. 동물 세포 배양에 사용되는 배지는 기초 배지로 조제할 수 있다. 기초 배지의 예는 이소코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (IMDM), 배지(Medium) 199, 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium) (EMEM), αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium) (DMEM), 햄(Ham's) F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지(Fischer's medium), 및 뉴로베이살 배지(Neurobasal Medium) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)), 및 이들의 혼합 배지를 포함한다. 배지는 혈청을 함유하거나 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 기초 배지는 또한 비타민 C류 (예를 들어, 아스코르브산), 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 티올 글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염, 시토카인 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "비타민 C류"는 L-아스코르브산 및 그의 유도체를 의미하고, "L-아스코르브산 유도체"는 생체내에서 효소 반응에 의해 비타민 C류가 되는 유도체를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 L-아스코르브산 유도체의 예는 비타민 C 포스페이트, 아스코르브산 글루코시드, 아스코르빌 에틸, 비타민 C 에스테르, 아스코르빌 테트라헥실데카노에이트, 아스코르빌 스테아레이트, 및 아스코르빌 2-포스페이트 6-팔미테이트를 포함한다. 비타민 C 포스페이트가 바람직하다. 비타민 C 포스페이트의 예는 L-아스코르브산 포스페이트 Na 및 L-아스코르브산 포스페이트 Mg와 같은 L-아스코르브산 포스페이트의 염을 포함한다.
단계 (1)에서 사용되는 기초 배지는 바람직하게는 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 티올 글리세롤, L-글루타민 및 아스코르브산을 함유하는 IMDM 배지이다.
단계 (1)에서 사용되는 배지에는 BMP4 (골 형성 단백질(Bone morphogenetic protein) 4), VEGF (혈관 내피 성장 인자), SCF (줄기 세포 인자(Stem cell factor)) 및 FLT-3L(Flt3 리간드)로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인 중 적어도 1종류로 추가로 보충될 수 있다. 배지는 보다 바람직하게는 VEGF, SCF 및 FLT-3L이 보충된 배양액이다.
단계 (1)에서 비타민 C류를 사용하는 경우, 비타민 C류는 4일마다, 3일마다, 2일마다, 또는 매일 부가 (공급)하는 것이 바람직하다. 배지 중 비타민 C류의 농도는 특히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 500 ng/ml에 상응하는 양 (예를 들어, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 또는r 500 ng/ml에 상응하는 양)이다.
단계 (1)에서 BMP4를 사용하는 경우, 배지 중 BMP4의 농도는 특히 제한되지는 않는다. 이는 바람직하게는 10 ng/ml - 100 ng/ml (예를 들어, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml), 보다 바람직하게는 20 ng/ml - 40 ng/ml이다.
단계 (1)에서 VEGF를 사용하는 경우, 배지 중 VEGF의 농도는 특히 제한되지는 않는다. 이는 바람직하게는 10 ng/ml - 100 ng/ml (예를 들어, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml), 특히 바람직하게는 20 ng/ml이다.
단계 (1)에서 SCF를 사용하는 경우, 배지 중 SCF의 농도는 특히 제한되지는 않는다. 이는 바람직하게는 10 ng/ml - 100 ng/ml (예를 들어, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml), 특히 바람직하게는 30 ng/ml이다.
단계 (1)에서 FLT-3L을 사용하는 경우, 배지 중 FLT-3L의 농도는 특히 제한되지는 않는다. 이는 바람직하게는 1 ng/ml - 100 ng/ml (예를 들어, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml, 5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml), 특히 바람직하게는 10 ng/ml이다.
단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포는 접착 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양될 수 있다. 접착 배양의 경우, 배양은 코팅제가 코팅된 배양 용기에서 수행될 수 있고/거나, 다른 세포와 공배양될 수 있다. 공배양을 위한 다른 세포의 예는 C3H10T1/2 (Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010) 및 다른 종 유래의 기질 세포(stromal cell) (Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov; 221(2): 367-77)를 포함한다. 코팅제의 예는 마트리겔(Matrigel)을 포함한다 (Nivea A, et al. PLoS One. 6(7): e22261, 2011). 현탁 배양 방법의 예는 문헌 [Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15, Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62], 및 [Saeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67]에 기술된 방법을 포함한다.
단계 (1)에서, 온도 조건은 제한되지 않는다. 온도는, 예를 들어, 약 37℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 조혈 전구 세포의 수 등을 모니터링함으로써 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 배양일수는 조혈전구세포를 얻을 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양 기간의 예는 적어도 6일, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일, 및 14일 이상을 포함한다. 배양 기간은 바람직하게는 14일이다. 더 긴 배양 기간은 일반적으로 조혈 전구 세포의 생산에 문제를 일으키지 않지만, 바람직하게는 35일 이하, 보다 바람직하게는 21일 이하이다. 배양은 저산소 조건 하에 수행될 수 있으며, 본 발명에서 저산소 조건은 예를 들어, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% 또는 그 미만의 산소 농도를 의미한다.
(2) 조혈 전구 세포를 T 세포로 분화시키는 단계(단계 (2))
조혈 전구 세포를 T 세포로 분화시키는 방법은 조혈 전구 세포를 T 세포로 분화할 수 있는 한 특히 제한되지는 않는다. 그 예는 (2-1) 조혈 전구 세포로부터 CD4CD8 이중 양성 T 세포를 유도하는 단계 및 (2-2) 예를 들어 WO 2016/076415 등에 기재된 바와 같이 CD4CD8 이중 양성 T 세포로부터 CD8 양성 T 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 조혈 전구 세포의 마커를 사용하여 단계 (1)에서 수득된 세포 집단으로부터 조혈 전구체를 미리 단리하는 것이 바람직하다. 마커로서는 CD43, CD34, CD31 및 CD144로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 언급할 수 있다.
(2-1) 조혈 전구 세포를 CD4CD8 이중 양성 T 세포로 유도하는 단계 (단계 (2-1))
본 발명에서, CD4CD8 이중 양성 T 세포로의 분화 방법의 예는 조혈 전구 세포를 유도 배지에서 CD4CD8 이중 양성 T 세포로 배양하는 방법을 포함한다.
본 발명에서, CD4CD8 이중양성 T 세포로의 분화를 유도하기 위한 배지는 특히 제한되지는 않으며, 동물 세포 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로 조제할 수 있다. 기초 배지의 예는 상기-언급한 단계 (1)에서 사용된 기초 배지와 유사한 것을 포함한다. 배지는 혈청을 포함하거나 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 기초 배지는 또한 비타민 C류, 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 티올 글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염, 시토카인 등을 포함한다.
단계 (2-1)에서 사용되는 바람직한 기초 배지는 혈청, 트랜스페린, 셀레늄 및 L-글루타민을 함유하는 αMEM 배지이다. 기초 배지에 비타민 C류를 부가하면 비타민 C류는 (1)단계와 동일하다.
단계 (2-1)에서 사용되는 배지는 시토카인 FLT-3L 및/또는 IL-7을 추가로 포함할 수 있으며, FLT-3L 및 IL-7을 함유하는 배지가 보다 바람직하다.
IL-7이 단계 (2-1)에서 사용되는 경우, 배양 배지 중 IL-7의 농도는 바람직하게는 1 ng/ml - 50 ng/ml (예를 들어, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml, 5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml), 특히 바람직하게는 5 ng/ml이다.
FLT-3L이 단계 (2-1)에서 사용되는 경우, FLT-3L은 상기-언급한 단계 (1)과 유사하게 사용할 수 있다.
단계 (2-1)에서, 조혈 전구 세포는 접착 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양될 수 있다. 접착 배양의 경우, 코팅된 배양 용기를 사용할 수 있고/거나 조혈 전구 세포를 피더 세포(feeder cell) 등과 공배양할 수 있다. 공배양을 위한 피더 세포의 예는 골수 기질 세포주, OP9 세포 (리켄 바이오리소스 센터(Riken BioResource Center)로부터 입수가능)를 포함한다. OP9 세포는 DLL4 또는 DLL1을 지속적으로 발현하는 OP9-DL4 세포 또는 OP9-DL1 세포인 것이 바람직하다 (Holmes R I and Zuniga-Pflucker J C. Cold Spring Harb Protoc. 2009). 본 발명에서, OP9 세포를 피더 세포로 사용하는 경우, 별도로 제조한 DLL4 또는 DLL1, 또는 DLL4 또는 DLL1과 Fc 등의 융합 단백질 등을 배지에 부가할 수 있다. 피더 세포를 사용하는 경우, 배양 중에 적절히 피더 세포를 교체하는 것이 바람직하다. 피더 세포의 교체는 배양 중인 대상 세포를 미리 플레이팅된 피더 세포에 옮겨서 수행할 수 있다. 교체는 5일마다, 4일마다, 3일마다 또는 2일마다 수행될 수 있다. 배양체(embryoid)의 현탁 배양에 의해 조혈 전구 세포를 얻는 경우, 단세포로 해리한 후 접착 배양을 행하는 것이 바람직하다. 세포는 피더 세포와 함께 공배양될 수 있지만, 배양은 피더 세포를 사용하지 않고 수행하는 것이 바람직하다.
접착 배양의 경우 배양 용기를 코팅하는 경우에 코팅제의 예는 마트리겔 (Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011)), 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 레트로넥틴(RetroNectin), DLL4 또는 DLL1, DLL4 또는 DLL1과 항체의 Fc 영역 등의 융합 단백질 (예를 들어, DLL4/Fc 키메라), 엔탁틴, 및/또는 이들의 조합 등을 포함하며, 레트로넥틴과 DLL4 및 Fc 영역 등의 융합 단백질의 조합이 바람직하다.
단계 (2-1)에서, 배양 온도 조건은 제한되지 않는다. 온도는, 예를 들어, 약 37℃ ,내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 CD4/CD8 이중 양성 T 세포의 수 등을 모니터링함으로써 통상의 기술자가 적절히 결정할 수 있다. 배양일수는 조혈전구세포를 얻을 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양 기간의 예는 적어도 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 16일 이상, 18일 이상, 20일 이상, 22일 이상, 및 23일 이상을 포함한다. 배양 기간은 바람직하게는 23일이다. 게다가, 90일 이하가 바람직하고, 42일 이하가 보다 바람직하다.
2-2) CD4CD8 이중양성(DP) T 세포로부터 CD8 양성 T 세포(CD3 단일 양성 T 세포)를 유도하는 단계 (단계 (2-2))
상기 (2-1) 단계에서 수득된 CD4/CD8 DPT 세포는 CD8 양성 T 세포로의 분화 유도 단계를 거쳐 CD8 단일 양성 T 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
단계 (2-2)에서 사용되는 기초 배지 및 배지의 예는 단계 (1)에서 사용되는 기초 배지 및 배지와 유사한 것을 포함한다.
전술한 배지는 부신피질 호르몬제를 함유할 수 있다. 부신피질 호르몬제로서는, 예를 들어 글루코코르티코이드 및 그 유도체 등을 포함한다. 글루코코르티코이드의 예는, 예를 들어, 코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 플루드로코르티손 아세테이트, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손 및 베클로메타손 디프로피오네이트를 포함한다. 이들 중에서, 덱사메타손이 바람직하다.
덱사메타손이 부신피질 호르몬제로 사용되는 경우, 배지 중 덱사메타손의 농도는 바람직하게는 1 nM - 100 nM (예를 들어, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM), 특히 바람직하게는 10 nM이다.
전술한 배지는 항체 (예를 들어, 항-CD3 항체, 항 CD28 항체, 항 CD2 항체), 또는 시토카인 (예를 들어, IL-7, IL-2, IL-15) 등을 함유할 수 있다.
항-CD3 항체가 단계 (2-2)에서 사용되는 경우, 항CD3 항체는 CD3을 특이적으로 인식하는 한 특히 제한되지는 않는다. 예를 들어, OKT3 클론으로부터 생산된 항체를 언급할 수 있다. 항-CD3 항체는 자성 비드 등에 결합될 수 있고, 또는 전술한 항-CD3 항체를 배지에 부가하는 대신에, 항-CD3 항체를 항-CD3 항체가 표면에 결합되어 있는 배양 용기에서 일정 기간 동안 T 림프구를 배양함으로써 자극을 줄 수 있다. 배지 중 항-CD3 항체의 농도는 바람직하게는 10 ng/ml - 1000 ng/ml (예를 들어, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml, 700 ng/ml, 800 ng/ml, 900 ng/ml, 1000 ng/ml), 특히 바람직하게는 500 ng/ml이다. 다른 항체의 농도도 배양 조건 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 결정할 수 있다.
단계 (2-2)에서 IL-2를 사용하는 경우, 배지 중 IL-2의 농도는 바람직하게는 10 U/ml - 1000 U/ml (예를 들어, 10 U/ml, 20 U/ml, 30 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 90 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 500 U/ml, 1000 U/ml), 특히 바람직하게는 100 U/ml이다. 단계 (2-2)에서 사용된 배지 중 IL-7 또는 IL-15의 농도는 바람직하게는 1 ng/ml - 100 ng/ml (예를 들어, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml), 특히 바람직하게는 10 ng/ml이다.
단계 (2-2)에서, 온도 조건은 특히 제한되지는 않는다. 온도는 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 42℃, 보다 바람직하게는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 CD8-양성 T 세포의 수 등을 모니터링함으로써 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 배양일수는 CD8 양성 T 세포를 얻을 수 있는 한 제한되지 않다. 배양 기간은 바람직하게는 1일 이상, 3일 이상, 7일 이상, 바람직하게는 60일 이하, 보다 바람직하게는 35일 이하이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는, 세포의 동종반응성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 단지 예시일 뿐 본 발명을 제한하지 않는 실시예를 참조하여 하기에서 더 상세히 설명된다.
[실시예]
[실시예 1] αβ TCR 불변 영역을 가지며 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖지 않는 TCR의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 LentiV 벡터의 제조
N-말단에 CD8 분자의 막 국소화 신호 펩티드를 부가한 각각의 α 쇄 (TRAC)와, N-말단에 IGH 분자의 막 국소화 신호 펩티드를 부가한 각각의 β 쇄 (TRBC1 또는 TRBC2)의 아미노산을 P2A 서열로 연결하여 폴리펩티드 쇄를 설계하였다(표 1 AB5-AB8). 설계된 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 올리고 DNA를 인공적으로 합성 (GenScript)하여 렌티바이러스 벡터 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 렌티바이러스 벡터 플라스미드에서, pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro (시스템바이오사이언스(SystemBioscience))의 CMV 프로모터는 인간 유비퀴틴 프로모터로 치환되었다. 바이러스 벡터의 생산은 시리온(SIRION)에 위탁하였다.
벡터 번호 리드(lead) TRBC 2A Lead TRAC 도입된 유전자에 함유된 염기 서열 발현될 펩티드 서열 1 (CD8-Cb) 발현될 펩티드 서열 2 (IGH-Ca)
AB5 CD8 TRBC1 P2A IGH TRAC 서열번호: 6 서열번호: 7 서열번호: 8
AB6 CD8 TRBC1S56C P2A IGH TRAC
T48C		 서열번호: 9 서열번호: 10 서열번호: 11
AB7 CD8 TRBC2 P2A IGH TRAC 서열번호: 12 서열번호: 13 서열번호: 8
AB8 CD8 TRBC2S55C P2A IGH TRAC
T48C		 서열번호: 14 서열번호: 15 서열번호: 11
TRAC: 서열번호: 1
TRAC T48C: 48번째 트레오닌이 시스테인으로 치환된 서열번호: 1
TRBC1: 서열번호: 2
TRBC1 S56C: 56번째 세린이 시스테인으로 치환된 서열번호: 2
TRBC2: 서열번호: 3
TRBC2 S55C: 55번째 세린은 시스테인으로 치환된 서열번호: 3
CD8: 서열번호: 4
IGH: 서열번호: 5
[실시예 2] TCR 변이체를 발현하는 T 세포의 제조
레트로넥틴 (타카라 바이오 인크.)이 코팅된 24웰 플레이트를 사용하여 4가지 유형의 CD3 유전자(γ, δ, ε 및 ζ)를 강제로 발현된 K562 세포 (K562-CD3 세포, 국립 암연구 센터(National Cancer Research Center), 닥터 우에무라(Dr. Uemura) 제공)에, 각각의 변이체를 인코딩하는 유전자를 형질감염시키기 위해 표 1에 나타낸 각 변이체를 코딩하는 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 렌티바이러스 벡터로 감염시킨 후, 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양하였다.
[실험예 1] 상기-언급한 TCR 변이체를 발현하는 T 세포의 세포막 표면 분자의 발현 평가
[실시예 2]에서 수득된, 표 1의 변이체를 발현하는 T 세포를 항-CD3 항체 (APC/Cy7, UCHT1, 바이로레전드)로 염색하였다. 이어서, LSR FortessaTMX-20 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience)) 유세포 분석기를 이용하여 세포막 표면에서 CD3 분자의 발현을 유세포 분석기로 검출하였다 (도 1). CD3의 발현은 또한 AB5에 의해 수득된 세포 및 AB7에 의해 수득된 세포의 세포막 표면에서 관찰되었다. 또한, AB6에 의해 수득된 세포와 AB8에 의해 수득된 세포의 세포막 표면에서 CD3의 발현이 보다 강하게 관찰되었다.
[실시예 3] TCR 변이체를 발현하는 iPS 세포 유래 T 세포의 제조
1. iPS 세포의 준비
iPS 세포로서, 교토 대학 iPS 세포 연구 및 응용 센터(iPS Cell Research and Application) (CiRA)에서 기증한 iPS 세포 (Ff-I01s04 균주: 건강한 인간 말초 혈액 단핵 세포 유래)를 사용하였다. iPS 세포는 CiRA에서 배포한 "인간 iPS 세포의 피더-프리 배양(Feeder-free culture of human iPS cells)" 프로토콜에 따라 배양되었다.
2. αβ TCR의 불변 영역을 갖고 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖지 않는 TCR의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 Lenti V 벡터의 제조
pLVSIN-CMV Neo (클론테크(Clontech))로부터 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 서열을 제거하고, pLVSIN-Ub를 이용하여 CMV 프로모터가 인간 유비퀴틴 프로모터로 치환된 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 상기에서 합성한 AB6를 코딩하는 인공 올리고 DNA를 pLVSIN-Ub 렌티바이러스 벡터의 다중 클로닝 부위에 혼입하였다. 이 플라스미드 및 렌티(Lenti)-X™ 293T 세포주 및 클론테크의 렌티-X™ 패키징 싱클 샷(Packaging Single Shots) (VSV-G)를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.
3. 변형된 T 세포 수용체 유전자의 iPS 세포로에 도입
[실시예 1]에서 제조한 AB6이 혼입된 렌티바이러스 벡터를 세포에 감염시켜 변형된 T 세포 수용체 유전자를 iPS 세포에 도입하였다.
[실시예 3] 1에서 제조한 iPS 세포에, 제조된 렌티바이러스 벡터를 감염시킴으로써, 변형된 TCR 유전자를 iPS 세포에 도입하였다. 이하에서는, 변형된 TCR 유전자가 도입된 iPS 세포를 때때로 "tTCR-iPSC"로 지칭한다.
4. iPS 세포의 조혈 전구 세포 (HPC)로의 분화
iPS 세포의 조혈 전구 세포 (HPC)로의 분화는 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Cell Reports 2(2012)1722-1735] 및 WO 2017/221975에 기재된 방법)에 따라 수행하였다. 구체적으로, [실시예 3] 3에서 수득된 tTCR-iPSC를 초저접착 처리된 6 웰 플레이트에 3 x 105개 세포/웰로 시딩하고 EB 배지 (StemPro34에 10 μg/ml 인간 인슐린, 5.5 μg/ml 인간 트랜스페린, 5 ng/ml 셀렌산나트륨, 2 mM L-글루타민, 45 mM α-모노티오글리세롤, 및 50 μg/ml 아스코르브산 2-포스페이트 부가)에 10 ng/ml BMP4, 50 ng/ml bFGF, 15 ng/ml VEGF, 2 μM SB431542를 부가하고, 5일 동안 저산소 조건 (5% O2)에서 5일 동안 배양하였다. 후속적으로, 50 ng/ml SCF, 30 ng/ml TPO, 10 ng/ml Flt3L을 부가하고, 세포를 5 - 9일 동안 추가 배양하여 비부착 세포 집단을 수득하였다. 배양 기간 동안, 배지는 2일 또는 3일마다 교체하였다. HPC를 포함하는 상기-언급한 비부착 세포 집단을 표 2에 기재된 항체를 사용하여 염색하였다. 상기-언급한 염색된 세포 집단을 FACSAria에 의해 분류하였다.
항-CD34 항체 압캠(Abcam) PE/Cy7
항-CD43 항체 BD APC
항-CD45 항체 바이오레전드 BV510
항-CD14 항체 바이오레전드 APC/이플루오르(eFluor)780
항-CD235a 항체 BD FITC
5. HPC를 T 세포로의 분화
[실시예 3] 4에서 수득된 세포 분획물을 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175] 및 WO 2017/221975에 기재된 방법)에 따라 림프구 세포로 분화시켰다. 구체적으로, 재조합 h-DLL4/Fc 키메라 (시노바이올로지칼(SinoBiological))와 레트로넥틴 (타카라 바이오 인크.)이 코팅된 48-웰-플레이트에 조혈 전구 세포 집단을 2000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2, 37℃ 조건 하에 배양하였다. 배양 기간 동안 배지는 2일 또는 3일마다 교체하였다. 배지로서, 15% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ng/ml 스트렙토마이신, 55 μM 2-메르캅토에탄올, 50 μg/ml 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/ml 인간 인슐린, 5.5 μg/ml 인간 트랜스페린, 5 ng/ml 셀렌산나트륨, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml IL-7, 50 ng/ml Flt3L, 100 ng/ml TPO, 15 μM SB203580, 30 ng/ml SDF-1α가 부가된 αMEM을 사용하였다. 세포를 배양 개시로부터 7일차 및 14일차에 유사하게 코팅된 48-웰-플레이트에 계대하였다. 모든 세포는 배양 시작일로부터 21일차에 수집되었다. 수집된 세포를 표 3에 기재된 항체 세트를 사용하여 염색하였다.
CD3 항체 바이오레전드 APC/Cy7
CD5 항체 바이오레전드 BV510
CD7 항체 바이오레전드 APC
TCRab 항체 이바이오사이언스(eBIoscience) FITC
[실험예 2] 상기-언급한 TCR 변이체를 발현하는 T 세포의 세포막 표면 분자 발현 평가
[실시예 3] 5에서 수득된 세포의 세포막 표면 상의 CD3, CD5, CD7, 및 αβTCR의 발현을 유세포분석기로 측정하였다 (도 2).
본 명세서에서, "포함하는(comprising)" 또는 "포함하다 (comprise)"와 같은 각각의 용어는 임의로 "~로 이루어진(consisting of)" 또는 "~로 이루어지다(consists of)"으로 대체된다.
[산업적 이용가능성]
본 발명의 변이체는, 세포에서 발현되는 경우, 세포의 동종반응성을 억제할 수 있어, 동종 이식에서 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)의 위험을 감소시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 변이체의 도입은 T 세포 요법에서 동종반응성을 제어하기 위한 하나의 옵션이 될 수 있다.
본 출원은 일본에 출원된 특허출원 번호 2018-245253 (출원일: 2018년 12월 27일)을 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University Takeda Pharmaceutical Company Limited <120> T-CELL RECEPTOR MODIFIED OBJECT <130> IPA210948-JP <150> JP 2018-245253 <151> 2018-12-27 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> constant region of TCR alpha chain <400> 1 Val Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 1 5 10 15 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 20 25 30 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 65 70 75 80 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp 85 90 95 Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe 100 105 110 Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 115 120 125 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 2 <211> 175 <212> 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cgagtggacc caggataggg ccaaacctgt cacccagatc 420 gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa 480 ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc 540 gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc atggtcaaga gaaaggattc cagaggctcc 600 ggaagcggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggccg gtgacgtcga ggagaatcct 660 ggccccatgg actggacatg gaggatactg ttcctggtag ccgcagctac tggcgcccat 720 tccgtaatcc agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac 780 aagtctgtct gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat 840 tctgatgtgt atatcacaga caaatgtgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc 900 aacagtgctg tggcctggag caacaaatct gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac 960 agcattattc cagaagacac cttcttcccc agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg 1020 gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg 1080 ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg 1140 tccagctga 1149 <210> 15 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CD8 and TRBC2 of AB8 <400> 15 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 20 25 30 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 35 40 45 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 50 55 60 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 65 70 75 80 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 85 90 95 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 100 105 110 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 115 120 125 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 130 135 140 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 145 150 155 160 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 165 170 175 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 180 185 190 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 195

Claims (7)

  1. α 쇄, β 쇄, γ 쇄 및 δ 쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 수용체 쇄의 불변 영역(constant region)을 포함하는 2개의 폴리펩티드의 조합을 포함하는 T-세포 수용체의 변이체(variant)이며, 여기서 폴리펩티드가 T 세포 수용체 쇄의 상보성 결정 영역 (complementary determining region; CDR), α 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR), 및 β 쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는 것인 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 중 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 포함하고, 다른 하나가 T 세포 수용체 α 쇄 또는 β 쇄의 불변 영역을 포함하는 것인 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 폴리펩티드가 1개 이상의 디설파이드 결합(disulfide bond)에 의해 결합되는 것인 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 코딩하는(encoding) 핵산 분자.
  5. 제4항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  6. 제5항에 따른 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 세포의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 변이체를 발현하는 세포.
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